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Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a la NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo de vida del virus que reduzca las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión genética son impulsados por la proximidad Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo tanto las respuestas séricas como las de anticuerpos mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Si bien estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para promover el NDV como vector humano de la vacuna contra la gripe. El virus parainfluenza tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 sólo se ha descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus que reduce las preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Cómo funcionan los vectores del virus alfa?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Para qué se desarrollaron los VRP derivados de VEE?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Cuál es la ventaja de los baculovirus?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. La LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Cuál es la ventaja de los vectores de baculovirus?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a la NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo de vida del virus que reduzca las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión genética son impulsados por la proximidad Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo tanto las respuestas séricas como las de anticuerpos mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Si bien estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para promover el NDV como vector humano de la vacuna contra la gripe. El virus parainfluenza tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 sólo se ha descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus que reduce las preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Qué inmunización basada en vectores de baculovirus proporcionó protección contra el desafío letal?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Qué es NYVAC?

Tráfico de proteínas nucleolares en respuesta al VIH-1 Tat: Rewiring the Nucleolushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499507/SHA: efa871aeaf22cbd0ce30e8bd1cb3d1afff2a98f9Autores: Jarboui, Mohamed Ali; Bidoia, Carlo; Woods, Elena; Roe, Barbara; Wynne, Kieran; Elia, Giuliano; Hall, William W.; Gautier, Virginie W.Fecha: 2012-11-15DOI: 10.1371/journal.pone.0048702Licencia: cc-byAbstract: La proteína Tat transactivante es una proteína reguladora viral esencial para la replicación del VIH-1. El nucleolo, un compartimento subnuclear altamente dinámico y estructurado sin membrana, es el sitio de ARNr y biogénesis ribosoma y está involucrado en numerosas funciones celulares incluyendo la regulación transcripcional, el control del ciclo celular y la infección viral. Importantemente, el tráfico nucleolar transitorio tanto de Tat como de las transcripciones virales del VIH-1 son críticos en la replicación del VIH-1, sin embargo, el(los) papel(es) del nucleolo en la replicación del VIH-1 sigue sin estar claro. Para entender mejor cómo la interacción de Tat con la maquinaria nucleolar contribuye a la patogénesis del VIH-1, investigamos los cambios cuantitativos en la composición del proteoma nucleolar de las células T de Jurkat que expresan establemente el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta TAP. Utilizando un enfoque proteómico organélaro basado en espectrometría de masas, junto con el etiquetado de isótopos estables en cultivo celular (SILAC), cuantificamos 520 proteínas, incluyendo 49 proteínas que muestran cambios significativos en la abundancia de nucleolos de células T de Jurkat sobre la expresión Tat. Numerosas proteínas que exhiben un cambio de pliegue fueron interactuadores Tat bien caracterizados y/o conocidos por ser críticos para la replicación del VIH-1. Esto sugiere que el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares por Tat proporcionan una capa adicional de control para regular la maquinaria celular involucrada en la patogénesis del VIH-1. El análisis del camino y la reconstrucción de la red revelaron que la expresión Tat resultó específicamente en el enriquecimiento nucleolar de proteínas que participan colectivamente en biogénesis ribosomal, homeostasis de proteínas, vías metabólicas incluyendo glucolítico, fosfato de pentosa, nucleótidos y aminoácidos vías biosintéticas, respuesta al estrés, vías de señalización de células T e integridad del genoma. Presentamos aquí el primer perfil diferencial del proteoma nucleolar de células T que expresan el HIV-1 Tat. Discutimos cómo estas proteínas participan colectivamente en redes interconectadas que convergen para adaptar las actividades dinámicas del nucleolus, que favorecen las actividades biosintéticas del huésped y pueden contribuir a crear un entorno celular que apoye la producción robusta del HIV-1. Texto: El nucleolus es un compartimento subnuclear altamente ordenado organizado alrededor de loci genéticos llamados regiones organizadoras nucleolares (NORs) formado por grupos de cientos de repeticiones de genes rDNA organizadas en repetición tándem cabeza a cola [1, 2]. Organelo sin membrana descrito originalmente como la ''Fábrica Ribosoma'', el nucleolus está dedicado a la transcripción de rDNA dirigida por ARN-polimerasa-I, procesamiento de rARN mediado por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (SORNPs) y conjunto ribosoma. La biogénesis del ribosoma es esencial para la síntesis de proteínas y la viabilidad celular [2] y, en última instancia, resulta en las subunidades ribosomales grandes (60S) y pequeñas (40S), que posteriormente se exportan al citoplasma. Este proceso celular fundamental, al que la célula dedica la mayor parte de sus recursos energéticos, está estrictamente regulado para adaptarse a los cambios dinámicos en la proliferación celular, la tasa de crecimiento y las actividades metabólicas [3]. El nucleolus es el sitio de procesamiento adicional de ARN, incluyendo la exportación y degradación de ARNm, la maduración de pequeños PNNR nucleares ricos en uridina (U snRNPs), que forman el núcleo del spliceosoma, biogénesis de ARNt y microARNs (miRNAs) [4]. El nucleolus también está involucrado en otros procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular, procesos oncogénicos, respuestas de estrés celular y traducción [4]. El concepto de nucleolo multifuncional y altamente dinámico ha sido corroborado por varios estudios que combinan enfoques proteómicos organelares y espectrometría cuantitativa de masas, y describen miles de proteínas que transitan por el nucleolo en respuesta a diversas condiciones metabólicas, estrés y ambientes celulares [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Colectivamente, los estudios mencionados representan hitos en la comprensión de la complejidad funcional del nucleolo, y demostraron que las proteínas nucleolares están en intercambio continuo con otros compartimentos nucleares y celulares en respuesta a determinadas condiciones celulares. Los estudios proteómicos que analizan los nucleoli de las células infectadas por el virus sincitial respiratorio humano (HRSV), el virus influenza A, el virus de la bronquitis infecciosa por coronavirus aviar (IBV) o el adenovirus destacaron cómo los virus pueden alterar de forma distintiva la distribución de proteínas nucleolares [2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Curiosamente, tanto las proteínas reguladoras del VIH-1 Tat como Rev localizan al nucleoplasma y al nucleolus. Ambas secuencias abarcan una señal de localización nucleolar (NoLS) que se superpone con su señal de localización nuclear (NLS), que rige su localización nucleolar [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. Además, Tat y Rev interactúan con el antígeno nucleolar B23 Sin embargo, un estudio reciente describió que en contraste con las células T de Jurkat y otras líneas celulares transformadas donde Tat está asociado con el núcleo y el nucleolo, en las células T primarias Tat se acumula principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Mientras que la regulación de su importación y/o exportación nuclear activa, como mediada por la familia de la carioferina/importación, se han descrito bien, los mecanismos que distribuyen Tat y Rev entre el citoplasma, el nucleoplasma y el nucleolo siguen siendo elusivos [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48]. Importantemente, dos estudios importantes de Machienzi y otros han revelado importantes vínculos funcionales entre la replicación del VIH-1 y el nucleo En primer lugar, podrían inhibir la replicación del VIH-1 y la función de transactivación Tat empleando un señuelo TAR dirigido específicamente al nucleolo. Además, utilizando un enfoque similar, con una ribozima anti-VIH-1 de cabeza martillo fusionada al ARN nucleolar pequeño U16 y por lo tanto dirigida al nucleolo, podrían suprimir dramáticamente la replicación del VIH-1. Colectivamente, estos hallazgos sugieren fuertemente que las transcripciones del VIH-1 y el tráfico nucleolar Tat son críticos para la replicación del VIH-1. Sin embargo, la naturaleza de estas contribuciones aún no se ha aclarado. En este informe, analizamos sistemáticamente las perturbaciones del proteoma nucleolar que ocurren en las células T de Jurkat expresando constitutivamente el VIH-1 Tat, utilizando un enfoque de espectrometría cuantitativa de masas. Después de la anotación detallada de los cambios cuantitativos de abundancia en la composición de la proteína nucleolar sobre la expresión Tat, nos centramos en los complejos celulares afectados por Tat y las vías de señalización asociadas con la biogénesis ribosoma, el spliceosoma, las chaperonas moleculares, la replicación y reparación del ADN y el metabolismo, y discutimos su posible implicación en la patogénesis del VIH-1. En este estudio, investigamos los cambios cuantitativos en el proteoma nucleolar de las células Jurkat T expresando constitutivamente el VIH-1 Tat (86aa) frente a su contraparte Tat negativo, utilizando el etiquetado estable de isótopos con aminoácidos en la tecnología de cultivo celular (SILAC), seguido por la espectrometría de masas en tándem ESI e implementamos el enfoque experimental descrito en la Figura 1A. En primer lugar, mediante la entrega de genes retrovirales, transferimos el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta de purificación de afinidad tándem (TAP) (constituido por dos proteínas G y un péptido de unión a estreptavidina) o TAP solo (vector de control) en el clon de células T de leucemia Jurkat E6-1 y clasificamos las células transducidas (GFP positivo) por FACS. Esto resultó en una población altamente enriquecida de células transducidas policlonales que presentaban diferentes niveles de expresión del transgén (Figura 1B). La funcionalidad del TAP-Tat fue confirmada mediante la transfección de las células TAP-Tat y TAP con un vector de genes reportero de luciferasa bajo el control del HIV-1 LTR (pGL3-LTR) [36]. Para abordar la funcionalidad de Tat fusionado a TAP, comparamos Jurkat TAP-Tat con Jurkat-tat, una línea celular que expresaba establemente Tat [51]. Ambas líneas celulares mostraron una actividad LTR del VIH-1 comparable después de la transfección con pGL3-LTR (Figura S1 ). A continuación, la expresión Tat y la localización subcelular fueron verificadas mediante fraccionamiento subcelular seguido por el análisis del WB (Figura 1E ). TAP-Tat mostró una localización nuclear/nucleolar prominente, pero también se pudo detectar en el citoplasma. Estas observaciones fueron además validadas mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 1E ). A continuación se comparó la tasa de crecimiento y proliferación de las líneas celulares de Jurkat TAP y TAP-Tat (Materiales y Métodos S1), que eran equivalentes (Figura S4A ). Del mismo modo, el análisis FACS confirmó que las poblaciones relativas en G1, S y G2/M eran similares para las células de Jurkat TAP-Tat y TAP (Figura S4B ). Se etiquetaron las células de Jurkat TAP-Tat y Jurkat TAP con isótopo ligero (R0K0) y pesado (R6K6) que contenían arginina y lisina, respectivamente. Después de cinco pasajes en su respectivo medio SILAC, se recolectaron 85 millones de células de cada cultivo, se agruparon y se aislaron sus nucleolis como se describió previamente (Figura 1A ) [52] Para evaluar la calidad de nuestro procedimiento de fraccionamiento, se investigó el enriquecimiento específico de antígenos nucleolares conocidos mediante el análisis Western Blot (Figura 1D). Se encontró que la nucleolina (110 kDa) y la fibrilarina (FBL) (34 kDa), dos proteínas nucleolares principales conocidas por localizar al componente granular del nucleolo, estaban muy enriquecidas en la fracción nucleolar mixta. Se observó que la nucleolina se distribuía igualmente entre las fracciones nuclear y citoplasmática. Este patrón de distribución de nucleolina parece ser específico para las células T de Jurkat, como se muestra anteriormente [52, 53]. La proteína nuclear PARP-1 (Poly ADPribose polimerasa 1) (113 kDa) estaba presente en la fracción nuclear y nucleoplasmática, pero se desplegó en la fracción La alfa-tubulina (50 kDa) fue altamente abundante en la fracción citoplasmática y débilmente detectada en las fracciones nucleares. Colectivamente, estos resultados confirmaron que nuestros métodos produjeron una fracción nucleolar altamente enriquecida sin contaminación cruzada significativa. Posteriormente, la mezcla de proteína nucleolar fue tripsindigerida y los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas. El análisis proteomico cuantitativo comparativo se realizó utilizando MaxQuant para analizar las proporciones en isótopos para cada péptido identificado. Se cuantificó un total de 2427 péptidos, representando 520 proteínas nucleolares cuantificadas. La lista completa anotada de proteínas nucleolares cuantificadas está disponible en la Tabla S1 y los datos brutos del análisis de espectrometría de masas se depositaron en la base de datos de repositorios Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/), a la que se puede acceder utilizando las claves de hash descritas en materiales y métodos. Anotamos las proteínas cuantificadas utilizando las herramientas ToppGene Suite [54] y extrajimos las anotaciones de Gene Onthology (GO) e InterPro [55]. El análisis de los procesos biológicos GO (Figura 1F ) reveló que los procesos biológicos mejor representados incluían la transcripción (24%), el procesamiento de ARN (23%), el proceso del ciclo celular (13%) y la organización cromosómica (15%), que refleja las funciones asociadas nucleolares y es comparable a nuestra caracterización anterior del proteoma nucleo El análisis de distribución subcelular (Figura 1F ) reveló que nuestro conjunto de datos contenía proteínas conocidas por localizarse en el nucleolo (49%), en el núcleo (24%) mientras que el 15% de las proteínas estaban descritas previamente para residir exclusivamente en el citoplasma. La distribución subcelular fue similar a nuestro análisis anterior del proteoma nucleolar de células T de Jurkat [52]. Tabla S1. La distribución de las relaciones proteicas se representan en la Figura 1G como log 2 (cambio de abundancia). Las relaciones SILAC indican cambios en la abundancia proteica en la fracción nucleolar de las células TAP de Jurkat en comparación con las células TAP de Jurkat. La distribución de las proteínas cuantificadas siguió una distribución gaussiana (Figura 1G ). Un total de 49 proteínas nucleolares exhibieron un cambio significativo de 1,5 veces o mayor Las células no mostraron cambios en el contenido en estado estacionario de algunos de los principales y abundantes componentes del nucleolo, incluyendo nucleofosfmina (NPM1/ B23), C23, FBL, proteína nucleolar P120 (NOL1) y proteína nucleolar 5A (NOL5A). Las distintas proporciones de cambios proteicos sobre la expresión Tat podrían reflejar la reorganización nucleolar específica y las actividades alteradas del nucleolo. Realizamos el análisis del WB para validar los resultados basados en SILAC obtenidos por nuestro enfoque proteómico cuantitativo (Figura 2 ). 15 proteínas seleccionadas mostraron intensidad diferencial en las fracciones nucleolares sobre la expresión Tat, incluyendo 9 enriquecidos (HSP90b, STAT3, pRb, CK2a, CK2a', HSP90a, Transportin, ZAP70, DDX3), y 3 agotados (ILF3, BOP1 y SSRP1) proteínas. Además, también probamos por el análisis WB, abundancia de proteínas no afectada por la expresión Tat (Importin beta, FBL, B23, C23). Estos resultados destacan la concordancia en la tendencia de las proporciones correspondientes de SILAC, a pesar de algunas diferencias en los rangos cuantitativos. Cabe destacar que, usando WB, pudimos observar un cambio de intensidad para la proteína con un cambio de pliegue SILAC tan bajo como 1,25 veces. Por un lado, el umbral de los cambios en la abundancia de proteínas se puede determinar estadísticamente y luego destacar los cambios en la abundancia más grandes como se ilustra en la Tabla 1. Alternativamente, el enriquecimiento o agotamiento coordinado de la mayoría de las proteínas pertenecientes a un complejo o vía celular distinto permitiría la definición de un grupo de proteínas de interés y potencial significación. Por lo tanto, nos centramos en proteínas individuales enriquecidas o agotadas con actividades asociadas con la patogénesis molecular del VIH-1 o Tat, y en modificaciones agrupadas que afectan vías de señalización celular enteras y complejos macromoleculares. Inicialmente nos centramos en las proteínas de señalización que interactúan con Tat y/o la patogénesis molecular asociada del VIH-1 y cuya abundancia en el nucleolo fue modulada por la expresión Tat. Fosfo-proteína fosfatasas. Fosfo-proteína fosfatasa PP1 y PP2A son esenciales Es importante destacar que el PP1 representa el 80% de la actividad de la fosfatasa Ser/Thr dentro del nucleolo. En nuestro estudio, el PP1 fue potencialmente enriquecido por 1,52 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat, lo que apoya estudios previos que describen el objetivo nuclear y nucleolar de PP1a por el HIV-1 Tat y cómo PP1 aumenta la regulación de la transcripción del VIH-1 [58, 59, 60, 61, 62]. El PP1 c también fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro [63]. Curiosamente, la asociación Tat con los promotores de la subunidad PP2A resulta en la sobreexpresión y regulación de la actividad PP2A en linfocitos [64, 65]. Además, PP2A contribuye a la regulación de la transcripción y replicación del VIH-1 [61, 66]. Retinoblastoma Protein. El gen supresor tumoral pRb protein mostró un cambio de 1,4 veces en el nucleolus sobre la expresión Tat [67]. Además, el análisis WB confirmó la translocación distinta del pRb del nucleoplasma al nucleolus por Tat (Figura 2 ). Dependiendo del tipo de célula, pRb puede ser hiperfosforilado o hipofosforilado sobre la expresión Tat y puede regular negativamente o positivamente la transcripción mediada por Tat respectivamente [68, 69, 70]. Curiosamente, la hiperfosforilación de los desencadenantes del pRB en su translocación en el nucleolo [71]. La fosforilación del pRB también se asocia con un aumento de la biogénesis ribosómica y el crecimiento celular [72]. STAT3. El transductor de señal de factor de transcripción y activador de la transcripción 3 (STAT3) se enriqueció significativamente (1,86 veces) en la fracción nucleolar por la expresión constitutiva Tat. Además, el análisis WB indicó que la expresión Tat podría promover la relocalización del STAT3 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento distinto en el nucleolo (Figura 2). Curiosamente, estudios anteriores han demostrado la activación mediada por Tat de la señalización STAT3, como lo demuestra su estado de fosforilación [73]. Curiosamente, la fosforilación STAT3 indujo la dimerización de la proteína después de su translocación al núcleo [74]. YBX1. YBX1, la proteína multifuncional de unión al ADN/ARN fue enriquecida por 1,38 veces en el nucleolo de las células de Jurkat sobre la expresión Tat. Curiosamente, YBX1 interactúa con Tat y TAR y modula la expresión génica del VIH-1 [63, 75]. ZAP70. La proteína tirosina cinasa ZAP70 (proteína quinasa asociada a la cadena Zeta 70) fue enriquecida por 1,24 veces en el nucleolo de las células de Jurkat expresando Tat [76]. Además, el análisis del WB reveló que la expresión Tat podría promover la relocalización del ZAP70 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento La proteína de matriz nuclear interna, Matrin 3 (MATR3), presentó un cambio de 1,39 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat. Se localiza en el nucleolasmo con un patrón difuso excluido de los nucleolos [77]. La matrin 3 ha sido identificada como parte del nucleoloma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Dos estudios recientes han descrito a la matrin 3 como parte de complejos de ribonucleoproteínas, incluyendo también el VIH-1 Rev y (elemento de respuesta Rev) RRE que contiene ARN VIH-1, y promoviendo la regulación post-transcripción del VIH-1 [78, 79, 80]. CASP10. La molécula pro-apotótica de señalización, Caspasa 10 (CASP10), se agotó significativamente de las células nucleolus de Jurkat-Tat (0,82 veces) [81]. Importantemente, la expresión Tat desregula la expresión y actividad de CASP10 en las células Jurkat [82]. ADAR1. Adenosina deaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR1), que convierte las adenosinas en inosinas en ARN de doble cadena, se agotó significativamente del nucleolus de las células Jurkat-Tat (0,78 veces). Curiosamente, ADAR1 sobreexpresión regula la replicación del VIH-1 a través de un mecanismo de edición del ARN [83, 84, 85, 86, 87, 88]. Además, ADAR1 pertenece al interactoroma nuclear in vitro Para subrayar las relaciones estructurales y funcionales de las proteínas nucleolares afectadas por el VIH-1 Tat, construimos una representación en red de nuestro conjunto de datos. Utilizamos la versión 2.6.3 de Cytoscape [89] y utilizando el plugin MiMI [90] para mapear interacciones previamente caracterizadas, extraídas de bases de datos de interacción de proteínas (BIND, DIP, HPRD, CCSB, Reactome, IntAct y MINT), lo que resultó en una red altamente densa y conectada que incluía 416 proteínas (nodos) de las 536 proteínas, unidas por 5060 interacciones no dirigidas (borde) (Figura 3A). El análisis de centralidad reveló un umbral de 23.7 interacciones por proteína. El análisis de topología utilizando el plugin CentiScaPe [91] mostró que la distribución del grado de nodo sigue una ley de energía (Figura S5 Es importante destacar que cuando analizamos la distribución del coeficiente de agrupamiento (Figura S6 ) encontramos que la red está organizada en una arquitectura jerárquica [92], donde los nodos conectados forman parte de áreas altamente agrupadas mantenidas por pocos hubs organizados alrededor del HIV-1 Tat. Además, el análisis de la conexión en grados nodos de nuestra red identificó al HIV-1 Tat como la proteína más conectada (Figura S6 ). Específicamente, el análisis de topología indicó que los valores para las centrales Tat eran los más altos (grado de nodo, estrés, radialidad, cercanía, entreess y centroides), caracterizando a Tat como la proteína principal del hub de la red nucleolar. De hecho, un total de 146 proteínas han sido descritas previamente para interactuar con Tat (Figura 3B, Tabla S2 ). Estas proteínas están involucradas En paralelo, caracterizamos la magnitud de los cambios de abundancia proteica relacionados observados en distintas vías celulares (Figura 4). Biogénesis ribosomal. Inicialmente nos centramos en la biogénesis ribosoma, función primaria del nucleolo. Pudimos observar un aumento general y coordinado en la abundancia de proteínas ribosomales en el nucleolo por expresión Tat (Figura 4 ). Mientras algunas proteínas ribosomales permanecían inalteradas, Tat causó la acumulación nucleolar de varias proteínas ribosomas grandes y pequeñas distintas, excepto RPL35A, para las cuales la expresión Tat causó una marcada disminución en el nivel nucleolar (0,29 veces). Asimismo, varias proteínas involucradas en el procesamiento de ARNr exhibieron un aumento general en la acumulación nucleolar sobre la expresión Tat. Estos incluyen a los miembros canónicos humanos de la familia L7ae junto con los miembros que participan en la Caja C/D, H/ACA y U3 snoRNPs (Figura 4). Por el contrario, BOP1, un componente del complejo PeBoW (Pescadillo Bop1 WDR12) esencial para la maduración de la subunidad ribosómica grande, se agotó significativamente del nucleolo de las células TAP-Tat Jurkat (0,81 veces) y esto fue confirmado por el análisis WB (Figura 2 ) [93]. Sin embargo, los otros componentes complejos PeBoW, Pes1 (0,94 veces) y WDR12 (1,1 veces), no fueron afectados por la expresión Tat. Se identificaron y cuantificaron en nuestro conjunto de datos 55 proteínas de las 108 proteínas spliceosomal conocidas [94]. Estas proteínas incluyen las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares U1, U2 y U5, Sm D1, D2, D3, F y B, y las heterogéneas ribonucleoproteínas nucleares. Nuestros datos sugieren un aumento distinto en la abundancia de proteínas específicas complejas del spliceosoma tras la expresión de HIV-1 Tat en células T de Jurkat (Figuras 3 y 4). Las únicas tres proteínas que se agotaron significativamente del nucleolo tras la expresión del HIV-1 Tat fueron RBMX (0,89 veces), HNRNPA2B1 (0,84 veces) y SNRPA (0,81 veces). Varias investigaciones mostraron alteración de la expresión en los factores de empalme celular en células infectadas por HIV-1 [95, 96] Hemos identificado varias chaperonas moleculares, cochaperonas y otros factores involucrados en la proteostasis para ser altamente enriquecidos en el nucleolo de las células T sobre la expresión Tat (Figuras 3 y 4), muchos de los cuales fueron previamente caracterizados como parte del interactoroma nuclear Tat [63]. Varias proteínas de choque térmico incluyendo DNAJs, específicas HSP90, HSP70 y HSP40 isoformas y sus cofactores se enriquecieron distintivamente en la fracción nucleolar de las células Jurkat expresando Tat (Figura 4 ). Como lo muestra WB, mientras que HSP90a y b son principalmente citoplasmáticas, la expresión Tat desencadena su relocalización al núcleo y nucleolus, corroborando nuestro enfoque cuantitativo proteómico (Figura 2). Del mismo modo, el choque térmico puede hacer que el HSP90 y el HSP70 se reubiquen en el nucleolo [97, 98, 99, 100, 101]. En un estudio reciente, el grupo de Fassati ha demostrado que el HSP90 está presente en el promotor del VIH-1 y puede regular directamente la expresión génica viral [102]. También observamos el aumento coordinado de la abundancia de la clase I (GroEL y GroES) y la clase II (chaperonina que contiene TCP-1 (CTT)) moléculas de chaperonina (Figuras 3 y 4) sobre la expresión Tat. Vía proteasómica de la ubiquitina. La vía proteasómica es el principal sistema proteolítico de células eucariotas [103]. Es importante destacar que la vía ubiquitina-proteasoma nuclear controla el suministro de proteínas ribosomales y es importante para la biogénesis ribosoma [104, 105]. El proteasoma 26S está compuesto por la partícula núcleo 20S (CP) y la partícula reguladora 19S (RP). Alternativamente, CP puede asociarse con el 11S RP para formar el inmunoproteasoma. Todas las proteínas cuantificadas en nuestro estudio son parte del complejo regulador 19S e incluyen PSMD2 (1,5 veces), PSMD3 (1,32 veces), PSMD11 (1,25 veces) y PSMD13 (0,72 veces), el único componente proteasoma significativamente agotado del nucleolo en presencia de Tat (Figura 4). Curiosamente, Tat interactúa con subunidades distintas del sistema proteasoma, incluyendo las subunidades 19S, 20S y 11S. Las consecuencias de estas interacciones incluyen la competencia de Tat con 11S RP o 19S RP para la unión al 20S CP, que resultó en la inhibición de la actividad de la peptidasa 20S [106, 107, 108, 109, 110, 111]. Además, Tat demostró modificar la composición proteosoma y la actividad, que afecta a la generación de antígenos péptidos reconocidos por linfocitos T citotóxicos [112]. Importantemente, un estudio reciente demostró que en ausencia de Tat, los componentes proteosomas están asociados al promotor del VIH-1 y la actividad proteosoma limita la transcripción [113]. La adición de Tat promovió la disociación de la subunidad 19S del proteasoma 20S, seguido por el enriquecimiento distintivo del complejo similar a 19S en extractos nucleares junto con el reclutamiento mediado por Tat de las subunidades 19S para el promotor del VIH-1, lo que facilitó su elongación transcripcional [113]. También cuantificamos UBA1 (1,36 veces), la ubiquitina-proteína ligasa UHRF1 (1,13 veces), UBC (1 veces) y dos Ubiquitinspecific-peptidases, USP30 (1,28 veces) y USP20 (0,06 veces) (Figura 4). Replicación y reparación del ADN. Tras la expresión del HIV-1 Tat, observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de varios factores celulares asociados con la replicación del ADN y las vías de reparación (Figura 4). Tat indujo el enriquecimiento coordinado del complejo MCM2-7 de mantenimiento cromosómico en miniatura (de 1.23-a 3,30 veces, respectivamente) [114]. MCM7, 6 y 3 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. El mantenimiento estructural de los cromosomas 2, SMC2, fue enriquecido (1,35 veces) en la fracción nucleolar por expresión Tat. SMC2 fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Mientras que el factor de replicación C1 (RFC1) y RFC2 (1,31 y 1,28 veces respectivamente) mostró un cambio de pliegue incrementado y RFC5/3 no se vieron afectados, RFC4 se redujo gravemente (0,69 veces) de la fracción nucleolar sobre la expresión Tat [115]. El RFC1 y RFC2 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Tat indujo el enriquecimiento de XRCC6 (1,27 veces) y XRCC5 (1,36 veces) en el nucleolo, que están involucrados en la reparación de la unión final del ADN no-homologoso (NHEJ) [116]. XRCC6 se asocia con complejos de preintegración viral que contienen HIV-1 Integrase y también interactúan con Tat y TAR [117, 118, 119]. Además, en una pantalla basada en ribozyme, el derribo del XRCC5 (Ku80) disminuyó tanto la integración retroviral como la transcripción Tatmediated [120]. Como parte de la reparación de la escisión base (BER), hemos identificado una importante endonucleasa apurínico/apirimidinica 1 (APEX1) (1,29 veces). Importantemente, en una pantalla de siRNA dirigida a los factores de reparación del ADN, se encontró que la reducción de APEX1 inhibe la infección por VIH-1 por más de 60% [121]. La proteína del grupo de alta movilidad (HMG) HMGA1 (1,30 veces), fue enriquecida en el nucleolo después de la expresión Tat [122]. HMGA1 interactúa con la integración del VIH-1 y forma parte del complejo de preintegración del VIH-1 [123, 124]. Importantemente, HMGA1 ha sido identificada en una pantalla proteómica, como un cofactor celular que interactúa con el VIH-1 59líder [125]. Metabolismo. Nuestros datos proteómicos sugieren que Tat induce perturbaciones en la glucólisis, la vía del fosfato pentosa y la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos (Figura 4 y Figura S7 ). En particular, en las células T que expresan Tat, detectamos cambios coordinados en la abundancia de proteínas no conocidas previamente que se asocian con la patogénesis del Tat, que revelaron conexiones inesperadas con la glicólisis y la vía del fosfato pentosa, incluyendo las siguientes enzimas glicólicas, lactato deshidrogenasa B (LDHB) (1,37 veces), la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1,17 veces) y la mutasa del ácido fosfoglicérico (PGAM1) (0,89 veces) (Figura 4 y Figura S En resumen, el GPI cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Posteriormente, el PFKP cataliza la conversión irreversible de fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato y es una enzima reguladora clave de la glucólisis. Al final de la vía glicolítica, PKM2, en su forma tetramérica, se sabe que genera ATP y piruvato, mientras que el LDHB desvía la mayoría del piruvato a la producción y regeneración de lactato de NAD+ en apoyo a la glicólisis continua, un fenómeno descrito para las células T proliferativas [126]. Esto regula la disponibilidad de los intermedios de glucosa, que se redirigen a las vías de la pentosa fosfato y de la serina biosíntesis para la producción de precursores biosintéticos de nucleótidos, fosfolípidos y aminoácidos. Como parte de la vía del fosfato de pentosa, hemos caracterizado el enriquecimiento significativo de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) (2,11 veces), que ramas de la vía de la glicólisis para generar NADPH, ribosa-5fosfato un precursor importante para la síntesis de nucleótidos. Consistente con esto, detectamos el aumento coordinado en la abundancia de enzimas que juega un papel central en la síntesis de purinas y pirimidinas. Más específicamente, IMPDH2 (1,66 veces), una enzima limitante de la tasa en el punto de rama de la biosíntesis de nucleótidos de purina, que conduce a la generación de nucleótidos de guanina, fosforibosil pirofosfato sintetasa 2 (PRPS2) (1,41 veces), cytidine-5-prime-trifosfato sintetasa (CTPS) (1,74 veces) que cataliza la conversión de UTP a CTP y la subunidad grande de ribonucleótido reductasa (RRM1) (1,56 veces). En parralel, observamos el aumento de la abundancia de la fosfoserina aminotransferasa PSAT1 (1,90 veces), una enzima implicada en la biosíntesis de serina, que se ha relacionado con la proliferación celular in vitro. La interfaz host-virus es un aspecto fundamental en la definición de la patogénesis molecular del VIH-1 [127, 128, 129, 130, 131, 132, 133]. De hecho, con su repertorio limitado de proteínas virales, el VIH-1 se basa ampliamente en la maquinaria de las células huésped para su replicación. Varios estudios recientes han capitalizado los recientes avances en las tecnologías ''OMICS'', y han revelado importantes perspectivas en este diálogo molecular finamente afinado [132, 134]. El VIH-1 Tat es esencial para la replicación viral y orquesta la expresión génica del VIH-1. La proteína reguladora viral es conocida por interactuar con una amplia gama de proteínas celulares y modular la expresión del gen celular y la vía de señalización [135, 136]. Nosotros y otros hemos utilizado enfoques a nivel del sistema para investigar la interacción Tat con la maquinaria de las células de acogida, que han caracterizado al HIV-1 Tat como un mediador crítico de la interfaz host-viral [137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149]. Aquí, hemos investigado el tráfico de proteínas nucleolares en respuesta a la expresión HIV-1 Tat en células T, con el fin de proporcionar ideas únicas y novedosas sobre el papel de la compartimentación de proteínas por Tat en el ajuste fino de la disponibilidad de proteínas y la función. Hemos desarrollado para este estudio, un modelo celular utilizando Jurkat T-cells expresando firmemente Tat fusionado en su N-ternminal a TAP-tag. Jurkat T-cells son robustos y presentan la ventaja de crecer sin estímulos y se transducen fácilmente utilizando Es importante destacar que se han empleado ampliamente para evaluar la patogénesis mediada por Tat utilizando enfoques de todo el sistema y para analizar las vías y funciones de señalización celular clave de las células T [144, 150, 151, 152]. De hecho, hemos encontrado que son especialmente adecuadas para cultivos in vitro prolongados en el medio SILAC y posterior aislamiento de su nucleolo, seguido por el análisis de MS, que requiere hasta 85 millones de células. Fusionamos Tat a la etiqueta TAP para permitir futuras aplicaciones posteriores como purificación de afinidad de Tandem o análisis IP de Cromatina. Importantemente, hemos confirmado que la etiqueta TAP N-terminal no interfirió con la función Tat ni su localización en las células Jurkat, cuando se compara con la no etiquetada-Tat. Aunque se sabe que Tat se acumula en el núcleo y el nucleolo en las células de Jurkat y otras líneas celulares transformadas, en las células T primarias, Tat se describe para acumularse principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Estas diferencias permanecen por caracterizarse, pero podrían estar relacionadas con diferentes niveles de expresión de los factores de transporte en las líneas celulares transformadas versus las células primarias, como se describe recientemente por Kuusisto et al. [39]. Además, Stauber y Pavlakis han sugerido que la localización nucleolar Tat podría ser el resultado de la sobreexpresión Tat [31]. Aquí, hemos seleccionado y empleado una población policlonal de células T Jurkat que expresan Tat en diferentes niveles. Proponemos que esta heterogeneidad en los niveles de expresión Tat podría reflejar la expresión estocástica Ta Utilizando una estrategia proteómica cuantitativa basada en un enfoque organélaro, cuantificamos más de 520 proteínas nucleolares, incluyendo 49 proteínas que muestran un cambio significativo en el pliegue. La medida en que las variaciones inducidas en la abundancia de proteínas nucleolares son biológicamente relevantes y pueden afectar los procesos celulares y/o virales queda por determinar. Sin embargo, la naturaleza biológica de las vías y los complejos macromoleculares afectados nos permiten discutir sus posibles asociaciones con la patogénesis del VIH-1. El VIH-1 Tat se expresa tempranamente después de la integración del genoma del VIH-1 y media el cambio a la fase de producción viral, asociado con la expresión génica proviral robusta, el ensamblaje de proteínas virales y, en última instancia, el surgimiento y liberación de viriones. En este contexto y basado en nuestros resultados, proponemos que Tat podría participar en la configuración del entorno intracelular y el perfil metabólico de De hecho, observamos el enriquecimiento nucleolar distinto de proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica, lo que podría ser indicativo de un aumento en la síntesis proteica. Con la notable exepción de RPL35A depleción nucleolar, proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica estaban en las 20 proteínas nucleolares más enriquecidas (NHP2L1, RLP14, RPL17, RPL27, RPS2, RPL13). Además, este efecto parece ser específico del HIV-1 Tat ya que la inhibición de transcripción por Actinomicina D resultó en el agotamiento total de proteínas ribosómicas en el nucleolo [9]. Además, el análisis proteómico cuantitativo de las células nucleas en adenovirus infectados mostró una leve disminución en proteínas ribosómicas [24] Si esto refleja un cambio en la biogénesis del ribosoma y/o un cambio en la composición de las subunidades ribosomales queda por determinar. Sin embargo, la necesidad adaptada de una producción elevada del ribosoma es intuitiva para un sistema que necesita apoyar la creciente demanda de nueva síntesis de proteínas virales. En parralel, observamos la modulación concordante de las vías que regulan la homeostasis proteica. Observamos la significativa acumulación nucleolar de múltiples chaperonas moleculares incluyendo las HSPs, el complejo TCP-1, y moléculas CANX/CALR y la abundancia nucleolar interrumpida de proteínas pertenecientes a la vía ubiquitina-proteasoma, que controla el suministro de proteínas ribosomales [104, 105]. Estas observaciones apoyan estudios previos que describen la modulación de la actividad proteasómica por Tat, que afectan a la expresión, el montaje y la localización de subunidades específicas de los complejos proteasómicos [106, 107, 108, 109, 110, 111, 113]. También observamos el agotamiento concomitante de CASP10 en el nucleolo de Jurkat TAP-Tat. Se ha sugerido que CASP10 podría estar dirigido al nucleolo para inhibir la síntesis proteica [154]. Curiosamente, la presencia y los papeles potenciales de las chaperonas moleculares en el nucleolo han sido destacados por Banski et al, quienes explican cómo la red chaperona podría regular la biogénesis ribosoma, la señalización celular y la respuesta al estrés [97, 155]. A medida que la producción viral avanza hacia la fase tardía y aumenta el estrés celular, el enriquecimiento nucleolar de las chaperonas moleculares por Tat no sólo podría permitir el plegado de adequat de proteínas virales recién sintetizadas, sino que también podría promover la tolerancia de las células infectadas al estrés y mantener la viabilidad celular. Coincidentemente, observamos el marcado enriquecimiento nucleolar de enzimas pertenecientes a vías metabólicas incluyendo glicólisis, fosfato de pentosa, nucleótido y aminoácidos vías biosintéticas. Del mismo modo, estas vías se elevan en células T proliferativas o en células cancerosas después de un cambio metabólico a la glicólisis aeróbica, también conocido como el efecto Warburg [156, 157, 158, 159]. Allí, los intermedios de glucosa de la vía de la glicólisis no sólo se comprometen a la producción de energía y se descomponen en piruvato para el ciclo TCA, sino que se redirigen a vías alternativas, incluyendo la vía del fosfato de pentosa, y se utilizan como precursores metabólicos para producir nucleótidos, aminoácidos, acetil CoA y NADPH para la homeostasis redox. De manera consistente, también se observó el enriquecimiento nucleolar concomitante de enzimas pertenecientes a la vía de síntesis de nucleótidos, incluyendo IMPH2, una enzima limitante conocida para controlar el pool de GTP. De igual manera, se observó el enriquecimiento nucleolar de PSAT1, una enzima involucrada en el metabolismo de serina y treonina, que está asociada con la proliferación celular [160]. Colectivamente, proponemos que mediante el control de la homeostas Sin embargo, las enzimas glucolíticas han sido detectadas en las fracciones nuclear y nucleolar mediante análisis proteómicos [8, 161]. Además, las enzimas glucolíticas, como PKM2, LDH, fosfoglicerato cinasa, GAPDH y aldosa, también han sido reportadas para mostrar localización nuclear y unirse al ADN [162]. Más específicamente, PKM2 es conocido por asociarse con el promotor y participar en la regulación de la expresión génica como coactivador transcripcional [163]. HIV-1 Tat ha sido descrito previamente como un inmunoregulador y más específicamente, ha sido reportado tanto para inhibir o promover la señalización TCR [164]. Hemos observado el enriquecimiento nucleolar por Tat de componentes proximales o aguas abajo clave de las vías de señalización de células T, incluyendo ZAP70, ILF3 y STAT3, que juegan un papel crucial en el desarrollo y activación de células T. Anteriormente los habíamos identificado como componentes específicos de células T del nucleolo, y los estudios de IF sugirieron que su asociación con el nucleolo podría ser regulada por condiciones específicas [165]. Nuestros resultados apoyan aún más que Tat podría contribuir a la disregulación de las señales derivadas de TCR y que el nucleolo podría representar un importante enlace espacial para las moléculas de señalización TCR. Observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de componentes clave de las vías de replicación, recombinación y reparación del ADN por Tat. Estos incluyen XRCC5 y XRCC6, HMGA1, APEX1, MCM2-7, SMC2, RFC1 y RFC2, mientras que RFC4 se encontró significativamente agotado. Curiosamente, estos cofactores se han asociado con la eficiencia de la integración del ADN retroviral en el ADN del huésped o la integridad del provirus integrado [166]. Si la abundancia creciente de estos factores dentro del nucleolo podría estar asociada con su participación potencial en la integración y mantenimiento de la integridad del gen provirus, queda por determinar. Los mecanismos de segregación mediada por Tat y compartimentación de proteínas dentro o fuera del nucleolo pueden depender de factores inherentes para cada proteína y la naturaleza de su relación con Tat, ya que el fraccionamiento subcelular combinado con el análisis del WB mostró que el patrón y el grado de redistribución subcelular entre proteínas variaban. Pudimos observar casos en los que Tat regulaba la expresión de proteínas que resultaban en un aumento general de estas proteínas en los compartimentos celulares incluyendo el nucleolo (DDX3, TNPO1). Alternativamente, Tat podía desencadenar la translocación nucleolar de proteínas directamente desde el citoplasma o el nucleoplasma (pRb). Además, observamos proteínas citoplasmáticas redistribuidas tanto al nucleoplasma como al nucleolo sobre la expresión Tat (STAT3, ZAP70 y HSP90). Finalmente, también notamos el agotamiento proteico en la fracción nucleolar acompañado de un aumento en el nucleoplasma (SSRP1). Sigue siendo difícil en esta etapa, apreciar si la acumulación de proteínas específicas resultaría en su activación o inhibición al secuestrarlas de su lugar de acción. Por el contrario, el agotamiento de una proteína del nucleolus podría resultar en la regulación descendente de su actividad en este lugar o podría ser el resultado de su movilización desde su sitio de almacenamiento, el nucleolus, al nucleoplasma o citoplasma donde puede realizar su función. Cabe destacar que identificamos a varios socios conocidos del VIH-1 Tat involucrados en la patogénesis del VIH-1, lo que sugiere que Tat podría modular físicamente su objetivo nucleolar o su reclutamiento a un sitio específico en el nucleoplasma o citoplasma. Tat también podría promover modificaciones post-traducción, lo que podría mediar la focalización de proteínas específicas al nucleolus. Esto se ilustra por las siguientes proteínas enriquecidas, pRb, PP1 y STAT3, para lo que la fosforilación es inducida por Tat. Importantemente, su estado de fosforilación determina su distribución subcelular, proporcionando así un mecanismo Además, nuestros datos indican que las serinas/treoninas quinasas (CK2 a') y fosfatasas (PP1) se enriquecieron significativamente en las fracciones nucleolares de Jurkat TAP-Tat. Estas enzimas representan la mayor parte de la actividad de fosforilación/desfosforilación en el nucleolo y pueden actuar como reguladores del tráfico de proteínas nucleolares. Además, Tat disminuyó significativamente los niveles de SUMO-2 en el nucleolo. Del mismo modo, se sabe que las modificaciones posteriores a la traducción mediadas por SUMO modulan la localización de proteínas nucleolares [104]. Dada la importancia potencial de las modificaciones posteriores a la traducción, incluida la fosforilación en el cambio mediado por Tat de la abundancia de proteínas nucleolares, un enfoque proteomico más específico como el enriquecimiento de fosfopétidos El control de la rotación de proteínas también es un medio importante para modular la abundancia de proteínas nucleolares. Las proteínas ribosómicas son degradadas por la vía Ubiquitina-Proteasoma para asegurar que su abundancia coincida con los niveles de transcripción de rRNA. A la inversa, las proteínas de choque térmico HSP90s las protegen de la degradación. Curiosamente, nuestros datos muestran que la modulación Tat de las proteínas de abundancia asociadas con la vía Ubiquitina-proteasoma y choque térmico. Esto podría contribuir al enriquecimiento observado de proteínas ribosómicas por Tat. Sin embargo, no podemos excluir que la mayor abundancia de proteínas ribosómicas en el nucleolo podría ser el resultado de la prevención mediada por Tat de su exportación al citoplasma. Curiosamente, utilizando un sistema celular diferente, una cepa transgénica de Drosophila melanogaster Tat, Ponti et al, analizaron los efectos de Tat en la biogénesis ribosoma, después de 3 días de tratamiento de choque térmico para inducir la expresión Tat bajo el control del promotor hsp70 [167]. Después de la expresión Tat, observaron un defecto en el procesamiento pre-rRNA asociado con una disminución en el nivel de 80S ribosomas [167]. Sin embargo, los diferentes sistemas celulares empleados combinados con la inducción de choque térmico de 3 días hacen que sus resultados sean difíciles de comparar con los nuestros. Mientras que estudios anteriores a nivel de sistema han monitoreado los efectos de la expresión Tat del VIH-1 en las células T, a nuestro conocimiento, hemos presentado aquí el primer análisis proteómico de la composición dinámica del nucleolus en respuesta a la expresión Tat del VIH Utilizando proteómica cuantitativa, hemos subrayado los cambios en la abundancia de proteínas nucleolares específicas y hemos destacado la reorganización nucleolar extensa y coordinada en respuesta a la expresión constitutiva Tat. Nuestros hallazgos subrayan que Tat que expresa células T exhiben un perfil proteómico nucleolar único, que puede reflejar una estrategia viral para facilitar la progresión a la producción viral robusta. Importantemente, hemos notado la relación funcional de proteínas nucleolares de nuestro conjunto de datos con la patogénesis VIH-1 y el Tat VIH-1 en particular. Esto aumenta aún más nuestra confianza en nuestra estrategia experimental y sugiere un papel para Tat en el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares. Finalmente, nuestro estudio proporciona nuevas ideas sobre la importancia de Tat en la conversación cruzada entre funciones nucleolares y patogénesis viral. También hemos identificado cambios en la abundancia de proteínas nucleolares que no estaban previamente asociados con la patogénesis del VIH-1, incluyendo proteínas asociadas a vías metabólicas, que proporcionan nuevos objetivos potenciales y vías celulares para la intervención terapéutica.Células T Jurkat, clon E6.1 (ATCC), Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP se mantuvieron en el medio RPMI-1640 complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (Gibco, aprobado por la UE), y antibióticos. Células Phoenix-GP (G.P. Nolan; www.stanford.edu/ group/nolan/), se mantuvieron en el medio DMEM complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (GIBCO, aprobado por la UE). La secuencia de HIV-1 Tat (VIH-1 HXB2, 86 aminoácidos) fue subclonada en el vector pENTR 2B (Invitrogen, A10463). Usando la tecnología Gateway (Invitrogen), introdujimos la secuencia HIV-1 Tat en el plásmido pCeMM-NTAP(GS)-Gw [168]. Las células Fénix (G.P. Nolan; www.stanford.edu/group/nolan/), fueron transfectadas usando Fugene 6 (Roche) con 5 mg del plásmido NTAP-Tat o NTAP y 3 mg del pMDG-VSVG. Los sobrenadantes virales fueron recolectados después de 48 h, filtrados y utilizados para transducir las líneas celulares de Jurkat. La construcción se denomina NTAP-Ta Utilizando la entrega de genes retrovirales, transferimos de forma estable células Jurkat (clone E6.1 (ATCC)). Los clones positivos llamados Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron ordenados para enriquecer la población de células que expresaban GFP usando el clasificador de células BC MoFlo XDP (Beckman Coulter). Las fracciones subcelulares (10 mg) fueron resueltas por SDS-PAGE y transferidas a membranas BioTrace PVDF (Pall corporation). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: a-Tubulina (Sc 5286), C23 (Sc 6013), y Fibrilarina (Sc 25397) de Santa Cruz Biotechnology, y PARP (AM30) de Calbiochem, Ratón anti-ZAP 70 (05-253, Millipore), Ratón anti-STAT3 (06-596, Millipore), Ratón anti-ILF3 (ab92355, Abcam), Ratón anti-HSP90 beta (ab32568, Abcam), Ratón anti-ADAR1 (ab88574, Abcam), Ratón anti-HDAC1 (ab19845, Abcam), Ratón anti-SSRP1 (ab21584, Abcam) conejo anti-BOP1 (ab86982, Abcam), Ratón anti-KpNB1 (ab10303, Abcam), Ra Para el análisis SILAC-RPMI R0K0 y SILAC-RPMI R6K6 (Células Dundidas) se utilizó un medio con un 10% de FBS dializado (GIBCO, 26400-036); las células Jurkat que expresaban NTAP-Tat y NTAP fueron transitadas en serie y cultivadas durante cinco duplicados para asegurar la incorporación completa de los aminoácidos marcados; la viabilidad de las células se verificó con Trypan Blue (0,4% solución, SIGMA) y posteriormente se confirmó mediante tinción IP y análisis FACS; las células se mezclaron a la relación 1:1 para obtener 140610 6 células; los nucleoli fueron aislados de la población celular mixta como se describió previamente en Jarboui et al., [165]. Los extractos nucleolares (100 mg) fueron resuspendidos en bicarbonato de amonio de 50 mM y en solución de tripsina digerida como se describió previamente en Jarboui y col. [165]. La muestra se realizó en un espectrómetro de masa termoscientifico LTQ Orbitrap XL conectado a un sistema cromatógrafo NANO LC.1DPLUS que incorporaba una muestra automática. La muestra fue cargada en una columna Biobasic C18 PicofritTM (100 mm de longitud, 75 mm ID) y fue separada por un gradiente de acetonitrilo en aumento, utilizando un gradiente de 142 min de fase inversa (0-40% de acetonitrilo durante 110 min) a un caudal de 300 nL min-1. El espectrómetro de masa fue operado en modo iónico positivo con una temperatura capilar de 200uC, una tensión capilar de 46V, una tensión de lente de tubo de 140V y con un potencial de 1800V aplicada al frit. Todos los datos fueron adquiridos con el espectrómetro de masa que funciona en modo de conmutación automática dependiente de datos. Se realizó una exploración MS de alta resolución utilizando el Orbitrap para seleccionar los 5 iones más intensos antes del análisis MS/MS utilizando la trampa Ion. La eficiencia de incorporación de aminoácidos etiquetados fue determinada mediante el análisis de los péptidos identificados en nucleoli aislados de la población celular mantenida en el medio 'Heavy' como se describe en [169]. Nuestro análisis mostró que teníamos una eficiencia de incorporación.95% (datos no mostrados). Los espectros MS/MS fueron buscados para la identificación y cuantificación de los péptidos utilizando el software MaxQuant [170] (versión 1.1.1.36), la Base de Datos del IPI Humano (versión 3.83) y el motor de búsqueda Andrómeda asociado a MaxQuant [171]. Se utilizaron parámetros estándar para MaxQuant con el Acetil (término N de Proteína) como modificación variable y Carbamidometilo (Cys) como modificación fija, se permitieron 2 escisiónes perdidas, excepto que se prohibió el filtrado de aminoácidos etiquetados. La desviación de masa inicial de los iones precursores y fragmentos fue de 7 ppm y 0,5 Da, respectivamente. Cada relación proteica fue calculada como promedio ponderado de intensidad de los coeficientes de péptidos individuales. Las proteínas fueron identificadas con el mínimo de un péptido con una tasa La ontología genética, la vía KEGG y los términos Pfam se extrajeron de entradas UNIPROT utilizando Perseo, un software del paquete de análisis de datos MaxQuant (http://www.maxquant.org ), y las herramientas de la suite ToppGene [54]. El Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron transfectados utilizando el sistema de electroporación Amaxa (biosistema Amaxa) con el pGL3 (pGL3-LTR) (Promega) como recomendado por Amaxa Biosystem. Los ensayos de doble luciferasa (Promega) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de Luciferasa se midió y normalizó contra la cantidad total de proteínas cuantificada por el kit de cuantificación de proteínas BCA (Pierce, Thermo Scientific). Para preservar Las células se fijaron en un 2% PFA durante 10 minutos en RT, permeabilizaron en un 0,5% Triton X-100 durante 15 minutos en RT y se bloquearon con 5% FCS. Las células se incubaron con el anticuerpo Tat VIH-1 de conejo (ab43014, Abcam) seguido por el anticuerpo secundario anti-Rabbit alexa fluor 647 (A-21246, Invitrogen). Las células se les permitió unirse a Cell-Tak (BD) recubierto de Diapositivas Silanizadas (DaoCytomation), y manchado con DAPI. Las imágenes se capturaron con un Microscopio Confocal Carl Zeiss equipado con un objetivo DIC de aceite de Plan-Apocromat 63X/14. El archivo de datos RAW proteómicos del análisis de espectrometría de masas se depositó en el repositorio Tranche(http El archivo se puede acceder y descargar utilizando la siguiente clave de hash:(R3O5SV5Z6HvWqrBNDhp21tXFetluDWYxvwMIfU-h6e1kMgarauCSq4dlNcxeUvFOHDEzLeDcg4X5Y8reSb6-MUA6wM1kIAAAAAAB/w = ). Materiales y Métodos S1 Descripción de los métodos empleados para examinar el ciclo celular, la viabilidad celular y el análisis de proliferación celular. (DOCX)

¿A dónde se mueve la proteína Tat en las células?

Tráfico de proteínas nucleolares en respuesta al VIH-1 Tat: Rewiring the Nucleolushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499507/SHA: efa871aeaf22cbd0ce30e8bd1cb3d1afff2a98f9Autores: Jarboui, Mohamed Ali; Bidoia, Carlo; Woods, Elena; Roe, Barbara; Wynne, Kieran; Elia, Giuliano; Hall, William W.; Gautier, Virginie W.Fecha: 2012-11-15DOI: 10.1371/journal.pone.0048702Licencia: cc-byAbstract: La proteína Tat transactivante es una proteína reguladora viral esencial para la replicación del VIH-1. El nucleolo, un compartimento subnuclear altamente dinámico y estructurado sin membrana, es el sitio de ARNr y biogénesis ribosoma y está involucrado en numerosas funciones celulares incluyendo la regulación transcripcional, el control del ciclo celular y la infección viral. Importantemente, el tráfico nucleolar transitorio tanto de Tat como de las transcripciones virales del VIH-1 son críticos en la replicación del VIH-1, sin embargo, el(los) papel(es) del nucleolo en la replicación del VIH-1 sigue sin estar claro. Para entender mejor cómo la interacción de Tat con la maquinaria nucleolar contribuye a la patogénesis del VIH-1, investigamos los cambios cuantitativos en la composición del proteoma nucleolar de las células T de Jurkat que expresan establemente el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta TAP. Utilizando un enfoque proteómico organélaro basado en espectrometría de masas, junto con el etiquetado de isótopos estables en cultivo celular (SILAC), cuantificamos 520 proteínas, incluyendo 49 proteínas que muestran cambios significativos en la abundancia de nucleolos de células T de Jurkat sobre la expresión Tat. Numerosas proteínas que exhiben un cambio de pliegue fueron interactuadores Tat bien caracterizados y/o conocidos por ser críticos para la replicación del VIH-1. Esto sugiere que el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares por Tat proporcionan una capa adicional de control para regular la maquinaria celular involucrada en la patogénesis del VIH-1. El análisis del camino y la reconstrucción de la red revelaron que la expresión Tat resultó específicamente en el enriquecimiento nucleolar de proteínas que participan colectivamente en biogénesis ribosomal, homeostasis de proteínas, vías metabólicas incluyendo glucolítico, fosfato de pentosa, nucleótidos y aminoácidos vías biosintéticas, respuesta al estrés, vías de señalización de células T e integridad del genoma. Presentamos aquí el primer perfil diferencial del proteoma nucleolar de células T que expresan el HIV-1 Tat. Discutimos cómo estas proteínas participan colectivamente en redes interconectadas que convergen para adaptar las actividades dinámicas del nucleolus, que favorecen las actividades biosintéticas del huésped y pueden contribuir a crear un entorno celular que apoye la producción robusta del HIV-1. Texto: El nucleolus es un compartimento subnuclear altamente ordenado organizado alrededor de loci genéticos llamados regiones organizadoras nucleolares (NORs) formado por grupos de cientos de repeticiones de genes rDNA organizadas en repetición tándem cabeza a cola [1, 2]. Organelo sin membrana descrito originalmente como la ''Fábrica Ribosoma'', el nucleolus está dedicado a la transcripción de rDNA dirigida por ARN-polimerasa-I, procesamiento de rARN mediado por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (SORNPs) y conjunto ribosoma. La biogénesis del ribosoma es esencial para la síntesis de proteínas y la viabilidad celular [2] y, en última instancia, resulta en las subunidades ribosomales grandes (60S) y pequeñas (40S), que posteriormente se exportan al citoplasma. Este proceso celular fundamental, al que la célula dedica la mayor parte de sus recursos energéticos, está estrictamente regulado para adaptarse a los cambios dinámicos en la proliferación celular, la tasa de crecimiento y las actividades metabólicas [3]. El nucleolus es el sitio de procesamiento adicional de ARN, incluyendo la exportación y degradación de ARNm, la maduración de pequeños PNNR nucleares ricos en uridina (U snRNPs), que forman el núcleo del spliceosoma, biogénesis de ARNt y microARNs (miRNAs) [4]. El nucleolus también está involucrado en otros procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular, procesos oncogénicos, respuestas de estrés celular y traducción [4]. El concepto de nucleolo multifuncional y altamente dinámico ha sido corroborado por varios estudios que combinan enfoques proteómicos organelares y espectrometría cuantitativa de masas, y describen miles de proteínas que transitan por el nucleolo en respuesta a diversas condiciones metabólicas, estrés y ambientes celulares [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Colectivamente, los estudios mencionados representan hitos en la comprensión de la complejidad funcional del nucleolo, y demostraron que las proteínas nucleolares están en intercambio continuo con otros compartimentos nucleares y celulares en respuesta a determinadas condiciones celulares. Los estudios proteómicos que analizan los nucleoli de las células infectadas por el virus sincitial respiratorio humano (HRSV), el virus influenza A, el virus de la bronquitis infecciosa por coronavirus aviar (IBV) o el adenovirus destacaron cómo los virus pueden alterar de forma distintiva la distribución de proteínas nucleolares [2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Curiosamente, tanto las proteínas reguladoras del VIH-1 Tat como Rev localizan al nucleoplasma y al nucleolus. Ambas secuencias abarcan una señal de localización nucleolar (NoLS) que se superpone con su señal de localización nuclear (NLS), que rige su localización nucleolar [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. Además, Tat y Rev interactúan con el antígeno nucleolar B23 Sin embargo, un estudio reciente describió que en contraste con las células T de Jurkat y otras líneas celulares transformadas donde Tat está asociado con el núcleo y el nucleolo, en las células T primarias Tat se acumula principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Mientras que la regulación de su importación y/o exportación nuclear activa, como mediada por la familia de la carioferina/importación, se han descrito bien, los mecanismos que distribuyen Tat y Rev entre el citoplasma, el nucleoplasma y el nucleolo siguen siendo elusivos [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48]. Importantemente, dos estudios importantes de Machienzi y otros han revelado importantes vínculos funcionales entre la replicación del VIH-1 y el nucleo En primer lugar, podrían inhibir la replicación del VIH-1 y la función de transactivación Tat empleando un señuelo TAR dirigido específicamente al nucleolo. Además, utilizando un enfoque similar, con una ribozima anti-VIH-1 de cabeza martillo fusionada al ARN nucleolar pequeño U16 y por lo tanto dirigida al nucleolo, podrían suprimir dramáticamente la replicación del VIH-1. Colectivamente, estos hallazgos sugieren fuertemente que las transcripciones del VIH-1 y el tráfico nucleolar Tat son críticos para la replicación del VIH-1. Sin embargo, la naturaleza de estas contribuciones aún no se ha aclarado. En este informe, analizamos sistemáticamente las perturbaciones del proteoma nucleolar que ocurren en las células T de Jurkat expresando constitutivamente el VIH-1 Tat, utilizando un enfoque de espectrometría cuantitativa de masas. Después de la anotación detallada de los cambios cuantitativos de abundancia en la composición de la proteína nucleolar sobre la expresión Tat, nos centramos en los complejos celulares afectados por Tat y las vías de señalización asociadas con la biogénesis ribosoma, el spliceosoma, las chaperonas moleculares, la replicación y reparación del ADN y el metabolismo, y discutimos su posible implicación en la patogénesis del VIH-1. En este estudio, investigamos los cambios cuantitativos en el proteoma nucleolar de las células Jurkat T expresando constitutivamente el VIH-1 Tat (86aa) frente a su contraparte Tat negativo, utilizando el etiquetado estable de isótopos con aminoácidos en la tecnología de cultivo celular (SILAC), seguido por la espectrometría de masas en tándem ESI e implementamos el enfoque experimental descrito en la Figura 1A. En primer lugar, mediante la entrega de genes retrovirales, transferimos el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta de purificación de afinidad tándem (TAP) (constituido por dos proteínas G y un péptido de unión a estreptavidina) o TAP solo (vector de control) en el clon de células T de leucemia Jurkat E6-1 y clasificamos las células transducidas (GFP positivo) por FACS. Esto resultó en una población altamente enriquecida de células transducidas policlonales que presentaban diferentes niveles de expresión del transgén (Figura 1B). La funcionalidad del TAP-Tat fue confirmada mediante la transfección de las células TAP-Tat y TAP con un vector de genes reportero de luciferasa bajo el control del HIV-1 LTR (pGL3-LTR) [36]. Para abordar la funcionalidad de Tat fusionado a TAP, comparamos Jurkat TAP-Tat con Jurkat-tat, una línea celular que expresaba establemente Tat [51]. Ambas líneas celulares mostraron una actividad LTR del VIH-1 comparable después de la transfección con pGL3-LTR (Figura S1 ). A continuación, la expresión Tat y la localización subcelular fueron verificadas mediante fraccionamiento subcelular seguido por el análisis del WB (Figura 1E ). TAP-Tat mostró una localización nuclear/nucleolar prominente, pero también se pudo detectar en el citoplasma. Estas observaciones fueron además validadas mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 1E ). A continuación se comparó la tasa de crecimiento y proliferación de las líneas celulares de Jurkat TAP y TAP-Tat (Materiales y Métodos S1), que eran equivalentes (Figura S4A ). Del mismo modo, el análisis FACS confirmó que las poblaciones relativas en G1, S y G2/M eran similares para las células de Jurkat TAP-Tat y TAP (Figura S4B ). Se etiquetaron las células de Jurkat TAP-Tat y Jurkat TAP con isótopo ligero (R0K0) y pesado (R6K6) que contenían arginina y lisina, respectivamente. Después de cinco pasajes en su respectivo medio SILAC, se recolectaron 85 millones de células de cada cultivo, se agruparon y se aislaron sus nucleolis como se describió previamente (Figura 1A ) [52] Para evaluar la calidad de nuestro procedimiento de fraccionamiento, se investigó el enriquecimiento específico de antígenos nucleolares conocidos mediante el análisis Western Blot (Figura 1D). Se encontró que la nucleolina (110 kDa) y la fibrilarina (FBL) (34 kDa), dos proteínas nucleolares principales conocidas por localizar al componente granular del nucleolo, estaban muy enriquecidas en la fracción nucleolar mixta. Se observó que la nucleolina se distribuía igualmente entre las fracciones nuclear y citoplasmática. Este patrón de distribución de nucleolina parece ser específico para las células T de Jurkat, como se muestra anteriormente [52, 53]. La proteína nuclear PARP-1 (Poly ADPribose polimerasa 1) (113 kDa) estaba presente en la fracción nuclear y nucleoplasmática, pero se desplegó en la fracción La alfa-tubulina (50 kDa) fue altamente abundante en la fracción citoplasmática y débilmente detectada en las fracciones nucleares. Colectivamente, estos resultados confirmaron que nuestros métodos produjeron una fracción nucleolar altamente enriquecida sin contaminación cruzada significativa. Posteriormente, la mezcla de proteína nucleolar fue tripsindigerida y los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas. El análisis proteomico cuantitativo comparativo se realizó utilizando MaxQuant para analizar las proporciones en isótopos para cada péptido identificado. Se cuantificó un total de 2427 péptidos, representando 520 proteínas nucleolares cuantificadas. La lista completa anotada de proteínas nucleolares cuantificadas está disponible en la Tabla S1 y los datos brutos del análisis de espectrometría de masas se depositaron en la base de datos de repositorios Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/), a la que se puede acceder utilizando las claves de hash descritas en materiales y métodos. Anotamos las proteínas cuantificadas utilizando las herramientas ToppGene Suite [54] y extrajimos las anotaciones de Gene Onthology (GO) e InterPro [55]. El análisis de los procesos biológicos GO (Figura 1F ) reveló que los procesos biológicos mejor representados incluían la transcripción (24%), el procesamiento de ARN (23%), el proceso del ciclo celular (13%) y la organización cromosómica (15%), que refleja las funciones asociadas nucleolares y es comparable a nuestra caracterización anterior del proteoma nucleo El análisis de distribución subcelular (Figura 1F ) reveló que nuestro conjunto de datos contenía proteínas conocidas por localizarse en el nucleolo (49%), en el núcleo (24%) mientras que el 15% de las proteínas estaban descritas previamente para residir exclusivamente en el citoplasma. La distribución subcelular fue similar a nuestro análisis anterior del proteoma nucleolar de células T de Jurkat [52]. Tabla S1. La distribución de las relaciones proteicas se representan en la Figura 1G como log 2 (cambio de abundancia). Las relaciones SILAC indican cambios en la abundancia proteica en la fracción nucleolar de las células TAP de Jurkat en comparación con las células TAP de Jurkat. La distribución de las proteínas cuantificadas siguió una distribución gaussiana (Figura 1G ). Un total de 49 proteínas nucleolares exhibieron un cambio significativo de 1,5 veces o mayor Las células no mostraron cambios en el contenido en estado estacionario de algunos de los principales y abundantes componentes del nucleolo, incluyendo nucleofosfmina (NPM1/ B23), C23, FBL, proteína nucleolar P120 (NOL1) y proteína nucleolar 5A (NOL5A). Las distintas proporciones de cambios proteicos sobre la expresión Tat podrían reflejar la reorganización nucleolar específica y las actividades alteradas del nucleolo. Realizamos el análisis del WB para validar los resultados basados en SILAC obtenidos por nuestro enfoque proteómico cuantitativo (Figura 2 ). 15 proteínas seleccionadas mostraron intensidad diferencial en las fracciones nucleolares sobre la expresión Tat, incluyendo 9 enriquecidos (HSP90b, STAT3, pRb, CK2a, CK2a', HSP90a, Transportin, ZAP70, DDX3), y 3 agotados (ILF3, BOP1 y SSRP1) proteínas. Además, también probamos por el análisis WB, abundancia de proteínas no afectada por la expresión Tat (Importin beta, FBL, B23, C23). Estos resultados destacan la concordancia en la tendencia de las proporciones correspondientes de SILAC, a pesar de algunas diferencias en los rangos cuantitativos. Cabe destacar que, usando WB, pudimos observar un cambio de intensidad para la proteína con un cambio de pliegue SILAC tan bajo como 1,25 veces. Por un lado, el umbral de los cambios en la abundancia de proteínas se puede determinar estadísticamente y luego destacar los cambios en la abundancia más grandes como se ilustra en la Tabla 1. Alternativamente, el enriquecimiento o agotamiento coordinado de la mayoría de las proteínas pertenecientes a un complejo o vía celular distinto permitiría la definición de un grupo de proteínas de interés y potencial significación. Por lo tanto, nos centramos en proteínas individuales enriquecidas o agotadas con actividades asociadas con la patogénesis molecular del VIH-1 o Tat, y en modificaciones agrupadas que afectan vías de señalización celular enteras y complejos macromoleculares. Inicialmente nos centramos en las proteínas de señalización que interactúan con Tat y/o la patogénesis molecular asociada del VIH-1 y cuya abundancia en el nucleolo fue modulada por la expresión Tat. Fosfo-proteína fosfatasas. Fosfo-proteína fosfatasa PP1 y PP2A son esenciales Es importante destacar que el PP1 representa el 80% de la actividad de la fosfatasa Ser/Thr dentro del nucleolo. En nuestro estudio, el PP1 fue potencialmente enriquecido por 1,52 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat, lo que apoya estudios previos que describen el objetivo nuclear y nucleolar de PP1a por el HIV-1 Tat y cómo PP1 aumenta la regulación de la transcripción del VIH-1 [58, 59, 60, 61, 62]. El PP1 c también fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro [63]. Curiosamente, la asociación Tat con los promotores de la subunidad PP2A resulta en la sobreexpresión y regulación de la actividad PP2A en linfocitos [64, 65]. Además, PP2A contribuye a la regulación de la transcripción y replicación del VIH-1 [61, 66]. Retinoblastoma Protein. El gen supresor tumoral pRb protein mostró un cambio de 1,4 veces en el nucleolus sobre la expresión Tat [67]. Además, el análisis WB confirmó la translocación distinta del pRb del nucleoplasma al nucleolus por Tat (Figura 2 ). Dependiendo del tipo de célula, pRb puede ser hiperfosforilado o hipofosforilado sobre la expresión Tat y puede regular negativamente o positivamente la transcripción mediada por Tat respectivamente [68, 69, 70]. Curiosamente, la hiperfosforilación de los desencadenantes del pRB en su translocación en el nucleolo [71]. La fosforilación del pRB también se asocia con un aumento de la biogénesis ribosómica y el crecimiento celular [72]. STAT3. El transductor de señal de factor de transcripción y activador de la transcripción 3 (STAT3) se enriqueció significativamente (1,86 veces) en la fracción nucleolar por la expresión constitutiva Tat. Además, el análisis WB indicó que la expresión Tat podría promover la relocalización del STAT3 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento distinto en el nucleolo (Figura 2). Curiosamente, estudios anteriores han demostrado la activación mediada por Tat de la señalización STAT3, como lo demuestra su estado de fosforilación [73]. Curiosamente, la fosforilación STAT3 indujo la dimerización de la proteína después de su translocación al núcleo [74]. YBX1. YBX1, la proteína multifuncional de unión al ADN/ARN fue enriquecida por 1,38 veces en el nucleolo de las células de Jurkat sobre la expresión Tat. Curiosamente, YBX1 interactúa con Tat y TAR y modula la expresión génica del VIH-1 [63, 75]. ZAP70. La proteína tirosina cinasa ZAP70 (proteína quinasa asociada a la cadena Zeta 70) fue enriquecida por 1,24 veces en el nucleolo de las células de Jurkat expresando Tat [76]. Además, el análisis del WB reveló que la expresión Tat podría promover la relocalización del ZAP70 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento La proteína de matriz nuclear interna, Matrin 3 (MATR3), presentó un cambio de 1,39 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat. Se localiza en el nucleolasmo con un patrón difuso excluido de los nucleolos [77]. La matrin 3 ha sido identificada como parte del nucleoloma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Dos estudios recientes han descrito a la matrin 3 como parte de complejos de ribonucleoproteínas, incluyendo también el VIH-1 Rev y (elemento de respuesta Rev) RRE que contiene ARN VIH-1, y promoviendo la regulación post-transcripción del VIH-1 [78, 79, 80]. CASP10. La molécula pro-apotótica de señalización, Caspasa 10 (CASP10), se agotó significativamente de las células nucleolus de Jurkat-Tat (0,82 veces) [81]. Importantemente, la expresión Tat desregula la expresión y actividad de CASP10 en las células Jurkat [82]. ADAR1. Adenosina deaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR1), que convierte las adenosinas en inosinas en ARN de doble cadena, se agotó significativamente del nucleolus de las células Jurkat-Tat (0,78 veces). Curiosamente, ADAR1 sobreexpresión regula la replicación del VIH-1 a través de un mecanismo de edición del ARN [83, 84, 85, 86, 87, 88]. Además, ADAR1 pertenece al interactoroma nuclear in vitro Para subrayar las relaciones estructurales y funcionales de las proteínas nucleolares afectadas por el VIH-1 Tat, construimos una representación en red de nuestro conjunto de datos. Utilizamos la versión 2.6.3 de Cytoscape [89] y utilizando el plugin MiMI [90] para mapear interacciones previamente caracterizadas, extraídas de bases de datos de interacción de proteínas (BIND, DIP, HPRD, CCSB, Reactome, IntAct y MINT), lo que resultó en una red altamente densa y conectada que incluía 416 proteínas (nodos) de las 536 proteínas, unidas por 5060 interacciones no dirigidas (borde) (Figura 3A). El análisis de centralidad reveló un umbral de 23.7 interacciones por proteína. El análisis de topología utilizando el plugin CentiScaPe [91] mostró que la distribución del grado de nodo sigue una ley de energía (Figura S5 Es importante destacar que cuando analizamos la distribución del coeficiente de agrupamiento (Figura S6 ) encontramos que la red está organizada en una arquitectura jerárquica [92], donde los nodos conectados forman parte de áreas altamente agrupadas mantenidas por pocos hubs organizados alrededor del HIV-1 Tat. Además, el análisis de la conexión en grados nodos de nuestra red identificó al HIV-1 Tat como la proteína más conectada (Figura S6 ). Específicamente, el análisis de topología indicó que los valores para las centrales Tat eran los más altos (grado de nodo, estrés, radialidad, cercanía, entreess y centroides), caracterizando a Tat como la proteína principal del hub de la red nucleolar. De hecho, un total de 146 proteínas han sido descritas previamente para interactuar con Tat (Figura 3B, Tabla S2 ). Estas proteínas están involucradas En paralelo, caracterizamos la magnitud de los cambios de abundancia proteica relacionados observados en distintas vías celulares (Figura 4). Biogénesis ribosomal. Inicialmente nos centramos en la biogénesis ribosoma, función primaria del nucleolo. Pudimos observar un aumento general y coordinado en la abundancia de proteínas ribosomales en el nucleolo por expresión Tat (Figura 4 ). Mientras algunas proteínas ribosomales permanecían inalteradas, Tat causó la acumulación nucleolar de varias proteínas ribosomas grandes y pequeñas distintas, excepto RPL35A, para las cuales la expresión Tat causó una marcada disminución en el nivel nucleolar (0,29 veces). Asimismo, varias proteínas involucradas en el procesamiento de ARNr exhibieron un aumento general en la acumulación nucleolar sobre la expresión Tat. Estos incluyen a los miembros canónicos humanos de la familia L7ae junto con los miembros que participan en la Caja C/D, H/ACA y U3 snoRNPs (Figura 4). Por el contrario, BOP1, un componente del complejo PeBoW (Pescadillo Bop1 WDR12) esencial para la maduración de la subunidad ribosómica grande, se agotó significativamente del nucleolo de las células TAP-Tat Jurkat (0,81 veces) y esto fue confirmado por el análisis WB (Figura 2 ) [93]. Sin embargo, los otros componentes complejos PeBoW, Pes1 (0,94 veces) y WDR12 (1,1 veces), no fueron afectados por la expresión Tat. Se identificaron y cuantificaron en nuestro conjunto de datos 55 proteínas de las 108 proteínas spliceosomal conocidas [94]. Estas proteínas incluyen las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares U1, U2 y U5, Sm D1, D2, D3, F y B, y las heterogéneas ribonucleoproteínas nucleares. Nuestros datos sugieren un aumento distinto en la abundancia de proteínas específicas complejas del spliceosoma tras la expresión de HIV-1 Tat en células T de Jurkat (Figuras 3 y 4). Las únicas tres proteínas que se agotaron significativamente del nucleolo tras la expresión del HIV-1 Tat fueron RBMX (0,89 veces), HNRNPA2B1 (0,84 veces) y SNRPA (0,81 veces). Varias investigaciones mostraron alteración de la expresión en los factores de empalme celular en células infectadas por HIV-1 [95, 96] Hemos identificado varias chaperonas moleculares, cochaperonas y otros factores involucrados en la proteostasis para ser altamente enriquecidos en el nucleolo de las células T sobre la expresión Tat (Figuras 3 y 4), muchos de los cuales fueron previamente caracterizados como parte del interactoroma nuclear Tat [63]. Varias proteínas de choque térmico incluyendo DNAJs, específicas HSP90, HSP70 y HSP40 isoformas y sus cofactores se enriquecieron distintivamente en la fracción nucleolar de las células Jurkat expresando Tat (Figura 4 ). Como lo muestra WB, mientras que HSP90a y b son principalmente citoplasmáticas, la expresión Tat desencadena su relocalización al núcleo y nucleolus, corroborando nuestro enfoque cuantitativo proteómico (Figura 2). Del mismo modo, el choque térmico puede hacer que el HSP90 y el HSP70 se reubiquen en el nucleolo [97, 98, 99, 100, 101]. En un estudio reciente, el grupo de Fassati ha demostrado que el HSP90 está presente en el promotor del VIH-1 y puede regular directamente la expresión génica viral [102]. También observamos el aumento coordinado de la abundancia de la clase I (GroEL y GroES) y la clase II (chaperonina que contiene TCP-1 (CTT)) moléculas de chaperonina (Figuras 3 y 4) sobre la expresión Tat. Vía proteasómica de la ubiquitina. La vía proteasómica es el principal sistema proteolítico de células eucariotas [103]. Es importante destacar que la vía ubiquitina-proteasoma nuclear controla el suministro de proteínas ribosomales y es importante para la biogénesis ribosoma [104, 105]. El proteasoma 26S está compuesto por la partícula núcleo 20S (CP) y la partícula reguladora 19S (RP). Alternativamente, CP puede asociarse con el 11S RP para formar el inmunoproteasoma. Todas las proteínas cuantificadas en nuestro estudio son parte del complejo regulador 19S e incluyen PSMD2 (1,5 veces), PSMD3 (1,32 veces), PSMD11 (1,25 veces) y PSMD13 (0,72 veces), el único componente proteasoma significativamente agotado del nucleolo en presencia de Tat (Figura 4). Curiosamente, Tat interactúa con subunidades distintas del sistema proteasoma, incluyendo las subunidades 19S, 20S y 11S. Las consecuencias de estas interacciones incluyen la competencia de Tat con 11S RP o 19S RP para la unión al 20S CP, que resultó en la inhibición de la actividad de la peptidasa 20S [106, 107, 108, 109, 110, 111]. Además, Tat demostró modificar la composición proteosoma y la actividad, que afecta a la generación de antígenos péptidos reconocidos por linfocitos T citotóxicos [112]. Importantemente, un estudio reciente demostró que en ausencia de Tat, los componentes proteosomas están asociados al promotor del VIH-1 y la actividad proteosoma limita la transcripción [113]. La adición de Tat promovió la disociación de la subunidad 19S del proteasoma 20S, seguido por el enriquecimiento distintivo del complejo similar a 19S en extractos nucleares junto con el reclutamiento mediado por Tat de las subunidades 19S para el promotor del VIH-1, lo que facilitó su elongación transcripcional [113]. También cuantificamos UBA1 (1,36 veces), la ubiquitina-proteína ligasa UHRF1 (1,13 veces), UBC (1 veces) y dos Ubiquitinspecific-peptidases, USP30 (1,28 veces) y USP20 (0,06 veces) (Figura 4). Replicación y reparación del ADN. Tras la expresión del HIV-1 Tat, observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de varios factores celulares asociados con la replicación del ADN y las vías de reparación (Figura 4). Tat indujo el enriquecimiento coordinado del complejo MCM2-7 de mantenimiento cromosómico en miniatura (de 1.23-a 3,30 veces, respectivamente) [114]. MCM7, 6 y 3 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. El mantenimiento estructural de los cromosomas 2, SMC2, fue enriquecido (1,35 veces) en la fracción nucleolar por expresión Tat. SMC2 fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Mientras que el factor de replicación C1 (RFC1) y RFC2 (1,31 y 1,28 veces respectivamente) mostró un cambio de pliegue incrementado y RFC5/3 no se vieron afectados, RFC4 se redujo gravemente (0,69 veces) de la fracción nucleolar sobre la expresión Tat [115]. El RFC1 y RFC2 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Tat indujo el enriquecimiento de XRCC6 (1,27 veces) y XRCC5 (1,36 veces) en el nucleolo, que están involucrados en la reparación de la unión final del ADN no-homologoso (NHEJ) [116]. XRCC6 se asocia con complejos de preintegración viral que contienen HIV-1 Integrase y también interactúan con Tat y TAR [117, 118, 119]. Además, en una pantalla basada en ribozyme, el derribo del XRCC5 (Ku80) disminuyó tanto la integración retroviral como la transcripción Tatmediated [120]. Como parte de la reparación de la escisión base (BER), hemos identificado una importante endonucleasa apurínico/apirimidinica 1 (APEX1) (1,29 veces). Importantemente, en una pantalla de siRNA dirigida a los factores de reparación del ADN, se encontró que la reducción de APEX1 inhibe la infección por VIH-1 por más de 60% [121]. La proteína del grupo de alta movilidad (HMG) HMGA1 (1,30 veces), fue enriquecida en el nucleolo después de la expresión Tat [122]. HMGA1 interactúa con la integración del VIH-1 y forma parte del complejo de preintegración del VIH-1 [123, 124]. Importantemente, HMGA1 ha sido identificada en una pantalla proteómica, como un cofactor celular que interactúa con el VIH-1 59líder [125]. Metabolismo. Nuestros datos proteómicos sugieren que Tat induce perturbaciones en la glucólisis, la vía del fosfato pentosa y la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos (Figura 4 y Figura S7 ). En particular, en las células T que expresan Tat, detectamos cambios coordinados en la abundancia de proteínas no conocidas previamente que se asocian con la patogénesis del Tat, que revelaron conexiones inesperadas con la glicólisis y la vía del fosfato pentosa, incluyendo las siguientes enzimas glicólicas, lactato deshidrogenasa B (LDHB) (1,37 veces), la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1,17 veces) y la mutasa del ácido fosfoglicérico (PGAM1) (0,89 veces) (Figura 4 y Figura S En resumen, el GPI cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Posteriormente, el PFKP cataliza la conversión irreversible de fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato y es una enzima reguladora clave de la glucólisis. Al final de la vía glicolítica, PKM2, en su forma tetramérica, se sabe que genera ATP y piruvato, mientras que el LDHB desvía la mayoría del piruvato a la producción y regeneración de lactato de NAD+ en apoyo a la glicólisis continua, un fenómeno descrito para las células T proliferativas [126]. Esto regula la disponibilidad de los intermedios de glucosa, que se redirigen a las vías de la pentosa fosfato y de la serina biosíntesis para la producción de precursores biosintéticos de nucleótidos, fosfolípidos y aminoácidos. Como parte de la vía del fosfato de pentosa, hemos caracterizado el enriquecimiento significativo de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) (2,11 veces), que ramas de la vía de la glicólisis para generar NADPH, ribosa-5fosfato un precursor importante para la síntesis de nucleótidos. Consistente con esto, detectamos el aumento coordinado en la abundancia de enzimas que juega un papel central en la síntesis de purinas y pirimidinas. Más específicamente, IMPDH2 (1,66 veces), una enzima limitante de la tasa en el punto de rama de la biosíntesis de nucleótidos de purina, que conduce a la generación de nucleótidos de guanina, fosforibosil pirofosfato sintetasa 2 (PRPS2) (1,41 veces), cytidine-5-prime-trifosfato sintetasa (CTPS) (1,74 veces) que cataliza la conversión de UTP a CTP y la subunidad grande de ribonucleótido reductasa (RRM1) (1,56 veces). En parralel, observamos el aumento de la abundancia de la fosfoserina aminotransferasa PSAT1 (1,90 veces), una enzima implicada en la biosíntesis de serina, que se ha relacionado con la proliferación celular in vitro. La interfaz host-virus es un aspecto fundamental en la definición de la patogénesis molecular del VIH-1 [127, 128, 129, 130, 131, 132, 133]. De hecho, con su repertorio limitado de proteínas virales, el VIH-1 se basa ampliamente en la maquinaria de las células huésped para su replicación. Varios estudios recientes han capitalizado los recientes avances en las tecnologías ''OMICS'', y han revelado importantes perspectivas en este diálogo molecular finamente afinado [132, 134]. El VIH-1 Tat es esencial para la replicación viral y orquesta la expresión génica del VIH-1. La proteína reguladora viral es conocida por interactuar con una amplia gama de proteínas celulares y modular la expresión del gen celular y la vía de señalización [135, 136]. Nosotros y otros hemos utilizado enfoques a nivel del sistema para investigar la interacción Tat con la maquinaria de las células de acogida, que han caracterizado al HIV-1 Tat como un mediador crítico de la interfaz host-viral [137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149]. Aquí, hemos investigado el tráfico de proteínas nucleolares en respuesta a la expresión HIV-1 Tat en células T, con el fin de proporcionar ideas únicas y novedosas sobre el papel de la compartimentación de proteínas por Tat en el ajuste fino de la disponibilidad de proteínas y la función. Hemos desarrollado para este estudio, un modelo celular utilizando Jurkat T-cells expresando firmemente Tat fusionado en su N-ternminal a TAP-tag. Jurkat T-cells son robustos y presentan la ventaja de crecer sin estímulos y se transducen fácilmente utilizando Es importante destacar que se han empleado ampliamente para evaluar la patogénesis mediada por Tat utilizando enfoques de todo el sistema y para analizar las vías y funciones de señalización celular clave de las células T [144, 150, 151, 152]. De hecho, hemos encontrado que son especialmente adecuadas para cultivos in vitro prolongados en el medio SILAC y posterior aislamiento de su nucleolo, seguido por el análisis de MS, que requiere hasta 85 millones de células. Fusionamos Tat a la etiqueta TAP para permitir futuras aplicaciones posteriores como purificación de afinidad de Tandem o análisis IP de Cromatina. Importantemente, hemos confirmado que la etiqueta TAP N-terminal no interfirió con la función Tat ni su localización en las células Jurkat, cuando se compara con la no etiquetada-Tat. Aunque se sabe que Tat se acumula en el núcleo y el nucleolo en las células de Jurkat y otras líneas celulares transformadas, en las células T primarias, Tat se describe para acumularse principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Estas diferencias permanecen por caracterizarse, pero podrían estar relacionadas con diferentes niveles de expresión de los factores de transporte en las líneas celulares transformadas versus las células primarias, como se describe recientemente por Kuusisto et al. [39]. Además, Stauber y Pavlakis han sugerido que la localización nucleolar Tat podría ser el resultado de la sobreexpresión Tat [31]. Aquí, hemos seleccionado y empleado una población policlonal de células T Jurkat que expresan Tat en diferentes niveles. Proponemos que esta heterogeneidad en los niveles de expresión Tat podría reflejar la expresión estocástica Ta Utilizando una estrategia proteómica cuantitativa basada en un enfoque organélaro, cuantificamos más de 520 proteínas nucleolares, incluyendo 49 proteínas que muestran un cambio significativo en el pliegue. La medida en que las variaciones inducidas en la abundancia de proteínas nucleolares son biológicamente relevantes y pueden afectar los procesos celulares y/o virales queda por determinar. Sin embargo, la naturaleza biológica de las vías y los complejos macromoleculares afectados nos permiten discutir sus posibles asociaciones con la patogénesis del VIH-1. El VIH-1 Tat se expresa tempranamente después de la integración del genoma del VIH-1 y media el cambio a la fase de producción viral, asociado con la expresión génica proviral robusta, el ensamblaje de proteínas virales y, en última instancia, el desarrollo y liberación de viriones. En este contexto y basado en nuestros resultados, proponemos que Tat podría participar en la configuración del entorno intracelular y el perfil metabólico de De hecho, observamos el enriquecimiento nucleolar distinto de proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica, lo que podría ser indicativo de un aumento en la síntesis proteica. Con la notable exepción de RPL35A depleción nucleolar, proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica estaban en las 20 proteínas nucleolares más enriquecidas (NHP2L1, RLP14, RPL17, RPL27, RPS2, RPL13). Además, este efecto parece ser específico del HIV-1 Tat ya que la inhibición de transcripción por Actinomicina D resultó en el agotamiento total de proteínas ribosómicas en el nucleolo [9]. Además, el análisis proteómico cuantitativo de las células nucleas en adenovirus infectados mostró una leve disminución en proteínas ribosómicas [24] Si esto refleja un cambio en la biogénesis del ribosoma y/o un cambio en la composición de las subunidades ribosomales queda por determinar. Sin embargo, la necesidad adaptada de una producción elevada del ribosoma es intuitiva para un sistema que necesita apoyar la creciente demanda de nueva síntesis de proteínas virales. En parralel, observamos la modulación concordante de las vías que regulan la homeostasis proteica. Observamos la significativa acumulación nucleolar de múltiples chaperonas moleculares incluyendo las HSPs, el complejo TCP-1, y moléculas CANX/CALR y la abundancia nucleolar interrumpida de proteínas pertenecientes a la vía ubiquitina-proteasoma, que controla el suministro de proteínas ribosomales [104, 105]. Estas observaciones apoyan estudios previos que describen la modulación de la actividad proteasómica por Tat, que afectan a la expresión, el montaje y la localización de subunidades específicas de los complejos proteasómicos [106, 107, 108, 109, 110, 111, 113]. También observamos el agotamiento concomitante de CASP10 en el nucleolo de Jurkat TAP-Tat. Se ha sugerido que CASP10 podría estar dirigido al nucleolo para inhibir la síntesis proteica [154]. Curiosamente, la presencia y los papeles potenciales de las chaperonas moleculares en el nucleolo han sido destacados por Banski et al, quienes explican cómo la red chaperona podría regular la biogénesis ribosoma, la señalización celular y la respuesta al estrés [97, 155]. A medida que la producción viral avanza hacia la fase tardía y aumenta el estrés celular, el enriquecimiento nucleolar de las chaperonas moleculares por Tat no sólo podría permitir el plegado de adequat de proteínas virales recién sintetizadas, sino que también podría promover la tolerancia de las células infectadas al estrés y mantener la viabilidad celular. Coincidentemente, observamos el marcado enriquecimiento nucleolar de enzimas pertenecientes a vías metabólicas incluyendo glicólisis, fosfato de pentosa, nucleótido y aminoácidos vías biosintéticas. Del mismo modo, estas vías se elevan en células T proliferativas o en células cancerosas después de un cambio metabólico a la glicólisis aeróbica, también conocido como el efecto Warburg [156, 157, 158, 159]. Allí, los intermedios de glucosa de la vía de la glicólisis no sólo se comprometen a la producción de energía y se descomponen en piruvato para el ciclo TCA, sino que se redirigen a vías alternativas, incluyendo la vía del fosfato de pentosa, y se utilizan como precursores metabólicos para producir nucleótidos, aminoácidos, acetil CoA y NADPH para la homeostasis redox. De manera consistente, también se observó el enriquecimiento nucleolar concomitante de enzimas pertenecientes a la vía de síntesis de nucleótidos, incluyendo IMPH2, una enzima limitante conocida para controlar el pool de GTP. De igual manera, se observó el enriquecimiento nucleolar de PSAT1, una enzima involucrada en el metabolismo de serina y treonina, que está asociada con la proliferación celular [160]. Colectivamente, proponemos que mediante el control de la homeostas Sin embargo, las enzimas glucolíticas han sido detectadas en las fracciones nuclear y nucleolar mediante análisis proteómicos [8, 161]. Además, las enzimas glucolíticas, como PKM2, LDH, fosfoglicerato cinasa, GAPDH y aldosa, también han sido reportadas para mostrar localización nuclear y unirse al ADN [162]. Más específicamente, PKM2 es conocido por asociarse con el promotor y participar en la regulación de la expresión génica como coactivador transcripcional [163]. HIV-1 Tat ha sido descrito previamente como un inmunoregulador y más específicamente, ha sido reportado tanto para inhibir o promover la señalización TCR [164]. Hemos observado el enriquecimiento nucleolar por Tat de componentes proximales o aguas abajo clave de las vías de señalización de células T, incluyendo ZAP70, ILF3 y STAT3, que juegan un papel crucial en el desarrollo y activación de células T. Anteriormente los habíamos identificado como componentes específicos de células T del nucleolo, y los estudios de IF sugirieron que su asociación con el nucleolo podría ser regulada por condiciones específicas [165]. Nuestros resultados apoyan aún más que Tat podría contribuir a la disregulación de las señales derivadas de TCR y que el nucleolo podría representar un importante enlace espacial para las moléculas de señalización TCR. Observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de componentes clave de las vías de replicación, recombinación y reparación del ADN por Tat. Estos incluyen XRCC5 y XRCC6, HMGA1, APEX1, MCM2-7, SMC2, RFC1 y RFC2, mientras que RFC4 se encontró significativamente agotado. Curiosamente, estos cofactores se han asociado con la eficiencia de la integración del ADN retroviral en el ADN del huésped o la integridad del provirus integrado [166]. Si la abundancia creciente de estos factores dentro del nucleolo podría estar asociada con su participación potencial en la integración y mantenimiento de la integridad del gen provirus, queda por determinar. Los mecanismos de segregación mediada por Tat y compartimentación de proteínas dentro o fuera del nucleolo pueden depender de factores inherentes para cada proteína y la naturaleza de su relación con Tat, ya que el fraccionamiento subcelular combinado con el análisis del WB mostró que el patrón y el grado de redistribución subcelular entre proteínas variaban. Pudimos observar casos en los que Tat regulaba la expresión de proteínas que resultaban en un aumento general de estas proteínas en los compartimentos celulares incluyendo el nucleolo (DDX3, TNPO1). Alternativamente, Tat podía desencadenar la translocación nucleolar de proteínas directamente desde el citoplasma o el nucleoplasma (pRb). Además, observamos proteínas citoplasmáticas redistribuidas tanto al nucleoplasma como al nucleolo sobre la expresión Tat (STAT3, ZAP70 y HSP90). Finalmente, también notamos el agotamiento proteico en la fracción nucleolar acompañado de un aumento en el nucleoplasma (SSRP1). Sigue siendo difícil en esta etapa, apreciar si la acumulación de proteínas específicas resultaría en su activación o inhibición al secuestrarlas de su lugar de acción. Por el contrario, el agotamiento de una proteína del nucleolus podría resultar en la regulación descendente de su actividad en este lugar o podría ser el resultado de su movilización desde su sitio de almacenamiento, el nucleolus, al nucleoplasma o citoplasma donde puede realizar su función. Cabe destacar que identificamos a varios socios conocidos del VIH-1 Tat involucrados en la patogénesis del VIH-1, lo que sugiere que Tat podría modular físicamente su objetivo nucleolar o su reclutamiento a un sitio específico en el nucleoplasma o citoplasma. Tat también podría promover modificaciones post-traducción, lo que podría mediar la focalización de proteínas específicas al nucleolus. Esto se ilustra por las siguientes proteínas enriquecidas, pRb, PP1 y STAT3, para lo que la fosforilación es inducida por Tat. Importantemente, su estado de fosforilación determina su distribución subcelular, proporcionando así un mecanismo Además, nuestros datos indican que las serinas/treoninas quinasas (CK2 a') y fosfatasas (PP1) se enriquecieron significativamente en las fracciones nucleolares de Jurkat TAP-Tat. Estas enzimas representan la mayor parte de la actividad de fosforilación/desfosforilación en el nucleolo y pueden actuar como reguladores del tráfico de proteínas nucleolares. Además, Tat disminuyó significativamente los niveles de SUMO-2 en el nucleolo. Del mismo modo, se sabe que las modificaciones posteriores a la traducción mediadas por SUMO modulan la localización de proteínas nucleolares [104]. Dada la importancia potencial de las modificaciones posteriores a la traducción, incluida la fosforilación en el cambio mediado por Tat de la abundancia de proteínas nucleolares, un enfoque proteomico más específico como el enriquecimiento de fosfopétidos El control de la rotación de proteínas también es un medio importante para modular la abundancia de proteínas nucleolares. Las proteínas ribosómicas son degradadas por la vía Ubiquitina-Proteasoma para asegurar que su abundancia coincida con los niveles de transcripción de rRNA. A la inversa, las proteínas de choque térmico HSP90s las protegen de la degradación. Curiosamente, nuestros datos muestran que la modulación Tat de las proteínas de abundancia asociadas con la vía Ubiquitina-proteasoma y choque térmico. Esto podría contribuir al enriquecimiento observado de proteínas ribosómicas por Tat. Sin embargo, no podemos excluir que la mayor abundancia de proteínas ribosómicas en el nucleolo podría ser el resultado de la prevención mediada por Tat de su exportación al citoplasma. Curiosamente, utilizando un sistema celular diferente, una cepa transgénica de Drosophila melanogaster Tat, Ponti et al, analizaron los efectos de Tat en la biogénesis ribosoma, después de 3 días de tratamiento de choque térmico para inducir la expresión Tat bajo el control del promotor hsp70 [167]. Después de la expresión Tat, observaron un defecto en el procesamiento pre-rRNA asociado con una disminución en el nivel de 80S ribosomas [167]. Sin embargo, los diferentes sistemas celulares empleados combinados con la inducción de choque térmico de 3 días hacen que sus resultados sean difíciles de comparar con los nuestros. Mientras que estudios anteriores a nivel de sistema han monitoreado los efectos de la expresión Tat del VIH-1 en las células T, a nuestro conocimiento, hemos presentado aquí el primer análisis proteómico de la composición dinámica del nucleolus en respuesta a la expresión Tat del VIH Utilizando proteómica cuantitativa, hemos subrayado los cambios en la abundancia de proteínas nucleolares específicas y hemos destacado la reorganización nucleolar extensa y coordinada en respuesta a la expresión constitutiva Tat. Nuestros hallazgos subrayan que Tat que expresa células T exhiben un perfil proteómico nucleolar único, que puede reflejar una estrategia viral para facilitar la progresión a la producción viral robusta. Importantemente, hemos notado la relación funcional de proteínas nucleolares de nuestro conjunto de datos con la patogénesis VIH-1 y el Tat VIH-1 en particular. Esto aumenta aún más nuestra confianza en nuestra estrategia experimental y sugiere un papel para Tat en el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares. Finalmente, nuestro estudio proporciona nuevas ideas sobre la importancia de Tat en la conversación cruzada entre funciones nucleolares y patogénesis viral. También hemos identificado cambios en la abundancia de proteínas nucleolares que no estaban previamente asociados con la patogénesis del VIH-1, incluyendo proteínas asociadas a vías metabólicas, que proporcionan nuevos objetivos potenciales y vías celulares para la intervención terapéutica.Células T Jurkat, clon E6.1 (ATCC), Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP se mantuvieron en el medio RPMI-1640 complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (Gibco, aprobado por la UE), y antibióticos. Células Phoenix-GP (G.P. Nolan; www.stanford.edu/ group/nolan/), se mantuvieron en el medio DMEM complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (GIBCO, aprobado por la UE). La secuencia de HIV-1 Tat (VIH-1 HXB2, 86 aminoácidos) fue subclonada en el vector pENTR 2B (Invitrogen, A10463). Usando la tecnología Gateway (Invitrogen), introdujimos la secuencia HIV-1 Tat en el plásmido pCeMM-NTAP(GS)-Gw [168]. Las células Fénix (G.P. Nolan; www.stanford.edu/group/nolan/), fueron transfectadas usando Fugene 6 (Roche) con 5 mg del plásmido NTAP-Tat o NTAP y 3 mg del pMDG-VSVG. Los sobrenadantes virales fueron recolectados después de 48 h, filtrados y utilizados para transducir las líneas celulares de Jurkat. La construcción se denomina NTAP-Ta Utilizando la entrega de genes retrovirales, transferimos de forma estable células Jurkat (clone E6.1 (ATCC)). Los clones positivos llamados Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron ordenados para enriquecer la población de células que expresaban GFP usando el clasificador de células BC MoFlo XDP (Beckman Coulter). Las fracciones subcelulares (10 mg) fueron resueltas por SDS-PAGE y transferidas a membranas BioTrace PVDF (Pall corporation). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: a-Tubulina (Sc 5286), C23 (Sc 6013), y Fibrilarina (Sc 25397) de Santa Cruz Biotechnology, y PARP (AM30) de Calbiochem, Ratón anti-ZAP 70 (05-253, Millipore), Ratón anti-STAT3 (06-596, Millipore), Ratón anti-ILF3 (ab92355, Abcam), Ratón anti-HSP90 beta (ab32568, Abcam), Ratón anti-ADAR1 (ab88574, Abcam), Ratón anti-HDAC1 (ab19845, Abcam), Ratón anti-SSRP1 (ab21584, Abcam) conejo anti-BOP1 (ab86982, Abcam), Ratón anti-KpNB1 (ab10303, Abcam), Ra Para el análisis SILAC-RPMI R0K0 y SILAC-RPMI R6K6 (Células Dundidas) se utilizó un medio con un 10% de FBS dializado (GIBCO, 26400-036); las células Jurkat que expresaban NTAP-Tat y NTAP fueron transitadas en serie y cultivadas durante cinco duplicados para asegurar la incorporación completa de los aminoácidos marcados; la viabilidad de las células se verificó con Trypan Blue (0,4% solución, SIGMA) y posteriormente se confirmó mediante tinción IP y análisis FACS; las células se mezclaron a la relación 1:1 para obtener 140610 6 células; los nucleoli fueron aislados de la población celular mixta como se describió previamente en Jarboui et al., [165]. Los extractos nucleolares (100 mg) fueron resuspendidos en bicarbonato de amonio de 50 mM y en solución de tripsina digerida como se describió previamente en Jarboui y col. [165]. La muestra se realizó en un espectrómetro de masa termoscientifico LTQ Orbitrap XL conectado a un sistema cromatógrafo NANO LC.1DPLUS que incorporaba una muestra automática. La muestra fue cargada en una columna Biobasic C18 PicofritTM (100 mm de longitud, 75 mm ID) y fue separada por un gradiente de acetonitrilo en aumento, utilizando un gradiente de 142 min de fase inversa (0-40% de acetonitrilo durante 110 min) a un caudal de 300 nL min-1. El espectrómetro de masa fue operado en modo iónico positivo con una temperatura capilar de 200uC, una tensión capilar de 46V, una tensión de lente de tubo de 140V y con un potencial de 1800V aplicada al frit. Todos los datos fueron adquiridos con el espectrómetro de masa que funciona en modo de conmutación automática dependiente de datos. Se realizó una exploración MS de alta resolución utilizando el Orbitrap para seleccionar los 5 iones más intensos antes del análisis MS/MS utilizando la trampa Ion. La eficiencia de incorporación de aminoácidos etiquetados fue determinada mediante el análisis de los péptidos identificados en nucleoli aislados de la población celular mantenida en el medio 'Heavy' como se describe en [169]. Nuestro análisis mostró que teníamos una eficiencia de incorporación.95% (datos no mostrados). Los espectros MS/MS fueron buscados para la identificación y cuantificación de los péptidos utilizando el software MaxQuant [170] (versión 1.1.1.36), la Base de Datos del IPI Humano (versión 3.83) y el motor de búsqueda Andrómeda asociado a MaxQuant [171]. Se utilizaron parámetros estándar para MaxQuant con el Acetil (término N de Proteína) como modificación variable y Carbamidometilo (Cys) como modificación fija, se permitieron 2 escisiónes perdidas, excepto que se prohibió el filtrado de aminoácidos etiquetados. La desviación de masa inicial de los iones precursores y fragmentos fue de 7 ppm y 0,5 Da, respectivamente. Cada relación proteica fue calculada como promedio ponderado de intensidad de los coeficientes de péptidos individuales. Las proteínas fueron identificadas con el mínimo de un péptido con una tasa La ontología genética, la vía KEGG y los términos Pfam se extrajeron de entradas UNIPROT utilizando Perseo, un software del paquete de análisis de datos MaxQuant (http://www.maxquant.org ), y las herramientas de la suite ToppGene [54]. El Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron transfectados utilizando el sistema de electroporación Amaxa (biosistema Amaxa) con el pGL3 (pGL3-LTR) (Promega) como recomendado por Amaxa Biosystem. Los ensayos de doble luciferasa (Promega) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de Luciferasa se midió y normalizó contra la cantidad total de proteínas cuantificada por el kit de cuantificación de proteínas BCA (Pierce, Thermo Scientific). Para preservar Las células se fijaron en un 2% PFA durante 10 minutos en RT, permeabilizaron en un 0,5% Triton X-100 durante 15 minutos en RT y se bloquearon con 5% FCS. Las células se incubaron con el anticuerpo Tat VIH-1 de conejo (ab43014, Abcam) seguido por el anticuerpo secundario anti-Rabbit alexa fluor 647 (A-21246, Invitrogen). Las células se les permitió unirse a Cell-Tak (BD) recubierto de Diapositivas Silanizadas (DaoCytomation), y manchado con DAPI. Las imágenes se capturaron con un Microscopio Confocal Carl Zeiss equipado con un objetivo DIC de aceite de Plan-Apocromat 63X/14. El archivo de datos RAW proteómicos del análisis de espectrometría de masas se depositó en el repositorio Tranche(http El archivo se puede acceder y descargar utilizando la siguiente clave de hash:(R3O5SV5Z6HvWqrBNDhp21tXFetluDWYxvwMIfU-h6e1kMgarauCSq4dlNcxeUvFOHDEzLeDcg4X5Y8reSb6-MUA6wM1kIAAAAAAB/w = ). Materiales y Métodos S1 Descripción de los métodos empleados para examinar el ciclo celular, la viabilidad celular y el análisis de proliferación celular. (DOCX)

¿Qué es un nucleolo?

Tráfico de proteínas nucleolares en respuesta al VIH-1 Tat: Rewiring the Nucleolushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499507/SHA: efa871aeaf22cbd0ce30e8bd1cb3d1afff2a98f9Autores: Jarboui, Mohamed Ali; Bidoia, Carlo; Woods, Elena; Roe, Barbara; Wynne, Kieran; Elia, Giuliano; Hall, William W.; Gautier, Virginie W.Fecha: 2012-11-15DOI: 10.1371/journal.pone.0048702Licencia: cc-byAbstract: La proteína Tat transactivante es una proteína reguladora viral esencial para la replicación del VIH-1. El nucleolo, un compartimento subnuclear altamente dinámico y estructurado sin membrana, es el sitio de ARNr y biogénesis ribosoma y está involucrado en numerosas funciones celulares incluyendo la regulación transcripcional, el control del ciclo celular y la infección viral. Importantemente, el tráfico nucleolar transitorio tanto de Tat como de las transcripciones virales del VIH-1 son críticos en la replicación del VIH-1, sin embargo, el(los) papel(es) del nucleolo en la replicación del VIH-1 sigue sin estar claro. Para entender mejor cómo la interacción de Tat con la maquinaria nucleolar contribuye a la patogénesis del VIH-1, investigamos los cambios cuantitativos en la composición del proteoma nucleolar de las células T de Jurkat que expresan establemente el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta TAP. Utilizando un enfoque proteómico organélaro basado en espectrometría de masas, junto con el etiquetado de isótopos estables en cultivo celular (SILAC), cuantificamos 520 proteínas, incluyendo 49 proteínas que muestran cambios significativos en la abundancia de nucleolos de células T de Jurkat sobre la expresión Tat. Numerosas proteínas que exhiben un cambio de pliegue fueron interactuadores Tat bien caracterizados y/o conocidos por ser críticos para la replicación del VIH-1. Esto sugiere que el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares por Tat proporcionan una capa adicional de control para regular la maquinaria celular involucrada en la patogénesis del VIH-1. El análisis del camino y la reconstrucción de la red revelaron que la expresión Tat resultó específicamente en el enriquecimiento nucleolar de proteínas que participan colectivamente en biogénesis ribosomal, homeostasis de proteínas, vías metabólicas incluyendo glucolítico, fosfato de pentosa, nucleótidos y aminoácidos vías biosintéticas, respuesta al estrés, vías de señalización de células T e integridad del genoma. Presentamos aquí el primer perfil diferencial del proteoma nucleolar de células T que expresan el HIV-1 Tat. Discutimos cómo estas proteínas participan colectivamente en redes interconectadas que convergen para adaptar las actividades dinámicas del nucleolus, que favorecen las actividades biosintéticas del huésped y pueden contribuir a crear un entorno celular que apoye la producción robusta del HIV-1. Texto: El nucleolus es un compartimento subnuclear altamente ordenado organizado alrededor de loci genéticos llamados regiones organizadoras nucleolares (NORs) formado por grupos de cientos de repeticiones de genes rDNA organizadas en repetición tándem cabeza a cola [1, 2]. Organelo sin membrana descrito originalmente como la ''Fábrica Ribosoma'', el nucleolus está dedicado a la transcripción de rDNA dirigida por ARN-polimerasa-I, procesamiento de rARN mediado por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (SORNPs) y conjunto ribosoma. La biogénesis del ribosoma es esencial para la síntesis de proteínas y la viabilidad celular [2] y, en última instancia, resulta en las subunidades ribosomales grandes (60S) y pequeñas (40S), que posteriormente se exportan al citoplasma. Este proceso celular fundamental, al que la célula dedica la mayor parte de sus recursos energéticos, está estrictamente regulado para adaptarse a los cambios dinámicos en la proliferación celular, la tasa de crecimiento y las actividades metabólicas [3]. El nucleolus es el sitio de procesamiento adicional de ARN, incluyendo la exportación y degradación de ARNm, la maduración de pequeños PNNR nucleares ricos en uridina (U snRNPs), que forman el núcleo del spliceosoma, biogénesis de ARNt y microARNs (miRNAs) [4]. El nucleolus también está involucrado en otros procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular, procesos oncogénicos, respuestas de estrés celular y traducción [4]. El concepto de nucleolo multifuncional y altamente dinámico ha sido corroborado por varios estudios que combinan enfoques proteómicos organelares y espectrometría cuantitativa de masas, y describen miles de proteínas que transitan por el nucleolo en respuesta a diversas condiciones metabólicas, estrés y ambientes celulares [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Colectivamente, los estudios mencionados representan hitos en la comprensión de la complejidad funcional del nucleolo, y demostraron que las proteínas nucleolares están en intercambio continuo con otros compartimentos nucleares y celulares en respuesta a determinadas condiciones celulares. Los estudios proteómicos que analizan los nucleoli de las células infectadas por el virus sincitial respiratorio humano (HRSV), el virus influenza A, el virus de la bronquitis infecciosa por coronavirus aviar (IBV) o el adenovirus destacaron cómo los virus pueden alterar de forma distintiva la distribución de proteínas nucleolares [2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Curiosamente, tanto las proteínas reguladoras del VIH-1 Tat como Rev localizan al nucleoplasma y al nucleolus. Ambas secuencias abarcan una señal de localización nucleolar (NoLS) que se superpone con su señal de localización nuclear (NLS), que rige su localización nucleolar [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. Además, Tat y Rev interactúan con el antígeno nucleolar B23 Sin embargo, un estudio reciente describió que en contraste con las células T de Jurkat y otras líneas celulares transformadas donde Tat está asociado con el núcleo y el nucleolo, en las células T primarias Tat se acumula principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Mientras que la regulación de su importación y/o exportación nuclear activa, como mediada por la familia de la carioferina/importación, se han descrito bien, los mecanismos que distribuyen Tat y Rev entre el citoplasma, el nucleoplasma y el nucleolo siguen siendo elusivos [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48]. Importantemente, dos estudios importantes de Machienzi y otros han revelado importantes vínculos funcionales entre la replicación del VIH-1 y el nucleo En primer lugar, podrían inhibir la replicación del VIH-1 y la función de transactivación Tat empleando un señuelo TAR dirigido específicamente al nucleolo. Además, utilizando un enfoque similar, con una ribozima anti-VIH-1 de cabeza martillo fusionada al ARN nucleolar pequeño U16 y por lo tanto dirigida al nucleolo, podrían suprimir dramáticamente la replicación del VIH-1. Colectivamente, estos hallazgos sugieren fuertemente que las transcripciones del VIH-1 y el tráfico nucleolar Tat son críticos para la replicación del VIH-1. Sin embargo, la naturaleza de estas contribuciones aún no se ha aclarado. En este informe, analizamos sistemáticamente las perturbaciones del proteoma nucleolar que ocurren en las células T de Jurkat expresando constitutivamente el VIH-1 Tat, utilizando un enfoque de espectrometría cuantitativa de masas. Después de la anotación detallada de los cambios cuantitativos de abundancia en la composición de la proteína nucleolar sobre la expresión Tat, nos centramos en los complejos celulares afectados por Tat y las vías de señalización asociadas con la biogénesis ribosoma, el spliceosoma, las chaperonas moleculares, la replicación y reparación del ADN y el metabolismo, y discutimos su posible implicación en la patogénesis del VIH-1. En este estudio, investigamos los cambios cuantitativos en el proteoma nucleolar de las células Jurkat T expresando constitutivamente el VIH-1 Tat (86aa) frente a su contraparte Tat negativo, utilizando el etiquetado estable de isótopos con aminoácidos en la tecnología de cultivo celular (SILAC), seguido por la espectrometría de masas en tándem ESI e implementamos el enfoque experimental descrito en la Figura 1A. En primer lugar, mediante la entrega de genes retrovirales, transferimos el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta de purificación de afinidad tándem (TAP) (constituido por dos proteínas G y un péptido de unión a estreptavidina) o TAP solo (vector de control) en el clon de células T de leucemia Jurkat E6-1 y clasificamos las células transducidas (GFP positivo) por FACS. Esto resultó en una población altamente enriquecida de células transducidas policlonales que presentaban diferentes niveles de expresión del transgén (Figura 1B). La funcionalidad del TAP-Tat fue confirmada mediante la transfección de las células TAP-Tat y TAP con un vector de genes reportero de luciferasa bajo el control del HIV-1 LTR (pGL3-LTR) [36]. Para abordar la funcionalidad de Tat fusionado a TAP, comparamos Jurkat TAP-Tat con Jurkat-tat, una línea celular que expresaba establemente Tat [51]. Ambas líneas celulares mostraron una actividad LTR del VIH-1 comparable después de la transfección con pGL3-LTR (Figura S1 ). A continuación, la expresión Tat y la localización subcelular fueron verificadas mediante fraccionamiento subcelular seguido por el análisis del WB (Figura 1E ). TAP-Tat mostró una localización nuclear/nucleolar prominente, pero también se pudo detectar en el citoplasma. Estas observaciones fueron además validadas mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 1E ). A continuación se comparó la tasa de crecimiento y proliferación de las líneas celulares de Jurkat TAP y TAP-Tat (Materiales y Métodos S1), que eran equivalentes (Figura S4A ). Del mismo modo, el análisis FACS confirmó que las poblaciones relativas en G1, S y G2/M eran similares para las células de Jurkat TAP-Tat y TAP (Figura S4B ). Se etiquetaron las células de Jurkat TAP-Tat y Jurkat TAP con isótopo ligero (R0K0) y pesado (R6K6) que contenían arginina y lisina, respectivamente. Después de cinco pasajes en su respectivo medio SILAC, se recolectaron 85 millones de células de cada cultivo, se agruparon y se aislaron sus nucleolis como se describió previamente (Figura 1A ) [52] Para evaluar la calidad de nuestro procedimiento de fraccionamiento, se investigó el enriquecimiento específico de antígenos nucleolares conocidos mediante el análisis Western Blot (Figura 1D). Se encontró que la nucleolina (110 kDa) y la fibrilarina (FBL) (34 kDa), dos proteínas nucleolares principales conocidas por localizar al componente granular del nucleolo, estaban muy enriquecidas en la fracción nucleolar mixta. Se observó que la nucleolina se distribuía igualmente entre las fracciones nuclear y citoplasmática. Este patrón de distribución de nucleolina parece ser específico para las células T de Jurkat, como se muestra anteriormente [52, 53]. La proteína nuclear PARP-1 (Poly ADPribose polimerasa 1) (113 kDa) estaba presente en la fracción nuclear y nucleoplasmática, pero se desplegó en la fracción La alfa-tubulina (50 kDa) fue altamente abundante en la fracción citoplasmática y débilmente detectada en las fracciones nucleares. Colectivamente, estos resultados confirmaron que nuestros métodos produjeron una fracción nucleolar altamente enriquecida sin contaminación cruzada significativa. Posteriormente, la mezcla de proteína nucleolar fue tripsindigerida y los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas. El análisis proteomico cuantitativo comparativo se realizó utilizando MaxQuant para analizar las proporciones en isótopos para cada péptido identificado. Se cuantificó un total de 2427 péptidos, representando 520 proteínas nucleolares cuantificadas. La lista completa anotada de proteínas nucleolares cuantificadas está disponible en la Tabla S1 y los datos brutos del análisis de espectrometría de masas se depositaron en la base de datos de repositorios Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/), a la que se puede acceder utilizando las claves de hash descritas en materiales y métodos. Anotamos las proteínas cuantificadas utilizando las herramientas ToppGene Suite [54] y extrajimos las anotaciones de Gene Onthology (GO) e InterPro [55]. El análisis de los procesos biológicos GO (Figura 1F ) reveló que los procesos biológicos mejor representados incluían la transcripción (24%), el procesamiento de ARN (23%), el proceso del ciclo celular (13%) y la organización cromosómica (15%), que refleja las funciones asociadas nucleolares y es comparable a nuestra caracterización anterior del proteoma nucleo El análisis de distribución subcelular (Figura 1F ) reveló que nuestro conjunto de datos contenía proteínas conocidas por localizarse en el nucleolo (49%), en el núcleo (24%) mientras que el 15% de las proteínas estaban descritas previamente para residir exclusivamente en el citoplasma. La distribución subcelular fue similar a nuestro análisis anterior del proteoma nucleolar de células T de Jurkat [52]. Tabla S1. La distribución de las relaciones proteicas se representan en la Figura 1G como log 2 (cambio de abundancia). Las relaciones SILAC indican cambios en la abundancia proteica en la fracción nucleolar de las células TAP de Jurkat en comparación con las células TAP de Jurkat. La distribución de las proteínas cuantificadas siguió una distribución gaussiana (Figura 1G ). Un total de 49 proteínas nucleolares exhibieron un cambio significativo de 1,5 veces o mayor Las células no mostraron cambios en el contenido en estado estacionario de algunos de los principales y abundantes componentes del nucleolo, incluyendo nucleofosfmina (NPM1/ B23), C23, FBL, proteína nucleolar P120 (NOL1) y proteína nucleolar 5A (NOL5A). Las distintas proporciones de cambios proteicos sobre la expresión Tat podrían reflejar la reorganización nucleolar específica y las actividades alteradas del nucleolo. Realizamos el análisis del WB para validar los resultados basados en SILAC obtenidos por nuestro enfoque proteómico cuantitativo (Figura 2 ). 15 proteínas seleccionadas mostraron intensidad diferencial en las fracciones nucleolares sobre la expresión Tat, incluyendo 9 enriquecidos (HSP90b, STAT3, pRb, CK2a, CK2a', HSP90a, Transportin, ZAP70, DDX3), y 3 agotados (ILF3, BOP1 y SSRP1) proteínas. Además, también probamos por el análisis WB, abundancia de proteínas no afectada por la expresión Tat (Importin beta, FBL, B23, C23). Estos resultados destacan la concordancia en la tendencia de las proporciones correspondientes de SILAC, a pesar de algunas diferencias en los rangos cuantitativos. Cabe destacar que, usando WB, pudimos observar un cambio de intensidad para la proteína con un cambio de pliegue SILAC tan bajo como 1,25 veces. Por un lado, el umbral de los cambios en la abundancia de proteínas se puede determinar estadísticamente y luego destacar los cambios en la abundancia más grandes como se ilustra en la Tabla 1. Alternativamente, el enriquecimiento o agotamiento coordinado de la mayoría de las proteínas pertenecientes a un complejo o vía celular distinto permitiría la definición de un grupo de proteínas de interés y potencial significación. Por lo tanto, nos centramos en proteínas individuales enriquecidas o agotadas con actividades asociadas con la patogénesis molecular del VIH-1 o Tat, y en modificaciones agrupadas que afectan vías de señalización celular enteras y complejos macromoleculares. Inicialmente nos centramos en las proteínas de señalización que interactúan con Tat y/o la patogénesis molecular asociada del VIH-1 y cuya abundancia en el nucleolo fue modulada por la expresión Tat. Fosfo-proteína fosfatasas. Fosfo-proteína fosfatasa PP1 y PP2A son esenciales Es importante destacar que el PP1 representa el 80% de la actividad de la fosfatasa Ser/Thr dentro del nucleolo. En nuestro estudio, el PP1 fue potencialmente enriquecido por 1,52 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat, lo que apoya estudios previos que describen el objetivo nuclear y nucleolar de PP1a por el HIV-1 Tat y cómo PP1 aumenta la regulación de la transcripción del VIH-1 [58, 59, 60, 61, 62]. El PP1 c también fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro [63]. Curiosamente, la asociación Tat con los promotores de la subunidad PP2A resulta en la sobreexpresión y regulación de la actividad PP2A en linfocitos [64, 65]. Además, PP2A contribuye a la regulación de la transcripción y replicación del VIH-1 [61, 66]. Retinoblastoma Protein. El gen supresor tumoral pRb protein mostró un cambio de 1,4 veces en el nucleolus sobre la expresión Tat [67]. Además, el análisis WB confirmó la translocación distinta del pRb del nucleoplasma al nucleolus por Tat (Figura 2 ). Dependiendo del tipo de célula, pRb puede ser hiperfosforilado o hipofosforilado sobre la expresión Tat y puede regular negativamente o positivamente la transcripción mediada por Tat respectivamente [68, 69, 70]. Curiosamente, la hiperfosforilación de los desencadenantes del pRB en su translocación en el nucleolo [71]. La fosforilación del pRB también se asocia con un aumento de la biogénesis ribosómica y el crecimiento celular [72]. STAT3. El transductor de señal de factor de transcripción y activador de la transcripción 3 (STAT3) se enriqueció significativamente (1,86 veces) en la fracción nucleolar por la expresión constitutiva Tat. Además, el análisis WB indicó que la expresión Tat podría promover la relocalización del STAT3 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento distinto en el nucleolo (Figura 2). Curiosamente, estudios anteriores han demostrado la activación mediada por Tat de la señalización STAT3, como lo demuestra su estado de fosforilación [73]. Curiosamente, la fosforilación STAT3 indujo la dimerización de la proteína después de su translocación al núcleo [74]. YBX1. YBX1, la proteína multifuncional de unión al ADN/ARN fue enriquecida por 1,38 veces en el nucleolo de las células de Jurkat sobre la expresión Tat. Curiosamente, YBX1 interactúa con Tat y TAR y modula la expresión génica del VIH-1 [63, 75]. ZAP70. La proteína tirosina cinasa ZAP70 (proteína quinasa asociada a la cadena Zeta 70) fue enriquecida por 1,24 veces en el nucleolo de las células de Jurkat expresando Tat [76]. Además, el análisis del WB reveló que la expresión Tat podría promover la relocalización del ZAP70 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento La proteína de matriz nuclear interna, Matrin 3 (MATR3), presentó un cambio de 1,39 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat. Se localiza en el nucleolasmo con un patrón difuso excluido de los nucleolos [77]. La matrin 3 ha sido identificada como parte del nucleoloma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Dos estudios recientes han descrito a la matrin 3 como parte de complejos de ribonucleoproteínas, incluyendo también el VIH-1 Rev y (elemento de respuesta Rev) RRE que contiene ARN VIH-1, y promoviendo la regulación post-transcripción del VIH-1 [78, 79, 80]. CASP10. La molécula pro-apotótica de señalización, Caspasa 10 (CASP10), se agotó significativamente de las células nucleolus de Jurkat-Tat (0,82 veces) [81]. Importantemente, la expresión Tat desregula la expresión y actividad de CASP10 en las células Jurkat [82]. ADAR1. Adenosina deaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR1), que convierte las adenosinas en inosinas en ARN de doble cadena, se agotó significativamente del nucleolus de las células Jurkat-Tat (0,78 veces). Curiosamente, ADAR1 sobreexpresión regula la replicación del VIH-1 a través de un mecanismo de edición del ARN [83, 84, 85, 86, 87, 88]. Además, ADAR1 pertenece al interactoroma nuclear in vitro Para subrayar las relaciones estructurales y funcionales de las proteínas nucleolares afectadas por el VIH-1 Tat, construimos una representación en red de nuestro conjunto de datos. Utilizamos la versión 2.6.3 de Cytoscape [89] y utilizando el plugin MiMI [90] para mapear interacciones previamente caracterizadas, extraídas de bases de datos de interacción de proteínas (BIND, DIP, HPRD, CCSB, Reactome, IntAct y MINT), lo que resultó en una red altamente densa y conectada que incluía 416 proteínas (nodos) de las 536 proteínas, unidas por 5060 interacciones no dirigidas (borde) (Figura 3A). El análisis de centralidad reveló un umbral de 23.7 interacciones por proteína. El análisis de topología utilizando el plugin CentiScaPe [91] mostró que la distribución del grado de nodo sigue una ley de energía (Figura S5 Es importante destacar que cuando analizamos la distribución del coeficiente de agrupamiento (Figura S6 ) encontramos que la red está organizada en una arquitectura jerárquica [92], donde los nodos conectados forman parte de áreas altamente agrupadas mantenidas por pocos hubs organizados alrededor del HIV-1 Tat. Además, el análisis de la conexión en grados nodos de nuestra red identificó al HIV-1 Tat como la proteína más conectada (Figura S6 ). Específicamente, el análisis de topología indicó que los valores para las centrales Tat eran los más altos (grado de nodo, estrés, radialidad, cercanía, entreess y centroides), caracterizando a Tat como la proteína principal del hub de la red nucleolar. De hecho, un total de 146 proteínas han sido descritas previamente para interactuar con Tat (Figura 3B, Tabla S2 ). Estas proteínas están involucradas En paralelo, caracterizamos la magnitud de los cambios de abundancia proteica relacionados observados en distintas vías celulares (Figura 4). Biogénesis ribosomal. Inicialmente nos centramos en la biogénesis ribosoma, función primaria del nucleolo. Pudimos observar un aumento general y coordinado en la abundancia de proteínas ribosomales en el nucleolo por expresión Tat (Figura 4 ). Mientras algunas proteínas ribosomales permanecían inalteradas, Tat causó la acumulación nucleolar de varias proteínas ribosomas grandes y pequeñas distintas, excepto RPL35A, para las cuales la expresión Tat causó una marcada disminución en el nivel nucleolar (0,29 veces). Asimismo, varias proteínas involucradas en el procesamiento de ARNr exhibieron un aumento general en la acumulación nucleolar sobre la expresión Tat. Estos incluyen a los miembros canónicos humanos de la familia L7ae junto con los miembros que participan en la Caja C/D, H/ACA y U3 snoRNPs (Figura 4). Por el contrario, BOP1, un componente del complejo PeBoW (Pescadillo Bop1 WDR12) esencial para la maduración de la subunidad ribosómica grande, se agotó significativamente del nucleolo de las células TAP-Tat Jurkat (0,81 veces) y esto fue confirmado por el análisis WB (Figura 2 ) [93]. Sin embargo, los otros componentes complejos PeBoW, Pes1 (0,94 veces) y WDR12 (1,1 veces), no fueron afectados por la expresión Tat. Se identificaron y cuantificaron en nuestro conjunto de datos 55 proteínas de las 108 proteínas spliceosomal conocidas [94]. Estas proteínas incluyen las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares U1, U2 y U5, Sm D1, D2, D3, F y B, y las heterogéneas ribonucleoproteínas nucleares. Nuestros datos sugieren un aumento distinto en la abundancia de proteínas específicas complejas del spliceosoma tras la expresión de HIV-1 Tat en células T de Jurkat (Figuras 3 y 4). Las únicas tres proteínas que se agotaron significativamente del nucleolo tras la expresión del HIV-1 Tat fueron RBMX (0,89 veces), HNRNPA2B1 (0,84 veces) y SNRPA (0,81 veces). Varias investigaciones mostraron alteración de la expresión en los factores de empalme celular en células infectadas por HIV-1 [95, 96] Hemos identificado varias chaperonas moleculares, cochaperonas y otros factores involucrados en la proteostasis para ser altamente enriquecidos en el nucleolo de las células T sobre la expresión Tat (Figuras 3 y 4), muchos de los cuales fueron previamente caracterizados como parte del interactoroma nuclear Tat [63]. Varias proteínas de choque térmico incluyendo DNAJs, específicas HSP90, HSP70 y HSP40 isoformas y sus cofactores se enriquecieron distintivamente en la fracción nucleolar de las células Jurkat expresando Tat (Figura 4 ). Como lo muestra WB, mientras que HSP90a y b son principalmente citoplasmáticas, la expresión Tat desencadena su relocalización al núcleo y nucleolus, corroborando nuestro enfoque cuantitativo proteómico (Figura 2). Del mismo modo, el choque térmico puede hacer que el HSP90 y el HSP70 se reubiquen en el nucleolo [97, 98, 99, 100, 101]. En un estudio reciente, el grupo de Fassati ha demostrado que el HSP90 está presente en el promotor del VIH-1 y puede regular directamente la expresión génica viral [102]. También observamos el aumento coordinado de la abundancia de la clase I (GroEL y GroES) y la clase II (chaperonina que contiene TCP-1 (CTT)) moléculas de chaperonina (Figuras 3 y 4) sobre la expresión Tat. Vía proteasómica de la ubiquitina. La vía proteasómica es el principal sistema proteolítico de células eucariotas [103]. Es importante destacar que la vía ubiquitina-proteasoma nuclear controla el suministro de proteínas ribosomales y es importante para la biogénesis ribosoma [104, 105]. El proteasoma 26S está compuesto por la partícula núcleo 20S (CP) y la partícula reguladora 19S (RP). Alternativamente, CP puede asociarse con el 11S RP para formar el inmunoproteasoma. Todas las proteínas cuantificadas en nuestro estudio son parte del complejo regulador 19S e incluyen PSMD2 (1,5 veces), PSMD3 (1,32 veces), PSMD11 (1,25 veces) y PSMD13 (0,72 veces), el único componente proteasoma significativamente agotado del nucleolo en presencia de Tat (Figura 4). Curiosamente, Tat interactúa con subunidades distintas del sistema proteasoma, incluyendo las subunidades 19S, 20S y 11S. Las consecuencias de estas interacciones incluyen la competencia de Tat con 11S RP o 19S RP para la unión al 20S CP, que resultó en la inhibición de la actividad de la peptidasa 20S [106, 107, 108, 109, 110, 111]. Además, Tat demostró modificar la composición proteosoma y la actividad, que afecta a la generación de antígenos péptidos reconocidos por linfocitos T citotóxicos [112]. Importantemente, un estudio reciente demostró que en ausencia de Tat, los componentes proteosomas están asociados al promotor del VIH-1 y la actividad proteosoma limita la transcripción [113]. La adición de Tat promovió la disociación de la subunidad 19S del proteasoma 20S, seguido por el enriquecimiento distintivo del complejo similar a 19S en extractos nucleares junto con el reclutamiento mediado por Tat de las subunidades 19S para el promotor del VIH-1, lo que facilitó su elongación transcripcional [113]. También cuantificamos UBA1 (1,36 veces), la ubiquitina-proteína ligasa UHRF1 (1,13 veces), UBC (1 veces) y dos Ubiquitinspecific-peptidases, USP30 (1,28 veces) y USP20 (0,06 veces) (Figura 4). Replicación y reparación del ADN. Tras la expresión del HIV-1 Tat, observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de varios factores celulares asociados con la replicación del ADN y las vías de reparación (Figura 4). Tat indujo el enriquecimiento coordinado del complejo MCM2-7 de mantenimiento cromosómico en miniatura (de 1.23-a 3,30 veces, respectivamente) [114]. MCM7, 6 y 3 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. El mantenimiento estructural de los cromosomas 2, SMC2, fue enriquecido (1,35 veces) en la fracción nucleolar por expresión Tat. SMC2 fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Mientras que el factor de replicación C1 (RFC1) y RFC2 (1,31 y 1,28 veces respectivamente) mostró un cambio de pliegue incrementado y RFC5/3 no se vieron afectados, RFC4 se redujo gravemente (0,69 veces) de la fracción nucleolar sobre la expresión Tat [115]. El RFC1 y RFC2 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Tat indujo el enriquecimiento de XRCC6 (1,27 veces) y XRCC5 (1,36 veces) en el nucleolo, que están involucrados en la reparación de la unión final del ADN no-homologoso (NHEJ) [116]. XRCC6 se asocia con complejos de preintegración viral que contienen HIV-1 Integrase y también interactúan con Tat y TAR [117, 118, 119]. Además, en una pantalla basada en ribozyme, el derribo del XRCC5 (Ku80) disminuyó tanto la integración retroviral como la transcripción Tatmediated [120]. Como parte de la reparación de la escisión base (BER), hemos identificado una importante endonucleasa apurínico/apirimidinica 1 (APEX1) (1,29 veces). Importantemente, en una pantalla de siRNA dirigida a los factores de reparación del ADN, se encontró que la reducción de APEX1 inhibe la infección por VIH-1 por más de 60% [121]. La proteína del grupo de alta movilidad (HMG) HMGA1 (1,30 veces), fue enriquecida en el nucleolo después de la expresión Tat [122]. HMGA1 interactúa con la integración del VIH-1 y forma parte del complejo de preintegración del VIH-1 [123, 124]. Importantemente, HMGA1 ha sido identificada en una pantalla proteómica, como un cofactor celular que interactúa con el VIH-1 59líder [125]. Metabolismo. Nuestros datos proteómicos sugieren que Tat induce perturbaciones en la glucólisis, la vía del fosfato pentosa y la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos (Figura 4 y Figura S7 ). En particular, en las células T que expresan Tat, detectamos cambios coordinados en la abundancia de proteínas no conocidas previamente que se asocian con la patogénesis del Tat, que revelaron conexiones inesperadas con la glicólisis y la vía del fosfato pentosa, incluyendo las siguientes enzimas glicólicas, lactato deshidrogenasa B (LDHB) (1,37 veces), la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1,17 veces) y la mutasa del ácido fosfoglicérico (PGAM1) (0,89 veces) (Figura 4 y Figura S En resumen, el GPI cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Posteriormente, el PFKP cataliza la conversión irreversible de fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato y es una enzima reguladora clave de la glucólisis. Al final de la vía glicolítica, PKM2, en su forma tetramérica, se sabe que genera ATP y piruvato, mientras que el LDHB desvía la mayoría del piruvato a la producción y regeneración de lactato de NAD+ en apoyo a la glicólisis continua, un fenómeno descrito para las células T proliferativas [126]. Esto regula la disponibilidad de los intermedios de glucosa, que se redirigen a las vías de la pentosa fosfato y de la serina biosíntesis para la producción de precursores biosintéticos de nucleótidos, fosfolípidos y aminoácidos. Como parte de la vía del fosfato de pentosa, hemos caracterizado el enriquecimiento significativo de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) (2,11 veces), que ramas de la vía de la glicólisis para generar NADPH, ribosa-5fosfato un precursor importante para la síntesis de nucleótidos. Consistente con esto, detectamos el aumento coordinado en la abundancia de enzimas que juega un papel central en la síntesis de purinas y pirimidinas. Más específicamente, IMPDH2 (1,66 veces), una enzima limitante de la tasa en el punto de rama de la biosíntesis de nucleótidos de purina, que conduce a la generación de nucleótidos de guanina, fosforibosil pirofosfato sintetasa 2 (PRPS2) (1,41 veces), cytidine-5-prime-trifosfato sintetasa (CTPS) (1,74 veces) que cataliza la conversión de UTP a CTP y la subunidad grande de ribonucleótido reductasa (RRM1) (1,56 veces). En parralel, observamos el aumento de la abundancia de la fosfoserina aminotransferasa PSAT1 (1,90 veces), una enzima implicada en la biosíntesis de serina, que se ha relacionado con la proliferación celular in vitro. La interfaz host-virus es un aspecto fundamental en la definición de la patogénesis molecular del VIH-1 [127, 128, 129, 130, 131, 132, 133]. De hecho, con su repertorio limitado de proteínas virales, el VIH-1 se basa ampliamente en la maquinaria de las células huésped para su replicación. Varios estudios recientes han capitalizado los recientes avances en las tecnologías ''OMICS'', y han revelado importantes perspectivas en este diálogo molecular finamente afinado [132, 134]. El VIH-1 Tat es esencial para la replicación viral y orquesta la expresión génica del VIH-1. La proteína reguladora viral es conocida por interactuar con una amplia gama de proteínas celulares y modular la expresión del gen celular y la vía de señalización [135, 136]. Nosotros y otros hemos utilizado enfoques a nivel del sistema para investigar la interacción Tat con la maquinaria de las células de acogida, que han caracterizado a HIV-1 Tat como mediador crítico de la interfaz host-viral [137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149]. Aquí, hemos investigado el tráfico de proteínas nucleolares en respuesta a la expresión HIV-1 Tat en células T, con el fin de proporcionar ideas únicas y novedosas sobre el papel de la compartimentación de proteínas por Tat en el ajuste fino de la disponibilidad de proteínas y la función. Hemos desarrollado para este estudio, un modelo celular utilizando Jurkat T-cells expresando firmemente Tat fusionado en su N-ternminal a TAP-tag. Es importante destacar que se han empleado ampliamente para evaluar la patogénesis mediada por Tat utilizando enfoques de todo el sistema y para analizar las vías y funciones de señalización celular clave de las células T [144, 150, 151, 152]. De hecho, hemos encontrado que son especialmente adecuadas para cultivos in vitro prolongados en el medio SILAC y posterior aislamiento de su nucleolo, seguido por el análisis de MS, que requiere hasta 85 millones de células. Fusionamos Tat a la etiqueta TAP para permitir futuras aplicaciones posteriores como purificación de afinidad de Tandem o análisis IP de Cromatina. Importantemente, hemos confirmado que la etiqueta TAP N-terminal no interfirió con la función Tat ni su localización en las células Jurkat, cuando se compara con la no etiquetada-Tat. Aunque se sabe que Tat se acumula en el núcleo y el nucleolo en las células de Jurkat y otras líneas celulares transformadas, en las células T primarias, Tat se describe para acumularse principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Estas diferencias permanecen por caracterizarse, pero podrían estar relacionadas con diferentes niveles de expresión de los factores de transporte en las líneas celulares transformadas versus las células primarias, como se describe recientemente por Kuusisto et al. [39]. Además, Stauber y Pavlakis han sugerido que la localización nucleolar Tat podría ser el resultado de la sobreexpresión Tat [31]. Aquí, hemos seleccionado y empleado una población policlonal de células T Jurkat que expresan Tat en diferentes niveles. Proponemos que esta heterogeneidad en los niveles de expresión Tat podría reflejar la expresión estocástica Ta Utilizando una estrategia proteómica cuantitativa basada en un enfoque organélaro, cuantificamos más de 520 proteínas nucleolares, incluyendo 49 proteínas que muestran un cambio significativo en el pliegue. La medida en que las variaciones inducidas en la abundancia de proteínas nucleolares son biológicamente relevantes y pueden afectar los procesos celulares y/o virales queda por determinar. Sin embargo, la naturaleza biológica de las vías y los complejos macromoleculares afectados nos permiten discutir sus posibles asociaciones con la patogénesis del VIH-1. El VIH-1 Tat se expresa tempranamente después de la integración del genoma del VIH-1 y media el cambio a la fase de producción viral, asociado con la expresión génica proviral robusta, el ensamblaje de proteínas virales y, en última instancia, el desarrollo y liberación de viriones. En este contexto y basado en nuestros resultados, proponemos que Tat podría participar en la configuración del entorno intracelular y el perfil metabólico de De hecho, observamos el enriquecimiento nucleolar distinto de proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica, lo que podría ser indicativo de un aumento en la síntesis proteica. Con la notable exepción de RPL35A depleción nucleolar, proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica estaban en las 20 proteínas nucleolares más enriquecidas (NHP2L1, RLP14, RPL17, RPL27, RPS2, RPL13). Además, este efecto parece ser específico del HIV-1 Tat ya que la inhibición de transcripción por Actinomicina D resultó en el agotamiento total de proteínas ribosómicas en el nucleolo [9]. Además, el análisis proteómico cuantitativo de las células nucleas en adenovirus infectados mostró una leve disminución en proteínas ribosómicas [24] Si esto refleja un cambio en la biogénesis del ribosoma y/o un cambio en la composición de las subunidades ribosomales queda por determinar. Sin embargo, la necesidad adaptada de una producción elevada del ribosoma es intuitiva para un sistema que necesita apoyar la creciente demanda de nueva síntesis de proteínas virales. En parralel, observamos la modulación concordante de las vías que regulan la homeostasis proteica. Observamos la significativa acumulación nucleolar de múltiples chaperonas moleculares incluyendo las HSPs, el complejo TCP-1, y moléculas CANX/CALR y la abundancia nucleolar interrumpida de proteínas pertenecientes a la vía ubiquitina-proteasoma, que controla el suministro de proteínas ribosomales [104, 105]. Estas observaciones apoyan estudios previos que describen la modulación de la actividad proteasómica por Tat, que afectan la expresión, el montaje y la localización de subunidades específicas de los complejos proteasómicos [106, 107, 108, 109, 110, 111, 113]. También observamos el agotamiento concomitante de CASP10 en el nucleolo de Jurkat TAP-Tat. Se ha sugerido que CASP10 podría estar dirigido al nucleolo para inhibir la síntesis proteica [154]. Curiosamente, la presencia y los roles potenciales de las chaperonas moleculares en el nucleolo han sido destacados por Banski et al, quienes explican cómo la red chaperona podría regular la biogénesis ribosómica, la señalización celular y la respuesta al estrés [97, 155]. A medida que la producción viral avanza hacia la fase tardía y aumenta el estrés celular, el enriquecimiento nucleolar de las chaperonas moleculares por Tat no sólo podría permitir el plegado de adequat de proteínas virales recién sintetizadas, sino que también podría promover la tolerancia de las células infectadas al estrés y mantener la viabilidad celular. Coincidentemente, observamos el marcado enriquecimiento nucleolar de enzimas pertenecientes a vías metabólicas incluyendo glicólisis, fosfato de pentosa, nucleótido y aminoácidos vías biosintéticas. Del mismo modo, estas vías se elevan en células T proliferativas o en células cancerosas después de un cambio metabólico a la glicólisis aeróbica, también conocido como el efecto Warburg [156, 157, 158, 159]. Allí, los intermedios de glucosa de la vía de la glicólisis no sólo se comprometen a la producción de energía y se descomponen en piruvato para el ciclo TCA, sino que se redirigen a vías alternativas, incluyendo la vía del fosfato de pentosa, y se utilizan como precursores metabólicos para producir nucleótidos, aminoácidos, acetil CoA y NADPH para la homeostasis redox. De manera consistente, también se observó el enriquecimiento nucleolar concomitante de enzimas pertenecientes a la vía de síntesis de nucleótidos, incluyendo IMPH2, una enzima limitante conocida para controlar el pool de GTP. De igual manera, se observó el enriquecimiento nucleolar de PSAT1, una enzima involucrada en el metabolismo de serina y treonina, que está asociada con la proliferación celular [160]. Colectivamente, proponemos que mediante el control de la homeostas Sin embargo, las enzimas glucolíticas han sido detectadas en las fracciones nuclear y nucleolar mediante análisis proteómicos [8, 161]. Además, las enzimas glucolíticas, como PKM2, LDH, fosfoglicerato cinasa, GAPDH y aldosa, también han sido reportadas para mostrar localización nuclear y unirse al ADN [162]. Más específicamente, PKM2 es conocido por asociarse con el promotor y participar en la regulación de la expresión génica como coactivador transcripcional [163]. HIV-1 Tat ha sido descrito previamente como un inmunoregulador y más específicamente, ha sido reportado tanto para inhibir o promover la señalización TCR [164]. Hemos observado el enriquecimiento nucleolar por Tat de componentes proximales o aguas abajo clave de las vías de señalización de células T, incluyendo ZAP70, ILF3 y STAT3, que juegan un papel crucial en el desarrollo y activación de células T. Anteriormente los habíamos identificado como componentes específicos de células T del nucleolo, y los estudios de IF sugirieron que su asociación con el nucleolo podría ser regulada por condiciones específicas [165]. Nuestros resultados apoyan aún más que Tat podría contribuir a la disregulación de las señales derivadas de TCR y que el nucleolo podría representar un importante enlace espacial para las moléculas de señalización TCR. Observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de componentes clave de las vías de replicación, recombinación y reparación del ADN por Tat. Estos incluyen XRCC5 y XRCC6, HMGA1, APEX1, MCM2-7, SMC2, RFC1 y RFC2, mientras que RFC4 se encontró significativamente agotado. Curiosamente, estos cofactores se han asociado con la eficiencia de la integración del ADN retroviral en el ADN del huésped o la integridad del provirus integrado [166]. Si la abundancia creciente de estos factores dentro del nucleolo podría estar asociada con su participación potencial en la integración y mantenimiento de la integridad del gen provirus, queda por determinar. Los mecanismos de segregación mediada por Tat y compartimentación de proteínas dentro o fuera del nucleolo pueden depender de factores inherentes para cada proteína y la naturaleza de su relación con Tat, ya que el fraccionamiento subcelular combinado con el análisis del WB mostró que el patrón y el grado de redistribución subcelular entre proteínas variaban. Pudimos observar casos en los que Tat regulaba la expresión de proteínas que resultaban en un aumento general de estas proteínas en los compartimentos celulares incluyendo el nucleolo (DDX3, TNPO1). Alternativamente, Tat podía desencadenar la translocación nucleolar de proteínas directamente desde el citoplasma o el nucleoplasma (pRb). Además, observamos proteínas citoplasmáticas redistribuidas tanto al nucleoplasma como al nucleolo sobre la expresión Tat (STAT3, ZAP70 y HSP90). Finalmente, también notamos el agotamiento proteico en la fracción nucleolar acompañado de un aumento en el nucleoplasma (SSRP1). Sigue siendo difícil en esta etapa, apreciar si la acumulación de proteínas específicas resultaría en su activación o inhibición al secuestrarlas de su lugar de acción. Por el contrario, el agotamiento de una proteína del nucleolus podría resultar en la regulación descendente de su actividad en este lugar o podría ser el resultado de su movilización desde su sitio de almacenamiento, el nucleolus, al nucleoplasma o citoplasma donde puede realizar su función. Cabe destacar que identificamos a varios socios conocidos del VIH-1 Tat involucrados en la patogénesis del VIH-1, lo que sugiere que Tat podría modular físicamente su objetivo nucleolar o su reclutamiento a un sitio específico en el nucleoplasma o citoplasma. Tat también podría promover modificaciones post-traducción, lo que podría mediar la focalización de proteínas específicas al nucleolus. Esto se ilustra por las siguientes proteínas enriquecidas, pRb, PP1 y STAT3, para lo que la fosforilación es inducida por Tat. Importantemente, su estado de fosforilación determina su distribución subcelular, proporcionando así un mecanismo Además, nuestros datos indican que las serinas/treoninas quinasas (CK2 a') y fosfatasas (PP1) se enriquecieron significativamente en las fracciones nucleolares de Jurkat TAP-Tat. Estas enzimas representan la mayor parte de la actividad de fosforilación/desfosforilación en el nucleolo y pueden actuar como reguladores del tráfico de proteínas nucleolares. Además, Tat disminuyó significativamente los niveles de SUMO-2 en el nucleolo. Del mismo modo, se sabe que las modificaciones posteriores a la traducción mediadas por SUMO modulan la localización de proteínas nucleolares [104]. Dada la importancia potencial de las modificaciones posteriores a la traducción, incluida la fosforilación en el cambio mediado por Tat de la abundancia de proteínas nucleolares, un enfoque proteomico más específico como el enriquecimiento de fosfopétidos El control de la rotación de proteínas también es un medio importante para modular la abundancia de proteínas nucleolares. Las proteínas ribosómicas son degradadas por la vía Ubiquitina-Proteasoma para asegurar que su abundancia coincida con los niveles de transcripción de rRNA. A la inversa, las proteínas de choque térmico HSP90s las protegen de la degradación. Curiosamente, nuestros datos muestran que la modulación Tat de las proteínas de abundancia asociadas con la vía Ubiquitina-proteasoma y choque térmico. Esto podría contribuir al enriquecimiento observado de proteínas ribosómicas por Tat. Sin embargo, no podemos excluir que la mayor abundancia de proteínas ribosómicas en el nucleolo podría ser el resultado de la prevención mediada por Tat de su exportación al citoplasma. Curiosamente, utilizando un sistema celular diferente, una cepa transgénica de Drosophila melanogaster Tat, Ponti et al, analizaron los efectos de Tat en la biogénesis ribosoma, después de 3 días de tratamiento de choque térmico para inducir la expresión Tat bajo el control del promotor hsp70 [167]. Después de la expresión Tat, observaron un defecto en el procesamiento pre-rRNA asociado con una disminución en el nivel de 80S ribosomas [167]. Sin embargo, los diferentes sistemas celulares empleados combinados con la inducción de choque térmico de 3 días hacen que sus resultados sean difíciles de comparar con los nuestros. Mientras que estudios anteriores a nivel de sistema han monitoreado los efectos de la expresión Tat del VIH-1 en las células T, a nuestro conocimiento, hemos presentado aquí el primer análisis proteómico de la composición dinámica del nucleolus en respuesta a la expresión Tat del VIH Utilizando proteómica cuantitativa, hemos subrayado los cambios en la abundancia de proteínas nucleolares específicas y hemos destacado la reorganización nucleolar extensa y coordinada en respuesta a la expresión constitutiva Tat. Nuestros hallazgos subrayan que Tat que expresa células T exhiben un perfil proteómico nucleolar único, que puede reflejar una estrategia viral para facilitar la progresión a la producción viral robusta. Importantemente, hemos notado la relación funcional de proteínas nucleolares de nuestro conjunto de datos con la patogénesis VIH-1 y el Tat VIH-1 en particular. Esto aumenta aún más nuestra confianza en nuestra estrategia experimental y sugiere un papel para Tat en el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares. Finalmente, nuestro estudio proporciona nuevas ideas sobre la importancia de Tat en la conversación cruzada entre funciones nucleolares y patogénesis viral. También hemos identificado cambios en la abundancia de proteínas nucleolares que no estaban previamente asociados con la patogénesis del VIH-1, incluyendo proteínas asociadas a vías metabólicas, que proporcionan nuevos objetivos potenciales y vías celulares para la intervención terapéutica.Células T Jurkat, clon E6.1 (ATCC), Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP se mantuvieron en el medio RPMI-1640 complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (Gibco, aprobado por la UE), y antibióticos. Células Phoenix-GP (G.P. Nolan; www.stanford.edu/ group/nolan/), se mantuvieron en el medio DMEM complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (GIBCO, aprobado por la UE). La secuencia de HIV-1 Tat (VIH-1 HXB2, 86 aminoácidos) fue subclonada en el vector pENTR 2B (Invitrogen, A10463). Usando la tecnología Gateway (Invitrogen), introdujimos la secuencia HIV-1 Tat en el plásmido pCeMM-NTAP(GS)-Gw [168]. Las células Fénix (G.P. Nolan; www.stanford.edu/group/nolan/), fueron transfectadas usando Fugene 6 (Roche) con 5 mg del plásmido NTAP-Tat o NTAP y 3 mg del pMDG-VSVG. Los sobrenadantes virales fueron recolectados después de 48 h, filtrados y utilizados para transducir las líneas celulares de Jurkat. La construcción se denomina NTAP-Ta Utilizando la entrega de genes retrovirales, transferimos de forma estable células Jurkat (clone E6.1 (ATCC)). Los clones positivos llamados Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron ordenados para enriquecer la población de células que expresaban GFP usando el clasificador de células BC MoFlo XDP (Beckman Coulter). Las fracciones subcelulares (10 mg) fueron resueltas por SDS-PAGE y transferidas a membranas BioTrace PVDF (Pall corporation). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: a-Tubulina (Sc 5286), C23 (Sc 6013), y Fibrilarina (Sc 25397) de Santa Cruz Biotechnology, y PARP (AM30) de Calbiochem, Ratón anti-ZAP 70 (05-253, Millipore), Ratón anti-STAT3 (06-596, Millipore), Ratón anti-ILF3 (ab92355, Abcam), Ratón anti-HSP90 beta (ab32568, Abcam), Ratón anti-ADAR1 (ab88574, Abcam), Ratón anti-HDAC1 (ab19845, Abcam), Ratón anti-SSRP1 (ab21584, Abcam) conejo anti-BOP1 (ab86982, Abcam), Ratón anti-KpNB1 (ab10303, Abcam), Ra Para el análisis SILAC-RPMI R0K0 y SILAC-RPMI R6K6 (Células Dundidas) se utilizó un medio con un 10% de FBS dializado (GIBCO, 26400-036); las células Jurkat que expresaban NTAP-Tat y NTAP fueron transitadas en serie y cultivadas durante cinco duplicados para asegurar la incorporación completa de los aminoácidos marcados; la viabilidad de las células se verificó con Trypan Blue (0,4% solución, SIGMA) y posteriormente se confirmó mediante tinción IP y análisis FACS; las células se mezclaron a la relación 1:1 para obtener 140610 6 células; los nucleoli fueron aislados de la población celular mixta como se describió previamente en Jarboui et al., [165]. Los extractos nucleolares (100 mg) fueron resuspendidos en bicarbonato de amonio de 50 mM y en solución de tripsina digerida como se describió previamente en Jarboui y col. [165]. La muestra se realizó en un espectrómetro de masa termoscientifico LTQ Orbitrap XL conectado a un sistema cromatógrafo NANO LC.1DPLUS que incorporaba una muestra automática. La muestra fue cargada en una columna Biobasic C18 PicofritTM (100 mm de longitud, 75 mm ID) y fue separada por un gradiente de acetonitrilo en aumento, utilizando un gradiente de 142 min de fase inversa (0-40% de acetonitrilo durante 110 min) a un caudal de 300 nL min-1. El espectrómetro de masa fue operado en modo iónico positivo con una temperatura capilar de 200uC, una tensión capilar de 46V, una tensión de lente de tubo de 140V y con un potencial de 1800V aplicada al frit. Todos los datos fueron adquiridos con el espectrómetro de masa que funciona en modo de conmutación automática dependiente de datos. Se realizó una exploración MS de alta resolución utilizando el Orbitrap para seleccionar los 5 iones más intensos antes del análisis MS/MS utilizando la trampa Ion. La eficiencia de incorporación de aminoácidos etiquetados fue determinada mediante el análisis de los péptidos identificados en nucleoli aislados de la población celular mantenida en el medio 'Heavy' como se describe en [169]. Nuestro análisis mostró que teníamos una eficiencia de incorporación.95% (datos no mostrados). Los espectros MS/MS fueron buscados para la identificación y cuantificación de los péptidos utilizando el software MaxQuant [170] (versión 1.1.1.36), la Base de Datos del IPI Humano (versión 3.83) y el motor de búsqueda Andrómeda asociado a MaxQuant [171]. Se utilizaron parámetros estándar para MaxQuant con el Acetil (término N de Proteína) como modificación variable y Carbamidometilo (Cys) como modificación fija, se permitieron 2 escisiónes perdidas, excepto que se prohibió el filtrado de aminoácidos etiquetados. La desviación de masa inicial de los iones precursores y fragmentos fue de 7 ppm y 0,5 Da, respectivamente. Cada relación proteica fue calculada como promedio ponderado de intensidad de los coeficientes de péptidos individuales. Las proteínas fueron identificadas con el mínimo de un péptido con una tasa La ontología genética, la vía KEGG y los términos Pfam se extrajeron de entradas UNIPROT utilizando Perseo, un software del paquete de análisis de datos MaxQuant (http://www.maxquant.org ), y las herramientas de la suite ToppGene [54]. El Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron transfectados utilizando el sistema de electroporación Amaxa (biosistema Amaxa) con el pGL3 (pGL3-LTR) (Promega) como recomendado por Amaxa Biosystem. Los ensayos de doble luciferasa (Promega) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de Luciferasa se midió y normalizó contra la cantidad total de proteínas cuantificada por el kit de cuantificación de proteínas BCA (Pierce, Thermo Scientific). Para preservar Las células se fijaron en un 2% PFA durante 10 minutos en RT, permeabilizaron en un 0,5% Triton X-100 durante 15 minutos en RT y se bloquearon con 5% FCS. Las células se incubaron con el anticuerpo Tat VIH-1 de conejo (ab43014, Abcam) seguido por el anticuerpo secundario anti-Rabbit alexa fluor 647 (A-21246, Invitrogen). Las células se les permitió unirse a Cell-Tak (BD) recubierto de Diapositivas Silanizadas (DaoCytomation), y manchado con DAPI. Las imágenes se capturaron con un Microscopio Confocal Carl Zeiss equipado con un objetivo DIC de aceite de Plan-Apocromat 63X/14. El archivo de datos RAW proteómicos del análisis de espectrometría de masas se depositó en el repositorio Tranche(http El archivo se puede acceder y descargar utilizando la siguiente clave de hash:(R3O5SV5Z6HvWqrBNDhp21tXFetluDWYxvwMIfU-h6e1kMgarauCSq4dlNcxeUvFOHDEzLeDcg4X5Y8reSb6-MUA6wM1kIAAAAAAB/w = ). Materiales y Métodos S1 Descripción de los métodos empleados para examinar el ciclo celular, la viabilidad celular y el análisis de proliferación celular. (DOCX)

¿Dónde se crean el ARNr y los ribosomas?

Tráfico de proteínas nucleolares en respuesta al VIH-1 Tat: Rewiring the Nucleolushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499507/SHA: efa871aeaf22cbd0ce30e8bd1cb3d1afff2a98f9Autores: Jarboui, Mohamed Ali; Bidoia, Carlo; Woods, Elena; Roe, Barbara; Wynne, Kieran; Elia, Giuliano; Hall, William W.; Gautier, Virginie W.Fecha: 2012-11-15DOI: 10.1371/journal.pone.0048702Licencia: cc-byAbstract: La proteína Tat transactivante es una proteína reguladora viral esencial para la replicación del VIH-1. El nucleolo, un compartimento subnuclear altamente dinámico y estructurado sin membrana, es el sitio de ARNr y biogénesis ribosoma y está involucrado en numerosas funciones celulares incluyendo la regulación transcripcional, el control del ciclo celular y la infección viral. Importantemente, el tráfico nucleolar transitorio tanto de Tat como de las transcripciones virales del VIH-1 son críticos en la replicación del VIH-1, sin embargo, el(los) papel(es) del nucleolo en la replicación del VIH-1 sigue sin estar claro. Para entender mejor cómo la interacción de Tat con la maquinaria nucleolar contribuye a la patogénesis del VIH-1, investigamos los cambios cuantitativos en la composición del proteoma nucleolar de las células T de Jurkat que expresan establemente el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta TAP. Utilizando un enfoque proteómico organélaro basado en espectrometría de masas, junto con el etiquetado de isótopos estables en cultivo celular (SILAC), cuantificamos 520 proteínas, incluyendo 49 proteínas que muestran cambios significativos en la abundancia de nucleolos de células T de Jurkat sobre la expresión Tat. Numerosas proteínas que exhiben un cambio de pliegue fueron interactuadores Tat bien caracterizados y/o conocidos por ser críticos para la replicación del VIH-1. Esto sugiere que el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares por Tat proporcionan una capa adicional de control para regular la maquinaria celular involucrada en la patogénesis del VIH-1. El análisis del camino y la reconstrucción de la red revelaron que la expresión Tat resultó específicamente en el enriquecimiento nucleolar de proteínas que participan colectivamente en biogénesis ribosomal, homeostasis de proteínas, vías metabólicas incluyendo glucolítico, fosfato de pentosa, nucleótidos y aminoácidos vías biosintéticas, respuesta al estrés, vías de señalización de células T e integridad del genoma. Presentamos aquí el primer perfil diferencial del proteoma nucleolar de células T que expresan el HIV-1 Tat. Discutimos cómo estas proteínas participan colectivamente en redes interconectadas que convergen para adaptar las actividades dinámicas del nucleolus, que favorecen las actividades biosintéticas del huésped y pueden contribuir a crear un entorno celular que apoye la producción robusta del HIV-1. Texto: El nucleolus es un compartimento subnuclear altamente ordenado organizado alrededor de loci genéticos llamados regiones organizadoras nucleolares (NORs) formado por grupos de cientos de repeticiones de genes rDNA organizadas en repetición tándem cabeza a cola [1, 2]. Organelo sin membrana descrito originalmente como la ''Fábrica Ribosoma'', el nucleolus está dedicado a la transcripción de rDNA dirigida por ARN-polimerasa-I, procesamiento de rARN mediado por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (SORNPs) y conjunto ribosoma. La biogénesis del ribosoma es esencial para la síntesis de proteínas y la viabilidad celular [2] y, en última instancia, resulta en las subunidades ribosomales grandes (60S) y pequeñas (40S), que posteriormente se exportan al citoplasma. Este proceso celular fundamental, al que la célula dedica la mayor parte de sus recursos energéticos, está estrictamente regulado para adaptarse a los cambios dinámicos en la proliferación celular, la tasa de crecimiento y las actividades metabólicas [3]. El nucleolus es el sitio de procesamiento adicional de ARN, incluyendo la exportación y degradación de ARNm, la maduración de pequeños PNNR nucleares ricos en uridina (U snRNPs), que forman el núcleo del spliceosoma, biogénesis de ARNt y microARNs (miRNAs) [4]. El nucleolus también está involucrado en otros procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular, procesos oncogénicos, respuestas de estrés celular y traducción [4]. El concepto de nucleolo multifuncional y altamente dinámico ha sido corroborado por varios estudios que combinan enfoques proteómicos organelares y espectrometría cuantitativa de masas, y describen miles de proteínas que transitan por el nucleolo en respuesta a diversas condiciones metabólicas, estrés y ambientes celulares [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Colectivamente, los estudios mencionados representan hitos en la comprensión de la complejidad funcional del nucleolo, y demostraron que las proteínas nucleolares están en intercambio continuo con otros compartimentos nucleares y celulares en respuesta a determinadas condiciones celulares. Los estudios proteómicos que analizan los nucleoli de las células infectadas por el virus sincitial respiratorio humano (HRSV), el virus influenza A, el virus de la bronquitis infecciosa por coronavirus aviar (IBV) o el adenovirus destacaron cómo los virus pueden alterar de forma distintiva la distribución de proteínas nucleolares [2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Curiosamente, tanto las proteínas reguladoras del VIH-1 Tat como Rev localizan al nucleoplasma y al nucleolus. Ambas secuencias abarcan una señal de localización nucleolar (NoLS) que se superpone con su señal de localización nuclear (NLS), que rige su localización nucleolar [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. Además, Tat y Rev interactúan con el antígeno nucleolar B23 Sin embargo, un estudio reciente describió que en contraste con las células T de Jurkat y otras líneas celulares transformadas donde Tat está asociado con el núcleo y el nucleolo, en las células T primarias Tat se acumula principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Mientras que la regulación de su importación y/o exportación nuclear activa, como mediada por la familia de la carioferina/importación, se han descrito bien, los mecanismos que distribuyen Tat y Rev entre el citoplasma, el nucleoplasma y el nucleolo siguen siendo elusivos [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48]. Importantemente, dos estudios importantes de Machienzi y otros han revelado importantes vínculos funcionales entre la replicación del VIH-1 y el nucleo En primer lugar, podrían inhibir la replicación del VIH-1 y la función de transactivación Tat empleando un señuelo TAR dirigido específicamente al nucleolo. Además, utilizando un enfoque similar, con una ribozima anti-VIH-1 de cabeza martillo fusionada al ARN nucleolar pequeño U16 y por lo tanto dirigida al nucleolo, podrían suprimir dramáticamente la replicación del VIH-1. Colectivamente, estos hallazgos sugieren fuertemente que las transcripciones del VIH-1 y el tráfico nucleolar Tat son críticos para la replicación del VIH-1. Sin embargo, la naturaleza de estas contribuciones aún no se ha aclarado. En este informe, analizamos sistemáticamente las perturbaciones del proteoma nucleolar que ocurren en las células T de Jurkat expresando constitutivamente el VIH-1 Tat, utilizando un enfoque de espectrometría cuantitativa de masas. Después de la anotación detallada de los cambios cuantitativos de abundancia en la composición de la proteína nucleolar sobre la expresión Tat, nos centramos en los complejos celulares afectados por Tat y las vías de señalización asociadas con la biogénesis ribosoma, el spliceosoma, las chaperonas moleculares, la replicación y reparación del ADN y el metabolismo, y discutimos su posible implicación en la patogénesis del VIH-1. En este estudio, investigamos los cambios cuantitativos en el proteoma nucleolar de las células Jurkat T expresando constitutivamente el VIH-1 Tat (86aa) frente a su contraparte Tat negativo, utilizando el etiquetado estable de isótopos con aminoácidos en la tecnología de cultivo celular (SILAC), seguido por la espectrometría de masas en tándem ESI e implementamos el enfoque experimental descrito en la Figura 1A. En primer lugar, mediante la entrega de genes retrovirales, transferimos el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta de purificación de afinidad tándem (TAP) (constituido por dos proteínas G y un péptido de unión a estreptavidina) o TAP solo (vector de control) en el clon de células T de leucemia Jurkat E6-1 y clasificamos las células transducidas (GFP positivo) por FACS. Esto resultó en una población altamente enriquecida de células transducidas policlonales que presentaban diferentes niveles de expresión del transgén (Figura 1B). La funcionalidad del TAP-Tat fue confirmada mediante la transfección de las células TAP-Tat y TAP con un vector de genes reportero de luciferasa bajo el control del HIV-1 LTR (pGL3-LTR) [36]. Para abordar la funcionalidad de Tat fusionado a TAP, comparamos Jurkat TAP-Tat con Jurkat-tat, una línea celular que expresaba establemente Tat [51]. Ambas líneas celulares mostraron una actividad LTR del VIH-1 comparable después de la transfección con pGL3-LTR (Figura S1 ). A continuación, la expresión Tat y la localización subcelular fueron verificadas mediante fraccionamiento subcelular seguido por el análisis del WB (Figura 1E ). TAP-Tat mostró una localización nuclear/nucleolar prominente, pero también se pudo detectar en el citoplasma. Estas observaciones fueron además validadas mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 1E ). A continuación se comparó la tasa de crecimiento y proliferación de las líneas celulares de Jurkat TAP y TAP-Tat (Materiales y Métodos S1), que eran equivalentes (Figura S4A ). Del mismo modo, el análisis FACS confirmó que las poblaciones relativas en G1, S y G2/M eran similares para las células de Jurkat TAP-Tat y TAP (Figura S4B ). Se etiquetaron las células de Jurkat TAP-Tat y Jurkat TAP con isótopo ligero (R0K0) y pesado (R6K6) que contenían arginina y lisina, respectivamente. Después de cinco pasajes en su respectivo medio SILAC, se recolectaron 85 millones de células de cada cultivo, se agruparon y se aislaron sus nucleolis como se describió previamente (Figura 1A ) [52] Para evaluar la calidad de nuestro procedimiento de fraccionamiento, se investigó el enriquecimiento específico de antígenos nucleolares conocidos mediante el análisis Western Blot (Figura 1D). Se encontró que la nucleolina (110 kDa) y la fibrilarina (FBL) (34 kDa), dos proteínas nucleolares principales conocidas por localizar al componente granular del nucleolo, estaban muy enriquecidas en la fracción nucleolar mixta. Se observó que la nucleolina se distribuía igualmente entre las fracciones nuclear y citoplasmática. Este patrón de distribución de nucleolina parece ser específico para las células T de Jurkat, como se muestra anteriormente [52, 53]. La proteína nuclear PARP-1 (Poly ADPribose polimerasa 1) (113 kDa) estaba presente en la fracción nuclear y nucleoplasmática, pero se desplegó en la fracción La alfa-tubulina (50 kDa) fue altamente abundante en la fracción citoplasmática y débilmente detectada en las fracciones nucleares. Colectivamente, estos resultados confirmaron que nuestros métodos produjeron una fracción nucleolar altamente enriquecida sin contaminación cruzada significativa. Posteriormente, la mezcla de proteína nucleolar fue tripsindigerida y los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas. El análisis proteomico cuantitativo comparativo se realizó utilizando MaxQuant para analizar las proporciones en isótopos para cada péptido identificado. Se cuantificó un total de 2427 péptidos, representando 520 proteínas nucleolares cuantificadas. La lista completa anotada de proteínas nucleolares cuantificadas está disponible en la Tabla S1 y los datos brutos del análisis de espectrometría de masas se depositaron en la base de datos de repositorios Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/), a la que se puede acceder utilizando las claves de hash descritas en materiales y métodos. Anotamos las proteínas cuantificadas utilizando las herramientas ToppGene Suite [54] y extrajimos las anotaciones de Gene Onthology (GO) e InterPro [55]. El análisis de los procesos biológicos GO (Figura 1F ) reveló que los procesos biológicos mejor representados incluían la transcripción (24%), el procesamiento de ARN (23%), el proceso del ciclo celular (13%) y la organización cromosómica (15%), que refleja las funciones asociadas nucleolares y es comparable a nuestra caracterización anterior del proteoma nucleo El análisis de distribución subcelular (Figura 1F ) reveló que nuestro conjunto de datos contenía proteínas conocidas por localizarse en el nucleolo (49%), en el núcleo (24%) mientras que el 15% de las proteínas estaban descritas previamente para residir exclusivamente en el citoplasma. La distribución subcelular fue similar a nuestro análisis anterior del proteoma nucleolar de células T de Jurkat [52]. Tabla S1. La distribución de las relaciones proteicas se representan en la Figura 1G como log 2 (cambio de abundancia). Las relaciones SILAC indican cambios en la abundancia proteica en la fracción nucleolar de las células TAP de Jurkat en comparación con las células TAP de Jurkat. La distribución de las proteínas cuantificadas siguió una distribución gaussiana (Figura 1G ). Un total de 49 proteínas nucleolares exhibieron un cambio significativo de 1,5 veces o mayor Las células no mostraron cambios en el contenido en estado estacionario de algunos de los principales y abundantes componentes del nucleolo, incluyendo nucleofosfmina (NPM1/ B23), C23, FBL, proteína nucleolar P120 (NOL1) y proteína nucleolar 5A (NOL5A). Las distintas proporciones de cambios proteicos sobre la expresión Tat podrían reflejar la reorganización nucleolar específica y las actividades alteradas del nucleolo. Realizamos el análisis del WB para validar los resultados basados en SILAC obtenidos por nuestro enfoque proteómico cuantitativo (Figura 2 ). 15 proteínas seleccionadas mostraron intensidad diferencial en las fracciones nucleolares sobre la expresión Tat, incluyendo 9 enriquecidos (HSP90b, STAT3, pRb, CK2a, CK2a', HSP90a, Transportin, ZAP70, DDX3), y 3 agotados (ILF3, BOP1 y SSRP1) proteínas. Además, también probamos por el análisis WB, abundancia de proteínas no afectada por la expresión Tat (Importin beta, FBL, B23, C23). Estos resultados destacan la concordancia en la tendencia de las proporciones correspondientes de SILAC, a pesar de algunas diferencias en los rangos cuantitativos. Cabe destacar que, usando WB, pudimos observar un cambio de intensidad para la proteína con un cambio de pliegue SILAC tan bajo como 1,25 veces. Por un lado, el umbral de los cambios en la abundancia de proteínas se puede determinar estadísticamente y luego destacar los cambios en la abundancia más grandes como se ilustra en la Tabla 1. Alternativamente, el enriquecimiento o agotamiento coordinado de la mayoría de las proteínas pertenecientes a un complejo o vía celular distinto permitiría la definición de un grupo de proteínas de interés y potencial significación. Por lo tanto, nos centramos en proteínas individuales enriquecidas o agotadas con actividades asociadas con la patogénesis molecular del VIH-1 o Tat, y en modificaciones agrupadas que afectan vías de señalización celular enteras y complejos macromoleculares. Inicialmente nos centramos en las proteínas de señalización que interactúan con Tat y/o la patogénesis molecular asociada del VIH-1 y cuya abundancia en el nucleolo fue modulada por la expresión Tat. Fosfo-proteína fosfatasas. Fosfo-proteína fosfatasa PP1 y PP2A son esenciales Es importante destacar que el PP1 representa el 80% de la actividad de la fosfatasa Ser/Thr dentro del nucleolo. En nuestro estudio, el PP1 fue potencialmente enriquecido por 1,52 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat, lo que apoya estudios previos que describen el objetivo nuclear y nucleolar de PP1a por el HIV-1 Tat y cómo PP1 aumenta la regulación de la transcripción del VIH-1 [58, 59, 60, 61, 62]. El PP1 c también fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro [63]. Curiosamente, la asociación Tat con los promotores de la subunidad PP2A resulta en la sobreexpresión y regulación de la actividad PP2A en linfocitos [64, 65]. Además, PP2A contribuye a la regulación de la transcripción y replicación del VIH-1 [61, 66]. Retinoblastoma Protein. El gen supresor tumoral pRb protein mostró un cambio de 1,4 veces en el nucleolus sobre la expresión Tat [67]. Además, el análisis WB confirmó la translocación distinta del pRb del nucleoplasma al nucleolus por Tat (Figura 2 ). Dependiendo del tipo de célula, pRb puede ser hiperfosforilado o hipofosforilado sobre la expresión Tat y puede regular negativamente o positivamente la transcripción mediada por Tat respectivamente [68, 69, 70]. Curiosamente, la hiperfosforilación de los desencadenantes del pRB en su translocación en el nucleolo [71]. La fosforilación del pRB también se asocia con un aumento de la biogénesis ribosómica y el crecimiento celular [72]. STAT3. El transductor de señal de factor de transcripción y activador de la transcripción 3 (STAT3) se enriqueció significativamente (1,86 veces) en la fracción nucleolar por la expresión constitutiva Tat. Además, el análisis WB indicó que la expresión Tat podría promover la relocalización del STAT3 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento distinto en el nucleolo (Figura 2). Curiosamente, estudios anteriores han demostrado la activación mediada por Tat de la señalización STAT3, como lo demuestra su estado de fosforilación [73]. Curiosamente, la fosforilación STAT3 indujo la dimerización de la proteína después de su translocación al núcleo [74]. YBX1. YBX1, la proteína multifuncional de unión al ADN/ARN fue enriquecida por 1,38 veces en el nucleolo de las células de Jurkat sobre la expresión Tat. Curiosamente, YBX1 interactúa con Tat y TAR y modula la expresión génica del VIH-1 [63, 75]. ZAP70. La proteína tirosina cinasa ZAP70 (proteína quinasa asociada a la cadena Zeta 70) fue enriquecida por 1,24 veces en el nucleolo de las células de Jurkat expresando Tat [76]. Además, el análisis del WB reveló que la expresión Tat podría promover la relocalización del ZAP70 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento La proteína de matriz nuclear interna, Matrin 3 (MATR3), presentó un cambio de 1,39 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat. Se localiza en el nucleolasmo con un patrón difuso excluido de los nucleolos [77]. La matrin 3 ha sido identificada como parte del nucleoloma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Dos estudios recientes han descrito a la matrin 3 como parte de complejos de ribonucleoproteínas, incluyendo también el VIH-1 Rev y (elemento de respuesta Rev) RRE que contiene ARN VIH-1, y promoviendo la regulación post-transcripción del VIH-1 [78, 79, 80]. CASP10. La molécula pro-apotótica de señalización, Caspasa 10 (CASP10), se agotó significativamente de las células nucleolus de Jurkat-Tat (0,82 veces) [81]. Importantemente, la expresión Tat desregula la expresión y actividad de CASP10 en las células Jurkat [82]. ADAR1. Adenosina deaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR1), que convierte las adenosinas en inosinas en ARN de doble cadena, se agotó significativamente del nucleolus de las células Jurkat-Tat (0,78 veces). Curiosamente, ADAR1 sobreexpresión regula la replicación del VIH-1 a través de un mecanismo de edición del ARN [83, 84, 85, 86, 87, 88]. Además, ADAR1 pertenece al interactoroma nuclear in vitro Para subrayar las relaciones estructurales y funcionales de las proteínas nucleolares afectadas por el VIH-1 Tat, construimos una representación en red de nuestro conjunto de datos. Utilizamos la versión 2.6.3 de Cytoscape [89] y utilizando el plugin MiMI [90] para mapear interacciones previamente caracterizadas, extraídas de bases de datos de interacción de proteínas (BIND, DIP, HPRD, CCSB, Reactome, IntAct y MINT), lo que resultó en una red altamente densa y conectada que incluía 416 proteínas (nodos) de las 536 proteínas, unidas por 5060 interacciones no dirigidas (borde) (Figura 3A). El análisis de centralidad reveló un umbral de 23.7 interacciones por proteína. El análisis de topología utilizando el plugin CentiScaPe [91] mostró que la distribución del grado de nodo sigue una ley de energía (Figura S5 Es importante destacar que cuando analizamos la distribución del coeficiente de agrupamiento (Figura S6 ) encontramos que la red está organizada en una arquitectura jerárquica [92], donde los nodos conectados forman parte de áreas altamente agrupadas mantenidas por pocos hubs organizados alrededor del HIV-1 Tat. Además, el análisis de la conexión en grados nodos de nuestra red identificó al HIV-1 Tat como la proteína más conectada (Figura S6 ). Específicamente, el análisis de topología indicó que los valores para las centrales Tat eran los más altos (grado de nodo, estrés, radialidad, cercanía, entreess y centroides), caracterizando a Tat como la proteína principal del hub de la red nucleolar. De hecho, un total de 146 proteínas han sido descritas previamente para interactuar con Tat (Figura 3B, Tabla S2 ). Estas proteínas están involucradas En paralelo, caracterizamos la magnitud de los cambios de abundancia proteica relacionados observados en distintas vías celulares (Figura 4). Biogénesis ribosomal. Inicialmente nos centramos en la biogénesis ribosoma, función primaria del nucleolo. Pudimos observar un aumento general y coordinado en la abundancia de proteínas ribosomales en el nucleolo por expresión Tat (Figura 4 ). Mientras algunas proteínas ribosomales permanecían inalteradas, Tat causó la acumulación nucleolar de varias proteínas ribosomas grandes y pequeñas distintas, excepto RPL35A, para las cuales la expresión Tat causó una marcada disminución en el nivel nucleolar (0,29 veces). Asimismo, varias proteínas involucradas en el procesamiento de ARNr exhibieron un aumento general en la acumulación nucleolar sobre la expresión Tat. Estos incluyen a los miembros canónicos humanos de la familia L7ae junto con los miembros que participan en la Caja C/D, H/ACA y U3 snoRNPs (Figura 4). Por el contrario, BOP1, un componente del complejo PeBoW (Pescadillo Bop1 WDR12) esencial para la maduración de la subunidad ribosómica grande, se agotó significativamente del nucleolo de las células TAP-Tat Jurkat (0,81 veces) y esto fue confirmado por el análisis WB (Figura 2 ) [93]. Sin embargo, los otros componentes complejos PeBoW, Pes1 (0,94 veces) y WDR12 (1,1 veces), no fueron afectados por la expresión Tat. Se identificaron y cuantificaron en nuestro conjunto de datos 55 proteínas de las 108 proteínas spliceosomal conocidas [94]. Estas proteínas incluyen las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares U1, U2 y U5, Sm D1, D2, D3, F y B, y las heterogéneas ribonucleoproteínas nucleares. Nuestros datos sugieren un aumento distinto en la abundancia de proteínas específicas complejas del spliceosoma tras la expresión de HIV-1 Tat en células T de Jurkat (Figuras 3 y 4). Las únicas tres proteínas que se agotaron significativamente del nucleolo tras la expresión del HIV-1 Tat fueron RBMX (0,89 veces), HNRNPA2B1 (0,84 veces) y SNRPA (0,81 veces). Varias investigaciones mostraron alteración de la expresión en los factores de empalme celular en células infectadas por HIV-1 [95, 96] Hemos identificado varias chaperonas moleculares, cochaperonas y otros factores involucrados en la proteostasis para ser altamente enriquecidos en el nucleolo de las células T sobre la expresión Tat (Figuras 3 y 4), muchos de los cuales fueron previamente caracterizados como parte del interactoroma nuclear Tat [63]. Varias proteínas de choque térmico incluyendo DNAJs, específicas HSP90, HSP70 y HSP40 isoformas y sus cofactores se enriquecieron distintivamente en la fracción nucleolar de las células Jurkat expresando Tat (Figura 4 ). Como lo muestra WB, mientras que HSP90a y b son principalmente citoplasmáticas, la expresión Tat desencadena su relocalización al núcleo y nucleolus, corroborando nuestro enfoque cuantitativo proteómico (Figura 2). Del mismo modo, el choque térmico puede hacer que el HSP90 y el HSP70 se reubiquen en el nucleolo [97, 98, 99, 100, 101]. En un estudio reciente, el grupo de Fassati ha demostrado que el HSP90 está presente en el promotor del VIH-1 y puede regular directamente la expresión génica viral [102]. También observamos el aumento coordinado de la abundancia de la clase I (GroEL y GroES) y la clase II (chaperonina que contiene TCP-1 (CTT)) moléculas de chaperonina (Figuras 3 y 4) sobre la expresión Tat. Vía proteasómica de la ubiquitina. La vía proteasómica es el principal sistema proteolítico de células eucariotas [103]. Es importante destacar que la vía ubiquitina-proteasoma nuclear controla el suministro de proteínas ribosomales y es importante para la biogénesis ribosoma [104, 105]. El proteasoma 26S está compuesto por la partícula núcleo 20S (CP) y la partícula reguladora 19S (RP). Alternativamente, CP puede asociarse con el 11S RP para formar el inmunoproteasoma. Todas las proteínas cuantificadas en nuestro estudio son parte del complejo regulador 19S e incluyen PSMD2 (1,5 veces), PSMD3 (1,32 veces), PSMD11 (1,25 veces) y PSMD13 (0,72 veces), el único componente proteasoma significativamente agotado del nucleolo en presencia de Tat (Figura 4). Curiosamente, Tat interactúa con subunidades distintas del sistema proteasoma, incluyendo las subunidades 19S, 20S y 11S. Las consecuencias de estas interacciones incluyen la competencia de Tat con 11S RP o 19S RP para la unión al 20S CP, que resultó en la inhibición de la actividad de la peptidasa 20S [106, 107, 108, 109, 110, 111]. Además, Tat demostró modificar la composición proteosoma y la actividad, que afecta a la generación de antígenos péptidos reconocidos por linfocitos T citotóxicos [112]. Importantemente, un estudio reciente demostró que en ausencia de Tat, los componentes proteosomas están asociados al promotor del VIH-1 y la actividad proteosoma limita la transcripción [113]. La adición de Tat promovió la disociación de la subunidad 19S del proteasoma 20S, seguido por el enriquecimiento distintivo del complejo similar a 19S en extractos nucleares junto con el reclutamiento mediado por Tat de las subunidades 19S para el promotor del VIH-1, lo que facilitó su elongación transcripcional [113]. También cuantificamos UBA1 (1,36 veces), la ubiquitina-proteína ligasa UHRF1 (1,13 veces), UBC (1 veces) y dos Ubiquitinspecific-peptidases, USP30 (1,28 veces) y USP20 (0,06 veces) (Figura 4). Replicación y reparación del ADN. Tras la expresión del HIV-1 Tat, observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de varios factores celulares asociados con la replicación del ADN y las vías de reparación (Figura 4). Tat indujo el enriquecimiento coordinado del complejo MCM2-7 de mantenimiento cromosómico en miniatura (de 1.23-a 3,30 veces, respectivamente) [114]. MCM7, 6 y 3 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. El mantenimiento estructural de los cromosomas 2, SMC2, fue enriquecido (1,35 veces) en la fracción nucleolar por expresión Tat. SMC2 fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Mientras que el factor de replicación C1 (RFC1) y RFC2 (1,31 y 1,28 veces respectivamente) mostró un cambio de pliegue incrementado y RFC5/3 no se vieron afectados, RFC4 se redujo gravemente (0,69 veces) de la fracción nucleolar sobre la expresión Tat [115]. El RFC1 y RFC2 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Tat indujo el enriquecimiento de XRCC6 (1,27 veces) y XRCC5 (1,36 veces) en el nucleolo, que están involucrados en la reparación de la unión final del ADN no-homologoso (NHEJ) [116]. XRCC6 se asocia con complejos de preintegración viral que contienen HIV-1 Integrase y también interactúan con Tat y TAR [117, 118, 119]. Además, en una pantalla basada en ribozyme, el derribo del XRCC5 (Ku80) disminuyó tanto la integración retroviral como la transcripción Tatmediated [120]. Como parte de la reparación de la escisión base (BER), hemos identificado una importante endonucleasa apurínico/apirimidinica 1 (APEX1) (1,29 veces). Importantemente, en una pantalla de siRNA dirigida a los factores de reparación del ADN, se encontró que la reducción de APEX1 inhibe la infección por VIH-1 por más de 60% [121]. La proteína del grupo de alta movilidad (HMG) HMGA1 (1,30 veces), fue enriquecida en el nucleolo después de la expresión Tat [122]. HMGA1 interactúa con la integración del VIH-1 y forma parte del complejo de preintegración del VIH-1 [123, 124]. Importantemente, HMGA1 ha sido identificada en una pantalla proteómica, como un cofactor celular que interactúa con el VIH-1 59líder [125]. Metabolismo. Nuestros datos proteómicos sugieren que Tat induce perturbaciones en la glucólisis, la vía del fosfato pentosa y la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos (Figura 4 y Figura S7 ). En particular, en las células T que expresan Tat, detectamos cambios coordinados en la abundancia de proteínas no conocidas previamente que se asocian con la patogénesis del Tat, que revelaron conexiones inesperadas con la glicólisis y la vía del fosfato pentosa, incluyendo las siguientes enzimas glicólicas, lactato deshidrogenasa B (LDHB) (1,37 veces), la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1,17 veces) y la mutasa del ácido fosfoglicérico (PGAM1) (0,89 veces) (Figura 4 y Figura S En resumen, el GPI cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Posteriormente, el PFKP cataliza la conversión irreversible de fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato y es una enzima reguladora clave de la glucólisis. Al final de la vía glicolítica, PKM2, en su forma tetramérica, se sabe que genera ATP y piruvato, mientras que el LDHB desvía la mayoría del piruvato a la producción y regeneración de lactato de NAD+ en apoyo a la glicólisis continua, un fenómeno descrito para las células T proliferativas [126]. Esto regula la disponibilidad de los intermedios de glucosa, que se redirigen a las vías de la pentosa fosfato y de la serina biosíntesis para la producción de precursores biosintéticos de nucleótidos, fosfolípidos y aminoácidos. Como parte de la vía del fosfato de pentosa, hemos caracterizado el enriquecimiento significativo de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) (2,11 veces), que ramas de la vía de la glicólisis para generar NADPH, ribosa-5fosfato un precursor importante para la síntesis de nucleótidos. Consistente con esto, detectamos el aumento coordinado en la abundancia de enzimas que juega un papel central en la síntesis de purinas y pirimidinas. Más específicamente, IMPDH2 (1,66 veces), una enzima limitante de la tasa en el punto de rama de la biosíntesis de nucleótidos de purina, que conduce a la generación de nucleótidos de guanina, fosforibosil pirofosfato sintetasa 2 (PRPS2) (1,41 veces), cytidine-5-prime-trifosfato sintetasa (CTPS) (1,74 veces) que cataliza la conversión de UTP a CTP y la subunidad grande de ribonucleótido reductasa (RRM1) (1,56 veces). En parralel, observamos el aumento de la abundancia de la fosfoserina aminotransferasa PSAT1 (1,90 veces), una enzima implicada en la biosíntesis de serina, que se ha relacionado con la proliferación celular in vitro. La interfaz host-virus es un aspecto fundamental en la definición de la patogénesis molecular del VIH-1 [127, 128, 129, 130, 131, 132, 133]. De hecho, con su repertorio limitado de proteínas virales, el VIH-1 se basa ampliamente en la maquinaria de las células huésped para su replicación. Varios estudios recientes han capitalizado los recientes avances en las tecnologías ''OMICS'', y han revelado importantes perspectivas en este diálogo molecular finamente afinado [132, 134]. El VIH-1 Tat es esencial para la replicación viral y orquesta la expresión génica del VIH-1. La proteína reguladora viral es conocida por interactuar con una amplia gama de proteínas celulares y modular la expresión del gen celular y la vía de señalización [135, 136]. Nosotros y otros hemos utilizado enfoques a nivel del sistema para investigar la interacción Tat con la maquinaria de las células de acogida, que han caracterizado al HIV-1 Tat como un mediador crítico de la interfaz host-viral [137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149]. Aquí, hemos investigado el tráfico de proteínas nucleolares en respuesta a la expresión HIV-1 Tat en células T, con el fin de proporcionar ideas únicas y novedosas sobre el papel de la compartimentación de proteínas por Tat en el ajuste fino de la disponibilidad de proteínas y la función. Hemos desarrollado para este estudio, un modelo celular utilizando Jurkat T-cells expresando firmemente Tat fusionado en su N-ternminal a TAP-tag. Jurkat T-cells son robustos y presentan la ventaja de crecer sin estímulos y se transducen fácilmente utilizando Es importante destacar que se han empleado ampliamente para evaluar la patogénesis mediada por Tat utilizando enfoques de todo el sistema y para analizar las vías y funciones de señalización celular clave de las células T [144, 150, 151, 152]. De hecho, hemos encontrado que son especialmente adecuadas para cultivos in vitro prolongados en el medio SILAC y posterior aislamiento de su nucleolo, seguido por el análisis de MS, que requiere hasta 85 millones de células. Fusionamos Tat a la etiqueta TAP para permitir futuras aplicaciones posteriores como purificación de afinidad de Tandem o análisis IP de Cromatina. Importantemente, hemos confirmado que la etiqueta TAP N-terminal no interfirió con la función Tat ni su localización en las células Jurkat, cuando se compara con la no etiquetada-Tat. Aunque se sabe que Tat se acumula en el núcleo y el nucleolo en las células de Jurkat y otras líneas celulares transformadas, en las células T primarias, Tat se describe para acumularse principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Estas diferencias permanecen por caracterizarse, pero podrían estar relacionadas con diferentes niveles de expresión de los factores de transporte en las líneas celulares transformadas versus las células primarias, como se describe recientemente por Kuusisto et al. [39]. Además, Stauber y Pavlakis han sugerido que la localización nucleolar Tat podría ser el resultado de la sobreexpresión Tat [31]. Aquí, hemos seleccionado y empleado una población policlonal de células T Jurkat que expresan Tat en diferentes niveles. Proponemos que esta heterogeneidad en los niveles de expresión Tat podría reflejar la expresión estocástica Ta Utilizando una estrategia proteómica cuantitativa basada en un enfoque organélaro, cuantificamos más de 520 proteínas nucleolares, incluyendo 49 proteínas que muestran un cambio significativo en el pliegue. La medida en que las variaciones inducidas en la abundancia de proteínas nucleolares son biológicamente relevantes y pueden afectar los procesos celulares y/o virales queda por determinar. Sin embargo, la naturaleza biológica de las vías y los complejos macromoleculares afectados nos permiten discutir sus posibles asociaciones con la patogénesis del VIH-1. El VIH-1 Tat se expresa tempranamente después de la integración del genoma del VIH-1 y media el cambio a la fase de producción viral, asociado con la expresión génica proviral robusta, el ensamblaje de proteínas virales y, en última instancia, el surgimiento y liberación de viriones. En este contexto y basado en nuestros resultados, proponemos que Tat podría participar en la configuración del entorno intracelular y el perfil metabólico de De hecho, observamos el enriquecimiento nucleolar distinto de proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica, lo que podría ser indicativo de un aumento en la síntesis proteica. Con la notable exepción de RPL35A depleción nucleolar, proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica estaban en las 20 proteínas nucleolares más enriquecidas (NHP2L1, RLP14, RPL17, RPL27, RPS2, RPL13). Además, este efecto parece ser específico del HIV-1 Tat ya que la inhibición de transcripción por Actinomicina D resultó en el agotamiento total de proteínas ribosómicas en el nucleolo [9]. Además, el análisis proteómico cuantitativo de las células nucleas en adenovirus infectados mostró una leve disminución en proteínas ribosómicas [24] Si esto refleja un cambio en la biogénesis del ribosoma y/o un cambio en la composición de las subunidades ribosomales queda por determinar. Sin embargo, la necesidad adaptada de una producción elevada del ribosoma es intuitiva para un sistema que necesita apoyar la creciente demanda de nueva síntesis de proteínas virales. En parralel, observamos la modulación concordante de las vías que regulan la homeostasis proteica. Observamos la significativa acumulación nucleolar de múltiples chaperonas moleculares incluyendo las HSPs, el complejo TCP-1, y moléculas CANX/CALR y la abundancia nucleolar interrumpida de proteínas pertenecientes a la vía ubiquitina-proteasoma, que controla el suministro de proteínas ribosomales [104, 105]. Estas observaciones apoyan estudios previos que describen la modulación de la actividad proteasómica por Tat, que afectan a la expresión, el montaje y la localización de subunidades específicas de los complejos proteasómicos [106, 107, 108, 109, 110, 111, 113]. También observamos el agotamiento concomitante de CASP10 en el nucleolo de Jurkat TAP-Tat. Se ha sugerido que CASP10 podría estar dirigido al nucleolo para inhibir la síntesis proteica [154]. Curiosamente, la presencia y los papeles potenciales de las chaperonas moleculares en el nucleolo han sido destacados por Banski et al, quienes explican cómo la red chaperona podría regular la biogénesis ribosoma, la señalización celular y la respuesta al estrés [97, 155]. A medida que la producción viral avanza hacia la fase tardía y aumenta el estrés celular, el enriquecimiento nucleolar de las chaperonas moleculares por Tat no sólo podría permitir el plegado de adequat de proteínas virales recién sintetizadas, sino que también podría promover la tolerancia de las células infectadas al estrés y mantener la viabilidad celular. Coincidentemente, observamos el marcado enriquecimiento nucleolar de enzimas pertenecientes a vías metabólicas incluyendo glicólisis, fosfato de pentosa, nucleótido y aminoácidos vías biosintéticas. Del mismo modo, estas vías se elevan en células T proliferativas o en células cancerosas después de un cambio metabólico a la glicólisis aeróbica, también conocido como el efecto Warburg [156, 157, 158, 159]. Allí, los intermedios de glucosa de la vía de la glicólisis no sólo se comprometen a la producción de energía y se descomponen en piruvato para el ciclo TCA, sino que se redirigen a vías alternativas, incluyendo la vía del fosfato de pentosa, y se utilizan como precursores metabólicos para producir nucleótidos, aminoácidos, acetil CoA y NADPH para la homeostasis redox. De manera consistente, también se observó el enriquecimiento nucleolar concomitante de enzimas pertenecientes a la vía de síntesis de nucleótidos, incluyendo IMPH2, una enzima limitante conocida para controlar el pool de GTP. De igual manera, se observó el enriquecimiento nucleolar de PSAT1, una enzima involucrada en el metabolismo de serina y treonina, que está asociada con la proliferación celular [160]. Colectivamente, proponemos que mediante el control de la homeostas Sin embargo, las enzimas glucolíticas han sido detectadas en las fracciones nuclear y nucleolar mediante análisis proteómicos [8, 161]. Además, las enzimas glucolíticas, como PKM2, LDH, fosfoglicerato cinasa, GAPDH y aldosa, también han sido reportadas para mostrar localización nuclear y unirse al ADN [162]. Más específicamente, PKM2 es conocido por asociarse con el promotor y participar en la regulación de la expresión génica como coactivador transcripcional [163]. HIV-1 Tat ha sido descrito previamente como un inmunoregulador y más específicamente, ha sido reportado tanto para inhibir o promover la señalización TCR [164]. Hemos observado el enriquecimiento nucleolar por Tat de componentes proximales o aguas abajo clave de las vías de señalización de células T, incluyendo ZAP70, ILF3 y STAT3, que juegan un papel crucial en el desarrollo y activación de células T. Anteriormente los habíamos identificado como componentes específicos de células T del nucleolo, y los estudios de IF sugirieron que su asociación con el nucleolo podría ser regulada por condiciones específicas [165]. Nuestros resultados apoyan aún más que Tat podría contribuir a la disregulación de las señales derivadas de TCR y que el nucleolo podría representar un importante enlace espacial para las moléculas de señalización TCR. Observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de componentes clave de las vías de replicación, recombinación y reparación del ADN por Tat. Estos incluyen XRCC5 y XRCC6, HMGA1, APEX1, MCM2-7, SMC2, RFC1 y RFC2, mientras que RFC4 se encontró significativamente agotado. Curiosamente, estos cofactores se han asociado con la eficiencia de la integración del ADN retroviral en el ADN del huésped o la integridad del provirus integrado [166]. Si la abundancia creciente de estos factores dentro del nucleolo podría estar asociada con su participación potencial en la integración y mantenimiento de la integridad del gen provirus, queda por determinar. Los mecanismos de segregación mediada por Tat y compartimentación de proteínas dentro o fuera del nucleolo pueden depender de factores inherentes para cada proteína y la naturaleza de su relación con Tat, ya que el fraccionamiento subcelular combinado con el análisis del WB mostró que el patrón y el grado de redistribución subcelular entre proteínas variaban. Pudimos observar casos en los que Tat regulaba la expresión de proteínas que resultaban en un aumento general de estas proteínas en los compartimentos celulares incluyendo el nucleolo (DDX3, TNPO1). Alternativamente, Tat podía desencadenar la translocación nucleolar de proteínas directamente desde el citoplasma o el nucleoplasma (pRb). Además, observamos proteínas citoplasmáticas redistribuidas tanto al nucleoplasma como al nucleolo sobre la expresión Tat (STAT3, ZAP70 y HSP90). Finalmente, también notamos el agotamiento proteico en la fracción nucleolar acompañado de un aumento en el nucleoplasma (SSRP1). Sigue siendo difícil en esta etapa, apreciar si la acumulación de proteínas específicas resultaría en su activación o inhibición al secuestrarlas de su lugar de acción. Por el contrario, el agotamiento de una proteína del nucleolus podría resultar en la regulación descendente de su actividad en este lugar o podría ser el resultado de su movilización desde su sitio de almacenamiento, el nucleolus, al nucleoplasma o citoplasma donde puede realizar su función. Cabe destacar que identificamos a varios socios conocidos del VIH-1 Tat involucrados en la patogénesis del VIH-1, lo que sugiere que Tat podría modular físicamente su objetivo nucleolar o su reclutamiento a un sitio específico en el nucleoplasma o citoplasma. Tat también podría promover modificaciones post-traducción, lo que podría mediar la focalización de proteínas específicas al nucleolus. Esto se ilustra por las siguientes proteínas enriquecidas, pRb, PP1 y STAT3, para lo que la fosforilación es inducida por Tat. Importantemente, su estado de fosforilación determina su distribución subcelular, proporcionando así un mecanismo Además, nuestros datos indican que las serinas/treoninas quinasas (CK2 a') y fosfatasas (PP1) se enriquecieron significativamente en las fracciones nucleolares de Jurkat TAP-Tat. Estas enzimas representan la mayor parte de la actividad de fosforilación/desfosforilación en el nucleolo y pueden actuar como reguladores del tráfico de proteínas nucleolares. Además, Tat disminuyó significativamente los niveles de SUMO-2 en el nucleolo. Del mismo modo, se sabe que las modificaciones posteriores a la traducción mediadas por SUMO modulan la localización de proteínas nucleolares [104]. Dada la importancia potencial de las modificaciones posteriores a la traducción, incluida la fosforilación en el cambio mediado por Tat de la abundancia de proteínas nucleolares, un enfoque proteomico más específico como el enriquecimiento de fosfopétidos El control de la rotación de proteínas también es un medio importante para modular la abundancia de proteínas nucleolares. Las proteínas ribosómicas son degradadas por la vía Ubiquitina-Proteasoma para asegurar que su abundancia coincida con los niveles de transcripción de rRNA. A la inversa, las proteínas de choque térmico HSP90s las protegen de la degradación. Curiosamente, nuestros datos muestran que la modulación Tat de las proteínas de abundancia asociadas con la vía Ubiquitina-proteasoma y choque térmico. Esto podría contribuir al enriquecimiento observado de proteínas ribosómicas por Tat. Sin embargo, no podemos excluir que la mayor abundancia de proteínas ribosómicas en el nucleolo podría ser el resultado de la prevención mediada por Tat de su exportación al citoplasma. Curiosamente, utilizando un sistema celular diferente, una cepa transgénica de Drosophila melanogaster Tat, Ponti et al, analizaron los efectos de Tat en la biogénesis ribosoma, después de 3 días de tratamiento de choque térmico para inducir la expresión Tat bajo el control del promotor hsp70 [167]. Después de la expresión Tat, observaron un defecto en el procesamiento pre-rRNA asociado con una disminución en el nivel de 80S ribosomas [167]. Sin embargo, los diferentes sistemas celulares empleados combinados con la inducción de choque térmico de 3 días hacen que sus resultados sean difíciles de comparar con los nuestros. Mientras que estudios anteriores a nivel de sistema han monitoreado los efectos de la expresión Tat del VIH-1 en las células T, a nuestro conocimiento, hemos presentado aquí el primer análisis proteómico de la composición dinámica del nucleolus en respuesta a la expresión Tat del VIH Utilizando proteómica cuantitativa, hemos subrayado los cambios en la abundancia de proteínas nucleolares específicas y hemos destacado la reorganización nucleolar extensa y coordinada en respuesta a la expresión constitutiva Tat. Nuestros hallazgos subrayan que Tat que expresa células T exhiben un perfil proteómico nucleolar único, que puede reflejar una estrategia viral para facilitar la progresión a la producción viral robusta. Importantemente, hemos notado la relación funcional de proteínas nucleolares de nuestro conjunto de datos con la patogénesis VIH-1 y el Tat VIH-1 en particular. Esto aumenta aún más nuestra confianza en nuestra estrategia experimental y sugiere un papel para Tat en el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares. Finalmente, nuestro estudio proporciona nuevas ideas sobre la importancia de Tat en la conversación cruzada entre funciones nucleolares y patogénesis viral. También hemos identificado cambios en la abundancia de proteínas nucleolares que no estaban previamente asociados con la patogénesis del VIH-1, incluyendo proteínas asociadas a vías metabólicas, que proporcionan nuevos objetivos potenciales y vías celulares para la intervención terapéutica.Células T Jurkat, clon E6.1 (ATCC), Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP se mantuvieron en el medio RPMI-1640 complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (Gibco, aprobado por la UE), y antibióticos. Células Phoenix-GP (G.P. Nolan; www.stanford.edu/ group/nolan/), se mantuvieron en el medio DMEM complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (GIBCO, aprobado por la UE). La secuencia de HIV-1 Tat (VIH-1 HXB2, 86 aminoácidos) fue subclonada en el vector pENTR 2B (Invitrogen, A10463). Usando la tecnología Gateway (Invitrogen), introdujimos la secuencia HIV-1 Tat en el plásmido pCeMM-NTAP(GS)-Gw [168]. Las células Fénix (G.P. Nolan; www.stanford.edu/group/nolan/), fueron transfectadas usando Fugene 6 (Roche) con 5 mg del plásmido NTAP-Tat o NTAP y 3 mg del pMDG-VSVG. Los sobrenadantes virales fueron recolectados después de 48 h, filtrados y utilizados para transducir las líneas celulares de Jurkat. La construcción se denomina NTAP-Ta Utilizando la entrega de genes retrovirales, transferimos de forma estable células Jurkat (clone E6.1 (ATCC)). Los clones positivos llamados Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron ordenados para enriquecer la población de células que expresaban GFP usando el clasificador de células BC MoFlo XDP (Beckman Coulter). Las fracciones subcelulares (10 mg) fueron resueltas por SDS-PAGE y transferidas a membranas BioTrace PVDF (Pall corporation). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: a-Tubulina (Sc 5286), C23 (Sc 6013), y Fibrilarina (Sc 25397) de Santa Cruz Biotechnology, y PARP (AM30) de Calbiochem, Ratón anti-ZAP 70 (05-253, Millipore), Ratón anti-STAT3 (06-596, Millipore), Ratón anti-ILF3 (ab92355, Abcam), Ratón anti-HSP90 beta (ab32568, Abcam), Ratón anti-ADAR1 (ab88574, Abcam), Ratón anti-HDAC1 (ab19845, Abcam), Ratón anti-SSRP1 (ab21584, Abcam) conejo anti-BOP1 (ab86982, Abcam), Ratón anti-KpNB1 (ab10303, Abcam), Ra Para el análisis SILAC-RPMI R0K0 y SILAC-RPMI R6K6 (Células Dundidas) se utilizó un medio con un 10% de FBS dializado (GIBCO, 26400-036); las células Jurkat que expresaban NTAP-Tat y NTAP fueron transitadas en serie y cultivadas durante cinco duplicados para asegurar la incorporación completa de los aminoácidos marcados; la viabilidad de las células se verificó con Trypan Blue (0,4% solución, SIGMA) y posteriormente se confirmó mediante tinción IP y análisis FACS; las células se mezclaron a la relación 1:1 para obtener 140610 6 células; los nucleoli fueron aislados de la población celular mixta como se describió previamente en Jarboui et al., [165]. Los extractos nucleolares (100 mg) fueron resuspendidos en bicarbonato de amonio de 50 mM y en solución de tripsina digerida como se describió previamente en Jarboui y col. [165]. La muestra se realizó en un espectrómetro de masa termoscientifico LTQ Orbitrap XL conectado a un sistema cromatógrafo NANO LC.1DPLUS que incorporaba una muestra automática. La muestra fue cargada en una columna Biobasic C18 PicofritTM (100 mm de longitud, 75 mm ID) y fue separada por un gradiente de acetonitrilo en aumento, utilizando un gradiente de 142 min de fase inversa (0-40% de acetonitrilo durante 110 min) a un caudal de 300 nL min-1. El espectrómetro de masa fue operado en modo iónico positivo con una temperatura capilar de 200uC, una tensión capilar de 46V, una tensión de lente de tubo de 140V y con un potencial de 1800V aplicada al frit. Todos los datos fueron adquiridos con el espectrómetro de masa que funciona en modo de conmutación automática dependiente de datos. Se realizó una exploración MS de alta resolución utilizando el Orbitrap para seleccionar los 5 iones más intensos antes del análisis MS/MS utilizando la trampa Ion. La eficiencia de incorporación de aminoácidos etiquetados fue determinada mediante el análisis de los péptidos identificados en nucleoli aislados de la población celular mantenida en el medio 'Heavy' como se describe en [169]. Nuestro análisis mostró que teníamos una eficiencia de incorporación.95% (datos no mostrados). Los espectros MS/MS fueron buscados para la identificación y cuantificación de los péptidos utilizando el software MaxQuant [170] (versión 1.1.1.36), la Base de Datos del IPI Humano (versión 3.83) y el motor de búsqueda Andrómeda asociado a MaxQuant [171]. Se utilizaron parámetros estándar para MaxQuant con el Acetil (término N de Proteína) como modificación variable y Carbamidometilo (Cys) como modificación fija, se permitieron 2 escisiónes perdidas, excepto que se prohibió el filtrado de aminoácidos etiquetados. La desviación de masa inicial de los iones precursores y fragmentos fue de 7 ppm y 0,5 Da, respectivamente. Cada relación proteica fue calculada como promedio ponderado de intensidad de los coeficientes de péptidos individuales. Las proteínas fueron identificadas con el mínimo de un péptido con una tasa La ontología genética, la vía KEGG y los términos Pfam se extrajeron de entradas UNIPROT utilizando Perseo, un software del paquete de análisis de datos MaxQuant (http://www.maxquant.org ), y las herramientas de la suite ToppGene [54]. El Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron transfectados utilizando el sistema de electroporación Amaxa (biosistema Amaxa) con el pGL3 (pGL3-LTR) (Promega) como recomendado por Amaxa Biosystem. Los ensayos de doble luciferasa (Promega) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de Luciferasa se midió y normalizó contra la cantidad total de proteínas cuantificada por el kit de cuantificación de proteínas BCA (Pierce, Thermo Scientific). Para preservar Las células se fijaron en un 2% PFA durante 10 minutos en RT, permeabilizaron en un 0,5% Triton X-100 durante 15 minutos en RT y se bloquearon con 5% FCS. Las células se incubaron con el anticuerpo Tat VIH-1 de conejo (ab43014, Abcam) seguido por el anticuerpo secundario anti-Rabbit alexa fluor 647 (A-21246, Invitrogen). Las células se les permitió unirse a Cell-Tak (BD) recubierto de Diapositivas Silanizadas (DaoCytomation), y manchado con DAPI. Las imágenes se capturaron con un Microscopio Confocal Carl Zeiss equipado con un objetivo DIC de aceite de Plan-Apocromat 63X/14. El archivo de datos RAW proteómicos del análisis de espectrometría de masas se depositó en el repositorio Tranche(http El archivo se puede acceder y descargar utilizando la siguiente clave de hash:(R3O5SV5Z6HvWqrBNDhp21tXFetluDWYxvwMIfU-h6e1kMgarauCSq4dlNcxeUvFOHDEzLeDcg4X5Y8reSb6-MUA6wM1kIAAAAAAB/w = ). Materiales y Métodos S1 Descripción de los métodos empleados para examinar el ciclo celular, la viabilidad celular y el análisis de proliferación celular. (DOCX)

¿Cuántas proteínas mostraron cambiar significativamente la cantidad de nucleolo de células T de Jurkat?

Tráfico de proteínas nucleolares en respuesta al VIH-1 Tat: Rewiring the Nucleolushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499507/SHA: efa871aeaf22cbd0ce30e8bd1cb3d1afff2a98f9Autores: Jarboui, Mohamed Ali; Bidoia, Carlo; Woods, Elena; Roe, Barbara; Wynne, Kieran; Elia, Giuliano; Hall, William W.; Gautier, Virginie W.Fecha: 2012-11-15DOI: 10.1371/journal.pone.0048702Licencia: cc-byAbstract: La proteína Tat transactivante es una proteína reguladora viral esencial para la replicación del VIH-1. El nucleolo, un compartimento subnuclear altamente dinámico y estructurado sin membrana, es el sitio de ARNr y biogénesis ribosoma y está involucrado en numerosas funciones celulares incluyendo la regulación transcripcional, el control del ciclo celular y la infección viral. Importantemente, el tráfico nucleolar transitorio tanto de Tat como de las transcripciones virales del VIH-1 son críticos en la replicación del VIH-1, sin embargo, el(los) papel(es) del nucleolo en la replicación del VIH-1 sigue sin estar claro. Para entender mejor cómo la interacción de Tat con la maquinaria nucleolar contribuye a la patogénesis del VIH-1, investigamos los cambios cuantitativos en la composición del proteoma nucleolar de las células T de Jurkat que expresan establemente el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta TAP. Utilizando un enfoque proteómico organélaro basado en espectrometría de masas, junto con el etiquetado de isótopos estables en cultivo celular (SILAC), cuantificamos 520 proteínas, incluyendo 49 proteínas que muestran cambios significativos en la abundancia de nucleolos de células T de Jurkat sobre la expresión Tat. Numerosas proteínas que exhiben un cambio de pliegue fueron interactuadores Tat bien caracterizados y/o conocidos por ser críticos para la replicación del VIH-1. Esto sugiere que el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares por Tat proporcionan una capa adicional de control para regular la maquinaria celular involucrada en la patogénesis del VIH-1. El análisis del camino y la reconstrucción de la red revelaron que la expresión Tat resultó específicamente en el enriquecimiento nucleolar de proteínas que participan colectivamente en biogénesis ribosomal, homeostasis de proteínas, vías metabólicas incluyendo glucolítico, fosfato de pentosa, nucleótidos y aminoácidos vías biosintéticas, respuesta al estrés, vías de señalización de células T e integridad del genoma. Presentamos aquí el primer perfil diferencial del proteoma nucleolar de células T que expresan el HIV-1 Tat. Discutimos cómo estas proteínas participan colectivamente en redes interconectadas que convergen para adaptar las actividades dinámicas del nucleolus, que favorecen las actividades biosintéticas del huésped y pueden contribuir a crear un entorno celular que apoye la producción robusta del HIV-1. Texto: El nucleolus es un compartimento subnuclear altamente ordenado organizado alrededor de loci genéticos llamados regiones organizadoras nucleolares (NORs) formado por grupos de cientos de repeticiones de genes rDNA organizadas en repetición tándem cabeza a cola [1, 2]. Organelo sin membrana descrito originalmente como la ''Fábrica Ribosoma'', el nucleolus está dedicado a la transcripción de rDNA dirigida por ARN-polimerasa-I, procesamiento de rARN mediado por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (SORNPs) y conjunto ribosoma. La biogénesis del ribosoma es esencial para la síntesis de proteínas y la viabilidad celular [2] y, en última instancia, resulta en las subunidades ribosomales grandes (60S) y pequeñas (40S), que posteriormente se exportan al citoplasma. Este proceso celular fundamental, al que la célula dedica la mayor parte de sus recursos energéticos, está estrictamente regulado para adaptarse a los cambios dinámicos en la proliferación celular, la tasa de crecimiento y las actividades metabólicas [3]. El nucleolus es el sitio de procesamiento adicional de ARN, incluyendo la exportación y degradación de ARNm, la maduración de pequeños PNNR nucleares ricos en uridina (U snRNPs), que forman el núcleo del spliceosoma, biogénesis de ARNt y microARNs (miRNAs) [4]. El nucleolus también está involucrado en otros procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular, procesos oncogénicos, respuestas de estrés celular y traducción [4]. El concepto de nucleolo multifuncional y altamente dinámico ha sido corroborado por varios estudios que combinan enfoques proteómicos organelares y espectrometría cuantitativa de masas, y describen miles de proteínas que transitan por el nucleolo en respuesta a diversas condiciones metabólicas, estrés y ambientes celulares [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Colectivamente, los estudios mencionados representan hitos en la comprensión de la complejidad funcional del nucleolo, y demostraron que las proteínas nucleolares están en intercambio continuo con otros compartimentos nucleares y celulares en respuesta a determinadas condiciones celulares. Los estudios proteómicos que analizan los nucleoli de las células infectadas por el virus sincitial respiratorio humano (HRSV), el virus influenza A, el virus de la bronquitis infecciosa por coronavirus aviar (IBV) o el adenovirus destacaron cómo los virus pueden alterar de forma distintiva la distribución de proteínas nucleolares [2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Curiosamente, tanto las proteínas reguladoras del VIH-1 Tat como Rev localizan al nucleoplasma y al nucleolus. Ambas secuencias abarcan una señal de localización nucleolar (NoLS) que se superpone con su señal de localización nuclear (NLS), que rige su localización nucleolar [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. Además, Tat y Rev interactúan con el antígeno nucleolar B23 Sin embargo, un estudio reciente describió que en contraste con las células T de Jurkat y otras líneas celulares transformadas donde Tat está asociado con el núcleo y el nucleolo, en las células T primarias Tat se acumula principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Mientras que la regulación de su importación y/o exportación nuclear activa, como mediada por la familia de la carioferina/importación, se han descrito bien, los mecanismos que distribuyen Tat y Rev entre el citoplasma, el nucleoplasma y el nucleolo siguen siendo elusivos [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48]. Importantemente, dos estudios importantes de Machienzi y otros han revelado importantes vínculos funcionales entre la replicación del VIH-1 y el nucleo En primer lugar, podrían inhibir la replicación del VIH-1 y la función de transactivación Tat empleando un señuelo TAR dirigido específicamente al nucleolo. Además, utilizando un enfoque similar, con una ribozima anti-VIH-1 de cabeza martillo fusionada al ARN nucleolar pequeño U16 y por lo tanto dirigida al nucleolo, podrían suprimir dramáticamente la replicación del VIH-1. Colectivamente, estos hallazgos sugieren fuertemente que las transcripciones del VIH-1 y el tráfico nucleolar Tat son críticos para la replicación del VIH-1. Sin embargo, la naturaleza de estas contribuciones aún no se ha aclarado. En este informe, analizamos sistemáticamente las perturbaciones del proteoma nucleolar que ocurren en las células T de Jurkat expresando constitutivamente el VIH-1 Tat, utilizando un enfoque de espectrometría cuantitativa de masas. Después de la anotación detallada de los cambios cuantitativos de abundancia en la composición de la proteína nucleolar sobre la expresión Tat, nos centramos en los complejos celulares afectados por Tat y las vías de señalización asociadas con la biogénesis ribosoma, el spliceosoma, las chaperonas moleculares, la replicación y reparación del ADN y el metabolismo, y discutimos su posible implicación en la patogénesis del VIH-1. En este estudio, investigamos los cambios cuantitativos en el proteoma nucleolar de las células Jurkat T expresando constitutivamente el VIH-1 Tat (86aa) frente a su contraparte Tat negativo, utilizando el etiquetado estable de isótopos con aminoácidos en la tecnología de cultivo celular (SILAC), seguido por la espectrometría de masas en tándem ESI e implementamos el enfoque experimental descrito en la Figura 1A. En primer lugar, mediante la entrega de genes retrovirales, transferimos el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta de purificación de afinidad tándem (TAP) (constituido por dos proteínas G y un péptido de unión a estreptavidina) o TAP solo (vector de control) en el clon de células T de leucemia Jurkat E6-1 y clasificamos las células transducidas (GFP positivo) por FACS. Esto resultó en una población altamente enriquecida de células transducidas policlonales que presentaban diferentes niveles de expresión del transgén (Figura 1B). La funcionalidad del TAP-Tat fue confirmada mediante la transfección de las células TAP-Tat y TAP con un vector de genes reportero de luciferasa bajo el control del HIV-1 LTR (pGL3-LTR) [36]. Para abordar la funcionalidad de Tat fusionado a TAP, comparamos Jurkat TAP-Tat con Jurkat-tat, una línea celular que expresaba establemente Tat [51]. Ambas líneas celulares mostraron una actividad LTR del VIH-1 comparable después de la transfección con pGL3-LTR (Figura S1 ). A continuación, la expresión Tat y la localización subcelular fueron verificadas mediante fraccionamiento subcelular seguido por el análisis del WB (Figura 1E ). TAP-Tat mostró una localización nuclear/nucleolar prominente, pero también se pudo detectar en el citoplasma. Estas observaciones fueron además validadas mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 1E ). A continuación se comparó la tasa de crecimiento y proliferación de las líneas celulares de Jurkat TAP y TAP-Tat (Materiales y Métodos S1), que eran equivalentes (Figura S4A ). Del mismo modo, el análisis FACS confirmó que las poblaciones relativas en G1, S y G2/M eran similares para las células de Jurkat TAP-Tat y TAP (Figura S4B ). Se etiquetaron las células de Jurkat TAP-Tat y Jurkat TAP con isótopo ligero (R0K0) y pesado (R6K6) que contenían arginina y lisina, respectivamente. Después de cinco pasajes en su respectivo medio SILAC, se recolectaron 85 millones de células de cada cultivo, se agruparon y se aislaron sus nucleolis como se describió previamente (Figura 1A ) [52] Para evaluar la calidad de nuestro procedimiento de fraccionamiento, se investigó el enriquecimiento específico de antígenos nucleolares conocidos mediante el análisis Western Blot (Figura 1D). Se encontró que la nucleolina (110 kDa) y la fibrilarina (FBL) (34 kDa), dos proteínas nucleolares principales conocidas por localizar al componente granular del nucleolo, estaban muy enriquecidas en la fracción nucleolar mixta. Se observó que la nucleolina se distribuía igualmente entre las fracciones nuclear y citoplasmática. Este patrón de distribución de nucleolina parece ser específico para las células T de Jurkat, como se muestra anteriormente [52, 53]. La proteína nuclear PARP-1 (Poly ADPribose polimerasa 1) (113 kDa) estaba presente en la fracción nuclear y nucleoplasmática, pero se desplegó en la fracción La alfa-tubulina (50 kDa) fue altamente abundante en la fracción citoplasmática y débilmente detectada en las fracciones nucleares. Colectivamente, estos resultados confirmaron que nuestros métodos produjeron una fracción nucleolar altamente enriquecida sin contaminación cruzada significativa. Posteriormente, la mezcla de proteína nucleolar fue tripsindigerida y los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas. El análisis proteomico cuantitativo comparativo se realizó utilizando MaxQuant para analizar las proporciones en isótopos para cada péptido identificado. Se cuantificó un total de 2427 péptidos, representando 520 proteínas nucleolares cuantificadas. La lista completa anotada de proteínas nucleolares cuantificadas está disponible en la Tabla S1 y los datos brutos del análisis de espectrometría de masas se depositaron en la base de datos de repositorios Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/), a la que se puede acceder utilizando las claves de hash descritas en materiales y métodos. Anotamos las proteínas cuantificadas utilizando las herramientas ToppGene Suite [54] y extrajimos las anotaciones de Gene Onthology (GO) e InterPro [55]. El análisis de los procesos biológicos GO (Figura 1F ) reveló que los procesos biológicos mejor representados incluían la transcripción (24%), el procesamiento de ARN (23%), el proceso del ciclo celular (13%) y la organización cromosómica (15%), que refleja las funciones asociadas nucleolares y es comparable a nuestra caracterización anterior del proteoma nucleo El análisis de distribución subcelular (Figura 1F ) reveló que nuestro conjunto de datos contenía proteínas conocidas por localizarse en el nucleolo (49%), en el núcleo (24%) mientras que el 15% de las proteínas estaban descritas previamente para residir exclusivamente en el citoplasma. La distribución subcelular fue similar a nuestro análisis anterior del proteoma nucleolar de células T de Jurkat [52]. Tabla S1. La distribución de las relaciones proteicas se representan en la Figura 1G como log 2 (cambio de abundancia). Las relaciones SILAC indican cambios en la abundancia proteica en la fracción nucleolar de las células TAP de Jurkat en comparación con las células TAP de Jurkat. La distribución de las proteínas cuantificadas siguió una distribución gaussiana (Figura 1G ). Un total de 49 proteínas nucleolares exhibieron un cambio significativo de 1,5 veces o mayor Las células no mostraron cambios en el contenido en estado estacionario de algunos de los principales y abundantes componentes del nucleolo, incluyendo nucleofosfmina (NPM1/ B23), C23, FBL, proteína nucleolar P120 (NOL1) y proteína nucleolar 5A (NOL5A). Las distintas proporciones de cambios proteicos sobre la expresión Tat podrían reflejar la reorganización nucleolar específica y las actividades alteradas del nucleolo. Realizamos el análisis del WB para validar los resultados basados en SILAC obtenidos por nuestro enfoque proteómico cuantitativo (Figura 2 ). 15 proteínas seleccionadas mostraron intensidad diferencial en las fracciones nucleolares sobre la expresión Tat, incluyendo 9 enriquecidos (HSP90b, STAT3, pRb, CK2a, CK2a', HSP90a, Transportin, ZAP70, DDX3), y 3 agotados (ILF3, BOP1 y SSRP1) proteínas. Además, también probamos por el análisis WB, abundancia de proteínas no afectada por la expresión Tat (Importin beta, FBL, B23, C23). Estos resultados destacan la concordancia en la tendencia de las proporciones correspondientes de SILAC, a pesar de algunas diferencias en los rangos cuantitativos. Cabe destacar que, usando WB, pudimos observar un cambio de intensidad para la proteína con un cambio de pliegue SILAC tan bajo como 1,25 veces. Por un lado, el umbral de los cambios en la abundancia de proteínas se puede determinar estadísticamente y luego destacar los cambios en la abundancia más grandes como se ilustra en la Tabla 1. Alternativamente, el enriquecimiento o agotamiento coordinado de la mayoría de las proteínas pertenecientes a un complejo o vía celular distinto permitiría la definición de un grupo de proteínas de interés y potencial significación. Por lo tanto, nos centramos en proteínas individuales enriquecidas o agotadas con actividades asociadas con la patogénesis molecular del VIH-1 o Tat, y en modificaciones agrupadas que afectan vías de señalización celular enteras y complejos macromoleculares. Inicialmente nos centramos en las proteínas de señalización que interactúan con Tat y/o la patogénesis molecular asociada del VIH-1 y cuya abundancia en el nucleolo fue modulada por la expresión Tat. Fosfo-proteína fosfatasas. Fosfo-proteína fosfatasa PP1 y PP2A son esenciales Es importante destacar que el PP1 representa el 80% de la actividad de la fosfatasa Ser/Thr dentro del nucleolo. En nuestro estudio, el PP1 fue potencialmente enriquecido por 1,52 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat, lo que apoya estudios previos que describen el objetivo nuclear y nucleolar de PP1a por el HIV-1 Tat y cómo PP1 aumenta la regulación de la transcripción del VIH-1 [58, 59, 60, 61, 62]. El PP1 c también fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro [63]. Curiosamente, la asociación Tat con los promotores de la subunidad PP2A resulta en la sobreexpresión y regulación de la actividad PP2A en linfocitos [64, 65]. Además, PP2A contribuye a la regulación de la transcripción y replicación del VIH-1 [61, 66]. Retinoblastoma Protein. El gen supresor tumoral pRb protein mostró un cambio de 1,4 veces en el nucleolus sobre la expresión Tat [67]. Además, el análisis WB confirmó la translocación distinta del pRb del nucleoplasma al nucleolus por Tat (Figura 2 ). Dependiendo del tipo de célula, pRb puede ser hiperfosforilado o hipofosforilado sobre la expresión Tat y puede regular negativamente o positivamente la transcripción mediada por Tat respectivamente [68, 69, 70]. Curiosamente, la hiperfosforilación de los desencadenantes del pRB en su translocación en el nucleolo [71]. La fosforilación del pRB también se asocia con un aumento de la biogénesis ribosómica y el crecimiento celular [72]. STAT3. El transductor de señal de factor de transcripción y activador de la transcripción 3 (STAT3) se enriqueció significativamente (1,86 veces) en la fracción nucleolar por la expresión constitutiva Tat. Además, el análisis WB indicó que la expresión Tat podría promover la relocalización del STAT3 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento distinto en el nucleolo (Figura 2). Curiosamente, estudios anteriores han demostrado la activación mediada por Tat de la señalización STAT3, como lo demuestra su estado de fosforilación [73]. Curiosamente, la fosforilación STAT3 indujo la dimerización de la proteína después de su translocación al núcleo [74]. YBX1. YBX1, la proteína multifuncional de unión al ADN/ARN fue enriquecida por 1,38 veces en el nucleolo de las células de Jurkat sobre la expresión Tat. Curiosamente, YBX1 interactúa con Tat y TAR y modula la expresión génica del VIH-1 [63, 75]. ZAP70. La proteína tirosina cinasa ZAP70 (proteína quinasa asociada a la cadena Zeta 70) fue enriquecida por 1,24 veces en el nucleolo de las células de Jurkat expresando Tat [76]. Además, el análisis del WB reveló que la expresión Tat podría promover la relocalización del ZAP70 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento La proteína de matriz nuclear interna, Matrin 3 (MATR3), presentó un cambio de 1,39 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat. Se localiza en el nucleolasmo con un patrón difuso excluido de los nucleolos [77]. La matrin 3 ha sido identificada como parte del nucleoloma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Dos estudios recientes han descrito a la matrin 3 como parte de complejos de ribonucleoproteínas, incluyendo también el VIH-1 Rev y (elemento de respuesta Rev) RRE que contiene ARN VIH-1, y promoviendo la regulación post-transcripción del VIH-1 [78, 79, 80]. CASP10. La molécula pro-apotótica de señalización, Caspasa 10 (CASP10), se agotó significativamente de las células nucleolus de Jurkat-Tat (0,82 veces) [81]. Importantemente, la expresión Tat desregula la expresión y actividad de CASP10 en las células Jurkat [82]. ADAR1. Adenosina deaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR1), que convierte las adenosinas en inosinas en ARN de doble cadena, se agotó significativamente del nucleolus de las células Jurkat-Tat (0,78 veces). Curiosamente, ADAR1 sobreexpresión regula la replicación del VIH-1 a través de un mecanismo de edición del ARN [83, 84, 85, 86, 87, 88]. Además, ADAR1 pertenece al interactoroma nuclear in vitro Para subrayar las relaciones estructurales y funcionales de las proteínas nucleolares afectadas por el VIH-1 Tat, construimos una representación en red de nuestro conjunto de datos. Utilizamos la versión 2.6.3 de Cytoscape [89] y utilizando el plugin MiMI [90] para mapear interacciones previamente caracterizadas, extraídas de bases de datos de interacción de proteínas (BIND, DIP, HPRD, CCSB, Reactome, IntAct y MINT), lo que resultó en una red altamente densa y conectada que incluía 416 proteínas (nodos) de las 536 proteínas, unidas por 5060 interacciones no dirigidas (borde) (Figura 3A). El análisis de centralidad reveló un umbral de 23.7 interacciones por proteína. El análisis de topología utilizando el plugin CentiScaPe [91] mostró que la distribución del grado de nodo sigue una ley de energía (Figura S5 Es importante destacar que cuando analizamos la distribución del coeficiente de agrupamiento (Figura S6 ) encontramos que la red está organizada en una arquitectura jerárquica [92], donde los nodos conectados forman parte de áreas altamente agrupadas mantenidas por pocos hubs organizados alrededor del HIV-1 Tat. Además, el análisis de la conexión en grados nodos de nuestra red identificó al HIV-1 Tat como la proteína más conectada (Figura S6 ). Específicamente, el análisis de topología indicó que los valores para las centrales Tat eran los más altos (grado de nodo, estrés, radialidad, cercanía, entreess y centroides), caracterizando a Tat como la proteína principal del hub de la red nucleolar. De hecho, un total de 146 proteínas han sido descritas previamente para interactuar con Tat (Figura 3B, Tabla S2 ). Estas proteínas están involucradas En paralelo, caracterizamos la magnitud de los cambios de abundancia proteica relacionados observados en distintas vías celulares (Figura 4). Biogénesis ribosomal. Inicialmente nos centramos en la biogénesis ribosoma, función primaria del nucleolo. Pudimos observar un aumento general y coordinado en la abundancia de proteínas ribosomales en el nucleolo por expresión Tat (Figura 4 ). Mientras algunas proteínas ribosomales permanecían inalteradas, Tat causó la acumulación nucleolar de varias proteínas ribosomas grandes y pequeñas distintas, excepto RPL35A, para las cuales la expresión Tat causó una marcada disminución en el nivel nucleolar (0,29 veces). Asimismo, varias proteínas involucradas en el procesamiento de ARNr exhibieron un aumento general en la acumulación nucleolar sobre la expresión Tat. Estos incluyen a los miembros canónicos humanos de la familia L7ae junto con los miembros que participan en la Caja C/D, H/ACA y U3 snoRNPs (Figura 4). Por el contrario, BOP1, un componente del complejo PeBoW (Pescadillo Bop1 WDR12) esencial para la maduración de la subunidad ribosómica grande, se agotó significativamente del nucleolo de las células TAP-Tat Jurkat (0,81 veces) y esto fue confirmado por el análisis WB (Figura 2 ) [93]. Sin embargo, los otros componentes complejos PeBoW, Pes1 (0,94 veces) y WDR12 (1,1 veces), no fueron afectados por la expresión Tat. Se identificaron y cuantificaron en nuestro conjunto de datos 55 proteínas de las 108 proteínas spliceosomal conocidas [94]. Estas proteínas incluyen las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares U1, U2 y U5, Sm D1, D2, D3, F y B, y las heterogéneas ribonucleoproteínas nucleares. Nuestros datos sugieren un aumento distinto en la abundancia de proteínas específicas complejas del spliceosoma tras la expresión de HIV-1 Tat en células T de Jurkat (Figuras 3 y 4). Las únicas tres proteínas que se agotaron significativamente del nucleolo tras la expresión del HIV-1 Tat fueron RBMX (0,89 veces), HNRNPA2B1 (0,84 veces) y SNRPA (0,81 veces). Varias investigaciones mostraron alteración de la expresión en los factores de empalme celular en células infectadas por HIV-1 [95, 96] Hemos identificado varias chaperonas moleculares, cochaperonas y otros factores involucrados en la proteostasis para ser altamente enriquecidos en el nucleolo de las células T sobre la expresión Tat (Figuras 3 y 4), muchos de los cuales fueron previamente caracterizados como parte del interactoroma nuclear Tat [63]. Varias proteínas de choque térmico incluyendo DNAJs, específicas HSP90, HSP70 y HSP40 isoformas y sus cofactores se enriquecieron distintivamente en la fracción nucleolar de las células Jurkat expresando Tat (Figura 4 ). Como lo muestra WB, mientras que HSP90a y b son principalmente citoplasmáticas, la expresión Tat desencadena su relocalización al núcleo y nucleolus, corroborando nuestro enfoque cuantitativo proteómico (Figura 2). Del mismo modo, el choque térmico puede hacer que el HSP90 y el HSP70 se reubiquen en el nucleolo [97, 98, 99, 100, 101]. En un estudio reciente, el grupo de Fassati ha demostrado que el HSP90 está presente en el promotor del VIH-1 y puede regular directamente la expresión génica viral [102]. También observamos el aumento coordinado de la abundancia de la clase I (GroEL y GroES) y la clase II (chaperonina que contiene TCP-1 (CTT)) moléculas de chaperonina (Figuras 3 y 4) sobre la expresión Tat. Vía proteasómica de la ubiquitina. La vía proteasómica es el principal sistema proteolítico de células eucariotas [103]. Es importante destacar que la vía ubiquitina-proteasoma nuclear controla el suministro de proteínas ribosomales y es importante para la biogénesis ribosoma [104, 105]. El proteasoma 26S está compuesto por la partícula núcleo 20S (CP) y la partícula reguladora 19S (RP). Alternativamente, CP puede asociarse con el 11S RP para formar el inmunoproteasoma. Todas las proteínas cuantificadas en nuestro estudio son parte del complejo regulador 19S e incluyen PSMD2 (1,5 veces), PSMD3 (1,32 veces), PSMD11 (1,25 veces) y PSMD13 (0,72 veces), el único componente proteasoma significativamente agotado del nucleolo en presencia de Tat (Figura 4). Curiosamente, Tat interactúa con subunidades distintas del sistema proteasoma, incluyendo las subunidades 19S, 20S y 11S. Las consecuencias de estas interacciones incluyen la competencia de Tat con 11S RP o 19S RP para la unión al 20S CP, que resultó en la inhibición de la actividad de la peptidasa 20S [106, 107, 108, 109, 110, 111]. Además, Tat demostró modificar la composición proteosoma y la actividad, que afecta a la generación de antígenos péptidos reconocidos por linfocitos T citotóxicos [112]. Importantemente, un estudio reciente demostró que en ausencia de Tat, los componentes proteosomas están asociados al promotor del VIH-1 y la actividad proteosoma limita la transcripción [113]. La adición de Tat promovió la disociación de la subunidad 19S del proteasoma 20S, seguido por el enriquecimiento distintivo del complejo similar a 19S en extractos nucleares junto con el reclutamiento mediado por Tat de las subunidades 19S para el promotor del VIH-1, lo que facilitó su elongación transcripcional [113]. También cuantificamos UBA1 (1,36 veces), la ubiquitina-proteína ligasa UHRF1 (1,13 veces), UBC (1 veces) y dos Ubiquitinspecific-peptidases, USP30 (1,28 veces) y USP20 (0,06 veces) (Figura 4). Replicación y reparación del ADN. Tras la expresión del HIV-1 Tat, observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de varios factores celulares asociados con la replicación del ADN y las vías de reparación (Figura 4). Tat indujo el enriquecimiento coordinado del complejo MCM2-7 de mantenimiento cromosómico en miniatura (de 1.23-a 3,30 veces, respectivamente) [114]. MCM7, 6 y 3 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. El mantenimiento estructural de los cromosomas 2, SMC2, fue enriquecido (1,35 veces) en la fracción nucleolar por expresión Tat. SMC2 fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Mientras que el factor de replicación C1 (RFC1) y RFC2 (1,31 y 1,28 veces respectivamente) mostró un cambio de pliegue incrementado y RFC5/3 no se vieron afectados, RFC4 se redujo gravemente (0,69 veces) de la fracción nucleolar sobre la expresión Tat [115]. El RFC1 y RFC2 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Tat indujo el enriquecimiento de XRCC6 (1,27 veces) y XRCC5 (1,36 veces) en el nucleolo, que están involucrados en la reparación de la unión final del ADN no-homologoso (NHEJ) [116]. XRCC6 se asocia con complejos de preintegración viral que contienen HIV-1 Integrase y también interactúan con Tat y TAR [117, 118, 119]. Además, en una pantalla basada en ribozyme, el derribo del XRCC5 (Ku80) disminuyó tanto la integración retroviral como la transcripción Tatmediated [120]. Como parte de la reparación de la escisión base (BER), hemos identificado una importante endonucleasa apurínico/apirimidinica 1 (APEX1) (1,29 veces). Importantemente, en una pantalla de siRNA dirigida a los factores de reparación del ADN, se encontró que la reducción de APEX1 inhibe la infección por VIH-1 por más de 60% [121]. La proteína del grupo de alta movilidad (HMG) HMGA1 (1,30 veces), fue enriquecida en el nucleolo después de la expresión Tat [122]. HMGA1 interactúa con la integración del VIH-1 y forma parte del complejo de preintegración del VIH-1 [123, 124]. Importantemente, HMGA1 ha sido identificada en una pantalla proteómica, como un cofactor celular que interactúa con el VIH-1 59líder [125]. Metabolismo. Nuestros datos proteómicos sugieren que Tat induce perturbaciones en la glucólisis, la vía del fosfato pentosa y la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos (Figura 4 y Figura S7 ). En particular, en las células T que expresan Tat, detectamos cambios coordinados en la abundancia de proteínas no conocidas previamente que se asocian con la patogénesis del Tat, que revelaron conexiones inesperadas con la glicólisis y la vía del fosfato pentosa, incluyendo las siguientes enzimas glicólicas, lactato deshidrogenasa B (LDHB) (1,37 veces), la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1,17 veces) y la mutasa del ácido fosfoglicérico (PGAM1) (0,89 veces) (Figura 4 y Figura S En resumen, el GPI cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Posteriormente, el PFKP cataliza la conversión irreversible de fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato y es una enzima reguladora clave de la glucólisis. Al final de la vía glicolítica, PKM2, en su forma tetramérica, se sabe que genera ATP y piruvato, mientras que el LDHB desvía la mayoría del piruvato a la producción y regeneración de lactato de NAD+ en apoyo a la glicólisis continua, un fenómeno descrito para las células T proliferativas [126]. Esto regula la disponibilidad de los intermedios de glucosa, que se redirigen a las vías de la pentosa fosfato y de la serina biosíntesis para la producción de precursores biosintéticos de nucleótidos, fosfolípidos y aminoácidos. Como parte de la vía del fosfato de pentosa, hemos caracterizado el enriquecimiento significativo de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) (2,11 veces), que ramas de la vía de la glicólisis para generar NADPH, ribosa-5fosfato un precursor importante para la síntesis de nucleótidos. Consistente con esto, detectamos el aumento coordinado en la abundancia de enzimas que juega un papel central en la síntesis de purinas y pirimidinas. Más específicamente, IMPDH2 (1,66 veces), una enzima limitante de la tasa en el punto de rama de la biosíntesis de nucleótidos de purina, que conduce a la generación de nucleótidos de guanina, fosforibosil pirofosfato sintetasa 2 (PRPS2) (1,41 veces), cytidine-5-prime-trifosfato sintetasa (CTPS) (1,74 veces) que cataliza la conversión de UTP a CTP y la subunidad grande de ribonucleótido reductasa (RRM1) (1,56 veces). En parralel, observamos el aumento de la abundancia de la fosfoserina aminotransferasa PSAT1 (1,90 veces), una enzima implicada en la biosíntesis de serina, que se ha relacionado con la proliferación celular in vitro. La interfaz host-virus es un aspecto fundamental en la definición de la patogénesis molecular del VIH-1 [127, 128, 129, 130, 131, 132, 133]. De hecho, con su repertorio limitado de proteínas virales, el VIH-1 se basa ampliamente en la maquinaria de las células huésped para su replicación. Varios estudios recientes han capitalizado los recientes avances en las tecnologías ''OMICS'', y han revelado importantes perspectivas en este diálogo molecular finamente afinado [132, 134]. El VIH-1 Tat es esencial para la replicación viral y orquesta la expresión génica del VIH-1. La proteína reguladora viral es conocida por interactuar con una amplia gama de proteínas celulares y modular la expresión del gen celular y la vía de señalización [135, 136]. Nosotros y otros hemos utilizado enfoques a nivel del sistema para investigar la interacción Tat con la maquinaria de las células de acogida, que han caracterizado al HIV-1 Tat como un mediador crítico de la interfaz host-viral [137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149]. Aquí, hemos investigado el tráfico de proteínas nucleolares en respuesta a la expresión HIV-1 Tat en células T, con el fin de proporcionar ideas únicas y novedosas sobre el papel de la compartimentación de proteínas por Tat en el ajuste fino de la disponibilidad de proteínas y la función. Hemos desarrollado para este estudio, un modelo celular utilizando Jurkat T-cells expresando firmemente Tat fusionado en su N-ternminal a TAP-tag. Jurkat T-cells son robustos y presentan la ventaja de crecer sin estímulos y se transducen fácilmente utilizando Es importante destacar que se han empleado ampliamente para evaluar la patogénesis mediada por Tat utilizando enfoques de todo el sistema y para analizar las vías y funciones de señalización celular clave de las células T [144, 150, 151, 152]. De hecho, hemos encontrado que son especialmente adecuadas para cultivos in vitro prolongados en el medio SILAC y posterior aislamiento de su nucleolo, seguido por el análisis de MS, que requiere hasta 85 millones de células. Fusionamos Tat a la etiqueta TAP para permitir futuras aplicaciones posteriores como purificación de afinidad de Tandem o análisis IP de Cromatina. Importantemente, hemos confirmado que la etiqueta TAP N-terminal no interfirió con la función Tat ni su localización en las células Jurkat, cuando se compara con la no etiquetada-Tat. Aunque se sabe que Tat se acumula en el núcleo y el nucleolo en las células de Jurkat y otras líneas celulares transformadas, en las células T primarias, Tat se describe para acumularse principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Estas diferencias permanecen por caracterizarse, pero podrían estar relacionadas con diferentes niveles de expresión de los factores de transporte en las líneas celulares transformadas versus las células primarias, como se describe recientemente por Kuusisto et al. [39]. Además, Stauber y Pavlakis han sugerido que la localización nucleolar Tat podría ser el resultado de la sobreexpresión Tat [31]. Aquí, hemos seleccionado y empleado una población policlonal de células T Jurkat que expresan Tat en diferentes niveles. Proponemos que esta heterogeneidad en los niveles de expresión Tat podría reflejar la expresión estocástica Ta Utilizando una estrategia proteómica cuantitativa basada en un enfoque organélaro, cuantificamos más de 520 proteínas nucleolares, incluyendo 49 proteínas que muestran un cambio significativo en el pliegue. La medida en que las variaciones inducidas en la abundancia de proteínas nucleolares son biológicamente relevantes y pueden afectar los procesos celulares y/o virales queda por determinar. Sin embargo, la naturaleza biológica de las vías y los complejos macromoleculares afectados nos permiten discutir sus posibles asociaciones con la patogénesis del VIH-1. El VIH-1 Tat se expresa tempranamente después de la integración del genoma del VIH-1 y media el cambio a la fase de producción viral, asociado con la expresión génica proviral robusta, el ensamblaje de proteínas virales y, en última instancia, el surgimiento y liberación de viriones. En este contexto y basado en nuestros resultados, proponemos que Tat podría participar en la configuración del entorno intracelular y el perfil metabólico de De hecho, observamos el enriquecimiento nucleolar distinto de proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica, lo que podría ser indicativo de un aumento en la síntesis proteica. Con la notable exepción de RPL35A depleción nucleolar, proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica estaban en las 20 proteínas nucleolares más enriquecidas (NHP2L1, RLP14, RPL17, RPL27, RPS2, RPL13). Además, este efecto parece ser específico del HIV-1 Tat ya que la inhibición de transcripción por Actinomicina D resultó en el agotamiento total de proteínas ribosómicas en el nucleolo [9]. Además, el análisis proteómico cuantitativo de las células nucleas en adenovirus infectados mostró una leve disminución en proteínas ribosómicas [24] Si esto refleja un cambio en la biogénesis del ribosoma y/o un cambio en la composición de las subunidades ribosomales queda por determinar. Sin embargo, la necesidad adaptada de una producción elevada del ribosoma es intuitiva para un sistema que necesita apoyar la creciente demanda de nueva síntesis de proteínas virales. En parralel, observamos la modulación concordante de las vías que regulan la homeostasis proteica. Observamos la significativa acumulación nucleolar de múltiples chaperonas moleculares incluyendo las HSPs, el complejo TCP-1, y moléculas CANX/CALR y la abundancia nucleolar interrumpida de proteínas pertenecientes a la vía ubiquitina-proteasoma, que controla el suministro de proteínas ribosomales [104, 105]. Estas observaciones apoyan estudios previos que describen la modulación de la actividad proteasómica por Tat, que afectan a la expresión, el montaje y la localización de subunidades específicas de los complejos proteasómicos [106, 107, 108, 109, 110, 111, 113]. También observamos el agotamiento concomitante de CASP10 en el nucleolo de Jurkat TAP-Tat. Se ha sugerido que CASP10 podría estar dirigido al nucleolo para inhibir la síntesis proteica [154]. Curiosamente, la presencia y los papeles potenciales de las chaperonas moleculares en el nucleolo han sido destacados por Banski et al, quienes explican cómo la red chaperona podría regular la biogénesis ribosoma, la señalización celular y la respuesta al estrés [97, 155]. A medida que la producción viral avanza hacia la fase tardía y aumenta el estrés celular, el enriquecimiento nucleolar de las chaperonas moleculares por Tat no sólo podría permitir el plegado de adequat de proteínas virales recién sintetizadas, sino que también podría promover la tolerancia de las células infectadas al estrés y mantener la viabilidad celular. Coincidentemente, observamos el marcado enriquecimiento nucleolar de enzimas pertenecientes a vías metabólicas incluyendo glicólisis, fosfato de pentosa, nucleótido y aminoácidos vías biosintéticas. Del mismo modo, estas vías se elevan en células T proliferativas o en células cancerosas después de un cambio metabólico a la glicólisis aeróbica, también conocido como el efecto Warburg [156, 157, 158, 159]. Allí, los intermedios de glucosa de la vía de la glicólisis no sólo se comprometen a la producción de energía y se descomponen en piruvato para el ciclo TCA, sino que se redirigen a vías alternativas, incluyendo la vía del fosfato de pentosa, y se utilizan como precursores metabólicos para producir nucleótidos, aminoácidos, acetil CoA y NADPH para la homeostasis redox. De manera consistente, también se observó el enriquecimiento nucleolar concomitante de enzimas pertenecientes a la vía de síntesis de nucleótidos, incluyendo IMPH2, una enzima limitante conocida para controlar el pool de GTP. De igual manera, se observó el enriquecimiento nucleolar de PSAT1, una enzima involucrada en el metabolismo de serina y treonina, que está asociada con la proliferación celular [160]. Colectivamente, proponemos que mediante el control de la homeostas Sin embargo, las enzimas glucolíticas han sido detectadas en las fracciones nuclear y nucleolar mediante análisis proteómicos [8, 161]. Además, las enzimas glucolíticas, como PKM2, LDH, fosfoglicerato cinasa, GAPDH y aldosa, también han sido reportadas para mostrar localización nuclear y unirse al ADN [162]. Más específicamente, PKM2 es conocido por asociarse con el promotor y participar en la regulación de la expresión génica como coactivador transcripcional [163]. HIV-1 Tat ha sido descrito previamente como un inmunoregulador y más específicamente, ha sido reportado tanto para inhibir o promover la señalización TCR [164]. Hemos observado el enriquecimiento nucleolar por Tat de componentes proximales o aguas abajo clave de las vías de señalización de células T, incluyendo ZAP70, ILF3 y STAT3, que juegan un papel crucial en el desarrollo y activación de células T. Anteriormente los habíamos identificado como componentes específicos de células T del nucleolo, y los estudios de IF sugirieron que su asociación con el nucleolo podría ser regulada por condiciones específicas [165]. Nuestros resultados apoyan aún más que Tat podría contribuir a la disregulación de las señales derivadas de TCR y que el nucleolo podría representar un importante enlace espacial para las moléculas de señalización TCR. Observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de componentes clave de las vías de replicación, recombinación y reparación del ADN por Tat. Estos incluyen XRCC5 y XRCC6, HMGA1, APEX1, MCM2-7, SMC2, RFC1 y RFC2, mientras que RFC4 se encontró significativamente agotado. Curiosamente, estos cofactores se han asociado con la eficiencia de la integración del ADN retroviral en el ADN del huésped o la integridad del provirus integrado [166]. Si la abundancia creciente de estos factores dentro del nucleolo podría estar asociada con su participación potencial en la integración y mantenimiento de la integridad del gen provirus, queda por determinar. Los mecanismos de segregación mediada por Tat y compartimentación de proteínas dentro o fuera del nucleolo pueden depender de factores inherentes para cada proteína y la naturaleza de su relación con Tat, ya que el fraccionamiento subcelular combinado con el análisis del WB mostró que el patrón y el grado de redistribución subcelular entre proteínas variaban. Pudimos observar casos en los que Tat regulaba la expresión de proteínas que resultaban en un aumento general de estas proteínas en los compartimentos celulares incluyendo el nucleolo (DDX3, TNPO1). Alternativamente, Tat podía desencadenar la translocación nucleolar de proteínas directamente desde el citoplasma o el nucleoplasma (pRb). Además, observamos proteínas citoplasmáticas redistribuidas tanto al nucleoplasma como al nucleolo sobre la expresión Tat (STAT3, ZAP70 y HSP90). Finalmente, también notamos el agotamiento proteico en la fracción nucleolar acompañado de un aumento en el nucleoplasma (SSRP1). Sigue siendo difícil en esta etapa, apreciar si la acumulación de proteínas específicas resultaría en su activación o inhibición al secuestrarlas de su lugar de acción. Por el contrario, el agotamiento de una proteína del nucleolus podría resultar en la regulación descendente de su actividad en este lugar o podría ser el resultado de su movilización desde su sitio de almacenamiento, el nucleolus, al nucleoplasma o citoplasma donde puede realizar su función. Cabe destacar que identificamos a varios socios conocidos del VIH-1 Tat involucrados en la patogénesis del VIH-1, lo que sugiere que Tat podría modular físicamente su objetivo nucleolar o su reclutamiento a un sitio específico en el nucleoplasma o citoplasma. Tat también podría promover modificaciones post-traducción, lo que podría mediar la focalización de proteínas específicas al nucleolus. Esto se ilustra por las siguientes proteínas enriquecidas, pRb, PP1 y STAT3, para lo que la fosforilación es inducida por Tat. Importantemente, su estado de fosforilación determina su distribución subcelular, proporcionando así un mecanismo Además, nuestros datos indican que las serinas/treoninas quinasas (CK2 a') y fosfatasas (PP1) se enriquecieron significativamente en las fracciones nucleolares de Jurkat TAP-Tat. Estas enzimas representan la mayor parte de la actividad de fosforilación/desfosforilación en el nucleolo y pueden actuar como reguladores del tráfico de proteínas nucleolares. Además, Tat disminuyó significativamente los niveles de SUMO-2 en el nucleolo. Del mismo modo, se sabe que las modificaciones posteriores a la traducción mediadas por SUMO modulan la localización de proteínas nucleolares [104]. Dada la importancia potencial de las modificaciones posteriores a la traducción, incluida la fosforilación en el cambio mediado por Tat de la abundancia de proteínas nucleolares, un enfoque proteomico más específico como el enriquecimiento de fosfopétidos El control de la rotación de proteínas también es un medio importante para modular la abundancia de proteínas nucleolares. Las proteínas ribosómicas son degradadas por la vía Ubiquitina-Proteasoma para asegurar que su abundancia coincida con los niveles de transcripción de rRNA. A la inversa, las proteínas de choque térmico HSP90s las protegen de la degradación. Curiosamente, nuestros datos muestran que la modulación Tat de las proteínas de abundancia asociadas con la vía Ubiquitina-proteasoma y choque térmico. Esto podría contribuir al enriquecimiento observado de proteínas ribosómicas por Tat. Sin embargo, no podemos excluir que la mayor abundancia de proteínas ribosómicas en el nucleolo podría ser el resultado de la prevención mediada por Tat de su exportación al citoplasma. Curiosamente, utilizando un sistema celular diferente, una cepa transgénica de Drosophila melanogaster Tat, Ponti et al, analizaron los efectos de Tat en la biogénesis ribosoma, después de 3 días de tratamiento de choque térmico para inducir la expresión Tat bajo el control del promotor hsp70 [167]. Después de la expresión Tat, observaron un defecto en el procesamiento pre-rRNA asociado con una disminución en el nivel de 80S ribosomas [167]. Sin embargo, los diferentes sistemas celulares empleados combinados con la inducción de choque térmico de 3 días hacen que sus resultados sean difíciles de comparar con los nuestros. Mientras que estudios anteriores a nivel de sistema han monitoreado los efectos de la expresión Tat del VIH-1 en las células T, a nuestro conocimiento, hemos presentado aquí el primer análisis proteómico de la composición dinámica del nucleolus en respuesta a la expresión Tat del VIH Utilizando proteómica cuantitativa, hemos subrayado los cambios en la abundancia de proteínas nucleolares específicas y hemos destacado la reorganización nucleolar extensa y coordinada en respuesta a la expresión constitutiva Tat. Nuestros hallazgos subrayan que Tat que expresa células T exhiben un perfil proteómico nucleolar único, que puede reflejar una estrategia viral para facilitar la progresión a la producción viral robusta. Importantemente, hemos notado la relación funcional de proteínas nucleolares de nuestro conjunto de datos con la patogénesis VIH-1 y el Tat VIH-1 en particular. Esto aumenta aún más nuestra confianza en nuestra estrategia experimental y sugiere un papel para Tat en el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares. Finalmente, nuestro estudio proporciona nuevas ideas sobre la importancia de Tat en la conversación cruzada entre funciones nucleolares y patogénesis viral. También hemos identificado cambios en la abundancia de proteínas nucleolares que no estaban previamente asociados con la patogénesis del VIH-1, incluyendo proteínas asociadas a vías metabólicas, que proporcionan nuevos objetivos potenciales y vías celulares para la intervención terapéutica.Células T Jurkat, clon E6.1 (ATCC), Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP se mantuvieron en el medio RPMI-1640 complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (Gibco, aprobado por la UE), y antibióticos. Células Phoenix-GP (G.P. Nolan; www.stanford.edu/ group/nolan/), se mantuvieron en el medio DMEM complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (GIBCO, aprobado por la UE). La secuencia de HIV-1 Tat (VIH-1 HXB2, 86 aminoácidos) fue subclonada en el vector pENTR 2B (Invitrogen, A10463). Usando la tecnología Gateway (Invitrogen), introdujimos la secuencia HIV-1 Tat en el plásmido pCeMM-NTAP(GS)-Gw [168]. Las células Fénix (G.P. Nolan; www.stanford.edu/group/nolan/), fueron transfectadas usando Fugene 6 (Roche) con 5 mg del plásmido NTAP-Tat o NTAP y 3 mg del pMDG-VSVG. Los sobrenadantes virales fueron recolectados después de 48 h, filtrados y utilizados para transducir las líneas celulares de Jurkat. La construcción se denomina NTAP-Ta Utilizando la entrega de genes retrovirales, transferimos de forma estable células Jurkat (clone E6.1 (ATCC)). Los clones positivos llamados Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron ordenados para enriquecer la población de células que expresaban GFP usando el clasificador de células BC MoFlo XDP (Beckman Coulter). Las fracciones subcelulares (10 mg) fueron resueltas por SDS-PAGE y transferidas a membranas BioTrace PVDF (Pall corporation). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: a-Tubulina (Sc 5286), C23 (Sc 6013), y Fibrilarina (Sc 25397) de Santa Cruz Biotechnology, y PARP (AM30) de Calbiochem, Ratón anti-ZAP 70 (05-253, Millipore), Ratón anti-STAT3 (06-596, Millipore), Ratón anti-ILF3 (ab92355, Abcam), Ratón anti-HSP90 beta (ab32568, Abcam), Ratón anti-ADAR1 (ab88574, Abcam), Ratón anti-HDAC1 (ab19845, Abcam), Ratón anti-SSRP1 (ab21584, Abcam) conejo anti-BOP1 (ab86982, Abcam), Ratón anti-KpNB1 (ab10303, Abcam), Ra Para el análisis SILAC-RPMI R0K0 y SILAC-RPMI R6K6 (Células Dundidas) se utilizó un medio con un 10% de FBS dializado (GIBCO, 26400-036); las células Jurkat que expresaban NTAP-Tat y NTAP fueron transitadas en serie y cultivadas durante cinco duplicados para asegurar la incorporación completa de los aminoácidos marcados; la viabilidad de las células se verificó con Trypan Blue (0,4% solución, SIGMA) y posteriormente se confirmó mediante tinción IP y análisis FACS; las células se mezclaron a la relación 1:1 para obtener 140610 6 células; los nucleoli fueron aislados de la población celular mixta como se describió previamente en Jarboui et al., [165]. Los extractos nucleolares (100 mg) fueron resuspendidos en bicarbonato de amonio de 50 mM y en solución de tripsina digerida como se describió previamente en Jarboui y col. [165]. La muestra se realizó en un espectrómetro de masa termoscientifico LTQ Orbitrap XL conectado a un sistema cromatógrafo NANO LC.1DPLUS que incorporaba una muestra automática. La muestra fue cargada en una columna Biobasic C18 PicofritTM (100 mm de longitud, 75 mm ID) y fue separada por un gradiente de acetonitrilo en aumento, utilizando un gradiente de 142 min de fase inversa (0-40% de acetonitrilo durante 110 min) a un caudal de 300 nL min-1. El espectrómetro de masa fue operado en modo iónico positivo con una temperatura capilar de 200uC, una tensión capilar de 46V, una tensión de lente de tubo de 140V y con un potencial de 1800V aplicada al frit. Todos los datos fueron adquiridos con el espectrómetro de masa que funciona en modo de conmutación automática dependiente de datos. Se realizó una exploración MS de alta resolución utilizando el Orbitrap para seleccionar los 5 iones más intensos antes del análisis MS/MS utilizando la trampa Ion. La eficiencia de incorporación de aminoácidos etiquetados fue determinada mediante el análisis de los péptidos identificados en nucleoli aislados de la población celular mantenida en el medio 'Heavy' como se describe en [169]. Nuestro análisis mostró que teníamos una eficiencia de incorporación.95% (datos no mostrados). Los espectros MS/MS fueron buscados para la identificación y cuantificación de los péptidos utilizando el software MaxQuant [170] (versión 1.1.1.36), la Base de Datos del IPI Humano (versión 3.83) y el motor de búsqueda Andrómeda asociado a MaxQuant [171]. Se utilizaron parámetros estándar para MaxQuant con el Acetil (término N de Proteína) como modificación variable y Carbamidometilo (Cys) como modificación fija, se permitieron 2 escisiónes perdidas, excepto que se prohibió el filtrado de aminoácidos etiquetados. La desviación de masa inicial de los iones precursores y fragmentos fue de 7 ppm y 0,5 Da, respectivamente. Cada relación proteica fue calculada como promedio ponderado de intensidad de los coeficientes de péptidos individuales. Las proteínas fueron identificadas con el mínimo de un péptido con una tasa La ontología genética, la vía KEGG y los términos Pfam se extrajeron de entradas UNIPROT utilizando Perseo, un software del paquete de análisis de datos MaxQuant (http://www.maxquant.org ), y las herramientas de la suite ToppGene [54]. El Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron transfectados utilizando el sistema de electroporación Amaxa (biosistema Amaxa) con el pGL3 (pGL3-LTR) (Promega) como recomendado por Amaxa Biosystem. Los ensayos de doble luciferasa (Promega) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de Luciferasa se midió y normalizó contra la cantidad total de proteínas cuantificada por el kit de cuantificación de proteínas BCA (Pierce, Thermo Scientific). Para preservar Las células se fijaron en un 2% PFA durante 10 minutos en RT, permeabilizaron en un 0,5% Triton X-100 durante 15 minutos en RT y se bloquearon con 5% FCS. Las células se incubaron con el anticuerpo Tat VIH-1 de conejo (ab43014, Abcam) seguido por el anticuerpo secundario anti-Rabbit alexa fluor 647 (A-21246, Invitrogen). Las células se les permitió unirse a Cell-Tak (BD) recubierto de Diapositivas Silanizadas (DaoCytomation), y manchado con DAPI. Las imágenes se capturaron con un Microscopio Confocal Carl Zeiss equipado con un objetivo DIC de aceite de Plan-Apocromat 63X/14. El archivo de datos RAW proteómicos del análisis de espectrometría de masas se depositó en el repositorio Tranche(http El archivo se puede acceder y descargar utilizando la siguiente clave de hash:(R3O5SV5Z6HvWqrBNDhp21tXFetluDWYxvwMIfU-h6e1kMgarauCSq4dlNcxeUvFOHDEzLeDcg4X5Y8reSb6-MUA6wM1kIAAAAAAB/w = ). Materiales y Métodos S1 Descripción de los métodos empleados para examinar el ciclo celular, la viabilidad celular y el análisis de proliferación celular. (DOCX)

¿Qué antígeno nucleolar es esencial para la localización de las proteínas Tat y Rev?

Tráfico de proteínas nucleolares en respuesta al VIH-1 Tat: Rewiring the Nucleolushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499507/SHA: efa871aeaf22cbd0ce30e8bd1cb3d1afff2a98f9Autores: Jarboui, Mohamed Ali; Bidoia, Carlo; Woods, Elena; Roe, Barbara; Wynne, Kieran; Elia, Giuliano; Hall, William W.; Gautier, Virginie W.Fecha: 2012-11-15DOI: 10.1371/journal.pone.0048702Licencia: cc-byAbstract: La proteína Tat transactivante es una proteína reguladora viral esencial para la replicación del VIH-1. El nucleolo, un compartimento subnuclear altamente dinámico y estructurado sin membrana, es el sitio de ARNr y biogénesis ribosoma y está involucrado en numerosas funciones celulares incluyendo la regulación transcripcional, el control del ciclo celular y la infección viral. Importantemente, el tráfico nucleolar transitorio tanto de Tat como de las transcripciones virales del VIH-1 son críticos en la replicación del VIH-1, sin embargo, el(los) papel(es) del nucleolo en la replicación del VIH-1 sigue sin estar claro. Para entender mejor cómo la interacción de Tat con la maquinaria nucleolar contribuye a la patogénesis del VIH-1, investigamos los cambios cuantitativos en la composición del proteoma nucleolar de las células T de Jurkat que expresan establemente el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta TAP. Utilizando un enfoque proteómico organélaro basado en espectrometría de masas, junto con el etiquetado de isótopos estables en cultivo celular (SILAC), cuantificamos 520 proteínas, incluyendo 49 proteínas que muestran cambios significativos en la abundancia de nucleolos de células T de Jurkat sobre la expresión Tat. Numerosas proteínas que exhiben un cambio de pliegue fueron interactuadores Tat bien caracterizados y/o conocidos por ser críticos para la replicación del VIH-1. Esto sugiere que el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares por Tat proporcionan una capa adicional de control para regular la maquinaria celular involucrada en la patogénesis del VIH-1. El análisis del camino y la reconstrucción de la red revelaron que la expresión Tat resultó específicamente en el enriquecimiento nucleolar de proteínas que participan colectivamente en biogénesis ribosomal, homeostasis de proteínas, vías metabólicas incluyendo glucolítico, fosfato de pentosa, nucleótidos y aminoácidos vías biosintéticas, respuesta al estrés, vías de señalización de células T e integridad del genoma. Presentamos aquí el primer perfil diferencial del proteoma nucleolar de células T que expresan el HIV-1 Tat. Discutimos cómo estas proteínas participan colectivamente en redes interconectadas que convergen para adaptar las actividades dinámicas del nucleolus, que favorecen las actividades biosintéticas del huésped y pueden contribuir a crear un entorno celular que apoye la producción robusta del HIV-1. Texto: El nucleolus es un compartimento subnuclear altamente ordenado organizado alrededor de loci genéticos llamados regiones organizadoras nucleolares (NORs) formado por grupos de cientos de repeticiones de genes rDNA organizadas en repetición tándem cabeza a cola [1, 2]. Organelo sin membrana descrito originalmente como la ''Fábrica Ribosoma'', el nucleolus está dedicado a la transcripción de rDNA dirigida por ARN-polimerasa-I, procesamiento de rARN mediado por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (SORNPs) y conjunto ribosoma. La biogénesis del ribosoma es esencial para la síntesis de proteínas y la viabilidad celular [2] y, en última instancia, resulta en las subunidades ribosomales grandes (60S) y pequeñas (40S), que posteriormente se exportan al citoplasma. Este proceso celular fundamental, al que la célula dedica la mayor parte de sus recursos energéticos, está estrictamente regulado para adaptarse a los cambios dinámicos en la proliferación celular, la tasa de crecimiento y las actividades metabólicas [3]. El nucleolus es el sitio de procesamiento adicional de ARN, incluyendo la exportación y degradación de ARNm, la maduración de pequeños PNNR nucleares ricos en uridina (U snRNPs), que forman el núcleo del spliceosoma, biogénesis de ARNt y microARNs (miRNAs) [4]. El nucleolus también está involucrado en otros procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular, procesos oncogénicos, respuestas de estrés celular y traducción [4]. El concepto de nucleolo multifuncional y altamente dinámico ha sido corroborado por varios estudios que combinan enfoques proteómicos organelares y espectrometría cuantitativa de masas, y describen miles de proteínas que transitan por el nucleolo en respuesta a diversas condiciones metabólicas, estrés y ambientes celulares [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Colectivamente, los estudios mencionados representan hitos en la comprensión de la complejidad funcional del nucleolo, y demostraron que las proteínas nucleolares están en intercambio continuo con otros compartimentos nucleares y celulares en respuesta a determinadas condiciones celulares. Los estudios proteómicos que analizan los nucleoli de las células infectadas por el virus sincitial respiratorio humano (HRSV), el virus influenza A, el virus de la bronquitis infecciosa por coronavirus aviar (IBV) o el adenovirus destacaron cómo los virus pueden alterar de forma distintiva la distribución de proteínas nucleolares [2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Curiosamente, tanto las proteínas reguladoras del VIH-1 Tat como Rev localizan al nucleoplasma y al nucleolus. Ambas secuencias abarcan una señal de localización nucleolar (NoLS) que se superpone con su señal de localización nuclear (NLS), que rige su localización nucleolar [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. Además, Tat y Rev interactúan con el antígeno nucleolar B23 Sin embargo, un estudio reciente describió que en contraste con las células T de Jurkat y otras líneas celulares transformadas donde Tat está asociado con el núcleo y el nucleolo, en las células T primarias Tat se acumula principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Mientras que la regulación de su importación y/o exportación nuclear activa, como mediada por la familia de la carioferina/importación, se han descrito bien, los mecanismos que distribuyen Tat y Rev entre el citoplasma, el nucleoplasma y el nucleolo siguen siendo elusivos [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48]. Importantemente, dos estudios importantes de Machienzi y otros han revelado importantes vínculos funcionales entre la replicación del VIH-1 y el nucleo En primer lugar, podrían inhibir la replicación del VIH-1 y la función de transactivación Tat empleando un señuelo TAR dirigido específicamente al nucleolo. Además, utilizando un enfoque similar, con una ribozima anti-VIH-1 de cabeza martillo fusionada al ARN nucleolar pequeño U16 y por lo tanto dirigida al nucleolo, podrían suprimir dramáticamente la replicación del VIH-1. Colectivamente, estos hallazgos sugieren fuertemente que las transcripciones del VIH-1 y el tráfico nucleolar Tat son críticos para la replicación del VIH-1. Sin embargo, la naturaleza de estas contribuciones aún no se ha aclarado. En este informe, analizamos sistemáticamente las perturbaciones del proteoma nucleolar que ocurren en las células T de Jurkat expresando constitutivamente el VIH-1 Tat, utilizando un enfoque de espectrometría cuantitativa de masas. Después de la anotación detallada de los cambios cuantitativos de abundancia en la composición de la proteína nucleolar sobre la expresión Tat, nos centramos en los complejos celulares afectados por Tat y las vías de señalización asociadas con la biogénesis ribosoma, el spliceosoma, las chaperonas moleculares, la replicación y reparación del ADN y el metabolismo, y discutimos su posible implicación en la patogénesis del VIH-1. En este estudio, investigamos los cambios cuantitativos en el proteoma nucleolar de las células Jurkat T expresando constitutivamente el VIH-1 Tat (86aa) frente a su contraparte Tat negativo, utilizando el etiquetado estable de isótopos con aminoácidos en la tecnología de cultivo celular (SILAC), seguido por la espectrometría de masas en tándem ESI e implementamos el enfoque experimental descrito en la Figura 1A. En primer lugar, mediante la entrega de genes retrovirales, transferimos el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta de purificación de afinidad tándem (TAP) (constituido por dos proteínas G y un péptido de unión a estreptavidina) o TAP solo (vector de control) en el clon de células T de leucemia Jurkat E6-1 y clasificamos las células transducidas (GFP positivo) por FACS. Esto resultó en una población altamente enriquecida de células transducidas policlonales que presentaban diferentes niveles de expresión del transgén (Figura 1B). La funcionalidad del TAP-Tat fue confirmada mediante la transfección de las células TAP-Tat y TAP con un vector de genes reportero de luciferasa bajo el control del HIV-1 LTR (pGL3-LTR) [36]. Para abordar la funcionalidad de Tat fusionado a TAP, comparamos Jurkat TAP-Tat con Jurkat-tat, una línea celular que expresaba establemente Tat [51]. Ambas líneas celulares mostraron una actividad LTR del VIH-1 comparable después de la transfección con pGL3-LTR (Figura S1 ). A continuación, la expresión Tat y la localización subcelular fueron verificadas mediante fraccionamiento subcelular seguido por el análisis del WB (Figura 1E ). TAP-Tat mostró una localización nuclear/nucleolar prominente, pero también se pudo detectar en el citoplasma. Estas observaciones fueron además validadas mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 1E ). A continuación se comparó la tasa de crecimiento y proliferación de las líneas celulares de Jurkat TAP y TAP-Tat (Materiales y Métodos S1), que eran equivalentes (Figura S4A ). Del mismo modo, el análisis FACS confirmó que las poblaciones relativas en G1, S y G2/M eran similares para las células de Jurkat TAP-Tat y TAP (Figura S4B ). Se etiquetaron las células de Jurkat TAP-Tat y Jurkat TAP con isótopo ligero (R0K0) y pesado (R6K6) que contenían arginina y lisina, respectivamente. Después de cinco pasajes en su respectivo medio SILAC, se recolectaron 85 millones de células de cada cultivo, se agruparon y se aislaron sus nucleolis como se describió previamente (Figura 1A ) [52] Para evaluar la calidad de nuestro procedimiento de fraccionamiento, se investigó el enriquecimiento específico de antígenos nucleolares conocidos mediante el análisis Western Blot (Figura 1D). Se encontró que la nucleolina (110 kDa) y la fibrilarina (FBL) (34 kDa), dos proteínas nucleolares principales conocidas por localizar al componente granular del nucleolo, estaban muy enriquecidas en la fracción nucleolar mixta. Se observó que la nucleolina se distribuía igualmente entre las fracciones nuclear y citoplasmática. Este patrón de distribución de nucleolina parece ser específico para las células T de Jurkat, como se muestra anteriormente [52, 53]. La proteína nuclear PARP-1 (Poly ADPribose polimerasa 1) (113 kDa) estaba presente en la fracción nuclear y nucleoplasmática, pero se desplegó en la fracción La alfa-tubulina (50 kDa) fue altamente abundante en la fracción citoplasmática y débilmente detectada en las fracciones nucleares. Colectivamente, estos resultados confirmaron que nuestros métodos produjeron una fracción nucleolar altamente enriquecida sin contaminación cruzada significativa. Posteriormente, la mezcla de proteína nucleolar fue tripsindigerida y los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas. El análisis proteomico cuantitativo comparativo se realizó utilizando MaxQuant para analizar las proporciones en isótopos para cada péptido identificado. Se cuantificó un total de 2427 péptidos, representando 520 proteínas nucleolares cuantificadas. La lista completa anotada de proteínas nucleolares cuantificadas está disponible en la Tabla S1 y los datos brutos del análisis de espectrometría de masas se depositaron en la base de datos de repositorios Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/), a la que se puede acceder utilizando las claves de hash descritas en materiales y métodos. Anotamos las proteínas cuantificadas utilizando las herramientas ToppGene Suite [54] y extrajimos las anotaciones de Gene Onthology (GO) e InterPro [55]. El análisis de los procesos biológicos GO (Figura 1F ) reveló que los procesos biológicos mejor representados incluían la transcripción (24%), el procesamiento de ARN (23%), el proceso del ciclo celular (13%) y la organización cromosómica (15%), que refleja las funciones asociadas nucleolares y es comparable a nuestra caracterización anterior del proteoma nucleo El análisis de distribución subcelular (Figura 1F ) reveló que nuestro conjunto de datos contenía proteínas conocidas por localizarse en el nucleolo (49%), en el núcleo (24%) mientras que el 15% de las proteínas estaban descritas previamente para residir exclusivamente en el citoplasma. La distribución subcelular fue similar a nuestro análisis anterior del proteoma nucleolar de células T de Jurkat [52]. Tabla S1. La distribución de las relaciones proteicas se representan en la Figura 1G como log 2 (cambio de abundancia). Las relaciones SILAC indican cambios en la abundancia proteica en la fracción nucleolar de las células TAP de Jurkat en comparación con las células TAP de Jurkat. La distribución de las proteínas cuantificadas siguió una distribución gaussiana (Figura 1G ). Un total de 49 proteínas nucleolares exhibieron un cambio significativo de 1,5 veces o mayor Las células no mostraron cambios en el contenido en estado estacionario de algunos de los principales y abundantes componentes del nucleolo, incluyendo nucleofosfmina (NPM1/ B23), C23, FBL, proteína nucleolar P120 (NOL1) y proteína nucleolar 5A (NOL5A). Las distintas proporciones de cambios proteicos sobre la expresión Tat podrían reflejar la reorganización nucleolar específica y las actividades alteradas del nucleolo. Realizamos el análisis del WB para validar los resultados basados en SILAC obtenidos por nuestro enfoque proteómico cuantitativo (Figura 2 ). 15 proteínas seleccionadas mostraron intensidad diferencial en las fracciones nucleolares sobre la expresión Tat, incluyendo 9 enriquecidos (HSP90b, STAT3, pRb, CK2a, CK2a', HSP90a, Transportin, ZAP70, DDX3), y 3 agotados (ILF3, BOP1 y SSRP1) proteínas. Además, también probamos por el análisis WB, abundancia de proteínas no afectada por la expresión Tat (Importin beta, FBL, B23, C23). Estos resultados destacan la concordancia en la tendencia de las proporciones correspondientes de SILAC, a pesar de algunas diferencias en los rangos cuantitativos. Cabe destacar que, usando WB, pudimos observar un cambio de intensidad para la proteína con un cambio de pliegue SILAC tan bajo como 1,25 veces. Por un lado, el umbral de los cambios en la abundancia de proteínas se puede determinar estadísticamente y luego destacar los cambios en la abundancia más grandes como se ilustra en la Tabla 1. Alternativamente, el enriquecimiento o agotamiento coordinado de la mayoría de las proteínas pertenecientes a un complejo o vía celular distinto permitiría la definición de un grupo de proteínas de interés y potencial significación. Por lo tanto, nos centramos en proteínas individuales enriquecidas o agotadas con actividades asociadas con la patogénesis molecular del VIH-1 o Tat, y en modificaciones agrupadas que afectan vías de señalización celular enteras y complejos macromoleculares. Inicialmente nos centramos en las proteínas de señalización que interactúan con Tat y/o la patogénesis molecular asociada del VIH-1 y cuya abundancia en el nucleolo fue modulada por la expresión Tat. Fosfo-proteína fosfatasas. Fosfo-proteína fosfatasa PP1 y PP2A son esenciales Es importante destacar que el PP1 representa el 80% de la actividad de la fosfatasa Ser/Thr dentro del nucleolo. En nuestro estudio, el PP1 fue potencialmente enriquecido por 1,52 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat, lo que apoya estudios previos que describen el objetivo nuclear y nucleolar de PP1a por el HIV-1 Tat y cómo PP1 aumenta la regulación de la transcripción del VIH-1 [58, 59, 60, 61, 62]. El PP1 c también fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro [63]. Curiosamente, la asociación Tat con los promotores de la subunidad PP2A resulta en la sobreexpresión y regulación de la actividad PP2A en linfocitos [64, 65]. Además, PP2A contribuye a la regulación de la transcripción y replicación del VIH-1 [61, 66]. Retinoblastoma Protein. El gen supresor tumoral pRb protein mostró un cambio de 1,4 veces en el nucleolus sobre la expresión Tat [67]. Además, el análisis WB confirmó la translocación distinta del pRb del nucleoplasma al nucleolus por Tat (Figura 2 ). Dependiendo del tipo de célula, pRb puede ser hiperfosforilado o hipofosforilado sobre la expresión Tat y puede regular negativamente o positivamente la transcripción mediada por Tat respectivamente [68, 69, 70]. Curiosamente, la hiperfosforilación de los desencadenantes del pRB en su translocación en el nucleolo [71]. La fosforilación del pRB también se asocia con un aumento de la biogénesis ribosómica y el crecimiento celular [72]. STAT3. El transductor de señal de factor de transcripción y activador de la transcripción 3 (STAT3) se enriqueció significativamente (1,86 veces) en la fracción nucleolar por la expresión constitutiva Tat. Además, el análisis WB indicó que la expresión Tat podría promover la relocalización del STAT3 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento distinto en el nucleolo (Figura 2). Curiosamente, estudios anteriores han demostrado la activación mediada por Tat de la señalización STAT3, como lo demuestra su estado de fosforilación [73]. Curiosamente, la fosforilación STAT3 indujo la dimerización de la proteína después de su translocación al núcleo [74]. YBX1. YBX1, la proteína multifuncional de unión al ADN/ARN fue enriquecida por 1,38 veces en el nucleolo de las células de Jurkat sobre la expresión Tat. Curiosamente, YBX1 interactúa con Tat y TAR y modula la expresión génica del VIH-1 [63, 75]. ZAP70. La proteína tirosina cinasa ZAP70 (proteína quinasa asociada a la cadena Zeta 70) fue enriquecida por 1,24 veces en el nucleolo de las células de Jurkat expresando Tat [76]. Además, el análisis del WB reveló que la expresión Tat podría promover la relocalización del ZAP70 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento La proteína de matriz nuclear interna, Matrin 3 (MATR3), presentó un cambio de 1,39 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat. Se localiza en el nucleolasmo con un patrón difuso excluido de los nucleolos [77]. La matrin 3 ha sido identificada como parte del nucleoloma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Dos estudios recientes han descrito a la matrin 3 como parte de complejos de ribonucleoproteínas, incluyendo también el VIH-1 Rev y (elemento de respuesta Rev) RRE que contiene ARN VIH-1, y promoviendo la regulación post-transcripción del VIH-1 [78, 79, 80]. CASP10. La molécula pro-apotótica de señalización, Caspasa 10 (CASP10), se agotó significativamente de las células nucleolus de Jurkat-Tat (0,82 veces) [81]. Importantemente, la expresión Tat desregula la expresión y actividad de CASP10 en las células Jurkat [82]. ADAR1. Adenosina deaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR1), que convierte las adenosinas en inosinas en ARN de doble cadena, se agotó significativamente del nucleolus de las células Jurkat-Tat (0,78 veces). Curiosamente, ADAR1 sobreexpresión regula la replicación del VIH-1 a través de un mecanismo de edición del ARN [83, 84, 85, 86, 87, 88]. Además, ADAR1 pertenece al interactoroma nuclear in vitro Para subrayar las relaciones estructurales y funcionales de las proteínas nucleolares afectadas por el VIH-1 Tat, construimos una representación en red de nuestro conjunto de datos. Utilizamos la versión 2.6.3 de Cytoscape [89] y utilizando el plugin MiMI [90] para mapear interacciones previamente caracterizadas, extraídas de bases de datos de interacción de proteínas (BIND, DIP, HPRD, CCSB, Reactome, IntAct y MINT), lo que resultó en una red altamente densa y conectada que incluía 416 proteínas (nodos) de las 536 proteínas, unidas por 5060 interacciones no dirigidas (borde) (Figura 3A). El análisis de centralidad reveló un umbral de 23.7 interacciones por proteína. El análisis de topología utilizando el plugin CentiScaPe [91] mostró que la distribución del grado de nodo sigue una ley de energía (Figura S5 Es importante destacar que cuando analizamos la distribución del coeficiente de agrupamiento (Figura S6 ) encontramos que la red está organizada en una arquitectura jerárquica [92], donde los nodos conectados forman parte de áreas altamente agrupadas mantenidas por pocos hubs organizados alrededor del HIV-1 Tat. Además, el análisis de la conexión en grados nodos de nuestra red identificó al HIV-1 Tat como la proteína más conectada (Figura S6 ). Específicamente, el análisis de topología indicó que los valores para las centrales Tat eran los más altos (grado de nodo, estrés, radialidad, cercanía, entreess y centroides), caracterizando a Tat como la proteína principal del hub de la red nucleolar. De hecho, un total de 146 proteínas han sido descritas previamente para interactuar con Tat (Figura 3B, Tabla S2 ). Estas proteínas están involucradas En paralelo, caracterizamos la magnitud de los cambios de abundancia proteica relacionados observados en distintas vías celulares (Figura 4). Biogénesis ribosomal. Inicialmente nos centramos en la biogénesis ribosoma, función primaria del nucleolo. Pudimos observar un aumento general y coordinado en la abundancia de proteínas ribosomales en el nucleolo por expresión Tat (Figura 4 ). Mientras algunas proteínas ribosomales permanecían inalteradas, Tat causó la acumulación nucleolar de varias proteínas ribosomas grandes y pequeñas distintas, excepto RPL35A, para las cuales la expresión Tat causó una marcada disminución en el nivel nucleolar (0,29 veces). Asimismo, varias proteínas involucradas en el procesamiento de ARNr exhibieron un aumento general en la acumulación nucleolar sobre la expresión Tat. Estos incluyen a los miembros canónicos humanos de la familia L7ae junto con los miembros que participan en la Caja C/D, H/ACA y U3 snoRNPs (Figura 4). Por el contrario, BOP1, un componente del complejo PeBoW (Pescadillo Bop1 WDR12) esencial para la maduración de la subunidad ribosómica grande, se agotó significativamente del nucleolo de las células TAP-Tat Jurkat (0,81 veces) y esto fue confirmado por el análisis WB (Figura 2 ) [93]. Sin embargo, los otros componentes complejos PeBoW, Pes1 (0,94 veces) y WDR12 (1,1 veces), no fueron afectados por la expresión Tat. Se identificaron y cuantificaron en nuestro conjunto de datos 55 proteínas de las 108 proteínas spliceosomal conocidas [94]. Estas proteínas incluyen las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares U1, U2 y U5, Sm D1, D2, D3, F y B, y las heterogéneas ribonucleoproteínas nucleares. Nuestros datos sugieren un aumento distinto en la abundancia de proteínas específicas complejas del spliceosoma tras la expresión de HIV-1 Tat en células T de Jurkat (Figuras 3 y 4). Las únicas tres proteínas que se agotaron significativamente del nucleolo tras la expresión del HIV-1 Tat fueron RBMX (0,89 veces), HNRNPA2B1 (0,84 veces) y SNRPA (0,81 veces). Varias investigaciones mostraron alteración de la expresión en los factores de empalme celular en células infectadas por HIV-1 [95, 96] Hemos identificado varias chaperonas moleculares, cochaperonas y otros factores involucrados en la proteostasis para ser altamente enriquecidos en el nucleolo de las células T sobre la expresión Tat (Figuras 3 y 4), muchos de los cuales fueron previamente caracterizados como parte del interactoroma nuclear Tat [63]. Varias proteínas de choque térmico incluyendo DNAJs, específicas HSP90, HSP70 y HSP40 isoformas y sus cofactores se enriquecieron distintivamente en la fracción nucleolar de las células Jurkat expresando Tat (Figura 4 ). Como lo muestra WB, mientras que HSP90a y b son principalmente citoplasmáticas, la expresión Tat desencadena su relocalización al núcleo y nucleolus, corroborando nuestro enfoque cuantitativo proteómico (Figura 2). Del mismo modo, el choque térmico puede hacer que el HSP90 y el HSP70 se reubiquen en el nucleolo [97, 98, 99, 100, 101]. En un estudio reciente, el grupo de Fassati ha demostrado que el HSP90 está presente en el promotor del VIH-1 y puede regular directamente la expresión génica viral [102]. También observamos el aumento coordinado de la abundancia de la clase I (GroEL y GroES) y la clase II (chaperonina que contiene TCP-1 (CTT)) moléculas de chaperonina (Figuras 3 y 4) sobre la expresión Tat. Vía proteasómica de la ubiquitina. La vía proteasómica es el principal sistema proteolítico de células eucariotas [103]. Es importante destacar que la vía ubiquitina-proteasoma nuclear controla el suministro de proteínas ribosomales y es importante para la biogénesis ribosoma [104, 105]. El proteasoma 26S está compuesto por la partícula núcleo 20S (CP) y la partícula reguladora 19S (RP). Alternativamente, CP puede asociarse con el 11S RP para formar el inmunoproteasoma. Todas las proteínas cuantificadas en nuestro estudio son parte del complejo regulador 19S e incluyen PSMD2 (1,5 veces), PSMD3 (1,32 veces), PSMD11 (1,25 veces) y PSMD13 (0,72 veces), el único componente proteasoma significativamente agotado del nucleolo en presencia de Tat (Figura 4). Curiosamente, Tat interactúa con subunidades distintas del sistema proteasoma, incluyendo las subunidades 19S, 20S y 11S. Las consecuencias de estas interacciones incluyen la competencia de Tat con 11S RP o 19S RP para la unión al 20S CP, que resultó en la inhibición de la actividad de la peptidasa 20S [106, 107, 108, 109, 110, 111]. Además, Tat demostró modificar la composición proteosoma y la actividad, que afecta a la generación de antígenos péptidos reconocidos por linfocitos T citotóxicos [112]. Importantemente, un estudio reciente demostró que en ausencia de Tat, los componentes proteosomas están asociados al promotor del VIH-1 y la actividad proteosoma limita la transcripción [113]. La adición de Tat promovió la disociación de la subunidad 19S del proteasoma 20S, seguido por el enriquecimiento distintivo del complejo similar a 19S en extractos nucleares junto con el reclutamiento mediado por Tat de las subunidades 19S para el promotor del VIH-1, lo que facilitó su elongación transcripcional [113]. También cuantificamos UBA1 (1,36 veces), la ubiquitina-proteína ligasa UHRF1 (1,13 veces), UBC (1 veces) y dos Ubiquitinspecific-peptidases, USP30 (1,28 veces) y USP20 (0,06 veces) (Figura 4). Replicación y reparación del ADN. Tras la expresión del HIV-1 Tat, observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de varios factores celulares asociados con la replicación del ADN y las vías de reparación (Figura 4). Tat indujo el enriquecimiento coordinado del complejo MCM2-7 de mantenimiento cromosómico en miniatura (de 1.23-a 3,30 veces, respectivamente) [114]. MCM7, 6 y 3 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. El mantenimiento estructural de los cromosomas 2, SMC2, fue enriquecido (1,35 veces) en la fracción nucleolar por expresión Tat. SMC2 fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Mientras que el factor de replicación C1 (RFC1) y RFC2 (1,31 y 1,28 veces respectivamente) mostró un cambio de pliegue incrementado y RFC5/3 no se vieron afectados, RFC4 se redujo gravemente (0,69 veces) de la fracción nucleolar sobre la expresión Tat [115]. El RFC1 y RFC2 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Tat indujo el enriquecimiento de XRCC6 (1,27 veces) y XRCC5 (1,36 veces) en el nucleolo, que están involucrados en la reparación de la unión final del ADN no-homologoso (NHEJ) [116]. XRCC6 se asocia con complejos de preintegración viral que contienen HIV-1 Integrase y también interactúan con Tat y TAR [117, 118, 119]. Además, en una pantalla basada en ribozyme, el derribo del XRCC5 (Ku80) disminuyó tanto la integración retroviral como la transcripción Tatmediated [120]. Como parte de la reparación de la escisión base (BER), hemos identificado una importante endonucleasa apurínico/apirimidinica 1 (APEX1) (1,29 veces). Importantemente, en una pantalla de siRNA dirigida a los factores de reparación del ADN, se encontró que la reducción de APEX1 inhibe la infección por VIH-1 por más de 60% [121]. La proteína del grupo de alta movilidad (HMG) HMGA1 (1,30 veces), fue enriquecida en el nucleolo después de la expresión Tat [122]. HMGA1 interactúa con la integración del VIH-1 y forma parte del complejo de preintegración del VIH-1 [123, 124]. Importantemente, HMGA1 ha sido identificada en una pantalla proteómica, como un cofactor celular que interactúa con el VIH-1 59líder [125]. Metabolismo. Nuestros datos proteómicos sugieren que Tat induce perturbaciones en la glucólisis, la vía del fosfato pentosa y la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos (Figura 4 y Figura S7 ). En particular, en las células T que expresan Tat, detectamos cambios coordinados en la abundancia de proteínas no conocidas previamente que se asocian con la patogénesis del Tat, que revelaron conexiones inesperadas con la glicólisis y la vía del fosfato pentosa, incluyendo las siguientes enzimas glicólicas, lactato deshidrogenasa B (LDHB) (1,37 veces), la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1,17 veces) y la mutasa del ácido fosfoglicérico (PGAM1) (0,89 veces) (Figura 4 y Figura S En resumen, el GPI cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Posteriormente, el PFKP cataliza la conversión irreversible de fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato y es una enzima reguladora clave de la glucólisis. Al final de la vía glicolítica, PKM2, en su forma tetramérica, se sabe que genera ATP y piruvato, mientras que el LDHB desvía la mayoría del piruvato a la producción y regeneración de lactato de NAD+ en apoyo a la glicólisis continua, un fenómeno descrito para las células T proliferativas [126]. Esto regula la disponibilidad de los intermedios de glucosa, que se redirigen a las vías de la pentosa fosfato y de la serina biosíntesis para la producción de precursores biosintéticos de nucleótidos, fosfolípidos y aminoácidos. Como parte de la vía del fosfato de pentosa, hemos caracterizado el enriquecimiento significativo de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) (2,11 veces), que ramas de la vía de la glicólisis para generar NADPH, ribosa-5fosfato un precursor importante para la síntesis de nucleótidos. Consistente con esto, detectamos el aumento coordinado en la abundancia de enzimas que juega un papel central en la síntesis de purinas y pirimidinas. Más específicamente, IMPDH2 (1,66 veces), una enzima limitante de la tasa en el punto de rama de la biosíntesis de nucleótidos de purina, que conduce a la generación de nucleótidos de guanina, fosforibosil pirofosfato sintetasa 2 (PRPS2) (1,41 veces), cytidine-5-prime-trifosfato sintetasa (CTPS) (1,74 veces) que cataliza la conversión de UTP a CTP y la subunidad grande de ribonucleótido reductasa (RRM1) (1,56 veces). En parralel, observamos el aumento de la abundancia de la fosfoserina aminotransferasa PSAT1 (1,90 veces), una enzima implicada en la biosíntesis de serina, que se ha relacionado con la proliferación celular in vitro. La interfaz host-virus es un aspecto fundamental en la definición de la patogénesis molecular del VIH-1 [127, 128, 129, 130, 131, 132, 133]. De hecho, con su repertorio limitado de proteínas virales, el VIH-1 se basa ampliamente en la maquinaria de las células huésped para su replicación. Varios estudios recientes han capitalizado los recientes avances en las tecnologías ''OMICS'', y han revelado importantes perspectivas en este diálogo molecular finamente afinado [132, 134]. El VIH-1 Tat es esencial para la replicación viral y orquesta la expresión génica del VIH-1. La proteína reguladora viral es conocida por interactuar con una amplia gama de proteínas celulares y modular la expresión del gen celular y la vía de señalización [135, 136]. Nosotros y otros hemos utilizado enfoques a nivel del sistema para investigar la interacción Tat con la maquinaria de las células de acogida, que han caracterizado al HIV-1 Tat como un mediador crítico de la interfaz host-viral [137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149]. Aquí, hemos investigado el tráfico de proteínas nucleolares en respuesta a la expresión HIV-1 Tat en células T, con el fin de proporcionar ideas únicas y novedosas sobre el papel de la compartimentación de proteínas por Tat en el ajuste fino de la disponibilidad de proteínas y la función. Hemos desarrollado para este estudio, un modelo celular utilizando Jurkat T-cells expresando firmemente Tat fusionado en su N-ternminal a TAP-tag. Jurkat T-cells son robustos y presentan la ventaja de crecer sin estímulos y se transducen fácilmente utilizando Es importante destacar que se han empleado ampliamente para evaluar la patogénesis mediada por Tat utilizando enfoques de todo el sistema y para analizar las vías y funciones de señalización celular clave de las células T [144, 150, 151, 152]. De hecho, hemos encontrado que son especialmente adecuadas para cultivos in vitro prolongados en el medio SILAC y posterior aislamiento de su nucleolo, seguido por el análisis de MS, que requiere hasta 85 millones de células. Fusionamos Tat a la etiqueta TAP para permitir futuras aplicaciones posteriores como purificación de afinidad de Tandem o análisis IP de Cromatina. Importantemente, hemos confirmado que la etiqueta TAP N-terminal no interfirió con la función Tat ni su localización en las células Jurkat, cuando se compara con la no etiquetada-Tat. Aunque se sabe que Tat se acumula en el núcleo y el nucleolo en las células de Jurkat y otras líneas celulares transformadas, en las células T primarias, Tat se describe para acumularse principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Estas diferencias permanecen por caracterizarse, pero podrían estar relacionadas con diferentes niveles de expresión de los factores de transporte en las líneas celulares transformadas versus las células primarias, como se describe recientemente por Kuusisto et al. [39]. Además, Stauber y Pavlakis han sugerido que la localización nucleolar Tat podría ser el resultado de la sobreexpresión Tat [31]. Aquí, hemos seleccionado y empleado una población policlonal de células T Jurkat que expresan Tat en diferentes niveles. Proponemos que esta heterogeneidad en los niveles de expresión Tat podría reflejar la expresión estocástica Ta Utilizando una estrategia proteómica cuantitativa basada en un enfoque organélaro, cuantificamos más de 520 proteínas nucleolares, incluyendo 49 proteínas que muestran un cambio significativo en el pliegue. La medida en que las variaciones inducidas en la abundancia de proteínas nucleolares son biológicamente relevantes y pueden afectar los procesos celulares y/o virales queda por determinar. Sin embargo, la naturaleza biológica de las vías y los complejos macromoleculares afectados nos permiten discutir sus posibles asociaciones con la patogénesis del VIH-1. El VIH-1 Tat se expresa tempranamente después de la integración del genoma del VIH-1 y media el cambio a la fase de producción viral, asociado con la expresión génica proviral robusta, el ensamblaje de proteínas virales y, en última instancia, el surgimiento y liberación de viriones. En este contexto y basado en nuestros resultados, proponemos que Tat podría participar en la configuración del entorno intracelular y el perfil metabólico de De hecho, observamos el enriquecimiento nucleolar distinto de proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica, lo que podría ser indicativo de un aumento en la síntesis proteica. Con la notable exepción de RPL35A depleción nucleolar, proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica estaban en las 20 proteínas nucleolares más enriquecidas (NHP2L1, RLP14, RPL17, RPL27, RPS2, RPL13). Además, este efecto parece ser específico del HIV-1 Tat ya que la inhibición de transcripción por Actinomicina D resultó en el agotamiento total de proteínas ribosómicas en el nucleolo [9]. Además, el análisis proteómico cuantitativo de las células nucleas en adenovirus infectados mostró una leve disminución en proteínas ribosómicas [24] Si esto refleja un cambio en la biogénesis del ribosoma y/o un cambio en la composición de las subunidades ribosomales queda por determinar. Sin embargo, la necesidad adaptada de una producción elevada del ribosoma es intuitiva para un sistema que necesita apoyar la creciente demanda de nueva síntesis de proteínas virales. En parralel, observamos la modulación concordante de las vías que regulan la homeostasis proteica. Observamos la significativa acumulación nucleolar de múltiples chaperonas moleculares incluyendo las HSPs, el complejo TCP-1, y moléculas CANX/CALR y la abundancia nucleolar interrumpida de proteínas pertenecientes a la vía ubiquitina-proteasoma, que controla el suministro de proteínas ribosomales [104, 105]. Estas observaciones apoyan estudios previos que describen la modulación de la actividad proteasómica por Tat, que afectan a la expresión, el montaje y la localización de subunidades específicas de los complejos proteasómicos [106, 107, 108, 109, 110, 111, 113]. También observamos el agotamiento concomitante de CASP10 en el nucleolo de Jurkat TAP-Tat. Se ha sugerido que CASP10 podría estar dirigido al nucleolo para inhibir la síntesis proteica [154]. Curiosamente, la presencia y los papeles potenciales de las chaperonas moleculares en el nucleolo han sido destacados por Banski et al, quienes explican cómo la red chaperona podría regular la biogénesis ribosoma, la señalización celular y la respuesta al estrés [97, 155]. A medida que la producción viral avanza hacia la fase tardía y aumenta el estrés celular, el enriquecimiento nucleolar de las chaperonas moleculares por Tat no sólo podría permitir el plegado de adequat de proteínas virales recién sintetizadas, sino que también podría promover la tolerancia de las células infectadas al estrés y mantener la viabilidad celular. Coincidentemente, observamos el marcado enriquecimiento nucleolar de enzimas pertenecientes a vías metabólicas incluyendo glicólisis, fosfato de pentosa, nucleótido y aminoácidos vías biosintéticas. Del mismo modo, estas vías se elevan en células T proliferativas o en células cancerosas después de un cambio metabólico a la glicólisis aeróbica, también conocido como el efecto Warburg [156, 157, 158, 159]. Allí, los intermedios de glucosa de la vía de la glicólisis no sólo se comprometen a la producción de energía y se descomponen en piruvato para el ciclo TCA, sino que se redirigen a vías alternativas, incluyendo la vía del fosfato de pentosa, y se utilizan como precursores metabólicos para producir nucleótidos, aminoácidos, acetil CoA y NADPH para la homeostasis redox. De manera consistente, también se observó el enriquecimiento nucleolar concomitante de enzimas pertenecientes a la vía de síntesis de nucleótidos, incluyendo IMPH2, una enzima limitante conocida para controlar el pool de GTP. De igual manera, se observó el enriquecimiento nucleolar de PSAT1, una enzima involucrada en el metabolismo de serina y treonina, que está asociada con la proliferación celular [160]. Colectivamente, proponemos que mediante el control de la homeostas Sin embargo, las enzimas glucolíticas han sido detectadas en las fracciones nuclear y nucleolar mediante análisis proteómicos [8, 161]. Además, las enzimas glucolíticas, como PKM2, LDH, fosfoglicerato cinasa, GAPDH y aldosa, también han sido reportadas para mostrar localización nuclear y unirse al ADN [162]. Más específicamente, PKM2 es conocido por asociarse con el promotor y participar en la regulación de la expresión génica como coactivador transcripcional [163]. HIV-1 Tat ha sido descrito previamente como un inmunoregulador y más específicamente, ha sido reportado tanto para inhibir o promover la señalización TCR [164]. Hemos observado el enriquecimiento nucleolar por Tat de componentes proximales o aguas abajo clave de las vías de señalización de células T, incluyendo ZAP70, ILF3 y STAT3, que juegan un papel crucial en el desarrollo y activación de células T. Anteriormente los habíamos identificado como componentes específicos de células T del nucleolo, y los estudios de IF sugirieron que su asociación con el nucleolo podría ser regulada por condiciones específicas [165]. Nuestros resultados apoyan aún más que Tat podría contribuir a la disregulación de las señales derivadas de TCR y que el nucleolo podría representar un importante enlace espacial para las moléculas de señalización TCR. Observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de componentes clave de las vías de replicación, recombinación y reparación del ADN por Tat. Estos incluyen XRCC5 y XRCC6, HMGA1, APEX1, MCM2-7, SMC2, RFC1 y RFC2, mientras que RFC4 se encontró significativamente agotado. Curiosamente, estos cofactores se han asociado con la eficiencia de la integración del ADN retroviral en el ADN del huésped o la integridad del provirus integrado [166]. Si la mayor abundancia de estos factores dentro del nucleolo podría estar asociada con su participación potencial en la integración y mantenimiento de la integridad del gen provirus, queda por determinar. Los mecanismos de segregación mediada por Tat y compartimentación de proteínas dentro o fuera del nucleolo pueden depender de factores inherentes para cada proteína y la naturaleza de su relación con Tat, ya que el fraccionamiento subcelular combinado con el análisis del WB mostró que el patrón y el grado de redistribución subcelular entre proteínas variaban. Pudimos observar casos en los que Tat regulaba la expresión de proteínas que resultaban en un aumento general de estas proteínas en los compartimentos celulares incluyendo el nucleolo (DDX3, TNPO1). Alternativamente, Tat podía desencadenar la translocación nucleolar de proteínas directamente desde el citoplasma o el nucleoplasma (pRb). Además, observamos proteínas citoplasmáticas redistribuidas tanto al nucleoplasma como al nucleolo sobre la expresión Tat (STAT3, ZAP70 y HSP90). Finalmente, también notamos el agotamiento proteico en la fracción nucleolar acompañado de un aumento en el nucleoplasma (SSRP1). Sigue siendo difícil en esta etapa, apreciar si la acumulación de proteínas específicas resultaría en su activación o inhibición al secuestrarlas de su lugar de acción. Por el contrario, el agotamiento de una proteína del nucleolus podría resultar en la regulación descendente de su actividad en este lugar o podría ser el resultado de su movilización desde su sitio de almacenamiento, el nucleolus, al nucleoplasma o citoplasma donde puede realizar su función. Cabe destacar que identificamos a varios socios conocidos del VIH-1 Tat involucrados en la patogénesis del VIH-1, lo que sugiere que Tat podría modular físicamente su objetivo nucleolar o su reclutamiento a un sitio específico en el nucleoplasma o citoplasma. Tat también podría promover modificaciones post-traducción, lo que podría mediar la focalización de proteínas específicas al nucleolus. Esto se ilustra por las siguientes proteínas enriquecidas, pRb, PP1 y STAT3, para lo que la fosforilación es inducida por Tat. Importantemente, su estado de fosforilación determina su distribución subcelular, proporcionando así un mecanismo Además, nuestros datos indican que las serinas/treoninas quinasas (CK2 a') y fosfatasas (PP1) se enriquecieron significativamente en las fracciones nucleolares de Jurkat TAP-Tat. Estas enzimas representan la mayor parte de la actividad de fosforilación/desfosforilación en el nucleolo y pueden actuar como reguladores del tráfico de proteínas nucleolares. Además, Tat disminuyó significativamente los niveles de SUMO-2 en el nucleolo. Del mismo modo, se sabe que las modificaciones posteriores a la traducción mediadas por SUMO modulan la localización de proteínas nucleolares [104]. Dada la importancia potencial de las modificaciones posteriores a la traducción, incluida la fosforilación en el cambio mediado por Tat de la abundancia de proteínas nucleolares, un enfoque proteomico más específico como el enriquecimiento de fosfopétidos El control de la rotación de proteínas también es un medio importante para modular la abundancia de proteínas nucleolares. Las proteínas ribosómicas son degradadas por la vía Ubiquitina-Proteasoma para asegurar que su abundancia coincida con los niveles de transcripción de rRNA. A la inversa, las proteínas de choque térmico HSP90s las protegen de la degradación. Curiosamente, nuestros datos muestran que la modulación Tat de las proteínas de abundancia asociadas con la vía Ubiquitina-proteasoma y choque térmico. Esto podría contribuir al enriquecimiento observado de proteínas ribosómicas por Tat. Sin embargo, no podemos excluir que la mayor abundancia de proteínas ribosómicas en el nucleolo podría ser el resultado de la prevención mediada por Tat de su exportación al citoplasma. Curiosamente, utilizando un sistema celular diferente, una cepa transgénica de Drosophila melanogaster Tat, Ponti et al, analizaron los efectos de Tat en la biogénesis ribosoma, después de 3 días de tratamiento de choque térmico para inducir la expresión Tat bajo el control del promotor hsp70 [167]. Después de la expresión Tat, observaron un defecto en el procesamiento pre-rRNA asociado con una disminución en el nivel de 80S ribosomas [167]. Sin embargo, los diferentes sistemas celulares empleados combinados con la inducción de choque térmico de 3 días hacen que sus resultados sean difíciles de comparar con los nuestros. Mientras que estudios anteriores a nivel de sistema han monitoreado los efectos de la expresión Tat del VIH-1 en las células T, a nuestro conocimiento, hemos presentado aquí el primer análisis proteómico de la composición dinámica del nucleolus en respuesta a la expresión Tat del VIH Utilizando proteómica cuantitativa, hemos subrayado los cambios en la abundancia de proteínas nucleolares específicas y hemos destacado la reorganización nucleolar extensa y coordinada en respuesta a la expresión constitutiva Tat. Nuestros hallazgos subrayan que Tat que expresa células T exhiben un perfil proteómico nucleolar único, que puede reflejar una estrategia viral para facilitar la progresión a la producción viral robusta. Importantemente, hemos notado la relación funcional de proteínas nucleolares de nuestro conjunto de datos con la patogénesis VIH-1 y el Tat VIH-1 en particular. Esto aumenta aún más nuestra confianza en nuestra estrategia experimental y sugiere un papel para Tat en el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares. Finalmente, nuestro estudio proporciona nuevas ideas sobre la importancia de Tat en la conversación cruzada entre funciones nucleolares y patogénesis viral. También hemos identificado cambios en la abundancia de proteínas nucleolares que no estaban previamente asociados con la patogénesis del VIH-1, incluyendo proteínas asociadas a vías metabólicas, que proporcionan nuevos objetivos potenciales y vías celulares para la intervención terapéutica.Células T Jurkat, clon E6.1 (ATCC), Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP se mantuvieron en el medio RPMI-1640 complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (Gibco, aprobado por la UE), y antibióticos. Células Phoenix-GP (G.P. Nolan; www.stanford.edu/ group/nolan/), se mantuvieron en el medio DMEM complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (GIBCO, aprobado por la UE). La secuencia de HIV-1 Tat (VIH-1 HXB2, 86 aminoácidos) fue subclonada en el vector pENTR 2B (Invitrogen, A10463). Usando la tecnología Gateway (Invitrogen), introdujimos la secuencia HIV-1 Tat en el plásmido pCeMM-NTAP(GS)-Gw [168]. Las células Fénix (G.P. Nolan; www.stanford.edu/group/nolan/), fueron transfectadas usando Fugene 6 (Roche) con 5 mg del plásmido NTAP-Tat o NTAP y 3 mg del pMDG-VSVG. Los sobrenadantes virales fueron recolectados después de 48 h, filtrados y utilizados para transducir las líneas celulares de Jurkat. La construcción se denomina NTAP-Ta Utilizando la entrega de genes retrovirales, transferimos de forma estable células Jurkat (clone E6.1 (ATCC)). Los clones positivos llamados Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron ordenados para enriquecer la población de células que expresaban GFP usando el clasificador de células BC MoFlo XDP (Beckman Coulter). Las fracciones subcelulares (10 mg) fueron resueltas por SDS-PAGE y transferidas a membranas BioTrace PVDF (Pall corporation). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: a-Tubulina (Sc 5286), C23 (Sc 6013), y Fibrilarina (Sc 25397) de Santa Cruz Biotechnology, y PARP (AM30) de Calbiochem, Ratón anti-ZAP 70 (05-253, Millipore), Ratón anti-STAT3 (06-596, Millipore), Ratón anti-ILF3 (ab92355, Abcam), Ratón anti-HSP90 beta (ab32568, Abcam), Ratón anti-ADAR1 (ab88574, Abcam), Ratón anti-HDAC1 (ab19845, Abcam), Ratón anti-SSRP1 (ab21584, Abcam) conejo anti-BOP1 (ab86982, Abcam), Ratón anti-KpNB1 (ab10303, Abcam), Ra Para el análisis SILAC-RPMI R0K0 y SILAC-RPMI R6K6 (Células Dundidas) se utilizó un medio con un 10% de FBS dializado (GIBCO, 26400-036); las células Jurkat que expresaban NTAP-Tat y NTAP fueron transitadas en serie y cultivadas durante cinco duplicados para asegurar la incorporación completa de los aminoácidos marcados; la viabilidad de las células se verificó con Trypan Blue (0,4% solución, SIGMA) y posteriormente se confirmó mediante tinción IP y análisis FACS; las células se mezclaron a la relación 1:1 para obtener 140610 6 células; los nucleoli fueron aislados de la población celular mixta como se describió previamente en Jarboui et al., [165]. Los extractos nucleolares (100 mg) fueron resuspendidos en bicarbonato de amonio de 50 mM y en solución de tripsina digerida como se describió previamente en Jarboui y col. [165]. La muestra se realizó en un espectrómetro de masa termoscientifico LTQ Orbitrap XL conectado a un sistema cromatógrafo NANO LC.1DPLUS que incorporaba una muestra automática. La muestra fue cargada en una columna Biobasic C18 PicofritTM (100 mm de longitud, 75 mm ID) y fue separada por un gradiente de acetonitrilo en aumento, utilizando un gradiente de 142 min de fase inversa (0-40% de acetonitrilo durante 110 min) a un caudal de 300 nL min-1. El espectrómetro de masa fue operado en modo iónico positivo con una temperatura capilar de 200uC, una tensión capilar de 46V, una tensión de lente de tubo de 140V y con un potencial de 1800V aplicada al frit. Todos los datos fueron adquiridos con el espectrómetro de masa que funciona en modo de conmutación automática dependiente de datos. Se realizó una exploración MS de alta resolución utilizando el Orbitrap para seleccionar los 5 iones más intensos antes del análisis MS/MS utilizando la trampa Ion. La eficiencia de incorporación de aminoácidos etiquetados fue determinada mediante el análisis de los péptidos identificados en nucleoli aislados de la población celular mantenida en el medio 'Heavy' como se describe en [169]. Nuestro análisis mostró que teníamos una eficiencia de incorporación.95% (datos no mostrados). Los espectros MS/MS fueron buscados para la identificación y cuantificación de los péptidos utilizando el software MaxQuant [170] (versión 1.1.1.36), la Base de Datos del IPI Humano (versión 3.83) y el motor de búsqueda Andrómeda asociado a MaxQuant [171]. Se utilizaron parámetros estándar para MaxQuant con el Acetil (término N de Proteína) como modificación variable y Carbamidometilo (Cys) como modificación fija, se permitieron 2 escisiónes perdidas, excepto que se prohibió el filtrado de aminoácidos etiquetados. La desviación de masa inicial de los iones precursores y fragmentos fue de 7 ppm y 0,5 Da, respectivamente. Cada relación proteica fue calculada como promedio ponderado de intensidad de los coeficientes de péptidos individuales. Las proteínas fueron identificadas con el mínimo de un péptido con una tasa La ontología genética, la vía KEGG y los términos Pfam se extrajeron de entradas UNIPROT utilizando Perseo, un software del paquete de análisis de datos MaxQuant (http://www.maxquant.org ), y las herramientas de la suite ToppGene [54]. El Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron transfectados utilizando el sistema de electroporación Amaxa (biosistema Amaxa) con el pGL3 (pGL3-LTR) (Promega) como recomendado por Amaxa Biosystem. Los ensayos de doble luciferasa (Promega) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de Luciferasa se midió y normalizó contra la cantidad total de proteínas cuantificada por el kit de cuantificación de proteínas BCA (Pierce, Thermo Scientific). Para preservar Las células se fijaron en un 2% PFA durante 10 minutos en RT, permeabilizaron en un 0,5% Triton X-100 durante 15 minutos en RT y se bloquearon con 5% FCS. Las células se incubaron con el anticuerpo Tat VIH-1 de conejo (ab43014, Abcam) seguido por el anticuerpo secundario anti-Rabbit alexa fluor 647 (A-21246, Invitrogen). Las células se les permitió unirse a Cell-Tak (BD) recubierto de Diapositivas Silanizadas (DaoCytomation), y manchado con DAPI. Las imágenes se capturaron con un Microscopio Confocal Carl Zeiss equipado con un objetivo DIC de aceite de Plan-Apocromat 63X/14. El archivo de datos RAW proteómicos del análisis de espectrometría de masas se depositó en el repositorio Tranche(http El archivo se puede acceder y descargar utilizando la siguiente clave de hash:(R3O5SV5Z6HvWqrBNDhp21tXFetluDWYxvwMIfU-h6e1kMgarauCSq4dlNcxeUvFOHDEzLeDcg4X5Y8reSb6-MUA6wM1kIAAAAAAB/w = ). Materiales y Métodos S1 Descripción de los métodos empleados para examinar el ciclo celular, la viabilidad celular y el análisis de proliferación celular. (DOCX)

¿Qué isótopo etiquetado lisina?

Tráfico de proteínas nucleolares en respuesta al VIH-1 Tat: Rewiring the Nucleolushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499507/SHA: efa871aeaf22cbd0ce30e8bd1cb3d1afff2a98f9Autores: Jarboui, Mohamed Ali; Bidoia, Carlo; Woods, Elena; Roe, Barbara; Wynne, Kieran; Elia, Giuliano; Hall, William W.; Gautier, Virginie W.Fecha: 2012-11-15DOI: 10.1371/journal.pone.0048702Licencia: cc-byAbstract: La proteína Tat transactivante es una proteína reguladora viral esencial para la replicación del VIH-1. El nucleolo, un compartimento subnuclear altamente dinámico y estructurado sin membrana, es el sitio de ARNr y biogénesis ribosoma y está involucrado en numerosas funciones celulares incluyendo la regulación transcripcional, el control del ciclo celular y la infección viral. Importantemente, el tráfico nucleolar transitorio tanto de Tat como de las transcripciones virales del VIH-1 son críticos en la replicación del VIH-1, sin embargo, el(los) papel(es) del nucleolo en la replicación del VIH-1 sigue sin estar claro. Para entender mejor cómo la interacción de Tat con la maquinaria nucleolar contribuye a la patogénesis del VIH-1, investigamos los cambios cuantitativos en la composición del proteoma nucleolar de las células T de Jurkat que expresan establemente el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta TAP. Utilizando un enfoque proteómico organélaro basado en espectrometría de masas, junto con el etiquetado de isótopos estables en cultivo celular (SILAC), cuantificamos 520 proteínas, incluyendo 49 proteínas que muestran cambios significativos en la abundancia de nucleolos de células T de Jurkat sobre la expresión Tat. Numerosas proteínas que exhiben un cambio de pliegue fueron interactuadores Tat bien caracterizados y/o conocidos por ser críticos para la replicación del VIH-1. Esto sugiere que el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares por Tat proporcionan una capa adicional de control para regular la maquinaria celular involucrada en la patogénesis del VIH-1. El análisis del camino y la reconstrucción de la red revelaron que la expresión Tat resultó específicamente en el enriquecimiento nucleolar de proteínas que participan colectivamente en biogénesis ribosomal, homeostasis de proteínas, vías metabólicas incluyendo glucolítico, fosfato de pentosa, nucleótidos y aminoácidos vías biosintéticas, respuesta al estrés, vías de señalización de células T e integridad del genoma. Presentamos aquí el primer perfil diferencial del proteoma nucleolar de células T que expresan el HIV-1 Tat. Discutimos cómo estas proteínas participan colectivamente en redes interconectadas que convergen para adaptar las actividades dinámicas del nucleolus, que favorecen las actividades biosintéticas del huésped y pueden contribuir a crear un entorno celular que apoye la producción robusta del HIV-1. Texto: El nucleolus es un compartimento subnuclear altamente ordenado organizado alrededor de loci genéticos llamados regiones organizadoras nucleolares (NORs) formado por grupos de cientos de repeticiones de genes rDNA organizadas en repetición tándem cabeza a cola [1, 2]. Organelo sin membrana descrito originalmente como la ''Fábrica Ribosoma'', el nucleolus está dedicado a la transcripción de rDNA dirigida por ARN-polimerasa-I, procesamiento de rARN mediado por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (SORNPs) y conjunto ribosoma. La biogénesis del ribosoma es esencial para la síntesis de proteínas y la viabilidad celular [2] y, en última instancia, resulta en las subunidades ribosomales grandes (60S) y pequeñas (40S), que posteriormente se exportan al citoplasma. Este proceso celular fundamental, al que la célula dedica la mayor parte de sus recursos energéticos, está estrictamente regulado para adaptarse a los cambios dinámicos en la proliferación celular, la tasa de crecimiento y las actividades metabólicas [3]. El nucleolus es el sitio de procesamiento adicional de ARN, incluyendo la exportación y degradación de ARNm, la maduración de pequeños PNNR nucleares ricos en uridina (U snRNPs), que forman el núcleo del spliceosoma, biogénesis de ARNt y microARNs (miRNAs) [4]. El nucleolus también está involucrado en otros procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular, procesos oncogénicos, respuestas de estrés celular y traducción [4]. El concepto de nucleolo multifuncional y altamente dinámico ha sido corroborado por varios estudios que combinan enfoques proteómicos organelares y espectrometría cuantitativa de masas, y describen miles de proteínas que transitan por el nucleolo en respuesta a diversas condiciones metabólicas, estrés y ambientes celulares [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Colectivamente, los estudios mencionados representan hitos en la comprensión de la complejidad funcional del nucleolo, y demostraron que las proteínas nucleolares están en intercambio continuo con otros compartimentos nucleares y celulares en respuesta a determinadas condiciones celulares. Los estudios proteómicos que analizan los nucleoli de las células infectadas por el virus sincitial respiratorio humano (HRSV), el virus influenza A, el virus de la bronquitis infecciosa por coronavirus aviar (IBV) o el adenovirus destacaron cómo los virus pueden alterar de forma distintiva la distribución de proteínas nucleolares [2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Curiosamente, tanto las proteínas reguladoras del VIH-1 Tat como Rev localizan al nucleoplasma y al nucleolus. Ambas secuencias abarcan una señal de localización nucleolar (NoLS) que se superpone con su señal de localización nuclear (NLS), que rige su localización nucleolar [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. Además, Tat y Rev interactúan con el antígeno nucleolar B23 Sin embargo, un estudio reciente describió que en contraste con las células T de Jurkat y otras líneas celulares transformadas donde Tat está asociado con el núcleo y el nucleolo, en las células T primarias Tat se acumula principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Mientras que la regulación de su importación y/o exportación nuclear activa, como mediada por la familia de la carioferina/importación, se han descrito bien, los mecanismos que distribuyen Tat y Rev entre el citoplasma, el nucleoplasma y el nucleolo siguen siendo elusivos [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48]. Importantemente, dos estudios importantes de Machienzi y otros han revelado importantes vínculos funcionales entre la replicación del VIH-1 y el nucleo En primer lugar, podrían inhibir la replicación del VIH-1 y la función de transactivación Tat empleando un señuelo TAR dirigido específicamente al nucleolo. Además, utilizando un enfoque similar, con una ribozima anti-VIH-1 de cabeza martillo fusionada al ARN nucleolar pequeño U16 y por lo tanto dirigida al nucleolo, podrían suprimir dramáticamente la replicación del VIH-1. Colectivamente, estos hallazgos sugieren fuertemente que las transcripciones del VIH-1 y el tráfico nucleolar Tat son críticos para la replicación del VIH-1. Sin embargo, la naturaleza de estas contribuciones aún no se ha aclarado. En este informe, analizamos sistemáticamente las perturbaciones del proteoma nucleolar que ocurren en las células T de Jurkat expresando constitutivamente el VIH-1 Tat, utilizando un enfoque de espectrometría cuantitativa de masas. Después de la anotación detallada de los cambios cuantitativos de abundancia en la composición de la proteína nucleolar sobre la expresión Tat, nos centramos en los complejos celulares afectados por Tat y las vías de señalización asociadas con la biogénesis ribosoma, el spliceosoma, las chaperonas moleculares, la replicación y reparación del ADN y el metabolismo, y discutimos su posible implicación en la patogénesis del VIH-1. En este estudio, investigamos los cambios cuantitativos en el proteoma nucleolar de las células Jurkat T expresando constitutivamente el VIH-1 Tat (86aa) frente a su contraparte Tat negativo, utilizando el etiquetado estable de isótopos con aminoácidos en la tecnología de cultivo celular (SILAC), seguido por la espectrometría de masas en tándem ESI e implementamos el enfoque experimental descrito en la Figura 1A. En primer lugar, mediante la entrega de genes retrovirales, transferimos el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta de purificación de afinidad tándem (TAP) (constituido por dos proteínas G y un péptido de unión a estreptavidina) o TAP solo (vector de control) en el clon de células T de leucemia Jurkat E6-1 y clasificamos las células transducidas (GFP positivo) por FACS. Esto resultó en una población altamente enriquecida de células transducidas policlonales que presentaban diferentes niveles de expresión del transgén (Figura 1B). La funcionalidad del TAP-Tat fue confirmada mediante la transfección de las células TAP-Tat y TAP con un vector de genes reportero de luciferasa bajo el control del HIV-1 LTR (pGL3-LTR) [36]. Para abordar la funcionalidad de Tat fusionado a TAP, comparamos Jurkat TAP-Tat con Jurkat-tat, una línea celular que expresaba establemente Tat [51]. Ambas líneas celulares mostraron una actividad LTR del VIH-1 comparable después de la transfección con pGL3-LTR (Figura S1 ). A continuación, la expresión Tat y la localización subcelular fueron verificadas mediante fraccionamiento subcelular seguido por el análisis del WB (Figura 1E ). TAP-Tat mostró una localización nuclear/nucleolar prominente, pero también se pudo detectar en el citoplasma. Estas observaciones fueron además validadas mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 1E ). A continuación se comparó la tasa de crecimiento y proliferación de las líneas celulares de Jurkat TAP y TAP-Tat (Materiales y Métodos S1), que eran equivalentes (Figura S4A ). Del mismo modo, el análisis FACS confirmó que las poblaciones relativas en G1, S y G2/M eran similares para las células de Jurkat TAP-Tat y TAP (Figura S4B ). Se etiquetaron las células de Jurkat TAP-Tat y Jurkat TAP con isótopo ligero (R0K0) y pesado (R6K6) que contenían arginina y lisina, respectivamente. Después de cinco pasajes en su respectivo medio SILAC, se recolectaron 85 millones de células de cada cultivo, se agruparon y se aislaron sus nucleolis como se describió previamente (Figura 1A ) [52] Para evaluar la calidad de nuestro procedimiento de fraccionamiento, se investigó el enriquecimiento específico de antígenos nucleolares conocidos mediante el análisis Western Blot (Figura 1D). Se encontró que la nucleolina (110 kDa) y la fibrilarina (FBL) (34 kDa), dos proteínas nucleolares principales conocidas por localizar al componente granular del nucleolo, estaban muy enriquecidas en la fracción nucleolar mixta. Se observó que la nucleolina se distribuía igualmente entre las fracciones nuclear y citoplasmática. Este patrón de distribución de nucleolina parece ser específico para las células T de Jurkat, como se muestra anteriormente [52, 53]. La proteína nuclear PARP-1 (Poly ADPribose polimerasa 1) (113 kDa) estaba presente en la fracción nuclear y nucleoplasmática, pero se desplegó en la fracción La alfa-tubulina (50 kDa) fue altamente abundante en la fracción citoplasmática y débilmente detectada en las fracciones nucleares. Colectivamente, estos resultados confirmaron que nuestros métodos produjeron una fracción nucleolar altamente enriquecida sin contaminación cruzada significativa. Posteriormente, la mezcla de proteína nucleolar fue tripsindigerida y los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas. El análisis proteomico cuantitativo comparativo se realizó utilizando MaxQuant para analizar las proporciones en isótopos para cada péptido identificado. Se cuantificó un total de 2427 péptidos, representando 520 proteínas nucleolares cuantificadas. La lista completa anotada de proteínas nucleolares cuantificadas está disponible en la Tabla S1 y los datos brutos del análisis de espectrometría de masas se depositaron en la base de datos de repositorios Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/), a la que se puede acceder utilizando las claves de hash descritas en materiales y métodos. Anotamos las proteínas cuantificadas utilizando las herramientas ToppGene Suite [54] y extrajimos las anotaciones de Gene Onthology (GO) e InterPro [55]. El análisis de los procesos biológicos GO (Figura 1F ) reveló que los procesos biológicos mejor representados incluían la transcripción (24%), el procesamiento de ARN (23%), el proceso del ciclo celular (13%) y la organización cromosómica (15%), que refleja las funciones asociadas nucleolares y es comparable a nuestra caracterización anterior del proteoma nucleo El análisis de distribución subcelular (Figura 1F ) reveló que nuestro conjunto de datos contenía proteínas conocidas por localizarse en el nucleolo (49%), en el núcleo (24%) mientras que el 15% de las proteínas estaban descritas previamente para residir exclusivamente en el citoplasma. La distribución subcelular fue similar a nuestro análisis anterior del proteoma nucleolar de células T de Jurkat [52]. Tabla S1. La distribución de las relaciones proteicas se representan en la Figura 1G como log 2 (cambio de abundancia). Las relaciones SILAC indican cambios en la abundancia proteica en la fracción nucleolar de las células TAP de Jurkat en comparación con las células TAP de Jurkat. La distribución de las proteínas cuantificadas siguió una distribución gaussiana (Figura 1G ). Un total de 49 proteínas nucleolares exhibieron un cambio significativo de 1,5 veces o mayor Las células no mostraron cambios en el contenido en estado estacionario de algunos de los principales y abundantes componentes del nucleolo, incluyendo nucleofosfmina (NPM1/ B23), C23, FBL, proteína nucleolar P120 (NOL1) y proteína nucleolar 5A (NOL5A). Las distintas proporciones de cambios proteicos sobre la expresión Tat podrían reflejar la reorganización nucleolar específica y las actividades alteradas del nucleolo. Realizamos el análisis del WB para validar los resultados basados en SILAC obtenidos por nuestro enfoque proteómico cuantitativo (Figura 2 ). 15 proteínas seleccionadas mostraron intensidad diferencial en las fracciones nucleolares sobre la expresión Tat, incluyendo 9 enriquecidos (HSP90b, STAT3, pRb, CK2a, CK2a', HSP90a, Transportin, ZAP70, DDX3), y 3 agotados (ILF3, BOP1 y SSRP1) proteínas. Además, también probamos por el análisis WB, abundancia de proteínas no afectada por la expresión Tat (Importin beta, FBL, B23, C23). Estos resultados destacan la concordancia en la tendencia de las proporciones correspondientes de SILAC, a pesar de algunas diferencias en los rangos cuantitativos. Cabe destacar que, usando WB, pudimos observar un cambio de intensidad para la proteína con un cambio de pliegue SILAC tan bajo como 1,25 veces. Por un lado, el umbral de los cambios en la abundancia de proteínas se puede determinar estadísticamente y luego destacar los cambios en la abundancia más grandes como se ilustra en la Tabla 1. Alternativamente, el enriquecimiento o agotamiento coordinado de la mayoría de las proteínas pertenecientes a un complejo o vía celular distinto permitiría la definición de un grupo de proteínas de interés y potencial significación. Por lo tanto, nos centramos en proteínas individuales enriquecidas o agotadas con actividades asociadas con la patogénesis molecular del VIH-1 o Tat, y en modificaciones agrupadas que afectan vías de señalización celular enteras y complejos macromoleculares. Inicialmente nos centramos en las proteínas de señalización que interactúan con Tat y/o la patogénesis molecular asociada del VIH-1 y cuya abundancia en el nucleolo fue modulada por la expresión Tat. Fosfo-proteína fosfatasas. Fosfo-proteína fosfatasa PP1 y PP2A son esenciales Es importante destacar que el PP1 representa el 80% de la actividad de la fosfatasa Ser/Thr dentro del nucleolo. En nuestro estudio, el PP1 fue potencialmente enriquecido por 1,52 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat, lo que apoya estudios previos que describen el objetivo nuclear y nucleolar de PP1a por el HIV-1 Tat y cómo PP1 aumenta la regulación de la transcripción del VIH-1 [58, 59, 60, 61, 62]. El PP1 c también fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro [63]. Curiosamente, la asociación Tat con los promotores de la subunidad PP2A resulta en la sobreexpresión y regulación de la actividad PP2A en linfocitos [64, 65]. Además, PP2A contribuye a la regulación de la transcripción y replicación del VIH-1 [61, 66]. Retinoblastoma Protein. El gen supresor tumoral pRb protein mostró un cambio de 1,4 veces en el nucleolus sobre la expresión Tat [67]. Además, el análisis WB confirmó la translocación distinta del pRb del nucleoplasma al nucleolus por Tat (Figura 2 ). Dependiendo del tipo de célula, pRb puede ser hiperfosforilado o hipofosforilado sobre la expresión Tat y puede regular negativamente o positivamente la transcripción mediada por Tat respectivamente [68, 69, 70]. Curiosamente, la hiperfosforilación de los desencadenantes del pRB en su translocación en el nucleolo [71]. La fosforilación del pRB también se asocia con un aumento de la biogénesis ribosómica y el crecimiento celular [72]. STAT3. El transductor de señal de factor de transcripción y activador de la transcripción 3 (STAT3) se enriqueció significativamente (1,86 veces) en la fracción nucleolar por la expresión constitutiva Tat. Además, el análisis WB indicó que la expresión Tat podría promover la relocalización del STAT3 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento distinto en el nucleolo (Figura 2). Curiosamente, estudios anteriores han demostrado la activación mediada por Tat de la señalización STAT3, como lo demuestra su estado de fosforilación [73]. Curiosamente, la fosforilación STAT3 indujo la dimerización de la proteína después de su translocación al núcleo [74]. YBX1. YBX1, la proteína multifuncional de unión al ADN/ARN fue enriquecida por 1,38 veces en el nucleolo de las células de Jurkat sobre la expresión Tat. Curiosamente, YBX1 interactúa con Tat y TAR y modula la expresión génica del VIH-1 [63, 75]. ZAP70. La proteína tirosina cinasa ZAP70 (proteína quinasa asociada a la cadena Zeta 70) fue enriquecida por 1,24 veces en el nucleolo de las células de Jurkat expresando Tat [76]. Además, el análisis del WB reveló que la expresión Tat podría promover la relocalización del ZAP70 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento La proteína de matriz nuclear interna, Matrin 3 (MATR3), presentó un cambio de 1,39 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat. Se localiza en el nucleolasmo con un patrón difuso excluido de los nucleolos [77]. La matrin 3 ha sido identificada como parte del nucleoloma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Dos estudios recientes han descrito a la matrin 3 como parte de complejos de ribonucleoproteínas, incluyendo también el VIH-1 Rev y (elemento de respuesta Rev) RRE que contiene ARN VIH-1, y promoviendo la regulación post-transcripción del VIH-1 [78, 79, 80]. CASP10. La molécula pro-apotótica de señalización, Caspasa 10 (CASP10), se agotó significativamente de las células nucleolus de Jurkat-Tat (0,82 veces) [81]. Importantemente, la expresión Tat desregula la expresión y actividad de CASP10 en las células Jurkat [82]. ADAR1. Adenosina deaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR1), que convierte las adenosinas en inosinas en ARN de doble cadena, se agotó significativamente del nucleolus de las células Jurkat-Tat (0,78 veces). Curiosamente, ADAR1 sobreexpresión regula la replicación del VIH-1 a través de un mecanismo de edición del ARN [83, 84, 85, 86, 87, 88]. Además, ADAR1 pertenece al interactoroma nuclear in vitro Para subrayar las relaciones estructurales y funcionales de las proteínas nucleolares afectadas por el VIH-1 Tat, construimos una representación en red de nuestro conjunto de datos. Utilizamos la versión 2.6.3 de Cytoscape [89] y utilizando el plugin MiMI [90] para mapear interacciones previamente caracterizadas, extraídas de bases de datos de interacción de proteínas (BIND, DIP, HPRD, CCSB, Reactome, IntAct y MINT), lo que resultó en una red altamente densa y conectada que incluía 416 proteínas (nodos) de las 536 proteínas, unidas por 5060 interacciones no dirigidas (borde) (Figura 3A). El análisis de centralidad reveló un umbral de 23.7 interacciones por proteína. El análisis de topología utilizando el plugin CentiScaPe [91] mostró que la distribución del grado de nodo sigue una ley de energía (Figura S5 Es importante destacar que cuando analizamos la distribución del coeficiente de agrupamiento (Figura S6 ) encontramos que la red está organizada en una arquitectura jerárquica [92], donde los nodos conectados forman parte de áreas altamente agrupadas mantenidas por pocos hubs organizados alrededor del HIV-1 Tat. Además, el análisis de la conexión en grados nodos de nuestra red identificó al HIV-1 Tat como la proteína más conectada (Figura S6 ). Específicamente, el análisis de topología indicó que los valores para las centrales Tat eran los más altos (grado de nodo, estrés, radialidad, cercanía, entreess y centroides), caracterizando a Tat como la proteína principal del hub de la red nucleolar. De hecho, un total de 146 proteínas han sido descritas previamente para interactuar con Tat (Figura 3B, Tabla S2 ). Estas proteínas están involucradas En paralelo, caracterizamos la magnitud de los cambios de abundancia proteica relacionados observados en distintas vías celulares (Figura 4). Biogénesis ribosomal. Inicialmente nos centramos en la biogénesis ribosoma, función primaria del nucleolo. Pudimos observar un aumento general y coordinado en la abundancia de proteínas ribosomales en el nucleolo por expresión Tat (Figura 4 ). Mientras algunas proteínas ribosomales permanecían inalteradas, Tat causó la acumulación nucleolar de varias proteínas ribosomas grandes y pequeñas distintas, excepto RPL35A, para las cuales la expresión Tat causó una marcada disminución en el nivel nucleolar (0,29 veces). Asimismo, varias proteínas involucradas en el procesamiento de ARNr exhibieron un aumento general en la acumulación nucleolar sobre la expresión Tat. Estos incluyen a los miembros canónicos humanos de la familia L7ae junto con los miembros que participan en la Caja C/D, H/ACA y U3 snoRNPs (Figura 4). Por el contrario, BOP1, un componente del complejo PeBoW (Pescadillo Bop1 WDR12) esencial para la maduración de la subunidad ribosómica grande, se agotó significativamente del nucleolo de las células TAP-Tat Jurkat (0,81 veces) y esto fue confirmado por el análisis WB (Figura 2 ) [93]. Sin embargo, los otros componentes complejos PeBoW, Pes1 (0,94 veces) y WDR12 (1,1 veces), no fueron afectados por la expresión Tat. Se identificaron y cuantificaron en nuestro conjunto de datos 55 proteínas de las 108 proteínas spliceosomal conocidas [94]. Estas proteínas incluyen las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares U1, U2 y U5, Sm D1, D2, D3, F y B, y las heterogéneas ribonucleoproteínas nucleares. Nuestros datos sugieren un aumento distinto en la abundancia de proteínas específicas complejas del spliceosoma tras la expresión de HIV-1 Tat en células T de Jurkat (Figuras 3 y 4). Las únicas tres proteínas que se agotaron significativamente del nucleolo tras la expresión del HIV-1 Tat fueron RBMX (0,89 veces), HNRNPA2B1 (0,84 veces) y SNRPA (0,81 veces). Varias investigaciones mostraron alteración de la expresión en los factores de empalme celular en células infectadas por HIV-1 [95, 96] Hemos identificado varias chaperonas moleculares, cochaperonas y otros factores involucrados en la proteostasis para ser altamente enriquecidos en el nucleolo de las células T sobre la expresión Tat (Figuras 3 y 4), muchos de los cuales fueron previamente caracterizados como parte del interactoroma nuclear Tat [63]. Varias proteínas de choque térmico incluyendo DNAJs, específicas HSP90, HSP70 y HSP40 isoformas y sus cofactores se enriquecieron distintivamente en la fracción nucleolar de las células Jurkat expresando Tat (Figura 4 ). Como lo muestra WB, mientras que HSP90a y b son principalmente citoplasmáticas, la expresión Tat desencadena su relocalización al núcleo y nucleolus, corroborando nuestro enfoque cuantitativo proteómico (Figura 2). Del mismo modo, el choque térmico puede hacer que el HSP90 y el HSP70 se reubiquen en el nucleolo [97, 98, 99, 100, 101]. En un estudio reciente, el grupo de Fassati ha demostrado que el HSP90 está presente en el promotor del VIH-1 y puede regular directamente la expresión génica viral [102]. También observamos el aumento coordinado de la abundancia de la clase I (GroEL y GroES) y la clase II (chaperonina que contiene TCP-1 (CTT)) moléculas de chaperonina (Figuras 3 y 4) sobre la expresión Tat. Vía proteasómica de la ubiquitina. La vía proteasómica es el principal sistema proteolítico de células eucariotas [103]. Es importante destacar que la vía ubiquitina-proteasoma nuclear controla el suministro de proteínas ribosomales y es importante para la biogénesis ribosoma [104, 105]. El proteasoma 26S está compuesto por la partícula núcleo 20S (CP) y la partícula reguladora 19S (RP). Alternativamente, CP puede asociarse con el 11S RP para formar el inmunoproteasoma. Todas las proteínas cuantificadas en nuestro estudio son parte del complejo regulador 19S e incluyen PSMD2 (1,5 veces), PSMD3 (1,32 veces), PSMD11 (1,25 veces) y PSMD13 (0,72 veces), el único componente proteasoma significativamente agotado del nucleolo en presencia de Tat (Figura 4). Curiosamente, Tat interactúa con subunidades distintas del sistema proteasoma, incluyendo las subunidades 19S, 20S y 11S. Las consecuencias de estas interacciones incluyen la competencia de Tat con 11S RP o 19S RP para la unión al 20S CP, que resultó en la inhibición de la actividad de la peptidasa 20S [106, 107, 108, 109, 110, 111]. Además, Tat demostró modificar la composición proteosoma y la actividad, que afecta a la generación de antígenos péptidos reconocidos por linfocitos T citotóxicos [112]. Importantemente, un estudio reciente demostró que en ausencia de Tat, los componentes proteosomas están asociados al promotor del VIH-1 y la actividad proteosoma limita la transcripción [113]. La adición de Tat promovió la disociación de la subunidad 19S del proteasoma 20S, seguido por el enriquecimiento distintivo del complejo similar a 19S en extractos nucleares junto con el reclutamiento mediado por Tat de las subunidades 19S para el promotor del VIH-1, lo que facilitó su elongación transcripcional [113]. También cuantificamos UBA1 (1,36 veces), la ubiquitina-proteína ligasa UHRF1 (1,13 veces), UBC (1 veces) y dos Ubiquitinspecific-peptidases, USP30 (1,28 veces) y USP20 (0,06 veces) (Figura 4). Replicación y reparación del ADN. Tras la expresión del HIV-1 Tat, observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de varios factores celulares asociados con la replicación del ADN y las vías de reparación (Figura 4). Tat indujo el enriquecimiento coordinado del complejo MCM2-7 de mantenimiento cromosómico en miniatura (de 1.23-a 3,30 veces, respectivamente) [114]. MCM7, 6 y 3 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. El mantenimiento estructural de los cromosomas 2, SMC2, fue enriquecido (1,35 veces) en la fracción nucleolar por expresión Tat. SMC2 fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Mientras que el factor de replicación C1 (RFC1) y RFC2 (1,31 y 1,28 veces respectivamente) mostró un cambio de pliegue incrementado y RFC5/3 no se vieron afectados, RFC4 se redujo gravemente (0,69 veces) de la fracción nucleolar sobre la expresión Tat [115]. El RFC1 y RFC2 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Tat indujo el enriquecimiento de XRCC6 (1,27 veces) y XRCC5 (1,36 veces) en el nucleolo, que están involucrados en la reparación de la unión final del ADN no-homologoso (NHEJ) [116]. XRCC6 se asocia con complejos de preintegración viral que contienen HIV-1 Integrase y también interactúan con Tat y TAR [117, 118, 119]. Además, en una pantalla basada en ribozyme, el derribo del XRCC5 (Ku80) disminuyó tanto la integración retroviral como la transcripción Tatmediated [120]. Como parte de la reparación de la escisión base (BER), hemos identificado una importante endonucleasa apurínico/apirimidinica 1 (APEX1) (1,29 veces). Importantemente, en una pantalla de siRNA dirigida a los factores de reparación del ADN, se encontró que la reducción de APEX1 inhibe la infección por VIH-1 por más de 60% [121]. La proteína del grupo de alta movilidad (HMG) HMGA1 (1,30 veces), fue enriquecida en el nucleolo después de la expresión Tat [122]. HMGA1 interactúa con la integración del VIH-1 y forma parte del complejo de preintegración del VIH-1 [123, 124]. Importantemente, HMGA1 ha sido identificada en una pantalla proteómica, como un cofactor celular que interactúa con el VIH-1 59líder [125]. Metabolismo. Nuestros datos proteómicos sugieren que Tat induce perturbaciones en la glucólisis, la vía del fosfato pentosa y la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos (Figura 4 y Figura S7 ). En particular, en las células T que expresan Tat, detectamos cambios coordinados en la abundancia de proteínas no conocidas previamente que se asocian con la patogénesis del Tat, que revelaron conexiones inesperadas con la glicólisis y la vía del fosfato pentosa, incluyendo las siguientes enzimas glicólicas, lactato deshidrogenasa B (LDHB) (1,37 veces), la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1,17 veces) y la mutasa del ácido fosfoglicérico (PGAM1) (0,89 veces) (Figura 4 y Figura S En resumen, el GPI cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Posteriormente, el PFKP cataliza la conversión irreversible de fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato y es una enzima reguladora clave de la glucólisis. Al final de la vía glicolítica, PKM2, en su forma tetramérica, se sabe que genera ATP y piruvato, mientras que el LDHB desvía la mayoría del piruvato a la producción y regeneración de lactato de NAD+ en apoyo a la glicólisis continua, un fenómeno descrito para las células T proliferativas [126]. Esto regula la disponibilidad de los intermedios de glucosa, que se redirigen a las vías de la pentosa fosfato y de la serina biosíntesis para la producción de precursores biosintéticos de nucleótidos, fosfolípidos y aminoácidos. Como parte de la vía del fosfato de pentosa, hemos caracterizado el enriquecimiento significativo de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) (2,11 veces), que ramas de la vía de la glicólisis para generar NADPH, ribosa-5fosfato un precursor importante para la síntesis de nucleótidos. Consistente con esto, detectamos el aumento coordinado en la abundancia de enzimas que juega un papel central en la síntesis de purinas y pirimidinas. Más específicamente, IMPDH2 (1,66 veces), una enzima limitante de la tasa en el punto de rama de la biosíntesis de nucleótidos de purina, que conduce a la generación de nucleótidos de guanina, fosforibosil pirofosfato sintetasa 2 (PRPS2) (1,41 veces), cytidine-5-prime-trifosfato sintetasa (CTPS) (1,74 veces) que cataliza la conversión de UTP a CTP y la subunidad grande de ribonucleótido reductasa (RRM1) (1,56 veces). En parralel, observamos el aumento de la abundancia de la fosfoserina aminotransferasa PSAT1 (1,90 veces), una enzima implicada en la biosíntesis de serina, que se ha relacionado con la proliferación celular in vitro. La interfaz host-virus es un aspecto fundamental en la definición de la patogénesis molecular del VIH-1 [127, 128, 129, 130, 131, 132, 133]. De hecho, con su repertorio limitado de proteínas virales, el VIH-1 se basa ampliamente en la maquinaria de las células huésped para su replicación. Varios estudios recientes han capitalizado los recientes avances en las tecnologías ''OMICS'', y han revelado importantes perspectivas en este diálogo molecular finamente afinado [132, 134]. El VIH-1 Tat es esencial para la replicación viral y orquesta la expresión génica del VIH-1. La proteína reguladora viral es conocida por interactuar con una amplia gama de proteínas celulares y modular la expresión del gen celular y la vía de señalización [135, 136]. Nosotros y otros hemos utilizado enfoques a nivel del sistema para investigar la interacción Tat con la maquinaria de las células de acogida, que han caracterizado al HIV-1 Tat como un mediador crítico de la interfaz host-viral [137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149]. Aquí, hemos investigado el tráfico de proteínas nucleolares en respuesta a la expresión HIV-1 Tat en células T, con el fin de proporcionar ideas únicas y novedosas sobre el papel de la compartimentación de proteínas por Tat en el ajuste fino de la disponibilidad de proteínas y la función. Hemos desarrollado para este estudio, un modelo celular utilizando Jurkat T-cells expresando firmemente Tat fusionado en su N-ternminal a TAP-tag. Jurkat T-cells son robustos y presentan la ventaja de crecer sin estímulos y se transducen fácilmente utilizando Es importante destacar que se han empleado ampliamente para evaluar la patogénesis mediada por Tat utilizando enfoques de todo el sistema y para analizar las vías y funciones de señalización celular clave de las células T [144, 150, 151, 152]. De hecho, hemos encontrado que son especialmente adecuadas para cultivos in vitro prolongados en el medio SILAC y posterior aislamiento de su nucleolo, seguido por el análisis de MS, que requiere hasta 85 millones de células. Fusionamos Tat a la etiqueta TAP para permitir futuras aplicaciones posteriores como purificación de afinidad de Tandem o análisis IP de Cromatina. Importantemente, hemos confirmado que la etiqueta TAP N-terminal no interfirió con la función Tat ni su localización en las células Jurkat, cuando se compara con la no etiquetada-Tat. Aunque se sabe que Tat se acumula en el núcleo y el nucleolo en las células de Jurkat y otras líneas celulares transformadas, en las células T primarias, Tat se describe para acumularse principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Estas diferencias permanecen por caracterizarse, pero podrían estar relacionadas con diferentes niveles de expresión de los factores de transporte en las líneas celulares transformadas versus las células primarias, como se describe recientemente por Kuusisto et al. [39]. Además, Stauber y Pavlakis han sugerido que la localización nucleolar Tat podría ser el resultado de la sobreexpresión Tat [31]. Aquí, hemos seleccionado y empleado una población policlonal de células T Jurkat que expresan Tat en diferentes niveles. Proponemos que esta heterogeneidad en los niveles de expresión Tat podría reflejar la expresión estocástica Ta Utilizando una estrategia proteómica cuantitativa basada en un enfoque organélaro, cuantificamos más de 520 proteínas nucleolares, incluyendo 49 proteínas que muestran un cambio significativo en el pliegue. La medida en que las variaciones inducidas en la abundancia de proteínas nucleolares son biológicamente relevantes y pueden afectar los procesos celulares y/o virales queda por determinar. Sin embargo, la naturaleza biológica de las vías y los complejos macromoleculares afectados nos permiten discutir sus posibles asociaciones con la patogénesis del VIH-1. El VIH-1 Tat se expresa tempranamente después de la integración del genoma del VIH-1 y media el cambio a la fase de producción viral, asociado con la expresión génica proviral robusta, el ensamblaje de proteínas virales y, en última instancia, el desarrollo y liberación de viriones. En este contexto y basado en nuestros resultados, proponemos que Tat podría participar en la configuración del entorno intracelular y el perfil metabólico de De hecho, observamos el enriquecimiento nucleolar distinto de proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica, lo que podría ser indicativo de un aumento en la síntesis proteica. Con la notable exepción de RPL35A depleción nucleolar, proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica estaban en las 20 proteínas nucleolares más enriquecidas (NHP2L1, RLP14, RPL17, RPL27, RPS2, RPL13). Además, este efecto parece ser específico del HIV-1 Tat ya que la inhibición de transcripción por Actinomicina D resultó en el agotamiento total de proteínas ribosómicas en el nucleolo [9]. Además, el análisis proteómico cuantitativo de las células nucleas en adenovirus infectados mostró una leve disminución en proteínas ribosómicas [24] Si esto refleja un cambio en la biogénesis del ribosoma y/o un cambio en la composición de las subunidades ribosomales queda por determinar. Sin embargo, la necesidad adaptada de una producción elevada del ribosoma es intuitiva para un sistema que necesita apoyar la creciente demanda de nueva síntesis de proteínas virales. En parralel, observamos la modulación concordante de las vías que regulan la homeostasis proteica. Observamos la significativa acumulación nucleolar de múltiples chaperonas moleculares incluyendo las HSPs, el complejo TCP-1, y moléculas CANX/CALR y la abundancia nucleolar interrumpida de proteínas pertenecientes a la vía ubiquitina-proteasoma, que controla el suministro de proteínas ribosomales [104, 105]. Estas observaciones apoyan estudios previos que describen la modulación de la actividad proteasómica por Tat, que afectan la expresión, el montaje y la localización de subunidades específicas de los complejos proteasómicos [106, 107, 108, 109, 110, 111, 113]. También observamos el agotamiento concomitante de CASP10 en el nucleolo de Jurkat TAP-Tat. Se ha sugerido que CASP10 podría estar dirigido al nucleolo para inhibir la síntesis proteica [154]. Curiosamente, la presencia y los roles potenciales de las chaperonas moleculares en el nucleolo han sido destacados por Banski et al, quienes explican cómo la red chaperona podría regular la biogénesis ribosómica, la señalización celular y la respuesta al estrés [97, 155]. A medida que la producción viral avanza hacia la fase tardía y aumenta el estrés celular, el enriquecimiento nucleolar de las chaperonas moleculares por Tat no sólo podría permitir el plegado de adequat de proteínas virales recién sintetizadas, sino que también podría promover la tolerancia de las células infectadas al estrés y mantener la viabilidad celular. Coincidentemente, observamos el marcado enriquecimiento nucleolar de enzimas pertenecientes a vías metabólicas incluyendo glicólisis, fosfato de pentosa, nucleótido y aminoácidos vías biosintéticas. Del mismo modo, estas vías se elevan en células T proliferativas o en células cancerosas después de un cambio metabólico a la glicólisis aeróbica, también conocido como el efecto Warburg [156, 157, 158, 159]. Allí, los intermedios de glucosa de la vía de la glicólisis no sólo se comprometen a la producción de energía y se descomponen en piruvato para el ciclo TCA, sino que se redirigen a vías alternativas, incluyendo la vía del fosfato de pentosa, y se utilizan como precursores metabólicos para producir nucleótidos, aminoácidos, acetil CoA y NADPH para la homeostasis redox. De manera consistente, también se observó el enriquecimiento nucleolar concomitante de enzimas pertenecientes a la vía de síntesis de nucleótidos, incluyendo IMPH2, una enzima limitante conocida para controlar el pool de GTP. De igual manera, se observó el enriquecimiento nucleolar de PSAT1, una enzima involucrada en el metabolismo de serina y treonina, que está asociada con la proliferación celular [160]. Colectivamente, proponemos que mediante el control de la homeostas Sin embargo, las enzimas glucolíticas han sido detectadas en las fracciones nuclear y nucleolar mediante análisis proteómicos [8, 161]. Además, las enzimas glucolíticas, como PKM2, LDH, fosfoglicerato cinasa, GAPDH y aldosa, también han sido reportadas para mostrar localización nuclear y unirse al ADN [162]. Más específicamente, PKM2 es conocido por asociarse con el promotor y participar en la regulación de la expresión génica como coactivador transcripcional [163]. HIV-1 Tat ha sido descrito previamente como un inmunoregulador y más específicamente, ha sido reportado tanto para inhibir o promover la señalización TCR [164]. Hemos observado el enriquecimiento nucleolar por Tat de componentes proximales o aguas abajo clave de las vías de señalización de células T, incluyendo ZAP70, ILF3 y STAT3, que juegan un papel crucial en el desarrollo y activación de células T. Anteriormente los habíamos identificado como componentes específicos de células T del nucleolo, y los estudios de IF sugirieron que su asociación con el nucleolo podría ser regulada por condiciones específicas [165]. Nuestros resultados apoyan aún más que Tat podría contribuir a la disregulación de las señales derivadas de TCR y que el nucleolo podría representar un importante enlace espacial para las moléculas de señalización TCR. Observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de componentes clave de las vías de replicación, recombinación y reparación del ADN por Tat. Estos incluyen XRCC5 y XRCC6, HMGA1, APEX1, MCM2-7, SMC2, RFC1 y RFC2, mientras que RFC4 se encontró significativamente agotado. Curiosamente, estos cofactores se han asociado con la eficiencia de la integración del ADN retroviral en el ADN del huésped o la integridad del provirus integrado [166]. Si la abundancia creciente de estos factores dentro del nucleolo podría estar asociada con su participación potencial en la integración y mantenimiento de la integridad del gen provirus, queda por determinar. Los mecanismos de segregación mediada por Tat y compartimentación de proteínas dentro o fuera del nucleolo pueden depender de factores inherentes para cada proteína y la naturaleza de su relación con Tat, ya que el fraccionamiento subcelular combinado con el análisis del WB mostró que el patrón y el grado de redistribución subcelular entre proteínas variaban. Pudimos observar casos en los que Tat regulaba la expresión de proteínas que resultaban en un aumento general de estas proteínas en los compartimentos celulares incluyendo el nucleolo (DDX3, TNPO1). Alternativamente, Tat podía desencadenar la translocación nucleolar de proteínas directamente desde el citoplasma o el nucleoplasma (pRb). Además, observamos proteínas citoplasmáticas redistribuidas tanto al nucleoplasma como al nucleolo sobre la expresión Tat (STAT3, ZAP70 y HSP90). Finalmente, también notamos el agotamiento proteico en la fracción nucleolar acompañado de un aumento en el nucleoplasma (SSRP1). Sigue siendo difícil en esta etapa, apreciar si la acumulación de proteínas específicas resultaría en su activación o inhibición al secuestrarlas de su lugar de acción. Por el contrario, el agotamiento de una proteína del nucleolus podría resultar en la regulación descendente de su actividad en este lugar o podría ser el resultado de su movilización desde su sitio de almacenamiento, el nucleolus, al nucleoplasma o citoplasma donde puede realizar su función. Cabe destacar que identificamos a varios socios conocidos del VIH-1 Tat involucrados en la patogénesis del VIH-1, lo que sugiere que Tat podría modular físicamente su objetivo nucleolar o su reclutamiento a un sitio específico en el nucleoplasma o citoplasma. Tat también podría promover modificaciones post-traducción, lo que podría mediar la focalización de proteínas específicas al nucleolus. Esto se ilustra por las siguientes proteínas enriquecidas, pRb, PP1 y STAT3, para lo que la fosforilación es inducida por Tat. Importantemente, su estado de fosforilación determina su distribución subcelular, proporcionando así un mecanismo Además, nuestros datos indican que las serinas/treoninas quinasas (CK2 a') y fosfatasas (PP1) se enriquecieron significativamente en las fracciones nucleolares de Jurkat TAP-Tat. Estas enzimas representan la mayor parte de la actividad de fosforilación/desfosforilación en el nucleolo y pueden actuar como reguladores del tráfico de proteínas nucleolares. Además, Tat disminuyó significativamente los niveles de SUMO-2 en el nucleolo. Del mismo modo, se sabe que las modificaciones posteriores a la traducción mediadas por SUMO modulan la localización de proteínas nucleolares [104]. Dada la importancia potencial de las modificaciones posteriores a la traducción, incluida la fosforilación en el cambio mediado por Tat de la abundancia de proteínas nucleolares, un enfoque proteomico más específico como el enriquecimiento de fosfopétidos El control de la rotación de proteínas también es un medio importante para modular la abundancia de proteínas nucleolares. Las proteínas ribosómicas son degradadas por la vía Ubiquitina-Proteasoma para asegurar que su abundancia coincida con los niveles de transcripción de rRNA. A la inversa, las proteínas de choque térmico HSP90s las protegen de la degradación. Curiosamente, nuestros datos muestran que la modulación Tat de las proteínas de abundancia asociadas con la vía Ubiquitina-proteasoma y choque térmico. Esto podría contribuir al enriquecimiento observado de proteínas ribosómicas por Tat. Sin embargo, no podemos excluir que la mayor abundancia de proteínas ribosómicas en el nucleolo podría ser el resultado de la prevención mediada por Tat de su exportación al citoplasma. Curiosamente, utilizando un sistema celular diferente, una cepa transgénica de Drosophila melanogaster Tat, Ponti et al, analizaron los efectos de Tat en la biogénesis ribosoma, después de 3 días de tratamiento de choque térmico para inducir la expresión Tat bajo el control del promotor hsp70 [167]. Después de la expresión Tat, observaron un defecto en el procesamiento pre-rRNA asociado con una disminución en el nivel de 80S ribosomas [167]. Sin embargo, los diferentes sistemas celulares empleados combinados con la inducción de choque térmico de 3 días hacen que sus resultados sean difíciles de comparar con los nuestros. Mientras que estudios anteriores a nivel de sistema han monitoreado los efectos de la expresión Tat del VIH-1 en las células T, a nuestro conocimiento, hemos presentado aquí el primer análisis proteómico de la composición dinámica del nucleolus en respuesta a la expresión Tat del VIH Utilizando proteómica cuantitativa, hemos subrayado los cambios en la abundancia de proteínas nucleolares específicas y hemos destacado la reorganización nucleolar extensa y coordinada en respuesta a la expresión constitutiva Tat. Nuestros hallazgos subrayan que Tat que expresa células T exhiben un perfil proteómico nucleolar único, que puede reflejar una estrategia viral para facilitar la progresión a la producción viral robusta. Importantemente, hemos notado la relación funcional de proteínas nucleolares de nuestro conjunto de datos con la patogénesis VIH-1 y el Tat VIH-1 en particular. Esto aumenta aún más nuestra confianza en nuestra estrategia experimental y sugiere un papel para Tat en el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares. Finalmente, nuestro estudio proporciona nuevas ideas sobre la importancia de Tat en la conversación cruzada entre funciones nucleolares y patogénesis viral. También hemos identificado cambios en la abundancia de proteínas nucleolares que no estaban previamente asociados con la patogénesis del VIH-1, incluyendo proteínas asociadas a vías metabólicas, que proporcionan nuevos objetivos potenciales y vías celulares para la intervención terapéutica.Células T Jurkat, clon E6.1 (ATCC), Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP se mantuvieron en el medio RPMI-1640 complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (Gibco, aprobado por la UE), y antibióticos. Células Phoenix-GP (G.P. Nolan; www.stanford.edu/ group/nolan/), se mantuvieron en el medio DMEM complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (GIBCO, aprobado por la UE). La secuencia de HIV-1 Tat (VIH-1 HXB2, 86 aminoácidos) fue subclonada en el vector pENTR 2B (Invitrogen, A10463). Usando la tecnología Gateway (Invitrogen), introdujimos la secuencia HIV-1 Tat en el plásmido pCeMM-NTAP(GS)-Gw [168]. Las células Fénix (G.P. Nolan; www.stanford.edu/group/nolan/), fueron transfectadas usando Fugene 6 (Roche) con 5 mg del plásmido NTAP-Tat o NTAP y 3 mg del pMDG-VSVG. Los sobrenadantes virales fueron recolectados después de 48 h, filtrados y utilizados para transducir las líneas celulares de Jurkat. La construcción se denomina NTAP-Ta Utilizando la entrega de genes retrovirales, transferimos de forma estable células Jurkat (clone E6.1 (ATCC)). Los clones positivos llamados Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron ordenados para enriquecer la población de células que expresaban GFP usando el clasificador de células BC MoFlo XDP (Beckman Coulter). Las fracciones subcelulares (10 mg) fueron resueltas por SDS-PAGE y transferidas a membranas BioTrace PVDF (Pall corporation). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: a-Tubulina (Sc 5286), C23 (Sc 6013), y Fibrilarina (Sc 25397) de Santa Cruz Biotechnology, y PARP (AM30) de Calbiochem, Ratón anti-ZAP 70 (05-253, Millipore), Ratón anti-STAT3 (06-596, Millipore), Ratón anti-ILF3 (ab92355, Abcam), Ratón anti-HSP90 beta (ab32568, Abcam), Ratón anti-ADAR1 (ab88574, Abcam), Ratón anti-HDAC1 (ab19845, Abcam), Ratón anti-SSRP1 (ab21584, Abcam) conejo anti-BOP1 (ab86982, Abcam), Ratón anti-KpNB1 (ab10303, Abcam), Ra Para el análisis SILAC-RPMI R0K0 y SILAC-RPMI R6K6 (Células Dundidas) se utilizó un medio con un 10% de FBS dializado (GIBCO, 26400-036); las células Jurkat que expresaban NTAP-Tat y NTAP fueron transitadas en serie y cultivadas durante cinco duplicados para asegurar la incorporación completa de los aminoácidos marcados; la viabilidad de las células se verificó con Trypan Blue (0,4% solución, SIGMA) y posteriormente se confirmó mediante tinción IP y análisis FACS; las células se mezclaron a la relación 1:1 para obtener 140610 6 células; los nucleoli fueron aislados de la población celular mixta como se describió previamente en Jarboui et al., [165]. Los extractos nucleolares (100 mg) fueron resuspendidos en bicarbonato de amonio de 50 mM y en solución de tripsina digerida como se describió previamente en Jarboui y col. [165]. La muestra se realizó en un espectrómetro de masa termoscientifico LTQ Orbitrap XL conectado a un sistema cromatógrafo NANO LC.1DPLUS que incorporaba una muestra automática. La muestra fue cargada en una columna Biobasic C18 PicofritTM (100 mm de longitud, 75 mm ID) y fue separada por un gradiente de acetonitrilo en aumento, utilizando un gradiente de 142 min de fase inversa (0-40% de acetonitrilo durante 110 min) a un caudal de 300 nL min-1. El espectrómetro de masa fue operado en modo iónico positivo con una temperatura capilar de 200uC, una tensión capilar de 46V, una tensión de lente de tubo de 140V y con un potencial de 1800V aplicada al frit. Todos los datos fueron adquiridos con el espectrómetro de masa que funciona en modo de conmutación automática dependiente de datos. Se realizó una exploración MS de alta resolución utilizando el Orbitrap para seleccionar los 5 iones más intensos antes del análisis MS/MS utilizando la trampa Ion. La eficiencia de incorporación de aminoácidos etiquetados fue determinada mediante el análisis de los péptidos identificados en nucleoli aislados de la población celular mantenida en el medio 'Heavy' como se describe en [169]. Nuestro análisis mostró que teníamos una eficiencia de incorporación.95% (datos no mostrados). Los espectros MS/MS fueron buscados para la identificación y cuantificación de los péptidos utilizando el software MaxQuant [170] (versión 1.1.1.36), la Base de Datos del IPI Humano (versión 3.83) y el motor de búsqueda Andrómeda asociado a MaxQuant [171]. Se utilizaron parámetros estándar para MaxQuant con el Acetil (término N de Proteína) como modificación variable y Carbamidometilo (Cys) como modificación fija, se permitieron 2 escisiónes perdidas, excepto que se prohibió el filtrado de aminoácidos etiquetados. La desviación de masa inicial de los iones precursores y fragmentos fue de 7 ppm y 0,5 Da, respectivamente. Cada relación proteica fue calculada como promedio ponderado de intensidad de los coeficientes de péptidos individuales. Las proteínas fueron identificadas con el mínimo de un péptido con una tasa La ontología genética, la vía KEGG y los términos Pfam se extrajeron de entradas UNIPROT utilizando Perseo, un software del paquete de análisis de datos MaxQuant (http://www.maxquant.org ), y las herramientas de la suite ToppGene [54]. El Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron transfectados utilizando el sistema de electroporación Amaxa (biosistema Amaxa) con el pGL3 (pGL3-LTR) (Promega) como recomendado por Amaxa Biosystem. Los ensayos de doble luciferasa (Promega) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de Luciferasa se midió y normalizó contra la cantidad total de proteínas cuantificada por el kit de cuantificación de proteínas BCA (Pierce, Thermo Scientific). Para preservar Las células se fijaron en un 2% PFA durante 10 minutos en RT, permeabilizaron en un 0,5% Triton X-100 durante 15 minutos en RT y se bloquearon con 5% FCS. Las células se incubaron con el anticuerpo Tat VIH-1 de conejo (ab43014, Abcam) seguido por el anticuerpo secundario anti-Rabbit alexa fluor 647 (A-21246, Invitrogen). Las células se les permitió unirse a Cell-Tak (BD) recubierto de Diapositivas Silanizadas (DaoCytomation), y manchado con DAPI. Las imágenes se capturaron con un Microscopio Confocal Carl Zeiss equipado con un objetivo DIC de aceite de Plan-Apocromat 63X/14. El archivo de datos RAW proteómicos del análisis de espectrometría de masas se depositó en el repositorio Tranche(http El archivo se puede acceder y descargar utilizando la siguiente clave de hash:(R3O5SV5Z6HvWqrBNDhp21tXFetluDWYxvwMIfU-h6e1kMgarauCSq4dlNcxeUvFOHDEzLeDcg4X5Y8reSb6-MUA6wM1kIAAAAAAB/w = ). Materiales y Métodos S1 Descripción de los métodos empleados para examinar el ciclo celular, la viabilidad celular y el análisis de proliferación celular. (DOCX)

¿Cuántas células se cosecharon de cada cultivo?

Tráfico de proteínas nucleolares en respuesta al VIH-1 Tat: Rewiring the Nucleolushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499507/SHA: efa871aeaf22cbd0ce30e8bd1cb3d1afff2a98f9Autores: Jarboui, Mohamed Ali; Bidoia, Carlo; Woods, Elena; Roe, Barbara; Wynne, Kieran; Elia, Giuliano; Hall, William W.; Gautier, Virginie W.Fecha: 2012-11-15DOI: 10.1371/journal.pone.0048702Licencia: cc-byAbstract: La proteína Tat transactivante es una proteína reguladora viral esencial para la replicación del VIH-1. El nucleolo, un compartimento subnuclear altamente dinámico y estructurado sin membrana, es el sitio de ARNr y biogénesis ribosoma y está involucrado en numerosas funciones celulares incluyendo la regulación transcripcional, el control del ciclo celular y la infección viral. Importantemente, el tráfico nucleolar transitorio tanto de Tat como de las transcripciones virales del VIH-1 son críticos en la replicación del VIH-1, sin embargo, el(los) papel(es) del nucleolo en la replicación del VIH-1 sigue sin estar claro. Para entender mejor cómo la interacción de Tat con la maquinaria nucleolar contribuye a la patogénesis del VIH-1, investigamos los cambios cuantitativos en la composición del proteoma nucleolar de las células T de Jurkat que expresan establemente el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta TAP. Utilizando un enfoque proteómico organélaro basado en espectrometría de masas, junto con el etiquetado de isótopos estables en cultivo celular (SILAC), cuantificamos 520 proteínas, incluyendo 49 proteínas que muestran cambios significativos en la abundancia de nucleolos de células T de Jurkat sobre la expresión Tat. Numerosas proteínas que exhiben un cambio de pliegue fueron interactuadores Tat bien caracterizados y/o conocidos por ser críticos para la replicación del VIH-1. Esto sugiere que el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares por Tat proporcionan una capa adicional de control para regular la maquinaria celular involucrada en la patogénesis del VIH-1. El análisis del camino y la reconstrucción de la red revelaron que la expresión Tat resultó específicamente en el enriquecimiento nucleolar de proteínas que participan colectivamente en biogénesis ribosomal, homeostasis de proteínas, vías metabólicas incluyendo glucolítico, fosfato de pentosa, nucleótidos y aminoácidos vías biosintéticas, respuesta al estrés, vías de señalización de células T e integridad del genoma. Presentamos aquí el primer perfil diferencial del proteoma nucleolar de células T que expresan el HIV-1 Tat. Discutimos cómo estas proteínas participan colectivamente en redes interconectadas que convergen para adaptar las actividades dinámicas del nucleolus, que favorecen las actividades biosintéticas del huésped y pueden contribuir a crear un entorno celular que apoye la producción robusta del HIV-1. Texto: El nucleolus es un compartimento subnuclear altamente ordenado organizado alrededor de loci genéticos llamados regiones organizadoras nucleolares (NORs) formado por grupos de cientos de repeticiones de genes rDNA organizadas en repetición tándem cabeza a cola [1, 2]. Organelo sin membrana descrito originalmente como la ''Fábrica Ribosoma'', el nucleolus está dedicado a la transcripción de rDNA dirigida por ARN-polimerasa-I, procesamiento de rARN mediado por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (SORNPs) y conjunto ribosoma. La biogénesis del ribosoma es esencial para la síntesis de proteínas y la viabilidad celular [2] y, en última instancia, resulta en las subunidades ribosomales grandes (60S) y pequeñas (40S), que posteriormente se exportan al citoplasma. Este proceso celular fundamental, al que la célula dedica la mayor parte de sus recursos energéticos, está estrictamente regulado para adaptarse a los cambios dinámicos en la proliferación celular, la tasa de crecimiento y las actividades metabólicas [3]. El nucleolus es el sitio de procesamiento adicional de ARN, incluyendo la exportación y degradación de ARNm, la maduración de pequeños PNNR nucleares ricos en uridina (U snRNPs), que forman el núcleo del spliceosoma, biogénesis de ARNt y microARNs (miRNAs) [4]. El nucleolus también está involucrado en otros procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular, procesos oncogénicos, respuestas de estrés celular y traducción [4]. El concepto de nucleolo multifuncional y altamente dinámico ha sido corroborado por varios estudios que combinan enfoques proteómicos organelares y espectrometría cuantitativa de masas, y describen miles de proteínas que transitan por el nucleolo en respuesta a diversas condiciones metabólicas, estrés y ambientes celulares [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Colectivamente, los estudios mencionados representan hitos en la comprensión de la complejidad funcional del nucleolo, y demostraron que las proteínas nucleolares están en intercambio continuo con otros compartimentos nucleares y celulares en respuesta a determinadas condiciones celulares. Los estudios proteómicos que analizan los nucleoli de las células infectadas por el virus sincitial respiratorio humano (HRSV), el virus influenza A, el virus de la bronquitis infecciosa por coronavirus aviar (IBV) o el adenovirus destacaron cómo los virus pueden alterar de forma distintiva la distribución de proteínas nucleolares [2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Curiosamente, tanto las proteínas reguladoras del VIH-1 Tat como Rev localizan al nucleoplasma y al nucleolus. Ambas secuencias abarcan una señal de localización nucleolar (NoLS) que se superpone con su señal de localización nuclear (NLS), que rige su localización nucleolar [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. Además, Tat y Rev interactúan con el antígeno nucleolar B23 Sin embargo, un estudio reciente describió que en contraste con las células T de Jurkat y otras líneas celulares transformadas donde Tat está asociado con el núcleo y el nucleolo, en las células T primarias Tat se acumula principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Mientras que la regulación de su importación y/o exportación nuclear activa, como mediada por la familia de la carioferina/importación, se han descrito bien, los mecanismos que distribuyen Tat y Rev entre el citoplasma, el nucleoplasma y el nucleolo siguen siendo elusivos [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48]. Importantemente, dos estudios importantes de Machienzi y otros han revelado importantes vínculos funcionales entre la replicación del VIH-1 y el nucleo En primer lugar, podrían inhibir la replicación del VIH-1 y la función de transactivación Tat empleando un señuelo TAR dirigido específicamente al nucleolo. Además, utilizando un enfoque similar, con una ribozima anti-VIH-1 de cabeza martillo fusionada al ARN nucleolar pequeño U16 y por lo tanto dirigida al nucleolo, podrían suprimir dramáticamente la replicación del VIH-1. Colectivamente, estos hallazgos sugieren fuertemente que las transcripciones del VIH-1 y el tráfico nucleolar Tat son críticos para la replicación del VIH-1. Sin embargo, la naturaleza de estas contribuciones aún no se ha aclarado. En este informe, analizamos sistemáticamente las perturbaciones del proteoma nucleolar que ocurren en las células T de Jurkat expresando constitutivamente el VIH-1 Tat, utilizando un enfoque de espectrometría cuantitativa de masas. Después de la anotación detallada de los cambios cuantitativos de abundancia en la composición de la proteína nucleolar sobre la expresión Tat, nos centramos en los complejos celulares afectados por Tat y las vías de señalización asociadas con la biogénesis ribosoma, el spliceosoma, las chaperonas moleculares, la replicación y reparación del ADN y el metabolismo, y discutimos su posible implicación en la patogénesis del VIH-1. En este estudio, investigamos los cambios cuantitativos en el proteoma nucleolar de las células Jurkat T expresando constitutivamente el VIH-1 Tat (86aa) frente a su contraparte Tat negativo, utilizando el etiquetado estable de isótopos con aminoácidos en la tecnología de cultivo celular (SILAC), seguido por la espectrometría de masas en tándem ESI e implementamos el enfoque experimental descrito en la Figura 1A. En primer lugar, mediante la entrega de genes retrovirales, transferimos el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta de purificación de afinidad tándem (TAP) (constituido por dos proteínas G y un péptido de unión a estreptavidina) o TAP solo (vector de control) en el clon de células T de leucemia Jurkat E6-1 y clasificamos las células transducidas (GFP positivo) por FACS. Esto resultó en una población altamente enriquecida de células transducidas policlonales que presentaban diferentes niveles de expresión del transgén (Figura 1B). La funcionalidad del TAP-Tat fue confirmada mediante la transfección de las células TAP-Tat y TAP con un vector de genes reportero de luciferasa bajo el control del HIV-1 LTR (pGL3-LTR) [36]. Para abordar la funcionalidad de Tat fusionado a TAP, comparamos Jurkat TAP-Tat con Jurkat-tat, una línea celular que expresaba establemente Tat [51]. Ambas líneas celulares mostraron una actividad LTR del VIH-1 comparable después de la transfección con pGL3-LTR (Figura S1 ). A continuación, la expresión Tat y la localización subcelular fueron verificadas mediante fraccionamiento subcelular seguido por el análisis del WB (Figura 1E ). TAP-Tat mostró una localización nuclear/nucleolar prominente, pero también se pudo detectar en el citoplasma. Estas observaciones fueron además validadas mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 1E ). A continuación se comparó la tasa de crecimiento y proliferación de las líneas celulares de Jurkat TAP y TAP-Tat (Materiales y Métodos S1), que eran equivalentes (Figura S4A ). Del mismo modo, el análisis FACS confirmó que las poblaciones relativas en G1, S y G2/M eran similares para las células de Jurkat TAP-Tat y TAP (Figura S4B ). Se etiquetaron las células de Jurkat TAP-Tat y Jurkat TAP con isótopo ligero (R0K0) y pesado (R6K6) que contenían arginina y lisina, respectivamente. Después de cinco pasajes en su respectivo medio SILAC, se recolectaron 85 millones de células de cada cultivo, se agruparon y se aislaron sus nucleolis como se describió previamente (Figura 1A ) [52] Para evaluar la calidad de nuestro procedimiento de fraccionamiento, se investigó el enriquecimiento específico de antígenos nucleolares conocidos mediante el análisis Western Blot (Figura 1D). Se encontró que la nucleolina (110 kDa) y la fibrilarina (FBL) (34 kDa), dos proteínas nucleolares principales conocidas por localizar al componente granular del nucleolo, estaban muy enriquecidas en la fracción nucleolar mixta. Se observó que la nucleolina se distribuía igualmente entre las fracciones nuclear y citoplasmática. Este patrón de distribución de nucleolina parece ser específico para las células T de Jurkat, como se muestra anteriormente [52, 53]. La proteína nuclear PARP-1 (Poly ADPribose polimerasa 1) (113 kDa) estaba presente en la fracción nuclear y nucleoplasmática, pero se desplegó en la fracción La alfa-tubulina (50 kDa) fue altamente abundante en la fracción citoplasmática y débilmente detectada en las fracciones nucleares. Colectivamente, estos resultados confirmaron que nuestros métodos produjeron una fracción nucleolar altamente enriquecida sin contaminación cruzada significativa. Posteriormente, la mezcla de proteína nucleolar fue tripsindigerida y los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas. El análisis proteomico cuantitativo comparativo se realizó utilizando MaxQuant para analizar las proporciones en isótopos para cada péptido identificado. Se cuantificó un total de 2427 péptidos, representando 520 proteínas nucleolares cuantificadas. La lista completa anotada de proteínas nucleolares cuantificadas está disponible en la Tabla S1 y los datos brutos del análisis de espectrometría de masas se depositaron en la base de datos de repositorios Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/), a la que se puede acceder utilizando las claves de hash descritas en materiales y métodos. Anotamos las proteínas cuantificadas utilizando las herramientas ToppGene Suite [54] y extrajimos las anotaciones de Gene Onthology (GO) e InterPro [55]. El análisis de los procesos biológicos GO (Figura 1F ) reveló que los procesos biológicos mejor representados incluían la transcripción (24%), el procesamiento de ARN (23%), el proceso del ciclo celular (13%) y la organización cromosómica (15%), que refleja las funciones asociadas nucleolares y es comparable a nuestra caracterización anterior del proteoma nucleo El análisis de distribución subcelular (Figura 1F ) reveló que nuestro conjunto de datos contenía proteínas conocidas por localizarse en el nucleolo (49%), en el núcleo (24%) mientras que el 15% de las proteínas estaban descritas previamente para residir exclusivamente en el citoplasma. La distribución subcelular fue similar a nuestro análisis anterior del proteoma nucleolar de células T de Jurkat [52]. Tabla S1. La distribución de las relaciones proteicas se representan en la Figura 1G como log 2 (cambio de abundancia). Las relaciones SILAC indican cambios en la abundancia proteica en la fracción nucleolar de las células TAP de Jurkat en comparación con las células TAP de Jurkat. La distribución de las proteínas cuantificadas siguió una distribución gaussiana (Figura 1G ). Un total de 49 proteínas nucleolares exhibieron un cambio significativo de 1,5 veces o mayor Las células no mostraron cambios en el contenido en estado estacionario de algunos de los principales y abundantes componentes del nucleolo, incluyendo nucleofosfmina (NPM1/ B23), C23, FBL, proteína nucleolar P120 (NOL1) y proteína nucleolar 5A (NOL5A). Las distintas proporciones de cambios proteicos sobre la expresión Tat podrían reflejar la reorganización nucleolar específica y las actividades alteradas del nucleolo. Realizamos el análisis del WB para validar los resultados basados en SILAC obtenidos por nuestro enfoque proteómico cuantitativo (Figura 2 ). 15 proteínas seleccionadas mostraron intensidad diferencial en las fracciones nucleolares sobre la expresión Tat, incluyendo 9 enriquecidos (HSP90b, STAT3, pRb, CK2a, CK2a', HSP90a, Transportin, ZAP70, DDX3), y 3 agotados (ILF3, BOP1 y SSRP1) proteínas. Además, también probamos por el análisis WB, abundancia de proteínas no afectada por la expresión Tat (Importin beta, FBL, B23, C23). Estos resultados destacan la concordancia en la tendencia de las proporciones correspondientes de SILAC, a pesar de algunas diferencias en los rangos cuantitativos. Cabe destacar que, usando WB, pudimos observar un cambio de intensidad para la proteína con un cambio de pliegue SILAC tan bajo como 1,25 veces. Por un lado, el umbral de los cambios en la abundancia de proteínas se puede determinar estadísticamente y luego destacar los cambios en la abundancia más grandes como se ilustra en la Tabla 1. Alternativamente, el enriquecimiento o agotamiento coordinado de la mayoría de las proteínas pertenecientes a un complejo o vía celular distinto permitiría la definición de un grupo de proteínas de interés y potencial significación. Por lo tanto, nos centramos en proteínas individuales enriquecidas o agotadas con actividades asociadas con la patogénesis molecular del VIH-1 o Tat, y en modificaciones agrupadas que afectan vías de señalización celular enteras y complejos macromoleculares. Inicialmente nos centramos en las proteínas de señalización que interactúan con Tat y/o la patogénesis molecular asociada del VIH-1 y cuya abundancia en el nucleolo fue modulada por la expresión Tat. Fosfo-proteína fosfatasas. Fosfo-proteína fosfatasa PP1 y PP2A son esenciales Es importante destacar que el PP1 representa el 80% de la actividad de la fosfatasa Ser/Thr dentro del nucleolo. En nuestro estudio, el PP1 fue potencialmente enriquecido por 1,52 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat, lo que apoya estudios previos que describen el objetivo nuclear y nucleolar de PP1a por el HIV-1 Tat y cómo PP1 aumenta la regulación de la transcripción del VIH-1 [58, 59, 60, 61, 62]. El PP1 c también fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro [63]. Curiosamente, la asociación Tat con los promotores de la subunidad PP2A resulta en la sobreexpresión y regulación de la actividad PP2A en linfocitos [64, 65]. Además, PP2A contribuye a la regulación de la transcripción y replicación del VIH-1 [61, 66]. Retinoblastoma Protein. El gen supresor tumoral pRb protein mostró un cambio de 1,4 veces en el nucleolus sobre la expresión Tat [67]. Además, el análisis WB confirmó la translocación distinta del pRb del nucleoplasma al nucleolus por Tat (Figura 2 ). Dependiendo del tipo de célula, pRb puede ser hiperfosforilado o hipofosforilado sobre la expresión Tat y puede regular negativamente o positivamente la transcripción mediada por Tat respectivamente [68, 69, 70]. Curiosamente, la hiperfosforilación de los desencadenantes del pRB en su translocación en el nucleolo [71]. La fosforilación del pRB también se asocia con un aumento de la biogénesis ribosómica y el crecimiento celular [72]. STAT3. El transductor de señal de factor de transcripción y activador de la transcripción 3 (STAT3) se enriqueció significativamente (1,86 veces) en la fracción nucleolar por la expresión constitutiva Tat. Además, el análisis WB indicó que la expresión Tat podría promover la relocalización del STAT3 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento distinto en el nucleolo (Figura 2). Curiosamente, estudios anteriores han demostrado la activación mediada por Tat de la señalización STAT3, como lo demuestra su estado de fosforilación [73]. Curiosamente, la fosforilación STAT3 indujo la dimerización de la proteína después de su translocación al núcleo [74]. YBX1. YBX1, la proteína multifuncional de unión al ADN/ARN fue enriquecida por 1,38 veces en el nucleolo de las células de Jurkat sobre la expresión Tat. Curiosamente, YBX1 interactúa con Tat y TAR y modula la expresión génica del VIH-1 [63, 75]. ZAP70. La proteína tirosina cinasa ZAP70 (proteína quinasa asociada a la cadena Zeta 70) fue enriquecida por 1,24 veces en el nucleolo de las células de Jurkat expresando Tat [76]. Además, el análisis del WB reveló que la expresión Tat podría promover la relocalización del ZAP70 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento La proteína de matriz nuclear interna, Matrin 3 (MATR3), presentó un cambio de 1,39 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat. Se localiza en el nucleolasmo con un patrón difuso excluido de los nucleolos [77]. La matrin 3 ha sido identificada como parte del nucleoloma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Dos estudios recientes han descrito a la matrin 3 como parte de complejos de ribonucleoproteínas, incluyendo también el VIH-1 Rev y (elemento de respuesta Rev) RRE que contiene ARN VIH-1, y promoviendo la regulación post-transcripción del VIH-1 [78, 79, 80]. CASP10. La molécula pro-apotótica de señalización, Caspasa 10 (CASP10), se agotó significativamente de las células nucleolus de Jurkat-Tat (0,82 veces) [81]. Importantemente, la expresión Tat desregula la expresión y actividad de CASP10 en las células Jurkat [82]. ADAR1. Adenosina deaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR1), que convierte las adenosinas en inosinas en ARN de doble cadena, se agotó significativamente del nucleolus de las células Jurkat-Tat (0,78 veces). Curiosamente, ADAR1 sobreexpresión regula la replicación del VIH-1 a través de un mecanismo de edición del ARN [83, 84, 85, 86, 87, 88]. Además, ADAR1 pertenece al interactoroma nuclear in vitro Para subrayar las relaciones estructurales y funcionales de las proteínas nucleolares afectadas por el VIH-1 Tat, construimos una representación en red de nuestro conjunto de datos. Utilizamos la versión 2.6.3 de Cytoscape [89] y utilizando el plugin MiMI [90] para mapear interacciones previamente caracterizadas, extraídas de bases de datos de interacción de proteínas (BIND, DIP, HPRD, CCSB, Reactome, IntAct y MINT), lo que resultó en una red altamente densa y conectada que incluía 416 proteínas (nodos) de las 536 proteínas, unidas por 5060 interacciones no dirigidas (borde) (Figura 3A). El análisis de centralidad reveló un umbral de 23.7 interacciones por proteína. El análisis de topología utilizando el plugin CentiScaPe [91] mostró que la distribución del grado de nodo sigue una ley de energía (Figura S5 Es importante destacar que cuando analizamos la distribución del coeficiente de agrupamiento (Figura S6 ) encontramos que la red está organizada en una arquitectura jerárquica [92], donde los nodos conectados forman parte de áreas altamente agrupadas mantenidas por pocos hubs organizados alrededor del HIV-1 Tat. Además, el análisis de la conexión en grados nodos de nuestra red identificó al HIV-1 Tat como la proteína más conectada (Figura S6 ). Específicamente, el análisis de topología indicó que los valores para las centrales Tat eran los más altos (grado de nodo, estrés, radialidad, cercanía, entreess y centroides), caracterizando a Tat como la proteína principal del hub de la red nucleolar. De hecho, un total de 146 proteínas han sido descritas previamente para interactuar con Tat (Figura 3B, Tabla S2 ). Estas proteínas están involucradas En paralelo, caracterizamos la magnitud de los cambios de abundancia proteica relacionados observados en distintas vías celulares (Figura 4). Biogénesis ribosomal. Inicialmente nos centramos en la biogénesis ribosoma, función primaria del nucleolo. Pudimos observar un aumento general y coordinado en la abundancia de proteínas ribosomales en el nucleolo por expresión Tat (Figura 4 ). Mientras algunas proteínas ribosomales permanecían inalteradas, Tat causó la acumulación nucleolar de varias proteínas ribosomas grandes y pequeñas distintas, excepto RPL35A, para las cuales la expresión Tat causó una marcada disminución en el nivel nucleolar (0,29 veces). Asimismo, varias proteínas involucradas en el procesamiento de ARNr exhibieron un aumento general en la acumulación nucleolar sobre la expresión Tat. Estos incluyen a los miembros canónicos humanos de la familia L7ae junto con los miembros que participan en la Caja C/D, H/ACA y U3 snoRNPs (Figura 4). Por el contrario, BOP1, un componente del complejo PeBoW (Pescadillo Bop1 WDR12) esencial para la maduración de la subunidad ribosómica grande, se agotó significativamente del nucleolo de las células TAP-Tat Jurkat (0,81 veces) y esto fue confirmado por el análisis WB (Figura 2 ) [93]. Sin embargo, los otros componentes complejos PeBoW, Pes1 (0,94 veces) y WDR12 (1,1 veces), no fueron afectados por la expresión Tat. Se identificaron y cuantificaron en nuestro conjunto de datos 55 proteínas de las 108 proteínas spliceosomal conocidas [94]. Estas proteínas incluyen las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares U1, U2 y U5, Sm D1, D2, D3, F y B, y las heterogéneas ribonucleoproteínas nucleares. Nuestros datos sugieren un aumento distinto en la abundancia de proteínas específicas complejas del spliceosoma tras la expresión de HIV-1 Tat en células T de Jurkat (Figuras 3 y 4). Las únicas tres proteínas que se agotaron significativamente del nucleolo tras la expresión del HIV-1 Tat fueron RBMX (0,89 veces), HNRNPA2B1 (0,84 veces) y SNRPA (0,81 veces). Varias investigaciones mostraron alteración de la expresión en los factores de empalme celular en células infectadas por HIV-1 [95, 96] Hemos identificado varias chaperonas moleculares, cochaperonas y otros factores involucrados en la proteostasis para ser altamente enriquecidos en el nucleolo de las células T sobre la expresión Tat (Figuras 3 y 4), muchos de los cuales fueron previamente caracterizados como parte del interactoroma nuclear Tat [63]. Varias proteínas de choque térmico incluyendo DNAJs, específicas HSP90, HSP70 y HSP40 isoformas y sus cofactores se enriquecieron distintivamente en la fracción nucleolar de las células Jurkat expresando Tat (Figura 4 ). Como lo muestra WB, mientras que HSP90a y b son principalmente citoplasmáticas, la expresión Tat desencadena su relocalización al núcleo y nucleolus, corroborando nuestro enfoque cuantitativo proteómico (Figura 2). Del mismo modo, el choque térmico puede hacer que el HSP90 y el HSP70 se reubiquen en el nucleolo [97, 98, 99, 100, 101]. En un estudio reciente, el grupo de Fassati ha demostrado que el HSP90 está presente en el promotor del VIH-1 y puede regular directamente la expresión génica viral [102]. También observamos el aumento coordinado de la abundancia de la clase I (GroEL y GroES) y la clase II (chaperonina que contiene TCP-1 (CTT)) moléculas de chaperonina (Figuras 3 y 4) sobre la expresión Tat. Vía proteasómica de la ubiquitina. La vía proteasómica es el principal sistema proteolítico de células eucariotas [103]. Es importante destacar que la vía ubiquitina-proteasoma nuclear controla el suministro de proteínas ribosomales y es importante para la biogénesis ribosoma [104, 105]. El proteasoma 26S está compuesto por la partícula núcleo 20S (CP) y la partícula reguladora 19S (RP). Alternativamente, CP puede asociarse con el 11S RP para formar el inmunoproteasoma. Todas las proteínas cuantificadas en nuestro estudio son parte del complejo regulador 19S e incluyen PSMD2 (1,5 veces), PSMD3 (1,32 veces), PSMD11 (1,25 veces) y PSMD13 (0,72 veces), el único componente proteasoma significativamente agotado del nucleolo en presencia de Tat (Figura 4). Curiosamente, Tat interactúa con subunidades distintas del sistema proteasoma, incluyendo las subunidades 19S, 20S y 11S. Las consecuencias de estas interacciones incluyen la competencia de Tat con 11S RP o 19S RP para la unión al 20S CP, que resultó en la inhibición de la actividad de la peptidasa 20S [106, 107, 108, 109, 110, 111]. Además, Tat demostró modificar la composición proteosoma y la actividad, que afecta a la generación de antígenos péptidos reconocidos por linfocitos T citotóxicos [112]. Importantemente, un estudio reciente demostró que en ausencia de Tat, los componentes proteosomas están asociados al promotor del VIH-1 y la actividad proteosoma limita la transcripción [113]. La adición de Tat promovió la disociación de la subunidad 19S del proteasoma 20S, seguido por el enriquecimiento distintivo del complejo similar a 19S en extractos nucleares junto con el reclutamiento mediado por Tat de las subunidades 19S para el promotor del VIH-1, lo que facilitó su elongación transcripcional [113]. También cuantificamos UBA1 (1,36 veces), la ubiquitina-proteína ligasa UHRF1 (1,13 veces), UBC (1 veces) y dos Ubiquitinspecific-peptidases, USP30 (1,28 veces) y USP20 (0,06 veces) (Figura 4). Replicación y reparación del ADN. Tras la expresión del HIV-1 Tat, observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de varios factores celulares asociados con la replicación del ADN y las vías de reparación (Figura 4). Tat indujo el enriquecimiento coordinado del complejo MCM2-7 de mantenimiento cromosómico en miniatura (de 1.23-a 3,30 veces, respectivamente) [114]. MCM7, 6 y 3 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. El mantenimiento estructural de los cromosomas 2, SMC2, fue enriquecido (1,35 veces) en la fracción nucleolar por expresión Tat. SMC2 fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Mientras que el factor de replicación C1 (RFC1) y RFC2 (1,31 y 1,28 veces respectivamente) mostró un cambio de pliegue incrementado y RFC5/3 no se vieron afectados, RFC4 se redujo gravemente (0,69 veces) de la fracción nucleolar sobre la expresión Tat [115]. El RFC1 y RFC2 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Tat indujo el enriquecimiento de XRCC6 (1,27 veces) y XRCC5 (1,36 veces) en el nucleolo, que están involucrados en la reparación de la unión final del ADN no-homologoso (NHEJ) [116]. XRCC6 se asocia con complejos de preintegración viral que contienen HIV-1 Integrase y también interactúan con Tat y TAR [117, 118, 119]. Además, en una pantalla basada en ribozyme, el derribo del XRCC5 (Ku80) disminuyó tanto la integración retroviral como la transcripción Tatmediated [120]. Como parte de la reparación de la escisión base (BER), hemos identificado una importante endonucleasa apurínico/apirimidinica 1 (APEX1) (1,29 veces). Importantemente, en una pantalla de siRNA dirigida a los factores de reparación del ADN, se encontró que la reducción de APEX1 inhibe la infección por VIH-1 por más de 60% [121]. La proteína del grupo de alta movilidad (HMG) HMGA1 (1,30 veces), fue enriquecida en el nucleolo después de la expresión Tat [122]. HMGA1 interactúa con la integración del VIH-1 y forma parte del complejo de preintegración del VIH-1 [123, 124]. Importantemente, HMGA1 ha sido identificada en una pantalla proteómica, como un cofactor celular que interactúa con el VIH-1 59líder [125]. Metabolismo. Nuestros datos proteómicos sugieren que Tat induce perturbaciones en la glucólisis, la vía del fosfato pentosa y la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos (Figura 4 y Figura S7 ). En particular, en las células T que expresan Tat, detectamos cambios coordinados en la abundancia de proteínas no conocidas previamente que se asocian con la patogénesis del Tat, que revelaron conexiones inesperadas con la glicólisis y la vía del fosfato pentosa, incluyendo las siguientes enzimas glicólicas, lactato deshidrogenasa B (LDHB) (1,37 veces), la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1,17 veces) y la mutasa del ácido fosfoglicérico (PGAM1) (0,89 veces) (Figura 4 y Figura S En resumen, el GPI cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Posteriormente, el PFKP cataliza la conversión irreversible de fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato y es una enzima reguladora clave de la glucólisis. Al final de la vía glicolítica, PKM2, en su forma tetramérica, se sabe que genera ATP y piruvato, mientras que el LDHB desvía la mayoría del piruvato a la producción y regeneración de lactato de NAD+ en apoyo a la glicólisis continua, un fenómeno descrito para las células T proliferativas [126]. Esto regula la disponibilidad de los intermedios de glucosa, que se redirigen a las vías de la pentosa fosfato y de la serina biosíntesis para la producción de precursores biosintéticos de nucleótidos, fosfolípidos y aminoácidos. Como parte de la vía del fosfato de pentosa, hemos caracterizado el enriquecimiento significativo de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) (2,11 veces), que ramas de la vía de la glicólisis para generar NADPH, ribosa-5fosfato un precursor importante para la síntesis de nucleótidos. Consistente con esto, detectamos el aumento coordinado en la abundancia de enzimas que juega un papel central en la síntesis de purinas y pirimidinas. Más específicamente, IMPDH2 (1,66 veces), una enzima limitante de la tasa en el punto de rama de la biosíntesis de nucleótidos de purina, que conduce a la generación de nucleótidos de guanina, fosforibosil pirofosfato sintetasa 2 (PRPS2) (1,41 veces), cytidine-5-prime-trifosfato sintetasa (CTPS) (1,74 veces) que cataliza la conversión de UTP a CTP y la subunidad grande de ribonucleótido reductasa (RRM1) (1,56 veces). En parralel, observamos el aumento de la abundancia de la fosfoserina aminotransferasa PSAT1 (1,90 veces), una enzima implicada en la biosíntesis de serina, que se ha relacionado con la proliferación celular in vitro. La interfaz host-virus es un aspecto fundamental en la definición de la patogénesis molecular del VIH-1 [127, 128, 129, 130, 131, 132, 133]. De hecho, con su repertorio limitado de proteínas virales, el VIH-1 se basa ampliamente en la maquinaria de las células huésped para su replicación. Varios estudios recientes han capitalizado los recientes avances en las tecnologías ''OMICS'', y han revelado importantes perspectivas en este diálogo molecular finamente afinado [132, 134]. El VIH-1 Tat es esencial para la replicación viral y orquesta la expresión génica del VIH-1. La proteína reguladora viral es conocida por interactuar con una amplia gama de proteínas celulares y modular la expresión del gen celular y la vía de señalización [135, 136]. Nosotros y otros hemos utilizado enfoques a nivel del sistema para investigar la interacción Tat con la maquinaria de las células de acogida, que han caracterizado a HIV-1 Tat como mediador crítico de la interfaz host-viral [137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149]. Aquí, hemos investigado el tráfico de proteínas nucleolares en respuesta a la expresión HIV-1 Tat en células T, con el fin de proporcionar ideas únicas y novedosas sobre el papel de la compartimentación de proteínas por Tat en el ajuste fino de la disponibilidad de proteínas y la función. Hemos desarrollado para este estudio, un modelo celular utilizando Jurkat T-cells expresando firmemente Tat fusionado en su N-ternminal a TAP-tag. Es importante destacar que se han empleado ampliamente para evaluar la patogénesis mediada por Tat utilizando enfoques de todo el sistema y para analizar las vías y funciones de señalización celular clave de las células T [144, 150, 151, 152]. De hecho, hemos encontrado que son especialmente adecuadas para cultivos in vitro prolongados en el medio SILAC y posterior aislamiento de su nucleolo, seguido por el análisis de MS, que requiere hasta 85 millones de células. Fusionamos Tat a la etiqueta TAP para permitir futuras aplicaciones posteriores como purificación de afinidad de Tandem o análisis IP de Cromatina. Importantemente, hemos confirmado que la etiqueta TAP N-terminal no interfirió con la función Tat ni su localización en las células Jurkat, cuando se compara con la no etiquetada-Tat. Aunque se sabe que Tat se acumula en el núcleo y el nucleolo en las células de Jurkat y otras líneas celulares transformadas, en las células T primarias, Tat se describe para acumularse principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Estas diferencias permanecen por caracterizarse, pero podrían estar relacionadas con diferentes niveles de expresión de los factores de transporte en las líneas celulares transformadas versus las células primarias, como se describe recientemente por Kuusisto et al. [39]. Además, Stauber y Pavlakis han sugerido que la localización nucleolar Tat podría ser el resultado de la sobreexpresión Tat [31]. Aquí, hemos seleccionado y empleado una población policlonal de células T Jurkat que expresan Tat en diferentes niveles. Proponemos que esta heterogeneidad en los niveles de expresión Tat podría reflejar la expresión estocástica Ta Utilizando una estrategia proteómica cuantitativa basada en un enfoque organélaro, cuantificamos más de 520 proteínas nucleolares, incluyendo 49 proteínas que muestran un cambio significativo en el pliegue. La medida en que las variaciones inducidas en la abundancia de proteínas nucleolares son biológicamente relevantes y pueden afectar los procesos celulares y/o virales queda por determinar. Sin embargo, la naturaleza biológica de las vías y los complejos macromoleculares afectados nos permiten discutir sus posibles asociaciones con la patogénesis del VIH-1. El VIH-1 Tat se expresa tempranamente después de la integración del genoma del VIH-1 y media el cambio a la fase de producción viral, asociado con la expresión génica proviral robusta, el ensamblaje de proteínas virales y, en última instancia, el desarrollo y liberación de viriones. En este contexto y basado en nuestros resultados, proponemos que Tat podría participar en la configuración del entorno intracelular y el perfil metabólico de De hecho, observamos el enriquecimiento nucleolar distinto de proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica, lo que podría ser indicativo de un aumento en la síntesis proteica. Con la notable exepción de RPL35A depleción nucleolar, proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica estaban en las 20 proteínas nucleolares más enriquecidas (NHP2L1, RLP14, RPL17, RPL27, RPS2, RPL13). Además, este efecto parece ser específico del HIV-1 Tat ya que la inhibición de transcripción por Actinomicina D resultó en el agotamiento total de proteínas ribosómicas en el nucleolo [9]. Además, el análisis proteómico cuantitativo de las células nucleas en adenovirus infectados mostró una leve disminución en proteínas ribosómicas [24] Si esto refleja un cambio en la biogénesis del ribosoma y/o un cambio en la composición de las subunidades ribosomales queda por determinar. Sin embargo, la necesidad adaptada de una producción elevada del ribosoma es intuitiva para un sistema que necesita apoyar la creciente demanda de nueva síntesis de proteínas virales. En parralel, observamos la modulación concordante de las vías que regulan la homeostasis proteica. Observamos la significativa acumulación nucleolar de múltiples chaperonas moleculares incluyendo las HSPs, el complejo TCP-1, y moléculas CANX/CALR y la abundancia nucleolar interrumpida de proteínas pertenecientes a la vía ubiquitina-proteasoma, que controla el suministro de proteínas ribosomales [104, 105]. Estas observaciones apoyan estudios previos que describen la modulación de la actividad proteasómica por Tat, que afectan la expresión, el montaje y la localización de subunidades específicas de los complejos proteasómicos [106, 107, 108, 109, 110, 111, 113]. También observamos el agotamiento concomitante de CASP10 en el nucleolo de Jurkat TAP-Tat. Se ha sugerido que CASP10 podría estar dirigido al nucleolo para inhibir la síntesis proteica [154]. Curiosamente, la presencia y los roles potenciales de las chaperonas moleculares en el nucleolo han sido destacados por Banski et al, quienes explican cómo la red chaperona podría regular la biogénesis ribosómica, la señalización celular y la respuesta al estrés [97, 155]. A medida que la producción viral avanza hacia la fase tardía y aumenta el estrés celular, el enriquecimiento nucleolar de las chaperonas moleculares por Tat no sólo podría permitir el plegado de adequat de proteínas virales recién sintetizadas, sino que también podría promover la tolerancia de las células infectadas al estrés y mantener la viabilidad celular. Coincidentemente, observamos el marcado enriquecimiento nucleolar de enzimas pertenecientes a vías metabólicas incluyendo glicólisis, fosfato de pentosa, nucleótido y aminoácidos vías biosintéticas. Del mismo modo, estas vías se elevan en células T proliferativas o en células cancerosas después de un cambio metabólico a la glicólisis aeróbica, también conocido como el efecto Warburg [156, 157, 158, 159]. Allí, los intermedios de glucosa de la vía de la glicólisis no sólo se comprometen a la producción de energía y se descomponen en piruvato para el ciclo TCA, sino que se redirigen a vías alternativas, incluyendo la vía del fosfato de pentosa, y se utilizan como precursores metabólicos para producir nucleótidos, aminoácidos, acetil CoA y NADPH para la homeostasis redox. De manera consistente, también se observó el enriquecimiento nucleolar concomitante de enzimas pertenecientes a la vía de síntesis de nucleótidos, incluyendo IMPH2, una enzima limitante conocida para controlar el pool de GTP. De igual manera, se observó el enriquecimiento nucleolar de PSAT1, una enzima involucrada en el metabolismo de serina y treonina, que está asociada con la proliferación celular [160]. Colectivamente, proponemos que mediante el control de la homeostas Sin embargo, las enzimas glucolíticas han sido detectadas en las fracciones nuclear y nucleolar mediante análisis proteómicos [8, 161]. Además, las enzimas glucolíticas, como PKM2, LDH, fosfoglicerato cinasa, GAPDH y aldosa, también han sido reportadas para mostrar localización nuclear y unirse al ADN [162]. Más específicamente, PKM2 es conocido por asociarse con el promotor y participar en la regulación de la expresión génica como coactivador transcripcional [163]. HIV-1 Tat ha sido descrito previamente como un inmunoregulador y más específicamente, ha sido reportado tanto para inhibir o promover la señalización TCR [164]. Hemos observado el enriquecimiento nucleolar por Tat de componentes proximales o aguas abajo clave de las vías de señalización de células T, incluyendo ZAP70, ILF3 y STAT3, que juegan un papel crucial en el desarrollo y activación de células T. Anteriormente los habíamos identificado como componentes específicos de células T del nucleolo, y los estudios de IF sugirieron que su asociación con el nucleolo podría ser regulada por condiciones específicas [165]. Nuestros resultados apoyan aún más que Tat podría contribuir a la disregulación de las señales derivadas de TCR y que el nucleolo podría representar un importante enlace espacial para las moléculas de señalización TCR. Observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de componentes clave de las vías de replicación, recombinación y reparación del ADN por Tat. Estos incluyen XRCC5 y XRCC6, HMGA1, APEX1, MCM2-7, SMC2, RFC1 y RFC2, mientras que RFC4 se encontró significativamente agotado. Curiosamente, estos cofactores se han asociado con la eficiencia de la integración del ADN retroviral en el ADN del huésped o la integridad del provirus integrado [166]. Si la abundancia creciente de estos factores dentro del nucleolo podría estar asociada con su participación potencial en la integración y mantenimiento de la integridad del gen provirus, queda por determinar. Los mecanismos de segregación mediada por Tat y compartimentación de proteínas dentro o fuera del nucleolo pueden depender de factores inherentes para cada proteína y la naturaleza de su relación con Tat, ya que el fraccionamiento subcelular combinado con el análisis del WB mostró que el patrón y el grado de redistribución subcelular entre proteínas variaban. Pudimos observar casos en los que Tat regulaba la expresión de proteínas que resultaban en un aumento general de estas proteínas en los compartimentos celulares incluyendo el nucleolo (DDX3, TNPO1). Alternativamente, Tat podía desencadenar la translocación nucleolar de proteínas directamente desde el citoplasma o el nucleoplasma (pRb). Además, observamos proteínas citoplasmáticas redistribuidas tanto al nucleoplasma como al nucleolo sobre la expresión Tat (STAT3, ZAP70 y HSP90). Finalmente, también notamos el agotamiento proteico en la fracción nucleolar acompañado de un aumento en el nucleoplasma (SSRP1). Sigue siendo difícil en esta etapa, apreciar si la acumulación de proteínas específicas resultaría en su activación o inhibición al secuestrarlas de su lugar de acción. Por el contrario, el agotamiento de una proteína del nucleolus podría resultar en la regulación descendente de su actividad en este lugar o podría ser el resultado de su movilización desde su sitio de almacenamiento, el nucleolus, al nucleoplasma o citoplasma donde puede realizar su función. Cabe destacar que identificamos a varios socios conocidos del VIH-1 Tat involucrados en la patogénesis del VIH-1, lo que sugiere que Tat podría modular físicamente su objetivo nucleolar o su reclutamiento a un sitio específico en el nucleoplasma o citoplasma. Tat también podría promover modificaciones post-traducción, lo que podría mediar la focalización de proteínas específicas al nucleolus. Esto se ilustra por las siguientes proteínas enriquecidas, pRb, PP1 y STAT3, para lo que la fosforilación es inducida por Tat. Importantemente, su estado de fosforilación determina su distribución subcelular, proporcionando así un mecanismo Además, nuestros datos indican que las serinas/treoninas quinasas (CK2 a') y fosfatasas (PP1) se enriquecieron significativamente en las fracciones nucleolares de Jurkat TAP-Tat. Estas enzimas representan la mayor parte de la actividad de fosforilación/desfosforilación en el nucleolo y pueden actuar como reguladores del tráfico de proteínas nucleolares. Además, Tat disminuyó significativamente los niveles de SUMO-2 en el nucleolo. Del mismo modo, se sabe que las modificaciones posteriores a la traducción mediadas por SUMO modulan la localización de proteínas nucleolares [104]. Dada la importancia potencial de las modificaciones posteriores a la traducción, incluida la fosforilación en el cambio mediado por Tat de la abundancia de proteínas nucleolares, un enfoque proteomico más específico como el enriquecimiento de fosfopétidos El control de la rotación de proteínas también es un medio importante para modular la abundancia de proteínas nucleolares. Las proteínas ribosómicas son degradadas por la vía Ubiquitina-Proteasoma para asegurar que su abundancia coincida con los niveles de transcripción de rRNA. A la inversa, las proteínas de choque térmico HSP90s las protegen de la degradación. Curiosamente, nuestros datos muestran que la modulación Tat de las proteínas de abundancia asociadas con la vía Ubiquitina-proteasoma y choque térmico. Esto podría contribuir al enriquecimiento observado de proteínas ribosómicas por Tat. Sin embargo, no podemos excluir que la mayor abundancia de proteínas ribosómicas en el nucleolo podría ser el resultado de la prevención mediada por Tat de su exportación al citoplasma. Curiosamente, utilizando un sistema celular diferente, una cepa transgénica de Drosophila melanogaster Tat, Ponti et al, analizaron los efectos de Tat en la biogénesis ribosoma, después de 3 días de tratamiento de choque térmico para inducir la expresión Tat bajo el control del promotor hsp70 [167]. Después de la expresión Tat, observaron un defecto en el procesamiento pre-rRNA asociado con una disminución en el nivel de 80S ribosomas [167]. Sin embargo, los diferentes sistemas celulares empleados combinados con la inducción de choque térmico de 3 días hacen que sus resultados sean difíciles de comparar con los nuestros. Mientras que estudios anteriores a nivel de sistema han monitoreado los efectos de la expresión Tat del VIH-1 en las células T, a nuestro conocimiento, hemos presentado aquí el primer análisis proteómico de la composición dinámica del nucleolus en respuesta a la expresión Tat del VIH Utilizando proteómica cuantitativa, hemos subrayado los cambios en la abundancia de proteínas nucleolares específicas y hemos destacado la reorganización nucleolar extensa y coordinada en respuesta a la expresión constitutiva Tat. Nuestros hallazgos subrayan que Tat que expresa células T exhiben un perfil proteómico nucleolar único, que puede reflejar una estrategia viral para facilitar la progresión a la producción viral robusta. Importantemente, hemos notado la relación funcional de proteínas nucleolares de nuestro conjunto de datos con la patogénesis VIH-1 y el Tat VIH-1 en particular. Esto aumenta aún más nuestra confianza en nuestra estrategia experimental y sugiere un papel para Tat en el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares. Finalmente, nuestro estudio proporciona nuevas ideas sobre la importancia de Tat en la conversación cruzada entre funciones nucleolares y patogénesis viral. También hemos identificado cambios en la abundancia de proteínas nucleolares que no estaban previamente asociados con la patogénesis del VIH-1, incluyendo proteínas asociadas a vías metabólicas, que proporcionan nuevos objetivos potenciales y vías celulares para la intervención terapéutica.Células T Jurkat, clon E6.1 (ATCC), Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP se mantuvieron en el medio RPMI-1640 complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (Gibco, aprobado por la UE), y antibióticos. Células Phoenix-GP (G.P. Nolan; www.stanford.edu/ group/nolan/), se mantuvieron en el medio DMEM complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (GIBCO, aprobado por la UE). La secuencia de HIV-1 Tat (VIH-1 HXB2, 86 aminoácidos) fue subclonada en el vector pENTR 2B (Invitrogen, A10463). Usando la tecnología Gateway (Invitrogen), introdujimos la secuencia HIV-1 Tat en el plásmido pCeMM-NTAP(GS)-Gw [168]. Las células Fénix (G.P. Nolan; www.stanford.edu/group/nolan/), fueron transfectadas usando Fugene 6 (Roche) con 5 mg del plásmido NTAP-Tat o NTAP y 3 mg del pMDG-VSVG. Los sobrenadantes virales fueron recolectados después de 48 h, filtrados y utilizados para transducir las líneas celulares de Jurkat. La construcción se denomina NTAP-Ta Utilizando la entrega de genes retrovirales, transferimos de forma estable células Jurkat (clone E6.1 (ATCC)). Los clones positivos llamados Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron ordenados para enriquecer la población de células que expresaban GFP usando el clasificador de células BC MoFlo XDP (Beckman Coulter). Las fracciones subcelulares (10 mg) fueron resueltas por SDS-PAGE y transferidas a membranas BioTrace PVDF (Pall corporation). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: a-Tubulina (Sc 5286), C23 (Sc 6013), y Fibrilarina (Sc 25397) de Santa Cruz Biotechnology, y PARP (AM30) de Calbiochem, Ratón anti-ZAP 70 (05-253, Millipore), Ratón anti-STAT3 (06-596, Millipore), Ratón anti-ILF3 (ab92355, Abcam), Ratón anti-HSP90 beta (ab32568, Abcam), Ratón anti-ADAR1 (ab88574, Abcam), Ratón anti-HDAC1 (ab19845, Abcam), Ratón anti-SSRP1 (ab21584, Abcam) conejo anti-BOP1 (ab86982, Abcam), Ratón anti-KpNB1 (ab10303, Abcam), Ra Para el análisis SILAC-RPMI R0K0 y SILAC-RPMI R6K6 (Células Dundidas) se utilizó un medio con un 10% de FBS dializado (GIBCO, 26400-036); las células Jurkat que expresaban NTAP-Tat y NTAP fueron transitadas en serie y cultivadas durante cinco duplicados para asegurar la incorporación completa de los aminoácidos marcados; la viabilidad de las células se verificó con Trypan Blue (0,4% solución, SIGMA) y posteriormente se confirmó mediante tinción IP y análisis FACS; las células se mezclaron a la relación 1:1 para obtener 140610 6 células; los nucleoli fueron aislados de la población celular mixta como se describió previamente en Jarboui et al., [165]. Los extractos nucleolares (100 mg) fueron resuspendidos en bicarbonato de amonio de 50 mM y en solución de tripsina digerida como se describió previamente en Jarboui y col. [165]. La muestra se realizó en un espectrómetro de masa termoscientifico LTQ Orbitrap XL conectado a un sistema cromatógrafo NANO LC.1DPLUS que incorporaba una muestra automática. La muestra fue cargada en una columna Biobasic C18 PicofritTM (100 mm de longitud, 75 mm ID) y fue separada por un gradiente de acetonitrilo en aumento, utilizando un gradiente de 142 min de fase inversa (0-40% de acetonitrilo durante 110 min) a un caudal de 300 nL min-1. El espectrómetro de masa fue operado en modo iónico positivo con una temperatura capilar de 200uC, una tensión capilar de 46V, una tensión de lente de tubo de 140V y con un potencial de 1800V aplicada al frit. Todos los datos fueron adquiridos con el espectrómetro de masa que funciona en modo de conmutación automática dependiente de datos. Se realizó una exploración MS de alta resolución utilizando el Orbitrap para seleccionar los 5 iones más intensos antes del análisis MS/MS utilizando la trampa Ion. La eficiencia de incorporación de aminoácidos etiquetados fue determinada mediante el análisis de los péptidos identificados en nucleoli aislados de la población celular mantenida en el medio 'Heavy' como se describe en [169]. Nuestro análisis mostró que teníamos una eficiencia de incorporación.95% (datos no mostrados). Los espectros MS/MS fueron buscados para la identificación y cuantificación de los péptidos utilizando el software MaxQuant [170] (versión 1.1.1.36), la Base de Datos del IPI Humano (versión 3.83) y el motor de búsqueda Andrómeda asociado a MaxQuant [171]. Se utilizaron parámetros estándar para MaxQuant con el Acetil (término N de Proteína) como modificación variable y Carbamidometilo (Cys) como modificación fija, se permitieron 2 escisiónes perdidas, excepto que se prohibió el filtrado de aminoácidos etiquetados. La desviación de masa inicial de los iones precursores y fragmentos fue de 7 ppm y 0,5 Da, respectivamente. Cada relación proteica fue calculada como promedio ponderado de intensidad de los coeficientes de péptidos individuales. Las proteínas fueron identificadas con el mínimo de un péptido con una tasa La ontología genética, la vía KEGG y los términos Pfam se extrajeron de entradas UNIPROT utilizando Perseo, un software del paquete de análisis de datos MaxQuant (http://www.maxquant.org ), y las herramientas de la suite ToppGene [54]. El Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron transfectados utilizando el sistema de electroporación Amaxa (biosistema Amaxa) con el pGL3 (pGL3-LTR) (Promega) como recomendado por Amaxa Biosystem. Los ensayos de doble luciferasa (Promega) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de Luciferasa se midió y normalizó contra la cantidad total de proteínas cuantificada por el kit de cuantificación de proteínas BCA (Pierce, Thermo Scientific). Para preservar Las células se fijaron en un 2% PFA durante 10 minutos en RT, permeabilizaron en un 0,5% Triton X-100 durante 15 minutos en RT y se bloquearon con 5% FCS. Las células se incubaron con el anticuerpo Tat VIH-1 de conejo (ab43014, Abcam) seguido por el anticuerpo secundario anti-Rabbit alexa fluor 647 (A-21246, Invitrogen). Las células se les permitió unirse a Cell-Tak (BD) recubierto de Diapositivas Silanizadas (DaoCytomation), y manchado con DAPI. Las imágenes se capturaron con un Microscopio Confocal Carl Zeiss equipado con un objetivo DIC de aceite de Plan-Apocromat 63X/14. El archivo de datos RAW proteómicos del análisis de espectrometría de masas se depositó en el repositorio Tranche(http El archivo se puede acceder y descargar utilizando la siguiente clave de hash:(R3O5SV5Z6HvWqrBNDhp21tXFetluDWYxvwMIfU-h6e1kMgarauCSq4dlNcxeUvFOHDEzLeDcg4X5Y8reSb6-MUA6wM1kIAAAAAAB/w = ). Materiales y Métodos S1 Descripción de los métodos empleados para examinar el ciclo celular, la viabilidad celular y el análisis de proliferación celular. (DOCX)

¿Cuánto dura la proteína nuclear PARP-1?

Tráfico de proteínas nucleolares en respuesta al VIH-1 Tat: Rewiring the Nucleolushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499507/SHA: efa871aeaf22cbd0ce30e8bd1cb3d1afff2a98f9Autores: Jarboui, Mohamed Ali; Bidoia, Carlo; Woods, Elena; Roe, Barbara; Wynne, Kieran; Elia, Giuliano; Hall, William W.; Gautier, Virginie W.Fecha: 2012-11-15DOI: 10.1371/journal.pone.0048702Licencia: cc-byAbstract: La proteína Tat transactivante es una proteína reguladora viral esencial para la replicación del VIH-1. El nucleolo, un compartimento subnuclear altamente dinámico y estructurado sin membrana, es el sitio de ARNr y biogénesis ribosoma y está involucrado en numerosas funciones celulares incluyendo la regulación transcripcional, el control del ciclo celular y la infección viral. Importantemente, el tráfico nucleolar transitorio tanto de Tat como de las transcripciones virales del VIH-1 son críticos en la replicación del VIH-1, sin embargo, el(los) papel(es) del nucleolo en la replicación del VIH-1 sigue sin estar claro. Para entender mejor cómo la interacción de Tat con la maquinaria nucleolar contribuye a la patogénesis del VIH-1, investigamos los cambios cuantitativos en la composición del proteoma nucleolar de las células T de Jurkat que expresan establemente el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta TAP. Utilizando un enfoque proteómico organélaro basado en espectrometría de masas, junto con el etiquetado de isótopos estables en cultivo celular (SILAC), cuantificamos 520 proteínas, incluyendo 49 proteínas que muestran cambios significativos en la abundancia de nucleolos de células T de Jurkat sobre la expresión Tat. Numerosas proteínas que exhiben un cambio de pliegue fueron interactuadores Tat bien caracterizados y/o conocidos por ser críticos para la replicación del VIH-1. Esto sugiere que el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares por Tat proporcionan una capa adicional de control para regular la maquinaria celular involucrada en la patogénesis del VIH-1. El análisis del camino y la reconstrucción de la red revelaron que la expresión Tat resultó específicamente en el enriquecimiento nucleolar de proteínas que participan colectivamente en biogénesis ribosomal, homeostasis de proteínas, vías metabólicas incluyendo glucolítico, fosfato de pentosa, nucleótidos y aminoácidos vías biosintéticas, respuesta al estrés, vías de señalización de células T e integridad del genoma. Presentamos aquí el primer perfil diferencial del proteoma nucleolar de células T que expresan el HIV-1 Tat. Discutimos cómo estas proteínas participan colectivamente en redes interconectadas que convergen para adaptar las actividades dinámicas del nucleolus, que favorecen las actividades biosintéticas del huésped y pueden contribuir a crear un entorno celular que apoye la producción robusta del HIV-1. Texto: El nucleolus es un compartimento subnuclear altamente ordenado organizado alrededor de loci genéticos llamados regiones organizadoras nucleolares (NORs) formado por grupos de cientos de repeticiones de genes rDNA organizadas en repetición tándem cabeza a cola [1, 2]. Organelo sin membrana descrito originalmente como la ''Fábrica Ribosoma'', el nucleolus está dedicado a la transcripción de rDNA dirigida por ARN-polimerasa-I, procesamiento de rARN mediado por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (SORNPs) y conjunto ribosoma. La biogénesis del ribosoma es esencial para la síntesis de proteínas y la viabilidad celular [2] y, en última instancia, resulta en las subunidades ribosomales grandes (60S) y pequeñas (40S), que posteriormente se exportan al citoplasma. Este proceso celular fundamental, al que la célula dedica la mayor parte de sus recursos energéticos, está estrictamente regulado para adaptarse a los cambios dinámicos en la proliferación celular, la tasa de crecimiento y las actividades metabólicas [3]. El nucleolus es el sitio de procesamiento adicional de ARN, incluyendo la exportación y degradación de ARNm, la maduración de pequeños PNNR nucleares ricos en uridina (U snRNPs), que forman el núcleo del spliceosoma, biogénesis de ARNt y microARNs (miRNAs) [4]. El nucleolus también está involucrado en otros procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular, procesos oncogénicos, respuestas de estrés celular y traducción [4]. El concepto de nucleolo multifuncional y altamente dinámico ha sido corroborado por varios estudios que combinan enfoques proteómicos organelares y espectrometría cuantitativa de masas, y describen miles de proteínas que transitan por el nucleolo en respuesta a diversas condiciones metabólicas, estrés y ambientes celulares [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Colectivamente, los estudios mencionados representan hitos en la comprensión de la complejidad funcional del nucleolo, y demostraron que las proteínas nucleolares están en intercambio continuo con otros compartimentos nucleares y celulares en respuesta a determinadas condiciones celulares. Los estudios proteómicos que analizan los nucleoli de las células infectadas por el virus sincitial respiratorio humano (HRSV), el virus influenza A, el virus de la bronquitis infecciosa por coronavirus aviar (IBV) o el adenovirus destacaron cómo los virus pueden alterar de forma distintiva la distribución de proteínas nucleolares [2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Curiosamente, tanto las proteínas reguladoras del VIH-1 Tat como Rev localizan al nucleoplasma y al nucleolus. Ambas secuencias abarcan una señal de localización nucleolar (NoLS) que se superpone con su señal de localización nuclear (NLS), que rige su localización nucleolar [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. Además, Tat y Rev interactúan con el antígeno nucleolar B23 Sin embargo, un estudio reciente describió que en contraste con las células T de Jurkat y otras líneas celulares transformadas donde Tat está asociado con el núcleo y el nucleolo, en las células T primarias Tat se acumula principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Mientras que la regulación de su importación y/o exportación nuclear activa, como mediada por la familia de la carioferina/importación, se han descrito bien, los mecanismos que distribuyen Tat y Rev entre el citoplasma, el nucleoplasma y el nucleolo siguen siendo elusivos [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48]. Importantemente, dos estudios importantes de Machienzi y otros han revelado importantes vínculos funcionales entre la replicación del VIH-1 y el nucleo En primer lugar, podrían inhibir la replicación del VIH-1 y la función de transactivación Tat empleando un señuelo TAR dirigido específicamente al nucleolo. Además, utilizando un enfoque similar, con una ribozima anti-VIH-1 de cabeza martillo fusionada al ARN nucleolar pequeño U16 y por lo tanto dirigida al nucleolo, podrían suprimir dramáticamente la replicación del VIH-1. Colectivamente, estos hallazgos sugieren fuertemente que las transcripciones del VIH-1 y el tráfico nucleolar Tat son críticos para la replicación del VIH-1. Sin embargo, la naturaleza de estas contribuciones aún no se ha aclarado. En este informe, analizamos sistemáticamente las perturbaciones del proteoma nucleolar que ocurren en las células T de Jurkat expresando constitutivamente el VIH-1 Tat, utilizando un enfoque de espectrometría cuantitativa de masas. Después de la anotación detallada de los cambios cuantitativos de abundancia en la composición de la proteína nucleolar sobre la expresión Tat, nos centramos en los complejos celulares afectados por Tat y las vías de señalización asociadas con la biogénesis ribosoma, el spliceosoma, las chaperonas moleculares, la replicación y reparación del ADN y el metabolismo, y discutimos su posible implicación en la patogénesis del VIH-1. En este estudio, investigamos los cambios cuantitativos en el proteoma nucleolar de las células Jurkat T expresando constitutivamente el VIH-1 Tat (86aa) frente a su contraparte Tat negativo, utilizando el etiquetado estable de isótopos con aminoácidos en la tecnología de cultivo celular (SILAC), seguido por la espectrometría de masas en tándem ESI e implementamos el enfoque experimental descrito en la Figura 1A. En primer lugar, mediante la entrega de genes retrovirales, transferimos el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta de purificación de afinidad tándem (TAP) (constituido por dos proteínas G y un péptido de unión a estreptavidina) o TAP solo (vector de control) en el clon de células T de leucemia Jurkat E6-1 y clasificamos las células transducidas (GFP positivo) por FACS. Esto resultó en una población altamente enriquecida de células transducidas policlonales que presentaban diferentes niveles de expresión del transgén (Figura 1B). La funcionalidad del TAP-Tat fue confirmada mediante la transfección de las células TAP-Tat y TAP con un vector de genes reportero de luciferasa bajo el control del HIV-1 LTR (pGL3-LTR) [36]. Para abordar la funcionalidad de Tat fusionado a TAP, comparamos Jurkat TAP-Tat con Jurkat-tat, una línea celular que expresaba establemente Tat [51]. Ambas líneas celulares mostraron una actividad LTR del VIH-1 comparable después de la transfección con pGL3-LTR (Figura S1 ). A continuación, la expresión Tat y la localización subcelular fueron verificadas mediante fraccionamiento subcelular seguido por el análisis del WB (Figura 1E ). TAP-Tat mostró una localización nuclear/nucleolar prominente, pero también se pudo detectar en el citoplasma. Estas observaciones fueron además validadas mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 1E ). A continuación se comparó la tasa de crecimiento y proliferación de las líneas celulares de Jurkat TAP y TAP-Tat (Materiales y Métodos S1), que eran equivalentes (Figura S4A ). Del mismo modo, el análisis FACS confirmó que las poblaciones relativas en G1, S y G2/M eran similares para las células de Jurkat TAP-Tat y TAP (Figura S4B ). Se etiquetaron las células de Jurkat TAP-Tat y Jurkat TAP con isótopo ligero (R0K0) y pesado (R6K6) que contenían arginina y lisina, respectivamente. Después de cinco pasajes en su respectivo medio SILAC, se recolectaron 85 millones de células de cada cultivo, se agruparon y se aislaron sus nucleolis como se describió previamente (Figura 1A ) [52] Para evaluar la calidad de nuestro procedimiento de fraccionamiento, se investigó el enriquecimiento específico de antígenos nucleolares conocidos mediante el análisis Western Blot (Figura 1D). Se encontró que la nucleolina (110 kDa) y la fibrilarina (FBL) (34 kDa), dos proteínas nucleolares principales conocidas por localizar al componente granular del nucleolo, estaban muy enriquecidas en la fracción nucleolar mixta. Se observó que la nucleolina se distribuía igualmente entre las fracciones nuclear y citoplasmática. Este patrón de distribución de nucleolina parece ser específico para las células T de Jurkat, como se muestra anteriormente [52, 53]. La proteína nuclear PARP-1 (Poly ADPribose polimerasa 1) (113 kDa) estaba presente en la fracción nuclear y nucleoplasmática, pero se desplegó en la fracción La alfa-tubulina (50 kDa) fue altamente abundante en la fracción citoplasmática y débilmente detectada en las fracciones nucleares. Colectivamente, estos resultados confirmaron que nuestros métodos produjeron una fracción nucleolar altamente enriquecida sin contaminación cruzada significativa. Posteriormente, la mezcla de proteína nucleolar fue tripsindigerida y los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas. El análisis proteomico cuantitativo comparativo se realizó utilizando MaxQuant para analizar las proporciones en isótopos para cada péptido identificado. Se cuantificó un total de 2427 péptidos, representando 520 proteínas nucleolares cuantificadas. La lista completa anotada de proteínas nucleolares cuantificadas está disponible en la Tabla S1 y los datos brutos del análisis de espectrometría de masas se depositaron en la base de datos de repositorios Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/), a la que se puede acceder utilizando las claves de hash descritas en materiales y métodos. Anotamos las proteínas cuantificadas utilizando las herramientas ToppGene Suite [54] y extrajimos las anotaciones de Gene Onthology (GO) e InterPro [55]. El análisis de los procesos biológicos GO (Figura 1F ) reveló que los procesos biológicos mejor representados incluían la transcripción (24%), el procesamiento de ARN (23%), el proceso del ciclo celular (13%) y la organización cromosómica (15%), que refleja las funciones asociadas nucleolares y es comparable a nuestra caracterización anterior del proteoma nucleo El análisis de distribución subcelular (Figura 1F ) reveló que nuestro conjunto de datos contenía proteínas conocidas por localizarse en el nucleolo (49%), en el núcleo (24%) mientras que el 15% de las proteínas estaban descritas previamente para residir exclusivamente en el citoplasma. La distribución subcelular fue similar a nuestro análisis anterior del proteoma nucleolar de células T de Jurkat [52]. Tabla S1. La distribución de las relaciones proteicas se representan en la Figura 1G como log 2 (cambio de abundancia). Las relaciones SILAC indican cambios en la abundancia proteica en la fracción nucleolar de las células TAP de Jurkat en comparación con las células TAP de Jurkat. La distribución de las proteínas cuantificadas siguió una distribución gaussiana (Figura 1G ). Un total de 49 proteínas nucleolares exhibieron un cambio significativo de 1,5 veces o mayor Las células no mostraron cambios en el contenido en estado estacionario de algunos de los principales y abundantes componentes del nucleolo, incluyendo nucleofosfmina (NPM1/ B23), C23, FBL, proteína nucleolar P120 (NOL1) y proteína nucleolar 5A (NOL5A). Las distintas proporciones de cambios proteicos sobre la expresión Tat podrían reflejar la reorganización nucleolar específica y las actividades alteradas del nucleolo. Realizamos el análisis del WB para validar los resultados basados en SILAC obtenidos por nuestro enfoque proteómico cuantitativo (Figura 2 ). 15 proteínas seleccionadas mostraron intensidad diferencial en las fracciones nucleolares sobre la expresión Tat, incluyendo 9 enriquecidos (HSP90b, STAT3, pRb, CK2a, CK2a', HSP90a, Transportin, ZAP70, DDX3), y 3 agotados (ILF3, BOP1 y SSRP1) proteínas. Además, también probamos por el análisis WB, abundancia de proteínas no afectada por la expresión Tat (Importin beta, FBL, B23, C23). Estos resultados destacan la concordancia en la tendencia de las proporciones correspondientes de SILAC, a pesar de algunas diferencias en los rangos cuantitativos. Cabe destacar que, usando WB, pudimos observar un cambio de intensidad para la proteína con un cambio de pliegue SILAC tan bajo como 1,25 veces. Por un lado, el umbral de los cambios en la abundancia de proteínas se puede determinar estadísticamente y luego destacar los cambios en la abundancia más grandes como se ilustra en la Tabla 1. Alternativamente, el enriquecimiento o agotamiento coordinado de la mayoría de las proteínas pertenecientes a un complejo o vía celular distinto permitiría la definición de un grupo de proteínas de interés y potencial significación. Por lo tanto, nos centramos en proteínas individuales enriquecidas o agotadas con actividades asociadas con la patogénesis molecular del VIH-1 o Tat, y en modificaciones agrupadas que afectan vías de señalización celular enteras y complejos macromoleculares. Inicialmente nos centramos en las proteínas de señalización que interactúan con Tat y/o la patogénesis molecular asociada del VIH-1 y cuya abundancia en el nucleolo fue modulada por la expresión Tat. Fosfo-proteína fosfatasas. Fosfo-proteína fosfatasa PP1 y PP2A son esenciales Es importante destacar que el PP1 representa el 80% de la actividad de la fosfatasa Ser/Thr dentro del nucleolo. En nuestro estudio, el PP1 fue potencialmente enriquecido por 1,52 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat, lo que apoya estudios previos que describen el objetivo nuclear y nucleolar de PP1a por el HIV-1 Tat y cómo PP1 aumenta la regulación de la transcripción del VIH-1 [58, 59, 60, 61, 62]. El PP1 c también fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro [63]. Curiosamente, la asociación Tat con los promotores de la subunidad PP2A resulta en la sobreexpresión y regulación de la actividad PP2A en linfocitos [64, 65]. Además, PP2A contribuye a la regulación de la transcripción y replicación del VIH-1 [61, 66]. Retinoblastoma Protein. El gen supresor tumoral pRb protein mostró un cambio de 1,4 veces en el nucleolus sobre la expresión Tat [67]. Además, el análisis WB confirmó la translocación distinta del pRb del nucleoplasma al nucleolus por Tat (Figura 2 ). Dependiendo del tipo de célula, pRb puede ser hiperfosforilado o hipofosforilado sobre la expresión Tat y puede regular negativamente o positivamente la transcripción mediada por Tat respectivamente [68, 69, 70]. Curiosamente, la hiperfosforilación de los desencadenantes del pRB en su translocación en el nucleolo [71]. La fosforilación del pRB también se asocia con un aumento de la biogénesis ribosómica y el crecimiento celular [72]. STAT3. El transductor de señal de factor de transcripción y activador de la transcripción 3 (STAT3) se enriqueció significativamente (1,86 veces) en la fracción nucleolar por la expresión constitutiva Tat. Además, el análisis WB indicó que la expresión Tat podría promover la relocalización del STAT3 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento distinto en el nucleolo (Figura 2). Curiosamente, estudios anteriores han demostrado la activación mediada por Tat de la señalización STAT3, como lo demuestra su estado de fosforilación [73]. Curiosamente, la fosforilación STAT3 indujo la dimerización de la proteína después de su translocación al núcleo [74]. YBX1. YBX1, la proteína multifuncional de unión al ADN/ARN fue enriquecida por 1,38 veces en el nucleolo de las células de Jurkat sobre la expresión Tat. Curiosamente, YBX1 interactúa con Tat y TAR y modula la expresión génica del VIH-1 [63, 75]. ZAP70. La proteína tirosina cinasa ZAP70 (proteína quinasa asociada a la cadena Zeta 70) fue enriquecida por 1,24 veces en el nucleolo de las células de Jurkat expresando Tat [76]. Además, el análisis del WB reveló que la expresión Tat podría promover la relocalización del ZAP70 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento La proteína de matriz nuclear interna, Matrin 3 (MATR3), presentó un cambio de 1,39 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat. Se localiza en el nucleolasmo con un patrón difuso excluido de los nucleolos [77]. La matrin 3 ha sido identificada como parte del nucleoloma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Dos estudios recientes han descrito a la matrin 3 como parte de complejos de ribonucleoproteínas, incluyendo también el VIH-1 Rev y (elemento de respuesta Rev) RRE que contiene ARN VIH-1, y promoviendo la regulación post-transcripción del VIH-1 [78, 79, 80]. CASP10. La molécula pro-apotótica de señalización, Caspasa 10 (CASP10), se agotó significativamente de las células nucleolus de Jurkat-Tat (0,82 veces) [81]. Importantemente, la expresión Tat desregula la expresión y actividad de CASP10 en las células Jurkat [82]. ADAR1. Adenosina deaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR1), que convierte las adenosinas en inosinas en ARN de doble cadena, se agotó significativamente del nucleolus de las células Jurkat-Tat (0,78 veces). Curiosamente, ADAR1 sobreexpresión regula la replicación del VIH-1 a través de un mecanismo de edición del ARN [83, 84, 85, 86, 87, 88]. Además, ADAR1 pertenece al interactoroma nuclear in vitro Para subrayar las relaciones estructurales y funcionales de las proteínas nucleolares afectadas por el VIH-1 Tat, construimos una representación en red de nuestro conjunto de datos. Utilizamos la versión 2.6.3 de Cytoscape [89] y utilizando el plugin MiMI [90] para mapear interacciones previamente caracterizadas, extraídas de bases de datos de interacción de proteínas (BIND, DIP, HPRD, CCSB, Reactome, IntAct y MINT), lo que resultó en una red altamente densa y conectada que incluía 416 proteínas (nodos) de las 536 proteínas, unidas por 5060 interacciones no dirigidas (borde) (Figura 3A). El análisis de centralidad reveló un umbral de 23.7 interacciones por proteína. El análisis de topología utilizando el plugin CentiScaPe [91] mostró que la distribución del grado de nodo sigue una ley de energía (Figura S5 Es importante destacar que cuando analizamos la distribución del coeficiente de agrupamiento (Figura S6 ) encontramos que la red está organizada en una arquitectura jerárquica [92], donde los nodos conectados forman parte de áreas altamente agrupadas mantenidas por pocos hubs organizados alrededor del HIV-1 Tat. Además, el análisis de la conexión en grados nodos de nuestra red identificó al HIV-1 Tat como la proteína más conectada (Figura S6 ). Específicamente, el análisis de topología indicó que los valores para las centrales Tat eran los más altos (grado de nodo, estrés, radialidad, cercanía, entreess y centroides), caracterizando a Tat como la proteína principal del hub de la red nucleolar. De hecho, un total de 146 proteínas han sido descritas previamente para interactuar con Tat (Figura 3B, Tabla S2 ). Estas proteínas están involucradas En paralelo, caracterizamos la magnitud de los cambios de abundancia proteica relacionados observados en distintas vías celulares (Figura 4). Biogénesis ribosomal. Inicialmente nos centramos en la biogénesis ribosoma, función primaria del nucleolo. Pudimos observar un aumento general y coordinado en la abundancia de proteínas ribosomales en el nucleolo por expresión Tat (Figura 4 ). Mientras algunas proteínas ribosomales permanecían inalteradas, Tat causó la acumulación nucleolar de varias proteínas ribosomas grandes y pequeñas distintas, excepto RPL35A, para las cuales la expresión Tat causó una marcada disminución en el nivel nucleolar (0,29 veces). Asimismo, varias proteínas involucradas en el procesamiento de ARNr exhibieron un aumento general en la acumulación nucleolar sobre la expresión Tat. Estos incluyen a los miembros canónicos humanos de la familia L7ae junto con los miembros que participan en la Caja C/D, H/ACA y U3 snoRNPs (Figura 4). Por el contrario, BOP1, un componente del complejo PeBoW (Pescadillo Bop1 WDR12) esencial para la maduración de la subunidad ribosómica grande, se agotó significativamente del nucleolo de las células TAP-Tat Jurkat (0,81 veces) y esto fue confirmado por el análisis WB (Figura 2 ) [93]. Sin embargo, los otros componentes complejos PeBoW, Pes1 (0,94 veces) y WDR12 (1,1 veces), no fueron afectados por la expresión Tat. Se identificaron y cuantificaron en nuestro conjunto de datos 55 proteínas de las 108 proteínas spliceosomal conocidas [94]. Estas proteínas incluyen las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares U1, U2 y U5, Sm D1, D2, D3, F y B, y las heterogéneas ribonucleoproteínas nucleares. Nuestros datos sugieren un aumento distinto en la abundancia de proteínas específicas complejas del spliceosoma tras la expresión de HIV-1 Tat en células T de Jurkat (Figuras 3 y 4). Las únicas tres proteínas que se agotaron significativamente del nucleolo tras la expresión del HIV-1 Tat fueron RBMX (0,89 veces), HNRNPA2B1 (0,84 veces) y SNRPA (0,81 veces). Varias investigaciones mostraron alteración de la expresión en los factores de empalme celular en células infectadas por HIV-1 [95, 96] Hemos identificado varias chaperonas moleculares, cochaperonas y otros factores involucrados en la proteostasis para ser altamente enriquecidos en el nucleolo de las células T sobre la expresión Tat (Figuras 3 y 4), muchos de los cuales fueron previamente caracterizados como parte del interactoroma nuclear Tat [63]. Varias proteínas de choque térmico incluyendo DNAJs, específicas HSP90, HSP70 y HSP40 isoformas y sus cofactores se enriquecieron distintivamente en la fracción nucleolar de las células Jurkat expresando Tat (Figura 4 ). Como lo muestra WB, mientras que HSP90a y b son principalmente citoplasmáticas, la expresión Tat desencadena su relocalización al núcleo y nucleolus, corroborando nuestro enfoque cuantitativo proteómico (Figura 2). Del mismo modo, el choque térmico puede hacer que el HSP90 y el HSP70 se reubiquen en el nucleolo [97, 98, 99, 100, 101]. En un estudio reciente, el grupo de Fassati ha demostrado que el HSP90 está presente en el promotor del VIH-1 y puede regular directamente la expresión génica viral [102]. También observamos el aumento coordinado de la abundancia de la clase I (GroEL y GroES) y la clase II (chaperonina que contiene TCP-1 (CTT)) moléculas de chaperonina (Figuras 3 y 4) sobre la expresión Tat. Vía proteasómica de la ubiquitina. La vía proteasómica es el principal sistema proteolítico de células eucariotas [103]. Es importante destacar que la vía ubiquitina-proteasoma nuclear controla el suministro de proteínas ribosomales y es importante para la biogénesis ribosoma [104, 105]. El proteasoma 26S está compuesto por la partícula núcleo 20S (CP) y la partícula reguladora 19S (RP). Alternativamente, CP puede asociarse con el 11S RP para formar el inmunoproteasoma. Todas las proteínas cuantificadas en nuestro estudio son parte del complejo regulador 19S e incluyen PSMD2 (1,5 veces), PSMD3 (1,32 veces), PSMD11 (1,25 veces) y PSMD13 (0,72 veces), el único componente proteasoma significativamente agotado del nucleolo en presencia de Tat (Figura 4). Curiosamente, Tat interactúa con subunidades distintas del sistema proteasoma, incluyendo las subunidades 19S, 20S y 11S. Las consecuencias de estas interacciones incluyen la competencia de Tat con 11S RP o 19S RP para la unión al 20S CP, que resultó en la inhibición de la actividad de la peptidasa 20S [106, 107, 108, 109, 110, 111]. Además, Tat demostró modificar la composición proteosoma y la actividad, que afecta a la generación de antígenos péptidos reconocidos por linfocitos T citotóxicos [112]. Importantemente, un estudio reciente demostró que en ausencia de Tat, los componentes proteosomas están asociados al promotor del VIH-1 y la actividad proteosoma limita la transcripción [113]. La adición de Tat promovió la disociación de la subunidad 19S del proteasoma 20S, seguido por el enriquecimiento distintivo del complejo similar a 19S en extractos nucleares junto con el reclutamiento mediado por Tat de las subunidades 19S para el promotor del VIH-1, lo que facilitó su elongación transcripcional [113]. También cuantificamos UBA1 (1,36 veces), la ubiquitina-proteína ligasa UHRF1 (1,13 veces), UBC (1 veces) y dos Ubiquitinspecific-peptidases, USP30 (1,28 veces) y USP20 (0,06 veces) (Figura 4). Replicación y reparación del ADN. Tras la expresión del HIV-1 Tat, observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de varios factores celulares asociados con la replicación del ADN y las vías de reparación (Figura 4). Tat indujo el enriquecimiento coordinado del complejo MCM2-7 de mantenimiento cromosómico en miniatura (de 1.23-a 3,30 veces, respectivamente) [114]. MCM7, 6 y 3 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. El mantenimiento estructural de los cromosomas 2, SMC2, fue enriquecido (1,35 veces) en la fracción nucleolar por expresión Tat. SMC2 fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Mientras que el factor de replicación C1 (RFC1) y RFC2 (1,31 y 1,28 veces respectivamente) mostró un cambio de pliegue incrementado y RFC5/3 no se vieron afectados, RFC4 se redujo gravemente (0,69 veces) de la fracción nucleolar sobre la expresión Tat [115]. El RFC1 y RFC2 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Tat indujo el enriquecimiento de XRCC6 (1,27 veces) y XRCC5 (1,36 veces) en el nucleolo, que están involucrados en la reparación de la unión final del ADN no-homologoso (NHEJ) [116]. XRCC6 se asocia con complejos de preintegración viral que contienen HIV-1 Integrase y también interactúan con Tat y TAR [117, 118, 119]. Además, en una pantalla basada en ribozyme, el derribo del XRCC5 (Ku80) disminuyó tanto la integración retroviral como la transcripción Tatmediated [120]. Como parte de la reparación de la escisión base (BER), hemos identificado una importante endonucleasa apurínico/apirimidinica 1 (APEX1) (1,29 veces). Importantemente, en una pantalla de siRNA dirigida a los factores de reparación del ADN, se encontró que la reducción de APEX1 inhibe la infección por VIH-1 por más de 60% [121]. La proteína del grupo de alta movilidad (HMG) HMGA1 (1,30 veces), fue enriquecida en el nucleolo después de la expresión Tat [122]. HMGA1 interactúa con la integración del VIH-1 y forma parte del complejo de preintegración del VIH-1 [123, 124]. Importantemente, HMGA1 ha sido identificada en una pantalla proteómica, como un cofactor celular que interactúa con el VIH-1 59líder [125]. Metabolismo. Nuestros datos proteómicos sugieren que Tat induce perturbaciones en la glucólisis, la vía del fosfato pentosa y la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos (Figura 4 y Figura S7 ). En particular, en las células T que expresan Tat, detectamos cambios coordinados en la abundancia de proteínas no conocidas previamente que se asocian con la patogénesis del Tat, que revelaron conexiones inesperadas con la glicólisis y la vía del fosfato pentosa, incluyendo las siguientes enzimas glicólicas, lactato deshidrogenasa B (LDHB) (1,37 veces), la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1,17 veces) y la mutasa del ácido fosfoglicérico (PGAM1) (0,89 veces) (Figura 4 y Figura S En resumen, el GPI cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Posteriormente, el PFKP cataliza la conversión irreversible de fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato y es una enzima reguladora clave de la glucólisis. Al final de la vía glicolítica, PKM2, en su forma tetramérica, se sabe que genera ATP y piruvato, mientras que el LDHB desvía la mayoría del piruvato a la producción y regeneración de lactato de NAD+ en apoyo a la glicólisis continua, un fenómeno descrito para las células T proliferativas [126]. Esto regula la disponibilidad de los intermedios de glucosa, que se redirigen a las vías de la pentosa fosfato y de la serina biosíntesis para la producción de precursores biosintéticos de nucleótidos, fosfolípidos y aminoácidos. Como parte de la vía del fosfato de pentosa, hemos caracterizado el enriquecimiento significativo de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) (2,11 veces), que ramas de la vía de la glicólisis para generar NADPH, ribosa-5fosfato un precursor importante para la síntesis de nucleótidos. Consistente con esto, detectamos el aumento coordinado en la abundancia de enzimas que juega un papel central en la síntesis de purinas y pirimidinas. Más específicamente, IMPDH2 (1,66 veces), una enzima limitante de la tasa en el punto de rama de la biosíntesis de nucleótidos de purina, que conduce a la generación de nucleótidos de guanina, fosforibosil pirofosfato sintetasa 2 (PRPS2) (1,41 veces), cytidine-5-prime-trifosfato sintetasa (CTPS) (1,74 veces) que cataliza la conversión de UTP a CTP y la subunidad grande de ribonucleótido reductasa (RRM1) (1,56 veces). En parralel, observamos el aumento de la abundancia de la fosfoserina aminotransferasa PSAT1 (1,90 veces), una enzima implicada en la biosíntesis de serina, que se ha relacionado con la proliferación celular in vitro. La interfaz host-virus es un aspecto fundamental en la definición de la patogénesis molecular del VIH-1 [127, 128, 129, 130, 131, 132, 133]. De hecho, con su repertorio limitado de proteínas virales, el VIH-1 se basa ampliamente en la maquinaria de las células huésped para su replicación. Varios estudios recientes han capitalizado los recientes avances en las tecnologías ''OMICS'', y han revelado importantes perspectivas en este diálogo molecular finamente afinado [132, 134]. El VIH-1 Tat es esencial para la replicación viral y orquesta la expresión génica del VIH-1. La proteína reguladora viral es conocida por interactuar con una amplia gama de proteínas celulares y modular la expresión del gen celular y la vía de señalización [135, 136]. Nosotros y otros hemos utilizado enfoques a nivel del sistema para investigar la interacción Tat con la maquinaria de las células de acogida, que han caracterizado al HIV-1 Tat como un mediador crítico de la interfaz host-viral [137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149]. Aquí, hemos investigado el tráfico de proteínas nucleolares en respuesta a la expresión HIV-1 Tat en células T, con el fin de proporcionar ideas únicas y novedosas sobre el papel de la compartimentación de proteínas por Tat en el ajuste fino de la disponibilidad de proteínas y la función. Hemos desarrollado para este estudio, un modelo celular utilizando Jurkat T-cells expresando firmemente Tat fusionado en su N-ternminal a TAP-tag. Jurkat T-cells son robustos y presentan la ventaja de crecer sin estímulos y se transducen fácilmente utilizando Es importante destacar que se han empleado ampliamente para evaluar la patogénesis mediada por Tat utilizando enfoques de todo el sistema y para analizar las vías y funciones de señalización celular clave de las células T [144, 150, 151, 152]. De hecho, hemos encontrado que son especialmente adecuadas para cultivos in vitro prolongados en el medio SILAC y posterior aislamiento de su nucleolo, seguido por el análisis de MS, que requiere hasta 85 millones de células. Fusionamos Tat a la etiqueta TAP para permitir futuras aplicaciones posteriores como purificación de afinidad de Tandem o análisis IP de Cromatina. Importantemente, hemos confirmado que la etiqueta TAP N-terminal no interfirió con la función Tat ni su localización en las células Jurkat, cuando se compara con la no etiquetada-Tat. Aunque se sabe que Tat se acumula en el núcleo y el nucleolo en las células de Jurkat y otras líneas celulares transformadas, en las células T primarias, Tat se describe para acumularse principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Estas diferencias permanecen por caracterizarse, pero podrían estar relacionadas con diferentes niveles de expresión de los factores de transporte en las líneas celulares transformadas versus las células primarias, como se describe recientemente por Kuusisto et al. [39]. Además, Stauber y Pavlakis han sugerido que la localización nucleolar Tat podría ser el resultado de la sobreexpresión Tat [31]. Aquí, hemos seleccionado y empleado una población policlonal de células T Jurkat que expresan Tat en diferentes niveles. Proponemos que esta heterogeneidad en los niveles de expresión Tat podría reflejar la expresión estocástica Ta Utilizando una estrategia proteómica cuantitativa basada en un enfoque organélaro, cuantificamos más de 520 proteínas nucleolares, incluyendo 49 proteínas que muestran un cambio significativo en el pliegue. La medida en que las variaciones inducidas en la abundancia de proteínas nucleolares son biológicamente relevantes y pueden afectar los procesos celulares y/o virales queda por determinar. Sin embargo, la naturaleza biológica de las vías y los complejos macromoleculares afectados nos permiten discutir sus posibles asociaciones con la patogénesis del VIH-1. El VIH-1 Tat se expresa tempranamente después de la integración del genoma del VIH-1 y media el cambio a la fase de producción viral, asociado con la expresión génica proviral robusta, el ensamblaje de proteínas virales y, en última instancia, el surgimiento y liberación de viriones. En este contexto y basado en nuestros resultados, proponemos que Tat podría participar en la configuración del entorno intracelular y el perfil metabólico de De hecho, observamos el enriquecimiento nucleolar distinto de proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica, lo que podría ser indicativo de un aumento en la síntesis proteica. Con la notable exepción de RPL35A depleción nucleolar, proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica estaban en las 20 proteínas nucleolares más enriquecidas (NHP2L1, RLP14, RPL17, RPL27, RPS2, RPL13). Además, este efecto parece ser específico del HIV-1 Tat ya que la inhibición de transcripción por Actinomicina D resultó en el agotamiento total de proteínas ribosómicas en el nucleolo [9]. Además, el análisis proteómico cuantitativo de las células nucleas en adenovirus infectados mostró una leve disminución en proteínas ribosómicas [24] Si esto refleja un cambio en la biogénesis del ribosoma y/o un cambio en la composición de las subunidades ribosomales queda por determinar. Sin embargo, la necesidad adaptada de una producción elevada del ribosoma es intuitiva para un sistema que necesita apoyar la creciente demanda de nueva síntesis de proteínas virales. En parralel, observamos la modulación concordante de las vías que regulan la homeostasis proteica. Observamos la significativa acumulación nucleolar de múltiples chaperonas moleculares incluyendo las HSPs, el complejo TCP-1, y moléculas CANX/CALR y la abundancia nucleolar interrumpida de proteínas pertenecientes a la vía ubiquitina-proteasoma, que controla el suministro de proteínas ribosomales [104, 105]. Estas observaciones apoyan estudios previos que describen la modulación de la actividad proteasómica por Tat, que afectan a la expresión, el montaje y la localización de subunidades específicas de los complejos proteasómicos [106, 107, 108, 109, 110, 111, 113]. También observamos el agotamiento concomitante de CASP10 en el nucleolo de Jurkat TAP-Tat. Se ha sugerido que CASP10 podría estar dirigido al nucleolo para inhibir la síntesis proteica [154]. Curiosamente, la presencia y los papeles potenciales de las chaperonas moleculares en el nucleolo han sido destacados por Banski et al, quienes explican cómo la red chaperona podría regular la biogénesis ribosoma, la señalización celular y la respuesta al estrés [97, 155]. A medida que la producción viral avanza hacia la fase tardía y aumenta el estrés celular, el enriquecimiento nucleolar de las chaperonas moleculares por Tat no sólo podría permitir el plegado de adequat de proteínas virales recién sintetizadas, sino que también podría promover la tolerancia de las células infectadas al estrés y mantener la viabilidad celular. Coincidentemente, observamos el marcado enriquecimiento nucleolar de enzimas pertenecientes a vías metabólicas incluyendo glicólisis, fosfato de pentosa, nucleótido y aminoácidos vías biosintéticas. Del mismo modo, estas vías se elevan en células T proliferativas o en células cancerosas después de un cambio metabólico a la glicólisis aeróbica, también conocido como el efecto Warburg [156, 157, 158, 159]. Allí, los intermedios de glucosa de la vía de la glicólisis no sólo se comprometen a la producción de energía y se descomponen en piruvato para el ciclo TCA, sino que se redirigen a vías alternativas, incluyendo la vía del fosfato de pentosa, y se utilizan como precursores metabólicos para producir nucleótidos, aminoácidos, acetil CoA y NADPH para la homeostasis redox. De manera consistente, también se observó el enriquecimiento nucleolar concomitante de enzimas pertenecientes a la vía de síntesis de nucleótidos, incluyendo IMPH2, una enzima limitante conocida para controlar el pool de GTP. De igual manera, se observó el enriquecimiento nucleolar de PSAT1, una enzima involucrada en el metabolismo de serina y treonina, que está asociada con la proliferación celular [160]. Colectivamente, proponemos que mediante el control de la homeostas Sin embargo, las enzimas glucolíticas han sido detectadas en las fracciones nuclear y nucleolar mediante análisis proteómicos [8, 161]. Además, las enzimas glucolíticas, como PKM2, LDH, fosfoglicerato cinasa, GAPDH y aldosa, también han sido reportadas para mostrar localización nuclear y unirse al ADN [162]. Más específicamente, PKM2 es conocido por asociarse con el promotor y participar en la regulación de la expresión génica como coactivador transcripcional [163]. HIV-1 Tat ha sido descrito previamente como un inmunoregulador y más específicamente, ha sido reportado tanto para inhibir o promover la señalización TCR [164]. Hemos observado el enriquecimiento nucleolar por Tat de componentes proximales o aguas abajo clave de las vías de señalización de células T, incluyendo ZAP70, ILF3 y STAT3, que juegan un papel crucial en el desarrollo y activación de células T. Anteriormente los habíamos identificado como componentes específicos de células T del nucleolo, y los estudios de IF sugirieron que su asociación con el nucleolo podría ser regulada por condiciones específicas [165]. Nuestros resultados apoyan aún más que Tat podría contribuir a la disregulación de las señales derivadas de TCR y que el nucleolo podría representar un importante enlace espacial para las moléculas de señalización TCR. Observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de componentes clave de las vías de replicación, recombinación y reparación del ADN por Tat. Estos incluyen XRCC5 y XRCC6, HMGA1, APEX1, MCM2-7, SMC2, RFC1 y RFC2, mientras que RFC4 se encontró significativamente agotado. Curiosamente, estos cofactores se han asociado con la eficiencia de la integración del ADN retroviral en el ADN del huésped o la integridad del provirus integrado [166]. Si la abundancia creciente de estos factores dentro del nucleolo podría estar asociada con su participación potencial en la integración y mantenimiento de la integridad del gen provirus, queda por determinar. Los mecanismos de segregación mediada por Tat y compartimentación de proteínas dentro o fuera del nucleolo pueden depender de factores inherentes para cada proteína y la naturaleza de su relación con Tat, ya que el fraccionamiento subcelular combinado con el análisis del WB mostró que el patrón y el grado de redistribución subcelular entre proteínas variaban. Pudimos observar casos en los que Tat regulaba la expresión de proteínas que resultaban en un aumento general de estas proteínas en los compartimentos celulares incluyendo el nucleolo (DDX3, TNPO1). Alternativamente, Tat podía desencadenar la translocación nucleolar de proteínas directamente desde el citoplasma o el nucleoplasma (pRb). Además, observamos proteínas citoplasmáticas redistribuidas tanto al nucleoplasma como al nucleolo sobre la expresión Tat (STAT3, ZAP70 y HSP90). Finalmente, también notamos el agotamiento proteico en la fracción nucleolar acompañado de un aumento en el nucleoplasma (SSRP1). Sigue siendo difícil en esta etapa, apreciar si la acumulación de proteínas específicas resultaría en su activación o inhibición al secuestrarlas de su lugar de acción. Por el contrario, el agotamiento de una proteína del nucleolus podría resultar en la regulación descendente de su actividad en este lugar o podría ser el resultado de su movilización desde su sitio de almacenamiento, el nucleolus, al nucleoplasma o citoplasma donde puede realizar su función. Cabe destacar que identificamos a varios socios conocidos del VIH-1 Tat involucrados en la patogénesis del VIH-1, lo que sugiere que Tat podría modular físicamente su objetivo nucleolar o su reclutamiento a un sitio específico en el nucleoplasma o citoplasma. Tat también podría promover modificaciones post-traducción, lo que podría mediar la focalización de proteínas específicas al nucleolus. Esto se ilustra por las siguientes proteínas enriquecidas, pRb, PP1 y STAT3, para lo que la fosforilación es inducida por Tat. Importantemente, su estado de fosforilación determina su distribución subcelular, proporcionando así un mecanismo Además, nuestros datos indican que las serinas/treoninas quinasas (CK2 a') y fosfatasas (PP1) se enriquecieron significativamente en las fracciones nucleolares de Jurkat TAP-Tat. Estas enzimas representan la mayor parte de la actividad de fosforilación/desfosforilación en el nucleolo y pueden actuar como reguladores del tráfico de proteínas nucleolares. Además, Tat disminuyó significativamente los niveles de SUMO-2 en el nucleolo. Del mismo modo, se sabe que las modificaciones posteriores a la traducción mediadas por SUMO modulan la localización de proteínas nucleolares [104]. Dada la importancia potencial de las modificaciones posteriores a la traducción, incluida la fosforilación en el cambio mediado por Tat de la abundancia de proteínas nucleolares, un enfoque proteomico más específico como el enriquecimiento de fosfopétidos El control de la rotación de proteínas también es un medio importante para modular la abundancia de proteínas nucleolares. Las proteínas ribosómicas son degradadas por la vía Ubiquitina-Proteasoma para asegurar que su abundancia coincida con los niveles de transcripción de rRNA. A la inversa, las proteínas de choque térmico HSP90s las protegen de la degradación. Curiosamente, nuestros datos muestran que la modulación Tat de las proteínas de abundancia asociadas con la vía Ubiquitina-proteasoma y choque térmico. Esto podría contribuir al enriquecimiento observado de proteínas ribosómicas por Tat. Sin embargo, no podemos excluir que la mayor abundancia de proteínas ribosómicas en el nucleolo podría ser el resultado de la prevención mediada por Tat de su exportación al citoplasma. Curiosamente, utilizando un sistema celular diferente, una cepa transgénica de Drosophila melanogaster Tat, Ponti et al, analizaron los efectos de Tat en la biogénesis ribosoma, después de 3 días de tratamiento de choque térmico para inducir la expresión Tat bajo el control del promotor hsp70 [167]. Después de la expresión Tat, observaron un defecto en el procesamiento pre-rRNA asociado con una disminución en el nivel de 80S ribosomas [167]. Sin embargo, los diferentes sistemas celulares empleados combinados con la inducción de choque térmico de 3 días hacen que sus resultados sean difíciles de comparar con los nuestros. Mientras que estudios anteriores a nivel de sistema han monitoreado los efectos de la expresión Tat del VIH-1 en las células T, a nuestro conocimiento, hemos presentado aquí el primer análisis proteómico de la composición dinámica del nucleolus en respuesta a la expresión Tat del VIH Utilizando proteómica cuantitativa, hemos subrayado los cambios en la abundancia de proteínas nucleolares específicas y hemos destacado la reorganización nucleolar extensa y coordinada en respuesta a la expresión constitutiva Tat. Nuestros hallazgos subrayan que Tat que expresa células T exhiben un perfil proteómico nucleolar único, que puede reflejar una estrategia viral para facilitar la progresión a la producción viral robusta. Importantemente, hemos notado la relación funcional de proteínas nucleolares de nuestro conjunto de datos con la patogénesis VIH-1 y el Tat VIH-1 en particular. Esto aumenta aún más nuestra confianza en nuestra estrategia experimental y sugiere un papel para Tat en el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares. Finalmente, nuestro estudio proporciona nuevas ideas sobre la importancia de Tat en la conversación cruzada entre funciones nucleolares y patogénesis viral. También hemos identificado cambios en la abundancia de proteínas nucleolares que no estaban previamente asociados con la patogénesis del VIH-1, incluyendo proteínas asociadas a vías metabólicas, que proporcionan nuevos objetivos potenciales y vías celulares para la intervención terapéutica.Células T Jurkat, clon E6.1 (ATCC), Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP se mantuvieron en el medio RPMI-1640 complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (Gibco, aprobado por la UE), y antibióticos. Células Phoenix-GP (G.P. Nolan; www.stanford.edu/ group/nolan/), se mantuvieron en el medio DMEM complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (GIBCO, aprobado por la UE). La secuencia de HIV-1 Tat (VIH-1 HXB2, 86 aminoácidos) fue subclonada en el vector pENTR 2B (Invitrogen, A10463). Usando la tecnología Gateway (Invitrogen), introdujimos la secuencia HIV-1 Tat en el plásmido pCeMM-NTAP(GS)-Gw [168]. Las células Fénix (G.P. Nolan; www.stanford.edu/group/nolan/), fueron transfectadas usando Fugene 6 (Roche) con 5 mg del plásmido NTAP-Tat o NTAP y 3 mg del pMDG-VSVG. Los sobrenadantes virales fueron recolectados después de 48 h, filtrados y utilizados para transducir las líneas celulares de Jurkat. La construcción se denomina NTAP-Ta Utilizando la entrega de genes retrovirales, transferimos de forma estable células Jurkat (clone E6.1 (ATCC)). Los clones positivos llamados Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron ordenados para enriquecer la población de células que expresaban GFP usando el clasificador de células BC MoFlo XDP (Beckman Coulter). Las fracciones subcelulares (10 mg) fueron resueltas por SDS-PAGE y transferidas a membranas BioTrace PVDF (Pall corporation). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: a-Tubulina (Sc 5286), C23 (Sc 6013), y Fibrilarina (Sc 25397) de Santa Cruz Biotechnology, y PARP (AM30) de Calbiochem, Ratón anti-ZAP 70 (05-253, Millipore), Ratón anti-STAT3 (06-596, Millipore), Ratón anti-ILF3 (ab92355, Abcam), Ratón anti-HSP90 beta (ab32568, Abcam), Ratón anti-ADAR1 (ab88574, Abcam), Ratón anti-HDAC1 (ab19845, Abcam), Ratón anti-SSRP1 (ab21584, Abcam) conejo anti-BOP1 (ab86982, Abcam), Ratón anti-KpNB1 (ab10303, Abcam), Ra Para el análisis SILAC-RPMI R0K0 y SILAC-RPMI R6K6 (Células Dundidas) se utilizó un medio con un 10% de FBS dializado (GIBCO, 26400-036); las células Jurkat que expresaban NTAP-Tat y NTAP fueron transitadas en serie y cultivadas durante cinco duplicados para asegurar la incorporación completa de los aminoácidos marcados; la viabilidad de las células se verificó con Trypan Blue (0,4% solución, SIGMA) y posteriormente se confirmó mediante tinción IP y análisis FACS; las células se mezclaron a la relación 1:1 para obtener 140610 6 células; los nucleoli fueron aislados de la población celular mixta como se describió previamente en Jarboui et al., [165]. Los extractos nucleolares (100 mg) fueron resuspendidos en bicarbonato de amonio de 50 mM y en solución de tripsina digerida como se describió previamente en Jarboui y col. [165]. La muestra se realizó en un espectrómetro de masa termoscientifico LTQ Orbitrap XL conectado a un sistema cromatógrafo NANO LC.1DPLUS que incorporaba una muestra automática. La muestra fue cargada en una columna Biobasic C18 PicofritTM (100 mm de longitud, 75 mm ID) y fue separada por un gradiente de acetonitrilo en aumento, utilizando un gradiente de 142 min de fase inversa (0-40% de acetonitrilo durante 110 min) a un caudal de 300 nL min-1. El espectrómetro de masa fue operado en modo iónico positivo con una temperatura capilar de 200uC, una tensión capilar de 46V, una tensión de lente de tubo de 140V y con un potencial de 1800V aplicada al frit. Todos los datos fueron adquiridos con el espectrómetro de masa que funciona en modo de conmutación automática dependiente de datos. Se realizó una exploración MS de alta resolución utilizando el Orbitrap para seleccionar los 5 iones más intensos antes del análisis MS/MS utilizando la trampa Ion. La eficiencia de incorporación de aminoácidos etiquetados fue determinada mediante el análisis de los péptidos identificados en nucleoli aislados de la población celular mantenida en el medio 'Heavy' como se describe en [169]. Nuestro análisis mostró que teníamos una eficiencia de incorporación.95% (datos no mostrados). Los espectros MS/MS fueron buscados para la identificación y cuantificación de los péptidos utilizando el software MaxQuant [170] (versión 1.1.1.36), la Base de Datos del IPI Humano (versión 3.83) y el motor de búsqueda Andrómeda asociado a MaxQuant [171]. Se utilizaron parámetros estándar para MaxQuant con el Acetil (término N de Proteína) como modificación variable y Carbamidometilo (Cys) como modificación fija, se permitieron 2 escisiónes perdidas, excepto que se prohibió el filtrado de aminoácidos etiquetados. La desviación de masa inicial de los iones precursores y fragmentos fue de 7 ppm y 0,5 Da, respectivamente. Cada relación proteica fue calculada como promedio ponderado de intensidad de los coeficientes de péptidos individuales. Las proteínas fueron identificadas con el mínimo de un péptido con una tasa La ontología genética, la vía KEGG y los términos Pfam se extrajeron de entradas UNIPROT utilizando Perseo, un software del paquete de análisis de datos MaxQuant (http://www.maxquant.org ), y las herramientas de la suite ToppGene [54]. El Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron transfectados utilizando el sistema de electroporación Amaxa (biosistema Amaxa) con el pGL3 (pGL3-LTR) (Promega) como recomendado por Amaxa Biosystem. Los ensayos de doble luciferasa (Promega) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de Luciferasa se midió y normalizó contra la cantidad total de proteínas cuantificada por el kit de cuantificación de proteínas BCA (Pierce, Thermo Scientific). Para preservar Las células se fijaron en un 2% PFA durante 10 minutos en RT, permeabilizaron en un 0,5% Triton X-100 durante 15 minutos en RT y se bloquearon con 5% FCS. Las células se incubaron con el anticuerpo Tat VIH-1 de conejo (ab43014, Abcam) seguido por el anticuerpo secundario anti-Rabbit alexa fluor 647 (A-21246, Invitrogen). Las células se les permitió unirse a Cell-Tak (BD) recubierto de Diapositivas Silanizadas (DaoCytomation), y manchado con DAPI. Las imágenes se capturaron con un Microscopio Confocal Carl Zeiss equipado con un objetivo DIC de aceite de Plan-Apocromat 63X/14. El archivo de datos RAW proteómicos del análisis de espectrometría de masas se depositó en el repositorio Tranche(http El archivo se puede acceder y descargar utilizando la siguiente clave de hash:(R3O5SV5Z6HvWqrBNDhp21tXFetluDWYxvwMIfU-h6e1kMgarauCSq4dlNcxeUvFOHDEzLeDcg4X5Y8reSb6-MUA6wM1kIAAAAAAB/w = ). Materiales y Métodos S1 Descripción de los métodos empleados para examinar el ciclo celular, la viabilidad celular y el análisis de proliferación celular. (DOCX)

¿Cuánto dura la proteína alfa-tubulina?

Tráfico de proteínas nucleolares en respuesta al VIH-1 Tat: Rewiring the Nucleolushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499507/SHA: efa871aeaf22cbd0ce30e8bd1cb3d1afff2a98f9Autores: Jarboui, Mohamed Ali; Bidoia, Carlo; Woods, Elena; Roe, Barbara; Wynne, Kieran; Elia, Giuliano; Hall, William W.; Gautier, Virginie W.Fecha: 2012-11-15DOI: 10.1371/journal.pone.0048702Licencia: cc-byAbstract: La proteína Tat transactivante es una proteína reguladora viral esencial para la replicación del VIH-1. El nucleolo, un compartimento subnuclear altamente dinámico y estructurado sin membrana, es el sitio de ARNr y biogénesis ribosoma y está involucrado en numerosas funciones celulares incluyendo la regulación transcripcional, el control del ciclo celular y la infección viral. Importantemente, el tráfico nucleolar transitorio tanto de Tat como de las transcripciones virales del VIH-1 son críticos en la replicación del VIH-1, sin embargo, el(los) papel(es) del nucleolo en la replicación del VIH-1 sigue sin estar claro. Para entender mejor cómo la interacción de Tat con la maquinaria nucleolar contribuye a la patogénesis del VIH-1, investigamos los cambios cuantitativos en la composición del proteoma nucleolar de las células T de Jurkat que expresan establemente el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta TAP. Utilizando un enfoque proteómico organélaro basado en espectrometría de masas, junto con el etiquetado de isótopos estables en cultivo celular (SILAC), cuantificamos 520 proteínas, incluyendo 49 proteínas que muestran cambios significativos en la abundancia de nucleolos de células T de Jurkat sobre la expresión Tat. Numerosas proteínas que exhiben un cambio de pliegue fueron interactuadores Tat bien caracterizados y/o conocidos por ser críticos para la replicación del VIH-1. Esto sugiere que el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares por Tat proporcionan una capa adicional de control para regular la maquinaria celular involucrada en la patogénesis del VIH-1. El análisis del camino y la reconstrucción de la red revelaron que la expresión Tat resultó específicamente en el enriquecimiento nucleolar de proteínas que participan colectivamente en biogénesis ribosomal, homeostasis de proteínas, vías metabólicas incluyendo glucolítico, fosfato de pentosa, nucleótidos y aminoácidos vías biosintéticas, respuesta al estrés, vías de señalización de células T e integridad del genoma. Presentamos aquí el primer perfil diferencial del proteoma nucleolar de células T que expresan el HIV-1 Tat. Discutimos cómo estas proteínas participan colectivamente en redes interconectadas que convergen para adaptar las actividades dinámicas del nucleolus, que favorecen las actividades biosintéticas del huésped y pueden contribuir a crear un entorno celular que apoye la producción robusta del HIV-1. Texto: El nucleolus es un compartimento subnuclear altamente ordenado organizado alrededor de loci genéticos llamados regiones organizadoras nucleolares (NORs) formado por grupos de cientos de repeticiones de genes rDNA organizadas en repetición tándem cabeza a cola [1, 2]. Organelo sin membrana descrito originalmente como la ''Fábrica Ribosoma'', el nucleolus está dedicado a la transcripción de rDNA dirigida por ARN-polimerasa-I, procesamiento de rARN mediado por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (SORNPs) y conjunto ribosoma. La biogénesis del ribosoma es esencial para la síntesis de proteínas y la viabilidad celular [2] y, en última instancia, resulta en las subunidades ribosomales grandes (60S) y pequeñas (40S), que posteriormente se exportan al citoplasma. Este proceso celular fundamental, al que la célula dedica la mayor parte de sus recursos energéticos, está estrictamente regulado para adaptarse a los cambios dinámicos en la proliferación celular, la tasa de crecimiento y las actividades metabólicas [3]. El nucleolus es el sitio de procesamiento adicional de ARN, incluyendo la exportación y degradación de ARNm, la maduración de pequeños PNNR nucleares ricos en uridina (U snRNPs), que forman el núcleo del spliceosoma, biogénesis de ARNt y microARNs (miRNAs) [4]. El nucleolus también está involucrado en otros procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular, procesos oncogénicos, respuestas de estrés celular y traducción [4]. El concepto de nucleolo multifuncional y altamente dinámico ha sido corroborado por varios estudios que combinan enfoques proteómicos organelares y espectrometría cuantitativa de masas, y describen miles de proteínas que transitan por el nucleolo en respuesta a diversas condiciones metabólicas, estrés y ambientes celulares [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Colectivamente, los estudios mencionados representan hitos en la comprensión de la complejidad funcional del nucleolo, y demostraron que las proteínas nucleolares están en intercambio continuo con otros compartimentos nucleares y celulares en respuesta a determinadas condiciones celulares. Los estudios proteómicos que analizan los nucleoli de las células infectadas por el virus sincitial respiratorio humano (HRSV), el virus influenza A, el virus de la bronquitis infecciosa por coronavirus aviar (IBV) o el adenovirus destacaron cómo los virus pueden alterar de forma distintiva la distribución de proteínas nucleolares [2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Curiosamente, tanto las proteínas reguladoras del VIH-1 Tat como Rev localizan al nucleoplasma y al nucleolus. Ambas secuencias abarcan una señal de localización nucleolar (NoLS) que se superpone con su señal de localización nuclear (NLS), que rige su localización nucleolar [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. Además, Tat y Rev interactúan con el antígeno nucleolar B23 Sin embargo, un estudio reciente describió que en contraste con las células T de Jurkat y otras líneas celulares transformadas donde Tat está asociado con el núcleo y el nucleolo, en las células T primarias Tat se acumula principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Mientras que la regulación de su importación y/o exportación nuclear activa, como mediada por la familia de la carioferina/importación, se han descrito bien, los mecanismos que distribuyen Tat y Rev entre el citoplasma, el nucleoplasma y el nucleolo siguen siendo elusivos [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48]. Importantemente, dos estudios importantes de Machienzi y otros han revelado importantes vínculos funcionales entre la replicación del VIH-1 y el nucleo En primer lugar, podrían inhibir la replicación del VIH-1 y la función de transactivación Tat empleando un señuelo TAR dirigido específicamente al nucleolo. Además, utilizando un enfoque similar, con una ribozima anti-VIH-1 de cabeza martillo fusionada al ARN nucleolar pequeño U16 y por lo tanto dirigida al nucleolo, podrían suprimir dramáticamente la replicación del VIH-1. Colectivamente, estos hallazgos sugieren fuertemente que las transcripciones del VIH-1 y el tráfico nucleolar Tat son críticos para la replicación del VIH-1. Sin embargo, la naturaleza de estas contribuciones aún no se ha aclarado. En este informe, analizamos sistemáticamente las perturbaciones del proteoma nucleolar que ocurren en las células T de Jurkat expresando constitutivamente el VIH-1 Tat, utilizando un enfoque de espectrometría cuantitativa de masas. Después de la anotación detallada de los cambios cuantitativos de abundancia en la composición de la proteína nucleolar sobre la expresión Tat, nos centramos en los complejos celulares afectados por Tat y las vías de señalización asociadas con la biogénesis ribosoma, el spliceosoma, las chaperonas moleculares, la replicación y reparación del ADN y el metabolismo, y discutimos su posible implicación en la patogénesis del VIH-1. En este estudio, investigamos los cambios cuantitativos en el proteoma nucleolar de las células Jurkat T expresando constitutivamente el VIH-1 Tat (86aa) frente a su contraparte Tat negativo, utilizando el etiquetado estable de isótopos con aminoácidos en la tecnología de cultivo celular (SILAC), seguido por la espectrometría de masas en tándem ESI e implementamos el enfoque experimental descrito en la Figura 1A. En primer lugar, mediante la entrega de genes retrovirales, transferimos el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta de purificación de afinidad tándem (TAP) (constituido por dos proteínas G y un péptido de unión a estreptavidina) o TAP solo (vector de control) en el clon de células T de leucemia Jurkat E6-1 y clasificamos las células transducidas (GFP positivo) por FACS. Esto resultó en una población altamente enriquecida de células transducidas policlonales que presentaban diferentes niveles de expresión del transgén (Figura 1B). La funcionalidad del TAP-Tat fue confirmada mediante la transfección de las células TAP-Tat y TAP con un vector de genes reportero de luciferasa bajo el control del HIV-1 LTR (pGL3-LTR) [36]. Para abordar la funcionalidad de Tat fusionado a TAP, comparamos Jurkat TAP-Tat con Jurkat-tat, una línea celular que expresaba establemente Tat [51]. Ambas líneas celulares mostraron una actividad LTR del VIH-1 comparable después de la transfección con pGL3-LTR (Figura S1 ). A continuación, la expresión Tat y la localización subcelular fueron verificadas mediante fraccionamiento subcelular seguido por el análisis del WB (Figura 1E ). TAP-Tat mostró una localización nuclear/nucleolar prominente, pero también se pudo detectar en el citoplasma. Estas observaciones fueron además validadas mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 1E ). A continuación se comparó la tasa de crecimiento y proliferación de las líneas celulares de Jurkat TAP y TAP-Tat (Materiales y Métodos S1), que eran equivalentes (Figura S4A ). Del mismo modo, el análisis FACS confirmó que las poblaciones relativas en G1, S y G2/M eran similares para las células de Jurkat TAP-Tat y TAP (Figura S4B ). Se etiquetaron las células de Jurkat TAP-Tat y Jurkat TAP con isótopo ligero (R0K0) y pesado (R6K6) que contenían arginina y lisina, respectivamente. Después de cinco pasajes en su respectivo medio SILAC, se recolectaron 85 millones de células de cada cultivo, se agruparon y se aislaron sus nucleolis como se describió previamente (Figura 1A ) [52] Para evaluar la calidad de nuestro procedimiento de fraccionamiento, se investigó el enriquecimiento específico de antígenos nucleolares conocidos mediante el análisis Western Blot (Figura 1D). Se encontró que la nucleolina (110 kDa) y la fibrilarina (FBL) (34 kDa), dos proteínas nucleolares principales conocidas por localizar al componente granular del nucleolo, estaban muy enriquecidas en la fracción nucleolar mixta. Se observó que la nucleolina se distribuía igualmente entre las fracciones nuclear y citoplasmática. Este patrón de distribución de nucleolina parece ser específico para las células T de Jurkat, como se muestra anteriormente [52, 53]. La proteína nuclear PARP-1 (Poly ADPribose polimerasa 1) (113 kDa) estaba presente en la fracción nuclear y nucleoplasmática, pero se desplegó en la fracción La alfa-tubulina (50 kDa) fue altamente abundante en la fracción citoplasmática y débilmente detectada en las fracciones nucleares. Colectivamente, estos resultados confirmaron que nuestros métodos produjeron una fracción nucleolar altamente enriquecida sin contaminación cruzada significativa. Posteriormente, la mezcla de proteína nucleolar fue tripsindigerida y los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas. El análisis proteomico cuantitativo comparativo se realizó utilizando MaxQuant para analizar las proporciones en isótopos para cada péptido identificado. Se cuantificó un total de 2427 péptidos, representando 520 proteínas nucleolares cuantificadas. La lista completa anotada de proteínas nucleolares cuantificadas está disponible en la Tabla S1 y los datos brutos del análisis de espectrometría de masas se depositaron en la base de datos de repositorios Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/), a la que se puede acceder utilizando las claves de hash descritas en materiales y métodos. Anotamos las proteínas cuantificadas utilizando las herramientas ToppGene Suite [54] y extrajimos las anotaciones de Gene Onthology (GO) e InterPro [55]. El análisis de los procesos biológicos GO (Figura 1F ) reveló que los procesos biológicos mejor representados incluían la transcripción (24%), el procesamiento de ARN (23%), el proceso del ciclo celular (13%) y la organización cromosómica (15%), que refleja las funciones asociadas nucleolares y es comparable a nuestra caracterización anterior del proteoma nucleo El análisis de distribución subcelular (Figura 1F ) reveló que nuestro conjunto de datos contenía proteínas conocidas por localizarse en el nucleolo (49%), en el núcleo (24%) mientras que el 15% de las proteínas estaban descritas previamente para residir exclusivamente en el citoplasma. La distribución subcelular fue similar a nuestro análisis anterior del proteoma nucleolar de células T de Jurkat [52]. Tabla S1. La distribución de las relaciones proteicas se representan en la Figura 1G como log 2 (cambio de abundancia). Las relaciones SILAC indican cambios en la abundancia proteica en la fracción nucleolar de las células TAP de Jurkat en comparación con las células TAP de Jurkat. La distribución de las proteínas cuantificadas siguió una distribución gaussiana (Figura 1G ). Un total de 49 proteínas nucleolares exhibieron un cambio significativo de 1,5 veces o mayor Las células no mostraron cambios en el contenido en estado estacionario de algunos de los principales y abundantes componentes del nucleolo, incluyendo nucleofosfmina (NPM1/ B23), C23, FBL, proteína nucleolar P120 (NOL1) y proteína nucleolar 5A (NOL5A). Las distintas proporciones de cambios proteicos sobre la expresión Tat podrían reflejar la reorganización nucleolar específica y las actividades alteradas del nucleolo. Realizamos el análisis del WB para validar los resultados basados en SILAC obtenidos por nuestro enfoque proteómico cuantitativo (Figura 2 ). 15 proteínas seleccionadas mostraron intensidad diferencial en las fracciones nucleolares sobre la expresión Tat, incluyendo 9 enriquecidos (HSP90b, STAT3, pRb, CK2a, CK2a', HSP90a, Transportin, ZAP70, DDX3), y 3 agotados (ILF3, BOP1 y SSRP1) proteínas. Además, también probamos por el análisis WB, abundancia de proteínas no afectada por la expresión Tat (Importin beta, FBL, B23, C23). Estos resultados destacan la concordancia en la tendencia de las proporciones correspondientes de SILAC, a pesar de algunas diferencias en los rangos cuantitativos. Cabe destacar que, usando WB, pudimos observar un cambio de intensidad para la proteína con un cambio de pliegue SILAC tan bajo como 1,25 veces. Por un lado, el umbral de los cambios en la abundancia de proteínas se puede determinar estadísticamente y luego destacar los cambios en la abundancia más grandes como se ilustra en la Tabla 1. Alternativamente, el enriquecimiento o agotamiento coordinado de la mayoría de las proteínas pertenecientes a un complejo o vía celular distinto permitiría la definición de un grupo de proteínas de interés y potencial significación. Por lo tanto, nos centramos en proteínas individuales enriquecidas o agotadas con actividades asociadas con la patogénesis molecular del VIH-1 o Tat, y en modificaciones agrupadas que afectan vías de señalización celular enteras y complejos macromoleculares. Inicialmente nos centramos en las proteínas de señalización que interactúan con Tat y/o la patogénesis molecular asociada del VIH-1 y cuya abundancia en el nucleolo fue modulada por la expresión Tat. Fosfo-proteína fosfatasas. Fosfo-proteína fosfatasa PP1 y PP2A son esenciales Es importante destacar que el PP1 representa el 80% de la actividad de la fosfatasa Ser/Thr dentro del nucleolo. En nuestro estudio, el PP1 fue potencialmente enriquecido por 1,52 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat, lo que apoya estudios previos que describen el objetivo nuclear y nucleolar de PP1a por el HIV-1 Tat y cómo PP1 aumenta la regulación de la transcripción del VIH-1 [58, 59, 60, 61, 62]. El PP1 c también fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro [63]. Curiosamente, la asociación Tat con los promotores de la subunidad PP2A resulta en la sobreexpresión y regulación de la actividad PP2A en linfocitos [64, 65]. Además, PP2A contribuye a la regulación de la transcripción y replicación del VIH-1 [61, 66]. Retinoblastoma Protein. El gen supresor tumoral pRb protein mostró un cambio de 1,4 veces en el nucleolus sobre la expresión Tat [67]. Además, el análisis WB confirmó la translocación distinta del pRb del nucleoplasma al nucleolus por Tat (Figura 2 ). Dependiendo del tipo de célula, pRb puede ser hiperfosforilado o hipofosforilado sobre la expresión Tat y puede regular negativamente o positivamente la transcripción mediada por Tat respectivamente [68, 69, 70]. Curiosamente, la hiperfosforilación de los desencadenantes del pRB en su translocación en el nucleolo [71]. La fosforilación del pRB también se asocia con un aumento de la biogénesis ribosómica y el crecimiento celular [72]. STAT3. El transductor de señal de factor de transcripción y activador de la transcripción 3 (STAT3) se enriqueció significativamente (1,86 veces) en la fracción nucleolar por la expresión constitutiva Tat. Además, el análisis WB indicó que la expresión Tat podría promover la relocalización del STAT3 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento distinto en el nucleolo (Figura 2). Curiosamente, estudios anteriores han demostrado la activación mediada por Tat de la señalización STAT3, como lo demuestra su estado de fosforilación [73]. Curiosamente, la fosforilación STAT3 indujo la dimerización de la proteína después de su translocación al núcleo [74]. YBX1. YBX1, la proteína multifuncional de unión al ADN/ARN fue enriquecida por 1,38 veces en el nucleolo de las células de Jurkat sobre la expresión Tat. Curiosamente, YBX1 interactúa con Tat y TAR y modula la expresión génica del VIH-1 [63, 75]. ZAP70. La proteína tirosina cinasa ZAP70 (proteína quinasa asociada a la cadena Zeta 70) fue enriquecida por 1,24 veces en el nucleolo de las células de Jurkat expresando Tat [76]. Además, el análisis del WB reveló que la expresión Tat podría promover la relocalización del ZAP70 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento La proteína de matriz nuclear interna, Matrin 3 (MATR3), presentó un cambio de 1,39 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat. Se localiza en el nucleolasmo con un patrón difuso excluido de los nucleolos [77]. La matrin 3 ha sido identificada como parte del nucleoloma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Dos estudios recientes han descrito a la matrin 3 como parte de complejos de ribonucleoproteínas, incluyendo también el VIH-1 Rev y (elemento de respuesta Rev) RRE que contiene ARN VIH-1, y promoviendo la regulación post-transcripción del VIH-1 [78, 79, 80]. CASP10. La molécula pro-apotótica de señalización, Caspasa 10 (CASP10), se agotó significativamente de las células nucleolus de Jurkat-Tat (0,82 veces) [81]. Importantemente, la expresión Tat desregula la expresión y actividad de CASP10 en las células Jurkat [82]. ADAR1. Adenosina deaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR1), que convierte las adenosinas en inosinas en ARN de doble cadena, se agotó significativamente del nucleolus de las células Jurkat-Tat (0,78 veces). Curiosamente, ADAR1 sobreexpresión regula la replicación del VIH-1 a través de un mecanismo de edición del ARN [83, 84, 85, 86, 87, 88]. Además, ADAR1 pertenece al interactoroma nuclear in vitro Para subrayar las relaciones estructurales y funcionales de las proteínas nucleolares afectadas por el VIH-1 Tat, construimos una representación en red de nuestro conjunto de datos. Utilizamos la versión 2.6.3 de Cytoscape [89] y utilizando el plugin MiMI [90] para mapear interacciones previamente caracterizadas, extraídas de bases de datos de interacción de proteínas (BIND, DIP, HPRD, CCSB, Reactome, IntAct y MINT), lo que resultó en una red altamente densa y conectada que incluía 416 proteínas (nodos) de las 536 proteínas, unidas por 5060 interacciones no dirigidas (borde) (Figura 3A). El análisis de centralidad reveló un umbral de 23.7 interacciones por proteína. El análisis de topología utilizando el plugin CentiScaPe [91] mostró que la distribución del grado de nodo sigue una ley de energía (Figura S5 Es importante destacar que cuando analizamos la distribución del coeficiente de agrupamiento (Figura S6 ) encontramos que la red está organizada en una arquitectura jerárquica [92], donde los nodos conectados forman parte de áreas altamente agrupadas mantenidas por pocos hubs organizados alrededor del HIV-1 Tat. Además, el análisis de la conexión en grados nodos de nuestra red identificó al HIV-1 Tat como la proteína más conectada (Figura S6 ). Específicamente, el análisis de topología indicó que los valores para las centrales Tat eran los más altos (grado de nodo, estrés, radialidad, cercanía, entreess y centroides), caracterizando a Tat como la proteína principal del hub de la red nucleolar. De hecho, un total de 146 proteínas han sido descritas previamente para interactuar con Tat (Figura 3B, Tabla S2 ). Estas proteínas están involucradas En paralelo, caracterizamos la magnitud de los cambios de abundancia proteica relacionados observados en distintas vías celulares (Figura 4). Biogénesis ribosomal. Inicialmente nos centramos en la biogénesis ribosoma, función primaria del nucleolo. Pudimos observar un aumento general y coordinado en la abundancia de proteínas ribosomales en el nucleolo por expresión Tat (Figura 4 ). Mientras algunas proteínas ribosomales permanecían inalteradas, Tat causó la acumulación nucleolar de varias proteínas ribosomas grandes y pequeñas distintas, excepto RPL35A, para las cuales la expresión Tat causó una marcada disminución en el nivel nucleolar (0,29 veces). Asimismo, varias proteínas involucradas en el procesamiento de ARNr exhibieron un aumento general en la acumulación nucleolar sobre la expresión Tat. Estos incluyen a los miembros canónicos humanos de la familia L7ae junto con los miembros que participan en la Caja C/D, H/ACA y U3 snoRNPs (Figura 4). Por el contrario, BOP1, un componente del complejo PeBoW (Pescadillo Bop1 WDR12) esencial para la maduración de la subunidad ribosómica grande, se agotó significativamente del nucleolo de las células TAP-Tat Jurkat (0,81 veces) y esto fue confirmado por el análisis WB (Figura 2 ) [93]. Sin embargo, los otros componentes complejos PeBoW, Pes1 (0,94 veces) y WDR12 (1,1 veces), no fueron afectados por la expresión Tat. Se identificaron y cuantificaron en nuestro conjunto de datos 55 proteínas de las 108 proteínas spliceosomal conocidas [94]. Estas proteínas incluyen las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares U1, U2 y U5, Sm D1, D2, D3, F y B, y las heterogéneas ribonucleoproteínas nucleares. Nuestros datos sugieren un aumento distinto en la abundancia de proteínas específicas complejas del spliceosoma tras la expresión de HIV-1 Tat en células T de Jurkat (Figuras 3 y 4). Las únicas tres proteínas que se agotaron significativamente del nucleolo tras la expresión del HIV-1 Tat fueron RBMX (0,89 veces), HNRNPA2B1 (0,84 veces) y SNRPA (0,81 veces). Varias investigaciones mostraron alteración de la expresión en los factores de empalme celular en células infectadas por HIV-1 [95, 96] Hemos identificado varias chaperonas moleculares, cochaperonas y otros factores involucrados en la proteostasis para ser altamente enriquecidos en el nucleolo de las células T sobre la expresión Tat (Figuras 3 y 4), muchos de los cuales fueron previamente caracterizados como parte del interactoroma nuclear Tat [63]. Varias proteínas de choque térmico incluyendo DNAJs, específicas HSP90, HSP70 y HSP40 isoformas y sus cofactores se enriquecieron distintivamente en la fracción nucleolar de las células Jurkat expresando Tat (Figura 4 ). Como lo muestra WB, mientras que HSP90a y b son principalmente citoplasmáticas, la expresión Tat desencadena su relocalización al núcleo y nucleolus, corroborando nuestro enfoque cuantitativo proteómico (Figura 2). Del mismo modo, el choque térmico puede hacer que el HSP90 y el HSP70 se reubiquen en el nucleolo [97, 98, 99, 100, 101]. En un estudio reciente, el grupo de Fassati ha demostrado que el HSP90 está presente en el promotor del VIH-1 y puede regular directamente la expresión génica viral [102]. También observamos el aumento coordinado de la abundancia de la clase I (GroEL y GroES) y la clase II (chaperonina que contiene TCP-1 (CTT)) moléculas de chaperonina (Figuras 3 y 4) sobre la expresión Tat. Vía proteasómica de la ubiquitina. La vía proteasómica es el principal sistema proteolítico de células eucariotas [103]. Es importante destacar que la vía ubiquitina-proteasoma nuclear controla el suministro de proteínas ribosomales y es importante para la biogénesis ribosoma [104, 105]. El proteasoma 26S está compuesto por la partícula núcleo 20S (CP) y la partícula reguladora 19S (RP). Alternativamente, CP puede asociarse con el 11S RP para formar el inmunoproteasoma. Todas las proteínas cuantificadas en nuestro estudio son parte del complejo regulador 19S e incluyen PSMD2 (1,5 veces), PSMD3 (1,32 veces), PSMD11 (1,25 veces) y PSMD13 (0,72 veces), el único componente proteasoma significativamente agotado del nucleolo en presencia de Tat (Figura 4). Curiosamente, Tat interactúa con subunidades distintas del sistema proteasoma, incluyendo las subunidades 19S, 20S y 11S. Las consecuencias de estas interacciones incluyen la competencia de Tat con 11S RP o 19S RP para la unión al 20S CP, que resultó en la inhibición de la actividad de la peptidasa 20S [106, 107, 108, 109, 110, 111]. Además, Tat demostró modificar la composición proteosoma y la actividad, que afecta a la generación de antígenos péptidos reconocidos por linfocitos T citotóxicos [112]. Importantemente, un estudio reciente demostró que en ausencia de Tat, los componentes proteosomas están asociados al promotor del VIH-1 y la actividad proteosoma limita la transcripción [113]. La adición de Tat promovió la disociación de la subunidad 19S del proteasoma 20S, seguido por el enriquecimiento distintivo del complejo similar a 19S en extractos nucleares junto con el reclutamiento mediado por Tat de las subunidades 19S para el promotor del VIH-1, lo que facilitó su elongación transcripcional [113]. También cuantificamos UBA1 (1,36 veces), la ubiquitina-proteína ligasa UHRF1 (1,13 veces), UBC (1 veces) y dos Ubiquitinspecific-peptidases, USP30 (1,28 veces) y USP20 (0,06 veces) (Figura 4). Replicación y reparación del ADN. Tras la expresión del HIV-1 Tat, observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de varios factores celulares asociados con la replicación del ADN y las vías de reparación (Figura 4). Tat indujo el enriquecimiento coordinado del complejo MCM2-7 de mantenimiento cromosómico en miniatura (de 1.23-a 3,30 veces, respectivamente) [114]. MCM7, 6 y 3 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. El mantenimiento estructural de los cromosomas 2, SMC2, fue enriquecido (1,35 veces) en la fracción nucleolar por expresión Tat. SMC2 fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Mientras que el factor de replicación C1 (RFC1) y RFC2 (1,31 y 1,28 veces respectivamente) mostró un cambio de pliegue incrementado y RFC5/3 no se vieron afectados, RFC4 se redujo gravemente (0,69 veces) de la fracción nucleolar sobre la expresión Tat [115]. El RFC1 y RFC2 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Tat indujo el enriquecimiento de XRCC6 (1,27 veces) y XRCC5 (1,36 veces) en el nucleolo, que están involucrados en la reparación de la unión final del ADN no-homologoso (NHEJ) [116]. XRCC6 se asocia con complejos de preintegración viral que contienen HIV-1 Integrase y también interactúan con Tat y TAR [117, 118, 119]. Además, en una pantalla basada en ribozyme, el derribo del XRCC5 (Ku80) disminuyó tanto la integración retroviral como la transcripción Tatmediated [120]. Como parte de la reparación de la escisión base (BER), hemos identificado una importante endonucleasa apurínico/apirimidinica 1 (APEX1) (1,29 veces). Importantemente, en una pantalla de siRNA dirigida a los factores de reparación del ADN, se encontró que la reducción de APEX1 inhibe la infección por VIH-1 por más de 60% [121]. La proteína del grupo de alta movilidad (HMG) HMGA1 (1,30 veces), fue enriquecida en el nucleolo después de la expresión Tat [122]. HMGA1 interactúa con la integración del VIH-1 y forma parte del complejo de preintegración del VIH-1 [123, 124]. Importantemente, HMGA1 ha sido identificada en una pantalla proteómica, como un cofactor celular que interactúa con el VIH-1 59líder [125]. Metabolismo. Nuestros datos proteómicos sugieren que Tat induce perturbaciones en la glucólisis, la vía del fosfato pentosa y la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos (Figura 4 y Figura S7 ). En particular, en las células T que expresan Tat, detectamos cambios coordinados en la abundancia de proteínas no conocidas previamente que se asocian con la patogénesis del Tat, que revelaron conexiones inesperadas con la glicólisis y la vía del fosfato pentosa, incluyendo las siguientes enzimas glicólicas, lactato deshidrogenasa B (LDHB) (1,37 veces), la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1,17 veces) y la mutasa del ácido fosfoglicérico (PGAM1) (0,89 veces) (Figura 4 y Figura S En resumen, el GPI cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Posteriormente, el PFKP cataliza la conversión irreversible de fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato y es una enzima reguladora clave de la glucólisis. Al final de la vía glicolítica, PKM2, en su forma tetramérica, se sabe que genera ATP y piruvato, mientras que el LDHB desvía la mayoría del piruvato a la producción y regeneración de lactato de NAD+ en apoyo a la glicólisis continua, un fenómeno descrito para las células T proliferativas [126]. Esto regula la disponibilidad de los intermedios de glucosa, que se redirigen a las vías de la pentosa fosfato y de la serina biosíntesis para la producción de precursores biosintéticos de nucleótidos, fosfolípidos y aminoácidos. Como parte de la vía del fosfato de pentosa, hemos caracterizado el enriquecimiento significativo de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) (2,11 veces), que ramas de la vía de la glicólisis para generar NADPH, ribosa-5fosfato un precursor importante para la síntesis de nucleótidos. Consistente con esto, detectamos el aumento coordinado en la abundancia de enzimas que juega un papel central en la síntesis de purinas y pirimidinas. Más específicamente, IMPDH2 (1,66 veces), una enzima limitante de la tasa en el punto de rama de la biosíntesis de nucleótidos de purina, que conduce a la generación de nucleótidos de guanina, fosforibosil pirofosfato sintetasa 2 (PRPS2) (1,41 veces), cytidine-5-prime-trifosfato sintetasa (CTPS) (1,74 veces) que cataliza la conversión de UTP a CTP y la subunidad grande de ribonucleótido reductasa (RRM1) (1,56 veces). En parralel, observamos el aumento de la abundancia de la fosfoserina aminotransferasa PSAT1 (1,90 veces), una enzima implicada en la biosíntesis de serina, que se ha relacionado con la proliferación celular in vitro. La interfaz host-virus es un aspecto fundamental en la definición de la patogénesis molecular del VIH-1 [127, 128, 129, 130, 131, 132, 133]. De hecho, con su repertorio limitado de proteínas virales, el VIH-1 se basa ampliamente en la maquinaria de las células huésped para su replicación. Varios estudios recientes han capitalizado los recientes avances en las tecnologías ''OMICS'', y han revelado importantes perspectivas en este diálogo molecular finamente afinado [132, 134]. El VIH-1 Tat es esencial para la replicación viral y orquesta la expresión génica del VIH-1. La proteína reguladora viral es conocida por interactuar con una amplia gama de proteínas celulares y modular la expresión del gen celular y la vía de señalización [135, 136]. Nosotros y otros hemos utilizado enfoques a nivel del sistema para investigar la interacción Tat con la maquinaria de las células de acogida, que han caracterizado a HIV-1 Tat como mediador crítico de la interfaz host-viral [137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149]. Aquí, hemos investigado el tráfico de proteínas nucleolares en respuesta a la expresión HIV-1 Tat en células T, con el fin de proporcionar ideas únicas y novedosas sobre el papel de la compartimentación de proteínas por Tat en el ajuste fino de la disponibilidad de proteínas y la función. Hemos desarrollado para este estudio, un modelo celular utilizando Jurkat T-cells expresando firmemente Tat fusionado en su N-ternminal a TAP-tag. Es importante destacar que se han empleado ampliamente para evaluar la patogénesis mediada por Tat utilizando enfoques de todo el sistema y para analizar las vías y funciones de señalización celular clave de las células T [144, 150, 151, 152]. De hecho, hemos encontrado que son especialmente adecuadas para cultivos in vitro prolongados en el medio SILAC y posterior aislamiento de su nucleolo, seguido por el análisis de MS, que requiere hasta 85 millones de células. Fusionamos Tat a la etiqueta TAP para permitir futuras aplicaciones posteriores como purificación de afinidad de Tandem o análisis IP de Cromatina. Importantemente, hemos confirmado que la etiqueta TAP N-terminal no interfirió con la función Tat ni su localización en las células Jurkat, cuando se compara con la no etiquetada-Tat. Aunque se sabe que Tat se acumula en el núcleo y el nucleolo en las células de Jurkat y otras líneas celulares transformadas, en las células T primarias, Tat se describe para acumularse principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Estas diferencias permanecen por caracterizarse, pero podrían estar relacionadas con diferentes niveles de expresión de los factores de transporte en las líneas celulares transformadas versus las células primarias, como se describe recientemente por Kuusisto et al. [39]. Además, Stauber y Pavlakis han sugerido que la localización nucleolar Tat podría ser el resultado de la sobreexpresión Tat [31]. Aquí, hemos seleccionado y empleado una población policlonal de células T Jurkat que expresan Tat en diferentes niveles. Proponemos que esta heterogeneidad en los niveles de expresión Tat podría reflejar la expresión estocástica Ta Utilizando una estrategia proteómica cuantitativa basada en un enfoque organélaro, cuantificamos más de 520 proteínas nucleolares, incluyendo 49 proteínas que muestran un cambio significativo en el pliegue. La medida en que las variaciones inducidas en la abundancia de proteínas nucleolares son biológicamente relevantes y pueden afectar los procesos celulares y/o virales queda por determinar. Sin embargo, la naturaleza biológica de las vías y los complejos macromoleculares afectados nos permiten discutir sus posibles asociaciones con la patogénesis del VIH-1. El VIH-1 Tat se expresa tempranamente después de la integración del genoma del VIH-1 y media el cambio a la fase de producción viral, asociado con la expresión génica proviral robusta, el ensamblaje de proteínas virales y, en última instancia, el desarrollo y liberación de viriones. En este contexto y basado en nuestros resultados, proponemos que Tat podría participar en la configuración del entorno intracelular y el perfil metabólico de De hecho, observamos el enriquecimiento nucleolar distinto de proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica, lo que podría ser indicativo de un aumento en la síntesis proteica. Con la notable exepción de RPL35A depleción nucleolar, proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica estaban en las 20 proteínas nucleolares más enriquecidas (NHP2L1, RLP14, RPL17, RPL27, RPS2, RPL13). Además, este efecto parece ser específico del HIV-1 Tat ya que la inhibición de transcripción por Actinomicina D resultó en el agotamiento total de proteínas ribosómicas en el nucleolo [9]. Además, el análisis proteómico cuantitativo de las células nucleas en adenovirus infectados mostró una leve disminución en proteínas ribosómicas [24] Si esto refleja un cambio en la biogénesis del ribosoma y/o un cambio en la composición de las subunidades ribosomales queda por determinar. Sin embargo, la necesidad adaptada de una producción elevada del ribosoma es intuitiva para un sistema que necesita apoyar la creciente demanda de nueva síntesis de proteínas virales. En parralel, observamos la modulación concordante de las vías que regulan la homeostasis proteica. Observamos la significativa acumulación nucleolar de múltiples chaperonas moleculares incluyendo las HSPs, el complejo TCP-1, y moléculas CANX/CALR y la abundancia nucleolar interrumpida de proteínas pertenecientes a la vía ubiquitina-proteasoma, que controla el suministro de proteínas ribosomales [104, 105]. Estas observaciones apoyan estudios previos que describen la modulación de la actividad proteasómica por Tat, que afectan la expresión, el montaje y la localización de subunidades específicas de los complejos proteasómicos [106, 107, 108, 109, 110, 111, 113]. También observamos el agotamiento concomitante de CASP10 en el nucleolo de Jurkat TAP-Tat. Se ha sugerido que CASP10 podría estar dirigido al nucleolo para inhibir la síntesis proteica [154]. Curiosamente, la presencia y los roles potenciales de las chaperonas moleculares en el nucleolo han sido destacados por Banski et al, quienes explican cómo la red chaperona podría regular la biogénesis ribosómica, la señalización celular y la respuesta al estrés [97, 155]. A medida que la producción viral avanza hacia la fase tardía y aumenta el estrés celular, el enriquecimiento nucleolar de las chaperonas moleculares por Tat no sólo podría permitir el plegado de adequat de proteínas virales recién sintetizadas, sino que también podría promover la tolerancia de las células infectadas al estrés y mantener la viabilidad celular. Coincidentemente, observamos el marcado enriquecimiento nucleolar de enzimas pertenecientes a vías metabólicas incluyendo glicólisis, fosfato de pentosa, nucleótido y aminoácidos vías biosintéticas. Del mismo modo, estas vías se elevan en células T proliferativas o en células cancerosas después de un cambio metabólico a la glicólisis aeróbica, también conocido como el efecto Warburg [156, 157, 158, 159]. Allí, los intermedios de glucosa de la vía de la glicólisis no sólo se comprometen a la producción de energía y se descomponen en piruvato para el ciclo TCA, sino que se redirigen a vías alternativas, incluyendo la vía del fosfato de pentosa, y se utilizan como precursores metabólicos para producir nucleótidos, aminoácidos, acetil CoA y NADPH para la homeostasis redox. De manera consistente, también se observó el enriquecimiento nucleolar concomitante de enzimas pertenecientes a la vía de síntesis de nucleótidos, incluyendo IMPH2, una enzima limitante conocida para controlar el pool de GTP. De igual manera, se observó el enriquecimiento nucleolar de PSAT1, una enzima involucrada en el metabolismo de serina y treonina, que está asociada con la proliferación celular [160]. Colectivamente, proponemos que mediante el control de la homeostas Sin embargo, las enzimas glucolíticas han sido detectadas en las fracciones nuclear y nucleolar mediante análisis proteómicos [8, 161]. Además, las enzimas glucolíticas, como PKM2, LDH, fosfoglicerato cinasa, GAPDH y aldosa, también han sido reportadas para mostrar localización nuclear y unirse al ADN [162]. Más específicamente, PKM2 es conocido por asociarse con el promotor y participar en la regulación de la expresión génica como coactivador transcripcional [163]. HIV-1 Tat ha sido descrito previamente como un inmunoregulador y más específicamente, ha sido reportado tanto para inhibir o promover la señalización TCR [164]. Hemos observado el enriquecimiento nucleolar por Tat de componentes proximales o aguas abajo clave de las vías de señalización de células T, incluyendo ZAP70, ILF3 y STAT3, que juegan un papel crucial en el desarrollo y activación de células T. Anteriormente los habíamos identificado como componentes específicos de células T del nucleolo, y los estudios de IF sugirieron que su asociación con el nucleolo podría ser regulada por condiciones específicas [165]. Nuestros resultados apoyan aún más que Tat podría contribuir a la disregulación de las señales derivadas de TCR y que el nucleolo podría representar un importante enlace espacial para las moléculas de señalización TCR. Observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de componentes clave de las vías de replicación, recombinación y reparación del ADN por Tat. Estos incluyen XRCC5 y XRCC6, HMGA1, APEX1, MCM2-7, SMC2, RFC1 y RFC2, mientras que RFC4 se encontró significativamente agotado. Curiosamente, estos cofactores se han asociado con la eficiencia de la integración del ADN retroviral en el ADN del huésped o la integridad del provirus integrado [166]. Si la abundancia creciente de estos factores dentro del nucleolo podría estar asociada con su participación potencial en la integración y mantenimiento de la integridad del gen provirus, queda por determinar. Los mecanismos de segregación mediada por Tat y compartimentación de proteínas dentro o fuera del nucleolo pueden depender de factores inherentes para cada proteína y la naturaleza de su relación con Tat, ya que el fraccionamiento subcelular combinado con el análisis del WB mostró que el patrón y el grado de redistribución subcelular entre proteínas variaban. Pudimos observar casos en los que Tat regulaba la expresión de proteínas que resultaban en un aumento general de estas proteínas en los compartimentos celulares incluyendo el nucleolo (DDX3, TNPO1). Alternativamente, Tat podía desencadenar la translocación nucleolar de proteínas directamente desde el citoplasma o el nucleoplasma (pRb). Además, observamos proteínas citoplasmáticas redistribuidas tanto al nucleoplasma como al nucleolo sobre la expresión Tat (STAT3, ZAP70 y HSP90). Finalmente, también notamos el agotamiento proteico en la fracción nucleolar acompañado de un aumento en el nucleoplasma (SSRP1). Sigue siendo difícil en esta etapa, apreciar si la acumulación de proteínas específicas resultaría en su activación o inhibición al secuestrarlas de su lugar de acción. Por el contrario, el agotamiento de una proteína del nucleolus podría resultar en la regulación descendente de su actividad en este lugar o podría ser el resultado de su movilización desde su sitio de almacenamiento, el nucleolus, al nucleoplasma o citoplasma donde puede realizar su función. Cabe destacar que identificamos a varios socios conocidos del VIH-1 Tat involucrados en la patogénesis del VIH-1, lo que sugiere que Tat podría modular físicamente su objetivo nucleolar o su reclutamiento a un sitio específico en el nucleoplasma o citoplasma. Tat también podría promover modificaciones post-traducción, lo que podría mediar la focalización de proteínas específicas al nucleolus. Esto se ilustra por las siguientes proteínas enriquecidas, pRb, PP1 y STAT3, para lo que la fosforilación es inducida por Tat. Importantemente, su estado de fosforilación determina su distribución subcelular, proporcionando así un mecanismo Además, nuestros datos indican que las serinas/treoninas quinasas (CK2 a') y fosfatasas (PP1) se enriquecieron significativamente en las fracciones nucleolares de Jurkat TAP-Tat. Estas enzimas representan la mayor parte de la actividad de fosforilación/desfosforilación en el nucleolo y pueden actuar como reguladores del tráfico de proteínas nucleolares. Además, Tat disminuyó significativamente los niveles de SUMO-2 en el nucleolo. Del mismo modo, se sabe que las modificaciones posteriores a la traducción mediadas por SUMO modulan la localización de proteínas nucleolares [104]. Dada la importancia potencial de las modificaciones posteriores a la traducción, incluida la fosforilación en el cambio mediado por Tat de la abundancia de proteínas nucleolares, un enfoque proteomico más específico como el enriquecimiento de fosfopétidos El control de la rotación de proteínas también es un medio importante para modular la abundancia de proteínas nucleolares. Las proteínas ribosómicas son degradadas por la vía Ubiquitina-Proteasoma para asegurar que su abundancia coincida con los niveles de transcripción de rRNA. A la inversa, las proteínas de choque térmico HSP90s las protegen de la degradación. Curiosamente, nuestros datos muestran que la modulación Tat de las proteínas de abundancia asociadas con la vía Ubiquitina-proteasoma y choque térmico. Esto podría contribuir al enriquecimiento observado de proteínas ribosómicas por Tat. Sin embargo, no podemos excluir que la mayor abundancia de proteínas ribosómicas en el nucleolo podría ser el resultado de la prevención mediada por Tat de su exportación al citoplasma. Curiosamente, utilizando un sistema celular diferente, una cepa transgénica de Drosophila melanogaster Tat, Ponti et al, analizaron los efectos de Tat en la biogénesis ribosoma, después de 3 días de tratamiento de choque térmico para inducir la expresión Tat bajo el control del promotor hsp70 [167]. Después de la expresión Tat, observaron un defecto en el procesamiento pre-rRNA asociado con una disminución en el nivel de 80S ribosomas [167]. Sin embargo, los diferentes sistemas celulares empleados combinados con la inducción de choque térmico de 3 días hacen que sus resultados sean difíciles de comparar con los nuestros. Mientras que estudios anteriores a nivel de sistema han monitoreado los efectos de la expresión Tat del VIH-1 en las células T, a nuestro conocimiento, hemos presentado aquí el primer análisis proteómico de la composición dinámica del nucleolus en respuesta a la expresión Tat del VIH Utilizando proteómica cuantitativa, hemos subrayado los cambios en la abundancia de proteínas nucleolares específicas y hemos destacado la reorganización nucleolar extensa y coordinada en respuesta a la expresión constitutiva Tat. Nuestros hallazgos subrayan que Tat que expresa células T exhiben un perfil proteómico nucleolar único, que puede reflejar una estrategia viral para facilitar la progresión a la producción viral robusta. Importantemente, hemos notado la relación funcional de proteínas nucleolares de nuestro conjunto de datos con la patogénesis VIH-1 y el Tat VIH-1 en particular. Esto aumenta aún más nuestra confianza en nuestra estrategia experimental y sugiere un papel para Tat en el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares. Finalmente, nuestro estudio proporciona nuevas ideas sobre la importancia de Tat en la conversación cruzada entre funciones nucleolares y patogénesis viral. También hemos identificado cambios en la abundancia de proteínas nucleolares que no estaban previamente asociados con la patogénesis del VIH-1, incluyendo proteínas asociadas a vías metabólicas, que proporcionan nuevos objetivos potenciales y vías celulares para la intervención terapéutica.Células T Jurkat, clon E6.1 (ATCC), Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP se mantuvieron en el medio RPMI-1640 complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (Gibco, aprobado por la UE), y antibióticos. Células Phoenix-GP (G.P. Nolan; www.stanford.edu/ group/nolan/), se mantuvieron en el medio DMEM complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (GIBCO, aprobado por la UE). La secuencia de HIV-1 Tat (VIH-1 HXB2, 86 aminoácidos) fue subclonada en el vector pENTR 2B (Invitrogen, A10463). Usando la tecnología Gateway (Invitrogen), introdujimos la secuencia HIV-1 Tat en el plásmido pCeMM-NTAP(GS)-Gw [168]. Las células Fénix (G.P. Nolan; www.stanford.edu/group/nolan/), fueron transfectadas usando Fugene 6 (Roche) con 5 mg del plásmido NTAP-Tat o NTAP y 3 mg del pMDG-VSVG. Los sobrenadantes virales fueron recolectados después de 48 h, filtrados y utilizados para transducir las líneas celulares de Jurkat. La construcción se denomina NTAP-Ta Utilizando la entrega de genes retrovirales, transferimos de forma estable células Jurkat (clone E6.1 (ATCC)). Los clones positivos llamados Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron ordenados para enriquecer la población de células que expresaban GFP usando el clasificador de células BC MoFlo XDP (Beckman Coulter). Las fracciones subcelulares (10 mg) fueron resueltas por SDS-PAGE y transferidas a membranas BioTrace PVDF (Pall corporation). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: a-Tubulina (Sc 5286), C23 (Sc 6013), y Fibrilarina (Sc 25397) de Santa Cruz Biotechnology, y PARP (AM30) de Calbiochem, Ratón anti-ZAP 70 (05-253, Millipore), Ratón anti-STAT3 (06-596, Millipore), Ratón anti-ILF3 (ab92355, Abcam), Ratón anti-HSP90 beta (ab32568, Abcam), Ratón anti-ADAR1 (ab88574, Abcam), Ratón anti-HDAC1 (ab19845, Abcam), Ratón anti-SSRP1 (ab21584, Abcam) conejo anti-BOP1 (ab86982, Abcam), Ratón anti-KpNB1 (ab10303, Abcam), Ra Para el análisis SILAC-RPMI R0K0 y SILAC-RPMI R6K6 (Células Dundidas) se utilizó un medio con un 10% de FBS dializado (GIBCO, 26400-036); las células Jurkat que expresaban NTAP-Tat y NTAP fueron transitadas en serie y cultivadas durante cinco duplicados para asegurar la incorporación completa de los aminoácidos marcados; la viabilidad de las células se verificó con Trypan Blue (0,4% solución, SIGMA) y posteriormente se confirmó mediante tinción IP y análisis FACS; las células se mezclaron a la relación 1:1 para obtener 140610 6 células; los nucleoli fueron aislados de la población celular mixta como se describió previamente en Jarboui et al., [165]. Los extractos nucleolares (100 mg) fueron resuspendidos en bicarbonato de amonio de 50 mM y en solución de tripsina digerida como se describió previamente en Jarboui y col. [165]. La muestra se realizó en un espectrómetro de masa termoscientifico LTQ Orbitrap XL conectado a un sistema cromatógrafo NANO LC.1DPLUS que incorporaba una muestra automática. La muestra fue cargada en una columna Biobasic C18 PicofritTM (100 mm de longitud, 75 mm ID) y fue separada por un gradiente de acetonitrilo en aumento, utilizando un gradiente de 142 min de fase inversa (0-40% de acetonitrilo durante 110 min) a un caudal de 300 nL min-1. El espectrómetro de masa fue operado en modo iónico positivo con una temperatura capilar de 200uC, una tensión capilar de 46V, una tensión de lente de tubo de 140V y con un potencial de 1800V aplicada al frit. Todos los datos fueron adquiridos con el espectrómetro de masa que funciona en modo de conmutación automática dependiente de datos. Se realizó una exploración MS de alta resolución utilizando el Orbitrap para seleccionar los 5 iones más intensos antes del análisis MS/MS utilizando la trampa Ion. La eficiencia de incorporación de aminoácidos etiquetados fue determinada mediante el análisis de los péptidos identificados en nucleoli aislados de la población celular mantenida en el medio 'Heavy' como se describe en [169]. Nuestro análisis mostró que teníamos una eficiencia de incorporación.95% (datos no mostrados). Los espectros MS/MS fueron buscados para la identificación y cuantificación de los péptidos utilizando el software MaxQuant [170] (versión 1.1.1.36), la Base de Datos del IPI Humano (versión 3.83) y el motor de búsqueda Andrómeda asociado a MaxQuant [171]. Se utilizaron parámetros estándar para MaxQuant con el Acetil (término N de Proteína) como modificación variable y Carbamidometilo (Cys) como modificación fija, se permitieron 2 escisiónes perdidas, excepto que se prohibió el filtrado de aminoácidos etiquetados. La desviación de masa inicial de los iones precursores y fragmentos fue de 7 ppm y 0,5 Da, respectivamente. Cada relación proteica fue calculada como promedio ponderado de intensidad de los coeficientes de péptidos individuales. Las proteínas fueron identificadas con el mínimo de un péptido con una tasa La ontología genética, la vía KEGG y los términos Pfam se extrajeron de entradas UNIPROT utilizando Perseo, un software del paquete de análisis de datos MaxQuant (http://www.maxquant.org ), y las herramientas de la suite ToppGene [54]. El Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron transfectados utilizando el sistema de electroporación Amaxa (biosistema Amaxa) con el pGL3 (pGL3-LTR) (Promega) como recomendado por Amaxa Biosystem. Los ensayos de doble luciferasa (Promega) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de Luciferasa se midió y normalizó contra la cantidad total de proteínas cuantificada por el kit de cuantificación de proteínas BCA (Pierce, Thermo Scientific). Para preservar Las células se fijaron en un 2% PFA durante 10 minutos en RT, permeabilizaron en un 0,5% Triton X-100 durante 15 minutos en RT y se bloquearon con 5% FCS. Las células se incubaron con el anticuerpo Tat VIH-1 de conejo (ab43014, Abcam) seguido por el anticuerpo secundario anti-Rabbit alexa fluor 647 (A-21246, Invitrogen). Las células se les permitió unirse a Cell-Tak (BD) recubierto de Diapositivas Silanizadas (DaoCytomation), y manchado con DAPI. Las imágenes se capturaron con un Microscopio Confocal Carl Zeiss equipado con un objetivo DIC de aceite de Plan-Apocromat 63X/14. El archivo de datos RAW proteómicos del análisis de espectrometría de masas se depositó en el repositorio Tranche(http El archivo se puede acceder y descargar utilizando la siguiente clave de hash:(R3O5SV5Z6HvWqrBNDhp21tXFetluDWYxvwMIfU-h6e1kMgarauCSq4dlNcxeUvFOHDEzLeDcg4X5Y8reSb6-MUA6wM1kIAAAAAAB/w = ). Materiales y Métodos S1 Descripción de los métodos empleados para examinar el ciclo celular, la viabilidad celular y el análisis de proliferación celular. (DOCX)

¿Dónde se encontró la alfa-tubulina menos abundantemente en la celda?

Tráfico de proteínas nucleolares en respuesta al VIH-1 Tat: Rewiring the Nucleolushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499507/SHA: efa871aeaf22cbd0ce30e8bd1cb3d1afff2a98f9Autores: Jarboui, Mohamed Ali; Bidoia, Carlo; Woods, Elena; Roe, Barbara; Wynne, Kieran; Elia, Giuliano; Hall, William W.; Gautier, Virginie W.Fecha: 2012-11-15DOI: 10.1371/journal.pone.0048702Licencia: cc-byAbstract: La proteína Tat transactivante es una proteína reguladora viral esencial para la replicación del VIH-1. El nucleolo, un compartimento subnuclear altamente dinámico y estructurado sin membrana, es el sitio de ARNr y biogénesis ribosoma y está involucrado en numerosas funciones celulares incluyendo la regulación transcripcional, el control del ciclo celular y la infección viral. Importantemente, el tráfico nucleolar transitorio tanto de Tat como de las transcripciones virales del VIH-1 son críticos en la replicación del VIH-1, sin embargo, el(los) papel(es) del nucleolo en la replicación del VIH-1 sigue sin estar claro. Para entender mejor cómo la interacción de Tat con la maquinaria nucleolar contribuye a la patogénesis del VIH-1, investigamos los cambios cuantitativos en la composición del proteoma nucleolar de las células T de Jurkat que expresan establemente el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta TAP. Utilizando un enfoque proteómico organélaro basado en espectrometría de masas, junto con el etiquetado de isótopos estables en cultivo celular (SILAC), cuantificamos 520 proteínas, incluyendo 49 proteínas que muestran cambios significativos en la abundancia de nucleolos de células T de Jurkat sobre la expresión Tat. Numerosas proteínas que exhiben un cambio de pliegue fueron interactuadores Tat bien caracterizados y/o conocidos por ser críticos para la replicación del VIH-1. Esto sugiere que el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares por Tat proporcionan una capa adicional de control para regular la maquinaria celular involucrada en la patogénesis del VIH-1. El análisis del camino y la reconstrucción de la red revelaron que la expresión Tat resultó específicamente en el enriquecimiento nucleolar de proteínas que participan colectivamente en biogénesis ribosomal, homeostasis de proteínas, vías metabólicas incluyendo glucolítico, fosfato de pentosa, nucleótidos y aminoácidos vías biosintéticas, respuesta al estrés, vías de señalización de células T e integridad del genoma. Presentamos aquí el primer perfil diferencial del proteoma nucleolar de células T que expresan el HIV-1 Tat. Discutimos cómo estas proteínas participan colectivamente en redes interconectadas que convergen para adaptar las actividades dinámicas del nucleolus, que favorecen las actividades biosintéticas del huésped y pueden contribuir a crear un entorno celular que apoye la producción robusta del HIV-1. Texto: El nucleolus es un compartimento subnuclear altamente ordenado organizado alrededor de loci genéticos llamados regiones organizadoras nucleolares (NORs) formado por grupos de cientos de repeticiones de genes rDNA organizadas en repetición tándem cabeza a cola [1, 2]. Organelo sin membrana descrito originalmente como la ''Fábrica Ribosoma'', el nucleolus está dedicado a la transcripción de rDNA dirigida por ARN-polimerasa-I, procesamiento de rARN mediado por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (SORNPs) y conjunto ribosoma. La biogénesis del ribosoma es esencial para la síntesis de proteínas y la viabilidad celular [2] y, en última instancia, resulta en las subunidades ribosomales grandes (60S) y pequeñas (40S), que posteriormente se exportan al citoplasma. Este proceso celular fundamental, al que la célula dedica la mayor parte de sus recursos energéticos, está estrictamente regulado para adaptarse a los cambios dinámicos en la proliferación celular, la tasa de crecimiento y las actividades metabólicas [3]. El nucleolus es el sitio de procesamiento adicional de ARN, incluyendo la exportación y degradación de ARNm, la maduración de pequeños PNNR nucleares ricos en uridina (U snRNPs), que forman el núcleo del spliceosoma, biogénesis de ARNt y microARNs (miRNAs) [4]. El nucleolus también está involucrado en otros procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular, procesos oncogénicos, respuestas de estrés celular y traducción [4]. El concepto de nucleolo multifuncional y altamente dinámico ha sido corroborado por varios estudios que combinan enfoques proteómicos organelares y espectrometría cuantitativa de masas, y describen miles de proteínas que transitan por el nucleolo en respuesta a diversas condiciones metabólicas, estrés y ambientes celulares [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Colectivamente, los estudios mencionados representan hitos en la comprensión de la complejidad funcional del nucleolo, y demostraron que las proteínas nucleolares están en intercambio continuo con otros compartimentos nucleares y celulares en respuesta a determinadas condiciones celulares. Los estudios proteómicos que analizan los nucleoli de las células infectadas por el virus sincitial respiratorio humano (HRSV), el virus influenza A, el virus de la bronquitis infecciosa por coronavirus aviar (IBV) o el adenovirus destacaron cómo los virus pueden alterar de forma distintiva la distribución de proteínas nucleolares [2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Curiosamente, tanto las proteínas reguladoras del VIH-1 Tat como Rev localizan al nucleoplasma y al nucleolus. Ambas secuencias abarcan una señal de localización nucleolar (NoLS) que se superpone con su señal de localización nuclear (NLS), que rige su localización nucleolar [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. Además, Tat y Rev interactúan con el antígeno nucleolar B23 Sin embargo, un estudio reciente describió que en contraste con las células T de Jurkat y otras líneas celulares transformadas donde Tat está asociado con el núcleo y el nucleolo, en las células T primarias Tat se acumula principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Mientras que la regulación de su importación y/o exportación nuclear activa, como mediada por la familia de la carioferina/importación, se han descrito bien, los mecanismos que distribuyen Tat y Rev entre el citoplasma, el nucleoplasma y el nucleolo siguen siendo elusivos [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48]. Importantemente, dos estudios importantes de Machienzi y otros han revelado importantes vínculos funcionales entre la replicación del VIH-1 y el nucleo En primer lugar, podrían inhibir la replicación del VIH-1 y la función de transactivación Tat empleando un señuelo TAR dirigido específicamente al nucleolo. Además, utilizando un enfoque similar, con una ribozima anti-VIH-1 de cabeza martillo fusionada al ARN nucleolar pequeño U16 y por lo tanto dirigida al nucleolo, podrían suprimir dramáticamente la replicación del VIH-1. Colectivamente, estos hallazgos sugieren fuertemente que las transcripciones del VIH-1 y el tráfico nucleolar Tat son críticos para la replicación del VIH-1. Sin embargo, la naturaleza de estas contribuciones aún no se ha aclarado. En este informe, analizamos sistemáticamente las perturbaciones del proteoma nucleolar que ocurren en las células T de Jurkat expresando constitutivamente el VIH-1 Tat, utilizando un enfoque de espectrometría cuantitativa de masas. Después de la anotación detallada de los cambios cuantitativos de abundancia en la composición de la proteína nucleolar sobre la expresión Tat, nos centramos en los complejos celulares afectados por Tat y las vías de señalización asociadas con la biogénesis ribosoma, el spliceosoma, las chaperonas moleculares, la replicación y reparación del ADN y el metabolismo, y discutimos su posible implicación en la patogénesis del VIH-1. En este estudio, investigamos los cambios cuantitativos en el proteoma nucleolar de las células Jurkat T expresando constitutivamente el VIH-1 Tat (86aa) frente a su contraparte Tat negativo, utilizando el etiquetado estable de isótopos con aminoácidos en la tecnología de cultivo celular (SILAC), seguido por la espectrometría de masas en tándem ESI e implementamos el enfoque experimental descrito en la Figura 1A. En primer lugar, mediante la entrega de genes retrovirales, transferimos el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta de purificación de afinidad tándem (TAP) (constituido por dos proteínas G y un péptido de unión a estreptavidina) o TAP solo (vector de control) en el clon de células T de leucemia Jurkat E6-1 y clasificamos las células transducidas (GFP positivo) por FACS. Esto resultó en una población altamente enriquecida de células transducidas policlonales que presentaban diferentes niveles de expresión del transgén (Figura 1B). La funcionalidad del TAP-Tat fue confirmada mediante la transfección de las células TAP-Tat y TAP con un vector de genes reportero de luciferasa bajo el control del HIV-1 LTR (pGL3-LTR) [36]. Para abordar la funcionalidad de Tat fusionado a TAP, comparamos Jurkat TAP-Tat con Jurkat-tat, una línea celular que expresaba establemente Tat [51]. Ambas líneas celulares mostraron una actividad LTR del VIH-1 comparable después de la transfección con pGL3-LTR (Figura S1 ). A continuación, la expresión Tat y la localización subcelular fueron verificadas mediante fraccionamiento subcelular seguido por el análisis del WB (Figura 1E ). TAP-Tat mostró una localización nuclear/nucleolar prominente, pero también se pudo detectar en el citoplasma. Estas observaciones fueron además validadas mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 1E ). A continuación se comparó la tasa de crecimiento y proliferación de las líneas celulares de Jurkat TAP y TAP-Tat (Materiales y Métodos S1), que eran equivalentes (Figura S4A ). Del mismo modo, el análisis FACS confirmó que las poblaciones relativas en G1, S y G2/M eran similares para las células de Jurkat TAP-Tat y TAP (Figura S4B ). Se etiquetaron las células de Jurkat TAP-Tat y Jurkat TAP con isótopo ligero (R0K0) y pesado (R6K6) que contenían arginina y lisina, respectivamente. Después de cinco pasajes en su respectivo medio SILAC, se recolectaron 85 millones de células de cada cultivo, se agruparon y se aislaron sus nucleolis como se describió previamente (Figura 1A ) [52] Para evaluar la calidad de nuestro procedimiento de fraccionamiento, se investigó el enriquecimiento específico de antígenos nucleolares conocidos mediante el análisis Western Blot (Figura 1D). Se encontró que la nucleolina (110 kDa) y la fibrilarina (FBL) (34 kDa), dos proteínas nucleolares principales conocidas por localizar al componente granular del nucleolo, estaban muy enriquecidas en la fracción nucleolar mixta. Se observó que la nucleolina se distribuía igualmente entre las fracciones nuclear y citoplasmática. Este patrón de distribución de nucleolina parece ser específico para las células T de Jurkat, como se muestra anteriormente [52, 53]. La proteína nuclear PARP-1 (Poly ADPribose polimerasa 1) (113 kDa) estaba presente en la fracción nuclear y nucleoplasmática, pero se desplegó en la fracción La alfa-tubulina (50 kDa) fue altamente abundante en la fracción citoplasmática y débilmente detectada en las fracciones nucleares. Colectivamente, estos resultados confirmaron que nuestros métodos produjeron una fracción nucleolar altamente enriquecida sin contaminación cruzada significativa. Posteriormente, la mezcla de proteína nucleolar fue tripsindigerida y los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas. El análisis proteomico cuantitativo comparativo se realizó utilizando MaxQuant para analizar las proporciones en isótopos para cada péptido identificado. Se cuantificó un total de 2427 péptidos, representando 520 proteínas nucleolares cuantificadas. La lista completa anotada de proteínas nucleolares cuantificadas está disponible en la Tabla S1 y los datos brutos del análisis de espectrometría de masas se depositaron en la base de datos de repositorios Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/), a la que se puede acceder utilizando las claves de hash descritas en materiales y métodos. Anotamos las proteínas cuantificadas utilizando las herramientas ToppGene Suite [54] y extrajimos las anotaciones de Gene Onthology (GO) e InterPro [55]. El análisis de los procesos biológicos GO (Figura 1F ) reveló que los procesos biológicos mejor representados incluían la transcripción (24%), el procesamiento de ARN (23%), el proceso del ciclo celular (13%) y la organización cromosómica (15%), que refleja las funciones asociadas nucleolares y es comparable a nuestra caracterización anterior del proteoma nucleo El análisis de distribución subcelular (Figura 1F ) reveló que nuestro conjunto de datos contenía proteínas conocidas por localizarse en el nucleolo (49%), en el núcleo (24%) mientras que el 15% de las proteínas estaban descritas previamente para residir exclusivamente en el citoplasma. La distribución subcelular fue similar a nuestro análisis anterior del proteoma nucleolar de células T de Jurkat [52]. Tabla S1. La distribución de las relaciones proteicas se representan en la Figura 1G como log 2 (cambio de abundancia). Las relaciones SILAC indican cambios en la abundancia proteica en la fracción nucleolar de las células TAP de Jurkat en comparación con las células TAP de Jurkat. La distribución de las proteínas cuantificadas siguió una distribución gaussiana (Figura 1G ). Un total de 49 proteínas nucleolares exhibieron un cambio significativo de 1,5 veces o mayor Las células no mostraron cambios en el contenido en estado estacionario de algunos de los principales y abundantes componentes del nucleolo, incluyendo nucleofosfmina (NPM1/ B23), C23, FBL, proteína nucleolar P120 (NOL1) y proteína nucleolar 5A (NOL5A). Las distintas proporciones de cambios proteicos sobre la expresión Tat podrían reflejar la reorganización nucleolar específica y las actividades alteradas del nucleolo. Realizamos el análisis del WB para validar los resultados basados en SILAC obtenidos por nuestro enfoque proteómico cuantitativo (Figura 2 ). 15 proteínas seleccionadas mostraron intensidad diferencial en las fracciones nucleolares sobre la expresión Tat, incluyendo 9 enriquecidos (HSP90b, STAT3, pRb, CK2a, CK2a', HSP90a, Transportin, ZAP70, DDX3), y 3 agotados (ILF3, BOP1 y SSRP1) proteínas. Además, también probamos por el análisis WB, abundancia de proteínas no afectada por la expresión Tat (Importin beta, FBL, B23, C23). Estos resultados destacan la concordancia en la tendencia de las proporciones correspondientes de SILAC, a pesar de algunas diferencias en los rangos cuantitativos. Cabe destacar que, usando WB, pudimos observar un cambio de intensidad para la proteína con un cambio de pliegue SILAC tan bajo como 1,25 veces. Por un lado, el umbral de los cambios en la abundancia de proteínas se puede determinar estadísticamente y luego destacar los cambios en la abundancia más grandes como se ilustra en la Tabla 1. Alternativamente, el enriquecimiento o agotamiento coordinado de la mayoría de las proteínas pertenecientes a un complejo o vía celular distinto permitiría la definición de un grupo de proteínas de interés y potencial significación. Por lo tanto, nos centramos en proteínas individuales enriquecidas o agotadas con actividades asociadas con la patogénesis molecular del VIH-1 o Tat, y en modificaciones agrupadas que afectan vías de señalización celular enteras y complejos macromoleculares. Inicialmente nos centramos en las proteínas de señalización que interactúan con Tat y/o la patogénesis molecular asociada del VIH-1 y cuya abundancia en el nucleolo fue modulada por la expresión Tat. Fosfo-proteína fosfatasas. Fosfo-proteína fosfatasa PP1 y PP2A son esenciales Es importante destacar que el PP1 representa el 80% de la actividad de la fosfatasa Ser/Thr dentro del nucleolo. En nuestro estudio, el PP1 fue potencialmente enriquecido por 1,52 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat, lo que apoya estudios previos que describen el objetivo nuclear y nucleolar de PP1a por el HIV-1 Tat y cómo PP1 aumenta la regulación de la transcripción del VIH-1 [58, 59, 60, 61, 62]. El PP1 c también fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro [63]. Curiosamente, la asociación Tat con los promotores de la subunidad PP2A resulta en la sobreexpresión y regulación de la actividad PP2A en linfocitos [64, 65]. Además, PP2A contribuye a la regulación de la transcripción y replicación del VIH-1 [61, 66]. Retinoblastoma Protein. El gen supresor tumoral pRb protein mostró un cambio de 1,4 veces en el nucleolus sobre la expresión Tat [67]. Además, el análisis WB confirmó la translocación distinta del pRb del nucleoplasma al nucleolus por Tat (Figura 2 ). Dependiendo del tipo de célula, pRb puede ser hiperfosforilado o hipofosforilado sobre la expresión Tat y puede regular negativamente o positivamente la transcripción mediada por Tat respectivamente [68, 69, 70]. Curiosamente, la hiperfosforilación de los desencadenantes del pRB en su translocación en el nucleolo [71]. La fosforilación del pRB también se asocia con un aumento de la biogénesis ribosómica y el crecimiento celular [72]. STAT3. El transductor de señal de factor de transcripción y activador de la transcripción 3 (STAT3) se enriqueció significativamente (1,86 veces) en la fracción nucleolar por la expresión constitutiva Tat. Además, el análisis WB indicó que la expresión Tat podría promover la relocalización del STAT3 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento distinto en el nucleolo (Figura 2). Curiosamente, estudios anteriores han demostrado la activación mediada por Tat de la señalización STAT3, como lo demuestra su estado de fosforilación [73]. Curiosamente, la fosforilación STAT3 indujo la dimerización de la proteína después de su translocación al núcleo [74]. YBX1. YBX1, la proteína multifuncional de unión al ADN/ARN fue enriquecida por 1,38 veces en el nucleolo de las células de Jurkat sobre la expresión Tat. Curiosamente, YBX1 interactúa con Tat y TAR y modula la expresión génica del VIH-1 [63, 75]. ZAP70. La proteína tirosina cinasa ZAP70 (proteína quinasa asociada a la cadena Zeta 70) fue enriquecida por 1,24 veces en el nucleolo de las células de Jurkat expresando Tat [76]. Además, el análisis del WB reveló que la expresión Tat podría promover la relocalización del ZAP70 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento La proteína de matriz nuclear interna, Matrin 3 (MATR3), presentó un cambio de 1,39 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat. Se localiza en el nucleolasmo con un patrón difuso excluido de los nucleolos [77]. La matrin 3 ha sido identificada como parte del nucleoloma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Dos estudios recientes han descrito a la matrin 3 como parte de complejos de ribonucleoproteínas, incluyendo también el VIH-1 Rev y (elemento de respuesta Rev) RRE que contiene ARN VIH-1, y promoviendo la regulación post-transcripción del VIH-1 [78, 79, 80]. CASP10. La molécula pro-apotótica de señalización, Caspasa 10 (CASP10), se agotó significativamente de las células nucleolus de Jurkat-Tat (0,82 veces) [81]. Importantemente, la expresión Tat desregula la expresión y actividad de CASP10 en las células Jurkat [82]. ADAR1. Adenosina deaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR1), que convierte las adenosinas en inosinas en ARN de doble cadena, se agotó significativamente del nucleolus de las células Jurkat-Tat (0,78 veces). Curiosamente, ADAR1 sobreexpresión regula la replicación del VIH-1 a través de un mecanismo de edición del ARN [83, 84, 85, 86, 87, 88]. Además, ADAR1 pertenece al interactoroma nuclear in vitro Para subrayar las relaciones estructurales y funcionales de las proteínas nucleolares afectadas por el VIH-1 Tat, construimos una representación en red de nuestro conjunto de datos. Utilizamos la versión 2.6.3 de Cytoscape [89] y utilizando el plugin MiMI [90] para mapear interacciones previamente caracterizadas, extraídas de bases de datos de interacción de proteínas (BIND, DIP, HPRD, CCSB, Reactome, IntAct y MINT), lo que resultó en una red altamente densa y conectada que incluía 416 proteínas (nodos) de las 536 proteínas, unidas por 5060 interacciones no dirigidas (borde) (Figura 3A). El análisis de centralidad reveló un umbral de 23.7 interacciones por proteína. El análisis de topología utilizando el plugin CentiScaPe [91] mostró que la distribución del grado de nodo sigue una ley de energía (Figura S5 Es importante destacar que cuando analizamos la distribución del coeficiente de agrupamiento (Figura S6 ) encontramos que la red está organizada en una arquitectura jerárquica [92], donde los nodos conectados forman parte de áreas altamente agrupadas mantenidas por pocos hubs organizados alrededor del HIV-1 Tat. Además, el análisis de la conexión en grados nodos de nuestra red identificó al HIV-1 Tat como la proteína más conectada (Figura S6 ). Específicamente, el análisis de topología indicó que los valores para las centrales Tat eran los más altos (grado de nodo, estrés, radialidad, cercanía, entreess y centroides), caracterizando a Tat como la proteína principal del hub de la red nucleolar. De hecho, un total de 146 proteínas han sido descritas previamente para interactuar con Tat (Figura 3B, Tabla S2 ). Estas proteínas están involucradas En paralelo, caracterizamos la magnitud de los cambios de abundancia proteica relacionados observados en distintas vías celulares (Figura 4). Biogénesis ribosomal. Inicialmente nos centramos en la biogénesis ribosoma, función primaria del nucleolo. Pudimos observar un aumento general y coordinado en la abundancia de proteínas ribosomales en el nucleolo por expresión Tat (Figura 4 ). Mientras algunas proteínas ribosomales permanecían inalteradas, Tat causó la acumulación nucleolar de varias proteínas ribosomas grandes y pequeñas distintas, excepto RPL35A, para las cuales la expresión Tat causó una marcada disminución en el nivel nucleolar (0,29 veces). Asimismo, varias proteínas involucradas en el procesamiento de ARNr exhibieron un aumento general en la acumulación nucleolar sobre la expresión Tat. Estos incluyen a los miembros canónicos humanos de la familia L7ae junto con los miembros que participan en la Caja C/D, H/ACA y U3 snoRNPs (Figura 4). Por el contrario, BOP1, un componente del complejo PeBoW (Pescadillo Bop1 WDR12) esencial para la maduración de la subunidad ribosómica grande, se agotó significativamente del nucleolo de las células TAP-Tat Jurkat (0,81 veces) y esto fue confirmado por el análisis WB (Figura 2 ) [93]. Sin embargo, los otros componentes complejos PeBoW, Pes1 (0,94 veces) y WDR12 (1,1 veces), no fueron afectados por la expresión Tat. Se identificaron y cuantificaron en nuestro conjunto de datos 55 proteínas de las 108 proteínas spliceosomal conocidas [94]. Estas proteínas incluyen las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares U1, U2 y U5, Sm D1, D2, D3, F y B, y las heterogéneas ribonucleoproteínas nucleares. Nuestros datos sugieren un aumento distinto en la abundancia de proteínas específicas complejas del spliceosoma tras la expresión de HIV-1 Tat en células T de Jurkat (Figuras 3 y 4). Las únicas tres proteínas que se agotaron significativamente del nucleolo tras la expresión del HIV-1 Tat fueron RBMX (0,89 veces), HNRNPA2B1 (0,84 veces) y SNRPA (0,81 veces). Varias investigaciones mostraron alteración de la expresión en los factores de empalme celular en células infectadas por HIV-1 [95, 96] Hemos identificado varias chaperonas moleculares, cochaperonas y otros factores involucrados en la proteostasis para ser altamente enriquecidos en el nucleolo de las células T sobre la expresión Tat (Figuras 3 y 4), muchos de los cuales fueron previamente caracterizados como parte del interactoroma nuclear Tat [63]. Varias proteínas de choque térmico incluyendo DNAJs, específicas HSP90, HSP70 y HSP40 isoformas y sus cofactores se enriquecieron distintivamente en la fracción nucleolar de las células Jurkat expresando Tat (Figura 4 ). Como lo muestra WB, mientras que HSP90a y b son principalmente citoplasmáticas, la expresión Tat desencadena su relocalización al núcleo y nucleolus, corroborando nuestro enfoque cuantitativo proteómico (Figura 2). Del mismo modo, el choque térmico puede hacer que el HSP90 y el HSP70 se reubiquen en el nucleolo [97, 98, 99, 100, 101]. En un estudio reciente, el grupo de Fassati ha demostrado que el HSP90 está presente en el promotor del VIH-1 y puede regular directamente la expresión génica viral [102]. También observamos el aumento coordinado de la abundancia de la clase I (GroEL y GroES) y la clase II (chaperonina que contiene TCP-1 (CTT)) moléculas de chaperonina (Figuras 3 y 4) sobre la expresión Tat. Vía proteasómica de la ubiquitina. La vía proteasómica es el principal sistema proteolítico de células eucariotas [103]. Es importante destacar que la vía ubiquitina-proteasoma nuclear controla el suministro de proteínas ribosomales y es importante para la biogénesis ribosoma [104, 105]. El proteasoma 26S está compuesto por la partícula núcleo 20S (CP) y la partícula reguladora 19S (RP). Alternativamente, CP puede asociarse con el 11S RP para formar el inmunoproteasoma. Todas las proteínas cuantificadas en nuestro estudio son parte del complejo regulador 19S e incluyen PSMD2 (1,5 veces), PSMD3 (1,32 veces), PSMD11 (1,25 veces) y PSMD13 (0,72 veces), el único componente proteasoma significativamente agotado del nucleolo en presencia de Tat (Figura 4). Curiosamente, Tat interactúa con subunidades distintas del sistema proteasoma, incluyendo las subunidades 19S, 20S y 11S. Las consecuencias de estas interacciones incluyen la competencia de Tat con 11S RP o 19S RP para la unión al 20S CP, que resultó en la inhibición de la actividad de la peptidasa 20S [106, 107, 108, 109, 110, 111]. Además, Tat demostró modificar la composición proteosoma y la actividad, que afecta a la generación de antígenos péptidos reconocidos por linfocitos T citotóxicos [112]. Importantemente, un estudio reciente demostró que en ausencia de Tat, los componentes proteosomas están asociados al promotor del VIH-1 y la actividad proteosoma limita la transcripción [113]. La adición de Tat promovió la disociación de la subunidad 19S del proteasoma 20S, seguido por el enriquecimiento distintivo del complejo similar a 19S en extractos nucleares junto con el reclutamiento mediado por Tat de las subunidades 19S para el promotor del VIH-1, lo que facilitó su elongación transcripcional [113]. También cuantificamos UBA1 (1,36 veces), la ubiquitina-proteína ligasa UHRF1 (1,13 veces), UBC (1 veces) y dos Ubiquitinspecific-peptidases, USP30 (1,28 veces) y USP20 (0,06 veces) (Figura 4). Replicación y reparación del ADN. Tras la expresión del HIV-1 Tat, observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de varios factores celulares asociados con la replicación del ADN y las vías de reparación (Figura 4). Tat indujo el enriquecimiento coordinado del complejo MCM2-7 de mantenimiento cromosómico en miniatura (de 1.23-a 3,30 veces, respectivamente) [114]. MCM7, 6 y 3 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. El mantenimiento estructural de los cromosomas 2, SMC2, fue enriquecido (1,35 veces) en la fracción nucleolar por expresión Tat. SMC2 fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Mientras que el factor de replicación C1 (RFC1) y RFC2 (1,31 y 1,28 veces respectivamente) mostró un cambio de pliegue incrementado y RFC5/3 no se vieron afectados, RFC4 se redujo gravemente (0,69 veces) de la fracción nucleolar sobre la expresión Tat [115]. El RFC1 y RFC2 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Tat indujo el enriquecimiento de XRCC6 (1,27 veces) y XRCC5 (1,36 veces) en el nucleolo, que están involucrados en la reparación de la unión final del ADN no-homologoso (NHEJ) [116]. XRCC6 se asocia con complejos de preintegración viral que contienen HIV-1 Integrase y también interactúan con Tat y TAR [117, 118, 119]. Además, en una pantalla basada en ribozyme, el derribo del XRCC5 (Ku80) disminuyó tanto la integración retroviral como la transcripción Tatmediated [120]. Como parte de la reparación de la escisión base (BER), hemos identificado una importante endonucleasa apurínico/apirimidinica 1 (APEX1) (1,29 veces). Importantemente, en una pantalla de siRNA dirigida a los factores de reparación del ADN, se encontró que la reducción de APEX1 inhibe la infección por VIH-1 por más de 60% [121]. La proteína del grupo de alta movilidad (HMG) HMGA1 (1,30 veces), fue enriquecida en el nucleolo después de la expresión Tat [122]. HMGA1 interactúa con la integración del VIH-1 y forma parte del complejo de preintegración del VIH-1 [123, 124]. Importantemente, HMGA1 ha sido identificada en una pantalla proteómica, como un cofactor celular que interactúa con el VIH-1 59líder [125]. Metabolismo. Nuestros datos proteómicos sugieren que Tat induce perturbaciones en la glucólisis, la vía del fosfato pentosa y la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos (Figura 4 y Figura S7 ). En particular, en las células T que expresan Tat, detectamos cambios coordinados en la abundancia de proteínas no conocidas previamente que se asocian con la patogénesis del Tat, que revelaron conexiones inesperadas con la glicólisis y la vía del fosfato pentosa, incluyendo las siguientes enzimas glicólicas, lactato deshidrogenasa B (LDHB) (1,37 veces), la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1,17 veces) y la mutasa del ácido fosfoglicérico (PGAM1) (0,89 veces) (Figura 4 y Figura S En resumen, el GPI cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Posteriormente, el PFKP cataliza la conversión irreversible de fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato y es una enzima reguladora clave de la glucólisis. Al final de la vía glicolítica, PKM2, en su forma tetramérica, se sabe que genera ATP y piruvato, mientras que el LDHB desvía la mayoría del piruvato a la producción y regeneración de lactato de NAD+ en apoyo a la glicólisis continua, un fenómeno descrito para las células T proliferativas [126]. Esto regula la disponibilidad de los intermedios de glucosa, que se redirigen a las vías de la pentosa fosfato y de la serina biosíntesis para la producción de precursores biosintéticos de nucleótidos, fosfolípidos y aminoácidos. Como parte de la vía del fosfato de pentosa, hemos caracterizado el enriquecimiento significativo de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) (2,11 veces), que ramas de la vía de la glicólisis para generar NADPH, ribosa-5fosfato un precursor importante para la síntesis de nucleótidos. Consistente con esto, detectamos el aumento coordinado en la abundancia de enzimas que juega un papel central en la síntesis de purinas y pirimidinas. Más específicamente, IMPDH2 (1,66 veces), una enzima limitante de la tasa en el punto de rama de la biosíntesis de nucleótidos de purina, que conduce a la generación de nucleótidos de guanina, fosforibosil pirofosfato sintetasa 2 (PRPS2) (1,41 veces), cytidine-5-prime-trifosfato sintetasa (CTPS) (1,74 veces) que cataliza la conversión de UTP a CTP y la subunidad grande de ribonucleótido reductasa (RRM1) (1,56 veces). En parralel, observamos el aumento de la abundancia de la fosfoserina aminotransferasa PSAT1 (1,90 veces), una enzima implicada en la biosíntesis de serina, que se ha relacionado con la proliferación celular in vitro. La interfaz host-virus es un aspecto fundamental en la definición de la patogénesis molecular del VIH-1 [127, 128, 129, 130, 131, 132, 133]. De hecho, con su repertorio limitado de proteínas virales, el VIH-1 se basa ampliamente en la maquinaria de las células huésped para su replicación. Varios estudios recientes han capitalizado los recientes avances en las tecnologías ''OMICS'', y han revelado importantes perspectivas en este diálogo molecular finamente afinado [132, 134]. El VIH-1 Tat es esencial para la replicación viral y orquesta la expresión génica del VIH-1. La proteína reguladora viral es conocida por interactuar con una amplia gama de proteínas celulares y modular la expresión del gen celular y la vía de señalización [135, 136]. Nosotros y otros hemos utilizado enfoques a nivel del sistema para investigar la interacción Tat con la maquinaria de las células de acogida, que han caracterizado al HIV-1 Tat como un mediador crítico de la interfaz host-viral [137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149]. Aquí, hemos investigado el tráfico de proteínas nucleolares en respuesta a la expresión HIV-1 Tat en células T, con el fin de proporcionar ideas únicas y novedosas sobre el papel de la compartimentación de proteínas por Tat en el ajuste fino de la disponibilidad de proteínas y la función. Hemos desarrollado para este estudio, un modelo celular utilizando Jurkat T-cells expresando firmemente Tat fusionado en su N-ternminal a TAP-tag. Jurkat T-cells son robustos y presentan la ventaja de crecer sin estímulos y se transducen fácilmente utilizando Es importante destacar que se han empleado ampliamente para evaluar la patogénesis mediada por Tat utilizando enfoques de todo el sistema y para analizar las vías y funciones de señalización celular clave de las células T [144, 150, 151, 152]. De hecho, hemos encontrado que son especialmente adecuadas para cultivos in vitro prolongados en el medio SILAC y posterior aislamiento de su nucleolo, seguido por el análisis de MS, que requiere hasta 85 millones de células. Fusionamos Tat a la etiqueta TAP para permitir futuras aplicaciones posteriores como purificación de afinidad de Tandem o análisis IP de Cromatina. Importantemente, hemos confirmado que la etiqueta TAP N-terminal no interfirió con la función Tat ni su localización en las células Jurkat, cuando se compara con la no etiquetada-Tat. Aunque se sabe que Tat se acumula en el núcleo y el nucleolo en las células de Jurkat y otras líneas celulares transformadas, en las células T primarias, Tat se describe para acumularse principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Estas diferencias permanecen por caracterizarse, pero podrían estar relacionadas con diferentes niveles de expresión de los factores de transporte en las líneas celulares transformadas versus las células primarias, como se describe recientemente por Kuusisto et al. [39]. Además, Stauber y Pavlakis han sugerido que la localización nucleolar Tat podría ser el resultado de la sobreexpresión Tat [31]. Aquí, hemos seleccionado y empleado una población policlonal de células T Jurkat que expresan Tat en diferentes niveles. Proponemos que esta heterogeneidad en los niveles de expresión Tat podría reflejar la expresión estocástica Ta Utilizando una estrategia proteómica cuantitativa basada en un enfoque organélaro, cuantificamos más de 520 proteínas nucleolares, incluyendo 49 proteínas que muestran un cambio significativo en el pliegue. La medida en que las variaciones inducidas en la abundancia de proteínas nucleolares son biológicamente relevantes y pueden afectar los procesos celulares y/o virales queda por determinar. Sin embargo, la naturaleza biológica de las vías y los complejos macromoleculares afectados nos permiten discutir sus posibles asociaciones con la patogénesis del VIH-1. El VIH-1 Tat se expresa tempranamente después de la integración del genoma del VIH-1 y media el cambio a la fase de producción viral, asociado con la expresión génica proviral robusta, el ensamblaje de proteínas virales y, en última instancia, el desarrollo y liberación de viriones. En este contexto y basado en nuestros resultados, proponemos que Tat podría participar en la configuración del entorno intracelular y el perfil metabólico de De hecho, observamos el enriquecimiento nucleolar distinto de proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica, lo que podría ser indicativo de un aumento en la síntesis proteica. Con la notable exepción de RPL35A depleción nucleolar, proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica estaban en las 20 proteínas nucleolares más enriquecidas (NHP2L1, RLP14, RPL17, RPL27, RPS2, RPL13). Además, este efecto parece ser específico del HIV-1 Tat ya que la inhibición de transcripción por Actinomicina D resultó en el agotamiento total de proteínas ribosómicas en el nucleolo [9]. Además, el análisis proteómico cuantitativo de las células nucleas en adenovirus infectados mostró una leve disminución en proteínas ribosómicas [24] Si esto refleja un cambio en la biogénesis del ribosoma y/o un cambio en la composición de las subunidades ribosomales queda por determinar. Sin embargo, la necesidad adaptada de una producción elevada del ribosoma es intuitiva para un sistema que necesita apoyar la creciente demanda de nueva síntesis de proteínas virales. En parralel, observamos la modulación concordante de las vías que regulan la homeostasis proteica. Observamos la significativa acumulación nucleolar de múltiples chaperonas moleculares incluyendo las HSPs, el complejo TCP-1, y moléculas CANX/CALR y la abundancia nucleolar interrumpida de proteínas pertenecientes a la vía ubiquitina-proteasoma, que controla el suministro de proteínas ribosomales [104, 105]. Estas observaciones apoyan estudios previos que describen la modulación de la actividad proteasómica por Tat, que afectan a la expresión, el montaje y la localización de subunidades específicas de los complejos proteasómicos [106, 107, 108, 109, 110, 111, 113]. También observamos el agotamiento concomitante de CASP10 en el nucleolo de Jurkat TAP-Tat. Se ha sugerido que CASP10 podría estar dirigido al nucleolo para inhibir la síntesis proteica [154]. Curiosamente, la presencia y los papeles potenciales de las chaperonas moleculares en el nucleolo han sido destacados por Banski et al, quienes explican cómo la red chaperona podría regular la biogénesis ribosoma, la señalización celular y la respuesta al estrés [97, 155]. A medida que la producción viral avanza hacia la fase tardía y aumenta el estrés celular, el enriquecimiento nucleolar de las chaperonas moleculares por Tat no sólo podría permitir el plegado de adequat de proteínas virales recién sintetizadas, sino que también podría promover la tolerancia de las células infectadas al estrés y mantener la viabilidad celular. Coincidentemente, observamos el marcado enriquecimiento nucleolar de enzimas pertenecientes a vías metabólicas incluyendo glicólisis, fosfato de pentosa, nucleótido y aminoácidos vías biosintéticas. Del mismo modo, estas vías se elevan en células T proliferativas o en células cancerosas después de un cambio metabólico a la glicólisis aeróbica, también conocido como el efecto Warburg [156, 157, 158, 159]. Allí, los intermedios de glucosa de la vía de la glicólisis no sólo se comprometen a la producción de energía y se descomponen en piruvato para el ciclo TCA, sino que se redirigen a vías alternativas, incluyendo la vía del fosfato de pentosa, y se utilizan como precursores metabólicos para producir nucleótidos, aminoácidos, acetil CoA y NADPH para la homeostasis redox. De manera consistente, también se observó el enriquecimiento nucleolar concomitante de enzimas pertenecientes a la vía de síntesis de nucleótidos, incluyendo IMPH2, una enzima limitante conocida para controlar el pool de GTP. De igual manera, se observó el enriquecimiento nucleolar de PSAT1, una enzima involucrada en el metabolismo de serina y treonina, que está asociada con la proliferación celular [160]. Colectivamente, proponemos que mediante el control de la homeostas Sin embargo, las enzimas glucolíticas han sido detectadas en las fracciones nuclear y nucleolar mediante análisis proteómicos [8, 161]. Además, las enzimas glucolíticas, como PKM2, LDH, fosfoglicerato cinasa, GAPDH y aldosa, también han sido reportadas para mostrar localización nuclear y unirse al ADN [162]. Más específicamente, PKM2 es conocido por asociarse con el promotor y participar en la regulación de la expresión génica como coactivador transcripcional [163]. HIV-1 Tat ha sido descrito previamente como un inmunoregulador y más específicamente, ha sido reportado tanto para inhibir o promover la señalización TCR [164]. Hemos observado el enriquecimiento nucleolar por Tat de componentes proximales o aguas abajo clave de las vías de señalización de células T, incluyendo ZAP70, ILF3 y STAT3, que juegan un papel crucial en el desarrollo y activación de células T. Anteriormente los habíamos identificado como componentes específicos de células T del nucleolo, y los estudios de IF sugirieron que su asociación con el nucleolo podría ser regulada por condiciones específicas [165]. Nuestros resultados apoyan aún más que Tat podría contribuir a la disregulación de las señales derivadas de TCR y que el nucleolo podría representar un importante enlace espacial para las moléculas de señalización TCR. Observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de componentes clave de las vías de replicación, recombinación y reparación del ADN por Tat. Estos incluyen XRCC5 y XRCC6, HMGA1, APEX1, MCM2-7, SMC2, RFC1 y RFC2, mientras que RFC4 se encontró significativamente agotado. Curiosamente, estos cofactores se han asociado con la eficiencia de la integración del ADN retroviral en el ADN del huésped o la integridad del provirus integrado [166]. Si la abundancia creciente de estos factores dentro del nucleolo podría estar asociada con su participación potencial en la integración y mantenimiento de la integridad del gen provirus, queda por determinar. Los mecanismos de segregación mediada por Tat y compartimentación de proteínas dentro o fuera del nucleolo pueden depender de factores inherentes para cada proteína y la naturaleza de su relación con Tat, ya que el fraccionamiento subcelular combinado con el análisis del WB mostró que el patrón y el grado de redistribución subcelular entre proteínas variaban. Pudimos observar casos en los que Tat regulaba la expresión de proteínas que resultaban en un aumento general de estas proteínas en los compartimentos celulares incluyendo el nucleolo (DDX3, TNPO1). Alternativamente, Tat podía desencadenar la translocación nucleolar de proteínas directamente desde el citoplasma o el nucleoplasma (pRb). Además, observamos proteínas citoplasmáticas redistribuidas tanto al nucleoplasma como al nucleolo sobre la expresión Tat (STAT3, ZAP70 y HSP90). Finalmente, también notamos el agotamiento proteico en la fracción nucleolar acompañado de un aumento en el nucleoplasma (SSRP1). Sigue siendo difícil en esta etapa, apreciar si la acumulación de proteínas específicas resultaría en su activación o inhibición al secuestrarlas de su lugar de acción. Por el contrario, el agotamiento de una proteína del nucleolus podría resultar en la regulación descendente de su actividad en este lugar o podría ser el resultado de su movilización desde su sitio de almacenamiento, el nucleolus, al nucleoplasma o citoplasma donde puede realizar su función. Cabe destacar que identificamos a varios socios conocidos del VIH-1 Tat involucrados en la patogénesis del VIH-1, lo que sugiere que Tat podría modular físicamente su objetivo nucleolar o su reclutamiento a un sitio específico en el nucleoplasma o citoplasma. Tat también podría promover modificaciones post-traducción, lo que podría mediar la focalización de proteínas específicas al nucleolus. Esto se ilustra por las siguientes proteínas enriquecidas, pRb, PP1 y STAT3, para lo que la fosforilación es inducida por Tat. Importantemente, su estado de fosforilación determina su distribución subcelular, proporcionando así un mecanismo Además, nuestros datos indican que las serinas/treoninas quinasas (CK2 a') y fosfatasas (PP1) se enriquecieron significativamente en las fracciones nucleolares de Jurkat TAP-Tat. Estas enzimas representan la mayor parte de la actividad de fosforilación/desfosforilación en el nucleolo y pueden actuar como reguladores del tráfico de proteínas nucleolares. Además, Tat disminuyó significativamente los niveles de SUMO-2 en el nucleolo. Del mismo modo, se sabe que las modificaciones posteriores a la traducción mediadas por SUMO modulan la localización de proteínas nucleolares [104]. Dada la importancia potencial de las modificaciones posteriores a la traducción, incluida la fosforilación en el cambio mediado por Tat de la abundancia de proteínas nucleolares, un enfoque proteomico más específico como el enriquecimiento de fosfopétidos El control de la rotación de proteínas también es un medio importante para modular la abundancia de proteínas nucleolares. Las proteínas ribosómicas son degradadas por la vía Ubiquitina-Proteasoma para asegurar que su abundancia coincida con los niveles de transcripción de rRNA. A la inversa, las proteínas de choque térmico HSP90s las protegen de la degradación. Curiosamente, nuestros datos muestran que la modulación Tat de las proteínas de abundancia asociadas con la vía Ubiquitina-proteasoma y choque térmico. Esto podría contribuir al enriquecimiento observado de proteínas ribosómicas por Tat. Sin embargo, no podemos excluir que la mayor abundancia de proteínas ribosómicas en el nucleolo podría ser el resultado de la prevención mediada por Tat de su exportación al citoplasma. Curiosamente, utilizando un sistema celular diferente, una cepa transgénica de Drosophila melanogaster Tat, Ponti et al, analizaron los efectos de Tat en la biogénesis ribosoma, después de 3 días de tratamiento de choque térmico para inducir la expresión Tat bajo el control del promotor hsp70 [167]. Después de la expresión Tat, observaron un defecto en el procesamiento pre-rRNA asociado con una disminución en el nivel de 80S ribosomas [167]. Sin embargo, los diferentes sistemas celulares empleados combinados con la inducción de choque térmico de 3 días hacen que sus resultados sean difíciles de comparar con los nuestros. Mientras que estudios anteriores a nivel de sistema han monitoreado los efectos de la expresión Tat del VIH-1 en las células T, a nuestro conocimiento, hemos presentado aquí el primer análisis proteómico de la composición dinámica del nucleolus en respuesta a la expresión Tat del VIH Utilizando proteómica cuantitativa, hemos subrayado los cambios en la abundancia de proteínas nucleolares específicas y hemos destacado la reorganización nucleolar extensa y coordinada en respuesta a la expresión constitutiva Tat. Nuestros hallazgos subrayan que Tat que expresa células T exhiben un perfil proteómico nucleolar único, que puede reflejar una estrategia viral para facilitar la progresión a la producción viral robusta. Importantemente, hemos notado la relación funcional de proteínas nucleolares de nuestro conjunto de datos con la patogénesis VIH-1 y el Tat VIH-1 en particular. Esto aumenta aún más nuestra confianza en nuestra estrategia experimental y sugiere un papel para Tat en el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares. Finalmente, nuestro estudio proporciona nuevas ideas sobre la importancia de Tat en la conversación cruzada entre funciones nucleolares y patogénesis viral. También hemos identificado cambios en la abundancia de proteínas nucleolares que no estaban previamente asociados con la patogénesis del VIH-1, incluyendo proteínas asociadas a vías metabólicas, que proporcionan nuevos objetivos potenciales y vías celulares para la intervención terapéutica.Células T Jurkat, clon E6.1 (ATCC), Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP se mantuvieron en el medio RPMI-1640 complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (Gibco, aprobado por la UE), y antibióticos. Células Phoenix-GP (G.P. Nolan; www.stanford.edu/ group/nolan/), se mantuvieron en el medio DMEM complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (GIBCO, aprobado por la UE). La secuencia de HIV-1 Tat (VIH-1 HXB2, 86 aminoácidos) fue subclonada en el vector pENTR 2B (Invitrogen, A10463). Usando la tecnología Gateway (Invitrogen), introdujimos la secuencia HIV-1 Tat en el plásmido pCeMM-NTAP(GS)-Gw [168]. Las células Fénix (G.P. Nolan; www.stanford.edu/group/nolan/), fueron transfectadas usando Fugene 6 (Roche) con 5 mg del plásmido NTAP-Tat o NTAP y 3 mg del pMDG-VSVG. Los sobrenadantes virales fueron recolectados después de 48 h, filtrados y utilizados para transducir las líneas celulares de Jurkat. La construcción se denomina NTAP-Ta Utilizando la entrega de genes retrovirales, transferimos de forma estable células Jurkat (clone E6.1 (ATCC)). Los clones positivos llamados Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron ordenados para enriquecer la población de células que expresaban GFP usando el clasificador de células BC MoFlo XDP (Beckman Coulter). Las fracciones subcelulares (10 mg) fueron resueltas por SDS-PAGE y transferidas a membranas BioTrace PVDF (Pall corporation). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: a-Tubulina (Sc 5286), C23 (Sc 6013), y Fibrilarina (Sc 25397) de Santa Cruz Biotechnology, y PARP (AM30) de Calbiochem, Ratón anti-ZAP 70 (05-253, Millipore), Ratón anti-STAT3 (06-596, Millipore), Ratón anti-ILF3 (ab92355, Abcam), Ratón anti-HSP90 beta (ab32568, Abcam), Ratón anti-ADAR1 (ab88574, Abcam), Ratón anti-HDAC1 (ab19845, Abcam), Ratón anti-SSRP1 (ab21584, Abcam) conejo anti-BOP1 (ab86982, Abcam), Ratón anti-KpNB1 (ab10303, Abcam), Ra Para el análisis SILAC-RPMI R0K0 y SILAC-RPMI R6K6 (Células Dundidas) se utilizó un medio con un 10% de FBS dializado (GIBCO, 26400-036); las células Jurkat que expresaban NTAP-Tat y NTAP fueron transitadas en serie y cultivadas durante cinco duplicados para asegurar la incorporación completa de los aminoácidos marcados; la viabilidad de las células se verificó con Trypan Blue (0,4% solución, SIGMA) y posteriormente se confirmó mediante tinción IP y análisis FACS; las células se mezclaron a la relación 1:1 para obtener 140610 6 células; los nucleoli fueron aislados de la población celular mixta como se describió previamente en Jarboui et al., [165]. Los extractos nucleolares (100 mg) fueron resuspendidos en bicarbonato de amonio de 50 mM y en solución de tripsina digerida como se describió previamente en Jarboui y col. [165]. La muestra se realizó en un espectrómetro de masa termoscientifico LTQ Orbitrap XL conectado a un sistema cromatógrafo NANO LC.1DPLUS que incorporaba una muestra automática. La muestra fue cargada en una columna Biobasic C18 PicofritTM (100 mm de longitud, 75 mm ID) y fue separada por un gradiente de acetonitrilo en aumento, utilizando un gradiente de 142 min de fase inversa (0-40% de acetonitrilo durante 110 min) a un caudal de 300 nL min-1. El espectrómetro de masa fue operado en modo iónico positivo con una temperatura capilar de 200uC, una tensión capilar de 46V, una tensión de lente de tubo de 140V y con un potencial de 1800V aplicada al frit. Todos los datos fueron adquiridos con el espectrómetro de masa que funciona en modo de conmutación automática dependiente de datos. Se realizó una exploración MS de alta resolución utilizando el Orbitrap para seleccionar los 5 iones más intensos antes del análisis MS/MS utilizando la trampa Ion. La eficiencia de incorporación de aminoácidos etiquetados fue determinada mediante el análisis de los péptidos identificados en nucleoli aislados de la población celular mantenida en el medio 'Heavy' como se describe en [169]. Nuestro análisis mostró que teníamos una eficiencia de incorporación.95% (datos no mostrados). Los espectros MS/MS fueron buscados para la identificación y cuantificación de los péptidos utilizando el software MaxQuant [170] (versión 1.1.1.36), la Base de Datos del IPI Humano (versión 3.83) y el motor de búsqueda Andrómeda asociado a MaxQuant [171]. Se utilizaron parámetros estándar para MaxQuant con el Acetil (término N de Proteína) como modificación variable y Carbamidometilo (Cys) como modificación fija, se permitieron 2 escisiónes perdidas, excepto que se prohibió el filtrado de aminoácidos etiquetados. La desviación de masa inicial de los iones precursores y fragmentos fue de 7 ppm y 0,5 Da, respectivamente. Cada relación proteica fue calculada como promedio ponderado de intensidad de los coeficientes de péptidos individuales. Las proteínas fueron identificadas con el mínimo de un péptido con una tasa La ontología genética, la vía KEGG y los términos Pfam se extrajeron de entradas UNIPROT utilizando Perseo, un software del paquete de análisis de datos MaxQuant (http://www.maxquant.org ), y las herramientas de la suite ToppGene [54]. El Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron transfectados utilizando el sistema de electroporación Amaxa (biosistema Amaxa) con el pGL3 (pGL3-LTR) (Promega) como recomendado por Amaxa Biosystem. Los ensayos de doble luciferasa (Promega) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de Luciferasa se midió y normalizó contra la cantidad total de proteínas cuantificada por el kit de cuantificación de proteínas BCA (Pierce, Thermo Scientific). Para preservar Las células se fijaron en un 2% PFA durante 10 minutos en RT, permeabilizaron en un 0,5% Triton X-100 durante 15 minutos en RT y se bloquearon con 5% FCS. Las células se incubaron con el anticuerpo Tat VIH-1 de conejo (ab43014, Abcam) seguido por el anticuerpo secundario anti-Rabbit alexa fluor 647 (A-21246, Invitrogen). Las células se les permitió unirse a Cell-Tak (BD) recubierto de Diapositivas Silanizadas (DaoCytomation), y manchado con DAPI. Las imágenes se capturaron con un Microscopio Confocal Carl Zeiss equipado con un objetivo DIC de aceite de Plan-Apocromat 63X/14. El archivo de datos RAW proteómicos del análisis de espectrometría de masas se depositó en el repositorio Tranche(http El archivo se puede acceder y descargar utilizando la siguiente clave de hash:(R3O5SV5Z6HvWqrBNDhp21tXFetluDWYxvwMIfU-h6e1kMgarauCSq4dlNcxeUvFOHDEzLeDcg4X5Y8reSb6-MUA6wM1kIAAAAAAB/w = ). Materiales y Métodos S1 Descripción de los métodos empleados para examinar el ciclo celular, la viabilidad celular y el análisis de proliferación celular. (DOCX)

¿Qué tipos de células se utilizan para estudiar la patogénesis mediada por Tat?

Tráfico de proteínas nucleolares en respuesta al VIH-1 Tat: Rewiring the Nucleolushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499507/SHA: efa871aeaf22cbd0ce30e8bd1cb3d1afff2a98f9Autores: Jarboui, Mohamed Ali; Bidoia, Carlo; Woods, Elena; Roe, Barbara; Wynne, Kieran; Elia, Giuliano; Hall, William W.; Gautier, Virginie W.Fecha: 2012-11-15DOI: 10.1371/journal.pone.0048702Licencia: cc-byAbstract: La proteína Tat transactivante es una proteína reguladora viral esencial para la replicación del VIH-1. El nucleolo, un compartimento subnuclear altamente dinámico y estructurado sin membrana, es el sitio de ARNr y biogénesis ribosoma y está involucrado en numerosas funciones celulares incluyendo la regulación transcripcional, el control del ciclo celular y la infección viral. Importantemente, el tráfico nucleolar transitorio tanto de Tat como de las transcripciones virales del VIH-1 son críticos en la replicación del VIH-1, sin embargo, el(los) papel(es) del nucleolo en la replicación del VIH-1 sigue sin estar claro. Para entender mejor cómo la interacción de Tat con la maquinaria nucleolar contribuye a la patogénesis del VIH-1, investigamos los cambios cuantitativos en la composición del proteoma nucleolar de las células T de Jurkat que expresan establemente el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta TAP. Utilizando un enfoque proteómico organélaro basado en espectrometría de masas, junto con el etiquetado de isótopos estables en cultivo celular (SILAC), cuantificamos 520 proteínas, incluyendo 49 proteínas que muestran cambios significativos en la abundancia de nucleolos de células T de Jurkat sobre la expresión Tat. Numerosas proteínas que exhiben un cambio de pliegue fueron interactuadores Tat bien caracterizados y/o conocidos por ser críticos para la replicación del VIH-1. Esto sugiere que el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares por Tat proporcionan una capa adicional de control para regular la maquinaria celular involucrada en la patogénesis del VIH-1. El análisis del camino y la reconstrucción de la red revelaron que la expresión Tat resultó específicamente en el enriquecimiento nucleolar de proteínas que participan colectivamente en biogénesis ribosomal, homeostasis de proteínas, vías metabólicas incluyendo glucolítico, fosfato de pentosa, nucleótidos y aminoácidos vías biosintéticas, respuesta al estrés, vías de señalización de células T e integridad del genoma. Presentamos aquí el primer perfil diferencial del proteoma nucleolar de células T que expresan el HIV-1 Tat. Discutimos cómo estas proteínas participan colectivamente en redes interconectadas que convergen para adaptar las actividades dinámicas del nucleolus, que favorecen las actividades biosintéticas del huésped y pueden contribuir a crear un entorno celular que apoye la producción robusta del HIV-1. Texto: El nucleolus es un compartimento subnuclear altamente ordenado organizado alrededor de loci genéticos llamados regiones organizadoras nucleolares (NORs) formado por grupos de cientos de repeticiones de genes rDNA organizadas en repetición tándem cabeza a cola [1, 2]. Organelo sin membrana descrito originalmente como la ''Fábrica Ribosoma'', el nucleolus está dedicado a la transcripción de rDNA dirigida por ARN-polimerasa-I, procesamiento de rARN mediado por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (SORNPs) y conjunto ribosoma. La biogénesis del ribosoma es esencial para la síntesis de proteínas y la viabilidad celular [2] y, en última instancia, resulta en las subunidades ribosomales grandes (60S) y pequeñas (40S), que posteriormente se exportan al citoplasma. Este proceso celular fundamental, al que la célula dedica la mayor parte de sus recursos energéticos, está estrictamente regulado para adaptarse a los cambios dinámicos en la proliferación celular, la tasa de crecimiento y las actividades metabólicas [3]. El nucleolus es el sitio de procesamiento adicional de ARN, incluyendo la exportación y degradación de ARNm, la maduración de pequeños PNNR nucleares ricos en uridina (U snRNPs), que forman el núcleo del spliceosoma, biogénesis de ARNt y microARNs (miRNAs) [4]. El nucleolus también está involucrado en otros procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular, procesos oncogénicos, respuestas de estrés celular y traducción [4]. El concepto de nucleolo multifuncional y altamente dinámico ha sido corroborado por varios estudios que combinan enfoques proteómicos organelares y espectrometría cuantitativa de masas, y describen miles de proteínas que transitan por el nucleolo en respuesta a diversas condiciones metabólicas, estrés y ambientes celulares [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Colectivamente, los estudios mencionados representan hitos en la comprensión de la complejidad funcional del nucleolo, y demostraron que las proteínas nucleolares están en intercambio continuo con otros compartimentos nucleares y celulares en respuesta a determinadas condiciones celulares. Los estudios proteómicos que analizan los nucleoli de las células infectadas por el virus sincitial respiratorio humano (HRSV), el virus influenza A, el virus de la bronquitis infecciosa por coronavirus aviar (IBV) o el adenovirus destacaron cómo los virus pueden alterar de forma distintiva la distribución de proteínas nucleolares [2, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Curiosamente, tanto las proteínas reguladoras del VIH-1 Tat como Rev localizan al nucleoplasma y al nucleolus. Ambas secuencias abarcan una señal de localización nucleolar (NoLS) que se superpone con su señal de localización nuclear (NLS), que rige su localización nucleolar [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. Además, Tat y Rev interactúan con el antígeno nucleolar B23 Sin embargo, un estudio reciente describió que en contraste con las células T de Jurkat y otras líneas celulares transformadas donde Tat está asociado con el núcleo y el nucleolo, en las células T primarias Tat se acumula principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Mientras que la regulación de su importación y/o exportación nuclear activa, como mediada por la familia de la carioferina/importación, se han descrito bien, los mecanismos que distribuyen Tat y Rev entre el citoplasma, el nucleoplasma y el nucleolo siguen siendo elusivos [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48]. Importantemente, dos estudios importantes de Machienzi y otros han revelado importantes vínculos funcionales entre la replicación del VIH-1 y el nucleo En primer lugar, podrían inhibir la replicación del VIH-1 y la función de transactivación Tat empleando un señuelo TAR dirigido específicamente al nucleolo. Además, utilizando un enfoque similar, con una ribozima anti-VIH-1 de cabeza martillo fusionada al ARN nucleolar pequeño U16 y por lo tanto dirigida al nucleolo, podrían suprimir dramáticamente la replicación del VIH-1. Colectivamente, estos hallazgos sugieren fuertemente que las transcripciones del VIH-1 y el tráfico nucleolar Tat son críticos para la replicación del VIH-1. Sin embargo, la naturaleza de estas contribuciones aún no se ha aclarado. En este informe, analizamos sistemáticamente las perturbaciones del proteoma nucleolar que ocurren en las células T de Jurkat expresando constitutivamente el VIH-1 Tat, utilizando un enfoque de espectrometría cuantitativa de masas. Después de la anotación detallada de los cambios cuantitativos de abundancia en la composición de la proteína nucleolar sobre la expresión Tat, nos centramos en los complejos celulares afectados por Tat y las vías de señalización asociadas con la biogénesis ribosoma, el spliceosoma, las chaperonas moleculares, la replicación y reparación del ADN y el metabolismo, y discutimos su posible implicación en la patogénesis del VIH-1. En este estudio, investigamos los cambios cuantitativos en el proteoma nucleolar de las células Jurkat T expresando constitutivamente el VIH-1 Tat (86aa) frente a su contraparte Tat negativo, utilizando el etiquetado estable de isótopos con aminoácidos en la tecnología de cultivo celular (SILAC), seguido por la espectrometría de masas en tándem ESI e implementamos el enfoque experimental descrito en la Figura 1A. En primer lugar, mediante la entrega de genes retrovirales, transferimos el HIV-1 Tat fusionado a una etiqueta de purificación de afinidad tándem (TAP) (constituido por dos proteínas G y un péptido de unión a estreptavidina) o TAP solo (vector de control) en el clon de células T de leucemia Jurkat E6-1 y clasificamos las células transducidas (GFP positivo) por FACS. Esto resultó en una población altamente enriquecida de células transducidas policlonales que presentaban diferentes niveles de expresión del transgén (Figura 1B). La funcionalidad del TAP-Tat fue confirmada mediante la transfección de las células TAP-Tat y TAP con un vector de genes reportero de luciferasa bajo el control del HIV-1 LTR (pGL3-LTR) [36]. Para abordar la funcionalidad de Tat fusionado a TAP, comparamos Jurkat TAP-Tat con Jurkat-tat, una línea celular que expresaba establemente Tat [51]. Ambas líneas celulares mostraron una actividad LTR del VIH-1 comparable después de la transfección con pGL3-LTR (Figura S1 ). A continuación, la expresión Tat y la localización subcelular fueron verificadas mediante fraccionamiento subcelular seguido por el análisis del WB (Figura 1E ). TAP-Tat mostró una localización nuclear/nucleolar prominente, pero también se pudo detectar en el citoplasma. Estas observaciones fueron además validadas mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 1E ). A continuación se comparó la tasa de crecimiento y proliferación de las líneas celulares de Jurkat TAP y TAP-Tat (Materiales y Métodos S1), que eran equivalentes (Figura S4A ). Del mismo modo, el análisis FACS confirmó que las poblaciones relativas en G1, S y G2/M eran similares para las células de Jurkat TAP-Tat y TAP (Figura S4B ). Se etiquetaron las células de Jurkat TAP-Tat y Jurkat TAP con isótopo ligero (R0K0) y pesado (R6K6) que contenían arginina y lisina, respectivamente. Después de cinco pasajes en su respectivo medio SILAC, se recolectaron 85 millones de células de cada cultivo, se agruparon y se aislaron sus nucleolis como se describió previamente (Figura 1A ) [52] Para evaluar la calidad de nuestro procedimiento de fraccionamiento, se investigó el enriquecimiento específico de antígenos nucleolares conocidos mediante el análisis Western Blot (Figura 1D). Se encontró que la nucleolina (110 kDa) y la fibrilarina (FBL) (34 kDa), dos proteínas nucleolares principales conocidas por localizar al componente granular del nucleolo, estaban muy enriquecidas en la fracción nucleolar mixta. Se observó que la nucleolina se distribuía igualmente entre las fracciones nuclear y citoplasmática. Este patrón de distribución de nucleolina parece ser específico para las células T de Jurkat, como se muestra anteriormente [52, 53]. La proteína nuclear PARP-1 (Poly ADPribose polimerasa 1) (113 kDa) estaba presente en la fracción nuclear y nucleoplasmática, pero se desplegó en la fracción La alfa-tubulina (50 kDa) fue altamente abundante en la fracción citoplasmática y débilmente detectada en las fracciones nucleares. Colectivamente, estos resultados confirmaron que nuestros métodos produjeron una fracción nucleolar altamente enriquecida sin contaminación cruzada significativa. Posteriormente, la mezcla de proteína nucleolar fue tripsindigerida y los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas. El análisis proteomico cuantitativo comparativo se realizó utilizando MaxQuant para analizar las proporciones en isótopos para cada péptido identificado. Se cuantificó un total de 2427 péptidos, representando 520 proteínas nucleolares cuantificadas. La lista completa anotada de proteínas nucleolares cuantificadas está disponible en la Tabla S1 y los datos brutos del análisis de espectrometría de masas se depositaron en la base de datos de repositorios Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/), a la que se puede acceder utilizando las claves de hash descritas en materiales y métodos. Anotamos las proteínas cuantificadas utilizando las herramientas ToppGene Suite [54] y extrajimos las anotaciones de Gene Onthology (GO) e InterPro [55]. El análisis de los procesos biológicos GO (Figura 1F ) reveló que los procesos biológicos mejor representados incluían la transcripción (24%), el procesamiento de ARN (23%), el proceso del ciclo celular (13%) y la organización cromosómica (15%), que refleja las funciones asociadas nucleolares y es comparable a nuestra caracterización anterior del proteoma nucleo El análisis de distribución subcelular (Figura 1F ) reveló que nuestro conjunto de datos contenía proteínas conocidas por localizarse en el nucleolo (49%), en el núcleo (24%) mientras que el 15% de las proteínas estaban descritas previamente para residir exclusivamente en el citoplasma. La distribución subcelular fue similar a nuestro análisis anterior del proteoma nucleolar de células T de Jurkat [52]. Tabla S1. La distribución de las relaciones proteicas se representan en la Figura 1G como log 2 (cambio de abundancia). Las relaciones SILAC indican cambios en la abundancia proteica en la fracción nucleolar de las células TAP de Jurkat en comparación con las células TAP de Jurkat. La distribución de las proteínas cuantificadas siguió una distribución gaussiana (Figura 1G ). Un total de 49 proteínas nucleolares exhibieron un cambio significativo de 1,5 veces o mayor Las células no mostraron cambios en el contenido en estado estacionario de algunos de los principales y abundantes componentes del nucleolo, incluyendo nucleofosfmina (NPM1/ B23), C23, FBL, proteína nucleolar P120 (NOL1) y proteína nucleolar 5A (NOL5A). Las distintas proporciones de cambios proteicos sobre la expresión Tat podrían reflejar la reorganización nucleolar específica y las actividades alteradas del nucleolo. Realizamos el análisis del WB para validar los resultados basados en SILAC obtenidos por nuestro enfoque proteómico cuantitativo (Figura 2 ). 15 proteínas seleccionadas mostraron intensidad diferencial en las fracciones nucleolares sobre la expresión Tat, incluyendo 9 enriquecidos (HSP90b, STAT3, pRb, CK2a, CK2a', HSP90a, Transportin, ZAP70, DDX3), y 3 agotados (ILF3, BOP1 y SSRP1) proteínas. Además, también probamos por el análisis WB, abundancia de proteínas no afectada por la expresión Tat (Importin beta, FBL, B23, C23). Estos resultados destacan la concordancia en la tendencia de las proporciones correspondientes de SILAC, a pesar de algunas diferencias en los rangos cuantitativos. Cabe destacar que, usando WB, pudimos observar un cambio de intensidad para la proteína con un cambio de pliegue SILAC tan bajo como 1,25 veces. Por un lado, el umbral de los cambios en la abundancia de proteínas se puede determinar estadísticamente y luego destacar los cambios en la abundancia más grandes como se ilustra en la Tabla 1. Alternativamente, el enriquecimiento o agotamiento coordinado de la mayoría de las proteínas pertenecientes a un complejo o vía celular distinto permitiría la definición de un grupo de proteínas de interés y potencial significación. Por lo tanto, nos centramos en proteínas individuales enriquecidas o agotadas con actividades asociadas con la patogénesis molecular del VIH-1 o Tat, y en modificaciones agrupadas que afectan vías de señalización celular enteras y complejos macromoleculares. Inicialmente nos centramos en las proteínas de señalización que interactúan con Tat y/o la patogénesis molecular asociada del VIH-1 y cuya abundancia en el nucleolo fue modulada por la expresión Tat. Fosfo-proteína fosfatasas. Fosfo-proteína fosfatasa PP1 y PP2A son esenciales Es importante destacar que el PP1 representa el 80% de la actividad de la fosfatasa Ser/Thr dentro del nucleolo. En nuestro estudio, el PP1 fue potencialmente enriquecido por 1,52 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat, lo que apoya estudios previos que describen el objetivo nuclear y nucleolar de PP1a por el HIV-1 Tat y cómo PP1 aumenta la regulación de la transcripción del VIH-1 [58, 59, 60, 61, 62]. El PP1 c también fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro [63]. Curiosamente, la asociación Tat con los promotores de la subunidad PP2A resulta en la sobreexpresión y regulación de la actividad PP2A en linfocitos [64, 65]. Además, PP2A contribuye a la regulación de la transcripción y replicación del VIH-1 [61, 66]. Retinoblastoma Protein. El gen supresor tumoral pRb protein mostró un cambio de 1,4 veces en el nucleolus sobre la expresión Tat [67]. Además, el análisis WB confirmó la translocación distinta del pRb del nucleoplasma al nucleolus por Tat (Figura 2 ). Dependiendo del tipo de célula, pRb puede ser hiperfosforilado o hipofosforilado sobre la expresión Tat y puede regular negativamente o positivamente la transcripción mediada por Tat respectivamente [68, 69, 70]. Curiosamente, la hiperfosforilación de los desencadenantes del pRB en su translocación en el nucleolo [71]. La fosforilación del pRB también se asocia con un aumento de la biogénesis ribosómica y el crecimiento celular [72]. STAT3. El transductor de señal de factor de transcripción y activador de la transcripción 3 (STAT3) se enriqueció significativamente (1,86 veces) en la fracción nucleolar por la expresión constitutiva Tat. Además, el análisis WB indicó que la expresión Tat podría promover la relocalización del STAT3 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento distinto en el nucleolo (Figura 2). Curiosamente, estudios anteriores han demostrado la activación mediada por Tat de la señalización STAT3, como lo demuestra su estado de fosforilación [73]. Curiosamente, la fosforilación STAT3 indujo la dimerización de la proteína después de su translocación al núcleo [74]. YBX1. YBX1, la proteína multifuncional de unión al ADN/ARN fue enriquecida por 1,38 veces en el nucleolo de las células de Jurkat sobre la expresión Tat. Curiosamente, YBX1 interactúa con Tat y TAR y modula la expresión génica del VIH-1 [63, 75]. ZAP70. La proteína tirosina cinasa ZAP70 (proteína quinasa asociada a la cadena Zeta 70) fue enriquecida por 1,24 veces en el nucleolo de las células de Jurkat expresando Tat [76]. Además, el análisis del WB reveló que la expresión Tat podría promover la relocalización del ZAP70 del citoplasma al núcleo, con un enriquecimiento La proteína de matriz nuclear interna, Matrin 3 (MATR3), presentó un cambio de 1,39 veces en el nucleolo de las células de Jurkat que expresan Tat. Se localiza en el nucleolasmo con un patrón difuso excluido de los nucleolos [77]. La matrin 3 ha sido identificada como parte del nucleoloma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Dos estudios recientes han descrito a la matrin 3 como parte de complejos de ribonucleoproteínas, incluyendo también el VIH-1 Rev y (elemento de respuesta Rev) RRE que contiene ARN VIH-1, y promoviendo la regulación post-transcripción del VIH-1 [78, 79, 80]. CASP10. La molécula pro-apotótica de señalización, Caspasa 10 (CASP10), se agotó significativamente de las células nucleolus de Jurkat-Tat (0,82 veces) [81]. Importantemente, la expresión Tat desregula la expresión y actividad de CASP10 en las células Jurkat [82]. ADAR1. Adenosina deaminasa que actúa sobre el ARN (ADAR1), que convierte las adenosinas en inosinas en ARN de doble cadena, se agotó significativamente del nucleolus de las células Jurkat-Tat (0,78 veces). Curiosamente, ADAR1 sobreexpresión regula la replicación del VIH-1 a través de un mecanismo de edición del ARN [83, 84, 85, 86, 87, 88]. Además, ADAR1 pertenece al interactoroma nuclear in vitro Para subrayar las relaciones estructurales y funcionales de las proteínas nucleolares afectadas por el VIH-1 Tat, construimos una representación en red de nuestro conjunto de datos. Utilizamos la versión 2.6.3 de Cytoscape [89] y utilizando el plugin MiMI [90] para mapear interacciones previamente caracterizadas, extraídas de bases de datos de interacción de proteínas (BIND, DIP, HPRD, CCSB, Reactome, IntAct y MINT), lo que resultó en una red altamente densa y conectada que incluía 416 proteínas (nodos) de las 536 proteínas, unidas por 5060 interacciones no dirigidas (borde) (Figura 3A). El análisis de centralidad reveló un umbral de 23.7 interacciones por proteína. El análisis de topología utilizando el plugin CentiScaPe [91] mostró que la distribución del grado de nodo sigue una ley de energía (Figura S5 Es importante destacar que cuando analizamos la distribución del coeficiente de agrupamiento (Figura S6 ) encontramos que la red está organizada en una arquitectura jerárquica [92], donde los nodos conectados forman parte de áreas altamente agrupadas mantenidas por pocos hubs organizados alrededor del HIV-1 Tat. Además, el análisis de la conexión en grados nodos de nuestra red identificó al HIV-1 Tat como la proteína más conectada (Figura S6 ). Específicamente, el análisis de topología indicó que los valores para las centrales Tat eran los más altos (grado de nodo, estrés, radialidad, cercanía, entreess y centroides), caracterizando a Tat como la proteína principal del hub de la red nucleolar. De hecho, un total de 146 proteínas han sido descritas previamente para interactuar con Tat (Figura 3B, Tabla S2 ). Estas proteínas están involucradas En paralelo, caracterizamos la magnitud de los cambios de abundancia proteica relacionados observados en distintas vías celulares (Figura 4). Biogénesis ribosomal. Inicialmente nos centramos en la biogénesis ribosoma, función primaria del nucleolo. Pudimos observar un aumento general y coordinado en la abundancia de proteínas ribosomales en el nucleolo por expresión Tat (Figura 4 ). Mientras algunas proteínas ribosomales permanecían inalteradas, Tat causó la acumulación nucleolar de varias proteínas ribosomas grandes y pequeñas distintas, excepto RPL35A, para las cuales la expresión Tat causó una marcada disminución en el nivel nucleolar (0,29 veces). Asimismo, varias proteínas involucradas en el procesamiento de ARNr exhibieron un aumento general en la acumulación nucleolar sobre la expresión Tat. Estos incluyen a los miembros canónicos humanos de la familia L7ae junto con los miembros que participan en la Caja C/D, H/ACA y U3 snoRNPs (Figura 4). Por el contrario, BOP1, un componente del complejo PeBoW (Pescadillo Bop1 WDR12) esencial para la maduración de la subunidad ribosómica grande, se agotó significativamente del nucleolo de las células TAP-Tat Jurkat (0,81 veces) y esto fue confirmado por el análisis WB (Figura 2 ) [93]. Sin embargo, los otros componentes complejos PeBoW, Pes1 (0,94 veces) y WDR12 (1,1 veces), no fueron afectados por la expresión Tat. Se identificaron y cuantificaron en nuestro conjunto de datos 55 proteínas de las 108 proteínas spliceosomal conocidas [94]. Estas proteínas incluyen las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares U1, U2 y U5, Sm D1, D2, D3, F y B, y las heterogéneas ribonucleoproteínas nucleares. Nuestros datos sugieren un aumento distinto en la abundancia de proteínas específicas complejas del spliceosoma tras la expresión de HIV-1 Tat en células T de Jurkat (Figuras 3 y 4). Las únicas tres proteínas que se agotaron significativamente del nucleolo tras la expresión del HIV-1 Tat fueron RBMX (0,89 veces), HNRNPA2B1 (0,84 veces) y SNRPA (0,81 veces). Varias investigaciones mostraron alteración de la expresión en los factores de empalme celular en células infectadas por HIV-1 [95, 96] Hemos identificado varias chaperonas moleculares, cochaperonas y otros factores involucrados en la proteostasis para ser altamente enriquecidos en el nucleolo de las células T sobre la expresión Tat (Figuras 3 y 4), muchos de los cuales fueron previamente caracterizados como parte del interactoroma nuclear Tat [63]. Varias proteínas de choque térmico incluyendo DNAJs, específicas HSP90, HSP70 y HSP40 isoformas y sus cofactores se enriquecieron distintivamente en la fracción nucleolar de las células Jurkat expresando Tat (Figura 4 ). Como lo muestra WB, mientras que HSP90a y b son principalmente citoplasmáticas, la expresión Tat desencadena su relocalización al núcleo y nucleolus, corroborando nuestro enfoque cuantitativo proteómico (Figura 2). Del mismo modo, el choque térmico puede hacer que el HSP90 y el HSP70 se reubiquen en el nucleolo [97, 98, 99, 100, 101]. En un estudio reciente, el grupo de Fassati ha demostrado que el HSP90 está presente en el promotor del VIH-1 y puede regular directamente la expresión génica viral [102]. También observamos el aumento coordinado de la abundancia de la clase I (GroEL y GroES) y la clase II (chaperonina que contiene TCP-1 (CTT)) moléculas de chaperonina (Figuras 3 y 4) sobre la expresión Tat. Vía proteasómica de la ubiquitina. La vía proteasómica es el principal sistema proteolítico de células eucariotas [103]. Es importante destacar que la vía ubiquitina-proteasoma nuclear controla el suministro de proteínas ribosomales y es importante para la biogénesis ribosoma [104, 105]. El proteasoma 26S está compuesto por la partícula núcleo 20S (CP) y la partícula reguladora 19S (RP). Alternativamente, CP puede asociarse con el 11S RP para formar el inmunoproteasoma. Todas las proteínas cuantificadas en nuestro estudio son parte del complejo regulador 19S e incluyen PSMD2 (1,5 veces), PSMD3 (1,32 veces), PSMD11 (1,25 veces) y PSMD13 (0,72 veces), el único componente proteasoma significativamente agotado del nucleolo en presencia de Tat (Figura 4). Curiosamente, Tat interactúa con subunidades distintas del sistema proteasoma, incluyendo las subunidades 19S, 20S y 11S. Las consecuencias de estas interacciones incluyen la competencia de Tat con 11S RP o 19S RP para la unión al 20S CP, que resultó en la inhibición de la actividad de la peptidasa 20S [106, 107, 108, 109, 110, 111]. Además, Tat demostró modificar la composición proteosoma y la actividad, que afecta a la generación de antígenos péptidos reconocidos por linfocitos T citotóxicos [112]. Importantemente, un estudio reciente demostró que en ausencia de Tat, los componentes proteosomas están asociados al promotor del VIH-1 y la actividad proteosoma limita la transcripción [113]. La adición de Tat promovió la disociación de la subunidad 19S del proteasoma 20S, seguido por el enriquecimiento distintivo del complejo similar a 19S en extractos nucleares junto con el reclutamiento mediado por Tat de las subunidades 19S para el promotor del VIH-1, lo que facilitó su elongación transcripcional [113]. También cuantificamos UBA1 (1,36 veces), la ubiquitina-proteína ligasa UHRF1 (1,13 veces), UBC (1 veces) y dos Ubiquitinspecific-peptidases, USP30 (1,28 veces) y USP20 (0,06 veces) (Figura 4). Replicación y reparación del ADN. Tras la expresión del HIV-1 Tat, observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de varios factores celulares asociados con la replicación del ADN y las vías de reparación (Figura 4). Tat indujo el enriquecimiento coordinado del complejo MCM2-7 de mantenimiento cromosómico en miniatura (de 1.23-a 3,30 veces, respectivamente) [114]. MCM7, 6 y 3 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. El mantenimiento estructural de los cromosomas 2, SMC2, fue enriquecido (1,35 veces) en la fracción nucleolar por expresión Tat. SMC2 fue identificado como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Mientras que el factor de replicación C1 (RFC1) y RFC2 (1,31 y 1,28 veces respectivamente) mostró un cambio de pliegue incrementado y RFC5/3 no se vieron afectados, RFC4 se redujo gravemente (0,69 veces) de la fracción nucleolar sobre la expresión Tat [115]. El RFC1 y RFC2 fueron identificados como parte del interactoroma nuclear in vitro del HIV-1 Tat [63]. Tat indujo el enriquecimiento de XRCC6 (1,27 veces) y XRCC5 (1,36 veces) en el nucleolo, que están involucrados en la reparación de la unión final del ADN no-homologoso (NHEJ) [116]. XRCC6 se asocia con complejos de preintegración viral que contienen HIV-1 Integrase y también interactúan con Tat y TAR [117, 118, 119]. Además, en una pantalla basada en ribozyme, el derribo del XRCC5 (Ku80) disminuyó tanto la integración retroviral como la transcripción Tatmediated [120]. Como parte de la reparación de la escisión base (BER), hemos identificado una importante endonucleasa apurínico/apirimidinica 1 (APEX1) (1,29 veces). Importantemente, en una pantalla de siRNA dirigida a los factores de reparación del ADN, se encontró que la reducción de APEX1 inhibe la infección por VIH-1 por más de 60% [121]. La proteína del grupo de alta movilidad (HMG) HMGA1 (1,30 veces), fue enriquecida en el nucleolo después de la expresión Tat [122]. HMGA1 interactúa con la integración del VIH-1 y forma parte del complejo de preintegración del VIH-1 [123, 124]. Importantemente, HMGA1 ha sido identificada en una pantalla proteómica, como un cofactor celular que interactúa con el VIH-1 59líder [125]. Metabolismo. Nuestros datos proteómicos sugieren que Tat induce perturbaciones en la glucólisis, la vía del fosfato pentosa y la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos (Figura 4 y Figura S7 ). En particular, en las células T que expresan Tat, detectamos cambios coordinados en la abundancia de proteínas no conocidas previamente que se asocian con la patogénesis del Tat, que revelaron conexiones inesperadas con la glicólisis y la vía del fosfato pentosa, incluyendo las siguientes enzimas glicólicas, lactato deshidrogenasa B (LDHB) (1,37 veces), la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1,17 veces) y la mutasa del ácido fosfoglicérico (PGAM1) (0,89 veces) (Figura 4 y Figura S En resumen, el GPI cataliza la isomerización reversible de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Posteriormente, el PFKP cataliza la conversión irreversible de fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato y es una enzima reguladora clave de la glucólisis. Al final de la vía glicolítica, PKM2, en su forma tetramérica, se sabe que genera ATP y piruvato, mientras que el LDHB desvía la mayoría del piruvato a la producción y regeneración de lactato de NAD+ en apoyo a la glicólisis continua, un fenómeno descrito para las células T proliferativas [126]. Esto regula la disponibilidad de los intermedios de glucosa, que se redirigen a las vías de la pentosa fosfato y de la serina biosíntesis para la producción de precursores biosintéticos de nucleótidos, fosfolípidos y aminoácidos. Como parte de la vía del fosfato de pentosa, hemos caracterizado el enriquecimiento significativo de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) (2,11 veces), que ramas de la vía de la glicólisis para generar NADPH, ribosa-5fosfato un precursor importante para la síntesis de nucleótidos. Consistente con esto, detectamos el aumento coordinado en la abundancia de enzimas que juega un papel central en la síntesis de purinas y pirimidinas. Más específicamente, IMPDH2 (1,66 veces), una enzima limitante de la tasa en el punto de rama de la biosíntesis de nucleótidos de purina, que conduce a la generación de nucleótidos de guanina, fosforibosil pirofosfato sintetasa 2 (PRPS2) (1,41 veces), cytidine-5-prime-trifosfato sintetasa (CTPS) (1,74 veces) que cataliza la conversión de UTP a CTP y la subunidad grande de ribonucleótido reductasa (RRM1) (1,56 veces). En parralel, observamos el aumento de la abundancia de la fosfoserina aminotransferasa PSAT1 (1,90 veces), una enzima implicada en la biosíntesis de serina, que se ha relacionado con la proliferación celular in vitro. La interfaz host-virus es un aspecto fundamental en la definición de la patogénesis molecular del VIH-1 [127, 128, 129, 130, 131, 132, 133]. De hecho, con su repertorio limitado de proteínas virales, el VIH-1 se basa ampliamente en la maquinaria de las células huésped para su replicación. Varios estudios recientes han capitalizado los recientes avances en las tecnologías ''OMICS'', y han revelado importantes perspectivas en este diálogo molecular finamente afinado [132, 134]. El VIH-1 Tat es esencial para la replicación viral y orquesta la expresión génica del VIH-1. La proteína reguladora viral es conocida por interactuar con una amplia gama de proteínas celulares y modular la expresión del gen celular y la vía de señalización [135, 136]. Nosotros y otros hemos utilizado enfoques a nivel del sistema para investigar la interacción Tat con la maquinaria de las células de acogida, que han caracterizado a HIV-1 Tat como mediador crítico de la interfaz host-viral [137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149]. Aquí, hemos investigado el tráfico de proteínas nucleolares en respuesta a la expresión HIV-1 Tat en células T, con el fin de proporcionar ideas únicas y novedosas sobre el papel de la compartimentación de proteínas por Tat en el ajuste fino de la disponibilidad de proteínas y la función. Hemos desarrollado para este estudio, un modelo celular utilizando Jurkat T-cells expresando firmemente Tat fusionado en su N-ternminal a TAP-tag. Es importante destacar que se han empleado ampliamente para evaluar la patogénesis mediada por Tat utilizando enfoques de todo el sistema y para analizar las vías y funciones de señalización celular clave de las células T [144, 150, 151, 152]. De hecho, hemos encontrado que son especialmente adecuadas para cultivos in vitro prolongados en el medio SILAC y posterior aislamiento de su nucleolo, seguido por el análisis de MS, que requiere hasta 85 millones de células. Fusionamos Tat a la etiqueta TAP para permitir futuras aplicaciones posteriores como purificación de afinidad de Tandem o análisis IP de Cromatina. Importantemente, hemos confirmado que la etiqueta TAP N-terminal no interfirió con la función Tat ni su localización en las células Jurkat, cuando se compara con la no etiquetada-Tat. Aunque se sabe que Tat se acumula en el núcleo y el nucleolo en las células de Jurkat y otras líneas celulares transformadas, en las células T primarias, Tat se describe para acumularse principalmente en la membrana plasmática, mientras que el tráfico a través del núcleo donde funciona [32]. Estas diferencias permanecen por caracterizarse, pero podrían estar relacionadas con diferentes niveles de expresión de los factores de transporte en las líneas celulares transformadas versus las células primarias, como se describe recientemente por Kuusisto et al. [39]. Además, Stauber y Pavlakis han sugerido que la localización nucleolar Tat podría ser el resultado de la sobreexpresión Tat [31]. Aquí, hemos seleccionado y empleado una población policlonal de células T Jurkat que expresan Tat en diferentes niveles. Proponemos que esta heterogeneidad en los niveles de expresión Tat podría reflejar la expresión estocástica Ta Utilizando una estrategia proteómica cuantitativa basada en un enfoque organélaro, cuantificamos más de 520 proteínas nucleolares, incluyendo 49 proteínas que muestran un cambio significativo en el pliegue. La medida en que las variaciones inducidas en la abundancia de proteínas nucleolares son biológicamente relevantes y pueden afectar los procesos celulares y/o virales queda por determinar. Sin embargo, la naturaleza biológica de las vías y los complejos macromoleculares afectados nos permiten discutir sus posibles asociaciones con la patogénesis del VIH-1. El VIH-1 Tat se expresa tempranamente después de la integración del genoma del VIH-1 y media el cambio a la fase de producción viral, asociado con la expresión génica proviral robusta, el ensamblaje de proteínas virales y, en última instancia, el desarrollo y liberación de viriones. En este contexto y basado en nuestros resultados, proponemos que Tat podría participar en la configuración del entorno intracelular y el perfil metabólico de De hecho, observamos el enriquecimiento nucleolar distinto de proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica, lo que podría ser indicativo de un aumento en la síntesis proteica. Con la notable exepción de RPL35A depleción nucleolar, proteínas ribosómicas y enzimas asociadas a la biogénesis ribosómica estaban en las 20 proteínas nucleolares más enriquecidas (NHP2L1, RLP14, RPL17, RPL27, RPS2, RPL13). Además, este efecto parece ser específico del HIV-1 Tat ya que la inhibición de transcripción por Actinomicina D resultó en el agotamiento total de proteínas ribosómicas en el nucleolo [9]. Además, el análisis proteómico cuantitativo de las células nucleas en adenovirus infectados mostró una leve disminución en proteínas ribosómicas [24] Si esto refleja un cambio en la biogénesis del ribosoma y/o un cambio en la composición de las subunidades ribosomales queda por determinar. Sin embargo, la necesidad adaptada de una producción elevada del ribosoma es intuitiva para un sistema que necesita apoyar la creciente demanda de nueva síntesis de proteínas virales. En parralel, observamos la modulación concordante de las vías que regulan la homeostasis proteica. Observamos la significativa acumulación nucleolar de múltiples chaperonas moleculares incluyendo las HSPs, el complejo TCP-1, y moléculas CANX/CALR y la abundancia nucleolar interrumpida de proteínas pertenecientes a la vía ubiquitina-proteasoma, que controla el suministro de proteínas ribosomales [104, 105]. Estas observaciones apoyan estudios previos que describen la modulación de la actividad proteasómica por Tat, que afectan la expresión, el montaje y la localización de subunidades específicas de los complejos proteasómicos [106, 107, 108, 109, 110, 111, 113]. También observamos el agotamiento concomitante de CASP10 en el nucleolo de Jurkat TAP-Tat. Se ha sugerido que CASP10 podría estar dirigido al nucleolo para inhibir la síntesis proteica [154]. Curiosamente, la presencia y los roles potenciales de las chaperonas moleculares en el nucleolo han sido destacados por Banski et al, quienes explican cómo la red chaperona podría regular la biogénesis ribosómica, la señalización celular y la respuesta al estrés [97, 155]. A medida que la producción viral avanza hacia la fase tardía y aumenta el estrés celular, el enriquecimiento nucleolar de las chaperonas moleculares por Tat no sólo podría permitir el plegado de adequat de proteínas virales recién sintetizadas, sino que también podría promover la tolerancia de las células infectadas al estrés y mantener la viabilidad celular. Coincidentemente, observamos el marcado enriquecimiento nucleolar de enzimas pertenecientes a vías metabólicas incluyendo glicólisis, fosfato de pentosa, nucleótido y aminoácidos vías biosintéticas. Del mismo modo, estas vías se elevan en células T proliferativas o en células cancerosas después de un cambio metabólico a la glicólisis aeróbica, también conocido como el efecto Warburg [156, 157, 158, 159]. Allí, los intermedios de glucosa de la vía de la glicólisis no sólo se comprometen a la producción de energía y se descomponen en piruvato para el ciclo TCA, sino que se redirigen a vías alternativas, incluyendo la vía del fosfato de pentosa, y se utilizan como precursores metabólicos para producir nucleótidos, aminoácidos, acetil CoA y NADPH para la homeostasis redox. De manera consistente, también se observó el enriquecimiento nucleolar concomitante de enzimas pertenecientes a la vía de síntesis de nucleótidos, incluyendo IMPH2, una enzima limitante conocida para controlar el pool de GTP. De igual manera, se observó el enriquecimiento nucleolar de PSAT1, una enzima involucrada en el metabolismo de serina y treonina, que está asociada con la proliferación celular [160]. Colectivamente, proponemos que mediante el control de la homeostas Sin embargo, las enzimas glucolíticas han sido detectadas en las fracciones nuclear y nucleolar mediante análisis proteómicos [8, 161]. Además, las enzimas glucolíticas, como PKM2, LDH, fosfoglicerato cinasa, GAPDH y aldosa, también han sido reportadas para mostrar localización nuclear y unirse al ADN [162]. Más específicamente, PKM2 es conocido por asociarse con el promotor y participar en la regulación de la expresión génica como coactivador transcripcional [163]. HIV-1 Tat ha sido descrito previamente como un inmunoregulador y más específicamente, ha sido reportado tanto para inhibir o promover la señalización TCR [164]. Hemos observado el enriquecimiento nucleolar por Tat de componentes proximales o aguas abajo clave de las vías de señalización de células T, incluyendo ZAP70, ILF3 y STAT3, que juegan un papel crucial en el desarrollo y activación de células T. Anteriormente los habíamos identificado como componentes específicos de células T del nucleolo, y los estudios de IF sugirieron que su asociación con el nucleolo podría ser regulada por condiciones específicas [165]. Nuestros resultados apoyan aún más que Tat podría contribuir a la disregulación de las señales derivadas de TCR y que el nucleolo podría representar un importante enlace espacial para las moléculas de señalización TCR. Observamos el enriquecimiento nucleolar coordinado de componentes clave de las vías de replicación, recombinación y reparación del ADN por Tat. Estos incluyen XRCC5 y XRCC6, HMGA1, APEX1, MCM2-7, SMC2, RFC1 y RFC2, mientras que RFC4 se encontró significativamente agotado. Curiosamente, estos cofactores se han asociado con la eficiencia de la integración del ADN retroviral en el ADN del huésped o la integridad del provirus integrado [166]. Si la abundancia creciente de estos factores dentro del nucleolo podría estar asociada con su participación potencial en la integración y mantenimiento de la integridad del gen provirus, queda por determinar. Los mecanismos de segregación mediada por Tat y compartimentación de proteínas dentro o fuera del nucleolo pueden depender de factores inherentes para cada proteína y la naturaleza de su relación con Tat, ya que el fraccionamiento subcelular combinado con el análisis del WB mostró que el patrón y el grado de redistribución subcelular entre proteínas variaban. Pudimos observar casos en los que Tat regulaba la expresión de proteínas que resultaban en un aumento general de estas proteínas en los compartimentos celulares incluyendo el nucleolo (DDX3, TNPO1). Alternativamente, Tat podía desencadenar la translocación nucleolar de proteínas directamente desde el citoplasma o el nucleoplasma (pRb). Además, observamos proteínas citoplasmáticas redistribuidas tanto al nucleoplasma como al nucleolo sobre la expresión Tat (STAT3, ZAP70 y HSP90). Finalmente, también notamos el agotamiento proteico en la fracción nucleolar acompañado de un aumento en el nucleoplasma (SSRP1). Sigue siendo difícil en esta etapa, apreciar si la acumulación de proteínas específicas resultaría en su activación o inhibición al secuestrarlas de su lugar de acción. Por el contrario, el agotamiento de una proteína del nucleolus podría resultar en la regulación descendente de su actividad en este lugar o podría ser el resultado de su movilización desde su sitio de almacenamiento, el nucleolus, al nucleoplasma o citoplasma donde puede realizar su función. Cabe destacar que identificamos a varios socios conocidos del VIH-1 Tat involucrados en la patogénesis del VIH-1, lo que sugiere que Tat podría modular físicamente su objetivo nucleolar o su reclutamiento a un sitio específico en el nucleoplasma o citoplasma. Tat también podría promover modificaciones post-traducción, lo que podría mediar la focalización de proteínas específicas al nucleolus. Esto se ilustra por las siguientes proteínas enriquecidas, pRb, PP1 y STAT3, para lo que la fosforilación es inducida por Tat. Importantemente, su estado de fosforilación determina su distribución subcelular, proporcionando así un mecanismo Además, nuestros datos indican que las serinas/treoninas quinasas (CK2 a') y fosfatasas (PP1) se enriquecieron significativamente en las fracciones nucleolares de Jurkat TAP-Tat. Estas enzimas representan la mayor parte de la actividad de fosforilación/desfosforilación en el nucleolo y pueden actuar como reguladores del tráfico de proteínas nucleolares. Además, Tat disminuyó significativamente los niveles de SUMO-2 en el nucleolo. Del mismo modo, se sabe que las modificaciones posteriores a la traducción mediadas por SUMO modulan la localización de proteínas nucleolares [104]. Dada la importancia potencial de las modificaciones posteriores a la traducción, incluida la fosforilación en el cambio mediado por Tat de la abundancia de proteínas nucleolares, un enfoque proteomico más específico como el enriquecimiento de fosfopétidos El control de la rotación de proteínas también es un medio importante para modular la abundancia de proteínas nucleolares. Las proteínas ribosómicas son degradadas por la vía Ubiquitina-Proteasoma para asegurar que su abundancia coincida con los niveles de transcripción de rRNA. A la inversa, las proteínas de choque térmico HSP90s las protegen de la degradación. Curiosamente, nuestros datos muestran que la modulación Tat de las proteínas de abundancia asociadas con la vía Ubiquitina-proteasoma y choque térmico. Esto podría contribuir al enriquecimiento observado de proteínas ribosómicas por Tat. Sin embargo, no podemos excluir que la mayor abundancia de proteínas ribosómicas en el nucleolo podría ser el resultado de la prevención mediada por Tat de su exportación al citoplasma. Curiosamente, utilizando un sistema celular diferente, una cepa transgénica de Drosophila melanogaster Tat, Ponti et al, analizaron los efectos de Tat en la biogénesis ribosoma, después de 3 días de tratamiento de choque térmico para inducir la expresión Tat bajo el control del promotor hsp70 [167]. Después de la expresión Tat, observaron un defecto en el procesamiento pre-rRNA asociado con una disminución en el nivel de 80S ribosomas [167]. Sin embargo, los diferentes sistemas celulares empleados combinados con la inducción de choque térmico de 3 días hacen que sus resultados sean difíciles de comparar con los nuestros. Mientras que estudios anteriores a nivel de sistema han monitoreado los efectos de la expresión Tat del VIH-1 en las células T, a nuestro conocimiento, hemos presentado aquí el primer análisis proteómico de la composición dinámica del nucleolus en respuesta a la expresión Tat del VIH Utilizando proteómica cuantitativa, hemos subrayado los cambios en la abundancia de proteínas nucleolares específicas y hemos destacado la reorganización nucleolar extensa y coordinada en respuesta a la expresión constitutiva Tat. Nuestros hallazgos subrayan que Tat que expresa células T exhiben un perfil proteómico nucleolar único, que puede reflejar una estrategia viral para facilitar la progresión a la producción viral robusta. Importantemente, hemos notado la relación funcional de proteínas nucleolares de nuestro conjunto de datos con la patogénesis VIH-1 y el Tat VIH-1 en particular. Esto aumenta aún más nuestra confianza en nuestra estrategia experimental y sugiere un papel para Tat en el control espacial y la compartimentación subcelular de estos cofactores celulares. Finalmente, nuestro estudio proporciona nuevas ideas sobre la importancia de Tat en la conversación cruzada entre funciones nucleolares y patogénesis viral. También hemos identificado cambios en la abundancia de proteínas nucleolares que no estaban previamente asociados con la patogénesis del VIH-1, incluyendo proteínas asociadas a vías metabólicas, que proporcionan nuevos objetivos potenciales y vías celulares para la intervención terapéutica.Células T Jurkat, clon E6.1 (ATCC), Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP se mantuvieron en el medio RPMI-1640 complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (Gibco, aprobado por la UE), y antibióticos. Células Phoenix-GP (G.P. Nolan; www.stanford.edu/ group/nolan/), se mantuvieron en el medio DMEM complementado con 10% (v/v) suero fetal bovino (GIBCO, aprobado por la UE). La secuencia de HIV-1 Tat (VIH-1 HXB2, 86 aminoácidos) fue subclonada en el vector pENTR 2B (Invitrogen, A10463). Usando la tecnología Gateway (Invitrogen), introdujimos la secuencia HIV-1 Tat en el plásmido pCeMM-NTAP(GS)-Gw [168]. Las células Fénix (G.P. Nolan; www.stanford.edu/group/nolan/), fueron transfectadas usando Fugene 6 (Roche) con 5 mg del plásmido NTAP-Tat o NTAP y 3 mg del pMDG-VSVG. Los sobrenadantes virales fueron recolectados después de 48 h, filtrados y utilizados para transducir las líneas celulares de Jurkat. La construcción se denomina NTAP-Ta Utilizando la entrega de genes retrovirales, transferimos de forma estable células Jurkat (clone E6.1 (ATCC)). Los clones positivos llamados Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron ordenados para enriquecer la población de células que expresaban GFP usando el clasificador de células BC MoFlo XDP (Beckman Coulter). Las fracciones subcelulares (10 mg) fueron resueltas por SDS-PAGE y transferidas a membranas BioTrace PVDF (Pall corporation). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: a-Tubulina (Sc 5286), C23 (Sc 6013), y Fibrilarina (Sc 25397) de Santa Cruz Biotechnology, y PARP (AM30) de Calbiochem, Ratón anti-ZAP 70 (05-253, Millipore), Ratón anti-STAT3 (06-596, Millipore), Ratón anti-ILF3 (ab92355, Abcam), Ratón anti-HSP90 beta (ab32568, Abcam), Ratón anti-ADAR1 (ab88574, Abcam), Ratón anti-HDAC1 (ab19845, Abcam), Ratón anti-SSRP1 (ab21584, Abcam) conejo anti-BOP1 (ab86982, Abcam), Ratón anti-KpNB1 (ab10303, Abcam), Ra Para el análisis SILAC-RPMI R0K0 y SILAC-RPMI R6K6 (Células Dundidas) se utilizó un medio con un 10% de FBS dializado (GIBCO, 26400-036); las células Jurkat que expresaban NTAP-Tat y NTAP fueron transitadas en serie y cultivadas durante cinco duplicados para asegurar la incorporación completa de los aminoácidos marcados; la viabilidad de las células se verificó con Trypan Blue (0,4% solución, SIGMA) y posteriormente se confirmó mediante tinción IP y análisis FACS; las células se mezclaron a la relación 1:1 para obtener 140610 6 células; los nucleoli fueron aislados de la población celular mixta como se describió previamente en Jarboui et al., [165]. Los extractos nucleolares (100 mg) fueron resuspendidos en bicarbonato de amonio de 50 mM y en solución de tripsina digerida como se describió previamente en Jarboui y col. [165]. La muestra se realizó en un espectrómetro de masa termoscientifico LTQ Orbitrap XL conectado a un sistema cromatógrafo NANO LC.1DPLUS que incorporaba una muestra automática. La muestra fue cargada en una columna Biobasic C18 PicofritTM (100 mm de longitud, 75 mm ID) y fue separada por un gradiente de acetonitrilo en aumento, utilizando un gradiente de 142 min de fase inversa (0-40% de acetonitrilo durante 110 min) a un caudal de 300 nL min-1. El espectrómetro de masa fue operado en modo iónico positivo con una temperatura capilar de 200uC, una tensión capilar de 46V, una tensión de lente de tubo de 140V y con un potencial de 1800V aplicada al frit. Todos los datos fueron adquiridos con el espectrómetro de masa que funciona en modo de conmutación automática dependiente de datos. Se realizó una exploración MS de alta resolución utilizando el Orbitrap para seleccionar los 5 iones más intensos antes del análisis MS/MS utilizando la trampa Ion. La eficiencia de incorporación de aminoácidos etiquetados fue determinada mediante el análisis de los péptidos identificados en nucleoli aislados de la población celular mantenida en el medio 'Heavy' como se describe en [169]. Nuestro análisis mostró que teníamos una eficiencia de incorporación.95% (datos no mostrados). Los espectros MS/MS fueron buscados para la identificación y cuantificación de los péptidos utilizando el software MaxQuant [170] (versión 1.1.1.36), la Base de Datos del IPI Humano (versión 3.83) y el motor de búsqueda Andrómeda asociado a MaxQuant [171]. Se utilizaron parámetros estándar para MaxQuant con el Acetil (término N de Proteína) como modificación variable y Carbamidometilo (Cys) como modificación fija, se permitieron 2 escisiónes perdidas, excepto que se prohibió el filtrado de aminoácidos etiquetados. La desviación de masa inicial de los iones precursores y fragmentos fue de 7 ppm y 0,5 Da, respectivamente. Cada relación proteica fue calculada como promedio ponderado de intensidad de los coeficientes de péptidos individuales. Las proteínas fueron identificadas con el mínimo de un péptido con una tasa La ontología genética, la vía KEGG y los términos Pfam se extrajeron de entradas UNIPROT utilizando Perseo, un software del paquete de análisis de datos MaxQuant (http://www.maxquant.org ), y las herramientas de la suite ToppGene [54]. El Jurkat NTAP-Tat y Jurkat NTAP fueron transfectados utilizando el sistema de electroporación Amaxa (biosistema Amaxa) con el pGL3 (pGL3-LTR) (Promega) como recomendado por Amaxa Biosystem. Los ensayos de doble luciferasa (Promega) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de Luciferasa se midió y normalizó contra la cantidad total de proteínas cuantificada por el kit de cuantificación de proteínas BCA (Pierce, Thermo Scientific). Para preservar Las células se fijaron en un 2% PFA durante 10 minutos en RT, permeabilizaron en un 0,5% Triton X-100 durante 15 minutos en RT y se bloquearon con 5% FCS. Las células se incubaron con el anticuerpo Tat VIH-1 de conejo (ab43014, Abcam) seguido por el anticuerpo secundario anti-Rabbit alexa fluor 647 (A-21246, Invitrogen). Las células se les permitió unirse a Cell-Tak (BD) recubierto de Diapositivas Silanizadas (DaoCytomation), y manchado con DAPI. Las imágenes se capturaron con un Microscopio Confocal Carl Zeiss equipado con un objetivo DIC de aceite de Plan-Apocromat 63X/14. El archivo de datos RAW proteómicos del análisis de espectrometría de masas se depositó en el repositorio Tranche(http El archivo se puede acceder y descargar utilizando la siguiente clave de hash:(R3O5SV5Z6HvWqrBNDhp21tXFetluDWYxvwMIfU-h6e1kMgarauCSq4dlNcxeUvFOHDEzLeDcg4X5Y8reSb6-MUA6wM1kIAAAAAAB/w = ). Materiales y Métodos S1 Descripción de los métodos empleados para examinar el ciclo celular, la viabilidad celular y el análisis de proliferación celular. (DOCX)

¿Cuántas proteínas mostraron un cambio significativo en el pliegue?

El análisis interactómico del virus de la coriomeningitis linfocítica nucleoproteína en las células infectadas revela que ATPasa Na(+)/K(+) transporta la subunidad Alfa 1 y prohíbe como factores de células huésped involucrados en el ciclo de vida de los mammarenavirushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5834214/SHA: efbd0dfc426da5dd25ce294111d6fa37571623773Autores: Iwasaki, Masaharu; Minder, Petra; Caì, Yíngyún; Kuhn, Jens H.; Yates, John R.; Torbett, Bruce E.; de la Torre, Juan C.Fecha: 2018-02-20DOI: 10.1371/journal. Además, la creciente evidencia indica que el mammarenavirus prototípico distribuido en todo el mundo, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), es un patógeno humano descuidado de importancia clínica. Las preocupaciones sobre los mammarenavirus patógenos humanos se exacerban por la falta de vacunas autorizadas, y la terapia actual antimammarenavirus se limita al uso fuera de la etiqueta de ribavirina que es sólo parcialmente eficaz. La comprensión detallada de las interacciones virus/células huésped puede facilitar el desarrollo de nuevas estrategias antimammarenavirus, apuntando a los componentes de la maquinaria de células huésped que son necesarios para la multiplicación eficiente de virus. Aquí documentamos la generación de un LCMV recombinante codificando una nucleoproteína (NP) que contiene una etiqueta de afinidad (rLCMV/Step-NP) y su uso para capturar el interactoma NP en células infectadas. Nuestro enfoque proteómico combinado con la genética y los ensayos de validación farmacológica identificaron a ATPasa Na(+)/K(+) transportando subunidad alfa 1 (ATP1A1) y prohibin (PHB) como factores provirales. Ensayos basados en células revelaron que ATP1A1 y PHB están involucrados en diferentes pasos del ciclo de vida del virus. En consecuencia, observamos un efecto inhibidor sinérgico en la multiplicación de LCMV con una combinación de inhibidores ATP1A1 y PHB. Demostramos que los inhibidores ATP1A1 suprimen la multiplicación del virus Lassa y Candid#1, una cepa vacunal atenuada viva del virus Junín, sugiriendo que el requisito de ATP1A1 en la multiplicación del virus se conserva entre los mammarenavirus genéticamente relacionados distantemente. Nuestros hallazgos sugieren que los inhibidores clínicamente aprobados de ATP1A1, como digoxina, podrían ser reutilizados para tratar infecciones por mammarenavirus patógenos para los seres humanos. Texto: Introducción Los Mammarenavirus (Arenaviridae: Mammarenavirus) causan infecciones crónicas de roedores en todo el mundo [1]. La invasión de viviendas humanas por roedores infectados puede resultar en infecciones humanas a través de la exposición mucosal a aerosoles o por contacto directo de la piel abrazada con material infeccioso. Varios mammarenavirus causan fiebres hemorrágicas virales (VHF) en los seres humanos y plantean importantes problemas de salud pública en sus áreas endémicas [2] [3] [4] [5] [6]. Los Mammarenavirus se clasifican en dos grupos principales, Viejo Mundo (OW) y Nuevo Mundo (NW) [1]. El virus OW Lassa (LASV), agente causal de la fiebre de Lassa (LF), es el patógeno OW mammarenaviral más significativo. Se estima que el virus LASV infecta a varios cientos de miles de individuos anualmente en África Occidental, resultando en un alto número de casos de LF asociados con alta morbilidad y letalidad. Además, las regiones endémicas de LASV se están expandiendo [7], y la asociación del virus recientemente identificado de la mammarenavirus Lujo con un brote de VHF en África Meridional [8, 9] ha suscitado preocupación por la aparición de nuevos virus de la VHF que causan la mammarenavirus. El virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) distribuido por todo el mundo es un patógeno humano descuidado de importancia clínica, especialmente en infecciones congénitas [11] [12] [13] [14] [15]. Además, la LCMV representa una amenaza especial para los individuos inmunocomprometidos, como se ha demostrado en casos mortales de infección por LCMV asociada a trasplantes de órganos [16, 17]. Sin embargo, la investigación de LCMV puede realizarse con seguridad en la contención BSL-2, en lugar de la contención BSL-4 necesaria para la investigación en vivo LASV o JUNV [18]. No existen vacunas con licencia de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los Estados Unidos para el tratamiento de infecciones por el virus de arena, aunque una cepa de vacuna viva atenuada de JUNV, Candid#1, está autorizada en Del mismo modo, la terapia actual contra el antimammarenavirus se limita a un uso offlabel de la ribavirina analógica nucleósida que es sólo parcialmente eficaz y puede causar efectos secundarios significativos [19] [20] [21]. El desarrollo de fármacos antimammarenavirus eficaces se ha visto obstaculizado por la falta de comprensión detallada de las interacciones virus/células huésped necesarias para la multiplicación del virus de la mammarena que podrían representar objetivos sensibles para la terapia antiviral. el problema potencial que la sobreexpresión de un único gen viral puede potenciar interacciones PPI que no son relevantes durante el curso de una infección por virus natural. Para superar este problema, diseñamos un LCMV recombinante (rLCMV) codificando un tándem [WSHPQFEK (GGSGS) 3 WSHPQFEK] Strep-tag fusionado a los amino-terminales de Para facilitar la identificación de PPI específico entre NP y proteínas de células huésped, utilizamos nuestra plataforma trisegmentada (r3) del mammarenavirus [30] para diseñar un r3LCMV expresando una versión C-terminal Strep-tag de proteína fluorescente verde mejorada (r3LCMV/eGFP-Strep) que usamos como control negativo (Fig 1A y 1B). Rescatamos rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep y confirmamos la expresión de NP estreptocada y eGFP en células infectadas por rLCMV/strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep, respectivamente (Fig 1C). A continuación, examinamos las propiedades de crecimiento de las células rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep en tres líneas celulares diferentes de hámsteres, humanos y primates no humanos (Células BHK-21, A549 y Vero E6, respectivamente) (Fig 1D). La aptitud de las cepas rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep disminuyó modestamente en comparación con la observada con cepas de tipo salvaje (WT) Armstrong (rLCMV ARM) y Clone 13 (rLCMV Cl-13) de LCMV. Sin embargo, tanto rLCMV/Strep-NP como r3LCMV/eGFP-Strep tenían cinética Al igual que con WT LCMV, la infección con rLCMV/Strep-NP impidió la producción de IFN-I bioactivo por las células en respuesta a la infección por el virus Sendai (SeV) determinada utilizando un bioensayo IFN basado en la protección contra el efecto citopático (ECP) inducido por la infección por el virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Fig 1E). Las células Vero tratadas durante 16 h con sobrenadantes cultivados en el tejido (TCS) de células A549 infectadas primero con WT LCMV o rLCMV/Strep, seguidas de una infección de 24 h con SeV, siguieron siendo totalmente susceptibles a la EPC inducida por VSV. Por el contrario, las células Vero tratadas con SCT de células A549 infectadas con rLCMV/NP(D382A), mutante incapaz de prevenir la inducción de IFN-I [30], y posteriormente con SeV, fueron protegidas contra la EPC inducida por VSV. Seleccionamos la línea celular humana A549 porque las células epiteliales pulmonares son uno de los objetivos iniciales de las células humanas tras la inhalación de mammarenavirions. Infectamos las células A549 (multiplicidad de infección [MOI] = 0,1) con rLCMV/Strep-NP o r3LCMV/eGFP-Strep (Fig 2A). A las 48 h post-inoculación (pi), preparamos lysatos celulares totales para ensayos de tracción (PD) utilizando una resina de sepharose Los alícuotas de los complejos proteicos presentes en las muestras de PD fueron fraccionados por electroforesis de gel dodecil-poliacrilamida (SDS-PAGE) (Fig 2B) seguida de tinción de gel proteínico rubí SYPRO. Comparamos el patrón de bandas proteicas manchadas detectadas entre rLCMV/Strep-NP- y r3LCMV/eGFP-Strepinfectadas y confirmamos la presencia de Strep-NP y eGFP-Strep en muestras pertinentes (Fig 2B). Los complejos proteicos en el resto de los eluatos de las muestras de PD fueron concentrados por precipitación de ácido tricloroacético (TCA) y sometidos a digestión de tripsina (Fig 2A). Los péptidos digeridos fueron sometidos a un análisis de espectrometría de masa de cromatografía líquida-tandem (LC-MS/MS) utilizando un espectrómetro de masa híbrido consistente en iones cuádrupoles lineales de doble célula (LTQ) Velos y un analizador de Orbitrap. Clasificamos proteínas de células huésped identificadas por el análisis de células huésped-LC-MS/MS de dos réplicas biológicas independientes en dos grupos: 1) proteínas encontradas únicamente en muestras de Strep-NP PD con al menos cinco recuentos espectrales (Tabla 1) y 2) proteínas encontradas en muestras de Strep-NP y eGFP-Strep PD con cinco o más recuentos espectrales en muestras de Strep-NP y al menos dos veces mayores en recuentos espectrales en muestras de Strep-NP PD en comparación con muestras de eG Entre las 53 proteínas presentes en las muestras de NP- y eGFP-PD, 36 tenían recuentos espectrales en la muestra de NP-PD que fueron menos de dos veces mayores que sus correspondientes recuentos espectrales en la muestra de eGFP-PD (Fig 2C y S1). Con base en los criterios descritos anteriormente, consideramos que estas proteínas son altamente improbables interactores específicos con una implicación en el ciclo de vida del LCMV, y por lo tanto no consideramos estos resultados para un análisis posterior. Sin embargo, reconocemos que no podemos descartar formalmente que algunos de estos impactos aún pudieran jugar un papel en el ciclo de vida del LCMV. La anotación proteica mediante la clasificación de la familia de proteínas (PANTHER) por relación evolutiva (Proceso Biológico) de los candidatos a la proteína interactuante del NP reveló que un gran número de proteínas estaban involucradas en También analizamos las funciones moleculares de los candidatos a proteínas NP-interactuantes según la clasificación del perfil proteico PAN-THER (Fig 2E), que reveló funciones bioquímicas diversificadas enriquecidas para proteínas de unión ácida nucleica y chaperonas. Para evaluar inicialmente los roles pro o antivirales de las proteínas de células huésped NP-interactuantes identificadas por LC-MS/MS, examinamos el efecto del pequeño ARN interferente (siRNA) mediado por kd (kd) de cada uno de los genes correspondientes sobre la multiplicación de rLCMV que expresa el gen reportero ZsGreen (ZsG) en células A549 (Fig 3A). Los siRNAs que utilizamos eran de la biblioteca de siRNA humana ON TARGET-Plus (OTP) (18,301 genes, 4 Los efectos fuera de blanco son impulsados principalmente por la actividad de semilla de microARN (miR) de cadena antisensible. En los OTPs, el hilo de sentido se modifica para favorecer la captación de cadena antisensible mientras que la región de semilla de cadena antisensible se modifica para reducir drásticamente la desecación de semilla [33]. Además, los OTPs están diseñados sobre la base del algoritmo SMARTselect (Dharmacon), ampliamente considerado como el mejor algoritmo para la estrategia de diseño racional de siRNA. Numerosos factores de células huésped mostraron un efecto anti-LCMV (aumento de la expresión ZsG por kd de los genes), incluyendo la proteína 1B asociada al microtúbulo (MAP1B) [ [38], el virus del dengue 2 (DEV-2) [39], y el virus chikungunya (CHIKV) [40 Para comenzar a evaluar las posibles implicaciones biológicas de las interacciones de proteína de NP-anfitriona identificadas, se seleccionó ATP1A1 y PHB dada la disponibilidad de reactivos, el conocimiento existente sobre sus roles en la fisiología celular y la evidencia de participación en la multiplicación de otros virus. Se confirmó que las células transfectadas con siRNA específicos de ATP1A1 y PHB exhibieron los niveles reducidos predichos en la expresión de proteína de ATP1A1 y PHB (Fig 3B). Asimismo, se examinó si los niveles de expresión reducida mediada por siRNA de ZsGreen correlacionados con los títulos de progenie de LCMV reducidos. Para ello, se infectaron las células A549 con expresión dirigida a siRNA de proteínas estreñidas. A549 células sembradas (5,0 x 10, A las 48 h, se prepararon lisatos celulares totales y se analizó la expresión proteica mediante el borrado occidental. (D) Propiedades de crecimiento de las rLCMV que expresaban proteínas etiquetadas con Strep. BHK-21 (1,75 x 10 5 células/pozo), A549 (1,25 x 10 5 células/pozo), o Vero E6 (1,25 x 10 5 células/pozo) sembradas en placas de 24 pozos y cultivadas durante la noche (MOI = 0,01) con los rLCMV indicados. En los momentos indicados, se recogieron los TCS y se determinaron los títulos del virus por IFFA. Los resultados representan un promedio ± DE de los resultados de tres experimentos independientes. (E) Falta de inducción de IFN-I en células infectadas con rLCMV/Strep-NP. Las células A549 fueron infectadas (MOI = 0,1) con el rLCMV indicado o el simulacro de infección, y 36 h más tarde infectadas con SeV (MOI = 1). A las 24 h pi con SeV, se recogieron y utilizaron TCS, tras la inactivación del virus por U.V., para tratar células Vero E6 durante 16 h, seguidas de infección con rVSV (MOI = 0,1) [rVSV(+)] o simulanfección [rVSV (-) ]. A las 24 h pi con rVSV, las células fueron fijas con 4% de PFA y manchadas con violeta cristalina para evaluar el efecto citopático inducido por rVSV. Utilizamos como control rLCMV/NP(D382A) que contiene mutación D382A dentro de NP, lo que se ha demostrado https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006892.g001 ATP1A1 o con NC siRNA 72 h antes de la infección con rLCMV/ZsG. Encontramos que siRNAmediated kd de ATP1A1 inhibió dramáticamente la expresión ZsGreen (Fig 3Ci), que se asoció con una reducción significativa de la progenie de LCMV infecciosa (Fig 3Cii). Nuestros intentos de ver la interacción entre NP y ATP1A1 o NP y PHB por coinmunoprecipitación no tuvieron éxito. Varias posibilidades podrían explicar esto, incluyendo interacciones de baja afinidad o alta tasa de encendido/apagado o ambas. Otra consideración es que sólo una fracción menor de NP podría estar involucrada en la interacción con una proteína de célula huésped dada, y por lo tanto, la detección de estas interacciones requeriría métodos altamente sensibles como LC-MS/MS. Para superar este problema utilizamos microscopía confocal para examinar la colocalización de NP con ATP1A1 y PHB en células infectadas con LCMV. Coeficientes de colocalización ponderados (CC), determinados tomando en consideración el brillo de cada señal de canal, fueron significativamente más altos que los CC no ponderados, lo que indica la presencia de píxeles más brillantes en las regiones colocalizadas en comparación con las regiones no colocalizadas (Fig 4). El glucósido cardíaco ouabaína es un inhibidor de ATP1A1 que se ha utilizado para tratar la insuficiencia cardíaca congestiva en países europeos [41]. El inhibidor de la PHB rocaglamida es una flavaglina de un árbol de Aglaia utilizado en la medicina tradicional china [42] que tiene una potente actividad anticancerosa [43]. Para examinar si la inhibición farmacológica de ATP1A1 o PHB inhibió la multiplicación de LCMV, pretratamos a seres humanos (A549 y HEK 293T), primates no humanos (Vero E6) y roedores (células murina L929 y hámster BHK-21) con ouabaína o rocaglamida y las infectamos con rLCMV/eGFP (S1 Fig). El tratamiento con ouabaína dio lugar a una fuerte inhibición dependiente de la dosis de expresión eGFP en células de primates humanas y no humanas infectadas, pero no afectó a la intensidad de expresión de eGFP en células de roedores Este hallazgo es consistente con roedores que expresan un alelo ATP1A1 resistente a la inhibición de la ouabaína [44]. Asimismo, observamos una inhibición dosis-dependiente de la expresión de la rocaglamida de eGFP en todas las líneas celulares infectadas con rLCMV/eGFP (S1B fig). De acuerdo con estos hallazgos, la producción de progenie de LCMV infecciosa se redujo mediante tratamiento con ouabaína o rocaglamida (fig. 5A) dentro de un rango de concentración que tuvo un impacto mínimo en la viabilidad celular (fig. 5B). Para examinar la correlación entre eficacia y citotoxicidad de estos compuestos, se determinó su índice terapéutico (TI = CC 50 /IC 50 (Fig 5Bi) ; mientras que rocaglamida tenía TI > 105 (CC 50 > 1000 nM, IC 50 = 9,51 nM) y 10,3 (CC 50 = 100 nM, IC 50 = 9,75 nM) en células A549 y Vero E6, respectivamente (Fig 5Bii). Además, el inhibidor antagonista de la ATP1A1, la bufalina, también mostró una fuerte actividad anti-LCMV con TIs de 8,92 (CC 50 Proteína de choque térmico HSP 90-alfa HSP90AA1 P07900 8 10 9 Endoplasmina HSP90B1 P14625 9 9 9 Gran aminoácidos neutros transportador pequeña subunidad 1 SLC7A5 Q01650 6 12 9 Queratina, tipo II cuticular Hb1 KRT81 Q14533 10 8 9 Helicasa Putativa MOV-10 MOV10 Q9HCE1 8 10 9 Proteína asociada a microtúbulos 1B MAP1B P46821 6 11 8,5 Cadena beta de espectro, rocaglamida (100 nM) (Fig 5C), además de apoyar una actividad anti-LC Para obtener información sobre los mecanismos por los que la ouabaína y la rocaglamida ejercen su actividad anti-LCMV, examinamos los efectos de estos compuestos en diferentes etapas del ciclo de vida de la LCMV. Primero, preguntamos si la ouabaína y la rocaglamida afectaban la entrada celular de la LCMV. Realizamos experimentos de tiempo de adición en los que tratamos a las células con ouabaína o rocaglamida antes de la inoculación viral (-1,5 h), en el momento de la inoculación (0 h), o 1,5 h pi (+1,5 h) (Fig 6A). En algunas muestras, utilizamos cloruro de amonio a partir de 4 h pi para bloquear múltiples rondas de infección viral. El tiempo de adición de compuestos no cambió significativamente el número de células positivas de la eGFP, lo que indica que ni la ouabaína ni la ro El número de células eGFP + en células tratadas con ouabaína se redujo en todos los puntos de adición en comparación con las células tratadas con dimetilsulfóxido (DMSO) del vehículo, pero fue similar al observado en células tratadas con cloruro de amonio. Por lo tanto, la ouabaína no inhibió la replicación y la expresión génica del ARN LCMV, sino más bien un paso tardío del ciclo de vida del LCMV. En contraste, el tratamiento con rocaglamida resultó en un número insignificante de células eGFP +, lo que indica que la rocaglamida inhibió la replicación y transcripción génica del ARN viral. Para investigar más a fondo el efecto de la ouabaína y la rocaglamida sobre la síntesis de ARN viral, infectamos células A549 con una LCMV infecciosa recombinante de un solo ciclo que expresaba e Setenta y dos horas más tarde, determinamos el porcentaje de expresión eGFP normalizada en células infectadas (Fig 6B). De acuerdo con nuestros resultados del experimento de tiempo de adición, la ouabaína no afectó la expresión eGFP de reportero. Sin embargo, la rocaglamida redujo la expresión eGFP, confirmando el efecto inhibidor de la rocaglamida en la síntesis de ARN del virus. También examinamos el efecto de la ouabaína y la rocaglamida en el último paso del ciclo de vida del virus de arena, la germinación mediada por Z. Para este experimento, transfectamos células con Z-Estrep- y Z-FLAG (epítopo de DYKDDK) que expresan los plásmidos de LCMV y LASV, respectivamente. A las 24 h después de la transfección, eliminamos el cultivo de tejido supernadante ( Cultivamos las células transfectadas en presencia o ausencia de ouabaína o rocaglamida. A las 24 h, determinamos por niveles WB de proteína Z tanto en lisatos celulares enteros y asociados con partículas víricas (VLPs) recolectadas de TCS. El tratamiento con rocaglamida, pero no con ouabaína, causó una reducción en la eficiencia de brotes de Z LCMV y LASV (Fig 6C y 6D). La reproducibilidad de estos hallazgos se confirmó a partir de los resultados de cuatro experimentos independientes (Fig 6E). También examinamos si la ouabaína podría interferir con un paso de ensamblaje de progenie infecciosa que no fue capturado por el ensayo de brotes Z a través de dos experimentos adicionales. El primer experimento consistió en el uso de una recién generada LCMV infecciosa recombinante de ciclo único que expresaba el gen reportero ZsGreen (scrLCMV/ZsG-P2A-NP) para infectar (MOI = 0,1) células A549 (1 st infección). Estas células fueron posteriormente transfectadas con un plásmido que expresaba LCMV GPC. Después de 24 h, usamos TCS para infectar una monocapa de células frescas (2 nd infección) e identificamos células infectadas basadas en la expresión ZsGreen. Para evaluar el efecto de la ouabaína en el ensamblaje de novo de progenie infecciosa determinamos proporciones normalizadas (2 nd /1 st infección) de células ZsGreen + (Fig 6F). El segundo experimento involucró infección (MOI = 0,1) de células con WT LCMV, y 48 h más tarde lavamos células infectadas tres veces para eliminar la progenie infecciosa extracelular producida durante las primeras 48 h de infección. Luego, se añadieron medios frescos que contenían ouabaína o control de vehículos DMSO, y 24 h más tarde determinamos títulos de virus en TCS (Fig 6G). Los resultados de ambos experimentos mostraron consistentemente que la ouabaína no inhibió el ensamblaje de novo del virus infeccioso extracelular. La terapia combinada puede aliviar significativamente el problema planteado por la rápida aparición de variantes farmacorresistentes comúnmente observadas durante las estrategias de monoterapia para controlar las infecciones por el virus ARN. Puesto que la ouabaína y la rocaglamida inhibieron diferentes pasos del ciclo de vida de LCMV, examinamos si su Para este experimento, infectamos células A549 con rLCMV/eGFP y las tratamos con ouabaína y rocaglamida utilizando diferentes concentraciones y combinaciones. A las 48 h pi, determinamos el porcentaje de expresión eGFP (Fig 7). El tratamiento combinado con ouabaína y rocaglamida dio lugar a una actividad anti-LCMV sinérgica que se realzó en condiciones utilizando concentraciones más altas de ouabaína y concentraciones más bajas de rocaglamida. Luego preguntamos si los factores de células hospedantes ATP1A1 y PHB contribuyeron también a la multiplicación de la fiebre hemorrágica viral causante de LASV. Tratamos células A549 con ouabaína, bufalina o rocaglamida e inoculamos las células tratadas con eGFP (rLASV/eGFP). Al igual que la infección por rLCMV, la multiplicación por LASV se restringió en células tratadas con ouabaína, bufalina o rocaglamida a concentraciones que afectaban mínimamente a la viabilidad celular, aunque sus valores IC 50 fueron ligeramente superiores a los encontrados con el sistema de infección por LCMV (Fig 5B y S2 Fig) ya que la ouabaína tenía IC 50 de 9,34 nM, la bufalina tenía IC 50 de 1,66 nM y la rocaglamida tenía IC 50 de 37,0 nM (Fig 8). También probamos el efecto de compuestos dirigidos a ATP1A1 y PHB sobre la multiplicación de JUNV. De acuerdo con nuestros resultados obtenidos con LCMV y LASV, ouabaína, bufalina y rocaglamida fuertemente suprimida multiplicación por JUNV (S3 Fig). Estos hallazgos indican que ATP1A1 y PHB funcionan como factores provirales de una gama de mammarenavirus. Identificamos ATP1A1 y PHB como proteínas novedosas de células huésped que contribuyen a la multiplicación eficiente de los mammarenavirus. Nuestro enfoque utilizando un LCMV recombinante que expresa NP con una etiqueta de afinidad facilitó la definición del interactoroma NP en el contexto de la infección por LCMV. Recientemente, utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb) específico de NP para precipitar NP y socios de proteínas celulares asociados en un interactoroma NP de mammarenavirus, King et al. identificaron 348 proteínas huésped que se asocian con LCMV NP [45]. Encontramos 99 proteínas comunes entre nuestro interactoroma LCMV NP filtrado de 171 proteínas y el interactoroma NP de LCMV documentado por King Las diferencias tanto en las condiciones experimentales como en las metodologías de análisis utilizadas para generar el interactoma NP de LCMV documentado por King et al. y nuestra probable h post-transfección, las células fueron lavadas con medios frescos para eliminar la producción mediada en Z de VLP en ausencia de tratamiento compuesto, y cultivadas para otras 24 h en medios frescos en presencia de ouabaína o Roc-A en las concentraciones indicadas. Los VLP presentes en TCS fueron recolectados por ultracentrifugación, y se prepararon lisatos celulares. La expresión de la proteína Z en VLPs y lisatos celulares fue determinada por manchas occidentales utilizando anticuerpos a Strep-tag (C) y FLAG-tag (D). La eficiencia de Budding para cada muestra fue estimada dividiendo la intensidad de señal de la proteína Z asociada con VLPs por la de Z detectada en la lisato celular. Los números en la parte inferior del panel C corresponden a las eficiencias de brotes LCMV Z determinadas en un experimento representativo. Los resultados mostrados en el panel E corresponden a la media y SD de cuatro experimentos independientes incluyendo el mostrado en el panel D. La eficiencia media de brotes de muestras de DMSO fue fijada al 100%. Los datos representan la media ± DE de cuatro experimentos independientes. (F) Efecto de la ouabaína en la incorporación de glicoproteína viral en viriones. Las células 293T sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pozos y cultivadas durante la noche fueron infectadas (MOI = 0,1) con SCLCMV/ZsG (1 st infección) durante 2 h y posteriormente transfectadas con 0,5 μg de pC-GPC. A las 24 h pi, las células se lavaban con medio fresco para eliminar la partícula vírica infecciosa producida en ausencia de tratamiento compuesto, y se cultivaban para otras 24 h en medio fresco en presencia de ouabaína a 40 nM (OUA). A las 48 h pi, se recogía TCS y se utilizaba para infectar la monocapa fresca de células BHK-21 (2 nd infección) sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pocillos 1 día antes de la infección, y se preparaba el lisato de células 293T. 24 h más tarde, se preparaba el lisato de células BHK-21. ZsLa intensidad de la señal verde se midía mediante un lector de placas fluorescente. La eficiencia de la incorporación de GP se estimaba dividiendo la intensidad de la señal verde en el lisato de células BH La eficiencia media de la incorporación GP de las muestras tratadas con DMSO se estableció al 100%. Los datos representan medios ± DE de tres experimentos independientes. Contribuyeron a las diferencias observadas entre los conjuntos de datos. A pesar del progreso en la implementación de pantallas globales basadas en proteómicas para identificar interacciones proteína-proteínas portadoras de virus, la superposición entre conjuntos de datos para el mismo sistema viral es generalmente limitada. Sin embargo, la superposición sustancial de 99 de las 171 proteínas interactuantes NP de ambos estudios apoya la confiabilidad global de ambos sistemas. Utilizamos los resultados del interactoroma eGFP-estrep, determinado en células infectadas por r3LCMV/eGFP-estrep, como un control para filtrar interacciones NP no específicas, lo que puede haber resultado en un mayor grado de rigor que en el estudio de King et al. para la selección de candidatos interactuantes NP. y el que presentamos en este trabajo, facilitará estudios futuros para caracterizar aún más las implicaciones funcionales y biológicas de las proteínas interactuantes de las células huésped-NP. Todos los NPs de mammarenavirus probados, con excepción del NP de TCRV, bloquearon la inducción IFN-I dependiente de IRF-3 [25, 46]. La actividad anti-IFN de NP se mapeó a su parte C-terminal y se vinculó al dominio de exonucleasasa de 3'-5' presente con la parte C-terminal de NP [30]. Inhibidor-B quinasa Nosotros, así como el trabajo de King et al. [45], no detectamos esta interacción NP-IKK. Esta discrepancia puede haber sido causada por una expresión muy baja de IKK-IKK- en células infectadas por LCMV, lo que impidió la detección de IKK-MS/MS. Alternativamente, la interacción NP-IKK-IKK- puede ser regulada temporalmente y tener lugar en tiempos tempranos pi, pero podría estar mayormente ausente a las 48 h pi, el momento en el que preparamos los lisatos celulares para nuestros estudios proteómicos. Estudios futuros comparando el interactoroma NP en diferentes momentos durante la infección contribuirán a una mejor comprensión de la dinámica de las interacciones proteína NP/antocélulas. Na + /K + -ATPasa es un transportador de iones de membrana bien caracterizado y está compuesto por dos subunidades funcionales (α y β) y una subunidad regulatoria γ [48]. ATP1A1 representa una de las cuatro subunidades α [49, 50]. Evidencia reciente ha sugerido que la Na + /K + -ATPasa está involucrada en múltiples vías de señalización celular que son independientes de su función de bombeo de iones [51]. Los inhibidores glucósidos cardíacos de la Na + /K + -ATPasa (NKA), llamados esteroides cardiotónicos (CST; por ejemplo, ouabaína, bufalina), han demostrado inhibir la multiplicación de diferentes virus, incluyendo virus del Ébola [35], coronavirus [36], herpes simplex virus 1 [52, 53], CHICKV [54], virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) [55], adenovirus [56] y virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino 1 [57]. Es probable que diferentes mecanismos contribuyan a la actividad antiviral de los CST, incluyendo funciones celulares alteradas moduladas por la actividad de señalización de Na + /K + -ATPasa [58]. Por lo tanto, una baja concentración de ouabaína induce un cambio conformacional en ATP1A1 que resulta en la activación y liberación de proto-oncogen tirosina proteína quinasa, Src, de ATP1A1, seguido de la activación de señales aguas abajo aún desconocidas que inhibe, por ejemplo, la entrada celular del virus de la hepatitis murina (MHV) [59]. Sin embargo, nuestros resultados indicaron que la ouabaína no interfirió con la entrada de células LCMV. Además, el tratamiento con el inhibidor de Src 4-amino-5-(4-metilfenil)-7-(t-butil)pirazolo [3,4-d] pirimidina (PP1) no contrarrestó la actividad anti-LCMV de ouabaína (S4 fig). Sin embargo, la señalización de SRC mediada por ATP1A1 podría contribuir de manera plausible al efecto inhibidor de la ouabaína en la multiplicación de JUNV como similar a la observada con MHV. Además, la entrada celular de JUNV se produce también por endocitosis mediada por clatrina [60], un proceso afectado por la señalización de Src. Ouabain se ha utilizado clínicamente en varios países europeos para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca congestiva, mientras que la bufalina se ha probado en ensayos clínicos para tratamientos contra el cáncer [61], y la digoxina CST ha sido aprobada por la FDA desde 1997 para tratar la insuficiencia cardíaca y la fibrilación auricular. El inhibidor de la PHB, rocaglamida, parecía interferir con la síntesis y el brote de ARN LCMV, pero no afectó la entrada de células LCMV. En contraste, se informó que la PHB era un receptor de entrada celular para DENV-2 [39] y CHIKV [40]. Por otro lado, la PHB no actuó como receptor de entrada de células virales para VHC. Más bien, la PHB contribuyó a la entrada de células VHC a través de la unión a RAF celular (c-Raf; proto-oncogene serina/treonina-proteína cinasa) y posterior activación del sarcoma de rata Harvey proto-oncogene (HRas) que induce una vía de transducción de señal requerida para la entrada de células VHC mediadas por el factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [37] Además, el kd mediado por siRNA de PHB disminuyó la producción de FLUAV H5N1 [38]. Estos hallazgos indican que el PHB está involucrado en diferentes etapas del ciclo de vida de una variedad de virus, y por lo tanto un blanco atractivo para el desarrollo de fármacos antivirales de amplio espectro. Rocaglate es un grupo de compuestos naturales, que incluye rocaglamida, que inhibe la síntesis de proteínas al apuntar al factor 4A de iniciación eucariota 4A (eIF4A) de la caja DEAD-ATP y ejerce actividad antitumoral [62, 63]. El compuesto de rocaglate, silvestrol, inhibe la multiplicación del virus del Ébola probablemente interfiriendo con el papel de eIF4A en la traducción de proteínas virales [64]. Mientras nos centramos en dos proteínas huésped, ATP1A1 y PHB, en este estudio, nuestro enfoque proteómico también identificó varias proteínas de células huésped interactuantes de NP cuya expresión kd a través de siRNA resultó en una multiplicación aumentada de LCMV. Estas proteínas, que incluyen MAP1B, podrían tener actividad anti-LCMV. MAP1B ha demostrado unirse a proteínas no estructurales 1 (NS1) y 2 (NS2) del virus sincitial respiratorio humano (HRSV) [34]. NS1 y NS2 de HRSV antagoniza la respuesta del huésped IFN-I al reducir los niveles de receptor de TNF asociados a factor (TRAF3), IKKel (NS1) y STAT2 (NS2) [65]. La interacción NS2-MAP1B interfirió con la capacidad de NS2 de HRSV para reducir los niveles de STAT2, mientras que el papel de la interacción NS1-MAP1B está por determinar [34]. Examinando el papel de la interacción NP-MAP1B en la modulación de la capacidad de NP para inhibir la inducción de tipo I IFN es de interés. Se identificó entre las proteínas de las células huésped interactuantes NP el virus de la leucemia de Moloney ARN 10 (MOV10), que ha sido reportado como un factor antiviral para FLUAV [66], retrovirus [67] [68] [69] [70] [71], y DENV-2 [72]. No observamos un aumento de la multiplicación de LCMV en células sometidas a kd mediadas por siRNA de MOV10, un hallazgo Sin embargo, consideramos que LCMV ya tiene una multiplicación óptima en células A549 y otros aumentos pueden ocurrir sólo en condiciones más bien únicas. MOV10 fue demostrado para mejorar la inducción IRF-3 mediada por IFN-I después de la infección por SeV a través de una unión de tanque quinasa 1 (TBK1)-independiente e IKK El CCT mamífero es crítico para el plegado de muchas proteínas con funciones importantes en diversos procesos celulares [74], y puede proteger las topologías de proteínas complejas dentro de su cavidad central durante la biosíntesis y el plegado [75]. La contribución de los miembros del CCT al ensamblaje del NP en una estructura nucleocápsida podría explicar su presencia en el NP, pero no en el eGFP, interactoma. Curiosamente, los miembros del CCT han sido implicados en la multiplicación de diferentes virus incluyendo virus de la rabia [76, 77], VHC [78] y FLUAV [79]. Sin embargo, el papel de estas proteínas del CCT en la multiplicación del virus sigue siendo desconocido y puede implicar funciones distintas de actuar como chaperonas moleculares. Estudios anteriores documentaron la presencia de varios componentes de la eIF4F, incluyendo 4A, dentro de los complejos de replicación viral-transcripción (RTC) detectados en células infectadas con LCMV [80] y TCRV [81]. Estos hallazgos, junto con la detección de una serie de proteínas ribosómicas en el interactoroma NP, sugieren que la traducción de mRNA virales puede tener lugar dentro de RTC. Sin embargo, la interferencia de rocaglamida con la actividad de eIF4A dentro de la RTC viral podría contribuir a su actividad anti-LCMV. En este trabajo, documentamos la generación de rLCMV/Strep-NP y su uso para definir el NP-interactoma en células infectadas. Presentamos evidencia de que ATP1A1 y PHB contribuyen a la multiplicación eficiente de mammarenavirus utilizando genética De acuerdo con nuestros hallazgos, el análisis bioinformático reveló que la red proteica asociada con ATP1A1 y PHB involucra a proteínas de células huésped con funciones en procesos biológicos que han sido implicados en la multiplicación del virus (S5 Fig). El enfoque experimental general descrito aquí puede facilitar la identificación de proteínas de células huésped interactuantes de NP biológicamente relevantes. Estudios futuros que elucidan los roles de los factores pro y antivirales de células huésped identificados en este estudio en la multiplicación del mammarenavirus avanzarán en nuestra comprensión de las múltiples funciones de NP y descubrir nuevos objetivos celulares para el desarrollo de fármacos antimammarenavirales. Además, al identificar factores provirales de células huésped, los fármacos que ya están aprobados pueden ser repurposing como terapéuticos para combatir infecciones por mammarenavirus patógenos humanos. El riñón de hámster BHK-21 (American Type Culture Collection, ATCC, CCL-10), el ratón de casa L929 (ATCC CCL-1), el grivet Vero E6 (ATCC CRL-1586), el A549 humano (ATCC CCL-185) y las células humanas HEK 293T (ATCC CRL-3216) se cultivaron en el medio de águila modificado de Dulbecco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) que contenía un 10% de suero fetal de bovino inactivado térmicamente, 2 mM de L-glutamina, 100 mg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina a 37°C y 5% de CO2. Los LCMV recombinantes WT, Armstrong (rLCMV ARM) y clon-13 (rLCMV Cl Se describió la generación de rLCMV/NP(D382A) y SeV, cepa Cantell, [30, 82, 83 ]. Un rLCMV sin GPC y expresando eGFP (rLCMVΔGPC/eGFP) fue generado por genética inversa utilizando procedimientos previamente descritos [84]. rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep fueron generados por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMV WT y LCMV trisegmentados (r3LCMV) expresando eGFP [30]. Para la generación de estos nuevos rLCMVs, creamos pol1S Cl-13 plásmidos que dirigían síntesis intracelular mediada por Pol1 de especies de ARN del genoma S de LCMV recombinante codificando para NP o e El rLCMV que expresa eGFP (rLCMV/eGFP) se generó como se describe [85], y el rLCMV que expresa ZsGreen (rLCMV/ZsG) en lugar de eGFP fue generado por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMV/eGFP. Generación de rLASV que expresa eGFP (rLASV/eGFP) se describirá en otra parte. Para la generación de un nuevo rLCMV de ciclo único que expresa ZsGreen (scrLCMV/ZsG-P2A-NP), un plásmido pol1S fue creado por omitiendo el marco de lectura abierto de GPC (ORF) a partir del plásmido pol1S utilizado para la generación de rLCMV/ZsG. scrLCMV/ZsG-P2A-NP fue rescatado por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMVΔGPC/eGFP [84]. Los títulos de LCMV se determinaron por inmunoenfoque formando ensayo (IFFA) como se describe [87]. Brevemente, se utilizaron diluciones en serie de 10 veces para infectar monocapas de células Vero E6 en una placa de 96 pocillos, y a Después de la permeabilización celular mediante tratamiento con tampón de dilución (DB) (0,3% Triton X-100 en PBS-conteniendo 3% de albúmina sérica bovina [BSA]), las células fueron manchadas con una rata mAb a NP (VL-4, Bio X Cell, West Lebanon, NH) conjugada con Alexa Fluor 488 (VL-4-AF488, Protein Labeling Kit, Life Technologies, Carlsbad, CA). Los títulos de VSV fueron determinados por un ensayo de placa. Los lisatos celulares totales se prepararon en el tampón de lisis PD (+) (250 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl [pH = 7,5], 0,5% TritonX-100, 10% glicerol, 1 mM de MgCl 2, 1 μM de CaCl 2, 1 μM de ZnCl 2 ) y se aclararon mediante centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. Los lisatos clarificados se mezclaron a una proporción de 1:1 con tampón de carga (100 mM de Tris [pH 6.8], 20% 2-mercaptoetanol, 4% SDS, 0,2% azul bromofenol, 20% glicerol) y hervidos durante 5 min. Las muestras de proteínas fueron fraccionadas por SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida de gradiente 4-20% (geles Mini-PROTEAN TGX 4-20%, Bio-Rad, Hércules, CA), y las proteínas fueron transferidas por electroblotting a membranas de difluoruro de polivinilideno (Membranas de Transferencia de Immobilina, Millipore, Billerica, MA). Para detectar proteínas etiquetadas con Strep, se reaccionaron membranas con anticuerpos monoclonales de ratón a Strep (QIAGEN, Germantown, MD), eGFP (Takara Bio USA, Mountain View, CA), GP 2 (We33/ 36), ATP1A1 (TehrmoFisher Scientific, Rockford, IL), PHB (Abcam, Cambridge, MA) o anticuerpos policlonales de conejo a α-tubulina (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) o gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, Millipore), respectivamente, seguidos de incubación con anticuerpos antimouse anti-peroxidasa apropiada y anti-rabbit inmunoglobulina G (IgG) (Jackson ImmunoInvestigation Laboratories, West Grove, SuperSignal West Pico o Femto sustrato quimioluminiscente (Thermo Fisher Scientific) se utilizó para obtener señales quimioluminiscentes que fueron visualizadas usando ImageQuant LAS 4000 Imager (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA). Retirada de proteínas estreptoscópicas del lisato celular infectado. A549 células preparadas en seis platos de 15 cm (aproximadamente 1,0 x 10 8 células en total) fueron infectadas con rLCMV/Step-NP o r3LCMV/eGFP en un MOI de 0,1. A las 48 h pi, las células fueron lavadas tres veces con PBS frío-hielo, raspadas en PBS frío-hielo fresco, y centrifugadas a 400 x g a 4°C durante 10 min. Se extrajo el sobrenadante y se lisaron células con 12 ml de tampón de lisis PD (+) complementado con un cóctel inhibidor de la proteasa y la fosfatasa de parada (Thermo Fisher Scientific) y 5 μg/ml de desoxiribonucleasa I (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ). El lisato se aclaró mediante centrifugación a 3,900 x g a 4oC durante 30 minutos para eliminar residuos celulares. El lisato celular clarificado fue incubado con resina de sefarosa estrep-tactina (QIAGEN) a 4oC. Después de 2 horas de incubación, la resina fue lavada tres veces con tampón de lisis PD (+) y una vez con tampón de lisis PD sin TritonX-100 ( tampón de Después de la centrifugación a 1.600 x g y 4oC durante 5 minutos, se eliminó el último tampón de lavado, y los complejos proteicos asociados con la resina se eludieron en 2 ml de tampón de lisis PD (-) que contenía 2,5 mM de destiobiotina. El eluato fue sometido a precipitación TCA seguido por digestión de tripsina. Microcolumna de tecnología de identificación de proteínas multidimensional. Se preparó una microcolumna MudPIT creando primero un frito Kasil en un extremo de un tubo capilar de diámetro exterior (OD) no desactivado (diámetro interior de 360 μm) (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). El frito Kasil se preparó sumergiendo brevemente un tubo capilar de 20-30 cm en 300 μl de Kasil 1624 solución bien mezclada de silicato potásico (PQ Corporation, Malvern, PA) y 100 μl de formamida, curándose a 100 °C durante 4 h, y cortando el frito a una longitud de %2 mm. Partículas fuertes de intercambio catiónico (SCX Luna, 5-μm diámetro, 125 Å poros, Phenomenex, Torrance, CA) se embalaron en la casa de las lonchas de partículas en metanol a 2,5 cm. Partículas de fase reversa (2 cm, C18 Aqua, 3-μm diámetro, 125 Å poros, Phenomenex) se embalaron sucesivamente en el tubo capilar utilizando el mismo método que la carga SCX. Análisis Mud Se generó una columna analítica de cromatografía líquida de fase inversa tirando de una punta de 100-μm (Diámetro Interior (ID) de 360 μm) de tubo capilar de OD (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) a 5-μm de ID. Las partículas de fase inversa (Luna C18, diámetro 3-μm, 125 Å poros, Phenomenex) se envasaron directamente en la columna arrastrada a 5,5 mPa hasta 15 cm de largo. La columna fue más embalada, lavada y descompuesta a 10 mPa con tampón B (80% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico) seguido de tampón A (5% acetonitrilo y 0,1% ácido fórmico). Las columnas de mudPIT y analíticas se montaron utilizando una unión de volumen cero muerto (Upchurch Scientific El análisis LC-MS/MS se realizó con una bomba LC de alta presión Agilent (Agilent) y una trampa de doble célula de iones cuadrúpolos lineal Orbitrap Velos (Thermo) utilizando una etapa de electrospray construida en la casa. El electrospray se realizó directamente desde la columna analítica mediante la aplicación del voltaje de ionización electrospray (ESI) a un tee (150 μm ID, Upchurch Scientific) directamente aguas abajo de un flujo dividido de 1:1.000 para reducir el caudal a 300 nl/min a través de las columnas. Se realizaron experimentos con mudPIT (10 pasos) en los que cada paso corresponde a 0, 10, 20, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100% tampón C (500 mM de acetato de amonio, 0,1% de ácido fórmico y 5% de acetonitrilo) y se ejecutó durante 3 minutos al comienzo de un gradiente de 110 minutos. Análisis de datos. Identificación de proteínas y péptidos se realizaron con Pipeline-IP2 (Aplicaciones proteómicas integradas, San Diego, CA. http://www. integratedproteomics.com/) utilizando algoritmos ProLUCID y DTASelect2. Parámetros de selección DTASelect fueron -p 2 -y 1-tripstat-pfp.01 -extra-pI-DB-dm-in. Los archivos en bruto de espectro se extrajeron en archivos ms2 de archivos en bruto utilizando el código abierto RawExtract 1.9.9 (Scripps Research Institute, La Jolla, CA; http://fields.scripps.edu/downloads.php), y los espectros de masa en tándem se buscaron en una base de datos de proteínas humanas (UniprotKB). Para estimar con precisión las probabilidades de péptidos y las tasas de falsos descubrimientos, se utilizó una base de datos de señuelos que contenía las secuencias inversas de todas las proteínas anexas a la base de datos de destino. Los espectros de masa en tándem se emparejaron con secuencias utilizando el algoritmo ProLUCID con tolerancia a las masas de péptidos de 600 ppm. Se consideró que la carbamidometilación (+57,02146 Da) de cisteína era una modificación estática. El cribado de siRNA A549 células (1.000 células/pozo) en una placa de 384-pozo se transfectó inversamente con 0,5 pmol de grupo de siRNA (S2 Table) dirigido a cada gen utilizando 0,1 μl de Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) (la concentración final de siRNA fue de 10 nM), seguido de incubación a 37°C y 5% de CO 2. A las 72 h de post-transfección, las células fueron infectadas (MOI = 0,05) con proteínas de rLCMV/ZsG. SiRNA objetivo de células huésped fueron seleccionadas en base a la disponibilidad de secuencias de siRNA validadas. Los siRNAs que usamos para examinar los efectos en la multiplicación de LCMV de la expresión noqueada de los golpes candidatos a proteína de la célula huésped interactuante NP correspondían al Genoma-ancho ON TAR-GET-Plus (OTP) Biblioteca de siRNA humana (18.301 genes, 4 siRNAs/gén; Dharmacon, Lafayette, CO). Las células A549 (3,0 x 10 4 células/bien) fueron transfectadas inversamente en una placa de 24 pozos con 6 pmol de piscinas de siRNA dirigidas a cada gen usando 1 μl de Lipofectamine RNAimax (concentración final de siRNA es 10 nM). A las 72 h post-transfección, el lisato celular total fue preparado en lisis modificada tampón A (25 mM Tris-HCl [pH = 8,0], 50 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1,25% desoxicolato sódico) y aclarado por centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. La concentración total de proteína de lisato celular clarificado fue medida por Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). La misma cantidad de proteína de cada muestra fue sometida a SDS-PAGE, y la expresión proteica de genes dirigidos a siRNA fue analizada por manchas occidentales. Después de la permeabilización celular mediante tratamiento con DB, las células fueron teñidas con 4',6-diamidin-2-fenilindol (DAPI). Las señales de fluorescencia verde (eGFP o ZsGreen) y DAPI fueron medidas por un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, Bio-Tek, Winooski, VT). Las células infectadas con mock y virus fueron fijas con 4 % de PFA. Después de la permeabilización celular y bloqueo mediante tratamiento con DB que contenía 1 % de suero normal de cabra, las células fueron incubadas con anticuerpos ATP1A1 o PHB de ratón primario seguidos por anticuerpos IgG antimouse secundario conjugados con Alexa Fluore 568 (antimouse IgG-AF56 En algunas muestras, se omitió el anticuerpo primario contra ATP1A1 o PHB para determinar la fluorescencia de fondo. Para visualizar los núcleos, se utilizó DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL) para montar los protectores en un vidrio deslizante. Se observaron células manchadas bajo un microscopio confocal (LSM 710, Zeiss) y datos analizados por el software ZEN (Zeiss). El análisis de co-localización se realizó sobre una base pixel por pixel utilizando el software Zen (Zeiss). Se marcaron ocho células verdes (NP-positivas) y se trazó cada píxel en el área marcada en el diagrama de dispersión basado en su nivel de intensidad de cada canal. Los umbrales de los canales verde y rojo se determinaron utilizando células infecciosas simuladas manchadas con anticuerpos VL-4-AF488 (anti-NP) y anti-ratón IgG conjugados con Alexa Fluor 568 sin utilizar anticuerpos anti-ATP1A1 o -PHB. A cada píxel se le asignó un valor de 1. Coeficientes de colocalización (CC) (o CC no ponderado) se determinaron dividiendo la suma de píxeles positivos tanto verdes como rojos por la suma de píxeles positivos verdes. Este cálculo se repitió para ocho células individuales. Para evaluar la especificidad de la colocalización, determinamos CC ponderado tomando en consideración el brillo de cada señal de canal. La comparación de los píxeles no ponderados y ponderados nos permitió determinar si había píxeles más brillantes en las regiones colocalizadas en comparación con las regiones no colocalizadas. Los valores de p se determinaron mediante un test de t emparejado de dos colas utilizando el software GraphPad Prism. Células A549 o Vero E6 sembradas (2,0 x 10 4 células/pozo) en una placa de 96 pocillos y cultivadas durante la noche se trataron con diluciones en serie de 3 veces a 37oC y 5 % CO 2 durante 2 h, seguidas de infección con rLCMV/eGFP (MOI = 0,01). Los compuestos estuvieron presentes en el punto final del estudio. A 48 h pi, las células se fijaron con un 4% de PFA en PBS, y la expresión eGFP fue examinada por un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Los valores medios obtenidos con células infectadas por DMSO y rL Las células A549 o Vero E6 sembradas en una placa de 96 pocillos (2,0 x 10,4 células/pozo) y cultivadas durante la noche fueron tratadas con diluciones en serie de 3 veces y cultivadas a 37oC y un 5% de CO 2 durante 48 h. Luego, se añadió el reactivo de solución CellTiter 96 AQ (Promega, Madison, WI). Posteriormente, el ensayo se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, y la absorbancia (490 nm) se obtuvo mediante un lector de ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) (SPECTRA max + 384; Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA). Los valores medios obtenidos con células tratadas con DMSO se fijaron al 100%. Las concentraciones de CC 50 se determinaron utilizando GraphPad Prism. Se generó un plásmido que expresaba la proteína Z estreptocada (pC-LCMV-Z-Strep) mediante un procedimiento similar para generar un plásmido que expresaba la proteína Z LASV (pC-LCMV-Z-FLAG) con la etiqueta C-terminal FLAG (pC-LASV-Z-FLAG), y el ensayo en ciernes se realizó como se describió anteriormente [88]. Las células (HEK 293T) en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 0,5 μg de vector pCAGGS vacío o pC-LCMV-Z-Strep o pC-LASV-Z-FLAG utilizando Lipofectamine 2000. A las 5 h de post-transfección, los medios fueron reemplazados por medios frescos e incubados a 37°C y 5% de CO 2 durante 19 Después de la eliminación del último medio de lavado, las células fueron cultivadas en medio fresco que contenía ouabaína (30 ó 40 nM) o rocaglamida (50 ó 100 nM) o concentración equivalente de DMSO, y 24 h más tarde, se recolectaron TCS y células que contenían partículas similares al virión (VLP). El lisato total de células fue preparado lisando las células con tampón de lisis (1% NP-40, 50 mM de Tris-HCl [pH 8,0], 62,5 mM NaCl, desoxicolato sódico al 0,4%). Después de aclarar el TCS de los desechos celulares mediante centrifugación a 400 x g y 4 °C durante 10 min, los VLP fueron recolectados por ultracentrifugación a 100.000 x g y 4 °C durante 30 min a través de un cojín de sacarosa Los VLP fueron resuspendidos en PBS, y la expresión Z en el lisato total de células y TCS (conteniendo VLPs) fueron analizados por manchas occidentales. Las células A549 infectadas con rLCMV/eGFP fueron recolectadas utilizando solución de desprendimiento de células de Accutasa (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA) y fijas con 4% PFA en PBS. La expresión eGFP fue examinada por citometría de flujo utilizando una BD LSR II (Becton Dickson), y los datos fueron analizados con FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Las células 293T sembradas (4,0 x 10 5 células/well) en una placa de 12 pozos y cultivadas durante la noche fueron infectadas con SCLCMV/ZsG-P2A-NP durante A las 24 h pi, las células fueron tres veces lavadas con medios frescos para eliminar la partícula vírica infecciosa producida en ausencia de tratamiento compuesto, y cultivadas durante otras 24 h en medios frescos en presencia de 40 nM de ouabaína o control del vehículo (DMSO). A las 48 h pi, se recogió TCS y se utilizó para infectar monocapas frescas de células BHK-21 sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pocillos 1 día antes de la infección, y se preparó el lisato de células 293T. 24 h más tarde, se preparó el lisato de células BHK-21. El lisato total de células se preparó en tampón de lisis celular (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl [pH = 7,5], 0,5% [NP-40], 1 mM de EDTA] y se aclaró mediante centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. ZsLa intensidad de la señal verde en el lisato de células clarificadas se midió mediante un lector de placas fluorescentes (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). A549 células sembradas (2 x 10 5 células/well) en una placa de 96 pozos y cultivadas durante la noche fueron tratadas con combinaciones de diferentes concentraciones de ouabaína y rocaglamida durante 2 h y luego infectadas (MOI = 0,01) con rLCMV/eGFP. A las 48 h pi, las células se fijaron, permeabilizaron mediante tratamiento con DB y se teñiron con DAPI. Las señales de eGFP y DAPI se midieron mediante un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Las lecturas de eGFP se normalizaron mediante lecturas de DAPI, y se utilizaron datos normalizados para analizar el efecto sinérgico de los dos compuestos por el programa MacSynergy II [89]. Los datos fueron analizados para valores de p mediante una prueba t sin emparejar de dos colas utilizando el software GraphPad Prism.

¿Cuáles son los grupos principales para los Mammarenavirus?

El análisis interactómico del virus de la coriomeningitis linfocítica nucleoproteína en las células infectadas revela que ATPasa Na(+)/K(+) transporta la subunidad Alfa 1 y prohíbe como factores de células huésped involucrados en el ciclo de vida de los mammarenavirushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5834214/SHA: efbd0dfc426da5dd25ce294111d6fa37571623773Autores: Iwasaki, Masaharu; Minder, Petra; Caì, Yíngyún; Kuhn, Jens H.; Yates, John R.; Torbett, Bruce E.; de la Torre, Juan C.Fecha: 2018-02-20DOI: 10.1371/journal. Además, la creciente evidencia indica que el mammarenavirus prototípico distribuido en todo el mundo, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), es un patógeno humano descuidado de importancia clínica. Las preocupaciones sobre los mammarenavirus patógenos humanos se exacerban por la falta de vacunas autorizadas, y la terapia actual antimammarenavirus se limita al uso fuera de la etiqueta de ribavirina que es sólo parcialmente eficaz. La comprensión detallada de las interacciones virus/células huésped puede facilitar el desarrollo de nuevas estrategias antimammarenavirus, apuntando a los componentes de la maquinaria de células huésped que son necesarios para la multiplicación eficiente de virus. Aquí documentamos la generación de un LCMV recombinante codificando una nucleoproteína (NP) que contiene una etiqueta de afinidad (rLCMV/Step-NP) y su uso para capturar el interactoma NP en células infectadas. Nuestro enfoque proteómico combinado con la genética y los ensayos de validación farmacológica identificaron a ATPasa Na(+)/K(+) transportando subunidad alfa 1 (ATP1A1) y prohibin (PHB) como factores provirales. Ensayos basados en células revelaron que ATP1A1 y PHB están involucrados en diferentes pasos del ciclo de vida del virus. En consecuencia, observamos un efecto inhibidor sinérgico en la multiplicación de LCMV con una combinación de inhibidores ATP1A1 y PHB. Demostramos que los inhibidores ATP1A1 suprimen la multiplicación del virus Lassa y Candid#1, una cepa vacunal atenuada viva del virus Junín, sugiriendo que el requisito de ATP1A1 en la multiplicación del virus se conserva entre los mammarenavirus genéticamente relacionados distantemente. Nuestros hallazgos sugieren que los inhibidores clínicamente aprobados de ATP1A1, como digoxina, podrían ser reutilizados para tratar infecciones por mammarenavirus patógenos para los seres humanos. Texto: Introducción Los Mammarenavirus (Arenaviridae: Mammarenavirus) causan infecciones crónicas de roedores en todo el mundo [1]. La invasión de viviendas humanas por roedores infectados puede resultar en infecciones humanas a través de la exposición mucosal a aerosoles o por contacto directo de la piel abrazada con material infeccioso. Varios mammarenavirus causan fiebres hemorrágicas virales (VHF) en los seres humanos y plantean importantes problemas de salud pública en sus áreas endémicas [2] [3] [4] [5] [6]. Los Mammarenavirus se clasifican en dos grupos principales, Viejo Mundo (OW) y Nuevo Mundo (NW) [1]. El virus OW Lassa (LASV), agente causal de la fiebre de Lassa (LF), es el patógeno OW mammarenaviral más significativo. Se estima que el virus LASV infecta a varios cientos de miles de individuos anualmente en África Occidental, resultando en un alto número de casos de LF asociados con alta morbilidad y letalidad. Además, las regiones endémicas de LASV se están expandiendo [7], y la asociación del virus recientemente identificado de la mammarenavirus Lujo con un brote de VHF en África Meridional [8, 9] ha suscitado preocupación por la aparición de nuevos virus de la VHF que causan la mammarenavirus. El virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) distribuido por todo el mundo es un patógeno humano descuidado de importancia clínica, especialmente en infecciones congénitas [11] [12] [13] [14] [15]. Además, la LCMV representa una amenaza especial para los individuos inmunocomprometidos, como se ha demostrado en casos mortales de infección por LCMV asociada a trasplantes de órganos [16, 17]. Sin embargo, la investigación de LCMV puede realizarse de forma segura en la contención BSL-2, en lugar de la contención BSL-4 necesaria para la investigación en vivo de LASV o JUNV [18]. No existen vacunas con licencia de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los Estados Unidos para el tratamiento de infecciones por arenavirus, aunque una cepa de vacuna viva atenuada de JUNV, Candid#1, está autorizada en Del mismo modo, la terapia actual contra el antimammarenavirus se limita a un uso offlabel de la ribavirina analógica nucleósida que es sólo parcialmente eficaz y puede causar efectos secundarios significativos [19] [20] [21]. El desarrollo de fármacos antimammarenavirus eficaces se ha visto obstaculizado por la falta de comprensión detallada de las interacciones virus/células huésped necesarias para la multiplicación del virus de la mammarena que podrían representar objetivos sensibles para la terapia antiviral. el problema potencial que la sobreexpresión de un único gen viral puede potenciar interacciones PPI que no son relevantes durante el curso de una infección por virus natural. Para superar este problema, diseñamos un LCMV recombinante (rLCMV) codificando un tándem [WSHPQFEK (GGSGS) 3 WSHPQFEK] Strep-tag fusionado a los amino-terminales de Para facilitar la identificación de PPI específico entre NP y proteínas de células huésped, utilizamos nuestra plataforma trisegmentada (r3) del mammarenavirus [30] para diseñar un r3LCMV expresando una versión C-terminal Strep-tag de proteína fluorescente verde mejorada (r3LCMV/eGFP-Strep) que usamos como control negativo (Fig 1A y 1B). Rescatamos rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep y confirmamos la expresión de NP y eGFP estreñidos en células infectadas por rLCMV/strep-NP y r3LCMV/eGFP, respectivamente (Fig 1C). A continuación, examinamos las propiedades de crecimiento de las células rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep en tres líneas celulares diferentes de hámsteres, humanos y primates no humanos (Células BHK-21, A549 y Vero E6, respectivamente) (Fig 1D). La aptitud de las cepas rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep disminuyó modestamente en comparación con la observada con cepas de tipo salvaje (WT) Armstrong (rLCMV ARM) y Clone 13 (rLCMV Cl-13) de LCMV. Sin embargo, tanto rLCMV/Strep-NP como r3LCMV/eGFP-Strep tenían cinética Al igual que con WT LCMV, la infección con rLCMV/Strep-NP impidió la producción de IFN-I bioactivo por las células en respuesta a la infección por el virus Sendai (SeV) determinada utilizando un bioensayo IFN basado en la protección contra el efecto citopático (ECP) inducido por la infección por el virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Fig 1E). Las células Vero tratadas durante 16 h con sobrenadantes cultivados en el tejido (TCS) de células A549 infectadas primero con WT LCMV o rLCMV/Strep, seguidas de una infección de 24 h con SeV, siguieron siendo totalmente susceptibles a la EPC inducida por VSV. Por el contrario, las células Vero tratadas con SCT de células A549 infectadas con rLCMV/NP(D382A), mutante incapaz de prevenir la inducción de IFN-I [30], y posteriormente con SeV, fueron protegidas contra la EPC inducida por VSV. Seleccionamos la línea celular humana A549 porque las células epiteliales pulmonares son uno de los objetivos iniciales de las células humanas tras la inhalación de mammarenavirions. Infectamos las células A549 (multiplicidad de infección [MOI] = 0,1) con rLCMV/Strep-NP o r3LCMV/eGFP-Strep (Fig 2A). A las 48 h post-inoculación (pi), preparamos lysatos celulares totales para ensayos de tracción (PD) utilizando una resina de sepharose Los alícuotas de los complejos proteicos presentes en las muestras de PD fueron fraccionados por electroforesis de gel dodecil-poliacrilamida (SDS-PAGE) (Fig 2B) seguida de tinción de gel proteínico rubí SYPRO. Comparamos el patrón de bandas proteicas manchadas detectadas entre rLCMV/Strep-NP- y r3LCMV/eGFP-Strepinfectadas y confirmamos la presencia de Strep-NP y eGFP-Strep en muestras pertinentes (Fig 2B). Los complejos proteicos en el resto de los eluatos de las muestras de PD fueron concentrados por precipitación de ácido tricloroacético (TCA) y sometidos a digestión de tripsina (Fig 2A). Los péptidos digeridos fueron sometidos a un análisis de espectrometría de masa de cromatografía líquida-tandem (LC-MS/MS) utilizando un espectrómetro de masa híbrido consistente en iones cuádrupoles lineales de doble célula (LTQ) Velos y un analizador de Orbitrap. Clasificamos proteínas de células huésped identificadas por el análisis de células huésped-LC-MS/MS de dos réplicas biológicas independientes en dos grupos: 1) proteínas encontradas únicamente en muestras de Strep-NP PD con al menos cinco recuentos espectrales (Tabla 1) y 2) proteínas encontradas en muestras de Strep-NP y eGFP-Strep PD con cinco o más recuentos espectrales en muestras de Strep-NP y al menos dos veces mayores en recuentos espectrales en muestras de Strep-NP PD en comparación con muestras de eG Entre las 53 proteínas presentes en las muestras de NP- y eGFP-PD, 36 tenían recuentos espectrales en la muestra de NP-PD que fueron menos de dos veces mayores que sus correspondientes recuentos espectrales en la muestra de eGFP-PD (Fig 2C y S1). Con base en los criterios descritos anteriormente, consideramos que estas proteínas son altamente improbables interactores específicos con una implicación en el ciclo de vida del LCMV, y por lo tanto no consideramos estos resultados para un análisis posterior. Sin embargo, reconocemos que no podemos descartar formalmente que algunos de estos impactos aún pudieran jugar un papel en el ciclo de vida del LCMV. La anotación proteica mediante la clasificación de la familia de proteínas (PANTHER) por relación evolutiva (Proceso Biológico) de los candidatos a la proteína interactuante del NP reveló que un gran número de proteínas estaban involucradas en También analizamos las funciones moleculares de los candidatos a proteínas NP-interactuantes según la clasificación del perfil proteico PAN-THER (Fig 2E), que reveló funciones bioquímicas diversificadas enriquecidas para proteínas de unión ácida nucleica y chaperonas. Para evaluar inicialmente los roles pro o antivirales de las proteínas de células huésped NP-interactuantes identificadas por LC-MS/MS, examinamos el efecto del pequeño ARN interferente (siRNA) mediado por kd (kd) de cada uno de los genes correspondientes sobre la multiplicación de rLCMV que expresa el gen reportero ZsGreen (ZsG) en células A549 (Fig 3A). Los siRNAs que utilizamos eran de la biblioteca de siRNA humana ON TARGET-Plus (OTP) (18,301 genes, 4 Los efectos fuera de blanco son impulsados principalmente por la actividad de semilla de microARN (miR) de cadena antisensible. En los OTPs, la cadena de sentido se modifica para favorecer la captación de cadena antisensible mientras que la región de semilla de cadena antisensible se modifica para reducir drásticamente la desecación relacionada con la semilla [33]. Además, las OTPs están diseñadas sobre la base del algoritmo SMARTselection (Dharmacon), ampliamente considerado como el mejor algoritmo para la estrategia de diseño racional de siRNA. Numerosos factores de células huésped mostraron un efecto anti-LCMV (aumento de la expresión ZsG por kd de los genes), incluyendo la proteína 1B asociada al microtúbulo (MAP1B) [ [38], el virus del dengue 2 (DEV-2) [39], y el virus chikungunya (CHIKV) Para comenzar a evaluar las posibles implicaciones biológicas de las interacciones de proteína de NP-anfitriona identificadas, se seleccionó ATP1A1 y PHB dada la disponibilidad de reactivos, el conocimiento existente sobre sus roles en la fisiología celular y la evidencia de participación en la multiplicación de otros virus. Se confirmó que las células transfectadas con siRNA específicos de ATP1A1 y PHB exhibieron los niveles reducidos predichos en la expresión de proteína de ATP1A1 y PHB (Fig 3B). Asimismo, se examinó si los niveles de expresión reducida mediada por siRNA de ZsGreen correlacionados con los títulos de progenie de LCMV reducidos. Para ello, se infectaron las células A549 con expresión dirigida a siRNA de proteínas estreñidas. A549 células sembradas (5,0 x 10, A las 48 h, se prepararon lisatos celulares totales y se analizó la expresión de proteínas mediante el borrado occidental. (D) Propiedades de crecimiento de rLCMV que expresaba proteínas etiquetadas con estreptococos. BHK-21 (1,75 x 10 5 células/pozo), A549 (1,25 x 10 5 células/pozo), o Vero E6 (1,25 x 10 5 células/pozo) células sembradas en placas de 24 pozos y cultivadas durante la noche (MOI = 0,01) con los rLCMV indicados. En los momentos indicados, se recogieron los TCSs y se determinaron los títulos del virus por IFFA. Los resultados representan un promedio ± DE de los resultados de tres experimentos independientes. (E) Falta de inducción de IFN-I en células infectadas con rLCMV/Estreptocope-NP. Las células A549 fueron infectadas (MOI = 0,1) con el rLCMV indicado o el simulacro de infección, y 36 h más tarde infectadas con SeV (MOI = 1). A las 24 h pi con SeV, se recogieron y utilizaron TCS, tras la inactivación del virus por U.V., para tratar células Vero E6 durante 16 h, seguidas de infección con rVSV (MOI = 0,1) [rVSV(+)] o simulanfección [rVSV (-) ]. A las 24 h pi con rVSV, las células fueron fijas con 4% de PFA y manchadas con violeta cristalina para evaluar el efecto citopático inducido por rVSV. Utilizamos como control rLCMV/NP(D382A) que contiene mutación D382A dentro de NP, lo que ha demostrado la https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006892.g001 ATP1A1 o con NC siRNA 72 h antes de la infección con rLCMV/ZsG. Encontramos que siRNAmediated kd de ATP1A1 inhibió dramáticamente la expresión ZsGreen (Fig 3Ci), que se asoció con una reducción significativa de la progenie de LCMV infecciosa (Fig 3Cii). Nuestros intentos de ver la interacción entre NP y ATP1A1 o NP y PHB por coinmunoprecipitación no tuvieron éxito. Varias posibilidades podrían explicar esto, incluyendo interacciones de baja afinidad o alta tasa de encendido/apagado o ambas. Otra consideración es que sólo una fracción menor de NP podría estar involucrada en la interacción con una proteína de célula huésped dada, y por lo tanto, la detección de estas interacciones requeriría métodos altamente sensibles como LC-MS/MS. Para superar este problema utilizamos microscopía confocal para examinar la colocalización de NP con ATP1A1 y PHB en células infectadas con LCMV. Coeficientes de colocalización ponderados (CC), determinados tomando en consideración el brillo de cada señal de canal, fueron significativamente más altos que los CC no ponderados, lo que indica la presencia de píxeles más brillantes en las regiones colocalizadas en comparación con las regiones no colocalizadas (Fig 4). El glucósido cardíaco ouabaína es un inhibidor de ATP1A1 que se ha utilizado para tratar la insuficiencia cardíaca congestiva en países europeos [41]. El inhibidor de la PHB rocaglamida es una flavaglina de un árbol de Aglaia utilizado en la medicina tradicional china [42] que tiene una potente actividad anticancerosa [43]. Para examinar si la inhibición farmacológica de ATP1A1 o PHB inhibió la multiplicación de LCMV, pretratamos a seres humanos (A549 y HEK 293T), primates no humanos (Vero E6) y roedores (células murina L929 y hámster BHK-21) con ouabaína o rocaglamida y las infectamos con rLCMV/eGFP (S1 Fig). El tratamiento con ouabaína dio lugar a una fuerte inhibición dependiente de la dosis de expresión eGFP en células de primates humanas y no humanas infectadas, pero no afectó a la intensidad de expresión de eGFP en células de roedores Este hallazgo es consistente con roedores que expresan un alelo ATP1A1 resistente a la inhibición de la ouabaína [44]. Asimismo, observamos una inhibición dosis-dependiente de la expresión de la rocaglamida de eGFP en todas las líneas celulares infectadas con rLCMV/eGFP (S1B fig). De acuerdo con estos hallazgos, la producción de progenie de LCMV infecciosa se redujo mediante tratamiento con ouabaína o rocaglamida (fig. 5A) dentro de un rango de concentración que tuvo un impacto mínimo en la viabilidad celular (fig. 5B). Para examinar la correlación entre eficacia y citotoxicidad de estos compuestos, se determinó su índice terapéutico (TI = CC 50 /IC 50 (Fig 5Bi) ; mientras que rocaglamida tenía TI > 105 (CC 50 > 1000 nM, IC 50 = 9,51 nM) y 10,3 (CC 50 = 100 nM, IC 50 = 9,75 nM) en células A549 y Vero E6, respectivamente (Fig 5Bii). Además, el inhibidor antagonista de la ATP1A1, la bufalina, también mostró una fuerte actividad anti-LCMV con TIs de 8,92 (CC 50 Proteína de choque térmico HSP 90-alfa HSP90AA1 P07900 8 10 9 Endoplasmina HSP90B1 P14625 9 9 9 Gran aminoácidos neutros transportador pequeña subunidad 1 SLC7A5 Q01650 6 12 9 Queratina, tipo II cuticular Hb1 KRT81 Q14533 10 8 9 Helicasa Putativa MOV-10 MOV10 Q9HCE1 8 10 9 Proteína asociada a microtúbulos 1B MAP1B P46821 6 11 8,5 Cadena beta de espectro, rocaglamida (100 nM) (Fig 5C), además de apoyar una actividad anti-LC Para obtener información sobre los mecanismos por los que la ouabaína y la rocaglamida ejercen su actividad anti-LCMV, examinamos los efectos de estos compuestos en diferentes etapas del ciclo de vida de la LCMV. Primero, preguntamos si la ouabaína y la rocaglamida afectaban la entrada celular de la LCMV. Realizamos experimentos de tiempo de adición en los que tratamos a las células con ouabaína o rocaglamida antes de la inoculación viral (-1,5 h), en el momento de la inoculación (0 h), o 1,5 h pi (+1,5 h) (Fig 6A). En algunas muestras, utilizamos cloruro de amonio a partir de 4 h pi para bloquear múltiples rondas de infección viral. El tiempo de adición de compuestos no cambió significativamente el número de células positivas de la eGFP, lo que indica que ni la ouabaína ni la ro El número de células eGFP + en células tratadas con ouabaína se redujo en todos los puntos de adición en comparación con las células tratadas con dimetilsulfóxido (DMSO) del vehículo, pero fue similar al observado en células tratadas con cloruro de amonio. Por lo tanto, la ouabaína no inhibió la replicación y la expresión génica del ARN LCMV, sino más bien un paso tardío del ciclo de vida del LCMV. En contraste, el tratamiento con rocaglamida resultó en un número insignificante de células eGFP +, lo que indica que la rocaglamida inhibió la replicación y transcripción génica del ARN viral. Para investigar más a fondo el efecto de la ouabaína y la rocaglamida sobre la síntesis de ARN viral, infectamos células A549 con una LCMV infecciosa recombinante de un solo ciclo que expresaba e Setenta y dos horas más tarde, determinamos el porcentaje de expresión eGFP normalizada en células infectadas (Fig 6B). De acuerdo con nuestros resultados del experimento de tiempo de adición, la ouabaína no afectó la expresión eGFP de reportero. Sin embargo, la rocaglamida redujo la expresión eGFP, confirmando el efecto inhibidor de la rocaglamida en la síntesis de ARN del virus. También examinamos el efecto de la ouabaína y la rocaglamida en el último paso del ciclo de vida del virus de arena, la germinación mediada por Z. Para este experimento, transfectamos células con Z-Estrep- y Z-FLAG (epítopo de DYKDDK) que expresan los plásmidos de LCMV y LASV, respectivamente. A las 24 h después de la transfección, eliminamos el cultivo de tejido supernadante ( Cultivamos las células transfectadas en presencia o ausencia de ouabaína o rocaglamida. A las 24 h, determinamos por niveles WB de proteína Z tanto en lisatos celulares enteros y asociados con partículas víricas (VLPs) recolectadas de TCS. El tratamiento con rocaglamida, pero no con ouabaína, causó una reducción en la eficiencia de brotes de Z LCMV y LASV (Fig 6C y 6D). La reproducibilidad de estos hallazgos se confirmó a partir de los resultados de cuatro experimentos independientes (Fig 6E). También examinamos si la ouabaína podría interferir con un paso de ensamblaje de progenie infecciosa que no fue capturado por el ensayo de brotes Z a través de dos experimentos adicionales. El primer experimento consistió en el uso de una recién generada LCMV infecciosa recombinante de ciclo único que expresaba el gen reportero ZsGreen (scrLCMV/ZsG-P2A-NP) para infectar (MOI = 0,1) células A549 (1 st infección). Estas células fueron posteriormente transfectadas con un plásmido que expresaba LCMV GPC. Después de 24 h, usamos TCS para infectar una monocapa de células frescas (2 nd infección) e identificamos células infectadas basadas en la expresión ZsGreen. Para evaluar el efecto de la ouabaína en el ensamblaje de novo de progenie infecciosa determinamos proporciones normalizadas (2 nd /1 st infección) de células ZsGreen + (Fig 6F). El segundo experimento involucró infección (MOI = 0,1) de células con WT LCMV, y 48 h más tarde lavamos células infectadas tres veces para eliminar la progenie infecciosa extracelular producida durante las primeras 48 h de infección. Luego, se añadieron medios frescos que contenían ouabaína o control de vehículos DMSO, y 24 h más tarde determinamos títulos de virus en TCS (Fig 6G). Los resultados de ambos experimentos mostraron consistentemente que la ouabaína no inhibió el ensamblaje de novo del virus infeccioso extracelular. La terapia combinada puede aliviar significativamente el problema planteado por la rápida aparición de variantes farmacorresistentes comúnmente observadas durante las estrategias de monoterapia para controlar las infecciones por el virus ARN. Puesto que la ouabaína y la rocaglamida inhibieron diferentes pasos del ciclo de vida de LCMV, examinamos si su Para este experimento, infectamos células A549 con rLCMV/eGFP y las tratamos con ouabaína y rocaglamida utilizando diferentes concentraciones y combinaciones. A las 48 h pi, determinamos el porcentaje de expresión eGFP (Fig 7). El tratamiento combinado con ouabaína y rocaglamida dio lugar a una actividad anti-LCMV sinérgica que se realzó en condiciones utilizando concentraciones más altas de ouabaína y concentraciones más bajas de rocaglamida. Luego preguntamos si los factores de células hospedantes ATP1A1 y PHB contribuyeron también a la multiplicación de la fiebre hemorrágica viral causante de LASV. Tratamos células A549 con ouabaína, bufalina o rocaglamida e inoculamos las células tratadas con eGFP (rLASV/eGFP). Al igual que la infección por rLCMV, la multiplicación por LASV se restringió en células tratadas con ouabaína, bufalina o rocaglamida a concentraciones que afectaban mínimamente a la viabilidad celular, aunque sus valores IC 50 fueron ligeramente superiores a los encontrados con el sistema de infección por LCMV (Fig 5B y S2 Fig) ya que la ouabaína tenía IC 50 de 9,34 nM, la bufalina tenía IC 50 de 1,66 nM y la rocaglamida tenía IC 50 de 37,0 nM (Fig 8). También probamos el efecto de compuestos dirigidos a ATP1A1 y PHB sobre la multiplicación de JUNV. De acuerdo con nuestros resultados obtenidos con LCMV y LASV, ouabaína, bufalina y rocaglamida fuertemente suprimida multiplicación por JUNV (S3 Fig). Estos hallazgos indican que ATP1A1 y PHB funcionan como factores provirales de una gama de mammarenavirus. Identificamos ATP1A1 y PHB como proteínas novedosas de células huésped que contribuyen a la multiplicación eficiente de los mammarenavirus. Nuestro enfoque utilizando un LCMV recombinante que expresa NP con una etiqueta de afinidad facilitó la definición del interactoroma NP en el contexto de la infección por LCMV. Recientemente, utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb) específico de NP para precipitar NP y socios de proteínas celulares asociados en un interactoroma NP de mammarenavirus, King et al. identificaron 348 proteínas huésped que se asocian con LCMV NP [45]. Encontramos 99 proteínas comunes entre nuestro interactoroma LCMV NP filtrado de 171 proteínas y el interactoroma NP de LCMV documentado por King Las diferencias tanto en las condiciones experimentales como en las metodologías de análisis utilizadas para generar el interactoma NP de LCMV documentado por King et al. y nuestra probable h post-transfección, las células fueron lavadas con medios frescos para eliminar la producción mediada en Z de VLP en ausencia de tratamiento compuesto, y cultivadas para otras 24 h en medios frescos en presencia de ouabaína o Roc-A en las concentraciones indicadas. Los VLP presentes en TCS fueron recolectados por ultracentrifugación, y se prepararon lisatos celulares. La expresión de la proteína Z en VLPs y lisatos celulares fue determinada por manchas occidentales utilizando anticuerpos a Strep-tag (C) y FLAG-tag (D). La eficiencia de Budding para cada muestra fue estimada dividiendo la intensidad de señal de la proteína Z asociada con VLPs por la de Z detectada en la lisato celular. Los números en la parte inferior del panel C corresponden a las eficiencias de brotes LCMV Z determinadas en un experimento representativo. Los resultados mostrados en el panel E corresponden a la media y SD de cuatro experimentos independientes incluyendo el mostrado en el panel D. La eficiencia media de brotes de muestras de DMSO fue fijada al 100%. Los datos representan la media ± DE de cuatro experimentos independientes. (F) Efecto de la ouabaína en la incorporación de glicoproteína viral en viriones. Las células 293T sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pozos y cultivadas durante la noche fueron infectadas (MOI = 0,1) con SCLCMV/ZsG (1 st infección) durante 2 h y posteriormente transfectadas con 0,5 μg de pC-GPC. A las 24 h pi, las células se lavaban con medio fresco para eliminar la partícula vírica infecciosa producida en ausencia de tratamiento compuesto, y se cultivaban para otras 24 h en medio fresco en presencia de ouabaína a 40 nM (OUA). A las 48 h pi, se recogía TCS y se utilizaba para infectar la monocapa fresca de células BHK-21 (2 nd infección) sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pocillos 1 día antes de la infección, y se preparaba el lisato de células 293T. 24 h más tarde, se preparaba el lisato de células BHK-21. ZsLa intensidad de la señal verde se midía mediante un lector de placas fluorescente. La eficiencia de la incorporación de GP se estimaba dividiendo la intensidad de la señal verde en el lisato de células BH La eficiencia media de la incorporación GP de las muestras tratadas con DMSO se estableció al 100%. Los datos representan medios ± DE de tres experimentos independientes. Contribuyeron a las diferencias observadas entre los conjuntos de datos. A pesar del progreso en la implementación de pantallas globales basadas en proteómicas para identificar interacciones proteína-proteínas portadoras de virus, la superposición entre conjuntos de datos para el mismo sistema viral es generalmente limitada. Sin embargo, la superposición sustancial de 99 de las 171 proteínas interactuantes NP de ambos estudios apoya la confiabilidad global de ambos sistemas. Utilizamos los resultados del interactoroma eGFP-estrep, determinado en células infectadas por r3LCMV/eGFP-estrep, como un control para filtrar interacciones NP no específicas, lo que puede haber resultado en un mayor grado de rigor que en el estudio de King et al. para la selección de candidatos interactuantes NP. y el que presentamos en este trabajo, facilitará estudios futuros para caracterizar aún más las implicaciones funcionales y biológicas de las proteínas interactuantes de las células huésped-NP. Todos los NPs de mammarenavirus probados, con excepción del NP de TCRV, bloquearon la inducción IFN-I dependiente de IRF-3 [25, 46]. La actividad anti-IFN de NP se mapeó a su parte C-terminal y se vinculó al dominio de exonucleasasa de 3'-5' presente con la parte C-terminal de NP [30]. Inhibidor-B quinasa Nosotros, así como el trabajo de King et al. [45], no detectamos esta interacción NP-IKK. Esta discrepancia puede haber sido causada por una expresión muy baja de IKK-IKK- en células infectadas por LCMV, lo que impidió la detección de IKK-MS/MS. Alternativamente, la interacción NP-IKK-IKK- puede ser regulada temporalmente y tener lugar en tiempos tempranos pi, pero podría estar mayormente ausente a las 48 h pi, el momento en el que preparamos los lisatos celulares para nuestros estudios proteómicos. Estudios futuros comparando el interactoroma NP en diferentes momentos durante la infección contribuirán a una mejor comprensión de la dinámica de las interacciones proteína NP/antocélulas. Na + /K + -ATPasa es un transportador de iones de membrana bien caracterizado y está compuesto por dos subunidades funcionales (α y β) y una subunidad regulatoria γ [48]. ATP1A1 representa una de las cuatro subunidades α [49, 50]. Evidencia reciente ha sugerido que la Na + /K + -ATPasa está involucrada en múltiples vías de señalización celular que son independientes de su función de bombeo de iones [51]. Los inhibidores glucósidos cardíacos de la Na + /K + -ATPasa (NKA), llamados esteroides cardiotónicos (CST; por ejemplo, ouabaína, bufalina), han demostrado inhibir la multiplicación de diferentes virus, incluyendo virus del Ébola [35], coronavirus [36], herpes simplex virus 1 [52, 53], CHICKV [54], virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) [55], adenovirus [56] y virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino 1 [57]. Es probable que diferentes mecanismos contribuyan a la actividad antiviral de los CST, incluyendo funciones celulares alteradas moduladas por la actividad de señalización de Na + /K + -ATPasa [58]. Por lo tanto, una baja concentración de ouabaína induce un cambio conformacional en ATP1A1 que resulta en la activación y liberación de proto-oncogen tirosina proteína quinasa, Src, de ATP1A1, seguido de la activación de señales aguas abajo aún desconocidas que inhibe, por ejemplo, la entrada celular del virus de la hepatitis murina (MHV) [59]. Sin embargo, nuestros resultados indicaron que la ouabaína no interfirió con la entrada de células LCMV. Además, el tratamiento con el inhibidor de Src 4-amino-5-(4-metilfenil)-7-(t-butil)pirazolo [3,4-d] pirimidina (PP1) no contrarrestó la actividad anti-LCMV de ouabaína (S4 fig). Sin embargo, la señalización de SRC mediada por ATP1A1 podría contribuir de manera plausible al efecto inhibidor de la ouabaína en la multiplicación de JUNV como similar a la observada con MHV. Además, la entrada celular de JUNV se produce también por endocitosis mediada por clatrina [60], un proceso afectado por la señalización de Src. Ouabain se ha utilizado clínicamente en varios países europeos para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca congestiva, mientras que la bufalina se ha probado en ensayos clínicos para tratamientos contra el cáncer [61], y la digoxina CST ha sido aprobada por la FDA desde 1997 para tratar la insuficiencia cardíaca y la fibrilación auricular. El inhibidor de la PHB, rocaglamida, parecía interferir con la síntesis y el brote de ARN LCMV, pero no afectó la entrada de células LCMV. En contraste, se informó que la PHB era un receptor de entrada celular para DENV-2 [39] y CHIKV [40]. Por otro lado, la PHB no actuó como receptor de entrada de células virales para VHC. Más bien, la PHB contribuyó a la entrada de células VHC a través de la unión a RAF celular (c-Raf; proto-oncogene serina/treonina-proteína cinasa) y posterior activación del sarcoma de rata Harvey proto-oncogene (HRas) que induce una vía de transducción de señal requerida para la entrada de células VHC mediadas por el factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [37] Además, el kd mediado por siRNA de PHB disminuyó la producción de FLUAV H5N1 [38]. Estos hallazgos indican que el PHB está involucrado en diferentes etapas del ciclo de vida de una variedad de virus, y por lo tanto un blanco atractivo para el desarrollo de fármacos antivirales de amplio espectro. Rocaglate es un grupo de compuestos naturales, que incluye rocaglamida, que inhibe la síntesis de proteínas al apuntar al factor 4A de iniciación eucariota 4A (eIF4A) de la caja DEAD-ATP y ejerce actividad antitumoral [62, 63]. El compuesto de rocaglate, silvestrol, inhibe la multiplicación del virus del Ébola probablemente interfiriendo con el papel de eIF4A en la traducción de proteínas virales [64]. Mientras nos centramos en dos proteínas huésped, ATP1A1 y PHB, en este estudio, nuestro enfoque proteómico también identificó varias proteínas de células huésped interactuantes de NP cuya expresión kd a través de siRNA resultó en una multiplicación aumentada de LCMV. Estas proteínas, que incluyen MAP1B, podrían tener actividad anti-LCMV. MAP1B ha demostrado unirse a proteínas no estructurales 1 (NS1) y 2 (NS2) del virus sincitial respiratorio humano (HRSV) [34]. NS1 y NS2 de HRSV antagoniza la respuesta del huésped IFN-I al reducir los niveles de receptor de TNF asociados a factor (TRAF3), IKKel (NS1) y STAT2 (NS2) [65]. La interacción NS2-MAP1B interfirió con la capacidad de NS2 de HRSV para reducir los niveles de STAT2, mientras que el papel de la interacción NS1-MAP1B está por determinar [34]. Examinando el papel de la interacción NP-MAP1B en la modulación de la capacidad de NP para inhibir la inducción de tipo I IFN es de interés. Se identificó entre las proteínas de las células huésped interactuantes NP el virus de la leucemia de Moloney ARN 10 (MOV10), que ha sido reportado como un factor antiviral para FLUAV [66], retrovirus [67] [68] [69] [70] [71], y DENV-2 [72]. No observamos un aumento de la multiplicación de LCMV en células sometidas a kd mediadas por siRNA de MOV10, un hallazgo Sin embargo, consideramos que LCMV ya tiene una multiplicación óptima en células A549 y otros aumentos pueden ocurrir sólo en condiciones más bien únicas. MOV10 fue demostrado para mejorar la inducción IRF-3 mediada por IFN-I después de la infección por SeV a través de una unión de tanque quinasa 1 (TBK1)-independiente e IKK El CCT mamífero es crítico para el plegado de muchas proteínas con funciones importantes en diversos procesos celulares [74], y puede proteger las topologías de proteínas complejas dentro de su cavidad central durante la biosíntesis y el plegado [75]. La contribución de los miembros del CCT al ensamblaje del NP en una estructura nucleocápsida podría explicar su presencia en el NP, pero no en el eGFP, interactoma. Curiosamente, los miembros del CCT han sido implicados en la multiplicación de diferentes virus incluyendo virus de la rabia [76, 77], VHC [78] y FLUAV [79]. Sin embargo, el papel de estas proteínas del CCT en la multiplicación del virus sigue siendo desconocido y puede implicar funciones distintas de actuar como chaperonas moleculares. Estudios anteriores documentaron la presencia de varios componentes de la eIF4F, incluyendo 4A, dentro de los complejos de replicación viral-transcripción (RTC) detectados en células infectadas con LCMV [80] y TCRV [81]. Estos hallazgos, junto con la detección de una serie de proteínas ribosómicas en el interactoroma NP, sugieren que la traducción de mRNA virales puede tener lugar dentro de RTC. Sin embargo, la interferencia de rocaglamida con la actividad de eIF4A dentro de la RTC viral podría contribuir a su actividad anti-LCMV. En este trabajo, documentamos la generación de rLCMV/Strep-NP y su uso para definir el NP-interactoma en células infectadas. Presentamos evidencia de que ATP1A1 y PHB contribuyen a la multiplicación eficiente de mammarenavirus utilizando genética De acuerdo con nuestros hallazgos, el análisis bioinformático reveló que la red proteica asociada con ATP1A1 y PHB involucra a proteínas de células huésped con funciones en procesos biológicos que han sido implicados en la multiplicación del virus (S5 Fig). El enfoque experimental general descrito aquí puede facilitar la identificación de proteínas de células huésped interactuantes de NP biológicamente relevantes. Estudios futuros que elucidan los roles de los factores pro y antivirales de células huésped identificados en este estudio en la multiplicación del mammarenavirus avanzarán en nuestra comprensión de las múltiples funciones de NP y descubrir nuevos objetivos celulares para el desarrollo de fármacos antimammarenavirales. Además, al identificar factores provirales de células huésped, los fármacos que ya están aprobados pueden ser repurposing como terapéuticos para combatir infecciones por mammarenavirus patógenos humanos. El riñón de hámster BHK-21 (American Type Culture Collection, ATCC, CCL-10), el ratón de casa L929 (ATCC CCL-1), el grivet Vero E6 (ATCC CRL-1586), el A549 humano (ATCC CCL-185) y las células humanas HEK 293T (ATCC CRL-3216) se cultivaron en el medio de águila modificado de Dulbecco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) que contenía un 10% de suero fetal de bovino inactivado térmicamente, 2 mM de L-glutamina, 100 mg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina a 37°C y 5% de CO2. Los LCMV recombinantes WT, Armstrong (rLCMV ARM) y clon-13 (rLCMV Cl Se describió la generación de rLCMV/NP(D382A) y SeV, cepa Cantell, [30, 82, 83 ]. Un rLCMV sin GPC y expresando eGFP (rLCMVΔGPC/eGFP) fue generado por genética inversa utilizando procedimientos previamente descritos [84]. rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep fueron generados por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMV WT y LCMV trisegmentados (r3LCMV) expresando eGFP [30]. Para la generación de estos nuevos rLCMVs, creamos pol1S Cl-13 plásmidos que dirigían síntesis intracelular mediada por Pol1 de especies de ARN del genoma S de LCMV recombinante codificando para NP o e El rLCMV que expresa eGFP (rLCMV/eGFP) se generó como se describe [85], y el rLCMV que expresa ZsGreen (rLCMV/ZsG) en lugar de eGFP fue generado por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMV/eGFP. Generación de rLASV que expresa eGFP (rLASV/eGFP) se describirá en otra parte. Para la generación de un nuevo rLCMV de ciclo único que expresa ZsGreen (scrLCMV/ZsG-P2A-NP), un plásmido pol1S fue creado por omitiendo el marco de lectura abierto de GPC (ORF) a partir del plásmido pol1S utilizado para la generación de rLCMV/ZsG. scrLCMV/ZsG-P2A-NP fue rescatado por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMVΔGPC/eGFP [84]. Los títulos de LCMV se determinaron por inmunoenfoque formando ensayo (IFFA) como se describe [87]. Brevemente, se utilizaron diluciones en serie de 10 veces para infectar monocapas de células Vero E6 en una placa de 96 pocillos, y a Después de la permeabilización celular mediante tratamiento con tampón de dilución (DB) (0,3% Triton X-100 en PBS-conteniendo 3% de albúmina sérica bovina [BSA]), las células fueron manchadas con una rata mAb a NP (VL-4, Bio X Cell, West Lebanon, NH) conjugada con Alexa Fluor 488 (VL-4-AF488, Protein Labeling Kit, Life Technologies, Carlsbad, CA). Los títulos de VSV fueron determinados por un ensayo de placa. Los lisatos celulares totales se prepararon en el tampón de lisis PD (+) (250 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl [pH = 7,5], 0,5% TritonX-100, 10% glicerol, 1 mM de MgCl 2, 1 μM de CaCl 2, 1 μM de ZnCl 2 ) y se aclararon mediante centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. Los lisatos clarificados se mezclaron a una proporción de 1:1 con tampón de carga (100 mM de Tris [pH 6.8], 20% 2-mercaptoetanol, 4% SDS, 0,2% azul bromofenol, 20% glicerol) y hervidos durante 5 min. Las muestras de proteínas fueron fraccionadas por SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida de gradiente 4-20% (geles Mini-PROTEAN TGX 4-20%, Bio-Rad, Hércules, CA), y las proteínas fueron transferidas por electroblotting a membranas de difluoruro de polivinilideno (Membranas de Transferencia de Immobilina, Millipore, Billerica, MA). Para detectar proteínas etiquetadas con Strep, se reaccionaron membranas con anticuerpos monoclonales de ratón a Strep (QIAGEN, Germantown, MD), eGFP (Takara Bio USA, Mountain View, CA), GP 2 (We33/ 36), ATP1A1 (TehrmoFisher Scientific, Rockford, IL), PHB (Abcam, Cambridge, MA) o anticuerpos policlonales de conejo a α-tubulina (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) o gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, Millipore), respectivamente, seguidos de incubación con anticuerpos antimouse anti-peroxidasa apropiada y anti-rabbit inmunoglobulina G (IgG) (Jackson ImmunoInvestigation Laboratories, West Grove, SuperSignal West Pico o Femto sustrato quimioluminiscente (Thermo Fisher Scientific) se utilizó para obtener señales quimioluminiscentes que fueron visualizadas usando ImageQuant LAS 4000 Imager (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA). Retirada de proteínas estreptoscópicas del lisato celular infectado. A549 células preparadas en seis platos de 15 cm (aproximadamente 1,0 x 10 8 células en total) fueron infectadas con rLCMV/Step-NP o r3LCMV/eGFP en un MOI de 0,1. A las 48 h pi, las células fueron lavadas tres veces con PBS frío-hielo, raspadas en PBS frío-hielo fresco, y centrifugadas a 400 x g a 4°C durante 10 min. Se extrajo el sobrenadante y se lisaron células con 12 ml de tampón de lisis PD (+) complementado con un cóctel inhibidor de la proteasa y la fosfatasa de parada (Thermo Fisher Scientific) y 5 μg/ml de desoxiribonucleasa I (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ). El lisato se aclaró mediante centrifugación a 3,900 x g a 4oC durante 30 minutos para eliminar residuos celulares. El lisato celular clarificado fue incubado con resina de sefarosa estrep-tactina (QIAGEN) a 4oC. Después de 2 horas de incubación, la resina fue lavada tres veces con tampón de lisis PD (+) y una vez con tampón de lisis PD sin TritonX-100 ( tampón de Después de la centrifugación a 1.600 x g y 4oC durante 5 minutos, se eliminó el último tampón de lavado, y los complejos proteicos asociados con la resina se eludieron en 2 ml de tampón de lisis PD (-) que contenía 2,5 mM de destiobiotina. El eluato fue sometido a precipitación TCA seguido por digestión de tripsina. Microcolumna de tecnología de identificación de proteínas multidimensional. Se preparó una microcolumna MudPIT creando primero un frito Kasil en un extremo de un tubo capilar de diámetro exterior (OD) no desactivado (diámetro interior de 360 μm) (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). El frito Kasil se preparó sumergiendo brevemente un tubo capilar de 20-30 cm en 300 μl de Kasil 1624 solución bien mezclada de silicato potásico (PQ Corporation, Malvern, PA) y 100 μl de formamida, curándose a 100 °C durante 4 h, y cortando el frito a una longitud de %2 mm. Partículas fuertes de intercambio catiónico (SCX Luna, 5-μm diámetro, 125 Å poros, Phenomenex, Torrance, CA) se embalaron en la casa de las lonchas de partículas en metanol a 2,5 cm. Partículas de fase reversa (2 cm, C18 Aqua, 3-μm diámetro, 125 Å poros, Phenomenex) se embalaron sucesivamente en el tubo capilar utilizando el mismo método que la carga SCX. Análisis Mud Se generó una columna analítica de cromatografía líquida de fase inversa tirando de una punta de 100-μm (Diámetro Interior (ID) de 360 μm) de tubo capilar de OD (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) a 5-μm de ID. Las partículas de fase inversa (Luna C18, diámetro 3-μm, 125 Å poros, Phenomenex) se envasaron directamente en la columna arrastrada a 5,5 mPa hasta 15 cm de largo. La columna fue más embalada, lavada y descompuesta a 10 mPa con tampón B (80% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico) seguido de tampón A (5% acetonitrilo y 0,1% ácido fórmico). Las columnas de mudPIT y analíticas se montaron utilizando una unión de volumen cero muerto (Upchurch Scientific El análisis LC-MS/MS se realizó con una bomba LC de alta presión Agilent (Agilent) y una trampa de doble célula de iones cuadrúpolos lineal Orbitrap Velos (Thermo) utilizando una etapa de electrospray construida en la casa. El electrospray se realizó directamente desde la columna analítica mediante la aplicación del voltaje de ionización electrospray (ESI) a un tee (150 μm ID, Upchurch Scientific) directamente aguas abajo de un flujo dividido de 1:1.000 para reducir el caudal a 300 nl/min a través de las columnas. Se realizaron experimentos con mudPIT (10 pasos) en los que cada paso corresponde a 0, 10, 20, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100% tampón C (500 mM de acetato de amonio, 0,1% de ácido fórmico y 5% de acetonitrilo) y se ejecutó durante 3 minutos al comienzo de un gradiente de 110 minutos. Análisis de datos. Identificación de proteínas y péptidos se realizaron con Pipeline-IP2 (Aplicaciones proteómicas integradas, San Diego, CA. http://www. integratedproteomics.com/) utilizando algoritmos ProLUCID y DTASelect2. Parámetros de selección DTASelect fueron -p 2 -y 1-tripstat-pfp.01 -extra-pI-DB-dm-in. Los archivos en bruto de espectro se extrajeron en archivos ms2 de archivos en bruto utilizando el código abierto RawExtract 1.9.9 (Scripps Research Institute, La Jolla, CA; http://fields.scripps.edu/downloads.php), y los espectros de masa en tándem se buscaron en una base de datos de proteínas humanas (UniprotKB). Para estimar con precisión las probabilidades de péptidos y las tasas de falsos descubrimientos, se utilizó una base de datos de señuelos que contenía las secuencias inversas de todas las proteínas anexas a la base de datos de destino. Los espectros de masa en tándem se emparejaron con secuencias utilizando el algoritmo ProLUCID con tolerancia a las masas de péptidos de 600 ppm. Se consideró que la carbamidometilación (+57,02146 Da) de cisteína era una modificación estática. El cribado de siRNA A549 células (1.000 células/pozo) en una placa de 384-pozo se transfectó inversamente con 0,5 pmol de grupo de siRNA (S2 Table) dirigido a cada gen utilizando 0,1 μl de Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) (la concentración final de siRNA fue de 10 nM), seguido de incubación a 37°C y 5% de CO 2. A las 72 h de post-transfección, las células fueron infectadas (MOI = 0,05) con proteínas de rLCMV/ZsG. SiRNA objetivo de células huésped fueron seleccionadas en base a la disponibilidad de secuencias de siRNA validadas. Los siRNAs que usamos para examinar los efectos en la multiplicación de LCMV de la expresión noqueada de los golpes candidatos a proteína de la célula huésped interactuante NP correspondían al Genoma-ancho ON TAR-GET-Plus (OTP) Biblioteca de siRNA humana (18.301 genes, 4 siRNAs/gén; Dharmacon, Lafayette, CO). Las células A549 (3,0 x 10 4 células/bien) fueron transfectadas inversamente en una placa de 24 pozos con 6 pmol de piscinas de siRNA dirigidas a cada gen usando 1 μl de Lipofectamine RNAimax (concentración final de siRNA es 10 nM). A las 72 h post-transfección, el lisato celular total fue preparado en lisis modificada tampón A (25 mM Tris-HCl [pH = 8,0], 50 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1,25% desoxicolato sódico) y aclarado por centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. La concentración total de proteína de lisato celular clarificado fue medida por Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). La misma cantidad de proteína de cada muestra fue sometida a SDS-PAGE, y la expresión proteica de genes dirigidos a siRNA fue analizada por manchas occidentales. Después de la permeabilización celular mediante tratamiento con DB, las células fueron teñidas con 4',6-diamidin-2-fenilindol (DAPI). Las señales de fluorescencia verde (eGFP o ZsGreen) y DAPI fueron medidas por un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, Bio-Tek, Winooski, VT). Las células infectadas con mock y virus fueron fijas con 4 % de PFA. Después de la permeabilización celular y bloqueo mediante tratamiento con DB que contenía 1 % de suero normal de cabra, las células fueron incubadas con anticuerpos ATP1A1 o PHB de ratón primario seguidos por anticuerpos IgG antimouse secundario conjugados con Alexa Fluore 568 (antimouse IgG-AF56 En algunas muestras, se omitió el anticuerpo primario contra ATP1A1 o PHB para determinar la fluorescencia de fondo. Para visualizar los núcleos, se utilizó DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL) para montar los protectores en un vidrio deslizante. Se observaron células manchadas bajo un microscopio confocal (LSM 710, Zeiss) y datos analizados por el software ZEN (Zeiss). El análisis de co-localización se realizó sobre una base pixel por pixel utilizando el software Zen (Zeiss). Se marcaron ocho células verdes (NP-positivas) y se trazó cada píxel en el área marcada en el diagrama de dispersión basado en su nivel de intensidad de cada canal. Los umbrales de los canales verde y rojo se determinaron utilizando células infecciosas simuladas manchadas con anticuerpos VL-4-AF488 (anti-NP) y anti-ratón IgG conjugados con Alexa Fluor 568 sin utilizar anticuerpos anti-ATP1A1 o -PHB. A cada píxel se le asignó un valor de 1. Coeficientes de colocalización (CC) (o CC no ponderado) se determinaron dividiendo la suma de píxeles positivos tanto verdes como rojos por la suma de píxeles positivos verdes. Este cálculo se repitió para ocho células individuales. Para evaluar la especificidad de la colocalización, determinamos CC ponderado tomando en consideración el brillo de cada señal de canal. La comparación de los píxeles no ponderados y ponderados nos permitió determinar si había píxeles más brillantes en las regiones colocalizadas en comparación con las regiones no colocalizadas. Los valores de p se determinaron mediante un test de t emparejado de dos colas utilizando el software GraphPad Prism. Células A549 o Vero E6 sembradas (2,0 x 10 4 células/pozo) en una placa de 96 pocillos y cultivadas durante la noche se trataron con diluciones en serie de 3 veces a 37oC y 5 % CO 2 durante 2 h, seguidas de infección con rLCMV/eGFP (MOI = 0,01). Los compuestos estuvieron presentes en el punto final del estudio. A 48 h pi, las células se fijaron con un 4% de PFA en PBS, y la expresión eGFP fue examinada por un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Los valores medios obtenidos con células infectadas por DMSO y rL Las células A549 o Vero E6 sembradas en una placa de 96 pocillos (2,0 x 10,4 células/pozo) y cultivadas durante la noche fueron tratadas con diluciones en serie de 3 veces y cultivadas a 37oC y un 5% de CO 2 durante 48 h. Luego, se añadió el reactivo de solución CellTiter 96 AQ (Promega, Madison, WI). Posteriormente, el ensayo se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, y la absorbancia (490 nm) se obtuvo mediante un lector de ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) (SPECTRA max + 384; Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA). Los valores medios obtenidos con células tratadas con DMSO se fijaron al 100%. Las concentraciones de CC 50 se determinaron utilizando GraphPad Prism. Se generó un plásmido que expresaba la proteína Z estreptocada (pC-LCMV-Z-Strep) mediante un procedimiento similar para generar un plásmido que expresaba la proteína Z LASV (pC-LCMV-Z-FLAG) con la etiqueta C-terminal FLAG (pC-LASV-Z-FLAG), y el ensayo en ciernes se realizó como se describió anteriormente [88]. Las células (HEK 293T) en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 0,5 μg de vector pCAGGS vacío o pC-LCMV-Z-Strep o pC-LASV-Z-FLAG utilizando Lipofectamine 2000. A las 5 h de post-transfección, los medios fueron reemplazados por medios frescos e incubados a 37°C y 5% de CO 2 durante 19 Después de la eliminación del último medio de lavado, las células fueron cultivadas en medio fresco que contenía ouabaína (30 ó 40 nM) o rocaglamida (50 ó 100 nM) o concentración equivalente de DMSO, y 24 h más tarde, se recolectaron TCS y células que contenían partículas similares al virión (VLP). El lisato total de células fue preparado lisando las células con tampón de lisis (1% NP-40, 50 mM de Tris-HCl [pH 8,0], 62,5 mM NaCl, desoxicolato sódico al 0,4%). Después de aclarar el TCS de los desechos celulares mediante centrifugación a 400 x g y 4 °C durante 10 min, los VLP fueron recolectados por ultracentrifugación a 100.000 x g y 4 °C durante 30 min a través de un cojín de sacarosa Los VLP fueron resuspendidos en PBS, y la expresión Z en el lisato total de células y TCS (conteniendo VLPs) fueron analizados por manchas occidentales. Las células A549 infectadas con rLCMV/eGFP fueron recolectadas utilizando solución de desprendimiento de células de Accutasa (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA) y fijas con 4% PFA en PBS. La expresión eGFP fue examinada por citometría de flujo utilizando una BD LSR II (Becton Dickson), y los datos fueron analizados con FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Las células 293T sembradas (4,0 x 10 5 células/well) en una placa de 12 pozos y cultivadas durante la noche fueron infectadas con SCLCMV/ZsG-P2A-NP durante A las 24 h pi, las células fueron tres veces lavadas con medios frescos para eliminar la partícula vírica infecciosa producida en ausencia de tratamiento compuesto, y cultivadas durante otras 24 h en medios frescos en presencia de 40 nM de ouabaína o control del vehículo (DMSO). A las 48 h pi, se recogió TCS y se utilizó para infectar monocapas frescas de células BHK-21 sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pocillos 1 día antes de la infección, y se preparó el lisato de células 293T. 24 h más tarde, se preparó el lisato de células BHK-21. El lisato total de células se preparó en tampón de lisis celular (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl [pH = 7,5], 0,5% [NP-40], 1 mM de EDTA] y se aclaró mediante centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. ZsLa intensidad de la señal verde en el lisato de células clarificadas se midió mediante un lector de placas fluorescentes (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). A549 células sembradas (2 x 10 5 células/well) en una placa de 96 pozos y cultivadas durante la noche fueron tratadas con combinaciones de diferentes concentraciones de ouabaína y rocaglamida durante 2 h y luego infectadas (MOI = 0,01) con rLCMV/eGFP. A las 48 h pi, las células se fijaron, permeabilizaron mediante tratamiento con DB y se teñiron con DAPI. Las señales de eGFP y DAPI se midieron mediante un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Las lecturas de eGFP se normalizaron mediante lecturas de DAPI, y se utilizaron datos normalizados para analizar el efecto sinérgico de los dos compuestos por el programa MacSynergy II [89]. Los datos fueron analizados para valores de p mediante una prueba t sin emparejar de dos colas utilizando el software GraphPad Prism.

¿Durante cuánto tiempo las células fueron infectadas antes del análisis?

El análisis interactómico del virus de la coriomeningitis linfocítica nucleoproteína en las células infectadas revela que ATPasa Na(+)/K(+) transporta la subunidad Alfa 1 y prohíbe como factores de células huésped involucrados en el ciclo de vida de los mammarenavirushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5834214/SHA: efbd0dfc426da5dd25ce294111d6fa37571623773Autores: Iwasaki, Masaharu; Minder, Petra; Caì, Yíngyún; Kuhn, Jens H.; Yates, John R.; Torbett, Bruce E.; de la Torre, Juan C.Fecha: 2018-02-20DOI: 10.1371/journal. Además, la creciente evidencia indica que el mammarenavirus prototípico distribuido en todo el mundo, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), es un patógeno humano descuidado de importancia clínica. Las preocupaciones sobre los mammarenavirus patógenos humanos se exacerban por la falta de vacunas autorizadas, y la terapia actual antimammarenavirus se limita al uso fuera de la etiqueta de ribavirina que es sólo parcialmente eficaz. La comprensión detallada de las interacciones virus/células huésped puede facilitar el desarrollo de nuevas estrategias antimammarenavirus, apuntando a los componentes de la maquinaria de células huésped que son necesarios para la multiplicación eficiente de virus. Aquí documentamos la generación de un LCMV recombinante codificando una nucleoproteína (NP) que contiene una etiqueta de afinidad (rLCMV/Step-NP) y su uso para capturar el interactoma NP en células infectadas. Nuestro enfoque proteómico combinado con la genética y los ensayos de validación farmacológica identificaron a ATPasa Na(+)/K(+) transportando subunidad alfa 1 (ATP1A1) y prohibin (PHB) como factores provirales. Ensayos basados en células revelaron que ATP1A1 y PHB están involucrados en diferentes pasos del ciclo de vida del virus. En consecuencia, observamos un efecto inhibidor sinérgico en la multiplicación de LCMV con una combinación de inhibidores ATP1A1 y PHB. Demostramos que los inhibidores ATP1A1 suprimen la multiplicación del virus Lassa y Candid#1, una cepa vacunal atenuada viva del virus Junín, sugiriendo que el requisito de ATP1A1 en la multiplicación del virus se conserva entre los mammarenavirus genéticamente relacionados distantemente. Nuestros hallazgos sugieren que los inhibidores clínicamente aprobados de ATP1A1, como digoxina, podrían ser reutilizados para tratar infecciones por mammarenavirus patógenos para los seres humanos. Texto: Introducción Los Mammarenavirus (Arenaviridae: Mammarenavirus) causan infecciones crónicas de roedores en todo el mundo [1]. La invasión de viviendas humanas por roedores infectados puede resultar en infecciones humanas a través de la exposición mucosal a aerosoles o por contacto directo de la piel abrazada con material infeccioso. Varios mammarenavirus causan fiebres hemorrágicas virales (VHF) en los seres humanos y plantean importantes problemas de salud pública en sus áreas endémicas [2] [3] [4] [5] [6]. Los Mammarenavirus se clasifican en dos grupos principales, Viejo Mundo (OW) y Nuevo Mundo (NW) [1]. El virus OW Lassa (LASV), agente causal de la fiebre de Lassa (LF), es el patógeno OW mammarenaviral más significativo. Se estima que el virus LASV infecta a varios cientos de miles de individuos anualmente en África Occidental, resultando en un alto número de casos de LF asociados con alta morbilidad y letalidad. Además, las regiones endémicas de LASV se están expandiendo [7], y la asociación del virus recientemente identificado de la mammarenavirus Lujo con un brote de VHF en África Meridional [8, 9] ha suscitado preocupación por la aparición de nuevos virus de la VHF que causan la mammarenavirus. El virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) distribuido por todo el mundo es un patógeno humano descuidado de importancia clínica, especialmente en infecciones congénitas [11] [12] [13] [14] [15]. Además, la LCMV representa una amenaza especial para los individuos inmunocomprometidos, como se ha demostrado en casos mortales de infección por LCMV asociada a trasplantes de órganos [16, 17]. Sin embargo, la investigación de LCMV puede realizarse de forma segura en la contención BSL-2, en lugar de la contención BSL-4 necesaria para la investigación en vivo de LASV o JUNV [18]. No existen vacunas con licencia de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los Estados Unidos para el tratamiento de infecciones por arenavirus, aunque una cepa de vacuna viva atenuada de JUNV, Candid#1, está autorizada en Del mismo modo, la terapia actual contra el antimammarenavirus se limita a un uso offlabel de la ribavirina analógica nucleósida que es sólo parcialmente eficaz y puede causar efectos secundarios significativos [19] [20] [21]. El desarrollo de fármacos antimammarenavirus eficaces se ha visto obstaculizado por la falta de comprensión detallada de las interacciones virus/células huésped necesarias para la multiplicación del virus de la mammarena que podrían representar objetivos sensibles para la terapia antiviral. el problema potencial que la sobreexpresión de un único gen viral puede potenciar interacciones PPI que no son relevantes durante el curso de una infección por virus natural. Para superar este problema, diseñamos un LCMV recombinante (rLCMV) codificando un tándem [WSHPQFEK (GGSGS) 3 WSHPQFEK] Strep-tag fusionado a los amino-terminales de Para facilitar la identificación de PPI específico entre NP y proteínas de células huésped, utilizamos nuestra plataforma trisegmentada (r3) del mammarenavirus [30] para diseñar un r3LCMV expresando una versión C-terminal Strep-tag de proteína fluorescente verde mejorada (r3LCMV/eGFP-Strep) que usamos como control negativo (Fig 1A y 1B). Rescatamos rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep y confirmamos la expresión de NP y eGFP estreñidos en células infectadas por rLCMV/strep-NP y r3LCMV/eGFP, respectivamente (Fig 1C). A continuación, examinamos las propiedades de crecimiento de las células rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep en tres líneas celulares diferentes de hámsteres, humanos y primates no humanos (Células BHK-21, A549 y Vero E6, respectivamente) (Fig 1D). La aptitud de las cepas rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep disminuyó modestamente en comparación con la observada con cepas de tipo salvaje (WT) Armstrong (rLCMV ARM) y Clone 13 (rLCMV Cl-13) de LCMV. Sin embargo, tanto rLCMV/Strep-NP como r3LCMV/eGFP-Strep tenían cinética Al igual que con WT LCMV, la infección con rLCMV/Strep-NP impidió la producción de IFN-I bioactivo por las células en respuesta a la infección por el virus Sendai (SeV) determinada utilizando un bioensayo IFN basado en la protección contra el efecto citopático (ECP) inducido por la infección por el virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Fig 1E). Las células Vero tratadas durante 16 h con sobrenadantes cultivados en el tejido (TCS) de células A549 infectadas primero con WT LCMV o rLCMV/Strep, seguidas de una infección de 24 h con SeV, siguieron siendo totalmente susceptibles a la EPC inducida por VSV. Por el contrario, las células Vero tratadas con SCT de células A549 infectadas con rLCMV/NP(D382A), mutante incapaz de prevenir la inducción de IFN-I [30], y posteriormente con SeV, fueron protegidas contra la EPC inducida por VSV. Seleccionamos la línea celular humana A549 porque las células epiteliales pulmonares son uno de los objetivos iniciales de las células humanas tras la inhalación de mammarenavirions. Infectamos las células A549 (multiplicidad de infección [MOI] = 0,1) con rLCMV/Strep-NP o r3LCMV/eGFP-Strep (Fig 2A). A las 48 h post-inoculación (pi), preparamos lysatos celulares totales para ensayos de tracción (PD) utilizando una resina de sepharose Los alícuotas de los complejos proteicos presentes en las muestras de PD fueron fraccionados por electroforesis de gel dodecil-poliacrilamida (SDS-PAGE) (Fig 2B) seguida de tinción de gel proteínico rubí SYPRO. Comparamos el patrón de bandas proteicas manchadas detectadas entre rLCMV/Strep-NP- y r3LCMV/eGFP-Strepinfectadas y confirmamos la presencia de Strep-NP y eGFP-Strep en muestras pertinentes (Fig 2B). Los complejos proteicos en el resto de los eluatos de las muestras de PD fueron concentrados por precipitación de ácido tricloroacético (TCA) y sometidos a digestión de tripsina (Fig 2A). Los péptidos digeridos fueron sometidos a un análisis de espectrometría de masa de cromatografía líquida-tandem (LC-MS/MS) utilizando un espectrómetro de masa híbrido consistente en iones cuádrupoles lineales de doble célula (LTQ) Velos y un analizador de Orbitrap. Clasificamos proteínas de células huésped identificadas por el análisis de células huésped-LC-MS/MS de dos réplicas biológicas independientes en dos grupos: 1) proteínas encontradas únicamente en muestras de Strep-NP PD con al menos cinco recuentos espectrales (Tabla 1) y 2) proteínas encontradas en muestras de Strep-NP y eGFP-Strep PD con cinco o más recuentos espectrales en muestras de Strep-NP y al menos dos veces mayores en recuentos espectrales en muestras de Strep-NP PD en comparación con muestras de eG Entre las 53 proteínas presentes en las muestras de NP- y eGFP-PD, 36 tenían recuentos espectrales en la muestra de NP-PD que fueron menos de dos veces mayores que sus correspondientes recuentos espectrales en la muestra de eGFP-PD (Fig 2C y S1). Con base en los criterios descritos anteriormente, consideramos que estas proteínas son altamente improbables interactores específicos con una implicación en el ciclo de vida del LCMV, y por lo tanto no consideramos estos resultados para un análisis posterior. Sin embargo, reconocemos que no podemos descartar formalmente que algunos de estos impactos aún pudieran jugar un papel en el ciclo de vida del LCMV. La anotación proteica mediante la clasificación de la familia de proteínas (PANTHER) por relación evolutiva (Proceso Biológico) de los candidatos a la proteína interactuante del NP reveló que un gran número de proteínas estaban involucradas en También analizamos las funciones moleculares de los candidatos a proteínas NP-interactuantes según la clasificación del perfil proteico PAN-THER (Fig 2E), que reveló funciones bioquímicas diversificadas enriquecidas para proteínas de unión ácida nucleica y chaperonas. Para evaluar inicialmente los roles pro o antivirales de las proteínas de células huésped NP-interactuantes identificadas por LC-MS/MS, examinamos el efecto del pequeño ARN interferente (siRNA) mediado por kd (kd) de cada uno de los genes correspondientes sobre la multiplicación de rLCMV que expresa el gen reportero ZsGreen (ZsG) en células A549 (Fig 3A). Los siRNAs que utilizamos eran de la biblioteca de siRNA humana ON TARGET-Plus (OTP) (18,301 genes, 4 Los efectos fuera de blanco son impulsados principalmente por la actividad de semilla de microARN (miR) de cadena antisensible. En los OTPs, el hilo de sentido se modifica para favorecer la captación de cadena antisensible mientras que la región de semilla de cadena antisensible se modifica para reducir drásticamente la desecación de semilla [33]. Además, los OTPs están diseñados sobre la base del algoritmo SMARTselect (Dharmacon), ampliamente considerado como el mejor algoritmo para la estrategia de diseño racional de siRNA. Numerosos factores de células huésped mostraron un efecto anti-LCMV (aumento de la expresión ZsG por kd de los genes), incluyendo la proteína 1B asociada al microtúbulo (MAP1B) [ [38], el virus del dengue 2 (DEV-2) [39], y el virus chikungunya (CHIKV) [40 Para comenzar a evaluar las posibles implicaciones biológicas de las interacciones de proteína de NP-anfitriona identificadas, se seleccionó ATP1A1 y PHB dada la disponibilidad de reactivos, el conocimiento existente sobre sus roles en la fisiología celular y la evidencia de participación en la multiplicación de otros virus. Se confirmó que las células transfectadas con siRNA específicos de ATP1A1 y PHB exhibieron los niveles reducidos predichos en la expresión de proteína de ATP1A1 y PHB (Fig 3B). Asimismo, se examinó si los niveles de expresión reducida mediada por siRNA de ZsGreen correlacionados con los títulos de progenie de LCMV reducidos. Para ello, se infectaron las células A549 con expresión dirigida a siRNA de proteínas estreñidas. A549 células sembradas (5,0 x 10, A las 48 h, se prepararon lisatos celulares totales y se analizó la expresión proteica mediante el borrado occidental. (D) Propiedades de crecimiento de las rLCMV que expresaban proteínas etiquetadas con Strep. BHK-21 (1,75 x 10 5 células/pozo), A549 (1,25 x 10 5 células/pozo), o Vero E6 (1,25 x 10 5 células/pozo) sembradas en placas de 24 pozos y cultivadas durante la noche (MOI = 0,01) con los rLCMV indicados. En los momentos indicados, se recogieron los TCS y se determinaron los títulos del virus por IFFA. Los resultados representan un promedio ± DE de los resultados de tres experimentos independientes. (E) Falta de inducción de IFN-I en células infectadas con rLCMV/Strep-NP. Las células A549 fueron infectadas (MOI = 0,1) con el rLCMV indicado o el simulacro de infección, y 36 h más tarde infectadas con SeV (MOI = 1). A las 24 h pi con SeV, se recogieron y utilizaron TCS, tras la inactivación del virus por U.V., para tratar células Vero E6 durante 16 h, seguidas de infección con rVSV (MOI = 0,1) [rVSV(+)] o simulanfección [rVSV (-) ]. A las 24 h pi con rVSV, las células fueron fijas con 4% de PFA y manchadas con violeta cristalina para evaluar el efecto citopático inducido por rVSV. Utilizamos como control rLCMV/NP(D382A) que contiene mutación D382A dentro de NP, lo que se ha demostrado https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006892.g001 ATP1A1 o con NC siRNA 72 h antes de la infección con rLCMV/ZsG. Encontramos que siRNAmediated kd de ATP1A1 inhibió dramáticamente la expresión ZsGreen (Fig 3Ci), que se asoció con una reducción significativa de la progenie de LCMV infecciosa (Fig 3Cii). Nuestros intentos de ver la interacción entre NP y ATP1A1 o NP y PHB por coinmunoprecipitación no tuvieron éxito. Varias posibilidades podrían explicar esto, incluyendo interacciones de baja afinidad o alta tasa de encendido/apagado o ambas. Otra consideración es que sólo una fracción menor de NP podría estar involucrada en la interacción con una proteína de célula huésped dada, y por lo tanto, la detección de estas interacciones requeriría métodos altamente sensibles como LC-MS/MS. Para superar este problema utilizamos microscopía confocal para examinar la colocalización de NP con ATP1A1 y PHB en células infectadas con LCMV. Coeficientes de colocalización ponderados (CC), determinados tomando en consideración el brillo de cada señal de canal, fueron significativamente más altos que los CC no ponderados, lo que indica la presencia de píxeles más brillantes en las regiones colocalizadas en comparación con las regiones no colocalizadas (Fig 4). El glucósido cardíaco ouabaína es un inhibidor de ATP1A1 que se ha utilizado para tratar la insuficiencia cardíaca congestiva en países europeos [41]. El inhibidor de la PHB rocaglamida es una flavaglina de un árbol de Aglaia utilizado en la medicina tradicional china [42] que tiene una potente actividad anticancerosa [43]. Para examinar si la inhibición farmacológica de ATP1A1 o PHB inhibió la multiplicación de LCMV, pretratamos a seres humanos (A549 y HEK 293T), primates no humanos (Vero E6) y roedores (células murina L929 y hámster BHK-21) con ouabaína o rocaglamida y las infectamos con rLCMV/eGFP (S1 Fig). El tratamiento con ouabaína dio lugar a una fuerte inhibición dependiente de la dosis de expresión eGFP en células de primates humanas y no humanas infectadas, pero no afectó a la intensidad de expresión de eGFP en células de roedores Este hallazgo es consistente con roedores que expresan un alelo ATP1A1 resistente a la inhibición de la ouabaína [44]. Asimismo, observamos una inhibición dosis-dependiente de la expresión de la rocaglamida de eGFP en todas las líneas celulares infectadas con rLCMV/eGFP (S1B fig). De acuerdo con estos hallazgos, la producción de progenie de LCMV infecciosa se redujo mediante tratamiento con ouabaína o rocaglamida (fig. 5A) dentro de un rango de concentración que tuvo un impacto mínimo en la viabilidad celular (fig. 5B). Para examinar la correlación entre eficacia y citotoxicidad de estos compuestos, se determinó su índice terapéutico (TI = CC 50 /IC 50 (Fig 5Bi) ; mientras que rocaglamida tenía TI > 105 (CC 50 > 1000 nM, IC 50 = 9,51 nM) y 10,3 (CC 50 = 100 nM, IC 50 = 9,75 nM) en células A549 y Vero E6, respectivamente (Fig 5Bii). Además, el inhibidor antagonista de la ATP1A1, la bufalina, también mostró una fuerte actividad anti-LCMV con TIs de 8,92 (CC 50 Proteína de choque térmico HSP 90-alfa HSP90AA1 P07900 8 10 9 Endoplasmina HSP90B1 P14625 9 9 9 Gran aminoácidos neutros transportador pequeña subunidad 1 SLC7A5 Q01650 6 12 9 Queratina, tipo II cuticular Hb1 KRT81 Q14533 10 8 9 Helicasa Putativa MOV-10 MOV10 Q9HCE1 8 10 9 Proteína asociada a microtúbulos 1B MAP1B P46821 6 11 8,5 Cadena beta de espectro, rocaglamida (100 nM) (Fig 5C), además de apoyar una actividad anti-LC Para obtener información sobre los mecanismos por los que la ouabaína y la rocaglamida ejercen su actividad anti-LCMV, examinamos los efectos de estos compuestos en diferentes etapas del ciclo de vida de la LCMV. Primero, preguntamos si la ouabaína y la rocaglamida afectaban la entrada celular de la LCMV. Realizamos experimentos de tiempo de adición en los que tratamos a las células con ouabaína o rocaglamida antes de la inoculación viral (-1,5 h), en el momento de la inoculación (0 h), o 1,5 h pi (+1,5 h) (Fig 6A). En algunas muestras, utilizamos cloruro de amonio a partir de 4 h pi para bloquear múltiples rondas de infección viral. El tiempo de adición de compuestos no cambió significativamente el número de células positivas de la eGFP, lo que indica que ni la ouabaína ni la ro El número de células eGFP + en células tratadas con ouabaína se redujo en todos los puntos de adición en comparación con las células tratadas con dimetilsulfóxido (DMSO) del vehículo, pero fue similar al observado en células tratadas con cloruro de amonio. Por lo tanto, la ouabaína no inhibió la replicación y la expresión génica del ARN LCMV, sino más bien un paso tardío del ciclo de vida del LCMV. En contraste, el tratamiento con rocaglamida resultó en un número insignificante de células eGFP +, lo que indica que la rocaglamida inhibió la replicación y transcripción génica del ARN viral. Para investigar más a fondo el efecto de la ouabaína y la rocaglamida sobre la síntesis de ARN viral, infectamos células A549 con una LCMV infecciosa recombinante de un solo ciclo que expresaba e Setenta y dos horas más tarde, determinamos el porcentaje de expresión eGFP normalizada en células infectadas (Fig 6B). De acuerdo con nuestros resultados del experimento de tiempo de adición, la ouabaína no afectó la expresión eGFP de reportero. Sin embargo, la rocaglamida redujo la expresión eGFP, confirmando el efecto inhibidor de la rocaglamida en la síntesis de ARN del virus. También examinamos el efecto de la ouabaína y la rocaglamida en el último paso del ciclo de vida del virus de arena, la germinación mediada por Z. Para este experimento, transfectamos células con Z-Estrep- y Z-FLAG (epítopo de DYKDDK) que expresan los plásmidos de LCMV y LASV, respectivamente. A las 24 h después de la transfección, eliminamos el cultivo de tejido supernadante ( Cultivamos las células transfectadas en presencia o ausencia de ouabaína o rocaglamida. A las 24 h, determinamos por niveles WB de proteína Z tanto en lisatos celulares enteros y asociados con partículas víricas (VLPs) recolectadas de TCS. El tratamiento con rocaglamida, pero no con ouabaína, causó una reducción en la eficiencia de brotes de Z LCMV y LASV (Fig 6C y 6D). La reproducibilidad de estos hallazgos se confirmó a partir de los resultados de cuatro experimentos independientes (Fig 6E). También examinamos si la ouabaína podría interferir con un paso de ensamblaje de progenie infecciosa que no fue capturado por el ensayo de brotes Z a través de dos experimentos adicionales. El primer experimento consistió en el uso de una recién generada LCMV infecciosa recombinante de ciclo único que expresaba el gen reportero ZsGreen (scrLCMV/ZsG-P2A-NP) para infectar (MOI = 0,1) células A549 (1 st infección). Estas células fueron posteriormente transfectadas con un plásmido que expresaba LCMV GPC. Después de 24 h, usamos TCS para infectar una monocapa de células frescas (2 nd infección) e identificamos células infectadas basadas en la expresión ZsGreen. Para evaluar el efecto de la ouabaína en el ensamblaje de novo de progenie infecciosa determinamos proporciones normalizadas (2 nd /1 st infección) de células ZsGreen + (Fig 6F). El segundo experimento involucró infección (MOI = 0,1) de células con WT LCMV, y 48 h más tarde lavamos células infectadas tres veces para eliminar la progenie infecciosa extracelular producida durante las primeras 48 h de infección. Luego, se añadieron medios frescos que contenían ouabaína o control de vehículos DMSO, y 24 h más tarde determinamos títulos de virus en TCS (Fig 6G). Los resultados de ambos experimentos mostraron consistentemente que la ouabaína no inhibió el ensamblaje de novo del virus infeccioso extracelular. La terapia combinada puede aliviar significativamente el problema planteado por la rápida aparición de variantes farmacorresistentes comúnmente observadas durante las estrategias de monoterapia para controlar las infecciones por el virus ARN. Puesto que la ouabaína y la rocaglamida inhibieron diferentes pasos del ciclo de vida de LCMV, examinamos si su Para este experimento, infectamos células A549 con rLCMV/eGFP y las tratamos con ouabaína y rocaglamida utilizando diferentes concentraciones y combinaciones. A las 48 h pi, determinamos el porcentaje de expresión eGFP (Fig 7). El tratamiento combinado con ouabaína y rocaglamida dio lugar a una actividad anti-LCMV sinérgica que se realzó en condiciones utilizando concentraciones más altas de ouabaína y concentraciones más bajas de rocaglamida. Luego preguntamos si los factores de células hospedantes ATP1A1 y PHB contribuyeron también a la multiplicación de la fiebre hemorrágica viral causante de LASV. Tratamos células A549 con ouabaína, bufalina o rocaglamida e inoculamos las células tratadas con eGFP (rLASV/eGFP). Al igual que la infección por rLCMV, la multiplicación por LASV se restringió en células tratadas con ouabaína, bufalina o rocaglamida a concentraciones que afectaban mínimamente a la viabilidad celular, aunque sus valores IC 50 fueron ligeramente superiores a los encontrados con el sistema de infección por LCMV (Fig 5B y S2 Fig) ya que la ouabaína tenía IC 50 de 9,34 nM, la bufalina tenía IC 50 de 1,66 nM y la rocaglamida tenía IC 50 de 37,0 nM (Fig 8). También probamos el efecto de compuestos dirigidos a ATP1A1 y PHB sobre la multiplicación de JUNV. De acuerdo con nuestros resultados obtenidos con LCMV y LASV, ouabaína, bufalina y rocaglamida fuertemente suprimida multiplicación por JUNV (S3 Fig). Estos hallazgos indican que ATP1A1 y PHB funcionan como factores provirales de una gama de mammarenavirus. Identificamos ATP1A1 y PHB como proteínas novedosas de células huésped que contribuyen a la multiplicación eficiente de los mammarenavirus. Nuestro enfoque utilizando un LCMV recombinante que expresa NP con una etiqueta de afinidad facilitó la definición del interactoroma NP en el contexto de la infección por LCMV. Recientemente, utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb) específico de NP para precipitar NP y socios de proteínas celulares asociados en un interactoroma NP de mammarenavirus, King et al. identificaron 348 proteínas huésped que se asocian con LCMV NP [45]. Encontramos 99 proteínas comunes entre nuestro interactoroma LCMV NP filtrado de 171 proteínas y el interactoroma NP de LCMV documentado por King Las diferencias tanto en las condiciones experimentales como en las metodologías de análisis utilizadas para generar el interactoma NP de LCMV documentado por King et al. y nuestra probable h post-transfección, las células fueron lavadas con medios frescos para eliminar la producción mediada en Z de VLP en ausencia de tratamiento compuesto, y cultivadas para otras 24 h en medios frescos en presencia de ouabaína o Roc-A en las concentraciones indicadas. Los VLP presentes en TCS fueron recolectados por ultracentrifugación, y se prepararon lisatos celulares. La expresión de la proteína Z en VLPs y lisatos celulares fue determinada por manchas occidentales utilizando anticuerpos a Strep-tag (C) y FLAG-tag (D). La eficiencia de Budding para cada muestra fue estimada dividiendo la intensidad de señal de la proteína Z asociada con VLPs por la de Z detectada en la lisato celular. Los números en la parte inferior del panel C corresponden a las eficiencias de brotes LCMV Z determinadas en un experimento representativo. Los resultados mostrados en el panel E corresponden a la media y SD de cuatro experimentos independientes incluyendo el mostrado en el panel D. La eficiencia media de brotes de muestras de DMSO fue fijada al 100%. Los datos representan la media ± DE de cuatro experimentos independientes. (F) Efecto de la ouabaína en la incorporación de glicoproteína viral en viriones. Las células 293T sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pozos y cultivadas durante la noche fueron infectadas (MOI = 0,1) con SCLCMV/ZsG (1 st infección) durante 2 h y posteriormente transfectadas con 0,5 μg de pC-GPC. A las 24 h pi, las células se lavaban con medio fresco para eliminar la partícula vírica infecciosa producida en ausencia de tratamiento compuesto, y se cultivaban para otras 24 h en medio fresco en presencia de ouabaína a 40 nM (OUA). A las 48 h pi, se recogía TCS y se utilizaba para infectar la monocapa fresca de células BHK-21 (2 nd infección) sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pocillos 1 día antes de la infección, y se preparaba el lisato de células 293T. 24 h más tarde, se preparaba el lisato de células BHK-21. ZsLa intensidad de la señal verde se midía mediante un lector de placas fluorescente. La eficiencia de la incorporación de GP se estimaba dividiendo la intensidad de la señal verde en el lisato de células BH La eficiencia media de la incorporación GP de las muestras tratadas con DMSO se estableció al 100%. Los datos representan medios ± DE de tres experimentos independientes. Contribuyeron a las diferencias observadas entre los conjuntos de datos. A pesar del progreso en la implementación de pantallas globales basadas en proteómicas para identificar interacciones proteína-proteínas portadoras de virus, la superposición entre conjuntos de datos para el mismo sistema viral es generalmente limitada. Sin embargo, la superposición sustancial de 99 de las 171 proteínas interactuantes NP de ambos estudios apoya la confiabilidad global de ambos sistemas. Utilizamos los resultados del interactoroma eGFP-estrep, determinado en células infectadas por r3LCMV/eGFP-estrep, como un control para filtrar interacciones NP no específicas, lo que puede haber resultado en un mayor grado de rigor que en el estudio de King et al. para la selección de candidatos interactuantes NP. y el que presentamos en este trabajo, facilitará estudios futuros para caracterizar aún más las implicaciones funcionales y biológicas de las proteínas interactuantes de las células huésped-NP. Todos los NPs de mammarenavirus probados, con excepción del NP de TCRV, bloquearon la inducción IFN-I dependiente de IRF-3 [25, 46]. La actividad anti-IFN de NP se mapeó a su parte C-terminal y se vinculó al dominio de exonucleasasa de 3'-5' presente con la parte C-terminal de NP [30]. Inhibidor-B quinasa Nosotros, así como el trabajo de King et al. [45], no detectamos esta interacción NP-IKK. Esta discrepancia puede haber sido causada por una expresión muy baja de IKK-IKK- en células infectadas por LCMV, lo que impidió la detección de IKK-MS/MS. Alternativamente, la interacción NP-IKK-IKK- puede ser regulada temporalmente y tener lugar en tiempos tempranos pi, pero podría estar mayormente ausente a las 48 h pi, el momento en el que preparamos los lisatos celulares para nuestros estudios proteómicos. Estudios futuros comparando el interactoroma NP en diferentes momentos durante la infección contribuirán a una mejor comprensión de la dinámica de las interacciones proteína NP/antocélulas. Na + /K + -ATPasa es un transportador de iones de membrana bien caracterizado y está compuesto por dos subunidades funcionales (α y β) y una subunidad regulatoria γ [48]. ATP1A1 representa una de las cuatro subunidades α [49, 50]. Evidencia reciente ha sugerido que la Na + /K + -ATPasa está involucrada en múltiples vías de señalización celular que son independientes de su función de bombeo de iones [51]. Los inhibidores glucósidos cardíacos de la Na + /K + -ATPasa (NKA), llamados esteroides cardiotónicos (CST; por ejemplo, ouabaína, bufalina), han demostrado inhibir la multiplicación de diferentes virus, incluyendo virus del Ébola [35], coronavirus [36], herpes simplex virus 1 [52, 53], CHICKV [54], virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) [55], adenovirus [56] y virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino 1 [57]. Es probable que diferentes mecanismos contribuyan a la actividad antiviral de los CST, incluyendo funciones celulares alteradas moduladas por la actividad de señalización de Na + /K + -ATPasa [58]. Por lo tanto, una baja concentración de ouabaína induce un cambio conformacional en ATP1A1 que resulta en la activación y liberación de proto-oncogen tirosina proteína quinasa, Src, de ATP1A1, seguido de la activación de señales aguas abajo aún desconocidas que inhibe, por ejemplo, la entrada celular del virus de la hepatitis murina (MHV) [59]. Sin embargo, nuestros resultados indicaron que la ouabaína no interfirió con la entrada de células LCMV. Además, el tratamiento con el inhibidor de Src 4-amino-5-(4-metilfenil)-7-(t-butil)pirazolo [3,4-d] pirimidina (PP1) no contrarrestó la actividad anti-LCMV de ouabaína (S4 fig). Sin embargo, la señalización de SRC mediada por ATP1A1 podría contribuir de manera plausible al efecto inhibidor de la ouabaína en la multiplicación de JUNV como similar a la observada con MHV. Además, la entrada celular de JUNV se produce también por endocitosis mediada por clatrina [60], un proceso afectado por la señalización de Src. Ouabain se ha utilizado clínicamente en varios países europeos para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca congestiva, mientras que la bufalina se ha probado en ensayos clínicos para tratamientos contra el cáncer [61], y la digoxina CST ha sido aprobada por la FDA desde 1997 para tratar la insuficiencia cardíaca y la fibrilación auricular. El inhibidor de la PHB, rocaglamida, parecía interferir con la síntesis y el brote de ARN LCMV, pero no afectó la entrada de células LCMV. En contraste, se informó que la PHB era un receptor de entrada celular para DENV-2 [39] y CHIKV [40]. Por otro lado, la PHB no actuó como receptor de entrada de células virales para VHC. Más bien, la PHB contribuyó a la entrada de células VHC a través de la unión a RAF celular (c-Raf; proto-oncogene serina/treonina-proteína cinasa) y posterior activación del sarcoma de rata Harvey proto-oncogene (HRas) que induce una vía de transducción de señal requerida para la entrada de células VHC mediadas por el factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [37] Además, el kd mediado por siRNA de PHB disminuyó la producción de FLUAV H5N1 [38]. Estos hallazgos indican que el PHB está involucrado en diferentes etapas del ciclo de vida de una variedad de virus, y por lo tanto un blanco atractivo para el desarrollo de fármacos antivirales de amplio espectro. Rocaglate es un grupo de compuestos naturales, que incluye rocaglamida, que inhibe la síntesis de proteínas al apuntar al factor 4A de iniciación eucariota 4A (eIF4A) de la caja DEAD-ATP y ejerce actividad antitumoral [62, 63]. El compuesto de rocaglate, silvestrol, inhibe la multiplicación del virus del Ébola probablemente interfiriendo con el papel de eIF4A en la traducción de proteínas virales [64]. Mientras nos centramos en dos proteínas huésped, ATP1A1 y PHB, en este estudio, nuestro enfoque proteómico también identificó varias proteínas de células huésped interactuantes de NP cuya expresión kd a través de siRNA resultó en una multiplicación aumentada de LCMV. Estas proteínas, que incluyen MAP1B, podrían tener actividad anti-LCMV. MAP1B ha demostrado unirse a proteínas no estructurales 1 (NS1) y 2 (NS2) del virus sincitial respiratorio humano (HRSV) [34]. NS1 y NS2 de HRSV antagoniza la respuesta del huésped IFN-I al reducir los niveles de receptor de TNF asociados a factor (TRAF3), IKKel (NS1) y STAT2 (NS2) [65]. La interacción NS2-MAP1B interfirió con la capacidad de NS2 de HRSV para reducir los niveles de STAT2, mientras que el papel de la interacción NS1-MAP1B está por determinar [34]. Examinando el papel de la interacción NP-MAP1B en la modulación de la capacidad de NP para inhibir la inducción de tipo I IFN es de interés. Se identificó entre las proteínas de las células huésped interactuantes NP el virus de la leucemia de Moloney ARN 10 (MOV10), que ha sido reportado como un factor antiviral para FLUAV [66], retrovirus [67] [68] [69] [70] [71], y DENV-2 [72]. No observamos un aumento de la multiplicación de LCMV en células sometidas a kd mediadas por siRNA de MOV10, un hallazgo Sin embargo, consideramos que LCMV ya tiene una multiplicación óptima en células A549 y otros aumentos pueden ocurrir sólo en condiciones más bien únicas. MOV10 fue demostrado para mejorar la inducción IRF-3 mediada por IFN-I después de la infección por SeV a través de una unión de tanque quinasa 1 (TBK1)-independiente e IKK El CCT mamífero es crítico para el plegado de muchas proteínas con funciones importantes en diversos procesos celulares [74], y puede proteger las topologías de proteínas complejas dentro de su cavidad central durante la biosíntesis y el plegado [75]. La contribución de los miembros del CCT al ensamblaje del NP en una estructura nucleocápsida podría explicar su presencia en el NP, pero no en el eGFP, interactoma. Curiosamente, los miembros del CCT han sido implicados en la multiplicación de diferentes virus incluyendo virus de la rabia [76, 77], VHC [78] y FLUAV [79]. Sin embargo, el papel de estas proteínas del CCT en la multiplicación del virus sigue siendo desconocido y puede implicar funciones distintas de actuar como chaperonas moleculares. Estudios anteriores documentaron la presencia de varios componentes de la eIF4F, incluyendo 4A, dentro de los complejos de replicación viral-transcripción (RTC) detectados en células infectadas con LCMV [80] y TCRV [81]. Estos hallazgos, junto con la detección de una serie de proteínas ribosómicas en el interactoroma NP, sugieren que la traducción de mRNA virales puede tener lugar dentro de RTC. Sin embargo, la interferencia de rocaglamida con la actividad de eIF4A dentro de la RTC viral podría contribuir a su actividad anti-LCMV. En este trabajo, documentamos la generación de rLCMV/Strep-NP y su uso para definir el NP-interactoma en células infectadas. Presentamos evidencia de que ATP1A1 y PHB contribuyen a la multiplicación eficiente de mammarenavirus utilizando genética De acuerdo con nuestros hallazgos, el análisis bioinformático reveló que la red proteica asociada con ATP1A1 y PHB involucra a proteínas de células huésped con funciones en procesos biológicos que han sido implicados en la multiplicación del virus (S5 Fig). El enfoque experimental general descrito aquí puede facilitar la identificación de proteínas de células huésped interactuantes de NP biológicamente relevantes. Estudios futuros que elucidan los roles de los factores pro y antivirales de células huésped identificados en este estudio en la multiplicación del mammarenavirus avanzarán en nuestra comprensión de las múltiples funciones de NP y descubrir nuevos objetivos celulares para el desarrollo de fármacos antimammarenavirales. Además, al identificar factores provirales de células huésped, los fármacos que ya están aprobados pueden ser repurposing como terapéuticos para combatir infecciones por mammarenavirus patógenos humanos. El riñón de hámster BHK-21 (American Type Culture Collection, ATCC, CCL-10), el ratón de casa L929 (ATCC CCL-1), el grivet Vero E6 (ATCC CRL-1586), el A549 humano (ATCC CCL-185) y las células humanas HEK 293T (ATCC CRL-3216) se cultivaron en el medio de águila modificado de Dulbecco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) que contenía un 10% de suero fetal de bovino inactivado térmicamente, 2 mM de L-glutamina, 100 mg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina a 37°C y 5% de CO2. Los LCMV recombinantes WT, Armstrong (rLCMV ARM) y clon-13 (rLCMV Cl Se describió la generación de rLCMV/NP(D382A) y SeV, cepa Cantell, [30, 82, 83 ]. Un rLCMV sin GPC y expresando eGFP (rLCMVΔGPC/eGFP) fue generado por genética inversa utilizando procedimientos previamente descritos [84]. rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep fueron generados por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMV WT y LCMV trisegmentados (r3LCMV) expresando eGFP [30]. Para la generación de estos nuevos rLCMVs, creamos pol1S Cl-13 plásmidos que dirigían síntesis intracelular mediada por Pol1 de especies de ARN del genoma S de LCMV recombinante codificando para NP o e El rLCMV que expresa eGFP (rLCMV/eGFP) se generó como se describe [85], y el rLCMV que expresa ZsGreen (rLCMV/ZsG) en lugar de eGFP fue generado por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMV/eGFP. Generación de rLASV que expresa eGFP (rLASV/eGFP) se describirá en otra parte. Para la generación de un nuevo rLCMV de ciclo único que expresa ZsGreen (scrLCMV/ZsG-P2A-NP), un plásmido pol1S fue creado por omitiendo el marco de lectura abierto de GPC (ORF) a partir del plásmido pol1S utilizado para la generación de rLCMV/ZsG. scrLCMV/ZsG-P2A-NP fue rescatado por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMVΔGPC/eGFP [84]. Los títulos de LCMV se determinaron por inmunoenfoque formando ensayo (IFFA) como se describe [87]. Brevemente, se utilizaron diluciones en serie de 10 veces para infectar monocapas de células Vero E6 en una placa de 96 pocillos, y a Después de la permeabilización celular mediante tratamiento con tampón de dilución (DB) (0,3% Triton X-100 en PBS-conteniendo 3% de albúmina sérica bovina [BSA]), las células fueron manchadas con una rata mAb a NP (VL-4, Bio X Cell, West Lebanon, NH) conjugada con Alexa Fluor 488 (VL-4-AF488, Protein Labeling Kit, Life Technologies, Carlsbad, CA). Los títulos de VSV fueron determinados por un ensayo de placa. Los lisatos celulares totales se prepararon en el tampón de lisis PD (+) (250 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl [pH = 7,5], 0,5% TritonX-100, 10% glicerol, 1 mM de MgCl 2, 1 μM de CaCl 2, 1 μM de ZnCl 2 ) y se aclararon mediante centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. Los lisatos clarificados se mezclaron a una proporción de 1:1 con tampón de carga (100 mM de Tris [pH 6.8], 20% 2-mercaptoetanol, 4% SDS, 0,2% azul bromofenol, 20% glicerol) y hervidos durante 5 min. Las muestras de proteínas fueron fraccionadas por SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida de gradiente 4-20% (geles Mini-PROTEAN TGX 4-20%, Bio-Rad, Hércules, CA), y las proteínas fueron transferidas por electroblotting a membranas de difluoruro de polivinilideno (Membranas de Transferencia de Immobilina, Millipore, Billerica, MA). Para detectar proteínas etiquetadas con Strep, se reaccionaron membranas con anticuerpos monoclonales de ratón a Strep (QIAGEN, Germantown, MD), eGFP (Takara Bio USA, Mountain View, CA), GP 2 (We33/ 36), ATP1A1 (TehrmoFisher Scientific, Rockford, IL), PHB (Abcam, Cambridge, MA) o anticuerpos policlonales de conejo a α-tubulina (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) o gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, Millipore), respectivamente, seguidos de incubación con anticuerpos antimouse anti-peroxidasa apropiada y anti-rabbit inmunoglobulina G (IgG) (Jackson ImmunoInvestigation Laboratories, West Grove, SuperSignal West Pico o Femto sustrato quimioluminiscente (Thermo Fisher Scientific) se utilizó para obtener señales quimioluminiscentes que fueron visualizadas usando ImageQuant LAS 4000 Imager (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA). Retirada de proteínas estreptoscópicas del lisato celular infectado. A549 células preparadas en seis platos de 15 cm (aproximadamente 1,0 x 10 8 células en total) fueron infectadas con rLCMV/Step-NP o r3LCMV/eGFP en un MOI de 0,1. A las 48 h pi, las células fueron lavadas tres veces con PBS frío-hielo, raspadas en PBS frío-hielo fresco, y centrifugadas a 400 x g a 4°C durante 10 min. Se extrajo el sobrenadante y se lisaron células con 12 ml de tampón de lisis PD (+) complementado con un cóctel inhibidor de la proteasa y la fosfatasa de parada (Thermo Fisher Scientific) y 5 μg/ml de desoxiribonucleasa I (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ). El lisato se aclaró mediante centrifugación a 3,900 x g a 4oC durante 30 minutos para eliminar residuos celulares. El lisato celular clarificado fue incubado con resina de sefarosa estrep-tactina (QIAGEN) a 4oC. Después de 2 horas de incubación, la resina fue lavada tres veces con tampón de lisis PD (+) y una vez con tampón de lisis PD sin TritonX-100 ( tampón de Después de la centrifugación a 1.600 x g y 4oC durante 5 minutos, se eliminó el último tampón de lavado, y los complejos proteicos asociados con la resina se eludieron en 2 ml de tampón de lisis PD (-) que contenía 2,5 mM de destiobiotina. El eluato fue sometido a precipitación TCA seguido por digestión de tripsina. Microcolumna de tecnología de identificación de proteínas multidimensional. Se preparó una microcolumna MudPIT creando primero un frito Kasil en un extremo de un tubo capilar de diámetro exterior (OD) no desactivado (diámetro interior de 360 μm) (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). El frito Kasil se preparó sumergiendo brevemente un tubo capilar de 20-30 cm en 300 μl de Kasil 1624 solución bien mezclada de silicato potásico (PQ Corporation, Malvern, PA) y 100 μl de formamida, curándose a 100 °C durante 4 h, y cortando el frito a una longitud de %2 mm. Partículas fuertes de intercambio catiónico (SCX Luna, 5-μm diámetro, 125 Å poros, Phenomenex, Torrance, CA) se embalaron en la casa de las lonchas de partículas en metanol a 2,5 cm. Partículas de fase reversa (2 cm, C18 Aqua, 3-μm diámetro, 125 Å poros, Phenomenex) se embalaron sucesivamente en el tubo capilar utilizando el mismo método que la carga SCX. Análisis Mud Se generó una columna analítica de cromatografía líquida de fase inversa tirando de una punta de 100-μm (Diámetro Interior (ID) de 360 μm) de tubo capilar de OD (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) a 5-μm de ID. Las partículas de fase inversa (Luna C18, diámetro 3-μm, 125 Å poros, Phenomenex) se envasaron directamente en la columna arrastrada a 5,5 mPa hasta 15 cm de largo. La columna fue más embalada, lavada y descompuesta a 10 mPa con tampón B (80% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico) seguido de tampón A (5% acetonitrilo y 0,1% ácido fórmico). Las columnas de mudPIT y analíticas se montaron utilizando una unión de volumen cero muerto (Upchurch Scientific El análisis LC-MS/MS se realizó con una bomba LC de alta presión Agilent (Agilent) y una trampa de doble célula de iones cuadrúpolos lineal Orbitrap Velos (Thermo) utilizando una etapa de electrospray construida en la casa. El electrospray se realizó directamente desde la columna analítica mediante la aplicación del voltaje de ionización electrospray (ESI) a un tee (150 μm ID, Upchurch Scientific) directamente aguas abajo de un flujo dividido de 1:1.000 para reducir el caudal a 300 nl/min a través de las columnas. Se realizaron experimentos con mudPIT (10 pasos) en los que cada paso corresponde a 0, 10, 20, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100% tampón C (500 mM de acetato de amonio, 0,1% de ácido fórmico y 5% de acetonitrilo) y se ejecutó durante 3 minutos al comienzo de un gradiente de 110 minutos. Análisis de datos. Identificación de proteínas y péptidos se realizaron con Pipeline-IP2 (Aplicaciones proteómicas integradas, San Diego, CA. http://www. integratedproteomics.com/) utilizando algoritmos ProLUCID y DTASelect2. Parámetros de selección DTASelect fueron -p 2 -y 1-tripstat-pfp.01 -extra-pI-DB-dm-in. Los archivos en bruto de espectro se extrajeron en archivos ms2 de archivos en bruto utilizando el código abierto RawExtract 1.9.9 (Scripps Research Institute, La Jolla, CA; http://fields.scripps.edu/downloads.php), y los espectros de masa en tándem se buscaron en una base de datos de proteínas humanas (UniprotKB). Para estimar con precisión las probabilidades de péptidos y las tasas de falsos descubrimientos, se utilizó una base de datos de señuelos que contenía las secuencias inversas de todas las proteínas anexas a la base de datos de destino. Los espectros de masa en tándem se emparejaron con secuencias utilizando el algoritmo ProLUCID con tolerancia a las masas de péptidos de 600 ppm. Se consideró que la carbamidometilación (+57,02146 Da) de cisteína era una modificación estática. El cribado de siRNA A549 células (1.000 células/pozo) en una placa de 384-pozo se transfectó inversamente con 0,5 pmol de grupo de siRNA (S2 Table) dirigido a cada gen utilizando 0,1 μl de Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) (la concentración final de siRNA fue de 10 nM), seguido de incubación a 37°C y 5% de CO 2. A las 72 h de post-transfección, las células fueron infectadas (MOI = 0,05) con proteínas de rLCMV/ZsG. SiRNA objetivo de células huésped fueron seleccionadas en base a la disponibilidad de secuencias de siRNA validadas. Los siRNAs que usamos para examinar los efectos en la multiplicación de LCMV de la expresión noqueada de los golpes candidatos a proteína de la célula huésped interactuante NP correspondían al Genoma-ancho ON TAR-GET-Plus (OTP) Biblioteca de siRNA humana (18.301 genes, 4 siRNAs/gén; Dharmacon, Lafayette, CO). Las células A549 (3,0 x 10 4 células/bien) fueron transfectadas inversamente en una placa de 24 pozos con 6 pmol de piscinas de siRNA dirigidas a cada gen usando 1 μl de Lipofectamine RNAimax (concentración final de siRNA es 10 nM). A las 72 h post-transfección, el lisato celular total fue preparado en lisis modificada tampón A (25 mM Tris-HCl [pH = 8,0], 50 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1,25% desoxicolato sódico) y aclarado por centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. La concentración total de proteína de lisato celular clarificado fue medida por Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). La misma cantidad de proteína de cada muestra fue sometida a SDS-PAGE, y la expresión proteica de genes dirigidos a siRNA fue analizada por manchas occidentales. Después de la permeabilización celular mediante tratamiento con DB, las células fueron teñidas con 4',6-diamidin-2-fenilindol (DAPI). Las señales de fluorescencia verde (eGFP o ZsGreen) y DAPI fueron medidas por un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, Bio-Tek, Winooski, VT). Las células infectadas con mock y virus fueron fijas con 4 % de PFA. Después de la permeabilización celular y bloqueo mediante tratamiento con DB que contenía 1 % de suero normal de cabra, las células fueron incubadas con anticuerpos ATP1A1 o PHB de ratón primario seguidos por anticuerpos IgG antimouse secundario conjugados con Alexa Fluore 568 (antimouse IgG-AF56 En algunas muestras, se omitió el anticuerpo primario contra ATP1A1 o PHB para determinar la fluorescencia de fondo. Para visualizar los núcleos, se utilizó DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL) para montar los protectores en un vidrio deslizante. Se observaron células manchadas bajo un microscopio confocal (LSM 710, Zeiss) y datos analizados por el software ZEN (Zeiss). El análisis de co-localización se realizó sobre una base pixel por pixel utilizando el software Zen (Zeiss). Se marcaron ocho células verdes (NP-positivas) y se trazó cada píxel en el área marcada en el diagrama de dispersión basado en su nivel de intensidad de cada canal. Los umbrales de los canales verde y rojo se determinaron utilizando células infecciosas simuladas manchadas con anticuerpos VL-4-AF488 (anti-NP) y anti-ratón IgG conjugados con Alexa Fluor 568 sin utilizar anticuerpos anti-ATP1A1 o -PHB. A cada píxel se le asignó un valor de 1. Coeficientes de colocalización (CC) (o CC no ponderado) se determinaron dividiendo la suma de píxeles positivos tanto verdes como rojos por la suma de píxeles positivos verdes. Este cálculo se repitió para ocho células individuales. Para evaluar la especificidad de la colocalización, determinamos CC ponderado tomando en consideración el brillo de cada señal de canal. La comparación de los píxeles no ponderados y ponderados nos permitió determinar si había píxeles más brillantes en las regiones colocalizadas en comparación con las regiones no colocalizadas. Los valores de p se determinaron mediante un test de t emparejado de dos colas utilizando el software GraphPad Prism. Células A549 o Vero E6 sembradas (2,0 x 10 4 células/pozo) en una placa de 96 pocillos y cultivadas durante la noche se trataron con diluciones en serie de 3 veces a 37oC y 5 % CO 2 durante 2 h, seguidas de infección con rLCMV/eGFP (MOI = 0,01). Los compuestos estuvieron presentes en el punto final del estudio. A 48 h pi, las células se fijaron con un 4% de PFA en PBS, y la expresión eGFP fue examinada por un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Los valores medios obtenidos con células infectadas por DMSO y rL Las células A549 o Vero E6 sembradas en una placa de 96 pocillos (2,0 x 10,4 células/pozo) y cultivadas durante la noche fueron tratadas con diluciones en serie de 3 veces y cultivadas a 37oC y un 5% de CO 2 durante 48 h. Luego, se añadió el reactivo de solución CellTiter 96 AQ (Promega, Madison, WI). Posteriormente, el ensayo se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, y la absorbancia (490 nm) se obtuvo mediante un lector de ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) (SPECTRA max + 384; Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA). Los valores medios obtenidos con células tratadas con DMSO se fijaron al 100%. Las concentraciones de CC 50 se determinaron utilizando GraphPad Prism. Se generó un plásmido que expresaba la proteína Z estreptocada (pC-LCMV-Z-Strep) mediante un procedimiento similar para generar un plásmido que expresaba la proteína Z LASV (pC-LCMV-Z-FLAG) con la etiqueta C-terminal FLAG (pC-LASV-Z-FLAG), y el ensayo en ciernes se realizó como se describió anteriormente [88]. Las células (HEK 293T) en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 0,5 μg de vector pCAGGS vacío o pC-LCMV-Z-Strep o pC-LASV-Z-FLAG utilizando Lipofectamine 2000. A las 5 h de post-transfección, los medios fueron reemplazados por medios frescos e incubados a 37°C y 5% de CO 2 durante 19 Después de la eliminación del último medio de lavado, las células fueron cultivadas en medio fresco que contenía ouabaína (30 ó 40 nM) o rocaglamida (50 ó 100 nM) o concentración equivalente de DMSO, y 24 h más tarde, se recolectaron TCS y células que contenían partículas similares al virión (VLP). El lisato total de células fue preparado lisando las células con tampón de lisis (1% NP-40, 50 mM de Tris-HCl [pH 8,0], 62,5 mM NaCl, desoxicolato sódico al 0,4%). Después de aclarar el TCS de los desechos celulares mediante centrifugación a 400 x g y 4 °C durante 10 min, los VLP fueron recolectados por ultracentrifugación a 100.000 x g y 4 °C durante 30 min a través de un cojín de sacarosa Los VLP fueron resuspendidos en PBS, y la expresión Z en el lisato total de células y TCS (conteniendo VLPs) fueron analizados por manchas occidentales. Las células A549 infectadas con rLCMV/eGFP fueron recolectadas utilizando solución de desprendimiento de células de Accutasa (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA) y fijas con 4% PFA en PBS. La expresión eGFP fue examinada por citometría de flujo utilizando una BD LSR II (Becton Dickson), y los datos fueron analizados con FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Las células 293T sembradas (4,0 x 10 5 células/well) en una placa de 12 pozos y cultivadas durante la noche fueron infectadas con SCLCMV/ZsG-P2A-NP durante A las 24 h pi, las células fueron tres veces lavadas con medios frescos para eliminar la partícula vírica infecciosa producida en ausencia de tratamiento compuesto, y cultivadas durante otras 24 h en medios frescos en presencia de 40 nM de ouabaína o control del vehículo (DMSO). A las 48 h pi, se recogió TCS y se utilizó para infectar monocapas frescas de células BHK-21 sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pocillos 1 día antes de la infección, y se preparó el lisato de células 293T. 24 h más tarde, se preparó el lisato de células BHK-21. El lisato total de células se preparó en tampón de lisis celular (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl [pH = 7,5], 0,5% [NP-40], 1 mM de EDTA] y se aclaró mediante centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. ZsLa intensidad de la señal verde en el lisato de células clarificadas se midió mediante un lector de placas fluorescentes (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). A549 células sembradas (2 x 10 5 células/well) en una placa de 96 pozos y cultivadas durante la noche fueron tratadas con combinaciones de diferentes concentraciones de ouabaína y rocaglamida durante 2 h y luego infectadas (MOI = 0,01) con rLCMV/eGFP. A las 48 h pi, las células se fijaron, permeabilizaron mediante tratamiento con DB y se teñiron con DAPI. Las señales de eGFP y DAPI se midieron mediante un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Las lecturas de eGFP se normalizaron mediante lecturas de DAPI, y se utilizaron datos normalizados para analizar el efecto sinérgico de los dos compuestos por el programa MacSynergy II [89]. Los datos fueron analizados para valores de p mediante una prueba t sin emparejar de dos colas utilizando el software GraphPad Prism.

¿Qué medicamento se usa para tratar la insuficiencia cardíaca congestiva?

El análisis interactómico del virus de la coriomeningitis linfocítica nucleoproteína en las células infectadas revela que ATPasa Na(+)/K(+) transporta la subunidad Alfa 1 y prohíbe como factores de células huésped involucrados en el ciclo de vida de los mammarenavirushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5834214/SHA: efbd0dfc426da5dd25ce294111d6fa37571623773Autores: Iwasaki, Masaharu; Minder, Petra; Caì, Yíngyún; Kuhn, Jens H.; Yates, John R.; Torbett, Bruce E.; de la Torre, Juan C.Fecha: 2018-02-20DOI: 10.1371/journal. Además, la creciente evidencia indica que el mammarenavirus prototípico distribuido en todo el mundo, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), es un patógeno humano descuidado de importancia clínica. Las preocupaciones sobre los mammarenavirus patógenos humanos se exacerban por la falta de vacunas autorizadas, y la terapia actual antimammarenavirus se limita al uso fuera de la etiqueta de ribavirina que es sólo parcialmente eficaz. La comprensión detallada de las interacciones virus/células huésped puede facilitar el desarrollo de nuevas estrategias antimammarenavirus, apuntando a los componentes de la maquinaria de células huésped que son necesarios para la multiplicación eficiente de virus. Aquí documentamos la generación de un LCMV recombinante codificando una nucleoproteína (NP) que contiene una etiqueta de afinidad (rLCMV/Step-NP) y su uso para capturar el interactoma NP en células infectadas. Nuestro enfoque proteómico combinado con la genética y los ensayos de validación farmacológica identificaron a ATPasa Na(+)/K(+) transportando subunidad alfa 1 (ATP1A1) y prohibin (PHB) como factores provirales. Ensayos basados en células revelaron que ATP1A1 y PHB están involucrados en diferentes pasos del ciclo de vida del virus. En consecuencia, observamos un efecto inhibidor sinérgico en la multiplicación de LCMV con una combinación de inhibidores ATP1A1 y PHB. Demostramos que los inhibidores ATP1A1 suprimen la multiplicación del virus Lassa y Candid#1, una cepa vacunal atenuada viva del virus Junín, sugiriendo que el requisito de ATP1A1 en la multiplicación del virus se conserva entre los mammarenavirus genéticamente relacionados distantemente. Nuestros hallazgos sugieren que los inhibidores clínicamente aprobados de ATP1A1, como digoxina, podrían ser reutilizados para tratar infecciones por mammarenavirus patógenos para los seres humanos. Texto: Introducción Los Mammarenavirus (Arenaviridae: Mammarenavirus) causan infecciones crónicas de roedores en todo el mundo [1]. La invasión de viviendas humanas por roedores infectados puede resultar en infecciones humanas a través de la exposición mucosal a aerosoles o por contacto directo de la piel abrazada con material infeccioso. Varios mammarenavirus causan fiebres hemorrágicas virales (VHF) en los seres humanos y plantean importantes problemas de salud pública en sus áreas endémicas [2] [3] [4] [5] [6]. Los Mammarenavirus se clasifican en dos grupos principales, Viejo Mundo (OW) y Nuevo Mundo (NW) [1]. El virus OW Lassa (LASV), agente causal de la fiebre de Lassa (LF), es el patógeno OW mammarenaviral más significativo. Se estima que el virus LASV infecta a varios cientos de miles de individuos anualmente en África Occidental, resultando en un alto número de casos de LF asociados con alta morbilidad y letalidad. Además, las regiones endémicas de LASV se están expandiendo [7], y la asociación del virus recientemente identificado de la mammarenavirus Lujo con un brote de VHF en África Meridional [8, 9] ha suscitado preocupación por la aparición de nuevos virus de la VHF que causan la mammarenavirus. El virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) distribuido por todo el mundo es un patógeno humano descuidado de importancia clínica, especialmente en infecciones congénitas [11] [12] [13] [14] [15]. Además, la LCMV representa una amenaza especial para los individuos inmunocomprometidos, como se ha demostrado en casos mortales de infección por LCMV asociada a trasplantes de órganos [16, 17]. Sin embargo, la investigación de LCMV puede realizarse de forma segura en la contención BSL-2, en lugar de la contención BSL-4 necesaria para la investigación en vivo de LASV o JUNV [18]. No existen vacunas con licencia de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los Estados Unidos para el tratamiento de infecciones por arenavirus, aunque una cepa de vacuna viva atenuada de JUNV, Candid#1, está autorizada en Del mismo modo, la terapia actual contra el antimammarenavirus se limita a un uso offlabel de la ribavirina analógica nucleósida que es sólo parcialmente eficaz y puede causar efectos secundarios significativos [19] [20] [21]. El desarrollo de fármacos antimammarenavirus eficaces se ha visto obstaculizado por la falta de comprensión detallada de las interacciones virus/células huésped necesarias para la multiplicación del virus de la mammarena que podrían representar objetivos sensibles para la terapia antiviral. el problema potencial que la sobreexpresión de un único gen viral puede potenciar interacciones PPI que no son relevantes durante el curso de una infección por virus natural. Para superar este problema, diseñamos un LCMV recombinante (rLCMV) codificando un tándem [WSHPQFEK (GGSGS) 3 WSHPQFEK] Strep-tag fusionado a los amino-terminales de Para facilitar la identificación de PPI específico entre NP y proteínas de células huésped, utilizamos nuestra plataforma trisegmentada (r3) del mammarenavirus [30] para diseñar un r3LCMV expresando una versión C-terminal Strep-tag de proteína fluorescente verde mejorada (r3LCMV/eGFP-Strep) que usamos como control negativo (Fig 1A y 1B). Rescatamos rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep y confirmamos la expresión de NP y eGFP estreñidos en células infectadas por rLCMV/strep-NP y r3LCMV/eGFP, respectivamente (Fig 1C). A continuación, examinamos las propiedades de crecimiento de las células rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep en tres líneas celulares diferentes de hámsteres, humanos y primates no humanos (Células BHK-21, A549 y Vero E6, respectivamente) (Fig 1D). La aptitud de las cepas rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep disminuyó modestamente en comparación con la observada con cepas de tipo salvaje (WT) Armstrong (rLCMV ARM) y Clone 13 (rLCMV Cl-13) de LCMV. Sin embargo, tanto rLCMV/Strep-NP como r3LCMV/eGFP-Strep tenían cinética Al igual que con WT LCMV, la infección con rLCMV/Strep-NP impidió la producción de IFN-I bioactivo por las células en respuesta a la infección por el virus Sendai (SeV) determinada utilizando un bioensayo IFN basado en la protección contra el efecto citopático (ECP) inducido por la infección por el virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Fig 1E). Las células Vero tratadas durante 16 h con sobrenadantes cultivados en el tejido (TCS) de células A549 infectadas primero con WT LCMV o rLCMV/Strep, seguidas de una infección de 24 h con SeV, siguieron siendo totalmente susceptibles a la EPC inducida por VSV. Por el contrario, las células Vero tratadas con SCT de células A549 infectadas con rLCMV/NP(D382A), mutante incapaz de prevenir la inducción de IFN-I [30], y posteriormente con SeV, fueron protegidas contra la EPC inducida por VSV. Seleccionamos la línea celular humana A549 porque las células epiteliales pulmonares son uno de los objetivos iniciales de las células humanas tras la inhalación de mammarenavirions. Infectamos las células A549 (multiplicidad de infección [MOI] = 0,1) con rLCMV/Strep-NP o r3LCMV/eGFP-Strep (Fig 2A). A las 48 h post-inoculación (pi), preparamos lysatos celulares totales para ensayos de tracción (PD) utilizando una resina de sepharose Los alícuotas de los complejos proteicos presentes en las muestras de PD fueron fraccionados por electroforesis de gel dodecil-poliacrilamida (SDS-PAGE) (Fig 2B) seguida de tinción de gel proteínico rubí SYPRO. Comparamos el patrón de bandas proteicas manchadas detectadas entre rLCMV/Strep-NP- y r3LCMV/eGFP-Strepinfectadas y confirmamos la presencia de Strep-NP y eGFP-Strep en muestras pertinentes (Fig 2B). Los complejos proteicos en el resto de los eluatos de las muestras de PD fueron concentrados por precipitación de ácido tricloroacético (TCA) y sometidos a digestión de tripsina (Fig 2A). Los péptidos digeridos fueron sometidos a un análisis de espectrometría de masa de cromatografía líquida-tandem (LC-MS/MS) utilizando un espectrómetro de masa híbrido consistente en iones cuádrupoles lineales de doble célula (LTQ) Velos y un analizador de Orbitrap. Clasificamos proteínas de células huésped identificadas por el análisis de células huésped-LC-MS/MS de dos réplicas biológicas independientes en dos grupos: 1) proteínas encontradas únicamente en muestras de Strep-NP PD con al menos cinco recuentos espectrales (Tabla 1) y 2) proteínas encontradas en muestras de Strep-NP y eGFP-Strep PD con cinco o más recuentos espectrales en muestras de Strep-NP y al menos dos veces mayores en recuentos espectrales en muestras de Strep-NP PD en comparación con muestras de eG Entre las 53 proteínas presentes en las muestras de NP- y eGFP-PD, 36 tenían recuentos espectrales en la muestra de NP-PD que fueron menos de dos veces mayores que sus correspondientes recuentos espectrales en la muestra de eGFP-PD (Fig 2C y S1). Con base en los criterios descritos anteriormente, consideramos que estas proteínas son altamente improbables interactores específicos con una implicación en el ciclo de vida del LCMV, y por lo tanto no consideramos estos resultados para un análisis posterior. Sin embargo, reconocemos que no podemos descartar formalmente que algunos de estos impactos aún pudieran jugar un papel en el ciclo de vida del LCMV. La anotación proteica mediante la clasificación de la familia de proteínas (PANTHER) por relación evolutiva (Proceso Biológico) de los candidatos a la proteína interactuante del NP reveló que un gran número de proteínas estaban involucradas en También analizamos las funciones moleculares de los candidatos a proteínas NP-interactuantes según la clasificación del perfil proteico PAN-THER (Fig 2E), que reveló funciones bioquímicas diversificadas enriquecidas para proteínas de unión ácida nucleica y chaperonas. Para evaluar inicialmente los roles pro o antivirales de las proteínas de células huésped NP-interactuantes identificadas por LC-MS/MS, examinamos el efecto del pequeño ARN interferente (siRNA) mediado por kd (kd) de cada uno de los genes correspondientes sobre la multiplicación de rLCMV que expresa el gen reportero ZsGreen (ZsG) en células A549 (Fig 3A). Los siRNAs que utilizamos eran de la biblioteca de siRNA humana ON TARGET-Plus (OTP) (18,301 genes, 4 Los efectos fuera de blanco son impulsados principalmente por la actividad de semilla de microARN (miR) de cadena antisensible. En los OTPs, la cadena de sentido se modifica para favorecer la captación de cadena antisensible mientras que la región de semilla de cadena antisensible se modifica para reducir drásticamente la desecación relacionada con la semilla [33]. Además, las OTPs están diseñadas sobre la base del algoritmo SMARTselection (Dharmacon), ampliamente considerado como el mejor algoritmo para la estrategia de diseño racional de siRNA. Numerosos factores de células huésped mostraron un efecto anti-LCMV (aumento de la expresión ZsG por kd de los genes), incluyendo la proteína 1B asociada al microtúbulo (MAP1B) [ [38], el virus del dengue 2 (DEV-2) [39], y el virus chikungunya (CHIKV) Para comenzar a evaluar las posibles implicaciones biológicas de las interacciones de proteína de NP-anfitriona identificadas, se seleccionó ATP1A1 y PHB dada la disponibilidad de reactivos, el conocimiento existente sobre sus roles en la fisiología celular y la evidencia de participación en la multiplicación de otros virus. Se confirmó que las células transfectadas con siRNA específicos de ATP1A1 y PHB exhibieron los niveles reducidos predichos en la expresión de proteína de ATP1A1 y PHB (Fig 3B). Asimismo, se examinó si los niveles de expresión reducida mediada por siRNA de ZsGreen correlacionados con los títulos de progenie de LCMV reducidos. Para ello, se infectaron las células A549 con expresión dirigida a siRNA de proteínas estreñidas. A549 células sembradas (5,0 x 10, A las 48 h, se prepararon lisatos celulares totales y se analizó la expresión de proteínas mediante el borrado occidental. (D) Propiedades de crecimiento de rLCMV que expresaba proteínas etiquetadas con estreptococos. BHK-21 (1,75 x 10 5 células/pozo), A549 (1,25 x 10 5 células/pozo), o Vero E6 (1,25 x 10 5 células/pozo) células sembradas en placas de 24 pozos y cultivadas durante la noche (MOI = 0,01) con los rLCMV indicados. En los momentos indicados, se recogieron los TCSs y se determinaron los títulos del virus por IFFA. Los resultados representan un promedio ± DE de los resultados de tres experimentos independientes. (E) Falta de inducción de IFN-I en células infectadas con rLCMV/Estreptocope-NP. Las células A549 fueron infectadas (MOI = 0,1) con el rLCMV indicado o el simulacro de infección, y 36 h más tarde infectadas con SeV (MOI = 1). A las 24 h pi con SeV, se recogieron y utilizaron TCS, tras la inactivación del virus por U.V., para tratar células Vero E6 durante 16 h, seguidas de infección con rVSV (MOI = 0,1) [rVSV(+)] o simulanfección [rVSV (-) ]. A las 24 h pi con rVSV, las células fueron fijas con 4% de PFA y manchadas con violeta cristalina para evaluar el efecto citopático inducido por rVSV. Utilizamos como control rLCMV/NP(D382A) que contiene mutación D382A dentro de NP, lo que ha demostrado la https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006892.g001 ATP1A1 o con NC siRNA 72 h antes de la infección con rLCMV/ZsG. Encontramos que siRNAmediated kd de ATP1A1 inhibió dramáticamente la expresión ZsGreen (Fig 3Ci), que se asoció con una reducción significativa de la progenie de LCMV infecciosa (Fig 3Cii). Nuestros intentos de ver la interacción entre NP y ATP1A1 o NP y PHB por coinmunoprecipitación no tuvieron éxito. Varias posibilidades podrían explicar esto, incluyendo interacciones de baja afinidad o alta tasa de encendido/apagado o ambas. Otra consideración es que sólo una fracción menor de NP podría estar involucrada en la interacción con una proteína de célula huésped dada, y por lo tanto, la detección de estas interacciones requeriría métodos altamente sensibles como LC-MS/MS. Para superar este problema utilizamos microscopía confocal para examinar la colocalización de NP con ATP1A1 y PHB en células infectadas con LCMV. Coeficientes de colocalización ponderados (CC), determinados tomando en consideración el brillo de cada señal de canal, fueron significativamente más altos que los CC no ponderados, lo que indica la presencia de píxeles más brillantes en las regiones colocalizadas en comparación con las regiones no colocalizadas (Fig 4). El glucósido cardíaco ouabaína es un inhibidor de ATP1A1 que se ha utilizado para tratar la insuficiencia cardíaca congestiva en países europeos [41]. El inhibidor de la PHB rocaglamida es una flavaglina de un árbol de Aglaia utilizado en la medicina tradicional china [42] que tiene una potente actividad anticancerosa [43]. Para examinar si la inhibición farmacológica de ATP1A1 o PHB inhibió la multiplicación de LCMV, pretratamos a seres humanos (A549 y HEK 293T), primates no humanos (Vero E6) y roedores (células murina L929 y hámster BHK-21) con ouabaína o rocaglamida y las infectamos con rLCMV/eGFP (S1 Fig). El tratamiento con ouabaína dio lugar a una fuerte inhibición dependiente de la dosis de expresión eGFP en células de primates humanas y no humanas infectadas, pero no afectó a la intensidad de expresión de eGFP en células de roedores Este hallazgo es consistente con roedores que expresan un alelo ATP1A1 resistente a la inhibición de la ouabaína [44]. Asimismo, observamos una inhibición dosis-dependiente de la expresión de la rocaglamida de eGFP en todas las líneas celulares infectadas con rLCMV/eGFP (S1B fig). De acuerdo con estos hallazgos, la producción de progenie de LCMV infecciosa se redujo mediante tratamiento con ouabaína o rocaglamida (fig. 5A) dentro de un rango de concentración que tuvo un impacto mínimo en la viabilidad celular (fig. 5B). Para examinar la correlación entre eficacia y citotoxicidad de estos compuestos, se determinó su índice terapéutico (TI = CC 50 /IC 50 (Fig 5Bi) ; mientras que rocaglamida tenía TI > 105 (CC 50 > 1000 nM, IC 50 = 9,51 nM) y 10,3 (CC 50 = 100 nM, IC 50 = 9,75 nM) en células A549 y Vero E6, respectivamente (Fig 5Bii). Además, el inhibidor antagonista de la ATP1A1, la bufalina, también mostró una fuerte actividad anti-LCMV con TIs de 8,92 (CC 50 Proteína de choque térmico HSP 90-alfa HSP90AA1 P07900 8 10 9 Endoplasmina HSP90B1 P14625 9 9 9 Gran aminoácidos neutros transportador pequeña subunidad 1 SLC7A5 Q01650 6 12 9 Queratina, tipo II cuticular Hb1 KRT81 Q14533 10 8 9 Helicasa Putativa MOV-10 MOV10 Q9HCE1 8 10 9 Proteína asociada a microtúbulos 1B MAP1B P46821 6 11 8,5 Cadena beta de espectro, rocaglamida (100 nM) (Fig 5C), además de apoyar una actividad anti-LC Para obtener información sobre los mecanismos por los que la ouabaína y la rocaglamida ejercen su actividad anti-LCMV, examinamos los efectos de estos compuestos en diferentes etapas del ciclo de vida de la LCMV. Primero, preguntamos si la ouabaína y la rocaglamida afectaban la entrada celular de la LCMV. Realizamos experimentos de tiempo de adición en los que tratamos a las células con ouabaína o rocaglamida antes de la inoculación viral (-1,5 h), en el momento de la inoculación (0 h), o 1,5 h pi (+1,5 h) (Fig 6A). En algunas muestras, utilizamos cloruro de amonio a partir de 4 h pi para bloquear múltiples rondas de infección viral. El tiempo de adición de compuestos no cambió significativamente el número de células positivas de la eGFP, lo que indica que ni la ouabaína ni la ro El número de células eGFP + en células tratadas con ouabaína se redujo en todos los puntos de adición en comparación con las células tratadas con dimetilsulfóxido (DMSO) del vehículo, pero fue similar al observado en células tratadas con cloruro de amonio. Por lo tanto, la ouabaína no inhibió la replicación y la expresión génica del ARN LCMV, sino más bien un paso tardío del ciclo de vida del LCMV. En contraste, el tratamiento con rocaglamida resultó en un número insignificante de células eGFP +, lo que indica que la rocaglamida inhibió la replicación y transcripción génica del ARN viral. Para investigar más a fondo el efecto de la ouabaína y la rocaglamida sobre la síntesis de ARN viral, infectamos células A549 con una LCMV infecciosa recombinante de un solo ciclo que expresaba e Setenta y dos horas más tarde, determinamos el porcentaje de expresión eGFP normalizada en células infectadas (Fig 6B). De acuerdo con nuestros resultados del experimento de tiempo de adición, la ouabaína no afectó la expresión eGFP de reportero. Sin embargo, la rocaglamida redujo la expresión eGFP, confirmando el efecto inhibidor de la rocaglamida en la síntesis de ARN del virus. También examinamos el efecto de la ouabaína y la rocaglamida en el último paso del ciclo de vida del virus de arena, la germinación mediada por Z. Para este experimento, transfectamos células con Z-Estrep- y Z-FLAG (epítopo de DYKDDK) que expresan los plásmidos de LCMV y LASV, respectivamente. A las 24 h después de la transfección, eliminamos el cultivo de tejido supernadante ( Cultivamos las células transfectadas en presencia o ausencia de ouabaína o rocaglamida. A las 24 h, determinamos por niveles WB de proteína Z tanto en lisatos celulares enteros y asociados con partículas víricas (VLPs) recolectadas de TCS. El tratamiento con rocaglamida, pero no con ouabaína, causó una reducción en la eficiencia de brotes de Z LCMV y LASV (Fig 6C y 6D). La reproducibilidad de estos hallazgos se confirmó a partir de los resultados de cuatro experimentos independientes (Fig 6E). También examinamos si la ouabaína podría interferir con un paso de ensamblaje de progenie infecciosa que no fue capturado por el ensayo de brotes Z a través de dos experimentos adicionales. El primer experimento consistió en el uso de una recién generada LCMV infecciosa recombinante de ciclo único que expresaba el gen reportero ZsGreen (scrLCMV/ZsG-P2A-NP) para infectar (MOI = 0,1) células A549 (1 st infección). Estas células fueron posteriormente transfectadas con un plásmido que expresaba LCMV GPC. Después de 24 h, usamos TCS para infectar una monocapa de células frescas (2 nd infección) e identificamos células infectadas basadas en la expresión ZsGreen. Para evaluar el efecto de la ouabaína en el ensamblaje de novo de progenie infecciosa determinamos proporciones normalizadas (2 nd /1 st infección) de células ZsGreen + (Fig 6F). El segundo experimento involucró infección (MOI = 0,1) de células con WT LCMV, y 48 h más tarde lavamos células infectadas tres veces para eliminar la progenie infecciosa extracelular producida durante las primeras 48 h de infección. Luego, se añadieron medios frescos que contenían ouabaína o control de vehículos DMSO, y 24 h más tarde determinamos títulos de virus en TCS (Fig 6G). Los resultados de ambos experimentos mostraron consistentemente que la ouabaína no inhibió el ensamblaje de novo del virus infeccioso extracelular. La terapia combinada puede aliviar significativamente el problema planteado por la rápida aparición de variantes farmacorresistentes comúnmente observadas durante las estrategias de monoterapia para controlar las infecciones por el virus ARN. Puesto que la ouabaína y la rocaglamida inhibieron diferentes pasos del ciclo de vida de LCMV, examinamos si su Para este experimento, infectamos células A549 con rLCMV/eGFP y las tratamos con ouabaína y rocaglamida utilizando diferentes concentraciones y combinaciones. A las 48 h pi, determinamos el porcentaje de expresión eGFP (Fig 7). El tratamiento combinado con ouabaína y rocaglamida dio lugar a una actividad anti-LCMV sinérgica que se realzó en condiciones utilizando concentraciones más altas de ouabaína y concentraciones más bajas de rocaglamida. Luego preguntamos si los factores de células hospedantes ATP1A1 y PHB contribuyeron también a la multiplicación de la fiebre hemorrágica viral causante de LASV. Tratamos células A549 con ouabaína, bufalina o rocaglamida e inoculamos las células tratadas con eGFP (rLASV/eGFP). Al igual que la infección por rLCMV, la multiplicación por LASV se restringió en células tratadas con ouabaína, bufalina o rocaglamida a concentraciones que afectaban mínimamente a la viabilidad celular, aunque sus valores IC 50 fueron ligeramente superiores a los encontrados con el sistema de infección por LCMV (Fig 5B y S2 Fig) ya que la ouabaína tenía IC 50 de 9,34 nM, la bufalina tenía IC 50 de 1,66 nM y la rocaglamida tenía IC 50 de 37,0 nM (Fig 8). También probamos el efecto de compuestos dirigidos a ATP1A1 y PHB sobre la multiplicación de JUNV. De acuerdo con nuestros resultados obtenidos con LCMV y LASV, ouabaína, bufalina y rocaglamida fuertemente suprimida multiplicación por JUNV (S3 Fig). Estos hallazgos indican que ATP1A1 y PHB funcionan como factores provirales de una gama de mammarenavirus. Identificamos ATP1A1 y PHB como proteínas novedosas de células huésped que contribuyen a la multiplicación eficiente de los mammarenavirus. Nuestro enfoque utilizando un LCMV recombinante que expresa NP con una etiqueta de afinidad facilitó la definición del interactoroma NP en el contexto de la infección por LCMV. Recientemente, utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb) específico de NP para precipitar NP y socios de proteínas celulares asociados en un interactoroma NP de mammarenavirus, King et al. identificaron 348 proteínas huésped que se asocian con LCMV NP [45]. Encontramos 99 proteínas comunes entre nuestro interactoroma LCMV NP filtrado de 171 proteínas y el interactoroma NP de LCMV documentado por King Las diferencias tanto en las condiciones experimentales como en las metodologías de análisis utilizadas para generar el interactoma NP de LCMV documentado por King et al. y nuestra probable h post-transfección, las células fueron lavadas con medios frescos para eliminar la producción mediada en Z de VLP en ausencia de tratamiento compuesto, y cultivadas para otras 24 h en medios frescos en presencia de ouabaína o Roc-A en las concentraciones indicadas. Los VLP presentes en TCS fueron recolectados por ultracentrifugación, y se prepararon lisatos celulares. La expresión de la proteína Z en VLPs y lisatos celulares fue determinada por manchas occidentales utilizando anticuerpos a Strep-tag (C) y FLAG-tag (D). La eficiencia de Budding para cada muestra fue estimada dividiendo la intensidad de señal de la proteína Z asociada con VLPs por la de Z detectada en la lisato celular. Los números en la parte inferior del panel C corresponden a las eficiencias de brotes LCMV Z determinadas en un experimento representativo. Los resultados mostrados en el panel E corresponden a la media y SD de cuatro experimentos independientes incluyendo el mostrado en el panel D. La eficiencia media de brotes de muestras de DMSO fue fijada al 100%. Los datos representan la media ± DE de cuatro experimentos independientes. (F) Efecto de la ouabaína en la incorporación de glicoproteína viral en viriones. Las células 293T sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pozos y cultivadas durante la noche fueron infectadas (MOI = 0,1) con SCLCMV/ZsG (1 st infección) durante 2 h y posteriormente transfectadas con 0,5 μg de pC-GPC. A las 24 h pi, las células se lavaban con medio fresco para eliminar la partícula vírica infecciosa producida en ausencia de tratamiento compuesto, y se cultivaban para otras 24 h en medio fresco en presencia de ouabaína a 40 nM (OUA). A las 48 h pi, se recogía TCS y se utilizaba para infectar la monocapa fresca de células BHK-21 (2 nd infección) sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pocillos 1 día antes de la infección, y se preparaba el lisato de células 293T. 24 h más tarde, se preparaba el lisato de células BHK-21. ZsLa intensidad de la señal verde se midía mediante un lector de placas fluorescente. La eficiencia de la incorporación de GP se estimaba dividiendo la intensidad de la señal verde en el lisato de células BH La eficiencia media de la incorporación GP de las muestras tratadas con DMSO se estableció al 100%. Los datos representan medios ± DE de tres experimentos independientes. Contribuyeron a las diferencias observadas entre los conjuntos de datos. A pesar del progreso en la implementación de pantallas globales basadas en proteómicas para identificar interacciones proteína-proteínas portadoras de virus, la superposición entre conjuntos de datos para el mismo sistema viral es generalmente limitada. Sin embargo, la superposición sustancial de 99 de las 171 proteínas interactuantes NP de ambos estudios apoya la confiabilidad global de ambos sistemas. Utilizamos los resultados del interactoroma eGFP-estrep, determinado en células infectadas por r3LCMV/eGFP-estrep, como un control para filtrar interacciones NP no específicas, lo que puede haber resultado en un mayor grado de rigor que en el estudio de King et al. para la selección de candidatos interactuantes NP. y el que presentamos en este trabajo, facilitará estudios futuros para caracterizar aún más las implicaciones funcionales y biológicas de las proteínas interactuantes de las células huésped-NP. Todos los NPs de mammarenavirus probados, con excepción del NP de TCRV, bloquearon la inducción IFN-I dependiente de IRF-3 [25, 46]. La actividad anti-IFN de NP se mapeó a su parte C-terminal y se vinculó al dominio de exonucleasasa de 3'-5' presente con la parte C-terminal de NP [30]. Inhibidor-B quinasa Nosotros, así como el trabajo de King et al. [45], no detectamos esta interacción NP-IKK. Esta discrepancia puede haber sido causada por una expresión muy baja de IKK-IKK- en células infectadas por LCMV, lo que impidió la detección de IKK-MS/MS. Alternativamente, la interacción NP-IKK-IKK- puede ser regulada temporalmente y tener lugar en tiempos tempranos pi, pero podría estar mayormente ausente a las 48 h pi, el momento en el que preparamos los lisatos celulares para nuestros estudios proteómicos. Estudios futuros comparando el interactoroma NP en diferentes momentos durante la infección contribuirán a una mejor comprensión de la dinámica de las interacciones proteína NP/antocélulas. Na + /K + -ATPasa es un transportador de iones de membrana bien caracterizado y está compuesto por dos subunidades funcionales (α y β) y una subunidad regulatoria γ [48]. ATP1A1 representa una de las cuatro subunidades α [49, 50]. Evidencia reciente ha sugerido que la Na + /K + -ATPasa está involucrada en múltiples vías de señalización celular que son independientes de su función de bombeo de iones [51]. Los inhibidores glucósidos cardíacos de la Na + /K + -ATPasa (NKA), llamados esteroides cardiotónicos (CST; por ejemplo, ouabaína, bufalina), han demostrado inhibir la multiplicación de diferentes virus, incluyendo virus del Ébola [35], coronavirus [36], herpes simplex virus 1 [52, 53], CHICKV [54], virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) [55], adenovirus [56] y virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino 1 [57]. Es probable que diferentes mecanismos contribuyan a la actividad antiviral de los CST, incluyendo funciones celulares alteradas moduladas por la actividad de señalización de Na + /K + -ATPasa [58]. Por lo tanto, una baja concentración de ouabaína induce un cambio conformacional en ATP1A1 que resulta en la activación y liberación de proto-oncogen tirosina proteína quinasa, Src, de ATP1A1, seguido de la activación de señales aguas abajo aún desconocidas que inhibe, por ejemplo, la entrada celular del virus de la hepatitis murina (MHV) [59]. Sin embargo, nuestros resultados indicaron que la ouabaína no interfirió con la entrada de células LCMV. Además, el tratamiento con el inhibidor de Src 4-amino-5-(4-metilfenil)-7-(t-butil)pirazolo [3,4-d] pirimidina (PP1) no contrarrestó la actividad anti-LCMV de ouabaína (S4 fig). Sin embargo, la señalización de SRC mediada por ATP1A1 podría contribuir de manera plausible al efecto inhibidor de la ouabaína en la multiplicación de JUNV como similar a la observada con MHV. Además, la entrada celular de JUNV se produce también por endocitosis mediada por clatrina [60], un proceso afectado por la señalización de Src. Ouabain se ha utilizado clínicamente en varios países europeos para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca congestiva, mientras que la bufalina se ha probado en ensayos clínicos para tratamientos contra el cáncer [61], y la digoxina CST ha sido aprobada por la FDA desde 1997 para tratar la insuficiencia cardíaca y la fibrilación auricular. El inhibidor de la PHB, rocaglamida, parecía interferir con la síntesis y el brote de ARN LCMV, pero no afectó la entrada de células LCMV. En contraste, se informó que la PHB era un receptor de entrada celular para DENV-2 [39] y CHIKV [40]. Por otro lado, la PHB no actuó como receptor de entrada de células virales para VHC. Más bien, la PHB contribuyó a la entrada de células VHC a través de la unión a RAF celular (c-Raf; proto-oncogene serina/treonina-proteína cinasa) y posterior activación del sarcoma de rata Harvey proto-oncogene (HRas) que induce una vía de transducción de señal requerida para la entrada de células VHC mediadas por el factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [37] Además, el kd mediado por siRNA de PHB disminuyó la producción de FLUAV H5N1 [38]. Estos hallazgos indican que el PHB está involucrado en diferentes etapas del ciclo de vida de una variedad de virus, y por lo tanto un blanco atractivo para el desarrollo de fármacos antivirales de amplio espectro. Rocaglate es un grupo de compuestos naturales, que incluye rocaglamida, que inhibe la síntesis de proteínas al apuntar al factor 4A de iniciación eucariota 4A (eIF4A) de la caja DEAD-ATP y ejerce actividad antitumoral [62, 63]. El compuesto de rocaglate, silvestrol, inhibe la multiplicación del virus del Ébola probablemente interfiriendo con el papel de eIF4A en la traducción de proteínas virales [64]. Mientras nos centramos en dos proteínas huésped, ATP1A1 y PHB, en este estudio, nuestro enfoque proteómico también identificó varias proteínas de células huésped interactuantes de NP cuya expresión kd a través de siRNA resultó en una multiplicación aumentada de LCMV. Estas proteínas, que incluyen MAP1B, podrían tener actividad anti-LCMV. MAP1B ha demostrado unirse a proteínas no estructurales 1 (NS1) y 2 (NS2) del virus sincitial respiratorio humano (HRSV) [34]. NS1 y NS2 de HRSV antagoniza la respuesta del huésped IFN-I al reducir los niveles de receptor de TNF asociados a factor (TRAF3), IKKel (NS1) y STAT2 (NS2) [65]. La interacción NS2-MAP1B interfirió con la capacidad de NS2 de HRSV para reducir los niveles de STAT2, mientras que el papel de la interacción NS1-MAP1B está por determinar [34]. Examinando el papel de la interacción NP-MAP1B en la modulación de la capacidad de NP para inhibir la inducción de tipo I IFN es de interés. Se identificó entre las proteínas de las células huésped interactuantes NP el virus de la leucemia de Moloney ARN 10 (MOV10), que ha sido reportado como un factor antiviral para FLUAV [66], retrovirus [67] [68] [69] [70] [71], y DENV-2 [72]. No observamos un aumento de la multiplicación de LCMV en células sometidas a kd mediadas por siRNA de MOV10, un hallazgo Sin embargo, consideramos que LCMV ya tiene una multiplicación óptima en células A549 y otros aumentos pueden ocurrir sólo en condiciones más bien únicas. MOV10 fue demostrado para mejorar la inducción IRF-3 mediada por IFN-I después de la infección por SeV a través de una unión de tanque quinasa 1 (TBK1)-independiente e IKK El CCT mamífero es crítico para el plegado de muchas proteínas con funciones importantes en diversos procesos celulares [74], y puede proteger las topologías de proteínas complejas dentro de su cavidad central durante la biosíntesis y el plegado [75]. La contribución de los miembros del CCT al ensamblaje del NP en una estructura nucleocápsida podría explicar su presencia en el NP, pero no en el eGFP, interactoma. Curiosamente, los miembros del CCT han sido implicados en la multiplicación de diferentes virus incluyendo virus de la rabia [76, 77], VHC [78] y FLUAV [79]. Sin embargo, el papel de estas proteínas del CCT en la multiplicación del virus sigue siendo desconocido y puede implicar funciones distintas de actuar como chaperonas moleculares. Estudios anteriores documentaron la presencia de varios componentes de la eIF4F, incluyendo 4A, dentro de los complejos de replicación viral-transcripción (RTC) detectados en células infectadas con LCMV [80] y TCRV [81]. Estos hallazgos, junto con la detección de una serie de proteínas ribosómicas en el interactoroma NP, sugieren que la traducción de mRNA virales puede tener lugar dentro de RTC. Sin embargo, la interferencia de rocaglamida con la actividad de eIF4A dentro de la RTC viral podría contribuir a su actividad anti-LCMV. En este trabajo, documentamos la generación de rLCMV/Strep-NP y su uso para definir el NP-interactoma en células infectadas. Presentamos evidencia de que ATP1A1 y PHB contribuyen a la multiplicación eficiente de mammarenavirus utilizando genética De acuerdo con nuestros hallazgos, el análisis bioinformático reveló que la red proteica asociada con ATP1A1 y PHB involucra a proteínas de células huésped con funciones en procesos biológicos que han sido implicados en la multiplicación del virus (S5 Fig). El enfoque experimental general descrito aquí puede facilitar la identificación de proteínas de células huésped interactuantes de NP biológicamente relevantes. Estudios futuros que elucidan los roles de los factores de células huésped pro y antivirales identificados en este estudio en la multiplicación del mammarenavirus avanzarán en nuestra comprensión de las múltiples funciones de NP y descubrir nuevos objetivos celulares para el desarrollo de fármacos antimammarenavirales. Además, al identificar factores de células huésped provirales, los fármacos que ya están aprobados pueden ser repurposing como terapéuticos para combatir infecciones por mammarenavirus patógenos humanos. El riñón de hámster BHK-21 (American Type Culture Collection, ATCC, CCL-10), el ratón de casa L929 (ATCC CCL-1), el grivet Vero E6 (ATCC CRL-1586), el A549 humano (ATCC CCL-185) y las células humanas HEK 293T (ATCC CRL-3216) se cultivaron en el medio de águila modificado de Dulbecco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) que contenía un 10% de suero fetal de bovino inactivado térmicamente, 2 mM de L-glutamina, 100 mg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina a 37°C y 5% de CO2. Los LCMV recombinantes WT, Armstrong (rLCMV ARM) y clon-13 (rLCMV Cl Se describió la generación de rLCMV/NP(D382A) y SeV, cepa Cantell, [30, 82, 83 ]. Un rLCMV sin GPC y expresando eGFP (rLCMVΔGPC/eGFP) fue generado por genética inversa utilizando procedimientos previamente descritos [84]. rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep fueron generados por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMV WT y LCMV trisegmentados (r3LCMV) expresando eGFP [30]. Para la generación de estos nuevos rLCMVs, creamos pol1S Cl-13 plásmidos que dirigían síntesis intracelular mediada por Pol1 de especies de ARN del genoma S de LCMV recombinante codificando para NP o e El rLCMV que expresa eGFP (rLCMV/eGFP) se generó como se describe [85], y el rLCMV que expresa ZsGreen (rLCMV/ZsG) en lugar de eGFP fue generado por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMV/eGFP. Generación de rLASV que expresa eGFP (rLASV/eGFP) se describirá en otra parte. Para la generación de un nuevo rLCMV de ciclo único que expresa ZsGreen (scrLCMV/ZsG-P2A-NP), un plásmido pol1S fue creado por omitiendo el marco de lectura abierto de GPC (ORF) a partir del plásmido pol1S utilizado para la generación de rLCMV/ZsG. scrLCMV/ZsG-P2A-NP fue rescatado por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMVΔGPC/eGFP [84]. Los títulos de LCMV se determinaron por inmunoenfoque formando ensayo (IFFA) como se describe [87]. Brevemente, se utilizaron diluciones en serie de 10 veces para infectar monocapas de células Vero E6 en una placa de 96 pocillos, y a Después de la permeabilización celular mediante tratamiento con tampón de dilución (DB) (0,3% Triton X-100 en PBS-conteniendo 3% de albúmina sérica bovina [BSA]), las células fueron manchadas con una rata mAb a NP (VL-4, Bio X Cell, West Lebanon, NH) conjugada con Alexa Fluor 488 (VL-4-AF488, Protein Labeling Kit, Life Technologies, Carlsbad, CA). Los títulos de VSV fueron determinados por un ensayo de placa. Los lisatos celulares totales se prepararon en el tampón de lisis PD (+) (250 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl [pH = 7,5], 0,5% TritonX-100, 10% glicerol, 1 mM de MgCl 2, 1 μM de CaCl 2, 1 μM de ZnCl 2 ) y se aclararon mediante centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. Los lisatos clarificados se mezclaron a una proporción de 1:1 con tampón de carga (100 mM de Tris [pH 6.8], 20% 2-mercaptoetanol, 4% SDS, 0,2% azul bromofenol, 20% glicerol) y hervidos durante 5 min. Las muestras de proteínas fueron fraccionadas por SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida de gradiente 4-20% (geles Mini-PROTEAN TGX 4-20%, Bio-Rad, Hércules, CA), y las proteínas fueron transferidas por electroblotting a membranas de difluoruro de polivinilideno (Membranas de Transferencia de Immobilina, Millipore, Billerica, MA). Para detectar proteínas etiquetadas con Strep, se reaccionaron membranas con anticuerpos monoclonales de ratón a Strep (QIAGEN, Germantown, MD), eGFP (Takara Bio USA, Mountain View, CA), GP 2 (We33/ 36), ATP1A1 (TehrmoFisher Scientific, Rockford, IL), PHB (Abcam, Cambridge, MA) o anticuerpos policlonales de conejo a α-tubulina (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) o gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, Millipore), respectivamente, seguidos de incubación con anticuerpos antimouse anti-peroxidasa apropiada y anti-rabbit inmunoglobulina G (IgG) (Jackson ImmunoInvestigation Laboratories, West Grove, SuperSignal West Pico o Femto sustrato quimioluminiscente (Thermo Fisher Scientific) se utilizó para obtener señales quimioluminiscentes que fueron visualizadas usando ImageQuant LAS 4000 Imager (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA). Retirada de proteínas estreptoscópicas del lisato celular infectado. A549 células preparadas en seis platos de 15 cm (aproximadamente 1,0 x 10 8 células en total) fueron infectadas con rLCMV/Step-NP o r3LCMV/eGFP en un MOI de 0,1. A las 48 h pi, las células fueron lavadas tres veces con PBS frío-hielo, raspadas en PBS frío-hielo fresco, y centrifugadas a 400 x g a 4°C durante 10 min. Se extrajo el sobrenadante y se lisaron células con 12 ml de tampón de lisis PD (+) complementado con un cóctel inhibidor de la proteasa y la fosfatasa de parada (Thermo Fisher Scientific) y 5 μg/ml de desoxiribonucleasa I (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ). El lisato se aclaró mediante centrifugación a 3,900 x g a 4oC durante 30 minutos para eliminar residuos celulares. El lisato celular clarificado fue incubado con resina de sefarosa estrep-tactina (QIAGEN) a 4oC. Después de 2 horas de incubación, la resina fue lavada tres veces con tampón de lisis PD (+) y una vez con tampón de lisis PD sin TritonX-100 ( tampón de Después de la centrifugación a 1.600 x g y 4oC durante 5 minutos, se eliminó el último tampón de lavado, y los complejos proteicos asociados con la resina se eludieron en 2 ml de tampón de lisis PD (-) que contenía 2,5 mM de destiobiotina. El eluato fue sometido a precipitación TCA seguido por digestión de tripsina. Microcolumna de tecnología de identificación de proteínas multidimensional. Se preparó una microcolumna MudPIT creando primero un frito Kasil en un extremo de un tubo capilar de diámetro exterior (OD) no desactivado (diámetro interior de 360 μm) (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). El frito Kasil se preparó sumergiendo brevemente un tubo capilar de 20-30 cm en 300 μl de Kasil 1624 solución bien mezclada de silicato potásico (PQ Corporation, Malvern, PA) y 100 μl de formamida, curándose a 100 °C durante 4 h, y cortando el frito a una longitud de %2 mm. Partículas fuertes de intercambio catiónico (SCX Luna, 5-μm diámetro, 125 Å poros, Phenomenex, Torrance, CA) se embalaron en la casa de las lonchas de partículas en metanol a 2,5 cm. Partículas de fase reversa (2 cm, C18 Aqua, 3-μm diámetro, 125 Å poros, Phenomenex) se embalaron sucesivamente en el tubo capilar utilizando el mismo método que la carga SCX. Análisis Mud Se generó una columna analítica de cromatografía líquida de fase inversa tirando de una punta de 100-μm (Diámetro Interior (ID) de 360 μm) de tubo capilar de OD (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) a 5-μm de ID. Las partículas de fase inversa (Luna C18, diámetro 3-μm, 125 Å poros, Phenomenex) se envasaron directamente en la columna arrastrada a 5,5 mPa hasta 15 cm de largo. La columna fue más embalada, lavada y descompuesta a 10 mPa con tampón B (80% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico) seguido de tampón A (5% acetonitrilo y 0,1% ácido fórmico). Las columnas de mudPIT y analíticas se montaron utilizando una unión de volumen cero muerto (Upchurch Scientific El análisis LC-MS/MS se realizó con una bomba LC de alta presión Agilent (Agilent) y una trampa de doble célula de iones cuadrúpolos lineal Orbitrap Velos (Thermo) utilizando una etapa de electrospray construida en la casa. El electrospray se realizó directamente desde la columna analítica mediante la aplicación del voltaje de ionización electrospray (ESI) a un tee (150 μm ID, Upchurch Scientific) directamente aguas abajo de un flujo dividido de 1:1.000 para reducir el caudal a 300 nl/min a través de las columnas. Se realizaron experimentos con mudPIT (10 pasos) en los que cada paso corresponde a 0, 10, 20, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100% tampón C (500 mM de acetato de amonio, 0,1% de ácido fórmico y 5% de acetonitrilo) y se ejecutó durante 3 minutos al comienzo de un gradiente de 110 minutos. Análisis de datos. Identificación de proteínas y péptidos se realizaron con Pipeline-IP2 (Aplicaciones proteómicas integradas, San Diego, CA. http://www. integratedproteomics.com/) utilizando algoritmos ProLUCID y DTASelect2. Parámetros de selección DTASelect fueron -p 2 -y 1-tripstat-pfp.01 -extra-pI-DB-dm-in. Los archivos en bruto de espectro se extrajeron en archivos ms2 de archivos en bruto utilizando el código abierto RawExtract 1.9.9 (Scripps Research Institute, La Jolla, CA; http://fields.scripps.edu/downloads.php), y los espectros de masa en tándem se buscaron en una base de datos de proteínas humanas (UniprotKB). Para estimar con precisión las probabilidades de péptidos y las tasas de falsos descubrimientos, se utilizó una base de datos de señuelos que contenía las secuencias inversas de todas las proteínas anexas a la base de datos de destino. Los espectros de masa en tándem se emparejaron con secuencias utilizando el algoritmo ProLUCID con tolerancia a las masas de péptidos de 600 ppm. Se consideró que la carbamidometilación (+57,02146 Da) de cisteína era una modificación estática. El cribado de siRNA A549 células (1.000 células/pozo) en una placa de 384-pozo se transfectó inversamente con 0,5 pmol de grupo de siRNA (S2 Table) dirigido a cada gen utilizando 0,1 μl de Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) (la concentración final de siRNA fue de 10 nM), seguido de incubación a 37°C y 5% de CO 2. A las 72 h de post-transfección, las células fueron infectadas (MOI = 0,05) con proteínas de rLCMV/ZsG. SiRNA objetivo de células huésped fueron seleccionadas en base a la disponibilidad de secuencias de siRNA validadas. Los siRNAs que usamos para examinar los efectos en la multiplicación de LCMV de la expresión noqueada de los golpes candidatos a proteína de la célula huésped interactuante NP correspondían al Genoma-ancho ON TAR-GET-Plus (OTP) Biblioteca de siRNA humana (18.301 genes, 4 siRNAs/gén; Dharmacon, Lafayette, CO). Las células A549 (3,0 x 10 4 células/bien) fueron transfectadas inversamente en una placa de 24 pozos con 6 pmol de piscinas de siRNA dirigidas a cada gen usando 1 μl de Lipofectamine RNAimax (concentración final de siRNA es 10 nM). A las 72 h post-transfección, el lisato celular total fue preparado en lisis modificada tampón A (25 mM Tris-HCl [pH = 8,0], 50 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1,25% desoxicolato sódico) y aclarado por centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. La concentración total de proteína de lisato celular clarificado fue medida por Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). La misma cantidad de proteína de cada muestra fue sometida a SDS-PAGE, y la expresión proteica de genes dirigidos a siRNA fue analizada por manchas occidentales. Después de la permeabilización celular mediante tratamiento con DB, las células fueron teñidas con 4',6-diamidin-2-fenilindol (DAPI). Las señales de fluorescencia verde (eGFP o ZsGreen) y DAPI fueron medidas por un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, Bio-Tek, Winooski, VT). Las células infectadas con mock y virus fueron fijas con 4 % de PFA. Después de la permeabilización celular y bloqueo mediante tratamiento con DB que contenía 1 % de suero normal de cabra, las células fueron incubadas con anticuerpos ATP1A1 o PHB de ratón primario seguidos por anticuerpos IgG antimouse secundario conjugados con Alexa Fluore 568 (antimouse IgG-AF56 En algunas muestras, se omitió el anticuerpo primario contra ATP1A1 o PHB para determinar la fluorescencia de fondo. Para visualizar los núcleos, se utilizó DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL) para montar los protectores en un vidrio deslizante. Se observaron células manchadas bajo un microscopio confocal (LSM 710, Zeiss) y datos analizados por el software ZEN (Zeiss). El análisis de co-localización se realizó sobre una base pixel por pixel utilizando el software Zen (Zeiss). Se marcaron ocho células verdes (NP-positivas) y se trazó cada píxel en el área marcada en el diagrama de dispersión basado en su nivel de intensidad de cada canal. Los umbrales de los canales verde y rojo se determinaron utilizando células infecciosas simuladas manchadas con anticuerpos VL-4-AF488 (anti-NP) y anti-ratón IgG conjugados con Alexa Fluor 568 sin utilizar anticuerpos anti-ATP1A1 o -PHB. A cada píxel se le asignó un valor de 1. Coeficientes de colocalización (CC) (o CC no ponderado) se determinaron dividiendo la suma de píxeles positivos tanto verdes como rojos por la suma de píxeles positivos verdes. Este cálculo se repitió para ocho células individuales. Para evaluar la especificidad de la colocalización, determinamos CC ponderado tomando en consideración el brillo de cada señal de canal. La comparación de los píxeles no ponderados y ponderados nos permitió determinar si había píxeles más brillantes en las regiones colocalizadas en comparación con las regiones no colocalizadas. Los valores de p se determinaron mediante un test de t emparejado de dos colas utilizando el software GraphPad Prism. Células A549 o Vero E6 sembradas (2,0 x 10 4 células/pozo) en una placa de 96 pocillos y cultivadas durante la noche se trataron con diluciones en serie de 3 veces a 37oC y 5 % CO 2 durante 2 h, seguidas de infección con rLCMV/eGFP (MOI = 0,01). Los compuestos estuvieron presentes en el punto final del estudio. A 48 h pi, las células se fijaron con un 4% de PFA en PBS, y la expresión eGFP fue examinada por un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Los valores medios obtenidos con células infectadas por DMSO y rL Las células A549 o Vero E6 sembradas en una placa de 96 pocillos (2,0 x 10,4 células/pozo) y cultivadas durante la noche fueron tratadas con diluciones en serie de 3 veces y cultivadas a 37oC y un 5% de CO 2 durante 48 h. Luego, se añadió el reactivo de solución CellTiter 96 AQ (Promega, Madison, WI). Posteriormente, el ensayo se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, y la absorbancia (490 nm) se obtuvo mediante un lector de ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) (SPECTRA max + 384; Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA). Los valores medios obtenidos con células tratadas con DMSO se fijaron al 100%. Las concentraciones de CC 50 se determinaron utilizando GraphPad Prism. Se generó un plásmido que expresaba la proteína Z estreptocada (pC-LCMV-Z-Strep) mediante un procedimiento similar para generar un plásmido que expresaba la proteína Z LASV (pC-LCMV-Z-FLAG) con la etiqueta C-terminal FLAG (pC-LASV-Z-FLAG), y el ensayo en ciernes se realizó como se describió anteriormente [88]. Las células (HEK 293T) en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 0,5 μg de vector pCAGGS vacío o pC-LCMV-Z-Strep o pC-LASV-Z-FLAG utilizando Lipofectamine 2000. A las 5 h de post-transfección, los medios fueron reemplazados por medios frescos e incubados a 37°C y 5% de CO 2 durante 19 Después de la eliminación del último medio de lavado, las células fueron cultivadas en medio fresco que contenía ouabaína (30 ó 40 nM) o rocaglamida (50 ó 100 nM) o concentración equivalente de DMSO, y 24 h más tarde, se recolectaron TCS y células que contenían partículas similares al virión (VLP). El lisato total de células fue preparado lisando las células con tampón de lisis (1% NP-40, 50 mM de Tris-HCl [pH 8,0], 62,5 mM NaCl, desoxicolato sódico al 0,4%). Después de aclarar el TCS de los desechos celulares mediante centrifugación a 400 x g y 4 °C durante 10 min, los VLP fueron recolectados por ultracentrifugación a 100.000 x g y 4 °C durante 30 min a través de un cojín de sacarosa Los VLP fueron resuspendidos en PBS, y la expresión Z en el lisato total de células y TCS (conteniendo VLPs) fueron analizados por manchas occidentales. Las células A549 infectadas con rLCMV/eGFP fueron recolectadas utilizando solución de desprendimiento de células de Accutasa (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA) y fijas con 4% PFA en PBS. La expresión eGFP fue examinada por citometría de flujo utilizando una BD LSR II (Becton Dickson), y los datos fueron analizados con FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Las células 293T sembradas (4,0 x 10 5 células/well) en una placa de 12 pozos y cultivadas durante la noche fueron infectadas con SCLCMV/ZsG-P2A-NP durante A las 24 h pi, las células fueron tres veces lavadas con medios frescos para eliminar la partícula vírica infecciosa producida en ausencia de tratamiento compuesto, y cultivadas durante otras 24 h en medios frescos en presencia de 40 nM de ouabaína o control del vehículo (DMSO). A las 48 h pi, se recogió TCS y se utilizó para infectar monocapas frescas de células BHK-21 sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pocillos 1 día antes de la infección, y se preparó el lisato de células 293T. 24 h más tarde, se preparó el lisato de células BHK-21. El lisato total de células se preparó en tampón de lisis celular (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl [pH = 7,5], 0,5% [NP-40], 1 mM de EDTA] y se aclaró mediante centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. ZsLa intensidad de la señal verde en el lisato de células clarificadas se midió mediante un lector de placas fluorescentes (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). A549 células sembradas (2 x 10 5 células/well) en una placa de 96 pozos y cultivadas durante la noche fueron tratadas con combinaciones de diferentes concentraciones de ouabaína y rocaglamida durante 2 h y luego infectadas (MOI = 0,01) con rLCMV/eGFP. A las 48 h pi, las células se fijaron, permeabilizaron mediante tratamiento con DB y se teñiron con DAPI. Las señales de eGFP y DAPI se midieron mediante un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Las lecturas de eGFP se normalizaron mediante lecturas de DAPI, y se utilizaron datos normalizados para analizar el efecto sinérgico de los dos compuestos por el programa MacSynergy II [89]. Los datos fueron analizados para valores de p mediante una prueba t sin emparejar de dos colas utilizando el software GraphPad Prism.

¿Qué inhibe la ouabaína?

El análisis interactómico del virus de la coriomeningitis linfocítica nucleoproteína en las células infectadas revela que ATPasa Na(+)/K(+) transporta la subunidad Alfa 1 y prohíbe como factores de células huésped involucrados en el ciclo de vida de los mammarenavirushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5834214/SHA: efbd0dfc426da5dd25ce294111d6fa37571623773Autores: Iwasaki, Masaharu; Minder, Petra; Caì, Yíngyún; Kuhn, Jens H.; Yates, John R.; Torbett, Bruce E.; de la Torre, Juan C.Fecha: 2018-02-20DOI: 10.1371/journal. Además, la creciente evidencia indica que el mammarenavirus prototípico distribuido en todo el mundo, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), es un patógeno humano descuidado de importancia clínica. Las preocupaciones sobre los mammarenavirus patógenos humanos se exacerban por la falta de vacunas autorizadas, y la terapia actual antimammarenavirus se limita al uso fuera de la etiqueta de ribavirina que es sólo parcialmente eficaz. La comprensión detallada de las interacciones virus/células huésped puede facilitar el desarrollo de nuevas estrategias antimammarenavirus, apuntando a los componentes de la maquinaria de células huésped que son necesarios para la multiplicación eficiente de virus. Aquí documentamos la generación de un LCMV recombinante codificando una nucleoproteína (NP) que contiene una etiqueta de afinidad (rLCMV/Step-NP) y su uso para capturar el interactoma NP en células infectadas. Nuestro enfoque proteómico combinado con la genética y los ensayos de validación farmacológica identificaron a ATPasa Na(+)/K(+) transportando subunidad alfa 1 (ATP1A1) y prohibin (PHB) como factores provirales. Ensayos basados en células revelaron que ATP1A1 y PHB están involucrados en diferentes pasos del ciclo de vida del virus. En consecuencia, observamos un efecto inhibidor sinérgico en la multiplicación de LCMV con una combinación de inhibidores ATP1A1 y PHB. Demostramos que los inhibidores ATP1A1 suprimen la multiplicación del virus Lassa y Candid#1, una cepa vacunal atenuada viva del virus Junín, sugiriendo que el requisito de ATP1A1 en la multiplicación del virus se conserva entre los mammarenavirus genéticamente relacionados distantemente. Nuestros hallazgos sugieren que los inhibidores clínicamente aprobados de ATP1A1, como digoxina, podrían ser reutilizados para tratar infecciones por mammarenavirus patógenos para los seres humanos. Texto: Introducción Los Mammarenavirus (Arenaviridae: Mammarenavirus) causan infecciones crónicas de roedores en todo el mundo [1]. La invasión de viviendas humanas por roedores infectados puede resultar en infecciones humanas a través de la exposición mucosal a aerosoles o por contacto directo de la piel abrazada con material infeccioso. Varios mammarenavirus causan fiebres hemorrágicas virales (VHF) en los seres humanos y plantean importantes problemas de salud pública en sus áreas endémicas [2] [3] [4] [5] [6]. Los Mammarenavirus se clasifican en dos grupos principales, Viejo Mundo (OW) y Nuevo Mundo (NW) [1]. El virus OW Lassa (LASV), agente causal de la fiebre de Lassa (LF), es el patógeno OW mammarenaviral más significativo. Se estima que el virus LASV infecta a varios cientos de miles de individuos anualmente en África Occidental, resultando en un alto número de casos de LF asociados con alta morbilidad y letalidad. Además, las regiones endémicas de LASV se están expandiendo [7], y la asociación del virus recientemente identificado de la mammarenavirus Lujo con un brote de VHF en África Meridional [8, 9] ha suscitado preocupación por la aparición de nuevos virus de la VHF que causan la mammarenavirus. El virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) distribuido por todo el mundo es un patógeno humano descuidado de importancia clínica, especialmente en infecciones congénitas [11] [12] [13] [14] [15]. Además, la LCMV representa una amenaza especial para los individuos inmunocomprometidos, como se ha demostrado en casos mortales de infección por LCMV asociada a trasplantes de órganos [16, 17]. Sin embargo, la investigación de LCMV puede realizarse de forma segura en la contención BSL-2, en lugar de la contención BSL-4 necesaria para la investigación en vivo de LASV o JUNV [18]. No existen vacunas con licencia de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los Estados Unidos para el tratamiento de infecciones por arenavirus, aunque una cepa de vacuna viva atenuada de JUNV, Candid#1, está autorizada en Del mismo modo, la terapia actual contra el antimammarenavirus se limita a un uso offlabel de la ribavirina analógica nucleósida que es sólo parcialmente eficaz y puede causar efectos secundarios significativos [19] [20] [21]. El desarrollo de fármacos antimammarenavirus eficaces se ha visto obstaculizado por la falta de comprensión detallada de las interacciones virus/células huésped necesarias para la multiplicación del virus de la mammarena que podrían representar objetivos sensibles para la terapia antiviral. el problema potencial que la sobreexpresión de un único gen viral puede potenciar interacciones PPI que no son relevantes durante el curso de una infección por virus natural. Para superar este problema, diseñamos un LCMV recombinante (rLCMV) codificando un tándem [WSHPQFEK (GGSGS) 3 WSHPQFEK] Strep-tag fusionado a los amino-terminales de Para facilitar la identificación de PPI específico entre NP y proteínas de células huésped, utilizamos nuestra plataforma trisegmentada (r3) del mammarenavirus [30] para diseñar un r3LCMV expresando una versión C-terminal Strep-tag de proteína fluorescente verde mejorada (r3LCMV/eGFP-Strep) que usamos como control negativo (Fig 1A y 1B). Rescatamos rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep y confirmamos la expresión de NP y eGFP estreñidos en células infectadas por rLCMV/strep-NP y r3LCMV/eGFP, respectivamente (Fig 1C). A continuación, examinamos las propiedades de crecimiento de las células rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep en tres líneas celulares diferentes de hámsteres, humanos y primates no humanos (Células BHK-21, A549 y Vero E6, respectivamente) (Fig 1D). La aptitud de las cepas rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep disminuyó modestamente en comparación con la observada con cepas de tipo salvaje (WT) Armstrong (rLCMV ARM) y Clone 13 (rLCMV Cl-13) de LCMV. Sin embargo, tanto rLCMV/Strep-NP como r3LCMV/eGFP-Strep tenían cinética Al igual que con WT LCMV, la infección con rLCMV/Strep-NP impidió la producción de IFN-I bioactivo por las células en respuesta a la infección por el virus Sendai (SeV) determinada utilizando un bioensayo IFN basado en la protección contra el efecto citopático (ECP) inducido por la infección por el virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Fig 1E). Las células Vero tratadas durante 16 h con sobrenadantes cultivados en el tejido (TCS) de células A549 infectadas primero con WT LCMV o rLCMV/Strep, seguidas de una infección de 24 h con SeV, siguieron siendo totalmente susceptibles a la EPC inducida por VSV. Por el contrario, las células Vero tratadas con SCT de células A549 infectadas con rLCMV/NP(D382A), mutante incapaz de prevenir la inducción de IFN-I [30], y posteriormente con SeV, fueron protegidas contra la EPC inducida por VSV. Seleccionamos la línea celular humana A549 porque las células epiteliales pulmonares son uno de los objetivos iniciales de las células humanas tras la inhalación de mammarenavirions. Infectamos las células A549 (multiplicidad de infección [MOI] = 0,1) con rLCMV/Strep-NP o r3LCMV/eGFP-Strep (Fig 2A). A las 48 h post-inoculación (pi), preparamos lysatos celulares totales para ensayos de tracción (PD) utilizando una resina de sepharose Los alícuotas de los complejos proteicos presentes en las muestras de PD fueron fraccionados por electroforesis de gel dodecil-poliacrilamida (SDS-PAGE) (Fig 2B) seguida de tinción de gel proteínico rubí SYPRO. Comparamos el patrón de bandas proteicas manchadas detectadas entre rLCMV/Strep-NP- y r3LCMV/eGFP-Strepinfectadas y confirmamos la presencia de Strep-NP y eGFP-Strep en muestras pertinentes (Fig 2B). Los complejos proteicos en el resto de los eluatos de las muestras de PD fueron concentrados por precipitación de ácido tricloroacético (TCA) y sometidos a digestión de tripsina (Fig 2A). Los péptidos digeridos fueron sometidos a un análisis de espectrometría de masa de cromatografía líquida-tandem (LC-MS/MS) utilizando un espectrómetro de masa híbrido consistente en iones cuádrupoles lineales de doble célula (LTQ) Velos y un analizador de Orbitrap. Clasificamos proteínas de células huésped identificadas por el análisis de células huésped-LC-MS/MS de dos réplicas biológicas independientes en dos grupos: 1) proteínas encontradas únicamente en muestras de Strep-NP PD con al menos cinco recuentos espectrales (Tabla 1) y 2) proteínas encontradas en muestras de Strep-NP y eGFP-Strep PD con cinco o más recuentos espectrales en muestras de Strep-NP y al menos dos veces mayores en recuentos espectrales en muestras de Strep-NP PD en comparación con muestras de eG Entre las 53 proteínas presentes en las muestras de NP- y eGFP-PD, 36 tenían recuentos espectrales en la muestra de NP-PD que fueron menos de dos veces mayores que sus correspondientes recuentos espectrales en la muestra de eGFP-PD (Fig 2C y S1). Con base en los criterios descritos anteriormente, consideramos que estas proteínas son altamente improbables interactores específicos con una implicación en el ciclo de vida del LCMV, y por lo tanto no consideramos estos resultados para un análisis posterior. Sin embargo, reconocemos que no podemos descartar formalmente que algunos de estos impactos aún pudieran jugar un papel en el ciclo de vida del LCMV. La anotación proteica mediante la clasificación de la familia de proteínas (PANTHER) por relación evolutiva (Proceso Biológico) de los candidatos a la proteína interactuante del NP reveló que un gran número de proteínas estaban involucradas en También analizamos las funciones moleculares de los candidatos a proteínas NP-interactuantes según la clasificación del perfil proteico PAN-THER (Fig 2E), que reveló funciones bioquímicas diversificadas enriquecidas para proteínas de unión ácida nucleica y chaperonas. Para evaluar inicialmente los roles pro o antivirales de las proteínas de células huésped NP-interactuantes identificadas por LC-MS/MS, examinamos el efecto del pequeño ARN interferente (siRNA) mediado por kd (kd) de cada uno de los genes correspondientes sobre la multiplicación de rLCMV que expresa el gen reportero ZsGreen (ZsG) en células A549 (Fig 3A). Los siRNAs que utilizamos eran de la biblioteca de siRNA humana ON TARGET-Plus (OTP) (18,301 genes, 4 Los efectos fuera de blanco son impulsados principalmente por la actividad de semilla de microARN (miR) de cadena antisensible. En los OTPs, la cadena de sentido se modifica para favorecer la captación de cadena antisensible mientras que la región de semilla de cadena antisensible se modifica para reducir drásticamente la desecación relacionada con la semilla [33]. Además, las OTPs están diseñadas sobre la base del algoritmo SMARTselection (Dharmacon), ampliamente considerado como el mejor algoritmo para la estrategia de diseño racional de siRNA. Numerosos factores de células huésped mostraron un efecto anti-LCMV (aumento de la expresión ZsG por kd de los genes), incluyendo la proteína 1B asociada al microtúbulo (MAP1B) [ [38], el virus del dengue 2 (DEV-2) [39], y el virus chikungunya (CHIKV) Para comenzar a evaluar las posibles implicaciones biológicas de las interacciones de proteína de NP-anfitriona identificadas, se seleccionó ATP1A1 y PHB dada la disponibilidad de reactivos, el conocimiento existente sobre sus roles en la fisiología celular y la evidencia de participación en la multiplicación de otros virus. Se confirmó que las células transfectadas con siRNA específicos de ATP1A1 y PHB exhibieron los niveles reducidos predichos en la expresión de proteína de ATP1A1 y PHB (Fig 3B). Asimismo, se examinó si los niveles de expresión reducida mediada por siRNA de ZsGreen correlacionados con los títulos de progenie de LCMV reducidos. Para ello, se infectaron las células A549 con expresión dirigida a siRNA de proteínas estreñidas. A549 células sembradas (5,0 x 10, A las 48 h, se prepararon lisatos celulares totales y se analizó la expresión de proteínas mediante el borrado occidental. (D) Propiedades de crecimiento de rLCMV que expresaba proteínas etiquetadas con estreptococos. BHK-21 (1,75 x 10 5 células/pozo), A549 (1,25 x 10 5 células/pozo), o Vero E6 (1,25 x 10 5 células/pozo) células sembradas en placas de 24 pozos y cultivadas durante la noche (MOI = 0,01) con los rLCMV indicados. En los momentos indicados, se recogieron los TCSs y se determinaron los títulos del virus por IFFA. Los resultados representan un promedio ± DE de los resultados de tres experimentos independientes. (E) Falta de inducción de IFN-I en células infectadas con rLCMV/Estreptocope-NP. Las células A549 fueron infectadas (MOI = 0,1) con el rLCMV indicado o el simulacro de infección, y 36 h más tarde infectadas con SeV (MOI = 1). A las 24 h pi con SeV, se recogieron y utilizaron TCS, tras la inactivación del virus por U.V., para tratar células Vero E6 durante 16 h, seguidas de infección con rVSV (MOI = 0,1) [rVSV(+)] o simulanfección [rVSV (-) ]. A las 24 h pi con rVSV, las células fueron fijas con 4% de PFA y manchadas con violeta cristalina para evaluar el efecto citopático inducido por rVSV. Utilizamos como control rLCMV/NP(D382A) que contiene mutación D382A dentro de NP, lo que ha demostrado la https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006892.g001 ATP1A1 o con NC siRNA 72 h antes de la infección con rLCMV/ZsG. Encontramos que siRNAmediated kd de ATP1A1 inhibió dramáticamente la expresión ZsGreen (Fig 3Ci), que se asoció con una reducción significativa de la progenie de LCMV infecciosa (Fig 3Cii). Nuestros intentos de ver la interacción entre NP y ATP1A1 o NP y PHB por coinmunoprecipitación no tuvieron éxito. Varias posibilidades podrían explicar esto, incluyendo interacciones de baja afinidad o alta tasa de encendido/apagado o ambas. Otra consideración es que sólo una fracción menor de NP podría estar involucrada en la interacción con una proteína de célula huésped dada, y por lo tanto, la detección de estas interacciones requeriría métodos altamente sensibles como LC-MS/MS. Para superar este problema utilizamos microscopía confocal para examinar la colocalización de NP con ATP1A1 y PHB en células infectadas con LCMV. Coeficientes de colocalización ponderados (CC), determinados tomando en consideración el brillo de cada señal de canal, fueron significativamente más altos que los CC no ponderados, lo que indica la presencia de píxeles más brillantes en las regiones colocalizadas en comparación con las regiones no colocalizadas (Fig 4). El glucósido cardíaco ouabaína es un inhibidor de ATP1A1 que se ha utilizado para tratar la insuficiencia cardíaca congestiva en países europeos [41]. El inhibidor de la PHB rocaglamida es una flavaglina de un árbol de Aglaia utilizado en la medicina tradicional china [42] que tiene una potente actividad anticancerosa [43]. Para examinar si la inhibición farmacológica de ATP1A1 o PHB inhibió la multiplicación de LCMV, pretratamos a seres humanos (A549 y HEK 293T), primates no humanos (Vero E6) y roedores (células murina L929 y hámster BHK-21) con ouabaína o rocaglamida y las infectamos con rLCMV/eGFP (S1 Fig). El tratamiento con ouabaína dio lugar a una fuerte inhibición dependiente de la dosis de expresión eGFP en células de primates humanas y no humanas infectadas, pero no afectó a la intensidad de expresión de eGFP en células de roedores Este hallazgo es consistente con roedores que expresan un alelo ATP1A1 resistente a la inhibición de la ouabaína [44]. Asimismo, observamos una inhibición dosis-dependiente de la expresión de la rocaglamida de eGFP en todas las líneas celulares infectadas con rLCMV/eGFP (S1B fig). De acuerdo con estos hallazgos, la producción de progenie de LCMV infecciosa se redujo mediante tratamiento con ouabaína o rocaglamida (fig. 5A) dentro de un rango de concentración que tuvo un impacto mínimo en la viabilidad celular (fig. 5B). Para examinar la correlación entre eficacia y citotoxicidad de estos compuestos, se determinó su índice terapéutico (TI = CC 50 /IC 50 (Fig 5Bi) ; mientras que rocaglamida tenía TI > 105 (CC 50 > 1000 nM, IC 50 = 9,51 nM) y 10,3 (CC 50 = 100 nM, IC 50 = 9,75 nM) en células A549 y Vero E6, respectivamente (Fig 5Bii). Además, el inhibidor antagonista de la ATP1A1, la bufalina, también mostró una fuerte actividad anti-LCMV con TIs de 8,92 (CC 50 Proteína de choque térmico HSP 90-alfa HSP90AA1 P07900 8 10 9 Endoplasmina HSP90B1 P14625 9 9 9 Gran aminoácidos neutros transportador pequeña subunidad 1 SLC7A5 Q01650 6 12 9 Queratina, tipo II cuticular Hb1 KRT81 Q14533 10 8 9 Helicasa Putativa MOV-10 MOV10 Q9HCE1 8 10 9 Proteína asociada a microtúbulos 1B MAP1B P46821 6 11 8,5 Cadena beta de espectro, rocaglamida (100 nM) (Fig 5C), además de apoyar una actividad anti-LC Para obtener información sobre los mecanismos por los que la ouabaína y la rocaglamida ejercen su actividad anti-LCMV, examinamos los efectos de estos compuestos en diferentes etapas del ciclo de vida de la LCMV. Primero, preguntamos si la ouabaína y la rocaglamida afectaban la entrada celular de la LCMV. Realizamos experimentos de tiempo de adición en los que tratamos a las células con ouabaína o rocaglamida antes de la inoculación viral (-1,5 h), en el momento de la inoculación (0 h), o 1,5 h pi (+1,5 h) (Fig 6A). En algunas muestras, utilizamos cloruro de amonio a partir de 4 h pi para bloquear múltiples rondas de infección viral. El tiempo de adición de compuestos no cambió significativamente el número de células positivas de la eGFP, lo que indica que ni la ouabaína ni la ro El número de células eGFP + en células tratadas con ouabaína se redujo en todos los puntos de adición en comparación con las células tratadas con dimetilsulfóxido (DMSO) del vehículo, pero fue similar al observado en células tratadas con cloruro de amonio. Por lo tanto, la ouabaína no inhibió la replicación y la expresión génica del ARN LCMV, sino más bien un paso tardío del ciclo de vida del LCMV. En contraste, el tratamiento con rocaglamida resultó en un número insignificante de células eGFP +, lo que indica que la rocaglamida inhibió la replicación y transcripción génica del ARN viral. Para investigar más a fondo el efecto de la ouabaína y la rocaglamida sobre la síntesis de ARN viral, infectamos células A549 con una LCMV infecciosa recombinante de un solo ciclo que expresaba e Setenta y dos horas más tarde, determinamos el porcentaje de expresión eGFP normalizada en células infectadas (Fig 6B). De acuerdo con nuestros resultados del experimento de tiempo de adición, la ouabaína no afectó la expresión eGFP de reportero. Sin embargo, la rocaglamida redujo la expresión eGFP, confirmando el efecto inhibidor de la rocaglamida en la síntesis de ARN del virus. También examinamos el efecto de la ouabaína y la rocaglamida en el último paso del ciclo de vida del virus de arena, la germinación mediada por Z. Para este experimento, transfectamos células con Z-Estrep- y Z-FLAG (epítopo de DYKDDK) que expresan los plásmidos de LCMV y LASV, respectivamente. A las 24 h después de la transfección, eliminamos el cultivo de tejido supernadante ( Cultivamos las células transfectadas en presencia o ausencia de ouabaína o rocaglamida. A las 24 h, determinamos por niveles WB de proteína Z tanto en lisatos celulares enteros y asociados con partículas víricas (VLPs) recolectadas de TCS. El tratamiento con rocaglamida, pero no con ouabaína, causó una reducción en la eficiencia de brotes de Z LCMV y LASV (Fig 6C y 6D). La reproducibilidad de estos hallazgos se confirmó a partir de los resultados de cuatro experimentos independientes (Fig 6E). También examinamos si la ouabaína podría interferir con un paso de ensamblaje de progenie infecciosa que no fue capturado por el ensayo de brotes Z a través de dos experimentos adicionales. El primer experimento consistió en el uso de una recién generada LCMV infecciosa recombinante de ciclo único que expresaba el gen reportero ZsGreen (scrLCMV/ZsG-P2A-NP) para infectar (MOI = 0,1) células A549 (1 st infección). Estas células fueron posteriormente transfectadas con un plásmido que expresaba LCMV GPC. Después de 24 h, usamos TCS para infectar una monocapa de células frescas (2 nd infección) e identificamos células infectadas basadas en la expresión ZsGreen. Para evaluar el efecto de la ouabaína en el ensamblaje de novo de progenie infecciosa determinamos proporciones normalizadas (2 nd /1 st infección) de células ZsGreen + (Fig 6F). El segundo experimento involucró infección (MOI = 0,1) de células con WT LCMV, y 48 h más tarde lavamos células infectadas tres veces para eliminar la progenie infecciosa extracelular producida durante las primeras 48 h de infección. Luego, se añadieron medios frescos que contenían ouabaína o control de vehículos DMSO, y 24 h más tarde determinamos títulos de virus en TCS (Fig 6G). Los resultados de ambos experimentos mostraron consistentemente que la ouabaína no inhibió el ensamblaje de novo del virus infeccioso extracelular. La terapia combinada puede aliviar significativamente el problema planteado por la rápida aparición de variantes farmacorresistentes comúnmente observadas durante las estrategias de monoterapia para controlar las infecciones por el virus ARN. Puesto que la ouabaína y la rocaglamida inhibieron diferentes pasos del ciclo de vida de LCMV, examinamos si su Para este experimento, infectamos células A549 con rLCMV/eGFP y las tratamos con ouabaína y rocaglamida utilizando diferentes concentraciones y combinaciones. A las 48 h pi, determinamos el porcentaje de expresión eGFP (Fig 7). El tratamiento combinado con ouabaína y rocaglamida dio lugar a una actividad anti-LCMV sinérgica que se realzó en condiciones utilizando concentraciones más altas de ouabaína y concentraciones más bajas de rocaglamida. Luego preguntamos si los factores de células hospedantes ATP1A1 y PHB contribuyeron también a la multiplicación de la fiebre hemorrágica viral causante de LASV. Tratamos células A549 con ouabaína, bufalina o rocaglamida e inoculamos las células tratadas con eGFP (rLASV/eGFP). Al igual que la infección por rLCMV, la multiplicación por LASV se restringió en células tratadas con ouabaína, bufalina o rocaglamida a concentraciones que afectaban mínimamente a la viabilidad celular, aunque sus valores IC 50 fueron ligeramente superiores a los encontrados con el sistema de infección por LCMV (Fig 5B y S2 Fig) ya que la ouabaína tenía IC 50 de 9,34 nM, la bufalina tenía IC 50 de 1,66 nM y la rocaglamida tenía IC 50 de 37,0 nM (Fig 8). También probamos el efecto de compuestos dirigidos a ATP1A1 y PHB sobre la multiplicación de JUNV. De acuerdo con nuestros resultados obtenidos con LCMV y LASV, ouabaína, bufalina y rocaglamida fuertemente suprimida multiplicación por JUNV (S3 Fig). Estos hallazgos indican que ATP1A1 y PHB funcionan como factores provirales de una gama de mammarenavirus. Identificamos ATP1A1 y PHB como proteínas novedosas de células huésped que contribuyen a la multiplicación eficiente de los mammarenavirus. Nuestro enfoque utilizando un LCMV recombinante que expresa NP con una etiqueta de afinidad facilitó la definición del interactoroma NP en el contexto de la infección por LCMV. Recientemente, utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb) específico de NP para precipitar NP y socios de proteínas celulares asociados en un interactoroma NP de mammarenavirus, King et al. identificaron 348 proteínas huésped que se asocian con LCMV NP [45]. Encontramos 99 proteínas comunes entre nuestro interactoroma LCMV NP filtrado de 171 proteínas y el interactoroma NP de LCMV documentado por King Las diferencias tanto en las condiciones experimentales como en las metodologías de análisis utilizadas para generar el interactoma NP de LCMV documentado por King et al. y nuestra probable h post-transfección, las células fueron lavadas con medios frescos para eliminar la producción mediada en Z de VLP en ausencia de tratamiento compuesto, y cultivadas para otras 24 h en medios frescos en presencia de ouabaína o Roc-A en las concentraciones indicadas. Los VLP presentes en TCS fueron recolectados por ultracentrifugación, y se prepararon lisatos celulares. La expresión de la proteína Z en VLPs y lisatos celulares fue determinada por manchas occidentales utilizando anticuerpos a Strep-tag (C) y FLAG-tag (D). La eficiencia de Budding para cada muestra fue estimada dividiendo la intensidad de señal de la proteína Z asociada con VLPs por la de Z detectada en la lisato celular. Los números en la parte inferior del panel C corresponden a las eficiencias de brotes LCMV Z determinadas en un experimento representativo. Los resultados mostrados en el panel E corresponden a la media y SD de cuatro experimentos independientes incluyendo el mostrado en el panel D. La eficiencia media de brotes de muestras de DMSO fue fijada al 100%. Los datos representan la media ± DE de cuatro experimentos independientes. (F) Efecto de la ouabaína en la incorporación de glicoproteína viral en viriones. Las células 293T sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pozos y cultivadas durante la noche fueron infectadas (MOI = 0,1) con SCLCMV/ZsG (1 st infección) durante 2 h y posteriormente transfectadas con 0,5 μg de pC-GPC. A las 24 h pi, las células se lavaban con medio fresco para eliminar la partícula vírica infecciosa producida en ausencia de tratamiento compuesto, y se cultivaban para otras 24 h en medio fresco en presencia de ouabaína a 40 nM (OUA). A las 48 h pi, se recogía TCS y se utilizaba para infectar la monocapa fresca de células BHK-21 (2 nd infección) sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pocillos 1 día antes de la infección, y se preparaba el lisato de células 293T. 24 h más tarde, se preparaba el lisato de células BHK-21. ZsLa intensidad de la señal verde se midía mediante un lector de placas fluorescente. La eficiencia de la incorporación de GP se estimaba dividiendo la intensidad de la señal verde en el lisato de células BH La eficiencia media de la incorporación GP de las muestras tratadas con DMSO se estableció al 100%. Los datos representan medios ± DE de tres experimentos independientes. Contribuyeron a las diferencias observadas entre los conjuntos de datos. A pesar del progreso en la implementación de pantallas globales basadas en proteómicas para identificar interacciones proteína-proteínas portadoras de virus, la superposición entre conjuntos de datos para el mismo sistema viral es generalmente limitada. Sin embargo, la superposición sustancial de 99 de las 171 proteínas interactuantes NP de ambos estudios apoya la confiabilidad global de ambos sistemas. Utilizamos los resultados del interactoroma eGFP-estrep, determinado en células infectadas por r3LCMV/eGFP-estrep, como un control para filtrar interacciones NP no específicas, lo que puede haber resultado en un mayor grado de rigor que en el estudio de King et al. para la selección de candidatos interactuantes NP. y el que presentamos en este trabajo, facilitará estudios futuros para caracterizar aún más las implicaciones funcionales y biológicas de las proteínas interactuantes de las células huésped-NP. Todos los NPs de mammarenavirus probados, con excepción del NP de TCRV, bloquearon la inducción IFN-I dependiente de IRF-3 [25, 46]. La actividad anti-IFN de NP se mapeó a su parte C-terminal y se vinculó al dominio de exonucleasasa de 3'-5' presente con la parte C-terminal de NP [30]. Inhibidor-B quinasa Nosotros, así como el trabajo de King et al. [45], no detectamos esta interacción NP-IKK. Esta discrepancia puede haber sido causada por una expresión muy baja de IKK-IKK- en células infectadas por LCMV, lo que impidió la detección de IKK-MS/MS. Alternativamente, la interacción NP-IKK-IKK- puede ser regulada temporalmente y tener lugar en tiempos tempranos pi, pero podría estar mayormente ausente a las 48 h pi, el momento en el que preparamos los lisatos celulares para nuestros estudios proteómicos. Estudios futuros comparando el interactoroma NP en diferentes momentos durante la infección contribuirán a una mejor comprensión de la dinámica de las interacciones proteína NP/antocélulas. Na + /K + -ATPasa es un transportador de iones de membrana bien caracterizado y está compuesto por dos subunidades funcionales (α y β) y una subunidad regulatoria γ [48]. ATP1A1 representa una de las cuatro subunidades α [49, 50]. Evidencia reciente ha sugerido que la Na + /K + -ATPasa está involucrada en múltiples vías de señalización celular que son independientes de su función de bombeo de iones [51]. Los inhibidores glucósidos cardíacos de la Na + /K + -ATPasa (NKA), llamados esteroides cardiotónicos (CST; por ejemplo, ouabaína, bufalina), han demostrado inhibir la multiplicación de diferentes virus, incluyendo virus del Ébola [35], coronavirus [36], herpes simplex virus 1 [52, 53], CHICKV [54], virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) [55], adenovirus [56] y virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino 1 [57]. Es probable que diferentes mecanismos contribuyan a la actividad antiviral de los CST, incluyendo funciones celulares alteradas moduladas por la actividad de señalización de Na + /K + -ATPasa [58]. Por lo tanto, una baja concentración de ouabaína induce un cambio conformacional en ATP1A1 que resulta en la activación y liberación de proto-oncogen tirosina proteína quinasa, Src, de ATP1A1, seguido de la activación de señales aguas abajo aún desconocidas que inhibe, por ejemplo, la entrada celular del virus de la hepatitis murina (MHV) [59]. Sin embargo, nuestros resultados indicaron que la ouabaína no interfirió con la entrada de células LCMV. Además, el tratamiento con el inhibidor de Src 4-amino-5-(4-metilfenil)-7-(t-butil)pirazolo [3,4-d] pirimidina (PP1) no contrarrestó la actividad anti-LCMV de ouabaína (S4 fig). Sin embargo, la señalización de SRC mediada por ATP1A1 podría contribuir de manera plausible al efecto inhibidor de la ouabaína en la multiplicación de JUNV como similar a la observada con MHV. Además, la entrada celular de JUNV se produce también por endocitosis mediada por clatrina [60], un proceso afectado por la señalización de Src. Ouabain se ha utilizado clínicamente en varios países europeos para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca congestiva, mientras que la bufalina se ha probado en ensayos clínicos para tratamientos contra el cáncer [61], y la digoxina CST ha sido aprobada por la FDA desde 1997 para tratar la insuficiencia cardíaca y la fibrilación auricular. El inhibidor de la PHB, rocaglamida, parecía interferir con la síntesis y el brote de ARN LCMV, pero no afectó la entrada de células LCMV. En contraste, se informó que la PHB era un receptor de entrada celular para DENV-2 [39] y CHIKV [40]. Por otro lado, la PHB no actuó como receptor de entrada de células virales para VHC. Más bien, la PHB contribuyó a la entrada de células VHC a través de la unión a RAF celular (c-Raf; proto-oncogene serina/treonina-proteína cinasa) y posterior activación del sarcoma de rata Harvey proto-oncogene (HRas) que induce una vía de transducción de señal requerida para la entrada de células VHC mediadas por el factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [37] Además, el kd mediado por siRNA de PHB disminuyó la producción de FLUAV H5N1 [38]. Estos hallazgos indican que el PHB está involucrado en diferentes etapas del ciclo de vida de una variedad de virus, y por lo tanto un blanco atractivo para el desarrollo de fármacos antivirales de amplio espectro. Rocaglate es un grupo de compuestos naturales, que incluye rocaglamida, que inhibe la síntesis de proteínas al apuntar al factor 4A de iniciación eucariota 4A (eIF4A) de la caja DEAD-ATP y ejerce actividad antitumoral [62, 63]. El compuesto de rocaglate, silvestrol, inhibe la multiplicación del virus del Ébola probablemente interfiriendo con el papel de eIF4A en la traducción de proteínas virales [64]. Mientras nos centramos en dos proteínas huésped, ATP1A1 y PHB, en este estudio, nuestro enfoque proteómico también identificó varias proteínas de células huésped interactuantes de NP cuya expresión kd a través de siRNA resultó en una multiplicación aumentada de LCMV. Estas proteínas, que incluyen MAP1B, podrían tener actividad anti-LCMV. MAP1B ha demostrado unirse a proteínas no estructurales 1 (NS1) y 2 (NS2) del virus sincitial respiratorio humano (HRSV) [34]. NS1 y NS2 de HRSV antagoniza la respuesta del huésped IFN-I al reducir los niveles de receptor de TNF asociados a factor (TRAF3), IKKel (NS1) y STAT2 (NS2) [65]. La interacción NS2-MAP1B interfirió con la capacidad de NS2 de HRSV para reducir los niveles de STAT2, mientras que el papel de la interacción NS1-MAP1B está por determinar [34]. Examinando el papel de la interacción NP-MAP1B en la modulación de la capacidad de NP para inhibir la inducción de tipo I IFN es de interés. Se identificó entre las proteínas de las células huésped interactuantes NP el virus de la leucemia de Moloney ARN 10 (MOV10), que ha sido reportado como un factor antiviral para FLUAV [66], retrovirus [67] [68] [69] [70] [71], y DENV-2 [72]. No observamos un aumento de la multiplicación de LCMV en células sometidas a kd mediadas por siRNA de MOV10, un hallazgo Sin embargo, consideramos que LCMV ya tiene una multiplicación óptima en células A549 y otros aumentos pueden ocurrir sólo en condiciones más bien únicas. MOV10 fue demostrado para mejorar la inducción IRF-3 mediada por IFN-I después de la infección por SeV a través de una unión de tanque quinasa 1 (TBK1)-independiente e IKK El CCT mamífero es crítico para el plegado de muchas proteínas con funciones importantes en diversos procesos celulares [74], y puede proteger las topologías de proteínas complejas dentro de su cavidad central durante la biosíntesis y el plegado [75]. La contribución de los miembros del CCT al ensamblaje del NP en una estructura nucleocápsida podría explicar su presencia en el NP, pero no en el eGFP, interactoma. Curiosamente, los miembros del CCT han sido implicados en la multiplicación de diferentes virus incluyendo virus de la rabia [76, 77], VHC [78] y FLUAV [79]. Sin embargo, el papel de estas proteínas del CCT en la multiplicación del virus sigue siendo desconocido y puede implicar funciones distintas de actuar como chaperonas moleculares. Estudios anteriores documentaron la presencia de varios componentes de la eIF4F, incluyendo 4A, dentro de los complejos de replicación viral-transcripción (RTC) detectados en células infectadas con LCMV [80] y TCRV [81]. Estos hallazgos, junto con la detección de una serie de proteínas ribosómicas en el interactoroma NP, sugieren que la traducción de mRNA virales puede tener lugar dentro de RTC. Sin embargo, la interferencia de rocaglamida con la actividad de eIF4A dentro de la RTC viral podría contribuir a su actividad anti-LCMV. En este trabajo, documentamos la generación de rLCMV/Strep-NP y su uso para definir el NP-interactoma en células infectadas. Presentamos evidencia de que ATP1A1 y PHB contribuyen a la multiplicación eficiente de mammarenavirus utilizando genética De acuerdo con nuestros hallazgos, el análisis bioinformático reveló que la red proteica asociada con ATP1A1 y PHB involucra a proteínas de células huésped con funciones en procesos biológicos que han sido implicados en la multiplicación del virus (S5 Fig). El enfoque experimental general descrito aquí puede facilitar la identificación de proteínas de células huésped interactuantes de NP biológicamente relevantes. Estudios futuros que elucidan los roles de los factores de células huésped pro y antivirales identificados en este estudio en la multiplicación del mammarenavirus avanzarán en nuestra comprensión de las múltiples funciones de NP y descubrir nuevos objetivos celulares para el desarrollo de fármacos antimammarenavirales. Además, al identificar factores de células huésped provirales, los fármacos que ya están aprobados pueden ser repurposing como terapéuticos para combatir infecciones por mammarenavirus patógenos humanos. El riñón de hámster BHK-21 (American Type Culture Collection, ATCC, CCL-10), el ratón de casa L929 (ATCC CCL-1), el grivet Vero E6 (ATCC CRL-1586), el A549 humano (ATCC CCL-185) y las células humanas HEK 293T (ATCC CRL-3216) se cultivaron en el medio de águila modificado de Dulbecco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) que contenía un 10% de suero fetal de bovino inactivado térmicamente, 2 mM de L-glutamina, 100 mg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina a 37°C y 5% de CO2. Los LCMV recombinantes WT, Armstrong (rLCMV ARM) y clon-13 (rLCMV Cl Se describió la generación de rLCMV/NP(D382A) y SeV, cepa Cantell, [30, 82, 83 ]. Un rLCMV sin GPC y expresando eGFP (rLCMVΔGPC/eGFP) fue generado por genética inversa utilizando procedimientos previamente descritos [84]. rLCMV/Strep-NP y r3LCMV/eGFP-Strep fueron generados por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMV WT y LCMV trisegmentados (r3LCMV) expresando eGFP [30]. Para la generación de estos nuevos rLCMVs, creamos pol1S Cl-13 plásmidos que dirigían síntesis intracelular mediada por Pol1 de especies de ARN del genoma S de LCMV recombinante codificando para NP o e El rLCMV que expresa eGFP (rLCMV/eGFP) se generó como se describe [85], y el rLCMV que expresa ZsGreen (rLCMV/ZsG) en lugar de eGFP fue generado por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMV/eGFP. Generación de rLASV que expresa eGFP (rLASV/eGFP) se describirá en otra parte. Para la generación de un nuevo rLCMV de ciclo único que expresa ZsGreen (scrLCMV/ZsG-P2A-NP), un plásmido pol1S fue creado por omitiendo el marco de lectura abierto de GPC (ORF) a partir del plásmido pol1S utilizado para la generación de rLCMV/ZsG. scrLCMV/ZsG-P2A-NP fue rescatado por genética inversa utilizando procedimientos similares para generar rLCMVΔGPC/eGFP [84]. Los títulos de LCMV se determinaron por inmunoenfoque formando ensayo (IFFA) como se describe [87]. Brevemente, se utilizaron diluciones en serie de 10 veces para infectar monocapas de células Vero E6 en una placa de 96 pocillos, y a Después de la permeabilización celular mediante tratamiento con tampón de dilución (DB) (0,3% Triton X-100 en PBS-conteniendo 3% de albúmina sérica bovina [BSA]), las células fueron manchadas con una rata mAb a NP (VL-4, Bio X Cell, West Lebanon, NH) conjugada con Alexa Fluor 488 (VL-4-AF488, Protein Labeling Kit, Life Technologies, Carlsbad, CA). Los títulos de VSV fueron determinados por un ensayo de placa. Los lisatos celulares totales se prepararon en el tampón de lisis PD (+) (250 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl [pH = 7,5], 0,5% TritonX-100, 10% glicerol, 1 mM de MgCl 2, 1 μM de CaCl 2, 1 μM de ZnCl 2 ) y se aclararon mediante centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. Los lisatos clarificados se mezclaron a una proporción de 1:1 con tampón de carga (100 mM de Tris [pH 6.8], 20% 2-mercaptoetanol, 4% SDS, 0,2% azul bromofenol, 20% glicerol) y hervidos durante 5 min. Las muestras de proteínas fueron fraccionadas por SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida de gradiente 4-20% (geles Mini-PROTEAN TGX 4-20%, Bio-Rad, Hércules, CA), y las proteínas fueron transferidas por electroblotting a membranas de difluoruro de polivinilideno (Membranas de Transferencia de Immobilina, Millipore, Billerica, MA). Para detectar proteínas etiquetadas con Strep, se reaccionaron membranas con anticuerpos monoclonales de ratón a Strep (QIAGEN, Germantown, MD), eGFP (Takara Bio USA, Mountain View, CA), GP 2 (We33/ 36), ATP1A1 (TehrmoFisher Scientific, Rockford, IL), PHB (Abcam, Cambridge, MA) o anticuerpos policlonales de conejo a α-tubulina (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) o gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, Millipore), respectivamente, seguidos de incubación con anticuerpos antimouse anti-peroxidasa apropiada y anti-rabbit inmunoglobulina G (IgG) (Jackson ImmunoInvestigation Laboratories, West Grove, SuperSignal West Pico o Femto sustrato quimioluminiscente (Thermo Fisher Scientific) se utilizó para obtener señales quimioluminiscentes que fueron visualizadas usando ImageQuant LAS 4000 Imager (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA). Retirada de proteínas estreptoscópicas del lisato celular infectado. A549 células preparadas en seis platos de 15 cm (aproximadamente 1,0 x 10 8 células en total) fueron infectadas con rLCMV/Step-NP o r3LCMV/eGFP en un MOI de 0,1. A las 48 h pi, las células fueron lavadas tres veces con PBS frío-hielo, raspadas en PBS frío-hielo fresco, y centrifugadas a 400 x g a 4°C durante 10 min. Se extrajo el sobrenadante y se lisaron células con 12 ml de tampón de lisis PD (+) complementado con un cóctel inhibidor de la proteasa y la fosfatasa de parada (Thermo Fisher Scientific) y 5 μg/ml de desoxiribonucleasa I (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ). El lisato se aclaró mediante centrifugación a 3,900 x g a 4oC durante 30 minutos para eliminar residuos celulares. El lisato celular clarificado fue incubado con resina de sefarosa estrep-tactina (QIAGEN) a 4oC. Después de 2 horas de incubación, la resina fue lavada tres veces con tampón de lisis PD (+) y una vez con tampón de lisis PD sin TritonX-100 ( tampón de Después de la centrifugación a 1.600 x g y 4oC durante 5 minutos, se eliminó el último tampón de lavado, y los complejos proteicos asociados con la resina se eludieron en 2 ml de tampón de lisis PD (-) que contenía 2,5 mM de destiobiotina. El eluato fue sometido a precipitación TCA seguido por digestión de tripsina. Microcolumna de tecnología de identificación de proteínas multidimensional. Se preparó una microcolumna MudPIT creando primero un frito Kasil en un extremo de un tubo capilar de diámetro exterior (OD) no desactivado (diámetro interior de 360 μm) (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). El frito Kasil se preparó sumergiendo brevemente un tubo capilar de 20-30 cm en 300 μl de Kasil 1624 solución bien mezclada de silicato potásico (PQ Corporation, Malvern, PA) y 100 μl de formamida, curándose a 100 °C durante 4 h, y cortando el frito a una longitud de %2 mm. Partículas fuertes de intercambio catiónico (SCX Luna, 5-μm diámetro, 125 Å poros, Phenomenex, Torrance, CA) se embalaron en la casa de las lonchas de partículas en metanol a 2,5 cm. Partículas de fase reversa (2 cm, C18 Aqua, 3-μm diámetro, 125 Å poros, Phenomenex) se embalaron sucesivamente en el tubo capilar utilizando el mismo método que la carga SCX. Análisis Mud Se generó una columna analítica de cromatografía líquida de fase inversa tirando de una punta de 100-μm (Diámetro Interior (ID) de 360 μm) de tubo capilar de OD (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) a 5-μm de ID. Las partículas de fase inversa (Luna C18, diámetro 3-μm, 125 Å poros, Phenomenex) se envasaron directamente en la columna arrastrada a 5,5 mPa hasta 15 cm de largo. La columna fue más embalada, lavada y descompuesta a 10 mPa con tampón B (80% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico) seguido de tampón A (5% acetonitrilo y 0,1% ácido fórmico). Las columnas de mudPIT y analíticas se montaron utilizando una unión de volumen cero muerto (Upchurch Scientific El análisis LC-MS/MS se realizó con una bomba LC de alta presión Agilent (Agilent) y una trampa de doble célula de iones cuadrúpolos lineal Orbitrap Velos (Thermo) utilizando una etapa de electrospray construida en la casa. El electrospray se realizó directamente desde la columna analítica mediante la aplicación del voltaje de ionización electrospray (ESI) a un tee (150 μm ID, Upchurch Scientific) directamente aguas abajo de un flujo dividido de 1:1.000 para reducir el caudal a 300 nl/min a través de las columnas. Se realizaron experimentos con mudPIT (10 pasos) en los que cada paso corresponde a 0, 10, 20, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100% tampón C (500 mM de acetato de amonio, 0,1% de ácido fórmico y 5% de acetonitrilo) y se ejecutó durante 3 minutos al comienzo de un gradiente de 110 minutos. Análisis de datos. Identificación de proteínas y péptidos se realizaron con Pipeline-IP2 (Aplicaciones proteómicas integradas, San Diego, CA. http://www. integratedproteomics.com/) utilizando algoritmos ProLUCID y DTASelect2. Parámetros de selección DTASelect fueron -p 2 -y 1-tripstat-pfp.01 -extra-pI-DB-dm-in. Los archivos en bruto de espectro se extrajeron en archivos ms2 de archivos en bruto utilizando el código abierto RawExtract 1.9.9 (Scripps Research Institute, La Jolla, CA; http://fields.scripps.edu/downloads.php), y los espectros de masa en tándem se buscaron en una base de datos de proteínas humanas (UniprotKB). Para estimar con precisión las probabilidades de péptidos y las tasas de falsos descubrimientos, se utilizó una base de datos de señuelos que contenía las secuencias inversas de todas las proteínas anexas a la base de datos de destino. Los espectros de masa en tándem se emparejaron con secuencias utilizando el algoritmo ProLUCID con tolerancia a las masas de péptidos de 600 ppm. Se consideró que la carbamidometilación (+57,02146 Da) de cisteína era una modificación estática. El cribado de siRNA A549 células (1.000 células/pozo) en una placa de 384-pozo se transfectó inversamente con 0,5 pmol de grupo de siRNA (S2 Table) dirigido a cada gen utilizando 0,1 μl de Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) (la concentración final de siRNA fue de 10 nM), seguido de incubación a 37°C y 5% de CO 2. A las 72 h de post-transfección, las células fueron infectadas (MOI = 0,05) con proteínas de rLCMV/ZsG. SiRNA objetivo de células huésped fueron seleccionadas en base a la disponibilidad de secuencias de siRNA validadas. Los siRNAs que usamos para examinar los efectos en la multiplicación de LCMV de la expresión noqueada de los golpes candidatos a proteína de la célula huésped interactuante NP correspondían al Genoma-ancho ON TAR-GET-Plus (OTP) Biblioteca de siRNA humana (18.301 genes, 4 siRNAs/gén; Dharmacon, Lafayette, CO). Las células A549 (3,0 x 10 4 células/bien) fueron transfectadas inversamente en una placa de 24 pozos con 6 pmol de piscinas de siRNA dirigidas a cada gen usando 1 μl de Lipofectamine RNAimax (concentración final de siRNA es 10 nM). A las 72 h post-transfección, el lisato celular total fue preparado en lisis modificada tampón A (25 mM Tris-HCl [pH = 8,0], 50 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1,25% desoxicolato sódico) y aclarado por centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. La concentración total de proteína de lisato celular clarificado fue medida por Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). La misma cantidad de proteína de cada muestra fue sometida a SDS-PAGE, y la expresión proteica de genes dirigidos a siRNA fue analizada por manchas occidentales. Después de la permeabilización celular mediante tratamiento con DB, las células fueron teñidas con 4',6-diamidin-2-fenilindol (DAPI). Las señales de fluorescencia verde (eGFP o ZsGreen) y DAPI fueron medidas por un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, Bio-Tek, Winooski, VT). Las células infectadas con mock y virus fueron fijas con 4 % de PFA. Después de la permeabilización celular y bloqueo mediante tratamiento con DB que contenía 1 % de suero normal de cabra, las células fueron incubadas con anticuerpos ATP1A1 o PHB de ratón primario seguidos por anticuerpos IgG antimouse secundario conjugados con Alexa Fluore 568 (antimouse IgG-AF56 En algunas muestras, se omitió el anticuerpo primario contra ATP1A1 o PHB para determinar la fluorescencia de fondo. Para visualizar los núcleos, se utilizó DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL) para montar los protectores en un vidrio deslizante. Se observaron células manchadas bajo un microscopio confocal (LSM 710, Zeiss) y datos analizados por el software ZEN (Zeiss). El análisis de co-localización se realizó sobre una base pixel por pixel utilizando el software Zen (Zeiss). Se marcaron ocho células verdes (NP-positivas) y se trazó cada píxel en el área marcada en el diagrama de dispersión basado en su nivel de intensidad de cada canal. Los umbrales de los canales verde y rojo se determinaron utilizando células infecciosas simuladas manchadas con anticuerpos VL-4-AF488 (anti-NP) y anti-ratón IgG conjugados con Alexa Fluor 568 sin utilizar anticuerpos anti-ATP1A1 o -PHB. A cada píxel se le asignó un valor de 1. Coeficientes de colocalización (CC) (o CC no ponderado) se determinaron dividiendo la suma de píxeles positivos tanto verdes como rojos por la suma de píxeles positivos verdes. Este cálculo se repitió para ocho células individuales. Para evaluar la especificidad de la colocalización, determinamos CC ponderado tomando en consideración el brillo de cada señal de canal. La comparación de los píxeles no ponderados y ponderados nos permitió determinar si había píxeles más brillantes en las regiones colocalizadas en comparación con las regiones no colocalizadas. Los valores de p se determinaron mediante un test de t emparejado de dos colas utilizando el software GraphPad Prism. Células A549 o Vero E6 sembradas (2,0 x 10 4 células/pozo) en una placa de 96 pocillos y cultivadas durante la noche se trataron con diluciones en serie de 3 veces a 37oC y 5 % CO 2 durante 2 h, seguidas de infección con rLCMV/eGFP (MOI = 0,01). Los compuestos estuvieron presentes en el punto final del estudio. A 48 h pi, las células se fijaron con un 4% de PFA en PBS, y la expresión eGFP fue examinada por un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Los valores medios obtenidos con células infectadas por DMSO y rL Las células A549 o Vero E6 sembradas en una placa de 96 pocillos (2,0 x 10,4 células/pozo) y cultivadas durante la noche fueron tratadas con diluciones en serie de 3 veces y cultivadas a 37oC y un 5% de CO 2 durante 48 h. Luego, se añadió el reactivo de solución CellTiter 96 AQ (Promega, Madison, WI). Posteriormente, el ensayo se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, y la absorbancia (490 nm) se obtuvo mediante un lector de ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) (SPECTRA max + 384; Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA). Los valores medios obtenidos con células tratadas con DMSO se fijaron al 100%. Las concentraciones de CC 50 se determinaron utilizando GraphPad Prism. Se generó un plásmido que expresaba la proteína Z estreptocada (pC-LCMV-Z-Strep) mediante un procedimiento similar para generar un plásmido que expresaba la proteína Z LASV (pC-LCMV-Z-FLAG) con la etiqueta C-terminal FLAG (pC-LASV-Z-FLAG), y el ensayo en ciernes se realizó como se describió anteriormente [88]. Las células (HEK 293T) en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 0,5 μg de vector pCAGGS vacío o pC-LCMV-Z-Strep o pC-LASV-Z-FLAG utilizando Lipofectamine 2000. A las 5 h de post-transfección, los medios fueron reemplazados por medios frescos e incubados a 37°C y 5% de CO 2 durante 19 Después de la eliminación del último medio de lavado, las células fueron cultivadas en medio fresco que contenía ouabaína (30 ó 40 nM) o rocaglamida (50 ó 100 nM) o concentración equivalente de DMSO, y 24 h más tarde, se recolectaron TCS y células que contenían partículas similares al virión (VLP). El lisato total de células fue preparado lisando las células con tampón de lisis (1% NP-40, 50 mM de Tris-HCl [pH 8,0], 62,5 mM NaCl, desoxicolato sódico al 0,4%). Después de aclarar el TCS de los desechos celulares mediante centrifugación a 400 x g y 4 °C durante 10 min, los VLP fueron recolectados por ultracentrifugación a 100.000 x g y 4 °C durante 30 min a través de un cojín de sacarosa Los VLP fueron resuspendidos en PBS, y la expresión Z en el lisato total de células y TCS (conteniendo VLPs) fueron analizados por manchas occidentales. Las células A549 infectadas con rLCMV/eGFP fueron recolectadas utilizando solución de desprendimiento de células de Accutasa (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA) y fijas con 4% PFA en PBS. La expresión eGFP fue examinada por citometría de flujo utilizando una BD LSR II (Becton Dickson), y los datos fueron analizados con FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Las células 293T sembradas (4,0 x 10 5 células/well) en una placa de 12 pozos y cultivadas durante la noche fueron infectadas con SCLCMV/ZsG-P2A-NP durante A las 24 h pi, las células fueron tres veces lavadas con medios frescos para eliminar la partícula vírica infecciosa producida en ausencia de tratamiento compuesto, y cultivadas durante otras 24 h en medios frescos en presencia de 40 nM de ouabaína o control del vehículo (DMSO). A las 48 h pi, se recogió TCS y se utilizó para infectar monocapas frescas de células BHK-21 sembradas (4,0 x 10 5 células/pozo) en una placa de 12 pocillos 1 día antes de la infección, y se preparó el lisato de células 293T. 24 h más tarde, se preparó el lisato de células BHK-21. El lisato total de células se preparó en tampón de lisis celular (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl [pH = 7,5], 0,5% [NP-40], 1 mM de EDTA] y se aclaró mediante centrifugación a 21,130 x g a 4°C durante 10 minutos. ZsLa intensidad de la señal verde en el lisato de células clarificadas se midió mediante un lector de placas fluorescentes (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). A549 células sembradas (2 x 10 5 células/well) en una placa de 96 pozos y cultivadas durante la noche fueron tratadas con combinaciones de diferentes concentraciones de ouabaína y rocaglamida durante 2 h y luego infectadas (MOI = 0,01) con rLCMV/eGFP. A las 48 h pi, las células se fijaron, permeabilizaron mediante tratamiento con DB y se teñiron con DAPI. Las señales de eGFP y DAPI se midieron mediante un lector de placas fluorescente (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Las lecturas de eGFP se normalizaron mediante lecturas de DAPI, y se utilizaron datos normalizados para analizar el efecto sinérgico de los dos compuestos por el programa MacSynergy II [89]. Los datos fueron analizados para valores de p mediante una prueba t sin emparejar de dos colas utilizando el software GraphPad Prism.

¿Qué factores atribuye este estudio a la eficiente multiplicación de los mammarenavirus?

Virus y evolución – ¿Virus Primero? Una Perspectiva Personalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6433886/SHA: f3b9fc0f8e0a431366196d3e835e1ec368b379d1Autores: Moelling, Karin; Broecker, FelixFecha: 2019-03-19DOI: 10.3389/fmicb.2019.00523Licencia: cc-byAbstract: El descubrimiento de exoplanetas dentro de zonas habitables putativas revolucionó la astrobiología en los últimos años. Estimuló el interés en la pregunta sobre el origen de la vida y su evolución. Aquí, discutimos cuáles podrían haber sido los roles de los virus al principio de la vida y durante la evolución. Los virus Están presentes en todas partes, en nuestros alrededores, los océanos, el suelo y en cada ser viviente. Los retrovirus contribuyeron a cerca de la mitad de nuestras secuencias genómicas y a la evolución de la placenta mamífera. Los virus contemporáneos reflejan la evolución que va desde el mundo del ARN hasta el mundo de las proteínas del ADN. ¿Hasta dónde podemos rastrear su contribución? Las entidades más tempranas que replican y evolucionan son las ribozimas o viroides que cumplen varios criterios de vida. El ARN puede realizar muchos aspectos de la vida e influencia nuestra expresión genética hasta hoy. Las estructuras más simples con información no codificante pueden representar modelos de vida construidos sobre información estructural, no genética. Los virus hoy son parásitos obligatorios dependiendo de las células huésped. Ejemplos de cómo un estilo de vida independiente podría haberse perdido son las mitocondrias, los cloroplastos, Rickettsia y otros, que solían ser bacterias autónomas y se convirtieron en parásitos o endosimbiontes intracelulares, perdiendo así la mayoría de sus genes. Incluso in vitro la pérdida de genes se puede recapitular todo el camino de la codificación a ARN no codificante. Además, los virus gigantes pueden indicar que no hay frontera aguda entre las entidades vivas y no vivas sino un continuo evolutivo. Aquí, se discute cómo los virus pueden perder y ganar genes, y que son motores esenciales de la evolución. Aparte de nuestra visión “virus primero”, hay otros como “proteínas primero” y “metabolismo primero”. Texto: Mycoplasma mycoides por eliminación sistemática de genes individuales resultó en un genoma sintético mínimo de 473 genes (Hutchison et al., 2016). ¿Puede uno considerar entidades vivientes más simples? Hay elementos con cero genes que cumplen muchos criterios para la vida temprana: ribozimas, ARN catalíticos estrechamente relacionados con los viroides. Fueron recuperados in vitro de 10 15 moléculas (aptadores), 220 nucleótidos en longitud, por 10 rondas de selección. Entre las muchas especies de ARN presentes en esta colección de cuasiespecies ARNs fueron miembros catalíticamente activos, ribozimas enzimáticamente activas. El espacio de secuencia para ARNs de 220-mers es de aproximadamente 3 × 10 132 (Eigen, 1971; Wilson y Szostak, 1999; Brackett y Dieckmann, 2006). Las ribozimas seleccionadas fueron capaces de replicar, separar, unir y formar enlaces péptidos. Pueden polimerizar químicamente la progenie, permitir que ocurran mutaciones y pueden evolucionar. Una molécula sirve como catalizador, la otra como sustrato. La replicación de ribozimas se demostró en el tubo de ensayo (Lincoln y Joyce, 2009). Ribozimas pueden formar enlaces péptidos entre aminoácidos (Zhang y Cech, 1997). Así, los pequeños péptidos estaban disponibles por actividad ribozima. En consecuencia, se ha propuesto una modificación del ARN como ácido péptido nucleico (PNA), con enlaces péptidos más estables en lugar de enlaces fosfodiéster (Zhang y Cech, 1997; Joyce, 2002). La replicación de moléculas de ARN se puede realizar químicamente a partir de ARN sin enzimas de polimerasa. Además, las deoxiribozimas pueden formarse a partir de ribonucleótidos (Wilson y Szostak, 1999). Así, el ADN puede surgir de ARN químicamente, sin la enzima proteica clave, la transcriptasa inversa. Todo un mundo vivo es posible a partir de ARN no codificante (ncRNA) antes de la evolución del código genético y enzimas proteicas. Ribozymes naturalmente consisten en ARN circulares de una sola cadena (Orgel, 2004). Carecen En lugar de ello, exhiben información estructural por los loops de horquilla que forman enlaces de hidrógeno entre hilos dobles incompletos, y lazos libres para interactuar con otras moléculas. Representan una cuasiespecie en la que muchas especies de ARN pueden formar, tales como ribozimas, moléculas similares a tRNA, y otros ncRNAs. Los ARNs dentro de tal grupo pueden unir aminoácidos. Noventa aminoácidos diferentes se han identificado en el meteorito Murchison encontrado en Australia, mientras que en la Tierra sólo alrededor de 20 de ellos se utilizan para la síntesis de proteínas (Meierhenrich, 2008). Donde la formación de ribozimas ocurrió en la Tierra primitiva es una cuestión de especulación. Los respiraderos hidrotermales como los fumadores negros en el océano profundo son posibilidades donde la vida puede haber comenzado (Martin et al., 2008). Allí, los gradientes de temperatura y Los poros o nichos ofrecen posibilidades de concentración de bloques de construcción, lo que es necesario para que ocurran reacciones químicas. Curiosamente, también el hielo es un candidato para la formación de ribozimas y reacciones químicas. Los cristales de hielo desplazan las biomoléculas en la fase líquida, lo que conduce a la concentración, creando una compartimentación cuasicelular donde se promueve la síntesis de novo de precursores de nucleótidos. Allí, puede surgir ARN y ribozimas, que son capaces de autorreplicarse (Attwater et al., 2010). Los complejos de ácido amino-tRNA pueden encontrar ARNs como "mRNAs". Tales interacciones podrían haber contribuido a la evolución del código genético. Esta secuencia de eventos puede conducir a precursores ribosoma primitivos. Las ribozimas son los elementos catalíticos esenciales en los ribosomas: "El ribosoma es un ribozima" (Cech, 2000), suplementado con cerca de un centenar de proteínas de andamio más tarde durante la evolución. Las proteínas tienen funciones estructurales y contribuyen indirectamente a la actividad enzimática. ¿Son estos ribozimas ribosomados fósiles de la Tierra primitiva? Los pequeños péptidos pueden ser formados por ribozimas antes de la evolución de los ribosomas, por lo que los aminoácidos simples o diméricos pueden originarse en el universo (Meierhenrich, 2008). Los pequeños péptidos con aminoácidos básicos pueden aumentar la actividad catalítica de las ribozimas como se muestra in vitro (Müller et al., 1994). Tales proteínas se conocen como proteínas de unión del ARN de virus del ARN que protegen el genoma del ARN, con motivos tales como RAPRKKG del nucleocápsido NCp7 del VIH (Schmalzbauer et al., 1996). Péptidos pueden mejorar la actividad catalítica de ribozimas hasta un 100 veces (Müller et al., 1994). Tales péptidos de virus del ARN sirven como chaperonas que eliminan estructuras de ARN de orden superior, permitiendo una interacción más eficiente de moléculas de ARN y aumentando las tasas de transcripción de polimerasas del ARN (Müller et al., 1994). Ribonucleoproteínas también pueden haber sido funcionalmente importantes durante la evolución de ribosomas (Harish y Caetano-Anolles, 2012). Estas estructuras preribosomales son también La transcripción inversa puede ser realizada químicamente por ribozimas. Esta acción no requiere necesariamente una proteína polimerasa como la transcriptasa inversa. Del mismo modo, los deoxiribonucleótidos pueden surgir por la eliminación de un oxígeno sin necesidad de una enzima proteica (una reductasa) como hoy, y permitir la polimerización del ADN (Wilson y Szostak, 1999; Joyce, 2002). Los mismos elementos de los precursores para ribosomas también son bloques de construcción de retrovirus, que pueden tener un origen evolutivo similar (Moeling, 2012 (Moeling,, 2013. tRNAs sirven como imprimadores para la transcriptasa inversa, y la secuencia de promotores de elementos transponibles se derivan de tRNAs (Lander et al., 2001). Los ribozimas se desarrollaron en intrones más complejos del grupo de autoescisión II con la inserción de genes que codifican una transcriptasa inversa y proteínas adicionales (Moelling y Broecker, 2015; Moelling et al., 2017) (Figura 1). Surgió como sorpresa que los genomas de casi todas las especies son ricos en ncDNA, transcriptos en ncRNAs, pero no codificando proteínas, como se evidencia, por ejemplo, por el proyecto "Enciclopedia de Elementos de ADN" (ENCODE). ncDNA equivale a más del 98% del genoma de ADN humano (Deveson et al., 2017). Los organismos más altos tienden a tener más información no codificante, lo que permite modos más complejos de regulación genética. Los ncRNAs son reguladores de las secuencias de codificación de proteínas. ncRNA puede variar desde cerca de cero en las bacterias más pequeñas como Pelagibacter ubique hasta alrededor del 98% en el genoma humano. Los virus de ARN como el retrovirus HIV albergan a los ncRNAs para la regulación génica como el elemento de respuesta transactivante (TAR), el sitio de unión para la proteína Tat para la expresión temprana del gen viral. Tat tiene un dominio altamente básico que comprende principalmente residuos de Lys y Arg, que se asemejan a otras proteínas de unión de ARN. ncRNA también sirve en genomas de ARN virales como sitios de entrada ribosomal, sitios de unión de imprimación o señales de embalaje. La síntesis de ADN depende de la síntesis de ARN como evento inicial, con ARN como iniciadores para la replicación de ADN, dentro de células como FIGURE 1 Un compartimento se muestra con componentes esenciales ARN no codificante (ncRNA), ribozimas o viroides, pueden realizar muchos pasos para la vida sin genes codificantes de proteínas, pero sólo por información estructural. Los aminoácidos individuales están indicados como puntos negros y pueden estar disponibles en la Tierra desde el universo. El ADN puede haber existido antes de retrovirus. El compartimento puede ser interpretado como previrus o precélulas. Viroide, verde; ARN, rojo; ADN, negro. así como durante la replicación retroviral, demostrando un requisito de ARN (Flint, 2015). El número de genes codificantes de proteínas de mamíferos es de alrededor de 20.000. Sorprendentemente, esto es sólo una quinta parte del número de genes de trigo pan (Appels et al., 2018). Tulips, maíz y otras plantas también tienen genomas más grandes, lo que indica que el número de genes no refleja necesariamente la ¿Podrían los genomas gigantes ser el resultado de la cría de plantas por agricultores o jardineros? De acuerdo con Szostak hay moléculas que aparecen como reliquias del mundo del ARN como el acetil-CoA o la vitamina B12, ambos están ligados a un ribonucleótido sin ninguna razón obvia - ¿se "olvidaron" para ser removidos? (Roberts y Szostak, 1997; Szostak et al., 2001; Szostak, 2011). Tal vez el ARN conectado sirve como estabilizador estructural. Las vesículas lipídicas podrían haber formado los primeros compartimentos y ribozimas cerrados, tRNAs con aminoácidos seleccionados, y ARN que se convirtieron en mRN. ¿Es esto un pre-células o pre-virus (Figura 1)? Patel et al. (2015) demostró que los bloques de construcción de la vida, ribonucleótidos, lípidos y aminoácidos, se pueden formar a partir de C, H, O, P, N, S en una síntesis de "una olla". Este estudio se puede considerar como un estudio de seguimiento de la síntesis clásica Urey-Miller in vitro de biomoléculas (Miller, 1953; Miller y Urey, 1959). La transición del ARN al mundo ADN fue promovida por la formación de la transcriptasa inversa. La enzima fue descrita por primera vez en retrovirus pero es casi ubicua y se encuentra en numerosas especies celulares, muchas de las cuales con funciones desconocidas (Simon y Zimmerly, 2008; Lescot et al., 2016). Es un vínculo importante entre el ARN y los mundos del ADN. El nombre de transcriptasa inversa es histórico e irritante porque es la transcriptasa "real" durante la transición del ARN al mundo del ADN. Del mismo modo, la ribonucleasa H (RNase H) es una enzima esencial de retrovirus (Mölling et al., 1971). La RNASA H resultó ser una de las cinco proteínas más frecuentes y antiguas (Ma et al., 2008 ) que pertenece a una superfamilia de más de sesenta representantes únicos diferentes y 152 familias con numerosas funciones (Majorek et al., 2014). Algunos de los muchos tRNAs pueden llegar a ser cargados con aminoácidos. Hay virus que contienen estructuras similares a tRNA (TLS), que se asemejan a estos primeros ARNs (Dreher, 2009). Los virus TLS incluyen virus de plantas, como el virus del mosaico amarillo de Turnip, en el virus del grupo de maní, el virus del mosaico de tabaco (TMV), y el virus del mosaico de Brome. Sólo la mitad del ARNt se encuentra en los Narnavirus de hongos. Los aminoácidos conocidos por ser componentes de virus similares al ARNt son valina, histidina y tirosina. Las estructuras también fueron designadas como "mimícritas", mejorando la traducción (Dreher, 2009 (Dreher,, 2010 ). Parecen elementos precursores "congelados" para la síntesis de proteínas. Esta combinación de un tRNA parcial vinculado a un aminoácido puede interpretarse como un paso evolutivo hacia la síntesis de proteínas, atrapado en un elemento viral. Los viroides carecen de capas proteicas y por lo tanto inicialmente no fueron designados como virus sino como virus cuando fueron descubiertos en 1971 por Theodor Diener. Él describió a los viroides como "fósiles vivos" (Diener, 2016) (Figura 2). De las patatas infectadas, Diener aisló el tubérculo del huso de la patata (PSTVd) cuyo genoma era aproximadamente 100 veces más pequeño que los de los virus conocidos en ese momento. Los viroides conocidos hoy en día van desde 246 hasta 467 nucleótidos. Contienen ARN circular de una sola cadena, son libres de proteínas y autorreplicantes sin información genética, pero sólo estructurales FIGURA 2 Los viroides son estructuras de horquilla y se muestran esquemáticamente y como micrografía electrónica. Viroides son, como ribozimas, sin información genética y juegan papeles biológicos importantes hoy en día en enfermedades de las plantas, en flores de claveles, en cáncer de hígado, como catalizador de la síntesis de proteínas en ribosomas y como ARNs regulatorios circulares, como "esponjas" para otros ARNs regulatorios. información en forma de horquillas de pelo (Riesner et al., 1979). Pueden generar copias de sí mismos en el entorno apropiado. Fueron designados como las "fronteras de la vida" (Flores et al., 2014). El conocimiento de la composición del virus se basó en TMV y su cristalización por Wendell Stanley en 1935 (Pennazio y Roggero, 2000). El genoma de TMV es ARN singlestranded codificante de proteínas de alrededor de 6.400 nucleótidos que está encerrado por una capa prote Los viroides, por el contrario, no codifican proteínas y carecen de capas, pero están estrechamente relacionados con los virus. Los viroides pueden perder su autonomía y dependen de las polimerasas del ARN huésped para replicarse, son capaces de infectar las plantas y muchos son patógenos económicamente importantes. Hay dos familias, el núcleo-replicante Pospiviroidae como PSTVd y el cloroplasto-replicante Avsunviroidae como el Viroide Sundblotch Aguado (ASBVd). Su replicación requiere enzimas del huésped. Por lo tanto, la autonomía es reemplazada por la dependencia de las enzimas del huésped y un estilo de vida intracelular. La mayoría de los viroides son a menudo ribozimáticamente activos -sin embargo son ejemplos de que este rasgo puede perderse como resultado de las condiciones ambientales cambiantes. Sólo las variantes nucleares, las Pospiviroidae, pueden perder su actividad ribozimática y utilizar la enzima RNASA III celular para su replicación. En contraste, las Avsunviroidae siguen siendo ribozimas de cabeza de martillo activas. Así, dentro del núcleo de una célula huésped, la función RNA enzimática puede volverse innecesaria. No genes, sino una función, la actividad catalítica, se pierde. Viroides aparentemente no ganar genes, pero cooperó para un estilo de vida más complejo. Por ejemplo, Carnation pequeño ARN tipo viroides (ARN CarSV) coopera con un retrovirus y está acompañado por un ADN homólogo generado por una transcriptasa inversa. Esta enzima presumiblemente se origina de un pararetrovirus de las plantas. Pararetrovirus empaqueta partículas del virus en una etapa diferente durante la replicación que retrovirus, el ADN, no el ARN Esta combinación única entre dos elementos virales sólo se ha detectado hasta ahora con CarSV en flores de claveles (Flores et al., 2005) (Flores et al.,, 2014. ¿Por qué tal cooperación evolucionó -tal vez por los jardineros reproductores? El ARN es sensible a la degradación; por lo tanto, el aumento genético y el crecimiento del genoma puede no ser favorable energéticamente -al menos no en las plantas. Ganancia de la función es, en este caso, la cooperación. El ARN circular (ARN circular) está relacionado con ribozimas/viroides como un regulador principal de otros ARN regulatorios, un ARN "esponja" que absorbe pequeños ARNes. Micro ARNs (miRNs) son reguladores post-transcripcionales que se ven afectados por la presencia de ARN circulares. se detectaron ARNs en cerebros humanos y Pueden unir 70 miRNA conservadas en una célula y su cantidad es de hasta 25.000 moléculas (Hansen et al., 2013). Su estructura recuerda a ribozimas catalíticamente activas. Hay un viroides excepcionales que obtuvieron información codificante y entraron en el hígado humano (Taylor, 2009). El viroides se conoce como virus delta de la hepatitis (HDV). Tiene el genoma más pequeño de cualquier virus animal conocido de cerca de 1.680 nucleótidos. Tiene propiedades típicas de los viroides, ya que contiene ARN circular, forma saltos de horquilla similares y réplicas en el núcleo utilizando enzimas huésped. Dos polimerasas tienen que redirigir su especificidad del ADN al ARN para generar el genoma y el antígeno del HDV. Ambos tienen actividad ribozima. En contraste con otras ribozimas, el HDV codifica una proteína, el antígeno delta de la hepatitis (HDVAg) que se presenta en dos formas, el pequeño HDVAg (24 kDa) que soporta la replicación y el gran HDVAg (27 kDa) que ayuda al ensamblaje del virión. El gen fue presuntamente recogido de la célula huésped por la recombinación del ARNm del HDV intermedio con un ARNm del huésped. La transmisión depende de un virus ayudante, el virus de la Hepatitis B (VHB), que entrega la capa (Taylor, 2009 ) ¿El empaquetado por un virus ayudante protege el genoma y por lo tanto permite que exista un viroides más grande? En las plantas, los viroides pueden no ser capaces de hacerse más grandes posiblemente debido a su sensibilidad a la degradación - pero tampoco pueden ser mucho más pequeños. Sólo se conoce un único viroides que está compuesto completamente de ARN codificante de proteínas con trillizos (AbouHaidar et al., 2014). Los viroides y los ARN replicantes relacionados son unidades replicantes propensas a errores y la frecuencia de error les impone un cierto tamaño mínimo, ya que de otro modo se extinguirían. Este mecanismo ha sido descrito como "catástrofe de error", lo que impide la supervivencia (Eigen, 1971 (Eigen,, 2013 ). Los viroides y ARN relacionados son los más pequeños réplicas conocidas. Los más pequeños se extinguirían en ausencia de sistemas de reparación. En resumen, el ARN puede catalizar muchas reacciones. Las enzimas proteicas que pueden haber evolucionado más tarde tienen mayores actividades catalíticas. Los ribozimas son portadores de información, pero no requieren genes de codificación. La información se almacena en su secuencia y estructura. Así, la replicación de un ARN inicial es seguida por el flujo de información, del ADN al ARN a la proteína, como se describe el Dogma Central (Crick, 1968). Incluso un flujo de información de la proteína al ADN ha sido descrito para algunas proteínas arqueales (Béguin et al., 2015). El mundo de proteínas de ADN contiene numerosos NCRNAs con funciones clave. ncRNA puede servir como un compuesto modelo para el origen de la vida en otros planetas. Por lo tanto, no la composición química de esta molécula es de importancia primordial, pero su simplicidad y multifuncionalidad. Además, el ARN es software y hardware en una sola molécula, que lo hace único en nuestro mundo. Hay otros escenarios además del aquí discutido "virus-first, " tales como "proteína-first", "metabolismo-fist" o el "mundo lípido" (Segré et al., 2001; Andras and Andras, 2005; Vasas et al., 2010; Moelling, 2012). Algunos de estos conceptos alternativos se construyeron sobre la filogenómica, la reconstrucción del árbol de la vida por secuenciación del genoma (Delsuc et al., 2005). Sorprendentemente, fue Sir Francis Crick, uno de los descubridores de la doble hélice del ADN, que declaró que no se sorprendería de un mundo completamente construido de ARN. Una predicción similar fue hecha por Walter Gilbert (Crick, 1968; Gilbert, 1986). ¡Qué visión! Nuestro mundo fue casi 50 años más tarde definido como "proteína ARN" mundo (Altman, 2013). Se puede especular que nuestro mundo fue construido de ribozimas o viroides, lo que significa "virus primero". Los ncRNAs aparecen como reliquias del mundo ARN pasado, antes de que el ADN, el código genético y las proteínas evolucionaran. Sin embargo, el ncRNA es esencial en nuestro mundo de ADN biológico hoy en día. Es posible producir tal ncRNA hoy en el tubo de prueba por pérdida de información génica de ARN codificante de proteínas. Esta reducción al ncRNA se demostró in vitro con ARN fago. El ARN genómico Qβ, 4.217 nucleótidos de longitud, fue incubado en presencia de replicasa Qβ, nucleótidos y sales libres, un medio rico en el tubo de prueba. El ARN se permitió replicar por medio de la réplica Qβ. La transferencia serial de alícuotas a medio fresco llevó a tasas de replicación cada vez más rápidas y a la reducción del tamaño genómico, hasta 218 nucleótidos de ncRNA en 74 generaciones. Este estudio demostró que, dependiendo de las condiciones ambientales, se puede producir una reducción génica extrema. Este experimento realizado en 1965 fue designado como "Monstruo de Spiegelman". El ARN de codificación se convirtió en replicación de ncRNA (Spiegelman et al., 1965; Kacian et al., 1972)! Manfred Eigen amplió este experimento y demostró además que una mezcla que no contiene ARN para empezar con pero sólo ribonucleótidos y la réplica Qβ puede bajo las condiciones correctas en un tubo de prueba generar espontáneamente ncRNA auto-replicante. Esto evolucionó en una forma similar al Monstruo de Spiegelman Además, un cambio en la concentración enzimática y la adición de ARN cortos o un intercalador de ARN influyeron en la población de ARN emergente (Sumper y Luce, 1975; Eigen, 2013). Así, la complejidad de los genomas depende del medio ambiente: las malas condiciones conducen a una mayor complejidad y a entornos ricos a una menor complejidad. El proceso demostrado en este experimento con componentes virales indica que la reversión a la simplicidad, la reducción de tamaño, la pérdida de información genética y la velocidad de replicación pueden ser las principales fuerzas de la vida, aunque esto parezca ser como una reversión de la evolución. El experimento puede tal vez ser generalizado desde el tubo de ensayo a un principio, que los sobrevivientes más exitosos en nuestro planeta son los virus y microorganismos, que se convirtieron en las entidades más abundantes. Tal vez la vida pueda comenzar de nuevo. Estos estudios plantean la cuestión de cómo las moléculas de ARN pueden llegar a ser Esto puede ser superado por el flujo de calor a través de un poro abierto en rocas sumergidas, que concentra la replicación de oligonucleótidos de un flujo de alimentación constante y la selección de hebras más largas. Esto se ha descrito para un aumento de 100 a 1.000 nucleótidos in vitro. Moléculas de ARN menores de 75 nucleótidos morirán (Kreysing et al., 2015). ¿Podría un medio ambiente pobre conducir a un aumento de complejidad? Esto podría ser probado. Ribozimas se demostró que crecen en tamaño por absorción de genes, como se demostró para HDV (Taylor, 2009 ). Un ejemplo inesperado interesante reciente que apoya la noción de que las condiciones ambientales influyen en la complejidad genética, es el microbioma intestinal humano. Su complejidad aumenta con diversos alimentos, mientras que alimentos ricos uniformes reducen su diversidad y pueden conducir a enfermedades como la obesidad. Unas pocas docenas de especies bacterianas y virales/fagos se conservan entre individuos (secuencias básicas) como una composición estable (Broecker et al., 2016c. La disbiosis se ha observado en varias enfermedades crónicas y en la obesidad, una pérdida de riqueza y diversidad bacterianas. La nutrición en condiciones afluentes con alimentos ricos en azúcar contribuye a la obesidad, lo que resulta en una reducción significativa de la complejidad del microbioma. Esta reducción es difícil de revertir (Cotillard et al., 2013; Le Chatelier et al., 2013). El microbioma intestinal en pacientes humanos con obesidad recuerda a la reducción genética descrita en el experimento del Monstruo de Spiegelman: reducción de genes en un entorno rico. La reducción de la complejidad del microbioma se atribuye en parte a la acción de los fagos, que bajo tales condiciones, definidas como estrés, lisian las El trasplante de microbiota fecal puede ser reemplazado incluso por fracciones solubles que contienen fagos o metabolitos del donante sin bacterias (Ott et al., 2017). Analógicamente, los microbiomas más complejos se encuentran en las tribus humanas indígenas de África, que viven en una amplia variedad de nutrientes diferentes. Es un proceso lento, sin embargo, para aumentar la complejidad de la microbiota intestinal por nutrición diversa. La microbiota asociada a la obesidad que sobrevive son más aptas y difíciles de contrarrestar. Urbanización y occidentalización de la dieta se asocia con una pérdida de biodiversidad microbiana, pérdida de organismos microbianos y genes (Segata, 2015). Para entender el mecanismo y la fuerza motriz para la reducción del genoma, las tasas de eliminación se probaron mediante la inserción de un gen indicador en el genoma de Salmonella entérica. La pérdida del gen indicador fue monitoreada por el paso en serie Las deleciones resultaron en genomas más pequeños con reducción o ausencia de genes de reparación de ADN (Koskiniemi et al., 2012). La pérdida de genes confirió una mayor aptitud a las bacterias bajo estas condiciones experimentales. Los mimivirus recientemente descubiertos y otros virus gigantes son dignos de considerar para entender la evolución de la vida con respecto a la contribución de los virus. Sus anfitriones son, por ejemplo, Acanthamoeba, Clorella, y Coccolithus algas (Emiliania huxleyi), pero también corales o esponjas como se discutió más recientemente. Los mimivirus fueron descubiertos por primera vez en torres de agua de refrigeración en Bradford, Reino Unido en 2003 con cerca de 1.000 genes, la mayoría de los cuales no relacionados con genes conocidos anteriormente. Los mimivirus han recibido atención porque contienen elementos que se consideraban distintivos de células vivas, no de virus, Los mimivirus albergan estos bloques de construcción como conjuntos incompletos que no son suficientes para la síntesis de proteínas independientes como las bacterias o las arcaeas pueden realizar, evitando que lleven una vida autónoma (La Scola et al., 2003 Scola et al.,, 2008. Son más grandes que algunas bacterias. Los virus gigantes pueden ser vistos como en un camino evolutivo hacia un organismo celular. Alternativamente, pueden haber evolucionado de un organismo celular por pérdida de información genética (Nasir y Caetano-Anolles, 2015). Los virus gigantes han tomado con frecuencia genes de sus anfitriones por transferencia horizontal de genes (HGT) (La Scola et al., 2008; Nasir y Caetano-Anolles, 2015; Colson et al., 2018). Un gráfico sobre los tamaños del genoma muestra que los mimivirus y las bacterias se superponen en tamaño, lo que indica una transición continua entre virus y bacterias y entre mundos vivos y no vivos (basado en Holmes, 2011) (Figura 3). Otros virus gigantes, como los megavirus, fueron descubiertos en el océano de Chile con 1.120 genes. Más recientemente, el Klosneuvirus fue identificado en las aguas residuales del monasterio Klosterneuburg en Austria en 2017 con 1.57 millones de pares de bases (Mitch, 2017). Pithovirus sibericum es el más grande entre los virus gigantes descubiertos hasta la fecha con un diámetro de 1,5 micras, un genoma de 470.000 pb con 467 genes putativos, 1,6 micras de longitud, y es presumiblemente de 30.000 años ya que fue recuperado de permafrost en Siberia (Legendre et al., 2014 Los virus Pandora más pequeños con 1 micron de longitud tienen genomas cinco veces más grandes, 2.500.000 pb (Philippe et al., 2013) (Figura 3). Los virus gigantes incluso pueden ser hospedadores de virus más pequeños, los virófagos, que recuerdan a los bacteriófagos, los virus de las bacterias. Estos virófagos como Sputnik son sólo 50 nm de tamaño con 18.343 pb de ADN circular y 21 genes de codificación proteica predichos. Se replican en fábricas virales y consumen los recursos del mimivirus, destruyéndolo así. Algunos, los virófagos incluso pueden integrarse en el genoma del huésped celular y se pueden reactivar cuando el huésped está infectado por virus gigantes. Así, virus gigantes sugieren que los virus están cerca de entidades vivas o pueden haber estado vivos (La Scola et al., 2008; En biología es común distinguir entre materia viva y muerta por la capacidad de sintetizar proteínas y replicar autónomamente. Los virus gigantes pueden ser considerados como un eslabón faltante entre los dos, porque albergan "casi" el aparato de síntesis de proteínas. La transición de vivir al mundo no vivo es continua, no separada por una línea fronteriza aguda (Figura 3). Los virus no son considerados vivos por la mayoría de la comunidad científica y como se escribe en los libros de texto, porque no pueden replicarse autónomamente. Sin embargo, algunos de los virus gigantes están equipados con casi todos los componentes de la maquinaria de síntesis de proteínas cerca de bacterias que sugieren que pertenecen a la materia viva (Schulz et al., 2017). Las ribozimas pueden haber sido la entidad replicante más temprana. Tal vez también otros virus fueron inicialmente más independientes de la Tierra primitiva que hoy en día. Como se describe en la Figura 1 puede haber sido inicialmente Sólo más tarde los virus pueden haber renunciado a su replicación autónoma y convertirse en parásitos, como se ha descrito para algunas bacterias (véase más adelante). Se han hecho esfuerzos para identificar la célula viva más pequeña que todavía se replica de forma autónoma. Entre las bacterias que presumiblemente se encuentran Pelagibacter ubique del clado SAR11 de bacterias (Giovannoni, 2017), que se descubrió en 1990. Es un alfa-proteobacterio con 1.389 genes presentes ubicuamente en todos los océanos. Puede alcanzar hasta 10 28 células vivas libres en total y representa aproximadamente el 25% de las células de plancton microbiano. Muy poco de su ADN es no codificante. Alberga fagos de tipo podofago, designados como "pelagiphage" (Zhao et al., 2013). Este pequeño bacteria fue designado como el organismo más común en el planeta. ¿ Esta bacteria autónoma es más pequeña que algunos virus gigantes parasitarios. Craig Venter, que primero logró secuenciar el genoma humano, trató de minimizar el genoma más pequeño putativo de una especie viva, de Mycoplasma mycoides, una bacteria parasitaria que vive en rumiantes (Gibson et al., 2008 (Gibson et al.,, 2010. Su grupo sintetizó un genoma de 531.000 bp con 473 genes, 149 de ellos (32%) con funciones desconocidas (Hutchison et al., 2016). Entre los organismos parasitarios vivos más pequeños está Nanoarchaeum equitans. Es un arqueón termofílico que vive a 80 • C y a pH 6 con 2% de sal (Huber et al., 2003). Su genoma tiene un tamaño de 490.000 bp y codifica 540 genes. N. equitans es un simbionte obligatorio de un arqueón más grande, Ignicoccus montando en él como en un caballo, de ahí el nombre (Huber et al., 2003). El mundo de los virus cubre una gama de tres troncos en tamaño de sus genomas: desde genes cero a cerca de 2.500 genes que ascienden a cerca de 2.500.000 bp de ADN. Los viroides de origen cero tienen unas 300 bases de longitud (Figura 3). La virosfera es el reservorio más exitoso de entidades biológicas en nuestro planeta en términos de número de partículas, velocidad de replicación, tasas de crecimiento y espacio secuencial. Hay alrededor de 10 33 virus en nuestro planeta y están presentes en cada especie existente (Suttle, 2005). No hay especies vivas sin virus! Los virus también ocurren libremente en los océanos, en el suelo, en nubes hasta la estratosfera y más Poblan el intestino humano, el canal de nacimiento y el exterior del cuerpo como capa protectora contra las poblaciones microbianas. Los microbios contienen fagos que se activan durante condiciones de estrés tales como la falta de nutrientes, el cambio de temperatura, la falta de espacio y otros cambios de las condiciones ambientales. Uno de los papeles más agitadores de la tierra de este siglo fue la publicación de la secuencia del genoma humano (Lander et al., 2001). Alrededor de la mitad, posiblemente incluso dos tercios de la secuencia se componen de retrovirus endógenos más o menos completos (ERVs) y retroelementos relacionados (REs) (de Koning et al., 2011). Las RE amplifican a través de mecanismos de copia y pasta que implican un paso de transcriptasa inversa de un ARN intermedio en ADN. Además, los elementos transponibles del ADN (TEs) se mueven por un mecanismo de corte y El origen de las REs está siendo discutido como restos de infecciones germinales retrovirales antiguas que se fijaron evolutivamente en el genoma. Alrededor de 450.000 elementos ERV humanos (HERV) constituyen alrededor del 8% del genoma humano consistente en elementos retrovirales distintivos como la mordaza, pol, genes env y repeticiones terminales largas flanqueantes (LTR) que actúan como promotores (Lander et al., 2001). Howard Temin, uno de los descubridores de la transcriptasa inversa, en 1985 ya describió elementos similares a retrovirus endógenos, que estimó en cerca del 10% de la secuencia del genoma humano y del ratón (Temin, 1985). El número real es alrededor del 45% como se estima hoy (Lander et al., 2001). En algunos genes como el gen Protein Kinase Inhibitor B (PKIB) determinamos alrededor del 70% de secuencias ¿Hay un límite? ¿Podría haber sido 100%? Se estima que los retrovirus han entrado en el linaje del genoma mamífero hace 550 millones de años (MYA) (Hayward, 2017). Las secuencias ERV más antiguas pueden existir pero hoy son irreconocibles debido a la acumulación de mutaciones. Los ERV sufren mutaciones, deleciones o eventos de recombinación homóloga con grandes deleciones y pueden llegar a ser tan cortos como los elementos LTR solos, que son unos pocos cientos de pb en longitud - los sobrantes de genomas retrovirales de larga duración de alrededor de 10.000 pb. Los promotores LTR pueden desregular genes vecinos. Los eventos de recombinación homóloga pueden ser considerados como eventos de pérdida de genes o reducción de genes. Es la suposición de que los ERV, que ya no eran necesarios para la defensa celular del huésped, ya no fueron Eugene Koonin señala que la infección y la integración son eventos únicos que se producen a un ritmo rápido, mientras que la pérdida y la reducción de genes pueden tardar mucho más tiempo (Wolf y Koonin, 2013). Una reducción frecuente de genes de genomas eucariotas es la pérdida de la proteína de envoltura viral codificada por el gen env. Sin un abrigo, los retrovirus ya no pueden dejar la célula e infectar otras células. Pierden la movilidad y se convierten en elementos intracelulares obligatorios. Los virus ayudantes pueden suministrar proteínas de envoltura en trans y movilizar los virus. Las TEs o REs se pueden considerar como ejemplos de reliquias de virus intracelulares sin capa -o podría haber sido al revés, tal vez precursores de retrovirus de larga duración? Estos elementos pueden amplificarse intracelularmente y modificar los genomas del huésped mediante la integración con el peligro potencial de alteración genética y cambios genéticos. Las REs pueden llevar a la duplicación de genes y al desarrollo de pseudogenes, con una copia para la conservación estable de las funciones adquiridas y la otra para las innovaciones (Cotton y Page, 2005). Tales duplicaciones constituyen grandes cantidades de genomas de mamíferos (Zhang, 2003). Los retrovirus tienen una duplicación de moiety RNASa H, una de las cuales sirve como enlace catalíticamente inactivo entre la RT polimerasa y la enzimáticamente activa RNASa H (Xiong y Eickbush, 1990; Malik y Eickbush, 2001; Moelling y Broecker, 2015; Moelling et al., 2017). Esta duplicación de genes se remonta a 500 millones de años (Cotton y Page, 2005). Las duplicaciones de genes son una causa común de cáncer, que a menudo se produce sólo en el genoma de la célula cancerosa en sí, Myc, Myb, ErbB2, Ras y Raf son oncogenes amplificados en diversos tipos de cánceres humanos (Vogelstein y Kinzler, 2002). La capacidad de los retrovirus para integrarse los hace distintos de los endosimbiontes que permanecen separados. Sin embargo, el resultado neto es muy similar, la adquisición de nueva información genética, que se transmite a la siguiente generación, si la línea germinal está infectada y se produjo la endogenización del virus. La integración viral no se limita a las células eucariotas, sino también un mecanismo en procariotes para el mantenimiento del estado lisogénico de los fagos dentro de las bacterias. Además, para otros virus eucariotas como el VHB, el antígeno de superficie envolvente BHsAg se puede eliminar, lo que conduce a un estilo de vida intracelular obligatorio para el virus, que especialmente en presencia de VHC promueve el cáncer (Yang et al., 2016). Se ha demostrado que el VIH pierde rápidamente uno de sus genes auxiliares, nef, originalmente por factor negativo. El gen se perdió dentro de un número bastante bajo de pasajes del virus crecido bajo condiciones de cultivo tisular por selección de células productoras de títulos de alto virus. La eliminación de nef resultó en un aumento significativo del título del virus en cultivo -de ahí el nombre. El producto del gen nef no era de necesidad dentro de las células de cultivo tisular, sino que era inhibitorio para la replicación. Sin embargo, es esencial para la patogenicidad en animales, y posteriormente nef fue reinterpretado como " Además, los hospederos humanos del VIH pueden perder una porción terminal significativa de un receptor de siete transmembranas en linfocitos, la célula diana primaria para la entrada del VIH y para la captación del virus. Esta molécula, el receptor de citocinas CCR5 es truncado por 32 aminoácidos carboxiterminales (CCR5-32), desactivando funcionalmente el receptor. La frecuencia de alelos del mutante CCR5-32 mutante es de alrededor del 10% en la población europea, haciendo que estas personas resistentes a las infecciones por VIH (Solloch et al., 2017). Esta pérdida genética en europeos ha demostrado hacer que los individuos resistentes no sólo contra la infección por VIH sino también contra la malaria. Esto puede haber sido la presión selectiva en el pasado antes de que el VIH/SIDA surgiera. No se ha descrito ningún efecto secundario para los seres humanos que carecen de este gen (Galva Los virus han demostrado ser motores de la evolución (Villarreal y Witzany, 2010), incluyendo el genoma humano, que por lo menos un 45% está compuesto de secuencias relacionadas con retrovirus. Además, los retrovirus endogenizados suministraron los genes de sincitina que son esenciales para el desarrollo de la placenta mamífera, y permitieron el crecimiento de embriones sin su rechazo por el sistema inmune materno (Dupressoir et al., 2012). Así, la misma propiedad que causa inmunodeficiencia en pacientes infectados por VIH y conduce al SIDA causa la formación de sincitia, fusión celular después de la infección por un retrovirus. También se ha propuesto que los virus estén en el origen de la evolución de la inmunidad adaptativa (Villarreal, 2009 ). Así, los genomas conformados por virus mediante el suministro de genes y mecanismos esenciales. La endogenización de retrovirus se ha producido en los genomas Si los ERVs integrados no ofrecían ninguna ventaja selectiva, se deterioraban y acumulaban mutaciones con pérdida de función, lo que se demostró directamente mediante la reconstrucción de un retrovirus infeccioso a partir de la secuencia de consenso de 9 secuencias de virus endógenos defectuosos, designados como Phoenix. El virus se expresaba a partir de un clon sintético de ADN construido en cultivo celular y partículas de virus formados identificadas por análisis microscópicos de alta resolución (Dewannieux y Heidmann, 2013). Los koalas en Australia están siendo endogenizados de un retrovirus (koala retrovirus, KoRV) en "tiempo real" y demuestran posibles consecuencias para la inmunidad. A principios de 1900, algunos individuos fueron trasladados a islas, incluida la isla Kangarooo, cerca del continente australiano para fines de repoblación, ya que los koalas estaban amenazados de extinción. Sin embargo, los koalas aislados en la isla de Kangaroo son KoRV negativos, lo que permite datar la introducción de KoRV en la población de koalas hace unos cien años. Muchos de los koalas infectados cayeron enfermos y murieron, sin embargo algunas poblaciones se volvieron resistentes dentro de unos 100 años, correspondientes a unas 10 generaciones. Los koalas probablemente desarrollaron resistencia debido a los provirus de ADN integrados. El retrovirus se transmite como exógeno así como virus endógeno, similar al retrovirus de ovejas Jaagsiekte (JSRV), por lo que los virus endogenizados protegen con un producto génico viral, como Env, contra infecciones de novo por "exclusión de la superinfección" (Tarlinton, 2012). La contribución de los retrovirus a la defensa antiviral es sorprendente, ya que todos los genes retrovirales tienen genes análogos en el mecanismo de defensa de las células eucarióticas siRNA/RNAi (Moelling et al., 2006). Los retrovirus pueden proteger contra la infección por otros virus relacionados, por ejemplo, al expresar proteínas Env que bloquean los receptores de la superficie celular (Villarreal, 2011). Un mecanismo comparable protege a las células bacterianas contra los fagos de ADN, mediante fragmentos de ADN de fagos integrados que se transcriben en ARNm e hibridan a los nuevos fagos de ADN entrantes y por lo tanto conducen a su destrucción por nucleasasases híbridos específicos, inmunidad CRISPR/Cas (Charpentier y Doudna, 2013). A menudo no se da cuenta de que la adquisición de inmunidad en bacterias y células La integración de retrovirus ocurre normalmente en las células somáticas después de la infección como un paso obligatorio durante el ciclo de vida viral. La infección de las células germinales puede conducir a la transmisión a la próxima generación y en última instancia dar lugar a resistencia hereditaria. Los retrovirus endogenizados probablemente causaron resistencia FIGURA 4 Los virus protegen contra los virus: los retrovirus protegen a una célula contra una nueva infección por un virus similar designado como "exclusión de la superinfección" o interferencia viral. Esto es mediado por productos genéticos virales como proteínas o ácidos nucleicos. Del mismo modo, los fagos protegen contra los fagos: la superinfección de bacterias es evitada por el ARN CRISPR/Cas originado por infecciones anteriores. Los mecanismos de defensa contra virus y fagos son análogos. La protección de virus o fagos contra superinfección representa defensa celular y inmunidad adquirida. Los cuatro ejemplos se discuten Del mismo modo, la resistencia al virus de la Inmunodeficiencia Simiana (SIV) en algunas especies de monos puede explicarse por la endogenización (Li et al., 2017) (Li et al., 2018. En el caso de los fagos y sus hospedadores procarióticos, el mecanismo se describe como CRISPR/Cas, que siguen principios análogos de "endogenización" del material genético entrante para su posterior exclusión. Se puede especular que el VIH también puede llegar a ser endogenizado en el genoma humano. Hay alguna evidencia de que el VIH puede infectar las células germinativas humanas y transmitirse al genoma embrionario (Wang et al., 2011). ¿Cuánto tiempo puede tardar esto no se conoce -10 generaciones? La pérdida de la función de los VRV puede ocurrir por mutaciones, supresiones de los env u otros genes y, en última instancia, El número de elementos retrovirus suma alrededor de 450.000, lo que corresponde al 8% del genoma humano (Lander et al., 2001; Cordaux y Batzer, 2009 ). Las regiones promotoras fueron analizadas por su contribución al cáncer activando genes vecinos -como consecuencia de una antigua infección por retrovirus. De hecho, los genes celulares activados por "promoción descendente" fueron identificados en estudios animales con activación del gen mic como uno de muchos ejemplos, llevando a un desarrollo crónico y no agudo del cáncer (Ott et al., 2013). Como mecanismo general para el cáncer humano hoy en día los LTRs no son identificados como un culpable mayor. La mayoría de los ERVs que encontramos hoy se han integrado durante la evolución en intrones u otras regiones donde su presencia es relativamente inofensiva. ¿Resultaron los otros en la muerte de los portadores que desaparecieron? Los efectos de los LTRs en los niveles de expresión de los genes huéspedes vecinos fueron estudiados con el virus humano endógeno, HERV-K, como posible causa de cáncer, pero esto no parece ser un fenómeno general (Broecker et al., 2016b). Como se demostró para los koalas, los ERVs pueden conferir inmunidad a las infecciones virales (Feschotte et al., 2012). Se demostró que un ERV relacionado, HERV-H, produce un ARN que mantiene las células embrionarias tempranas pluripotentes e incluso revierte las células adultas para recuperar la pluripotencia (Grow et al., 2015). Así, el papel de los ERVs puede ser más complejo de lo que conocemos actualmente. Elementos transponibles y REs que perdieron la capacidad de transmisión celular mediante la eliminación de la proteína del abrigo contribuyen principalmente a la complejidad genética de Están "bloqueados" dentro de las células y son los principales impulsores del aumento de la complejidad genética (Cordaux y Batzer, 2009 ). Se podría especular que estos elementos intracelulares son retrovirus replicantesincompetentes que carecen de abrigos (Lander et al., 2001). Los murciélagos transmiten virus como el Ébola y el coronavirus SARS sin sufrir de enfermedad (Beltz, 2018). Incluso virus ARN como Bornavirus han demostrado integrarse por transcripción inversa ilegítima, posiblemente también proporcionando inmunidad contra la superinfección (Katzourakis y Gifford, 2010). Hay dos eventos prominentes que contribuyeron significativamente al éxito de la vida y la formación de células. Ambos están asociados con la reducción de genes. Este fenómeno puede jugar un papel para la evolución de los virus de estilos de vida autónomos a parásitos. En la década de 1960 Lynn Margulis propuso un origen extracelular para las mitocondrias (Margulis, 1970,, 1993 ). Una célula ancestral, tal vez un arqueón, fue infectada por una bacteria anaerobia, que dio lugar a las mitocondrias. Del mismo modo, cianobacterias formaron los cloroplastos en las células vegetales modernas. Mitocondrias surgió hace alrededor de 1.450 millones de años (BYA) (Embley y Martin, 2006). Mitocondrias y cloroplastos son los ejemplos más llamativos para un cambio en el estilo de vida de bacterias autónomas a endosimbiontes. Esta transición a menudo se considera como extremadamente rara y un sello distintivo de la evolución de la vida en nuestro planeta. Sin embargo, hay muchos otros parásitos intracelulares obligados como Rickettsia, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii (el agente causal de la fiebre Q), Mycobacterium leprae, M. tuberculosis, y M. mycoides (Beare et al., 2006). El cambio de estilo de vida de los endosimbiontes en los dos casos de mitocondrias y cloroplastos es sorprendente. Ambos redujeron drásticamente su composición genética. Mitocondria contiene menos de 37 genes, que dejaron de ser los originales alrededor de 3.000 genes. Es endogenización de retrovirus, los ERV, que se integran en células germinales, relacionadas con la endosimbiosis? Son estos modelos endosimbionts para la transición de un estilo de vida autónomo a una vida parasitaria que puede haber tenido lugar con virus? Un ejemplo típico más reciente para una evolución reductiva son Rickettsia. Estas bacterias se supone por algún tiempo que son virus debido a su existencia parasitaria intracelular obligatoria. Rickettsia han evolucionado de bacterias que replican autónomamente. Evolución reductiva de endosimbiontes puede producir bacterias con genomas diminutos a expensas de la vida extracelular autónoma. Sus genomas son 1,11 millones de pbp en longitud con cerca de 834 genes codificantes de proteínas, y pérdida de 24% por la evolución reductiva (Ogata et al., 2001). Rickettsia puede tener alguna relación con cianobacterias, que se consideran como los principales simbiontes. ¿Se puede especular que los virus pueden haber sido entidades autónomas inicialmente? Viroides pueden haber sufrido la transición de la autonomía a parásitos, tal como se muestra para mitocondria, cloroplastos o Rickettsia? ¿Hasta qué punto los virus han sido autónomos e independientes de los metabolismos celulares originalmente -y contribuyeron al origen de las células? ¿Podrían haber perdido su autonomía más tarde y convertirse en parásitos? Los virus son minimalistas en su composición y deben haber sufrido reducciones genéticas estrictas (Flint, 2015). ¿Cuán pequeños pueden llegar a ser sus genomas? La mayoría de los virus ARN codificados todavía contienen elementos reguladores, ncRNA en las 3 y 5 regiones terminales para la entrada ribosomal, síntesis proteica, regulación transcripcional, y otros. Un subgrupo de retrovirus es un ejemplo interesante en cuanto a la pérdida simultánea y la ganancia de información genética. Los retrovirus oncogénicos o tumoresvirus pueden recombinarse con genes celulares que bajo los promotores de retrovirus pueden convertirse en oncogenes y conductores de cáncer. Alrededor de cien oncogenes han sido seleccionados en los laboratorios y estudiados durante La selección de las ventajas de crecimiento de las células huésped llevó al descubrimiento de los oncogenes que promueven el crecimiento más rápido que conocemos hoy en día, como Ras, Raf, ErbB o Myc, que son en parte objetivos exitosos para los medicamentos anticancerosos (Moelling et al., 1984). Estos oncogenes fueron en la mayoría de los casos tomados por los retrovirus a expensas de los genes estructurales (gag), replicando (pol) o envolvente (env), y a menudo se expresan como proteínas de fusión con Gag. Así, los retrovirus oncogénicos son virus defectuosos intracelulares obligatorios y fueron seleccionados para en el laboratorio por los investigadores para los oncogenes con la capacidad de crecimiento más potente promover. Necesitan el suministro de genes replicatorios en trans de virus ayudantes co-infectantes para infectar otras células (Flint, 2015) Algunas cepas del virus del sarcoma de Rous mantienen la replicación competente al transportar el src derivado de la célula (para el sarcoma) oncogén que codifica una proteína de 536 aminoácidos que aparentemente pueden encajar en la partícula retroviral junto con el genoma viral de tamaño completo (Broecker et al., 2016a). Razones espaciales pueden haber influido en la formación de retrovirus oncogénicos y limitado su tamaño y, por lo tanto, llevado a sus fenotipos defectuosos. Hay indicios de que la actividad incontrolada de (retro)transposones en las células germinativas puede resultar en enfermedades como la infertilidad masculina -presumiblemente por "catástrofe grave", causada por demasiados eventos de transposición. En los mamíferos, los piRNAs doman la actividad transpoon por medio de la actividad de la RNASa H de las proteínas PIWI durante la espermatogénesis (Girard et al., 2006). Sólo una minoría de virus son patógenos; la mayoría de ellos no causan enfermedades. Por el contrario, son más importantes como impulsores de la evolución, como transmisores de material genético, como agentes innovadores. En particular, los virus ARN son los más innovadores. Algunos de ellos son patógenos y peligrosos, como el VIH o el virus influenza, o los viroides en las plantas. Los virus ARN son capaces de cambiar tan rápidamente que el sistema inmunitario del huésped es incapaz de contrarrestar la infección. La patogenicidad surge cuando las condiciones ambientales cambian, por ejemplo, cuando un virus entra en un nuevo organismo o especie. El aumento de la complejidad celular por virus es una característica importante de la evolución. Tales cambios evolutivos importantes son tomados recientemente como argumentos en contra de la teoría evolutiva por Charles Darwin quien consideró cambios graduales, pequeños incrementos por mutaciones como la base principal para la selección y la evolución. Nueva crítica está abordando este pensamiento, considerando cambios más grandes como impulsores evolutivos. Tales cambios surgen por muchos fenómenos complejos tales como endosimbiosis, infección por procariotos, virus y hongos, recombinación de genes, HGT, infecciones, sexo. Cambios dramáticos tales como endosimbiosis o infecciones de patógenos extienden el concepto de Darwin de evolución. Hay numerosos ejemplos para la contribución de virus a la evolución de la vida desde por lo menos hasta 550 MYA (Hayward, 2017). Pero el ruido genético a través de mutaciones aleatorias no nos permite volver al origen de la vida. Por analogía, se puede especular que en algún momento los virus autónomos renunciaron a la independencia para una vida intracelular obligatoria -como se ha descrito para las mitocondrias y los cloroplastos, pero también las bacterias intracelulares como Rickettsia. Esta especulación se basa en el concepto de que la vida temprana debe haber comenzado simple y con alta variabilidad genética y luego se volvió más compleja. Pero la complejidad se puede renunciar a un estilo de vida menos consumidor de energía con genomas pequeños y alta velocidad de replicación (Moelling, 2012 (Moelling,, 2013 ). Por lo tanto, la pregunta puede repetirse: "¿Son los virus nuestros antepasados más antiguos?"Alguna vida fósil puede ser parcialmente reproducida in vitro por los experimentos de seguimiento de Spiegelman y Eigen, explicando el gran potencial de supervivencia del NCRNA simple. Los virus pueden ser patógenos, pero su reconocimiento como causa principal de enfermedades es Esta noción se basa en la historia de los virus en la medicina, como se explica en un libro titulado "Viruses: More Friends Than Foes" (Moelling, 2017). El escenario descrito aquí se centra en los virus como motores de la evolución. El mundo del ARN temprano se interesó hace 20-30 años, como lo demuestran las referencias anteriores. Sorprendentemente, hay científicos que todavía creen en la "hipótesis del pansperm" y piensan que los retrovirus son de origen extraterrestre (Steele et al., 2018). El interés reciente en el origen de la vida surgió de los exoplanetas recién descubiertos cuyo número aumenta diariamente -y que pueden ser tan numerosos como 10 25. Así, las estadísticas puras hacen que algunas personas crean que hay vida extraterrestre. La vida extraterrestre se imita en laboratorios en la Tierra con muchos supuestos -quizás esta El debate que aquí se presenta debe considerarse como un concepto de réplica simple y de entidades en evolución posiblemente derivadas de diferentes bloques de construcción en otros entornos, siendo la estructura más relevante que la secuencia.

¿Cuáles son las entidades biológicas más abundantes de la Tierra?

Virus y evolución – ¿Virus Primero? Una Perspectiva Personalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6433886/SHA: f3b9fc0f8e0a431366196d3e835e1ec368b379d1Autores: Moelling, Karin; Broecker, FelixFecha: 2019-03-19DOI: 10.3389/fmicb.2019.00523Licencia: cc-byAbstract: El descubrimiento de exoplanetas dentro de zonas habitables putativas revolucionó la astrobiología en los últimos años. Estimuló el interés en la pregunta sobre el origen de la vida y su evolución. Aquí, discutimos cuáles podrían haber sido los roles de los virus al principio de la vida y durante la evolución. Los virus Están presentes en todas partes, en nuestros alrededores, los océanos, el suelo y en cada ser viviente. Los retrovirus contribuyeron a cerca de la mitad de nuestras secuencias genómicas y a la evolución de la placenta mamífera. Los virus contemporáneos reflejan la evolución que va desde el mundo del ARN hasta el mundo de las proteínas del ADN. ¿Hasta dónde podemos rastrear su contribución? Las entidades más tempranas que replican y evolucionan son las ribozimas o viroides que cumplen varios criterios de vida. El ARN puede realizar muchos aspectos de la vida e influencia nuestra expresión genética hasta hoy. Las estructuras más simples con información no codificante pueden representar modelos de vida construidos sobre información estructural, no genética. Los virus hoy son parásitos obligatorios dependiendo de las células huésped. Ejemplos de cómo un estilo de vida independiente podría haberse perdido son las mitocondrias, los cloroplastos, Rickettsia y otros, que solían ser bacterias autónomas y se convirtieron en parásitos o endosimbiontes intracelulares, perdiendo así la mayoría de sus genes. Incluso in vitro la pérdida de genes se puede recapitular todo el camino de la codificación a ARN no codificante. Además, los virus gigantes pueden indicar que no hay frontera aguda entre las entidades vivas y no vivas sino un continuo evolutivo. Aquí, se discute cómo los virus pueden perder y ganar genes, y que son motores esenciales de la evolución. Aparte de nuestra visión “virus primero”, hay otros como “proteínas primero” y “metabolismo primero”. Texto: Mycoplasma mycoides por eliminación sistemática de genes individuales resultó en un genoma sintético mínimo de 473 genes (Hutchison et al., 2016). ¿Puede uno considerar entidades vivientes más simples? Hay elementos con cero genes que cumplen muchos criterios para la vida temprana: ribozimas, ARN catalíticos estrechamente relacionados con los viroides. Fueron recuperados in vitro de 10 15 moléculas (aptadores), 220 nucleótidos en longitud, por 10 rondas de selección. Entre las muchas especies de ARN presentes en esta colección de cuasiespecies ARNs fueron miembros catalíticamente activos, ribozimas enzimáticamente activas. El espacio de secuencia para ARNs de 220-mers es de aproximadamente 3 × 10 132 (Eigen, 1971; Wilson y Szostak, 1999; Brackett y Dieckmann, 2006). Las ribozimas seleccionadas fueron capaces de replicar, separar, unir y formar enlaces péptidos. Pueden polimerizar químicamente la progenie, permitir que ocurran mutaciones y pueden evolucionar. Una molécula sirve como catalizador, la otra como sustrato. La replicación de ribozimas se demostró en el tubo de ensayo (Lincoln y Joyce, 2009). Ribozimas pueden formar enlaces péptidos entre aminoácidos (Zhang y Cech, 1997). Así, los pequeños péptidos estaban disponibles por actividad ribozima. En consecuencia, se ha propuesto una modificación del ARN como ácido péptido nucleico (PNA), con enlaces péptidos más estables en lugar de enlaces fosfodiéster (Zhang y Cech, 1997; Joyce, 2002). La replicación de moléculas de ARN se puede realizar químicamente a partir de ARN sin enzimas de polimerasa. Además, las deoxiribozimas pueden formarse a partir de ribonucleótidos (Wilson y Szostak, 1999). Así, el ADN puede surgir de ARN químicamente, sin la enzima proteica clave, la transcriptasa inversa. Todo un mundo vivo es posible a partir de ARN no codificante (ncRNA) antes de la evolución del código genético y enzimas proteicas. Ribozymes naturalmente consisten en ARN circulares de una sola cadena (Orgel, 2004). Carecen En lugar de ello, exhiben información estructural por los loops de horquilla que forman enlaces de hidrógeno entre hilos dobles incompletos, y lazos libres para interactuar con otras moléculas. Representan una cuasiespecie en la que muchas especies de ARN pueden formar, tales como ribozimas, moléculas similares a tRNA, y otros ncRNAs. Los ARNs dentro de tal grupo pueden unir aminoácidos. Noventa aminoácidos diferentes se han identificado en el meteorito Murchison encontrado en Australia, mientras que en la Tierra sólo alrededor de 20 de ellos se utilizan para la síntesis de proteínas (Meierhenrich, 2008). Donde la formación de ribozimas ocurrió en la Tierra primitiva es una cuestión de especulación. Los respiraderos hidrotermales como los fumadores negros en el océano profundo son posibilidades donde la vida puede haber comenzado (Martin et al., 2008). Allí, los gradientes de temperatura y Los poros o nichos ofrecen posibilidades de concentración de bloques de construcción, lo que es necesario para que ocurran reacciones químicas. Curiosamente, también el hielo es un candidato para la formación de ribozimas y reacciones químicas. Los cristales de hielo desplazan las biomoléculas en la fase líquida, lo que conduce a la concentración, creando una compartimentación cuasicelular donde se promueve la síntesis de novo de precursores de nucleótidos. Allí, puede surgir ARN y ribozimas, que son capaces de autorreplicarse (Attwater et al., 2010). Los complejos de ácido amino-tRNA pueden encontrar ARNs como "mRNAs". Tales interacciones podrían haber contribuido a la evolución del código genético. Esta secuencia de eventos puede conducir a precursores ribosoma primitivos. Las ribozimas son los elementos catalíticos esenciales en los ribosomas: "El ribosoma es un ribozima" (Cech, 2000), suplementado con cerca de un centenar de proteínas de andamio más tarde durante la evolución. Las proteínas tienen funciones estructurales y contribuyen indirectamente a la actividad enzimática. ¿Son estos ribozimas ribosomados fósiles de la Tierra primitiva? Los pequeños péptidos pueden ser formados por ribozimas antes de la evolución de los ribosomas, por lo que los aminoácidos simples o diméricos pueden originarse en el universo (Meierhenrich, 2008). Los pequeños péptidos con aminoácidos básicos pueden aumentar la actividad catalítica de las ribozimas como se muestra in vitro (Müller et al., 1994). Tales proteínas se conocen como proteínas de unión del ARN de virus del ARN que protegen el genoma del ARN, con motivos tales como RAPRKKG del nucleocápsido NCp7 del VIH (Schmalzbauer et al., 1996). Péptidos pueden mejorar la actividad catalítica de ribozimas hasta un 100 veces (Müller et al., 1994). Tales péptidos de virus del ARN sirven como chaperonas que eliminan estructuras de ARN de orden superior, permitiendo una interacción más eficiente de moléculas de ARN y aumentando las tasas de transcripción de polimerasas del ARN (Müller et al., 1994). Ribonucleoproteínas también pueden haber sido funcionalmente importantes durante la evolución de ribosomas (Harish y Caetano-Anolles, 2012). Estas estructuras preribosomales son también La transcripción inversa puede ser realizada químicamente por ribozimas. Esta acción no requiere necesariamente una proteína polimerasa como la transcriptasa inversa. Del mismo modo, los deoxiribonucleótidos pueden surgir por la eliminación de un oxígeno sin la necesidad de una enzima proteica (una reductasa) como hoy, y permitir la polimerización del ADN (Wilson y Szostak, 1999; Joyce, 2002). Los mismos elementos de los precursores para ribosomas también son bloques de construcción de retrovirus, que pueden tener un origen evolutivo similar (Moeling, 2012 (Moeling,, 2013. tRNAs sirven como imprimadores para la transcriptasa inversa, y la secuencia de promotores de elementos transponibles se derivan de tRNAs (Lander et al., 2001). Los ribozimas se desarrollaron en intrones más complejos del grupo de autoescisión II con la inserción de genes que codifican una transcriptasa inversa y proteínas adicionales (Moelling y Broecker, 2015; Moelling et al., 2017) (Figura 1). Surgió como sorpresa que los genomas de casi todas las especies son ricos en ncDNA, transcriptos en ncRNAs, pero no codificando proteínas, como se evidencia, por ejemplo, por el proyecto "Enciclopedia de Elementos de ADN" (ENCODE). ncDNA equivale a más del 98% del genoma de ADN humano (Deveson et al., 2017). Los organismos más altos tienden a tener más información no codificante, lo que permite modos más complejos de regulación genética. Los ncRNAs son reguladores de las secuencias de codificación de proteínas. ncRNA puede variar desde cerca de cero en las bacterias más pequeñas como Pelagibacter ubique hasta alrededor del 98% en el genoma humano. Los virus de ARN como el retrovirus HIV albergan a los ncRNAs para la regulación génica como el elemento de respuesta transactivante (TAR), el sitio de unión para la proteína Tat para la expresión temprana del gen viral. Tat tiene un dominio altamente básico que comprende principalmente residuos de Lys y Arg, que se asemejan a otras proteínas de unión de ARN. ncRNA también sirve en genomas de ARN virales como sitios de entrada ribosomal, sitios de unión de imprimación o señales de empaquetado. La síntesis del ADN depende de la síntesis del ARN como evento inicial, con ARN como iniciadores para la replicación del ADN, dentro de células como FIGURE 1 Un compartimento se muestra con componentes ARN no codificante (ncRNA), ribozimas o viroides, pueden realizar muchos pasos para la vida sin genes codificantes de proteínas, pero sólo por información estructural. Los aminoácidos individuales están indicados como puntos negros y pueden estar disponibles en la Tierra desde el universo. El ADN puede haber existido antes de retrovirus. El compartimento puede ser interpretado como previrus o precélulas. Viroide, verde; ARN, rojo; ADN, negro. así como durante la replicación retroviral, demostrando un requisito de ARN (Flint, 2015). El número de genes codificantes de proteínas de mamíferos es de alrededor de 20.000. Sorprendentemente, esto es sólo una quinta parte del número de genes de trigo pan (Appels et al., 2018). Tulips, maíz y otras plantas también tienen genomas más grandes, lo que indica que el número de genes no refleja necesariamente la ¿Podrían los genomas gigantes ser el resultado de la cría de plantas por agricultores o jardineros? De acuerdo con Szostak hay moléculas que aparecen como reliquias del mundo del ARN como el acetil-CoA o la vitamina B12, ambos están ligados a un ribonucleótido sin ninguna razón obvia - ¿se "olvidaron" para ser removidos? (Roberts y Szostak, 1997; Szostak et al., 2001; Szostak, 2011). Tal vez el ARN conectado sirve como estabilizador estructural. Las vesículas lipídicas podrían haber formado los primeros compartimentos y ribozimas cerrados, tRNAs con aminoácidos seleccionados, y ARN que se convirtieron en mRN. ¿Es esto un pre-células o pre-virus (Figura 1)? Patel et al. (2015) demostró que los bloques de construcción de la vida, ribonucleótidos, lípidos y aminoácidos, se pueden formar a partir de C, H, O, P, N, S en una síntesis de "una olla". Este estudio se puede considerar como un estudio de seguimiento de la síntesis clásica Urey-Miller in vitro de biomoléculas (Miller, 1953; Miller y Urey, 1959). La transición del ARN al mundo ADN fue promovida por la formación de la transcriptasa inversa. La enzima fue descrita por primera vez en retrovirus pero es casi ubicua y se encuentra en numerosas especies celulares, muchas de las cuales con funciones desconocidas (Simon y Zimmerly, 2008; Lescot et al., 2016). Es un vínculo importante entre el ARN y los mundos del ADN. El nombre de transcriptasa inversa es histórico e irritante porque es la transcriptasa "real" durante la transición del ARN al mundo del ADN. Del mismo modo, la ribonucleasa H (RNase H) es una enzima esencial de retrovirus (Mölling et al., 1971). La RNASA H resultó ser una de las cinco proteínas más frecuentes y antiguas (Ma et al., 2008 ) que pertenece a una superfamilia de más de sesenta representantes únicos diferentes y 152 familias con numerosas funciones (Majorek et al., 2014). Algunos de los muchos tRNAs pueden llegar a ser cargados con aminoácidos. Hay virus que contienen estructuras similares a tRNA (TLS), que se asemejan a estos primeros ARNs (Dreher, 2009). Los virus TLS incluyen virus de plantas, como el virus del mosaico amarillo de Turnip, en el virus del grupo de maní, el virus del mosaico de tabaco (TMV), y el virus del mosaico de Brome. Sólo la mitad del ARNt se encuentra en los Narnavirus de hongos. Los aminoácidos conocidos por ser componentes de virus similares al ARNt son valina, histidina y tirosina. Las estructuras también fueron designadas como "mimícritas", mejorando la traducción (Dreher, 2009 (Dreher,, 2010 ). Parecen elementos precursores "congelados" para la síntesis de proteínas. Esta combinación de un tRNA parcial vinculado a un aminoácido puede interpretarse como un paso evolutivo hacia la síntesis de proteínas, atrapado en un elemento viral. Los viroides carecen de capas proteicas y por lo tanto inicialmente no fueron designados como virus sino como virus cuando fueron descubiertos en 1971 por Theodor Diener. Él describió a los viroides como "fósiles vivos" (Diener, 2016) (Figura 2). De las patatas infectadas, Diener aisló el tubérculo del huso de la patata (PSTVd) cuyo genoma era aproximadamente 100 veces más pequeño que los de los virus conocidos en ese momento. Los viroides conocidos hoy en día van desde 246 hasta 467 nucleótidos. Contienen ARN circular de una sola cadena, son libres de proteínas y autorreplicantes sin información genética, pero sólo estructurales FIGURA 2 Los viroides son estructuras de horquilla y se muestran esquemáticamente y como micrografía electrónica. Viroides son, como ribozimas, sin información genética y juegan papeles biológicos importantes hoy en día en enfermedades de las plantas, en flores de claveles, en cáncer de hígado, como catalizador de la síntesis de proteínas en ribosomas y como ARNs regulatorios circulares, como "esponjas" para otros ARNs regulatorios. información en forma de horquillas de pelo (Riesner et al., 1979). Pueden generar copias de sí mismos en el entorno apropiado. Fueron designados como las "fronteras de la vida" (Flores et al., 2014). El conocimiento de la composición del virus se basó en TMV y su cristalización por Wendell Stanley en 1935 (Pennazio y Roggero, 2000). El genoma de TMV es ARN singlestranded codificante de proteínas de alrededor de 6.400 nucleótidos que está encerrado por una capa prote Los viroides, por el contrario, no codifican proteínas y carecen de capas, pero están estrechamente relacionados con los virus. Los viroides pueden perder su autonomía y dependen de las polimerasas del ARN huésped para replicarse, son capaces de infectar las plantas y muchos son patógenos económicamente importantes. Hay dos familias, el núcleo-replicante Pospiviroidae como PSTVd y el cloroplasto-replicante Avsunviroidae como el Viroide Sundblotch Aguado (ASBVd). Su replicación requiere enzimas del huésped. Por lo tanto, la autonomía es reemplazada por la dependencia de las enzimas del huésped y un estilo de vida intracelular. La mayoría de los viroides son a menudo ribozimáticamente activos -sin embargo son ejemplos de que este rasgo puede perderse como resultado de las condiciones ambientales cambiantes. Sólo las variantes nucleares, las Pospiviroidae, pueden perder su actividad ribozimática y utilizar la enzima RNASA III celular para su replicación. En contraste, las Avsunviroidae siguen siendo ribozimas de cabeza de martillo activas. Así, dentro del núcleo de una célula huésped, la función RNA enzimática puede volverse innecesaria. No genes, sino una función, la actividad catalítica, se pierde. Viroides aparentemente no ganar genes, pero cooperó para un estilo de vida más complejo. Por ejemplo, Carnation pequeño ARN tipo viroides (ARN CarSV) coopera con un retrovirus y está acompañado por un ADN homólogo generado por una transcriptasa inversa. Esta enzima presumiblemente se origina de un pararetrovirus de las plantas. Pararetrovirus empaqueta partículas del virus en una etapa diferente durante la replicación que retrovirus, el ADN, no el ARN Esta combinación única entre dos elementos virales sólo se ha detectado hasta ahora con CarSV en flores de claveles (Flores et al., 2005) (Flores et al.,, 2014. ¿Por qué tal cooperación evolucionó -tal vez por los jardineros reproductores? El ARN es sensible a la degradación; por lo tanto, el aumento genético y el crecimiento del genoma puede no ser favorable energéticamente -al menos no en las plantas. Ganancia de la función es, en este caso, la cooperación. El ARN circular (ARN circular) está relacionado con ribozimas/viroides como un regulador principal de otros ARN regulatorios, un ARN "esponja" que absorbe pequeños ARNes. Micro ARNs (miRNs) son reguladores post-transcripcionales que se ven afectados por la presencia de ARN circulares. se detectaron ARNs en cerebros humanos y Pueden unir 70 miRNA conservadas en una célula y su cantidad es de hasta 25.000 moléculas (Hansen et al., 2013). Su estructura recuerda a ribozimas catalíticamente activas. Hay un viroides excepcionales que obtuvieron información codificante y entraron en el hígado humano (Taylor, 2009). El viroides se conoce como virus delta de la hepatitis (HDV). Tiene el genoma más pequeño de cualquier virus animal conocido de cerca de 1.680 nucleótidos. Tiene propiedades típicas de los viroides, ya que contiene ARN circular, forma saltos de horquilla similares y réplicas en el núcleo utilizando enzimas huésped. Dos polimerasas tienen que redirigir su especificidad del ADN al ARN para generar el genoma y el antígeno del HDV. Ambos tienen actividad ribozima. En contraste con otras ribozimas, el HDV codifica una proteína, el antígeno delta de la hepatitis (HDVAg) que se presenta en dos formas, el pequeño HDVAg (24 kDa) que soporta la replicación y el gran HDVAg (27 kDa) que ayuda al ensamblaje del virión. El gen fue presuntamente recogido de la célula huésped por la recombinación del ARNm del HDV intermedio con un ARNm del huésped. La transmisión depende de un virus ayudante, el virus de la Hepatitis B (VHB), que entrega la capa (Taylor, 2009 ) ¿El empaquetado por un virus ayudante protege el genoma y por lo tanto permite que exista un viroides más grande? En las plantas, los viroides pueden no ser capaces de hacerse más grandes posiblemente debido a su sensibilidad a la degradación - pero tampoco pueden ser mucho más pequeños. Sólo se conoce un único viroides que está compuesto completamente de ARN codificante de proteínas con trillizos (AbouHaidar et al., 2014). Los viroides y los ARN replicantes relacionados son unidades replicantes propensas a errores y la frecuencia de error les impone un cierto tamaño mínimo, ya que de otro modo se extinguirían. Este mecanismo ha sido descrito como "catástrofe de error", lo que impide la supervivencia (Eigen, 1971 (Eigen,, 2013 ). Los viroides y ARN relacionados son los más pequeños réplicas conocidas. Los más pequeños se extinguirían en ausencia de sistemas de reparación. En resumen, el ARN puede catalizar muchas reacciones. Las enzimas proteicas que pueden haber evolucionado más tarde tienen mayores actividades catalíticas. Los ribozimas son portadores de información, pero no requieren genes de codificación. La información se almacena en su secuencia y estructura. Así, la replicación de un ARN inicial es seguida por el flujo de información, del ADN al ARN a la proteína, como se describe el Dogma Central (Crick, 1968). Incluso un flujo de información de la proteína al ADN ha sido descrito para algunas proteínas arqueales (Béguin et al., 2015). El mundo de proteínas de ADN contiene numerosos NCRNAs con funciones clave. ncRNA puede servir como un compuesto modelo para el origen de la vida en otros planetas. Por lo tanto, no la composición química de esta molécula es de importancia primordial, pero su simplicidad y multifuncionalidad. Además, el ARN es software y hardware en una sola molécula, que lo hace único en nuestro mundo. Hay otros escenarios además del aquí discutido "virus-first, " tales como "proteína-first", "metabolismo-fist" o el "mundo lípido" (Segré et al., 2001; Andras and Andras, 2005; Vasas et al., 2010; Moelling, 2012). Algunos de estos conceptos alternativos se construyeron sobre la filogenómica, la reconstrucción del árbol de la vida por secuenciación del genoma (Delsuc et al., 2005). Sorprendentemente, fue Sir Francis Crick, uno de los descubridores de la doble hélice del ADN, que declaró que no se sorprendería de un mundo completamente construido de ARN. Una predicción similar fue hecha por Walter Gilbert (Crick, 1968; Gilbert, 1986). ¡Qué visión! Nuestro mundo fue casi 50 años más tarde definido como "proteína ARN" mundo (Altman, 2013). Se puede especular que nuestro mundo fue construido de ribozimas o viroides, lo que significa "virus primero". Los ncRNAs aparecen como reliquias del mundo ARN pasado, antes de que el ADN, el código genético y las proteínas evolucionaran. Sin embargo, el ncRNA es esencial en nuestro mundo de ADN biológico hoy en día. Es posible producir tal ncRNA hoy en el tubo de prueba por pérdida de información génica de ARN codificante de proteínas. Esta reducción al ncRNA se demostró in vitro con ARN fago. El ARN genómico Qβ, 4.217 nucleótidos de longitud, fue incubado en presencia de replicasa Qβ, nucleótidos y sales libres, un medio rico en el tubo de prueba. El ARN se permitió replicar por medio de la réplica Qβ. La transferencia serial de alícuotas a medio fresco llevó a tasas de replicación cada vez más rápidas y a la reducción del tamaño genómico, hasta 218 nucleótidos de ncRNA en 74 generaciones. Este estudio demostró que, dependiendo de las condiciones ambientales, se puede producir una reducción génica extrema. Este experimento realizado en 1965 fue designado como "Monstruo de Spiegelman". El ARN de codificación se convirtió en replicación de ncRNA (Spiegelman et al., 1965; Kacian et al., 1972)! Manfred Eigen amplió este experimento y demostró además que una mezcla que no contiene ARN para empezar con pero sólo ribonucleótidos y la réplica Qβ puede bajo las condiciones correctas en un tubo de prueba generar espontáneamente ncRNA auto-replicante. Esto evolucionó en una forma similar al Monstruo de Spiegelman Además, un cambio en la concentración enzimática y la adición de ARN cortos o un intercalador de ARN influyeron en la población de ARN emergente (Sumper y Luce, 1975; Eigen, 2013). Así, la complejidad de los genomas depende del medio ambiente: las malas condiciones conducen a una mayor complejidad y a entornos ricos a una menor complejidad. El proceso demostrado en este experimento con componentes virales indica que la reversión a la simplicidad, la reducción de tamaño, la pérdida de información genética y la velocidad de replicación pueden ser las principales fuerzas de la vida, aunque esto parezca ser como una reversión de la evolución. El experimento puede tal vez ser generalizado desde el tubo de ensayo a un principio, que los sobrevivientes más exitosos en nuestro planeta son los virus y microorganismos, que se convirtieron en las entidades más abundantes. Tal vez la vida pueda comenzar de nuevo. Estos estudios plantean la cuestión de cómo las moléculas de ARN pueden llegar a ser Esto puede ser superado por el flujo de calor a través de un poro abierto en rocas sumergidas, que concentra la replicación de oligonucleótidos de un flujo de alimentación constante y la selección de hebras más largas. Esto se ha descrito para un aumento de 100 a 1.000 nucleótidos in vitro. Moléculas de ARN menores de 75 nucleótidos morirán (Kreysing et al., 2015). ¿Podría un medio ambiente pobre conducir a un aumento de complejidad? Esto podría ser probado. Ribozimas se demostró que crecen en tamaño por absorción de genes, como se demostró para HDV (Taylor, 2009 ). Un ejemplo inesperado interesante reciente que apoya la noción de que las condiciones ambientales influyen en la complejidad genética, es el microbioma intestinal humano. Su complejidad aumenta con diversos alimentos, mientras que alimentos ricos uniformes reducen su diversidad y pueden conducir a enfermedades como la obesidad. Unas pocas docenas de especies bacterianas y virales/fagos se conservan entre individuos (secuencias básicas) como una composición estable (Broecker et al., 2016c. La disbiosis se ha observado en varias enfermedades crónicas y en la obesidad, una pérdida de riqueza y diversidad bacterianas. La nutrición en condiciones afluentes con alimentos ricos en azúcar contribuye a la obesidad, lo que resulta en una reducción significativa de la complejidad del microbioma. Esta reducción es difícil de revertir (Cotillard et al., 2013; Le Chatelier et al., 2013). El microbioma intestinal en pacientes humanos con obesidad recuerda a la reducción genética descrita en el experimento del Monstruo de Spiegelman: reducción de genes en un entorno rico. La reducción de la complejidad del microbioma se atribuye en parte a la acción de los fagos, que bajo tales condiciones, definidas como estrés, lisian las El trasplante de microbiota fecal puede ser reemplazado incluso por fracciones solubles que contienen fagos o metabolitos del donante sin bacterias (Ott et al., 2017). Analógicamente, los microbiomas más complejos se encuentran en las tribus humanas indígenas de África, que viven en una amplia variedad de nutrientes diferentes. Es un proceso lento, sin embargo, para aumentar la complejidad de la microbiota intestinal por nutrición diversa. La microbiota asociada a la obesidad que sobrevive son más aptas y difíciles de contrarrestar. Urbanización y occidentalización de la dieta se asocia con una pérdida de biodiversidad microbiana, pérdida de organismos microbianos y genes (Segata, 2015). Para entender el mecanismo y la fuerza motriz para la reducción del genoma, las tasas de eliminación se probaron mediante la inserción de un gen indicador en el genoma de Salmonella entérica. La pérdida del gen indicador fue monitoreada por el paso en serie Las deleciones resultaron en genomas más pequeños con reducción o ausencia de genes de reparación de ADN (Koskiniemi et al., 2012). La pérdida de genes confirió una mayor aptitud a las bacterias bajo estas condiciones experimentales. Los mimivirus recientemente descubiertos y otros virus gigantes son dignos de considerar para entender la evolución de la vida con respecto a la contribución de los virus. Sus anfitriones son, por ejemplo, Acanthamoeba, Clorella, y Coccolithus algas (Emiliania huxleyi), pero también corales o esponjas como se discutió más recientemente. Los mimivirus fueron descubiertos por primera vez en torres de agua de refrigeración en Bradford, Reino Unido en 2003 con cerca de 1.000 genes, la mayoría de los cuales no relacionados con genes conocidos anteriormente. Los mimivirus han recibido atención porque contienen elementos que se consideraban distintivos de células vivas, no de virus, Los mimivirus albergan estos bloques de construcción como conjuntos incompletos que no son suficientes para la síntesis de proteínas independientes como las bacterias o las arcaeas pueden realizar, evitando que lleven una vida autónoma (La Scola et al., 2003 Scola et al.,, 2008. Son más grandes que algunas bacterias. Los virus gigantes pueden ser vistos como en un camino evolutivo hacia un organismo celular. Alternativamente, pueden haber evolucionado de un organismo celular por pérdida de información genética (Nasir y Caetano-Anolles, 2015). Los virus gigantes han tomado con frecuencia genes de sus anfitriones por transferencia horizontal de genes (HGT) (La Scola et al., 2008; Nasir y Caetano-Anolles, 2015; Colson et al., 2018). Un gráfico sobre los tamaños del genoma muestra que los mimivirus y las bacterias se superponen en tamaño, lo que indica una transición continua entre virus y bacterias y entre mundos vivos y no vivos (basado en Holmes, 2011) (Figura 3). Otros virus gigantes, como los megavirus, fueron descubiertos en el océano de Chile con 1.120 genes. Más recientemente, el Klosneuvirus fue identificado en las aguas residuales del monasterio Klosterneuburg en Austria en 2017 con 1.57 millones de pares de bases (Mitch, 2017). Pithovirus sibericum es el más grande entre los virus gigantes descubiertos hasta la fecha con un diámetro de 1,5 micras, un genoma de 470.000 pb con 467 genes putativos, 1,6 micras de longitud, y es presumiblemente de 30.000 años ya que fue recuperado de permafrost en Siberia (Legendre et al., 2014 Los virus Pandora más pequeños con 1 micron de longitud tienen genomas cinco veces más grandes, 2.500.000 pb (Philippe et al., 2013) (Figura 3). Los virus gigantes incluso pueden ser hospedadores de virus más pequeños, los virófagos, que recuerdan a los bacteriófagos, los virus de las bacterias. Estos virófagos como Sputnik son sólo 50 nm de tamaño con 18.343 pb de ADN circular y 21 genes de codificación proteica predichos. Se replican en fábricas virales y consumen los recursos del mimivirus, destruyéndolo así. Algunos, los virófagos incluso pueden integrarse en el genoma del huésped celular y se pueden reactivar cuando el huésped está infectado por virus gigantes. Así, virus gigantes sugieren que los virus están cerca de entidades vivas o pueden haber estado vivos (La Scola et al., 2008; En biología es común distinguir entre materia viva y muerta por la capacidad de sintetizar proteínas y replicar autónomamente. Los virus gigantes pueden ser considerados como un eslabón faltante entre los dos, porque albergan "casi" el aparato de síntesis de proteínas. La transición de vivir al mundo no vivo es continua, no separada por una línea fronteriza aguda (Figura 3). Los virus no son considerados vivos por la mayoría de la comunidad científica y como se escribe en los libros de texto, porque no pueden replicarse autónomamente. Sin embargo, algunos de los virus gigantes están equipados con casi todos los componentes de la maquinaria de síntesis de proteínas cerca de bacterias que sugieren que pertenecen a la materia viva (Schulz et al., 2017). Las ribozimas pueden haber sido la entidad replicante más temprana. Tal vez también otros virus fueron inicialmente más independientes de la Tierra primitiva que hoy en día. Como se describe en la Figura 1 puede haber sido inicialmente Sólo más tarde los virus pueden haber renunciado a su replicación autónoma y convertirse en parásitos, como se ha descrito para algunas bacterias (véase más adelante). Se han hecho esfuerzos para identificar la célula viva más pequeña que todavía se replica de forma autónoma. Entre las bacterias que presumiblemente se encuentran Pelagibacter ubique del clado SAR11 de bacterias (Giovannoni, 2017), que se descubrió en 1990. Es un alfa-proteobacterio con 1.389 genes presentes ubicuamente en todos los océanos. Puede alcanzar hasta 10 28 células vivas libres en total y representa aproximadamente el 25% de las células de plancton microbiano. Muy poco de su ADN es no codificante. Alberga fagos de tipo podofago, designados como "pelagiphage" (Zhao et al., 2013). Este pequeño bacteria fue designado como el organismo más común en el planeta. ¿ Esta bacteria autónoma es más pequeña que algunos virus gigantes parasitarios. Craig Venter, que primero logró secuenciar el genoma humano, trató de minimizar el genoma más pequeño putativo de una especie viva, de Mycoplasma mycoides, una bacteria parasitaria que vive en rumiantes (Gibson et al., 2008 (Gibson et al.,, 2010. Su grupo sintetizó un genoma de 531.000 bp con 473 genes, 149 de ellos (32%) con funciones desconocidas (Hutchison et al., 2016). Entre los organismos parasitarios vivos más pequeños está Nanoarchaeum equitans. Es un arqueón termofílico que vive a 80 • C y a pH 6 con 2% de sal (Huber et al., 2003). Su genoma tiene un tamaño de 490.000 bp y codifica 540 genes. N. equitans es un simbionte obligatorio de un arqueón más grande, Ignicoccus montando en él como en un caballo, de ahí el nombre (Huber et al., 2003). El mundo de los virus cubre una gama de tres troncos en tamaño de sus genomas: desde genes cero a cerca de 2.500 genes que ascienden a cerca de 2.500.000 bp de ADN. Los viroides de origen cero tienen unas 300 bases de longitud (Figura 3). La virosfera es el reservorio más exitoso de entidades biológicas en nuestro planeta en términos de número de partículas, velocidad de replicación, tasas de crecimiento y espacio secuencial. Hay alrededor de 10 33 virus en nuestro planeta y están presentes en cada especie existente (Suttle, 2005). No hay especies vivas sin virus! Los virus también ocurren libremente en los océanos, en el suelo, en nubes hasta la estratosfera y más Poblan el intestino humano, el canal de nacimiento y el exterior del cuerpo como capa protectora contra las poblaciones microbianas. Los microbios contienen fagos que se activan durante condiciones de estrés tales como la falta de nutrientes, el cambio de temperatura, la falta de espacio y otros cambios de las condiciones ambientales. Uno de los papeles más agitadores de la tierra de este siglo fue la publicación de la secuencia del genoma humano (Lander et al., 2001). Alrededor de la mitad, posiblemente incluso dos tercios de la secuencia se componen de retrovirus endógenos más o menos completos (ERVs) y retroelementos relacionados (REs) (de Koning et al., 2011). Las RE amplifican a través de mecanismos de copia y pasta que implican un paso de transcriptasa inversa de un ARN intermedio en ADN. Además, los elementos transponibles del ADN (TEs) se mueven por un mecanismo de corte y El origen de las REs está siendo discutido como restos de infecciones germinales retrovirales antiguas que se fijaron evolutivamente en el genoma. Alrededor de 450.000 elementos ERV humanos (HERV) constituyen alrededor del 8% del genoma humano consistente en elementos retrovirales distintivos como la mordaza, pol, genes env y repeticiones terminales largas flanqueantes (LTR) que actúan como promotores (Lander et al., 2001). Howard Temin, uno de los descubridores de la transcriptasa inversa, en 1985 ya describió elementos similares a retrovirus endógenos, que estimó en cerca del 10% de la secuencia del genoma humano y del ratón (Temin, 1985). El número real es alrededor del 45% como se estima hoy (Lander et al., 2001). En algunos genes como el gen Protein Kinase Inhibitor B (PKIB) determinamos alrededor del 70% de secuencias ¿Hay un límite? ¿Podría haber sido 100%? Se estima que los retrovirus han entrado en el linaje del genoma mamífero hace 550 millones de años (MYA) (Hayward, 2017). Las secuencias ERV más antiguas pueden existir pero hoy son irreconocibles debido a la acumulación de mutaciones. Los ERV sufren mutaciones, deleciones o eventos de recombinación homóloga con grandes deleciones y pueden llegar a ser tan cortos como los elementos LTR solos, que son unos pocos cientos de pb en longitud - los sobrantes de genomas retrovirales de larga duración de alrededor de 10.000 pb. Los promotores LTR pueden desregular genes vecinos. Los eventos de recombinación homóloga pueden ser considerados como eventos de pérdida de genes o reducción de genes. Es la suposición de que los ERV, que ya no eran necesarios para la defensa celular del huésped, ya no fueron Eugene Koonin señala que la infección y la integración son eventos únicos que se producen a un ritmo rápido, mientras que la pérdida y la reducción de genes pueden tardar mucho más tiempo (Wolf y Koonin, 2013). Una reducción frecuente de genes de genomas eucariotas es la pérdida de la proteína de envoltura viral codificada por el gen env. Sin un abrigo, los retrovirus ya no pueden dejar la célula e infectar otras células. Pierden la movilidad y se convierten en elementos intracelulares obligatorios. Los virus ayudantes pueden suministrar proteínas de envoltura en trans y movilizar los virus. Las TEs o REs se pueden considerar como ejemplos de reliquias de virus intracelulares sin capa -o podría haber sido al revés, tal vez precursores de retrovirus de larga duración? Estos elementos pueden amplificarse intracelularmente y modificar los genomas del huésped mediante la integración con el peligro potencial de alteración genética y cambios genéticos. Las REs pueden llevar a la duplicación de genes y al desarrollo de pseudogenes, con una copia para la conservación estable de las funciones adquiridas y la otra para las innovaciones (Cotton y Page, 2005). Tales duplicaciones constituyen grandes cantidades de genomas de mamíferos (Zhang, 2003). Los retrovirus tienen una duplicación de moiety RNASa H, una de las cuales sirve como enlace catalíticamente inactivo entre la RT polimerasa y la enzimáticamente activa RNASa H (Xiong y Eickbush, 1990; Malik y Eickbush, 2001; Moelling y Broecker, 2015; Moelling et al., 2017). Esta duplicación de genes se remonta a 500 millones de años (Cotton y Page, 2005). Las duplicaciones de genes son una causa común de cáncer, que a menudo se produce sólo en el genoma de la célula cancerosa en sí, Myc, Myb, ErbB2, Ras y Raf son oncogenes amplificados en diversos tipos de cánceres humanos (Vogelstein y Kinzler, 2002). La capacidad de los retrovirus para integrarse los hace distintos de los endosimbiontes que permanecen separados. Sin embargo, el resultado neto es muy similar, la adquisición de nueva información genética, que se transmite a la siguiente generación, si la línea germinal está infectada y se produjo la endogenización del virus. La integración viral no se limita a las células eucariotas, sino también un mecanismo en procariotes para el mantenimiento del estado lisogénico de los fagos dentro de las bacterias. Además, para otros virus eucariotas como el VHB, el antígeno de superficie envolvente BHsAg se puede eliminar, lo que conduce a un estilo de vida intracelular obligatorio para el virus, que especialmente en presencia de VHC promueve el cáncer (Yang et al., 2016). Se ha demostrado que el VIH pierde rápidamente uno de sus genes auxiliares, nef, originalmente por factor negativo. El gen se perdió dentro de un número bastante bajo de pasajes del virus crecido bajo condiciones de cultivo tisular por selección de células productoras de títulos de alto virus. La eliminación de nef resultó en un aumento significativo del título del virus en cultivo -de ahí el nombre. El producto del gen nef no era de necesidad dentro de las células de cultivo tisular, sino que era inhibitorio para la replicación. Sin embargo, es esencial para la patogenicidad en animales, y posteriormente nef fue reinterpretado como " Además, los hospederos humanos del VIH pueden perder una porción terminal significativa de un receptor de siete transmembranas en linfocitos, la célula diana primaria para la entrada del VIH y para la captación del virus. Esta molécula, el receptor de citocinas CCR5 es truncado por 32 aminoácidos carboxiterminales (CCR5-32), desactivando funcionalmente el receptor. La frecuencia de alelos del mutante CCR5-32 mutante es de alrededor del 10% en la población europea, haciendo que estas personas resistentes a las infecciones por VIH (Solloch et al., 2017). Esta pérdida genética en europeos ha demostrado hacer que los individuos resistentes no sólo contra la infección por VIH sino también contra la malaria. Esto puede haber sido la presión selectiva en el pasado antes de que el VIH/SIDA surgiera. No se ha descrito ningún efecto secundario para los seres humanos que carecen de este gen (Galva Los virus han demostrado ser motores de la evolución (Villarreal y Witzany, 2010), incluyendo el genoma humano, que por lo menos un 45% está compuesto de secuencias relacionadas con retrovirus. Además, los retrovirus endogenizados suministraron los genes de sincitina que son esenciales para el desarrollo de la placenta mamífera, y permitieron el crecimiento de embriones sin su rechazo por el sistema inmune materno (Dupressoir et al., 2012). Así, la misma propiedad que causa inmunodeficiencia en pacientes infectados por VIH y conduce al SIDA causa la formación de sincitia, fusión celular después de la infección por un retrovirus. También se ha propuesto que los virus estén en el origen de la evolución de la inmunidad adaptativa (Villarreal, 2009 ). Así, los genomas conformados por virus mediante el suministro de genes y mecanismos esenciales. La endogenización de retrovirus se ha producido en los genomas Si los ERVs integrados no ofrecían ninguna ventaja selectiva, se deterioraban y acumulaban mutaciones con pérdida de función, lo que se demostró directamente mediante la reconstrucción de un retrovirus infeccioso a partir de la secuencia de consenso de 9 secuencias de virus endógenos defectuosos, designados como Phoenix. El virus se expresaba a partir de un clon sintético de ADN construido en cultivo celular y partículas de virus formados identificadas por análisis microscópicos de alta resolución (Dewannieux y Heidmann, 2013). Los koalas en Australia están siendo endogenizados de un retrovirus (koala retrovirus, KoRV) en "tiempo real" y demuestran posibles consecuencias para la inmunidad. A principios de 1900, algunos individuos fueron trasladados a islas, incluida la isla Kangarooo, cerca del continente australiano para fines de repoblación, ya que los koalas estaban amenazados de extinción. Sin embargo, los koalas aislados en la isla de Kangaroo son KoRV negativos, lo que permite datar la introducción de KoRV en la población de koalas hace unos cien años. Muchos de los koalas infectados cayeron enfermos y murieron, sin embargo algunas poblaciones se volvieron resistentes dentro de unos 100 años, correspondientes a unas 10 generaciones. Los koalas probablemente desarrollaron resistencia debido a los provirus de ADN integrados. El retrovirus se transmite como exógeno así como virus endógeno, similar al retrovirus de ovejas Jaagsiekte (JSRV), por lo que los virus endogenizados protegen con un producto génico viral, como Env, contra infecciones de novo por "exclusión de la superinfección" (Tarlinton, 2012). La contribución de los retrovirus a la defensa antiviral es sorprendente, ya que todos los genes retrovirales tienen genes análogos en el mecanismo de defensa de las células eucarióticas siRNA/RNAi (Moelling et al., 2006). Los retrovirus pueden proteger contra la infección por otros virus relacionados, por ejemplo, al expresar proteínas Env que bloquean los receptores de la superficie celular (Villarreal, 2011). Un mecanismo comparable protege a las células bacterianas contra los fagos de ADN, mediante fragmentos de ADN de fagos integrados que se transcriben en ARNm e hibridan a los nuevos fagos de ADN entrantes y por lo tanto conducen a su destrucción por nucleasasases híbridos específicos, inmunidad CRISPR/Cas (Charpentier y Doudna, 2013). A menudo no se da cuenta de que la adquisición de inmunidad en bacterias y células La integración de retrovirus ocurre normalmente en las células somáticas después de la infección como un paso obligatorio durante el ciclo de vida viral. La infección de las células germinales puede conducir a la transmisión a la próxima generación y en última instancia dar lugar a resistencia hereditaria. Los retrovirus endogenizados probablemente causaron resistencia FIGURA 4 Los virus protegen contra los virus: los retrovirus protegen a una célula contra una nueva infección por un virus similar designado como "exclusión de la superinfección" o interferencia viral. Esto es mediado por productos genéticos virales como proteínas o ácidos nucleicos. Del mismo modo, los fagos protegen contra los fagos: la superinfección de bacterias es evitada por el ARN CRISPR/Cas originado por infecciones anteriores. Los mecanismos de defensa contra virus y fagos son análogos. La protección de virus o fagos contra superinfección representa defensa celular y inmunidad adquirida. Los cuatro ejemplos se discuten Del mismo modo, la resistencia al virus de la Inmunodeficiencia Simiana (SIV) en algunas especies de monos puede explicarse por la endogenización (Li et al., 2017) (Li et al., 2018. En el caso de los fagos y sus hospedadores procarióticos, el mecanismo se describe como CRISPR/Cas, que siguen principios análogos de "endogenización" del material genético entrante para su posterior exclusión. Se puede especular que el VIH también puede llegar a ser endogenizado en el genoma humano. Hay alguna evidencia de que el VIH puede infectar las células germinativas humanas y transmitirse al genoma embrionario (Wang et al., 2011). ¿Cuánto tiempo puede tardar esto no se conoce -10 generaciones? La pérdida de la función de los VRV puede ocurrir por mutaciones, supresiones de los env u otros genes y, en última instancia, El número de elementos retrovirus suma alrededor de 450.000, lo que corresponde al 8% del genoma humano (Lander et al., 2001; Cordaux y Batzer, 2009 ). Las regiones promotoras fueron analizadas por su contribución al cáncer activando genes vecinos -como consecuencia de una antigua infección por retrovirus. De hecho, los genes celulares activados por "promoción descendente" fueron identificados en estudios animales con activación del gen mic como uno de muchos ejemplos, llevando a un desarrollo crónico y no agudo del cáncer (Ott et al., 2013). Como mecanismo general para el cáncer humano hoy en día los LTRs no son identificados como un culpable mayor. La mayoría de los ERVs que encontramos hoy se han integrado durante la evolución en intrones u otras regiones donde su presencia es relativamente inofensiva. ¿Resultaron los otros en la muerte de los portadores que desaparecieron? Los efectos de los LTRs en los niveles de expresión de los genes huéspedes vecinos fueron estudiados con el virus humano endógeno, HERV-K, como posible causa de cáncer, pero esto no parece ser un fenómeno general (Broecker et al., 2016b). Como se demostró para los koalas, los ERVs pueden conferir inmunidad a las infecciones virales (Feschotte et al., 2012). Se demostró que un ERV relacionado, HERV-H, produce un ARN que mantiene las células embrionarias tempranas pluripotentes e incluso revierte las células adultas para recuperar la pluripotencia (Grow et al., 2015). Así, el papel de los ERVs puede ser más complejo de lo que conocemos actualmente. Elementos transponibles y REs que perdieron la capacidad de transmisión celular mediante la eliminación de la proteína del abrigo contribuyen principalmente a la complejidad genética de Están "bloqueados" dentro de las células y son los principales impulsores del aumento de la complejidad genética (Cordaux y Batzer, 2009 ). Se podría especular que estos elementos intracelulares son retrovirus replicantesincompetentes que carecen de abrigos (Lander et al., 2001). Los murciélagos transmiten virus como el Ébola y el coronavirus SARS sin sufrir de enfermedad (Beltz, 2018). Incluso virus ARN como Bornavirus han demostrado integrarse por transcripción inversa ilegítima, posiblemente también proporcionando inmunidad contra la superinfección (Katzourakis y Gifford, 2010). Hay dos eventos prominentes que contribuyeron significativamente al éxito de la vida y la formación de células. Ambos están asociados con la reducción de genes. Este fenómeno puede jugar un papel para la evolución de los virus de estilos de vida autónomos a parásitos. En la década de 1960 Lynn Margulis propuso un origen extracelular para las mitocondrias (Margulis, 1970,, 1993 ). Una célula ancestral, tal vez un arqueón, fue infectada por una bacteria anaerobia, que dio lugar a las mitocondrias. Del mismo modo, cianobacterias formaron los cloroplastos en las células vegetales modernas. Mitocondrias surgió hace alrededor de 1.450 millones de años (BYA) (Embley y Martin, 2006). Mitocondrias y cloroplastos son los ejemplos más llamativos para un cambio en el estilo de vida de bacterias autónomas a endosimbiontes. Esta transición a menudo se considera como extremadamente rara y un sello distintivo de la evolución de la vida en nuestro planeta. Sin embargo, hay muchos otros parásitos intracelulares obligados como Rickettsia, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii (el agente causal de la fiebre Q), Mycobacterium leprae, M. tuberculosis, y M. mycoides (Beare et al., 2006). El cambio de estilo de vida de los endosimbiontes en los dos casos de mitocondrias y cloroplastos es sorprendente. Ambos redujeron drásticamente su composición genética. Mitocondria contiene menos de 37 genes, que dejaron de ser los originales alrededor de 3.000 genes. Es endogenización de retrovirus, los ERV, que se integran en células germinales, relacionadas con la endosimbiosis? Son estos modelos endosimbionts para la transición de un estilo de vida autónomo a una vida parasitaria que puede haber tenido lugar con virus? Un ejemplo típico más reciente para una evolución reductiva son Rickettsia. Estas bacterias se supone por algún tiempo que son virus debido a su existencia parasitaria intracelular obligatoria. Rickettsia han evolucionado de bacterias que replican autónomamente. Evolución reductiva de endosimbiontes puede producir bacterias con genomas diminutos a expensas de la vida extracelular autónoma. Sus genomas son 1,11 millones de pbp en longitud con cerca de 834 genes codificantes de proteínas, y pérdida de 24% por la evolución reductiva (Ogata et al., 2001). Rickettsia puede tener alguna relación con cianobacterias, que se consideran como los principales simbiontes. ¿Se puede especular que los virus pueden haber sido entidades autónomas inicialmente? Viroides pueden haber sufrido la transición de la autonomía a parásitos, tal como se muestra para mitocondria, cloroplastos o Rickettsia? ¿Hasta qué punto los virus han sido autónomos e independientes de los metabolismos celulares originalmente -y contribuyeron al origen de las células? ¿Podrían haber perdido su autonomía más tarde y convertirse en parásitos? Los virus son minimalistas en su composición y deben haber sufrido reducciones genéticas estrictas (Flint, 2015). ¿Cuán pequeños pueden llegar a ser sus genomas? La mayoría de los virus ARN codificados todavía contienen elementos reguladores, ncRNA en las 3 y 5 regiones terminales para la entrada ribosomal, síntesis proteica, regulación transcripcional, y otros. Un subgrupo de retrovirus es un ejemplo interesante en cuanto a la pérdida simultánea y la ganancia de información genética. Los retrovirus oncogénicos o tumoresvirus pueden recombinarse con genes celulares que bajo los promotores de retrovirus pueden convertirse en oncogenes y conductores de cáncer. Alrededor de cien oncogenes han sido seleccionados en los laboratorios y estudiados durante La selección de las ventajas de crecimiento de las células huésped llevó al descubrimiento de los oncogenes que promueven el crecimiento más rápido que conocemos hoy en día, como Ras, Raf, ErbB o Myc, que son en parte objetivos exitosos para los medicamentos anticancerosos (Moelling et al., 1984). Estos oncogenes fueron en la mayoría de los casos tomados por los retrovirus a expensas de los genes estructurales (gag), replicando (pol) o envolvente (env), y a menudo se expresan como proteínas de fusión con Gag. Así, los retrovirus oncogénicos son virus defectuosos intracelulares obligatorios y fueron seleccionados para en el laboratorio por los investigadores para los oncogenes con la capacidad de crecimiento más potente promover. Necesitan el suministro de genes replicatorios en trans de virus ayudantes co-infectantes para infectar otras células (Flint, 2015) Algunas cepas del virus del sarcoma de Rous mantienen la replicación competente al transportar el src derivado de la célula (para el sarcoma) oncogén que codifica una proteína de 536 aminoácidos que aparentemente pueden encajar en la partícula retroviral junto con el genoma viral de tamaño completo (Broecker et al., 2016a). Razones espaciales pueden haber influido en la formación de retrovirus oncogénicos y limitado su tamaño y, por lo tanto, llevado a sus fenotipos defectuosos. Hay indicios de que la actividad incontrolada de (retro)transposones en las células germinativas puede resultar en enfermedades como la infertilidad masculina -presumiblemente por "catástrofe grave", causada por demasiados eventos de transposición. En los mamíferos, los piRNAs doman la actividad transpoon por medio de la actividad de la RNASa H de las proteínas PIWI durante la espermatogénesis (Girard et al., 2006). Sólo una minoría de virus son patógenos; la mayoría de ellos no causan enfermedades. Por el contrario, son más importantes como impulsores de la evolución, como transmisores de material genético, como agentes innovadores. En particular, los virus ARN son los más innovadores. Algunos de ellos son patógenos y peligrosos, como el VIH o el virus influenza, o los viroides en las plantas. Los virus ARN son capaces de cambiar tan rápidamente que el sistema inmunitario del huésped es incapaz de contrarrestar la infección. La patogenicidad surge cuando las condiciones ambientales cambian, por ejemplo, cuando un virus entra en un nuevo organismo o especie. El aumento de la complejidad celular por virus es una característica importante de la evolución. Tales cambios evolutivos importantes son tomados recientemente como argumentos en contra de la teoría evolutiva por Charles Darwin quien consideró cambios graduales, pequeños incrementos por mutaciones como la base principal para la selección y la evolución. Nueva crítica está abordando este pensamiento, considerando cambios más grandes como impulsores evolutivos. Tales cambios surgen por muchos fenómenos complejos tales como endosimbiosis, infección por procariotos, virus y hongos, recombinación de genes, HGT, infecciones, sexo. Cambios dramáticos tales como endosimbiosis o infecciones de patógenos extienden el concepto de Darwin de evolución. Hay numerosos ejemplos para la contribución de virus a la evolución de la vida desde por lo menos hasta 550 MYA (Hayward, 2017). Pero el ruido genético a través de mutaciones aleatorias no nos permite volver al origen de la vida. Por analogía, se puede especular que en algún momento los virus autónomos renunciaron a la independencia para una vida intracelular obligatoria -como se ha descrito para las mitocondrias y los cloroplastos, pero también las bacterias intracelulares como Rickettsia. Esta especulación se basa en el concepto de que la vida temprana debe haber comenzado simple y con alta variabilidad genética y luego se volvió más compleja. Pero la complejidad se puede renunciar a un estilo de vida menos consumidor de energía con genomas pequeños y alta velocidad de replicación (Moelling, 2012 (Moelling,, 2013 ). Por lo tanto, la pregunta puede repetirse: "¿Son los virus nuestros antepasados más antiguos?"Alguna vida fósil puede ser parcialmente reproducida in vitro por los experimentos de seguimiento de Spiegelman y Eigen, explicando el gran potencial de supervivencia del NCRNA simple. Los virus pueden ser patógenos, pero su reconocimiento como causa principal de enfermedades es Esta noción se basa en la historia de los virus en la medicina, como se explica en un libro titulado "Viruses: More Friends Than Foes" (Moelling, 2017). El escenario descrito aquí se centra en los virus como motores de la evolución. El mundo del ARN temprano se interesó hace 20-30 años, como lo demuestran las referencias anteriores. Sorprendentemente, hay científicos que todavía creen en la "hipótesis del pansperm" y piensan que los retrovirus son de origen extraterrestre (Steele et al., 2018). El interés reciente en el origen de la vida surgió de los exoplanetas recién descubiertos cuyo número aumenta diariamente -y que pueden ser tan numerosos como 10 25. Así, las estadísticas puras hacen que algunas personas crean que hay vida extraterrestre. La vida extraterrestre se imita en laboratorios en la Tierra con muchos supuestos -quizás esta El debate que aquí se presenta debe considerarse como un concepto de réplica simple y de entidades en evolución posiblemente derivadas de diferentes bloques de construcción en otros entornos, siendo la estructura más relevante que la secuencia.

¿Cuáles fueron las primeras entidades replicantes que cumplen varios criterios para la vida?

Virus y evolución – ¿Virus Primero? Una Perspectiva Personalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6433886/SHA: f3b9fc0f8e0a431366196d3e835e1ec368b379d1Autores: Moelling, Karin; Broecker, FelixFecha: 2019-03-19DOI: 10.3389/fmicb.2019.00523Licencia: cc-byAbstract: El descubrimiento de exoplanetas dentro de zonas habitables putativas revolucionó la astrobiología en los últimos años. Estimuló el interés en la pregunta sobre el origen de la vida y su evolución. Aquí, discutimos cuáles podrían haber sido los roles de los virus al principio de la vida y durante la evolución. Los virus Están presentes en todas partes, en nuestros alrededores, los océanos, el suelo y en cada ser viviente. Los retrovirus contribuyeron a cerca de la mitad de nuestras secuencias genómicas y a la evolución de la placenta mamífera. Los virus contemporáneos reflejan la evolución que va desde el mundo del ARN hasta el mundo de las proteínas del ADN. ¿Hasta dónde podemos rastrear su contribución? Las entidades más tempranas que replican y evolucionan son las ribozimas o viroides que cumplen varios criterios de vida. El ARN puede realizar muchos aspectos de la vida e influencia nuestra expresión genética hasta hoy. Las estructuras más simples con información no codificante pueden representar modelos de vida construidos sobre información estructural, no genética. Los virus hoy son parásitos obligatorios dependiendo de las células huésped. Ejemplos de cómo un estilo de vida independiente podría haberse perdido son las mitocondrias, los cloroplastos, Rickettsia y otros, que solían ser bacterias autónomas y se convirtieron en parásitos o endosimbiontes intracelulares, perdiendo así la mayoría de sus genes. Incluso in vitro la pérdida de genes se puede recapitular todo el camino de la codificación a ARN no codificante. Además, los virus gigantes pueden indicar que no hay frontera aguda entre las entidades vivas y no vivas sino un continuo evolutivo. Aquí, se discute cómo los virus pueden perder y ganar genes, y que son motores esenciales de la evolución. Aparte de nuestra visión “virus primero”, hay otros como “proteínas primero” y “metabolismo primero”. Texto: Mycoplasma mycoides por eliminación sistemática de genes individuales resultó en un genoma sintético mínimo de 473 genes (Hutchison et al., 2016). ¿Puede uno considerar entidades vivientes más simples? Hay elementos con cero genes que cumplen muchos criterios para la vida temprana: ribozimas, ARN catalíticos estrechamente relacionados con los viroides. Fueron recuperados in vitro de 10 15 moléculas (aptadores), 220 nucleótidos en longitud, por 10 rondas de selección. Entre las muchas especies de ARN presentes en esta colección de cuasiespecies ARNs fueron miembros catalíticamente activos, ribozimas enzimáticamente activas. El espacio de secuencia para ARNs de 220-mers es de aproximadamente 3 × 10 132 (Eigen, 1971; Wilson y Szostak, 1999; Brackett y Dieckmann, 2006). Las ribozimas seleccionadas fueron capaces de replicar, separar, unir y formar enlaces péptidos. Pueden polimerizar químicamente la progenie, permitir que ocurran mutaciones y pueden evolucionar. Una molécula sirve como catalizador, la otra como sustrato. La replicación de ribozimas se demostró en el tubo de ensayo (Lincoln y Joyce, 2009). Ribozimas pueden formar enlaces péptidos entre aminoácidos (Zhang y Cech, 1997). Así, los pequeños péptidos estaban disponibles por actividad ribozima. En consecuencia, se ha propuesto una modificación del ARN como ácido péptido nucleico (PNA), con enlaces péptidos más estables en lugar de enlaces fosfodiéster (Zhang y Cech, 1997; Joyce, 2002). La replicación de moléculas de ARN se puede realizar químicamente a partir de ARN sin enzimas de polimerasa. Además, las deoxiribozimas pueden formarse a partir de ribonucleótidos (Wilson y Szostak, 1999). Así, el ADN puede surgir de ARN químicamente, sin la enzima proteica clave, la transcriptasa inversa. Todo un mundo vivo es posible a partir de ARN no codificante (ncRNA) antes de la evolución del código genético y enzimas proteicas. Ribozymes naturalmente consisten en ARN circulares de una sola cadena (Orgel, 2004). Carecen En lugar de ello, exhiben información estructural por los loops de horquilla que forman enlaces de hidrógeno entre hilos dobles incompletos, y lazos libres para interactuar con otras moléculas. Representan una cuasiespecie en la que muchas especies de ARN pueden formar, tales como ribozimas, moléculas similares a tRNA, y otros ncRNAs. Los ARNs dentro de tal grupo pueden unir aminoácidos. Noventa aminoácidos diferentes se han identificado en el meteorito Murchison encontrado en Australia, mientras que en la Tierra sólo alrededor de 20 de ellos se utilizan para la síntesis de proteínas (Meierhenrich, 2008). Donde la formación de ribozimas ocurrió en la Tierra primitiva es una cuestión de especulación. Los respiraderos hidrotermales como los fumadores negros en el océano profundo son posibilidades donde la vida puede haber comenzado (Martin et al., 2008). Allí, los gradientes de temperatura y Los poros o nichos ofrecen posibilidades de concentración de bloques de construcción, lo que es necesario para que ocurran reacciones químicas. Curiosamente, también el hielo es un candidato para la formación de ribozimas y reacciones químicas. Los cristales de hielo desplazan las biomoléculas en la fase líquida, lo que conduce a la concentración, creando una compartimentación cuasicelular donde se promueve la síntesis de novo de precursores de nucleótidos. Allí, puede surgir ARN y ribozimas, que son capaces de autorreplicarse (Attwater et al., 2010). Los complejos de ácido amino-tRNA pueden encontrar ARNs como "mRNAs". Tales interacciones podrían haber contribuido a la evolución del código genético. Esta secuencia de eventos puede conducir a precursores ribosoma primitivos. Las ribozimas son los elementos catalíticos esenciales en los ribosomas: "El ribosoma es un ribozima" (Cech, 2000), suplementado con cerca de un centenar de proteínas de andamio más tarde durante la evolución. Las proteínas tienen funciones estructurales y contribuyen indirectamente a la actividad enzimática. ¿Son estos ribozimas ribosomados fósiles de la Tierra primitiva? Los pequeños péptidos pueden ser formados por ribozimas antes de la evolución de los ribosomas, por lo que los aminoácidos simples o diméricos pueden originarse en el universo (Meierhenrich, 2008). Los pequeños péptidos con aminoácidos básicos pueden aumentar la actividad catalítica de las ribozimas como se muestra in vitro (Müller et al., 1994). Tales proteínas se conocen como proteínas de unión del ARN de virus del ARN que protegen el genoma del ARN, con motivos tales como RAPRKKG del nucleocápsido NCp7 del VIH (Schmalzbauer et al., 1996). Péptidos pueden mejorar la actividad catalítica de ribozimas hasta un 100 veces (Müller et al., 1994). Tales péptidos de virus del ARN sirven como chaperonas que eliminan estructuras de ARN de orden superior, permitiendo una interacción más eficiente de moléculas de ARN y aumentando las tasas de transcripción de polimerasas del ARN (Müller et al., 1994). Ribonucleoproteínas también pueden haber sido funcionalmente importantes durante la evolución de ribosomas (Harish y Caetano-Anolles, 2012). Estas estructuras preribosomales son también La transcripción inversa puede ser realizada químicamente por ribozimas. Esta acción no requiere necesariamente una proteína polimerasa como la transcriptasa inversa. Del mismo modo, los deoxiribonucleótidos pueden surgir por la eliminación de un oxígeno sin la necesidad de una enzima proteica (una reductasa) como hoy, y permitir la polimerización del ADN (Wilson y Szostak, 1999; Joyce, 2002). Los mismos elementos de los precursores para ribosomas también son bloques de construcción de retrovirus, que pueden tener un origen evolutivo similar (Moeling, 2012 (Moeling,, 2013. tRNAs sirven como imprimadores para la transcriptasa inversa, y la secuencia de promotores de elementos transponibles se derivan de tRNAs (Lander et al., 2001). Los ribozimas se desarrollaron en intrones más complejos del grupo de autoescisión II con la inserción de genes que codifican una transcriptasa inversa y proteínas adicionales (Moelling y Broecker, 2015; Moelling et al., 2017) (Figura 1). Surgió como sorpresa que los genomas de casi todas las especies son ricos en ncDNA, transcriptos en ncRNAs, pero no codificando proteínas, como se evidencia, por ejemplo, por el proyecto "Enciclopedia de Elementos de ADN" (ENCODE). ncDNA equivale a más del 98% del genoma de ADN humano (Deveson et al., 2017). Los organismos más altos tienden a tener más información no codificante, lo que permite modos más complejos de regulación genética. Los ncRNAs son reguladores de las secuencias de codificación de proteínas. ncRNA puede variar desde cerca de cero en las bacterias más pequeñas como Pelagibacter ubique hasta alrededor del 98% en el genoma humano. Los virus de ARN como el retrovirus HIV albergan a los ncRNAs para la regulación génica como el elemento de respuesta transactivante (TAR), el sitio de unión para la proteína Tat para la expresión temprana del gen viral. Tat tiene un dominio altamente básico que comprende principalmente residuos de Lys y Arg, que se asemejan a otras proteínas de unión de ARN. ncRNA también sirve en genomas de ARN virales como sitios de entrada ribosomal, sitios de unión de imprimación o señales de empaquetado. La síntesis del ADN depende de la síntesis del ARN como evento inicial, con ARN como iniciadores para la replicación del ADN, dentro de células como FIGURE 1 Un compartimento se muestra con componentes ARN no codificante (ncRNA), ribozimas o viroides, pueden realizar muchos pasos para la vida sin genes codificantes de proteínas, pero sólo por información estructural. Los aminoácidos individuales están indicados como puntos negros y pueden estar disponibles en la Tierra desde el universo. El ADN puede haber existido antes de retrovirus. El compartimento puede ser interpretado como previrus o precélulas. Viroide, verde; ARN, rojo; ADN, negro. así como durante la replicación retroviral, demostrando un requisito de ARN (Flint, 2015). El número de genes codificantes de proteínas de mamíferos es de alrededor de 20.000. Sorprendentemente, esto es sólo una quinta parte del número de genes de trigo pan (Appels et al., 2018). Tulips, maíz y otras plantas también tienen genomas más grandes, lo que indica que el número de genes no refleja necesariamente la ¿Podrían los genomas gigantes ser el resultado de la cría de plantas por agricultores o jardineros? De acuerdo con Szostak hay moléculas que aparecen como reliquias del mundo del ARN como el acetil-CoA o la vitamina B12, ambos están ligados a un ribonucleótido sin ninguna razón obvia - ¿se "olvidaron" para ser removidos? (Roberts y Szostak, 1997; Szostak et al., 2001; Szostak, 2011). Tal vez el ARN conectado sirve como estabilizador estructural. Las vesículas lipídicas podrían haber formado los primeros compartimentos y ribozimas cerrados, tRNAs con aminoácidos seleccionados, y ARN que se convirtieron en mRN. ¿Es esto un pre-células o pre-virus (Figura 1)? Patel et al. (2015) demostró que los bloques de construcción de la vida, ribonucleótidos, lípidos y aminoácidos, se pueden formar a partir de C, H, O, P, N, S en una síntesis de "una olla". Este estudio se puede considerar como un estudio de seguimiento de la síntesis clásica Urey-Miller in vitro de biomoléculas (Miller, 1953; Miller y Urey, 1959). La transición del ARN al mundo ADN fue promovida por la formación de la transcriptasa inversa. La enzima fue descrita por primera vez en retrovirus pero es casi ubicua y se encuentra en numerosas especies celulares, muchas de las cuales con funciones desconocidas (Simon y Zimmerly, 2008; Lescot et al., 2016). Es un vínculo importante entre el ARN y los mundos del ADN. El nombre de transcriptasa inversa es histórico e irritante porque es la transcriptasa "real" durante la transición del ARN al mundo del ADN. Del mismo modo, la ribonucleasa H (RNase H) es una enzima esencial de retrovirus (Mölling et al., 1971). La RNASA H resultó ser una de las cinco proteínas más frecuentes y antiguas (Ma et al., 2008 ) que pertenece a una superfamilia de más de sesenta representantes únicos diferentes y 152 familias con numerosas funciones (Majorek et al., 2014). Algunos de los muchos tRNAs pueden llegar a ser cargados con aminoácidos. Hay virus que contienen estructuras similares a tRNA (TLS), que se asemejan a estos primeros ARNs (Dreher, 2009). Los virus TLS incluyen virus de plantas, como el virus del mosaico amarillo de Turnip, en el virus del grupo de maní, el virus del mosaico de tabaco (TMV), y el virus del mosaico de Brome. Sólo la mitad del ARNt se encuentra en los Narnavirus de hongos. Los aminoácidos conocidos por ser componentes de virus similares al ARNt son valina, histidina y tirosina. Las estructuras también fueron designadas como "mimícritas", mejorando la traducción (Dreher, 2009 (Dreher,, 2010 ). Parecen elementos precursores "congelados" para la síntesis de proteínas. Esta combinación de un tRNA parcial vinculado a un aminoácido puede interpretarse como un paso evolutivo hacia la síntesis de proteínas, atrapado en un elemento viral. Los viroides carecen de capas proteicas y por lo tanto inicialmente no fueron designados como virus sino como virus cuando fueron descubiertos en 1971 por Theodor Diener. Él describió a los viroides como "fósiles vivos" (Diener, 2016) (Figura 2). De las patatas infectadas, Diener aisló el tubérculo del huso de la patata (PSTVd) cuyo genoma era aproximadamente 100 veces más pequeño que los de los virus conocidos en ese momento. Los viroides conocidos hoy en día van desde 246 hasta 467 nucleótidos. Contienen ARN circular de una sola cadena, son libres de proteínas y autorreplicantes sin información genética, pero sólo estructurales FIGURA 2 Los viroides son estructuras de horquilla y se muestran esquemáticamente y como micrografía electrónica. Viroides son, como ribozimas, sin información genética y juegan papeles biológicos importantes hoy en día en enfermedades de las plantas, en flores de claveles, en cáncer de hígado, como catalizador de la síntesis de proteínas en ribosomas y como ARNs regulatorios circulares, como "esponjas" para otros ARNs regulatorios. información en forma de horquillas de pelo (Riesner et al., 1979). Pueden generar copias de sí mismos en el entorno apropiado. Fueron designados como las "fronteras de la vida" (Flores et al., 2014). El conocimiento de la composición del virus se basó en TMV y su cristalización por Wendell Stanley en 1935 (Pennazio y Roggero, 2000). El genoma de TMV es ARN singlestranded codificante de proteínas de alrededor de 6.400 nucleótidos que está encerrado por una capa prote Los viroides, por el contrario, no codifican proteínas y carecen de capas, pero están estrechamente relacionados con los virus. Los viroides pueden perder su autonomía y dependen de las polimerasas del ARN huésped para replicarse, son capaces de infectar las plantas y muchos son patógenos económicamente importantes. Hay dos familias, el núcleo-replicante Pospiviroidae como PSTVd y el cloroplasto-replicante Avsunviroidae como el Viroide Sundblotch Aguado (ASBVd). Su replicación requiere enzimas del huésped. Por lo tanto, la autonomía es reemplazada por la dependencia de las enzimas del huésped y un estilo de vida intracelular. La mayoría de los viroides son a menudo ribozimáticamente activos -sin embargo son ejemplos de que este rasgo puede perderse como resultado de las condiciones ambientales cambiantes. Sólo las variantes nucleares, las Pospiviroidae, pueden perder su actividad ribozimática y utilizar la enzima RNASA III celular para su replicación. En contraste, las Avsunviroidae siguen siendo ribozimas de cabeza de martillo activas. Así, dentro del núcleo de una célula huésped, la función RNA enzimática puede volverse innecesaria. No genes, sino una función, la actividad catalítica, se pierde. Viroides aparentemente no ganar genes, pero cooperó para un estilo de vida más complejo. Por ejemplo, Carnation pequeño ARN tipo viroides (ARN CarSV) coopera con un retrovirus y está acompañado por un ADN homólogo generado por una transcriptasa inversa. Esta enzima presumiblemente se origina de un pararetrovirus de las plantas. Pararetrovirus empaqueta partículas del virus en una etapa diferente durante la replicación que retrovirus, el ADN, no el ARN Esta combinación única entre dos elementos virales sólo se ha detectado hasta ahora con CarSV en flores de claveles (Flores et al., 2005) (Flores et al.,, 2014. ¿Por qué tal cooperación evolucionó -tal vez por los jardineros reproductores? El ARN es sensible a la degradación; por lo tanto, el aumento genético y el crecimiento del genoma puede no ser favorable energéticamente -al menos no en las plantas. Ganancia de la función es, en este caso, la cooperación. El ARN circular (ARN circular) está relacionado con ribozimas/viroides como un regulador principal de otros ARN regulatorios, un ARN "esponja" que absorbe pequeños ARNes. Micro ARNs (miRNs) son reguladores post-transcripcionales que se ven afectados por la presencia de ARN circulares. se detectaron ARNs en cerebros humanos y Pueden unir 70 miRNA conservadas en una célula y su cantidad es de hasta 25.000 moléculas (Hansen et al., 2013). Su estructura recuerda a ribozimas catalíticamente activas. Hay un viroides excepcionales que obtuvieron información codificante y entraron en el hígado humano (Taylor, 2009). El viroides se conoce como virus delta de la hepatitis (HDV). Tiene el genoma más pequeño de cualquier virus animal conocido de cerca de 1.680 nucleótidos. Tiene propiedades típicas de los viroides, ya que contiene ARN circular, forma saltos de horquilla similares y réplicas en el núcleo utilizando enzimas huésped. Dos polimerasas tienen que redirigir su especificidad del ADN al ARN para generar el genoma y el antígeno del HDV. Ambos tienen actividad ribozima. En contraste con otras ribozimas, el HDV codifica una proteína, el antígeno delta de la hepatitis (HDVAg) que se presenta en dos formas, el pequeño HDVAg (24 kDa) que soporta la replicación y el gran HDVAg (27 kDa) que ayuda al ensamblaje del virión. El gen fue presuntamente recogido de la célula huésped por la recombinación del ARNm del HDV intermedio con un ARNm del huésped. La transmisión depende de un virus ayudante, el virus de la Hepatitis B (VHB), que entrega la capa (Taylor, 2009 ) ¿El empaquetado por un virus ayudante protege el genoma y por lo tanto permite que exista un viroides más grande? En las plantas, los viroides pueden no ser capaces de hacerse más grandes posiblemente debido a su sensibilidad a la degradación - pero tampoco pueden ser mucho más pequeños. Sólo se conoce un único viroides que está compuesto completamente de ARN codificante de proteínas con trillizos (AbouHaidar et al., 2014). Los viroides y los ARN replicantes relacionados son unidades replicantes propensas a errores y la frecuencia de error les impone un cierto tamaño mínimo, ya que de otro modo se extinguirían. Este mecanismo ha sido descrito como "catástrofe de error", lo que impide la supervivencia (Eigen, 1971 (Eigen,, 2013 ). Los viroides y ARN relacionados son los más pequeños réplicas conocidas. Los más pequeños se extinguirían en ausencia de sistemas de reparación. En resumen, el ARN puede catalizar muchas reacciones. Las enzimas proteicas que pueden haber evolucionado más tarde tienen mayores actividades catalíticas. Los ribozimas son portadores de información, pero no requieren genes de codificación. La información se almacena en su secuencia y estructura. Así, la replicación de un ARN inicial es seguida por el flujo de información, del ADN al ARN a la proteína, como se describe el Dogma Central (Crick, 1968). Incluso un flujo de información de la proteína al ADN ha sido descrito para algunas proteínas arqueales (Béguin et al., 2015). El mundo de proteínas de ADN contiene numerosos NCRNAs con funciones clave. ncRNA puede servir como un compuesto modelo para el origen de la vida en otros planetas. Por lo tanto, no la composición química de esta molécula es de importancia primordial, pero su simplicidad y multifuncionalidad. Además, el ARN es software y hardware en una sola molécula, que lo hace único en nuestro mundo. Hay otros escenarios además del aquí discutido "virus-first, " tales como "proteína-first", "metabolismo-fist" o el "mundo lípido" (Segré et al., 2001; Andras and Andras, 2005; Vasas et al., 2010; Moelling, 2012). Algunos de estos conceptos alternativos se construyeron sobre la filogenómica, la reconstrucción del árbol de la vida por secuenciación del genoma (Delsuc et al., 2005). Sorprendentemente, fue Sir Francis Crick, uno de los descubridores de la doble hélice del ADN, que declaró que no se sorprendería de un mundo completamente construido de ARN. Una predicción similar fue hecha por Walter Gilbert (Crick, 1968; Gilbert, 1986). ¡Qué visión! Nuestro mundo fue casi 50 años más tarde definido como "proteína ARN" mundo (Altman, 2013). Se puede especular que nuestro mundo fue construido de ribozimas o viroides, lo que significa "virus primero". Los ncRNAs aparecen como reliquias del mundo ARN pasado, antes de que el ADN, el código genético y las proteínas evolucionaran. Sin embargo, el ncRNA es esencial en nuestro mundo de ADN biológico hoy en día. Es posible producir tal ncRNA hoy en el tubo de prueba por pérdida de información génica de ARN codificante de proteínas. Esta reducción al ncRNA se demostró in vitro con ARN fago. El ARN genómico Qβ, 4.217 nucleótidos de longitud, fue incubado en presencia de replicasa Qβ, nucleótidos y sales libres, un medio rico en el tubo de prueba. El ARN se permitió replicar por medio de la réplica Qβ. La transferencia serial de alícuotas a medio fresco llevó a tasas de replicación cada vez más rápidas y a la reducción del tamaño genómico, hasta 218 nucleótidos de ncRNA en 74 generaciones. Este estudio demostró que, dependiendo de las condiciones ambientales, se puede producir una reducción génica extrema. Este experimento realizado en 1965 fue designado como "Monstruo de Spiegelman". El ARN de codificación se convirtió en replicación de ncRNA (Spiegelman et al., 1965; Kacian et al., 1972)! Manfred Eigen amplió este experimento y demostró además que una mezcla que no contiene ARN para empezar con pero sólo ribonucleótidos y la réplica Qβ puede bajo las condiciones correctas en un tubo de prueba generar espontáneamente ncRNA auto-replicante. Esto evolucionó en una forma similar al Monstruo de Spiegelman Además, un cambio en la concentración enzimática y la adición de ARN cortos o un intercalador de ARN influyeron en la población de ARN emergente (Sumper y Luce, 1975; Eigen, 2013). Así, la complejidad de los genomas depende del medio ambiente: las malas condiciones conducen a una mayor complejidad y a entornos ricos a una menor complejidad. El proceso demostrado en este experimento con componentes virales indica que la reversión a la simplicidad, la reducción de tamaño, la pérdida de información genética y la velocidad de replicación pueden ser las principales fuerzas de la vida, aunque esto parezca ser como una reversión de la evolución. El experimento puede tal vez ser generalizado desde el tubo de ensayo a un principio, que los sobrevivientes más exitosos en nuestro planeta son los virus y microorganismos, que se convirtieron en las entidades más abundantes. Tal vez la vida pueda comenzar de nuevo. Estos estudios plantean la cuestión de cómo las moléculas de ARN pueden llegar a ser Esto puede ser superado por el flujo de calor a través de un poro abierto en rocas sumergidas, que concentra la replicación de oligonucleótidos de un flujo de alimentación constante y la selección de hebras más largas. Esto se ha descrito para un aumento de 100 a 1.000 nucleótidos in vitro. Moléculas de ARN menores de 75 nucleótidos morirán (Kreysing et al., 2015). ¿Podría un medio ambiente pobre conducir a un aumento de complejidad? Esto podría ser probado. Ribozimas se demostró que crecen en tamaño por absorción de genes, como se demostró para HDV (Taylor, 2009 ). Un ejemplo inesperado interesante reciente que apoya la noción de que las condiciones ambientales influyen en la complejidad genética, es el microbioma intestinal humano. Su complejidad aumenta con diversos alimentos, mientras que alimentos ricos uniformes reducen su diversidad y pueden conducir a enfermedades como la obesidad. Unas pocas docenas de especies bacterianas y virales/fagos se conservan entre individuos (secuencias básicas) como una composición estable (Broecker et al., 2016c. La disbiosis se ha observado en varias enfermedades crónicas y en la obesidad, una pérdida de riqueza y diversidad bacterianas. La nutrición en condiciones afluentes con alimentos ricos en azúcar contribuye a la obesidad, lo que resulta en una reducción significativa de la complejidad del microbioma. Esta reducción es difícil de revertir (Cotillard et al., 2013; Le Chatelier et al., 2013). El microbioma intestinal en pacientes humanos con obesidad recuerda a la reducción genética descrita en el experimento del Monstruo de Spiegelman: reducción de genes en un entorno rico. La reducción de la complejidad del microbioma se atribuye en parte a la acción de los fagos, que bajo tales condiciones, definidas como estrés, lisian las El trasplante de microbiota fecal puede ser reemplazado incluso por fracciones solubles que contienen fagos o metabolitos del donante sin bacterias (Ott et al., 2017). Analógicamente, los microbiomas más complejos se encuentran en las tribus humanas indígenas de África, que viven en una amplia variedad de nutrientes diferentes. Es un proceso lento, sin embargo, para aumentar la complejidad de la microbiota intestinal por nutrición diversa. La microbiota asociada a la obesidad que sobrevive son más aptas y difíciles de contrarrestar. Urbanización y occidentalización de la dieta se asocia con una pérdida de biodiversidad microbiana, pérdida de organismos microbianos y genes (Segata, 2015). Para entender el mecanismo y la fuerza motriz para la reducción del genoma, las tasas de eliminación se probaron mediante la inserción de un gen indicador en el genoma de Salmonella entérica. La pérdida del gen indicador fue monitoreada por el paso en serie Las deleciones resultaron en genomas más pequeños con reducción o ausencia de genes de reparación de ADN (Koskiniemi et al., 2012). La pérdida de genes confirió una mayor aptitud a las bacterias bajo estas condiciones experimentales. Los mimivirus recientemente descubiertos y otros virus gigantes son dignos de considerar para entender la evolución de la vida con respecto a la contribución de los virus. Sus anfitriones son, por ejemplo, Acanthamoeba, Clorella, y Coccolithus algas (Emiliania huxleyi), pero también corales o esponjas como se discutió más recientemente. Los mimivirus fueron descubiertos por primera vez en torres de agua de refrigeración en Bradford, Reino Unido en 2003 con cerca de 1.000 genes, la mayoría de los cuales no relacionados con genes conocidos anteriormente. Los mimivirus han recibido atención porque contienen elementos que se consideraban distintivos de células vivas, no de virus, Los mimivirus albergan estos bloques de construcción como conjuntos incompletos que no son suficientes para la síntesis de proteínas independientes como las bacterias o las arcaeas pueden realizar, evitando que lleven una vida autónoma (La Scola et al., 2003 Scola et al.,, 2008. Son más grandes que algunas bacterias. Los virus gigantes pueden ser vistos como en un camino evolutivo hacia un organismo celular. Alternativamente, pueden haber evolucionado de un organismo celular por pérdida de información genética (Nasir y Caetano-Anolles, 2015). Los virus gigantes han tomado con frecuencia genes de sus anfitriones por transferencia horizontal de genes (HGT) (La Scola et al., 2008; Nasir y Caetano-Anolles, 2015; Colson et al., 2018). Un gráfico sobre los tamaños del genoma muestra que los mimivirus y las bacterias se superponen en tamaño, lo que indica una transición continua entre virus y bacterias y entre mundos vivos y no vivos (basado en Holmes, 2011) (Figura 3). Otros virus gigantes, como los megavirus, fueron descubiertos en el océano de Chile con 1.120 genes. Más recientemente, el Klosneuvirus fue identificado en las aguas residuales del monasterio Klosterneuburg en Austria en 2017 con 1.57 millones de pares de bases (Mitch, 2017). Pithovirus sibericum es el más grande entre los virus gigantes descubiertos hasta la fecha con un diámetro de 1,5 micras, un genoma de 470.000 pb con 467 genes putativos, 1,6 micras de longitud, y es presumiblemente de 30.000 años ya que fue recuperado de permafrost en Siberia (Legendre et al., 2014 Los virus Pandora más pequeños con 1 micron de longitud tienen genomas cinco veces más grandes, 2.500.000 pb (Philippe et al., 2013) (Figura 3). Los virus gigantes incluso pueden ser hospedadores de virus más pequeños, los virófagos, que recuerdan a los bacteriófagos, los virus de las bacterias. Estos virófagos como Sputnik son sólo 50 nm de tamaño con 18.343 pb de ADN circular y 21 genes de codificación proteica predichos. Se replican en fábricas virales y consumen los recursos del mimivirus, destruyéndolo así. Algunos, los virófagos incluso pueden integrarse en el genoma del huésped celular y se pueden reactivar cuando el huésped está infectado por virus gigantes. Así, virus gigantes sugieren que los virus están cerca de entidades vivas o pueden haber estado vivos (La Scola et al., 2008; En biología es común distinguir entre materia viva y muerta por la capacidad de sintetizar proteínas y replicar autónomamente. Los virus gigantes pueden ser considerados como un eslabón faltante entre los dos, porque albergan "casi" el aparato de síntesis de proteínas. La transición de vivir al mundo no vivo es continua, no separada por una línea fronteriza aguda (Figura 3). Los virus no son considerados vivos por la mayoría de la comunidad científica y como se escribe en los libros de texto, porque no pueden replicarse autónomamente. Sin embargo, algunos de los virus gigantes están equipados con casi todos los componentes de la maquinaria de síntesis de proteínas cerca de bacterias que sugieren que pertenecen a la materia viva (Schulz et al., 2017). Las ribozimas pueden haber sido la entidad replicante más temprana. Tal vez también otros virus fueron inicialmente más independientes de la Tierra primitiva que hoy en día. Como se describe en la Figura 1 puede haber sido inicialmente Sólo más tarde los virus pueden haber renunciado a su replicación autónoma y convertirse en parásitos, como se ha descrito para algunas bacterias (véase más adelante). Se han hecho esfuerzos para identificar la célula viva más pequeña que todavía se replica de forma autónoma. Entre las bacterias que presumiblemente se encuentran Pelagibacter ubique del clado SAR11 de bacterias (Giovannoni, 2017), que se descubrió en 1990. Es un alfa-proteobacterio con 1.389 genes presentes ubicuamente en todos los océanos. Puede alcanzar hasta 10 28 células vivas libres en total y representa aproximadamente el 25% de las células de plancton microbiano. Muy poco de su ADN es no codificante. Alberga fagos de tipo podofago, designados como "pelagiphage" (Zhao et al., 2013). Este pequeño bacteria fue designado como el organismo más común en el planeta. ¿ Esta bacteria autónoma es más pequeña que algunos virus gigantes parasitarios. Craig Venter, que primero logró secuenciar el genoma humano, trató de minimizar el genoma más pequeño putativo de una especie viva, de Mycoplasma mycoides, una bacteria parasitaria que vive en rumiantes (Gibson et al., 2008 (Gibson et al.,, 2010. Su grupo sintetizó un genoma de 531.000 bp con 473 genes, 149 de ellos (32%) con funciones desconocidas (Hutchison et al., 2016). Entre los organismos parasitarios vivos más pequeños está Nanoarchaeum equitans. Es un arqueón termofílico que vive a 80 • C y a pH 6 con 2% de sal (Huber et al., 2003). Su genoma tiene un tamaño de 490.000 bp y codifica 540 genes. N. equitans es un simbionte obligatorio de un arqueón más grande, Ignicoccus montando en él como en un caballo, de ahí el nombre (Huber et al., 2003). El mundo de los virus cubre una gama de tres troncos en tamaño de sus genomas: desde genes cero a cerca de 2.500 genes que ascienden a cerca de 2.500.000 bp de ADN. Los viroides de origen cero tienen unas 300 bases de longitud (Figura 3). La virosfera es el reservorio más exitoso de entidades biológicas en nuestro planeta en términos de número de partículas, velocidad de replicación, tasas de crecimiento y espacio secuencial. Hay alrededor de 10 33 virus en nuestro planeta y están presentes en cada especie existente (Suttle, 2005). No hay especies vivas sin virus! Los virus también ocurren libremente en los océanos, en el suelo, en nubes hasta la estratosfera y más Poblan el intestino humano, el canal de nacimiento y el exterior del cuerpo como capa protectora contra las poblaciones microbianas. Los microbios contienen fagos que se activan durante condiciones de estrés tales como la falta de nutrientes, el cambio de temperatura, la falta de espacio y otros cambios de las condiciones ambientales. Uno de los papeles más agitadores de la tierra de este siglo fue la publicación de la secuencia del genoma humano (Lander et al., 2001). Alrededor de la mitad, posiblemente incluso dos tercios de la secuencia se componen de retrovirus endógenos más o menos completos (ERVs) y retroelementos relacionados (REs) (de Koning et al., 2011). Las RE amplifican a través de mecanismos de copia y pasta que implican un paso de transcriptasa inversa de un ARN intermedio en ADN. Además, los elementos transponibles del ADN (TEs) se mueven por un mecanismo de corte y El origen de las REs está siendo discutido como restos de infecciones germinales retrovirales antiguas que se fijaron evolutivamente en el genoma. Alrededor de 450.000 elementos ERV humanos (HERV) constituyen alrededor del 8% del genoma humano consistente en elementos retrovirales distintivos como la mordaza, pol, genes env y repeticiones terminales largas flanqueantes (LTR) que actúan como promotores (Lander et al., 2001). Howard Temin, uno de los descubridores de la transcriptasa inversa, en 1985 ya describió elementos similares a retrovirus endógenos, que estimó en cerca del 10% de la secuencia del genoma humano y del ratón (Temin, 1985). El número real es alrededor del 45% como se estima hoy (Lander et al., 2001). En algunos genes como el gen Protein Kinase Inhibitor B (PKIB) determinamos alrededor del 70% de secuencias ¿Hay un límite? ¿Podría haber sido 100%? Se estima que los retrovirus han entrado en el linaje del genoma mamífero hace 550 millones de años (MYA) (Hayward, 2017). Las secuencias ERV más antiguas pueden existir pero hoy son irreconocibles debido a la acumulación de mutaciones. Los ERV sufren mutaciones, deleciones o eventos de recombinación homóloga con grandes deleciones y pueden llegar a ser tan cortos como los elementos LTR solos, que son unos pocos cientos de pb en longitud - los sobrantes de genomas retrovirales de larga duración de alrededor de 10.000 pb. Los promotores LTR pueden desregular genes vecinos. Los eventos de recombinación homóloga pueden ser considerados como eventos de pérdida de genes o reducción de genes. Es la suposición de que los ERV, que ya no eran necesarios para la defensa celular del huésped, ya no fueron Eugene Koonin señala que la infección y la integración son eventos únicos que se producen a un ritmo rápido, mientras que la pérdida y la reducción de genes pueden tardar mucho más tiempo (Wolf y Koonin, 2013). Una reducción frecuente de genes de genomas eucariotas es la pérdida de la proteína de envoltura viral codificada por el gen env. Sin un abrigo, los retrovirus ya no pueden dejar la célula e infectar otras células. Pierden la movilidad y se convierten en elementos intracelulares obligatorios. Los virus ayudantes pueden suministrar proteínas de envoltura en trans y movilizar los virus. Las TEs o REs se pueden considerar como ejemplos de reliquias de virus intracelulares sin capa -o podría haber sido al revés, tal vez precursores de retrovirus de larga duración? Estos elementos pueden amplificarse intracelularmente y modificar los genomas del huésped mediante la integración con el peligro potencial de alteración genética y cambios genéticos. Las REs pueden llevar a la duplicación de genes y al desarrollo de pseudogenes, con una copia para la conservación estable de las funciones adquiridas y la otra para las innovaciones (Cotton y Page, 2005). Tales duplicaciones constituyen grandes cantidades de genomas de mamíferos (Zhang, 2003). Los retrovirus tienen una duplicación de moiety RNASa H, una de las cuales sirve como enlace catalíticamente inactivo entre la RT polimerasa y la enzimáticamente activa RNASa H (Xiong y Eickbush, 1990; Malik y Eickbush, 2001; Moelling y Broecker, 2015; Moelling et al., 2017). Esta duplicación de genes se remonta a 500 millones de años (Cotton y Page, 2005). Las duplicaciones de genes son una causa común de cáncer, que a menudo se produce sólo en el genoma de la célula cancerosa en sí, Myc, Myb, ErbB2, Ras y Raf son oncogenes amplificados en diversos tipos de cánceres humanos (Vogelstein y Kinzler, 2002). La capacidad de los retrovirus para integrarse los hace distintos de los endosimbiontes que permanecen separados. Sin embargo, el resultado neto es muy similar, la adquisición de nueva información genética, que se transmite a la siguiente generación, si la línea germinal está infectada y se produjo la endogenización del virus. La integración viral no se limita a las células eucariotas, sino también un mecanismo en procariotes para el mantenimiento del estado lisogénico de los fagos dentro de las bacterias. Además, para otros virus eucariotas como el VHB, el antígeno de superficie envolvente BHsAg se puede eliminar, lo que conduce a un estilo de vida intracelular obligatorio para el virus, que especialmente en presencia de VHC promueve el cáncer (Yang et al., 2016). Se ha demostrado que el VIH pierde rápidamente uno de sus genes auxiliares, nef, originalmente por factor negativo. El gen se perdió dentro de un número bastante bajo de pasajes del virus crecido bajo condiciones de cultivo tisular por selección de células productoras de títulos de alto virus. La eliminación de nef resultó en un aumento significativo del título del virus en cultivo -de ahí el nombre. El producto del gen nef no era de necesidad dentro de las células de cultivo tisular, sino que era inhibitorio para la replicación. Sin embargo, es esencial para la patogenicidad en animales, y posteriormente nef fue reinterpretado como " Además, los hospederos humanos del VIH pueden perder una porción terminal significativa de un receptor de siete transmembranas en linfocitos, la célula diana primaria para la entrada del VIH y para la captación del virus. Esta molécula, el receptor de citocinas CCR5 es truncado por 32 aminoácidos carboxiterminales (CCR5-32), desactivando funcionalmente el receptor. La frecuencia de alelos del mutante CCR5-32 mutante es de alrededor del 10% en la población europea, haciendo que estas personas resistentes a las infecciones por VIH (Solloch et al., 2017). Esta pérdida genética en europeos ha demostrado hacer que los individuos resistentes no sólo contra la infección por VIH sino también contra la malaria. Esto puede haber sido la presión selectiva en el pasado antes de que el VIH/SIDA surgiera. No se ha descrito ningún efecto secundario para los seres humanos que carecen de este gen (Galva Los virus han demostrado ser motores de la evolución (Villarreal y Witzany, 2010), incluyendo el genoma humano, que por lo menos un 45% está compuesto de secuencias relacionadas con retrovirus. Además, los retrovirus endogenizados suministraron los genes de sincitina que son esenciales para el desarrollo de la placenta mamífera, y permitieron el crecimiento de embriones sin su rechazo por el sistema inmune materno (Dupressoir et al., 2012). Así, la misma propiedad que causa inmunodeficiencia en pacientes infectados por VIH y conduce al SIDA causa la formación de sincitia, fusión celular después de la infección por un retrovirus. También se ha propuesto que los virus estén en el origen de la evolución de la inmunidad adaptativa (Villarreal, 2009 ). Así, los genomas conformados por virus mediante el suministro de genes y mecanismos esenciales. La endogenización de retrovirus se ha producido en los genomas Si los ERVs integrados no ofrecían ninguna ventaja selectiva, se deterioraban y acumulaban mutaciones con pérdida de función, lo que se demostró directamente mediante la reconstrucción de un retrovirus infeccioso a partir de la secuencia de consenso de 9 secuencias de virus endógenos defectuosos, designados como Phoenix. El virus se expresaba a partir de un clon sintético de ADN construido en cultivo celular y partículas de virus formados identificadas por análisis microscópicos de alta resolución (Dewannieux y Heidmann, 2013). Los koalas en Australia están siendo endogenizados de un retrovirus (koala retrovirus, KoRV) en "tiempo real" y demuestran posibles consecuencias para la inmunidad. A principios de 1900, algunos individuos fueron trasladados a islas, incluida la isla Kangarooo, cerca del continente australiano para fines de repoblación, ya que los koalas estaban amenazados de extinción. Sin embargo, los koalas aislados en la isla de Kangaroo son KoRV negativos, lo que permite datar la introducción de KoRV en la población de koalas hace unos cien años. Muchos de los koalas infectados cayeron enfermos y murieron, sin embargo algunas poblaciones se volvieron resistentes dentro de unos 100 años, correspondientes a unas 10 generaciones. Los koalas probablemente desarrollaron resistencia debido a los provirus de ADN integrados. El retrovirus se transmite como exógeno así como virus endógeno, similar al retrovirus de ovejas Jaagsiekte (JSRV), por lo que los virus endogenizados protegen con un producto génico viral, como Env, contra infecciones de novo por "exclusión de la superinfección" (Tarlinton, 2012). La contribución de los retrovirus a la defensa antiviral es sorprendente, ya que todos los genes retrovirales tienen genes análogos en el mecanismo de defensa de las células eucarióticas siRNA/RNAi (Moelling et al., 2006). Los retrovirus pueden proteger contra la infección por otros virus relacionados, por ejemplo, al expresar proteínas Env que bloquean los receptores de la superficie celular (Villarreal, 2011). Un mecanismo comparable protege a las células bacterianas contra los fagos de ADN, mediante fragmentos de ADN de fagos integrados que se transcriben en ARNm e hibridan a los nuevos fagos de ADN entrantes y por lo tanto conducen a su destrucción por nucleasasases híbridos específicos, inmunidad CRISPR/Cas (Charpentier y Doudna, 2013). A menudo no se da cuenta de que la adquisición de inmunidad en bacterias y células La integración de retrovirus ocurre normalmente en las células somáticas después de la infección como un paso obligatorio durante el ciclo de vida viral. La infección de las células germinales puede conducir a la transmisión a la próxima generación y en última instancia dar lugar a resistencia hereditaria. Los retrovirus endogenizados probablemente causaron resistencia FIGURA 4 Los virus protegen contra los virus: los retrovirus protegen a una célula contra una nueva infección por un virus similar designado como "exclusión de la superinfección" o interferencia viral. Esto es mediado por productos genéticos virales como proteínas o ácidos nucleicos. Del mismo modo, los fagos protegen contra los fagos: la superinfección de bacterias es evitada por el ARN CRISPR/Cas originado por infecciones anteriores. Los mecanismos de defensa contra virus y fagos son análogos. La protección de virus o fagos contra superinfección representa defensa celular y inmunidad adquirida. Los cuatro ejemplos se discuten Del mismo modo, la resistencia al virus de la Inmunodeficiencia Simiana (SIV) en algunas especies de monos puede explicarse por la endogenización (Li et al., 2017) (Li et al., 2018. En el caso de los fagos y sus hospedadores procarióticos, el mecanismo se describe como CRISPR/Cas, que siguen principios análogos de "endogenización" del material genético entrante para su posterior exclusión. Se puede especular que el VIH también puede llegar a ser endogenizado en el genoma humano. Hay alguna evidencia de que el VIH puede infectar las células germinativas humanas y transmitirse al genoma embrionario (Wang et al., 2011). ¿Cuánto tiempo puede tardar esto no se conoce -10 generaciones? La pérdida de la función de los VRV puede ocurrir por mutaciones, supresiones de los env u otros genes y, en última instancia, El número de elementos retrovirus suma alrededor de 450.000, lo que corresponde al 8% del genoma humano (Lander et al., 2001; Cordaux y Batzer, 2009 ). Las regiones promotoras fueron analizadas por su contribución al cáncer activando genes vecinos -como consecuencia de una antigua infección por retrovirus. De hecho, los genes celulares activados por "promoción descendente" fueron identificados en estudios animales con activación del gen mic como uno de muchos ejemplos, llevando a un desarrollo crónico y no agudo del cáncer (Ott et al., 2013). Como mecanismo general para el cáncer humano hoy en día los LTRs no son identificados como un culpable mayor. La mayoría de los ERVs que encontramos hoy se han integrado durante la evolución en intrones u otras regiones donde su presencia es relativamente inofensiva. ¿Resultaron los otros en la muerte de los portadores que desaparecieron? Los efectos de los LTRs en los niveles de expresión de los genes huéspedes vecinos fueron estudiados con el virus humano endógeno, HERV-K, como posible causa de cáncer, pero esto no parece ser un fenómeno general (Broecker et al., 2016b). Como se demostró para los koalas, los ERVs pueden conferir inmunidad a las infecciones virales (Feschotte et al., 2012). Se demostró que un ERV relacionado, HERV-H, produce un ARN que mantiene las células embrionarias tempranas pluripotentes e incluso revierte las células adultas para recuperar la pluripotencia (Grow et al., 2015). Así, el papel de los ERVs puede ser más complejo de lo que conocemos actualmente. Elementos transponibles y REs que perdieron la capacidad de transmisión celular mediante la eliminación de la proteína del abrigo contribuyen principalmente a la complejidad genética de Están "bloqueados" dentro de las células y son los principales impulsores del aumento de la complejidad genética (Cordaux y Batzer, 2009 ). Se podría especular que estos elementos intracelulares son retrovirus replicantesincompetentes que carecen de abrigos (Lander et al., 2001). Los murciélagos transmiten virus como el Ébola y el coronavirus SARS sin sufrir de enfermedad (Beltz, 2018). Incluso virus ARN como Bornavirus han demostrado integrarse por transcripción inversa ilegítima, posiblemente también proporcionando inmunidad contra la superinfección (Katzourakis y Gifford, 2010). Hay dos eventos prominentes que contribuyeron significativamente al éxito de la vida y la formación de células. Ambos están asociados con la reducción de genes. Este fenómeno puede jugar un papel para la evolución de los virus de estilos de vida autónomos a parásitos. En la década de 1960 Lynn Margulis propuso un origen extracelular para las mitocondrias (Margulis, 1970,, 1993 ). Una célula ancestral, tal vez un arqueón, fue infectada por una bacteria anaerobia, que dio lugar a las mitocondrias. Del mismo modo, cianobacterias formaron los cloroplastos en las células vegetales modernas. Mitocondrias surgió hace alrededor de 1.450 millones de años (BYA) (Embley y Martin, 2006). Mitocondrias y cloroplastos son los ejemplos más llamativos para un cambio en el estilo de vida de bacterias autónomas a endosimbiontes. Esta transición a menudo se considera como extremadamente rara y un sello distintivo de la evolución de la vida en nuestro planeta. Sin embargo, hay muchos otros parásitos intracelulares obligados como Rickettsia, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii (el agente causal de la fiebre Q), Mycobacterium leprae, M. tuberculosis, y M. mycoides (Beare et al., 2006). El cambio de estilo de vida de los endosimbiontes en los dos casos de mitocondrias y cloroplastos es sorprendente. Ambos redujeron drásticamente su composición genética. Mitocondria contiene menos de 37 genes, que dejaron de ser los originales alrededor de 3.000 genes. Es endogenización de retrovirus, los ERV, que se integran en células germinales, relacionadas con la endosimbiosis? Son estos modelos endosimbionts para la transición de un estilo de vida autónomo a una vida parasitaria que puede haber tenido lugar con virus? Un ejemplo típico más reciente para una evolución reductiva son Rickettsia. Estas bacterias se supone por algún tiempo que son virus debido a su existencia parasitaria intracelular obligatoria. Rickettsia han evolucionado de bacterias que replican autónomamente. Evolución reductiva de endosimbiontes puede producir bacterias con genomas diminutos a expensas de la vida extracelular autónoma. Sus genomas son 1,11 millones de pbp en longitud con cerca de 834 genes codificantes de proteínas, y pérdida de 24% por la evolución reductiva (Ogata et al., 2001). Rickettsia puede tener alguna relación con cianobacterias, que se consideran como los principales simbiontes. ¿Se puede especular que los virus pueden haber sido entidades autónomas inicialmente? Viroides pueden haber sufrido la transición de la autonomía a parásitos, tal como se muestra para mitocondria, cloroplastos o Rickettsia? ¿Hasta qué punto los virus han sido autónomos e independientes de los metabolismos celulares originalmente -y contribuyeron al origen de las células? ¿Podrían haber perdido su autonomía más tarde y convertirse en parásitos? Los virus son minimalistas en su composición y deben haber sufrido reducciones genéticas estrictas (Flint, 2015). ¿Cuán pequeños pueden llegar a ser sus genomas? La mayoría de los virus ARN codificados todavía contienen elementos reguladores, ncRNA en las 3 y 5 regiones terminales para la entrada ribosomal, síntesis proteica, regulación transcripcional, y otros. Un subgrupo de retrovirus es un ejemplo interesante en cuanto a la pérdida simultánea y la ganancia de información genética. Los retrovirus oncogénicos o tumoresvirus pueden recombinarse con genes celulares que bajo los promotores de retrovirus pueden convertirse en oncogenes y conductores de cáncer. Alrededor de cien oncogenes han sido seleccionados en los laboratorios y estudiados durante La selección de las ventajas de crecimiento de las células huésped llevó al descubrimiento de los oncogenes que promueven el crecimiento más rápido que conocemos hoy en día, como Ras, Raf, ErbB o Myc, que son en parte objetivos exitosos para los medicamentos anticancerosos (Moelling et al., 1984). Estos oncogenes fueron en la mayoría de los casos tomados por los retrovirus a expensas de los genes estructurales (gag), replicando (pol) o envolvente (env), y a menudo se expresan como proteínas de fusión con Gag. Así, los retrovirus oncogénicos son virus defectuosos intracelulares obligatorios y fueron seleccionados para en el laboratorio por los investigadores para los oncogenes con la capacidad de crecimiento más potente promover. Necesitan el suministro de genes replicatorios en trans de virus ayudantes co-infectantes para infectar otras células (Flint, 2015) Algunas cepas del virus del sarcoma de Rous mantienen la replicación competente al transportar el src derivado de la célula (para el sarcoma) oncogén que codifica una proteína de 536 aminoácidos que aparentemente pueden encajar en la partícula retroviral junto con el genoma viral de tamaño completo (Broecker et al., 2016a). Razones espaciales pueden haber influido en la formación de retrovirus oncogénicos y limitado su tamaño y, por lo tanto, llevado a sus fenotipos defectuosos. Hay indicios de que la actividad incontrolada de (retro)transposones en las células germinativas puede resultar en enfermedades como la infertilidad masculina -presumiblemente por "catástrofe grave", causada por demasiados eventos de transposición. En los mamíferos, los piRNAs doman la actividad transpoon por medio de la actividad de la RNASa H de las proteínas PIWI durante la espermatogénesis (Girard et al., 2006). Sólo una minoría de virus son patógenos; la mayoría de ellos no causan enfermedades. Por el contrario, son más importantes como impulsores de la evolución, como transmisores de material genético, como agentes innovadores. En particular, los virus ARN son los más innovadores. Algunos de ellos son patógenos y peligrosos, como el VIH o el virus influenza, o los viroides en las plantas. Los virus ARN son capaces de cambiar tan rápidamente que el sistema inmunitario del huésped es incapaz de contrarrestar la infección. La patogenicidad surge cuando las condiciones ambientales cambian, por ejemplo, cuando un virus entra en un nuevo organismo o especie. El aumento de la complejidad celular por virus es una característica importante de la evolución. Tales cambios evolutivos importantes son tomados recientemente como argumentos en contra de la teoría evolutiva por Charles Darwin quien consideró cambios graduales, pequeños incrementos por mutaciones como la base principal para la selección y la evolución. Nueva crítica está abordando este pensamiento, considerando cambios más grandes como impulsores evolutivos. Tales cambios surgen por muchos fenómenos complejos tales como endosimbiosis, infección por procariotos, virus y hongos, recombinación de genes, HGT, infecciones, sexo. Cambios dramáticos tales como endosimbiosis o infecciones de patógenos extienden el concepto de Darwin de evolución. Hay numerosos ejemplos para la contribución de virus a la evolución de la vida desde por lo menos hasta 550 MYA (Hayward, 2017). Pero el ruido genético a través de mutaciones aleatorias no nos permite volver al origen de la vida. Por analogía, se puede especular que en algún momento los virus autónomos renunciaron a la independencia para una vida intracelular obligatoria -como se ha descrito para las mitocondrias y los cloroplastos, pero también las bacterias intracelulares como Rickettsia. Esta especulación se basa en el concepto de que la vida temprana debe haber comenzado simple y con alta variabilidad genética y luego se volvió más compleja. Pero la complejidad se puede renunciar a un estilo de vida menos consumidor de energía con genomas pequeños y alta velocidad de replicación (Moelling, 2012 (Moelling,, 2013 ). Por lo tanto, la pregunta puede repetirse: "¿Son los virus nuestros antepasados más antiguos?"Alguna vida fósil puede ser parcialmente reproducida in vitro por los experimentos de seguimiento de Spiegelman y Eigen, explicando el gran potencial de supervivencia del NCRNA simple. Los virus pueden ser patógenos, pero su reconocimiento como causa principal de enfermedades es Esta noción se basa en la historia de los virus en la medicina, como se explica en un libro titulado "Viruses: More Friends Than Foes" (Moelling, 2017). El escenario descrito aquí se centra en los virus como motores de la evolución. El mundo del ARN temprano se interesó hace 20-30 años, como lo demuestran las referencias anteriores. Sorprendentemente, hay científicos que todavía creen en la "hipótesis del pansperm" y piensan que los retrovirus son de origen extraterrestre (Steele et al., 2018). El interés reciente en el origen de la vida surgió de los exoplanetas recién descubiertos cuyo número aumenta diariamente -y que pueden ser tan numerosos como 10 25. Así, las estadísticas puras hacen que algunas personas crean que hay vida extraterrestre. La vida extraterrestre se imita en laboratorios en la Tierra con muchos supuestos -quizás esta El debate que aquí se presenta debe considerarse como un concepto de réplica simple y de entidades en evolución posiblemente derivadas de diferentes bloques de construcción en otros entornos, siendo la estructura más relevante que la secuencia.

¿Qué entidades sin genes satisfacen los criterios para la vida?

Virus y evolución – ¿Virus Primero? Una Perspectiva Personalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6433886/SHA: f3b9fc0f8e0a431366196d3e835e1ec368b379d1Autores: Moelling, Karin; Broecker, FelixFecha: 2019-03-19DOI: 10.3389/fmicb.2019.00523Licencia: cc-byAbstract: El descubrimiento de exoplanetas dentro de zonas habitables putativas revolucionó la astrobiología en los últimos años. Estimuló el interés en la pregunta sobre el origen de la vida y su evolución. Aquí, discutimos cuáles podrían haber sido los roles de los virus al principio de la vida y durante la evolución. Los virus Están presentes en todas partes, en nuestros alrededores, los océanos, el suelo y en cada ser viviente. Los retrovirus contribuyeron a cerca de la mitad de nuestras secuencias genómicas y a la evolución de la placenta mamífera. Los virus contemporáneos reflejan la evolución que va desde el mundo del ARN hasta el mundo de las proteínas del ADN. ¿Hasta dónde podemos rastrear su contribución? Las entidades más tempranas que replican y evolucionan son las ribozimas o viroides que cumplen varios criterios de vida. El ARN puede realizar muchos aspectos de la vida e influencia nuestra expresión genética hasta hoy. Las estructuras más simples con información no codificante pueden representar modelos de vida construidos sobre información estructural, no genética. Los virus hoy son parásitos obligatorios dependiendo de las células huésped. Ejemplos de cómo un estilo de vida independiente podría haberse perdido son las mitocondrias, los cloroplastos, Rickettsia y otros, que solían ser bacterias autónomas y se convirtieron en parásitos o endosimbiontes intracelulares, perdiendo así la mayoría de sus genes. Incluso in vitro la pérdida de genes se puede recapitular todo el camino de la codificación a ARN no codificante. Además, los virus gigantes pueden indicar que no hay frontera aguda entre las entidades vivas y no vivas sino un continuo evolutivo. Aquí, se discute cómo los virus pueden perder y ganar genes, y que son motores esenciales de la evolución. Aparte de nuestra visión “virus primero”, hay otros como “proteínas primero” y “metabolismo primero”. Texto: Mycoplasma mycoides por eliminación sistemática de genes individuales resultó en un genoma sintético mínimo de 473 genes (Hutchison et al., 2016). ¿Puede uno considerar entidades vivientes más simples? Hay elementos con cero genes que cumplen muchos criterios para la vida temprana: ribozimas, ARN catalíticos estrechamente relacionados con los viroides. Fueron recuperados in vitro de 10 15 moléculas (aptadores), 220 nucleótidos en longitud, por 10 rondas de selección. Entre las muchas especies de ARN presentes en esta colección de cuasiespecies ARNs fueron miembros catalíticamente activos, ribozimas enzimáticamente activas. El espacio de secuencia para ARNs de 220-mers es de aproximadamente 3 × 10 132 (Eigen, 1971; Wilson y Szostak, 1999; Brackett y Dieckmann, 2006). Las ribozimas seleccionadas fueron capaces de replicar, separar, unir y formar enlaces péptidos. Pueden polimerizar químicamente la progenie, permitir que ocurran mutaciones y pueden evolucionar. Una molécula sirve como catalizador, la otra como sustrato. La replicación de ribozimas se demostró en el tubo de ensayo (Lincoln y Joyce, 2009). Ribozimas pueden formar enlaces péptidos entre aminoácidos (Zhang y Cech, 1997). Así, los pequeños péptidos estaban disponibles por actividad ribozima. En consecuencia, se ha propuesto una modificación del ARN como ácido péptido nucleico (PNA), con enlaces péptidos más estables en lugar de enlaces fosfodiéster (Zhang y Cech, 1997; Joyce, 2002). La replicación de moléculas de ARN se puede realizar químicamente a partir de ARN sin enzimas de polimerasa. Además, las deoxiribozimas pueden formarse a partir de ribonucleótidos (Wilson y Szostak, 1999). Así, el ADN puede surgir de ARN químicamente, sin la enzima proteica clave, la transcriptasa inversa. Todo un mundo vivo es posible a partir de ARN no codificante (ncRNA) antes de la evolución del código genético y enzimas proteicas. Ribozymes naturalmente consisten en ARN circulares de una sola cadena (Orgel, 2004). Carecen En lugar de ello, exhiben información estructural por los loops de horquilla que forman enlaces de hidrógeno entre hilos dobles incompletos, y lazos libres para interactuar con otras moléculas. Representan una cuasiespecie en la que muchas especies de ARN pueden formar, tales como ribozimas, moléculas similares a tRNA, y otros ncRNAs. Los ARNs dentro de tal grupo pueden unir aminoácidos. Noventa aminoácidos diferentes se han identificado en el meteorito Murchison encontrado en Australia, mientras que en la Tierra sólo alrededor de 20 de ellos se utilizan para la síntesis de proteínas (Meierhenrich, 2008). Donde la formación de ribozimas ocurrió en la Tierra primitiva es una cuestión de especulación. Los respiraderos hidrotermales como los fumadores negros en el océano profundo son posibilidades donde la vida puede haber comenzado (Martin et al., 2008). Allí, los gradientes de temperatura y Los poros o nichos ofrecen posibilidades de concentración de bloques de construcción, lo que es necesario para que ocurran reacciones químicas. Curiosamente, también el hielo es un candidato para la formación de ribozimas y reacciones químicas. Los cristales de hielo desplazan las biomoléculas en la fase líquida, lo que conduce a la concentración, creando una compartimentación cuasicelular donde se promueve la síntesis de novo de precursores de nucleótidos. Allí, puede surgir ARN y ribozimas, que son capaces de autorreplicarse (Attwater et al., 2010). Los complejos de ácido amino-tRNA pueden encontrar ARNs como "mRNAs". Tales interacciones podrían haber contribuido a la evolución del código genético. Esta secuencia de eventos puede conducir a precursores ribosoma primitivos. Las ribozimas son los elementos catalíticos esenciales en los ribosomas: "El ribosoma es un ribozima" (Cech, 2000), suplementado con cerca de un centenar de proteínas de andamio más tarde durante la evolución. Las proteínas tienen funciones estructurales y contribuyen indirectamente a la actividad enzimática. ¿Son estos ribozimas ribosomados fósiles de la Tierra primitiva? Los pequeños péptidos pueden ser formados por ribozimas antes de la evolución de los ribosomas, por lo que los aminoácidos simples o diméricos pueden originarse en el universo (Meierhenrich, 2008). Los pequeños péptidos con aminoácidos básicos pueden aumentar la actividad catalítica de las ribozimas como se muestra in vitro (Müller et al., 1994). Tales proteínas se conocen como proteínas de unión del ARN de virus del ARN que protegen el genoma del ARN, con motivos tales como RAPRKKG del nucleocápsido NCp7 del VIH (Schmalzbauer et al., 1996). Péptidos pueden mejorar la actividad catalítica de ribozimas hasta un 100 veces (Müller et al., 1994). Tales péptidos de virus del ARN sirven como chaperonas que eliminan estructuras de ARN de orden superior, permitiendo una interacción más eficiente de moléculas de ARN y aumentando las tasas de transcripción de polimerasas del ARN (Müller et al., 1994). Ribonucleoproteínas también pueden haber sido funcionalmente importantes durante la evolución de ribosomas (Harish y Caetano-Anolles, 2012). Estas estructuras preribosomales son también La transcripción inversa puede ser realizada químicamente por ribozimas. Esta acción no requiere necesariamente una proteína polimerasa como la transcriptasa inversa. Del mismo modo, los deoxiribonucleótidos pueden surgir por la eliminación de un oxígeno sin la necesidad de una enzima proteica (una reductasa) como hoy, y permitir la polimerización del ADN (Wilson y Szostak, 1999; Joyce, 2002). Los mismos elementos de los precursores para ribosomas también son bloques de construcción de retrovirus, que pueden tener un origen evolutivo similar (Moeling, 2012 (Moeling,, 2013. tRNAs sirven como imprimadores para la transcriptasa inversa, y la secuencia de promotores de elementos transponibles se derivan de tRNAs (Lander et al., 2001). Los ribozimas se desarrollaron en intrones más complejos del grupo de autoescisión II con la inserción de genes que codifican una transcriptasa inversa y proteínas adicionales (Moelling y Broecker, 2015; Moelling et al., 2017) (Figura 1). Surgió como sorpresa que los genomas de casi todas las especies son ricos en ncDNA, transcriptos en ncRNAs, pero no codificando proteínas, como se evidencia, por ejemplo, por el proyecto "Enciclopedia de Elementos de ADN" (ENCODE). ncDNA equivale a más del 98% del genoma de ADN humano (Deveson et al., 2017). Los organismos más altos tienden a tener más información no codificante, lo que permite modos más complejos de regulación genética. Los ncRNAs son reguladores de las secuencias de codificación de proteínas. ncRNA puede variar desde cerca de cero en las bacterias más pequeñas como Pelagibacter ubique hasta alrededor del 98% en el genoma humano. Los virus de ARN como el retrovirus HIV albergan a los ncRNAs para la regulación génica como el elemento de respuesta transactivante (TAR), el sitio de unión para la proteína Tat para la expresión temprana del gen viral. Tat tiene un dominio altamente básico que comprende principalmente residuos de Lys y Arg, que se asemejan a otras proteínas de unión de ARN. ncRNA también sirve en genomas de ARN virales como sitios de entrada ribosomal, sitios de unión de imprimación o señales de empaquetado. La síntesis del ADN depende de la síntesis del ARN como evento inicial, con ARN como iniciadores para la replicación del ADN, dentro de células como FIGURE 1 Un compartimento se muestra con componentes ARN no codificante (ncRNA), ribozimas o viroides, pueden realizar muchos pasos para la vida sin genes codificantes de proteínas, pero sólo por información estructural. Los aminoácidos individuales están indicados como puntos negros y pueden estar disponibles en la Tierra desde el universo. El ADN puede haber existido antes de retrovirus. El compartimento puede ser interpretado como previrus o precélulas. Viroide, verde; ARN, rojo; ADN, negro. así como durante la replicación retroviral, demostrando un requisito de ARN (Flint, 2015). El número de genes codificantes de proteínas de mamíferos es de alrededor de 20.000. Sorprendentemente, esto es sólo una quinta parte del número de genes de trigo pan (Appels et al., 2018). Tulips, maíz y otras plantas también tienen genomas más grandes, lo que indica que el número de genes no refleja necesariamente la ¿Podrían los genomas gigantes ser el resultado de la cría de plantas por agricultores o jardineros? De acuerdo con Szostak hay moléculas que aparecen como reliquias del mundo del ARN como el acetil-CoA o la vitamina B12, ambos están ligados a un ribonucleótido sin ninguna razón obvia - ¿se "olvidaron" para ser removidos? (Roberts y Szostak, 1997; Szostak et al., 2001; Szostak, 2011). Tal vez el ARN conectado sirve como estabilizador estructural. Las vesículas lipídicas podrían haber formado los primeros compartimentos y ribozimas cerrados, tRNAs con aminoácidos seleccionados, y ARN que se convirtieron en mRN. ¿Es esto un pre-células o pre-virus (Figura 1)? Patel et al. (2015) demostró que los bloques de construcción de la vida, ribonucleótidos, lípidos y aminoácidos, se pueden formar a partir de C, H, O, P, N, S en una síntesis de "una olla". Este estudio se puede considerar como un estudio de seguimiento de la síntesis clásica Urey-Miller in vitro de biomoléculas (Miller, 1953; Miller y Urey, 1959). La transición del ARN al mundo ADN fue promovida por la formación de la transcriptasa inversa. La enzima fue descrita por primera vez en retrovirus pero es casi ubicua y se encuentra en numerosas especies celulares, muchas de las cuales con funciones desconocidas (Simon y Zimmerly, 2008; Lescot et al., 2016). Es un vínculo importante entre el ARN y los mundos del ADN. El nombre de transcriptasa inversa es histórico e irritante porque es la transcriptasa "real" durante la transición del ARN al mundo del ADN. Del mismo modo, la ribonucleasa H (RNase H) es una enzima esencial de retrovirus (Mölling et al., 1971). La RNASA H resultó ser una de las cinco proteínas más frecuentes y antiguas (Ma et al., 2008 ) que pertenece a una superfamilia de más de sesenta representantes únicos diferentes y 152 familias con numerosas funciones (Majorek et al., 2014). Algunos de los muchos tRNAs pueden llegar a ser cargados con aminoácidos. Hay virus que contienen estructuras similares a tRNA (TLS), que se asemejan a estos primeros ARNs (Dreher, 2009). Los virus TLS incluyen virus de plantas, como el virus del mosaico amarillo de Turnip, en el virus del grupo de maní, el virus del mosaico de tabaco (TMV), y el virus del mosaico de Brome. Sólo la mitad del ARNt se encuentra en los Narnavirus de hongos. Los aminoácidos conocidos por ser componentes de virus similares al ARNt son valina, histidina y tirosina. Las estructuras también fueron designadas como "mimícritas", mejorando la traducción (Dreher, 2009 (Dreher,, 2010 ). Parecen elementos precursores "congelados" para la síntesis de proteínas. Esta combinación de un tRNA parcial vinculado a un aminoácido puede interpretarse como un paso evolutivo hacia la síntesis de proteínas, atrapado en un elemento viral. Los viroides carecen de capas proteicas y por lo tanto inicialmente no fueron designados como virus sino como virus cuando fueron descubiertos en 1971 por Theodor Diener. Él describió a los viroides como "fósiles vivos" (Diener, 2016) (Figura 2). De las patatas infectadas, Diener aisló el tubérculo del huso de la patata (PSTVd) cuyo genoma era aproximadamente 100 veces más pequeño que los de los virus conocidos en ese momento. Los viroides conocidos hoy en día van desde 246 hasta 467 nucleótidos. Contienen ARN circular de una sola cadena, son libres de proteínas y autorreplicantes sin información genética, pero sólo estructurales FIGURA 2 Los viroides son estructuras de horquilla y se muestran esquemáticamente y como micrografía electrónica. Viroides son, como ribozimas, sin información genética y juegan papeles biológicos importantes hoy en día en enfermedades de las plantas, en flores de claveles, en cáncer de hígado, como catalizador de la síntesis de proteínas en ribosomas y como ARNs regulatorios circulares, como "esponjas" para otros ARNs regulatorios. información en forma de horquillas de pelo (Riesner et al., 1979). Pueden generar copias de sí mismos en el entorno apropiado. Fueron designados como las "fronteras de la vida" (Flores et al., 2014). El conocimiento de la composición del virus se basó en TMV y su cristalización por Wendell Stanley en 1935 (Pennazio y Roggero, 2000). El genoma de TMV es ARN singlestranded codificante de proteínas de alrededor de 6.400 nucleótidos que está encerrado por una capa prote Los viroides, por el contrario, no codifican proteínas y carecen de capas, pero están estrechamente relacionados con los virus. Los viroides pueden perder su autonomía y dependen de las polimerasas del ARN huésped para replicarse, son capaces de infectar las plantas y muchos son patógenos económicamente importantes. Hay dos familias, el núcleo-replicante Pospiviroidae como PSTVd y el cloroplasto-replicante Avsunviroidae como el Viroide Sundblotch Aguado (ASBVd). Su replicación requiere enzimas del huésped. Por lo tanto, la autonomía es reemplazada por la dependencia de las enzimas del huésped y un estilo de vida intracelular. La mayoría de los viroides son a menudo ribozimáticamente activos -sin embargo son ejemplos de que este rasgo puede perderse como resultado de las condiciones ambientales cambiantes. Sólo las variantes nucleares, las Pospiviroidae, pueden perder su actividad ribozimática y utilizar la enzima RNASA III celular para su replicación. En contraste, las Avsunviroidae siguen siendo ribozimas de cabeza de martillo activas. Así, dentro del núcleo de una célula huésped, la función RNA enzimática puede volverse innecesaria. No genes, sino una función, la actividad catalítica, se pierde. Viroides aparentemente no ganar genes, pero cooperó para un estilo de vida más complejo. Por ejemplo, Carnation pequeño ARN tipo viroides (ARN CarSV) coopera con un retrovirus y está acompañado por un ADN homólogo generado por una transcriptasa inversa. Esta enzima presumiblemente se origina de un pararetrovirus de las plantas. Pararetrovirus empaqueta partículas del virus en una etapa diferente durante la replicación que retrovirus, el ADN, no el ARN Esta combinación única entre dos elementos virales sólo se ha detectado hasta ahora con CarSV en flores de claveles (Flores et al., 2005) (Flores et al.,, 2014. ¿Por qué tal cooperación evolucionó -tal vez por los jardineros reproductores? El ARN es sensible a la degradación; por lo tanto, el aumento genético y el crecimiento del genoma puede no ser favorable energéticamente -al menos no en las plantas. Ganancia de la función es, en este caso, la cooperación. El ARN circular (ARN circular) está relacionado con ribozimas/viroides como un regulador principal de otros ARN regulatorios, un ARN "esponja" que absorbe pequeños ARNes. Micro ARNs (miRNs) son reguladores post-transcripcionales que se ven afectados por la presencia de ARN circulares. se detectaron ARNs en cerebros humanos y Pueden unir 70 miRNA conservadas en una célula y su cantidad es de hasta 25.000 moléculas (Hansen et al., 2013). Su estructura recuerda a ribozimas catalíticamente activas. Hay un viroides excepcionales que obtuvieron información codificante y entraron en el hígado humano (Taylor, 2009). El viroides se conoce como virus delta de la hepatitis (HDV). Tiene el genoma más pequeño de cualquier virus animal conocido de cerca de 1.680 nucleótidos. Tiene propiedades típicas de los viroides, ya que contiene ARN circular, forma saltos de horquilla similares y réplicas en el núcleo utilizando enzimas huésped. Dos polimerasas tienen que redirigir su especificidad del ADN al ARN para generar el genoma y el antígeno del HDV. Ambos tienen actividad ribozima. En contraste con otras ribozimas, el HDV codifica una proteína, el antígeno delta de la hepatitis (HDVAg) que se presenta en dos formas, el pequeño HDVAg (24 kDa) que soporta la replicación y el gran HDVAg (27 kDa) que ayuda al ensamblaje del virión. El gen fue presuntamente recogido de la célula huésped por la recombinación del ARNm del HDV intermedio con un ARNm del huésped. La transmisión depende de un virus ayudante, el virus de la Hepatitis B (VHB), que entrega la capa (Taylor, 2009 ) ¿El empaquetado por un virus ayudante protege el genoma y por lo tanto permite que exista un viroides más grande? En las plantas, los viroides pueden no ser capaces de hacerse más grandes posiblemente debido a su sensibilidad a la degradación - pero tampoco pueden ser mucho más pequeños. Sólo se conoce un único viroides que está compuesto completamente de ARN codificante de proteínas con trillizos (AbouHaidar et al., 2014). Los viroides y los ARN replicantes relacionados son unidades replicantes propensas a errores y la frecuencia de error les impone un cierto tamaño mínimo, ya que de otro modo se extinguirían. Este mecanismo ha sido descrito como "catástrofe de error", lo que impide la supervivencia (Eigen, 1971 (Eigen,, 2013 ). Los viroides y ARN relacionados son los más pequeños réplicas conocidas. Los más pequeños se extinguirían en ausencia de sistemas de reparación. En resumen, el ARN puede catalizar muchas reacciones. Las enzimas proteicas que pueden haber evolucionado más tarde tienen mayores actividades catalíticas. Los ribozimas son portadores de información, pero no requieren genes de codificación. La información se almacena en su secuencia y estructura. Así, la replicación de un ARN inicial es seguida por el flujo de información, del ADN al ARN a la proteína, como se describe el Dogma Central (Crick, 1968). Incluso un flujo de información de la proteína al ADN ha sido descrito para algunas proteínas arqueales (Béguin et al., 2015). El mundo de proteínas de ADN contiene numerosos NCRNAs con funciones clave. ncRNA puede servir como un compuesto modelo para el origen de la vida en otros planetas. Por lo tanto, no la composición química de esta molécula es de importancia primordial, pero su simplicidad y multifuncionalidad. Además, el ARN es software y hardware en una sola molécula, que lo hace único en nuestro mundo. Hay otros escenarios además del aquí discutido "virus-first, " tales como "proteína-first", "metabolismo-fist" o el "mundo lípido" (Segré et al., 2001; Andras and Andras, 2005; Vasas et al., 2010; Moelling, 2012). Algunos de estos conceptos alternativos se construyeron sobre la filogenómica, la reconstrucción del árbol de la vida por secuenciación del genoma (Delsuc et al., 2005). Sorprendentemente, fue Sir Francis Crick, uno de los descubridores de la doble hélice del ADN, que declaró que no se sorprendería de un mundo completamente construido de ARN. Una predicción similar fue hecha por Walter Gilbert (Crick, 1968; Gilbert, 1986). ¡Qué visión! Nuestro mundo fue casi 50 años más tarde definido como "proteína ARN" mundo (Altman, 2013). Se puede especular que nuestro mundo fue construido de ribozimas o viroides, lo que significa "virus primero". Los ncRNAs aparecen como reliquias del mundo ARN pasado, antes de que el ADN, el código genético y las proteínas evolucionaran. Sin embargo, el ncRNA es esencial en nuestro mundo de ADN biológico hoy en día. Es posible producir tal ncRNA hoy en el tubo de prueba por pérdida de información génica de ARN codificante de proteínas. Esta reducción al ncRNA se demostró in vitro con ARN fago. El ARN genómico Qβ, 4.217 nucleótidos de longitud, fue incubado en presencia de replicasa Qβ, nucleótidos y sales libres, un medio rico en el tubo de prueba. El ARN se permitió replicar por medio de la réplica Qβ. La transferencia serial de alícuotas a medio fresco llevó a tasas de replicación cada vez más rápidas y a la reducción del tamaño genómico, hasta 218 nucleótidos de ncRNA en 74 generaciones. Este estudio demostró que, dependiendo de las condiciones ambientales, se puede producir una reducción génica extrema. Este experimento realizado en 1965 fue designado como "Monstruo de Spiegelman". El ARN de codificación se convirtió en replicación de ncRNA (Spiegelman et al., 1965; Kacian et al., 1972)! Manfred Eigen amplió este experimento y demostró además que una mezcla que no contiene ARN para empezar con pero sólo ribonucleótidos y la réplica Qβ puede bajo las condiciones correctas en un tubo de prueba generar espontáneamente ncRNA auto-replicante. Esto evolucionó en una forma similar al Monstruo de Spiegelman Además, un cambio en la concentración enzimática y la adición de ARN cortos o un intercalador de ARN influyeron en la población de ARN emergente (Sumper y Luce, 1975; Eigen, 2013). Así, la complejidad de los genomas depende del medio ambiente: las malas condiciones conducen a una mayor complejidad y a entornos ricos a una menor complejidad. El proceso demostrado en este experimento con componentes virales indica que la reversión a la simplicidad, la reducción de tamaño, la pérdida de información genética y la velocidad de replicación pueden ser las principales fuerzas de la vida, aunque esto parezca ser como una reversión de la evolución. El experimento puede tal vez ser generalizado desde el tubo de ensayo a un principio, que los sobrevivientes más exitosos en nuestro planeta son los virus y microorganismos, que se convirtieron en las entidades más abundantes. Tal vez la vida pueda comenzar de nuevo. Estos estudios plantean la cuestión de cómo las moléculas de ARN pueden llegar a ser Esto puede ser superado por el flujo de calor a través de un poro abierto en rocas sumergidas, que concentra la replicación de oligonucleótidos de un flujo de alimentación constante y la selección de hebras más largas. Esto se ha descrito para un aumento de 100 a 1.000 nucleótidos in vitro. Moléculas de ARN menores de 75 nucleótidos morirán (Kreysing et al., 2015). ¿Podría un medio ambiente pobre conducir a un aumento de complejidad? Esto podría ser probado. Ribozimas se demostró que crecen en tamaño por absorción de genes, como se demostró para HDV (Taylor, 2009 ). Un ejemplo inesperado interesante reciente que apoya la noción de que las condiciones ambientales influyen en la complejidad genética, es el microbioma intestinal humano. Su complejidad aumenta con diversos alimentos, mientras que alimentos ricos uniformes reducen su diversidad y pueden conducir a enfermedades como la obesidad. Unas pocas docenas de especies bacterianas y virales/fagos se conservan entre individuos (secuencias básicas) como una composición estable (Broecker et al., 2016c. La disbiosis se ha observado en varias enfermedades crónicas y en la obesidad, una pérdida de riqueza y diversidad bacterianas. La nutrición en condiciones afluentes con alimentos ricos en azúcar contribuye a la obesidad, lo que resulta en una reducción significativa de la complejidad del microbioma. Esta reducción es difícil de revertir (Cotillard et al., 2013; Le Chatelier et al., 2013). El microbioma intestinal en pacientes humanos con obesidad recuerda a la reducción genética descrita en el experimento del Monstruo de Spiegelman: reducción de genes en un entorno rico. La reducción de la complejidad del microbioma se atribuye en parte a la acción de los fagos, que bajo tales condiciones, definidas como estrés, lisian las El trasplante de microbiota fecal puede ser reemplazado incluso por fracciones solubles que contienen fagos o metabolitos del donante sin bacterias (Ott et al., 2017). Analógicamente, los microbiomas más complejos se encuentran en las tribus humanas indígenas de África, que viven en una amplia variedad de nutrientes diferentes. Es un proceso lento, sin embargo, para aumentar la complejidad de la microbiota intestinal por nutrición diversa. La microbiota asociada a la obesidad que sobrevive son más aptas y difíciles de contrarrestar. Urbanización y occidentalización de la dieta se asocia con una pérdida de biodiversidad microbiana, pérdida de organismos microbianos y genes (Segata, 2015). Para entender el mecanismo y la fuerza motriz para la reducción del genoma, las tasas de eliminación se probaron mediante la inserción de un gen indicador en el genoma de Salmonella entérica. La pérdida del gen indicador fue monitoreada por el paso en serie Las deleciones resultaron en genomas más pequeños con reducción o ausencia de genes de reparación de ADN (Koskiniemi et al., 2012). La pérdida de genes confirió una mayor aptitud a las bacterias bajo estas condiciones experimentales. Los mimivirus recientemente descubiertos y otros virus gigantes son dignos de considerar para entender la evolución de la vida con respecto a la contribución de los virus. Sus anfitriones son, por ejemplo, Acanthamoeba, Clorella, y Coccolithus algas (Emiliania huxleyi), pero también corales o esponjas como se discutió más recientemente. Los mimivirus fueron descubiertos por primera vez en torres de agua de refrigeración en Bradford, Reino Unido en 2003 con cerca de 1.000 genes, la mayoría de los cuales no relacionados con genes conocidos anteriormente. Los mimivirus han recibido atención porque contienen elementos que se consideraban distintivos de células vivas, no de virus, Los mimivirus albergan estos bloques de construcción como conjuntos incompletos que no son suficientes para la síntesis de proteínas independientes como las bacterias o las arcaeas pueden realizar, evitando que lleven una vida autónoma (La Scola et al., 2003 Scola et al.,, 2008. Son más grandes que algunas bacterias. Los virus gigantes pueden ser vistos como en un camino evolutivo hacia un organismo celular. Alternativamente, pueden haber evolucionado de un organismo celular por pérdida de información genética (Nasir y Caetano-Anolles, 2015). Los virus gigantes han tomado con frecuencia genes de sus anfitriones por transferencia horizontal de genes (HGT) (La Scola et al., 2008; Nasir y Caetano-Anolles, 2015; Colson et al., 2018). Un gráfico sobre los tamaños del genoma muestra que los mimivirus y las bacterias se superponen en tamaño, lo que indica una transición continua entre virus y bacterias y entre mundos vivos y no vivos (basado en Holmes, 2011) (Figura 3). Otros virus gigantes, como los megavirus, fueron descubiertos en el océano de Chile con 1.120 genes. Más recientemente, el Klosneuvirus fue identificado en las aguas residuales del monasterio Klosterneuburg en Austria en 2017 con 1.57 millones de pares de bases (Mitch, 2017). Pithovirus sibericum es el más grande entre los virus gigantes descubiertos hasta la fecha con un diámetro de 1,5 micras, un genoma de 470.000 pb con 467 genes putativos, 1,6 micras de longitud, y es presumiblemente de 30.000 años ya que fue recuperado de permafrost en Siberia (Legendre et al., 2014 Los virus Pandora más pequeños con 1 micron de longitud tienen genomas cinco veces más grandes, 2.500.000 pb (Philippe et al., 2013) (Figura 3). Los virus gigantes incluso pueden ser hospedadores de virus más pequeños, los virófagos, que recuerdan a los bacteriófagos, los virus de las bacterias. Estos virófagos como Sputnik son sólo 50 nm de tamaño con 18.343 pb de ADN circular y 21 genes de codificación proteica predichos. Se replican en fábricas virales y consumen los recursos del mimivirus, destruyéndolo así. Algunos, los virófagos incluso pueden integrarse en el genoma del huésped celular y se pueden reactivar cuando el huésped está infectado por virus gigantes. Así, virus gigantes sugieren que los virus están cerca de entidades vivas o pueden haber estado vivos (La Scola et al., 2008; En biología es común distinguir entre materia viva y muerta por la capacidad de sintetizar proteínas y replicar autónomamente. Los virus gigantes pueden ser considerados como un eslabón faltante entre los dos, porque albergan "casi" el aparato de síntesis de proteínas. La transición de vivir al mundo no vivo es continua, no separada por una línea fronteriza aguda (Figura 3). Los virus no son considerados vivos por la mayoría de la comunidad científica y como se escribe en los libros de texto, porque no pueden replicarse autónomamente. Sin embargo, algunos de los virus gigantes están equipados con casi todos los componentes de la maquinaria de síntesis de proteínas cerca de bacterias que sugieren que pertenecen a la materia viva (Schulz et al., 2017). Las ribozimas pueden haber sido la entidad replicante más temprana. Tal vez también otros virus fueron inicialmente más independientes de la Tierra primitiva que hoy en día. Como se describe en la Figura 1 puede haber sido inicialmente Sólo más tarde los virus pueden haber renunciado a su replicación autónoma y convertirse en parásitos, como se ha descrito para algunas bacterias (véase más adelante). Se han hecho esfuerzos para identificar la célula viva más pequeña que todavía se replica de forma autónoma. Entre las bacterias que presumiblemente se encuentran Pelagibacter ubique del clado SAR11 de bacterias (Giovannoni, 2017), que se descubrió en 1990. Es un alfa-proteobacterio con 1.389 genes presentes ubicuamente en todos los océanos. Puede alcanzar hasta 10 28 células vivas libres en total y representa aproximadamente el 25% de las células de plancton microbiano. Muy poco de su ADN es no codificante. Alberga fagos de tipo podofago, designados como "pelagiphage" (Zhao et al., 2013). Este pequeño bacteria fue designado como el organismo más común en el planeta. ¿ Esta bacteria autónoma es más pequeña que algunos virus gigantes parasitarios. Craig Venter, que primero logró secuenciar el genoma humano, trató de minimizar el genoma más pequeño putativo de una especie viva, de Mycoplasma mycoides, una bacteria parasitaria que vive en rumiantes (Gibson et al., 2008 (Gibson et al.,, 2010. Su grupo sintetizó un genoma de 531.000 bp con 473 genes, 149 de ellos (32%) con funciones desconocidas (Hutchison et al., 2016). Entre los organismos parasitarios vivos más pequeños está Nanoarchaeum equitans. Es un arqueón termofílico que vive a 80 • C y a pH 6 con 2% de sal (Huber et al., 2003). Su genoma tiene un tamaño de 490.000 bp y codifica 540 genes. N. equitans es un simbionte obligatorio de un arqueón más grande, Ignicoccus montando en él como en un caballo, de ahí el nombre (Huber et al., 2003). El mundo de los virus cubre una gama de tres troncos en tamaño de sus genomas: desde genes cero a cerca de 2.500 genes que ascienden a cerca de 2.500.000 bp de ADN. Los viroides de origen cero tienen unas 300 bases de longitud (Figura 3). La virosfera es el reservorio más exitoso de entidades biológicas en nuestro planeta en términos de número de partículas, velocidad de replicación, tasas de crecimiento y espacio secuencial. Hay alrededor de 10 33 virus en nuestro planeta y están presentes en cada especie existente (Suttle, 2005). No hay especies vivas sin virus! Los virus también ocurren libremente en los océanos, en el suelo, en nubes hasta la estratosfera y más Poblan el intestino humano, el canal de nacimiento y el exterior del cuerpo como capa protectora contra las poblaciones microbianas. Los microbios contienen fagos que se activan durante condiciones de estrés tales como la falta de nutrientes, el cambio de temperatura, la falta de espacio y otros cambios de las condiciones ambientales. Uno de los papeles más agitadores de la tierra de este siglo fue la publicación de la secuencia del genoma humano (Lander et al., 2001). Alrededor de la mitad, posiblemente incluso dos tercios de la secuencia se componen de retrovirus endógenos más o menos completos (ERVs) y retroelementos relacionados (REs) (de Koning et al., 2011). Las RE amplifican a través de mecanismos de copia y pasta que implican un paso de transcriptasa inversa de un ARN intermedio en ADN. Además, los elementos transponibles del ADN (TEs) se mueven por un mecanismo de corte y El origen de las REs está siendo discutido como restos de infecciones germinales retrovirales antiguas que se fijaron evolutivamente en el genoma. Alrededor de 450.000 elementos ERV humanos (HERV) constituyen alrededor del 8% del genoma humano consistente en elementos retrovirales distintivos como la mordaza, pol, genes env y repeticiones terminales largas flanqueantes (LTR) que actúan como promotores (Lander et al., 2001). Howard Temin, uno de los descubridores de la transcriptasa inversa, en 1985 ya describió elementos similares a retrovirus endógenos, que estimó en cerca del 10% de la secuencia del genoma humano y del ratón (Temin, 1985). El número real es alrededor del 45% como se estima hoy (Lander et al., 2001). En algunos genes como el gen Protein Kinase Inhibitor B (PKIB) determinamos alrededor del 70% de secuencias ¿Hay un límite? ¿Podría haber sido 100%? Se estima que los retrovirus han entrado en el linaje del genoma mamífero hace 550 millones de años (MYA) (Hayward, 2017). Las secuencias ERV más antiguas pueden existir pero hoy son irreconocibles debido a la acumulación de mutaciones. Los ERV sufren mutaciones, deleciones o eventos de recombinación homóloga con grandes deleciones y pueden llegar a ser tan cortos como los elementos LTR solos, que son unos pocos cientos de pb en longitud - los sobrantes de genomas retrovirales de larga duración de alrededor de 10.000 pb. Los promotores LTR pueden desregular genes vecinos. Los eventos de recombinación homóloga pueden ser considerados como eventos de pérdida de genes o reducción de genes. Es la suposición de que los ERV, que ya no eran necesarios para la defensa celular del huésped, ya no fueron Eugene Koonin señala que la infección y la integración son eventos únicos que se producen a un ritmo rápido, mientras que la pérdida y la reducción de genes pueden tardar mucho más tiempo (Wolf y Koonin, 2013). Una reducción frecuente de genes de genomas eucariotas es la pérdida de la proteína de envoltura viral codificada por el gen env. Sin un abrigo, los retrovirus ya no pueden dejar la célula e infectar otras células. Pierden la movilidad y se convierten en elementos intracelulares obligatorios. Los virus ayudantes pueden suministrar proteínas de envoltura en trans y movilizar los virus. Las TEs o REs se pueden considerar como ejemplos de reliquias de virus intracelulares sin capa -o podría haber sido al revés, tal vez precursores de retrovirus de larga duración? Estos elementos pueden amplificarse intracelularmente y modificar los genomas del huésped mediante la integración con el peligro potencial de alteración genética y cambios genéticos. Las REs pueden llevar a la duplicación de genes y al desarrollo de pseudogenes, con una copia para la conservación estable de las funciones adquiridas y la otra para las innovaciones (Cotton y Page, 2005). Tales duplicaciones constituyen grandes cantidades de genomas de mamíferos (Zhang, 2003). Los retrovirus tienen una duplicación de moiety RNASa H, una de las cuales sirve como enlace catalíticamente inactivo entre la RT polimerasa y la enzimáticamente activa RNASa H (Xiong y Eickbush, 1990; Malik y Eickbush, 2001; Moelling y Broecker, 2015; Moelling et al., 2017). Esta duplicación de genes se remonta a 500 millones de años (Cotton y Page, 2005). Las duplicaciones de genes son una causa común de cáncer, que a menudo se produce sólo en el genoma de la célula cancerosa en sí, Myc, Myb, ErbB2, Ras y Raf son oncogenes amplificados en diversos tipos de cánceres humanos (Vogelstein y Kinzler, 2002). La capacidad de los retrovirus para integrarse los hace distintos de los endosimbiontes que permanecen separados. Sin embargo, el resultado neto es muy similar, la adquisición de nueva información genética, que se transmite a la siguiente generación, si la línea germinal está infectada y se produjo la endogenización del virus. La integración viral no se limita a las células eucariotas, sino también un mecanismo en procariotes para el mantenimiento del estado lisogénico de los fagos dentro de las bacterias. Además, para otros virus eucariotas como el VHB, el antígeno de superficie envolvente BHsAg se puede eliminar, lo que conduce a un estilo de vida intracelular obligatorio para el virus, que especialmente en presencia de VHC promueve el cáncer (Yang et al., 2016). Se ha demostrado que el VIH pierde rápidamente uno de sus genes auxiliares, nef, originalmente por factor negativo. El gen se perdió dentro de un número bastante bajo de pasajes del virus crecido bajo condiciones de cultivo tisular por selección de células productoras de títulos de alto virus. La eliminación de nef resultó en un aumento significativo del título del virus en cultivo -de ahí el nombre. El producto del gen nef no era de necesidad dentro de las células de cultivo tisular, sino que era inhibitorio para la replicación. Sin embargo, es esencial para la patogenicidad en animales, y posteriormente nef fue reinterpretado como " Además, los hospederos humanos del VIH pueden perder una porción terminal significativa de un receptor de siete transmembranas en linfocitos, la célula diana primaria para la entrada del VIH y para la captación del virus. Esta molécula, el receptor de citocinas CCR5 es truncado por 32 aminoácidos carboxiterminales (CCR5-32), desactivando funcionalmente el receptor. La frecuencia de alelos del mutante CCR5-32 mutante es de alrededor del 10% en la población europea, haciendo que estas personas resistentes a las infecciones por VIH (Solloch et al., 2017). Esta pérdida genética en europeos ha demostrado hacer que los individuos resistentes no sólo contra la infección por VIH sino también contra la malaria. Esto puede haber sido la presión selectiva en el pasado antes de que el VIH/SIDA surgiera. No se ha descrito ningún efecto secundario para los seres humanos que carecen de este gen (Galva Los virus han demostrado ser motores de la evolución (Villarreal y Witzany, 2010), incluyendo el genoma humano, que por lo menos un 45% está compuesto de secuencias relacionadas con retrovirus. Además, los retrovirus endogenizados suministraron los genes de sincitina que son esenciales para el desarrollo de la placenta mamífera, y permitieron el crecimiento de embriones sin su rechazo por el sistema inmune materno (Dupressoir et al., 2012). Así, la misma propiedad que causa inmunodeficiencia en pacientes infectados por VIH y conduce al SIDA causa la formación de sincitia, fusión celular después de la infección por un retrovirus. También se ha propuesto que los virus estén en el origen de la evolución de la inmunidad adaptativa (Villarreal, 2009 ). Así, los genomas conformados por virus mediante el suministro de genes y mecanismos esenciales. La endogenización de retrovirus se ha producido en los genomas Si los ERVs integrados no ofrecían ninguna ventaja selectiva, se deterioraban y acumulaban mutaciones con pérdida de función, lo que se demostró directamente mediante la reconstrucción de un retrovirus infeccioso a partir de la secuencia de consenso de 9 secuencias de virus endógenos defectuosos, designados como Phoenix. El virus se expresaba a partir de un clon sintético de ADN construido en cultivo celular y partículas de virus formados identificadas por análisis microscópicos de alta resolución (Dewannieux y Heidmann, 2013). Los koalas en Australia están siendo endogenizados de un retrovirus (koala retrovirus, KoRV) en "tiempo real" y demuestran posibles consecuencias para la inmunidad. A principios de 1900, algunos individuos fueron trasladados a islas, incluida la isla Kangarooo, cerca del continente australiano para fines de repoblación, ya que los koalas estaban amenazados de extinción. Sin embargo, los koalas aislados en la isla de Kangaroo son KoRV negativos, lo que permite datar la introducción de KoRV en la población de koalas hace unos cien años. Muchos de los koalas infectados cayeron enfermos y murieron, sin embargo algunas poblaciones se volvieron resistentes dentro de unos 100 años, correspondientes a unas 10 generaciones. Los koalas probablemente desarrollaron resistencia debido a los provirus de ADN integrados. El retrovirus se transmite como exógeno así como virus endógeno, similar al retrovirus de ovejas Jaagsiekte (JSRV), por lo que los virus endogenizados protegen con un producto génico viral, como Env, contra infecciones de novo por "exclusión de la superinfección" (Tarlinton, 2012). La contribución de los retrovirus a la defensa antiviral es sorprendente, ya que todos los genes retrovirales tienen genes análogos en el mecanismo de defensa de las células eucarióticas siRNA/RNAi (Moelling et al., 2006). Los retrovirus pueden proteger contra la infección por otros virus relacionados, por ejemplo, al expresar proteínas Env que bloquean los receptores de la superficie celular (Villarreal, 2011). Un mecanismo comparable protege a las células bacterianas contra los fagos de ADN, mediante fragmentos de ADN de fagos integrados que se transcriben en ARNm e hibridan a los nuevos fagos de ADN entrantes y por lo tanto conducen a su destrucción por nucleasasases híbridos específicos, inmunidad CRISPR/Cas (Charpentier y Doudna, 2013). A menudo no se da cuenta de que la adquisición de inmunidad en bacterias y células La integración de retrovirus ocurre normalmente en las células somáticas después de la infección como un paso obligatorio durante el ciclo de vida viral. La infección de las células germinales puede conducir a la transmisión a la próxima generación y en última instancia dar lugar a resistencia hereditaria. Los retrovirus endogenizados probablemente causaron resistencia FIGURA 4 Los virus protegen contra los virus: los retrovirus protegen a una célula contra una nueva infección por un virus similar designado como "exclusión de la superinfección" o interferencia viral. Esto es mediado por productos genéticos virales como proteínas o ácidos nucleicos. Del mismo modo, los fagos protegen contra los fagos: la superinfección de bacterias es evitada por el ARN CRISPR/Cas originado por infecciones anteriores. Los mecanismos de defensa contra virus y fagos son análogos. La protección de virus o fagos contra superinfección representa defensa celular y inmunidad adquirida. Los cuatro ejemplos se discuten Del mismo modo, la resistencia al virus de la Inmunodeficiencia Simiana (SIV) en algunas especies de monos puede explicarse por la endogenización (Li et al., 2017) (Li et al., 2018. En el caso de los fagos y sus hospedadores procarióticos, el mecanismo se describe como CRISPR/Cas, que siguen principios análogos de "endogenización" del material genético entrante para su posterior exclusión. Se puede especular que el VIH también puede llegar a ser endogenizado en el genoma humano. Hay alguna evidencia de que el VIH puede infectar las células germinativas humanas y transmitirse al genoma embrionario (Wang et al., 2011). ¿Cuánto tiempo puede tardar esto no se conoce -10 generaciones? La pérdida de la función de los VRV puede ocurrir por mutaciones, supresiones de los env u otros genes y, en última instancia, El número de elementos retrovirus suma alrededor de 450.000, lo que corresponde al 8% del genoma humano (Lander et al., 2001; Cordaux y Batzer, 2009 ). Las regiones promotoras fueron analizadas por su contribución al cáncer activando genes vecinos -como consecuencia de una antigua infección por retrovirus. De hecho, los genes celulares activados por "promoción descendente" fueron identificados en estudios animales con activación del gen mic como uno de muchos ejemplos, llevando a un desarrollo crónico y no agudo del cáncer (Ott et al., 2013). Como mecanismo general para el cáncer humano hoy en día los LTRs no son identificados como un culpable mayor. La mayoría de los ERVs que encontramos hoy se han integrado durante la evolución en intrones u otras regiones donde su presencia es relativamente inofensiva. ¿Resultaron los otros en la muerte de los portadores que desaparecieron? Los efectos de los LTRs en los niveles de expresión de los genes huéspedes vecinos fueron estudiados con el virus humano endógeno, HERV-K, como posible causa de cáncer, pero esto no parece ser un fenómeno general (Broecker et al., 2016b). Como se demostró para los koalas, los ERVs pueden conferir inmunidad a las infecciones virales (Feschotte et al., 2012). Se demostró que un ERV relacionado, HERV-H, produce un ARN que mantiene las células embrionarias tempranas pluripotentes e incluso revierte las células adultas para recuperar la pluripotencia (Grow et al., 2015). Así, el papel de los ERVs puede ser más complejo de lo que conocemos actualmente. Elementos transponibles y REs que perdieron la capacidad de transmisión celular mediante la eliminación de la proteína del abrigo contribuyen principalmente a la complejidad genética de Están "bloqueados" dentro de las células y son los principales impulsores del aumento de la complejidad genética (Cordaux y Batzer, 2009 ). Se podría especular que estos elementos intracelulares son retrovirus replicantesincompetentes que carecen de abrigos (Lander et al., 2001). Los murciélagos transmiten virus como el Ébola y el coronavirus SARS sin sufrir de enfermedad (Beltz, 2018). Incluso virus ARN como Bornavirus han demostrado integrarse por transcripción inversa ilegítima, posiblemente también proporcionando inmunidad contra la superinfección (Katzourakis y Gifford, 2010). Hay dos eventos prominentes que contribuyeron significativamente al éxito de la vida y la formación de células. Ambos están asociados con la reducción de genes. Este fenómeno puede jugar un papel para la evolución de los virus de estilos de vida autónomos a parásitos. En la década de 1960 Lynn Margulis propuso un origen extracelular para las mitocondrias (Margulis, 1970,, 1993 ). Una célula ancestral, tal vez un arqueón, fue infectada por una bacteria anaerobia, que dio lugar a las mitocondrias. Del mismo modo, cianobacterias formaron los cloroplastos en las células vegetales modernas. Mitocondrias surgió hace alrededor de 1.450 millones de años (BYA) (Embley y Martin, 2006). Mitocondrias y cloroplastos son los ejemplos más llamativos para un cambio en el estilo de vida de bacterias autónomas a endosimbiontes. Esta transición a menudo se considera como extremadamente rara y un sello distintivo de la evolución de la vida en nuestro planeta. Sin embargo, hay muchos otros parásitos intracelulares obligados como Rickettsia, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii (el agente causal de la fiebre Q), Mycobacterium leprae, M. tuberculosis, y M. mycoides (Beare et al., 2006). El cambio de estilo de vida de los endosimbiontes en los dos casos de mitocondrias y cloroplastos es sorprendente. Ambos redujeron drásticamente su composición genética. Mitocondria contiene menos de 37 genes, que dejaron de ser los originales alrededor de 3.000 genes. Es endogenización de retrovirus, los ERV, que se integran en células germinales, relacionadas con la endosimbiosis? Son estos modelos endosimbionts para la transición de un estilo de vida autónomo a una vida parasitaria que puede haber tenido lugar con virus? Un ejemplo típico más reciente para una evolución reductiva son Rickettsia. Estas bacterias se supone por algún tiempo que son virus debido a su existencia parasitaria intracelular obligatoria. Rickettsia han evolucionado de bacterias que replican autónomamente. Evolución reductiva de endosimbiontes puede producir bacterias con genomas diminutos a expensas de la vida extracelular autónoma. Sus genomas son 1,11 millones de pbp en longitud con cerca de 834 genes codificantes de proteínas, y pérdida de 24% por la evolución reductiva (Ogata et al., 2001). Rickettsia puede tener alguna relación con cianobacterias, que se consideran como los principales simbiontes. ¿Se puede especular que los virus pueden haber sido entidades autónomas inicialmente? Viroides pueden haber sufrido la transición de la autonomía a parásitos, tal como se muestra para mitocondria, cloroplastos o Rickettsia? ¿Hasta qué punto los virus han sido autónomos e independientes de los metabolismos celulares originalmente -y contribuyeron al origen de las células? ¿Podrían haber perdido su autonomía más tarde y convertirse en parásitos? Los virus son minimalistas en su composición y deben haber sufrido reducciones genéticas estrictas (Flint, 2015). ¿Cuán pequeños pueden llegar a ser sus genomas? La mayoría de los virus ARN codificados todavía contienen elementos reguladores, ncRNA en las 3 y 5 regiones terminales para la entrada ribosomal, síntesis proteica, regulación transcripcional, y otros. Un subgrupo de retrovirus es un ejemplo interesante en cuanto a la pérdida simultánea y la ganancia de información genética. Los retrovirus oncogénicos o tumoresvirus pueden recombinarse con genes celulares que bajo los promotores de retrovirus pueden convertirse en oncogenes y conductores de cáncer. Alrededor de cien oncogenes han sido seleccionados en los laboratorios y estudiados durante La selección de las ventajas de crecimiento de las células huésped llevó al descubrimiento de los oncogenes que promueven el crecimiento más rápido que conocemos hoy en día, como Ras, Raf, ErbB o Myc, que son en parte objetivos exitosos para los medicamentos anticancerosos (Moelling et al., 1984). Estos oncogenes fueron en la mayoría de los casos tomados por los retrovirus a expensas de los genes estructurales (gag), replicando (pol) o envolvente (env), y a menudo se expresan como proteínas de fusión con Gag. Así, los retrovirus oncogénicos son virus defectuosos intracelulares obligatorios y fueron seleccionados para en el laboratorio por los investigadores para los oncogenes con la capacidad de crecimiento más potente promover. Necesitan el suministro de genes replicatorios en trans de virus ayudantes co-infectantes para infectar otras células (Flint, 2015) Algunas cepas del virus del sarcoma de Rous mantienen la replicación competente al transportar el src derivado de la célula (para el sarcoma) oncogén que codifica una proteína de 536 aminoácidos que aparentemente pueden encajar en la partícula retroviral junto con el genoma viral de tamaño completo (Broecker et al., 2016a). Razones espaciales pueden haber influido en la formación de retrovirus oncogénicos y limitado su tamaño y, por lo tanto, llevado a sus fenotipos defectuosos. Hay indicios de que la actividad incontrolada de (retro)transposones en las células germinativas puede resultar en enfermedades como la infertilidad masculina -presumiblemente por "catástrofe grave", causada por demasiados eventos de transposición. En los mamíferos, los piRNAs doman la actividad transpoon por medio de la actividad de la RNASa H de las proteínas PIWI durante la espermatogénesis (Girard et al., 2006). Sólo una minoría de virus son patógenos; la mayoría de ellos no causan enfermedades. Por el contrario, son más importantes como impulsores de la evolución, como transmisores de material genético, como agentes innovadores. En particular, los virus ARN son los más innovadores. Algunos de ellos son patógenos y peligrosos, como el VIH o el virus influenza, o los viroides en las plantas. Los virus ARN son capaces de cambiar tan rápidamente que el sistema inmunitario del huésped es incapaz de contrarrestar la infección. La patogenicidad surge cuando las condiciones ambientales cambian, por ejemplo, cuando un virus entra en un nuevo organismo o especie. El aumento de la complejidad celular por virus es una característica importante de la evolución. Tales cambios evolutivos importantes son tomados recientemente como argumentos en contra de la teoría evolutiva por Charles Darwin quien consideró cambios graduales, pequeños incrementos por mutaciones como la base principal para la selección y la evolución. Nueva crítica está abordando este pensamiento, considerando cambios más grandes como impulsores evolutivos. Tales cambios surgen por muchos fenómenos complejos tales como endosimbiosis, infección por procariotos, virus y hongos, recombinación de genes, HGT, infecciones, sexo. Cambios dramáticos tales como endosimbiosis o infecciones de patógenos extienden el concepto de Darwin de evolución. Hay numerosos ejemplos para la contribución de virus a la evolución de la vida desde por lo menos hasta 550 MYA (Hayward, 2017). Pero el ruido genético a través de mutaciones aleatorias no nos permite volver al origen de la vida. Por analogía, se puede especular que en algún momento los virus autónomos renunciaron a la independencia para una vida intracelular obligatoria -como se ha descrito para las mitocondrias y los cloroplastos, pero también las bacterias intracelulares como Rickettsia. Esta especulación se basa en el concepto de que la vida temprana debe haber comenzado simple y con alta variabilidad genética y luego se volvió más compleja. Pero la complejidad se puede renunciar a un estilo de vida menos consumidor de energía con genomas pequeños y alta velocidad de replicación (Moelling, 2012 (Moelling,, 2013 ). Por lo tanto, la pregunta puede repetirse: "¿Son los virus nuestros antepasados más antiguos?"Alguna vida fósil puede ser parcialmente reproducida in vitro por los experimentos de seguimiento de Spiegelman y Eigen, explicando el gran potencial de supervivencia del NCRNA simple. Los virus pueden ser patógenos, pero su reconocimiento como causa principal de enfermedades es Esta noción se basa en la historia de los virus en la medicina, como se explica en un libro titulado "Viruses: More Friends Than Foes" (Moelling, 2017). El escenario descrito aquí se centra en los virus como motores de la evolución. El mundo del ARN temprano se interesó hace 20-30 años, como lo demuestran las referencias anteriores. Sorprendentemente, hay científicos que todavía creen en la "hipótesis del pansperm" y piensan que los retrovirus son de origen extraterrestre (Steele et al., 2018). El interés reciente en el origen de la vida surgió de los exoplanetas recién descubiertos cuyo número aumenta diariamente -y que pueden ser tan numerosos como 10 25. Así, las estadísticas puras hacen que algunas personas crean que hay vida extraterrestre. La vida extraterrestre se imita en laboratorios en la Tierra con muchos supuestos -quizás esta El debate que aquí se presenta debe considerarse como un concepto de réplica simple y de entidades en evolución posiblemente derivadas de diferentes bloques de construcción en otros entornos, siendo la estructura más relevante que la secuencia.

¿Qué grupo de cuasiespecies de ARN satisfacen los criterios para la vida?

Virus y evolución – ¿Virus Primero? Una Perspectiva Personalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6433886/SHA: f3b9fc0f8e0a431366196d3e835e1ec368b379d1Autores: Moelling, Karin; Broecker, FelixFecha: 2019-03-19DOI: 10.3389/fmicb.2019.00523Licencia: cc-byAbstract: El descubrimiento de exoplanetas dentro de zonas habitables putativas revolucionó la astrobiología en los últimos años. Estimuló el interés en la pregunta sobre el origen de la vida y su evolución. Aquí, discutimos cuáles podrían haber sido los roles de los virus al principio de la vida y durante la evolución. Los virus Están presentes en todas partes, en nuestros alrededores, los océanos, el suelo y en cada ser viviente. Los retrovirus contribuyeron a cerca de la mitad de nuestras secuencias genómicas y a la evolución de la placenta mamífera. Los virus contemporáneos reflejan la evolución que va desde el mundo del ARN hasta el mundo de las proteínas del ADN. ¿Hasta dónde podemos rastrear su contribución? Las entidades más tempranas que replican y evolucionan son las ribozimas o viroides que cumplen varios criterios de vida. El ARN puede realizar muchos aspectos de la vida e influencia nuestra expresión genética hasta hoy. Las estructuras más simples con información no codificante pueden representar modelos de vida construidos sobre información estructural, no genética. Los virus hoy son parásitos obligatorios dependiendo de las células huésped. Ejemplos de cómo un estilo de vida independiente podría haberse perdido son las mitocondrias, los cloroplastos, Rickettsia y otros, que solían ser bacterias autónomas y se convirtieron en parásitos o endosimbiontes intracelulares, perdiendo así la mayoría de sus genes. Incluso in vitro la pérdida de genes se puede recapitular todo el camino de la codificación a ARN no codificante. Además, los virus gigantes pueden indicar que no hay frontera aguda entre las entidades vivas y no vivas sino un continuo evolutivo. Aquí, se discute cómo los virus pueden perder y ganar genes, y que son motores esenciales de la evolución. Aparte de nuestra visión “virus primero”, hay otros como “proteínas primero” y “metabolismo primero”. Texto: Mycoplasma mycoides por eliminación sistemática de genes individuales resultó en un genoma sintético mínimo de 473 genes (Hutchison et al., 2016). ¿Puede uno considerar entidades vivientes más simples? Hay elementos con cero genes que cumplen muchos criterios para la vida temprana: ribozimas, ARN catalíticos estrechamente relacionados con los viroides. Fueron recuperados in vitro de 10 15 moléculas (aptadores), 220 nucleótidos en longitud, por 10 rondas de selección. Entre las muchas especies de ARN presentes en esta colección de cuasiespecies ARNs fueron miembros catalíticamente activos, ribozimas enzimáticamente activas. El espacio de secuencia para ARNs de 220-mers es de aproximadamente 3 × 10 132 (Eigen, 1971; Wilson y Szostak, 1999; Brackett y Dieckmann, 2006). Las ribozimas seleccionadas fueron capaces de replicar, separar, unir y formar enlaces péptidos. Pueden polimerizar químicamente la progenie, permitir que ocurran mutaciones y pueden evolucionar. Una molécula sirve como catalizador, la otra como sustrato. La replicación de ribozimas se demostró en el tubo de ensayo (Lincoln y Joyce, 2009). Ribozimas pueden formar enlaces péptidos entre aminoácidos (Zhang y Cech, 1997). Así, los pequeños péptidos estaban disponibles por actividad ribozima. En consecuencia, se ha propuesto una modificación del ARN como ácido péptido nucleico (PNA), con enlaces péptidos más estables en lugar de enlaces fosfodiéster (Zhang y Cech, 1997; Joyce, 2002). La replicación de moléculas de ARN se puede realizar químicamente a partir de ARN sin enzimas de polimerasa. Además, las deoxiribozimas pueden formarse a partir de ribonucleótidos (Wilson y Szostak, 1999). Así, el ADN puede surgir de ARN químicamente, sin la enzima proteica clave, la transcriptasa inversa. Todo un mundo vivo es posible a partir de ARN no codificante (ncRNA) antes de la evolución del código genético y enzimas proteicas. Ribozymes naturalmente consisten en ARN circulares de una sola cadena (Orgel, 2004). Carecen En lugar de ello, exhiben información estructural por los loops de horquilla que forman enlaces de hidrógeno entre hilos dobles incompletos, y lazos libres para interactuar con otras moléculas. Representan una cuasiespecie en la que muchas especies de ARN pueden formar, tales como ribozimas, moléculas similares a tRNA, y otros ncRNAs. Los ARNs dentro de tal grupo pueden unir aminoácidos. Noventa aminoácidos diferentes se han identificado en el meteorito Murchison encontrado en Australia, mientras que en la Tierra sólo alrededor de 20 de ellos se utilizan para la síntesis de proteínas (Meierhenrich, 2008). Donde la formación de ribozimas ocurrió en la Tierra primitiva es una cuestión de especulación. Los respiraderos hidrotermales como los fumadores negros en el océano profundo son posibilidades donde la vida puede haber comenzado (Martin et al., 2008). Allí, los gradientes de temperatura y Los poros o nichos ofrecen posibilidades de concentración de bloques de construcción, lo que es necesario para que ocurran reacciones químicas. Curiosamente, también el hielo es un candidato para la formación de ribozimas y reacciones químicas. Los cristales de hielo desplazan las biomoléculas en la fase líquida, lo que conduce a la concentración, creando una compartimentación cuasicelular donde se promueve la síntesis de novo de precursores de nucleótidos. Allí, puede surgir ARN y ribozimas, que son capaces de autorreplicarse (Attwater et al., 2010). Los complejos de ácido amino-tRNA pueden encontrar ARNs como "mRNAs". Tales interacciones podrían haber contribuido a la evolución del código genético. Esta secuencia de eventos puede conducir a precursores ribosoma primitivos. Las ribozimas son los elementos catalíticos esenciales en los ribosomas: "El ribosoma es un ribozima" (Cech, 2000), suplementado con cerca de un centenar de proteínas de andamio más tarde durante la evolución. Las proteínas tienen funciones estructurales y contribuyen indirectamente a la actividad enzimática. ¿Son estos ribozimas ribosomados fósiles de la Tierra primitiva? Los pequeños péptidos pueden ser formados por ribozimas antes de la evolución de los ribosomas, por lo que los aminoácidos simples o diméricos pueden originarse en el universo (Meierhenrich, 2008). Los pequeños péptidos con aminoácidos básicos pueden aumentar la actividad catalítica de las ribozimas como se muestra in vitro (Müller et al., 1994). Tales proteínas se conocen como proteínas de unión del ARN de virus del ARN que protegen el genoma del ARN, con motivos tales como RAPRKKG del nucleocápsido NCp7 del VIH (Schmalzbauer et al., 1996). Péptidos pueden mejorar la actividad catalítica de ribozimas hasta un 100 veces (Müller et al., 1994). Tales péptidos de virus del ARN sirven como chaperonas que eliminan estructuras de ARN de orden superior, permitiendo una interacción más eficiente de moléculas de ARN y aumentando las tasas de transcripción de polimerasas del ARN (Müller et al., 1994). Ribonucleoproteínas también pueden haber sido funcionalmente importantes durante la evolución de ribosomas (Harish y Caetano-Anolles, 2012). Estas estructuras preribosomales son también La transcripción inversa puede ser realizada químicamente por ribozimas. Esta acción no requiere necesariamente una proteína polimerasa como la transcriptasa inversa. Del mismo modo, los deoxiribonucleótidos pueden surgir por la eliminación de un oxígeno sin la necesidad de una enzima proteica (una reductasa) como hoy, y permitir la polimerización del ADN (Wilson y Szostak, 1999; Joyce, 2002). Los mismos elementos de los precursores para ribosomas también son bloques de construcción de retrovirus, que pueden tener un origen evolutivo similar (Moeling, 2012 (Moeling,, 2013. tRNAs sirven como imprimadores para la transcriptasa inversa, y la secuencia de promotores de elementos transponibles se derivan de tRNAs (Lander et al., 2001). Los ribozimas se desarrollaron en intrones más complejos del grupo de autoescisión II con la inserción de genes que codifican una transcriptasa inversa y proteínas adicionales (Moelling y Broecker, 2015; Moelling et al., 2017) (Figura 1). Surgió como sorpresa que los genomas de casi todas las especies son ricos en ncDNA, transcriptos en ncRNAs, pero no codificando proteínas, como se evidencia, por ejemplo, por el proyecto "Enciclopedia de Elementos de ADN" (ENCODE). ncDNA equivale a más del 98% del genoma de ADN humano (Deveson et al., 2017). Los organismos más altos tienden a tener más información no codificante, lo que permite modos más complejos de regulación genética. Los ncRNAs son reguladores de las secuencias de codificación de proteínas. ncRNA puede variar desde cerca de cero en las bacterias más pequeñas como Pelagibacter ubique hasta alrededor del 98% en el genoma humano. Los virus de ARN como el retrovirus HIV albergan a los ncRNAs para la regulación génica como el elemento de respuesta transactivante (TAR), el sitio de unión para la proteína Tat para la expresión temprana del gen viral. Tat tiene un dominio altamente básico que comprende principalmente residuos de Lys y Arg, que se asemejan a otras proteínas de unión de ARN. ncRNA también sirve en genomas de ARN virales como sitios de entrada ribosomal, sitios de unión de imprimación o señales de empaquetado. La síntesis del ADN depende de la síntesis del ARN como evento inicial, con ARN como iniciadores para la replicación del ADN, dentro de células como FIGURE 1 Un compartimento se muestra con componentes ARN no codificante (ncRNA), ribozimas o viroides, pueden realizar muchos pasos para la vida sin genes codificantes de proteínas, pero sólo por información estructural. Los aminoácidos individuales están indicados como puntos negros y pueden estar disponibles en la Tierra desde el universo. El ADN puede haber existido antes de retrovirus. El compartimento puede ser interpretado como previrus o precélulas. Viroide, verde; ARN, rojo; ADN, negro. así como durante la replicación retroviral, demostrando un requisito de ARN (Flint, 2015). El número de genes codificantes de proteínas de mamíferos es de alrededor de 20.000. Sorprendentemente, esto es sólo una quinta parte del número de genes de trigo pan (Appels et al., 2018). Tulips, maíz y otras plantas también tienen genomas más grandes, lo que indica que el número de genes no refleja necesariamente la ¿Podrían los genomas gigantes ser el resultado de la cría de plantas por agricultores o jardineros? De acuerdo con Szostak hay moléculas que aparecen como reliquias del mundo del ARN como el acetil-CoA o la vitamina B12, ambos están ligados a un ribonucleótido sin ninguna razón obvia - ¿se "olvidaron" para ser removidos? (Roberts y Szostak, 1997; Szostak et al., 2001; Szostak, 2011). Tal vez el ARN conectado sirve como estabilizador estructural. Las vesículas lipídicas podrían haber formado los primeros compartimentos y ribozimas cerrados, tRNAs con aminoácidos seleccionados, y ARN que se convirtieron en mRN. ¿Es esto un pre-células o pre-virus (Figura 1)? Patel et al. (2015) demostró que los bloques de construcción de la vida, ribonucleótidos, lípidos y aminoácidos, se pueden formar a partir de C, H, O, P, N, S en una síntesis de "una olla". Este estudio se puede considerar como un estudio de seguimiento de la síntesis clásica Urey-Miller in vitro de biomoléculas (Miller, 1953; Miller y Urey, 1959). La transición del ARN al mundo ADN fue promovida por la formación de la transcriptasa inversa. La enzima fue descrita por primera vez en retrovirus pero es casi ubicua y se encuentra en numerosas especies celulares, muchas de las cuales con funciones desconocidas (Simon y Zimmerly, 2008; Lescot et al., 2016). Es un vínculo importante entre el ARN y los mundos del ADN. El nombre de transcriptasa inversa es histórico e irritante porque es la transcriptasa "real" durante la transición del ARN al mundo del ADN. Del mismo modo, la ribonucleasa H (RNase H) es una enzima esencial de retrovirus (Mölling et al., 1971). La RNASA H resultó ser una de las cinco proteínas más frecuentes y antiguas (Ma et al., 2008 ) que pertenece a una superfamilia de más de sesenta representantes únicos diferentes y 152 familias con numerosas funciones (Majorek et al., 2014). Algunos de los muchos tRNAs pueden llegar a ser cargados con aminoácidos. Hay virus que contienen estructuras similares a tRNA (TLS), que se asemejan a estos primeros ARNs (Dreher, 2009). Los virus TLS incluyen virus de plantas, como el virus del mosaico amarillo de Turnip, en el virus del grupo de maní, el virus del mosaico de tabaco (TMV), y el virus del mosaico de Brome. Sólo la mitad del ARNt se encuentra en los Narnavirus de hongos. Los aminoácidos conocidos por ser componentes de virus similares al ARNt son valina, histidina y tirosina. Las estructuras también fueron designadas como "mimícritas", mejorando la traducción (Dreher, 2009 (Dreher,, 2010 ). Parecen elementos precursores "congelados" para la síntesis de proteínas. Esta combinación de un tRNA parcial vinculado a un aminoácido puede interpretarse como un paso evolutivo hacia la síntesis de proteínas, atrapado en un elemento viral. Los viroides carecen de capas proteicas y por lo tanto inicialmente no fueron designados como virus sino como virus cuando fueron descubiertos en 1971 por Theodor Diener. Él describió a los viroides como "fósiles vivos" (Diener, 2016) (Figura 2). De las patatas infectadas, Diener aisló el tubérculo del huso de la patata (PSTVd) cuyo genoma era aproximadamente 100 veces más pequeño que los de los virus conocidos en ese momento. Los viroides conocidos hoy en día van desde 246 hasta 467 nucleótidos. Contienen ARN circular de una sola cadena, son libres de proteínas y autorreplicantes sin información genética, pero sólo estructurales FIGURA 2 Los viroides son estructuras de horquilla y se muestran esquemáticamente y como micrografía electrónica. Viroides son, como ribozimas, sin información genética y juegan papeles biológicos importantes hoy en día en enfermedades de las plantas, en flores de claveles, en cáncer de hígado, como catalizador de la síntesis de proteínas en ribosomas y como ARNs regulatorios circulares, como "esponjas" para otros ARNs regulatorios. información en forma de horquillas de pelo (Riesner et al., 1979). Pueden generar copias de sí mismos en el entorno apropiado. Fueron designados como las "fronteras de la vida" (Flores et al., 2014). El conocimiento de la composición del virus se basó en TMV y su cristalización por Wendell Stanley en 1935 (Pennazio y Roggero, 2000). El genoma de TMV es ARN singlestranded codificante de proteínas de alrededor de 6.400 nucleótidos que está encerrado por una capa prote Los viroides, por el contrario, no codifican proteínas y carecen de capas, pero están estrechamente relacionados con los virus. Los viroides pueden perder su autonomía y dependen de las polimerasas del ARN huésped para replicarse, son capaces de infectar las plantas y muchos son patógenos económicamente importantes. Hay dos familias, el núcleo-replicante Pospiviroidae como PSTVd y el cloroplasto-replicante Avsunviroidae como el Viroide Sundblotch Aguado (ASBVd). Su replicación requiere enzimas del huésped. Por lo tanto, la autonomía es reemplazada por la dependencia de las enzimas del huésped y un estilo de vida intracelular. La mayoría de los viroides son a menudo ribozimáticamente activos -sin embargo son ejemplos de que este rasgo puede perderse como resultado de las condiciones ambientales cambiantes. Sólo las variantes nucleares, las Pospiviroidae, pueden perder su actividad ribozimática y utilizar la enzima RNASA III celular para su replicación. En contraste, las Avsunviroidae siguen siendo ribozimas de cabeza de martillo activas. Así, dentro del núcleo de una célula huésped, la función RNA enzimática puede volverse innecesaria. No genes, sino una función, la actividad catalítica, se pierde. Viroides aparentemente no ganar genes, pero cooperó para un estilo de vida más complejo. Por ejemplo, Carnation pequeño ARN tipo viroides (ARN CarSV) coopera con un retrovirus y está acompañado por un ADN homólogo generado por una transcriptasa inversa. Esta enzima presumiblemente se origina de un pararetrovirus de las plantas. Pararetrovirus empaqueta partículas del virus en una etapa diferente durante la replicación que retrovirus, el ADN, no el ARN Esta combinación única entre dos elementos virales sólo se ha detectado hasta ahora con CarSV en flores de claveles (Flores et al., 2005) (Flores et al.,, 2014. ¿Por qué tal cooperación evolucionó -tal vez por los jardineros reproductores? El ARN es sensible a la degradación; por lo tanto, el aumento genético y el crecimiento del genoma puede no ser favorable energéticamente -al menos no en las plantas. Ganancia de la función es, en este caso, la cooperación. El ARN circular (ARN circular) está relacionado con ribozimas/viroides como un regulador principal de otros ARN regulatorios, un ARN "esponja" que absorbe pequeños ARNes. Micro ARNs (miRNs) son reguladores post-transcripcionales que se ven afectados por la presencia de ARN circulares. se detectaron ARNs en cerebros humanos y Pueden unir 70 miRNA conservadas en una célula y su cantidad es de hasta 25.000 moléculas (Hansen et al., 2013). Su estructura recuerda a ribozimas catalíticamente activas. Hay un viroides excepcionales que obtuvieron información codificante y entraron en el hígado humano (Taylor, 2009). El viroides se conoce como virus delta de la hepatitis (HDV). Tiene el genoma más pequeño de cualquier virus animal conocido de cerca de 1.680 nucleótidos. Tiene propiedades típicas de los viroides, ya que contiene ARN circular, forma saltos de horquilla similares y réplicas en el núcleo utilizando enzimas huésped. Dos polimerasas tienen que redirigir su especificidad del ADN al ARN para generar el genoma y el antígeno del HDV. Ambos tienen actividad ribozima. En contraste con otras ribozimas, el HDV codifica una proteína, el antígeno delta de la hepatitis (HDVAg) que se presenta en dos formas, el pequeño HDVAg (24 kDa) que soporta la replicación y el gran HDVAg (27 kDa) que ayuda al ensamblaje del virión. El gen fue presuntamente recogido de la célula huésped por la recombinación del ARNm del HDV intermedio con un ARNm del huésped. La transmisión depende de un virus ayudante, el virus de la Hepatitis B (VHB), que entrega la capa (Taylor, 2009 ) ¿El empaquetado por un virus ayudante protege el genoma y por lo tanto permite que exista un viroides más grande? En las plantas, los viroides pueden no ser capaces de hacerse más grandes posiblemente debido a su sensibilidad a la degradación - pero tampoco pueden ser mucho más pequeños. Sólo se conoce un único viroides que está compuesto completamente de ARN codificante de proteínas con trillizos (AbouHaidar et al., 2014). Los viroides y los ARN replicantes relacionados son unidades replicantes propensas a errores y la frecuencia de error les impone un cierto tamaño mínimo, ya que de otro modo se extinguirían. Este mecanismo ha sido descrito como "catástrofe de error", lo que impide la supervivencia (Eigen, 1971 (Eigen,, 2013 ). Los viroides y ARN relacionados son los más pequeños réplicas conocidas. Los más pequeños se extinguirían en ausencia de sistemas de reparación. En resumen, el ARN puede catalizar muchas reacciones. Las enzimas proteicas que pueden haber evolucionado más tarde tienen mayores actividades catalíticas. Los ribozimas son portadores de información, pero no requieren genes de codificación. La información se almacena en su secuencia y estructura. Así, la replicación de un ARN inicial es seguida por el flujo de información, del ADN al ARN a la proteína, como se describe el Dogma Central (Crick, 1968). Incluso un flujo de información de la proteína al ADN ha sido descrito para algunas proteínas arqueales (Béguin et al., 2015). El mundo de proteínas de ADN contiene numerosos NCRNAs con funciones clave. ncRNA puede servir como un compuesto modelo para el origen de la vida en otros planetas. Por lo tanto, no la composición química de esta molécula es de importancia primordial, pero su simplicidad y multifuncionalidad. Además, el ARN es software y hardware en una sola molécula, que lo hace único en nuestro mundo. Hay otros escenarios además del aquí discutido "virus-first, " tales como "proteína-first", "metabolismo-fist" o el "mundo lípido" (Segré et al., 2001; Andras and Andras, 2005; Vasas et al., 2010; Moelling, 2012). Algunos de estos conceptos alternativos se construyeron sobre la filogenómica, la reconstrucción del árbol de la vida por secuenciación del genoma (Delsuc et al., 2005). Sorprendentemente, fue Sir Francis Crick, uno de los descubridores de la doble hélice del ADN, que declaró que no se sorprendería de un mundo completamente construido de ARN. Una predicción similar fue hecha por Walter Gilbert (Crick, 1968; Gilbert, 1986). ¡Qué visión! Nuestro mundo fue casi 50 años más tarde definido como "proteína ARN" mundo (Altman, 2013). Se puede especular que nuestro mundo fue construido de ribozimas o viroides, lo que significa "virus primero". Los ncRNAs aparecen como reliquias del mundo ARN pasado, antes de que el ADN, el código genético y las proteínas evolucionaran. Sin embargo, el ncRNA es esencial en nuestro mundo de ADN biológico hoy en día. Es posible producir tal ncRNA hoy en el tubo de prueba por pérdida de información génica de ARN codificante de proteínas. Esta reducción al ncRNA se demostró in vitro con ARN fago. El ARN genómico Qβ, 4.217 nucleótidos de longitud, fue incubado en presencia de replicasa Qβ, nucleótidos y sales libres, un medio rico en el tubo de prueba. El ARN se permitió replicar por medio de la réplica Qβ. La transferencia serial de alícuotas a medio fresco llevó a tasas de replicación cada vez más rápidas y a la reducción del tamaño genómico, hasta 218 nucleótidos de ncRNA en 74 generaciones. Este estudio demostró que, dependiendo de las condiciones ambientales, se puede producir una reducción génica extrema. Este experimento realizado en 1965 fue designado como "Monstruo de Spiegelman". El ARN de codificación se convirtió en replicación de ncRNA (Spiegelman et al., 1965; Kacian et al., 1972)! Manfred Eigen amplió este experimento y demostró además que una mezcla que no contiene ARN para empezar con pero sólo ribonucleótidos y la réplica Qβ puede bajo las condiciones correctas en un tubo de prueba generar espontáneamente ncRNA auto-replicante. Esto evolucionó en una forma similar al Monstruo de Spiegelman Además, un cambio en la concentración enzimática y la adición de ARN cortos o un intercalador de ARN influyeron en la población de ARN emergente (Sumper y Luce, 1975; Eigen, 2013). Así, la complejidad de los genomas depende del medio ambiente: las malas condiciones conducen a una mayor complejidad y a entornos ricos a una menor complejidad. El proceso demostrado en este experimento con componentes virales indica que la reversión a la simplicidad, la reducción de tamaño, la pérdida de información genética y la velocidad de replicación pueden ser las principales fuerzas de la vida, aunque esto parezca ser como una reversión de la evolución. El experimento puede tal vez ser generalizado desde el tubo de ensayo a un principio, que los sobrevivientes más exitosos en nuestro planeta son los virus y microorganismos, que se convirtieron en las entidades más abundantes. Tal vez la vida pueda comenzar de nuevo. Estos estudios plantean la cuestión de cómo las moléculas de ARN pueden llegar a ser Esto puede ser superado por el flujo de calor a través de un poro abierto en rocas sumergidas, que concentra la replicación de oligonucleótidos de un flujo de alimentación constante y la selección de hebras más largas. Esto se ha descrito para un aumento de 100 a 1.000 nucleótidos in vitro. Moléculas de ARN menores de 75 nucleótidos morirán (Kreysing et al., 2015). ¿Podría un medio ambiente pobre conducir a un aumento de complejidad? Esto podría ser probado. Ribozimas se demostró que crecen en tamaño por absorción de genes, como se demostró para HDV (Taylor, 2009 ). Un ejemplo inesperado interesante reciente que apoya la noción de que las condiciones ambientales influyen en la complejidad genética, es el microbioma intestinal humano. Su complejidad aumenta con diversos alimentos, mientras que alimentos ricos uniformes reducen su diversidad y pueden conducir a enfermedades como la obesidad. Unas pocas docenas de especies bacterianas y virales/fagos se conservan entre individuos (secuencias básicas) como una composición estable (Broecker et al., 2016c. La disbiosis se ha observado en varias enfermedades crónicas y en la obesidad, una pérdida de riqueza y diversidad bacterianas. La nutrición en condiciones afluentes con alimentos ricos en azúcar contribuye a la obesidad, lo que resulta en una reducción significativa de la complejidad del microbioma. Esta reducción es difícil de revertir (Cotillard et al., 2013; Le Chatelier et al., 2013). El microbioma intestinal en pacientes humanos con obesidad recuerda a la reducción genética descrita en el experimento del Monstruo de Spiegelman: reducción de genes en un entorno rico. La reducción de la complejidad del microbioma se atribuye en parte a la acción de los fagos, que bajo tales condiciones, definidas como estrés, lisian las El trasplante de microbiota fecal puede ser reemplazado incluso por fracciones solubles que contienen fagos o metabolitos del donante sin bacterias (Ott et al., 2017). Analógicamente, los microbiomas más complejos se encuentran en las tribus humanas indígenas de África, que viven en una amplia variedad de nutrientes diferentes. Es un proceso lento, sin embargo, para aumentar la complejidad de la microbiota intestinal por nutrición diversa. La microbiota asociada a la obesidad que sobrevive son más aptas y difíciles de contrarrestar. Urbanización y occidentalización de la dieta se asocia con una pérdida de biodiversidad microbiana, pérdida de organismos microbianos y genes (Segata, 2015). Para entender el mecanismo y la fuerza motriz para la reducción del genoma, las tasas de eliminación se probaron mediante la inserción de un gen indicador en el genoma de Salmonella entérica. La pérdida del gen indicador fue monitoreada por el paso en serie Las deleciones resultaron en genomas más pequeños con reducción o ausencia de genes de reparación de ADN (Koskiniemi et al., 2012). La pérdida de genes confirió una mayor aptitud a las bacterias bajo estas condiciones experimentales. Los mimivirus recientemente descubiertos y otros virus gigantes son dignos de considerar para entender la evolución de la vida con respecto a la contribución de los virus. Sus anfitriones son, por ejemplo, Acanthamoeba, Clorella, y Coccolithus algas (Emiliania huxleyi), pero también corales o esponjas como se discutió más recientemente. Los mimivirus fueron descubiertos por primera vez en torres de agua de refrigeración en Bradford, Reino Unido en 2003 con cerca de 1.000 genes, la mayoría de los cuales no relacionados con genes conocidos anteriormente. Los mimivirus han recibido atención porque contienen elementos que se consideraban distintivos de células vivas, no de virus, Los mimivirus albergan estos bloques de construcción como conjuntos incompletos que no son suficientes para la síntesis de proteínas independientes como las bacterias o las arcaeas pueden realizar, evitando que lleven una vida autónoma (La Scola et al., 2003 Scola et al.,, 2008. Son más grandes que algunas bacterias. Los virus gigantes pueden ser vistos como en un camino evolutivo hacia un organismo celular. Alternativamente, pueden haber evolucionado de un organismo celular por pérdida de información genética (Nasir y Caetano-Anolles, 2015). Los virus gigantes han tomado con frecuencia genes de sus anfitriones por transferencia horizontal de genes (HGT) (La Scola et al., 2008; Nasir y Caetano-Anolles, 2015; Colson et al., 2018). Un gráfico sobre los tamaños del genoma muestra que los mimivirus y las bacterias se superponen en tamaño, lo que indica una transición continua entre virus y bacterias y entre mundos vivos y no vivos (basado en Holmes, 2011) (Figura 3). Otros virus gigantes, como los megavirus, fueron descubiertos en el océano de Chile con 1.120 genes. Más recientemente, el Klosneuvirus fue identificado en las aguas residuales del monasterio Klosterneuburg en Austria en 2017 con 1.57 millones de pares de bases (Mitch, 2017). Pithovirus sibericum es el más grande entre los virus gigantes descubiertos hasta la fecha con un diámetro de 1,5 micras, un genoma de 470.000 pb con 467 genes putativos, 1,6 micras de longitud, y es presumiblemente de 30.000 años ya que fue recuperado de permafrost en Siberia (Legendre et al., 2014 Los virus Pandora más pequeños con 1 micron de longitud tienen genomas cinco veces más grandes, 2.500.000 pb (Philippe et al., 2013) (Figura 3). Los virus gigantes incluso pueden ser hospedadores de virus más pequeños, los virófagos, que recuerdan a los bacteriófagos, los virus de las bacterias. Estos virófagos como Sputnik son sólo 50 nm de tamaño con 18.343 pb de ADN circular y 21 genes de codificación proteica predichos. Se replican en fábricas virales y consumen los recursos del mimivirus, destruyéndolo así. Algunos, los virófagos incluso pueden integrarse en el genoma del huésped celular y se pueden reactivar cuando el huésped está infectado por virus gigantes. Así, virus gigantes sugieren que los virus están cerca de entidades vivas o pueden haber estado vivos (La Scola et al., 2008; En biología es común distinguir entre materia viva y muerta por la capacidad de sintetizar proteínas y replicar autónomamente. Los virus gigantes pueden ser considerados como un eslabón faltante entre los dos, porque albergan "casi" el aparato de síntesis de proteínas. La transición de vivir al mundo no vivo es continua, no separada por una línea fronteriza aguda (Figura 3). Los virus no son considerados vivos por la mayoría de la comunidad científica y como se escribe en los libros de texto, porque no pueden replicarse autónomamente. Sin embargo, algunos de los virus gigantes están equipados con casi todos los componentes de la maquinaria de síntesis de proteínas cerca de bacterias que sugieren que pertenecen a la materia viva (Schulz et al., 2017). Las ribozimas pueden haber sido la entidad replicante más temprana. Tal vez también otros virus fueron inicialmente más independientes de la Tierra primitiva que hoy en día. Como se describe en la Figura 1 puede haber sido inicialmente Sólo más tarde los virus pueden haber renunciado a su replicación autónoma y convertirse en parásitos, como se ha descrito para algunas bacterias (véase más adelante). Se han hecho esfuerzos para identificar la célula viva más pequeña que todavía se replica de forma autónoma. Entre las bacterias que presumiblemente se encuentran Pelagibacter ubique del clado SAR11 de bacterias (Giovannoni, 2017), que se descubrió en 1990. Es un alfa-proteobacterio con 1.389 genes presentes ubicuamente en todos los océanos. Puede alcanzar hasta 10 28 células vivas libres en total y representa aproximadamente el 25% de las células de plancton microbiano. Muy poco de su ADN es no codificante. Alberga fagos de tipo podofago, designados como "pelagiphage" (Zhao et al., 2013). Este pequeño bacteria fue designado como el organismo más común en el planeta. ¿ Esta bacteria autónoma es más pequeña que algunos virus gigantes parasitarios. Craig Venter, que primero logró secuenciar el genoma humano, trató de minimizar el genoma más pequeño putativo de una especie viva, de Mycoplasma mycoides, una bacteria parasitaria que vive en rumiantes (Gibson et al., 2008 (Gibson et al.,, 2010. Su grupo sintetizó un genoma de 531.000 bp con 473 genes, 149 de ellos (32%) con funciones desconocidas (Hutchison et al., 2016). Entre los organismos parasitarios vivos más pequeños está Nanoarchaeum equitans. Es un arqueón termofílico que vive a 80 • C y a pH 6 con 2% de sal (Huber et al., 2003). Su genoma tiene un tamaño de 490.000 bp y codifica 540 genes. N. equitans es un simbionte obligatorio de un arqueón más grande, Ignicoccus montando en él como en un caballo, de ahí el nombre (Huber et al., 2003). El mundo de los virus cubre una gama de tres troncos en tamaño de sus genomas: desde genes cero a cerca de 2.500 genes que ascienden a cerca de 2.500.000 bp de ADN. Los viroides de origen cero tienen unas 300 bases de longitud (Figura 3). La virosfera es el reservorio más exitoso de entidades biológicas en nuestro planeta en términos de número de partículas, velocidad de replicación, tasas de crecimiento y espacio secuencial. Hay alrededor de 10 33 virus en nuestro planeta y están presentes en cada especie existente (Suttle, 2005). No hay especies vivas sin virus! Los virus también ocurren libremente en los océanos, en el suelo, en nubes hasta la estratosfera y más Poblan el intestino humano, el canal de nacimiento y el exterior del cuerpo como capa protectora contra las poblaciones microbianas. Los microbios contienen fagos que se activan durante condiciones de estrés tales como la falta de nutrientes, el cambio de temperatura, la falta de espacio y otros cambios de las condiciones ambientales. Uno de los papeles más agitadores de la tierra de este siglo fue la publicación de la secuencia del genoma humano (Lander et al., 2001). Alrededor de la mitad, posiblemente incluso dos tercios de la secuencia se componen de retrovirus endógenos más o menos completos (ERVs) y retroelementos relacionados (REs) (de Koning et al., 2011). Las RE amplifican a través de mecanismos de copia y pasta que implican un paso de transcriptasa inversa de un ARN intermedio en ADN. Además, los elementos transponibles del ADN (TEs) se mueven por un mecanismo de corte y El origen de las REs está siendo discutido como restos de infecciones germinales retrovirales antiguas que se fijaron evolutivamente en el genoma. Alrededor de 450.000 elementos ERV humanos (HERV) constituyen alrededor del 8% del genoma humano consistente en elementos retrovirales distintivos como la mordaza, pol, genes env y repeticiones terminales largas flanqueantes (LTR) que actúan como promotores (Lander et al., 2001). Howard Temin, uno de los descubridores de la transcriptasa inversa, en 1985 ya describió elementos similares a retrovirus endógenos, que estimó en cerca del 10% de la secuencia del genoma humano y del ratón (Temin, 1985). El número real es alrededor del 45% como se estima hoy (Lander et al., 2001). En algunos genes como el gen Protein Kinase Inhibitor B (PKIB) determinamos alrededor del 70% de secuencias ¿Hay un límite? ¿Podría haber sido 100%? Se estima que los retrovirus han entrado en el linaje del genoma mamífero hace 550 millones de años (MYA) (Hayward, 2017). Las secuencias ERV más antiguas pueden existir pero hoy son irreconocibles debido a la acumulación de mutaciones. Los ERV sufren mutaciones, deleciones o eventos de recombinación homóloga con grandes deleciones y pueden llegar a ser tan cortos como los elementos LTR solos, que son unos pocos cientos de pb en longitud - los sobrantes de genomas retrovirales de larga duración de alrededor de 10.000 pb. Los promotores LTR pueden desregular genes vecinos. Los eventos de recombinación homóloga pueden ser considerados como eventos de pérdida de genes o reducción de genes. Es la suposición de que los ERV, que ya no eran necesarios para la defensa celular del huésped, ya no fueron Eugene Koonin señala que la infección y la integración son eventos únicos que se producen a un ritmo rápido, mientras que la pérdida y la reducción de genes pueden tardar mucho más tiempo (Wolf y Koonin, 2013). Una reducción frecuente de genes de genomas eucariotas es la pérdida de la proteína de envoltura viral codificada por el gen env. Sin un abrigo, los retrovirus ya no pueden dejar la célula e infectar otras células. Pierden la movilidad y se convierten en elementos intracelulares obligatorios. Los virus ayudantes pueden suministrar proteínas de envoltura en trans y movilizar los virus. Las TEs o REs se pueden considerar como ejemplos de reliquias de virus intracelulares sin capa -o podría haber sido al revés, tal vez precursores de retrovirus de larga duración? Estos elementos pueden amplificarse intracelularmente y modificar los genomas del huésped mediante la integración con el peligro potencial de alteración genética y cambios genéticos. Las REs pueden llevar a la duplicación de genes y al desarrollo de pseudogenes, con una copia para la conservación estable de las funciones adquiridas y la otra para las innovaciones (Cotton y Page, 2005). Tales duplicaciones constituyen grandes cantidades de genomas de mamíferos (Zhang, 2003). Los retrovirus tienen una duplicación de moiety RNASa H, una de las cuales sirve como enlace catalíticamente inactivo entre la RT polimerasa y la enzimáticamente activa RNASa H (Xiong y Eickbush, 1990; Malik y Eickbush, 2001; Moelling y Broecker, 2015; Moelling et al., 2017). Esta duplicación de genes se remonta a 500 millones de años (Cotton y Page, 2005). Las duplicaciones de genes son una causa común de cáncer, que a menudo se produce sólo en el genoma de la célula cancerosa en sí, Myc, Myb, ErbB2, Ras y Raf son oncogenes amplificados en diversos tipos de cánceres humanos (Vogelstein y Kinzler, 2002). La capacidad de los retrovirus para integrarse los hace distintos de los endosimbiontes que permanecen separados. Sin embargo, el resultado neto es muy similar, la adquisición de nueva información genética, que se transmite a la siguiente generación, si la línea germinal está infectada y se produjo la endogenización del virus. La integración viral no se limita a las células eucariotas, sino también un mecanismo en procariotes para el mantenimiento del estado lisogénico de los fagos dentro de las bacterias. Además, para otros virus eucariotas como el VHB, el antígeno de superficie envolvente BHsAg se puede eliminar, lo que conduce a un estilo de vida intracelular obligatorio para el virus, que especialmente en presencia de VHC promueve el cáncer (Yang et al., 2016). Se ha demostrado que el VIH pierde rápidamente uno de sus genes auxiliares, nef, originalmente por factor negativo. El gen se perdió dentro de un número bastante bajo de pasajes del virus crecido bajo condiciones de cultivo tisular por selección de células productoras de títulos de alto virus. La eliminación de nef resultó en un aumento significativo del título del virus en cultivo -de ahí el nombre. El producto del gen nef no era de necesidad dentro de las células de cultivo tisular, sino que era inhibitorio para la replicación. Sin embargo, es esencial para la patogenicidad en animales, y posteriormente nef fue reinterpretado como " Además, los hospederos humanos del VIH pueden perder una porción terminal significativa de un receptor de siete transmembranas en linfocitos, la célula diana primaria para la entrada del VIH y para la captación del virus. Esta molécula, el receptor de citocinas CCR5 es truncado por 32 aminoácidos carboxiterminales (CCR5-32), desactivando funcionalmente el receptor. La frecuencia de alelos del mutante CCR5-32 mutante es de alrededor del 10% en la población europea, haciendo que estas personas resistentes a las infecciones por VIH (Solloch et al., 2017). Esta pérdida genética en europeos ha demostrado hacer que los individuos resistentes no sólo contra la infección por VIH sino también contra la malaria. Esto puede haber sido la presión selectiva en el pasado antes de que el VIH/SIDA surgiera. No se ha descrito ningún efecto secundario para los seres humanos que carecen de este gen (Galva Los virus han demostrado ser motores de la evolución (Villarreal y Witzany, 2010), incluyendo el genoma humano, que por lo menos un 45% está compuesto de secuencias relacionadas con retrovirus. Además, los retrovirus endogenizados suministraron los genes de sincitina que son esenciales para el desarrollo de la placenta mamífera, y permitieron el crecimiento de embriones sin su rechazo por el sistema inmune materno (Dupressoir et al., 2012). Así, la misma propiedad que causa inmunodeficiencia en pacientes infectados por VIH y conduce al SIDA causa la formación de sincitia, fusión celular después de la infección por un retrovirus. También se ha propuesto que los virus estén en el origen de la evolución de la inmunidad adaptativa (Villarreal, 2009 ). Así, los genomas conformados por virus mediante el suministro de genes y mecanismos esenciales. La endogenización de retrovirus se ha producido en los genomas Si los ERVs integrados no ofrecían ninguna ventaja selectiva, se deterioraban y acumulaban mutaciones con pérdida de función, lo que se demostró directamente mediante la reconstrucción de un retrovirus infeccioso a partir de la secuencia de consenso de 9 secuencias de virus endógenos defectuosos, designados como Phoenix. El virus se expresaba a partir de un clon sintético de ADN construido en cultivo celular y partículas de virus formados identificadas por análisis microscópicos de alta resolución (Dewannieux y Heidmann, 2013). Los koalas en Australia están siendo endogenizados de un retrovirus (koala retrovirus, KoRV) en "tiempo real" y demuestran posibles consecuencias para la inmunidad. A principios de 1900, algunos individuos fueron trasladados a islas, incluida la isla Kangarooo, cerca del continente australiano para fines de repoblación, ya que los koalas estaban amenazados de extinción. Sin embargo, los koalas aislados en la isla de Kangaroo son KoRV negativos, lo que permite datar la introducción de KoRV en la población de koalas hace unos cien años. Muchos de los koalas infectados cayeron enfermos y murieron, sin embargo algunas poblaciones se volvieron resistentes dentro de unos 100 años, correspondientes a unas 10 generaciones. Los koalas probablemente desarrollaron resistencia debido a los provirus de ADN integrados. El retrovirus se transmite como exógeno así como virus endógeno, similar al retrovirus de ovejas Jaagsiekte (JSRV), por lo que los virus endogenizados protegen con un producto génico viral, como Env, contra infecciones de novo por "exclusión de la superinfección" (Tarlinton, 2012). La contribución de los retrovirus a la defensa antiviral es sorprendente, ya que todos los genes retrovirales tienen genes análogos en el mecanismo de defensa de las células eucarióticas siRNA/RNAi (Moelling et al., 2006). Los retrovirus pueden proteger contra la infección por otros virus relacionados, por ejemplo, al expresar proteínas Env que bloquean los receptores de la superficie celular (Villarreal, 2011). Un mecanismo comparable protege a las células bacterianas contra los fagos de ADN, mediante fragmentos de ADN de fagos integrados que se transcriben en ARNm e hibridan a los nuevos fagos de ADN entrantes y por lo tanto conducen a su destrucción por nucleasasases híbridos específicos, inmunidad CRISPR/Cas (Charpentier y Doudna, 2013). A menudo no se da cuenta de que la adquisición de inmunidad en bacterias y células La integración de retrovirus ocurre normalmente en las células somáticas después de la infección como un paso obligatorio durante el ciclo de vida viral. La infección de las células germinales puede conducir a la transmisión a la próxima generación y en última instancia dar lugar a resistencia hereditaria. Los retrovirus endogenizados probablemente causaron resistencia FIGURA 4 Los virus protegen contra los virus: los retrovirus protegen a una célula contra una nueva infección por un virus similar designado como "exclusión de la superinfección" o interferencia viral. Esto es mediado por productos genéticos virales como proteínas o ácidos nucleicos. Del mismo modo, los fagos protegen contra los fagos: la superinfección de bacterias es evitada por el ARN CRISPR/Cas originado por infecciones anteriores. Los mecanismos de defensa contra virus y fagos son análogos. La protección de virus o fagos contra superinfección representa defensa celular y inmunidad adquirida. Los cuatro ejemplos se discuten Del mismo modo, la resistencia al virus de la Inmunodeficiencia Simiana (SIV) en algunas especies de monos puede explicarse por la endogenización (Li et al., 2017) (Li et al., 2018. En el caso de los fagos y sus hospedadores procarióticos, el mecanismo se describe como CRISPR/Cas, que siguen principios análogos de "endogenización" del material genético entrante para su posterior exclusión. Se puede especular que el VIH también puede llegar a ser endogenizado en el genoma humano. Hay alguna evidencia de que el VIH puede infectar las células germinativas humanas y transmitirse al genoma embrionario (Wang et al., 2011). ¿Cuánto tiempo puede tardar esto no se conoce -10 generaciones? La pérdida de la función de los VRV puede ocurrir por mutaciones, supresiones de los env u otros genes y, en última instancia, El número de elementos retrovirus suma alrededor de 450.000, lo que corresponde al 8% del genoma humano (Lander et al., 2001; Cordaux y Batzer, 2009 ). Las regiones promotoras fueron analizadas por su contribución al cáncer activando genes vecinos -como consecuencia de una antigua infección por retrovirus. De hecho, los genes celulares activados por "promoción descendente" fueron identificados en estudios animales con activación del gen mic como uno de muchos ejemplos, llevando a un desarrollo crónico y no agudo del cáncer (Ott et al., 2013). Como mecanismo general para el cáncer humano hoy en día los LTRs no son identificados como un culpable mayor. La mayoría de los ERVs que encontramos hoy se han integrado durante la evolución en intrones u otras regiones donde su presencia es relativamente inofensiva. ¿Resultaron los otros en la muerte de los portadores que desaparecieron? Los efectos de los LTRs en los niveles de expresión de los genes huéspedes vecinos fueron estudiados con el virus humano endógeno, HERV-K, como posible causa de cáncer, pero esto no parece ser un fenómeno general (Broecker et al., 2016b). Como se demostró para los koalas, los ERVs pueden conferir inmunidad a las infecciones virales (Feschotte et al., 2012). Se demostró que un ERV relacionado, HERV-H, produce un ARN que mantiene las células embrionarias tempranas pluripotentes e incluso revierte las células adultas para recuperar la pluripotencia (Grow et al., 2015). Así, el papel de los ERVs puede ser más complejo de lo que conocemos actualmente. Elementos transponibles y REs que perdieron la capacidad de transmisión celular mediante la eliminación de la proteína del abrigo contribuyen principalmente a la complejidad genética de Están "bloqueados" dentro de las células y son los principales impulsores del aumento de la complejidad genética (Cordaux y Batzer, 2009 ). Se podría especular que estos elementos intracelulares son retrovirus replicantesincompetentes que carecen de abrigos (Lander et al., 2001). Los murciélagos transmiten virus como el Ébola y el coronavirus SARS sin sufrir de enfermedad (Beltz, 2018). Incluso virus ARN como Bornavirus han demostrado integrarse por transcripción inversa ilegítima, posiblemente también proporcionando inmunidad contra la superinfección (Katzourakis y Gifford, 2010). Hay dos eventos prominentes que contribuyeron significativamente al éxito de la vida y la formación de células. Ambos están asociados con la reducción de genes. Este fenómeno puede jugar un papel para la evolución de los virus de estilos de vida autónomos a parásitos. En la década de 1960 Lynn Margulis propuso un origen extracelular para las mitocondrias (Margulis, 1970,, 1993 ). Una célula ancestral, tal vez un arqueón, fue infectada por una bacteria anaerobia, que dio lugar a las mitocondrias. Del mismo modo, cianobacterias formaron los cloroplastos en las células vegetales modernas. Mitocondrias surgió hace alrededor de 1.450 millones de años (BYA) (Embley y Martin, 2006). Mitocondrias y cloroplastos son los ejemplos más llamativos para un cambio en el estilo de vida de bacterias autónomas a endosimbiontes. Esta transición a menudo se considera como extremadamente rara y un sello distintivo de la evolución de la vida en nuestro planeta. Sin embargo, hay muchos otros parásitos intracelulares obligados como Rickettsia, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii (el agente causal de la fiebre Q), Mycobacterium leprae, M. tuberculosis, y M. mycoides (Beare et al., 2006). El cambio de estilo de vida de los endosimbiontes en los dos casos de mitocondrias y cloroplastos es sorprendente. Ambos redujeron drásticamente su composición genética. Mitocondria contiene menos de 37 genes, que dejaron de ser los originales alrededor de 3.000 genes. Es endogenización de retrovirus, los ERV, que se integran en células germinales, relacionadas con la endosimbiosis? Son estos modelos endosimbionts para la transición de un estilo de vida autónomo a una vida parasitaria que puede haber tenido lugar con virus? Un ejemplo típico más reciente para una evolución reductiva son Rickettsia. Estas bacterias se supone por algún tiempo que son virus debido a su existencia parasitaria intracelular obligatoria. Rickettsia han evolucionado de bacterias que replican autónomamente. Evolución reductiva de endosimbiontes puede producir bacterias con genomas diminutos a expensas de la vida extracelular autónoma. Sus genomas son 1,11 millones de pbp en longitud con cerca de 834 genes codificantes de proteínas, y pérdida de 24% por la evolución reductiva (Ogata et al., 2001). Rickettsia puede tener alguna relación con cianobacterias, que se consideran como los principales simbiontes. ¿Se puede especular que los virus pueden haber sido entidades autónomas inicialmente? Viroides pueden haber sufrido la transición de la autonomía a parásitos, tal como se muestra para mitocondria, cloroplastos o Rickettsia? ¿Hasta qué punto los virus han sido autónomos e independientes de los metabolismos celulares originalmente -y contribuyeron al origen de las células? ¿Podrían haber perdido su autonomía más tarde y convertirse en parásitos? Los virus son minimalistas en su composición y deben haber sufrido reducciones genéticas estrictas (Flint, 2015). ¿Cuán pequeños pueden llegar a ser sus genomas? La mayoría de los virus ARN codificados todavía contienen elementos reguladores, ncRNA en las 3 y 5 regiones terminales para la entrada ribosomal, síntesis proteica, regulación transcripcional, y otros. Un subgrupo de retrovirus es un ejemplo interesante en cuanto a la pérdida simultánea y la ganancia de información genética. Los retrovirus oncogénicos o tumoresvirus pueden recombinarse con genes celulares que bajo los promotores de retrovirus pueden convertirse en oncogenes y conductores de cáncer. Alrededor de cien oncogenes han sido seleccionados en los laboratorios y estudiados durante La selección de las ventajas de crecimiento de las células huésped llevó al descubrimiento de los oncogenes que promueven el crecimiento más rápido que conocemos hoy en día, como Ras, Raf, ErbB o Myc, que son en parte objetivos exitosos para los medicamentos anticancerosos (Moelling et al., 1984). Estos oncogenes fueron en la mayoría de los casos tomados por los retrovirus a expensas de los genes estructurales (gag), replicando (pol) o envolvente (env), y a menudo se expresan como proteínas de fusión con Gag. Así, los retrovirus oncogénicos son virus defectuosos intracelulares obligatorios y fueron seleccionados para en el laboratorio por los investigadores para los oncogenes con la capacidad de crecimiento más potente promover. Necesitan el suministro de genes replicatorios en trans de virus ayudantes co-infectantes para infectar otras células (Flint, 2015) Algunas cepas del virus del sarcoma de Rous mantienen la replicación competente al transportar el src derivado de la célula (para el sarcoma) oncogén que codifica una proteína de 536 aminoácidos que aparentemente pueden encajar en la partícula retroviral junto con el genoma viral de tamaño completo (Broecker et al., 2016a). Razones espaciales pueden haber influido en la formación de retrovirus oncogénicos y limitado su tamaño y, por lo tanto, llevado a sus fenotipos defectuosos. Hay indicios de que la actividad incontrolada de (retro)transposones en las células germinativas puede resultar en enfermedades como la infertilidad masculina -presumiblemente por "catástrofe grave", causada por demasiados eventos de transposición. En los mamíferos, los piRNAs doman la actividad transpoon por medio de la actividad de la RNASa H de las proteínas PIWI durante la espermatogénesis (Girard et al., 2006). Sólo una minoría de virus son patógenos; la mayoría de ellos no causan enfermedades. Por el contrario, son más importantes como impulsores de la evolución, como transmisores de material genético, como agentes innovadores. En particular, los virus ARN son los más innovadores. Algunos de ellos son patógenos y peligrosos, como el VIH o el virus influenza, o los viroides en las plantas. Los virus ARN son capaces de cambiar tan rápidamente que el sistema inmunitario del huésped es incapaz de contrarrestar la infección. La patogenicidad surge cuando las condiciones ambientales cambian, por ejemplo, cuando un virus entra en un nuevo organismo o especie. El aumento de la complejidad celular por virus es una característica importante de la evolución. Tales cambios evolutivos importantes son tomados recientemente como argumentos en contra de la teoría evolutiva por Charles Darwin quien consideró cambios graduales, pequeños incrementos por mutaciones como la base principal para la selección y la evolución. Nueva crítica está abordando este pensamiento, considerando cambios más grandes como impulsores evolutivos. Tales cambios surgen por muchos fenómenos complejos tales como endosimbiosis, infección por procariotos, virus y hongos, recombinación de genes, HGT, infecciones, sexo. Cambios dramáticos tales como endosimbiosis o infecciones de patógenos extienden el concepto de Darwin de evolución. Hay numerosos ejemplos para la contribución de virus a la evolución de la vida desde por lo menos hasta 550 MYA (Hayward, 2017). Pero el ruido genético a través de mutaciones aleatorias no nos permite volver al origen de la vida. Por analogía, se puede especular que en algún momento los virus autónomos renunciaron a la independencia para una vida intracelular obligatoria -como se ha descrito para las mitocondrias y los cloroplastos, pero también las bacterias intracelulares como Rickettsia. Esta especulación se basa en el concepto de que la vida temprana debe haber comenzado simple y con alta variabilidad genética y luego se volvió más compleja. Pero la complejidad se puede renunciar a un estilo de vida menos consumidor de energía con genomas pequeños y alta velocidad de replicación (Moelling, 2012 (Moelling,, 2013 ). Por lo tanto, la pregunta puede repetirse: "¿Son los virus nuestros antepasados más antiguos?"Alguna vida fósil puede ser parcialmente reproducida in vitro por los experimentos de seguimiento de Spiegelman y Eigen, explicando el gran potencial de supervivencia del NCRNA simple. Los virus pueden ser patógenos, pero su reconocimiento como causa principal de enfermedades es Esta noción se basa en la historia de los virus en la medicina, como se explica en un libro titulado "Viruses: More Friends Than Foes" (Moelling, 2017). El escenario descrito aquí se centra en los virus como motores de la evolución. El mundo del ARN temprano se interesó hace 20-30 años, como lo demuestran las referencias anteriores. Sorprendentemente, hay científicos que todavía creen en la "hipótesis del pansperm" y piensan que los retrovirus son de origen extraterrestre (Steele et al., 2018). El interés reciente en el origen de la vida surgió de los exoplanetas recién descubiertos cuyo número aumenta diariamente -y que pueden ser tan numerosos como 10 25. Así, las estadísticas puras hacen que algunas personas crean que hay vida extraterrestre. La vida extraterrestre se imita en laboratorios en la Tierra con muchos supuestos -quizás esta El debate que aquí se presenta debe considerarse como un concepto de réplica simple y de entidades en evolución posiblemente derivadas de diferentes bloques de construcción en otros entornos, siendo la estructura más relevante que la secuencia.

¿Necesita la replicación de ARN enzimas polimerasas?

Virus y evolución – ¿Virus Primero? Una Perspectiva Personalhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6433886/SHA: f3b9fc0f8e0a431366196d3e835e1ec368b379d1Autores: Moelling, Karin; Broecker, FelixFecha: 2019-03-19DOI: 10.3389/fmicb.2019.00523Licencia: cc-byAbstract: El descubrimiento de exoplanetas dentro de zonas habitables putativas revolucionó la astrobiología en los últimos años. Estimuló el interés en la pregunta sobre el origen de la vida y su evolución. Aquí, discutimos cuáles podrían haber sido los roles de los virus al principio de la vida y durante la evolución. Los virus Están presentes en todas partes, en nuestros alrededores, los océanos, el suelo y en cada ser viviente. Los retrovirus contribuyeron a cerca de la mitad de nuestras secuencias genómicas y a la evolución de la placenta mamífera. Los virus contemporáneos reflejan la evolución que va desde el mundo del ARN hasta el mundo de las proteínas del ADN. ¿Hasta dónde podemos rastrear su contribución? Las entidades más tempranas que replican y evolucionan son las ribozimas o viroides que cumplen varios criterios de vida. El ARN puede realizar muchos aspectos de la vida e influencia nuestra expresión genética hasta hoy. Las estructuras más simples con información no codificante pueden representar modelos de vida construidos sobre información estructural, no genética. Los virus hoy son parásitos obligatorios dependiendo de las células huésped. Ejemplos de cómo un estilo de vida independiente podría haberse perdido son las mitocondrias, los cloroplastos, Rickettsia y otros, que solían ser bacterias autónomas y se convirtieron en parásitos o endosimbiontes intracelulares, perdiendo así la mayoría de sus genes. Incluso in vitro la pérdida de genes se puede recapitular todo el camino de la codificación a ARN no codificante. Además, los virus gigantes pueden indicar que no hay frontera aguda entre las entidades vivas y no vivas sino un continuo evolutivo. Aquí, se discute cómo los virus pueden perder y ganar genes, y que son motores esenciales de la evolución. Aparte de nuestra visión “virus primero”, hay otros como “proteínas primero” y “metabolismo primero”. Texto: Mycoplasma mycoides por eliminación sistemática de genes individuales resultó en un genoma sintético mínimo de 473 genes (Hutchison et al., 2016). ¿Puede uno considerar entidades vivientes más simples? Hay elementos con cero genes que cumplen muchos criterios para la vida temprana: ribozimas, ARN catalíticos estrechamente relacionados con los viroides. Fueron recuperados in vitro de 10 15 moléculas (aptadores), 220 nucleótidos en longitud, por 10 rondas de selección. Entre las muchas especies de ARN presentes en esta colección de cuasiespecies ARNs fueron miembros catalíticamente activos, ribozimas enzimáticamente activas. El espacio de secuencia para ARNs de 220-mers es de aproximadamente 3 × 10 132 (Eigen, 1971; Wilson y Szostak, 1999; Brackett y Dieckmann, 2006). Las ribozimas seleccionadas fueron capaces de replicar, separar, unir y formar enlaces péptidos. Pueden polimerizar químicamente la progenie, permitir que ocurran mutaciones y pueden evolucionar. Una molécula sirve como catalizador, la otra como sustrato. La replicación de ribozimas se demostró en el tubo de ensayo (Lincoln y Joyce, 2009). Ribozimas pueden formar enlaces péptidos entre aminoácidos (Zhang y Cech, 1997). Así, los pequeños péptidos estaban disponibles por actividad ribozima. En consecuencia, se ha propuesto una modificación del ARN como ácido péptido nucleico (PNA), con enlaces péptidos más estables en lugar de enlaces fosfodiéster (Zhang y Cech, 1997; Joyce, 2002). La replicación de moléculas de ARN se puede realizar químicamente a partir de ARN sin enzimas de polimerasa. Además, las deoxiribozimas pueden formarse a partir de ribonucleótidos (Wilson y Szostak, 1999). Así, el ADN puede surgir de ARN químicamente, sin la enzima proteica clave, la transcriptasa inversa. Todo un mundo vivo es posible a partir de ARN no codificante (ncRNA) antes de la evolución del código genético y enzimas proteicas. Ribozymes naturalmente consisten en ARN circulares de una sola cadena (Orgel, 2004). Carecen En lugar de ello, exhiben información estructural por los loops de horquilla que forman enlaces de hidrógeno entre hilos dobles incompletos, y lazos libres para interactuar con otras moléculas. Representan una cuasiespecie en la que muchas especies de ARN pueden formar, tales como ribozimas, moléculas similares a tRNA, y otros ncRNAs. Los ARNs dentro de tal grupo pueden unir aminoácidos. Noventa aminoácidos diferentes se han identificado en el meteorito Murchison encontrado en Australia, mientras que en la Tierra sólo alrededor de 20 de ellos se utilizan para la síntesis de proteínas (Meierhenrich, 2008). Donde la formación de ribozimas ocurrió en la Tierra primitiva es una cuestión de especulación. Los respiraderos hidrotermales como los fumadores negros en el océano profundo son posibilidades donde la vida puede haber comenzado (Martin et al., 2008). Allí, los gradientes de temperatura y Los poros o nichos ofrecen posibilidades de concentración de bloques de construcción, lo que es necesario para que ocurran reacciones químicas. Curiosamente, también el hielo es un candidato para la formación de ribozimas y reacciones químicas. Los cristales de hielo desplazan las biomoléculas en la fase líquida, lo que conduce a la concentración, creando una compartimentación cuasicelular donde se promueve la síntesis de novo de precursores de nucleótidos. Allí, puede surgir ARN y ribozimas, que son capaces de autorreplicarse (Attwater et al., 2010). Los complejos de ácido amino-tRNA pueden encontrar ARNs como "mRNAs". Tales interacciones podrían haber contribuido a la evolución del código genético. Esta secuencia de eventos puede conducir a precursores ribosoma primitivos. Las ribozimas son los elementos catalíticos esenciales en los ribosomas: "El ribosoma es un ribozima" (Cech, 2000), suplementado con cerca de un centenar de proteínas de andamio más tarde durante la evolución. Las proteínas tienen funciones estructurales y contribuyen indirectamente a la actividad enzimática. ¿Son estos ribozimas ribosomados fósiles de la Tierra primitiva? Los pequeños péptidos pueden ser formados por ribozimas antes de la evolución de los ribosomas, por lo que los aminoácidos simples o diméricos pueden originarse en el universo (Meierhenrich, 2008). Los pequeños péptidos con aminoácidos básicos pueden aumentar la actividad catalítica de las ribozimas como se muestra in vitro (Müller et al., 1994). Tales proteínas se conocen como proteínas de unión del ARN de virus del ARN que protegen el genoma del ARN, con motivos tales como RAPRKKG del nucleocápsido NCp7 del VIH (Schmalzbauer et al., 1996). Péptidos pueden mejorar la actividad catalítica de ribozimas hasta un 100 veces (Müller et al., 1994). Tales péptidos de virus del ARN sirven como chaperonas que eliminan estructuras de ARN de orden superior, permitiendo una interacción más eficiente de moléculas de ARN y aumentando las tasas de transcripción de polimerasas del ARN (Müller et al., 1994). Ribonucleoproteínas también pueden haber sido funcionalmente importantes durante la evolución de ribosomas (Harish y Caetano-Anolles, 2012). Estas estructuras preribosomales son también La transcripción inversa puede ser realizada químicamente por ribozimas. Esta acción no requiere necesariamente una proteína polimerasa como la transcriptasa inversa. Del mismo modo, los deoxiribonucleótidos pueden surgir por la eliminación de un oxígeno sin la necesidad de una enzima proteica (una reductasa) como hoy, y permitir la polimerización del ADN (Wilson y Szostak, 1999; Joyce, 2002). Los mismos elementos de los precursores para ribosomas también son bloques de construcción de retrovirus, que pueden tener un origen evolutivo similar (Moeling, 2012 (Moeling,, 2013. tRNAs sirven como imprimadores para la transcriptasa inversa, y la secuencia de promotores de elementos transponibles se derivan de tRNAs (Lander et al., 2001). Los ribozimas se desarrollaron en intrones más complejos del grupo de autoescisión II con la inserción de genes que codifican una transcriptasa inversa y proteínas adicionales (Moelling y Broecker, 2015; Moelling et al., 2017) (Figura 1). Surgió como sorpresa que los genomas de casi todas las especies son ricos en ncDNA, transcriptos en ncRNAs, pero no codificando proteínas, como se evidencia, por ejemplo, por el proyecto "Enciclopedia de Elementos de ADN" (ENCODE). ncDNA equivale a más del 98% del genoma de ADN humano (Deveson et al., 2017). Los organismos más altos tienden a tener más información no codificante, lo que permite modos más complejos de regulación genética. Los ncRNAs son reguladores de las secuencias de codificación de proteínas. ncRNA puede variar desde cerca de cero en las bacterias más pequeñas como Pelagibacter ubique hasta alrededor del 98% en el genoma humano. Los virus de ARN como el retrovirus HIV albergan a los ncRNAs para la regulación génica como el elemento de respuesta transactivante (TAR), el sitio de unión para la proteína Tat para la expresión temprana del gen viral. Tat tiene un dominio altamente básico que comprende principalmente residuos de Lys y Arg, que se asemejan a otras proteínas de unión de ARN. ncRNA también sirve en genomas de ARN virales como sitios de entrada ribosomal, sitios de unión de imprimación o señales de empaquetado. La síntesis del ADN depende de la síntesis del ARN como evento inicial, con ARN como iniciadores para la replicación del ADN, dentro de células como FIGURE 1 Un compartimento se muestra con componentes ARN no codificante (ncRNA), ribozimas o viroides, pueden realizar muchos pasos para la vida sin genes codificantes de proteínas, pero sólo por información estructural. Los aminoácidos individuales están indicados como puntos negros y pueden estar disponibles en la Tierra desde el universo. El ADN puede haber existido antes de retrovirus. El compartimento puede ser interpretado como previrus o precélulas. Viroide, verde; ARN, rojo; ADN, negro. así como durante la replicación retroviral, demostrando un requisito de ARN (Flint, 2015). El número de genes codificantes de proteínas de mamíferos es de alrededor de 20.000. Sorprendentemente, esto es sólo una quinta parte del número de genes de trigo pan (Appels et al., 2018). Tulips, maíz y otras plantas también tienen genomas más grandes, lo que indica que el número de genes no refleja necesariamente la ¿Podrían los genomas gigantes ser el resultado de la cría de plantas por agricultores o jardineros? De acuerdo con Szostak hay moléculas que aparecen como reliquias del mundo del ARN como el acetil-CoA o la vitamina B12, ambos están ligados a un ribonucleótido sin ninguna razón obvia - ¿se "olvidaron" para ser removidos? (Roberts y Szostak, 1997; Szostak et al., 2001; Szostak, 2011). Tal vez el ARN conectado sirve como estabilizador estructural. Las vesículas lipídicas podrían haber formado los primeros compartimentos y ribozimas cerrados, tRNAs con aminoácidos seleccionados, y ARN que se convirtieron en mRN. ¿Es esto un pre-células o pre-virus (Figura 1)? Patel et al. (2015) demostró que los bloques de construcción de la vida, ribonucleótidos, lípidos y aminoácidos, se pueden formar a partir de C, H, O, P, N, S en una síntesis de "una olla". Este estudio se puede considerar como un estudio de seguimiento de la síntesis clásica Urey-Miller in vitro de biomoléculas (Miller, 1953; Miller y Urey, 1959). La transición del ARN al mundo ADN fue promovida por la formación de la transcriptasa inversa. La enzima fue descrita por primera vez en retrovirus pero es casi ubicua y se encuentra en numerosas especies celulares, muchas de las cuales con funciones desconocidas (Simon y Zimmerly, 2008; Lescot et al., 2016). Es un vínculo importante entre el ARN y los mundos del ADN. El nombre de transcriptasa inversa es histórico e irritante porque es la transcriptasa "real" durante la transición del ARN al mundo del ADN. Del mismo modo, la ribonucleasa H (RNase H) es una enzima esencial de retrovirus (Mölling et al., 1971). La RNASA H resultó ser una de las cinco proteínas más frecuentes y antiguas (Ma et al., 2008 ) que pertenece a una superfamilia de más de sesenta representantes únicos diferentes y 152 familias con numerosas funciones (Majorek et al., 2014). Algunos de los muchos tRNAs pueden llegar a ser cargados con aminoácidos. Hay virus que contienen estructuras similares a tRNA (TLS), que se asemejan a estos primeros ARNs (Dreher, 2009). Los virus TLS incluyen virus de plantas, como el virus del mosaico amarillo de Turnip, en el virus del grupo de maní, el virus del mosaico de tabaco (TMV), y el virus del mosaico de Brome. Sólo la mitad del ARNt se encuentra en los Narnavirus de hongos. Los aminoácidos conocidos por ser componentes de virus similares al ARNt son valina, histidina y tirosina. Las estructuras también fueron designadas como "mimícritas", mejorando la traducción (Dreher, 2009 (Dreher,, 2010 ). Parecen elementos precursores "congelados" para la síntesis de proteínas. Esta combinación de un tRNA parcial vinculado a un aminoácido puede interpretarse como un paso evolutivo hacia la síntesis de proteínas, atrapado en un elemento viral. Los viroides carecen de capas proteicas y por lo tanto inicialmente no fueron designados como virus sino como virus cuando fueron descubiertos en 1971 por Theodor Diener. Él describió a los viroides como "fósiles vivos" (Diener, 2016) (Figura 2). De las patatas infectadas, Diener aisló el tubérculo del huso de la patata (PSTVd) cuyo genoma era aproximadamente 100 veces más pequeño que los de los virus conocidos en ese momento. Los viroides conocidos hoy en día van desde 246 hasta 467 nucleótidos. Contienen ARN circular de una sola cadena, son libres de proteínas y autorreplicantes sin información genética, pero sólo estructurales FIGURA 2 Los viroides son estructuras de horquilla y se muestran esquemáticamente y como micrografía electrónica. Viroides son, como ribozimas, sin información genética y juegan papeles biológicos importantes hoy en día en enfermedades de las plantas, en flores de claveles, en cáncer de hígado, como catalizador de la síntesis de proteínas en ribosomas y como ARNs regulatorios circulares, como "esponjas" para otros ARNs regulatorios. información en forma de horquillas de pelo (Riesner et al., 1979). Pueden generar copias de sí mismos en el entorno apropiado. Fueron designados como las "fronteras de la vida" (Flores et al., 2014). El conocimiento de la composición del virus se basó en TMV y su cristalización por Wendell Stanley en 1935 (Pennazio y Roggero, 2000). El genoma de TMV es ARN singlestranded codificante de proteínas de alrededor de 6.400 nucleótidos que está encerrado por una capa prote Los viroides, por el contrario, no codifican proteínas y carecen de capas, pero están estrechamente relacionados con los virus. Los viroides pueden perder su autonomía y dependen de las polimerasas del ARN huésped para replicarse, son capaces de infectar las plantas y muchos son patógenos económicamente importantes. Hay dos familias, el núcleo-replicante Pospiviroidae como PSTVd y el cloroplasto-replicante Avsunviroidae como el Viroide Sundblotch Aguado (ASBVd). Su replicación requiere enzimas del huésped. Por lo tanto, la autonomía es reemplazada por la dependencia de las enzimas del huésped y un estilo de vida intracelular. La mayoría de los viroides son a menudo ribozimáticamente activos -sin embargo son ejemplos de que este rasgo puede perderse como resultado de las condiciones ambientales cambiantes. Sólo las variantes nucleares, las Pospiviroidae, pueden perder su actividad ribozimática y utilizar la enzima RNASA III celular para su replicación. En contraste, las Avsunviroidae siguen siendo ribozimas de cabeza de martillo activas. Así, dentro del núcleo de una célula huésped, la función RNA enzimática puede volverse innecesaria. No genes, sino una función, la actividad catalítica, se pierde. Viroides aparentemente no ganar genes, pero cooperó para un estilo de vida más complejo. Por ejemplo, Carnation pequeño ARN tipo viroides (ARN CarSV) coopera con un retrovirus y está acompañado por un ADN homólogo generado por una transcriptasa inversa. Esta enzima presumiblemente se origina de un pararetrovirus de las plantas. Pararetrovirus empaqueta partículas del virus en una etapa diferente durante la replicación que retrovirus, el ADN, no el ARN Esta combinación única entre dos elementos virales sólo se ha detectado hasta ahora con CarSV en flores de claveles (Flores et al., 2005) (Flores et al.,, 2014. ¿Por qué tal cooperación evolucionó -tal vez por los jardineros reproductores? El ARN es sensible a la degradación; por lo tanto, el aumento genético y el crecimiento del genoma puede no ser favorable energéticamente -al menos no en las plantas. Ganancia de la función es, en este caso, la cooperación. El ARN circular (ARN circular) está relacionado con ribozimas/viroides como un regulador principal de otros ARN regulatorios, un ARN "esponja" que absorbe pequeños ARNes. Micro ARNs (miRNs) son reguladores post-transcripcionales que se ven afectados por la presencia de ARN circulares. se detectaron ARNs en cerebros humanos y Pueden unir 70 miRNA conservadas en una célula y su cantidad es de hasta 25.000 moléculas (Hansen et al., 2013). Su estructura recuerda a ribozimas catalíticamente activas. Hay un viroides excepcionales que obtuvieron información codificante y entraron en el hígado humano (Taylor, 2009). El viroides se conoce como virus delta de la hepatitis (HDV). Tiene el genoma más pequeño de cualquier virus animal conocido de cerca de 1.680 nucleótidos. Tiene propiedades típicas de los viroides, ya que contiene ARN circular, forma saltos de horquilla similares y réplicas en el núcleo utilizando enzimas huésped. Dos polimerasas tienen que redirigir su especificidad del ADN al ARN para generar el genoma y el antígeno del HDV. Ambos tienen actividad ribozima. En contraste con otras ribozimas, el HDV codifica una proteína, el antígeno delta de la hepatitis (HDVAg) que se presenta en dos formas, el pequeño HDVAg (24 kDa) que soporta la replicación y el gran HDVAg (27 kDa) que ayuda al ensamblaje del virión. El gen fue presuntamente recogido de la célula huésped por la recombinación del ARNm del HDV intermedio con un ARNm del huésped. La transmisión depende de un virus ayudante, el virus de la Hepatitis B (VHB), que entrega la capa (Taylor, 2009 ) ¿El empaquetado por un virus ayudante protege el genoma y por lo tanto permite que exista un viroides más grande? En las plantas, los viroides pueden no ser capaces de hacerse más grandes posiblemente debido a su sensibilidad a la degradación - pero tampoco pueden ser mucho más pequeños. Sólo se conoce un único viroides que está compuesto completamente de ARN codificante de proteínas con trillizos (AbouHaidar et al., 2014). Los viroides y los ARN replicantes relacionados son unidades replicantes propensas a errores y la frecuencia de error les impone un cierto tamaño mínimo, ya que de otro modo se extinguirían. Este mecanismo ha sido descrito como "catástrofe de error", lo que impide la supervivencia (Eigen, 1971 (Eigen,, 2013 ). Los viroides y ARN relacionados son los más pequeños réplicas conocidas. Los más pequeños se extinguirían en ausencia de sistemas de reparación. En resumen, el ARN puede catalizar muchas reacciones. Las enzimas proteicas que pueden haber evolucionado más tarde tienen mayores actividades catalíticas. Los ribozimas son portadores de información, pero no requieren genes de codificación. La información se almacena en su secuencia y estructura. Así, la replicación de un ARN inicial es seguida por el flujo de información, del ADN al ARN a la proteína, como se describe el Dogma Central (Crick, 1968). Incluso un flujo de información de la proteína al ADN ha sido descrito para algunas proteínas arqueales (Béguin et al., 2015). El mundo de proteínas de ADN contiene numerosos NCRNAs con funciones clave. ncRNA puede servir como un compuesto modelo para el origen de la vida en otros planetas. Por lo tanto, no la composición química de esta molécula es de importancia primordial, pero su simplicidad y multifuncionalidad. Además, el ARN es software y hardware en una sola molécula, que lo hace único en nuestro mundo. Hay otros escenarios además del aquí discutido "virus-first, " tales como "proteína-first", "metabolismo-fist" o el "mundo lípido" (Segré et al., 2001; Andras and Andras, 2005; Vasas et al., 2010; Moelling, 2012). Algunos de estos conceptos alternativos se construyeron sobre la filogenómica, la reconstrucción del árbol de la vida por secuenciación del genoma (Delsuc et al., 2005). Sorprendentemente, fue Sir Francis Crick, uno de los descubridores de la doble hélice del ADN, que declaró que no se sorprendería de un mundo completamente construido de ARN. Una predicción similar fue hecha por Walter Gilbert (Crick, 1968; Gilbert, 1986). ¡Qué visión! Nuestro mundo fue casi 50 años más tarde definido como "proteína ARN" mundo (Altman, 2013). Se puede especular que nuestro mundo fue construido de ribozimas o viroides, lo que significa "virus primero". Los ncRNAs aparecen como reliquias del mundo ARN pasado, antes de que el ADN, el código genético y las proteínas evolucionaran. Sin embargo, el ncRNA es esencial en nuestro mundo de ADN biológico hoy en día. Es posible producir tal ncRNA hoy en el tubo de prueba por pérdida de información génica de ARN codificante de proteínas. Esta reducción al ncRNA se demostró in vitro con ARN fago. El ARN genómico Qβ, 4.217 nucleótidos de longitud, fue incubado en presencia de replicasa Qβ, nucleótidos y sales libres, un medio rico en el tubo de prueba. El ARN se permitió replicar por medio de la réplica Qβ. La transferencia serial de alícuotas a medio fresco llevó a tasas de replicación cada vez más rápidas y a la reducción del tamaño genómico, hasta 218 nucleótidos de ncRNA en 74 generaciones. Este estudio demostró que, dependiendo de las condiciones ambientales, se puede producir una reducción génica extrema. Este experimento realizado en 1965 fue designado como "Monstruo de Spiegelman". El ARN de codificación se convirtió en replicación de ncRNA (Spiegelman et al., 1965; Kacian et al., 1972)! Manfred Eigen amplió este experimento y demostró además que una mezcla que no contiene ARN para empezar con pero sólo ribonucleótidos y la réplica Qβ puede bajo las condiciones correctas en un tubo de prueba generar espontáneamente ncRNA auto-replicante. Esto evolucionó en una forma similar al Monstruo de Spiegelman Además, un cambio en la concentración enzimática y la adición de ARN cortos o un intercalador de ARN influyeron en la población de ARN emergente (Sumper y Luce, 1975; Eigen, 2013). Así, la complejidad de los genomas depende del medio ambiente: las malas condiciones conducen a una mayor complejidad y a entornos ricos a una menor complejidad. El proceso demostrado en este experimento con componentes virales indica que la reversión a la simplicidad, la reducción de tamaño, la pérdida de información genética y la velocidad de replicación pueden ser las principales fuerzas de la vida, aunque esto parezca ser como una reversión de la evolución. El experimento puede tal vez ser generalizado desde el tubo de ensayo a un principio, que los sobrevivientes más exitosos en nuestro planeta son los virus y microorganismos, que se convirtieron en las entidades más abundantes. Tal vez la vida pueda comenzar de nuevo. Estos estudios plantean la cuestión de cómo las moléculas de ARN pueden llegar a ser Esto puede ser superado por el flujo de calor a través de un poro abierto en rocas sumergidas, que concentra la replicación de oligonucleótidos de un flujo de alimentación constante y la selección de hebras más largas. Esto se ha descrito para un aumento de 100 a 1.000 nucleótidos in vitro. Moléculas de ARN menores de 75 nucleótidos morirán (Kreysing et al., 2015). ¿Podría un medio ambiente pobre conducir a un aumento de complejidad? Esto podría ser probado. Ribozimas se demostró que crecen en tamaño por absorción de genes, como se demostró para HDV (Taylor, 2009 ). Un ejemplo inesperado interesante reciente que apoya la noción de que las condiciones ambientales influyen en la complejidad genética, es el microbioma intestinal humano. Su complejidad aumenta con diversos alimentos, mientras que alimentos ricos uniformes reducen su diversidad y pueden conducir a enfermedades como la obesidad. Unas pocas docenas de especies bacterianas y virales/fagos se conservan entre individuos (secuencias básicas) como una composición estable (Broecker et al., 2016c. La disbiosis se ha observado en varias enfermedades crónicas y en la obesidad, una pérdida de riqueza y diversidad bacterianas. La nutrición en condiciones afluentes con alimentos ricos en azúcar contribuye a la obesidad, lo que resulta en una reducción significativa de la complejidad del microbioma. Esta reducción es difícil de revertir (Cotillard et al., 2013; Le Chatelier et al., 2013). El microbioma intestinal en pacientes humanos con obesidad recuerda a la reducción genética descrita en el experimento del Monstruo de Spiegelman: reducción de genes en un entorno rico. La reducción de la complejidad del microbioma se atribuye en parte a la acción de los fagos, que bajo tales condiciones, definidas como estrés, lisian las El trasplante de microbiota fecal puede ser reemplazado incluso por fracciones solubles que contienen fagos o metabolitos del donante sin bacterias (Ott et al., 2017). Analógicamente, los microbiomas más complejos se encuentran en las tribus humanas indígenas de África, que viven en una amplia variedad de nutrientes diferentes. Es un proceso lento, sin embargo, para aumentar la complejidad de la microbiota intestinal por nutrición diversa. La microbiota asociada a la obesidad que sobrevive son más aptas y difíciles de contrarrestar. Urbanización y occidentalización de la dieta se asocia con una pérdida de biodiversidad microbiana, pérdida de organismos microbianos y genes (Segata, 2015). Para entender el mecanismo y la fuerza motriz para la reducción del genoma, las tasas de eliminación se probaron mediante la inserción de un gen indicador en el genoma de Salmonella entérica. La pérdida del gen indicador fue monitoreada por el paso en serie Las deleciones resultaron en genomas más pequeños con reducción o ausencia de genes de reparación de ADN (Koskiniemi et al., 2012). La pérdida de genes confirió una mayor aptitud a las bacterias bajo estas condiciones experimentales. Los mimivirus recientemente descubiertos y otros virus gigantes son dignos de considerar para entender la evolución de la vida con respecto a la contribución de los virus. Sus anfitriones son, por ejemplo, Acanthamoeba, Clorella, y Coccolithus algas (Emiliania huxleyi), pero también corales o esponjas como se discutió más recientemente. Los mimivirus fueron descubiertos por primera vez en torres de agua de refrigeración en Bradford, Reino Unido en 2003 con cerca de 1.000 genes, la mayoría de los cuales no relacionados con genes conocidos anteriormente. Los mimivirus han recibido atención porque contienen elementos que se consideraban distintivos de células vivas, no de virus, Los mimivirus albergan estos bloques de construcción como conjuntos incompletos que no son suficientes para la síntesis de proteínas independientes como las bacterias o las arcaeas pueden realizar, evitando que lleven una vida autónoma (La Scola et al., 2003 Scola et al.,, 2008. Son más grandes que algunas bacterias. Los virus gigantes pueden ser vistos como en un camino evolutivo hacia un organismo celular. Alternativamente, pueden haber evolucionado de un organismo celular por pérdida de información genética (Nasir y Caetano-Anolles, 2015). Los virus gigantes han tomado con frecuencia genes de sus anfitriones por transferencia horizontal de genes (HGT) (La Scola et al., 2008; Nasir y Caetano-Anolles, 2015; Colson et al., 2018). Un gráfico sobre los tamaños del genoma muestra que los mimivirus y las bacterias se superponen en tamaño, lo que indica una transición continua entre virus y bacterias y entre mundos vivos y no vivos (basado en Holmes, 2011) (Figura 3). Otros virus gigantes, como los megavirus, fueron descubiertos en el océano de Chile con 1.120 genes. Más recientemente, el Klosneuvirus fue identificado en las aguas residuales del monasterio Klosterneuburg en Austria en 2017 con 1.57 millones de pares de bases (Mitch, 2017). Pithovirus sibericum es el más grande entre los virus gigantes descubiertos hasta la fecha con un diámetro de 1,5 micras, un genoma de 470.000 pb con 467 genes putativos, 1,6 micras de longitud, y es presumiblemente de 30.000 años ya que fue recuperado de permafrost en Siberia (Legendre et al., 2014 Los virus Pandora más pequeños con 1 micron de longitud tienen genomas cinco veces más grandes, 2.500.000 pb (Philippe et al., 2013) (Figura 3). Los virus gigantes incluso pueden ser hospedadores de virus más pequeños, los virófagos, que recuerdan a los bacteriófagos, los virus de las bacterias. Estos virófagos como Sputnik son sólo 50 nm de tamaño con 18.343 pb de ADN circular y 21 genes de codificación proteica predichos. Se replican en fábricas virales y consumen los recursos del mimivirus, destruyéndolo así. Algunos, los virófagos incluso pueden integrarse en el genoma del huésped celular y se pueden reactivar cuando el huésped está infectado por virus gigantes. Así, virus gigantes sugieren que los virus están cerca de entidades vivas o pueden haber estado vivos (La Scola et al., 2008; En biología es común distinguir entre materia viva y muerta por la capacidad de sintetizar proteínas y replicar autónomamente. Los virus gigantes pueden ser considerados como un eslabón faltante entre los dos, porque albergan "casi" el aparato de síntesis de proteínas. La transición de vivir al mundo no vivo es continua, no separada por una línea fronteriza aguda (Figura 3). Los virus no son considerados vivos por la mayoría de la comunidad científica y como se escribe en los libros de texto, porque no pueden replicarse autónomamente. Sin embargo, algunos de los virus gigantes están equipados con casi todos los componentes de la maquinaria de síntesis de proteínas cerca de bacterias que sugieren que pertenecen a la materia viva (Schulz et al., 2017). Las ribozimas pueden haber sido la entidad replicante más temprana. Tal vez también otros virus fueron inicialmente más independientes de la Tierra primitiva que hoy en día. Como se describe en la Figura 1 puede haber sido inicialmente Sólo más tarde los virus pueden haber renunciado a su replicación autónoma y convertirse en parásitos, como se ha descrito para algunas bacterias (véase más adelante). Se han hecho esfuerzos para identificar la célula viva más pequeña que todavía se replica de forma autónoma. Entre las bacterias que presumiblemente se encuentran Pelagibacter ubique del clado SAR11 de bacterias (Giovannoni, 2017), que se descubrió en 1990. Es un alfa-proteobacterio con 1.389 genes presentes ubicuamente en todos los océanos. Puede alcanzar hasta 10 28 células vivas libres en total y representa aproximadamente el 25% de las células de plancton microbiano. Muy poco de su ADN es no codificante. Alberga fagos de tipo podofago, designados como "pelagiphage" (Zhao et al., 2013). Este pequeño bacteria fue designado como el organismo más común en el planeta. ¿ Esta bacteria autónoma es más pequeña que algunos virus gigantes parasitarios. Craig Venter, que primero logró secuenciar el genoma humano, trató de minimizar el genoma más pequeño putativo de una especie viva, de Mycoplasma mycoides, una bacteria parasitaria que vive en rumiantes (Gibson et al., 2008 (Gibson et al.,, 2010. Su grupo sintetizó un genoma de 531.000 bp con 473 genes, 149 de ellos (32%) con funciones desconocidas (Hutchison et al., 2016). Entre los organismos parasitarios vivos más pequeños está Nanoarchaeum equitans. Es un arqueón termofílico que vive a 80 • C y a pH 6 con 2% de sal (Huber et al., 2003). Su genoma tiene un tamaño de 490.000 bp y codifica 540 genes. N. equitans es un simbionte obligatorio de un arqueón más grande, Ignicoccus montando en él como en un caballo, de ahí el nombre (Huber et al., 2003). El mundo de los virus cubre una gama de tres troncos en tamaño de sus genomas: desde genes cero a cerca de 2.500 genes que ascienden a cerca de 2.500.000 bp de ADN. Los viroides de origen cero tienen unas 300 bases de longitud (Figura 3). La virosfera es el reservorio más exitoso de entidades biológicas en nuestro planeta en términos de número de partículas, velocidad de replicación, tasas de crecimiento y espacio secuencial. Hay alrededor de 10 33 virus en nuestro planeta y están presentes en cada especie existente (Suttle, 2005). No hay especies vivas sin virus! Los virus también ocurren libremente en los océanos, en el suelo, en nubes hasta la estratosfera y más Poblan el intestino humano, el canal de nacimiento y el exterior del cuerpo como capa protectora contra las poblaciones microbianas. Los microbios contienen fagos que se activan durante condiciones de estrés tales como la falta de nutrientes, el cambio de temperatura, la falta de espacio y otros cambios de las condiciones ambientales. Uno de los papeles más agitadores de la tierra de este siglo fue la publicación de la secuencia del genoma humano (Lander et al., 2001). Alrededor de la mitad, posiblemente incluso dos tercios de la secuencia se componen de retrovirus endógenos más o menos completos (ERVs) y retroelementos relacionados (REs) (de Koning et al., 2011). Las RE amplifican a través de mecanismos de copia y pasta que implican un paso de transcriptasa inversa de un ARN intermedio en ADN. Además, los elementos transponibles del ADN (TEs) se mueven por un mecanismo de corte y El origen de las REs está siendo discutido como restos de infecciones germinales retrovirales antiguas que se fijaron evolutivamente en el genoma. Alrededor de 450.000 elementos ERV humanos (HERV) constituyen alrededor del 8% del genoma humano consistente en elementos retrovirales distintivos como la mordaza, pol, genes env y repeticiones terminales largas flanqueantes (LTR) que actúan como promotores (Lander et al., 2001). Howard Temin, uno de los descubridores de la transcriptasa inversa, en 1985 ya describió elementos similares a retrovirus endógenos, que estimó en cerca del 10% de la secuencia del genoma humano y del ratón (Temin, 1985). El número real es alrededor del 45% como se estima hoy (Lander et al., 2001). En algunos genes como el gen Protein Kinase Inhibitor B (PKIB) determinamos alrededor del 70% de secuencias ¿Hay un límite? ¿Podría haber sido 100%? Se estima que los retrovirus han entrado en el linaje del genoma mamífero hace 550 millones de años (MYA) (Hayward, 2017). Las secuencias ERV más antiguas pueden existir pero hoy son irreconocibles debido a la acumulación de mutaciones. Los ERV sufren mutaciones, deleciones o eventos de recombinación homóloga con grandes deleciones y pueden llegar a ser tan cortos como los elementos LTR solos, que son unos pocos cientos de pb en longitud - los sobrantes de genomas retrovirales de larga duración de alrededor de 10.000 pb. Los promotores LTR pueden desregular genes vecinos. Los eventos de recombinación homóloga pueden ser considerados como eventos de pérdida de genes o reducción de genes. Es la suposición de que los ERV, que ya no eran necesarios para la defensa celular del huésped, ya no fueron Eugene Koonin señala que la infección y la integración son eventos únicos que se producen a un ritmo rápido, mientras que la pérdida y la reducción de genes pueden tardar mucho más tiempo (Wolf y Koonin, 2013). Una reducción frecuente de genes de genomas eucariotas es la pérdida de la proteína de envoltura viral codificada por el gen env. Sin un abrigo, los retrovirus ya no pueden dejar la célula e infectar otras células. Pierden la movilidad y se convierten en elementos intracelulares obligatorios. Los virus ayudantes pueden suministrar proteínas de envoltura en trans y movilizar los virus. Las TEs o REs se pueden considerar como ejemplos de reliquias de virus intracelulares sin capa -o podría haber sido al revés, tal vez precursores de retrovirus de larga duración? Estos elementos pueden amplificarse intracelularmente y modificar los genomas del huésped mediante la integración con el peligro potencial de alteración genética y cambios genéticos. Las REs pueden llevar a la duplicación de genes y al desarrollo de pseudogenes, con una copia para la conservación estable de las funciones adquiridas y la otra para las innovaciones (Cotton y Page, 2005). Tales duplicaciones constituyen grandes cantidades de genomas de mamíferos (Zhang, 2003). Los retrovirus tienen una duplicación de moiety RNASa H, una de las cuales sirve como enlace catalíticamente inactivo entre la RT polimerasa y la enzimáticamente activa RNASa H (Xiong y Eickbush, 1990; Malik y Eickbush, 2001; Moelling y Broecker, 2015; Moelling et al., 2017). Esta duplicación de genes se remonta a 500 millones de años (Cotton y Page, 2005). Las duplicaciones de genes son una causa común de cáncer, que a menudo se produce sólo en el genoma de la célula cancerosa en sí, Myc, Myb, ErbB2, Ras y Raf son oncogenes amplificados en diversos tipos de cánceres humanos (Vogelstein y Kinzler, 2002). La capacidad de los retrovirus para integrarse los hace distintos de los endosimbiontes que permanecen separados. Sin embargo, el resultado neto es muy similar, la adquisición de nueva información genética, que se transmite a la siguiente generación, si la línea germinal está infectada y se produjo la endogenización del virus. La integración viral no se limita a las células eucariotas, sino también un mecanismo en procariotes para el mantenimiento del estado lisogénico de los fagos dentro de las bacterias. Además, para otros virus eucariotas como el VHB, el antígeno de superficie envolvente BHsAg se puede eliminar, lo que conduce a un estilo de vida intracelular obligatorio para el virus, que especialmente en presencia de VHC promueve el cáncer (Yang et al., 2016). Se ha demostrado que el VIH pierde rápidamente uno de sus genes auxiliares, nef, originalmente por factor negativo. El gen se perdió dentro de un número bastante bajo de pasajes del virus crecido bajo condiciones de cultivo tisular por selección de células productoras de títulos de alto virus. La eliminación de nef resultó en un aumento significativo del título del virus en cultivo -de ahí el nombre. El producto del gen nef no era de necesidad dentro de las células de cultivo tisular, sino que era inhibitorio para la replicación. Sin embargo, es esencial para la patogenicidad en animales, y posteriormente nef fue reinterpretado como " Además, los hospederos humanos del VIH pueden perder una porción terminal significativa de un receptor de siete transmembranas en linfocitos, la célula diana primaria para la entrada del VIH y para la captación del virus. Esta molécula, el receptor de citocinas CCR5 es truncado por 32 aminoácidos carboxiterminales (CCR5-32), desactivando funcionalmente el receptor. La frecuencia de alelos del mutante CCR5-32 mutante es de alrededor del 10% en la población europea, haciendo que estas personas resistentes a las infecciones por VIH (Solloch et al., 2017). Esta pérdida genética en europeos ha demostrado hacer que los individuos resistentes no sólo contra la infección por VIH sino también contra la malaria. Esto puede haber sido la presión selectiva en el pasado antes de que el VIH/SIDA surgiera. No se ha descrito ningún efecto secundario para los seres humanos que carecen de este gen (Galva Los virus han demostrado ser motores de la evolución (Villarreal y Witzany, 2010), incluyendo el genoma humano, que por lo menos un 45% está compuesto de secuencias relacionadas con retrovirus. Además, los retrovirus endogenizados suministraron los genes de sincitina que son esenciales para el desarrollo de la placenta mamífera, y permitieron el crecimiento de embriones sin su rechazo por el sistema inmune materno (Dupressoir et al., 2012). Así, la misma propiedad que causa inmunodeficiencia en pacientes infectados por VIH y conduce al SIDA causa la formación de sincitia, fusión celular después de la infección por un retrovirus. También se ha propuesto que los virus estén en el origen de la evolución de la inmunidad adaptativa (Villarreal, 2009 ). Así, los genomas conformados por virus mediante el suministro de genes y mecanismos esenciales. La endogenización de retrovirus se ha producido en los genomas Si los ERVs integrados no ofrecían ninguna ventaja selectiva, se deterioraban y acumulaban mutaciones con pérdida de función, lo que se demostró directamente mediante la reconstrucción de un retrovirus infeccioso a partir de la secuencia de consenso de 9 secuencias de virus endógenos defectuosos, designados como Phoenix. El virus se expresaba a partir de un clon sintético de ADN construido en cultivo celular y partículas de virus formados identificadas por análisis microscópicos de alta resolución (Dewannieux y Heidmann, 2013). Los koalas en Australia están siendo endogenizados de un retrovirus (koala retrovirus, KoRV) en "tiempo real" y demuestran posibles consecuencias para la inmunidad. A principios de 1900, algunos individuos fueron trasladados a islas, incluida la isla Kangarooo, cerca del continente australiano para fines de repoblación, ya que los koalas estaban amenazados de extinción. Sin embargo, los koalas aislados en la isla de Kangaroo son KoRV negativos, lo que permite datar la introducción de KoRV en la población de koalas hace unos cien años. Muchos de los koalas infectados cayeron enfermos y murieron, sin embargo algunas poblaciones se volvieron resistentes dentro de unos 100 años, correspondientes a unas 10 generaciones. Los koalas probablemente desarrollaron resistencia debido a los provirus de ADN integrados. El retrovirus se transmite como exógeno así como virus endógeno, similar al retrovirus de ovejas Jaagsiekte (JSRV), por lo que los virus endogenizados protegen con un producto génico viral, como Env, contra infecciones de novo por "exclusión de la superinfección" (Tarlinton, 2012). La contribución de los retrovirus a la defensa antiviral es sorprendente, ya que todos los genes retrovirales tienen genes análogos en el mecanismo de defensa de las células eucarióticas siRNA/RNAi (Moelling et al., 2006). Los retrovirus pueden proteger contra la infección por otros virus relacionados, por ejemplo, al expresar proteínas Env que bloquean los receptores de la superficie celular (Villarreal, 2011). Un mecanismo comparable protege a las células bacterianas contra los fagos de ADN, mediante fragmentos de ADN de fagos integrados que se transcriben en ARNm e hibridan a los nuevos fagos de ADN entrantes y por lo tanto conducen a su destrucción por nucleasasases híbridos específicos, inmunidad CRISPR/Cas (Charpentier y Doudna, 2013). A menudo no se da cuenta de que la adquisición de inmunidad en bacterias y células La integración de retrovirus ocurre normalmente en las células somáticas después de la infección como un paso obligatorio durante el ciclo de vida viral. La infección de las células germinales puede conducir a la transmisión a la próxima generación y en última instancia dar lugar a resistencia hereditaria. Los retrovirus endogenizados probablemente causaron resistencia FIGURA 4 Los virus protegen contra los virus: los retrovirus protegen a una célula contra una nueva infección por un virus similar designado como "exclusión de la superinfección" o interferencia viral. Esto es mediado por productos genéticos virales como proteínas o ácidos nucleicos. Del mismo modo, los fagos protegen contra los fagos: la superinfección de bacterias es evitada por el ARN CRISPR/Cas originado por infecciones anteriores. Los mecanismos de defensa contra virus y fagos son análogos. La protección de virus o fagos contra superinfección representa defensa celular y inmunidad adquirida. Los cuatro ejemplos se discuten Del mismo modo, la resistencia al virus de la Inmunodeficiencia Simiana (SIV) en algunas especies de monos puede explicarse por la endogenización (Li et al., 2017) (Li et al., 2018. En el caso de los fagos y sus hospedadores procarióticos, el mecanismo se describe como CRISPR/Cas, que siguen principios análogos de "endogenización" del material genético entrante para su posterior exclusión. Se puede especular que el VIH también puede llegar a ser endogenizado en el genoma humano. Hay alguna evidencia de que el VIH puede infectar las células germinativas humanas y transmitirse al genoma embrionario (Wang et al., 2011). ¿Cuánto tiempo puede tardar esto no se conoce -10 generaciones? La pérdida de la función de los VRV puede ocurrir por mutaciones, supresiones de los env u otros genes y, en última instancia, El número de elementos retrovirus suma alrededor de 450.000, lo que corresponde al 8% del genoma humano (Lander et al., 2001; Cordaux y Batzer, 2009 ). Las regiones promotoras fueron analizadas por su contribución al cáncer activando genes vecinos -como consecuencia de una antigua infección por retrovirus. De hecho, los genes celulares activados por "promoción descendente" fueron identificados en estudios animales con activación del gen mic como uno de muchos ejemplos, llevando a un desarrollo crónico y no agudo del cáncer (Ott et al., 2013). Como mecanismo general para el cáncer humano hoy en día los LTRs no son identificados como un culpable mayor. La mayoría de los ERVs que encontramos hoy se han integrado durante la evolución en intrones u otras regiones donde su presencia es relativamente inofensiva. ¿Resultaron los otros en la muerte de los portadores que desaparecieron? Los efectos de los LTRs en los niveles de expresión de los genes huéspedes vecinos fueron estudiados con el virus humano endógeno, HERV-K, como posible causa de cáncer, pero esto no parece ser un fenómeno general (Broecker et al., 2016b). Como se demostró para los koalas, los ERVs pueden conferir inmunidad a las infecciones virales (Feschotte et al., 2012). Se demostró que un ERV relacionado, HERV-H, produce un ARN que mantiene las células embrionarias tempranas pluripotentes e incluso revierte las células adultas para recuperar la pluripotencia (Grow et al., 2015). Así, el papel de los ERVs puede ser más complejo de lo que conocemos actualmente. Elementos transponibles y REs que perdieron la capacidad de transmisión celular mediante la eliminación de la proteína del abrigo contribuyen principalmente a la complejidad genética de Están "bloqueados" dentro de las células y son los principales impulsores del aumento de la complejidad genética (Cordaux y Batzer, 2009 ). Se podría especular que estos elementos intracelulares son retrovirus replicantesincompetentes que carecen de abrigos (Lander et al., 2001). Los murciélagos transmiten virus como el Ébola y el coronavirus SARS sin sufrir de enfermedad (Beltz, 2018). Incluso virus ARN como Bornavirus han demostrado integrarse por transcripción inversa ilegítima, posiblemente también proporcionando inmunidad contra la superinfección (Katzourakis y Gifford, 2010). Hay dos eventos prominentes que contribuyeron significativamente al éxito de la vida y la formación de células. Ambos están asociados con la reducción de genes. Este fenómeno puede jugar un papel para la evolución de los virus de estilos de vida autónomos a parásitos. En la década de 1960 Lynn Margulis propuso un origen extracelular para las mitocondrias (Margulis, 1970,, 1993 ). Una célula ancestral, tal vez un arqueón, fue infectada por una bacteria anaerobia, que dio lugar a las mitocondrias. Del mismo modo, cianobacterias formaron los cloroplastos en las células vegetales modernas. Mitocondrias surgió hace alrededor de 1.450 millones de años (BYA) (Embley y Martin, 2006). Mitocondrias y cloroplastos son los ejemplos más llamativos para un cambio en el estilo de vida de bacterias autónomas a endosimbiontes. Esta transición a menudo se considera como extremadamente rara y un sello distintivo de la evolución de la vida en nuestro planeta. Sin embargo, hay muchos otros parásitos intracelulares obligados como Rickettsia, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii (el agente causal de la fiebre Q), Mycobacterium leprae, M. tuberculosis, y M. mycoides (Beare et al., 2006). El cambio de estilo de vida de los endosimbiontes en los dos casos de mitocondrias y cloroplastos es sorprendente. Ambos redujeron drásticamente su composición genética. Mitocondria contiene menos de 37 genes, que dejaron de ser los originales alrededor de 3.000 genes. Es endogenización de retrovirus, los ERV, que se integran en células germinales, relacionadas con la endosimbiosis? Son estos modelos endosimbionts para la transición de un estilo de vida autónomo a una vida parasitaria que puede haber tenido lugar con virus? Un ejemplo típico más reciente para una evolución reductiva son Rickettsia. Estas bacterias se supone por algún tiempo que son virus debido a su existencia parasitaria intracelular obligatoria. Rickettsia han evolucionado de bacterias que replican autónomamente. Evolución reductiva de endosimbiontes puede producir bacterias con genomas diminutos a expensas de la vida extracelular autónoma. Sus genomas son 1,11 millones de pbp en longitud con cerca de 834 genes codificantes de proteínas, y pérdida de 24% por la evolución reductiva (Ogata et al., 2001). Rickettsia puede tener alguna relación con cianobacterias, que se consideran como los principales simbiontes. ¿Se puede especular que los virus pueden haber sido entidades autónomas inicialmente? Viroides pueden haber sufrido la transición de la autonomía a parásitos, tal como se muestra para mitocondria, cloroplastos o Rickettsia? ¿Hasta qué punto los virus han sido autónomos e independientes de los metabolismos celulares originalmente -y contribuyeron al origen de las células? ¿Podrían haber perdido su autonomía más tarde y convertirse en parásitos? Los virus son minimalistas en su composición y deben haber sufrido reducciones genéticas estrictas (Flint, 2015). ¿Cuán pequeños pueden llegar a ser sus genomas? La mayoría de los virus ARN codificados todavía contienen elementos reguladores, ncRNA en las 3 y 5 regiones terminales para la entrada ribosomal, síntesis proteica, regulación transcripcional, y otros. Un subgrupo de retrovirus es un ejemplo interesante en cuanto a la pérdida simultánea y la ganancia de información genética. Los retrovirus oncogénicos o tumoresvirus pueden recombinarse con genes celulares que bajo los promotores de retrovirus pueden convertirse en oncogenes y conductores de cáncer. Alrededor de cien oncogenes han sido seleccionados en los laboratorios y estudiados durante La selección de las ventajas de crecimiento de las células huésped llevó al descubrimiento de los oncogenes que promueven el crecimiento más rápido que conocemos hoy en día, como Ras, Raf, ErbB o Myc, que son en parte objetivos exitosos para los medicamentos anticancerosos (Moelling et al., 1984). Estos oncogenes fueron en la mayoría de los casos tomados por los retrovirus a expensas de los genes estructurales (gag), replicando (pol) o envolvente (env), y a menudo se expresan como proteínas de fusión con Gag. Así, los retrovirus oncogénicos son virus defectuosos intracelulares obligatorios y fueron seleccionados para en el laboratorio por los investigadores para los oncogenes con la capacidad de crecimiento más potente promover. Necesitan el suministro de genes replicatorios en trans de virus ayudantes co-infectantes para infectar otras células (Flint, 2015) Algunas cepas del virus del sarcoma de Rous mantienen la replicación competente al transportar el src derivado de la célula (para el sarcoma) oncogén que codifica una proteína de 536 aminoácidos que aparentemente pueden encajar en la partícula retroviral junto con el genoma viral de tamaño completo (Broecker et al., 2016a). Razones espaciales pueden haber influido en la formación de retrovirus oncogénicos y limitado su tamaño y, por lo tanto, llevado a sus fenotipos defectuosos. Hay indicios de que la actividad incontrolada de (retro)transposones en las células germinativas puede resultar en enfermedades como la infertilidad masculina -presumiblemente por "catástrofe grave", causada por demasiados eventos de transposición. En los mamíferos, los piRNAs doman la actividad transpoon por medio de la actividad de la RNASa H de las proteínas PIWI durante la espermatogénesis (Girard et al., 2006). Sólo una minoría de virus son patógenos; la mayoría de ellos no causan enfermedades. Por el contrario, son más importantes como impulsores de la evolución, como transmisores de material genético, como agentes innovadores. En particular, los virus ARN son los más innovadores. Algunos de ellos son patógenos y peligrosos, como el VIH o el virus influenza, o los viroides en las plantas. Los virus ARN son capaces de cambiar tan rápidamente que el sistema inmunitario del huésped es incapaz de contrarrestar la infección. La patogenicidad surge cuando las condiciones ambientales cambian, por ejemplo, cuando un virus entra en un nuevo organismo o especie. El aumento de la complejidad celular por virus es una característica importante de la evolución. Tales cambios evolutivos importantes son tomados recientemente como argumentos en contra de la teoría evolutiva por Charles Darwin quien consideró cambios graduales, pequeños incrementos por mutaciones como la base principal para la selección y la evolución. Nueva crítica está abordando este pensamiento, considerando cambios más grandes como impulsores evolutivos. Tales cambios surgen por muchos fenómenos complejos tales como endosimbiosis, infección por procariotos, virus y hongos, recombinación de genes, HGT, infecciones, sexo. Cambios dramáticos tales como endosimbiosis o infecciones de patógenos extienden el concepto de Darwin de evolución. Hay numerosos ejemplos para la contribución de virus a la evolución de la vida desde por lo menos hasta 550 MYA (Hayward, 2017). Pero el ruido genético a través de mutaciones aleatorias no nos permite volver al origen de la vida. Por analogía, se puede especular que en algún momento los virus autónomos renunciaron a la independencia para una vida intracelular obligatoria -como se ha descrito para las mitocondrias y los cloroplastos, pero también las bacterias intracelulares como Rickettsia. Esta especulación se basa en el concepto de que la vida temprana debe haber comenzado simple y con alta variabilidad genética y luego se volvió más compleja. Pero la complejidad se puede renunciar a un estilo de vida menos consumidor de energía con genomas pequeños y alta velocidad de replicación (Moelling, 2012 (Moelling,, 2013 ). Por lo tanto, la pregunta puede repetirse: "¿Son los virus nuestros antepasados más antiguos?"Alguna vida fósil puede ser parcialmente reproducida in vitro por los experimentos de seguimiento de Spiegelman y Eigen, explicando el gran potencial de supervivencia del NCRNA simple. Los virus pueden ser patógenos, pero su reconocimiento como causa principal de enfermedades es Esta noción se basa en la historia de los virus en la medicina, como se explica en un libro titulado "Viruses: More Friends Than Foes" (Moelling, 2017). El escenario descrito aquí se centra en los virus como motores de la evolución. El mundo del ARN temprano se interesó hace 20-30 años, como lo demuestran las referencias anteriores. Sorprendentemente, hay científicos que todavía creen en la "hipótesis del pansperm" y piensan que los retrovirus son de origen extraterrestre (Steele et al., 2018). El interés reciente en el origen de la vida surgió de los exoplanetas recién descubiertos cuyo número aumenta diariamente -y que pueden ser tan numerosos como 10 25. Así, las estadísticas puras hacen que algunas personas crean que hay vida extraterrestre. La vida extraterrestre se imita en laboratorios en la Tierra con muchos supuestos -quizás esta El debate que aquí se presenta debe considerarse como un concepto de réplica simple y de entidades en evolución posiblemente derivadas de diferentes bloques de construcción en otros entornos, siendo la estructura más relevante que la secuencia.

¿En qué consisten las ribozimas?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Qué es el virus Chikungunya?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Qué conclusión se extrae de este informe?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era muy susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Qué es CHIKV?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Cómo se propaga CHIKV a los seres humanos?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Qué significa Chikungunya en swahili?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Qué es vectorizado por, en Asia?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

En el pico epidémico, ¿cuántos casos por semana había en la isla?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Qué es este detalle de revisión?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Cuántos genotipos de CHIKV han sido aislados?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Cuántos días es el período de incubación?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Por qué se caracteriza la etapa crónica?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Qué afecta a CHIKV?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Qué porcentaje de personas que sufren de la CHIKF tienen más de 65 años?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Qué porcentaje muere?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Qué es lo que es el vector de la gran epidemia en las Islas de la Reunión?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Qué porcentaje de la población se vio afectada?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Qué tiene habilitado el E1-A226V?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Qué se ha convertido en el vector preferido y letal?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Cuál se convirtió en el principal vector en el Océano Índico dentro de 1-2 años después de la introducción de CHIKV?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Cuál es la presencia de Ae.albopictus en América del Norte?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Qué porcentaje de recién nacidos fueron infectados por su madre?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Cuáles han sido algunos casos de transmisión de la madre al feto?

Chikungunya: ¿Una epidemia potencialmente emergente? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAutores: Thiboutot, Michelle M.; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahFecha: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Licencia: cc-byAbstract: El virus de Chikungunya es un patógeno emergente transmitido por mosquitos que tiene un impacto importante en En 2005-2007, y en 2007 en Europa, se han notificado grandes brotes en zonas del sudeste asiático y en varias de sus islas vecinas. Además, se han confirmado casos positivos en los Estados Unidos en viajeros que regresan de zonas de brotes conocidos. Actualmente, no hay vacuna ni tratamiento antiviral. Con la amenaza de una pandemia mundial emergente, los problemas peculiares asociados con las epidemias más inmediatas y estacionales justifican el desarrollo de una vacuna eficaz. En esta revisión, se resumen las pruebas que respaldan estos conceptos. Texto: El virus Chikungunya (CHIKV), un patógeno transmitido por mosquitos enumerado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) como patógeno prioritario de categoría C que causa la fiebre de Chikungunya (CHIKF), se ha propagado por toda Asia, África y partes de Europa en los últimos tiempos [1, 2, 3]. CHIKV es un virus transmitido por artrópodos (arbovirus) y se transmite a los seres humanos principalmente por Aedes aegypti, el infame propagador de la fiebre amarilla [4, 5]. La infección por CHIKV está marcada por un intenso dolor articular, contorsionando a sus víctimas en posturas inusuales [6]. La enfermedad recibe su nombre del lenguaje vernáculo de Kimakonde de Tanzania y Mozambique, y la palabra chikungunya significa ''lo que contorsiona o se dobla'' y se traduce en swahili a ''la enfermedad del caminante doblado'' [7, 8, 9]. En África, CHIKV se mantiene en un ciclo silvatico entre Aedes spp. mosquitos, primates salvajes, ardillas, aves y roedores (Figura 1 ) [10]. En Asia, la enfermedad es vectorizada por Ae. aegypti y Ae. albopictus [11]. La transmisión en Asia se produce en un ciclo urbano en el que el mosquito propaga la enfermedad de un ser humano infectado a un ser humano no infectado, siguiendo un patrón epidemiológico similar al de la fiebre del dengue [12]. La epidemia de CHIKV de 2005-2006 en las islas de la Reunión en el Océano Índico, estimuló el descubrimiento de una nueva especie vectorial, Ae. albopictus [5]. Esta epidemia, que destrozó más de un tercio de la población de la isla, alcanzó su nivel máximo de devastación entre enero y febrero de 2006, cuando más de 46.000 casos salieron a la luz cada semana, incluidas 284 muertes [5, 13]. Ae. albopictus es común en las zonas urbanas de los Estados Unidos y ya florece en 36 En consecuencia, esta revisión detalla detalladamente la epidemiología y la expansión global de CHIKV, describe sus características clínicas y patogénesis y sus síntomas y complicaciones, y finalmente nomina un posible enfoque de la vacuna contra la infección CHIKV. CHIKV ha sido aislado en tres genotipos basados en estudios filogenéticos. Estos genotipos, basados en las secuencias genéticas de una proteína Envelope (E1), son asiáticos, este/centro/sumafricanos y del África occidental [4, 11, 15]. Utilizando modelos filogenéticos, Cherian et al. estiman que el genotipo asiático de CHIKV surgió entre 50 y 310 años atrás, y los genotipos de África occidental y oriental divergieron entre 100 y 840 años atrás [15]. Desde entonces, CHIKV ha recorrido un largo camino, con varias mutaciones incorporadas, y ha continuado Las actividades recientes de CHIKV incluyen la epidemia de la India en 2005-2006, que fue seguida por una explosión repentina de casos en 2007. Se informó de que aproximadamente 1,3 millones de personas en 13 estados estaban infectadas en la India [12, 16], y CHIKV también estaba muy extendida en Malasia, Sri Lanka e Indonesia [17]. En julio-agosto de 2007, se informó de CHYKV en Italia, probablemente traídos por viajeros de regiones propensas a CHIKV de la India, África e islas del Océano Índico como Mauricio, Madagascar y Seychelles. Se encontró que pocos de los aislados italianos habían evolucionado a partir del aislado de Kerala, que estaba asociado con un cambio A226V en el gen E1 que representa una adaptación evolutiva exitosa en el vector de mosquitos similar a las observadas en la Isla Reunión [2, 18, 19]. Varios viajeros han traído a casa a CHIKV después de visitar zonas con poblaciones activamente infectadas [12, 20]. Estos casos han sido documentados en países europeos, Australia, Asia y los Estados Unidos [8, 21]. Los Estados Unidos ya han reportado al menos doce casos de CHIKV asociados a viajes, mientras que Francia ha reportado 850 casos, y el Reino Unido 93 [8, 14]. Además, los viajeros infectados por CHIKV también han sido diagnosticados en Australia, Bélgica, Canadá, República Checa, Guayana Francesa, Alemania, Hong Kong, Italia, Japón, Kenya, Malasia, Martinica, Noruega, Suiza y Sri Lanka [21]. Algunos viajeros eran virémicos, preocupantes funcionarios de salud pública sobre la propagación de CHIKV a nuevas áreas [1, 8]. El tiempo de incubación de CHIKV es relativamente corto, requiriendo sólo 2-6 d Vazeille et al. detectaron CHIKV en las glándulas salivales de Ae. albopictus sólo 2 d después de la infección [5]. Tras la infección, CHIKF tiende a presentarse en dos fases. La primera etapa es aguda, mientras que la segunda etapa, experimentada por la mayoría, pero no todas, es persistente, causando poliartritis incapacitante. Las características de la fase aguda incluyen un inicio brusco de fiebre, artralgia, y en algunos casos, erupción maculopapular [6, 23]. La fase aguda causa dolor articular y muscular tan intenso que hace muy difícil el movimiento y postra a sus víctimas [6, 20]. El noventa y cinco por ciento de los adultos infectados son sintomáticos después de la infección, y de éstos, la mayoría se incapacitan durante semanas o meses como resultado de la disminución de la dexteridad, pérdida de movilidad y Dieciocho meses después de la aparición de la enfermedad, el 40% de los pacientes todavía tienen IgM anti-CHIKV [6, 18, 23, 24]. El estadio crónico de CHIKF se caracteriza por poliartralgia que puede durar de semanas a años más allá de la etapa aguda [6]. CHIKV ha demostrado atacar fibroblastos, explicando la implicación de músculos, articulaciones y tejidos conectivos de la piel. El alto número de terminaciones nerviosas nociceptivas encontradas dentro de las articulaciones y tejidos conectivos musculares puede explicar el dolor asociado con CHIKF [25, 26]. Más del 50% de los pacientes que sufren de CHYKF grave son mayores de 65 años, y más del 33% de ellos mueren. La mayoría de los adultos que sufren de CHIKF grave tienen condiciones médicas subyacentes [6, 24, 27]. El otro grupo que es de Otras complicaciones asociadas con CHICKV, desde la más común hasta la menos común, incluyen insuficiencia respiratoria, descompensación cardiovascular, meningoencefalitis, hepatitis aguda grave, efectos cutáneos graves, otros problemas del sistema nervioso central e insuficiencia renal [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27]. CHICKV realiza un ciclo complejo de replicación tras la infección del huésped (Figura 2 ), lo que hace que su genoma sea susceptible a mutaciones [28, 29]. Por ejemplo, Ae. aegypti, responsable de epidemias en Kenia, Comoras y Seychelles, llevó CHICKV con una alanina en la posición 226 del gen E1 (E1-A226) [4, 18]. La población de la especie albopictus www.plosntds.org, resultó en una presión ecológica, favoreciendo la sustitución de la alanina en la posición 226 por la valina (E1-A226V) [5]. Esta mutación permitió que la especie vectorial secundaria de CHIKV, Ae. albopictus, suplementara a Ae. aegypti como su vector primario [5]. En un año, la mutación E1-A226V estaba presente en la Isla de la Reunión, y Ae. albopictus aparentemente vectoriaba la gran epidemia que infectaba al 34% de la población de La Reunión [5]. Todas las cepas CHIKV aisladas de Mayotte portaban la mutación E1-A226V, y la mutación también se encontró en Madagascar en 2007 [5]. La mutación E1-A226V no estaba presente al comienzo del brote de las Sin embargo, más del 90% de las cepas virales posteriores encontradas allí habían incorporado la mutación (diciembre-marzo de 2006), lo que indica un cambio de genotipo durante la temporada de invierno [5, 18, 20]. La mutación E1-A226V también permitió un aumento de la infectividad de Ae. albopictus en comparación con su infectividad de Ae. aegypti [4, 11, 18, 30], y con varios factores tomados juntos, Ae. albopictus se ha convertido en el nuevo vector preferido y más letal para CHIKV [4, 5, 11]. De hecho, Tsetsarkin et al. encontraron que un virus verde Fluorescente etiquetado E1-A226V era 100 veces más infeccioso para Ae. albopictus que para Ae. aegypti [4]. Albopictus se convirtió en el principal vector de CHIKV dentro de 1-2 años después de que CHIKV se introdujo en la región [31]. Cabe señalar que Ae. aegypti se ha establecido muy probablemente en América del Norte durante más de 300 años, mientras que Ae. albopictus ha estado en muchas áreas de los EE.UU., desde 1985, principalmente en Florida [32] y desde entonces ha ampliado su alcance en el país. Reiskind et al. se propusieron determinar si los mosquitos Ae. aegypti y Ae. albopictus capturados en Florida eran susceptibles a la infección por CHIKV por un aislado de La Reunión [32]. Cada mosquito probado era altamente susceptible a la infección por un clon infeccioso de larga duración del aislado de La Réunion Island, CHIKV LR2006 OPY1 cepa. Las cepas de albopictus eran más susceptibles a la infección, la ecología general y las diferencias en los patrones de mordedura humana necesitan ser estudiadas más adelante.Característicamente, hay dos rondas de traducción: (+) ARN genómico sensorial (49S9 = 11,7 kb) actúa directamente como ARNm y se traduce parcialmente (59 fin) para producir proteínas no estructurales (nsp's). Estas proteínas son responsables de la replicación y formación de un hilo complementario (2), la plantilla para la síntesis de hilos adicionales (+) La replicación subgenómica de ARNm (26 S = 4,1 kb) se produce a través de la síntesis de ARN intermedio de larga duración (2), que está regulada por nsp4 y p123 precursor en la infección temprana y más tarde por nsp maduro. El montaje se produce en la superficie celular, y el sobre se adquiere como brotes del virus de la célula y la liberación y maduración se produjo casi simultáneamente. La replicación se produce en el citoplasma y es muy rápida (,4 h) [28, 29]. doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org para obtener una comprensión más precisa de una posible epidemia de CHICV en los EE.UU. [32]. Durante el 7 d anterior al nacimiento, ninguna madre humana ha sido reportada para transmitir la enfermedad verticalmente. Sin embargo, cerca del 50% de los recién nacidos dados mientras la madre estaba infectada con CHICV contrajeron la enfermedad de su madre, a pesar del método de parto. Además, ha habido casos de transmisión de CHIKV de madre al feto causando enfermedad congénita y muerte fetal [33]. En un estudio similar realizado por Gerardin y otros, se reportaron diecinueve casos de infección neonatal asociada con viremia materna intraparto que progresó en el desarrollo de encefalitis debido a la transmisión vertical de madres infectadas [34]. Las similitudes clínicas y epidemiológicas con la fiebre del dengue dificultan el diagnóstico CHIKV, lo que puede llevar a los médicos a diagnosticar erróneamente CHIKV como fiebre del dengue; por lo tanto, la incidencia de CHIKV puede ser en realidad mayor de lo que se cree (Tabla 1 ) [6, 12, 35]. La cantidad de tiempo transcurrido desde el inicio de la enfermedad es el parámetro más crítico al elegir una prueba diagnóstica. CHIKV puede detectarse y aislarse cultivando con células de mosquito (C6/36), células de Vero (mammalianas) o en ratones [26]. Sin embargo, este método puede tomar al menos una semana y alcanzar una alta sensibilidad durante la fase virémica, que por lo general sólo dura hasta 48 h después de la picadura. Cinco días después de la infección, el enfoque de aislamiento viral La RT-PCR, por su parte, es un método más rápido y sensible que puede ser utilizado en la primera semana de inicio de la enfermedad [26], y actualmente es el método más sensible para detectar y cuantificar el ARNm viral [4, 36]. La detección serológica clásica, mediante ensayos como ELISA [37], inmunofluorescencia [5, 38], unión de complementos e inhibición de la hemaglutinación [39], constituye la segunda herramienta diagnóstica utilizada para el diagnóstico biológico de la infección por CHIKV. Estas técnicas probadas son útiles para la detección de antígenos en mosquitos durante estudios epidemiológicos. Estos ensayos detectan IgM e IgG específicos para el virus, sin embargo la sensibilidad y especificidad de estos ensayos ha sido poco caracterizada. La competencia viral, o el potencial de infección y transmisión viral, es un parámetro importante que puede cuantificarse por ELISA Los biomarcadores mostraron una infección grave por CHIKV [40]. Encontraron disminución de los niveles de RANTOS y aumento de los niveles de Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-1b (IL-1b) que podrían ser demandados por detección de CHIKV en pacientes como indicadores de tormenta de citoquinas impulsadas por CHIKV. Couderc et al. demostraron otra citocina, tipo I IFN, como agente clave en la progresión a infección por CHIKV [26]. Utilizando un modelo de ratón nulo IFN-a/b, demostraron evidencia de músculos, articulaciones y piel como objetivos privilegiados de CHIKV, lo cual es consistente con patología humana. Aunque Ng et al. concluyeron que los niveles de RANTOS fueron significativamente suprimidos en pacientes CHIKF graves [40], curiosamente, se ha observado un aumento Dado que los síntomas de CHICF imitan los de la fiebre del dengue, los resultados obtenidos de este estudio sugieren fuertemente que los RANTOS podrían ser un biomarcador potencial distintivo que diferencia entre estas dos enfermedades clínicamente similares. No hay tratamientos antivirales aprobados actualmente disponibles para CHICV [1, 3, 12, 42]. Actualmente, CHICF se trata sintomáticamente, por lo general con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o esteroides, reposo en cama y líquidos. Se cree que el movimiento y el ejercicio suave disminuyen la rigidez y la artralgia matutina, pero el ejercicio pesado puede exacerbar los síntomas reumáticos. Los corticosteroides se pueden utilizar en casos de infección crónica por CHICKV debilitante. Hay un debate sobre la conveniencia de la cloroquina como tratamiento para la artritis antiinflamatoria no resuelta, no esteroidea [43]. Un estudio mostró que la producción viral se redujo drásticamente en www.plosntds.org a 16 h después de la infección después del tratamiento con 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-clorometilcetona), un inhibidor de la furina [42, 44]. La cloroquina actuó elevando el pH, bloqueando la entrada del virus en la célula dependiente de bajo pH. Es importante señalar que dec-RVKR-cmk o cloroquina sólo inhibió la propagación viral de células a células, no la replicación de CHICKV una vez que entró en la célula [43]. Sin embargo, la mayoría estaría de acuerdo en que el mejor arma contra CHIKV es la prevención. Una vacuna CHIKV en vivo desarrollada por los Estados Unidos alcanzó la fase II de ensayo clínico que abarcó a 59 voluntarios sanos [45] Ocho por ciento de los voluntarios experimentaron artralgia transitoria, mientras que el 98% de los voluntarios tuvieron seroconversión [45]. Sin embargo, las vacunas CHIKV vivas son todavía cuestionables. No se puede descartar el riesgo de una vacuna viva posiblemente induciendo reumatismo crónico. Además, existe la cuestión de si el uso generalizado entre el público podría desencadenar la transmisión de mosquitos o conducir a una infección crónica o reversión viral [1]. Un enfoque alternativo sería producir una vacuna quimérica contra CHIKV. Wang et al. desarrollaron una vacuna contra el alfavirus quimérico que es uniformemente atenuada y no causa reactogenicidad en ratones [3]. Tres versiones diferentes de esta vacuna se hicieron utilizando tres vectores de columna vertebral diferentes: la encefalitis equina venezolana (VEEV) cepa vacuna atenuada T-83, el virus de la encefalitis equina oriental En resumen, las proteínas estructurales de CHIKV fueron diseñadas en las espinas vertebrales de las vacunas mencionadas para producir las quimeras [3]. Estas quimeras fueron encontradas para estimular una fuerte inmunidad humoral, e incluso a dosis de 5,3-5,8 log 10 PFU, no desencadenaron reactogenicidad. Cuando los ratones vacunados fueron desafiados con CHIKV, ni ratones adultos ni neonatales aumentaron de peso, tuvieron fiebre, o mostraron signos de enfermedad neurológica. Al comparar las quimeras con la vacuna Ejército181/25, la vacuna Ejército resultó en niveles más altos de viremia y replicación en las articulaciones de ratones neonatales. Debido a que las articulaciones son blanco conocido de CHYKV, Wang et al. señalaron que su vacuna podría evitar los efectos secundarios reactivos negativos de la vacuna Ejército. Después de ser vacunada subcutáneamente con 5,3-5,8 log 10 PFU de Las quimeras VVEV y VEEV dieron títulos de anticuerpos neutralizantes más altos que las quimeras SINV sin ser más virulentas. Además, las quimeras VVEV y VEEV CHIKV parecían ser más inmunogénicas que la vacuna del Ejército a pesar de la menor viremia y replicación de las quimeras en las articulaciones de ratones neonatales [3]. Tiwari et al. [46] adoptaron una estrategia diferente utilizando CHIKV inactivado formal en combinación con alhidrogel (Aluminum Hydroxide) como adyuvante. Este estudio sugiere claramente que esta vacuna provoca respuestas inmunes humorales y celulares en ratones, proporcionando su potencial inmunogénico. Un estudio reciente de Couderc et al. [47] mostró la inmunización pasiva como un tratamiento potencial para la infección por CHIKV. Utilizando inmunoglobulina purificada extraída de pacientes con CHIKV convalecientes, demostraron una actividad neutralizante efectiva frente a la infección por CHIKV tanto in vitro como in vivo, lo que establece un potencial abordaje preventivo y terapéutico para combatir la infección por CHIKV. Los estudios de patogénesis realizados con virus alfa relacionados, como RRV, han demostrado el papel de los macrófagos en la persistencia de la infección [48]. También demostraron el papel de las células CD8 T específicas del RRV en la eliminación de la carga viral en pacientes infectados, lo que justifica investigaciones similares con CHIKV y la importancia de investigar una vacuna basada en la respuesta inmune mediada por células contra CHIKV [49]. Siempre hay ciertos riesgos asociados con vacunas virales vivas atenuadas o inactivadas [50]. Una manera de evitar estos problemas potenciales es construir una vacuna de ADN basada en consenso Una consecuencia de la rápida evolución de CHIKV es la dificultad para construir una vacuna que sea capaz de alcanzar la Figura 3. Niveles de IgG específicos de CHIKV en ratones inmunizados con vacunas CHIKV. Cada grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) fue inmunizado con 12,5 mg de vector de control de pVax1 o plásmidos de vacuna CHIKV como se indica en 0 y 2 wk. Los ratones se sangraron 2 wk después de cada inmunización, y el suero de cada grupo se diluyó a 1:100 y 1:500 para reacción con construcciones específicas de vacuna. Se incubaron suero durante 1 h a 37uC en placas de 96 pocillos recubiertas con 2 mg/ml de péptidos CHIKV respectivos, y se detectó anticuerpo utilizando IgG-HRP antimouse doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org protege eficazmente a grandes poblaciones de múltiples cepas del virus. Una de las fortalezas de las vacunas de ADN consensuadas es su capacidad de inducir respuestas inmunitarias reactivas cruzadas contra los tres grupos filogenéticos distintos de CHICKV. También las vacunas basadas en el ADN se pueden producir más rápidamente que las vacunas basadas en proteínas. Recientemente, Muthumani et al. construyeron una vacuna que se demostró que induce tanto la inmunidad humoral como celular in vivo en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 wk de edad [49]. Estos ratones fueron inmunizados utilizando un método de electroporación in vivo para entregar la vacuna al músculo cuadriceps. Para diseñar el constructo, alinearon 21 secuencias de CHIKV aisladas entre 1952 y 2006, utilizando cepas de diferentes países, incluyendo Isla La Reunión. El nucleótido más común entre las secuencias fue elegido en cada posición para ser utilizado en el constructo de consenso, teniendo cuidado de no alterar el marco de lectura. Realizaron optimización de codón y ARN, agregaron una secuencia de Kozak fuerte, y sustituyeron el péptido de señal con una secuencia líder de inmunoglobulina E para mejorar la eficacia de la vacuna. Después de inmunizar a los ratones, se recolectaron bazos junto con suero y se probaron para determinar el título de anticuerpos. Después de tres inmunizaciones, se demostró que las vacunas de consenso E1, E2 y C inducen respuestas inmunes de células T que conducen a respuestas fuertes IFN-c y proliferación en ratones C57/BL6. Además, en comparación con los ratones de control, los ratones inmunizados tenían niveles totales de IgG más altos, así como anticuerpos específicos anti-E1, específicos anti-E2 y anti-C específicos IgG, sugiriendo una fuerte respuesta inmune humoral (Figura 3 ) y también especificidad para los antígenos codificados en los constructos de la vacuna (Figura 4 ). Debido a sus resultados prometedores y la necesidad de una vacuna más segura, esta vacuna de consenso ADN merece una investigación adicional. Determinar la longevidad de los efectos protectores de la vacuna y la persistencia de anticuerpos y respuestas IFN-c podría ser el siguiente paso de la investigación. También se deben realizar estudios cuestionados de ratones inmunizados. La enfermedad transmitida por mosquitos CHIKV ha causado brotes masivos durante al menos medio siglo, pero ya no se limita a los países en desarrollo www.plosntds.org. Comenzó a Como resultado, la NIAID ha designado a CHIKV como patógeno de categoría C junto con los virus de la gripe y el SARS-CoV [3]. La comprensión de la gravedad potencial de esta enfermedad es exigente; por ejemplo, si se utiliza como arma biológica, la economía mundial podría quedar gravemente debilitada; si suficientes miembros de las fuerzas armadas se infectaran durante un despliegue militar, las operaciones militares podrían verse afectadas significativamente. Los esfuerzos para vigilar la enfermedad sólo proporcionarán una advertencia mínima en una sociedad mundial, y las medidas para prevenir la morbilidad y mortalidad asociadas con pandemias son imprescindibles [21, 31]. A pesar de la gravedad de su potencia infecciosa y el temor de que sea un arma biológica potencial, en la actualidad no hay vacuna contra las infecciones por CHIKV. En 2000 se llevaron a cabo ensayos con vacunas atenuadas en vivo, pero se suspendió la financiación del proyecto. A pesar de la baja respuesta de anticuerpos a las vacunas de ADN, otras numerosas ventajas han eclipsado estos inconvenientes menores (Tabla 2), siendo la más importante la capacidad de inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares [51, 54]. A juzgar por el éxito reciente, como el constructo inmunogénico desarrollado por Muthumani et al., las vacunas de ADN podrían jugar un papel importante en la lucha contra la CHIKV [49]. Las vacunas son literalmente un componente crítico del control de la enfermedad de CHIKV y, por lo tanto, la investigación en esta área es muy alentadora. La dramática propagación de los virus del dengue (DEV) por toda la América tropical desde 1980 a través de los mismos vectores y hospedadores humanos subraya el riesgo para la salud pública en las Américas. Los eventos adversos asociados con la vacuna viva actual están bien documentados [55]. Teniendo en cuenta estos inconvenientes, se deben realizar esfuerzos serios para desarrollar nuevas estrategias que prevengan la propagación y las complicaciones.

¿Cuál es la designación NIAID de CHIKV?

Los trabajadores sanitarios indican una mala preparación para el brote de la enfermedad por el virus del Ébola en la región de Ashanti de Ghanahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5461762/SHA: f8efe7295a7cf875c8a695df3e87a42e651ce60dAutores: Annan, Augustina Angelina; Yar, Denis Dekugmen; Owusu, Michael; Biney, Eno Akua; Forson, Paa Kobina; Okyere, Portia Boakye; Gyimah, Akosua Adumea; Owusu-Dabo, EllisFecha: 2017-06-06DOI: 10.1186/s12889-017-4474-6Licencia: cc-byAbstract: Aunque Ghana no registró (y todavía no ha registrado) ningún caso, y varios trabajadores de la salud han recibido numerosos planes de capacitación, no hay registro de ningún estudio que evaluara la preparación de los trabajadores de la salud (HCWS) con respecto a la EVD y cualquier enfermedad propensa a la emergencia en Ghana. Por lo tanto, se realizó un estudio interseccional basado en hospitales con 101 HCW de dos instalaciones en Kumasi, Ghana para evaluar el nivel de preparación de los HCW para responder a cualquier posible EVD. MÉTODOS: Se administró un cuestionario cara a cara utilizando una lista de verificación adaptada de la OMS (2015) y los CDC (2014) para la preparación para el ébola y se evaluaron las lagunas generales de conocimientos, y la preparación de los HCW ghaneses en determinados centros de salud de la región de Ashanti de Ghana de octubre a diciembre de 2015. RESULTADOS: Sólo el 25,74% (n = 26) consideró que sus instalaciones estaban suficientemente equipadas para manejar y manejar a los pacientes con EVE. Cuando se les preguntó qué desinfectante usar después de atender y cuidar a un paciente sospechoso con EVE, sólo el 8,91% (n = 9) pudo identificar correctamente el desinfectante adecuado (χ(2) = 28,52, p = 0,001). CONCLUSIÓN: Nuestro estudio demuestra que muchos HCWs no están bien preparados y no están dispuestos a atender a la EVE. Más allá de la adquisición de conocimientos, existe la necesidad de más entrenamiento de vez en cuando para preparar plenamente a los HCWs para manejar cualquier posible caso de EVE. Texto: Durante el último brote de EVEs y su consiguiente epidemia masiva con una mortalidad muy alta [1], muchos sistemas y servicios de salud en África Occidental fueron abrumados e interrumpidos. Esto se debió en parte a que los sistemas de salud pobres y débiles, junto con los trabajadores de primera línea no preparados y no calificados (HCWs), se vieron agravados por la mala comprensión de la dinámica de la enfermedad vinculada a la falta de recursos necesarios.Durante la primera parte de 2014, la aparición de EVE [1] en Guinea, sacudió a los sistemas de atención de la salud de la subregión de África occidental, cobrando más de 9800 vidas [2] incluyendo más de 491 (58,7%) muertes de HCWs a causa de 839 infecciones [2]. Por lo tanto, esta epidemia reforzó el hecho de que los HCWs están en alto riesgo de infectarse con la enfermedad de acuerdo con sus funciones básicas. Los estudios realizados en Nigeria, Guinea y la India indican el bajo nivel de conocimiento, actitud negativa y prácticas deficientes que pueden eliminarse mediante la formación continua de los trabajadores humanitarios, así como el suministro de los recursos necesarios y adecuados en el cumplimiento de sus obligaciones [3] [4] [5]. Los países más afectados fueron Liberia, Sierra Leona, Guinea y varios otros países con casos importados [7]. Al igual que la mayoría de los países de África occidental, Ghana estaba en alta alerta y era el número uno en la lista de países considerados de alto riesgo de EVD. Así, el país trató de hacer algunos preparativos a raíz de la epidemia [8]. El Gobierno, con el apoyo de organizaciones donantes como la Organización Mundial de la Salud (OMS), Médicos sin Fronteras (MSF) puso en marcha recursos para la formación de profesionales de la salud y algún nivel de reequipamiento de los hospitales y preparación de los trabajadores sanitarios ante posibles situaciones de emergencia. Varios HCW recibieron capacitación teórica y práctica sobre cómo manejar a las personas infectadas y afectadas. Estas sesiones de capacitación tomaron la forma de entrenamiento in situ y fuera del sitio, así como talleres. También se realizaron ejercicios de simulación para demostrar cómo reaccionarían los HCW durante los escenarios de emergencia del EVD. Por ejemplo, el gobierno alemán a través del Centro Kumasi para la Investigación Colaborativa en Medicina Tropical organizó la capacitación de varios nacionales de África Occidental sobre toma de muestras, pruebas de muestreo y uso y doffing de equipo de protección personal (http://kccr.org). Más importante aún, hubo la construcción de tres centros de tratamiento y también, un servicio de ambulancias de reserva para el transporte de casos confirmados a los centros de tratamiento. Por cierto, Ghana no registró ningún caso a raíz de la epidemia y hasta ahora no ha registrado ningún caso de EVD. Sin embargo, la respuesta de HCW a los escenarios identificó varias lagunas. Después de una serie de cursos de formación para los trabajadores sanitarios, se podría suponer fácilmente que los trabajadores de la salud están adecuadamente preparados y equipados con los conocimientos y habilidades necesarios para hacer frente a cualquier posible brote de EVD. No está claro, por ejemplo, en qué medida se practicaron estos ejercicios y durante cuánto tiempo se hicieron parte de las actividades hospitalarias de rutina. Por lo tanto, se pregunta qué tan bien preparados están los trabajadores de la salud en Ghana para responder no sólo a la EVD sino a otras enfermedades propensas a epidemias (EPD) que requieren un enfoque concertado de preparación y gestión. Aunque se han invertido algunos recursos en respuesta al susto del EVD en Ghana, no se ha realizado ninguna evaluación sobre la preparación de los trabajadores de la salud ante posibles situaciones de emergencia. En consecuencia, si el personal sanitario carece de los conocimientos básicos, prácticos y organizativos necesarios para planificar y responder a esas situaciones de emergencia, no sólo sería un fracaso para sí mismo, sino también para la población en general, como fue el caso de la reciente epidemia en África occidental. Es importante, por ejemplo, comprender la dinámica de lo que impulsará a un HCW a estar dispuesto a poner su vida en el cumplimiento de su deber en un caso de EVE. Por lo tanto, es fundamental comprender la preparación actual del trabajador sanitario en Ghana para formular recomendaciones para la formación y planificación futuras de cualquier situación epidémica. Por lo tanto, es necesario que Ghana disponga de datos empíricos sobre la preparación general para emergencias para determinar y comprender las lagunas de conocimientos, y evaluar los conocimientos frente a la práctica en un intento de proporcionar orientación para las políticas, no se puede exagerar. En vista de esto, se evaluó el nivel de preparación, preparación y conocimiento de la respuesta de emergencia de EVD entre una población de trabajadores de la salud (HCWs) en la Metrópolis de Kumasi de la región de Ashanti, Ghana. Realizamos un estudio hospitalario basado en secciones transversales entre los trabajadores de la salud en los hospitales gubernamentales de Kumasi Sur y Suntreso designados como "unidad de retención avanzada para el ébola" y "equipo permanente de Ébola", respectivamente, en la Metrópolis de Kumasi. Los hospitales de Kumasi Sur y Suntreso tienen una asistencia mensual media del Departamento de Pacientes Fueras (DOP) de unos 20.603 y 11.712 pacientes, respectivamente, y personal de salud de aproximadamente 450 personas cada uno. Organizamos un día de capacitación para nuestros asistentes de investigación sobre cómo utilizar el dispositivo Personal Digital Assistant (PDA) Nota Samsung Galaxy 8 GT-N5100 (Samsung Electronics Co. Ltd., Seúl, Corea) en la captura de datos. La versión original del cuestionario fue preprobada, con cinco trabajadores sanitarios que eran similares en sus características a los miembros de la población del estudio pero fuera del área de jurisdicción y estudio para asegurar la validez y sesgo de medición. El cuestionario fue revisado a partir de las sugerencias y comentarios (principalmente sobre cómo se habían construido las preguntas) obtenidos del piloto. Esta fue la herramienta final y validada de captura de datos utilizada durante el estudio. En ambas instalaciones, contactamos a los Superintendentes Médicos para obtener permiso para asistir a sus reuniones matutinas para explicar los propósitos y objetivos del trabajo a los HCWs. Durante este tiempo, los HCWs Algunas de las preguntas formuladas incluyeron el organismo responsable de la EVD, el modo de transmisión de la enfermedad, la preparación del HCW para manejar cualquier caso de EVD y otras características clínicas tempranas de la infección. Al estimar el tamaño de la muestra para este estudio, los datos previos del hospital indican que hay aproximadamente 900 HCW en las dos instalaciones. Suponiendo un intervalo de confianza del 95% y si el 70% de estos HCW entrara en contacto con un caso sospechoso de EVD, permitiendo una tasa de error del 10%, aproximadamente 87 HCW proporcionarían un poder de estudio por defecto del 80% y un alfa del 5%. Con aproximadamente una tasa de no respuesta del 15% nos permitiría tomar muestras de 101 HCW de las dos instalaciones que prestaban servicios de emergencia dentro de la región de Ashanti de Ghana. Por lo tanto, cualquier trabajador sanitario que atendiera directamente a pacientes en situación de emergencia era elegible para ser incluido en el A partir de esta lista, tomamos una muestra aleatoria sistemática de todos los trabajadores de salud elegibles para representar el tamaño de la muestra. Después de obtener el consentimiento informado por escrito indicado por la firma y o la huella dactilar de los participantes, luego administramos los cuestionarios dentro de las dos instalaciones. Utilizamos la Lista de verificación OMS (2015) y CDC (2014) para la preparación para el ébola que proporciona sugerencias prácticas y específicas para asegurar que los centros de salud puedan ayudar a su personal a detectar posibles casos de ébola, proteger al personal y responder adecuadamente [9, 10]. Esta lista de verificación incluyó la evaluación, el conocimiento y la preparación de las instalaciones de los HCW. Sobre la base de estas listas, desarrollamos un cuestionario para determinar el conocimiento general y la preparación de los HCW ghaneses sobre el brote de EVD. Nuestro cuestionario fue administrado a partir de un PDA y registró la demografía, preparación Las respuestas a estas preguntas fueron necesarias por parte de los HCWs para determinar el acceso a la información sobre EVD entre los HCWs, su conocimiento sobre EVD y la forma de compensación que los HCWs piensan que sería apropiado al atender el caso de EVD entre otros. Los datos fueron recolectados electrónicamente utilizando tabletas para almacenamiento en la nube a través de CommCare ODK versión 2.27.2, agregados al archivo Microsoft Excel, exportados a la versión STATA 14 y analizados. Se utilizaron estadísticas descriptivas para resumir la distribución de diversas variables en tablas y figuras. Las variables categóricas fueron analizadas utilizando pruebas quirquare y regresión logística para asociaciones. Antecedentes de los participantes en el estudio Tabla 1 muestra las características de fondo de los participantes del estudio. Fueron entrevistados un total de 101 participantes del estudio, de los cuales 85 (84,16%) eran mujeres. La mayoría (54,46%) de los encuestados estaban casados; un total de 52,48% (53) había estado ejerciendo su profesión durante menos de 5 años (SD = 9,22 ± 10,52 años). En ambos centros, el 75,25% (76) de los encuestados había estado trabajando en el centro durante menos de 5 años (SD = 4,04 ± 4,07 años). La tabla 2 muestra el conocimiento y la conciencia de los participantes sobre la EVE. De los 101 HCW entrevistados, el 83,17% (n = 84) identificó correctamente la causa de la EVE, el 13,86% (n = 14) no conocía la causa, mientras que el 2,97% (n = 3) etiquetaba incorrectamente la causa como una bacteria. Un total de 72 (71,29%) HCW indicaron que los medios de comunicación, especialmente la radio, eran la principal fuente de información cuando se les preguntó dónde habían oído hablar por primera vez de EVE, lo que fue significativamente mayor que otras fuentes (χ 2 = 45,44, p < 0,05). Cuando se les preguntó qué laboratorio de nivel de bioseguridad (BSL) se requería para probar muestras de pacientes sospechosos de EVE, un total de 19 (18,81%) indicaron BSL-3, de los cuales 11 (10,89%) eran Médicos, mientras que 8 (7,92) y 1 (0,99%) eran Enfermeras y Auxiliares Médicos, respectivamente. Otros 76 (75,25%), de los cuales 9 (8,91%) eran médicos, 62 (61,39%) Enfermeras Cuando se les preguntó qué desinfectante usar después de atender y atender a un paciente sospechoso de EVE, sólo el La preparación para un brote de EVE por la categoría HCW Tabla 3 muestra los niveles de preparación de los HCW para manejar y manejar el brote de EVE. Cuando se preguntó a los HCW si consideraban que sus instalaciones estaban suficientemente equipadas para manejar y manejar a los pacientes con EVE, el 25,74% (n = 26) respondió afirmativamente, mientras que el 54,46% (55) indicó lo contrario. De esto, 14 (13,86%) fueron médicos, 39 (38,61%) enfermeros y 2 (1,98%) fueron AP (χ 2 = 2,66, p = 0,62). Si se infectaron accidentalmente con EVE después de atender a un paciente con EVE, 98 (97,03%) de los encuestados indicaron que aceptarían estar aislados (χ 2 = 4,69, p = 0,321). Mientras tanto, el 44,55% (n = 45) de los HCW atender Un total de 92 (91.09%) HCWs encuestados indicaron que no estaban adecuadamente entrenados para manejar un caso sospechoso de EVE. Cuando se les pidió que evaluaran su competencia en el manejo de un paciente sospechoso de EVE, 18.81% (n = 19) indicaron que tenían poca confianza y competencia, mientras que 6,93% (n = 7) indicaron que estaban extremadamente seguros de manejar un caso sospechoso de EVE (χ 2 = 13.09, p = 0.11). Más allá de la EVE, pedimos a nuestra población de la encuesta que nombrara otras enfermedades propensas a la epidemia. Del total de HCWs entrevistados, 56.43% (57/101) mencionaron enfermedades epidémicas de origen bacterial como tuberculosis y cólera. Otro 33,70% (34/101) llamaron enfermedades de origen viral como SARS, gripe, VIH, fiebre de Lassa y dengue, mientras que 9,90% (10 Cuando se les preguntó la forma de compensación que los HCW consideraban apropiada cuando se ocupaban de un paciente sospechoso de ébola, las respuestas recibidas incluían el seguro personal (32/101), la indemnización familiar en caso de muerte (31/101), el dinero (30/101) y los premios (8/101), mientras que otros también sugirieron la promoción del empleo (7/101), y otros (18/101). Nuestra población de la encuesta recomendó la provisión de logística y capacitación como dos cuestiones clave en el camino a seguir para preparar adecuadamente a los HCW hacia cualquier enfermedad propensa a la epidemia. Si bien se tiene constancia de que el reciente brote de EVD registró una mortalidad muy alta entre los HCW, según sabemos, sólo unos pocos estudios han abordado estas cuestiones en previsión de un brote de EVD, particularmente en países no afectados por la epidemia de EVD y especialmente en el África subsahariana, este estudio es casi inexistente. Por lo tanto, nuestro estudio evaluó cómo los HCW preparados están frente a una posible epidemia de EVD. Los resultados de esta encuesta mostraron que más de la mitad (54,46%) de los HCW indicaron que sus instalaciones no estaban listas para tratar casos de EVD. Casi el 92% indicaron que no estaban adecuadamente entrenados para manejar un caso sospechoso de EVD y no es sorprendente que menos del 50% indicaran que estarían dispuestos a atender a un paciente sospechoso. Además, casi un tercio de los HCW también querrían un seguro para sí mismos y sus familias en caso de que estuvieran infectados Estos resultados son claramente indicativos de lo mal preparados que están los HCW encuestados en la cara de una enfermedad propensa a la epidemia potencialmente mortal, como la EVD en Ghana. En este estudio, sólo el 25,7% de los HCW dijeron que sus instalaciones estaban suficientemente equipadas para manejar un brote de EVD. Tales bajas calificaciones de los hospitales por la mayoría de los HCW son una marca de falta de confianza en sus instalaciones de preparación y esto puede indicar una verdadera falta de preparación y preparación de los hospitales para manejar no sólo los casos de EVD sino otras enfermedades potencialmente propensas a epidemias. Alternativamente, también podría significar que los HCW eran probablemente inconscientes de los trabajos preparatorios y reequipamiento de sus instalaciones para manejar la situación de los brotes de EVD. La disposición a trabajar durante brotes y emergencias se considera un sentido del deber incluso frente al riesgo. En este estudio, menos del 50% de los HCW indicaron su Además, más de un tercio indicó varias formas de compensación para sí mismos o las familias en caso de muerte o mientras se ocupa de un caso de EVD, lo que implica que si los HCWs están seguros o garantizados de que ellos y sus familias serían atendidos en caso de muerte o mientras se ocupan de un caso de EVD, trabajarán de buena gana frente a cualquier escenario de emergencia. La suposición es que los HCWs trabajarían de buena gana frente a una emergencia de enfermedades infecciosas y responderían adecuadamente; sin embargo, hay evidencias de que los HCWs evitan este "deber sagrado" en el cuidado de los pacientes y dejarían a los pacientes vulnerables en tiempos de crisis [11]. Para evitar que los HCW se infecten mientras están obligados a trabajar incluso frente al riesgo personal que exigen sus códigos de ética y profesionalismo, es imperativo asegurar que se cumplan las normas convencionales, garantías y prácticas de salud pública adecuadas para que los HCW puedan responder a tales brotes de manera que no estén infectados y o afectados a pesar de los riesgos que puedan enfrentar y seguir enfrentando [12]. Así, el entrenamiento adecuado de los HCW como lo indicaron los encuestados durante el estudio, junto con la reequipación de algunos centros de salud, es muy crítico para asegurar que estén equipados con los conocimientos y herramientas necesarios para trabajar frente a cualquier epidemia. El conocimiento general de la EVD es crucial para responder adecuadamente y atender a los pacientes. Casi el 17% de nuestra población de estudio no pudo identificar que la EVD es causada por un virus. Menos del 10% pudo identificar correctamente el 0,5% de hipoclorito de sodio como el mejor desinfectante de las muchas opciones proporcionadas, lo que contradice fuertemente un estudio similar realizado en Conakry durante el pico de la epidemia, donde el 68% de los HCW conocían la concentración correcta de desinfectante [5]. Aunque no intentan comparar estos dos escenarios, esta información puede ser vital para la comprensión de que el conocimiento de los HCW en la prevención de infecciones y medidas de control es crítico en su cumplimiento de su deber. Este estudio mostró que la mayoría de los HCWs escucharon por primera vez de EVD a través de los medios de comunicación, especialmente la radio. Esto establece el papel crucial que juegan los medios de comunicación en informar a la población general en tales brotes de enfermedad. A pesar del pluralismo de los medios de comunicación, sigue incumbiendo a las instituciones e instalaciones de salud organizar una formación especial sobre cualquier enfermedad infecciosa emergente que se produzca a nivel mundial para actualizar los conocimientos de los HCW. El aislamiento es una medida de salud pública clave para prevenir la propagación de enfermedades infecciosas. En este estudio, más del 97% de los HCW indicaron su voluntad de cumplir y aceptaron ser aislados en caso de que se infectaran después de atender a un paciente sospechoso de EVE. Sin embargo, una pequeña proporción de los HCW encuestados declararon que serían muy infelices, y esto podría afectar en última instancia al cumplimiento. El aislamiento es uno de los métodos más antiguos de control de brotes de enfermedades transmisibles para los pacientes [13]. Sin embargo, cabe señalar que menos del 50% dijeron que estarían dispuestos a atender a un paciente sospechoso de EVE y sospechamos que podría estar relacionado con el temor a la seguridad personal [14]. La respuesta de emergencia de una enfermedad epidémica propensa a un virus o patógeno exótico provocará naturalmente cierto nivel de miedo y escepticismo entre cualquier grupo de individuos, especialmente cuando su conocimiento sobre la dinámica del brote de la enfermedad es bajo. Hay historias de HCW que han evitado la responsabilidad de tratar a algunos pacientes [15] y esto se puso de manifiesto en el VIH/SIDA y el síndrome respiratorio agudo grave-Coronavirus (SARS-CoV) durante los años 1980 y 2003, respectivamente, donde el miedo al contacto con pacientes sospechosos e infectados apretó a algunos HCW [16, 17]. A la larga, este temor probablemente afectaría su confianza y compromiso con la profesionalidad. Los resultados de este estudio apuntan al hecho de que el conocimiento y la provisión de herramientas como el equipo de protección del personal (EPP) y otras logísticas por sí solas no son suficientemente buenas. El punto de vista general es que la devoción del país a su personal de salud puede ser un factor contributivo en todo esto y no puede ser ignorado. Sin embargo, inspirarse en los HCW y sentirse seguro en el cuidado de tales brotes de enfermedades altamente infecciosas es crítico. Durante nuestro estudio, los HCW indicaron varias formas de compensación que se les pagarían si fueran afectados en el caso del ataque de EVD. Este estudio tenía algunas limitaciones inherentes. Este estudio fue un estudio exploratorio y el tamaño de nuestra muestra fue limitado. Por lo tanto, aunque no tratamos de generalizar los resultados, somos de la opinión de que esto puede ser un reflejo de los HCW en general. Además, ya que nuestro estudio se centró principalmente en dos instalaciones de salud, de nuevo tenemos cuidado en extrapolarlos a otros para reflejar otras instalaciones. Además, como esto no ha sido una experiencia real, y una encuesta basada en cuestionarios, las respuestas pueden no reflejar A pesar de estas limitaciones, la necesidad de capacitación fue fuerte entre los HCW. Los resultados demuestran aún más la falta de preparación de los centros de salud, y la gran proporción de HCWs renuentes a atender a un caso sospechoso de EVE. Esto requiere esfuerzos concertados de las instituciones e instalaciones de salud para equipar y preparar a los HCWs con los instrumentos y conocimientos necesarios y asegurar la competencia para manejar cualquier enfermedad propensa a epidemias.

¿Cuántas instalaciones fueron monitoreadas en este estudio?

Los trabajadores sanitarios indican una mala preparación para el brote de la enfermedad por el virus del Ébola en la región de Ashanti de Ghanahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5461762/SHA: f8efe7295a7cf875c8a695df3e87a42e651ce60dAutores: Annan, Augustina Angelina; Yar, Denis Dekugmen; Owusu, Michael; Biney, Eno Akua; Forson, Paa Kobina; Okyere, Portia Boakye; Gyimah, Akosua Adumea; Owusu-Dabo, EllisFecha: 2017-06-06DOI: 10.1186/s12889-017-4474-6Licencia: cc-byAbstract: Aunque Ghana no registró (y todavía no ha registrado) ningún caso, y varios trabajadores de la salud han recibido numerosos planes de capacitación, no hay registro de ningún estudio que evaluara la preparación de los trabajadores de la salud (HCWS) con respecto a la EVD y cualquier enfermedad propensa a la emergencia en Ghana. Por lo tanto, se realizó un estudio interseccional basado en hospitales con 101 HCW de dos instalaciones en Kumasi, Ghana para evaluar el nivel de preparación de los HCW para responder a cualquier posible EVD. MÉTODOS: Se administró un cuestionario cara a cara utilizando una lista de verificación adaptada de la OMS (2015) y los CDC (2014) para la preparación para el ébola y se evaluaron las lagunas generales de conocimientos, y la preparación de los HCW ghaneses en determinados centros de salud de la región de Ashanti de Ghana de octubre a diciembre de 2015. RESULTADOS: Sólo el 25,74% (n = 26) consideró que sus instalaciones estaban suficientemente equipadas para manejar y manejar a los pacientes con EVE. Cuando se les preguntó qué desinfectante usar después de atender y cuidar a un paciente sospechoso con EVE, sólo el 8,91% (n = 9) pudo identificar correctamente el desinfectante adecuado (χ(2) = 28,52, p = 0,001). CONCLUSIÓN: Nuestro estudio demuestra que muchos HCWs no están bien preparados y no están dispuestos a atender a la EVE. Más allá de la adquisición de conocimientos, existe la necesidad de más entrenamiento de vez en cuando para preparar plenamente a los HCWs para manejar cualquier posible caso de EVE. Texto: Durante el último brote de EVEs y su consiguiente epidemia masiva con una mortalidad muy alta [1], muchos sistemas y servicios de salud en África Occidental fueron abrumados e interrumpidos. Esto se debió en parte a que los sistemas de salud pobres y débiles, junto con los trabajadores de primera línea no preparados y no calificados (HCWs), se vieron agravados por la mala comprensión de la dinámica de la enfermedad vinculada a la falta de recursos necesarios.Durante la primera parte de 2014, la aparición de EVE [1] en Guinea, sacudió a los sistemas de atención de la salud de la subregión de África occidental, cobrando más de 9800 vidas [2] incluyendo más de 491 (58,7%) muertes de HCWs a causa de 839 infecciones [2]. Por lo tanto, esta epidemia reforzó el hecho de que los HCWs están en alto riesgo de infectarse con la enfermedad de acuerdo con sus funciones básicas. Los estudios realizados en Nigeria, Guinea y la India indican el bajo nivel de conocimiento, actitud negativa y prácticas deficientes que pueden eliminarse mediante la formación continua de los trabajadores humanitarios, así como el suministro de los recursos necesarios y adecuados en el cumplimiento de sus obligaciones [3] [4] [5]. Los países más afectados fueron Liberia, Sierra Leona, Guinea y varios otros países con casos importados [7]. Al igual que la mayoría de los países de África occidental, Ghana estaba en alta alerta y era el número uno en la lista de países considerados de alto riesgo de EVD. Así, el país trató de hacer algunos preparativos a raíz de la epidemia [8]. El Gobierno, con el apoyo de organizaciones donantes como la Organización Mundial de la Salud (OMS), Médicos sin Fronteras (MSF) puso en marcha recursos para la formación de profesionales de la salud y algún nivel de reequipamiento de los hospitales y preparación de los trabajadores sanitarios ante posibles situaciones de emergencia. Varios HCW recibieron capacitación teórica y práctica sobre cómo manejar a las personas infectadas y afectadas. Estas sesiones de capacitación tomaron la forma de entrenamiento in situ y fuera del sitio, así como talleres. También se realizaron ejercicios de simulación para demostrar cómo reaccionarían los HCW durante los escenarios de emergencia del EVD. Por ejemplo, el gobierno alemán a través del Centro Kumasi para la Investigación Colaborativa en Medicina Tropical organizó la capacitación de varios nacionales de África Occidental sobre toma de muestras, pruebas de muestreo y uso y doffing de equipo de protección personal (http://kccr.org). Más importante aún, hubo la construcción de tres centros de tratamiento y también, un servicio de ambulancias de reserva para el transporte de casos confirmados a los centros de tratamiento. Por cierto, Ghana no registró ningún caso a raíz de la epidemia y hasta ahora no ha registrado ningún caso de EVD. Sin embargo, la respuesta de HCW a los escenarios identificó varias lagunas. Después de una serie de cursos de formación para los trabajadores sanitarios, se podría suponer fácilmente que los trabajadores de la salud están adecuadamente preparados y equipados con los conocimientos y habilidades necesarios para hacer frente a cualquier posible brote de EVD. No está claro, por ejemplo, en qué medida se practicaron estos ejercicios y durante cuánto tiempo se hicieron parte de las actividades hospitalarias de rutina. Por lo tanto, se pregunta qué tan bien preparados están los trabajadores de la salud en Ghana para responder no sólo a la EVD sino a otras enfermedades propensas a epidemias (EPD) que requieren un enfoque concertado de preparación y gestión. Aunque se han invertido algunos recursos en respuesta al susto del EVD en Ghana, no se ha realizado ninguna evaluación sobre la preparación de los trabajadores de la salud ante posibles situaciones de emergencia. En consecuencia, si el personal sanitario carece de los conocimientos básicos, prácticos y organizativos necesarios para planificar y responder a esas situaciones de emergencia, no sólo sería un fracaso para sí mismo, sino también para la población en general, como fue el caso de la reciente epidemia en África occidental. Es importante, por ejemplo, comprender la dinámica de lo que impulsará a un HCW a estar dispuesto a poner su vida en el cumplimiento de su deber en un caso de EVE. Por lo tanto, es fundamental comprender la preparación actual del trabajador sanitario en Ghana para formular recomendaciones para la formación y planificación futuras de cualquier situación epidémica. Por lo tanto, es necesario que Ghana disponga de datos empíricos sobre la preparación general para emergencias para determinar y comprender las lagunas de conocimientos, y evaluar los conocimientos frente a la práctica en un intento de proporcionar orientación para las políticas, no se puede exagerar. En vista de esto, se evaluó el nivel de preparación, preparación y conocimiento de la respuesta de emergencia de EVD entre una población de trabajadores de la salud (HCWs) en la Metrópolis de Kumasi de la región de Ashanti, Ghana. Realizamos un estudio hospitalario basado en secciones transversales entre los trabajadores de la salud en los hospitales gubernamentales de Kumasi Sur y Suntreso designados como "unidad de retención avanzada para el ébola" y "equipo permanente de Ébola", respectivamente, en la Metrópolis de Kumasi. Los hospitales de Kumasi Sur y Suntreso tienen una asistencia mensual media del Departamento de Pacientes Fueras (DOP) de unos 20.603 y 11.712 pacientes, respectivamente, y personal de salud de aproximadamente 450 personas cada uno. Organizamos un día de capacitación para nuestros asistentes de investigación sobre cómo utilizar el dispositivo Personal Digital Assistant (PDA) Nota Samsung Galaxy 8 GT-N5100 (Samsung Electronics Co. Ltd., Seúl, Corea) en la captura de datos. La versión original del cuestionario fue preprobada, con cinco trabajadores sanitarios que eran similares en sus características a los miembros de la población del estudio pero fuera del área de jurisdicción y estudio para asegurar la validez y sesgo de medición. El cuestionario fue revisado a partir de las sugerencias y comentarios (principalmente sobre cómo se habían construido las preguntas) obtenidos del piloto. Esta fue la herramienta final y validada de captura de datos utilizada durante el estudio. En ambas instalaciones, contactamos a los Superintendentes Médicos para obtener permiso para asistir a sus reuniones matutinas para explicar los propósitos y objetivos del trabajo a los HCWs. Durante este tiempo, los HCWs Algunas de las preguntas formuladas incluyeron el organismo responsable de la EVD, el modo de transmisión de la enfermedad, la preparación del HCW para manejar cualquier caso de EVD y otras características clínicas tempranas de la infección. Al estimar el tamaño de la muestra para este estudio, los datos previos del hospital indican que hay aproximadamente 900 HCW en las dos instalaciones. Suponiendo un intervalo de confianza del 95% y si el 70% de estos HCW entrara en contacto con un caso sospechoso de EVD, permitiendo una tasa de error del 10%, aproximadamente 87 HCW proporcionarían un poder de estudio por defecto del 80% y un alfa del 5%. Con aproximadamente una tasa de no respuesta del 15% nos permitiría tomar muestras de 101 HCW de las dos instalaciones que prestaban servicios de emergencia dentro de la región de Ashanti de Ghana. Por lo tanto, cualquier trabajador sanitario que atendiera directamente a pacientes en situación de emergencia era elegible para ser incluido en el A partir de esta lista, tomamos una muestra aleatoria sistemática de todos los trabajadores de salud elegibles para representar el tamaño de la muestra. Después de obtener el consentimiento informado por escrito indicado por la firma y o la huella dactilar de los participantes, luego administramos los cuestionarios dentro de las dos instalaciones. Utilizamos la Lista de verificación OMS (2015) y CDC (2014) para la preparación para el ébola que proporciona sugerencias prácticas y específicas para asegurar que los centros de salud puedan ayudar a su personal a detectar posibles casos de ébola, proteger al personal y responder adecuadamente [9, 10]. Esta lista de verificación incluyó la evaluación, el conocimiento y la preparación de las instalaciones de los HCW. Sobre la base de estas listas, desarrollamos un cuestionario para determinar el conocimiento general y la preparación de los HCW ghaneses sobre el brote de EVD. Nuestro cuestionario fue administrado a partir de un PDA y registró la demografía, preparación Las respuestas a estas preguntas fueron necesarias por parte de los HCWs para determinar el acceso a la información sobre EVD entre los HCWs, su conocimiento sobre EVD y la forma de compensación que los HCWs piensan que sería apropiado al atender el caso de EVD entre otros. Los datos fueron recolectados electrónicamente utilizando tabletas para almacenamiento en la nube a través de CommCare ODK versión 2.27.2, agregados al archivo Microsoft Excel, exportados a la versión STATA 14 y analizados. Se utilizaron estadísticas descriptivas para resumir la distribución de diversas variables en tablas y figuras. Las variables categóricas fueron analizadas utilizando pruebas quirquare y regresión logística para asociaciones. Antecedentes de los participantes en el estudio Tabla 1 muestra las características de fondo de los participantes del estudio. Fueron entrevistados un total de 101 participantes del estudio, de los cuales 85 (84,16%) eran mujeres. La mayoría (54,46%) de los encuestados estaban casados; un total de 52,48% (53) había estado ejerciendo su profesión durante menos de 5 años (SD = 9,22 ± 10,52 años). En ambos centros, el 75,25% (76) de los encuestados había estado trabajando en el centro durante menos de 5 años (SD = 4,04 ± 4,07 años). La tabla 2 muestra el conocimiento y la conciencia de los participantes sobre la EVE. De los 101 HCW entrevistados, el 83,17% (n = 84) identificó correctamente la causa de la EVE, el 13,86% (n = 14) no conocía la causa, mientras que el 2,97% (n = 3) etiquetaba incorrectamente la causa como una bacteria. Un total de 72 (71,29%) HCW indicaron que los medios de comunicación, especialmente la radio, eran la principal fuente de información cuando se les preguntó dónde habían oído hablar por primera vez de EVE, lo que fue significativamente mayor que otras fuentes (χ 2 = 45,44, p < 0,05). Cuando se les preguntó qué laboratorio de nivel de bioseguridad (BSL) se requería para probar muestras de pacientes sospechosos de EVE, un total de 19 (18,81%) indicaron BSL-3, de los cuales 11 (10,89%) eran Médicos, mientras que 8 (7,92) y 1 (0,99%) eran Enfermeras y Auxiliares Médicos, respectivamente. Otros 76 (75,25%), de los cuales 9 (8,91%) eran médicos, 62 (61,39%) Enfermeras Cuando se les preguntó qué desinfectante usar después de atender y atender a un paciente sospechoso de EVE, sólo el La preparación para un brote de EVE por la categoría HCW Tabla 3 muestra los niveles de preparación de los HCW para manejar y manejar el brote de EVE. Cuando se preguntó a los HCW si consideraban que sus instalaciones estaban suficientemente equipadas para manejar y manejar a los pacientes con EVE, el 25,74% (n = 26) respondió afirmativamente, mientras que el 54,46% (55) indicó lo contrario. De esto, 14 (13,86%) fueron médicos, 39 (38,61%) enfermeros y 2 (1,98%) fueron AP (χ 2 = 2,66, p = 0,62). Si se infectaron accidentalmente con EVE después de atender a un paciente con EVE, 98 (97,03%) de los encuestados indicaron que aceptarían estar aislados (χ 2 = 4,69, p = 0,321). Mientras tanto, el 44,55% (n = 45) de los HCW atender Un total de 92 (91.09%) HCWs encuestados indicaron que no estaban adecuadamente entrenados para manejar un caso sospechoso de EVE. Cuando se les pidió que evaluaran su competencia en el manejo de un paciente sospechoso de EVE, 18.81% (n = 19) indicaron que tenían poca confianza y competencia, mientras que 6,93% (n = 7) indicaron que estaban extremadamente seguros de manejar un caso sospechoso de EVE (χ 2 = 13.09, p = 0.11). Más allá de la EVE, pedimos a nuestra población de la encuesta que nombrara otras enfermedades propensas a la epidemia. Del total de HCWs entrevistados, 56.43% (57/101) mencionaron enfermedades epidémicas de origen bacterial como tuberculosis y cólera. Otro 33,70% (34/101) llamaron enfermedades de origen viral como SARS, gripe, VIH, fiebre de Lassa y dengue, mientras que 9,90% (10 Cuando se les preguntó la forma de compensación que los HCW consideraban apropiada cuando se ocupaban de un paciente sospechoso de ébola, las respuestas recibidas incluían el seguro personal (32/101), la indemnización familiar en caso de muerte (31/101), el dinero (30/101) y los premios (8/101), mientras que otros también sugirieron la promoción del empleo (7/101), y otros (18/101). Nuestra población de la encuesta recomendó la provisión de logística y capacitación como dos cuestiones clave en el camino a seguir para preparar adecuadamente a los HCW hacia cualquier enfermedad propensa a la epidemia. Si bien se tiene constancia de que el reciente brote de EVD registró una mortalidad muy alta entre los HCW, según sabemos, sólo unos pocos estudios han abordado estas cuestiones en previsión de un brote de EVD, particularmente en países no afectados por la epidemia de EVD y especialmente en el África subsahariana, este estudio es casi inexistente. Por lo tanto, nuestro estudio evaluó cómo los HCW preparados están frente a una posible epidemia de EVD. Los resultados de esta encuesta mostraron que más de la mitad (54,46%) de los HCW indicaron que sus instalaciones no estaban listas para tratar casos de EVD. Casi el 92% indicaron que no estaban adecuadamente entrenados para manejar un caso sospechoso de EVD y no es sorprendente que menos del 50% indicaran que estarían dispuestos a atender a un paciente sospechoso. Además, casi un tercio de los HCW también querrían un seguro para sí mismos y sus familias en caso de que estuvieran infectados Estos resultados son claramente indicativos de lo mal preparados que están los HCW encuestados en la cara de una enfermedad propensa a la epidemia potencialmente mortal, como la EVD en Ghana. En este estudio, sólo el 25,7% de los HCW dijeron que sus instalaciones estaban suficientemente equipadas para manejar un brote de EVD. Tales bajas calificaciones de los hospitales por la mayoría de los HCW son una marca de falta de confianza en sus instalaciones de preparación y esto puede indicar una verdadera falta de preparación y preparación de los hospitales para manejar no sólo los casos de EVD sino otras enfermedades potencialmente propensas a epidemias. Alternativamente, también podría significar que los HCW eran probablemente inconscientes de los trabajos preparatorios y reequipamiento de sus instalaciones para manejar la situación de los brotes de EVD. La disposición a trabajar durante brotes y emergencias se considera un sentido del deber incluso frente al riesgo. En este estudio, menos del 50% de los HCW indicaron su Además, más de un tercio indicó varias formas de compensación para sí mismos o las familias en caso de muerte o mientras se ocupa de un caso de EVD, lo que implica que si los HCWs están seguros o garantizados de que ellos y sus familias serían atendidos en caso de muerte o mientras se ocupan de un caso de EVD, trabajarán de buena gana frente a cualquier escenario de emergencia. La suposición es que los HCWs trabajarían de buena gana frente a una emergencia de enfermedades infecciosas y responderían adecuadamente; sin embargo, hay evidencias de que los HCWs evitan este "deber sagrado" en el cuidado de los pacientes y dejarían a los pacientes vulnerables en tiempos de crisis [11]. Para evitar que los HCW se infecten mientras están obligados a trabajar incluso frente al riesgo personal que exigen sus códigos de ética y profesionalismo, es imperativo asegurar que se cumplan las normas convencionales, garantías y prácticas de salud pública adecuadas para que los HCW puedan responder a tales brotes de manera que no estén infectados y o afectados a pesar de los riesgos que puedan enfrentar y seguir enfrentando [12]. Así, el entrenamiento adecuado de los HCW como lo indicaron los encuestados durante el estudio, junto con la reequipación de algunos centros de salud, es muy crítico para asegurar que estén equipados con los conocimientos y herramientas necesarios para trabajar frente a cualquier epidemia. El conocimiento general de la EVD es crucial para responder adecuadamente y atender a los pacientes. Casi el 17% de nuestra población de estudio no pudo identificar que la EVD es causada por un virus. Menos del 10% pudo identificar correctamente el 0,5% de hipoclorito de sodio como el mejor desinfectante de las muchas opciones proporcionadas, lo que contradice fuertemente un estudio similar realizado en Conakry durante el pico de la epidemia, donde el 68% de los HCW conocían la concentración correcta de desinfectante [5]. Aunque no intentan comparar estos dos escenarios, esta información puede ser vital para la comprensión de que el conocimiento de los HCW en la prevención de infecciones y medidas de control es crítico en su cumplimiento de su deber. Este estudio mostró que la mayoría de los HCWs escucharon por primera vez de EVD a través de los medios de comunicación, especialmente la radio. Esto establece el papel crucial que juegan los medios de comunicación en informar a la población general en tales brotes de enfermedad. A pesar del pluralismo de los medios de comunicación, sigue incumbiendo a las instituciones e instalaciones de salud organizar una formación especial sobre cualquier enfermedad infecciosa emergente que se produzca a nivel mundial para actualizar los conocimientos de los HCW. El aislamiento es una medida de salud pública clave para prevenir la propagación de enfermedades infecciosas. En este estudio, más del 97% de los HCW indicaron su voluntad de cumplir y aceptaron ser aislados en caso de que se infectaran después de atender a un paciente sospechoso de EVE. Sin embargo, una pequeña proporción de los HCW encuestados declararon que serían muy infelices, y esto podría afectar en última instancia al cumplimiento. El aislamiento es uno de los métodos más antiguos de control de brotes de enfermedades transmisibles para los pacientes [13]. Sin embargo, cabe señalar que menos del 50% dijeron que estarían dispuestos a atender a un paciente sospechoso de EVE y sospechamos que podría estar relacionado con el temor a la seguridad personal [14]. La respuesta de emergencia de una enfermedad epidémica propensa a un virus o patógeno exótico provocará naturalmente cierto nivel de miedo y escepticismo entre cualquier grupo de individuos, especialmente cuando su conocimiento sobre la dinámica del brote de la enfermedad es bajo. Hay historias de HCW que han evitado la responsabilidad de tratar a algunos pacientes [15] y esto se puso de manifiesto en el VIH/SIDA y el síndrome respiratorio agudo grave-Coronavirus (SARS-CoV) durante los años 1980 y 2003, respectivamente, donde el miedo al contacto con pacientes sospechosos e infectados apretó a algunos HCW [16, 17]. A la larga, este temor probablemente afectaría su confianza y compromiso con la profesionalidad. Los resultados de este estudio apuntan al hecho de que el conocimiento y la provisión de herramientas como el equipo de protección del personal (EPP) y otras logísticas por sí solas no son suficientemente buenas. El punto de vista general es que la devoción del país a su personal de salud puede ser un factor contributivo en todo esto y no puede ser ignorado. Sin embargo, inspirarse en los HCW y sentirse seguro en el cuidado de tales brotes de enfermedades altamente infecciosas es crítico. Durante nuestro estudio, los HCW indicaron varias formas de compensación que se les pagarían si fueran afectados en el caso del ataque de EVD. Este estudio tenía algunas limitaciones inherentes. Este estudio fue un estudio exploratorio y el tamaño de nuestra muestra fue limitado. Por lo tanto, aunque no tratamos de generalizar los resultados, somos de la opinión de que esto puede ser un reflejo de los HCW en general. Además, ya que nuestro estudio se centró principalmente en dos instalaciones de salud, de nuevo tenemos cuidado en extrapolarlos a otros para reflejar otras instalaciones. Además, como esto no ha sido una experiencia real, y una encuesta basada en cuestionarios, las respuestas pueden no reflejar A pesar de estas limitaciones, la necesidad de capacitación fue fuerte entre los HCW. Los resultados demuestran aún más la falta de preparación de los centros de salud, y la gran proporción de HCWs renuentes a atender a un caso sospechoso de EVE. Esto requiere esfuerzos concertados de las instituciones e instalaciones de salud para equipar y preparar a los HCWs con los instrumentos y conocimientos necesarios y asegurar la competencia para manejar cualquier enfermedad propensa a epidemias.

¿Qué porcentaje de las instalaciones creían que estaban adecuadamente equipadas para tratar la enfermedad por el virus del Ébola?

Los trabajadores sanitarios indican una mala preparación para el brote de la enfermedad por el virus del Ébola en la región de Ashanti de Ghanahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5461762/SHA: f8efe7295a7cf875c8a695df3e87a42e651ce60dAutores: Annan, Augustina Angelina; Yar, Denis Dekugmen; Owusu, Michael; Biney, Eno Akua; Forson, Paa Kobina; Okyere, Portia Boakye; Gyimah, Akosua Adumea; Owusu-Dabo, EllisFecha: 2017-06-06DOI: 10.1186/s12889-017-4474-6Licencia: cc-byAbstract: Aunque Ghana no registró (y todavía no ha registrado) ningún caso, y varios trabajadores de la salud han recibido numerosos planes de capacitación, no hay registro de ningún estudio que evaluara la preparación de los trabajadores de la salud (HCWS) con respecto a la EVD y cualquier enfermedad propensa a la emergencia en Ghana. Por lo tanto, se realizó un estudio interseccional basado en hospitales con 101 HCW de dos instalaciones en Kumasi, Ghana para evaluar el nivel de preparación de los HCW para responder a cualquier posible EVD. MÉTODOS: Se administró un cuestionario cara a cara utilizando una lista de verificación adaptada de la OMS (2015) y los CDC (2014) para la preparación para el ébola y se evaluaron las lagunas generales de conocimientos, y la preparación de los HCW ghaneses en determinados centros de salud de la región de Ashanti de Ghana de octubre a diciembre de 2015. RESULTADOS: Sólo el 25,74% (n = 26) consideró que sus instalaciones estaban suficientemente equipadas para manejar y manejar a los pacientes con EVE. Cuando se les preguntó qué desinfectante usar después de atender y cuidar a un paciente sospechoso con EVE, sólo el 8,91% (n = 9) pudo identificar correctamente el desinfectante adecuado (χ(2) = 28,52, p = 0,001). CONCLUSIÓN: Nuestro estudio demuestra que muchos HCWs no están bien preparados y no están dispuestos a atender a la EVE. Más allá de la adquisición de conocimientos, existe la necesidad de más entrenamiento de vez en cuando para preparar plenamente a los HCWs para manejar cualquier posible caso de EVE. Texto: Durante el último brote de EVEs y su consiguiente epidemia masiva con una mortalidad muy alta [1], muchos sistemas y servicios de salud en África Occidental fueron abrumados e interrumpidos. Esto se debió en parte a que los sistemas de salud pobres y débiles, junto con los trabajadores de primera línea no preparados y no calificados (HCWs), se vieron agravados por la mala comprensión de la dinámica de la enfermedad vinculada a la falta de recursos necesarios.Durante la primera parte de 2014, la aparición de EVE [1] en Guinea, sacudió a los sistemas de atención de la salud de la subregión de África occidental, cobrando más de 9800 vidas [2] incluyendo más de 491 (58,7%) muertes de HCWs a causa de 839 infecciones [2]. Por lo tanto, esta epidemia reforzó el hecho de que los HCWs están en alto riesgo de infectarse con la enfermedad de acuerdo con sus funciones básicas. Los estudios realizados en Nigeria, Guinea y la India indican el bajo nivel de conocimiento, actitud negativa y prácticas deficientes que pueden eliminarse mediante la formación continua de los trabajadores humanitarios, así como el suministro de los recursos necesarios y adecuados en el cumplimiento de sus obligaciones [3] [4] [5]. Los países más afectados fueron Liberia, Sierra Leona, Guinea y varios otros países con casos importados [7]. Al igual que la mayoría de los países de África occidental, Ghana estaba en alta alerta y era el número uno en la lista de países considerados de alto riesgo de EVD. Así, el país trató de hacer algunos preparativos a raíz de la epidemia [8]. El Gobierno, con el apoyo de organizaciones donantes como la Organización Mundial de la Salud (OMS), Médicos sin Fronteras (MSF) puso en marcha recursos para la formación de profesionales de la salud y algún nivel de reequipamiento de los hospitales y preparación de los trabajadores sanitarios ante posibles situaciones de emergencia. Varios HCW recibieron capacitación teórica y práctica sobre cómo manejar a las personas infectadas y afectadas. Estas sesiones de capacitación tomaron la forma de entrenamiento in situ y fuera del sitio, así como talleres. También se realizaron ejercicios de simulación para demostrar cómo reaccionarían los HCW durante los escenarios de emergencia del EVD. Por ejemplo, el gobierno alemán a través del Centro Kumasi para la Investigación Colaborativa en Medicina Tropical organizó la capacitación de varios nacionales de África Occidental sobre toma de muestras, pruebas de muestreo y uso y doffing de equipo de protección personal (http://kccr.org). Más importante aún, hubo la construcción de tres centros de tratamiento y también, un servicio de ambulancias de reserva para el transporte de casos confirmados a los centros de tratamiento. Por cierto, Ghana no registró ningún caso a raíz de la epidemia y hasta ahora no ha registrado ningún caso de EVD. Sin embargo, la respuesta de HCW a los escenarios identificó varias lagunas. Después de una serie de cursos de formación para los trabajadores sanitarios, se podría suponer fácilmente que los trabajadores de la salud están adecuadamente preparados y equipados con los conocimientos y habilidades necesarios para hacer frente a cualquier posible brote de EVD. No está claro, por ejemplo, en qué medida se practicaron estos ejercicios y durante cuánto tiempo se hicieron parte de las actividades hospitalarias de rutina. Por lo tanto, se pregunta qué tan bien preparados están los trabajadores de la salud en Ghana para responder no sólo a la EVD sino a otras enfermedades propensas a epidemias (EPD) que requieren un enfoque concertado de preparación y gestión. Aunque se han invertido algunos recursos en respuesta al susto del EVD en Ghana, no se ha realizado ninguna evaluación sobre la preparación de los trabajadores de la salud ante posibles situaciones de emergencia. En consecuencia, si el personal sanitario carece de los conocimientos básicos, prácticos y organizativos necesarios para planificar y responder a esas situaciones de emergencia, no sólo sería un fracaso para sí mismo, sino también para la población en general, como fue el caso de la reciente epidemia en África occidental. Es importante, por ejemplo, comprender la dinámica de lo que impulsará a un HCW a estar dispuesto a poner su vida en el cumplimiento de su deber en un caso de EVE. Por lo tanto, es fundamental comprender la preparación actual del trabajador sanitario en Ghana para formular recomendaciones para la formación y planificación futuras de cualquier situación epidémica. Por lo tanto, es necesario que Ghana disponga de datos empíricos sobre la preparación general para emergencias para determinar y comprender las lagunas de conocimientos, y evaluar los conocimientos frente a la práctica en un intento de proporcionar orientación para las políticas, no se puede exagerar. En vista de esto, se evaluó el nivel de preparación, preparación y conocimiento de la respuesta de emergencia de EVD entre una población de trabajadores de la salud (HCWs) en la Metrópolis de Kumasi de la región de Ashanti, Ghana. Realizamos un estudio hospitalario basado en secciones transversales entre los trabajadores de la salud en los hospitales gubernamentales de Kumasi Sur y Suntreso designados como "unidad de retención avanzada para el ébola" y "equipo permanente de Ébola", respectivamente, en la Metrópolis de Kumasi. Los hospitales de Kumasi Sur y Suntreso tienen una asistencia mensual media del Departamento de Pacientes Fueras (DOP) de unos 20.603 y 11.712 pacientes, respectivamente, y personal de salud de aproximadamente 450 personas cada uno. Organizamos un día de capacitación para nuestros asistentes de investigación sobre cómo utilizar el dispositivo Personal Digital Assistant (PDA) Nota Samsung Galaxy 8 GT-N5100 (Samsung Electronics Co. Ltd., Seúl, Corea) en la captura de datos. La versión original del cuestionario fue preprobada, con cinco trabajadores sanitarios que eran similares en sus características a los miembros de la población del estudio pero fuera del área de jurisdicción y estudio para asegurar la validez y sesgo de medición. El cuestionario fue revisado a partir de las sugerencias y comentarios (principalmente sobre cómo se habían construido las preguntas) obtenidos del piloto. Esta fue la herramienta final y validada de captura de datos utilizada durante el estudio. En ambas instalaciones, contactamos a los Superintendentes Médicos para obtener permiso para asistir a sus reuniones matutinas para explicar los propósitos y objetivos del trabajo a los HCWs. Durante este tiempo, los HCWs Algunas de las preguntas formuladas incluyeron el organismo responsable de la EVD, el modo de transmisión de la enfermedad, la preparación del HCW para manejar cualquier caso de EVD y otras características clínicas tempranas de la infección. Al estimar el tamaño de la muestra para este estudio, los datos previos del hospital indican que hay aproximadamente 900 HCW en las dos instalaciones. Suponiendo un intervalo de confianza del 95% y si el 70% de estos HCW entrara en contacto con un caso sospechoso de EVD, permitiendo una tasa de error del 10%, aproximadamente 87 HCW proporcionarían un poder de estudio por defecto del 80% y un alfa del 5%. Con aproximadamente una tasa de no respuesta del 15% nos permitiría tomar muestras de 101 HCW de las dos instalaciones que prestaban servicios de emergencia dentro de la región de Ashanti de Ghana. Por lo tanto, cualquier trabajador sanitario que atendiera directamente a pacientes en situación de emergencia era elegible para ser incluido en el A partir de esta lista, tomamos una muestra aleatoria sistemática de todos los trabajadores de salud elegibles para representar el tamaño de la muestra. Después de obtener el consentimiento informado por escrito indicado por la firma y o la huella dactilar de los participantes, luego administramos los cuestionarios dentro de las dos instalaciones. Utilizamos la Lista de verificación OMS (2015) y CDC (2014) para la preparación para el ébola que proporciona sugerencias prácticas y específicas para asegurar que los centros de salud puedan ayudar a su personal a detectar posibles casos de ébola, proteger al personal y responder adecuadamente [9, 10]. Esta lista de verificación incluyó la evaluación, el conocimiento y la preparación de las instalaciones de los HCW. Sobre la base de estas listas, desarrollamos un cuestionario para determinar el conocimiento general y la preparación de los HCW ghaneses sobre el brote de EVD. Nuestro cuestionario fue administrado a partir de un PDA y registró la demografía, preparación Las respuestas a estas preguntas fueron necesarias por parte de los HCWs para determinar el acceso a la información sobre EVD entre los HCWs, su conocimiento sobre EVD y la forma de compensación que los HCWs piensan que sería apropiado al atender el caso de EVD entre otros. Los datos fueron recolectados electrónicamente utilizando tabletas para almacenamiento en la nube a través de CommCare ODK versión 2.27.2, agregados al archivo Microsoft Excel, exportados a la versión STATA 14 y analizados. Se utilizaron estadísticas descriptivas para resumir la distribución de diversas variables en tablas y figuras. Las variables categóricas fueron analizadas utilizando pruebas quirquare y regresión logística para asociaciones. Antecedentes de los participantes en el estudio Tabla 1 muestra las características de fondo de los participantes del estudio. Fueron entrevistados un total de 101 participantes del estudio, de los cuales 85 (84,16%) eran mujeres. La mayoría (54,46%) de los encuestados estaban casados; un total de 52,48% (53) había estado ejerciendo su profesión durante menos de 5 años (SD = 9,22 ± 10,52 años). En ambos centros, el 75,25% (76) de los encuestados había estado trabajando en el centro durante menos de 5 años (SD = 4,04 ± 4,07 años). La tabla 2 muestra el conocimiento y la conciencia de los participantes sobre la EVE. De los 101 HCW entrevistados, el 83,17% (n = 84) identificó correctamente la causa de la EVE, el 13,86% (n = 14) no conocía la causa, mientras que el 2,97% (n = 3) etiquetaba incorrectamente la causa como una bacteria. Un total de 72 (71,29%) HCW indicaron que los medios de comunicación, especialmente la radio, eran la principal fuente de información cuando se les preguntó dónde habían oído hablar por primera vez de EVE, lo que fue significativamente mayor que otras fuentes (χ 2 = 45,44, p < 0,05). Cuando se les preguntó qué laboratorio de nivel de bioseguridad (BSL) se requería para probar muestras de pacientes sospechosos de EVE, un total de 19 (18,81%) indicaron BSL-3, de los cuales 11 (10,89%) eran Médicos, mientras que 8 (7,92) y 1 (0,99%) eran Enfermeras y Auxiliares Médicos, respectivamente. Otros 76 (75,25%), de los cuales 9 (8,91%) eran médicos, 62 (61,39%) Enfermeras Cuando se les preguntó qué desinfectante usar después de atender y atender a un paciente sospechoso de EVE, sólo el La preparación para un brote de EVE por la categoría HCW Tabla 3 muestra los niveles de preparación de los HCW para manejar y manejar el brote de EVE. Cuando se preguntó a los HCW si consideraban que sus instalaciones estaban suficientemente equipadas para manejar y manejar a los pacientes con EVE, el 25,74% (n = 26) respondió afirmativamente, mientras que el 54,46% (55) indicó lo contrario. De esto, 14 (13,86%) fueron médicos, 39 (38,61%) enfermeros y 2 (1,98%) fueron AP (χ 2 = 2,66, p = 0,62). Si se infectaron accidentalmente con EVE después de atender a un paciente con EVE, 98 (97,03%) de los encuestados indicaron que aceptarían estar aislados (χ 2 = 4,69, p = 0,321). Mientras tanto, el 44,55% (n = 45) de los HCW atender Un total de 92 (91.09%) HCWs encuestados indicaron que no estaban adecuadamente entrenados para manejar un caso sospechoso de EVE. Cuando se les pidió que evaluaran su competencia en el manejo de un paciente sospechoso de EVE, 18.81% (n = 19) indicaron que tenían poca confianza y competencia, mientras que 6,93% (n = 7) indicaron que estaban extremadamente seguros de manejar un caso sospechoso de EVE (χ 2 = 13.09, p = 0.11). Más allá de la EVE, pedimos a nuestra población de la encuesta que nombrara otras enfermedades propensas a la epidemia. Del total de HCWs entrevistados, 56.43% (57/101) mencionaron enfermedades epidémicas de origen bacterial como tuberculosis y cólera. Otro 33,70% (34/101) llamaron enfermedades de origen viral como SARS, gripe, VIH, fiebre de Lassa y dengue, mientras que 9,90% (10 Cuando se les preguntó la forma de compensación que los HCW consideraban apropiada cuando se ocupaban de un paciente sospechoso de ébola, las respuestas recibidas incluían el seguro personal (32/101), la indemnización familiar en caso de muerte (31/101), el dinero (30/101) y los premios (8/101), mientras que otros también sugirieron la promoción del empleo (7/101), y otros (18/101). Nuestra población de la encuesta recomendó la provisión de logística y capacitación como dos cuestiones clave en el camino a seguir para preparar adecuadamente a los HCW hacia cualquier enfermedad propensa a la epidemia. Si bien se tiene constancia de que el reciente brote de EVD registró una mortalidad muy alta entre los HCW, según sabemos, sólo unos pocos estudios han abordado estas cuestiones en previsión de un brote de EVD, particularmente en países no afectados por la epidemia de EVD y especialmente en el África subsahariana, este estudio es casi inexistente. Por lo tanto, nuestro estudio evaluó cómo los HCW preparados están frente a una posible epidemia de EVD. Los resultados de esta encuesta mostraron que más de la mitad (54,46%) de los HCW indicaron que sus instalaciones no estaban listas para tratar casos de EVD. Casi el 92% indicaron que no estaban adecuadamente entrenados para manejar un caso sospechoso de EVD y no es sorprendente que menos del 50% indicaran que estarían dispuestos a atender a un paciente sospechoso. Además, casi un tercio de los HCW también querrían un seguro para sí mismos y sus familias en caso de que estuvieran infectados Estos resultados son claramente indicativos de lo mal preparados que están los HCW encuestados en la cara de una enfermedad propensa a la epidemia potencialmente mortal, como la EVD en Ghana. En este estudio, sólo el 25,7% de los HCW dijeron que sus instalaciones estaban suficientemente equipadas para manejar un brote de EVD. Tales bajas calificaciones de los hospitales por la mayoría de los HCW son una marca de falta de confianza en sus instalaciones de preparación y esto puede indicar una verdadera falta de preparación y preparación de los hospitales para manejar no sólo los casos de EVD sino otras enfermedades potencialmente propensas a epidemias. Alternativamente, también podría significar que los HCW eran probablemente inconscientes de los trabajos preparatorios y reequipamiento de sus instalaciones para manejar la situación de los brotes de EVD. La disposición a trabajar durante brotes y emergencias se considera un sentido del deber incluso frente al riesgo. En este estudio, menos del 50% de los HCW indicaron su Además, más de un tercio indicó varias formas de compensación para sí mismos o las familias en caso de muerte o mientras se ocupa de un caso de EVD, lo que implica que si los HCWs están seguros o garantizados de que ellos y sus familias serían atendidos en caso de muerte o mientras se ocupan de un caso de EVD, trabajarán de buena gana frente a cualquier escenario de emergencia. La suposición es que los HCWs trabajarían de buena gana frente a una emergencia de enfermedades infecciosas y responderían adecuadamente; sin embargo, hay evidencias de que los HCWs evitan este "deber sagrado" en el cuidado de los pacientes y dejarían a los pacientes vulnerables en tiempos de crisis [11]. Para evitar que los HCW se infecten mientras están obligados a trabajar incluso frente al riesgo personal que exigen sus códigos de ética y profesionalismo, es imperativo asegurar que se cumplan las normas convencionales, garantías y prácticas de salud pública adecuadas para que los HCW puedan responder a tales brotes de manera que no estén infectados y o afectados a pesar de los riesgos que puedan enfrentar y seguir enfrentando [12]. Así, el entrenamiento adecuado de los HCW como lo indicaron los encuestados durante el estudio, junto con la reequipación de algunos centros de salud, es muy crítico para asegurar que estén equipados con los conocimientos y herramientas necesarios para trabajar frente a cualquier epidemia. El conocimiento general de la EVD es crucial para responder adecuadamente y atender a los pacientes. Casi el 17% de nuestra población de estudio no pudo identificar que la EVD es causada por un virus. Menos del 10% pudo identificar correctamente el 0,5% de hipoclorito de sodio como el mejor desinfectante de las muchas opciones proporcionadas, lo que contradice fuertemente un estudio similar realizado en Conakry durante el pico de la epidemia, donde el 68% de los HCW conocían la concentración correcta de desinfectante [5]. Aunque no intentan comparar estos dos escenarios, esta información puede ser vital para la comprensión de que el conocimiento de los HCW en la prevención de infecciones y medidas de control es crítico en su cumplimiento de su deber. Este estudio mostró que la mayoría de los HCWs escucharon por primera vez de EVD a través de los medios de comunicación, especialmente la radio. Esto establece el papel crucial que juegan los medios de comunicación en informar a la población general en tales brotes de enfermedad. A pesar del pluralismo de los medios de comunicación, sigue incumbiendo a las instituciones e instalaciones de salud organizar una formación especial sobre cualquier enfermedad infecciosa emergente que se produzca a nivel mundial para actualizar los conocimientos de los HCW. El aislamiento es una medida de salud pública clave para prevenir la propagación de enfermedades infecciosas. En este estudio, más del 97% de los HCW indicaron su voluntad de cumplir y aceptaron ser aislados en caso de que se infectaran después de atender a un paciente sospechoso de EVE. Sin embargo, una pequeña proporción de los HCW encuestados declararon que serían muy infelices, y esto podría afectar en última instancia al cumplimiento. El aislamiento es uno de los métodos más antiguos de control de brotes de enfermedades transmisibles para los pacientes [13]. Sin embargo, cabe señalar que menos del 50% dijeron que estarían dispuestos a atender a un paciente sospechoso de EVE y sospechamos que podría estar relacionado con el temor a la seguridad personal [14]. La respuesta de emergencia de una enfermedad epidémica propensa a un virus o patógeno exótico provocará naturalmente cierto nivel de miedo y escepticismo entre cualquier grupo de individuos, especialmente cuando su conocimiento sobre la dinámica del brote de la enfermedad es bajo. Hay historias de HCW que han evitado la responsabilidad de tratar a algunos pacientes [15] y esto se puso de manifiesto en el VIH/SIDA y el síndrome respiratorio agudo grave-Coronavirus (SARS-CoV) durante los años 1980 y 2003, respectivamente, donde el miedo al contacto con pacientes sospechosos e infectados apretó a algunos HCW [16, 17]. A la larga, este temor probablemente afectaría su confianza y compromiso con la profesionalidad. Los resultados de este estudio apuntan al hecho de que el conocimiento y la provisión de herramientas como el equipo de protección del personal (EPP) y otras logísticas por sí solas no son suficientemente buenas. El punto de vista general es que la devoción del país a su personal de salud puede ser un factor contributivo en todo esto y no puede ser ignorado. Sin embargo, inspirarse en los HCW y sentirse seguro en el cuidado de tales brotes de enfermedades altamente infecciosas es crítico. Durante nuestro estudio, los HCW indicaron varias formas de compensación que se les pagarían si fueran afectados en el caso del ataque de EVD. Este estudio tenía algunas limitaciones inherentes. Este estudio fue un estudio exploratorio y el tamaño de nuestra muestra fue limitado. Por lo tanto, aunque no tratamos de generalizar los resultados, somos de la opinión de que esto puede ser un reflejo de los HCW en general. Además, ya que nuestro estudio se centró principalmente en dos instalaciones de salud, de nuevo tenemos cuidado en extrapolarlos a otros para reflejar otras instalaciones. Además, como esto no ha sido una experiencia real, y una encuesta basada en cuestionarios, las respuestas pueden no reflejar A pesar de estas limitaciones, la necesidad de capacitación fue fuerte entre los HCW. Los resultados demuestran aún más la falta de preparación de los centros de salud, y la gran proporción de HCWs renuentes a atender a un caso sospechoso de EVE. Esto requiere esfuerzos concertados de las instituciones e instalaciones de salud para equipar y preparar a los HCWs con los instrumentos y conocimientos necesarios y asegurar la competencia para manejar cualquier enfermedad propensa a epidemias.

¿Cuántas instalaciones creían que estaban adecuadamente equipadas para tratar la enfermedad por el virus Ebla?

Los trabajadores sanitarios indican una mala preparación para el brote de la enfermedad por el virus del Ébola en la región de Ashanti de Ghanahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5461762/SHA: f8efe7295a7cf875c8a695df3e87a42e651ce60dAutores: Annan, Augustina Angelina; Yar, Denis Dekugmen; Owusu, Michael; Biney, Eno Akua; Forson, Paa Kobina; Okyere, Portia Boakye; Gyimah, Akosua Adumea; Owusu-Dabo, EllisFecha: 2017-06-06DOI: 10.1186/s12889-017-4474-6Licencia: cc-byAbstract: Aunque Ghana no registró (y todavía no ha registrado) ningún caso, y varios trabajadores de la salud han recibido numerosos planes de capacitación, no hay registro de ningún estudio que evaluara la preparación de los trabajadores de la salud (HCWS) con respecto a la EVD y cualquier enfermedad propensa a la emergencia en Ghana. Por lo tanto, se realizó un estudio interseccional basado en hospitales con 101 HCW de dos instalaciones en Kumasi, Ghana para evaluar el nivel de preparación de los HCW para responder a cualquier posible EVD. MÉTODOS: Se administró un cuestionario cara a cara utilizando una lista de verificación adaptada de la OMS (2015) y los CDC (2014) para la preparación para el ébola y se evaluaron las lagunas generales de conocimientos, y la preparación de los HCW ghaneses en determinados centros de salud de la región de Ashanti de Ghana de octubre a diciembre de 2015. RESULTADOS: Sólo el 25,74% (n = 26) consideró que sus instalaciones estaban suficientemente equipadas para manejar y manejar a los pacientes con EVE. Cuando se les preguntó qué desinfectante usar después de atender y cuidar a un paciente sospechoso con EVE, sólo el 8,91% (n = 9) pudo identificar correctamente el desinfectante adecuado (χ(2) = 28,52, p = 0,001). CONCLUSIÓN: Nuestro estudio demuestra que muchos HCWs no están bien preparados y no están dispuestos a atender a la EVE. Más allá de la adquisición de conocimientos, existe la necesidad de más entrenamiento de vez en cuando para preparar plenamente a los HCWs para manejar cualquier posible caso de EVE. Texto: Durante el último brote de EVEs y su consiguiente epidemia masiva con una mortalidad muy alta [1], muchos sistemas y servicios de salud en África Occidental fueron abrumados e interrumpidos. Esto se debió en parte a que los sistemas de salud pobres y débiles, junto con los trabajadores de primera línea no preparados y no calificados (HCWs), se vieron agravados por la mala comprensión de la dinámica de la enfermedad vinculada a la falta de recursos necesarios.Durante la primera parte de 2014, la aparición de EVE [1] en Guinea, sacudió a los sistemas de atención de la salud de la subregión de África occidental, cobrando más de 9800 vidas [2] incluyendo más de 491 (58,7%) muertes de HCWs a causa de 839 infecciones [2]. Por lo tanto, esta epidemia reforzó el hecho de que los HCWs están en alto riesgo de infectarse con la enfermedad de acuerdo con sus funciones básicas. Los estudios realizados en Nigeria, Guinea y la India indican el bajo nivel de conocimiento, actitud negativa y prácticas deficientes que pueden eliminarse mediante la formación continua de los trabajadores humanitarios, así como el suministro de los recursos necesarios y adecuados en el cumplimiento de sus obligaciones [3] [4] [5]. Los países más afectados fueron Liberia, Sierra Leona, Guinea y varios otros países con casos importados [7]. Al igual que la mayoría de los países de África occidental, Ghana estaba en alta alerta y era el número uno en la lista de países considerados de alto riesgo de EVD. Así, el país trató de hacer algunos preparativos a raíz de la epidemia [8]. El Gobierno, con el apoyo de organizaciones donantes como la Organización Mundial de la Salud (OMS), Médicos sin Fronteras (MSF) puso en marcha recursos para la formación de profesionales de la salud y algún nivel de reequipamiento de los hospitales y preparación de los trabajadores sanitarios ante posibles situaciones de emergencia. Varios HCW recibieron capacitación teórica y práctica sobre cómo manejar a las personas infectadas y afectadas. Estas sesiones de capacitación tomaron la forma de entrenamiento in situ y fuera del sitio, así como talleres. También se realizaron ejercicios de simulación para demostrar cómo reaccionarían los HCW durante los escenarios de emergencia del EVD. Por ejemplo, el gobierno alemán a través del Centro Kumasi para la Investigación Colaborativa en Medicina Tropical organizó la capacitación de varios nacionales de África Occidental sobre toma de muestras, pruebas de muestreo y uso y doffing de equipo de protección personal (http://kccr.org). Más importante aún, hubo la construcción de tres centros de tratamiento y también, un servicio de ambulancias de reserva para el transporte de casos confirmados a los centros de tratamiento. Por cierto, Ghana no registró ningún caso a raíz de la epidemia y hasta ahora no ha registrado ningún caso de EVD. Sin embargo, la respuesta de HCW a los escenarios identificó varias lagunas. Después de una serie de cursos de formación para los trabajadores sanitarios, se podría suponer fácilmente que los trabajadores de la salud están adecuadamente preparados y equipados con los conocimientos y habilidades necesarios para hacer frente a cualquier posible brote de EVD. No está claro, por ejemplo, en qué medida se practicaron estos ejercicios y durante cuánto tiempo se hicieron parte de las actividades hospitalarias de rutina. Por lo tanto, se pregunta qué tan bien preparados están los trabajadores de la salud en Ghana para responder no sólo a la EVD sino a otras enfermedades propensas a epidemias (EPD) que requieren un enfoque concertado de preparación y gestión. Aunque se han invertido algunos recursos en respuesta al susto del EVD en Ghana, no se ha realizado ninguna evaluación sobre la preparación de los trabajadores de la salud ante posibles situaciones de emergencia. En consecuencia, si el personal sanitario carece de los conocimientos básicos, prácticos y organizativos necesarios para planificar y responder a esas situaciones de emergencia, no sólo sería un fracaso para sí mismo, sino también para la población en general, como fue el caso de la reciente epidemia en África occidental. Es importante, por ejemplo, comprender la dinámica de lo que impulsará a un HCW a estar dispuesto a poner su vida en el cumplimiento de su deber en un caso de EVE. Por lo tanto, es fundamental comprender la preparación actual del trabajador sanitario en Ghana para formular recomendaciones para la formación y planificación futuras de cualquier situación epidémica. Por lo tanto, es necesario que Ghana disponga de datos empíricos sobre la preparación general para emergencias para determinar y comprender las lagunas de conocimientos, y evaluar los conocimientos frente a la práctica en un intento de proporcionar orientación para las políticas, no se puede exagerar. En vista de esto, se evaluó el nivel de preparación, preparación y conocimiento de la respuesta de emergencia de EVD entre una población de trabajadores de la salud (HCWs) en la Metrópolis de Kumasi de la región de Ashanti, Ghana. Realizamos un estudio hospitalario basado en secciones transversales entre los trabajadores de la salud en los hospitales gubernamentales de Kumasi Sur y Suntreso designados como "unidad de retención avanzada para el ébola" y "equipo permanente de Ébola", respectivamente, en la Metrópolis de Kumasi. Los hospitales de Kumasi Sur y Suntreso tienen una asistencia mensual media del Departamento de Pacientes Fueras (DOP) de unos 20.603 y 11.712 pacientes, respectivamente, y personal de salud de aproximadamente 450 personas cada uno. Organizamos un día de capacitación para nuestros asistentes de investigación sobre cómo utilizar el dispositivo Personal Digital Assistant (PDA) Nota Samsung Galaxy 8 GT-N5100 (Samsung Electronics Co. Ltd., Seúl, Corea) en la captura de datos. La versión original del cuestionario fue preprobada, con cinco trabajadores sanitarios que eran similares en sus características a los miembros de la población del estudio pero fuera del área de jurisdicción y estudio para asegurar la validez y sesgo de medición. El cuestionario fue revisado a partir de las sugerencias y comentarios (principalmente sobre cómo se habían construido las preguntas) obtenidos del piloto. Esta fue la herramienta final y validada de captura de datos utilizada durante el estudio. En ambas instalaciones, contactamos a los Superintendentes Médicos para obtener permiso para asistir a sus reuniones matutinas para explicar los propósitos y objetivos del trabajo a los HCWs. Durante este tiempo, los HCWs Algunas de las preguntas formuladas incluyeron el organismo responsable de la EVD, el modo de transmisión de la enfermedad, la preparación del HCW para manejar cualquier caso de EVD y otras características clínicas tempranas de la infección. Al estimar el tamaño de la muestra para este estudio, los datos previos del hospital indican que hay aproximadamente 900 HCW en las dos instalaciones. Suponiendo un intervalo de confianza del 95% y si el 70% de estos HCW entrara en contacto con un caso sospechoso de EVD, permitiendo una tasa de error del 10%, aproximadamente 87 HCW proporcionarían un poder de estudio por defecto del 80% y un alfa del 5%. Con aproximadamente una tasa de no respuesta del 15% nos permitiría tomar muestras de 101 HCW de las dos instalaciones que prestaban servicios de emergencia dentro de la región de Ashanti de Ghana. Por lo tanto, cualquier trabajador sanitario que atendiera directamente a pacientes en situación de emergencia era elegible para ser incluido en el A partir de esta lista, tomamos una muestra aleatoria sistemática de todos los trabajadores de salud elegibles para representar el tamaño de la muestra. Después de obtener el consentimiento informado por escrito indicado por la firma y o la huella dactilar de los participantes, luego administramos los cuestionarios dentro de las dos instalaciones. Utilizamos la Lista de verificación OMS (2015) y CDC (2014) para la preparación para el ébola que proporciona sugerencias prácticas y específicas para asegurar que los centros de salud puedan ayudar a su personal a detectar posibles casos de ébola, proteger al personal y responder adecuadamente [9, 10]. Esta lista de verificación incluyó la evaluación, el conocimiento y la preparación de las instalaciones de los HCW. Sobre la base de estas listas, desarrollamos un cuestionario para determinar el conocimiento general y la preparación de los HCW ghaneses sobre el brote de EVD. Nuestro cuestionario fue administrado a partir de un PDA y registró la demografía, preparación Las respuestas a estas preguntas fueron necesarias por parte de los HCWs para determinar el acceso a la información sobre EVD entre los HCWs, su conocimiento sobre EVD y la forma de compensación que los HCWs piensan que sería apropiado al atender el caso de EVD entre otros. Los datos fueron recolectados electrónicamente utilizando tabletas para almacenamiento en la nube a través de CommCare ODK versión 2.27.2, agregados al archivo Microsoft Excel, exportados a la versión STATA 14 y analizados. Se utilizaron estadísticas descriptivas para resumir la distribución de diversas variables en tablas y figuras. Las variables categóricas fueron analizadas utilizando pruebas quirquare y regresión logística para asociaciones. Antecedentes de los participantes en el estudio Tabla 1 muestra las características de fondo de los participantes del estudio. Fueron entrevistados un total de 101 participantes del estudio, de los cuales 85 (84,16%) eran mujeres. La mayoría (54,46%) de los encuestados estaban casados; un total de 52,48% (53) había estado ejerciendo su profesión durante menos de 5 años (SD = 9,22 ± 10,52 años). En ambos centros, el 75,25% (76) de los encuestados había estado trabajando en el centro durante menos de 5 años (SD = 4,04 ± 4,07 años). La tabla 2 muestra el conocimiento y la conciencia de los participantes sobre la EVE. De los 101 HCW entrevistados, el 83,17% (n = 84) identificó correctamente la causa de la EVE, el 13,86% (n = 14) no conocía la causa, mientras que el 2,97% (n = 3) etiquetaba incorrectamente la causa como una bacteria. Un total de 72 (71,29%) HCW indicaron que los medios de comunicación, especialmente la radio, eran la principal fuente de información cuando se les preguntó dónde habían oído hablar por primera vez de EVE, lo que fue significativamente mayor que otras fuentes (χ 2 = 45,44, p < 0,05). Cuando se les preguntó qué laboratorio de nivel de bioseguridad (BSL) se requería para probar muestras de pacientes sospechosos de EVE, un total de 19 (18,81%) indicaron BSL-3, de los cuales 11 (10,89%) eran Médicos, mientras que 8 (7,92) y 1 (0,99%) eran Enfermeras y Auxiliares Médicos, respectivamente. Otros 76 (75,25%), de los cuales 9 (8,91%) eran médicos, 62 (61,39%) Enfermeras Cuando se les preguntó qué desinfectante usar después de atender y atender a un paciente sospechoso de EVE, sólo el La preparación para un brote de EVE por la categoría HCW Tabla 3 muestra los niveles de preparación de los HCW para manejar y manejar el brote de EVE. Cuando se preguntó a los HCW si consideraban que sus instalaciones estaban suficientemente equipadas para manejar y manejar a los pacientes con EVE, el 25,74% (n = 26) respondió afirmativamente, mientras que el 54,46% (55) indicó lo contrario. De esto, 14 (13,86%) fueron médicos, 39 (38,61%) enfermeros y 2 (1,98%) fueron AP (χ 2 = 2,66, p = 0,62). Si se infectaron accidentalmente con EVE después de atender a un paciente con EVE, 98 (97,03%) de los encuestados indicaron que aceptarían estar aislados (χ 2 = 4,69, p = 0,321). Mientras tanto, el 44,55% (n = 45) de los HCW atender Un total de 92 (91.09%) HCWs encuestados indicaron que no estaban adecuadamente entrenados para manejar un caso sospechoso de EVE. Cuando se les pidió que evaluaran su competencia en el manejo de un paciente sospechoso de EVE, 18.81% (n = 19) indicaron que tenían poca confianza y competencia, mientras que 6,93% (n = 7) indicaron que estaban extremadamente seguros de manejar un caso sospechoso de EVE (χ 2 = 13.09, p = 0.11). Más allá de la EVE, pedimos a nuestra población de la encuesta que nombrara otras enfermedades propensas a la epidemia. Del total de HCWs entrevistados, 56.43% (57/101) mencionaron enfermedades epidémicas de origen bacterial como tuberculosis y cólera. Otro 33,70% (34/101) llamaron enfermedades de origen viral como SARS, gripe, VIH, fiebre de Lassa y dengue, mientras que 9,90% (10 Cuando se les preguntó la forma de compensación que los HCW consideraban apropiada cuando se ocupaban de un paciente sospechoso de ébola, las respuestas recibidas incluían el seguro personal (32/101), la indemnización familiar en caso de muerte (31/101), el dinero (30/101) y los premios (8/101), mientras que otros también sugirieron la promoción del empleo (7/101), y otros (18/101). Nuestra población de la encuesta recomendó la provisión de logística y capacitación como dos cuestiones clave en el camino a seguir para preparar adecuadamente a los HCW hacia cualquier enfermedad propensa a la epidemia. Si bien se tiene constancia de que el reciente brote de EVD registró una mortalidad muy alta entre los HCW, según sabemos, sólo unos pocos estudios han abordado estas cuestiones en previsión de un brote de EVD, particularmente en países no afectados por la epidemia de EVD y especialmente en el África subsahariana, este estudio es casi inexistente. Por lo tanto, nuestro estudio evaluó cómo los HCW preparados están frente a una posible epidemia de EVD. Los resultados de esta encuesta mostraron que más de la mitad (54,46%) de los HCW indicaron que sus instalaciones no estaban listas para tratar casos de EVD. Casi el 92% indicaron que no estaban adecuadamente entrenados para manejar un caso sospechoso de EVD y no es sorprendente que menos del 50% indicaran que estarían dispuestos a atender a un paciente sospechoso. Además, casi un tercio de los HCW también querrían un seguro para sí mismos y sus familias en caso de que estuvieran infectados Estos resultados son claramente indicativos de lo mal preparados que están los HCW encuestados en la cara de una enfermedad propensa a la epidemia potencialmente mortal, como la EVD en Ghana. En este estudio, sólo el 25,7% de los HCW dijeron que sus instalaciones estaban suficientemente equipadas para manejar un brote de EVD. Tales bajas calificaciones de los hospitales por la mayoría de los HCW son una marca de falta de confianza en sus instalaciones de preparación y esto puede indicar una verdadera falta de preparación y preparación de los hospitales para manejar no sólo los casos de EVD sino otras enfermedades potencialmente propensas a epidemias. Alternativamente, también podría significar que los HCW eran probablemente inconscientes de los trabajos preparatorios y reequipamiento de sus instalaciones para manejar la situación de los brotes de EVD. La disposición a trabajar durante brotes y emergencias se considera un sentido del deber incluso frente al riesgo. En este estudio, menos del 50% de los HCW indicaron su Además, más de un tercio indicó varias formas de compensación para sí mismos o las familias en caso de muerte o mientras se ocupa de un caso de EVD, lo que implica que si los HCWs están seguros o garantizados de que ellos y sus familias serían atendidos en caso de muerte o mientras se ocupan de un caso de EVD, trabajarán de buena gana frente a cualquier escenario de emergencia. La suposición es que los HCWs trabajarían de buena gana frente a una emergencia de enfermedades infecciosas y responderían adecuadamente; sin embargo, hay evidencias de que los HCWs evitan este "deber sagrado" en el cuidado de los pacientes y dejarían a los pacientes vulnerables en tiempos de crisis [11]. Para evitar que los HCW se infecten mientras están obligados a trabajar incluso frente al riesgo personal que exigen sus códigos de ética y profesionalismo, es imperativo asegurar que se cumplan las normas convencionales, garantías y prácticas de salud pública adecuadas para que los HCW puedan responder a tales brotes de manera que no estén infectados y o afectados a pesar de los riesgos que puedan enfrentar y seguir enfrentando [12]. Así, el entrenamiento adecuado de los HCW como lo indicaron los encuestados durante el estudio, junto con la reequipación de algunos centros de salud, es muy crítico para asegurar que estén equipados con los conocimientos y herramientas necesarios para trabajar frente a cualquier epidemia. El conocimiento general de la EVD es crucial para responder adecuadamente y atender a los pacientes. Casi el 17% de nuestra población de estudio no pudo identificar que la EVD es causada por un virus. Menos del 10% pudo identificar correctamente el 0,5% de hipoclorito de sodio como el mejor desinfectante de las muchas opciones proporcionadas, lo que contradice fuertemente un estudio similar realizado en Conakry durante el pico de la epidemia, donde el 68% de los HCW conocían la concentración correcta de desinfectante [5]. Aunque no intentan comparar estos dos escenarios, esta información puede ser vital para la comprensión de que el conocimiento de los HCW en la prevención de infecciones y medidas de control es crítico en su cumplimiento de su deber. Este estudio mostró que la mayoría de los HCWs escucharon por primera vez de EVD a través de los medios de comunicación, especialmente la radio. Esto establece el papel crucial que juegan los medios de comunicación en informar a la población general en tales brotes de enfermedad. A pesar del pluralismo de los medios de comunicación, sigue incumbiendo a las instituciones e instalaciones de salud organizar una formación especial sobre cualquier enfermedad infecciosa emergente que se produzca a nivel mundial para actualizar los conocimientos de los HCW. El aislamiento es una medida de salud pública clave para prevenir la propagación de enfermedades infecciosas. En este estudio, más del 97% de los HCW indicaron su voluntad de cumplir y aceptaron ser aislados en caso de que se infectaran después de atender a un paciente sospechoso de EVE. Sin embargo, una pequeña proporción de los HCW encuestados declararon que serían muy infelices, y esto podría afectar en última instancia al cumplimiento. El aislamiento es uno de los métodos más antiguos de control de brotes de enfermedades transmisibles para los pacientes [13]. Sin embargo, cabe señalar que menos del 50% dijeron que estarían dispuestos a atender a un paciente sospechoso de EVE y sospechamos que podría estar relacionado con el temor a la seguridad personal [14]. La respuesta de emergencia de una enfermedad epidémica propensa a un virus o patógeno exótico provocará naturalmente cierto nivel de miedo y escepticismo entre cualquier grupo de individuos, especialmente cuando su conocimiento sobre la dinámica del brote de la enfermedad es bajo. Hay historias de HCW que han evitado la responsabilidad de tratar a algunos pacientes [15] y esto se puso de manifiesto en el VIH/SIDA y el síndrome respiratorio agudo grave-Coronavirus (SARS-CoV) durante los años 1980 y 2003, respectivamente, donde el miedo al contacto con pacientes sospechosos e infectados apretó a algunos HCW [16, 17]. A la larga, este temor probablemente afectaría su confianza y compromiso con la profesionalidad. Los resultados de este estudio apuntan al hecho de que el conocimiento y la provisión de herramientas como el equipo de protección del personal (EPP) y otras logísticas por sí solas no son suficientemente buenas. El punto de vista general es que la devoción del país a su personal de salud puede ser un factor contributivo en todo esto y no puede ser ignorado. Sin embargo, inspirarse en los HCW y sentirse seguro en el cuidado de tales brotes de enfermedades altamente infecciosas es crítico. Durante nuestro estudio, los HCW indicaron varias formas de compensación que se les pagarían si fueran afectados en el caso del ataque de EVD. Este estudio tenía algunas limitaciones inherentes. Este estudio fue un estudio exploratorio y el tamaño de nuestra muestra fue limitado. Por lo tanto, aunque no tratamos de generalizar los resultados, somos de la opinión de que esto puede ser un reflejo de los HCW en general. Además, ya que nuestro estudio se centró principalmente en dos instalaciones de salud, de nuevo tenemos cuidado en extrapolarlos a otros para reflejar otras instalaciones. Además, como esto no ha sido una experiencia real, y una encuesta basada en cuestionarios, las respuestas pueden no reflejar A pesar de estas limitaciones, la necesidad de capacitación fue fuerte entre los HCW. Los resultados demuestran aún más la falta de preparación de los centros de salud, y la gran proporción de HCWs renuentes a atender a un caso sospechoso de EVE. Esto requiere esfuerzos concertados de las instituciones e instalaciones de salud para equipar y preparar a los HCWs con los instrumentos y conocimientos necesarios y asegurar la competencia para manejar cualquier enfermedad propensa a epidemias.

¿Cuántos trabajadores de la salud estarían dispuestos a seguir trabajando durante el brote del virus del Ébola?

Análisis basado en la secuenciación del ARN del transcriptoma del bazo después de la infección por el virus de la bronquitis infecciosa de pollos seleccionados para diferentes concentraciones séricas de lectina de unión de manoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4729133/SHA: f5f1cd43740b5b6eca8b3cf2714fc0854a746519Autores: Hamzić, Edin; Kjærup, Rikke Brødsgaard; Mach, Núria; Minozzi, Guilietta; Strozzi, Francesco; Gualdi, Valentina; Williams, John L.; Chen, Jun; Wattrang, Eva; Buitenhuis, Bart; Juul-Madsen, He La comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la interacción entre las respuestas inmunes innatas y adaptativas a la infección por IBV es un elemento crucial para la mejora de las estrategias de control del IB. Para ello, se estudiaron dos líneas de pollo, seleccionadas para la concentración sérica alta (línea L10H) y baja (línea L10L) de lectina de unión a manosa (MBL). En total, se utilizaron 32 aves de cada línea. Dieciséis aves de cada línea fueron infectadas con IBV y dieciséis no fueron infectadas. Ocho aves no infectadas e infectadas de cada línea fueron eutanizadas a las 1 y 3 semanas después de la infección. Se realizó secuenciación de ARN en muestras de bazo de las 64 aves y se realizó análisis de expresión genética diferencial para cuatro comparaciones: línea L10L frente a L10H para aves no infectadas en las semanas 1 y 3, respectivamente, y de la misma RESULTADOS: Comparando aves no infectadas L10H y L10L, identificamos 1698 y 1424 genes expresados diferencialmente (DE) en las semanas 1 y 3, respectivamente. Para las aves infectadas por IBV, 1934 y 866 genes DE fueron identificados entre las dos líneas en las semanas 1 y 3, respectivamente. Los dos términos de GO más enriquecidos que surgieron de la comparación de aves no infectadas entre las dos líneas fueron “Activación de linfocitos involucrados en la respuesta inmune” y “Recombinación somática de genes inmunoglobulinos involucrados en la respuesta inmune” en las semanas 1 y 3, respectivamente. Al comparar aves infectadas por IBV entre las dos líneas, los términos de GO más enriquecidos fueron “Activación de células T alfa-beta” y “Regulación positiva de la activación de leucocitos” en las semanas 1 y 3, respectivamente. CONCLUSIONES: Las aves sanas de las dos líneas mostraron diferencias significativas en los perfiles de expresión para subconjuntos de genes adaptativos e innatos relacionados con la inmunidad, mientras que la comparación de las aves infectadas por el IBV de las dos líneas mostró diferencias en la expresión de genes relacionados con la inmunidad involucrados en la activación y proliferación de las células T. Las diferencias observadas en el transcriptoma entre las dos líneas indican que la selección para el MBL había influido en la inmunidad innata, así como en la inmunidad adaptativa. MATERIAL COMPLEMENTARIO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.11866/s12864-016-2403-1) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Conclusiones: Las aves sanas de las dos líneas mostraron diferencias significativas en los perfiles de expresión para subconjuntos de genes adaptativos e innatos relacionados con la inmunidad Las diferencias de transcriptoma observadas entre las dos líneas indican que la selección de MBL influyó en la inmunidad innata y adaptativa.Keywords: IBV, Coronavirus, Bronquitis infecciosa, Pollo, secuenciación de ARN, Transcriptome, Bazo, Lectina de unión de Mannosa, Respuesta Inmune Antecedentes La bronquitis infecciosa aviar (IB) es una enfermedad aguda y altamente contagiosa del tracto respiratorio superior causada por el virus de la bronquitis infecciosa (IBV). El virus es un miembro de la familia Coronaviridae y tiene numerosos serotipos y cepas. La replicación rápida combinada con alta tasa de mutación y recombinación son las principales causas de la alta diversidad observada [1]. El tracto respiratorio es el órgano principal y punto de entrada del virus, antes de su posterior propagación a riñones y gónadas. Los síntomas más comunes del IB están relacionados con el tracto respiratorio e incluyen jadeo, tos, estornudos, rales traqueales y secreción nasal [2]. La conversión de alimento y el aumento diario medio se ven afectados en los pollos de engorde, y la infección suele ir seguida de infecciones bacterianas secundarias. En capas, el IBV causa una reducción en la producción y calidad de los huevos. Hoy en día, el IB es una de las enfermedades más importantes económicamente en la industria avícola [2]. Los brotes de infección se controlan mediante una combinación de prácticas estrictas de manejo y vacunación. Las prácticas de manejo estrictas, que incluyen el mantenimiento de la temperatura de la vivienda y la ventilación, son esenciales, ya que el IBV es altamente contagioso y se propaga muy rápido. Las vacunas vivas atenuadas e inactivadas se utilizan ampliamente para el control y la prevención de la infección por IBV [3, 4 Debido a que hay poca o ninguna protección cruzada entre los diferentes serotipos/variantes del virus, por lo tanto las vacunas deben contener serotipos presentes en un área particular para inducir una protección adecuada [1]. Nuevas vacunas de múltiples cepas con la combinación óptima de antígenos y adyuvantes óptimos son necesarias para el futuro control del IBV. Comprender los mecanismos moleculares implicados en la interacción entre las respuestas inmunes innatas y adaptativas a la infección por IBV es un elemento crucial para mejorar aún más las vacunas. La infección por IBV induce una amplia gama de respuestas inmunes en pollos. Una respuesta inmune innata se activa durante las etapas iniciales de infección en el revestimiento mucosa de la tráquea después de la unión de viriones del IBV a los receptores de células epiteliales [5]. La activación de esta respuesta inmune innata puede ser iniciada por el receptor de Además, se ha observado una rápida activación de las células asesinas naturales (NK) un día después de la infección por el IBV [8], así como un aumento del número de macrófagos en los pulmones y la tráquea después de la infección primaria por el IBV [9]. En el caso de las respuestas inmunes adaptativas, las subpoblaciones de linfocitos T participan activamente en las primeras etapas del aclaramiento del IBV [7, 10], exhibiendo una rápida activación sobre la infección por el IBV [6]. Además, los estudios han demostrado que los linfocitos T citotóxicos (LCT) desempeñan un papel importante en la respuesta a las infecciones primarias por el IBV [10, 11]. Además de las respuestas a las células T, se han notificado anticuerpos específicos del IBV, de las tres clases de anticuerpos presentes en los pollos [12] [13] [14]. Los sistemas inmunitarios innatos y adaptativos están fuertemente interconectados, lo que también se observa en la respuesta a la infección por IBV, y la conexión posiblemente implica la coleccion de suero, la lectina de unión a la mano (MBL) como agente clave [16]. En el presente estudio se utilizaron dos líneas de pollo seleccionadas para concentraciones séricas altas y bajas de MBL (designadas L10H y L10L, respectivamente). La cría selectiva se ha llevado a cabo durante 14 generaciones utilizando la combinación de dos cepas (67,5 % de pollos UM-B19 y 33,5 % de Cornish Blanco) como población inicial, según lo descrito por Juul-Madsen y otros [17]. El resultado final fue dos líneas divergentes, con concentraciones séricas medias de MBL de 33,4 μg/ml para la línea L10H y 7,6 μg/ml para la La concentración sérica media de MBL para 14 líneas de pollo diferentes que representan tanto pollos de engorde como capas es de alrededor de 6 μg/ml, pero varía de 0,4 a 37,8 μg/ml en pollos sanos normales con proteína producida en el hígado como principal fuente de MBL circulante [17]. En pollos, se ha observado una correlación positiva entre las concentraciones séricas de MBL y la gravedad de varias infecciones, tales como infecciones causadas por IBV [19], Escherichia coli [20] y Pasteurella multocida [21]. En pollos, el MBL se une al IBV [16, 22], por lo que es posible que el MBL facilite respuestas innatas como la opsonofagocitosis, la activación complementaria o la neutralización del virus, en las primeras etapas de la infección por IBV. En apoyo del papel de la MBL en respuesta al IBV, Kjaerup et al. [18] observaron diferencias considerables en los parámetros inmunes adaptativos celulares en respuesta a una infección por IBV entre las líneas L10L y L10H. Además, las aves de la línea L10H presentaron cargas virales menores y daño menos grave de los cilios traqueales después de la infección por IBV en comparación con las aves de la línea L10L. El objetivo de este estudio fue caracterizar el transcriptoma del bazo de las aves sanas de las dos líneas seleccionadas para el MBL sérico, e investigar las diferencias en los mecanismos moleculares detrás del desarrollo de inmunidad adaptativa sistémica entre las líneas L10L y L10H infectadas con IBV. La línea temporal experimental y los puntos de tiempo de muestreo están ilustrados en la figura 1 y Kjaerup et al. [18] Las aves fueron infectadas a las 3 semanas de edad y a partir del día 2 post-infección (p.i.), mostraron signos clínicos característicos de infección por IBV, incluyendo estornudos y respiración laboriosa. Se evaluaron cargas virales en hisopos traqueales para todas las aves como se informó en el artículo anterior publicado en el estudio experimental de infección [18]. No se detectaron virus en las aves no infectadas en ningún momento a lo largo del experimento. Se detectaron genomas virales en hisopos de aves infectadas del día 1 al 8 p.i. Cabe destacar que se observaron cargas virales significativamente menores (p < 0.03) en las aves de la línea L10H en comparación con las aves infectadas de la línea L10L [18]. Se produjeron datos de detección y cuantificación de la secuenciación de ARN de expresión génica esplénica de ocho aves infectadas y ocho Todas las muestras pasaron las medidas de control de calidad para las lecturas secuenciadas crudas y recortadas excepto para el individuo número 46, que fue eliminado debido a un número muy bajo de lecturas secuenciadas. Para las aves restantes, se obtuvo un promedio de más de 37 millones de lecturas por muestra para las 63 muestras analizadas, con el 81% de las lecturas cartografiadas a la secuencia de referencia del genoma del pollo, como se describe en la sección de materiales y métodos (Ver estadísticas resumidas con el número de lecturas cartográficas y totales se presenta en el archivo adicional 1: Tabla S1 ). En total, se identificaron 17.113 genes expresados. Después de filtrar genes con menos de una lectura por millón en ocho muestras [24] (genes que no alcanzarían significación estadística para la expresión diferencial), la lista final contenía 11.292 genes expresados. Antes de realizar el análisis diferencial de expresión génica, se realizó un análisis multivariable El diagrama de escalamiento multidimensional (SMD) en genes expresados entre las dos líneas, L10H y L10L, mostró que difieren considerablemente en sus perfiles del transcriptoma tanto para aves no infectadas como infectadas por el IBV [Ver Fichero Adicional 2: Figura S1 ]. Además, la variación interindividual en la expresión génica en la semana 1 fue considerablemente mayor que la observada en la semana 3 para aves no infectadas e infectadas por el IBV [Ver Fichero Adicional 2: Figura S1 ]. Las aves 22 y 47 fueron separadas del resto en la parcela del SMD [Ver Fichero Adicional 2: Figura S1 ]. Sin embargo, la inspección de los datos de secuencias en bruto y los parámetros de mapeo no identificaron ningún problema técnico que explicara el out-grouping observado de estas aves. Además, se realizó un análisis de componentes principales interclase (PCA) utilizando recuentos La interclase PCA reveló que las aves 22 y 47 fueron colocadas fuera de los intervalos de confianza del 95 % de sus respectivos tratamientos [Ver ficha adicional 3: Figura S2]. Sin embargo, la PCA no identificó ningún gen con perfiles de recuento extremos que pudieran haber contribuido a la dispersión del transcriptoma de las aves 22 y 47 con respecto a sus grupos de tratamiento.Aunque no hubo una clara explicación técnica o biológica para su fuera de grupo, estas muestras fueron retiradas del análisis posterior.Se realizó un análisis de expresión genética diferencial para comparar las dos líneas de pollo (L10L y L10H) en dos momentos para las líneas no infectadas (C1 y C2, ver Figura 1 ) y las aves infectadas por el IBV (C3 y C4, ver Figura 1 ).Un gran número de genes se expresaron diferencialmente (DE) entre las líneas L10L y L10H en las semanas 1 y 3, tanto para las aves no Se identificaron 1.698 y 1.424 genes DE para las aves no infectadas entre las líneas L10L y L10H en las semanas 1 y 3, respectivamente (ver Tabla 1 ). En total 692 genes tenían mayor expresión en la línea L10H y 1.006 tenían mayor expresión en la línea L10L para las aves no infectadas en la semana 1 [Ver Fichero adicional 4: Tabla S2 ] y 774 genes tenían mayor expresión en la línea L10H y 650 genes tenían mayor expresión en la línea L10L para las aves no infectadas en la semana 3 [Ver Fichero adicional 5: Tabla S3 ]. Comparando las aves infectadas por IBV L10H y L10L, se identificaron 1.934 y 866 genes DE en las semanas 1 y 3, respectivamente (ver Tabla 1 ). En total, 931 genes tenían mayor expresión en la línea L10H y 1.003 tenían mayor expresión en la línea L10L en la semana 1 y en la semana 3, 508 tenían mayor expresión en la línea L10H y 358 tenían mayor expresión en la línea L10L (tabla 1, archivo adicional 6: tabla S4 y archivo adicional 7: tabla S5 ). También hubo cambios relacionados con el estado en la expresión génica como se muestra en el diagrama de Venn (fig. 2). En la semana 1, el número total de genes DE en aves no infectadas Fig. 2 ). De 3.011 (1077 + 621 + 1313) genes DE para aves no infectadas e infectadas entre las dos líneas sólo 621 (~20 %) fueron comunes para dos comparaciones (fig. 2 ). En la semana 3, el número total de genes DE en aves no infectadas entre las dos líneas fue de 1424 (883 + 541) 2 ) que fue mayor en comparación con 866 (541 + 325) en las aves infectadas entre las dos líneas (Tabla 1, Fig. 2 ). Al comparar las aves no infectadas e infectadas entre las dos líneas, 541 (~30 %) genes fueron comunes de un total de 1749 (883 + 541 + 325) genes DE para ambas comparaciones (Fig. 2). Además, también se realizó un análisis diferencial de expresión génica para comparar dos puntos de tiempo (semana 1 y semana 3) en las dos líneas de pollo (L10L y L10H) para las aves no infectadas (C5 y C6, ver Fig. 1 ) y IBV (C7 y C8, ver Fig. 1 ). Finalmente, se realizó un análisis diferencial de expresión génica para comparar los dos estados de infección (infectados e infectados por IBV) en dos puntos de tiempo para la línea de pollo L10L (C9 y C10, ver Tabla S6, Fichero adicional 9: Tabla S7, Fichero adicional 10: Tabla S8, Fichero adicional 11: Tabla S9, Fichero adicional 12: Tabla S10, Fichero adicional 13: Tabla S11, Fichero adicional 14: Tabla S12 y Fichero adicional 15: Tabla S13 ]. Se realizó un análisis de conjunto de genes de enriquecimiento para identificar términos de Ontología (GO) "Proceso del Sistema Inmune" sobrerrepresentados utilizando las listas de genes DE de comparaciones entre aves no infectadas e infectadas de las dos líneas a 1 y 3 semanas p.i. Los términos más enriquecidos del Sistema Inmune GO entre las dos Los términos del Sistema Inmune GO asociados a genes que se expresaron diferencialmente entre las dos líneas para las aves no infectadas en la semana 1 fueron "Activación de linfocitos involucrados en la respuesta inmune" (GO:0002285), "Activación de la respuesta inmune innata" (GO:0002218), "Inmunidad mediada por linfocitos" (GO:0002449), y "Comparación de leucocitos entre las dos líneas, L10H y L10L, aves no infectadas e infectadas en dos momentos (semanas 1 y 3). 1 Para las aves no infectadas en la semana 3, los términos del Sistema Inmunitario GO más enriquecidos fueron "Recombinación somática de genes de inmunoglobulina involucrados en la respuesta inmune" (GO:0002204) y "Reacción inmune adaptativa basada en la recombinación somática de receptores inmunes construidos a partir de la superfamilia inmunoglobulina" (GO:0002460) [Ver Fig. 3, Ver Fichero adicional 17: Figura S4 ]. En total, 47 genes DE mapeados a términos del Sistema Inmunitario GO en esta comparación (Fig. 4). Entre los genes DE que tuvieron una expresión más alta en la línea L10H en la semana 3, en el grupo no infectado, fueron IL7, FKBP1B, FAS y PTPN22, que también fueron vistos diferencialmente expresados entre líneas en la semana 1 [Ver Fig. 4 Comparando las aves infectadas de las dos líneas, en la semana 1, "Activación de células alfa-beta T" (GO:0046631), "Activación de la respuesta inmune innata" (GO:0002218) y "Diferenciación de leucocitos" (GO:0002521) las funciones fueron los tres términos más enriquecidos del sistema inmunológico GO (Fig. 3). CXCR4 (Receptor de quimioterapia 4), PTPN22 y FAS estaban entre los genes más altamente expresados en L10H [Ver Fig. 4, Fichero adicional 18: Figura S5 ]. El término principal del sistema inmunológico GO que fue fuertemente enriquecido para las aves infectadas en la semana 3 fue "Regulación positiva de la activación de leucocitos" (GO:0002696) [Ver Figura S6 ]. El presente estudio utilizó dos líneas, L10L y L10H, que han sido seleccionadas divergentemente para una concentración sérica alta y baja de MBL durante 14 generaciones, Fig. 3 Mapa funcional de genes expresados diferencialmente enriquecidos para términos del Sistema Inmune GO. Las categorías superiores de los términos del Sistema Inmune GO asociados con genes expresados diferencialmente (DE), todas ellas estadísticamente significativas (valor p ajustado < 0,001). Los fragmentos de la tabla representan el número de genes asociados a los términos como proporción del número total de genes dentro del término GO respectivo. Los términos que no se han agrupado se muestran en gris respectivamente. Estas dos líneas han sido ampliamente utilizadas para estudios inmunológicos y muestran diferencias en parámetros inmunológicos después de ser desafiados con varios patógenos [18, 22, 25]. El bazo es un órgano linfoide secundario donde las respuestas inmunes innatas y adaptativas pueden ser montadas de Además, se considera que el bazo aviar desempeña un papel inmunológico muy importante, ya que los vasos linfáticos y los ganglios linfáticos aviares están mal desarrollados [26]. Se investigaron las diferencias del transcriptoma en el bazo entre las dos líneas, L10L y L10H, para las aves no infectadas (saludables) y las infectadas por el IBV, centrándose en la expresión diferencial de genes inmunorelacionados dentro de términos de GO significativamente enriquecidos relacionados con el inmune. Se observaron grandes diferencias en los perfiles del transcriptoma entre las aves de las dos líneas, tanto no infectadas (saludables) como siguiendo el desafío experimental del IBV [Ver ficha adicional 2: Figura S1 ]. La representación del mapa de calor de los genes expresados diferencialmente (DE) asociados con los términos del Sistema Inmune GO para las cuatro comparaciones entre las dos líneas, L10H y L10L, no infectados e infectados en dos puntos de tiempo, semanas 1 y 3. El mapa de calor se construye utilizando los valores promedio de recuentos por millón para cada grupo que la selección de los niveles séricos de MBL en las dos líneas tuvo un efecto mucho más amplio que va más allá de la expresión del gen MBL [27]. Las diferencias de transcriptoma observadas pueden probablemente atribuirse a una respuesta correlacionada a la selección [28] o deriva genética aleatoria [29]. La selección relacionada ocurre cuando un rasgo se ve afectado por la selección en otro rasgo y depende de una correlación genética entre los dos rasgos, que es bien conocida en la cría animal [30]. Alternativamente, la deriva genética aleatoria podría contribuir a las diferencias observadas Centrándose en la expresión de genes relacionados con la inmunidad: en la semana 1, las aves no infectadas mostraron diferencias en la expresión de genes involucrados tanto en la inmunidad adaptativa como en las vías relacionadas con la inmunidad innata [Ver el archivo adicional 16: Figura S3 ]. Además, la línea L10H tuvo una expresión inferior para el subconjunto de los genes inmunes innatos, TYRO3, TRAF3 y TLR7 en la semana 1 [Ver el archivo adicional 16: Figura S3 y Fig. 4 ]. TYRO3 codifica el receptor de tirosineproteína cinasa 3 (TYRO3) que está involucrado en la inhibición de las vías de señalización de TLR y las vías de señalización de citoquinas inducidas por TLR. Estas dos vías influyen en los procesos relacionados con la inmunidad, incluyendo proliferación celular/supervivencia, adhesión celular y migración e inhibe la respuesta inflamatoria innata a los TRAF3 codifica una proteína de señalización citoplasmática, que juega un papel crítico en la regulación de la respuesta antiviral y la evasión viral [32] [33]. TLR7 también fue uno de los genes innatos de inmunidad DE con mayor expresión en la línea L10H. Chicken TLR7 ha demostrado desempeñar un papel en la respuesta a las infecciones por VBI [9, 35]. Además de las diferencias en los perfiles de expresión de un subconjunto de genes inmunes innatos, las dos líneas también difieren en su expresión de genes inmunes adaptativos. Las aves no infectadas de L10H tuvieron una expresión genética más alta en comparación con la línea L10L, para TGFB3, IL7, FKBP1B, FAS y PTPN22. Estos genes son conocidos por estar involucrados en una amplia gama de procesos inmunes adaptativos. En los seres humanos, la reducción de la señalización TGF-β en las células T ha demostrado aumentar la función de las células CD8 T de manera indirecta, lo que resulta en la rápida eliminación de virus, lo que permite la creación de una respuesta eficaz de la memoria [36]. Del mismo modo, la IL-7 humana desempeña un papel clave en la supervivencia de ambas células ingenuas [37] y de la memoria [38, 39] CD4 y CD8 T. Además, un estudio in vitro mostró que la inhibición de FKBP1B y otras ciclofilinas bloquearon la replicación de diferentes Coronavirus, incluyendo el IBV [40]. Por analogía, las aves no infectadas de la línea L10H tuvieron una mayor expresión de IL7, FKBP1B, FAS y PTPN22. Generalmente las aves no infectadas (saludables) de las dos líneas exhiben diferentes perfiles de La selección en la cría de animales ha demostrado tener un efecto extenso en una variedad de rasgos incluyendo inmunológicos [30]. Además, se ha observado una respuesta correlacionada a la selección en el caso en que la selección se realizó en rasgos menos complejos como los niveles de testosterona [41]. Finalmente, diferentes perfiles de expresión para el subconjunto de inmunes innatos y adaptativos en las aves no infectadas de las dos líneas podrían deberse al equilibrio en el efecto de los niveles séricos de MBL. Altos niveles de MBL humanos han sido reportados principalmente como beneficiosos mientras que en caso de enfermedad parasitaria intracelular el efecto del nivel sérico de MBL podría ser opuesto [42]. Los resultados indican que la selección de los niveles séricos de MBL podría conducir a favorecer modos específicos de respuestas inmunes dependiendo de la función de MBL. Se observaron grandes diferencias en los patrones de expresión entre las dos líneas que siguieron a la infección por el IBV y estas diferencias involucraron vías adaptativas relacionadas con la inmunidad que se asocian con la activación de las células T alfa-beta (GO:0046631) y la activación de la respuesta inmune innata (GO:0002218) [Ver archivo adicional 18: Figura S5 ]. El enriquecimiento observado para los términos GO relacionados con la activación de las células T está de acuerdo con un estudio previo de estas líneas que mostró que las células T específicas del IBV están presentes en grandes números en el bazo después de la infección por el IB [43]. En la semana 1 post infección CXCR4, FAS y PTPN22 mostraron mayor expresión en la línea L10H. Los receptores de quimioquinas CXC se expresan en las células T efectoras y de memoria y desempeñan un papel clave en la homeostas Se ha demostrado que la FAS está regulada en el riñón de los pollos con VBI [45]. La vía Fas/FasL es una vía importante para matar células T citotóxicas [46]. Del mismo modo, se ha demostrado que la PTPN22 se expresa de manera diferencial en los pollos después del desafío patógeno, y en particular después de la infección por Escherichia coli [47]. Además, VCAM1 y JMJD6 estuvieron entre los genes adaptativos relacionados con la inmunidad DE entre líneas en la semana 3 [Ver Fig. 4, Fichero adicional 19: Figura S6 ]. Se sabe que el gen VCAM1 está involucrado en la activación de células T [48]. Además, un estudio reciente demostró que JMJD6 regula la proliferación de células T de memoria durante una infección viral [49], lo que es de gran interés teniendo en cuenta que Los resultados muestran que las dos líneas difieren grandemente en la expresión de genes adaptativos relacionados con la inmunidad después de la infección, lo que puede implicar la presencia de diferentes modos de regulación génica. Los tiempos de muestreo fueron elegidos para acceder a las respuestas tanto en la fase efectora (semana 1) como en la fase de memoria (semana 3) de la respuesta inmune adaptativa al IBV. De acuerdo, a la semana 1 los subconjuntos de infección post-infección de genes que participan activamente en la proliferación de células T muestran diferencias entre las líneas. Además, en la semana 3 los perfiles de expresión génica inmune en respuesta a la infección por IBV que difieren entre las líneas están más relacionados con el mantenimiento de la memoria de las células T. Se sabe que el MBL está involucrado en la regulación de la maduración de las células dendríticas, así como en la producción de citocinas [50]. Por lo tanto, las dos líneas seleccionadas para diferentes concentraciones séricas de MBL pueden mostrar diferencias en las respuestas inmunes adaptativas y el desarrollo de inmunidad adaptativa como resultado de diferencias en la respuesta a la señalización de citoquinas de células dendríticas. Otros estudios de las dos líneas, L10L y L10H, han demostrado que difieren en los parámetros de respuesta a la enfermedad después de ser desafiados con diferentes patógenos. La línea L10L se ha asociado con un aumento de la replicación viral en las vías respiratorias después de una infección por el virus de la bronquitis infecciosa (VII) [18], una tasa de crecimiento reducida después de una infección por Escherichia coli [20] y una mayor colonización intestinal después de la infección por Salmonella Infantis [51]. Además, las aves L10H en el presente estudio mostraron un daño menos severo de los cilios traqueales después de la infección por VBI en comparación con la línea L10L (datos no publicados).En el experimento actual se observaron diferencias fenotípicas en rasgos adicionales relacionados con la inmunidad adaptativa, incluyendo el número de células B circulantes y células T citotóxicas [18]. A partir de estas observaciones parece que la selección de alta concentración sérica de MBL permite a las aves hacer frente mejor después de infectarse con una gama de patógenos. Por lo tanto, las diferencias observadas en los perfiles de expresión para los genes inmunes adaptativos e innatos son un reflejo de las diferencias en la resistencia a la enfermedad y las respuestas inmunitarias entre las líneas L10L y L10H. En conclusión, se observaron grandes diferencias en el transcriptoma del bazo entre las dos líneas de pollo Las aves no infectadas de las dos líneas mostraron diferencias en los perfiles de expresión para un subconjunto de genes adaptativos e innatos relacionados con la inmunidad, lo que puede representar diferencias en la preparación para responder a una infección. Después de la infección por IBV, las dos líneas mostraron grandes diferencias en la expresión de genes involucrados en la respuesta inmune celular adaptativa como la activación y las vías de proliferación de las células T y por lo tanto su capacidad para responder a la infección, lo que se refleja en la diferencia en la carga de patógenos observada entre las dos líneas. Este estudio es un seguimiento del experimento realizado por Kjaerup et al. [18] que caracterizó la respuesta inmune celular y humoral de las dos líneas de pollo, L10H y L10L, divergentemente seleccionadas para concentraciones séricas de MBL tras la infección por IBV. En total, 96 aves fueron utilizadas en el estudio experimental provenientes de las dos Las 96 aves fueron criadas juntas en un ambiente bioseguro libre de IBV hasta que tenían 3 semanas de edad y luego asignadas a dos grupos diferentes con 24 aves de cada línea en cada grupo (no infectadas e infectadas). Las aves fueron transferidas a una instalación de nivel de bioseguridad 2 y colocadas en aisladores. Dos aisladores contenían pollos no infectados y dos aisladores contenían pollos infectados. Cada aislador tenía una mezcla igual de las dos líneas descritas por Kjaerup et al. [18]. La cepa virulenta IBV-M41 se utilizó para la infección (un regalo amable del Dr. med. vet. Hans C. Philipp en la Lohmann Animal Health GmbH, Cuxhaven, Alemania). La inócula IBV fue preparada en solución salina fosfatada (PBS) inmediatamente antes de su uso y contenía 2 × 10,2 EID 50 /200 μl de virus IBV-M41. El primer y el segundo grupo (los grupos no infectados) fueron infectados con 200 μl de PBS por ave. El tercero y el cuarto grupo (los grupos infectados) recibieron 200 μl de IBV-M41. La inócula fue administrada medio nasal y medio por vía oral para imitar las vías naturales de infección del IBV en el pollo. Los pollos fueron alimentados con dietas que cumplían o superaban los requisitos del Consejo Nacional de Investigación. Se proporcionó alimento y agua ad libitum. Las aves fueron monitoreadas diariamente para detectar signos clínicos de enfermedad y los parámetros de enfermedad fueron medidos según lo reportado por Kjaerup et al. [18]. El estudio se realizó bajo estricta aprobación ética y monitoreo (ver la declaración al final de la sección Materiales y Métodos). Para este estudio se recolectaron 64 muestras de bazo y se utilizaron para la secuenciación del ARN. Las aves fueron sacrificadas 1 y 3 semanas después de la infección por dislocación cervical y se recolectaron muestras de bazo. En ambos momentos, se recolectaron ocho muestras de las dos líneas, L10H y L10L, de cada grupo (no infectadas e infectadas) como se ilustra en la Fig. 1. Después de la recolección, los bazos fueron seccionados (rebanda transversal triangular de la parte superior) y muestras idénticas de cada pollo fueron inmediatamente colocadas en la Solución de Estabilización RNAlater® (Ambion Inc., Austin, Texas) que fueron incubadas a 4°C durante la noche y luego transferidas a -20°C el día siguiente. Las muestras de tejido fueron homo El ARN total se extrajo con el kit Qiagen RNAeasy (Catalog ID 74104, Qiagen, Venlo, Países Bajos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad de las 64 muestras de ARN total se verificó utilizando un dispositivo de cinta adhesiva ARN de 2200 TapeStation (Agilent, Santa Clara, CA, EE.UU.) y la concentración se determinó utilizando un espectrofotómetro ND-1000 (Nano-Drop, Wilmington, DE). Las bibliotecas se prepararon con el kit de preparación de muestras de Ilumina TruseqRNA (Catalog ID FC-122-1001, Ilumina, San Diego, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante y se evaluaron con la Estación Agilent Tape 2200. Las bibliotecas fueron cuantificadas por Picogreen y luego normalizadas a 10 nM Las cantidades equimolares de cada biblioteca se mezclaron antes de la desnaturalización de NaOH. El kit de clúster de Ilumina Truseq PE v3 (Catalog ID PE-401-3001) se utilizó para generar clústeres en la célula de Ilumina Flowcell injertada y las bibliotecas hibridadas se secuenciaron en seis líneas de una célula de Flowcell en el Hiseq2000 con 100 ciclos de un módulo de secuenciación de extremo emparejado utilizando el kit de Truseq SBS v3 (Catalog ID FC-401-3001). Control de calidad, mapeo de secuencias de ARN lee y recuento mapeo lee La calidad de control inicial fue evaluada por el software FastQC versión 0,11.3 [52]. Las lecturas en bruto fueron recortadas para bases de baja calidad utilizando la herramienta Trimmomatic versión 0.32 [ Las lecturas recortadas fueron cartografiadas al genoma de referencia de Gallus gallus (Gallus_gallus-4.0, versión 80 [54] ) utilizando un alineador empalmado TopHat2 versión 2.014 [55]. La anotación del gen Gallus gallus utilizada para el mapeo fue recuperada de la base de datos Ensembl versión 80 (www.ensembl.org ). La calidad del mapeo fue evaluada utilizando un conjunto de scripts Python dentro del conjunto de herramientas RSeQC [56]. La evaluación del control de calidad incluyó la inspección de la cobertura de lectura sobre todo el cuerpo genético para evaluar si la cobertura de lectura era uniforme y si había algún sesgo de 5' o 3', así como cómo las lecturas cartografiadas fueron distribuidas sobre las características del genoma. El HTSEq-count es un script Python dentro del marco HTSEq, versión 0.7.1, que es un kit de herramientas de código abierto que permite la entrada de los recuentos brutos de lecturas alineadas para ser anotados con nombres genéticos basados en características genómicas [57]. Los recuentos de lectura obtenidos se utilizaron para estimar la expresión génica e identificar genes expresados diferencialmente (DE). Esto se logró utilizando la versión 3.10.0 del paquete Bioconductor edgeR [58] y la versión 3.24.5 [59], siguiendo un protocolo descrito anteriormente [24]. Antes de realizar análisis estadísticos, los genes con bajos niveles de expresión se filtraron utilizando un umbral de al menos una lectura por millón en n de las muestras, donde n es el tamaño del grupo más pequeño de réplicas, que en este caso era ocho. Para tener en cuenta los efectos técnicos y biológicos, los recuentos se normal Esta función normaliza los datos encontrando un conjunto de factores de escalado para los tamaños de las bibliotecas que minimizan los cambios de log-fold entre las muestras. Los factores de escala fueron calculados utilizando la media recortada de valores M (TMM) entre las muestras [58]. Se calcularon estimaciones de dispersión comunes y etiquetadas con el método de probabilidad ajustado del perfil Cox-Reid con el fin de corregir la variación técnica y biológica al instalar el modelo binomio negativo multivariado [60]. El escalado multidimensional (MDS) se implementó en el paquete edgeR, para evaluar visualmente la similitud de las muestras. El gráfico MDS fue creado para visualizar la relación entre las muestras e identificar posibles valores atípicos [58]. El MDS se basa en comparar la relación entre todos los pares de muestras mediante la aplicación de una medida de distancia pareja específica [58]. La matriz fue construida para adaptarse al modelo saturado donde cada combinación de tratamiento fue considerada separadamente. Ocho combinaciones de tratamiento fueron consideradas como ilustradas en la Fig. 1 : aves no infectadas de la línea L10H en la semana 1, aves no infectadas de la línea L10L en la semana 1, aves infectadas de la línea L10H en la semana 1, aves infectadas de la línea L10L en la semana 1, aves no infectadas de la línea L10L en la semana 3, aves infectadas de la línea L10H en la semana 3, aves infectadas de la línea L10L en la semana 3, aves infectadas de la línea L10L en la semana 3. Una prueba de la relación de probabilidad del modelo lineal generalizado, especificando la diferencia de interés, fue utilizada para probar la expresión diferencial entre estas combinaciones de tratamiento. El análisis de expresión diferencial se realizó comparando las diferencias de log-fold en los recuentos genéticos entre dos líneas (L10H y L10L) en diferentes puntos de tiempo (semanas 1 y 3) y para diferentes estados (no infectados e infectados) por separado (Fig. 1 ). Las tasas de falso descubrimiento de Benjamini Hochberg (FDR) para un experimento con transcriptoma en todo el área fueron calculadas para corregir para pruebas múltiples [61]. Todos los genes con un valor p ajustado en FDR <0,05 fueron considerados genes de interés individuales y fueron retenidos para un análisis posterior. El análisis funcional de los genes DE se realizó utilizando la versión Citoscape 3.2.1 [62, 63] con la versión ClueGo 2.1.7 plug-in [64] para enriquecer la anotación y enriquecimiento de los genes expresados diferencialmente (DE) para cuatro comparaciones (C1- ClueGO determina la distribución de los genes diana a través de los términos y vías de GO (ontología genética): este estudio se centró en: el valor p se calculó utilizando pruebas hipergeométricas del lado derecho y el ajuste de Benjamini-Hochberg se utilizó para la corrección de múltiples pruebas; un valor p ajustado de 0,001 indicó una desviación estadísticamente significativa de la distribución esperada, y que los términos y vías de GO correspondientes se enriquecieron para los genes diana; la fuerza de asociación entre los términos se calculó utilizando una estadística de kappa corregida de 0,4; la red creada representó los términos como nodos que estaban vinculados en base a un nivel de puntuación de 0,4 kappa; el tamaño de los nodos reflejó la significancia de enriquecimiento de los términos; la red se estableció automáticamente mediante el algoritmo de diseño orgánico apoyado por Cytoscape; los grupos funcionales fueron creados mediante la fusión iterativa de grupos inicialmente definidos Sólo los grupos funcionales representados por su término más significativo fueron visualizados en la red proporcionando una visión perspicaz de sus interrelaciones [64]. Los procedimientos experimentales se llevaron a cabo bajo los protocolos aprobados por la Inspección Danesa de Experimentos Animales y cumplieron con la Ley No 382 del Ministerio de Justicia de Dinamarca (10 de junio de 1987) y las Leyes 739 (6 de diciembre de 1988) y 333 (19 de mayo de 1990) sobre experimentación y cuidado de animales experimentales. La licencia para realizar el experimento animal fue obtenida por Helle R. Juul-Madsen. comparación entre aves no infectadas en la semana 1. Los términos del Sistema Inmune GO fueron identificados como nodos y vinculados basados en su nivel de puntuación kappa (> = 0,4) y valor p < 0,001. Grupos relacionados funcionalmente parcialmente superpuestos. Los términos GO están etiquetados en colores de acuerdo con la agrupación jerárquica de términos GO. Los términos Las tablas circulares de color de los nodos del sistema inmune GO muestran la proporción génica asociada con el término respectivo. (PDF 60 kb)Archivo adicional 17: Figura S4. Representación en red de los términos enriquecidos del sistema inmunológico GO de los genes expresados diferencialmente (DE) para la comparación entre aves no infectadas en la semana 3. Los términos del sistema inmunológico GO se identificaron como nodos y se vincularon en base a su nivel de puntuación kappa (> = 0,4) y valor p < 0,001. Los grupos relacionados funcionalmente parcialmente se superponen. Los términos GO se etiquetan en colores según la agrupación jerárquica de términos GO. Los términos que no se han agrupado se muestran en gris. Los gráficos circulares de color de los nodos del sistema inmunológico GO muestran la proporción génica asociada con el término respectivo. (PDF 55 kb) Fichero adicional 18: Figura S5. Representación en red Los términos GO Immune System fueron identificados como nodos y enlazados en base a su nivel de puntuación kappa (> = 0.4) y valor p < 0.001. Los grupos funcionalmente relacionados parcialmente se superponen. Los términos GO se etiquetan en colores de acuerdo a la agrupación jerárquica de términos GO. Los términos que no se han agrupado se muestran en gris. Los gráficos de color de los nodos GO Immune System muestran la proporción de genes asociados con el término respectivo. (PDF 70 kb) Archivo adicional 19: Figura S6. Representación en red de los términos enriquecidos GO Immune System de los genes expresados diferencialmente (DE) para la comparación entre aves infectadas en la semana 3. Los términos GO Immune System fueron identificados como nodos y vinculados en base a su nivel de puntuación kappa (> = 0.4) y p-valor < 0.001. Los grupos funcionalmente Los términos que no se han agrupado se muestran en gris. Las tablas de colores de los nodos del sistema inmune GO muestran la proporción de genes asociada con el término respectivo. (PDF 30 kb)

¿Qué causa la bronquitis infecciosa aviar?

Análisis basado en la secuenciación del ARN del transcriptoma del bazo después de la infección por el virus de la bronquitis infecciosa de pollos seleccionados para diferentes concentraciones séricas de lectina de unión de manoshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4729133/SHA: f5f1cd43740b5b6eca8b3cf2714fc0854a746519Autores: Hamzić, Edin; Kjærup, Rikke Brødsgaard; Mach, Núria; Minozzi, Guilietta; Strozzi, Francesco; Gualdi, Valentina; Williams, John L.; Chen, Jun; Wattrang, Eva; Buitenhuis, Bart; Juul-Madsen, He La comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la interacción entre las respuestas inmunes innatas y adaptativas a la infección por IBV es un elemento crucial para la mejora de las estrategias de control del IB. Para ello, se estudiaron dos líneas de pollo, seleccionadas para la concentración sérica alta (línea L10H) y baja (línea L10L) de lectina de unión a manosa (MBL). En total, se utilizaron 32 aves de cada línea. Dieciséis aves de cada línea fueron infectadas con IBV y dieciséis no fueron infectadas. Ocho aves no infectadas e infectadas de cada línea fueron eutanizadas a las 1 y 3 semanas después de la infección. Se realizó secuenciación de ARN en muestras de bazo de las 64 aves y se realizó análisis de expresión genética diferencial para cuatro comparaciones: línea L10L frente a L10H para aves no infectadas en las semanas 1 y 3, respectivamente, y de la misma RESULTADOS: Comparando aves no infectadas L10H y L10L, identificamos 1698 y 1424 genes expresados diferencialmente (DE) en las semanas 1 y 3, respectivamente. Para las aves infectadas por IBV, 1934 y 866 genes DE fueron identificados entre las dos líneas en las semanas 1 y 3, respectivamente. Los dos términos de GO más enriquecidos que surgieron de la comparación de aves no infectadas entre las dos líneas fueron “Activación de linfocitos involucrados en la respuesta inmune” y “Recombinación somática de genes inmunoglobulinos involucrados en la respuesta inmune” en las semanas 1 y 3, respectivamente. Al comparar aves infectadas por IBV entre las dos líneas, los términos de GO más enriquecidos fueron “Activación de células T alfa-beta” y “Regulación positiva de la activación de leucocitos” en las semanas 1 y 3, respectivamente. CONCLUSIONES: Las aves sanas de las dos líneas mostraron diferencias significativas en los perfiles de expresión para subconjuntos de genes adaptativos e innatos relacionados con la inmunidad, mientras que la comparación de las aves infectadas por el IBV de las dos líneas mostró diferencias en la expresión de genes relacionados con la inmunidad involucrados en la activación y proliferación de las células T. Las diferencias observadas en el transcriptoma entre las dos líneas indican que la selección para el MBL había influido en la inmunidad innata, así como en la inmunidad adaptativa. MATERIAL COMPLEMENTARIO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.11866/s12864-016-2403-1) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Conclusiones: Las aves sanas de las dos líneas mostraron diferencias significativas en los perfiles de expresión para subconjuntos de genes adaptativos e innatos relacionados con la inmunidad Las diferencias de transcriptoma observadas entre las dos líneas indican que la selección de MBL influyó en la inmunidad innata y adaptativa.Keywords: IBV, Coronavirus, Bronquitis infecciosa, Pollo, secuenciación de ARN, Transcriptome, Bazo, Lectina de unión de Mannosa, Respuesta Inmune Antecedentes La bronquitis infecciosa aviar (IB) es una enfermedad aguda y altamente contagiosa del tracto respiratorio superior causada por el virus de la bronquitis infecciosa (IBV). El virus es un miembro de la familia Coronaviridae y tiene numerosos serotipos y cepas. La replicación rápida combinada con alta tasa de mutación y recombinación son las principales causas de la alta diversidad observada [1]. El tracto respiratorio es el órgano principal y punto de entrada del virus, antes de su posterior propagación a riñones y gónadas. Los síntomas más comunes del IB están relacionados con el tracto respiratorio e incluyen jadeo, tos, estornudos, rales traqueales y secreción nasal [2]. La conversión de alimento y el aumento diario medio se ven afectados en los pollos de engorde, y la infección suele ir seguida de infecciones bacterianas secundarias. En capas, el IBV causa una reducción en la producción y calidad de los huevos. Hoy en día, el IB es una de las enfermedades más importantes económicamente en la industria avícola [2]. Los brotes de infección se controlan mediante una combinación de prácticas estrictas de manejo y vacunación. Las prácticas de manejo estrictas, que incluyen el mantenimiento de la temperatura de la vivienda y la ventilación, son esenciales, ya que el IBV es altamente contagioso y se propaga muy rápido. Las vacunas vivas atenuadas e inactivadas se utilizan ampliamente para el control y la prevención de la infección por IBV [3, 4 Debido a que hay poca o ninguna protección cruzada entre los diferentes serotipos/variantes del virus, por lo tanto las vacunas deben contener serotipos presentes en un área particular para inducir una protección adecuada [1]. Nuevas vacunas de múltiples cepas con la combinación óptima de antígenos y adyuvantes óptimos son necesarias para el futuro control del IBV. Comprender los mecanismos moleculares implicados en la interacción entre las respuestas inmunes innatas y adaptativas a la infección por IBV es un elemento crucial para mejorar aún más las vacunas. La infección por IBV induce una amplia gama de respuestas inmunes en pollos. Una respuesta inmune innata se activa durante las etapas iniciales de infección en el revestimiento mucosa de la tráquea después de la unión de viriones del IBV a los receptores de células epiteliales [5]. La activación de esta respuesta inmune innata puede ser iniciada por el receptor de Además, se ha observado una rápida activación de las células asesinas naturales (NK) un día después de la infección por el IBV [8], así como un aumento del número de macrófagos en los pulmones y la tráquea después de la infección primaria por el IBV [9]. En el caso de las respuestas inmunes adaptativas, las subpoblaciones de linfocitos T participan activamente en las primeras etapas del aclaramiento del IBV [7, 10], exhibiendo una rápida activación sobre la infección por el IBV [6]. Además, los estudios han demostrado que los linfocitos T citotóxicos (LCT) desempeñan un papel importante en la respuesta a las infecciones primarias por el IBV [10, 11]. Además de las respuestas a las células T, se han notificado anticuerpos específicos del IBV, de las tres clases de anticuerpos presentes en los pollos [12] [13] [14]. Los sistemas inmunitarios innatos y adaptativos están fuertemente interconectados, lo que también se observa en la respuesta a la infección por IBV, y la conexión posiblemente implica la coleccion de suero, la lectina de unión a la mano (MBL) como agente clave [16]. En el presente estudio se utilizaron dos líneas de pollo seleccionadas para concentraciones séricas altas y bajas de MBL (designadas L10H y L10L, respectivamente). La cría selectiva se ha llevado a cabo durante 14 generaciones utilizando la combinación de dos cepas (67,5 % de pollos UM-B19 y 33,5 % de Cornish Blanco) como población inicial, según lo descrito por Juul-Madsen y otros [17]. El resultado final fue dos líneas divergentes, con concentraciones séricas medias de MBL de 33,4 μg/ml para la línea L10H y 7,6 μg/ml para la La concentración sérica media de MBL para 14 líneas de pollo diferentes que representan tanto pollos de engorde como capas es de alrededor de 6 μg/ml, pero varía de 0,4 a 37,8 μg/ml en pollos sanos normales con proteína producida en el hígado como principal fuente de MBL circulante [17]. En pollos, se ha observado una correlación positiva entre las concentraciones séricas de MBL y la gravedad de varias infecciones, tales como infecciones causadas por IBV [19], Escherichia coli [20] y Pasteurella multocida [21]. En pollos, el MBL se une al IBV [16, 22], por lo que es posible que el MBL facilite respuestas innatas como la opsonofagocitosis, la activación complementaria o la neutralización del virus, en las primeras etapas de la infección por IBV. En apoyo del papel de la MBL en respuesta al IBV, Kjaerup et al. [18] observaron diferencias considerables en los parámetros inmunes adaptativos celulares en respuesta a una infección por IBV entre las líneas L10L y L10H. Además, las aves de la línea L10H presentaron cargas virales menores y daño menos grave de los cilios traqueales después de la infección por IBV en comparación con las aves de la línea L10L. El objetivo de este estudio fue caracterizar el transcriptoma del bazo de las aves sanas de las dos líneas seleccionadas para el MBL sérico, e investigar las diferencias en los mecanismos moleculares detrás del desarrollo de inmunidad adaptativa sistémica entre las líneas L10L y L10H infectadas con IBV. La línea temporal experimental y los puntos de tiempo de muestreo están ilustrados en la figura 1 y Kjaerup et al. [18] Las aves fueron infectadas a las 3 semanas de edad y a partir del día 2 post-infección (p.i.), mostraron signos clínicos característicos de infección por IBV, incluyendo estornudos y respiración laboriosa. Se evaluaron cargas virales en hisopos traqueales para todas las aves como se informó en el artículo anterior publicado en el estudio experimental de infección [18]. No se detectaron virus en las aves no infectadas en ningún momento a lo largo del experimento. Se detectaron genomas virales en hisopos de aves infectadas del día 1 al 8 p.i. Cabe destacar que se observaron cargas virales significativamente menores (p < 0.03) en las aves de la línea L10H en comparación con las aves infectadas de la línea L10L [18]. Se produjeron datos de detección y cuantificación de la secuenciación de ARN de expresión génica esplénica de ocho aves infectadas y ocho Todas las muestras pasaron las medidas de control de calidad para las lecturas secuenciadas crudas y recortadas excepto para el individuo número 46, que fue eliminado debido a un número muy bajo de lecturas secuenciadas. Para las aves restantes, se obtuvo un promedio de más de 37 millones de lecturas por muestra para las 63 muestras analizadas, con el 81% de las lecturas cartografiadas a la secuencia de referencia del genoma del pollo, como se describe en la sección de materiales y métodos (Ver estadísticas resumidas con el número de lecturas cartográficas y totales se presenta en el archivo adicional 1: Tabla S1 ). En total, se identificaron 17.113 genes expresados. Después de filtrar genes con menos de una lectura por millón en ocho muestras [24] (genes que no alcanzarían significación estadística para la expresión diferencial), la lista final contenía 11.292 genes expresados. Antes de realizar el análisis diferencial de expresión génica, se realizó un análisis multivariable El diagrama de escalamiento multidimensional (SMD) en genes expresados entre las dos líneas, L10H y L10L, mostró que difieren considerablemente en sus perfiles del transcriptoma tanto para aves no infectadas como infectadas por el IBV [Ver Fichero Adicional 2: Figura S1 ]. Además, la variación interindividual en la expresión génica en la semana 1 fue considerablemente mayor que la observada en la semana 3 para aves no infectadas e infectadas por el IBV [Ver Fichero Adicional 2: Figura S1 ]. Las aves 22 y 47 fueron separadas del resto en la parcela del SMD [Ver Fichero Adicional 2: Figura S1 ]. Sin embargo, la inspección de los datos de secuencias en bruto y los parámetros de mapeo no identificaron ningún problema técnico que explicara el out-grouping observado de estas aves. Además, se realizó un análisis de componentes principales interclase (PCA) utilizando recuentos La interclase PCA reveló que las aves 22 y 47 fueron colocadas fuera de los intervalos de confianza del 95 % de sus respectivos tratamientos [Ver ficha adicional 3: Figura S2]. Sin embargo, la PCA no identificó ningún gen con perfiles de recuento extremos que pudieran haber contribuido a la dispersión del transcriptoma de las aves 22 y 47 con respecto a sus grupos de tratamiento.Aunque no hubo una clara explicación técnica o biológica para su fuera de grupo, estas muestras fueron retiradas del análisis posterior.Se realizó un análisis de expresión genética diferencial para comparar las dos líneas de pollo (L10L y L10H) en dos momentos para las líneas no infectadas (C1 y C2, ver Figura 1 ) y las aves infectadas por el IBV (C3 y C4, ver Figura 1 ).Un gran número de genes se expresaron diferencialmente (DE) entre las líneas L10L y L10H en las semanas 1 y 3, tanto para las aves no Se identificaron 1.698 y 1.424 genes DE para las aves no infectadas entre las líneas L10L y L10H en las semanas 1 y 3, respectivamente (ver Tabla 1 ). En total 692 genes tenían mayor expresión en la línea L10H y 1.006 tenían mayor expresión en la línea L10L para las aves no infectadas en la semana 1 [Ver Fichero adicional 4: Tabla S2 ] y 774 genes tenían mayor expresión en la línea L10H y 650 genes tenían mayor expresión en la línea L10L para las aves no infectadas en la semana 3 [Ver Fichero adicional 5: Tabla S3 ]. Comparando las aves infectadas por IBV L10H y L10L, se identificaron 1.934 y 866 genes DE en las semanas 1 y 3, respectivamente (ver Tabla 1 ). En total, 931 genes tenían mayor expresión en la línea L10H y 1.003 tenían mayor expresión en la línea L10L en la semana 1 y en la semana 3, 508 tenían mayor expresión en la línea L10H y 358 tenían mayor expresión en la línea L10L (tabla 1, archivo adicional 6: tabla S4 y archivo adicional 7: tabla S5 ). También hubo cambios relacionados con el estado en la expresión génica como se muestra en el diagrama de Venn (fig. 2). En la semana 1, el número total de genes DE en aves no infectadas Fig. 2 ). De 3.011 (1077 + 621 + 1313) genes DE para aves no infectadas e infectadas entre las dos líneas sólo 621 (~20 %) fueron comunes para dos comparaciones (fig. 2 ). En la semana 3, el número total de genes DE en aves no infectadas entre las dos líneas fue de 1424 (883 + 541) 2 ) que fue mayor en comparación con 866 (541 + 325) en las aves infectadas entre las dos líneas (Tabla 1, Fig. 2 ). Al comparar las aves no infectadas e infectadas entre las dos líneas, 541 (~30 %) genes fueron comunes de un total de 1749 (883 + 541 + 325) genes DE para ambas comparaciones (Fig. 2). Además, también se realizó un análisis diferencial de expresión génica para comparar dos puntos de tiempo (semana 1 y semana 3) en las dos líneas de pollo (L10L y L10H) para las aves no infectadas (C5 y C6, ver Fig. 1 ) y IBV (C7 y C8, ver Fig. 1 ). Finalmente, se realizó un análisis diferencial de expresión génica para comparar los dos estados de infección (infectados e infectados por IBV) en dos puntos de tiempo para la línea de pollo L10L (C9 y C10, ver Tabla S6, Fichero adicional 9: Tabla S7, Fichero adicional 10: Tabla S8, Fichero adicional 11: Tabla S9, Fichero adicional 12: Tabla S10, Fichero adicional 13: Tabla S11, Fichero adicional 14: Tabla S12 y Fichero adicional 15: Tabla S13 ]. Se realizó un análisis de conjunto de genes de enriquecimiento para identificar términos de Ontología (GO) "Proceso del Sistema Inmune" sobrerrepresentados utilizando las listas de genes DE de comparaciones entre aves no infectadas e infectadas de las dos líneas a 1 y 3 semanas p.i. Los términos más enriquecidos del Sistema Inmune GO entre las dos Los términos del Sistema Inmune GO asociados a genes que se expresaron diferencialmente entre las dos líneas para las aves no infectadas en la semana 1 fueron "Activación de linfocitos involucrados en la respuesta inmune" (GO:0002285), "Activación de la respuesta inmune innata" (GO:0002218), "Inmunidad mediada por linfocitos" (GO:0002449), y "Comparación de leucocitos entre las dos líneas, L10H y L10L, aves no infectadas e infectadas en dos momentos (semanas 1 y 3). 1 Para las aves no infectadas en la semana 3, los términos del Sistema Inmunitario GO más enriquecidos fueron "Recombinación somática de genes de inmunoglobulina involucrados en la respuesta inmune" (GO:0002204) y "Reacción inmune adaptativa basada en la recombinación somática de receptores inmunes construidos a partir de la superfamilia inmunoglobulina" (GO:0002460) [Ver Fig. 3, Ver Fichero adicional 17: Figura S4 ]. En total, 47 genes DE mapeados a términos del Sistema Inmunitario GO en esta comparación (Fig. 4). Entre los genes DE que tuvieron una expresión más alta en la línea L10H en la semana 3, en el grupo no infectado, fueron IL7, FKBP1B, FAS y PTPN22, que también fueron vistos diferencialmente expresados entre líneas en la semana 1 [Ver Fig. 4 Comparando las aves infectadas de las dos líneas, en la semana 1, "Activación de células alfa-beta T" (GO:0046631), "Activación de la respuesta inmune innata" (GO:0002218) y "Diferenciación de leucocitos" (GO:0002521) las funciones fueron los tres términos más enriquecidos del sistema inmunológico GO (Fig. 3). CXCR4 (Receptor de quimioterapia 4), PTPN22 y FAS estaban entre los genes más altamente expresados en L10H [Ver Fig. 4, Fichero adicional 18: Figura S5 ]. El término principal del sistema inmunológico GO que fue fuertemente enriquecido para las aves infectadas en la semana 3 fue "Regulación positiva de la activación de leucocitos" (GO:0002696) [Ver Figura S6 ]. El presente estudio utilizó dos líneas, L10L y L10H, que han sido seleccionadas divergentemente para una concentración sérica alta y baja de MBL durante 14 generaciones, Fig. 3 Mapa funcional de genes expresados diferencialmente enriquecidos para términos del Sistema Inmune GO. Las categorías superiores de los términos del Sistema Inmune GO asociados con genes expresados diferencialmente (DE), todas ellas estadísticamente significativas (valor p ajustado < 0,001). Los fragmentos de la tabla representan el número de genes asociados a los términos como proporción del número total de genes dentro del término GO respectivo. Los términos que no se han agrupado se muestran en gris respectivamente. Estas dos líneas han sido ampliamente utilizadas para estudios inmunológicos y muestran diferencias en parámetros inmunológicos después de ser desafiados con varios patógenos [18, 22, 25]. El bazo es un órgano linfoide secundario donde las respuestas inmunes innatas y adaptativas pueden ser montadas de Además, se considera que el bazo aviar desempeña un papel inmunológico muy importante, ya que los vasos linfáticos y los ganglios linfáticos aviares están mal desarrollados [26]. Se investigaron las diferencias del transcriptoma en el bazo entre las dos líneas, L10L y L10H, para las aves no infectadas (saludables) y las infectadas por el IBV, centrándose en la expresión diferencial de genes inmunorelacionados dentro de términos de GO significativamente enriquecidos relacionados con el inmune. Se observaron grandes diferencias en los perfiles del transcriptoma entre las aves de las dos líneas, tanto no infectadas (saludables) como siguiendo el desafío experimental del IBV [Ver ficha adicional 2: Figura S1 ]. La representación del mapa de calor de los genes expresados diferencialmente (DE) asociados con los términos del Sistema Inmune GO para las cuatro comparaciones entre las dos líneas, L10H y L10L, no infectados e infectados en dos puntos de tiempo, semanas 1 y 3. El mapa de calor se construye utilizando los valores promedio de recuentos por millón para cada grupo que la selección de los niveles séricos de MBL en las dos líneas tuvo un efecto mucho más amplio que va más allá de la expresión del gen MBL [27]. Las diferencias de transcriptoma observadas pueden probablemente atribuirse a una respuesta correlacionada a la selección [28] o deriva genética aleatoria [29]. La selección relacionada ocurre cuando un rasgo se ve afectado por la selección en otro rasgo y depende de una correlación genética entre los dos rasgos, que es bien conocida en la cría animal [30]. Alternativamente, la deriva genética aleatoria podría contribuir a las diferencias observadas Centrándose en la expresión de genes relacionados con la inmunidad: en la semana 1, las aves no infectadas mostraron diferencias en la expresión de genes involucrados tanto en la inmunidad adaptativa como en las vías relacionadas con la inmunidad innata [Ver el archivo adicional 16: Figura S3 ]. Además, la línea L10H tuvo una expresión inferior para el subconjunto de los genes inmunes innatos, TYRO3, TRAF3 y TLR7 en la semana 1 [Ver el archivo adicional 16: Figura S3 y Fig. 4 ]. TYRO3 codifica el receptor de tirosineproteína cinasa 3 (TYRO3) que está involucrado en la inhibición de las vías de señalización de TLR y las vías de señalización de citoquinas inducidas por TLR. Estas dos vías influyen en los procesos relacionados con la inmunidad, incluyendo proliferación celular/supervivencia, adhesión celular y migración e inhibe la respuesta inflamatoria innata a los TRAF3 codifica una proteína de señalización citoplasmática, que juega un papel crítico en la regulación de la respuesta antiviral y la evasión viral [32] [33]. TLR7 también fue uno de los genes innatos de inmunidad DE con mayor expresión en la línea L10H. Chicken TLR7 ha demostrado desempeñar un papel en la respuesta a las infecciones por VBI [9, 35]. Además de las diferencias en los perfiles de expresión de un subconjunto de genes inmunes innatos, las dos líneas también difieren en su expresión de genes inmunes adaptativos. Las aves no infectadas de L10H tuvieron una expresión genética más alta en comparación con la línea L10L, para TGFB3, IL7, FKBP1B, FAS y PTPN22. Estos genes son conocidos por estar involucrados en una amplia gama de procesos inmunes adaptativos. En los seres humanos, la reducción de la señalización TGF-β en las células T ha demostrado aumentar la función de las células CD8 T de manera indirecta, lo que resulta en la rápida eliminación de virus, lo que permite la creación de una respuesta eficaz de la memoria [36]. Del mismo modo, la IL-7 humana desempeña un papel clave en la supervivencia de ambas células ingenuas [37] y de la memoria [38, 39] CD4 y CD8 T. Además, un estudio in vitro mostró que la inhibición de FKBP1B y otras ciclofilinas bloquearon la replicación de diferentes Coronavirus, incluyendo el IBV [40]. Por analogía, las aves no infectadas de la línea L10H tuvieron una mayor expresión de IL7, FKBP1B, FAS y PTPN22. Generalmente las aves no infectadas (saludables) de las dos líneas exhiben diferentes perfiles de La selección en la cría de animales ha demostrado tener un efecto extenso en una variedad de rasgos incluyendo inmunológicos [30]. Además, se ha observado una respuesta correlacionada a la selección en el caso en que la selección se realizó en rasgos menos complejos como los niveles de testosterona [41]. Finalmente, diferentes perfiles de expresión para el subconjunto de inmunes innatos y adaptativos en las aves no infectadas de las dos líneas podrían deberse al equilibrio en el efecto de los niveles séricos de MBL. Altos niveles de MBL humanos han sido reportados principalmente como beneficiosos mientras que en caso de enfermedad parasitaria intracelular el efecto del nivel sérico de MBL podría ser opuesto [42]. Los resultados indican que la selección de los niveles séricos de MBL podría conducir a favorecer modos específicos de respuestas inmunes dependiendo de la función de MBL. Se observaron grandes diferencias en los patrones de expresión entre las dos líneas que siguieron a la infección por el IBV y estas diferencias involucraron vías adaptativas relacionadas con la inmunidad que se asocian con la activación de las células T alfa-beta (GO:0046631) y la activación de la respuesta inmune innata (GO:0002218) [Ver archivo adicional 18: Figura S5 ]. El enriquecimiento observado para los términos GO relacionados con la activación de las células T está de acuerdo con un estudio previo de estas líneas que mostró que las células T específicas del IBV están presentes en grandes números en el bazo después de la infección por el IB [43]. En la semana 1 post infección CXCR4, FAS y PTPN22 mostraron mayor expresión en la línea L10H. Los receptores de quimioquinas CXC se expresan en las células T efectoras y de memoria y desempeñan un papel clave en la homeostas Se ha demostrado que la FAS está regulada en el riñón de los pollos con VBI [45]. La vía Fas/FasL es una vía importante para matar células T citotóxicas [46]. Del mismo modo, se ha demostrado que la PTPN22 se expresa de manera diferencial en los pollos después del desafío patógeno, y en particular después de la infección por Escherichia coli [47]. Además, VCAM1 y JMJD6 estuvieron entre los genes adaptativos relacionados con la inmunidad DE entre líneas en la semana 3 [Ver Fig. 4, Fichero adicional 19: Figura S6 ]. Se sabe que el gen VCAM1 está involucrado en la activación de células T [48]. Además, un estudio reciente demostró que JMJD6 regula la proliferación de células T de memoria durante una infección viral [49], lo que es de gran interés teniendo en cuenta que Los resultados muestran que las dos líneas difieren grandemente en la expresión de genes adaptativos relacionados con la inmunidad después de la infección, lo que puede implicar la presencia de diferentes modos de regulación génica. Los tiempos de muestreo fueron elegidos para acceder a las respuestas tanto en la fase efectora (semana 1) como en la fase de memoria (semana 3) de la respuesta inmune adaptativa al IBV. De acuerdo, a la semana 1 los subconjuntos de infección post-infección de genes que participan activamente en la proliferación de células T muestran diferencias entre las líneas. Además, en la semana 3 los perfiles de expresión génica inmune en respuesta a la infección por IBV que difieren entre las líneas están más relacionados con el mantenimiento de la memoria de las células T. Se sabe que el MBL está involucrado en la regulación de la maduración de las células dendríticas, así como en la producción de citocinas [50]. Por lo tanto, las dos líneas seleccionadas para diferentes concentraciones séricas de MBL pueden mostrar diferencias en las respuestas inmunes adaptativas y el desarrollo de inmunidad adaptativa como resultado de diferencias en la respuesta a la señalización de citoquinas de células dendríticas. Otros estudios de las dos líneas, L10L y L10H, han demostrado que difieren en los parámetros de respuesta a la enfermedad después de ser desafiados con diferentes patógenos. La línea L10L se ha asociado con un aumento de la replicación viral en las vías respiratorias después de una infección por el virus de la bronquitis infecciosa (VII) [18], una tasa de crecimiento reducida después de una infección por Escherichia coli [20] y una mayor colonización intestinal después de la infección por Salmonella Infantis [51]. Además, las aves L10H en el presente estudio mostraron un daño menos severo de los cilios traqueales después de la infección por VBI en comparación con la línea L10L (datos no publicados).En el experimento actual se observaron diferencias fenotípicas en rasgos adicionales relacionados con la inmunidad adaptativa, incluyendo el número de células B circulantes y células T citotóxicas [18]. A partir de estas observaciones parece que la selección de alta concentración sérica de MBL permite a las aves hacer frente mejor después de infectarse con una gama de patógenos. Por lo tanto, las diferencias observadas en los perfiles de expresión para los genes inmunes adaptativos e innatos son un reflejo de las diferencias en la resistencia a la enfermedad y las respuestas inmunitarias entre las líneas L10L y L10H. En conclusión, se observaron grandes diferencias en el transcriptoma del bazo entre las dos líneas de pollo Las aves no infectadas de las dos líneas mostraron diferencias en los perfiles de expresión para un subconjunto de genes adaptativos e innatos relacionados con la inmunidad, lo que puede representar diferencias en la preparación para responder a una infección. Después de la infección por IBV, las dos líneas mostraron grandes diferencias en la expresión de genes involucrados en la respuesta inmune celular adaptativa como la activación y las vías de proliferación de las células T y por lo tanto su capacidad para responder a la infección, lo que se refleja en la diferencia en la carga de patógenos observada entre las dos líneas. Este estudio es un seguimiento del experimento realizado por Kjaerup et al. [18] que caracterizó la respuesta inmune celular y humoral de las dos líneas de pollo, L10H y L10L, divergentemente seleccionadas para concentraciones séricas de MBL tras la infección por IBV. En total, 96 aves fueron utilizadas en el estudio experimental provenientes de las dos Las 96 aves fueron criadas juntas en un ambiente bioseguro libre de IBV hasta que tenían 3 semanas de edad y luego asignadas a dos grupos diferentes con 24 aves de cada línea en cada grupo (no infectadas e infectadas). Las aves fueron transferidas a una instalación de nivel de bioseguridad 2 y colocadas en aisladores. Dos aisladores contenían pollos no infectados y dos aisladores contenían pollos infectados. Cada aislador tenía una mezcla igual de las dos líneas descritas por Kjaerup et al. [18]. La cepa virulenta IBV-M41 se utilizó para la infección (un regalo amable del Dr. med. vet. Hans C. Philipp en la Lohmann Animal Health GmbH, Cuxhaven, Alemania). La inócula IBV fue preparada en solución salina fosfatada (PBS) inmediatamente antes de su uso y contenía 2 × 10,2 EID 50 /200 μl de virus IBV-M41. El primer y el segundo grupo (los grupos no infectados) fueron infectados con 200 μl de PBS por ave. El tercero y el cuarto grupo (los grupos infectados) recibieron 200 μl de IBV-M41. La inócula fue administrada medio nasal y medio por vía oral para imitar las vías naturales de infección del IBV en el pollo. Los pollos fueron alimentados con dietas que cumplían o superaban los requisitos del Consejo Nacional de Investigación. Se proporcionó alimento y agua ad libitum. Las aves fueron monitoreadas diariamente para detectar signos clínicos de enfermedad y los parámetros de enfermedad fueron medidos según lo reportado por Kjaerup et al. [18]. El estudio se realizó bajo estricta aprobación ética y monitoreo (ver la declaración al final de la sección Materiales y Métodos). Para este estudio se recolectaron 64 muestras de bazo y se utilizaron para la secuenciación del ARN. Las aves fueron sacrificadas 1 y 3 semanas después de la infección por dislocación cervical y se recolectaron muestras de bazo. En ambos momentos, se recolectaron ocho muestras de las dos líneas, L10H y L10L, de cada grupo (no infectadas e infectadas) como se ilustra en la Fig. 1. Después de la recolección, los bazos fueron seccionados (rebanda transversal triangular de la parte superior) y muestras idénticas de cada pollo fueron inmediatamente colocadas en la Solución de Estabilización RNAlater® (Ambion Inc., Austin, Texas) que fueron incubadas a 4°C durante la noche y luego transferidas a -20°C el día siguiente. Las muestras de tejido fueron homo El ARN total se extrajo con el kit Qiagen RNAeasy (Catalog ID 74104, Qiagen, Venlo, Países Bajos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad de las 64 muestras de ARN total se verificó utilizando un dispositivo de cinta adhesiva ARN de 2200 TapeStation (Agilent, Santa Clara, CA, EE.UU.) y la concentración se determinó utilizando un espectrofotómetro ND-1000 (Nano-Drop, Wilmington, DE). Las bibliotecas se prepararon con el kit de preparación de muestras de Ilumina TruseqRNA (Catalog ID FC-122-1001, Ilumina, San Diego, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante y se evaluaron con la Estación Agilent Tape 2200. Las bibliotecas fueron cuantificadas por Picogreen y luego normalizadas a 10 nM Las cantidades equimolares de cada biblioteca se mezclaron antes de la desnaturalización de NaOH. El kit de clúster de Ilumina Truseq PE v3 (Catalog ID PE-401-3001) se utilizó para generar clústeres en la célula de Ilumina Flowcell injertada y las bibliotecas hibridadas se secuenciaron en seis líneas de una célula de Flowcell en el Hiseq2000 con 100 ciclos de un módulo de secuenciación de extremo emparejado utilizando el kit de Truseq SBS v3 (Catalog ID FC-401-3001). Control de calidad, mapeo de secuencias de ARN lee y recuento mapeo lee La calidad de control inicial fue evaluada por el software FastQC versión 0,11.3 [52]. Las lecturas en bruto fueron recortadas para bases de baja calidad utilizando la herramienta Trimmomatic versión 0.32 [ Las lecturas recortadas fueron cartografiadas al genoma de referencia de Gallus gallus (Gallus_gallus-4.0, versión 80 [54] ) utilizando un alineador empalmado TopHat2 versión 2.014 [55]. La anotación del gen Gallus gallus utilizada para el mapeo fue recuperada de la base de datos Ensembl versión 80 (www.ensembl.org ). La calidad del mapeo fue evaluada utilizando un conjunto de scripts Python dentro del conjunto de herramientas RSeQC [56]. La evaluación del control de calidad incluyó la inspección de la cobertura de lectura sobre todo el cuerpo genético para evaluar si la cobertura de lectura era uniforme y si había algún sesgo de 5' o 3', así como cómo las lecturas cartografiadas fueron distribuidas sobre las características del genoma. El HTSEq-count es un script Python dentro del marco HTSEq, versión 0.7.1, que es un kit de herramientas de código abierto que permite la entrada de los recuentos brutos de lecturas alineadas para ser anotados con nombres genéticos basados en características genómicas [57]. Los recuentos de lectura obtenidos se utilizaron para estimar la expresión génica e identificar genes expresados diferencialmente (DE). Esto se logró utilizando la versión 3.10.0 del paquete Bioconductor edgeR [58] y la versión 3.24.5 [59], siguiendo un protocolo descrito anteriormente [24]. Antes de realizar análisis estadísticos, los genes con bajos niveles de expresión se filtraron utilizando un umbral de al menos una lectura por millón en n de las muestras, donde n es el tamaño del grupo más pequeño de réplicas, que en este caso era ocho. Para tener en cuenta los efectos técnicos y biológicos, los recuentos se normal Esta función normaliza los datos encontrando un conjunto de factores de escalado para los tamaños de las bibliotecas que minimizan los cambios de log-fold entre las muestras. Los factores de escala fueron calculados utilizando la media recortada de valores M (TMM) entre las muestras [58]. Se calcularon estimaciones de dispersión comunes y etiquetadas con el método de probabilidad ajustado del perfil Cox-Reid con el fin de corregir la variación técnica y biológica al instalar el modelo binomio negativo multivariado [60]. El escalado multidimensional (MDS) se implementó en el paquete edgeR, para evaluar visualmente la similitud de las muestras. El gráfico MDS fue creado para visualizar la relación entre las muestras e identificar posibles valores atípicos [58]. El MDS se basa en comparar la relación entre todos los pares de muestras mediante la aplicación de una medida de distancia pareja específica [58]. La matriz fue construida para adaptarse al modelo saturado donde cada combinación de tratamiento fue considerada separadamente. Ocho combinaciones de tratamiento fueron consideradas como ilustradas en la Fig. 1 : aves no infectadas de la línea L10H en la semana 1, aves no infectadas de la línea L10L en la semana 1, aves infectadas de la línea L10H en la semana 1, aves infectadas de la línea L10L en la semana 1, aves no infectadas de la línea L10L en la semana 3, aves infectadas de la línea L10H en la semana 3, aves infectadas de la línea L10L en la semana 3, aves infectadas de la línea L10L en la semana 3. Una prueba de la relación de probabilidad del modelo lineal generalizado, especificando la diferencia de interés, fue utilizada para probar la expresión diferencial entre estas combinaciones de tratamiento. El análisis de expresión diferencial se realizó comparando las diferencias de log-fold en los recuentos genéticos entre dos líneas (L10H y L10L) en diferentes puntos de tiempo (semanas 1 y 3) y para diferentes estados (no infectados e infectados) por separado (Fig. 1 ). Las tasas de falso descubrimiento de Benjamini Hochberg (FDR) para un experimento con transcriptoma en todo el área fueron calculadas para corregir para pruebas múltiples [61]. Todos los genes con un valor p ajustado en FDR <0,05 fueron considerados genes de interés individuales y fueron retenidos para un análisis posterior. El análisis funcional de los genes DE se realizó utilizando la versión Citoscape 3.2.1 [62, 63] con la versión ClueGo 2.1.7 plug-in [64] para enriquecer la anotación y enriquecimiento de los genes expresados diferencialmente (DE) para cuatro comparaciones (C1- ClueGO determina la distribución de los genes diana a través de los términos y vías de GO (ontología genética): este estudio se centró en: el valor p se calculó utilizando pruebas hipergeométricas del lado derecho y el ajuste de Benjamini-Hochberg se utilizó para la corrección de múltiples pruebas; un valor p ajustado de 0,001 indicó una desviación estadísticamente significativa de la distribución esperada, y que los términos y vías de GO correspondientes se enriquecieron para los genes diana; la fuerza de asociación entre los términos se calculó utilizando una estadística de kappa corregida de 0,4; la red creada representó los términos como nodos que estaban vinculados en base a un nivel de puntuación de 0,4 kappa; el tamaño de los nodos reflejó la significancia de enriquecimiento de los términos; la red se estableció automáticamente mediante el algoritmo de diseño orgánico apoyado por Cytoscape; los grupos funcionales fueron creados mediante la fusión iterativa de grupos inicialmente definidos Sólo los grupos funcionales representados por su término más significativo fueron visualizados en la red proporcionando una visión perspicaz de sus interrelaciones [64]. Los procedimientos experimentales se llevaron a cabo bajo los protocolos aprobados por la Inspección Danesa de Experimentos Animales y cumplieron con la Ley No 382 del Ministerio de Justicia de Dinamarca (10 de junio de 1987) y las Leyes 739 (6 de diciembre de 1988) y 333 (19 de mayo de 1990) sobre experimentación y cuidado de animales experimentales. La licencia para realizar el experimento animal fue obtenida por Helle R. Juul-Madsen. comparación entre aves no infectadas en la semana 1. Los términos del Sistema Inmune GO fueron identificados como nodos y vinculados basados en su nivel de puntuación kappa (> = 0,4) y valor p < 0,001. Grupos relacionados funcionalmente parcialmente superpuestos. Los términos GO están etiquetados en colores de acuerdo con la agrupación jerárquica de términos GO. Los términos Las tablas circulares de color de los nodos del sistema inmune GO muestran la proporción génica asociada con el término respectivo. (PDF 60 kb)Archivo adicional 17: Figura S4. Representación en red de los términos enriquecidos del sistema inmunológico GO de los genes expresados diferencialmente (DE) para la comparación entre aves no infectadas en la semana 3. Los términos del sistema inmunológico GO se identificaron como nodos y se vincularon en base a su nivel de puntuación kappa (> = 0,4) y valor p < 0,001. Los grupos relacionados funcionalmente parcialmente se superponen. Los términos GO se etiquetan en colores según la agrupación jerárquica de términos GO. Los términos que no se han agrupado se muestran en gris. Los gráficos circulares de color de los nodos del sistema inmunológico GO muestran la proporción génica asociada con el término respectivo. (PDF 55 kb) Fichero adicional 18: Figura S5. Representación en red Los términos GO Immune System fueron identificados como nodos y enlazados en base a su nivel de puntuación kappa (> = 0.4) y valor p < 0.001. Los grupos funcionalmente relacionados parcialmente se superponen. Los términos GO se etiquetan en colores de acuerdo a la agrupación jerárquica de términos GO. Los términos que no se han agrupado se muestran en gris. Los gráficos de color de los nodos GO Immune System muestran la proporción de genes asociados con el término respectivo. (PDF 70 kb) Archivo adicional 19: Figura S6. Representación en red de los términos enriquecidos GO Immune System de los genes expresados diferencialmente (DE) para la comparación entre aves infectadas en la semana 3. Los términos GO Immune System fueron identificados como nodos y vinculados en base a su nivel de puntuación kappa (> = 0.4) y p-valor < 0.001. Los grupos funcionalmente Los términos que no se han agrupado se muestran en gris. Las tablas de colores de los nodos del sistema inmune GO muestran la proporción de genes asociada con el término respectivo. (PDF 30 kb)

¿Qué órgano se utilizó para las muestras de secuenciación de ARN?

Dinámica viral acelerada en las líneas celulares de murciélagos, con implicaciones para la emergencia zoonóticahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7064339/SHA: f2cc0d63ff2c4aaa127c4caae21d8f3a0067e3d5Autores: Brook, Cara E; Boots, Mike; Chandran, Kartik; Dobson, Andrew P; Drosten, Christian; Graham, Andrea L; Grenfell, Bryan T; Müller, Marcel A; Ng, Melinda; Wang, Lin-Fa; van Leeuwen, AniekeFecha: 2020-02-03DOI: 10.7554/elife.48401Licencia: cc-byAbstract: Bats host virulent zoo Se necesita una comprensión mecánica del impacto de las capacidades de alojamiento del virus de los murciélagos, incluyendo vías inmunológicas exclusivamente constitutivas, en la dinámica viral a escala celular para dilucidar la emergencia zoonótica. Realizamos ensayos de infectividad del virus en líneas celulares de murciélagos que expresan fenotipos inmunes inducidos y constitutivos, y luego desarrollamos un modelo teórico de nuestro sistema in vitro, que encajamos con los datos empíricos. Los modelos más adecuados recapitularon los fenotipos inmunes esperados para líneas celulares representativas, apoyando defensas antivirales robustas en células de murciélagos que se correlacionaron con estimaciones más altas para las tasas de propagación viral dentro del huésped. En general, las respuestas inmunológicas aumentadas limitan la morbilidad celular inducida por patógenos, lo que puede facilitar el establecimiento de infecciones persistentes de rápida propagación dentro del huésped. Texto: Los murciélagos han recibido mucha atención en los últimos años por su papel como anfitriones de reservorios de zoonosis virales emergentes, incluyendo la rabia y los lissavirus relacionados, Hendra y Nipah henipavirus, Ebola y Marburg filovirus, y el coronavirus SARS (Calisher et al., 2006; Wang y Anderson, 2019). En la mayoría de los mamíferos no quirópteros, henipavirus, filovirus y coronavirus inducen morbilidad y mortalidad sustancial, muestran corta duración de la infección, y provocan inmunidad robusta y a largo plazo en los huéspedes que sobreviven infección (Nicholls et al., 2003; Hooper et al., 2001; Mahanty y Bray, 2004). Los murciélagos, por el contrario, no demuestran síntomas obvios de enfermedad al infectarse con patógenos altamente virulentos en mamíferos no volátiles (Schountz et al., 2017), pero pueden, en cambio, apoyar virus como infecciones persistentes a largo plazo, en lugar de patologías transitorias e inmunizantes (Plowright et al., 2016). Los avances recientes de las investigaciones están comenzando a arrojar luz sobre los mecanismos moleculares por los cuales los murciélagos evitan la patología de estos patógenos de otro modo virulentos (Brook y Dobson, 2015). Los murciélagos aprovechan un conjunto de mecanismos específicos de la especie para limitar la carga viral, que incluyen las incompatibilidades de la secuencia del receptor del huésped para algunas combinaciones de virus del murciélago (Ng et al., 2015; Takadate et al., 2020) y la expresión constitutiva de la citocina antivir Típicamente, la presencia de ARN viral o ADN en el citoplasma de células de mamíferos inducirá la secreción de proteínas de interferón tipo I (IFN-a e IFN-b), que promueven la expresión y traducción de genes estimulados por interferón (ISGs) en células vecinas y las hacen efectivamente antivirales (Stetson y Medzhitov, 2006). En algunas células de murciélago, los planos transcripcionómicos para esta respuesta de IFN se expresan constitutivamente, incluso en ausencia de estimulación por ARN viral o ADN (Zhou et al., 2016). En los mamíferos no voladores, la expresión constitutiva de IFN probablemente provocaría inflamación generalizada e inmunopatología concomitante sobre la infección viral, pero los murciélagos apoyan adaptaciones únicas para combatir la inflamación (Zhang et al., 2013; Ahn et al., 2019; Xie et al., 2018; Pavlovich et al., 2018) que pueden haber evolucionado para mitigar el daño metabólico inducido durante el vuelo (Kacprzyk et al., 2017). La medida en que la expresión constitutiva de IFN-a significa defensa antiviral constitutiva en forma de proteína funcional IFN-a permanece sin resolver. En las células de murciélago que expresan constitutivamente IFN-a, algunos ISGs estimulados por proteínas, aguas abajo parecen ser también expresados constitutivamente, pero la inducción ISG adicional es posible después de desafío viral y estimulación de IFN-b (Zhou et al., 2016; Xie et al., 2018). A pesar de los recientes avances en la comprensión molecular de la tolerancia viral del murciélago, las consecuencias de esta inmunidad única del murciélago en la dinámica del virus dentro del huésped-y sus implicaciones para la comprensión de la emergencia zoonótica-todavía no han sido aclaradas. El campo de 'dinámica del virus' fue desarrollado por primera vez para describir los fundamentos mecánicos de los patrones a largo plazo de la carga viral en estado estacionario exhibida por los pacientes en infecciones de fase crónica con VIH, que parecían producir y virus claro a tasas equivalentes (Nowak y May, 2000; Ho et al., Los modelos de agotamiento celular objetivo simple, en los que la carga viral es dictada por un digestivo de eLife inferior Los murciélagos pueden transportar virus que son mortales a otros mamíferos sin mostrar síntomas graves. De hecho, los murciélagos son reservorios naturales para virus que tienen algunas de las tasas de mortalidad más altas de cualquier virus que la gente adquiere de animales salvajes -incluyendo la rabia, el ébola y el coronavirus SARS. Los murciélagos tienen un conjunto de defensas antivirales que mantienen la cantidad de virus en control. Por ejemplo, algunos murciélagos tienen una respuesta inmune antiviral llamada vía del interferón perpetuamente encendido. En la mayoría de otros mamíferos, tener una respuesta inmune hipervigilante causaría inflamación dañina. Los murciélagos, sin embargo, han adaptado los rasgos antiinflamatorios que los protegen de tales daños, incluyen la pérdida de ciertos genes que normalmente promueven la inflamación. Sin embargo, nadie ha explorado previamente cómo estas defensas Los experimentos hicieron uso de células de una especie de murciélago - el zorro volador negro - en el que la vía del interferón está siempre encendido, y otro - el murciélago de la fruta egipcia - en el que esta vía sólo se activa durante una infección. Las células del murciélago se infectaron con tres virus diferentes, y luego Brook et al. observaron cómo la vía del interferón ayudó a mantener las infecciones en control, antes de crear un modelo informático de esta respuesta. Los experimentos y el modelo ayudaron a revelar que las defensas de los murciélagos pueden tener una desventaja potencial para otros animales, incluyendo humanos. En ambas especies del murciélago, las respuestas antivirales más fuertes fueron contrarrestadas por el virus que se propaga más rápidamente de la célula a la célula. Esto sugiere que las defensas inmunes del murciélago pueden impulsar la evolución de virus de transmisión más rápida, y mientras que los murciélagos están bien protegidos de los efectos nocivos de sus propios virus prolíficos, otras criaturas como los Los hallazgos pueden ayudar a explicar por qué los murciélagos son a menudo la fuente de virus que son mortales en los seres humanos. Aprender más acerca de las defensas antivirales de los murciélagos y cómo impulsan la evolución del virus puede ayudar a los científicos a desarrollar mejores maneras de predecir, prevenir o limitar la propagación de virus de los murciélagos a los seres humanos. Se necesitan más estudios en los murciélagos para ayudar a estos esfuerzos. Mientras tanto, los experimentos destacan la importancia de advertir a las personas para evitar el contacto directo con murciélagos salvajes. aumentar el suministro de recursos de células de huésped susceptibles de infección, se desarrollaron por primera vez para el VIH (Perelson, 2002), pero desde entonces se han aplicado a otras infecciones crónicas, incluyendo el virus de hepatitis-C (Neumann et al., 1998), virus de hepatitis-B (Nowak et al., 1996) y citomegalovirus (Emery et al., 1999 En trabajos recientes se han adoptado técnicas similares para modelar la dinámica interna de las infecciones agudas, como la gripe A y el sarampión, que inspiran el debate sobre la medida en que el modelado explícito del control inmunológico descendente puede mejorar la inferencia más allá de las hipótesis básicas de limitación de recursos del modelo celular objetivo (Baccam et al., 2006; Pawelek et al., 2012; Saenz et al., 2010; Morris et al., 2018). Para investigar el impacto de procesos inmunes únicos de murciélagos en la cinética viral in vitro, primero realizamos una serie de experimentos de infección viral en líneas celulares de murciélagos que expresan fenotipos de interferón divergentes, y luego desarrollamos un modelo teórico que aclara la dinámica de la propagación viral dentro del huésped. Evaluamos nuestro modelo teórico analíticamente independiente de los datos, luego ajustamos el modelo a los datos recuperados de los ensayos experimentales in vitro con el fin de estimar las tasas de transmisión del virus dentro del huésped y la progresión celular al estado antiviral bajo diversos supuestos de inmunidad ausente, inducida y constitutiva. Finalmente, confirmamos nuestros hallazgos en simulaciones estocásticas espacialmente explícitas de series temporales ajustadas de nuestro modelo medio de campo. Hipotemamos que los procesos inmunes descendentes rebaten la limitación de recursos clásicos en líneas de células de murciélago descritas como antivirales constitutivas en la literatura, ofreciendo una predicción testable para modelos que se ajusten a los datos empíricos. Predecimos además que las respuestas antivirales más robustas estarían asociadas con las tasas de propagación de virus más rápidas dentro del huésped, pero también protegen a las células contra la mortalidad inducida por virus para apoyar las infecciones de larga duración en el cultivo de tejidos. Primero exploramos la influencia del fenotipo inmune innato en la propagación viral dentro del huésped en una serie de experimentos de infección en cultivo celular. Se realizaron ensayos de placa en monocapas de placa de seis pozos de tres líneas de células renales de mamíferos inmortalizadas: [1] células Vero (mono verde africano), que son defectuosas de IFN y, por lo tanto, limitadas en capacidad antiviral (Desmyter et al., 1968) ; [2] células RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus) que demuestran respuestas idiosincráticas inducidas por interferón sobre el desafío viral (Kuzmin et al., 2017; Arnold et al., 2018; Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018) ; y [3] células PaKiT01 (Pteropus alecto) que expresan constitutivamente IFN-a (Zhou et al., 2016; Crameri et al., 2009). Para intensificar las diferencias celulares específicas en la inmunidad constitutiva, realizamos ensayos de infectividad con la estomatitis vesicular rVSV-G, rVSV-EBOV, y rVSV-MARV, previamente descritos (Miller et al., 2012; Wong et al., 2010). Dos de estos virus, rVSV-EBOV y rVSV-MARV, son recombinantes cuya entrada celular está mediada por la glucoproteína de los filovirus de murciélago, Ébola (EBOV) y Marburg (MARV), lo que nos permite modular el grado de defensa estructural, así como inmunológica, antiviral en juego en cada infección. El trabajo anterior en este laboratorio ha demostrado incompatibilidades en el receptor de filovirus NPC1 que hacen a las células PaKiT01 refractarias a la infección con rVSV-MARV (Ng y Chandrab, 2018, resultados inéditos), haciéndolos estructuralmente antivirales, más allá de su expresión constitutiva de IFN-a. Las tres líneas celulares fueron desafiadas con los tres virus en dos multiplicidades de infección (MOI): 0,001 y 0,0001. Entre 18 y 39 ensayos se realizaron en cada combinación celular-virus-MOI, excepto infecciones por rVSV-MARV en las células PaKiT01 en MOI = 0,001, para las cuales sólo se realizaron ocho ensayos (ver Materiales y métodos; Figura 1 -figura suplementos 1-3, archivo suplementario 1). Debido a que los ensayos de placa restringen la transmisión viral de vecinos a vecinos en el espacio celular bidimensional (Howat et al., 2006), pudimos rastrear la propagación de células infectadas por virus que expresan GFP a través de monocapas de tejido a través de microscopía de fluorescencia invertida. Para cada ensayo de infección, monitoreamos y reimaginamos placas hasta 200 horas de observación o hasta la destrucción total de monocapas, procesamos imágenes resultantes, y generamos una serie de tiempo de la proporción de espacio de placa ocupada por células infecciosas a lo largo de la duración de cada ensayo (ver Materiales y métodos). Utilizamos modelos aditivos generalizados para inferir el curso temporal de todos los cultivos celulares replicados y construir el conjunto de datos multi-trial al que finalmente encajamos nuestro modelo de transmisión mecanística para cada combinación específica de línea celular-virus (Figura 1; Figura 1 -figura 1 - Los tres virus de la estomatitis vesicular recombinante (rVSV-G, rVSV-EBOV y rVSV-MARV) infectaron Vero, RoNi/7.1, y cultivos tisulares PaKiT01 en ambos MOIs focales. Después de la invasión, el virus se diseminó rápidamente a través de la mayoría de las monocapas celulares, resultando en una extinción epidémica inducida por el virus. Las epidemias fueron menos graves en los cultivos de células de murciélago, especialmente cuando se infectaron con los filovirus recombinantes, rVSV-EBOV y rVSV-MARV. La destrucción de monocapas se evitó en el caso de infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en las células de PaKiT01: en las primeras, la infección viral persistente se mantuvo a lo largo de Asumimos que este patrón era el resultado de la extinción epidémica mediada por el sistema inmunitario (Figura 1). Los patrones del MOI = 0,001 fueron ampliamente recapitulados en el MOI = 0,0001, aunque con proporciones totales algo reducidas (Figura 1-figura suplemento 5). Un modelo teórico adecuado a los datos in vitro recapitula los fenotipos inmunes esperados para las células de murciélagos A continuación, desarrollamos un modelo dentro del huésped para adaptarse a estos datos para dilucidar los efectos de la inmunidad inducida y constitutiva sobre la dinámica de propagación viral en el tejido huésped (Figura 1 ). El sistema compartimental dentro del huésped imitaba nuestra monocapa de cultivo celular bidimensional, con células que ocupaban cinco estados de infección distintos: susceptibles (S), antivirales (A), expuestos (E), infecciosos (I) y muertos (D). Modelamos las células expuestas como infectadas pero aún no infecciosas, capturando la "fase eclipsa" de la integración viral en una célula huésped que precede a la replicación viral. Las células antivirales eran inmunes a la infección viral, de acuerdo con el "estado antiviral" inducido por la estimulación del interferón de los ISG en los tejidos adyacentes a la infección (Stetson y Medzhitov, 2006). Debido a que nuestro objetivo era traducir los datos disponibles en procesos modelados, no modelamos explícitamente la dinámica del interferón, sino que escalamos la tasa de progresión celular de las células sensibles a los antivirales (r) por la proporción de células expuestas (globalmente) en el sistema. En sistemas que permiten la inmunidad constitutiva, una segunda tasa de adquisición celular del estado antiviral (") adicionalmente escalada con la proporción global de células sensibles en el modelo. En comparación con el virus, las partículas IFN son pequeñas y altamente difusivas, justificando esta suposición de señalización global en la extensión espacial limitada de una placa de seis pozos y manteniendo la coherencia con las aproximaciones de modelado previas de la señalización IFN en el ensayo de placa (Howat et al., 2006). Para representar mejor nuestro sistema de monocapa empírica, expresamos nuestras variables de estado como proporciones (P S, P A, P E, P I, y P D ), bajo supuestos de transmisión dependiente de la frecuencia en una población bien mezclada (Keeling y Rohani, 2008), aunque note que la inclusión de P D (representando la proporción de espacio muerto en el tejido modelado) tuvo el efecto funcional de variar la transmisión con densidad celular infecciosa. Esto resultó en el siguiente sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias:Definimos la 'inmunidad inducida' como completa, modelando todas las células como susceptibles a la invasión viral en equilibrio libre de enfermedad, con defensas inducidas después de la exposición viral a través del término r. Por el contrario, permitimos que el grado de inmunidad constitutiva varíe a través del rango de parámetros de " > 0, definiendo un sistema 'constitutivo' como aquel que contiene cualquier célula antiviral en equilibrio libre de enfermedad. Al ajustar este modelo a los datos de cultivo de tejidos, estimamos independientemente tanto r como "; así como la tasa de transmisión de células a células, b, para cada combinación de células y virus. Dado que la medida en que IFN-a se expresa constitutivamente se traduce constitutivamente en proteína funcional todavía no se conoce para los anfitriones de murciélagos (Zhou et al., 2016), este enfoque permitió que nuestros datos de cultivo de tejidos para impulsar la inferencia de modelado: incluso en las líneas celulares PaKiT01 conocidas por expresar constitutivamente IFN-a, la verdadera extensión constitutiva del sistema (es decir, la cantidad de células antivirales presentes en el equilibrio libre de enfermedad) se permitió variar a través de la estimación de ": Para los fines de ajuste del modelo, fijamos el valor de c, la tasa de retorno de las células antivirales a estado susceptible, en 0. La pequeña escala espacial y el corto curso de tiempo (máximo 200 horas) de nuestros experimentos probablemente prohibieron cualquier retorno de las células antivirales al estado susceptible en nuestro sistema empírico; sin embargo, conservamos el término c en las evaluaciones analíticas de nuestro modelo porque la regresión del estado antiviral al estado susceptible es posible durante largos periodos de tiempo in vitro y a la escala de un organismo completo (Radke et al., 1974; Rasmussen y Farley, 1975; Samuel y Knutson, 1982). Antes de adaptarnos a la serie de tiempo empírico, realizamos análisis de bifurcación de nuestro modelo teórico y generamos hipótesis probables sobre la base de resultados de modelos. De nuestro sistema de modelo interno (Ecuación 1-5), derivamos la siguiente expresión para R 0, el número de reproducción básica de patógenos (Fichero complementario 2):Los patógenos pueden invadir un cultivo de tejido Las tasas rápidas de adquisición antiviral constitutiva (") impulsarán R 0 <1: los cultivos tisulares con inmunidad antiviral altamente constitutiva serán por lo tanto resistentes a la invasión del virus desde el principio. Dado que, por definición, la inmunidad inducida se estimula después de la invasión inicial del virus, la tasa de adquisición antiviral inducida (r) no se incorpora a la ecuación para R 0; mientras que los procesos inmunes inducidos pueden controlar el virus después de la invasión inicial, no pueden evitar que ocurra a partir de. En casos de inmunidad totalmente inducida o ausente (" 1⁄4 0), la ecuación R 0 se reduce así a una forma típica del modelo SEIR clásico:En equilibrio, el modelo de campo teórico, medio demuestra uno de los tres estados de infección: equilibrio endémico, ciclos límite estables, o ninguna infección (Figura 2). Respectivamente, estos estados se aproximan a la infección persistente, la extinción epidémica inducida por virus y los fenotipos de extinción epidémica mediada por el sistema inmunitario previamente observados en experimentos de cultivo de tejidos (Figura 1 ). Teóricamente, el equilibrio endémico se mantiene cuando se generan nuevas infecciones al mismo ritmo que se pierden las infecciones, mientras que los ciclos límite representan un espacio paramétrico bajo el cual las poblaciones infecciosas y susceptibles están bloqueadas en oscilaciones predecibles. Equilibrios endémicos resultantes de la regeneración celular (es decir, nacimientos) se han descrito in vivo para el VIH (Coffin, 1995) e in vitro para los ensayos de placas de herpesvirus (Howat et al., 2006), pero debido a que se aproximan tan estrechamente a cero, los verdaderos ciclos límite probablemente sólo ocurren teóricamente, en lugar de producir extinciones estocásticas en series El análisis de bifurcación de nuestro modelo medio de campo reveló que las regiones de ninguna infección (extinción de patógenos) estaban limitadas a valores de umbral más bajo (punto Branch) para b, por debajo de los cuales el patógeno no pudo invadir. No encontramos ningún umbral superior a invasión para b bajo ninguna circunstancia (es decir, b lo suficientemente alto como para impulsar la extinción inducida por patógenos), pero los valores altos de b resultaron en bifurcaciones Hopf, que delinean regiones de espacio paramétrico caracterizadas por ciclos límite. Puesto que los ciclos límite se aproximan tan estrechamente a cero, los bs altos recuperados en este rango probablemente producirían extinciones epidémicas inducidas por virus en condiciones experimentales. Consistente con nuestra derivación para R 0, encontramos que el umbral de punto de Rama para invasión viral fue independiente de cambios en el parámetro inmune inducido (r) pero saturado en valores altos de " que caracterizan la inmunidad altamente constitutiva (Figura 3). A continuación, encajamos nuestro modelo teórico por mínimos cuadrados a cada combinación de línea celular-virus, bajo ausente, inducido, y constitutivo suposiciones de inmunidad. En general, los modelos mejor adaptados recapitularon resultados esperados basados en el fenotipo inmune de la línea celular en cuestión, como se describe en la literatura general (Tabla 1 Irónicamente, el modelo inmune inducido ofreció un ajuste ligeramente mejor que el constitutivo a las infecciones por rVSV-MARV en la línea celular PaKiT01 (la combinación de línea celular-virus para la que conocemos una incompatibilidad constitutiva antiviral de receptor de células para estar en juego). Debido a que los supuestos constitutivos inmunes pueden prohibir la invasión de patógenos (R 0 < 1), el modelo se ajusta a esta serie temporal bajo supuestos constitutivos se vieron impedidos por sobreestimación de ", que prohibió la invasión de patógenos. Sólo mediante la incorporación de una tasa extremadamente rápida de adquisición antiviral inducida podría el modelo garantizar que la infección inicial se permitiría y luego se controlaría rápidamente. En todas las parcelas del panel (A) la tasa de adquisición inmune antiviral inducida (r) se fijó en 0.01. El panel (B) representa la dinámica bajo inmunidad invariablemente inducida, que va desde ausente (izquierda: r=0) hasta alta (derecha: r=1). En todas las parcelas del panel (B) la tasa de adquisición antiviral constitutiva (") se fijó en 0.0001 Las curvas de puntos de rama se representan como líneas sólidas y curvas Hopf como líneas rayadas. El espacio blanco indica equilibrio endémico (persistencia), el espacio gris indica ciclos límite y el espacio negro no indica infección (extinción).Otros valores de parámetro para el análisis de equilibrio se fijaron en: b = 025, m = 0,001, s = 1/6, c = 0. Los puntos especiales de los análisis de bifurcaciones se enumeran en el archivo complementario 3. Al ajustar nuestro modelo teórico a los datos in vitro, estimamos la tasa de transmisión del virus dentro del huésped (b) y la tasa(s) de adquisición celular al estado antiviral (r o r + ") (cuadro 1 ; archivo suplementario 4). Bajo supuestos inmunes ausentes, r y " se fijaron en 0 mientras que b se estimó; bajo supuestos inmunológicos inducidos " se fijó en 0 mientras que r y b se estimaron; y bajo hipótesis inmunológicas constitutivas, los tres parámetros Las estimaciones de parámetros de mejor ajuste para los datos de MOI=0,001 se visualizan en conjunción con br y b -" bifurcaciones en (r) y (B) la tasa de inmunidad constitutiva de adquisición antiviral ("). Los paneles muestran variación en el grado de inmunidad, de ausente (izquierda) a alto (derecha). Las curvas de punto de rama se representan como líneas sólidas y las curvas de Hopf como líneas discontinuas. El espacio blanco indica equilibrio endémico (persistencia), el espacio gris indica ciclo límite y el espacio negro no indica infección (extinción). Otros valores de parámetros para el análisis de equilibrio se fijaron en: b = 025, m = 0,001, s = 1/6, a = 1/6, c = 0. Los puntos especiales de los análisis de bifurcaciones se enumeran en el archivo suplementario 3. A diferencia de las células Vero, el modelo de inmunidad inducida ofrecía el mejor ajuste a todos los datos de RoNi/7.1, consistentes con los patrones reportados en la literatura y nuestra propia validación por qPCR (Tabla 1; Arnold et al., 2018; Kuzmin et al., 2017; Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018). Al igual que en los ensayos con células Vero, estimamos los valores b más altos para las infecciones por rVSV-G en las líneas celulares de RoNi/7.1 pero aquí recuperamos estimaciones b más altas para rVSV-MARV que para rVSV-EBOV. Esta inversión se equilibró con una tasa estimada más alta de adquisición a estado antiviral (r) para rVSV-EBOV frente a rVSV-MARV. En general, observamos que las tasas más rápidas de adquisición antiviral (ya sea inducida, r, constitutiva, ", o ambas) se correlacionaban con mayores tasas de transmisión (b). Al compensarse por r, los valores estimados para las infecciones por RoNi/7.1 mantuvieron la misma amplitud que los estimados para las líneas celulares de Vero inmune-ausente pero causaron epidemias más suaves y reducción de la mortalidad celular (Figura 1). Las estimaciones de parámetros de RoNi/7.1 localizadas en la región correspondientes al equilibrio endémico para el modelo determinista teórico (Figura 4), produciendo epidemias menos agudas que sin embargo se extinguieron en experimentos estocásticos. Finalmente, los ensayos de rVSV-G y rVSV-EBOV en células PaKiT01 se ajustaron mejor por modelos que asumen inmunidad constitutiva, mientras que las infecciones por rVSV-MARV en PaKiT01 se emparejaron equivalentemente con modelos que asumen inmunidad inducida o constitutiva-con modelos inducidos favorecidos sobre constitutivos en comparaciones AIC porque se estimó un parámetro menos (figura 1-figura suplementos 4-5; archivo suplementario 4). Para todas las infecciones por virus, las líneas celulares de PaKiT01 produjeron b estima un orden completo de magnitud superior a Vero o RoNi/7.1 células, con cada b equilibrado por una respuesta inmune (ya sea r, o r combinado con ") también un orden de magnitud superior al recuperado para las otras líneas celulares (figura 4 ; tabla 1 ). Al igual que en células RoNi/7.1, el parámetro PaKi Debido a que los procesos inmunes constitutivos pueden realmente prohibir la invasión inicial de patógenos, la inmunidad constitutiva se ajusta a las infecciones por rVSV-MARV en líneas celulares PaKiT01 constantemente localizadas en o por debajo del umbral del punto de Rama para la invasión del virus (R 0 1⁄4 1). Durante el ajuste del modelo para la optimización de ", cualquier prueba de parámetros de " valores que producen R 0 < 1 no dio lugar a ninguna infección y, en consecuencia, produjo un ajuste extremadamente deficiente a los datos de las series temporales infecciosas. En todos los modelos, asumiendo inmunidad constitutiva, en todas las líneas celulares, las contribuciones antivirales de " virus prohibidos de invadir en absoluto. Con el fin de comparar las contribuciones relativas de los diferentes procesos inmunes de cada línea celular a la dinámica epidémica, a continuación utilizamos nuestras estimaciones de parámetros de campo promedio para calcular la 'tasa antiviral' inicial de acumulación de células antivirales tras la invasión del virus para cada combinación de células-virus-MOI basado en la siguiente ecuación:donde P E se calculó a partir de la dosis infecciosa inicial (MOI) de cada experimento de infección y P S se estimó en equilibrio libre de enfermedad:Porque y "ambos contribuyen a esta tasa antiviral inicial, las hipótesis inmunológicas inducidas y constitutivas son capaces de producir tasas igualmente rápidas, dependiendo de los ajustes de parámetros. De hecho, bajo supuestos inmunes totalmente inducidos, la tasa de adquisición antiviral inducida (r) estimada para la infección por rVSV-MARV en las células PaKiT01 fue tan alta que la tasa antiviral En realidad, sabemos que las incompatibilidades con los receptores NPC1 hacen que las líneas celulares PaKiT01 constitutivamente sean refractarias a la infección por rVSV-MARV (Ng y Chandrab, 2018, resultados inéditos) y que las células PaKiT01 también expresan constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a. Los resultados de ajuste del modelo sugieren que esta expresión constitutiva de IFN-a puede actuar más como una respuesta inmune rápidamente inducible tras la invasión del virus que como una secreción constitutiva de la proteína funcional IFN-a. Sin embargo, como hipotetizado, las líneas celulares PaKiT01 fueron con mucho la más antiviral de cualquiera en nuestro estudio-con tasas antivirales iniciales estimadas en varios órdenes de magnitud superiores a cualquier otro en nuestro estudio, bajo supuestos inducidos o constitutivos (Tabla 1 ; Ficha complementaria 4). Las células RoNi/7.1 mostraron la segunda firma de inmunidad más pronunciada, seguida de las células Vero, para las cuales la tasa antiviral inicial fue esencialmente cero incluso bajo supuestos forzados de inmunidad inducida o constitutiva (Tabla 1 ; Archivo suplementario 4). Utilizando parámetros ajustados para b y ", calculamos adicionalmente R 0, el número de reproducción básico para el virus, para cada combinación de línea celular-virus-MOI (Tabla 1 ; Archivo suplementario 4). Encontramos que R 0 fue esencialmente sin cambios en diferentes supuestos inmunes para las células RoNi/7.1 y Vero, para las cuales la tasa antiviral inicial fue baja. En el caso de las células PaKiT01, una alta tasa inicial de antiviral bajo inmunidad inducida o constitutiva resultó en una estimación correspondientemente alta de b (y, por consiguiente, R 0 ) que aún produjo la misma curva epidémica que resultó de las estimaciones mucho más bajas para b y R 0 emparejadas con inmunidad ausente. Estos hallazgos sugieren que las respuestas inmunes antivirales protegen los tejidos huésped contra la mortalidad celular inducida por virus y pueden facilitar el establecimiento de tasas de transmisión más rápidas dentro del huésped. La destrucción total de monocapas se produjo en todas las combinaciones de virus celulares excepto infecciones por rVSV-EBOV en células RoNi/7.1 e infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en células PaKiT01. La destrucción de monocapas correspondió al agotamiento celular sensible y al recambio epidémico donde R efectivo (el producto de R 0 y Para las infecciones por rVSV-EBOV en las células antivirales inducidas RoNi/7.1, las células vivas remanentes salvaguardadas, que dieron a luz nuevas células sensibles tardíamente en la serie temporal. En las infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en las células PaKiT01, esta protección antiviral detuvo la epidemia (Figura 5 ; R-efectiva <1) antes de que los susceptibles declinaran completamente. En el caso de las infecciones por rVSV-EBOV en las células PaKiT01, el nacimiento de nuevos susceptibles a partir de células vivas remanentes protegidas por el estado antiviral mantuvo la transmisión tardía para facilitar la persistencia de la epidemia a largo plazo. Es importante destacar que bajo los valores de parámetros fijos para la tasa de incubación de la infección (s) y la tasa de mortalidad inducida por la infección (a), los modelos no pudieron reproducir las series de tiempo infeccioso a más largo plazo captadas en los datos de infecciones por rVSV-EBOV en las líneas celulares de PaKiT01 sin incorporación de nacimientos celulares, suposición adoptada en representaciones de modelos anteriores de la dinámica viral mediada por IFN en el cultivo de tejidos (Howat et al., 2006). En nuestros experimentos, observamos que la reproducción celular se llevó a cabo como ensayos de placa alcanzó confluencia. Finalmente, debido a que el efecto protector de las células antivirales es más claramente observable espacialmente, confirmamos nuestros resultados simulando series de tiempo ajustadas en una reconstrucción estocástica espacialmente explícita de nuestro modelo de campo medio. En las simulaciones espaciales, las tasas de adquisición antiviral se fijaron en valores ajustados para r y " derivados de las estimaciones medias de campo, mientras que las tasas de transmisión (b) se fijaron en valores diez veces superiores a los estimados en condiciones medias de campo, teniendo en cuenta la intensificación de los umbrales de parámetros que permitían la invasión de patógenos en las interacciones espaciales locales (véanse Materiales y métodos; Videos 1-3; Suplemento 3 de la figura 5; Fichero complementario 5; Webb y otros, 2007). En series temporales inmunitarias, las células antivirales espaciales actuaron como "refugios" que protegían a las células vivas de la infección como cada onda epidémica inicial "lavada" a través de una monocapa celular. Los murciélagos son reservorios para varias zoonosis emergentes importantes, pero parecen no experimentar la enfermedad de patógenos virales de otro modo virulentos. Aunque la literatura biológica molecular ha hecho grandes progresos en el esclarecimiento de los mecanismos por los cuales los murciélagos toleran infecciones virales (Zhou et al., 2016; Ahn et al., 2019; Xie et al., 2018; Pavlovich et al., 2018; Zhang et al., 2013), el impacto de la inmunidad única de los murciélagos en la dinámica del virus dentro del huésped no ha sido bien aclarada. Utilizamos una combinación innovadora de experimentación in vitro y modelado dentro del huésped para explorar el impacto de la inmunidad única de los murciélagos en la dinámica del virus. Críticamente, descubrimos que las líneas de células de murciélago demostraron una firma de respuesta inmune mejorada mediada por interferón, de forma constitutiva o inducida, que permitió establecer tasas rápidas de transmisión del Estos resultados fueron apoyados por el análisis bifurcado independiente de los datos de nuestro modelo teórico de campo medio, así como por el ajuste de este modelo a las series de tiempo de infección viral establecidas en el cultivo de células de murciélagos. Además, demostramos que el estado antiviral inducido por la vía del interferón protege a las células vivas de la mortalidad en el cultivo de tejidos, resultando en epidemias in vitro de larga duración que aumentan la probabilidad de establecer una infección persistente a largo plazo. Nuestros hallazgos sugieren que los virus evolucionados en depósitos de murciélagos que poseen capacidades mejoradas de IFN podrían lograr tasas de transmisión más rápidas dentro del huésped sin causar patología a sus huéspedes. Estos virus de rápida reproducción probablemente generarían una virulencia extrema sobre el derrame a los huéspedes que carecen de capacidades inmunes similares a los murciélagos. Para lograr estos resultados, primero desarrollamos un modelo teórico novedoso, dentro del huésped, elucidando los efectos de la inmunidad Consideramos que una línea celular es constitutivamente inmune si posee cualquier número de células antivirales en equilibrio libre de enfermedad pero permite que la extensión de inmunidad constitutiva varíe a través del rango de parámetros para ", la tasa constitutiva de adquisición antiviral. Al derivar la ecuación para R 0, el número básico de reproducción, que define las condiciones umbral para la invasión viral de un tejido (R 0 > 1), demostramos cómo el umbral de invasión se eleva a valores altos de adquisición antiviral constitutiva, ". Los procesos inmunes constitutivos pueden así prohibir la invasión de patógenos, mientras que las respuestas inducidas, por definición, sólo pueden controlar las infecciones post-hoc. Una vez que se han alcanzado los umbrales de invasión patogénica, las suposiciones de inmunidad constitutiva limitarán la mortalidad celular (virulencia) incurrida a altas tasas de transmisión. Independientemente del mecanismo (inducido o constitutivo), las células antivirales estimuladas por interferón parecen desempeñar un papel clave en el mantenimiento de infecciones persistentes o a largo plazo al proteger a las células sensibles de la infección rápida y la muerte celular concomitante. El ajuste de nuestro modelo a los datos in vitro apoyó los fenotipos inmunes esperados para diferentes líneas celulares de murciélagos, como se describe en la literatura. Modelos simples de células diana que ignoran los efectos de la inmunidad mejor serie temporal infecciosa recapitulada derivada de células Vero deficientes de IFN, mientras que los modelos que asumen procesos inmunes inducidos reprodujeron con mayor precisión ensayos derivados de células RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus), que poseen una respuesta IFN inducida por virus estándar. En la mayoría de los casos, los modelos que asumen procesos inmunes constitutivos mejor recrean epidemias de virus producidas en las células de PaKiT01 (Pteropus alecto), que se sabe que expresan constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a (Zhou et al., 2016). El apoyo del modelo para suposiciones inmunológicas inducidas en ajustes a infecciones por rVSV-MARV en las células de PaKiT01 sugiere que la expresión constitutiva IFN-a característica de las células de P. alecto puede representar más un proceso de primogenitura inmune constitutivo que una defensa perpetua, funcional y antiviral. Los resultados del ajuste del modelo de campo medio fueron confirmados adicionalmente en simulaciones estocásticas espacialmente explícitas de cada serie temporal. Como se ha demostrado anteriormente en los modelos internos para el VIH (Coffin, 1995; Perelson et al., 1996; Nowak et al., 1995; Bonhoeffer et al., 1997; Ho et al., 1995), los supuestos de agotamiento simple de las células diana a menudo pueden proporcionar aproximaciones satisfactorias de la dinámica viral, especialmente las reproducidas en sistemas in vitro simples. Críticamente, nuestro ajuste del modelo enfatiza la necesidad de incorporar los efectos descendentes del control inmunológico para reproducir con precisión las series de tiempo infecciosas derivadas de cultivos de células de murciélago, especialmente las resultantes de la línea celular PaKiT01 P. alecto robustamente antiviral. Estos hallazgos indican que las vías inmunes mejoradas mediadas por la IFN en los reservorios de murciélagos pueden promover tasas elevadas de replicación del virus dentro del huésped antes de la aparición de especies cruzadas. No El trabajo futuro debe extender estos estudios de cultivo celular para incluir mediciones de múltiples variables de estado (es decir, células antivirales) para mejorar la inferencia epidemiológica.La continua recurrencia de epidemias de Ébola en toda África central destaca la importancia de entender el papel de los murciélagos como reservorios para la enfermedad zoonótica virulenta. La última década ha nacido testigo de un consenso emergente con respecto a las vías únicas por las cuales los murciélagos resisten y toleran infecciones altamente virulentas (Brook y Dobson, 2015; Xie et al., 2018; Zhang et al., 2013; Ahn et al., 2019; Zhou et al., 2016; Ng et al., 2015; Pavlovich et al., 2018). Sin embargo, sigue siendo difícil comprender los mecanismos por los cuales los murciélagos apoyan patógenos endémicos a nivel poblacional, o promueven la evolución de El mantenimiento endémico de la infección es una característica definitoria de un reservorio de patógenos (Haydon et al., 2002), y los murciélagos parecen merecer tal título, apoyando la persistencia a largo plazo de infecciones virales altamente transmisibles en poblaciones insulares aisladas muy por debajo de los tamaños críticos esperados de la comunidad (Peel et al., 2012). Los investigadores debaten la influencia relativa de los mecanismos a nivel de la población y dentro del huésped que podrían explicar estas tendencias (Plowright et al., 2016), pero cada vez más, los datos de campo son difíciles de conciliar sin reconocer un papel para las infecciones persistentes (Peel et al., 2018; Brook et al., 2019). Presentamos métodos generales para estudiar la dinámica viral a escala cruzada, que sugieren que la persistencia dentro del huésped está respaldada por respuestas antivirales robustas características de los procesos inmunes al murciélago. Los virus que evolucionan rápidamente las tasas de replicación bajo estas robustas defensas antivirales pueden representar el mayor riesgo para la aparición de patógenos de especies cruzadas en huéspedes de derrames con sistemas inmunes que difieren de los únicos a los murciélagos. Todos los experimentos se llevaron a cabo en tres líneas de células renales de mamíferos inmortalizados: Vero (mono verde africano), RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus) (Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011) y PaKiT01 (Pteropus alecto) (Crameri et al., 2009). Las identificaciones de especies de todas las líneas de células de murciélago se confirmaron morfológica y genéticamente en las publicaciones en las que fueron descritos originalmente (Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011; Crameri et al., 2009) Las monocapas de cada línea celular fueron cultivadas hasta 90% de confluencia (~9Â10 5 células) en placas de 6 pocillos. Las células fueron mantenidas en una incubadora humidificada de 37oC, 5% CO 2 y cultivadas en el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies, Grand Island, NY), complementadas con suero bovino fetal 2% (Gemini Bio Products, West Sacramento, CA), y 1% penicilina-estreptomicina (Life Technologies).Las células fueron analizadas mensualmente para detectar la contaminación por micoplasma mientras se realizaban experimentos; todas las células determinaron negativo para la contaminación en cada prueba. El trabajo anterior ha demostrado que todas las líneas celulares utilizadas son capaces de montar una respuesta IFN de tipo I en caso de desafío viral, con la excepción de las células Vero, que poseen una deficiencia IFN-b (Desmyter et al., 1968; Rhim et al., 1969; Emeny y Morgan, 1979). Las células RoNi/7.1 han demostrado montar defensas IFN inducidas idiosincráticas ante infección viral (Pavlovich et al., 2018; Kuzmin et al., 2017; Arnold et al., 2018; Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011), mientras que las células PaKiT01 son conocidas por expresar constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a (Zhou et al., 2016). Este trabajo es la primera documentación de la señalización de IFN inducida en caso de desafío con los VSV recombinantes particulares descritos a continuación. Verificamos fenotipos inmunes antivirales conocidos a través de qPCR. Los resultados fueron consistentes con la literatura, indicando un papel menos pronunciado para la defensa del interferón contra la infección viral en las células RoNi/7.1 versus PaKiT01. Se han descrito previamente los virus de la estomatitis vesicular recombinante con capacidad de replicación (Wong et al., 2010; Miller et al., 2012). Los virus fueron seleccionados para representar una amplia gama de respuestas antivirales anticipadas de las células huésped, basadas en una gama de historias evolutivas pasadas entre la entrada de células glucoproteínas del virus y el receptor de entrada de la célula huésped. Estas interacciones variaron desde la ausencia total de historia evolutiva en el caso de infecciones por rVSV-G en todas las líneas celulares hasta una incompatibilidad de entrada celular a nivel de receptor conocido en el caso de infecciones por rVSV-MARV en las líneas celulares PaKiT01. Para medir las infecciones de rVSV en cada una de las líneas celulares descritas anteriormente, para calcular la dosis viral correcta para cada MOI, se añadió NH 4 Cl (20 mM) a cultivos celulares infectados a 1-2 horas de postinfección para bloquear la propagación viral, y las células eGFP positivas individuales se contabilizaron manualmente a las 12-14 horas de postinfección. Los trabajos publicados anteriormente indican que las líneas de células renales inmortalizadas de Rousettus aegyptiacus (RoNi/7.1) y Pteropus alecto (PaKiT01) exhiben diferentes fenotipos inmunes antivirales innatos a través de, respectivamente, inducidos (Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018; Kühl et al., 2011; Arnold et al., 2018) y expresión constitutiva (Zhou et al., 2016) de los genes de interferón tipo I. Verificamos estos fenotipos publicados en nuestras propias líneas celulares infectadas con rVSV-G, rVSV-EBOV, y rVSV-MARV vía qPCR de genes IFN-a e IFN-b a través de una serie longitudinal de infecciones. Específicamente, realizamos múltiples series temporales de infección de cada línea celular con cada uno de los virus descritos anteriormente, bajo condiciones de infección simuladas y en MOIs de 0,0001 y 0,001-con excepción de rVSV-MARV en líneas celulares PaKiT01, para lo cual la infección sólo se realizó en MOI = 0,0001 debido a las limitadas existencias virales y a la extremadamente baja infectividad de este virus en esta línea celular (requeriendo así altas cargas virales para la infección inicial).Todos los experimentos se ejecutaron en duplicado en placas 6well, de tal manera que una placa típica para cualquiera de los tres virus tenía dos pozos de control (mock), dos MOI = 0,0001 pozos y dos MOI = 0,001 pozos, excepto las placas PaKiT01, que tenían dos controles y cuatro MOI = 0,0001 pozos en un momento dado. Justificamos esta exención de PaKiT01 a través de la expectativa de que IFN-una expresión es constitutiva para estas células, y por la suposición de que cualquier expresión exhibida en el MOI inferior también debería estar presente en el MOI superior. Para estas series de tiempo de expresión génica, cuatro placas de 6 pocillos para cada combinación de línea celular-virus fueron incubadas con virus durante una hora a 37oC. Después de la incubación, el virus fue aspirado, y los monocapas celulares fueron lavados en PBS, luego cubiertos con un ensayo de placa de agar superpuesto para imitar las condiciones bajo las cuales se realizaron los ensayos de infección. Las placas se recolectaron secuencialmente en los puntos de tiempo de aproximadamente 5, 10, 15 y 20 horas después de la infección (el tiempo exacto variaba como múltiples ensayos se ejecutaban simultáneamente). Después de la cosecha de cada placa, se eliminó la capa de agar y se lisó el virus y se extrajo ARN de las células utilizando el kit Zymo Quick ARN Mini Prep, de acuerdo con las instrucciones del fabricante e incluyendo el paso para la digestión del ADN celular. Después de la extracción, la calidad del ARN se verificó a través de nanodrop, y el ARN se convirtió a cDNA utilizando el kit de síntesis de cDNA de Superscript III Invitrogen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. cDNA se almacenó a 4oC y como un stock congelado a À20oC para esperar qPCR. Nos encargamos de qPCR de cDNA para evaluar la expresión de los genes de interferón tipo I, IFN-a e IFNb, y el gen de mantenimiento de la casa, b-Actin, utilizando imprimaciones Para qPCR, se incubaron 2 ml de cada muestra de cDNA con 7 ml de agua desionizada, 1 ml de 5 UM de mezcla de imprimación hacia adelante/reversa y 10 ml de iTaq Universal SYBR Green, luego se cicló en una máquina de PCR QuantStudio3 en tiempo real bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 C durante 2 minutos seguido de 40 ciclos de: desnaturalización a 95 C (5 s), recocido a 58 C (15 s), y extensión a 72 C (10 s). Presentamos valores d-Ct simples para cada ejecución, con Ct en bruto del gen de interés objetivo (IFN-a o IFN-b) sustraído del Ct en bruto del gen de limpieza b-Actin en la Figura 1 -figura suplemento 6. El cálculo del cambio de pliegue sobre la infección viral en comparación con el simulacro usando el método d-d-Ct (Livak y Schmittgen, 2001) fue inapropiado en este caso, ya que deseábamos demostrar la expresión constitutiva de IFN-a en células PaKiT01, por lo que los datos de células simuladas eran idénticos a los producidos a partir de células infectadas. Después de crecer a ~ 90% de confluencia, las células fueron incubadas con rVSV en pellets expresando eGFP (rVSV-G, rVSV-EBOV, rVSV-MARV). Las líneas celulares fueron desafiadas con una baja (0,0001) y alta (0.001) multiplicidad de infección (MOI) para cada virus. En una monocapa celular infectada en un determinado MOI (m), la proporción de células (P), infectadas por k partículas virales puede ser descrita por la distribución de Poisson: P k ð 1⁄4 e Àm m k!, de tal manera que el número de células inicialmente infectadas en un experimento es igual a: 1 À e Àm. Asumimos que un cultivo confluente ~90 % en el origen de cada ensayo estaba compuesto por ~9x10 5 células y conducía todos los experimentos en MOIs de 0,0001 y 0,001, lo que significa que comenzamos cada ensayo introduciendo virus a, respectivamente, ~81 u 810 células, que representan la variable de estado 'E' en nuestro modelo teórico. Los MOIs bajos fueron seleccionados para aproximar mejor la dinámica de infección de campo media y limitar artefactos de estructuración espacial, tales como extinción epidémica prematura cuando las placas en crecimiento Se prepararon placas de seis pocillos con cada infección por duplicado o triplicado, de manera que un pozo de control (sin virus) y 2-3 pozos cada uno en el MOI 0,001 y 0,0001 fueron incubados simultáneamente en la misma placa. En total, se realizaron entre 18 y 39 ensayos en cada combinación de células-virus-MOI, excepto infecciones por r-VSV-MARV en células PaKiT01 en el MOI = 0,001, para lo cual se realizaron sólo ocho ensayos debido a la baja infectividad de este virus en esta línea celular, lo que requirió altas cargas virales para la infección inicial. Las células fueron incubadas con virus por una hora a 37oC. Después de la incubación, el virus fue aspirado, y las monocapas celulares fueron lavadas en PBS, luego cubiertas con una capa viscosa fundida (50% 2X MEM/Lglutamina; 5% FBS; 3% HEPES; 42% agarosa), enfriadas durante 20 min, y re-incubadas en su ambiente original humidificado 37°C, 5% CO 2. Después de la aplicación de la superposición, las placas fueron monitoreadas periódicamente utilizando un microscopio de fluorescencia invertido hasta que se presenciaron los primeros signos de expresión de GFP (~6-9.5 hr post-infección, dependiendo de la línea celular y el virus bajo investigación). A partir de ese momento, un subconjunto cuadrado del centro de cada pozo (compuesto por 64 o 36 sub-marcos y que correspondía aproximadamente al 60% y 40% del espacio de pozo entero) fue fotografiado periódicamente, utilizando una plataforma CellInsight CX5 High Content Screening (HCS) con un objetivo aéreo 4X (ThermoFisher, Inc, Waltham, MA). Los ajustes de microscopios se mantuvieron estándar en todos los ensayos, con tiempo de exposición fijado en 0,0006 s para cada imagen. Se implicó un canal de color, de tal manera que las imágenes producidas muestran células que expresan GFP en células blancas y no GFP en negro (figura 1-figura suplemento 1). Los pozos fueron fotografiados en rotación, con la mayor frecuencia posible, desde el inicio de la expresión GFP hasta el momento en que la mayoría de las células del pozo fueron consideradas muertas, la expresión GFP ya no pudo ser detectada, o la terminación temprana fue deseada para permitir la tinción de Hoechst. En el caso de las células PaKiT01 infectadas con rVSV-EBOV, donde se estableció una infección aparentemente persistente, el ensayo fue terminado después de 200+ horas (8+ días) de observación continua. Al finalizar todos los ensayos, las células fueron fijas en formaldehído (4% durante 15 min), incubadas con mancha Hoechst (0,0005% durante 15 min) (ThermoFisher, Inc, Waltham, MA), luego imágenes en 4X en la plataforma CellInsight CX5 High Content Screening (HCS). Un canal de color fue permitido de tal manera que las imágenes producidas mostraron núcleos vivos en células blancas y muertas en negro. Colores de la mancha Hoechst ADN celular, y la infección viral se cree que interfiere con la claridad de la mancha (Dembowski y DeLuca, 2015). Como tal, la terminación de la infección, la fijación celular y la tinción Hoechst permite la generación de una serie de tiempo áspero de células vivas no infecciosas (es decir, susceptibles + células antivirales) para complementar las imágenes que produjeron series temporales de proporciones infecciosas. Debido a la incertidumbre sobre el estado epidémico exacto de las células manchadas de Hoechst (es decir, las células expuestas pero aún no infecciosas pueden todavía mancharse), elegimos adaptar nuestros modelos sólo a las series infecciosas de tiempo derivadas de imágenes que expresan GFP y utilizaron las imágenes de mancha Hoechst como un control visual Las imágenes recuperadas de la serie temporal anterior fueron procesadas en forma binaria ('infecciosa' vs. 'no infecciosa' o, para las imágenes manchadas de Hoechst, 'live' vs.'muerta') utilizando el paquete EBImage (Pau et al., 2010) en la versión R 3.6 para MacIntosh, después de métodos más detallados en el archivo suplementario 7. Las imágenes binarias fueron procesadas posteriormente en series temporales de imágenes infecciosas o, para las imágenes manchadas de Hoechst, células vivas utilizando una serie de scripts de recuento de células. Debido a limitaciones logísticas (es decir, muchas placas de ensayos simultáneos de infección en ejecución y sólo un microscopio de imágenes disponible), el curso temporal de la imagen a lo largo de la duración de cada ensayo fue muy variable. Como tal, ajustamos una serie de modelos estadísticos a nuestros datos de imagen procesados para reconstruir valores confiables de la proporción infecciosa de cada pozo por hora para cada ensayo distinto en todas las combinaciones de línea celular-virus-MOI (Figura 1 Para derivar la expresión de R 0, el número básico de patógenos reproductivos in vitro, utilizamos técnicas de Next Generation Matrix (NGM) (Diekmann et al., 1990; Heffernan et al., 2005), empleando Wolfram Mathematica (versión 11.2) como herramienta analítica. R 0 describe el número de nuevas infecciones generadas por una infección existente en una población huésped completamente susceptible; un patógeno invadirá una población cuando R 0 > 1 (archivo suplementario 2). Luego analizamos las propiedades de estabilidad del sistema, explorando la dinámica a través de un rango de espacios de parámetros, utilizando MatCont (versión 2.2) (Dhooge et al. La tasa de natalidad, b, y la tasa de mortalidad natural, m, equilibrio para producir una tasa de crecimiento a nivel de población, de tal manera que es imposible estimar tanto b como m simultáneamente a partir de los datos del tamaño total de la población. Como tal, fijamos b en 025 y estimamos m mediante el ajuste de una versión ausente de infección de nuestro modelo de campo medio a las series de tiempo susceptibles derivadas de la tinción de pozos de control de Hoechst para cada una de las tres líneas celulares (figura 1-figura suplemento 7). Esto produjo una tasa de mortalidad natural, m, correspondiente a una vida útil de aproximadamente 121, 191 y 84 horas, respectivamente, para Vero, RoNi/7.1, y PaKiT01 líneas celulares (figura 1-figura suplemento 7). A continuación, fijamos la tasa de incubación del virus, s, como la inversa de la duración más corta observada del tiempo desde la infección inicial hasta la observación de las primeras células infecciosas a través del microscopio fluorescente para todas las combinaciones de nueve líneas celulares -virus (con un rango de 6 a 9,5 horas). Fijamos a, la tasa de mortalidad inducida por infección, en 1/6, un estándar aceptado para la cinética viral general (Howat et al., 2006), y mantuvimos c, la tasa de regresión celular antiviral a estado susceptible, en 0 para el intervalo de tiempo (< 200 horas) de los ensayos de infección celular experimental. Estimamos valores específicos de línea celular-virus-MOI para b, r, y " mediante el ajuste de la producción determinista de proporciones infecciosas en nuestro modelo de campo medio a la serie completa de resultados estadísticos de todos los ensayos para cada serie de tiempo de cultivo celular El ajuste se realizó minimizando la suma de las diferencias cuadradas entre la salida del modelo determinista y la proporción infecciosa específica de la línea celularvirus-MOI de los datos en cada paso del tiempo. Optimizamos los parámetros para el MOI = 0,001 y 0,0001 simultáneamente para aprovechar la potencia estadística a través de los dos conjuntos de datos, estimando una tasa de transmisión diferente, b, para ensayos que se ejecutan a cada dosis infecciosa pero, cuando proceda, estimando las mismas tasas de r y " a través de las dos series temporales. Utilizamos el solucionador de ecuaciones diferenciales lsoda() en el paquete R deSolve (Soetaert et al., 2010) para obtener soluciones numéricas para el modelo de campo medio y se llevó a cabo la minimización utilizando el algoritmo 'Nelder-Mead' de la función optim() en la base R. Todos los ajustes del modelo se En el caso de ataques fallidos o hessianos indefinidos, generamos una serie de conjeturas aleatorias alrededor de las condiciones de inicio y continuamos la estimación hasta que se lograron los ajustes exitosos. Todas las combinaciones de datos de dieciocho líneas celulares-virus-MOI fueron ajustadas por una versión inmune ausente (" = r = 0) del modelo teórico y, posteriormente, una inmunidad inducida (" = 0; r > 0) e inmunidad constitutiva (" > 0; r > 0) del modelo. Finalmente, comparamos los ajustes a través de cada combinación celular-virus-MOI vía AIC. Al calcular AIC, el número de parámetros ajustados en cada modelo (k) variaba entre los fenotipos inmunes, con un parámetro (b) estimado para supuestos inmunes ausentes, dos (b y r) para supuestos inmunológicos inducidos, y tres (b, r El tamaño de la muestra (n) correspondió al número de pasos de tiempo discretos en todos los ensayos infecciosos empíricos a los que se ajustó el modelo para cada combinación de virus de línea celular. Todos los scripts de ajuste y comparación de modelos están disponibles libremente para su descarga en el siguiente repositorio FigShare: DOI: 10.6084/m9.figshare.8312807. Finalmente, verificamos que todos los campos promedio encajan en un contexto espacial, con el fin de dilucidar más a fondo el papel de las células antivirales en cada serie temporal. Construimos nuestro modelo espacial en C++ implementado en R utilizando los paquetes Rcpp y RcppArmadillo (Eddelbuettel y Francois, 2011; Eddelbuettel y Sanderson, 2017). (2006), modelamos este sistema en una celosía hexagonal bidimensional, utilizando un tiempo epidémico de diez minutos para transiciones del estado celular. En la inicialización de cada simulación, asignamos aleatoriamente una duración de vida útil natural, período de incubación, período de infectividad y tiempo desde el estado antiviral hasta el estado susceptible a todas las células en una monocapa teórica. Las duraciones paramétricas se extrajeron de una distribución normal centrada en la inversa de las respectivas tasas fijas de m, s, a y c, según lo reportado con nuestro modelo de campo medio. Las transiciones que involucraban las tasas inducidas (r) y constitutivas (") de adquisición antiviral se gobernaban probabilísticamente y se ajustaban dinámicamente en cada paso del tiempo basado en el entorno global. Como tal, fijamos estos parámetros en los mismos valores estimados en el modelo de campo medio, y multiplicamos tanto r como " por la proporción global de, respectivamente, células expuestas y susceptibles en un tiempo dado. A diferencia de las tasas de adquisición antiviral, las transiciones que involucran la tasa de nacimiento (b) y la tasa de transmisión (b) ocurrieron probabilísticamente en base al entorno local de cada célula. La tasa de nacimiento, b, se multiplicó por la proporción de células sensibles dentro de una circunferencia de seis vecinos de una célula muerta focal, mientras que b se multiplicó por la proporción de células infecciosas dentro de una vecindad de treinta y seis de una célula susceptible focal, permitiendo así que la transmisión viral se extienda más allá de los límites más cercanos de una célula infecciosa. Para compensar los umbrales más altos de persistencia celular e invasión de virus que se producen en condiciones espaciales locales (Webb et al., 2007), aumentamos la tasa de natalidad, b, y la tasa de transmisión de células a células, b, respectivamente, a seis y diez veces los valores utilizados en el modelo de campo medio (Fichero complementario 4). Derivamos estos aumentos sobre la base de la suposición de que los nacimientos tuvieron lugar exclusivamente sobre la base de interacciones de par-vecino más cercano (las seis células inmediatamente adyacentes a una célula muerta focal), mientras que la transmisión viral se concentró localmente pero incluyó una pequeña contribución global (7,5%), que representa las treinta y seis células que rodean a una susceptible focal. Justificamos estos aumentos y derivamos sus orígenes más adelante en el archivo suplementario 5. simulamos diez series de tiempo espacial estocástico para todas las combinaciones de células-virus bajo las tres suposiciones inmunes a un tamaño de población de Formulario de notificación transparente Disponibilidad de datos Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en el manuscrito y los archivos de soporte. Todas las imágenes y códigos utilizados en este estudio se han puesto a disposición para su descarga en el siguiente Figshare

¿Qué hacen los murciélagos en su lugar?

Dinámica viral acelerada en las líneas celulares de murciélagos, con implicaciones para la emergencia zoonóticahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7064339/SHA: f2cc0d63ff2c4aaa127c4caae21d8f3a0067e3d5Autores: Brook, Cara E; Boots, Mike; Chandran, Kartik; Dobson, Andrew P; Drosten, Christian; Graham, Andrea L; Grenfell, Bryan T; Müller, Marcel A; Ng, Melinda; Wang, Lin-Fa; van Leeuwen, AniekeFecha: 2020-02-03DOI: 10.7554/elife.48401Licencia: cc-byAbstract: Bats host virulent zoo Se necesita una comprensión mecánica del impacto de las capacidades de alojamiento del virus de los murciélagos, incluyendo vías inmunológicas exclusivamente constitutivas, en la dinámica viral a escala celular para dilucidar la emergencia zoonótica. Realizamos ensayos de infectividad del virus en líneas celulares de murciélagos que expresan fenotipos inmunes inducidos y constitutivos, y luego desarrollamos un modelo teórico de nuestro sistema in vitro, que encajamos con los datos empíricos. Los modelos más adecuados recapitularon los fenotipos inmunes esperados para líneas celulares representativas, apoyando defensas antivirales robustas en células de murciélagos que se correlacionaron con estimaciones más altas para las tasas de propagación viral dentro del huésped. En general, las respuestas inmunológicas aumentadas limitan la morbilidad celular inducida por patógenos, lo que puede facilitar el establecimiento de infecciones persistentes de rápida propagación dentro del huésped. Texto: Los murciélagos han recibido mucha atención en los últimos años por su papel como anfitriones de reservorios de zoonosis virales emergentes, incluyendo la rabia y los lissavirus relacionados, Hendra y Nipah henipavirus, Ebola y Marburg filovirus, y el coronavirus SARS (Calisher et al., 2006; Wang y Anderson, 2019). En la mayoría de los mamíferos no quirópteros, henipavirus, filovirus y coronavirus inducen morbilidad y mortalidad sustancial, muestran corta duración de la infección, y provocan inmunidad robusta y a largo plazo en los huéspedes que sobreviven infección (Nicholls et al., 2003; Hooper et al., 2001; Mahanty y Bray, 2004). Los murciélagos, por el contrario, no demuestran síntomas obvios de enfermedad al infectarse con patógenos altamente virulentos en mamíferos no volátiles (Schountz et al., 2017), pero pueden, en cambio, apoyar virus como infecciones persistentes a largo plazo, en lugar de patologías transitorias e inmunizantes (Plowright et al., 2016). Los avances recientes de las investigaciones están comenzando a arrojar luz sobre los mecanismos moleculares por los cuales los murciélagos evitan la patología de estos patógenos de otro modo virulentos (Brook y Dobson, 2015). Los murciélagos aprovechan un conjunto de mecanismos específicos de la especie para limitar la carga viral, que incluyen las incompatibilidades de la secuencia del receptor del huésped para algunas combinaciones de virus del murciélago (Ng et al., 2015; Takadate et al., 2020) y la expresión constitutiva de la citocina antivir Típicamente, la presencia de ARN viral o ADN en el citoplasma de células de mamíferos inducirá la secreción de proteínas de interferón tipo I (IFN-a e IFN-b), que promueven la expresión y traducción de genes estimulados por interferón (ISGs) en células vecinas y las hacen efectivamente antivirales (Stetson y Medzhitov, 2006). En algunas células de murciélago, los planos transcripcionómicos para esta respuesta de IFN se expresan constitutivamente, incluso en ausencia de estimulación por ARN viral o ADN (Zhou et al., 2016). En los mamíferos no voladores, la expresión constitutiva de IFN probablemente provocaría inflamación generalizada e inmunopatología concomitante sobre la infección viral, pero los murciélagos apoyan adaptaciones únicas para combatir la inflamación (Zhang et al., 2013; Ahn et al., 2019; Xie et al., 2018; Pavlovich et al., 2018) que pueden haber evolucionado para mitigar el daño metabólico inducido durante el vuelo (Kacprzyk et al., 2017). La medida en que la expresión constitutiva de IFN-a significa defensa antiviral constitutiva en forma de proteína funcional IFN-a permanece sin resolver. En las células de murciélago que expresan constitutivamente IFN-a, algunos ISGs estimulados por proteínas, aguas abajo parecen ser también expresados constitutivamente, pero la inducción ISG adicional es posible después de desafío viral y estimulación de IFN-b (Zhou et al., 2016; Xie et al., 2018). A pesar de los recientes avances en la comprensión molecular de la tolerancia viral del murciélago, las consecuencias de esta inmunidad única del murciélago en la dinámica del virus dentro del huésped-y sus implicaciones para la comprensión de la emergencia zoonótica-todavía no han sido aclaradas. El campo de 'dinámica del virus' fue desarrollado por primera vez para describir los fundamentos mecánicos de los patrones a largo plazo de la carga viral en estado estacionario exhibida por los pacientes en infecciones de fase crónica con VIH, que parecían producir y virus claro a tasas equivalentes (Nowak y May, 2000; Ho et al., Los modelos de agotamiento celular objetivo simple, en los que la carga viral es dictada por un digestivo de eLife inferior Los murciélagos pueden transportar virus que son mortales a otros mamíferos sin mostrar síntomas graves. De hecho, los murciélagos son reservorios naturales para virus que tienen algunas de las tasas de mortalidad más altas de cualquier virus que la gente adquiere de animales salvajes -incluyendo la rabia, el ébola y el coronavirus SARS. Los murciélagos tienen un conjunto de defensas antivirales que mantienen la cantidad de virus en control. Por ejemplo, algunos murciélagos tienen una respuesta inmune antiviral llamada vía del interferón perpetuamente encendido. En la mayoría de otros mamíferos, tener una respuesta inmune hipervigilante causaría inflamación dañina. Los murciélagos, sin embargo, han adaptado los rasgos antiinflamatorios que los protegen de tales daños, incluyen la pérdida de ciertos genes que normalmente promueven la inflamación. Sin embargo, nadie ha explorado previamente cómo estas defensas Los experimentos hicieron uso de células de una especie de murciélago - el zorro volador negro - en el que la vía del interferón está siempre encendido, y otro - el murciélago de la fruta egipcia - en el que esta vía sólo se activa durante una infección. Las células del murciélago se infectaron con tres virus diferentes, y luego Brook et al. observaron cómo la vía del interferón ayudó a mantener las infecciones en control, antes de crear un modelo informático de esta respuesta. Los experimentos y el modelo ayudaron a revelar que las defensas de los murciélagos pueden tener una desventaja potencial para otros animales, incluyendo humanos. En ambas especies del murciélago, las respuestas antivirales más fuertes fueron contrarrestadas por el virus que se propaga más rápidamente de la célula a la célula. Esto sugiere que las defensas inmunes del murciélago pueden impulsar la evolución de virus de transmisión más rápida, y mientras que los murciélagos están bien protegidos de los efectos nocivos de sus propios virus prolíficos, otras criaturas como los Los hallazgos pueden ayudar a explicar por qué los murciélagos son a menudo la fuente de virus que son mortales en los seres humanos. Aprender más acerca de las defensas antivirales de los murciélagos y cómo impulsan la evolución del virus puede ayudar a los científicos a desarrollar mejores maneras de predecir, prevenir o limitar la propagación de virus de los murciélagos a los seres humanos. Se necesitan más estudios en los murciélagos para ayudar a estos esfuerzos. Mientras tanto, los experimentos destacan la importancia de advertir a las personas para evitar el contacto directo con murciélagos salvajes. aumentar el suministro de recursos de células de huésped susceptibles de infección, se desarrollaron por primera vez para el VIH (Perelson, 2002), pero desde entonces se han aplicado a otras infecciones crónicas, incluyendo el virus de hepatitis-C (Neumann et al., 1998), virus de hepatitis-B (Nowak et al., 1996) y citomegalovirus (Emery et al., 1999 En trabajos recientes se han adoptado técnicas similares para modelar la dinámica interna de las infecciones agudas, como la gripe A y el sarampión, que inspiran el debate sobre la medida en que el modelado explícito del control inmunológico descendente puede mejorar la inferencia más allá de las hipótesis básicas de limitación de recursos del modelo celular objetivo (Baccam et al., 2006; Pawelek et al., 2012; Saenz et al., 2010; Morris et al., 2018). Para investigar el impacto de procesos inmunes únicos de murciélagos en la cinética viral in vitro, primero realizamos una serie de experimentos de infección viral en líneas celulares de murciélagos que expresan fenotipos de interferón divergentes, y luego desarrollamos un modelo teórico que aclara la dinámica de la propagación viral dentro del huésped. Evaluamos nuestro modelo teórico analíticamente independiente de los datos, luego ajustamos el modelo a los datos recuperados de los ensayos experimentales in vitro con el fin de estimar las tasas de transmisión del virus dentro del huésped y la progresión celular al estado antiviral bajo diversos supuestos de inmunidad ausente, inducida y constitutiva. Finalmente, confirmamos nuestros hallazgos en simulaciones estocásticas espacialmente explícitas de series temporales ajustadas de nuestro modelo medio de campo. Hipotemamos que los procesos inmunes descendentes rebaten la limitación de recursos clásicos en líneas de células de murciélago descritas como antivirales constitutivas en la literatura, ofreciendo una predicción testable para modelos que se ajusten a los datos empíricos. Predecimos además que las respuestas antivirales más robustas estarían asociadas con las tasas de propagación de virus más rápidas dentro del huésped, pero también protegen a las células contra la mortalidad inducida por virus para apoyar las infecciones de larga duración en el cultivo de tejidos. Primero exploramos la influencia del fenotipo inmune innato en la propagación viral dentro del huésped en una serie de experimentos de infección en cultivo celular. Se realizaron ensayos de placa en monocapas de placa de seis pozos de tres líneas de células renales de mamíferos inmortalizadas: [1] células Vero (mono verde africano), que son defectuosas de IFN y, por lo tanto, limitadas en capacidad antiviral (Desmyter et al., 1968) ; [2] células RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus) que demuestran respuestas idiosincráticas inducidas por interferón sobre el desafío viral (Kuzmin et al., 2017; Arnold et al., 2018; Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018) ; y [3] células PaKiT01 (Pteropus alecto) que expresan constitutivamente IFN-a (Zhou et al., 2016; Crameri et al., 2009). Para intensificar las diferencias celulares específicas en la inmunidad constitutiva, realizamos ensayos de infectividad con la estomatitis vesicular rVSV-G, rVSV-EBOV, y rVSV-MARV, previamente descritos (Miller et al., 2012; Wong et al., 2010). Dos de estos virus, rVSV-EBOV y rVSV-MARV, son recombinantes cuya entrada celular está mediada por la glucoproteína de los filovirus de murciélago, Ébola (EBOV) y Marburg (MARV), lo que nos permite modular el grado de defensa estructural, así como inmunológica, antiviral en juego en cada infección. El trabajo anterior en este laboratorio ha demostrado incompatibilidades en el receptor de filovirus NPC1 que hacen a las células PaKiT01 refractarias a la infección con rVSV-MARV (Ng y Chandrab, 2018, resultados inéditos), haciéndolos estructuralmente antivirales, más allá de su expresión constitutiva de IFN-a. Las tres líneas celulares fueron desafiadas con los tres virus en dos multiplicidades de infección (MOI): 0,001 y 0,0001. Entre 18 y 39 ensayos se realizaron en cada combinación celular-virus-MOI, excepto infecciones por rVSV-MARV en las células PaKiT01 en MOI = 0,001, para las cuales sólo se realizaron ocho ensayos (ver Materiales y métodos; Figura 1 -figura suplementos 1-3, archivo suplementario 1). Debido a que los ensayos de placa restringen la transmisión viral de vecinos a vecinos en el espacio celular bidimensional (Howat et al., 2006), pudimos rastrear la propagación de células infectadas por virus que expresan GFP a través de monocapas de tejido a través de microscopía de fluorescencia invertida. Para cada ensayo de infección, monitoreamos y reimaginamos placas hasta 200 horas de observación o hasta la destrucción total de monocapas, procesamos imágenes resultantes, y generamos una serie de tiempo de la proporción de espacio de placa ocupada por células infecciosas a lo largo de la duración de cada ensayo (ver Materiales y métodos). Utilizamos modelos aditivos generalizados para inferir el curso temporal de todos los cultivos celulares replicados y construir el conjunto de datos multi-trial al que finalmente encajamos nuestro modelo de transmisión mecanística para cada combinación específica de línea celular-virus (Figura 1; Figura 1 -figura 1 - Los tres virus de la estomatitis vesicular recombinante (rVSV-G, rVSV-EBOV y rVSV-MARV) infectaron Vero, RoNi/7.1, y cultivos tisulares PaKiT01 en ambos MOIs focales. Después de la invasión, el virus se diseminó rápidamente a través de la mayoría de las monocapas celulares, resultando en una extinción epidémica inducida por el virus. Las epidemias fueron menos graves en los cultivos de células de murciélago, especialmente cuando se infectaron con los filovirus recombinantes, rVSV-EBOV y rVSV-MARV. La destrucción de monocapas se evitó en el caso de infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en las células de PaKiT01: en las primeras, la infección viral persistente se mantuvo a lo largo de Asumimos que este patrón era el resultado de la extinción epidémica mediada por el sistema inmunitario (Figura 1). Los patrones del MOI = 0,001 fueron ampliamente recapitulados en el MOI = 0,0001, aunque con proporciones totales algo reducidas (Figura 1-figura suplemento 5). Un modelo teórico adecuado a los datos in vitro recapitula los fenotipos inmunes esperados para las células de murciélagos A continuación, desarrollamos un modelo dentro del huésped para adaptarse a estos datos para dilucidar los efectos de la inmunidad inducida y constitutiva sobre la dinámica de propagación viral en el tejido huésped (Figura 1 ). El sistema compartimental dentro del huésped imitaba nuestra monocapa de cultivo celular bidimensional, con células que ocupaban cinco estados de infección distintos: susceptibles (S), antivirales (A), expuestos (E), infecciosos (I) y muertos (D). Modelamos las células expuestas como infectadas pero aún no infecciosas, capturando la "fase eclipsa" de la integración viral en una célula huésped que precede a la replicación viral. Las células antivirales eran inmunes a la infección viral, de acuerdo con el "estado antiviral" inducido por la estimulación del interferón de los ISG en los tejidos adyacentes a la infección (Stetson y Medzhitov, 2006). Debido a que nuestro objetivo era traducir los datos disponibles en procesos modelados, no modelamos explícitamente la dinámica del interferón, sino que escalamos la tasa de progresión celular de las células sensibles a los antivirales (r) por la proporción de células expuestas (globalmente) en el sistema. En sistemas que permiten la inmunidad constitutiva, una segunda tasa de adquisición celular del estado antiviral (") adicionalmente escalada con la proporción global de células sensibles en el modelo. En comparación con el virus, las partículas IFN son pequeñas y altamente difusivas, justificando esta suposición de señalización global en la extensión espacial limitada de una placa de seis pozos y manteniendo la coherencia con las aproximaciones de modelado previas de la señalización IFN en el ensayo de placa (Howat et al., 2006). Para representar mejor nuestro sistema de monocapa empírica, expresamos nuestras variables de estado como proporciones (P S, P A, P E, P I, y P D ), bajo supuestos de transmisión dependiente de la frecuencia en una población bien mezclada (Keeling y Rohani, 2008), aunque note que la inclusión de P D (representando la proporción de espacio muerto en el tejido modelado) tuvo el efecto funcional de variar la transmisión con densidad celular infecciosa. Esto resultó en el siguiente sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias:Definimos la 'inmunidad inducida' como completa, modelando todas las células como susceptibles a la invasión viral en equilibrio libre de enfermedad, con defensas inducidas después de la exposición viral a través del término r. Por el contrario, permitimos que el grado de inmunidad constitutiva varíe a través del rango de parámetros de " > 0, definiendo un sistema 'constitutivo' como aquel que contiene cualquier célula antiviral en equilibrio libre de enfermedad. Al ajustar este modelo a los datos de cultivo de tejidos, estimamos independientemente tanto r como "; así como la tasa de transmisión de células a células, b, para cada combinación de células y virus. Dado que la medida en que IFN-a se expresa constitutivamente se traduce constitutivamente en proteína funcional todavía no se conoce para los anfitriones de murciélagos (Zhou et al., 2016), este enfoque permitió que nuestros datos de cultivo de tejidos para impulsar la inferencia de modelado: incluso en las líneas celulares PaKiT01 conocidas por expresar constitutivamente IFN-a, la verdadera extensión constitutiva del sistema (es decir, la cantidad de células antivirales presentes en el equilibrio libre de enfermedad) se permitió variar a través de la estimación de ": Para los fines de ajuste del modelo, fijamos el valor de c, la tasa de retorno de las células antivirales a estado susceptible, en 0. La pequeña escala espacial y el corto curso de tiempo (máximo 200 horas) de nuestros experimentos probablemente prohibieron cualquier retorno de las células antivirales al estado susceptible en nuestro sistema empírico; sin embargo, conservamos el término c en las evaluaciones analíticas de nuestro modelo porque la regresión del estado antiviral al estado susceptible es posible durante largos periodos de tiempo in vitro y a la escala de un organismo completo (Radke et al., 1974; Rasmussen y Farley, 1975; Samuel y Knutson, 1982). Antes de adaptarnos a la serie de tiempo empírico, realizamos análisis de bifurcación de nuestro modelo teórico y generamos hipótesis probables sobre la base de resultados de modelos. De nuestro sistema de modelo interno (Ecuación 1-5), derivamos la siguiente expresión para R 0, el número de reproducción básica de patógenos (Fichero complementario 2):Los patógenos pueden invadir un cultivo de tejido Las tasas rápidas de adquisición antiviral constitutiva (") impulsarán R 0 <1: los cultivos tisulares con inmunidad antiviral altamente constitutiva serán por lo tanto resistentes a la invasión del virus desde el principio. Dado que, por definición, la inmunidad inducida se estimula después de la invasión inicial del virus, la tasa de adquisición antiviral inducida (r) no se incorpora a la ecuación para R 0; mientras que los procesos inmunes inducidos pueden controlar el virus después de la invasión inicial, no pueden evitar que ocurra a partir de. En casos de inmunidad totalmente inducida o ausente (" 1⁄4 0), la ecuación R 0 se reduce así a una forma típica del modelo SEIR clásico:En equilibrio, el modelo de campo teórico, medio demuestra uno de los tres estados de infección: equilibrio endémico, ciclos límite estables, o ninguna infección (Figura 2). Respectivamente, estos estados se aproximan a la infección persistente, la extinción epidémica inducida por virus y los fenotipos de extinción epidémica mediada por el sistema inmunitario previamente observados en experimentos de cultivo de tejidos (Figura 1 ). Teóricamente, el equilibrio endémico se mantiene cuando se generan nuevas infecciones al mismo ritmo que se pierden las infecciones, mientras que los ciclos límite representan un espacio paramétrico bajo el cual las poblaciones infecciosas y susceptibles están bloqueadas en oscilaciones predecibles. Equilibrios endémicos resultantes de la regeneración celular (es decir, nacimientos) se han descrito in vivo para el VIH (Coffin, 1995) e in vitro para los ensayos de placas de herpesvirus (Howat et al., 2006), pero debido a que se aproximan tan estrechamente a cero, los verdaderos ciclos límite probablemente sólo ocurren teóricamente, en lugar de producir extinciones estocásticas en series El análisis de bifurcación de nuestro modelo medio de campo reveló que las regiones de ninguna infección (extinción de patógenos) estaban limitadas a valores de umbral más bajo (punto Branch) para b, por debajo de los cuales el patógeno no pudo invadir. No encontramos ningún umbral superior a invasión para b bajo ninguna circunstancia (es decir, b lo suficientemente alto como para impulsar la extinción inducida por patógenos), pero los valores altos de b resultaron en bifurcaciones Hopf, que delinean regiones de espacio paramétrico caracterizadas por ciclos límite. Puesto que los ciclos límite se aproximan tan estrechamente a cero, los bs altos recuperados en este rango probablemente producirían extinciones epidémicas inducidas por virus en condiciones experimentales. Consistente con nuestra derivación para R 0, encontramos que el umbral de punto de Rama para invasión viral fue independiente de cambios en el parámetro inmune inducido (r) pero saturado en valores altos de " que caracterizan la inmunidad altamente constitutiva (Figura 3). A continuación, encajamos nuestro modelo teórico por mínimos cuadrados a cada combinación de línea celular-virus, bajo ausente, inducido, y constitutivo suposiciones de inmunidad. En general, los modelos mejor adaptados recapitularon resultados esperados basados en el fenotipo inmune de la línea celular en cuestión, como se describe en la literatura general (Tabla 1 Irónicamente, el modelo inmune inducido ofreció un ajuste ligeramente mejor que el constitutivo a las infecciones por rVSV-MARV en la línea celular PaKiT01 (la combinación de línea celular-virus para la que conocemos una incompatibilidad constitutiva antiviral de receptor de células para estar en juego). Debido a que los supuestos constitutivos inmunes pueden prohibir la invasión de patógenos (R 0 < 1), el modelo se ajusta a esta serie temporal bajo supuestos constitutivos se vieron impedidos por sobreestimación de ", que prohibió la invasión de patógenos. Sólo mediante la incorporación de una tasa extremadamente rápida de adquisición antiviral inducida podría el modelo garantizar que la infección inicial se permitiría y luego se controlaría rápidamente. En todas las parcelas del panel (A) la tasa de adquisición inmune antiviral inducida (r) se fijó en 0.01. El panel (B) representa la dinámica bajo inmunidad invariablemente inducida, que va desde ausente (izquierda: r=0) hasta alta (derecha: r=1). En todas las parcelas del panel (B) la tasa de adquisición antiviral constitutiva (") se fijó en 0.0001 Las curvas de puntos de rama se representan como líneas sólidas y curvas Hopf como líneas rayadas. El espacio blanco indica equilibrio endémico (persistencia), el espacio gris indica ciclos límite y el espacio negro no indica infección (extinción).Otros valores de parámetro para el análisis de equilibrio se fijaron en: b = 025, m = 0,001, s = 1/6, c = 0. Los puntos especiales de los análisis de bifurcaciones se enumeran en el archivo complementario 3. Al ajustar nuestro modelo teórico a los datos in vitro, estimamos la tasa de transmisión del virus dentro del huésped (b) y la tasa(s) de adquisición celular al estado antiviral (r o r + ") (cuadro 1 ; archivo suplementario 4). Bajo supuestos inmunes ausentes, r y " se fijaron en 0 mientras que b se estimó; bajo supuestos inmunológicos inducidos " se fijó en 0 mientras que r y b se estimaron; y bajo hipótesis inmunológicas constitutivas, los tres parámetros Las estimaciones de parámetros de mejor ajuste para los datos de MOI=0,001 se visualizan en conjunción con br y b -" bifurcaciones en (r) y (B) la tasa de inmunidad constitutiva de adquisición antiviral ("). Los paneles muestran variación en el grado de inmunidad, de ausente (izquierda) a alto (derecha). Las curvas de punto de rama se representan como líneas sólidas y las curvas de Hopf como líneas discontinuas. El espacio blanco indica equilibrio endémico (persistencia), el espacio gris indica ciclo límite y el espacio negro no indica infección (extinción). Otros valores de parámetros para el análisis de equilibrio se fijaron en: b = 025, m = 0,001, s = 1/6, a = 1/6, c = 0. Los puntos especiales de los análisis de bifurcaciones se enumeran en el archivo suplementario 3. A diferencia de las células Vero, el modelo de inmunidad inducida ofrecía el mejor ajuste a todos los datos de RoNi/7.1, consistentes con los patrones reportados en la literatura y nuestra propia validación por qPCR (Tabla 1; Arnold et al., 2018; Kuzmin et al., 2017; Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018). Al igual que en los ensayos con células Vero, estimamos los valores b más altos para las infecciones por rVSV-G en las líneas celulares de RoNi/7.1 pero aquí recuperamos estimaciones b más altas para rVSV-MARV que para rVSV-EBOV. Esta inversión se equilibró con una tasa estimada más alta de adquisición a estado antiviral (r) para rVSV-EBOV frente a rVSV-MARV. En general, observamos que las tasas más rápidas de adquisición antiviral (ya sea inducida, r, constitutiva, ", o ambas) se correlacionaban con mayores tasas de transmisión (b). Al compensarse por r, los valores estimados para las infecciones por RoNi/7.1 mantuvieron la misma amplitud que los estimados para las líneas celulares de Vero inmune-ausente pero causaron epidemias más suaves y reducción de la mortalidad celular (Figura 1). Las estimaciones de parámetros de RoNi/7.1 localizadas en la región correspondientes al equilibrio endémico para el modelo determinista teórico (Figura 4), produciendo epidemias menos agudas que sin embargo se extinguieron en experimentos estocásticos. Finalmente, los ensayos de rVSV-G y rVSV-EBOV en células PaKiT01 se ajustaron mejor por modelos que asumen inmunidad constitutiva, mientras que las infecciones por rVSV-MARV en PaKiT01 se emparejaron equivalentemente con modelos que asumen inmunidad inducida o constitutiva-con modelos inducidos favorecidos sobre constitutivos en comparaciones AIC porque se estimó un parámetro menos (figura 1-figura suplementos 4-5; archivo suplementario 4). Para todas las infecciones por virus, las líneas celulares de PaKiT01 produjeron b estima un orden completo de magnitud superior a Vero o RoNi/7.1 células, con cada b equilibrado por una respuesta inmune (ya sea r, o r combinado con ") también un orden de magnitud superior al recuperado para las otras líneas celulares (figura 4 ; tabla 1 ). Al igual que en células RoNi/7.1, el parámetro PaKi Debido a que los procesos inmunes constitutivos pueden realmente prohibir la invasión inicial de patógenos, la inmunidad constitutiva se ajusta a las infecciones por rVSV-MARV en líneas celulares PaKiT01 constantemente localizadas en o por debajo del umbral del punto de Rama para la invasión del virus (R 0 1⁄4 1). Durante el ajuste del modelo para la optimización de ", cualquier prueba de parámetros de " valores que producen R 0 < 1 no dio lugar a ninguna infección y, en consecuencia, produjo un ajuste extremadamente deficiente a los datos de las series temporales infecciosas. En todos los modelos, asumiendo inmunidad constitutiva, en todas las líneas celulares, las contribuciones antivirales de " virus prohibidos de invadir en absoluto. Con el fin de comparar las contribuciones relativas de los diferentes procesos inmunes de cada línea celular a la dinámica epidémica, a continuación utilizamos nuestras estimaciones de parámetros de campo promedio para calcular la 'tasa antiviral' inicial de acumulación de células antivirales tras la invasión del virus para cada combinación de células-virus-MOI basado en la siguiente ecuación:donde P E se calculó a partir de la dosis infecciosa inicial (MOI) de cada experimento de infección y P S se estimó en equilibrio libre de enfermedad:Porque y "ambos contribuyen a esta tasa antiviral inicial, las hipótesis inmunológicas inducidas y constitutivas son capaces de producir tasas igualmente rápidas, dependiendo de los ajustes de parámetros. De hecho, bajo supuestos inmunes totalmente inducidos, la tasa de adquisición antiviral inducida (r) estimada para la infección por rVSV-MARV en las células PaKiT01 fue tan alta que la tasa antiviral En realidad, sabemos que las incompatibilidades con los receptores NPC1 hacen que las líneas celulares PaKiT01 constitutivamente sean refractarias a la infección por rVSV-MARV (Ng y Chandrab, 2018, resultados inéditos) y que las células PaKiT01 también expresan constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a. Los resultados de ajuste del modelo sugieren que esta expresión constitutiva de IFN-a puede actuar más como una respuesta inmune rápidamente inducible tras la invasión del virus que como una secreción constitutiva de la proteína funcional IFN-a. Sin embargo, como hipotetizado, las líneas celulares PaKiT01 fueron con mucho la más antiviral de cualquiera en nuestro estudio-con tasas antivirales iniciales estimadas en varios órdenes de magnitud superiores a cualquier otro en nuestro estudio, bajo supuestos inducidos o constitutivos (Tabla 1 ; Ficha complementaria 4). Las células RoNi/7.1 mostraron la segunda firma de inmunidad más pronunciada, seguida de las células Vero, para las cuales la tasa antiviral inicial fue esencialmente cero incluso bajo supuestos forzados de inmunidad inducida o constitutiva (Tabla 1 ; Archivo suplementario 4). Utilizando parámetros ajustados para b y ", calculamos adicionalmente R 0, el número de reproducción básico para el virus, para cada combinación de línea celular-virus-MOI (Tabla 1 ; Archivo suplementario 4). Encontramos que R 0 fue esencialmente sin cambios en diferentes supuestos inmunes para las células RoNi/7.1 y Vero, para las cuales la tasa antiviral inicial fue baja. En el caso de las células PaKiT01, una alta tasa inicial de antiviral bajo inmunidad inducida o constitutiva resultó en una estimación correspondientemente alta de b (y, por consiguiente, R 0 ) que aún produjo la misma curva epidémica que resultó de las estimaciones mucho más bajas para b y R 0 emparejadas con inmunidad ausente. Estos hallazgos sugieren que las respuestas inmunes antivirales protegen los tejidos huésped contra la mortalidad celular inducida por virus y pueden facilitar el establecimiento de tasas de transmisión más rápidas dentro del huésped. La destrucción total de monocapas se produjo en todas las combinaciones de virus celulares excepto infecciones por rVSV-EBOV en células RoNi/7.1 e infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en células PaKiT01. La destrucción de monocapas correspondió al agotamiento celular sensible y al recambio epidémico donde R efectivo (el producto de R 0 y Para las infecciones por rVSV-EBOV en las células antivirales inducidas RoNi/7.1, las células vivas remanentes salvaguardadas, que dieron a luz nuevas células sensibles tardíamente en la serie temporal. En las infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en las células PaKiT01, esta protección antiviral detuvo la epidemia (Figura 5 ; R-efectiva <1) antes de que los susceptibles declinaran completamente. En el caso de las infecciones por rVSV-EBOV en las células PaKiT01, el nacimiento de nuevos susceptibles a partir de células vivas remanentes protegidas por el estado antiviral mantuvo la transmisión tardía para facilitar la persistencia de la epidemia a largo plazo. Es importante destacar que bajo los valores de parámetros fijos para la tasa de incubación de la infección (s) y la tasa de mortalidad inducida por la infección (a), los modelos no pudieron reproducir las series de tiempo infeccioso a más largo plazo captadas en los datos de infecciones por rVSV-EBOV en las líneas celulares de PaKiT01 sin incorporación de nacimientos celulares, suposición adoptada en representaciones de modelos anteriores de la dinámica viral mediada por IFN en el cultivo de tejidos (Howat et al., 2006). En nuestros experimentos, observamos que la reproducción celular se llevó a cabo como ensayos de placa alcanzó confluencia. Finalmente, debido a que el efecto protector de las células antivirales es más claramente observable espacialmente, confirmamos nuestros resultados simulando series de tiempo ajustadas en una reconstrucción estocástica espacialmente explícita de nuestro modelo de campo medio. En las simulaciones espaciales, las tasas de adquisición antiviral se fijaron en valores ajustados para r y " derivados de las estimaciones medias de campo, mientras que las tasas de transmisión (b) se fijaron en valores diez veces superiores a los estimados en condiciones medias de campo, teniendo en cuenta la intensificación de los umbrales de parámetros que permitían la invasión de patógenos en las interacciones espaciales locales (véanse Materiales y métodos; Videos 1-3; Suplemento 3 de la figura 5; Fichero complementario 5; Webb y otros, 2007). En series temporales inmunitarias, las células antivirales espaciales actuaron como "refugios" que protegían a las células vivas de la infección como cada onda epidémica inicial "lavada" a través de una monocapa celular. Los murciélagos son reservorios para varias zoonosis emergentes importantes, pero parecen no experimentar la enfermedad de patógenos virales de otro modo virulentos. Aunque la literatura biológica molecular ha hecho grandes progresos en el esclarecimiento de los mecanismos por los cuales los murciélagos toleran infecciones virales (Zhou et al., 2016; Ahn et al., 2019; Xie et al., 2018; Pavlovich et al., 2018; Zhang et al., 2013), el impacto de la inmunidad única de los murciélagos en la dinámica del virus dentro del huésped no ha sido bien aclarada. Utilizamos una combinación innovadora de experimentación in vitro y modelado dentro del huésped para explorar el impacto de la inmunidad única de los murciélagos en la dinámica del virus. Críticamente, descubrimos que las líneas de células de murciélago demostraron una firma de respuesta inmune mejorada mediada por interferón, de forma constitutiva o inducida, que permitió establecer tasas rápidas de transmisión del Estos resultados fueron apoyados por el análisis bifurcado independiente de los datos de nuestro modelo teórico de campo medio, así como por el ajuste de este modelo a las series de tiempo de infección viral establecidas en el cultivo de células de murciélagos. Además, demostramos que el estado antiviral inducido por la vía del interferón protege a las células vivas de la mortalidad en el cultivo de tejidos, resultando en epidemias in vitro de larga duración que aumentan la probabilidad de establecer una infección persistente a largo plazo. Nuestros hallazgos sugieren que los virus evolucionados en depósitos de murciélagos que poseen capacidades mejoradas de IFN podrían lograr tasas de transmisión más rápidas dentro del huésped sin causar patología a sus huéspedes. Estos virus de rápida reproducción probablemente generarían una virulencia extrema sobre el derrame a los huéspedes que carecen de capacidades inmunes similares a los murciélagos. Para lograr estos resultados, primero desarrollamos un modelo teórico novedoso, dentro del huésped, elucidando los efectos de la inmunidad Consideramos que una línea celular es constitutivamente inmune si posee cualquier número de células antivirales en equilibrio libre de enfermedad pero permite que la extensión de inmunidad constitutiva varíe a través del rango de parámetros para ", la tasa constitutiva de adquisición antiviral. Al derivar la ecuación para R 0, el número básico de reproducción, que define las condiciones umbral para la invasión viral de un tejido (R 0 > 1), demostramos cómo el umbral de invasión se eleva a valores altos de adquisición antiviral constitutiva, ". Los procesos inmunes constitutivos pueden así prohibir la invasión de patógenos, mientras que las respuestas inducidas, por definición, sólo pueden controlar las infecciones post-hoc. Una vez que se han alcanzado los umbrales de invasión patogénica, las suposiciones de inmunidad constitutiva limitarán la mortalidad celular (virulencia) incurrida a altas tasas de transmisión. Independientemente del mecanismo (inducido o constitutivo), las células antivirales estimuladas por interferón parecen desempeñar un papel clave en el mantenimiento de infecciones persistentes o a largo plazo al proteger a las células sensibles de la infección rápida y la muerte celular concomitante. El ajuste de nuestro modelo a los datos in vitro apoyó los fenotipos inmunes esperados para diferentes líneas celulares de murciélagos, como se describe en la literatura. Modelos simples de células diana que ignoran los efectos de la inmunidad mejor serie temporal infecciosa recapitulada derivada de células Vero deficientes de IFN, mientras que los modelos que asumen procesos inmunes inducidos reprodujeron con mayor precisión ensayos derivados de células RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus), que poseen una respuesta IFN inducida por virus estándar. En la mayoría de los casos, los modelos que asumen procesos inmunes constitutivos mejor recrean epidemias de virus producidas en las células de PaKiT01 (Pteropus alecto), que se sabe que expresan constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a (Zhou et al., 2016). El apoyo del modelo para suposiciones inmunológicas inducidas en ajustes a infecciones por rVSV-MARV en las células de PaKiT01 sugiere que la expresión constitutiva IFN-a característica de las células de P. alecto puede representar más un proceso de primogenitura inmune constitutivo que una defensa perpetua, funcional y antiviral. Los resultados del ajuste del modelo de campo medio fueron confirmados adicionalmente en simulaciones estocásticas espacialmente explícitas de cada serie temporal. Como se ha demostrado anteriormente en los modelos internos para el VIH (Coffin, 1995; Perelson et al., 1996; Nowak et al., 1995; Bonhoeffer et al., 1997; Ho et al., 1995), los supuestos de agotamiento simple de las células diana a menudo pueden proporcionar aproximaciones satisfactorias de la dinámica viral, especialmente las reproducidas en sistemas in vitro simples. Críticamente, nuestro ajuste del modelo enfatiza la necesidad de incorporar los efectos descendentes del control inmunológico para reproducir con precisión las series de tiempo infecciosas derivadas de cultivos de células de murciélago, especialmente las resultantes de la línea celular PaKiT01 P. alecto robustamente antiviral. Estos hallazgos indican que las vías inmunes mejoradas mediadas por la IFN en los reservorios de murciélagos pueden promover tasas elevadas de replicación del virus dentro del huésped antes de la aparición de especies cruzadas. No El trabajo futuro debe extender estos estudios de cultivo celular para incluir mediciones de múltiples variables de estado (es decir, células antivirales) para mejorar la inferencia epidemiológica.La continua recurrencia de epidemias de Ébola en toda África central destaca la importancia de entender el papel de los murciélagos como reservorios para la enfermedad zoonótica virulenta. La última década ha nacido testigo de un consenso emergente con respecto a las vías únicas por las cuales los murciélagos resisten y toleran infecciones altamente virulentas (Brook y Dobson, 2015; Xie et al., 2018; Zhang et al., 2013; Ahn et al., 2019; Zhou et al., 2016; Ng et al., 2015; Pavlovich et al., 2018). Sin embargo, sigue siendo difícil comprender los mecanismos por los cuales los murciélagos apoyan patógenos endémicos a nivel poblacional, o promueven la evolución de El mantenimiento endémico de la infección es una característica definitoria de un reservorio de patógenos (Haydon et al., 2002), y los murciélagos parecen merecer tal título, apoyando la persistencia a largo plazo de infecciones virales altamente transmisibles en poblaciones insulares aisladas muy por debajo de los tamaños críticos esperados de la comunidad (Peel et al., 2012). Los investigadores debaten la influencia relativa de los mecanismos a nivel de la población y dentro del huésped que podrían explicar estas tendencias (Plowright et al., 2016), pero cada vez más, los datos de campo son difíciles de conciliar sin reconocer un papel para las infecciones persistentes (Peel et al., 2018; Brook et al., 2019). Presentamos métodos generales para estudiar la dinámica viral a escala cruzada, que sugieren que la persistencia dentro del huésped está respaldada por respuestas antivirales robustas características de los procesos inmunes al murciélago. Los virus que evolucionan rápidamente las tasas de replicación bajo estas robustas defensas antivirales pueden representar el mayor riesgo para la aparición de patógenos de especies cruzadas en huéspedes de derrames con sistemas inmunes que difieren de los únicos a los murciélagos. Todos los experimentos se llevaron a cabo en tres líneas de células renales de mamíferos inmortalizados: Vero (mono verde africano), RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus) (Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011) y PaKiT01 (Pteropus alecto) (Crameri et al., 2009). Las identificaciones de especies de todas las líneas de células de murciélago se confirmaron morfológica y genéticamente en las publicaciones en las que se describieron originalmente (Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011; Crameri et al., 2009 Las monocapas de cada línea celular fueron cultivadas hasta 90% de confluencia (~9Â10 5 células) en placas de 6 pocillos. Las células fueron mantenidas en una incubadora humidificada de 37oC, 5% CO 2 y cultivadas en el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies, Grand Island, NY), complementadas con suero bovino fetal 2% (Gemini Bio Products, West Sacramento, CA), y 1% penicilina-estreptomicina (Life Technologies).Las células fueron analizadas mensualmente para detectar la contaminación por micoplasma mientras se realizaban experimentos; todas las células determinaron negativo para la contaminación en cada prueba. El trabajo anterior ha demostrado que todas las líneas celulares utilizadas son capaces de montar una respuesta IFN de tipo I en caso de desafío viral, con la excepción de las células Vero, que poseen una deficiencia IFN-b (Desmyter et al., 1968; Rhim et al., 1969; Emeny y Morgan, 1979). Las células RoNi/7.1 han demostrado montar defensas IFN inducidas idiosincráticas ante infección viral (Pavlovich et al., 2018; Kuzmin et al., 2017; Arnold et al., 2018; Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011), mientras que las células PaKiT01 son conocidas por expresar constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a (Zhou et al., 2016). Este trabajo es la primera documentación de la señalización de IFN inducida en caso de desafío con los VSV recombinantes particulares descritos a continuación. Verificamos fenotipos inmunes antivirales conocidos a través de qPCR. Los resultados fueron consistentes con la literatura, indicando un papel menos pronunciado para la defensa del interferón contra la infección viral en las células RoNi/7.1 versus PaKiT01. Se han descrito previamente los virus de la estomatitis vesicular recombinante con capacidad de replicación (Wong et al., 2010; Miller et al., 2012). Los virus fueron seleccionados para representar una amplia gama de respuestas antivirales anticipadas de las células huésped, basadas en una gama de historias evolutivas pasadas entre la entrada de células glucoproteínas del virus y el receptor de entrada de la célula huésped. Estas interacciones variaron desde la ausencia total de historia evolutiva en el caso de infecciones por rVSV-G en todas las líneas celulares hasta una incompatibilidad de entrada celular a nivel de receptor conocido en el caso de infecciones por rVSV-MARV en las líneas celulares PaKiT01. Para medir las infecciones de rVSV en cada una de las líneas celulares descritas anteriormente, para calcular la dosis viral correcta para cada MOI, se añadió NH 4 Cl (20 mM) a cultivos celulares infectados a 1-2 horas de postinfección para bloquear la propagación viral, y las células eGFP positivas individuales se contabilizaron manualmente a las 12-14 horas de postinfección. Los trabajos publicados anteriormente indican que las líneas de células renales inmortalizadas de Rousettus aegyptiacus (RoNi/7.1) y Pteropus alecto (PaKiT01) exhiben diferentes fenotipos inmunes antivirales innatos a través de, respectivamente, inducidos (Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018; Kühl et al., 2011; Arnold et al., 2018) y expresión constitutiva (Zhou et al., 2016) de los genes de interferón tipo I. Verificamos estos fenotipos publicados en nuestras propias líneas celulares infectadas con rVSV-G, rVSV-EBOV, y rVSV-MARV vía qPCR de genes IFN-a e IFN-b a través de una serie longitudinal de infecciones. Específicamente, realizamos múltiples series temporales de infección de cada línea celular con cada uno de los virus descritos anteriormente, bajo condiciones de infección simuladas y en MOIs de 0,0001 y 0,001-con excepción de rVSV-MARV en líneas celulares PaKiT01, para lo cual la infección sólo se realizó en MOI = 0,0001 debido a las limitadas existencias virales y a la extremadamente baja infectividad de este virus en esta línea celular (requeriendo así altas cargas virales para la infección inicial).Todos los experimentos se ejecutaron en duplicado en placas 6well, de tal manera que una placa típica para cualquiera de los tres virus tenía dos pozos de control (mock), dos MOI = 0,0001 pozos y dos MOI = 0,001 pozos, excepto las placas PaKiT01, que tenían dos controles y cuatro MOI = 0,0001 pozos en un momento dado. Justificamos esta exención de PaKiT01 a través de la expectativa de que IFN-una expresión es constitutiva para estas células, y por la suposición de que cualquier expresión exhibida en el MOI inferior también debería estar presente en el MOI superior. Para estas series de tiempo de expresión génica, cuatro placas de 6 pocillos para cada combinación de línea celular-virus fueron incubadas con virus durante una hora a 37oC. Después de la incubación, el virus fue aspirado, y los monocapas celulares fueron lavados en PBS, luego cubiertos con un ensayo de placa de agar superpuesto para imitar las condiciones bajo las cuales se realizaron los ensayos de infección. Las placas se recolectaron secuencialmente en los puntos de tiempo de aproximadamente 5, 10, 15 y 20 horas después de la infección (el tiempo exacto variaba como múltiples ensayos se ejecutaban simultáneamente). Después de la cosecha de cada placa, se eliminó la capa de agar y se lisó el virus y se extrajo ARN de las células utilizando el kit Zymo Quick ARN Mini Prep, de acuerdo con las instrucciones del fabricante e incluyendo el paso para la digestión del ADN celular. Después de la extracción, la calidad del ARN se verificó a través de nanodrop, y el ARN se convirtió a cDNA utilizando el kit de síntesis de cDNA de Superscript III Invitrogen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. cDNA se almacenó a 4oC y como un stock congelado a À20oC para esperar qPCR. Nos encargamos de qPCR de cDNA para evaluar la expresión de los genes de interferón tipo I, IFN-a e IFNb, y el gen de mantenimiento de la casa, b-Actin, utilizando imprimaciones Para qPCR, se incubaron 2 ml de cada muestra de cDNA con 7 ml de agua desionizada, 1 ml de 5 UM de mezcla de imprimación hacia adelante/reversa y 10 ml de iTaq Universal SYBR Green, luego se cicló en una máquina de PCR QuantStudio3 en tiempo real bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 C durante 2 minutos seguido de 40 ciclos de: desnaturalización a 95 C (5 s), recocido a 58 C (15 s), y extensión a 72 C (10 s). Se reportan valores d-Ct simples para cada ejecución, con Ct en bruto del gen objetivo de interés (IFN-a o IFN-b) restado de Ct en bruto del gen de limpieza b-Actin en la Figura 1 -figura suplemento 6. El cálculo del cambio de pliegue sobre la infección viral en comparación con el simulacro usando el método d-d-Ct (Livak y Schmittgen, 2001) fue inapropiado en este caso, ya que deseábamos demostrar la expresión constitutiva de IFN-a en células PaKiT01, por lo que los datos de células simuladas eran idénticos a los producidos a partir de células infectadas. Después de crecer a ~ 90% de confluencia, las células fueron incubadas con rVSV en pellets expresando eGFP (rVSV-G, rVSV-EBOV, rVSV-MARV). Las líneas celulares fueron desafiadas con una baja (0,0001) y alta (0.001) multiplicidad de infección (MOI) para cada virus. En una monocapa celular infectada en un determinado MOI (m), la proporción de células (P), infectadas por k partículas virales puede ser descrita por la distribución de Poisson: P k ð 1⁄4 e Àm m k!, de tal manera que el número de células inicialmente infectadas en un experimento es igual a: 1 À e Àm. Asumimos que un cultivo confluente ~90 % en el origen de cada ensayo estaba compuesto por ~9x10 5 células y conducía todos los experimentos en MOIs de 0,0001 y 0,001, lo que significa que comenzamos cada ensayo introduciendo virus a, respectivamente, ~81 u 810 células, que representan la variable de estado 'E' en nuestro modelo teórico. Los MOIs bajos fueron seleccionados para aproximar mejor la dinámica de infección de campo media y limitar artefactos de estructuración espacial, tales como extinción epidémica prematura cuando las placas en crecimiento Se prepararon placas de seis pocillos con cada infección por duplicado o triplicado, de manera que un pozo de control (sin virus) y 2-3 pozos cada uno en el MOI 0,001 y 0,0001 fueron incubados simultáneamente en la misma placa. En total, se realizaron entre 18 y 39 ensayos en cada combinación de células-virus-MOI, excepto infecciones por r-VSV-MARV en células PaKiT01 en el MOI = 0,001, para lo cual se realizaron sólo ocho ensayos debido a la baja infectividad de este virus en esta línea celular, lo que requirió altas cargas virales para la infección inicial. Las células fueron incubadas con virus por una hora a 37oC. Después de la incubación, el virus fue aspirado, y las monocapas celulares fueron lavadas en PBS, luego cubiertas con una capa viscosa fundida (50% 2X MEM/Lglutamina; 5% FBS; 3% HEPES; 42% agarosa), enfriadas durante 20 min, y re-incubadas en su ambiente original humidificado 37°C, 5% CO 2. Después de la aplicación de la superposición, las placas fueron monitoreadas periódicamente utilizando un microscopio de fluorescencia invertido hasta que se presenciaron los primeros signos de expresión de GFP (~6-9.5 hr post-infección, dependiendo de la línea celular y el virus bajo investigación). A partir de ese momento, un subconjunto cuadrado del centro de cada pozo (compuesto por 64 o 36 sub-marcos y que correspondía aproximadamente al 60% y 40% del espacio de pozo entero) fue fotografiado periódicamente, utilizando una plataforma CellInsight CX5 High Content Screening (HCS) con un objetivo aéreo 4X (ThermoFisher, Inc, Waltham, MA). Los ajustes de microscopios se mantuvieron estándar en todos los ensayos, con tiempo de exposición fijado en 0,0006 s para cada imagen. Se implicó un canal de color, de modo que las imágenes producidas muestran células que expresan GFP en células blancas y no GFP en negro (Figura 1-figura suplemento 1). Los pozos fueron fotografiados en rotación, con la mayor frecuencia posible, desde el inicio de la expresión GFP hasta el momento en que la mayoría de las células del pozo fueron consideradas muertas, la expresión GFP ya no pudo ser detectada, o la terminación temprana fue deseada para permitir la tinción de Hoechst. En el caso de las células PaKiT01 infectadas con rVSV-EBOV, donde se estableció una infección aparentemente persistente, el ensayo fue terminado después de 200+ horas (8+ días) de observación continua. Al finalizar todos los ensayos, las células fueron fijas en formaldehído (4% durante 15 min), incubadas con mancha Hoechst (0,0005% durante 15 min) (ThermoFisher, Inc, Waltham, MA), luego imágenes en 4X en la plataforma CellInsight CX5 High Content Screening (HCS). Un canal de color fue permitido de tal manera que las imágenes producidas mostraron núcleos vivos en células blancas y muertas en negro. Colores de la mancha Hoechst ADN celular, y la infección viral se cree que interfiere con la claridad de la mancha (Dembowski y DeLuca, 2015). Como tal, la terminación de la infección, la fijación celular y la tinción Hoechst permite la generación de una serie de tiempo áspero de células vivas no infecciosas (es decir, susceptibles + células antivirales) para complementar las imágenes que produjeron series temporales de proporciones infecciosas. Debido a la incertidumbre sobre el estado epidémico exacto de las células manchadas de Hoechst (es decir, las células expuestas pero aún no infecciosas pueden todavía mancharse), elegimos adaptar nuestros modelos sólo a las series infecciosas de tiempo derivadas de imágenes que expresan GFP y utilizaron las imágenes de mancha Hoechst como un control visual Las imágenes recuperadas de la serie temporal anterior fueron procesadas en forma binaria ('infecciosa' vs. 'no infecciosa' o, para las imágenes manchadas de Hoechst, 'live' vs.'muerta') utilizando el paquete EBImage (Pau et al., 2010) en la versión R 3.6 para MacIntosh, después de métodos más detallados en el archivo suplementario 7. Las imágenes binarias fueron procesadas posteriormente en series temporales de imágenes infecciosas o, para las imágenes manchadas de Hoechst, células vivas utilizando una serie de scripts de recuento de células. Debido a limitaciones logísticas (es decir, muchas placas de ensayos simultáneos de infección en ejecución y sólo un microscopio de imágenes disponible), el curso temporal de la imagen a lo largo de la duración de cada ensayo fue muy variable. Como tal, ajustamos una serie de modelos estadísticos a nuestros datos de imagen procesados para reconstruir valores confiables de la proporción infecciosa de cada pozo por hora para cada ensayo distinto en todas las combinaciones de línea celular-virus-MOI (Figura 1 Para derivar la expresión de R 0, el número básico de patógenos reproductivos in vitro, utilizamos técnicas de Next Generation Matrix (NGM) (Diekmann et al., 1990; Heffernan et al., 2005), empleando Wolfram Mathematica (versión 11.2) como herramienta analítica. R 0 describe el número de nuevas infecciones generadas por una infección existente en una población huésped completamente susceptible; un patógeno invadirá una población cuando R 0 > 1 (archivo suplementario 2). Luego analizamos las propiedades de estabilidad del sistema, explorando la dinámica a través de un rango de espacios de parámetros, utilizando MatCont (versión 2.2) (Dhooge et al. La tasa de natalidad, b, y la tasa de mortalidad natural, m, equilibrio para producir una tasa de crecimiento a nivel de población, de tal manera que es imposible estimar tanto b como m simultáneamente a partir de los datos del tamaño total de la población. Como tal, fijamos b en 025 y estimamos m mediante el ajuste de una versión ausente de infección de nuestro modelo de campo medio a las series de tiempo susceptibles derivadas de la tinción de pozos de control de Hoechst para cada una de las tres líneas celulares (figura 1-figura suplemento 7). Esto produjo una tasa de mortalidad natural, m, correspondiente a una vida útil de aproximadamente 121, 191 y 84 horas, respectivamente, para Vero, RoNi/7.1, y PaKiT01 líneas celulares (figura 1-figura suplemento 7). A continuación, fijamos la tasa de incubación del virus, s, como la inversa de la duración más corta observada del tiempo desde la infección inicial hasta la observación de las primeras células infecciosas a través del microscopio fluorescente para todas las combinaciones de nueve líneas celulares -virus (con un rango de 6 a 9,5 horas). Fijamos a, la tasa de mortalidad inducida por infección, en 1/6, un estándar aceptado para la cinética viral general (Howat et al., 2006), y mantuvimos c, la tasa de regresión celular antiviral a estado susceptible, en 0 para el intervalo de tiempo (< 200 horas) de los ensayos de infección celular experimental. Estimamos valores específicos de línea celular-virus-MOI para b, r, y " mediante el ajuste de la producción determinista de proporciones infecciosas en nuestro modelo de campo medio a la serie completa de resultados estadísticos de todos los ensayos para cada serie de tiempo de cultivo celular El ajuste se realizó minimizando la suma de las diferencias cuadradas entre la salida del modelo determinista y la proporción infecciosa específica de la línea celularvirus-MOI de los datos en cada paso del tiempo. Optimizamos los parámetros para el MOI = 0,001 y 0,0001 simultáneamente para aprovechar la potencia estadística a través de los dos conjuntos de datos, estimando una tasa de transmisión diferente, b, para ensayos que se ejecutan a cada dosis infecciosa pero, cuando proceda, estimando las mismas tasas de r y " a través de las dos series temporales. Utilizamos el solucionador de ecuaciones diferenciales lsoda() en el paquete R deSolve (Soetaert et al., 2010) para obtener soluciones numéricas para el modelo de campo medio y se llevó a cabo la minimización utilizando el algoritmo 'Nelder-Mead' de la función optim() en la base R. Todos los ajustes del modelo se En el caso de ataques fallidos o hessianos indefinidos, generamos una serie de conjeturas aleatorias alrededor de las condiciones de inicio y continuamos la estimación hasta que se lograron los ajustes exitosos. Todas las combinaciones de datos de dieciocho líneas celulares-virus-MOI fueron ajustadas por una versión inmune ausente (" = r = 0) del modelo teórico y, posteriormente, una inmunidad inducida (" = 0; r > 0) e inmunidad constitutiva (" > 0; r > 0) del modelo. Finalmente, comparamos los ajustes a través de cada combinación celular-virus-MOI vía AIC. Al calcular AIC, el número de parámetros ajustados en cada modelo (k) variaba entre los fenotipos inmunes, con un parámetro (b) estimado para supuestos inmunes ausentes, dos (b y r) para supuestos inmunológicos inducidos, y tres (b, r El tamaño de la muestra (n) correspondió al número de pasos de tiempo discretos en todos los ensayos infecciosos empíricos a los que se ajustó el modelo para cada combinación de virus de línea celular. Todos los scripts de ajuste y comparación de modelos están disponibles libremente para su descarga en el siguiente repositorio FigShare: DOI: 10.6084/m9.figshare.8312807. Finalmente, verificamos que todos los campos promedio encajan en un contexto espacial, con el fin de dilucidar más a fondo el papel de las células antivirales en cada serie temporal. Construimos nuestro modelo espacial en C++ implementado en R utilizando los paquetes Rcpp y RcppArmadillo (Eddelbuettel y Francois, 2011; Eddelbuettel y Sanderson, 2017). (2006), modelamos este sistema en una celosía hexagonal bidimensional, utilizando un tiempo epidémico de diez minutos para transiciones del estado celular. En la inicialización de cada simulación, asignamos aleatoriamente una duración de vida útil natural, período de incubación, período de infectividad y tiempo de estado antiviral a estado susceptible a todas las células en una monocapa teórica. Las duraciones paramétricas se extrajeron de una distribución normal centrada en la inversa de las tasas fijas respectivas de m, s, a, y c, según lo reportado con nuestro modelo de campo medio. Las transiciones que involucraban las tasas inducidas (r) y constitutivas (") de adquisición antiviral se gobernaban probabilísticamente y se ajustaban dinámicamente en cada paso del tiempo basado en el entorno global. Como tal, fijamos estos parámetros en los mismos valores estimados en el modelo de campo medio, y multiplicamos tanto r como " por la proporción global de, respectivamente, células expuestas y susceptibles en un tiempo dado. A diferencia de las tasas de adquisición antiviral, las transiciones que involucran la tasa de nacimiento (b) y la tasa de transmisión (b) ocurrieron probabilísticamente en base al entorno local de cada célula. La tasa de nacimiento, b, se multiplicó por la proporción de células sensibles dentro de una circunferencia de seis vecinos de una célula muerta focal, mientras que b se multiplicó por la proporción de células infecciosas dentro de una vecindad de treinta y seis de una célula susceptible focal, permitiendo así que la transmisión viral se extienda más allá de los límites más cercanos de una célula infecciosa. Para compensar los umbrales más altos de persistencia celular e invasión de virus que se producen en condiciones espaciales locales (Webb et al., 2007), aumentamos la tasa de natalidad, b, y la tasa de transmisión de células a células, b, respectivamente, a seis y diez veces los valores utilizados en el modelo de campo medio (Fichero complementario 4). Derivamos estos aumentos sobre la base de la suposición de que los nacimientos tuvieron lugar exclusivamente sobre la base de interacciones de par-vecino más cercano (las seis células inmediatamente adyacentes a una célula muerta focal), mientras que la transmisión viral se concentró localmente pero incluyó una pequeña contribución global (7,5%), que representa las treinta y seis células que rodean a una susceptible focal. Justificamos estos aumentos y derivamos sus orígenes más adelante en el archivo suplementario 5. simulamos diez series de tiempo espacial estocástico para todas las combinaciones de células-virus bajo las tres suposiciones inmunes a un tamaño de población de Formulario de notificación transparente Disponibilidad de datos Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en el manuscrito y los archivos de soporte. Todas las imágenes y códigos utilizados en este estudio se han puesto a disposición para su descarga en el siguiente Figshare

¿Qué sería causado por esta hipervigilancia en la mayoría de los otros mamíferos?

Dinámica viral acelerada en las líneas celulares de murciélagos, con implicaciones para la emergencia zoonóticahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7064339/SHA: f2cc0d63ff2c4aaa127c4caae21d8f3a0067e3d5Autores: Brook, Cara E; Boots, Mike; Chandran, Kartik; Dobson, Andrew P; Drosten, Christian; Graham, Andrea L; Grenfell, Bryan T; Müller, Marcel A; Ng, Melinda; Wang, Lin-Fa; van Leeuwen, AniekeFecha: 2020-02-03DOI: 10.7554/elife.48401Licencia: cc-byAbstract: Bats host virulent zoo Se necesita una comprensión mecánica del impacto de las capacidades de alojamiento del virus de los murciélagos, incluyendo vías inmunológicas exclusivamente constitutivas, en la dinámica viral a escala celular para dilucidar la emergencia zoonótica. Realizamos ensayos de infectividad del virus en líneas celulares de murciélagos que expresan fenotipos inmunes inducidos y constitutivos, y luego desarrollamos un modelo teórico de nuestro sistema in vitro, que encajamos con los datos empíricos. Los modelos más adecuados recapitularon los fenotipos inmunes esperados para líneas celulares representativas, apoyando defensas antivirales robustas en células de murciélagos que se correlacionaron con estimaciones más altas para las tasas de propagación viral dentro del huésped. En general, las respuestas inmunológicas aumentadas limitan la morbilidad celular inducida por patógenos, lo que puede facilitar el establecimiento de infecciones persistentes de rápida propagación dentro del huésped. Texto: Los murciélagos han recibido mucha atención en los últimos años por su papel como anfitriones de reservorios de zoonosis virales emergentes, incluyendo la rabia y los lissavirus relacionados, Hendra y Nipah henipavirus, Ebola y Marburg filovirus, y el coronavirus SARS (Calisher et al., 2006; Wang y Anderson, 2019). En la mayoría de los mamíferos no quirópteros, henipavirus, filovirus y coronavirus inducen morbilidad y mortalidad sustancial, muestran corta duración de la infección, y provocan inmunidad robusta y a largo plazo en los huéspedes que sobreviven infección (Nicholls et al., 2003; Hooper et al., 2001; Mahanty y Bray, 2004). Los murciélagos, por el contrario, no demuestran síntomas obvios de enfermedad al infectarse con patógenos altamente virulentos en mamíferos no volátiles (Schountz et al., 2017), pero pueden, en cambio, apoyar virus como infecciones persistentes a largo plazo, en lugar de patologías transitorias e inmunizantes (Plowright et al., 2016). Los avances recientes de las investigaciones están comenzando a arrojar luz sobre los mecanismos moleculares por los cuales los murciélagos evitan la patología de estos patógenos de otro modo virulentos (Brook y Dobson, 2015). Los murciélagos aprovechan un conjunto de mecanismos específicos de la especie para limitar la carga viral, que incluyen las incompatibilidades de la secuencia del receptor del huésped para algunas combinaciones de virus del murciélago (Ng et al., 2015; Takadate et al., 2020) y la expresión constitutiva de la citocina antivir Típicamente, la presencia de ARN viral o ADN en el citoplasma de células de mamíferos inducirá la secreción de proteínas de interferón tipo I (IFN-a e IFN-b), que promueven la expresión y traducción de genes estimulados por interferón (ISGs) en células vecinas y las hacen efectivamente antivirales (Stetson y Medzhitov, 2006). En algunas células de murciélago, los planos transcripcionómicos para esta respuesta de IFN se expresan constitutivamente, incluso en ausencia de estimulación por ARN viral o ADN (Zhou et al., 2016). En los mamíferos no voladores, la expresión constitutiva de IFN probablemente provocaría inflamación generalizada e inmunopatología concomitante sobre la infección viral, pero los murciélagos apoyan adaptaciones únicas para combatir la inflamación (Zhang et al., 2013; Ahn et al., 2019; Xie et al., 2018; Pavlovich et al., 2018) que pueden haber evolucionado para mitigar el daño metabólico inducido durante el vuelo (Kacprzyk et al., 2017). La medida en que la expresión constitutiva de IFN-a significa defensa antiviral constitutiva en forma de proteína funcional IFN-a permanece sin resolver. En las células de murciélago que expresan constitutivamente IFN-a, algunos ISGs estimulados por proteínas, aguas abajo parecen ser también expresados constitutivamente, pero la inducción ISG adicional es posible después de desafío viral y estimulación de IFN-b (Zhou et al., 2016; Xie et al., 2018). A pesar de los recientes avances en la comprensión molecular de la tolerancia viral del murciélago, las consecuencias de esta inmunidad única del murciélago en la dinámica del virus dentro del huésped-y sus implicaciones para la comprensión de la emergencia zoonótica-todavía no han sido aclaradas. El campo de 'dinámica del virus' fue desarrollado por primera vez para describir los fundamentos mecánicos de los patrones a largo plazo de la carga viral en estado estacionario exhibida por los pacientes en infecciones de fase crónica con VIH, que parecían producir y virus claro a tasas equivalentes (Nowak y May, 2000; Ho et al., Los modelos de agotamiento celular objetivo simple, en los que la carga viral es dictada por un digestivo de eLife inferior Los murciélagos pueden transportar virus que son mortales a otros mamíferos sin mostrar síntomas graves. De hecho, los murciélagos son reservorios naturales para virus que tienen algunas de las tasas de mortalidad más altas de cualquier virus que la gente adquiere de animales salvajes -incluyendo la rabia, el ébola y el coronavirus SARS. Los murciélagos tienen un conjunto de defensas antivirales que mantienen la cantidad de virus en control. Por ejemplo, algunos murciélagos tienen una respuesta inmune antiviral llamada vía del interferón perpetuamente encendido. En la mayoría de otros mamíferos, tener una respuesta inmune hipervigilante causaría inflamación dañina. Los murciélagos, sin embargo, han adaptado los rasgos antiinflamatorios que los protegen de tales daños, incluyen la pérdida de ciertos genes que normalmente promueven la inflamación. Sin embargo, nadie ha explorado previamente cómo estas defensas Los experimentos hicieron uso de células de una especie de murciélago - el zorro volador negro - en el que la vía del interferón está siempre encendido, y otro - el murciélago de la fruta egipcia - en el que esta vía sólo se activa durante una infección. Las células del murciélago se infectaron con tres virus diferentes, y luego Brook et al. observaron cómo la vía del interferón ayudó a mantener las infecciones en control, antes de crear un modelo informático de esta respuesta. Los experimentos y el modelo ayudaron a revelar que las defensas de los murciélagos pueden tener una desventaja potencial para otros animales, incluyendo humanos. En ambas especies del murciélago, las respuestas antivirales más fuertes fueron contrarrestadas por el virus que se propaga más rápidamente de la célula a la célula. Esto sugiere que las defensas inmunes del murciélago pueden impulsar la evolución de virus de transmisión más rápida, y mientras que los murciélagos están bien protegidos de los efectos nocivos de sus propios virus prolíficos, otras criaturas como los Los hallazgos pueden ayudar a explicar por qué los murciélagos son a menudo la fuente de virus que son mortales en los seres humanos. Aprender más acerca de las defensas antivirales de los murciélagos y cómo impulsan la evolución del virus puede ayudar a los científicos a desarrollar mejores maneras de predecir, prevenir o limitar la propagación de virus de los murciélagos a los seres humanos. Se necesitan más estudios en los murciélagos para ayudar a estos esfuerzos. Mientras tanto, los experimentos destacan la importancia de advertir a las personas para evitar el contacto directo con murciélagos salvajes. aumentar el suministro de recursos de células de huésped susceptibles de infección, se desarrollaron por primera vez para el VIH (Perelson, 2002), pero desde entonces se han aplicado a otras infecciones crónicas, incluyendo el virus de hepatitis-C (Neumann et al., 1998), virus de hepatitis-B (Nowak et al., 1996) y citomegalovirus (Emery et al., 1999 En trabajos recientes se han adoptado técnicas similares para modelar la dinámica interna de las infecciones agudas, como la gripe A y el sarampión, que inspiran el debate sobre la medida en que el modelado explícito del control inmunológico descendente puede mejorar la inferencia más allá de las hipótesis básicas de limitación de recursos del modelo celular objetivo (Baccam et al., 2006; Pawelek et al., 2012; Saenz et al., 2010; Morris et al., 2018). Para investigar el impacto de procesos inmunes únicos de murciélagos en la cinética viral in vitro, primero realizamos una serie de experimentos de infección viral en líneas celulares de murciélagos que expresan fenotipos de interferón divergentes, y luego desarrollamos un modelo teórico que aclara la dinámica de la propagación viral dentro del huésped. Evaluamos nuestro modelo teórico analíticamente independiente de los datos, luego ajustamos el modelo a los datos recuperados de los ensayos experimentales in vitro con el fin de estimar las tasas de transmisión del virus dentro del huésped y la progresión celular al estado antiviral bajo diversos supuestos de inmunidad ausente, inducida y constitutiva. Finalmente, confirmamos nuestros hallazgos en simulaciones estocásticas espacialmente explícitas de series temporales ajustadas de nuestro modelo medio de campo. Hipotemamos que los procesos inmunes descendentes rebaten la limitación de recursos clásicos en líneas de células de murciélago descritas como antivirales constitutivas en la literatura, ofreciendo una predicción testable para modelos que se ajusten a los datos empíricos. Predecimos además que las respuestas antivirales más robustas estarían asociadas con las tasas de propagación de virus más rápidas dentro del huésped, pero también protegen a las células contra la mortalidad inducida por virus para apoyar las infecciones de larga duración en el cultivo de tejidos. Primero exploramos la influencia del fenotipo inmune innato en la propagación viral dentro del huésped en una serie de experimentos de infección en cultivo celular. Se realizaron ensayos de placa en monocapas de placa de seis pozos de tres líneas de células renales de mamíferos inmortalizadas: [1] células Vero (mono verde africano), que son defectuosas de IFN y, por lo tanto, limitadas en capacidad antiviral (Desmyter et al., 1968) ; [2] células RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus) que demuestran respuestas idiosincráticas inducidas por interferón sobre el desafío viral (Kuzmin et al., 2017; Arnold et al., 2018; Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018) ; y [3] células PaKiT01 (Pteropus alecto) que expresan constitutivamente IFN-a (Zhou et al., 2016; Crameri et al., 2009). Para intensificar las diferencias celulares específicas en la inmunidad constitutiva, realizamos ensayos de infectividad con la estomatitis vesicular rVSV-G, rVSV-EBOV, y rVSV-MARV, previamente descritos (Miller et al., 2012; Wong et al., 2010). Dos de estos virus, rVSV-EBOV y rVSV-MARV, son recombinantes cuya entrada celular está mediada por la glucoproteína de los filovirus de murciélago, Ébola (EBOV) y Marburg (MARV), lo que nos permite modular el grado de defensa estructural, así como inmunológica, antiviral en juego en cada infección. El trabajo anterior en este laboratorio ha demostrado incompatibilidades en el receptor de filovirus NPC1 que hacen a las células PaKiT01 refractarias a la infección con rVSV-MARV (Ng y Chandrab, 2018, resultados inéditos), haciéndolos estructuralmente antivirales, más allá de su expresión constitutiva de IFN-a. Las tres líneas celulares fueron desafiadas con los tres virus en dos multiplicidades de infección (MOI): 0,001 y 0,0001. Entre 18 y 39 ensayos se realizaron en cada combinación celular-virus-MOI, excepto infecciones por rVSV-MARV en las células PaKiT01 en MOI = 0,001, para las cuales sólo se realizaron ocho ensayos (ver Materiales y métodos; Figura 1 -figura suplementos 1-3, archivo suplementario 1). Debido a que los ensayos de placa restringen la transmisión viral de vecinos a vecinos en el espacio celular bidimensional (Howat et al., 2006), pudimos rastrear la propagación de células infectadas por virus que expresan GFP a través de monocapas de tejido a través de microscopía de fluorescencia invertida. Para cada ensayo de infección, monitoreamos y reimaginamos placas hasta 200 horas de observación o hasta la destrucción total de monocapas, procesamos imágenes resultantes, y generamos una serie de tiempo de la proporción de espacio de placa ocupada por células infecciosas a lo largo de la duración de cada ensayo (ver Materiales y métodos). Utilizamos modelos aditivos generalizados para inferir el curso temporal de todos los cultivos celulares replicados y construir el conjunto de datos multi-trial al que finalmente encajamos nuestro modelo de transmisión mecanística para cada combinación específica de línea celular-virus (Figura 1; Figura 1 -figura 1 - Los tres virus de la estomatitis vesicular recombinante (rVSV-G, rVSV-EBOV y rVSV-MARV) infectaron Vero, RoNi/7.1, y cultivos tisulares PaKiT01 en ambos MOIs focales. Después de la invasión, el virus se diseminó rápidamente a través de la mayoría de las monocapas celulares, resultando en una extinción epidémica inducida por el virus. Las epidemias fueron menos graves en los cultivos de células de murciélago, especialmente cuando se infectaron con los filovirus recombinantes, rVSV-EBOV y rVSV-MARV. La destrucción de monocapas se evitó en el caso de infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en las células de PaKiT01: en las primeras, la infección viral persistente se mantuvo a lo largo de Asumimos que este patrón era el resultado de la extinción epidémica mediada por el sistema inmunitario (Figura 1). Los patrones del MOI = 0,001 fueron ampliamente recapitulados en el MOI = 0,0001, aunque con proporciones totales algo reducidas (Figura 1-figura suplemento 5). Un modelo teórico adecuado a los datos in vitro recapitula los fenotipos inmunes esperados para las células de murciélagos A continuación, desarrollamos un modelo dentro del huésped para adaptarse a estos datos para dilucidar los efectos de la inmunidad inducida y constitutiva sobre la dinámica de propagación viral en el tejido huésped (Figura 1 ). El sistema compartimental dentro del huésped imitaba nuestra monocapa de cultivo celular bidimensional, con células que ocupaban cinco estados de infección distintos: susceptibles (S), antivirales (A), expuestos (E), infecciosos (I) y muertos (D). Modelamos las células expuestas como infectadas pero aún no infecciosas, capturando la "fase eclipsa" de la integración viral en una célula huésped que precede a la replicación viral. Las células antivirales eran inmunes a la infección viral, de acuerdo con el "estado antiviral" inducido por la estimulación del interferón de los ISG en los tejidos adyacentes a la infección (Stetson y Medzhitov, 2006). Debido a que nuestro objetivo era traducir los datos disponibles en procesos modelados, no modelamos explícitamente la dinámica del interferón, sino que escalamos la tasa de progresión celular de las células sensibles a los antivirales (r) por la proporción de células expuestas (globalmente) en el sistema. En sistemas que permiten la inmunidad constitutiva, una segunda tasa de adquisición celular del estado antiviral (") adicionalmente escalada con la proporción global de células sensibles en el modelo. En comparación con el virus, las partículas IFN son pequeñas y altamente difusivas, justificando esta suposición de señalización global en la extensión espacial limitada de una placa de seis pozos y manteniendo la coherencia con las aproximaciones de modelado previas de la señalización IFN en el ensayo de placa (Howat et al., 2006). Para representar mejor nuestro sistema de monocapa empírica, expresamos nuestras variables de estado como proporciones (P S, P A, P E, P I, y P D ), bajo supuestos de transmisión dependiente de la frecuencia en una población bien mezclada (Keeling y Rohani, 2008), aunque note que la inclusión de P D (representando la proporción de espacio muerto en el tejido modelado) tuvo el efecto funcional de variar la transmisión con densidad celular infecciosa. Esto resultó en el siguiente sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias:Definimos la 'inmunidad inducida' como completa, modelando todas las células como susceptibles a la invasión viral en equilibrio libre de enfermedad, con defensas inducidas después de la exposición viral a través del término r. Por el contrario, permitimos que el grado de inmunidad constitutiva varíe a través del rango de parámetros de " > 0, definiendo un sistema 'constitutivo' como aquel que contiene cualquier célula antiviral en equilibrio libre de enfermedad. Al ajustar este modelo a los datos de cultivo de tejidos, estimamos independientemente tanto r como "; así como la tasa de transmisión de células a células, b, para cada combinación de células y virus. Dado que la medida en que IFN-a se expresa constitutivamente se traduce constitutivamente en proteína funcional todavía no se conoce para los anfitriones de murciélagos (Zhou et al., 2016), este enfoque permitió que nuestros datos de cultivo de tejidos para impulsar la inferencia de modelado: incluso en las líneas celulares PaKiT01 conocidas por expresar constitutivamente IFN-a, la verdadera extensión constitutiva del sistema (es decir, la cantidad de células antivirales presentes en el equilibrio libre de enfermedad) se permitió variar a través de la estimación de ": Para los fines de ajuste del modelo, fijamos el valor de c, la tasa de retorno de las células antivirales a estado susceptible, en 0. La pequeña escala espacial y el corto curso de tiempo (máximo 200 horas) de nuestros experimentos probablemente prohibieron cualquier retorno de las células antivirales al estado susceptible en nuestro sistema empírico; sin embargo, conservamos el término c en las evaluaciones analíticas de nuestro modelo porque la regresión del estado antiviral al estado susceptible es posible durante largos periodos de tiempo in vitro y a la escala de un organismo completo (Radke et al., 1974; Rasmussen y Farley, 1975; Samuel y Knutson, 1982). Antes de adaptarnos a la serie de tiempo empírico, realizamos análisis de bifurcación de nuestro modelo teórico y generamos hipótesis probables sobre la base de resultados de modelos. De nuestro sistema de modelo interno (Ecuación 1-5), derivamos la siguiente expresión para R 0, el número de reproducción básica de patógenos (Fichero complementario 2):Los patógenos pueden invadir un cultivo de tejido Las tasas rápidas de adquisición antiviral constitutiva (") impulsarán R 0 <1: los cultivos tisulares con inmunidad antiviral altamente constitutiva serán por lo tanto resistentes a la invasión del virus desde el principio. Dado que, por definición, la inmunidad inducida se estimula después de la invasión inicial del virus, la tasa de adquisición antiviral inducida (r) no se incorpora a la ecuación para R 0; mientras que los procesos inmunes inducidos pueden controlar el virus después de la invasión inicial, no pueden evitar que ocurra a partir de. En casos de inmunidad totalmente inducida o ausente (" 1⁄4 0), la ecuación R 0 se reduce así a una forma típica del modelo SEIR clásico:En equilibrio, el modelo de campo teórico, medio demuestra uno de los tres estados de infección: equilibrio endémico, ciclos límite estables, o ninguna infección (Figura 2). Respectivamente, estos estados se aproximan a la infección persistente, la extinción epidémica inducida por virus y los fenotipos de extinción epidémica mediada por el sistema inmunitario previamente observados en experimentos de cultivo de tejidos (Figura 1 ). Teóricamente, el equilibrio endémico se mantiene cuando se generan nuevas infecciones al mismo ritmo que se pierden las infecciones, mientras que los ciclos límite representan un espacio paramétrico bajo el cual las poblaciones infecciosas y susceptibles están bloqueadas en oscilaciones predecibles. Equilibrios endémicos resultantes de la regeneración celular (es decir, nacimientos) se han descrito in vivo para el VIH (Coffin, 1995) e in vitro para los ensayos de placas de herpesvirus (Howat et al., 2006), pero debido a que se aproximan tan estrechamente a cero, los verdaderos ciclos límite probablemente sólo ocurren teóricamente, en lugar de producir extinciones estocásticas en series El análisis de bifurcación de nuestro modelo medio de campo reveló que las regiones de ninguna infección (extinción de patógenos) estaban limitadas a valores de umbral más bajo (punto Branch) para b, por debajo de los cuales el patógeno no pudo invadir. No encontramos ningún umbral superior a invasión para b bajo ninguna circunstancia (es decir, b lo suficientemente alto como para impulsar la extinción inducida por patógenos), pero los valores altos de b resultaron en bifurcaciones Hopf, que delinean regiones de espacio paramétrico caracterizadas por ciclos límite. Puesto que los ciclos límite se aproximan tan estrechamente a cero, los bs altos recuperados en este rango probablemente producirían extinciones epidémicas inducidas por virus en condiciones experimentales. Consistente con nuestra derivación para R 0, encontramos que el umbral de punto de Rama para invasión viral fue independiente de cambios en el parámetro inmune inducido (r) pero saturado en valores altos de " que caracterizan la inmunidad altamente constitutiva (Figura 3). A continuación, encajamos nuestro modelo teórico por mínimos cuadrados a cada combinación de línea celular-virus, bajo ausente, inducido, y constitutivo suposiciones de inmunidad. En general, los modelos mejor adaptados recapitularon resultados esperados basados en el fenotipo inmune de la línea celular en cuestión, como se describe en la literatura general (Tabla 1 Irónicamente, el modelo inmune inducido ofreció un ajuste ligeramente mejor que el constitutivo a las infecciones por rVSV-MARV en la línea celular PaKiT01 (la combinación de línea celular-virus para la que conocemos una incompatibilidad constitutiva antiviral de receptor de células para estar en juego). Debido a que los supuestos constitutivos inmunes pueden prohibir la invasión de patógenos (R 0 < 1), el modelo se ajusta a esta serie temporal bajo supuestos constitutivos se vieron impedidos por sobreestimación de ", que prohibió la invasión de patógenos. Sólo mediante la incorporación de una tasa extremadamente rápida de adquisición antiviral inducida podría el modelo garantizar que la infección inicial se permitiría y luego se controlaría rápidamente. En todas las parcelas del panel (A) la tasa de adquisición inmune antiviral inducida (r) se fijó en 0.01. El panel (B) representa la dinámica bajo inmunidad invariablemente inducida, que va desde ausente (izquierda: r=0) hasta alta (derecha: r=1). En todas las parcelas del panel (B) la tasa de adquisición antiviral constitutiva (") se fijó en 0.0001 Las curvas de puntos de rama se representan como líneas sólidas y curvas Hopf como líneas rayadas. El espacio blanco indica equilibrio endémico (persistencia), el espacio gris indica ciclos límite y el espacio negro no indica infección (extinción).Otros valores de parámetro para el análisis de equilibrio se fijaron en: b = 025, m = 0,001, s = 1/6, c = 0. Los puntos especiales de los análisis de bifurcaciones se enumeran en el archivo complementario 3. Al ajustar nuestro modelo teórico a los datos in vitro, estimamos la tasa de transmisión del virus dentro del huésped (b) y la tasa(s) de adquisición celular al estado antiviral (r o r + ") (cuadro 1 ; archivo suplementario 4). Bajo supuestos inmunes ausentes, r y " se fijaron en 0 mientras que b se estimó; bajo supuestos inmunológicos inducidos " se fijó en 0 mientras que r y b se estimaron; y bajo hipótesis inmunológicas constitutivas, los tres parámetros Las estimaciones de parámetros de mejor ajuste para los datos de MOI=0,001 se visualizan en conjunción con br y b -" bifurcaciones en (r) y (B) la tasa de inmunidad constitutiva de adquisición antiviral ("). Los paneles muestran variación en el grado de inmunidad, de ausente (izquierda) a alto (derecha). Las curvas de punto de rama se representan como líneas sólidas y las curvas de Hopf como líneas discontinuas. El espacio blanco indica equilibrio endémico (persistencia), el espacio gris indica ciclo límite y el espacio negro no indica infección (extinción). Otros valores de parámetros para el análisis de equilibrio se fijaron en: b = 025, m = 0,001, s = 1/6, a = 1/6, c = 0. Los puntos especiales de los análisis de bifurcaciones se enumeran en el archivo suplementario 3. A diferencia de las células Vero, el modelo de inmunidad inducida ofrecía el mejor ajuste a todos los datos de RoNi/7.1, consistentes con los patrones reportados en la literatura y nuestra propia validación por qPCR (Tabla 1; Arnold et al., 2018; Kuzmin et al., 2017; Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018). Al igual que en los ensayos con células Vero, estimamos los valores b más altos para las infecciones por rVSV-G en las líneas celulares de RoNi/7.1 pero aquí recuperamos estimaciones b más altas para rVSV-MARV que para rVSV-EBOV. Esta inversión se equilibró con una tasa estimada más alta de adquisición a estado antiviral (r) para rVSV-EBOV frente a rVSV-MARV. En general, observamos que las tasas más rápidas de adquisición antiviral (ya sea inducida, r, constitutiva, ", o ambas) se correlacionaban con mayores tasas de transmisión (b). Al compensarse por r, los valores estimados para las infecciones por RoNi/7.1 mantuvieron la misma amplitud que los estimados para las líneas celulares de Vero inmune-ausente pero causaron epidemias más suaves y reducción de la mortalidad celular (Figura 1). Las estimaciones de parámetros de RoNi/7.1 localizadas en la región correspondientes al equilibrio endémico para el modelo determinista teórico (Figura 4), produciendo epidemias menos agudas que sin embargo se extinguieron en experimentos estocásticos. Finalmente, los ensayos de rVSV-G y rVSV-EBOV en células PaKiT01 se ajustaron mejor por modelos que asumen inmunidad constitutiva, mientras que las infecciones por rVSV-MARV en PaKiT01 se emparejaron equivalentemente con modelos que asumen inmunidad inducida o constitutiva-con modelos inducidos favorecidos sobre constitutivos en comparaciones AIC porque se estimó un parámetro menos (figura 1-figura suplementos 4-5; archivo suplementario 4). Para todas las infecciones por virus, las líneas celulares de PaKiT01 produjeron b estima un orden completo de magnitud superior a Vero o RoNi/7.1 células, con cada b equilibrado por una respuesta inmune (ya sea r, o r combinado con ") también un orden de magnitud superior al recuperado para las otras líneas celulares (figura 4 ; tabla 1 ). Al igual que en células RoNi/7.1, el parámetro PaKi Debido a que los procesos inmunes constitutivos pueden realmente prohibir la invasión inicial de patógenos, la inmunidad constitutiva se ajusta a las infecciones por rVSV-MARV en líneas celulares PaKiT01 constantemente localizadas en o por debajo del umbral del punto de Rama para la invasión del virus (R 0 1⁄4 1). Durante el ajuste del modelo para la optimización de ", cualquier prueba de parámetros de " valores que producen R 0 < 1 no dio lugar a ninguna infección y, en consecuencia, produjo un ajuste extremadamente deficiente a los datos de las series temporales infecciosas. En todos los modelos, asumiendo inmunidad constitutiva, en todas las líneas celulares, las contribuciones antivirales de " virus prohibidos de invadir en absoluto. Con el fin de comparar las contribuciones relativas de los diferentes procesos inmunes de cada línea celular a la dinámica epidémica, a continuación utilizamos nuestras estimaciones de parámetros de campo promedio para calcular la 'tasa antiviral' inicial de acumulación de células antivirales tras la invasión del virus para cada combinación de células-virus-MOI basado en la siguiente ecuación:donde P E se calculó a partir de la dosis infecciosa inicial (MOI) de cada experimento de infección y P S se estimó en equilibrio libre de enfermedad:Porque y "ambos contribuyen a esta tasa antiviral inicial, las hipótesis inmunológicas inducidas y constitutivas son capaces de producir tasas igualmente rápidas, dependiendo de los ajustes de parámetros. De hecho, bajo supuestos inmunes totalmente inducidos, la tasa de adquisición antiviral inducida (r) estimada para la infección por rVSV-MARV en las células PaKiT01 fue tan alta que la tasa antiviral En realidad, sabemos que las incompatibilidades con los receptores NPC1 hacen que las líneas celulares PaKiT01 constitutivamente sean refractarias a la infección por rVSV-MARV (Ng y Chandrab, 2018, resultados inéditos) y que las células PaKiT01 también expresan constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a. Los resultados de ajuste del modelo sugieren que esta expresión constitutiva de IFN-a puede actuar más como una respuesta inmune rápidamente inducible tras la invasión del virus que como una secreción constitutiva de la proteína funcional IFN-a. Sin embargo, como hipotetizado, las líneas celulares PaKiT01 fueron con mucho la más antiviral de cualquiera en nuestro estudio-con tasas antivirales iniciales estimadas en varios órdenes de magnitud superiores a cualquier otro en nuestro estudio, bajo supuestos inducidos o constitutivos (Tabla 1 ; Ficha complementaria 4). Las células RoNi/7.1 mostraron la segunda firma de inmunidad más pronunciada, seguida de las células Vero, para las cuales la tasa antiviral inicial fue esencialmente cero incluso bajo supuestos forzados de inmunidad inducida o constitutiva (Tabla 1 ; Archivo suplementario 4). Utilizando parámetros ajustados para b y ", calculamos adicionalmente R 0, el número de reproducción básico para el virus, para cada combinación de línea celular-virus-MOI (Tabla 1 ; Archivo suplementario 4). Encontramos que R 0 fue esencialmente sin cambios en diferentes supuestos inmunes para las células RoNi/7.1 y Vero, para las cuales la tasa antiviral inicial fue baja. En el caso de las células PaKiT01, una alta tasa inicial de antiviral bajo inmunidad inducida o constitutiva resultó en una estimación correspondientemente alta de b (y, por consiguiente, R 0 ) que aún produjo la misma curva epidémica que resultó de las estimaciones mucho más bajas para b y R 0 emparejadas con inmunidad ausente. Estos hallazgos sugieren que las respuestas inmunes antivirales protegen los tejidos huésped contra la mortalidad celular inducida por virus y pueden facilitar el establecimiento de tasas de transmisión más rápidas dentro del huésped. La destrucción total de monocapas se produjo en todas las combinaciones de virus celulares excepto infecciones por rVSV-EBOV en células RoNi/7.1 e infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en células PaKiT01. La destrucción de monocapas correspondió al agotamiento celular sensible y al recambio epidémico donde R efectivo (el producto de R 0 y Para las infecciones por rVSV-EBOV en las células antivirales inducidas RoNi/7.1, las células vivas remanentes salvaguardadas, que dieron a luz nuevas células sensibles tardíamente en la serie temporal. En las infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en las células PaKiT01, esta protección antiviral detuvo la epidemia (Figura 5 ; R-efectiva <1) antes de que los susceptibles declinaran completamente. En el caso de las infecciones por rVSV-EBOV en las células PaKiT01, el nacimiento de nuevos susceptibles a partir de células vivas remanentes protegidas por el estado antiviral mantuvo la transmisión tardía para facilitar la persistencia de la epidemia a largo plazo. Es importante destacar que bajo los valores de parámetros fijos para la tasa de incubación de la infección (s) y la tasa de mortalidad inducida por la infección (a), los modelos no pudieron reproducir las series de tiempo infeccioso a más largo plazo captadas en los datos de infecciones por rVSV-EBOV en las líneas celulares de PaKiT01 sin incorporación de nacimientos celulares, suposición adoptada en representaciones de modelos anteriores de la dinámica viral mediada por IFN en el cultivo de tejidos (Howat et al., 2006). En nuestros experimentos, observamos que la reproducción celular se llevó a cabo como ensayos de placa alcanzó confluencia. Finalmente, debido a que el efecto protector de las células antivirales es más claramente observable espacialmente, confirmamos nuestros resultados simulando series de tiempo ajustadas en una reconstrucción estocástica espacialmente explícita de nuestro modelo de campo medio. En las simulaciones espaciales, las tasas de adquisición antiviral se fijaron en valores ajustados para r y " derivados de las estimaciones medias de campo, mientras que las tasas de transmisión (b) se fijaron en valores diez veces superiores a los estimados en condiciones medias de campo, teniendo en cuenta la intensificación de los umbrales de parámetros que permitían la invasión de patógenos en las interacciones espaciales locales (véanse Materiales y métodos; Videos 1-3; Suplemento 3 de la figura 5; Fichero complementario 5; Webb y otros, 2007). En series temporales inmunitarias, las células antivirales espaciales actuaron como "refugios" que protegían a las células vivas de la infección como cada onda epidémica inicial "lavada" a través de una monocapa celular. Los murciélagos son reservorios para varias zoonosis emergentes importantes, pero parecen no experimentar la enfermedad de patógenos virales de otro modo virulentos. Aunque la literatura biológica molecular ha hecho grandes progresos en el esclarecimiento de los mecanismos por los cuales los murciélagos toleran infecciones virales (Zhou et al., 2016; Ahn et al., 2019; Xie et al., 2018; Pavlovich et al., 2018; Zhang et al., 2013), el impacto de la inmunidad única de los murciélagos en la dinámica del virus dentro del huésped no ha sido bien aclarada. Utilizamos una combinación innovadora de experimentación in vitro y modelado dentro del huésped para explorar el impacto de la inmunidad única de los murciélagos en la dinámica del virus. Críticamente, descubrimos que las líneas de células de murciélago demostraron una firma de respuesta inmune mejorada mediada por interferón, de forma constitutiva o inducida, que permitió establecer tasas rápidas de transmisión del Estos resultados fueron apoyados por el análisis bifurcado independiente de los datos de nuestro modelo teórico de campo medio, así como por el ajuste de este modelo a las series de tiempo de infección viral establecidas en el cultivo de células de murciélagos. Además, demostramos que el estado antiviral inducido por la vía del interferón protege a las células vivas de la mortalidad en el cultivo de tejidos, resultando en epidemias in vitro de larga duración que aumentan la probabilidad de establecer una infección persistente a largo plazo. Nuestros hallazgos sugieren que los virus evolucionados en depósitos de murciélagos que poseen capacidades mejoradas de IFN podrían lograr tasas de transmisión más rápidas dentro del huésped sin causar patología a sus huéspedes. Estos virus de rápida reproducción probablemente generarían una virulencia extrema sobre el derrame a los huéspedes que carecen de capacidades inmunes similares a los murciélagos. Para lograr estos resultados, primero desarrollamos un modelo teórico novedoso, dentro del huésped, elucidando los efectos de la inmunidad Consideramos que una línea celular es constitutivamente inmune si posee cualquier número de células antivirales en equilibrio libre de enfermedad pero permite que la extensión de inmunidad constitutiva varíe a través del rango de parámetros para ", la tasa constitutiva de adquisición antiviral. Al derivar la ecuación para R 0, el número básico de reproducción, que define las condiciones umbral para la invasión viral de un tejido (R 0 > 1), demostramos cómo el umbral de invasión se eleva a valores altos de adquisición antiviral constitutiva, ". Los procesos inmunes constitutivos pueden así prohibir la invasión de patógenos, mientras que las respuestas inducidas, por definición, sólo pueden controlar las infecciones post-hoc. Una vez que se han alcanzado los umbrales de invasión patogénica, las suposiciones de inmunidad constitutiva limitarán la mortalidad celular (virulencia) incurrida a altas tasas de transmisión. Independientemente del mecanismo (inducido o constitutivo), las células antivirales estimuladas por interferón parecen desempeñar un papel clave en el mantenimiento de infecciones persistentes o a largo plazo al proteger a las células sensibles de la infección rápida y la muerte celular concomitante. El ajuste de nuestro modelo a los datos in vitro apoyó los fenotipos inmunes esperados para diferentes líneas celulares de murciélagos, como se describe en la literatura. Modelos simples de células diana que ignoran los efectos de la inmunidad mejor serie temporal infecciosa recapitulada derivada de células Vero deficientes de IFN, mientras que los modelos que asumen procesos inmunes inducidos reprodujeron con mayor precisión ensayos derivados de células RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus), que poseen una respuesta IFN inducida por virus estándar. En la mayoría de los casos, los modelos que asumen procesos inmunes constitutivos mejor recrean epidemias de virus producidas en las células de PaKiT01 (Pteropus alecto), que se sabe que expresan constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a (Zhou et al., 2016). El apoyo del modelo para suposiciones inmunológicas inducidas en ajustes a infecciones por rVSV-MARV en las células de PaKiT01 sugiere que la expresión constitutiva IFN-a característica de las células de P. alecto puede representar más un proceso de primogenitura inmune constitutivo que una defensa perpetua, funcional y antiviral. Los resultados del ajuste del modelo de campo medio fueron confirmados adicionalmente en simulaciones estocásticas espacialmente explícitas de cada serie temporal. Como se ha demostrado anteriormente en los modelos internos para el VIH (Coffin, 1995; Perelson et al., 1996; Nowak et al., 1995; Bonhoeffer et al., 1997; Ho et al., 1995), los supuestos de agotamiento simple de las células diana a menudo pueden proporcionar aproximaciones satisfactorias de la dinámica viral, especialmente las reproducidas en sistemas in vitro simples. Críticamente, nuestro ajuste del modelo enfatiza la necesidad de incorporar los efectos descendentes del control inmunológico para reproducir con precisión las series de tiempo infecciosas derivadas de cultivos de células de murciélago, especialmente las resultantes de la línea celular PaKiT01 P. alecto robustamente antiviral. Estos hallazgos indican que las vías inmunes mejoradas mediadas por la IFN en los reservorios de murciélagos pueden promover tasas elevadas de replicación del virus dentro del huésped antes de la aparición de especies cruzadas. No El trabajo futuro debe extender estos estudios de cultivo celular para incluir mediciones de múltiples variables de estado (es decir, células antivirales) para mejorar la inferencia epidemiológica.La continua recurrencia de epidemias de Ébola en toda África central destaca la importancia de entender el papel de los murciélagos como reservorios para la enfermedad zoonótica virulenta. La última década ha nacido testigo de un consenso emergente con respecto a las vías únicas por las cuales los murciélagos resisten y toleran infecciones altamente virulentas (Brook y Dobson, 2015; Xie et al., 2018; Zhang et al., 2013; Ahn et al., 2019; Zhou et al., 2016; Ng et al., 2015; Pavlovich et al., 2018). Sin embargo, sigue siendo difícil comprender los mecanismos por los cuales los murciélagos apoyan patógenos endémicos a nivel poblacional, o promueven la evolución de El mantenimiento endémico de la infección es una característica definitoria de un reservorio de patógenos (Haydon et al., 2002), y los murciélagos parecen merecer tal título, apoyando la persistencia a largo plazo de infecciones virales altamente transmisibles en poblaciones insulares aisladas muy por debajo de los tamaños críticos esperados de la comunidad (Peel et al., 2012). Los investigadores debaten la influencia relativa de los mecanismos a nivel de la población y dentro del huésped que podrían explicar estas tendencias (Plowright et al., 2016), pero cada vez más, los datos de campo son difíciles de conciliar sin reconocer un papel para las infecciones persistentes (Peel et al., 2018; Brook et al., 2019). Presentamos métodos generales para estudiar la dinámica viral a escala cruzada, que sugieren que la persistencia dentro del huésped está respaldada por respuestas antivirales robustas características de los procesos inmunes al murciélago. Los virus que evolucionan rápidamente las tasas de replicación bajo estas robustas defensas antivirales pueden representar el mayor riesgo para la aparición de patógenos de especies cruzadas en huéspedes de derrames con sistemas inmunes que difieren de los únicos a los murciélagos. Todos los experimentos se llevaron a cabo en tres líneas de células renales de mamíferos inmortalizados: Vero (mono verde africano), RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus) (Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011) y PaKiT01 (Pteropus alecto) (Crameri et al., 2009). Las identificaciones de especies de todas las líneas de células de murciélago se confirmaron morfológica y genéticamente en las publicaciones en las que fueron descritos originalmente (Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011; Crameri et al., 2009) Las monocapas de cada línea celular fueron cultivadas hasta 90% de confluencia (~9Â10 5 células) en placas de 6 pocillos. Las células fueron mantenidas en una incubadora humidificada de 37oC, 5% CO 2 y cultivadas en el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies, Grand Island, NY), complementadas con suero bovino fetal 2% (Gemini Bio Products, West Sacramento, CA), y 1% penicilina-estreptomicina (Life Technologies).Las células fueron analizadas mensualmente para detectar la contaminación por micoplasma mientras se realizaban experimentos; todas las células determinaron negativo para la contaminación en cada prueba. El trabajo anterior ha demostrado que todas las líneas celulares utilizadas son capaces de montar una respuesta IFN de tipo I en caso de desafío viral, con la excepción de las células Vero, que poseen una deficiencia IFN-b (Desmyter et al., 1968; Rhim et al., 1969; Emeny y Morgan, 1979). Las células RoNi/7.1 han demostrado montar defensas IFN inducidas idiosincráticas ante infección viral (Pavlovich et al., 2018; Kuzmin et al., 2017; Arnold et al., 2018; Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011), mientras que las células PaKiT01 son conocidas por expresar constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a (Zhou et al., 2016). Este trabajo es la primera documentación de la señalización de IFN inducida en caso de desafío con los VSV recombinantes particulares descritos a continuación. Verificamos fenotipos inmunes antivirales conocidos a través de qPCR. Los resultados fueron consistentes con la literatura, indicando un papel menos pronunciado para la defensa del interferón contra la infección viral en las células RoNi/7.1 versus PaKiT01. Se han descrito previamente los virus de la estomatitis vesicular recombinante con capacidad de replicación (Wong et al., 2010; Miller et al., 2012). Los virus fueron seleccionados para representar una amplia gama de respuestas antivirales anticipadas de las células huésped, basadas en una gama de historias evolutivas pasadas entre la entrada de células glucoproteínas del virus y el receptor de entrada de la célula huésped. Estas interacciones variaron desde la ausencia total de historia evolutiva en el caso de infecciones por rVSV-G en todas las líneas celulares hasta una incompatibilidad de entrada celular a nivel de receptor conocido en el caso de infecciones por rVSV-MARV en las líneas celulares PaKiT01. Para medir las infecciones de rVSV en cada una de las líneas celulares descritas anteriormente, para calcular la dosis viral correcta para cada MOI, se añadió NH 4 Cl (20 mM) a cultivos celulares infectados a 1-2 horas de postinfección para bloquear la propagación viral, y las células eGFP positivas individuales se contabilizaron manualmente a las 12-14 horas de postinfección. Los trabajos publicados anteriormente indican que las líneas de células renales inmortalizadas de Rousettus aegyptiacus (RoNi/7.1) y Pteropus alecto (PaKiT01) exhiben diferentes fenotipos inmunes antivirales innatos a través de, respectivamente, inducidos (Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018; Kühl et al., 2011; Arnold et al., 2018) y expresión constitutiva (Zhou et al., 2016) de los genes de interferón tipo I. Verificamos estos fenotipos publicados en nuestras propias líneas celulares infectadas con rVSV-G, rVSV-EBOV, y rVSV-MARV vía qPCR de genes IFN-a e IFN-b a través de una serie longitudinal de infecciones. Específicamente, realizamos múltiples series temporales de infección de cada línea celular con cada uno de los virus descritos anteriormente, bajo condiciones de infección simuladas y en MOIs de 0,0001 y 0,001-con excepción de rVSV-MARV en líneas celulares PaKiT01, para lo cual la infección sólo se realizó en MOI = 0,0001 debido a las limitadas existencias virales y a la extremadamente baja infectividad de este virus en esta línea celular (requeriendo así altas cargas virales para la infección inicial).Todos los experimentos se ejecutaron en duplicado en placas 6well, de tal manera que una placa típica para cualquiera de los tres virus tenía dos pozos de control (mock), dos MOI = 0,0001 pozos y dos MOI = 0,001 pozos, excepto las placas PaKiT01, que tenían dos controles y cuatro MOI = 0,0001 pozos en un momento dado. Justificamos esta exención de PaKiT01 a través de la expectativa de que IFN-una expresión es constitutiva para estas células, y por la suposición de que cualquier expresión exhibida en el MOI inferior también debería estar presente en el MOI superior. Para estas series de tiempo de expresión génica, cuatro placas de 6 pocillos para cada combinación de línea celular-virus fueron incubadas con virus durante una hora a 37oC. Después de la incubación, el virus fue aspirado, y los monocapas celulares fueron lavados en PBS, luego cubiertos con un ensayo de placa de agar superpuesto para imitar las condiciones bajo las cuales se realizaron los ensayos de infección. Las placas se recolectaron secuencialmente en los puntos de tiempo de aproximadamente 5, 10, 15 y 20 horas después de la infección (el tiempo exacto variaba como múltiples ensayos se ejecutaban simultáneamente). Después de la cosecha de cada placa, se eliminó la capa de agar y se lisó el virus y se extrajo ARN de las células utilizando el kit Zymo Quick ARN Mini Prep, de acuerdo con las instrucciones del fabricante e incluyendo el paso para la digestión del ADN celular. Después de la extracción, la calidad del ARN se verificó a través de nanodrop, y el ARN se convirtió a cDNA utilizando el kit de síntesis de cDNA de Superscript III Invitrogen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. cDNA se almacenó a 4oC y como un stock congelado a À20oC para esperar qPCR. Nos encargamos de qPCR de cDNA para evaluar la expresión de los genes de interferón tipo I, IFN-a e IFNb, y el gen de mantenimiento de la casa, b-Actin, utilizando imprimaciones Para qPCR, se incubaron 2 ml de cada muestra de cDNA con 7 ml de agua desionizada, 1 ml de 5 UM de mezcla de imprimación hacia adelante/reversa y 10 ml de iTaq Universal SYBR Green, luego se cicló en una máquina de PCR QuantStudio3 en tiempo real bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 C durante 2 minutos seguido de 40 ciclos de: desnaturalización a 95 C (5 s), recocido a 58 C (15 s), y extensión a 72 C (10 s). Presentamos valores d-Ct simples para cada ejecución, con Ct en bruto del gen de interés objetivo (IFN-a o IFN-b) sustraído del Ct en bruto del gen de limpieza b-Actin en la Figura 1 -figura suplemento 6. El cálculo del cambio de pliegue sobre la infección viral en comparación con el simulacro usando el método d-d-Ct (Livak y Schmittgen, 2001) fue inapropiado en este caso, ya que deseábamos demostrar la expresión constitutiva de IFN-a en células PaKiT01, por lo que los datos de células simuladas eran idénticos a los producidos a partir de células infectadas. Después de crecer a ~ 90% de confluencia, las células fueron incubadas con rVSV en pellets expresando eGFP (rVSV-G, rVSV-EBOV, rVSV-MARV). Las líneas celulares fueron desafiadas con una baja (0,0001) y alta (0.001) multiplicidad de infección (MOI) para cada virus. En una monocapa celular infectada en un determinado MOI (m), la proporción de células (P), infectadas por k partículas virales puede ser descrita por la distribución de Poisson: P k ð 1⁄4 e Àm m k!, de tal manera que el número de células inicialmente infectadas en un experimento es igual a: 1 À e Àm. Asumimos que un cultivo confluente ~90 % en el origen de cada ensayo estaba compuesto por ~9x10 5 células y conducía todos los experimentos en MOIs de 0,0001 y 0,001, lo que significa que comenzamos cada ensayo introduciendo virus a, respectivamente, ~81 u 810 células, que representan la variable de estado 'E' en nuestro modelo teórico. Los MOIs bajos fueron seleccionados para aproximar mejor la dinámica de infección de campo media y limitar artefactos de estructuración espacial, tales como extinción epidémica prematura cuando las placas en crecimiento Se prepararon placas de seis pocillos con cada infección por duplicado o triplicado, de manera que un pozo de control (sin virus) y 2-3 pozos cada uno en el MOI 0,001 y 0,0001 fueron incubados simultáneamente en la misma placa. En total, se realizaron entre 18 y 39 ensayos en cada combinación de células-virus-MOI, excepto infecciones por r-VSV-MARV en células PaKiT01 en el MOI = 0,001, para lo cual se realizaron sólo ocho ensayos debido a la baja infectividad de este virus en esta línea celular, lo que requirió altas cargas virales para la infección inicial. Las células fueron incubadas con virus por una hora a 37oC. Después de la incubación, el virus fue aspirado, y las monocapas celulares fueron lavadas en PBS, luego cubiertas con una capa viscosa fundida (50% 2X MEM/Lglutamina; 5% FBS; 3% HEPES; 42% agarosa), enfriadas durante 20 min, y re-incubadas en su ambiente original humidificado 37°C, 5% CO 2. Después de la aplicación de la superposición, las placas fueron monitoreadas periódicamente utilizando un microscopio de fluorescencia invertido hasta que se presenciaron los primeros signos de expresión de GFP (~6-9.5 hr post-infección, dependiendo de la línea celular y el virus bajo investigación). A partir de ese momento, un subconjunto cuadrado del centro de cada pozo (compuesto por 64 o 36 sub-marcos y que correspondía aproximadamente al 60% y 40% del espacio de pozo entero) fue fotografiado periódicamente, utilizando una plataforma CellInsight CX5 High Content Screening (HCS) con un objetivo aéreo 4X (ThermoFisher, Inc, Waltham, MA). Los ajustes de microscopios se mantuvieron estándar en todos los ensayos, con tiempo de exposición fijado en 0,0006 s para cada imagen. Se implicó un canal de color, de tal manera que las imágenes producidas muestran células que expresan GFP en células blancas y no GFP en negro (figura 1-figura suplemento 1). Los pozos fueron fotografiados en rotación, con la mayor frecuencia posible, desde el inicio de la expresión GFP hasta el momento en que la mayoría de las células del pozo fueron consideradas muertas, la expresión GFP ya no pudo ser detectada, o la terminación temprana fue deseada para permitir la tinción de Hoechst. En el caso de las células PaKiT01 infectadas con rVSV-EBOV, donde se estableció una infección aparentemente persistente, el ensayo fue terminado después de 200+ horas (8+ días) de observación continua. Al finalizar todos los ensayos, las células fueron fijas en formaldehído (4% durante 15 min), incubadas con mancha Hoechst (0,0005% durante 15 min) (ThermoFisher, Inc, Waltham, MA), luego imágenes en 4X en la plataforma CellInsight CX5 High Content Screening (HCS). Un canal de color fue permitido de tal manera que las imágenes producidas mostraron núcleos vivos en células blancas y muertas en negro. Colores de la mancha Hoechst ADN celular, y la infección viral se cree que interfiere con la claridad de la mancha (Dembowski y DeLuca, 2015). Como tal, la terminación de la infección, la fijación celular y la tinción Hoechst permite la generación de una serie de tiempo áspero de células vivas no infecciosas (es decir, susceptibles + células antivirales) para complementar las imágenes que produjeron series temporales de proporciones infecciosas. Debido a la incertidumbre sobre el estado epidémico exacto de las células manchadas de Hoechst (es decir, las células expuestas pero aún no infecciosas pueden todavía mancharse), elegimos adaptar nuestros modelos sólo a las series infecciosas de tiempo derivadas de imágenes que expresan GFP y utilizaron las imágenes de mancha Hoechst como un control visual Las imágenes recuperadas de la serie temporal anterior fueron procesadas en forma binaria ('infecciosa' vs. 'no infecciosa' o, para las imágenes manchadas de Hoechst, 'live' vs.'muerta') utilizando el paquete EBImage (Pau et al., 2010) en la versión R 3.6 para MacIntosh, después de métodos más detallados en el archivo suplementario 7. Las imágenes binarias fueron procesadas posteriormente en series temporales de imágenes infecciosas o, para las imágenes manchadas de Hoechst, células vivas utilizando una serie de scripts de recuento de células. Debido a limitaciones logísticas (es decir, muchas placas de ensayos simultáneos de infección en ejecución y sólo un microscopio de imágenes disponible), el curso temporal de la imagen a lo largo de la duración de cada ensayo fue muy variable. Como tal, ajustamos una serie de modelos estadísticos a nuestros datos de imagen procesados para reconstruir valores confiables de la proporción infecciosa de cada pozo por hora para cada ensayo distinto en todas las combinaciones de línea celular-virus-MOI (Figura 1 Para derivar la expresión de R 0, el número básico de patógenos reproductivos in vitro, utilizamos técnicas de Next Generation Matrix (NGM) (Diekmann et al., 1990; Heffernan et al., 2005), empleando Wolfram Mathematica (versión 11.2) como herramienta analítica. R 0 describe el número de nuevas infecciones generadas por una infección existente en una población huésped completamente susceptible; un patógeno invadirá una población cuando R 0 > 1 (archivo suplementario 2). Luego analizamos las propiedades de estabilidad del sistema, explorando la dinámica a través de un rango de espacios de parámetros, utilizando MatCont (versión 2.2) (Dhooge et al. La tasa de natalidad, b, y la tasa de mortalidad natural, m, equilibrio para producir una tasa de crecimiento a nivel de población, de tal manera que es imposible estimar tanto b como m simultáneamente a partir de los datos del tamaño total de la población. Como tal, fijamos b en 025 y estimamos m mediante el ajuste de una versión ausente de infección de nuestro modelo de campo medio a las series de tiempo susceptibles derivadas de la tinción de pozos de control de Hoechst para cada una de las tres líneas celulares (figura 1-figura suplemento 7). Esto produjo una tasa de mortalidad natural, m, correspondiente a una vida útil de aproximadamente 121, 191 y 84 horas, respectivamente, para Vero, RoNi/7.1, y PaKiT01 líneas celulares (figura 1-figura suplemento 7). A continuación, fijamos la tasa de incubación del virus, s, como la inversa de la duración más corta observada del tiempo desde la infección inicial hasta la observación de las primeras células infecciosas a través del microscopio fluorescente para todas las combinaciones de nueve líneas celulares -virus (con un rango de 6 a 9,5 horas). Fijamos a, la tasa de mortalidad inducida por infección, en 1/6, un estándar aceptado para la cinética viral general (Howat et al., 2006), y mantuvimos c, la tasa de regresión celular antiviral a estado susceptible, en 0 para el intervalo de tiempo (< 200 horas) de los ensayos de infección celular experimental. Estimamos valores específicos de línea celular-virus-MOI para b, r, y " mediante el ajuste de la producción determinista de proporciones infecciosas en nuestro modelo de campo medio a la serie completa de resultados estadísticos de todos los ensayos para cada serie de tiempo de cultivo celular El ajuste se realizó minimizando la suma de las diferencias cuadradas entre la salida del modelo determinista y la proporción infecciosa específica de la línea celularvirus-MOI de los datos en cada paso del tiempo. Optimizamos los parámetros para el MOI = 0,001 y 0,0001 simultáneamente para aprovechar la potencia estadística a través de los dos conjuntos de datos, estimando una tasa de transmisión diferente, b, para ensayos que se ejecutan a cada dosis infecciosa pero, cuando proceda, estimando las mismas tasas de r y " a través de las dos series temporales. Utilizamos el solucionador de ecuaciones diferenciales lsoda() en el paquete R deSolve (Soetaert et al., 2010) para obtener soluciones numéricas para el modelo de campo medio y se llevó a cabo la minimización utilizando el algoritmo 'Nelder-Mead' de la función optim() en la base R. Todos los ajustes del modelo se En el caso de ataques fallidos o hessianos indefinidos, generamos una serie de conjeturas aleatorias alrededor de las condiciones de inicio y continuamos la estimación hasta que se lograron los ajustes exitosos. Todas las combinaciones de datos de dieciocho líneas celulares-virus-MOI fueron ajustadas por una versión inmune ausente (" = r = 0) del modelo teórico y, posteriormente, una inmunidad inducida (" = 0; r > 0) e inmunidad constitutiva (" > 0; r > 0) del modelo. Finalmente, comparamos los ajustes a través de cada combinación celular-virus-MOI vía AIC. Al calcular AIC, el número de parámetros ajustados en cada modelo (k) variaba entre los fenotipos inmunes, con un parámetro (b) estimado para supuestos inmunes ausentes, dos (b y r) para supuestos inmunológicos inducidos, y tres (b, r El tamaño de la muestra (n) correspondió al número de pasos de tiempo discretos en todos los ensayos infecciosos empíricos a los que se ajustó el modelo para cada combinación de virus de línea celular. Todos los scripts de ajuste y comparación de modelos están disponibles libremente para su descarga en el siguiente repositorio FigShare: DOI: 10.6084/m9.figshare.8312807. Finalmente, verificamos que todos los campos promedio encajan en un contexto espacial, con el fin de dilucidar más a fondo el papel de las células antivirales en cada serie temporal. Construimos nuestro modelo espacial en C++ implementado en R utilizando los paquetes Rcpp y RcppArmadillo (Eddelbuettel y Francois, 2011; Eddelbuettel y Sanderson, 2017). (2006), modelamos este sistema en una celosía hexagonal bidimensional, utilizando un tiempo epidémico de diez minutos para transiciones del estado celular. En la inicialización de cada simulación, asignamos aleatoriamente una duración de vida útil natural, período de incubación, período de infectividad y tiempo desde el estado antiviral hasta el estado susceptible a todas las células en una monocapa teórica. Las duraciones paramétricas se extrajeron de una distribución normal centrada en la inversa de las respectivas tasas fijas de m, s, a y c, según lo reportado con nuestro modelo de campo medio. Las transiciones que involucraban las tasas inducidas (r) y constitutivas (") de adquisición antiviral se gobernaban probabilísticamente y se ajustaban dinámicamente en cada paso del tiempo basado en el entorno global. Como tal, fijamos estos parámetros en los mismos valores estimados en el modelo de campo medio, y multiplicamos tanto r como " por la proporción global de, respectivamente, células expuestas y susceptibles en un tiempo dado. A diferencia de las tasas de adquisición antiviral, las transiciones que involucran la tasa de nacimiento (b) y la tasa de transmisión (b) ocurrieron probabilísticamente en base al entorno local de cada célula. La tasa de nacimiento, b, se multiplicó por la proporción de células sensibles dentro de una circunferencia de seis vecinos de una célula muerta focal, mientras que b se multiplicó por la proporción de células infecciosas dentro de una vecindad de treinta y seis de una célula susceptible focal, permitiendo así que la transmisión viral se extienda más allá de los límites más cercanos de una célula infecciosa. Para compensar los umbrales más altos de persistencia celular e invasión de virus que se producen en condiciones espaciales locales (Webb et al., 2007), aumentamos la tasa de natalidad, b, y la tasa de transmisión de células a células, b, respectivamente, a seis y diez veces los valores utilizados en el modelo de campo medio (Fichero complementario 4). Derivamos estos aumentos sobre la base de la suposición de que los nacimientos tuvieron lugar exclusivamente sobre la base de interacciones de par-vecino más cercano (las seis células inmediatamente adyacentes a una célula muerta focal), mientras que la transmisión viral se concentró localmente pero incluyó una pequeña contribución global (7,5%), que representa las treinta y seis células que rodean a una susceptible focal. Justificamos estos aumentos y derivamos sus orígenes más adelante en el archivo suplementario 5. simulamos diez series de tiempo espacial estocástico para todas las combinaciones de células-virus bajo las tres suposiciones inmunes a un tamaño de población de Formulario de notificación transparente Disponibilidad de datos Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en el manuscrito y los archivos de soporte. Todas las imágenes y códigos utilizados en este estudio se han puesto a disposición para su descarga en el siguiente Figshare

¿Qué especies de murciélagos se compararon?

Dinámica viral acelerada en las líneas celulares de murciélagos, con implicaciones para la emergencia zoonóticahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7064339/SHA: f2cc0d63ff2c4aaa127c4caae21d8f3a0067e3d5Autores: Brook, Cara E; Boots, Mike; Chandran, Kartik; Dobson, Andrew P; Drosten, Christian; Graham, Andrea L; Grenfell, Bryan T; Müller, Marcel A; Ng, Melinda; Wang, Lin-Fa; van Leeuwen, AniekeFecha: 2020-02-03DOI: 10.7554/elife.48401Licencia: cc-byAbstract: Bats host virulent zoo Se necesita una comprensión mecánica del impacto de las capacidades de alojamiento del virus de los murciélagos, incluyendo vías inmunológicas exclusivamente constitutivas, en la dinámica viral a escala celular para dilucidar la emergencia zoonótica. Realizamos ensayos de infectividad del virus en líneas celulares de murciélagos que expresan fenotipos inmunes inducidos y constitutivos, y luego desarrollamos un modelo teórico de nuestro sistema in vitro, que encajamos con los datos empíricos. Los modelos más adecuados recapitularon los fenotipos inmunes esperados para líneas celulares representativas, apoyando defensas antivirales robustas en células de murciélagos que se correlacionaron con estimaciones más altas para las tasas de propagación viral dentro del huésped. En general, las respuestas inmunológicas aumentadas limitan la morbilidad celular inducida por patógenos, lo que puede facilitar el establecimiento de infecciones persistentes de rápida propagación dentro del huésped. Texto: Los murciélagos han recibido mucha atención en los últimos años por su papel como anfitriones de reservorios de zoonosis virales emergentes, incluyendo la rabia y los lissavirus relacionados, Hendra y Nipah henipavirus, Ebola y Marburg filovirus, y el coronavirus SARS (Calisher et al., 2006; Wang y Anderson, 2019). En la mayoría de los mamíferos no quirópteros, henipavirus, filovirus y coronavirus inducen morbilidad y mortalidad sustancial, muestran corta duración de la infección, y provocan inmunidad robusta y a largo plazo en los huéspedes que sobreviven infección (Nicholls et al., 2003; Hooper et al., 2001; Mahanty y Bray, 2004). Los murciélagos, por el contrario, no demuestran síntomas obvios de enfermedad al infectarse con patógenos altamente virulentos en mamíferos no volátiles (Schountz et al., 2017), pero pueden, en cambio, apoyar virus como infecciones persistentes a largo plazo, en lugar de patologías transitorias e inmunizantes (Plowright et al., 2016). Los avances recientes de las investigaciones están comenzando a arrojar luz sobre los mecanismos moleculares por los cuales los murciélagos evitan la patología de estos patógenos de otro modo virulentos (Brook y Dobson, 2015). Los murciélagos aprovechan un conjunto de mecanismos específicos de la especie para limitar la carga viral, que incluyen las incompatibilidades de la secuencia del receptor del huésped para algunas combinaciones de virus del murciélago (Ng et al., 2015; Takadate et al., 2020) y la expresión constitutiva de la citocina antivir Típicamente, la presencia de ARN viral o ADN en el citoplasma de células de mamíferos inducirá la secreción de proteínas de interferón tipo I (IFN-a e IFN-b), que promueven la expresión y traducción de genes estimulados por interferón (ISGs) en células vecinas y las hacen efectivamente antivirales (Stetson y Medzhitov, 2006). En algunas células de murciélago, los planos transcripcionómicos para esta respuesta de IFN se expresan constitutivamente, incluso en ausencia de estimulación por ARN viral o ADN (Zhou et al., 2016). En los mamíferos no voladores, la expresión constitutiva de IFN probablemente provocaría inflamación generalizada e inmunopatología concomitante sobre la infección viral, pero los murciélagos apoyan adaptaciones únicas para combatir la inflamación (Zhang et al., 2013; Ahn et al., 2019; Xie et al., 2018; Pavlovich et al., 2018) que pueden haber evolucionado para mitigar el daño metabólico inducido durante el vuelo (Kacprzyk et al., 2017). La medida en que la expresión constitutiva de IFN-a significa defensa antiviral constitutiva en forma de proteína funcional IFN-a permanece sin resolver. En las células de murciélago que expresan constitutivamente IFN-a, algunos ISGs estimulados por proteínas, aguas abajo parecen ser también expresados constitutivamente, pero la inducción ISG adicional es posible después de desafío viral y estimulación de IFN-b (Zhou et al., 2016; Xie et al., 2018). A pesar de los recientes avances en la comprensión molecular de la tolerancia viral del murciélago, las consecuencias de esta inmunidad única del murciélago en la dinámica del virus dentro del huésped-y sus implicaciones para la comprensión de la emergencia zoonótica-todavía no han sido aclaradas. El campo de 'dinámica del virus' fue desarrollado por primera vez para describir los fundamentos mecánicos de los patrones a largo plazo de la carga viral en estado estacionario exhibida por los pacientes en infecciones de fase crónica con VIH, que parecían producir y virus claro a tasas equivalentes (Nowak y May, 2000; Ho et al., Los modelos de agotamiento celular objetivo simple, en los que la carga viral es dictada por un digestivo de eLife inferior Los murciélagos pueden transportar virus que son mortales a otros mamíferos sin mostrar síntomas graves. De hecho, los murciélagos son reservorios naturales para virus que tienen algunas de las tasas de mortalidad más altas de cualquier virus que la gente adquiere de animales salvajes -incluyendo la rabia, el ébola y el coronavirus SARS. Los murciélagos tienen un conjunto de defensas antivirales que mantienen la cantidad de virus en control. Por ejemplo, algunos murciélagos tienen una respuesta inmune antiviral llamada vía del interferón perpetuamente encendido. En la mayoría de otros mamíferos, tener una respuesta inmune hipervigilante causaría inflamación dañina. Los murciélagos, sin embargo, han adaptado los rasgos antiinflamatorios que los protegen de tales daños, incluyen la pérdida de ciertos genes que normalmente promueven la inflamación. Sin embargo, nadie ha explorado previamente cómo estas defensas Los experimentos hicieron uso de células de una especie de murciélago - el zorro volador negro - en el que la vía del interferón está siempre encendido, y otro - el murciélago de la fruta egipcia - en el que esta vía sólo se activa durante una infección. Las células del murciélago se infectaron con tres virus diferentes, y luego Brook et al. observaron cómo la vía del interferón ayudó a mantener las infecciones en control, antes de crear un modelo informático de esta respuesta. Los experimentos y el modelo ayudaron a revelar que las defensas de los murciélagos pueden tener una desventaja potencial para otros animales, incluyendo humanos. En ambas especies del murciélago, las respuestas antivirales más fuertes fueron contrarrestadas por el virus que se propaga más rápidamente de la célula a la célula. Esto sugiere que las defensas inmunes del murciélago pueden impulsar la evolución de virus de transmisión más rápida, y mientras que los murciélagos están bien protegidos de los efectos nocivos de sus propios virus prolíficos, otras criaturas como los Los hallazgos pueden ayudar a explicar por qué los murciélagos son a menudo la fuente de virus que son mortales en los seres humanos. Aprender más acerca de las defensas antivirales de los murciélagos y cómo impulsan la evolución del virus puede ayudar a los científicos a desarrollar mejores maneras de predecir, prevenir o limitar la propagación de virus de los murciélagos a los seres humanos. Se necesitan más estudios en los murciélagos para ayudar a estos esfuerzos. Mientras tanto, los experimentos destacan la importancia de advertir a las personas para evitar el contacto directo con murciélagos salvajes. aumentar el suministro de recursos de células de huésped susceptibles de infección, se desarrollaron por primera vez para el VIH (Perelson, 2002), pero desde entonces se han aplicado a otras infecciones crónicas, incluyendo el virus de hepatitis-C (Neumann et al., 1998), virus de hepatitis-B (Nowak et al., 1996) y citomegalovirus (Emery et al., 1999 En trabajos recientes se han adoptado técnicas similares para modelar la dinámica interna de las infecciones agudas, como la gripe A y el sarampión, que inspiran el debate sobre la medida en que el modelado explícito del control inmunológico descendente puede mejorar la inferencia más allá de las hipótesis básicas de limitación de recursos del modelo celular objetivo (Baccam et al., 2006; Pawelek et al., 2012; Saenz et al., 2010; Morris et al., 2018). Para investigar el impacto de procesos inmunes únicos de murciélagos en la cinética viral in vitro, primero realizamos una serie de experimentos de infección viral en líneas celulares de murciélagos que expresan fenotipos de interferón divergentes, y luego desarrollamos un modelo teórico que aclara la dinámica de la propagación viral dentro del huésped. Evaluamos nuestro modelo teórico analíticamente independiente de los datos, luego ajustamos el modelo a los datos recuperados de los ensayos experimentales in vitro con el fin de estimar las tasas de transmisión del virus dentro del huésped y la progresión celular al estado antiviral bajo diversos supuestos de inmunidad ausente, inducida y constitutiva. Finalmente, confirmamos nuestros hallazgos en simulaciones estocásticas espacialmente explícitas de series temporales ajustadas de nuestro modelo medio de campo. Hipotemamos que los procesos inmunes descendentes rebaten la limitación de recursos clásicos en líneas de células de murciélago descritas como antivirales constitutivas en la literatura, ofreciendo una predicción testable para modelos que se ajusten a los datos empíricos. Predecimos además que las respuestas antivirales más robustas estarían asociadas con las tasas de propagación de virus más rápidas dentro del huésped, pero también protegen a las células contra la mortalidad inducida por virus para apoyar las infecciones de larga duración en el cultivo de tejidos. Primero exploramos la influencia del fenotipo inmune innato en la propagación viral dentro del huésped en una serie de experimentos de infección en cultivo celular. Se realizaron ensayos de placa en monocapas de placa de seis pozos de tres líneas de células renales de mamíferos inmortalizadas: [1] células Vero (mono verde africano), que son defectuosas de IFN y, por lo tanto, limitadas en capacidad antiviral (Desmyter et al., 1968) ; [2] células RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus) que demuestran respuestas idiosincráticas inducidas por interferón sobre el desafío viral (Kuzmin et al., 2017; Arnold et al., 2018; Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018) ; y [3] células PaKiT01 (Pteropus alecto) que expresan constitutivamente IFN-a (Zhou et al., 2016; Crameri et al., 2009). Para intensificar las diferencias celulares específicas en la inmunidad constitutiva, realizamos ensayos de infectividad con la estomatitis vesicular rVSV-G, rVSV-EBOV, y rVSV-MARV, previamente descritos (Miller et al., 2012; Wong et al., 2010). Dos de estos virus, rVSV-EBOV y rVSV-MARV, son recombinantes cuya entrada celular está mediada por la glucoproteína de los filovirus de murciélago, Ébola (EBOV) y Marburg (MARV), lo que nos permite modular el grado de defensa estructural, así como inmunológica, antiviral en juego en cada infección. El trabajo anterior en este laboratorio ha demostrado incompatibilidades en el receptor de filovirus NPC1 que hacen a las células PaKiT01 refractarias a la infección con rVSV-MARV (Ng y Chandrab, 2018, resultados inéditos), haciéndolos estructuralmente antivirales, más allá de su expresión constitutiva de IFN-a. Las tres líneas celulares fueron desafiadas con los tres virus en dos multiplicidades de infección (MOI): 0,001 y 0,0001. Entre 18 y 39 ensayos se realizaron en cada combinación celular-virus-MOI, excepto infecciones por rVSV-MARV en las células PaKiT01 en MOI = 0,001, para las cuales sólo se realizaron ocho ensayos (ver Materiales y métodos; Figura 1 -figura suplementos 1-3, archivo suplementario 1). Debido a que los ensayos de placa restringen la transmisión viral de vecinos a vecinos en el espacio celular bidimensional (Howat et al., 2006), pudimos rastrear la propagación de células infectadas por virus que expresan GFP a través de monocapas de tejido a través de microscopía de fluorescencia invertida. Para cada ensayo de infección, monitoreamos y reimaginamos placas hasta 200 horas de observación o hasta la destrucción total de monocapas, procesamos imágenes resultantes, y generamos una serie de tiempo de la proporción de espacio de placa ocupada por células infecciosas a lo largo de la duración de cada ensayo (ver Materiales y métodos). Utilizamos modelos aditivos generalizados para inferir el curso temporal de todos los cultivos celulares replicados y construir el conjunto de datos multi-trial al que finalmente encajamos nuestro modelo de transmisión mecanística para cada combinación específica de línea celular-virus (Figura 1; Figura 1 -figura 1 - Los tres virus de la estomatitis vesicular recombinante (rVSV-G, rVSV-EBOV y rVSV-MARV) infectaron Vero, RoNi/7.1, y cultivos tisulares PaKiT01 en ambos MOIs focales. Después de la invasión, el virus se diseminó rápidamente a través de la mayoría de las monocapas celulares, resultando en una extinción epidémica inducida por el virus. Las epidemias fueron menos graves en los cultivos de células de murciélago, especialmente cuando se infectaron con los filovirus recombinantes, rVSV-EBOV y rVSV-MARV. La destrucción de monocapas se evitó en el caso de infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en las células de PaKiT01: en las primeras, la infección viral persistente se mantuvo a lo largo de Asumimos que este patrón era el resultado de la extinción epidémica mediada por el sistema inmunitario (Figura 1). Los patrones del MOI = 0,001 fueron ampliamente recapitulados en el MOI = 0,0001, aunque con proporciones totales algo reducidas (Figura 1-figura suplemento 5). Un modelo teórico adecuado a los datos in vitro recapitula los fenotipos inmunes esperados para las células de murciélagos A continuación, desarrollamos un modelo dentro del huésped para adaptarse a estos datos para dilucidar los efectos de la inmunidad inducida y constitutiva sobre la dinámica de propagación viral en el tejido huésped (Figura 1 ). El sistema compartimental dentro del huésped imitaba nuestra monocapa de cultivo celular bidimensional, con células que ocupaban cinco estados de infección distintos: susceptibles (S), antivirales (A), expuestos (E), infecciosos (I) y muertos (D). Modelamos las células expuestas como infectadas pero aún no infecciosas, capturando la "fase eclipsa" de la integración viral en una célula huésped que precede a la replicación viral. Las células antivirales eran inmunes a la infección viral, de acuerdo con el "estado antiviral" inducido por la estimulación del interferón de los ISG en los tejidos adyacentes a la infección (Stetson y Medzhitov, 2006). Debido a que nuestro objetivo era traducir los datos disponibles en procesos modelados, no modelamos explícitamente la dinámica del interferón, sino que escalamos la tasa de progresión celular de las células sensibles a los antivirales (r) por la proporción de células expuestas (globalmente) en el sistema. En sistemas que permiten la inmunidad constitutiva, una segunda tasa de adquisición celular del estado antiviral (") adicionalmente escalada con la proporción global de células sensibles en el modelo. En comparación con el virus, las partículas IFN son pequeñas y altamente difusivas, justificando esta suposición de señalización global en la extensión espacial limitada de una placa de seis pozos y manteniendo la coherencia con las aproximaciones de modelado previas de la señalización IFN en el ensayo de placa (Howat et al., 2006). Para representar mejor nuestro sistema de monocapa empírica, expresamos nuestras variables de estado como proporciones (P S, P A, P E, P I, y P D ), bajo supuestos de transmisión dependiente de la frecuencia en una población bien mezclada (Keeling y Rohani, 2008), aunque note que la inclusión de P D (representando la proporción de espacio muerto en el tejido modelado) tuvo el efecto funcional de variar la transmisión con densidad celular infecciosa. Esto resultó en el siguiente sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias:Definimos la 'inmunidad inducida' como completa, modelando todas las células como susceptibles a la invasión viral en equilibrio libre de enfermedad, con defensas inducidas después de la exposición viral a través del término r. Por el contrario, permitimos que el grado de inmunidad constitutiva varíe a través del rango de parámetros de " > 0, definiendo un sistema 'constitutivo' como aquel que contiene cualquier célula antiviral en equilibrio libre de enfermedad. Al ajustar este modelo a los datos de cultivo de tejidos, estimamos independientemente tanto r como "; así como la tasa de transmisión de células a células, b, para cada combinación de células y virus. Dado que la medida en que IFN-a se expresa constitutivamente se traduce constitutivamente en proteína funcional todavía no se conoce para los anfitriones de murciélagos (Zhou et al., 2016), este enfoque permitió que nuestros datos de cultivo de tejidos para impulsar la inferencia de modelado: incluso en las líneas celulares PaKiT01 conocidas por expresar constitutivamente IFN-a, la verdadera extensión constitutiva del sistema (es decir, la cantidad de células antivirales presentes en el equilibrio libre de enfermedad) se permitió variar a través de la estimación de ": Para los fines de ajuste del modelo, fijamos el valor de c, la tasa de retorno de las células antivirales a estado susceptible, en 0. La pequeña escala espacial y el corto curso de tiempo (máximo 200 horas) de nuestros experimentos probablemente prohibieron cualquier retorno de las células antivirales al estado susceptible en nuestro sistema empírico; sin embargo, conservamos el término c en las evaluaciones analíticas de nuestro modelo porque la regresión del estado antiviral al estado susceptible es posible durante largos periodos de tiempo in vitro y a la escala de un organismo completo (Radke et al., 1974; Rasmussen y Farley, 1975; Samuel y Knutson, 1982). Antes de adaptarnos a la serie de tiempo empírico, realizamos análisis de bifurcación de nuestro modelo teórico y generamos hipótesis probables sobre la base de resultados de modelos. De nuestro sistema de modelo interno (Ecuación 1-5), derivamos la siguiente expresión para R 0, el número de reproducción básica de patógenos (Fichero complementario 2):Los patógenos pueden invadir un cultivo de tejido Las tasas rápidas de adquisición antiviral constitutiva (") impulsarán R 0 <1: los cultivos tisulares con inmunidad antiviral altamente constitutiva serán por lo tanto resistentes a la invasión del virus desde el principio. Dado que, por definición, la inmunidad inducida se estimula después de la invasión inicial del virus, la tasa de adquisición antiviral inducida (r) no se incorpora a la ecuación para R 0; mientras que los procesos inmunes inducidos pueden controlar el virus después de la invasión inicial, no pueden evitar que ocurra a partir de. En casos de inmunidad totalmente inducida o ausente (" 1⁄4 0), la ecuación R 0 se reduce así a una forma típica del modelo SEIR clásico:En equilibrio, el modelo de campo teórico, medio demuestra uno de los tres estados de infección: equilibrio endémico, ciclos límite estables, o ninguna infección (Figura 2). Respectivamente, estos estados se aproximan a la infección persistente, la extinción epidémica inducida por virus y los fenotipos de extinción epidémica mediada por el sistema inmunitario previamente observados en experimentos de cultivo de tejidos (Figura 1 ). Teóricamente, el equilibrio endémico se mantiene cuando se generan nuevas infecciones al mismo ritmo que se pierden las infecciones, mientras que los ciclos límite representan un espacio paramétrico bajo el cual las poblaciones infecciosas y susceptibles están bloqueadas en oscilaciones predecibles. Equilibrios endémicos resultantes de la regeneración celular (es decir, nacimientos) se han descrito in vivo para el VIH (Coffin, 1995) e in vitro para los ensayos de placas de herpesvirus (Howat et al., 2006), pero debido a que se aproximan tan estrechamente a cero, los verdaderos ciclos límite probablemente sólo ocurren teóricamente, en lugar de producir extinciones estocásticas en series El análisis de bifurcación de nuestro modelo medio de campo reveló que las regiones de ninguna infección (extinción de patógenos) estaban limitadas a valores de umbral más bajo (punto Branch) para b, por debajo de los cuales el patógeno no pudo invadir. No encontramos ningún umbral superior a invasión para b bajo ninguna circunstancia (es decir, b lo suficientemente alto como para impulsar la extinción inducida por patógenos), pero los valores altos de b resultaron en bifurcaciones Hopf, que delinean regiones de espacio paramétrico caracterizadas por ciclos límite. Puesto que los ciclos límite se aproximan tan estrechamente a cero, los bs altos recuperados en este rango probablemente producirían extinciones epidémicas inducidas por virus en condiciones experimentales. Consistente con nuestra derivación para R 0, encontramos que el umbral de punto de Rama para invasión viral fue independiente de cambios en el parámetro inmune inducido (r) pero saturado en valores altos de " que caracterizan la inmunidad altamente constitutiva (Figura 3). A continuación, encajamos nuestro modelo teórico por mínimos cuadrados a cada combinación de línea celular-virus, bajo ausente, inducido, y constitutivo suposiciones de inmunidad. En general, los modelos mejor adaptados recapitularon resultados esperados basados en el fenotipo inmune de la línea celular en cuestión, como se describe en la literatura general (Tabla 1 Irónicamente, el modelo inmune inducido ofreció un ajuste ligeramente mejor que el constitutivo a las infecciones por rVSV-MARV en la línea celular PaKiT01 (la combinación de línea celular-virus para la que conocemos una incompatibilidad constitutiva antiviral de receptor de células para estar en juego). Debido a que los supuestos constitutivos inmunes pueden prohibir la invasión de patógenos (R 0 < 1), el modelo se ajusta a esta serie temporal bajo supuestos constitutivos se vieron impedidos por sobreestimación de ", que prohibió la invasión de patógenos. Sólo mediante la incorporación de una tasa extremadamente rápida de adquisición antiviral inducida podría el modelo garantizar que la infección inicial se permitiría y luego se controlaría rápidamente. En todas las parcelas del panel (A) la tasa de adquisición inmune antiviral inducida (r) se fijó en 0.01. El panel (B) representa la dinámica bajo inmunidad invariablemente inducida, que va desde ausente (izquierda: r=0) hasta alta (derecha: r=1). En todas las parcelas del panel (B) la tasa de adquisición antiviral constitutiva (") se fijó en 0.0001 Las curvas de puntos de rama se representan como líneas sólidas y curvas Hopf como líneas rayadas. El espacio blanco indica equilibrio endémico (persistencia), el espacio gris indica ciclos límite y el espacio negro no indica infección (extinción).Otros valores de parámetro para el análisis de equilibrio se fijaron en: b = 025, m = 0,001, s = 1/6, c = 0. Los puntos especiales de los análisis de bifurcaciones se enumeran en el archivo complementario 3. Al ajustar nuestro modelo teórico a los datos in vitro, estimamos la tasa de transmisión del virus dentro del huésped (b) y la tasa(s) de adquisición celular al estado antiviral (r o r + ") (cuadro 1 ; archivo suplementario 4). Bajo supuestos inmunes ausentes, r y " se fijaron en 0 mientras que b se estimó; bajo supuestos inmunológicos inducidos " se fijó en 0 mientras que r y b se estimaron; y bajo hipótesis inmunológicas constitutivas, los tres parámetros Las estimaciones de parámetros de mejor ajuste para los datos de MOI=0,001 se visualizan en conjunción con br y b -" bifurcaciones en (r) y (B) la tasa de inmunidad constitutiva de adquisición antiviral ("). Los paneles muestran variación en el grado de inmunidad, de ausente (izquierda) a alto (derecha). Las curvas de punto de rama se representan como líneas sólidas y las curvas de Hopf como líneas discontinuas. El espacio blanco indica equilibrio endémico (persistencia), el espacio gris indica ciclo límite y el espacio negro no indica infección (extinción). Otros valores de parámetros para el análisis de equilibrio se fijaron en: b = 025, m = 0,001, s = 1/6, a = 1/6, c = 0. Los puntos especiales de los análisis de bifurcaciones se enumeran en el archivo suplementario 3. A diferencia de las células Vero, el modelo de inmunidad inducida ofrecía el mejor ajuste a todos los datos de RoNi/7.1, consistentes con los patrones reportados en la literatura y nuestra propia validación por qPCR (Tabla 1; Arnold et al., 2018; Kuzmin et al., 2017; Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018). Al igual que en los ensayos con células Vero, estimamos los valores b más altos para las infecciones por rVSV-G en las líneas celulares de RoNi/7.1 pero aquí recuperamos estimaciones b más altas para rVSV-MARV que para rVSV-EBOV. Esta inversión se equilibró con una tasa estimada más alta de adquisición a estado antiviral (r) para rVSV-EBOV frente a rVSV-MARV. En general, observamos que las tasas más rápidas de adquisición antiviral (ya sea inducida, r, constitutiva, ", o ambas) se correlacionaban con mayores tasas de transmisión (b). Al compensarse por r, los valores estimados para las infecciones por RoNi/7.1 mantuvieron la misma amplitud que los estimados para las líneas celulares de Vero inmune-ausente pero causaron epidemias más suaves y reducción de la mortalidad celular (Figura 1). Las estimaciones de parámetros de RoNi/7.1 localizadas en la región correspondientes al equilibrio endémico para el modelo determinista teórico (Figura 4), produciendo epidemias menos agudas que sin embargo se extinguieron en experimentos estocásticos. Finalmente, los ensayos de rVSV-G y rVSV-EBOV en células PaKiT01 se ajustaron mejor por modelos que asumen inmunidad constitutiva, mientras que las infecciones por rVSV-MARV en PaKiT01 se emparejaron equivalentemente con modelos que asumen inmunidad inducida o constitutiva-con modelos inducidos favorecidos sobre constitutivos en comparaciones AIC porque se estimó un parámetro menos (figura 1-figura suplementos 4-5; archivo suplementario 4). Para todas las infecciones por virus, las líneas celulares de PaKiT01 produjeron b estima un orden completo de magnitud superior a Vero o RoNi/7.1 células, con cada b equilibrado por una respuesta inmune (ya sea r, o r combinado con ") también un orden de magnitud superior al recuperado para las otras líneas celulares (figura 4 ; tabla 1 ). Al igual que en células RoNi/7.1, el parámetro PaKi Debido a que los procesos inmunes constitutivos pueden realmente prohibir la invasión inicial de patógenos, la inmunidad constitutiva se ajusta a las infecciones por rVSV-MARV en líneas celulares PaKiT01 constantemente localizadas en o por debajo del umbral del punto de Rama para la invasión del virus (R 0 1⁄4 1). Durante el ajuste del modelo para la optimización de ", cualquier prueba de parámetros de " valores que producen R 0 < 1 no dio lugar a ninguna infección y, en consecuencia, produjo un ajuste extremadamente deficiente a los datos de las series temporales infecciosas. En todos los modelos, asumiendo inmunidad constitutiva, en todas las líneas celulares, las contribuciones antivirales de " virus prohibidos de invadir en absoluto. Con el fin de comparar las contribuciones relativas de los diferentes procesos inmunes de cada línea celular a la dinámica epidémica, a continuación utilizamos nuestras estimaciones de parámetros de campo promedio para calcular la 'tasa antiviral' inicial de acumulación de células antivirales tras la invasión del virus para cada combinación de células-virus-MOI basado en la siguiente ecuación:donde P E se calculó a partir de la dosis infecciosa inicial (MOI) de cada experimento de infección y P S se estimó en equilibrio libre de enfermedad:Porque y "ambos contribuyen a esta tasa antiviral inicial, las hipótesis inmunológicas inducidas y constitutivas son capaces de producir tasas igualmente rápidas, dependiendo de los ajustes de parámetros. De hecho, bajo supuestos inmunes totalmente inducidos, la tasa de adquisición antiviral inducida (r) estimada para la infección por rVSV-MARV en las células PaKiT01 fue tan alta que la tasa antiviral En realidad, sabemos que las incompatibilidades con los receptores NPC1 hacen que las líneas celulares PaKiT01 constitutivamente sean refractarias a la infección por rVSV-MARV (Ng y Chandrab, 2018, resultados inéditos) y que las células PaKiT01 también expresan constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a. Los resultados de ajuste del modelo sugieren que esta expresión constitutiva de IFN-a puede actuar más como una respuesta inmune rápidamente inducible tras la invasión del virus que como una secreción constitutiva de la proteína funcional IFN-a. Sin embargo, como hipotetizado, las líneas celulares PaKiT01 fueron con mucho la más antiviral de cualquiera en nuestro estudio-con tasas antivirales iniciales estimadas en varios órdenes de magnitud superiores a cualquier otro en nuestro estudio, bajo supuestos inducidos o constitutivos (Tabla 1 ; Ficha complementaria 4). Las células RoNi/7.1 mostraron la segunda firma de inmunidad más pronunciada, seguida de las células Vero, para las cuales la tasa antiviral inicial fue esencialmente cero incluso bajo supuestos forzados de inmunidad inducida o constitutiva (Tabla 1 ; Archivo suplementario 4). Utilizando parámetros ajustados para b y ", calculamos adicionalmente R 0, el número de reproducción básico para el virus, para cada combinación de línea celular-virus-MOI (Tabla 1 ; Archivo suplementario 4). Encontramos que R 0 fue esencialmente sin cambios en diferentes supuestos inmunes para las células RoNi/7.1 y Vero, para las cuales la tasa antiviral inicial fue baja. En el caso de las células PaKiT01, una alta tasa inicial de antiviral bajo inmunidad inducida o constitutiva resultó en una estimación correspondientemente alta de b (y, por consiguiente, R 0 ) que aún produjo la misma curva epidémica que resultó de las estimaciones mucho más bajas para b y R 0 emparejadas con inmunidad ausente. Estos hallazgos sugieren que las respuestas inmunes antivirales protegen los tejidos huésped contra la mortalidad celular inducida por virus y pueden facilitar el establecimiento de tasas de transmisión más rápidas dentro del huésped. La destrucción total de monocapas se produjo en todas las combinaciones de virus celulares excepto infecciones por rVSV-EBOV en células RoNi/7.1 e infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en células PaKiT01. La destrucción de monocapas correspondió al agotamiento celular sensible y al recambio epidémico donde R efectivo (el producto de R 0 y Para las infecciones por rVSV-EBOV en las células antivirales inducidas RoNi/7.1, las células vivas remanentes salvaguardadas, que dieron a luz nuevas células sensibles tardíamente en la serie temporal. En las infecciones por rVSV-EBOV y rVSV-MARV en las células PaKiT01, esta protección antiviral detuvo la epidemia (Figura 5 ; R-efectiva <1) antes de que los susceptibles declinaran completamente. En el caso de las infecciones por rVSV-EBOV en las células PaKiT01, el nacimiento de nuevos susceptibles a partir de células vivas remanentes protegidas por el estado antiviral mantuvo la transmisión tardía para facilitar la persistencia de la epidemia a largo plazo. Es importante destacar que bajo los valores de parámetros fijos para la tasa de incubación de la infección (s) y la tasa de mortalidad inducida por la infección (a), los modelos no pudieron reproducir las series de tiempo infeccioso a más largo plazo captadas en los datos de infecciones por rVSV-EBOV en las líneas celulares de PaKiT01 sin incorporación de nacimientos celulares, suposición adoptada en representaciones de modelos anteriores de la dinámica viral mediada por IFN en el cultivo de tejidos (Howat et al., 2006). En nuestros experimentos, observamos que la reproducción celular se llevó a cabo como ensayos de placa alcanzó confluencia. Finalmente, debido a que el efecto protector de las células antivirales es más claramente observable espacialmente, confirmamos nuestros resultados simulando series de tiempo ajustadas en una reconstrucción estocástica espacialmente explícita de nuestro modelo de campo medio. En las simulaciones espaciales, las tasas de adquisición antiviral se fijaron en valores ajustados para r y " derivados de las estimaciones medias de campo, mientras que las tasas de transmisión (b) se fijaron en valores diez veces superiores a los estimados en condiciones medias de campo, teniendo en cuenta la intensificación de los umbrales de parámetros que permitían la invasión de patógenos en las interacciones espaciales locales (véanse Materiales y métodos; Videos 1-3; Suplemento 3 de la figura 5; Fichero complementario 5; Webb y otros, 2007). En series temporales inmunitarias, las células antivirales espaciales actuaron como "refugios" que protegían a las células vivas de la infección como cada onda epidémica inicial "lavada" a través de una monocapa celular. Los murciélagos son reservorios para varias zoonosis emergentes importantes, pero parecen no experimentar la enfermedad de patógenos virales de otro modo virulentos. Aunque la literatura biológica molecular ha hecho grandes progresos en el esclarecimiento de los mecanismos por los cuales los murciélagos toleran infecciones virales (Zhou et al., 2016; Ahn et al., 2019; Xie et al., 2018; Pavlovich et al., 2018; Zhang et al., 2013), el impacto de la inmunidad única de los murciélagos en la dinámica del virus dentro del huésped no ha sido bien aclarada. Utilizamos una combinación innovadora de experimentación in vitro y modelado dentro del huésped para explorar el impacto de la inmunidad única de los murciélagos en la dinámica del virus. Críticamente, descubrimos que las líneas de células de murciélago demostraron una firma de respuesta inmune mejorada mediada por interferón, de forma constitutiva o inducida, que permitió establecer tasas rápidas de transmisión del Estos resultados fueron apoyados por el análisis bifurcado independiente de los datos de nuestro modelo teórico de campo medio, así como por el ajuste de este modelo a las series de tiempo de infección viral establecidas en el cultivo de células de murciélagos. Además, demostramos que el estado antiviral inducido por la vía del interferón protege a las células vivas de la mortalidad en el cultivo de tejidos, resultando en epidemias in vitro de larga duración que aumentan la probabilidad de establecer una infección persistente a largo plazo. Nuestros hallazgos sugieren que los virus evolucionados en depósitos de murciélagos que poseen capacidades mejoradas de IFN podrían lograr tasas de transmisión más rápidas dentro del huésped sin causar patología a sus huéspedes. Estos virus de rápida reproducción probablemente generarían una virulencia extrema sobre el derrame a los huéspedes que carecen de capacidades inmunes similares a los murciélagos. Para lograr estos resultados, primero desarrollamos un modelo teórico novedoso, dentro del huésped, elucidando los efectos de la inmunidad Consideramos que una línea celular es constitutivamente inmune si posee cualquier número de células antivirales en equilibrio libre de enfermedad pero permite que la extensión de inmunidad constitutiva varíe a través del rango de parámetros para ", la tasa constitutiva de adquisición antiviral. Al derivar la ecuación para R 0, el número básico de reproducción, que define las condiciones umbral para la invasión viral de un tejido (R 0 > 1), demostramos cómo el umbral de invasión se eleva a valores altos de adquisición antiviral constitutiva, ". Los procesos inmunes constitutivos pueden así prohibir la invasión de patógenos, mientras que las respuestas inducidas, por definición, sólo pueden controlar las infecciones post-hoc. Una vez que se han alcanzado los umbrales de invasión patogénica, las suposiciones de inmunidad constitutiva limitarán la mortalidad celular (virulencia) incurrida a altas tasas de transmisión. Independientemente del mecanismo (inducido o constitutivo), las células antivirales estimuladas por interferón parecen desempeñar un papel clave en el mantenimiento de infecciones persistentes o a largo plazo al proteger a las células sensibles de la infección rápida y la muerte celular concomitante. El ajuste de nuestro modelo a los datos in vitro apoyó los fenotipos inmunes esperados para diferentes líneas celulares de murciélagos, como se describe en la literatura. Modelos simples de células diana que ignoran los efectos de la inmunidad mejor serie temporal infecciosa recapitulada derivada de células Vero deficientes de IFN, mientras que los modelos que asumen procesos inmunes inducidos reprodujeron con mayor precisión ensayos derivados de células RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus), que poseen una respuesta IFN inducida por virus estándar. En la mayoría de los casos, los modelos que asumen procesos inmunes constitutivos mejor recrean epidemias de virus producidas en las células de PaKiT01 (Pteropus alecto), que se sabe que expresan constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a (Zhou et al., 2016). El apoyo del modelo para suposiciones inmunológicas inducidas en ajustes a infecciones por rVSV-MARV en las células de PaKiT01 sugiere que la expresión constitutiva IFN-a característica de las células de P. alecto puede representar más un proceso de primogenitura inmune constitutivo que una defensa perpetua, funcional y antiviral. Los resultados del ajuste del modelo de campo medio fueron confirmados adicionalmente en simulaciones estocásticas espacialmente explícitas de cada serie temporal. Como se ha demostrado anteriormente en los modelos internos para el VIH (Coffin, 1995; Perelson et al., 1996; Nowak et al., 1995; Bonhoeffer et al., 1997; Ho et al., 1995), los supuestos de agotamiento simple de las células diana a menudo pueden proporcionar aproximaciones satisfactorias de la dinámica viral, especialmente las reproducidas en sistemas in vitro simples. Críticamente, nuestro ajuste del modelo enfatiza la necesidad de incorporar los efectos descendentes del control inmunológico para reproducir con precisión las series de tiempo infecciosas derivadas de cultivos de células de murciélago, especialmente las resultantes de la línea celular PaKiT01 P. alecto robustamente antiviral. Estos hallazgos indican que las vías inmunes mejoradas mediadas por la IFN en los reservorios de murciélagos pueden promover tasas elevadas de replicación del virus dentro del huésped antes de la aparición de especies cruzadas. No El trabajo futuro debe extender estos estudios de cultivo celular para incluir mediciones de múltiples variables de estado (es decir, células antivirales) para mejorar la inferencia epidemiológica.La continua recurrencia de epidemias de Ébola en toda África central destaca la importancia de entender el papel de los murciélagos como reservorios para la enfermedad zoonótica virulenta. La última década ha nacido testigo de un consenso emergente con respecto a las vías únicas por las cuales los murciélagos resisten y toleran infecciones altamente virulentas (Brook y Dobson, 2015; Xie et al., 2018; Zhang et al., 2013; Ahn et al., 2019; Zhou et al., 2016; Ng et al., 2015; Pavlovich et al., 2018). Sin embargo, sigue siendo difícil comprender los mecanismos por los cuales los murciélagos apoyan patógenos endémicos a nivel poblacional, o promueven la evolución de El mantenimiento endémico de la infección es una característica definitoria de un reservorio de patógenos (Haydon et al., 2002), y los murciélagos parecen merecer tal título, apoyando la persistencia a largo plazo de infecciones virales altamente transmisibles en poblaciones insulares aisladas muy por debajo de los tamaños críticos esperados de la comunidad (Peel et al., 2012). Los investigadores debaten la influencia relativa de los mecanismos a nivel de la población y dentro del huésped que podrían explicar estas tendencias (Plowright et al., 2016), pero cada vez más, los datos de campo son difíciles de conciliar sin reconocer un papel para las infecciones persistentes (Peel et al., 2018; Brook et al., 2019). Presentamos métodos generales para estudiar la dinámica viral a escala cruzada, que sugieren que la persistencia dentro del huésped está respaldada por respuestas antivirales robustas características de los procesos inmunes al murciélago. Los virus que evolucionan rápidamente las tasas de replicación bajo estas robustas defensas antivirales pueden representar el mayor riesgo para la aparición de patógenos de especies cruzadas en huéspedes de derrames con sistemas inmunes que difieren de los únicos a los murciélagos. Todos los experimentos se llevaron a cabo en tres líneas de células renales de mamíferos inmortalizados: Vero (mono verde africano), RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus) (Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011) y PaKiT01 (Pteropus alecto) (Crameri et al., 2009). Las identificaciones de especies de todas las líneas de células de murciélago se confirmaron morfológica y genéticamente en las publicaciones en las que fueron descritos originalmente (Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011; Crameri et al., 2009) Las monocapas de cada línea celular fueron cultivadas hasta 90% de confluencia (~9Â10 5 células) en placas de 6 pocillos. Las células fueron mantenidas en una incubadora humidificada de 37oC, 5% CO 2 y cultivadas en el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies, Grand Island, NY), complementadas con suero bovino fetal 2% (Gemini Bio Products, West Sacramento, CA), y 1% penicilina-estreptomicina (Life Technologies).Las células fueron analizadas mensualmente para detectar la contaminación por micoplasma mientras se realizaban experimentos; todas las células determinaron negativo para la contaminación en cada prueba. El trabajo anterior ha demostrado que todas las líneas celulares utilizadas son capaces de montar una respuesta IFN de tipo I en caso de desafío viral, con la excepción de las células Vero, que poseen una deficiencia IFN-b (Desmyter et al., 1968; Rhim et al., 1969; Emeny y Morgan, 1979). Las células RoNi/7.1 han demostrado montar defensas IFN inducidas idiosincráticas ante infección viral (Pavlovich et al., 2018; Kuzmin et al., 2017; Arnold et al., 2018; Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011), mientras que las células PaKiT01 son conocidas por expresar constitutivamente la citocina antiviral, IFN-a (Zhou et al., 2016). Este trabajo es la primera documentación de la señalización de IFN inducida en caso de desafío con los VSV recombinantes particulares descritos a continuación. Verificamos fenotipos inmunes antivirales conocidos a través de qPCR. Los resultados fueron consistentes con la literatura, indicando un papel menos pronunciado para la defensa del interferón contra la infección viral en las células RoNi/7.1 versus PaKiT01. Se han descrito previamente los virus de la estomatitis vesicular recombinante con capacidad de replicación (Wong et al., 2010; Miller et al., 2012). Los virus fueron seleccionados para representar una amplia gama de respuestas antivirales anticipadas de las células huésped, basadas en una gama de historias evolutivas pasadas entre la entrada de células glucoproteínas del virus y el receptor de entrada de la célula huésped. Estas interacciones variaron desde la ausencia total de historia evolutiva en el caso de infecciones por rVSV-G en todas las líneas celulares hasta una incompatibilidad de entrada celular a nivel de receptor conocido en el caso de infecciones por rVSV-MARV en las líneas celulares PaKiT01. Para medir las infecciones de rVSV en cada una de las líneas celulares descritas anteriormente, para calcular la dosis viral correcta para cada MOI, se añadió NH 4 Cl (20 mM) a cultivos celulares infectados a 1-2 horas de postinfección para bloquear la propagación viral, y las células eGFP positivas individuales se contabilizaron manualmente a las 12-14 horas de postinfección. Los trabajos publicados anteriormente indican que las líneas de células renales inmortalizadas de Rousettus aegyptiacus (RoNi/7.1) y Pteropus alecto (PaKiT01) exhiben diferentes fenotipos inmunes antivirales innatos a través de, respectivamente, inducidos (Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018; Kühl et al., 2011; Arnold et al., 2018) y expresión constitutiva (Zhou et al., 2016) de los genes de interferón tipo I. Verificamos estos fenotipos publicados en nuestras propias líneas celulares infectadas con rVSV-G, rVSV-EBOV, y rVSV-MARV vía qPCR de genes IFN-a e IFN-b a través de una serie longitudinal de infecciones. Específicamente, realizamos múltiples series temporales de infección de cada línea celular con cada uno de los virus descritos anteriormente, bajo condiciones de infección simuladas y en MOIs de 0,0001 y 0,001-con excepción de rVSV-MARV en líneas celulares PaKiT01, para lo cual la infección sólo se realizó en MOI = 0,0001 debido a las limitadas existencias virales y a la extremadamente baja infectividad de este virus en esta línea celular (requeriendo así altas cargas virales para la infección inicial).Todos los experimentos se ejecutaron en duplicado en placas 6well, de tal manera que una placa típica para cualquiera de los tres virus tenía dos pozos de control (mock), dos MOI = 0,0001 pozos y dos MOI = 0,001 pozos, excepto las placas PaKiT01, que tenían dos controles y cuatro MOI = 0,0001 pozos en un momento dado. Justificamos esta exención de PaKiT01 a través de la expectativa de que IFN-una expresión es constitutiva para estas células, y por la suposición de que cualquier expresión exhibida en el MOI inferior también debería estar presente en el MOI superior. Para estas series de tiempo de expresión génica, cuatro placas de 6 pocillos para cada combinación de línea celular-virus fueron incubadas con virus durante una hora a 37oC. Después de la incubación, el virus fue aspirado, y los monocapas celulares fueron lavados en PBS, luego cubiertos con un ensayo de placa de agar superpuesto para imitar las condiciones bajo las cuales se realizaron los ensayos de infección. Las placas se recolectaron secuencialmente en los puntos de tiempo de aproximadamente 5, 10, 15 y 20 horas después de la infección (el tiempo exacto variaba como múltiples ensayos se ejecutaban simultáneamente). Después de la cosecha de cada placa, se eliminó la capa de agar y se lisó el virus y se extrajo ARN de las células utilizando el kit Zymo Quick ARN Mini Prep, de acuerdo con las instrucciones del fabricante e incluyendo el paso para la digestión del ADN celular. Después de la extracción, la calidad del ARN se verificó a través de nanodrop, y el ARN se convirtió a cDNA utilizando el kit de síntesis de cDNA de Superscript III Invitrogen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. cDNA se almacenó a 4oC y como un stock congelado a À20oC para esperar qPCR. Nos encargamos de qPCR de cDNA para evaluar la expresión de los genes de interferón tipo I, IFN-a e IFNb, y el gen de mantenimiento de la casa, b-Actin, utilizando imprimaciones Para qPCR, se incubaron 2 ml de cada muestra de cDNA con 7 ml de agua desionizada, 1 ml de 5 UM de mezcla de imprimación hacia adelante/reversa y 10 ml de iTaq Universal SYBR Green, luego se cicló en una máquina de PCR QuantStudio3 en tiempo real bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 C durante 2 minutos seguido de 40 ciclos de: desnaturalización a 95 C (5 s), recocido a 58 C (15 s), y extensión a 72 C (10 s). Presentamos valores d-Ct simples para cada ejecución, con Ct en bruto del gen de interés objetivo (IFN-a o IFN-b) sustraído del Ct en bruto del gen de limpieza b-Actin en la Figura 1 -figura suplemento 6. El cálculo del cambio de pliegue sobre la infección viral en comparación con el simulacro usando el método d-d-Ct (Livak y Schmittgen, 2001) fue inapropiado en este caso, ya que deseábamos demostrar la expresión constitutiva de IFN-a en células PaKiT01, por lo que los datos de células simuladas eran idénticos a los producidos a partir de células infectadas. Después de crecer a ~ 90% de confluencia, las células fueron incubadas con rVSV en pellets expresando eGFP (rVSV-G, rVSV-EBOV, rVSV-MARV). Las líneas celulares fueron desafiadas con una baja (0,0001) y alta (0.001) multiplicidad de infección (MOI) para cada virus. En una monocapa celular infectada en un determinado MOI (m), la proporción de células (P), infectadas por k partículas virales puede ser descrita por la distribución de Poisson: P k ð 1⁄4 e Àm m k!, de tal manera que el número de células inicialmente infectadas en un experimento es igual a: 1 À e Àm. Asumimos que un cultivo confluente ~90 % en el origen de cada ensayo estaba compuesto por ~9x10 5 células y conducía todos los experimentos en MOIs de 0,0001 y 0,001, lo que significa que comenzamos cada ensayo introduciendo virus a, respectivamente, ~81 u 810 células, que representan la variable de estado 'E' en nuestro modelo teórico. Los MOIs bajos fueron seleccionados para aproximar mejor la dinámica de infección de campo media y limitar artefactos de estructuración espacial, tales como extinción epidémica prematura cuando las placas en crecimiento Se prepararon placas de seis pocillos con cada infección por duplicado o triplicado, de manera que un pozo de control (sin virus) y 2-3 pozos cada uno en el MOI 0,001 y 0,0001 fueron incubados simultáneamente en la misma placa. En total, se realizaron entre 18 y 39 ensayos en cada combinación de células-virus-MOI, excepto infecciones por r-VSV-MARV en células PaKiT01 en el MOI = 0,001, para lo cual se realizaron sólo ocho ensayos debido a la baja infectividad de este virus en esta línea celular, lo que requirió altas cargas virales para la infección inicial. Las células fueron incubadas con virus por una hora a 37oC. Después de la incubación, el virus fue aspirado, y las monocapas celulares fueron lavadas en PBS, luego cubiertas con una capa viscosa fundida (50% 2X MEM/Lglutamina; 5% FBS; 3% HEPES; 42% agarosa), enfriadas durante 20 min, y re-incubadas en su ambiente original humidificado 37°C, 5% CO 2. Después de la aplicación de la superposición, las placas fueron monitoreadas periódicamente utilizando un microscopio de fluorescencia invertido hasta que se presenciaron los primeros signos de expresión de GFP (~6-9.5 hr post-infección, dependiendo de la línea celular y el virus bajo investigación). A partir de ese momento, un subconjunto cuadrado del centro de cada pozo (compuesto por 64 o 36 sub-marcos y que correspondía aproximadamente al 60% y 40% del espacio de pozo entero) fue fotografiado periódicamente, utilizando una plataforma CellInsight CX5 High Content Screening (HCS) con un objetivo aéreo 4X (ThermoFisher, Inc, Waltham, MA). Los ajustes de microscopios se mantuvieron estándar en todos los ensayos, con tiempo de exposición fijado en 0,0006 s para cada imagen. Se implicó un canal de color, de tal manera que las imágenes producidas muestran células que expresan GFP en células blancas y no GFP en negro (figura 1-figura suplemento 1). Los pozos fueron fotografiados en rotación, con la mayor frecuencia posible, desde el inicio de la expresión GFP hasta el momento en que la mayoría de las células del pozo fueron consideradas muertas, la expresión GFP ya no pudo ser detectada, o la terminación temprana fue deseada para permitir la tinción de Hoechst. En el caso de las células PaKiT01 infectadas con rVSV-EBOV, donde se estableció una infección aparentemente persistente, el ensayo fue terminado después de 200+ horas (8+ días) de observación continua. Al finalizar todos los ensayos, las células fueron fijas en formaldehído (4% durante 15 min), incubadas con mancha Hoechst (0,0005% durante 15 min) (ThermoFisher, Inc, Waltham, MA), luego imágenes en 4X en la plataforma CellInsight CX5 High Content Screening (HCS). Un canal de color fue permitido de tal manera que las imágenes producidas mostraron núcleos vivos en células blancas y muertas en negro. Colores de la mancha Hoechst ADN celular, y la infección viral se cree que interfiere con la claridad de la mancha (Dembowski y DeLuca, 2015). Como tal, la terminación de la infección, la fijación celular y la tinción Hoechst permite la generación de una serie de tiempo áspero de células vivas no infecciosas (es decir, susceptibles + células antivirales) para complementar las imágenes que produjeron series temporales de proporciones infecciosas. Debido a la incertidumbre sobre el estado epidémico exacto de las células manchadas de Hoechst (es decir, las células expuestas pero aún no infecciosas pueden todavía mancharse), elegimos adaptar nuestros modelos sólo a las series infecciosas de tiempo derivadas de imágenes que expresan GFP y utilizaron las imágenes de mancha Hoechst como un control visual Las imágenes recuperadas de la serie temporal anterior fueron procesadas en forma binaria ('infecciosa' vs. 'no infecciosa' o, para las imágenes manchadas de Hoechst, 'live' vs.'muerta') utilizando el paquete EBImage (Pau et al., 2010) en la versión R 3.6 para MacIntosh, después de métodos más detallados en el archivo suplementario 7. Las imágenes binarias fueron procesadas posteriormente en series temporales de imágenes infecciosas o, para las imágenes manchadas de Hoechst, células vivas utilizando una serie de scripts de recuento de células. Debido a limitaciones logísticas (es decir, muchas placas de ensayos simultáneos de infección en ejecución y sólo un microscopio de imágenes disponible), el curso temporal de la imagen a lo largo de la duración de cada ensayo fue muy variable. Como tal, ajustamos una serie de modelos estadísticos a nuestros datos de imagen procesados para reconstruir valores confiables de la proporción infecciosa de cada pozo por hora para cada ensayo distinto en todas las combinaciones de línea celular-virus-MOI (Figura 1 Para derivar la expresión de R 0, el número básico de patógenos reproductivos in vitro, utilizamos técnicas de Next Generation Matrix (NGM) (Diekmann et al., 1990; Heffernan et al., 2005), empleando Wolfram Mathematica (versión 11.2) como herramienta analítica. R 0 describe el número de nuevas infecciones generadas por una infección existente en una población huésped completamente susceptible; un patógeno invadirá una población cuando R 0 > 1 (archivo suplementario 2). Luego analizamos las propiedades de estabilidad del sistema, explorando la dinámica a través de un rango de espacios de parámetros, utilizando MatCont (versión 2.2) (Dhooge et al. La tasa de natalidad, b, y la tasa de mortalidad natural, m, equilibrio para producir una tasa de crecimiento a nivel de población, de tal manera que es imposible estimar tanto b como m simultáneamente a partir de los datos del tamaño total de la población. Como tal, fijamos b en 025 y estimamos m mediante el ajuste de una versión ausente de infección de nuestro modelo de campo medio a las series de tiempo susceptibles derivadas de la tinción de pozos de control de Hoechst para cada una de las tres líneas celulares (figura 1-figura suplemento 7). Esto produjo una tasa de mortalidad natural, m, correspondiente a una vida útil de aproximadamente 121, 191 y 84 horas, respectivamente, para Vero, RoNi/7.1, y PaKiT01 líneas celulares (figura 1-figura suplemento 7). A continuación, fijamos la tasa de incubación del virus, s, como la inversa de la duración más corta observada del tiempo desde la infección inicial hasta la observación de las primeras células infecciosas a través del microscopio fluorescente para todas las combinaciones de nueve líneas celulares -virus (con un rango de 6 a 9,5 horas). Fijamos a, la tasa de mortalidad inducida por infección, en 1/6, un estándar aceptado para la cinética viral general (Howat et al., 2006), y mantuvimos c, la tasa de regresión celular antiviral a estado susceptible, en 0 para el intervalo de tiempo (< 200 horas) de los ensayos de infección celular experimental. Estimamos valores específicos de línea celular-virus-MOI para b, r, y " mediante el ajuste de la producción determinista de proporciones infecciosas en nuestro modelo de campo medio a la serie completa de resultados estadísticos de todos los ensayos para cada serie de tiempo de cultivo celular El ajuste se realizó minimizando la suma de las diferencias cuadradas entre la salida del modelo determinista y la proporción infecciosa específica de la línea celularvirus-MOI de los datos en cada paso del tiempo. Optimizamos los parámetros para el MOI = 0,001 y 0,0001 simultáneamente para aprovechar la potencia estadística a través de los dos conjuntos de datos, estimando una tasa de transmisión diferente, b, para ensayos que se ejecutan a cada dosis infecciosa pero, cuando proceda, estimando las mismas tasas de r y " a través de las dos series temporales. Utilizamos el solucionador de ecuaciones diferenciales lsoda() en el paquete R deSolve (Soetaert et al., 2010) para obtener soluciones numéricas para el modelo de campo medio y se llevó a cabo la minimización utilizando el algoritmo 'Nelder-Mead' de la función optim() en la base R. Todos los ajustes del modelo se En el caso de ataques fallidos o hessianos indefinidos, generamos una serie de conjeturas aleatorias alrededor de las condiciones de inicio y continuamos la estimación hasta que se lograron los ajustes exitosos. Todas las combinaciones de datos de dieciocho líneas celulares-virus-MOI fueron ajustadas por una versión inmune ausente (" = r = 0) del modelo teórico y, posteriormente, una inmunidad inducida (" = 0; r > 0) e inmunidad constitutiva (" > 0; r > 0) del modelo. Finalmente, comparamos los ajustes a través de cada combinación celular-virus-MOI vía AIC. Al calcular AIC, el número de parámetros ajustados en cada modelo (k) variaba entre los fenotipos inmunes, con un parámetro (b) estimado para supuestos inmunes ausentes, dos (b y r) para supuestos inmunológicos inducidos, y tres (b, r El tamaño de la muestra (n) correspondió al número de pasos de tiempo discretos en todos los ensayos infecciosos empíricos a los que se ajustó el modelo para cada combinación de virus de línea celular. Todos los scripts de ajuste y comparación de modelos están disponibles libremente para su descarga en el siguiente repositorio FigShare: DOI: 10.6084/m9.figshare.8312807. Finalmente, verificamos que todos los campos promedio encajan en un contexto espacial, con el fin de dilucidar más a fondo el papel de las células antivirales en cada serie temporal. Construimos nuestro modelo espacial en C++ implementado en R utilizando los paquetes Rcpp y RcppArmadillo (Eddelbuettel y Francois, 2011; Eddelbuettel y Sanderson, 2017). (2006), modelamos este sistema en una celosía hexagonal bidimensional, utilizando un tiempo epidémico de diez minutos para transiciones del estado celular. En la inicialización de cada simulación, asignamos aleatoriamente una duración de vida útil natural, período de incubación, período de infectividad y tiempo desde el estado antiviral hasta el estado susceptible a todas las células en una monocapa teórica. Las duraciones paramétricas se extrajeron de una distribución normal centrada en la inversa de las respectivas tasas fijas de m, s, a y c, según lo reportado con nuestro modelo de campo medio. Las transiciones que involucraban las tasas inducidas (r) y constitutivas (") de adquisición antiviral se gobernaban probabilísticamente y se ajustaban dinámicamente en cada paso del tiempo basado en el entorno global. Como tal, fijamos estos parámetros en los mismos valores estimados en el modelo de campo medio, y multiplicamos tanto r como " por la proporción global de, respectivamente, células expuestas y susceptibles en un tiempo dado. A diferencia de las tasas de adquisición antiviral, las transiciones que involucran la tasa de nacimiento (b) y la tasa de transmisión (b) ocurrieron probabilísticamente en base al entorno local de cada célula. La tasa de nacimiento, b, se multiplicó por la proporción de células sensibles dentro de una circunferencia de seis vecinos de una célula muerta focal, mientras que b se multiplicó por la proporción de células infecciosas dentro de una vecindad de treinta y seis de una célula susceptible focal, permitiendo así que la transmisión viral se extienda más allá de los límites más cercanos de una célula infecciosa. Para compensar los umbrales más altos de persistencia celular e invasión de virus que se producen en condiciones espaciales locales (Webb et al., 2007), aumentamos la tasa de natalidad, b, y la tasa de transmisión de células a células, b, respectivamente, a seis y diez veces los valores utilizados en el modelo de campo medio (Fichero complementario 4). Derivamos estos aumentos sobre la base de la suposición de que los nacimientos tuvieron lugar exclusivamente sobre la base de interacciones de par-vecino más cercano (las seis células inmediatamente adyacentes a una célula muerta focal), mientras que la transmisión viral se concentró localmente pero incluyó una pequeña contribución global (7,5%), que representa las treinta y seis células que rodean a una susceptible focal. Justificamos estos aumentos y derivamos sus orígenes más adelante en el archivo suplementario 5. simulamos diez series de tiempo espacial estocástico para todas las combinaciones de células-virus bajo las tres suposiciones inmunes a un tamaño de población de Formulario de notificación transparente Disponibilidad de datos Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en el manuscrito y los archivos de soporte. Todas las imágenes y códigos utilizados en este estudio se han puesto a disposición para su descarga en el siguiente Figshare

¿Cuál sería el beneficio de aprender más sobre las defensas de los murciélagos y cómo impulsan la evolución del virus?

CDC Summary 21 MAR 2020,https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/cases-updates/summary.htmlEsta es una situación en rápida evolución y los CDC proporcionarán información y orientación actualizadas a medida que estén disponibles. Actualizado el 21 de marzo de 2020CDC está respondiendo a una pandemia de enfermedades respiratorias que se propagan de persona a persona causada por un coronavirus novedoso (nuevo). La enfermedad ha sido nombrada “enfermedad por coronavirus 2019” (abreviado “COVID-19”). Esta situación plantea un grave riesgo para la salud pública. El gobierno federal está trabajando estrechamente con socios estatales, locales, tribales y territoriales, así como socios de salud pública, para responder a esta situación. Los Estados Unidos a nivel nacional se encuentran en la fase de inicio de la pandemia. Los Estados en los que se está produciendo la propagación comunitaria se encuentran en la fase de aceleración. La duración y gravedad de cada fase pandémica puede variar dependiendo de las características del virus y la respuesta de la salud pública. Los CDC y los laboratorios de salud pública estatales y locales están probando el virus que causa COVID-19. Vea el mapa de pruebas de laboratorio de salud pública de los CDC. Todos los 50 estados han reportado casos de COVID-19 a los CDC. Los casos EE.UU. COVID-19 incluyen:Casos importados en viajerosCasos entre contactos cercanos de un caso conocidoCasos adquiridos por la comunidad donde se desconoce la fuente de la infección. Veintisiete estados de los EE.UU. están reportando alguna difusión comunitaria de COVID-19. Vea los últimos recuentos de casos, muertes y un mapa de los estados con casos El 16 de marzo, la Casa Blanca anunció un programa llamado “15 días para reducir la propagación”, icono pdf icono externo que es un esfuerzo nacional para frenar la propagación de COVID-19 a través de la implementación de distanciamiento social en todos los niveles de la sociedad. Las personas mayores y las personas con condiciones crónicas graves deben tomar precauciones especiales porque están en mayor riesgo de desarrollar una enfermedad COVID-19 grave. Si usted es un proveedor de atención médica, utilice su juicio para determinar si un paciente tiene signos y síntomas compatibles con COVID-19 y si el paciente debe ser probado. Factores a considerar además de los síntomas clínicos pueden incluir:¿El paciente ha viajado recientemente desde una zona afectada? ¿Ha estado el paciente en estrecho contacto con alguien con COVID-19 o con pacientes con neumonía de causa desconocida? Si usted es un proveedor de atención médica o un proveedor de atención de salud pública que cuida a un paciente COVID-19, por favor cuídese y siga los procedimientos de control de infecciones recomendados. Las personas que tienen fiebre o tos deben considerar si pueden tener COVID-19, dependiendo de dónde viven, sus antecedentes de viaje u otras exposiciones. Más de la mitad de los EE.UU. está viendo algún nivel de propagación comunitaria de COVID-19. Las pruebas de COVID-19 pueden ser visitadas a través de proveedores médicos o departamentos de salud pública, pero no hay tratamiento para este virus. La mayoría de las personas tienen enfermedades leves y son capaces de recuperarse en casa sin atención médica. Para las personas que están enfermas de COVID-19, pero no están lo suficientemente enfermas para ser hospitalizadas, por favor siga las instrucciones de los CDC sobre cómo reducir el riesgo de propagar su enfermedad a otros. Las personas que están levemente Si usted ha estado en China u otra zona afectada o ha estado expuesto a alguien enfermo con COVID-19 en los últimos 14 días, se enfrentará a algunas limitaciones en su movimiento y actividad. Por favor, siga las instrucciones durante este tiempo. Su cooperación es integral a la respuesta de salud pública en curso para tratar de reducir la propagación de este virus. COVID-19 EmergenceCOVID-19 es causada por un coronavirus. Coronavirus son una gran familia de virus que son comunes en las personas y muchas especies diferentes de animales, incluyendo camellos, ganado vacuno, gatos y murciélagos. Rara vez, los coronavirus animales pueden infectar a las personas y luego se propagan entre personas como MERS-CoV, SARS-CoV, y ahora con este nuevo virus (llamado SARS-CoV-2). El virus SARS-CoV-2 es un betacoronavirus, como MERS-CoV y SA Los tres virus tienen su origen en murciélagos. Las secuencias de los pacientes estadounidenses son similares a la que China publicó inicialmente, sugiriendo una posible aparición reciente de este virus de un reservorio de animales. Al principio, muchos de los pacientes en el epicentro del brote en Wuhan, provincia de Hubei, China tenían algún vínculo con un gran mercado de mariscos y animales vivos, lo que sugiere la propagación animal a persona. Más tarde, un número creciente de pacientes al parecer no tuvieron exposición a los mercados de animales, lo que indica la propagación de persona a persona. La diseminación de persona a persona se informó posteriormente fuera de Hubei y en países fuera de China, incluso en los Estados Unidos. Algunos destinos internacionales ahora tienen una comunidad en curso con el virus que causa COVID-19, al igual que algunas partes de los Estados Unidos. La propagación de la comunidad significa que algunas personas han sido infectadas y no se sabe cómo o dónde se expusieron. SeveridadEl cuadro clínico completo con respecto a COVID-19 no es totalmente conocido.Las enfermedades reportadas han oscilado entre muy leves (incluyendo algunos sin síntomas reportados) a graves, incluyendo enfermedades que resultan en la muerte.Si bien la información hasta ahora sugiere que la mayoría de las enfermedades COVID-19 son leves, un informe externo fuera de China sugiere que las enfermedades graves ocurren en el 16% de los casos.Las personas mayores y las personas de todas las edades con condiciones médicas crónicas graves —como enfermedades del corazón, enfermedades pulmonares y diabetes, por ejemplo— parecen estar en mayor riesgo de desarrollar enfermedades COVID-19 graves. La pandemia de la pandemia de la COVID-19 es un brote global de enfermedad. Las pandemias ocurren cuando un nuevo virus emerge para infectar a las personas y se puede propagar entre las personas de manera sostenible. Debido a que hay poca o ninguna inmunidad preexistente contra el nuevo virus, se propaga por todo el mundo. El virus que causa la COVID-19 está infectando a las personas y extendiéndose fácilmente de persona a persona. Se han detectado casos en la mayoría de los países del mundo y la propagación comunitaria se está detectando en un número creciente de países. El 11 de marzo, el brote de la COVID-19 se caracterizó como una pandemia por el icono externo de la OMS. Esta es la primera pandemia que se sabe que es causada por la aparición de un nuevo coronavirus. En el siglo pasado, ha habido cuatro pandemias causadas por la aparición de nuevos virus de la gripe. Las pandemias de enfermedades respiratorias siguen una cierta progresión delineada en un “Marco de Intervalos Pandémicos”. Las pandemias comienzan con una fase de investigación, seguida de reconocimiento, iniciación y fases de aceleración. El pico de enfermedades ocurre al final de la fase de aceleración, que es seguido por una fase de desaceleración, durante la cual hay una disminución de enfermedades. Diferentes países pueden estar en diferentes fases de la pandemia en cualquier momento y diferentes partes del mismo país también pueden estar en diferentes fases de una pandemia. Hay investigaciones en curso para aprender más. Esta es una situación en rápida evolución y la información se actualizará a medida que esté disponible. Evaluación de riesgosEl riesgo depende de las características del virus, incluyendo lo bien que se propaga entre las personas; la gravedad de la enfermedad resultante; y las medidas médicas u otras disponibles para controlar el impacto del virus (por ejemplo, vacunas o medicamentos que pueden tratar la enfermedad) y el éxito relativo de En ausencia de vacunas o medicamentos de tratamiento, las intervenciones no farmacéuticas se convierten en la estrategia de respuesta más importante. Estas son las intervenciones comunitarias que pueden reducir el impacto de la enfermedad. El riesgo de COVID-19 a los estadounidenses se puede desglosar en riesgo de exposición versus riesgo de enfermedad grave y muerte. Riesgo de exposición:El riesgo inmediato de estar expuesto a este virus es todavía bajo para la mayoría de los estadounidenses, pero a medida que el brote se expande, ese riesgo aumentará. Casos de COVID-19 y casos de propagación comunitaria se están reportando en un número creciente de estados. Las personas en lugares donde la propagación comunitaria continua del virus que causa COVID-19 se ha reportado están en riesgo elevado de exposición, con el nivel de riesgo dependiente de la ubicación. Los trabajadores sanitarios que atienden a pacientes con COVID-19 están en riesgo elevado de exposición. Los viajeros que regresan de lugares internacionales afectados donde la propagación de la comunidad está ocurriendo también están en riesgo elevado de exposición, con el nivel de riesgo dependiente de donde viajaron. Riesgo de enfermedad grave:La información temprana fuera de China, donde COVID-19 comenzó por primera vez, muestra que algunas personas están en mayor riesgo de enfermarse de esta enfermedad. Esto incluye: Adultos mayores, con riesgo que aumenta por la edad. Las personas que tienen enfermedades crónicas graves como:Enfermedad del corazónDiabetesEnfermedad de LungCDC ha desarrollado directrices para ayudar en la evaluación del riesgo y el manejo de las personas con exposición potencial a COVID-19. Qué puede sucederMás casos de COVID-19 son probables que se identifiquen en los Estados Unidos en los próximos días, incluyendo más casos de propagación comunitaria. Los CDC esperan que se produzca una transmisión generalizada de COVID-19 en los Estados Unidos. En los próximos meses, la La transmisión generalizada de COVID-19 podría traducirse en un gran número de personas que necesitan atención médica al mismo tiempo. Las escuelas, guarderías y lugares de trabajo pueden experimentar un mayor absentismo. Las reuniones masivas pueden ser escasamente atendidas o pospuestas. La salud pública y los sistemas de salud pueden sobrecargarse, con tasas elevadas de hospitalizaciones y muertes. Otras infraestructuras críticas, como la aplicación de la ley, los servicios médicos de emergencia y los sectores de la industria del transporte también pueden verse afectados. Los proveedores de atención médica y los hospitales pueden verse abrumados. En este momento, no hay vacuna para proteger contra COVID-19 y no hay medicamentos aprobados para tratarlo. Las intervenciones no farmacéuticas serán la estrategia de respuesta más importante para tratar de retrasar la propagación del virus y reducir el impacto de la enfermedad. El gobierno federal está trabajando en estrecha colaboración con socios estatales, locales, tribales y territoriales, así como socios de salud pública, para responder a esta amenaza de salud pública. Aspectos destacados de la respuesta del CDC CDC estableció un Sistema de Gestión de Incidentes COVID-19 el 7 de enero de 2020. El 21 de enero, el CDC activó su Centro de Operaciones de Emergencia para brindar mejor apoyo continuo a la respuesta del COVID-19. El gobierno de Estados Unidos ha tomado medidas sin precedentes con respecto a los viajes en respuesta a la creciente amenaza de salud pública planteada por este nuevo coronavirus:Los extranjeros que han estado en China, Irán, el Reino Unido, Irlanda y cualquiera de los 26 países europeos en el área Schengen en los últimos 14 días no pueden entrar en los Estados Unidos. Los ciudadanos estadounidenses, residentes y sus familiares inmediatos que han sido cualquiera de esos países en los últimos 14 días pueden entrar en los Estados Unidos, pero están sujetos a vigilancia de la salud y posible cuarentena por un máximo de 14 días. Las personas con mayor riesgo de enfermedad grave de COVID-19 evitan los viajes en crucero y los viajes aéreos no esenciales. Los CDC han emitido orientaciones específicas adicionales sobre los viajes relacionados con COVID-19. Los CDC han emitido orientaciones clínicas, como:Guía clínica para el manejo de pacientes con enfermedad coronaria confirmada (COVID-19). Los CDC también han publicado orientaciones para otros entornos, entre ellos:Preparación para COVID-19: Instalaciones de Cuidados de Largo Plazo, Hogares de EnfermeríaLa interrupción del aislamiento domiciliario para personas con COVID-19CDC ha desplegado equipos multidisciplinarios para apoyar a los departamentos de salud estatales en la identificación de casos, localización de contactos, gestión clínica y comunicaciones públicas. Los CDC han trabajado con socios federales para apoyar el regreso seguro de estadounidenses afectados por COVID-19. Una parte importante del papel de los CDC durante una emergencia de salud pública es desarrollar una prueba para el patógeno y dotar a los laboratorios de salud pública estatales y locales con capacidad de prueba. Los CDC han desarrollado una prueba rRT-PCR para diagnosticar COVID-19. A partir de la noche del 17 de marzo, 89 laboratorios de salud pública estatales y locales en 50 estados, el Distrito de Columbia, Guam y Puerto Rico han verificado con éxito y están utilizando pruebas de diagnóstico Los fabricantes comerciales están produciendo ahora sus propias pruebas. Los CDC han cultivado el virus COVID-19 en cultivo celular, lo cual es necesario para estudios adicionales, incluyendo para la caracterización genética adicional. El virus de cultivo celular fue enviado al repositorio de recursos BEI de NIH para su uso por la amplia comunidad científica. Los CDC también están desarrollando una prueba de serología para COVID-19. Otros recursos disponiblesLos siguientes recursos están disponibles con información sobre COVID-19World Health Organization, Coronavirusexternal icono

¿Cómo se propaga COVID-19?

CDC Summary 21 MAR 2020,https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/cases-updates/summary.htmlEsta es una situación en rápida evolución y los CDC proporcionarán información y orientación actualizadas a medida que estén disponibles. Actualizado el 21 de marzo de 2020CDC está respondiendo a una pandemia de enfermedades respiratorias que se propagan de persona a persona causada por un coronavirus novedoso (nuevo). La enfermedad ha sido nombrada “enfermedad por coronavirus 2019” (abreviado “COVID-19”). Esta situación plantea un grave riesgo para la salud pública. El gobierno federal está trabajando estrechamente con socios estatales, locales, tribales y territoriales, así como socios de salud pública, para responder a esta situación. Los Estados Unidos a nivel nacional se encuentran en la fase de inicio de la pandemia. Los Estados en los que se está produciendo la propagación comunitaria se encuentran en la fase de aceleración. La duración y gravedad de cada fase pandémica puede variar dependiendo de las características del virus y la respuesta de la salud pública. Los CDC y los laboratorios de salud pública estatales y locales están probando el virus que causa COVID-19. Vea el mapa de pruebas de laboratorio de salud pública de los CDC. Todos los 50 estados han reportado casos de COVID-19 a los CDC. Los casos EE.UU. COVID-19 incluyen:Casos importados en viajerosCasos entre contactos cercanos de un caso conocidoCasos adquiridos por la comunidad donde se desconoce la fuente de la infección. Veintisiete estados de los EE.UU. están reportando alguna difusión comunitaria de COVID-19. Vea los últimos recuentos de casos, muertes y un mapa de los estados con casos El 16 de marzo, la Casa Blanca anunció un programa llamado “15 días para reducir la propagación”, icono pdf icono externo que es un esfuerzo nacional para frenar la propagación de COVID-19 a través de la implementación de distanciamiento social en todos los niveles de la sociedad. Las personas mayores y las personas con condiciones crónicas graves deben tomar precauciones especiales porque están en mayor riesgo de desarrollar una enfermedad COVID-19 grave. Si usted es un proveedor de atención médica, utilice su juicio para determinar si un paciente tiene signos y síntomas compatibles con COVID-19 y si el paciente debe ser probado. Factores a considerar además de los síntomas clínicos pueden incluir:¿El paciente ha viajado recientemente desde una zona afectada? ¿Ha estado el paciente en estrecho contacto con alguien con COVID-19 o con pacientes con neumonía de causa desconocida? Si usted es un proveedor de atención médica o un proveedor de atención de salud pública que cuida a un paciente COVID-19, por favor cuídese y siga los procedimientos de control de infecciones recomendados. Las personas que tienen fiebre o tos deben considerar si pueden tener COVID-19, dependiendo de dónde viven, sus antecedentes de viaje u otras exposiciones. Más de la mitad de los EE.UU. está viendo algún nivel de propagación comunitaria de COVID-19. Las pruebas de COVID-19 pueden ser visitadas a través de proveedores médicos o departamentos de salud pública, pero no hay tratamiento para este virus. La mayoría de las personas tienen enfermedades leves y son capaces de recuperarse en casa sin atención médica. Para las personas que están enfermas de COVID-19, pero no están lo suficientemente enfermas para ser hospitalizadas, por favor siga las instrucciones de los CDC sobre cómo reducir el riesgo de propagar su enfermedad a otros. Las personas que están levemente Si usted ha estado en China u otra zona afectada o ha estado expuesto a alguien enfermo con COVID-19 en los últimos 14 días, se enfrentará a algunas limitaciones en su movimiento y actividad. Por favor, siga las instrucciones durante este tiempo. Su cooperación es integral a la respuesta de salud pública en curso para tratar de reducir la propagación de este virus. COVID-19 EmergenceCOVID-19 es causada por un coronavirus. Coronavirus son una gran familia de virus que son comunes en las personas y muchas especies diferentes de animales, incluyendo camellos, ganado vacuno, gatos y murciélagos. Rara vez, los coronavirus animales pueden infectar a las personas y luego se propagan entre personas como MERS-CoV, SARS-CoV, y ahora con este nuevo virus (llamado SARS-CoV-2). El virus SARS-CoV-2 es un betacoronavirus, como MERS-CoV y SA Los tres virus tienen su origen en murciélagos. Las secuencias de los pacientes estadounidenses son similares a la que China publicó inicialmente, sugiriendo una posible aparición reciente de este virus de un reservorio de animales. Al principio, muchos de los pacientes en el epicentro del brote en Wuhan, provincia de Hubei, China tenían algún vínculo con un gran mercado de mariscos y animales vivos, lo que sugiere la propagación animal a persona. Más tarde, un número creciente de pacientes al parecer no tuvieron exposición a los mercados de animales, lo que indica la propagación de persona a persona. La diseminación de persona a persona se informó posteriormente fuera de Hubei y en países fuera de China, incluso en los Estados Unidos. Algunos destinos internacionales ahora tienen una comunidad en curso con el virus que causa COVID-19, al igual que algunas partes de los Estados Unidos. La propagación de la comunidad significa que algunas personas han sido infectadas y no se sabe cómo o dónde se expusieron. SeveridadEl cuadro clínico completo con respecto a COVID-19 no es totalmente conocido.Las enfermedades reportadas han oscilado entre muy leves (incluyendo algunos sin síntomas reportados) a graves, incluyendo enfermedades que resultan en la muerte.Si bien la información hasta ahora sugiere que la mayoría de las enfermedades COVID-19 son leves, un informe externo fuera de China sugiere que las enfermedades graves ocurren en el 16% de los casos.Las personas mayores y las personas de todas las edades con condiciones médicas crónicas graves —como enfermedades del corazón, enfermedades pulmonares y diabetes, por ejemplo— parecen estar en mayor riesgo de desarrollar enfermedades COVID-19 graves. La pandemia de la pandemia de la COVID-19 es un brote global de enfermedad. Las pandemias ocurren cuando un nuevo virus emerge para infectar a las personas y se puede propagar entre las personas de manera sostenible. Debido a que hay poca o ninguna inmunidad preexistente contra el nuevo virus, se propaga por todo el mundo. El virus que causa la COVID-19 está infectando a las personas y extendiéndose fácilmente de persona a persona. Se han detectado casos en la mayoría de los países del mundo y la propagación comunitaria se está detectando en un número creciente de países. El 11 de marzo, el brote de la COVID-19 se caracterizó como una pandemia por el icono externo de la OMS. Esta es la primera pandemia que se sabe que es causada por la aparición de un nuevo coronavirus. En el siglo pasado, ha habido cuatro pandemias causadas por la aparición de nuevos virus de la gripe. Las pandemias de enfermedades respiratorias siguen una cierta progresión delineada en un “Marco de Intervalos Pandémicos”. Las pandemias comienzan con una fase de investigación, seguida de reconocimiento, iniciación y fases de aceleración. El pico de enfermedades ocurre al final de la fase de aceleración, que es seguido por una fase de desaceleración, durante la cual hay una disminución de enfermedades. Diferentes países pueden estar en diferentes fases de la pandemia en cualquier momento y diferentes partes del mismo país también pueden estar en diferentes fases de una pandemia. Hay investigaciones en curso para aprender más. Esta es una situación en rápida evolución y la información se actualizará a medida que esté disponible. Evaluación de riesgosEl riesgo depende de las características del virus, incluyendo lo bien que se propaga entre las personas; la gravedad de la enfermedad resultante; y las medidas médicas u otras disponibles para controlar el impacto del virus (por ejemplo, vacunas o medicamentos que pueden tratar la enfermedad) y el éxito relativo de En ausencia de vacunas o medicamentos de tratamiento, las intervenciones no farmacéuticas se convierten en la estrategia de respuesta más importante. Estas son las intervenciones comunitarias que pueden reducir el impacto de la enfermedad. El riesgo de COVID-19 a los estadounidenses se puede desglosar en riesgo de exposición versus riesgo de enfermedad grave y muerte. Riesgo de exposición:El riesgo inmediato de estar expuesto a este virus es todavía bajo para la mayoría de los estadounidenses, pero a medida que el brote se expande, ese riesgo aumentará. Casos de COVID-19 y casos de propagación comunitaria se están reportando en un número creciente de estados. Las personas en lugares donde la propagación comunitaria continua del virus que causa COVID-19 se ha reportado están en riesgo elevado de exposición, con el nivel de riesgo dependiente de la ubicación. Los trabajadores sanitarios que atienden a pacientes con COVID-19 están en riesgo elevado de exposición. Los viajeros que regresan de lugares internacionales afectados donde la propagación de la comunidad está ocurriendo también están en riesgo elevado de exposición, con el nivel de riesgo dependiente de donde viajaron. Riesgo de enfermedad grave:La información temprana fuera de China, donde COVID-19 comenzó por primera vez, muestra que algunas personas están en mayor riesgo de enfermarse de esta enfermedad. Esto incluye: Adultos mayores, con riesgo que aumenta por la edad. Las personas que tienen enfermedades crónicas graves como:Enfermedad del corazónDiabetesEnfermedad de LungCDC ha desarrollado directrices para ayudar en la evaluación del riesgo y el manejo de las personas con exposición potencial a COVID-19. Qué puede sucederMás casos de COVID-19 son probables que se identifiquen en los Estados Unidos en los próximos días, incluyendo más casos de propagación comunitaria. Los CDC esperan que se produzca una transmisión generalizada de COVID-19 en los Estados Unidos. En los próximos meses, la La transmisión generalizada de COVID-19 podría traducirse en un gran número de personas que necesitan atención médica al mismo tiempo. Las escuelas, guarderías y lugares de trabajo pueden experimentar un mayor absentismo. Las reuniones masivas pueden ser escasamente atendidas o pospuestas. La salud pública y los sistemas de salud pueden sobrecargarse, con tasas elevadas de hospitalizaciones y muertes. Otras infraestructuras críticas, como la aplicación de la ley, los servicios médicos de emergencia y los sectores de la industria del transporte también pueden verse afectados. Los proveedores de atención médica y los hospitales pueden verse abrumados. En este momento, no hay vacuna para proteger contra COVID-19 y no hay medicamentos aprobados para tratarlo. Las intervenciones no farmacéuticas serán la estrategia de respuesta más importante para tratar de retrasar la propagación del virus y reducir el impacto de la enfermedad. El gobierno federal está trabajando en estrecha colaboración con socios estatales, locales, tribales y territoriales, así como socios de salud pública, para responder a esta amenaza de salud pública. Aspectos destacados de la respuesta del CDC CDC estableció un Sistema de Gestión de Incidentes COVID-19 el 7 de enero de 2020. El 21 de enero, el CDC activó su Centro de Operaciones de Emergencia para brindar mejor apoyo continuo a la respuesta del COVID-19. El gobierno de Estados Unidos ha tomado medidas sin precedentes con respecto a los viajes en respuesta a la creciente amenaza de salud pública planteada por este nuevo coronavirus:Los extranjeros que han estado en China, Irán, el Reino Unido, Irlanda y cualquiera de los 26 países europeos en el área Schengen en los últimos 14 días no pueden entrar en los Estados Unidos. Los ciudadanos estadounidenses, residentes y sus familiares inmediatos que han sido cualquiera de esos países en los últimos 14 días pueden entrar en los Estados Unidos, pero están sujetos a vigilancia de la salud y posible cuarentena por un máximo de 14 días. Las personas con mayor riesgo de enfermedad grave de COVID-19 evitan los viajes en crucero y los viajes aéreos no esenciales. Los CDC han emitido orientaciones específicas adicionales sobre los viajes relacionados con COVID-19. Los CDC han emitido orientaciones clínicas, como:Guía clínica para el manejo de pacientes con enfermedad coronaria confirmada (COVID-19). Los CDC también han publicado orientaciones para otros entornos, entre ellos:Preparación para COVID-19: Instalaciones de Cuidados de Largo Plazo, Hogares de EnfermeríaLa interrupción del aislamiento domiciliario para personas con COVID-19CDC ha desplegado equipos multidisciplinarios para apoyar a los departamentos de salud estatales en la identificación de casos, localización de contactos, gestión clínica y comunicaciones públicas. Los CDC han trabajado con socios federales para apoyar el regreso seguro de estadounidenses afectados por COVID-19. Una parte importante del papel de los CDC durante una emergencia de salud pública es desarrollar una prueba para el patógeno y dotar a los laboratorios de salud pública estatales y locales con capacidad de prueba. Los CDC han desarrollado una prueba rRT-PCR para diagnosticar COVID-19. A partir de la noche del 17 de marzo, 89 laboratorios de salud pública estatales y locales en 50 estados, el Distrito de Columbia, Guam y Puerto Rico han verificado con éxito y están utilizando pruebas de diagnóstico Los fabricantes comerciales están produciendo ahora sus propias pruebas. Los CDC han cultivado el virus COVID-19 en cultivo celular, lo cual es necesario para estudios adicionales, incluyendo para la caracterización genética adicional. El virus de cultivo celular fue enviado al repositorio de recursos BEI de NIH para su uso por la amplia comunidad científica. Los CDC también están desarrollando una prueba de serología para COVID-19. Otros recursos disponiblesLos siguientes recursos están disponibles con información sobre COVID-19World Health Organization, Coronavirusexternal icono

¿Cuántos estados en Estados Unidos han reportado casos de COVID-19?

CDC Summary 21 MAR 2020,https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/cases-updates/summary.htmlEsta es una situación en rápida evolución y los CDC proporcionarán información y orientación actualizadas a medida que estén disponibles. Actualizado el 21 de marzo de 2020CDC está respondiendo a una pandemia de enfermedades respiratorias que se propagan de persona a persona causada por un coronavirus novedoso (nuevo). La enfermedad ha sido nombrada “enfermedad por coronavirus 2019” (abreviado “COVID-19”). Esta situación plantea un grave riesgo para la salud pública. El gobierno federal está trabajando estrechamente con socios estatales, locales, tribales y territoriales, así como socios de salud pública, para responder a esta situación. Los Estados Unidos a nivel nacional se encuentran en la fase de inicio de la pandemia. Los Estados en los que se está produciendo la propagación comunitaria se encuentran en la fase de aceleración. La duración y gravedad de cada fase pandémica puede variar dependiendo de las características del virus y la respuesta de la salud pública. Los CDC y los laboratorios de salud pública estatales y locales están probando el virus que causa COVID-19. Vea el mapa de pruebas de laboratorio de salud pública de los CDC. Todos los 50 estados han reportado casos de COVID-19 a los CDC. Los casos EE.UU. COVID-19 incluyen:Casos importados en viajerosCasos entre contactos cercanos de un caso conocidoCasos adquiridos por la comunidad donde se desconoce la fuente de la infección. Veintisiete estados de los EE.UU. están reportando alguna difusión comunitaria de COVID-19. Vea los últimos recuentos de casos, muertes y un mapa de los estados con casos El 16 de marzo, la Casa Blanca anunció un programa llamado “15 días para reducir la propagación”, icono pdf icono externo que es un esfuerzo nacional para frenar la propagación de COVID-19 a través de la implementación de distanciamiento social en todos los niveles de la sociedad. Las personas mayores y las personas con condiciones crónicas graves deben tomar precauciones especiales porque están en mayor riesgo de desarrollar una enfermedad COVID-19 grave. Si usted es un proveedor de atención médica, utilice su juicio para determinar si un paciente tiene signos y síntomas compatibles con COVID-19 y si el paciente debe ser probado. Factores a considerar además de los síntomas clínicos pueden incluir:¿El paciente ha viajado recientemente desde una zona afectada? ¿Ha estado el paciente en estrecho contacto con alguien con COVID-19 o con pacientes con neumonía de causa desconocida? Si usted es un proveedor de atención médica o un proveedor de atención de salud pública que cuida a un paciente COVID-19, por favor cuídese y siga los procedimientos de control de infecciones recomendados. Las personas que tienen fiebre o tos deben considerar si pueden tener COVID-19, dependiendo de dónde viven, sus antecedentes de viaje u otras exposiciones. Más de la mitad de los EE.UU. está viendo algún nivel de propagación comunitaria de COVID-19. Las pruebas de COVID-19 pueden ser visitadas a través de proveedores médicos o departamentos de salud pública, pero no hay tratamiento para este virus. La mayoría de las personas tienen enfermedades leves y son capaces de recuperarse en casa sin atención médica. Para las personas que están enfermas de COVID-19, pero no están lo suficientemente enfermas para ser hospitalizadas, por favor siga las instrucciones de los CDC sobre cómo reducir el riesgo de propagar su enfermedad a otros. Las personas que están levemente Si usted ha estado en China u otra zona afectada o ha estado expuesto a alguien enfermo con COVID-19 en los últimos 14 días, se enfrentará a algunas limitaciones en su movimiento y actividad. Por favor, siga las instrucciones durante este tiempo. Su cooperación es integral a la respuesta de salud pública en curso para tratar de reducir la propagación de este virus. COVID-19 EmergenceCOVID-19 es causada por un coronavirus. Coronavirus son una gran familia de virus que son comunes en las personas y muchas especies diferentes de animales, incluyendo camellos, ganado vacuno, gatos y murciélagos. Rara vez, los coronavirus animales pueden infectar a las personas y luego se propagan entre personas como MERS-CoV, SARS-CoV, y ahora con este nuevo virus (llamado SARS-CoV-2). El virus SARS-CoV-2 es un betacoronavirus, como MERS-CoV y SA Los tres virus tienen su origen en murciélagos. Las secuencias de los pacientes estadounidenses son similares a la que China publicó inicialmente, sugiriendo una posible aparición reciente de este virus de un reservorio de animales. Al principio, muchos de los pacientes en el epicentro del brote en Wuhan, provincia de Hubei, China tenían algún vínculo con un gran mercado de mariscos y animales vivos, lo que sugiere la propagación animal a persona. Más tarde, un número creciente de pacientes al parecer no tuvieron exposición a los mercados de animales, lo que indica la propagación de persona a persona. La diseminación de persona a persona se informó posteriormente fuera de Hubei y en países fuera de China, incluso en los Estados Unidos. Algunos destinos internacionales ahora tienen una comunidad en curso con el virus que causa COVID-19, al igual que algunas partes de los Estados Unidos. La propagación de la comunidad significa que algunas personas han sido infectadas y no se sabe cómo o dónde se expusieron. SeveridadEl cuadro clínico completo con respecto a COVID-19 no es totalmente conocido.Las enfermedades reportadas han oscilado entre muy leves (incluyendo algunos sin síntomas reportados) a graves, incluyendo enfermedades que resultan en la muerte.Si bien la información hasta ahora sugiere que la mayoría de las enfermedades COVID-19 son leves, un informe externo fuera de China sugiere que las enfermedades graves ocurren en el 16% de los casos.Las personas mayores y las personas de todas las edades con condiciones médicas crónicas graves —como enfermedades del corazón, enfermedades pulmonares y diabetes, por ejemplo— parecen estar en mayor riesgo de desarrollar enfermedades COVID-19 graves. La pandemia de la pandemia de la COVID-19 es un brote global de enfermedad. Las pandemias ocurren cuando un nuevo virus emerge para infectar a las personas y se puede propagar entre las personas de manera sostenible. Debido a que hay poca o ninguna inmunidad preexistente contra el nuevo virus, se propaga por todo el mundo. El virus que causa la COVID-19 está infectando a las personas y extendiéndose fácilmente de persona a persona. Se han detectado casos en la mayoría de los países del mundo y la propagación comunitaria se está detectando en un número creciente de países. El 11 de marzo, el brote de la COVID-19 se caracterizó como una pandemia por el icono externo de la OMS. Esta es la primera pandemia que se sabe que es causada por la aparición de un nuevo coronavirus. En el siglo pasado, ha habido cuatro pandemias causadas por la aparición de nuevos virus de la gripe. Las pandemias de enfermedades respiratorias siguen una cierta progresión delineada en un “Marco de Intervalos Pandémicos”. Las pandemias comienzan con una fase de investigación, seguida de reconocimiento, iniciación y fases de aceleración. El pico de enfermedades ocurre al final de la fase de aceleración, que es seguido por una fase de desaceleración, durante la cual hay una disminución de enfermedades. Diferentes países pueden estar en diferentes fases de la pandemia en cualquier momento y diferentes partes del mismo país también pueden estar en diferentes fases de una pandemia. Hay investigaciones en curso para aprender más. Esta es una situación en rápida evolución y la información se actualizará a medida que esté disponible. Evaluación de riesgosEl riesgo depende de las características del virus, incluyendo lo bien que se propaga entre las personas; la gravedad de la enfermedad resultante; y las medidas médicas u otras disponibles para controlar el impacto del virus (por ejemplo, vacunas o medicamentos que pueden tratar la enfermedad) y el éxito relativo de En ausencia de vacunas o medicamentos de tratamiento, las intervenciones no farmacéuticas se convierten en la estrategia de respuesta más importante. Estas son las intervenciones comunitarias que pueden reducir el impacto de la enfermedad. El riesgo de COVID-19 a los estadounidenses se puede desglosar en riesgo de exposición versus riesgo de enfermedad grave y muerte. Riesgo de exposición:El riesgo inmediato de estar expuesto a este virus es todavía bajo para la mayoría de los estadounidenses, pero a medida que el brote se expande, ese riesgo aumentará. Casos de COVID-19 y casos de propagación comunitaria se están reportando en un número creciente de estados. Las personas en lugares donde la propagación comunitaria continua del virus que causa COVID-19 se ha reportado están en riesgo elevado de exposición, con el nivel de riesgo dependiente de la ubicación. Los trabajadores sanitarios que atienden a pacientes con COVID-19 están en riesgo elevado de exposición. Los viajeros que regresan de lugares internacionales afectados donde la propagación de la comunidad está ocurriendo también están en riesgo elevado de exposición, con el nivel de riesgo dependiente de donde viajaron. Riesgo de enfermedad grave:La información temprana fuera de China, donde COVID-19 comenzó por primera vez, muestra que algunas personas están en mayor riesgo de enfermarse de esta enfermedad. Esto incluye: Adultos mayores, con riesgo que aumenta por la edad. Las personas que tienen enfermedades crónicas graves como:Enfermedad del corazónDiabetesEnfermedad de LungCDC ha desarrollado directrices para ayudar en la evaluación del riesgo y el manejo de las personas con exposición potencial a COVID-19. Qué puede sucederMás casos de COVID-19 son probables que se identifiquen en los Estados Unidos en los próximos días, incluyendo más casos de propagación comunitaria. Los CDC esperan que se produzca una transmisión generalizada de COVID-19 en los Estados Unidos. En los próximos meses, la La transmisión generalizada de COVID-19 podría traducirse en un gran número de personas que necesitan atención médica al mismo tiempo. Las escuelas, guarderías y lugares de trabajo pueden experimentar un mayor absentismo. Las reuniones masivas pueden ser escasamente atendidas o pospuestas. La salud pública y los sistemas de salud pueden sobrecargarse, con tasas elevadas de hospitalizaciones y muertes. Otras infraestructuras críticas, como la aplicación de la ley, los servicios médicos de emergencia y los sectores de la industria del transporte también pueden verse afectados. Los proveedores de atención médica y los hospitales pueden verse abrumados. En este momento, no hay vacuna para proteger contra COVID-19 y no hay medicamentos aprobados para tratarlo. Las intervenciones no farmacéuticas serán la estrategia de respuesta más importante para tratar de retrasar la propagación del virus y reducir el impacto de la enfermedad. El gobierno federal está trabajando en estrecha colaboración con socios estatales, locales, tribales y territoriales, así como socios de salud pública, para responder a esta amenaza de salud pública. Aspectos destacados de la respuesta del CDC CDC estableció un Sistema de Gestión de Incidentes COVID-19 el 7 de enero de 2020. El 21 de enero, el CDC activó su Centro de Operaciones de Emergencia para brindar mejor apoyo continuo a la respuesta del COVID-19. El gobierno de Estados Unidos ha tomado medidas sin precedentes con respecto a los viajes en respuesta a la creciente amenaza de salud pública planteada por este nuevo coronavirus:Los extranjeros que han estado en China, Irán, el Reino Unido, Irlanda y cualquiera de los 26 países europeos en el área Schengen en los últimos 14 días no pueden entrar en los Estados Unidos. Los ciudadanos estadounidenses, residentes y sus familiares inmediatos que han sido cualquiera de esos países en los últimos 14 días pueden entrar en los Estados Unidos, pero están sujetos a vigilancia de la salud y posible cuarentena por un máximo de 14 días. Las personas con mayor riesgo de enfermedad grave de COVID-19 evitan los viajes en crucero y los viajes aéreos no esenciales. Los CDC han emitido orientaciones específicas adicionales sobre los viajes relacionados con COVID-19. Los CDC han emitido orientaciones clínicas, como:Guía clínica para el manejo de pacientes con enfermedad coronaria confirmada (COVID-19). Los CDC también han publicado orientaciones para otros entornos, entre ellos:Preparación para COVID-19: Instalaciones de Cuidados de Largo Plazo, Hogares de EnfermeríaLa interrupción del aislamiento domiciliario para personas con COVID-19CDC ha desplegado equipos multidisciplinarios para apoyar a los departamentos de salud estatales en la identificación de casos, localización de contactos, gestión clínica y comunicaciones públicas. Los CDC han trabajado con socios federales para apoyar el regreso seguro de estadounidenses afectados por COVID-19. Una parte importante del papel de los CDC durante una emergencia de salud pública es desarrollar una prueba para el patógeno y dotar a los laboratorios de salud pública estatales y locales con capacidad de prueba. Los CDC han desarrollado una prueba rRT-PCR para diagnosticar COVID-19. A partir de la noche del 17 de marzo, 89 laboratorios de salud pública estatales y locales en 50 estados, el Distrito de Columbia, Guam y Puerto Rico han verificado con éxito y están utilizando pruebas de diagnóstico Los fabricantes comerciales están produciendo ahora sus propias pruebas. Los CDC han cultivado el virus COVID-19 en cultivo celular, lo cual es necesario para estudios adicionales, incluyendo para la caracterización genética adicional. El virus de cultivo celular fue enviado al repositorio de recursos BEI de NIH para su uso por la amplia comunidad científica. Los CDC también están desarrollando una prueba de serología para COVID-19. Otros recursos disponiblesLos siguientes recursos están disponibles con información sobre COVID-19World Health Organization, Coronavirusexternal icono

¿Cuándo lanzó la Casa Blanca el programa "15 días para reducir la propagación"?

CDC Summary 21 MAR 2020,https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/cases-updates/summary.htmlEsta es una situación en rápida evolución y los CDC proporcionarán información y orientación actualizadas a medida que estén disponibles. Actualizado el 21 de marzo de 2020CDC está respondiendo a una pandemia de enfermedades respiratorias que se propagan de persona a persona causada por un coronavirus novedoso (nuevo). La enfermedad ha sido nombrada “enfermedad por coronavirus 2019” (abreviado “COVID-19”). Esta situación plantea un grave riesgo para la salud pública. El gobierno federal está trabajando estrechamente con socios estatales, locales, tribales y territoriales, así como socios de salud pública, para responder a esta situación. Los Estados Unidos a nivel nacional se encuentran en la fase de inicio de la pandemia. Los Estados en los que se está produciendo la propagación comunitaria se encuentran en la fase de aceleración. La duración y gravedad de cada fase pandémica puede variar dependiendo de las características del virus y la respuesta de la salud pública. Los CDC y los laboratorios de salud pública estatales y locales están probando el virus que causa COVID-19. Vea el mapa de pruebas de laboratorio de salud pública de los CDC. Todos los 50 estados han reportado casos de COVID-19 a los CDC. Los casos EE.UU. COVID-19 incluyen:Casos importados en viajerosCasos entre contactos cercanos de un caso conocidoCasos adquiridos por la comunidad donde se desconoce la fuente de la infección. Veintisiete estados de los EE.UU. están reportando alguna difusión comunitaria de COVID-19. Vea los últimos recuentos de casos, muertes y un mapa de los estados con casos El 16 de marzo, la Casa Blanca anunció un programa llamado “15 días para reducir la propagación”, icono pdf icono externo que es un esfuerzo nacional para frenar la propagación de COVID-19 a través de la implementación de distanciamiento social en todos los niveles de la sociedad. Las personas mayores y las personas con condiciones crónicas graves deben tomar precauciones especiales porque están en mayor riesgo de desarrollar una enfermedad COVID-19 grave. Si usted es un proveedor de atención médica, utilice su juicio para determinar si un paciente tiene signos y síntomas compatibles con COVID-19 y si el paciente debe ser probado. Factores a considerar además de los síntomas clínicos pueden incluir:¿El paciente ha viajado recientemente desde una zona afectada? ¿Ha estado el paciente en estrecho contacto con alguien con COVID-19 o con pacientes con neumonía de causa desconocida? Si usted es un proveedor de atención médica o un proveedor de atención de salud pública que cuida a un paciente COVID-19, por favor cuídese y siga los procedimientos de control de infecciones recomendados. Las personas que tienen fiebre o tos deben considerar si pueden tener COVID-19, dependiendo de dónde viven, sus antecedentes de viaje u otras exposiciones. Más de la mitad de los EE.UU. está viendo algún nivel de propagación comunitaria de COVID-19. Las pruebas de COVID-19 pueden ser visitadas a través de proveedores médicos o departamentos de salud pública, pero no hay tratamiento para este virus. La mayoría de las personas tienen enfermedades leves y son capaces de recuperarse en casa sin atención médica. Para las personas que están enfermas de COVID-19, pero no están lo suficientemente enfermas para ser hospitalizadas, por favor siga las instrucciones de los CDC sobre cómo reducir el riesgo de propagar su enfermedad a otros. Las personas que están levemente Si usted ha estado en China u otra zona afectada o ha estado expuesto a alguien enfermo con COVID-19 en los últimos 14 días, se enfrentará a algunas limitaciones en su movimiento y actividad. Por favor, siga las instrucciones durante este tiempo. Su cooperación es integral a la respuesta de salud pública en curso para tratar de reducir la propagación de este virus. COVID-19 EmergenceCOVID-19 es causada por un coronavirus. Coronavirus son una gran familia de virus que son comunes en las personas y muchas especies diferentes de animales, incluyendo camellos, ganado vacuno, gatos y murciélagos. Rara vez, los coronavirus animales pueden infectar a las personas y luego se propagan entre personas como MERS-CoV, SARS-CoV, y ahora con este nuevo virus (llamado SARS-CoV-2). El virus SARS-CoV-2 es un betacoronavirus, como MERS-CoV y SA Los tres virus tienen su origen en murciélagos. Las secuencias de los pacientes estadounidenses son similares a la que China publicó inicialmente, sugiriendo una posible aparición reciente de este virus de un reservorio de animales. Al principio, muchos de los pacientes en el epicentro del brote en Wuhan, provincia de Hubei, China tenían algún vínculo con un gran mercado de mariscos y animales vivos, lo que sugiere la propagación animal a persona. Más tarde, un número creciente de pacientes al parecer no tuvieron exposición a los mercados de animales, lo que indica la propagación de persona a persona. La diseminación de persona a persona se informó posteriormente fuera de Hubei y en países fuera de China, incluso en los Estados Unidos. Algunos destinos internacionales ahora tienen una comunidad en curso con el virus que causa COVID-19, al igual que algunas partes de los Estados Unidos. La propagación de la comunidad significa que algunas personas han sido infectadas y no se sabe cómo o dónde se expusieron. SeveridadEl cuadro clínico completo con respecto a COVID-19 no es totalmente conocido.Las enfermedades reportadas han oscilado entre muy leves (incluyendo algunos sin síntomas reportados) a graves, incluyendo enfermedades que resultan en la muerte.Si bien la información hasta ahora sugiere que la mayoría de las enfermedades COVID-19 son leves, un informe externo fuera de China sugiere que las enfermedades graves ocurren en el 16% de los casos.Las personas mayores y las personas de todas las edades con condiciones médicas crónicas graves —como enfermedades del corazón, enfermedades pulmonares y diabetes, por ejemplo— parecen estar en mayor riesgo de desarrollar enfermedades COVID-19 graves. La pandemia de la pandemia de la COVID-19 es un brote global de enfermedad. Las pandemias ocurren cuando un nuevo virus emerge para infectar a las personas y se puede propagar entre las personas de manera sostenible. Debido a que hay poca o ninguna inmunidad preexistente contra el nuevo virus, se propaga por todo el mundo. El virus que causa la COVID-19 está infectando a las personas y extendiéndose fácilmente de persona a persona. Se han detectado casos en la mayoría de los países del mundo y la propagación comunitaria se está detectando en un número creciente de países. El 11 de marzo, el brote de la COVID-19 se caracterizó como una pandemia por el icono externo de la OMS. Esta es la primera pandemia que se sabe que es causada por la aparición de un nuevo coronavirus. En el siglo pasado, ha habido cuatro pandemias causadas por la aparición de nuevos virus de la gripe. Las pandemias de enfermedades respiratorias siguen una cierta progresión delineada en un “Marco de Intervalos Pandémicos”. Las pandemias comienzan con una fase de investigación, seguida de reconocimiento, iniciación y fases de aceleración. El pico de enfermedades ocurre al final de la fase de aceleración, que es seguido por una fase de desaceleración, durante la cual hay una disminución de enfermedades. Diferentes países pueden estar en diferentes fases de la pandemia en cualquier momento y diferentes partes del mismo país también pueden estar en diferentes fases de una pandemia. Hay investigaciones en curso para aprender más. Esta es una situación en rápida evolución y la información se actualizará a medida que esté disponible. Evaluación de riesgosEl riesgo depende de las características del virus, incluyendo lo bien que se propaga entre las personas; la gravedad de la enfermedad resultante; y las medidas médicas u otras disponibles para controlar el impacto del virus (por ejemplo, vacunas o medicamentos que pueden tratar la enfermedad) y el éxito relativo de En ausencia de vacunas o medicamentos de tratamiento, las intervenciones no farmacéuticas se convierten en la estrategia de respuesta más importante. Estas son las intervenciones comunitarias que pueden reducir el impacto de la enfermedad. El riesgo de COVID-19 a los estadounidenses se puede desglosar en riesgo de exposición versus riesgo de enfermedad grave y muerte. Riesgo de exposición:El riesgo inmediato de estar expuesto a este virus es todavía bajo para la mayoría de los estadounidenses, pero a medida que el brote se expande, ese riesgo aumentará. Casos de COVID-19 y casos de propagación comunitaria se están reportando en un número creciente de estados. Las personas en lugares donde la propagación comunitaria continua del virus que causa COVID-19 se ha reportado están en riesgo elevado de exposición, con el nivel de riesgo dependiente de la ubicación. Los trabajadores sanitarios que atienden a pacientes con COVID-19 están en riesgo elevado de exposición. Los viajeros que regresan de lugares internacionales afectados donde la propagación de la comunidad está ocurriendo también están en riesgo elevado de exposición, con el nivel de riesgo dependiente de donde viajaron. Riesgo de enfermedad grave:La información temprana fuera de China, donde COVID-19 comenzó por primera vez, muestra que algunas personas están en mayor riesgo de enfermarse de esta enfermedad. Esto incluye: Adultos mayores, con riesgo que aumenta por la edad. Las personas que tienen enfermedades crónicas graves como:Enfermedad del corazónDiabetesEnfermedad de LungCDC ha desarrollado directrices para ayudar en la evaluación del riesgo y el manejo de las personas con exposición potencial a COVID-19. Qué puede sucederMás casos de COVID-19 son probables que se identifiquen en los Estados Unidos en los próximos días, incluyendo más casos de propagación comunitaria. Los CDC esperan que se produzca una transmisión generalizada de COVID-19 en los Estados Unidos. En los próximos meses, la La transmisión generalizada de COVID-19 podría traducirse en un gran número de personas que necesitan atención médica al mismo tiempo. Las escuelas, guarderías y lugares de trabajo pueden experimentar un mayor absentismo. Las reuniones masivas pueden ser escasamente atendidas o pospuestas. La salud pública y los sistemas de salud pueden sobrecargarse, con tasas elevadas de hospitalizaciones y muertes. Otras infraestructuras críticas, como la aplicación de la ley, los servicios médicos de emergencia y los sectores de la industria del transporte también pueden verse afectados. Los proveedores de atención médica y los hospitales pueden verse abrumados. En este momento, no hay vacuna para proteger contra COVID-19 y no hay medicamentos aprobados para tratarlo. Las intervenciones no farmacéuticas serán la estrategia de respuesta más importante para tratar de retrasar la propagación del virus y reducir el impacto de la enfermedad. El gobierno federal está trabajando en estrecha colaboración con socios estatales, locales, tribales y territoriales, así como socios de salud pública, para responder a esta amenaza de salud pública. Aspectos destacados de la respuesta del CDC CDC estableció un Sistema de Gestión de Incidentes COVID-19 el 7 de enero de 2020. El 21 de enero, el CDC activó su Centro de Operaciones de Emergencia para brindar mejor apoyo continuo a la respuesta del COVID-19. El gobierno de Estados Unidos ha tomado medidas sin precedentes con respecto a los viajes en respuesta a la creciente amenaza de salud pública planteada por este nuevo coronavirus:Los extranjeros que han estado en China, Irán, el Reino Unido, Irlanda y cualquiera de los 26 países europeos en el área Schengen en los últimos 14 días no pueden entrar en los Estados Unidos. Los ciudadanos estadounidenses, residentes y sus familiares inmediatos que han sido cualquiera de esos países en los últimos 14 días pueden entrar en los Estados Unidos, pero están sujetos a vigilancia de la salud y posible cuarentena por un máximo de 14 días. Las personas con mayor riesgo de enfermedad grave de COVID-19 evitan los viajes en crucero y los viajes aéreos no esenciales. Los CDC han emitido orientaciones específicas adicionales sobre los viajes relacionados con COVID-19. Los CDC han emitido orientaciones clínicas, como:Guía clínica para el manejo de pacientes con enfermedad coronaria confirmada (COVID-19). Los CDC también han publicado orientaciones para otros entornos, entre ellos:Preparación para COVID-19: Instalaciones de Cuidados de Largo Plazo, Hogares de EnfermeríaLa interrupción del aislamiento domiciliario para personas con COVID-19CDC ha desplegado equipos multidisciplinarios para apoyar a los departamentos de salud estatales en la identificación de casos, localización de contactos, gestión clínica y comunicaciones públicas. Los CDC han trabajado con socios federales para apoyar el regreso seguro de estadounidenses afectados por COVID-19. Una parte importante del papel de los CDC durante una emergencia de salud pública es desarrollar una prueba para el patógeno y dotar a los laboratorios de salud pública estatales y locales con capacidad de prueba. Los CDC han desarrollado una prueba rRT-PCR para diagnosticar COVID-19. A partir de la noche del 17 de marzo, 89 laboratorios de salud pública estatales y locales en 50 estados, el Distrito de Columbia, Guam y Puerto Rico han verificado con éxito y están utilizando pruebas de diagnóstico Los fabricantes comerciales están produciendo ahora sus propias pruebas. Los CDC han cultivado el virus COVID-19 en cultivo celular, lo cual es necesario para estudios adicionales, incluyendo para la caracterización genética adicional. El virus de cultivo celular fue enviado al repositorio de recursos BEI de NIH para su uso por la amplia comunidad científica. Los CDC también están desarrollando una prueba de serología para COVID-19. Otros recursos disponiblesLos siguientes recursos están disponibles con información sobre COVID-19World Health Organization, Coronavirusexternal icono

¿Qué tipo de virus es el SARS-CoV-2?

CDC Summary 21 MAR 2020,https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/cases-updates/summary.htmlEsta es una situación en rápida evolución y los CDC proporcionarán información y orientación actualizadas a medida que estén disponibles. Actualizado el 21 de marzo de 2020CDC está respondiendo a una pandemia de enfermedades respiratorias que se propagan de persona a persona causada por un coronavirus novedoso (nuevo). La enfermedad ha sido nombrada “enfermedad por coronavirus 2019” (abreviado “COVID-19”). Esta situación plantea un grave riesgo para la salud pública. El gobierno federal está trabajando estrechamente con socios estatales, locales, tribales y territoriales, así como socios de salud pública, para responder a esta situación. Los Estados Unidos a nivel nacional se encuentran en la fase de inicio de la pandemia. Los Estados en los que se está produciendo la propagación comunitaria se encuentran en la fase de aceleración. La duración y gravedad de cada fase pandémica puede variar dependiendo de las características del virus y la respuesta de la salud pública. Los CDC y los laboratorios de salud pública estatales y locales están probando el virus que causa COVID-19. Vea el mapa de pruebas de laboratorio de salud pública de los CDC. Todos los 50 estados han reportado casos de COVID-19 a los CDC. Los casos EE.UU. COVID-19 incluyen:Casos importados en viajerosCasos entre contactos cercanos de un caso conocidoCasos adquiridos por la comunidad donde se desconoce la fuente de la infección. Veintisiete estados de los EE.UU. están reportando alguna difusión comunitaria de COVID-19. Vea los últimos recuentos de casos, muertes y un mapa de los estados con casos El 16 de marzo, la Casa Blanca anunció un programa llamado “15 días para reducir la propagación”, icono pdf icono externo que es un esfuerzo nacional para frenar la propagación de COVID-19 a través de la implementación de distanciamiento social en todos los niveles de la sociedad. Las personas mayores y las personas con condiciones crónicas graves deben tomar precauciones especiales porque están en mayor riesgo de desarrollar una enfermedad COVID-19 grave. Si usted es un proveedor de atención médica, utilice su juicio para determinar si un paciente tiene signos y síntomas compatibles con COVID-19 y si el paciente debe ser probado. Factores a considerar además de los síntomas clínicos pueden incluir:¿El paciente ha viajado recientemente desde una zona afectada? ¿Ha estado el paciente en estrecho contacto con alguien con COVID-19 o con pacientes con neumonía de causa desconocida? Si usted es un proveedor de atención médica o un proveedor de atención de salud pública que cuida a un paciente COVID-19, por favor cuídese y siga los procedimientos de control de infecciones recomendados. Las personas que tienen fiebre o tos deben considerar si pueden tener COVID-19, dependiendo de dónde viven, sus antecedentes de viaje u otras exposiciones. Más de la mitad de los EE.UU. está viendo algún nivel de propagación comunitaria de COVID-19. Las pruebas de COVID-19 pueden ser visitadas a través de proveedores médicos o departamentos de salud pública, pero no hay tratamiento para este virus. La mayoría de las personas tienen enfermedades leves y son capaces de recuperarse en casa sin atención médica. Para las personas que están enfermas de COVID-19, pero no están lo suficientemente enfermas para ser hospitalizadas, por favor siga las instrucciones de los CDC sobre cómo reducir el riesgo de propagar su enfermedad a otros. Las personas que están levemente Si usted ha estado en China u otra zona afectada o ha estado expuesto a alguien enfermo con COVID-19 en los últimos 14 días, se enfrentará a algunas limitaciones en su movimiento y actividad. Por favor, siga las instrucciones durante este tiempo. Su cooperación es integral a la respuesta de salud pública en curso para tratar de reducir la propagación de este virus. COVID-19 EmergenceCOVID-19 es causada por un coronavirus. Coronavirus son una gran familia de virus que son comunes en las personas y muchas especies diferentes de animales, incluyendo camellos, ganado vacuno, gatos y murciélagos. Rara vez, los coronavirus animales pueden infectar a las personas y luego se propagan entre personas como MERS-CoV, SARS-CoV, y ahora con este nuevo virus (llamado SARS-CoV-2). El virus SARS-CoV-2 es un betacoronavirus, como MERS-CoV y SA Los tres virus tienen su origen en murciélagos. Las secuencias de los pacientes estadounidenses son similares a la que China publicó inicialmente, sugiriendo una posible aparición reciente de este virus de un reservorio de animales. Al principio, muchos de los pacientes en el epicentro del brote en Wuhan, provincia de Hubei, China tenían algún vínculo con un gran mercado de mariscos y animales vivos, lo que sugiere la propagación animal a persona. Más tarde, un número creciente de pacientes al parecer no tuvieron exposición a los mercados de animales, lo que indica la propagación de persona a persona. La diseminación de persona a persona se informó posteriormente fuera de Hubei y en países fuera de China, incluso en los Estados Unidos. Algunos destinos internacionales ahora tienen una comunidad en curso con el virus que causa COVID-19, al igual que algunas partes de los Estados Unidos. La propagación de la comunidad significa que algunas personas han sido infectadas y no se sabe cómo o dónde se expusieron. SeveridadEl cuadro clínico completo con respecto a COVID-19 no es totalmente conocido.Las enfermedades reportadas han oscilado entre muy leves (incluyendo algunos sin síntomas reportados) a graves, incluyendo enfermedades que resultan en la muerte.Si bien la información hasta ahora sugiere que la mayoría de las enfermedades COVID-19 son leves, un informe externo fuera de China sugiere que las enfermedades graves ocurren en el 16% de los casos.Las personas mayores y las personas de todas las edades con condiciones médicas crónicas graves —como enfermedades del corazón, enfermedades pulmonares y diabetes, por ejemplo— parecen estar en mayor riesgo de desarrollar enfermedades COVID-19 graves. La pandemia de la pandemia de la COVID-19 es un brote global de enfermedad. Las pandemias ocurren cuando un nuevo virus emerge para infectar a las personas y se puede propagar entre las personas de manera sostenible. Debido a que hay poca o ninguna inmunidad preexistente contra el nuevo virus, se propaga por todo el mundo. El virus que causa la COVID-19 está infectando a las personas y extendiéndose fácilmente de persona a persona. Se han detectado casos en la mayoría de los países del mundo y la propagación comunitaria se está detectando en un número creciente de países. El 11 de marzo, el brote de la COVID-19 se caracterizó como una pandemia por el icono externo de la OMS. Esta es la primera pandemia que se sabe que es causada por la aparición de un nuevo coronavirus. En el siglo pasado, ha habido cuatro pandemias causadas por la aparición de nuevos virus de la gripe. Las pandemias de enfermedades respiratorias siguen una cierta progresión delineada en un “Marco de Intervalos Pandémicos”. Las pandemias comienzan con una fase de investigación, seguida de reconocimiento, iniciación y fases de aceleración. El pico de enfermedades ocurre al final de la fase de aceleración, que es seguido por una fase de desaceleración, durante la cual hay una disminución de enfermedades. Diferentes países pueden estar en diferentes fases de la pandemia en cualquier momento y diferentes partes del mismo país también pueden estar en diferentes fases de una pandemia. Hay investigaciones en curso para aprender más. Esta es una situación en rápida evolución y la información se actualizará a medida que esté disponible. Evaluación de riesgosEl riesgo depende de las características del virus, incluyendo lo bien que se propaga entre las personas; la gravedad de la enfermedad resultante; y las medidas médicas u otras disponibles para controlar el impacto del virus (por ejemplo, vacunas o medicamentos que pueden tratar la enfermedad) y el éxito relativo de En ausencia de vacunas o medicamentos de tratamiento, las intervenciones no farmacéuticas se convierten en la estrategia de respuesta más importante. Estas son las intervenciones comunitarias que pueden reducir el impacto de la enfermedad. El riesgo de COVID-19 a los estadounidenses se puede desglosar en riesgo de exposición versus riesgo de enfermedad grave y muerte. Riesgo de exposición:El riesgo inmediato de estar expuesto a este virus es todavía bajo para la mayoría de los estadounidenses, pero a medida que el brote se expande, ese riesgo aumentará. Casos de COVID-19 y casos de propagación comunitaria se están reportando en un número creciente de estados. Las personas en lugares donde la propagación comunitaria continua del virus que causa COVID-19 se ha reportado están en riesgo elevado de exposición, con el nivel de riesgo dependiente de la ubicación. Los trabajadores sanitarios que atienden a pacientes con COVID-19 están en riesgo elevado de exposición. Los viajeros que regresan de lugares internacionales afectados donde la propagación de la comunidad está ocurriendo también están en riesgo elevado de exposición, con el nivel de riesgo dependiente de donde viajaron. Riesgo de enfermedad grave:La información temprana fuera de China, donde COVID-19 comenzó por primera vez, muestra que algunas personas están en mayor riesgo de enfermarse de esta enfermedad. Esto incluye: Adultos mayores, con riesgo que aumenta por la edad. Las personas que tienen enfermedades crónicas graves como:Enfermedad del corazónDiabetesEnfermedad de LungCDC ha desarrollado directrices para ayudar en la evaluación del riesgo y el manejo de las personas con exposición potencial a COVID-19. Qué puede sucederMás casos de COVID-19 son probables que se identifiquen en los Estados Unidos en los próximos días, incluyendo más casos de propagación comunitaria. Los CDC esperan que se produzca una transmisión generalizada de COVID-19 en los Estados Unidos. En los próximos meses, la La transmisión generalizada de COVID-19 podría traducirse en un gran número de personas que necesitan atención médica al mismo tiempo. Las escuelas, guarderías y lugares de trabajo pueden experimentar un mayor absentismo. Las reuniones masivas pueden ser escasamente atendidas o pospuestas. La salud pública y los sistemas de salud pueden sobrecargarse, con tasas elevadas de hospitalizaciones y muertes. Otras infraestructuras críticas, como la aplicación de la ley, los servicios médicos de emergencia y los sectores de la industria del transporte también pueden verse afectados. Los proveedores de atención médica y los hospitales pueden verse abrumados. En este momento, no hay vacuna para proteger contra COVID-19 y no hay medicamentos aprobados para tratarlo. Las intervenciones no farmacéuticas serán la estrategia de respuesta más importante para tratar de retrasar la propagación del virus y reducir el impacto de la enfermedad. El gobierno federal está trabajando en estrecha colaboración con socios estatales, locales, tribales y territoriales, así como socios de salud pública, para responder a esta amenaza de salud pública. Aspectos destacados de la respuesta del CDC CDC estableció un Sistema de Gestión de Incidentes COVID-19 el 7 de enero de 2020. El 21 de enero, el CDC activó su Centro de Operaciones de Emergencia para brindar mejor apoyo continuo a la respuesta del COVID-19. El gobierno de Estados Unidos ha tomado medidas sin precedentes con respecto a los viajes en respuesta a la creciente amenaza de salud pública planteada por este nuevo coronavirus:Los extranjeros que han estado en China, Irán, el Reino Unido, Irlanda y cualquiera de los 26 países europeos en el área Schengen en los últimos 14 días no pueden entrar en los Estados Unidos. Los ciudadanos estadounidenses, residentes y sus familiares inmediatos que han sido cualquiera de esos países en los últimos 14 días pueden entrar en los Estados Unidos, pero están sujetos a vigilancia de la salud y posible cuarentena por un máximo de 14 días. Las personas con mayor riesgo de enfermedad grave de COVID-19 evitan los viajes en crucero y los viajes aéreos no esenciales. Los CDC han emitido orientaciones específicas adicionales sobre los viajes relacionados con COVID-19. Los CDC han emitido orientaciones clínicas, como:Guía clínica para el manejo de pacientes con enfermedad coronaria confirmada (COVID-19). Los CDC también han publicado orientaciones para otros entornos, entre ellos:Preparación para COVID-19: Instalaciones de Cuidados de Largo Plazo, Hogares de EnfermeríaLa interrupción del aislamiento domiciliario para personas con COVID-19CDC ha desplegado equipos multidisciplinarios para apoyar a los departamentos de salud estatales en la identificación de casos, localización de contactos, gestión clínica y comunicaciones públicas. Los CDC han trabajado con socios federales para apoyar el regreso seguro de estadounidenses afectados por COVID-19. Una parte importante del papel de los CDC durante una emergencia de salud pública es desarrollar una prueba para el patógeno y dotar a los laboratorios de salud pública estatales y locales con capacidad de prueba. Los CDC han desarrollado una prueba rRT-PCR para diagnosticar COVID-19. A partir de la noche del 17 de marzo, 89 laboratorios de salud pública estatales y locales en 50 estados, el Distrito de Columbia, Guam y Puerto Rico han verificado con éxito y están utilizando pruebas de diagnóstico Los fabricantes comerciales están produciendo ahora sus propias pruebas. Los CDC han cultivado el virus COVID-19 en cultivo celular, lo cual es necesario para estudios adicionales, incluyendo para la caracterización genética adicional. El virus de cultivo celular fue enviado al repositorio de recursos BEI de NIH para su uso por la amplia comunidad científica. Los CDC también están desarrollando una prueba de serología para COVID-19. Otros recursos disponiblesLos siguientes recursos están disponibles con información sobre COVID-19World Health Organization, Coronavirusexternal icono

¿En qué fase se produce el pico de la pandemia?

CDC Summary 21 MAR 2020,https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/cases-updates/summary.htmlEsta es una situación en rápida evolución y los CDC proporcionarán información y orientación actualizadas a medida que estén disponibles. Actualizado el 21 de marzo de 2020CDC está respondiendo a una pandemia de enfermedades respiratorias que se propagan de persona a persona causada por un coronavirus novedoso (nuevo). La enfermedad ha sido nombrada “enfermedad por coronavirus 2019” (abreviado “COVID-19”). Esta situación plantea un grave riesgo para la salud pública. El gobierno federal está trabajando estrechamente con socios estatales, locales, tribales y territoriales, así como socios de salud pública, para responder a esta situación. Los Estados Unidos a nivel nacional se encuentran en la fase de inicio de la pandemia. Los Estados en los que se está produciendo la propagación comunitaria se encuentran en la fase de aceleración. La duración y gravedad de cada fase pandémica puede variar dependiendo de las características del virus y la respuesta de la salud pública. Los CDC y los laboratorios de salud pública estatales y locales están probando el virus que causa COVID-19. Vea el mapa de pruebas de laboratorio de salud pública de los CDC. Todos los 50 estados han reportado casos de COVID-19 a los CDC. Los casos EE.UU. COVID-19 incluyen:Casos importados en viajerosCasos entre contactos cercanos de un caso conocidoCasos adquiridos por la comunidad donde se desconoce la fuente de la infección. Veintisiete estados de los EE.UU. están reportando alguna difusión comunitaria de COVID-19. Vea los últimos recuentos de casos, muertes y un mapa de los estados con casos El 16 de marzo, la Casa Blanca anunció un programa llamado “15 días para reducir la propagación”, icono pdf icono externo que es un esfuerzo nacional para frenar la propagación de COVID-19 a través de la implementación de distanciamiento social en todos los niveles de la sociedad. Las personas mayores y las personas con condiciones crónicas graves deben tomar precauciones especiales porque están en mayor riesgo de desarrollar una enfermedad COVID-19 grave. Si usted es un proveedor de atención médica, utilice su juicio para determinar si un paciente tiene signos y síntomas compatibles con COVID-19 y si el paciente debe ser probado. Factores a considerar además de los síntomas clínicos pueden incluir:¿El paciente ha viajado recientemente desde una zona afectada? ¿Ha estado el paciente en estrecho contacto con alguien con COVID-19 o con pacientes con neumonía de causa desconocida? Si usted es un proveedor de atención médica o un proveedor de atención de salud pública que cuida a un paciente COVID-19, por favor cuídese y siga los procedimientos de control de infecciones recomendados. Las personas que tienen fiebre o tos deben considerar si pueden tener COVID-19, dependiendo de dónde viven, sus antecedentes de viaje u otras exposiciones. Más de la mitad de los EE.UU. está viendo algún nivel de propagación comunitaria de COVID-19. Las pruebas de COVID-19 pueden ser visitadas a través de proveedores médicos o departamentos de salud pública, pero no hay tratamiento para este virus. La mayoría de las personas tienen enfermedades leves y son capaces de recuperarse en casa sin atención médica. Para las personas que están enfermas de COVID-19, pero no están lo suficientemente enfermas para ser hospitalizadas, por favor siga las instrucciones de los CDC sobre cómo reducir el riesgo de propagar su enfermedad a otros. Las personas que están levemente Si usted ha estado en China u otra zona afectada o ha estado expuesto a alguien enfermo con COVID-19 en los últimos 14 días, se enfrentará a algunas limitaciones en su movimiento y actividad. Por favor, siga las instrucciones durante este tiempo. Su cooperación es integral a la respuesta de salud pública en curso para tratar de reducir la propagación de este virus. COVID-19 EmergenceCOVID-19 es causada por un coronavirus. Coronavirus son una gran familia de virus que son comunes en las personas y muchas especies diferentes de animales, incluyendo camellos, ganado vacuno, gatos y murciélagos. Rara vez, los coronavirus animales pueden infectar a las personas y luego se propagan entre personas como MERS-CoV, SARS-CoV, y ahora con este nuevo virus (llamado SARS-CoV-2). El virus SARS-CoV-2 es un betacoronavirus, como MERS-CoV y SA Los tres virus tienen su origen en murciélagos. Las secuencias de los pacientes estadounidenses son similares a la que China publicó inicialmente, sugiriendo una posible aparición reciente de este virus de un reservorio de animales. Al principio, muchos de los pacientes en el epicentro del brote en Wuhan, provincia de Hubei, China tenían algún vínculo con un gran mercado de mariscos y animales vivos, lo que sugiere la propagación animal a persona. Más tarde, un número creciente de pacientes al parecer no tuvieron exposición a los mercados de animales, lo que indica la propagación de persona a persona. La diseminación de persona a persona se informó posteriormente fuera de Hubei y en países fuera de China, incluso en los Estados Unidos. Algunos destinos internacionales ahora tienen una comunidad en curso con el virus que causa COVID-19, al igual que algunas partes de los Estados Unidos. La propagación de la comunidad significa que algunas personas han sido infectadas y no se sabe cómo o dónde se expusieron. SeveridadEl cuadro clínico completo con respecto a COVID-19 no es totalmente conocido.Las enfermedades reportadas han oscilado entre muy leves (incluyendo algunos sin síntomas reportados) a graves, incluyendo enfermedades que resultan en la muerte.Si bien la información hasta ahora sugiere que la mayoría de las enfermedades COVID-19 son leves, un informe externo fuera de China sugiere que las enfermedades graves ocurren en el 16% de los casos.Las personas mayores y las personas de todas las edades con condiciones médicas crónicas graves —como enfermedades del corazón, enfermedades pulmonares y diabetes, por ejemplo— parecen estar en mayor riesgo de desarrollar enfermedades COVID-19 graves. La pandemia de la pandemia de la COVID-19 es un brote global de enfermedad. Las pandemias ocurren cuando un nuevo virus emerge para infectar a las personas y se puede propagar entre las personas de manera sostenible. Debido a que hay poca o ninguna inmunidad preexistente contra el nuevo virus, se propaga por todo el mundo. El virus que causa la COVID-19 está infectando a las personas y extendiéndose fácilmente de persona a persona. Se han detectado casos en la mayoría de los países del mundo y la propagación comunitaria se está detectando en un número creciente de países. El 11 de marzo, el brote de la COVID-19 se caracterizó como una pandemia por el icono externo de la OMS. Esta es la primera pandemia que se sabe que es causada por la aparición de un nuevo coronavirus. En el siglo pasado, ha habido cuatro pandemias causadas por la aparición de nuevos virus de la gripe. Las pandemias de enfermedades respiratorias siguen una cierta progresión delineada en un “Marco de Intervalos Pandémicos”. Las pandemias comienzan con una fase de investigación, seguida de reconocimiento, iniciación y fases de aceleración. El pico de enfermedades ocurre al final de la fase de aceleración, que es seguido por una fase de desaceleración, durante la cual hay una disminución de enfermedades. Diferentes países pueden estar en diferentes fases de la pandemia en cualquier momento y diferentes partes del mismo país también pueden estar en diferentes fases de una pandemia. Hay investigaciones en curso para aprender más. Esta es una situación en rápida evolución y la información se actualizará a medida que esté disponible. Evaluación de riesgosEl riesgo depende de las características del virus, incluyendo lo bien que se propaga entre las personas; la gravedad de la enfermedad resultante; y las medidas médicas u otras disponibles para controlar el impacto del virus (por ejemplo, vacunas o medicamentos que pueden tratar la enfermedad) y el éxito relativo de En ausencia de vacunas o medicamentos de tratamiento, las intervenciones no farmacéuticas se convierten en la estrategia de respuesta más importante. Estas son las intervenciones comunitarias que pueden reducir el impacto de la enfermedad. El riesgo de COVID-19 a los estadounidenses se puede desglosar en riesgo de exposición versus riesgo de enfermedad grave y muerte. Riesgo de exposición:El riesgo inmediato de estar expuesto a este virus es todavía bajo para la mayoría de los estadounidenses, pero a medida que el brote se expande, ese riesgo aumentará. Casos de COVID-19 y casos de propagación comunitaria se están reportando en un número creciente de estados. Las personas en lugares donde la propagación comunitaria continua del virus que causa COVID-19 se ha reportado están en riesgo elevado de exposición, con el nivel de riesgo dependiente de la ubicación. Los trabajadores sanitarios que atienden a pacientes con COVID-19 están en riesgo elevado de exposición. Los viajeros que regresan de lugares internacionales afectados donde la propagación de la comunidad está ocurriendo también están en riesgo elevado de exposición, con el nivel de riesgo dependiente de donde viajaron. Riesgo de enfermedad grave:La información temprana fuera de China, donde COVID-19 comenzó por primera vez, muestra que algunas personas están en mayor riesgo de enfermarse de esta enfermedad. Esto incluye: Adultos mayores, con riesgo que aumenta por la edad. Las personas que tienen enfermedades crónicas graves como:Enfermedad del corazónDiabetesEnfermedad de LungCDC ha desarrollado directrices para ayudar en la evaluación del riesgo y el manejo de las personas con exposición potencial a COVID-19. Qué puede sucederMás casos de COVID-19 son probables que se identifiquen en los Estados Unidos en los próximos días, incluyendo más casos de propagación comunitaria. Los CDC esperan que se produzca una transmisión generalizada de COVID-19 en los Estados Unidos. En los próximos meses, la La transmisión generalizada de COVID-19 podría traducirse en un gran número de personas que necesitan atención médica al mismo tiempo. Las escuelas, guarderías y lugares de trabajo pueden experimentar un mayor absentismo. Las reuniones masivas pueden ser escasamente atendidas o pospuestas. La salud pública y los sistemas de salud pueden sobrecargarse, con tasas elevadas de hospitalizaciones y muertes. Otras infraestructuras críticas, como la aplicación de la ley, los servicios médicos de emergencia y los sectores de la industria del transporte también pueden verse afectados. Los proveedores de atención médica y los hospitales pueden verse abrumados. En este momento, no hay vacuna para proteger contra COVID-19 y no hay medicamentos aprobados para tratarlo. Las intervenciones no farmacéuticas serán la estrategia de respuesta más importante para tratar de retrasar la propagación del virus y reducir el impacto de la enfermedad. El gobierno federal está trabajando en estrecha colaboración con socios estatales, locales, tribales y territoriales, así como socios de salud pública, para responder a esta amenaza de salud pública. Aspectos destacados de la respuesta del CDC CDC estableció un Sistema de Gestión de Incidentes COVID-19 el 7 de enero de 2020. El 21 de enero, el CDC activó su Centro de Operaciones de Emergencia para brindar mejor apoyo continuo a la respuesta del COVID-19. El gobierno de Estados Unidos ha tomado medidas sin precedentes con respecto a los viajes en respuesta a la creciente amenaza de salud pública planteada por este nuevo coronavirus:Los extranjeros que han estado en China, Irán, el Reino Unido, Irlanda y cualquiera de los 26 países europeos en el área Schengen en los últimos 14 días no pueden entrar en los Estados Unidos. Los ciudadanos estadounidenses, residentes y sus familiares inmediatos que han sido cualquiera de esos países en los últimos 14 días pueden entrar en los Estados Unidos, pero están sujetos a vigilancia de la salud y posible cuarentena por un máximo de 14 días. Las personas con mayor riesgo de enfermedad grave de COVID-19 evitan los viajes en crucero y los viajes aéreos no esenciales. Los CDC han emitido orientaciones específicas adicionales sobre los viajes relacionados con COVID-19. Los CDC han emitido orientaciones clínicas, como:Guía clínica para el manejo de pacientes con enfermedad coronaria confirmada (COVID-19). Los CDC también han publicado orientaciones para otros entornos, entre ellos:Preparación para COVID-19: Instalaciones de Cuidados de Largo Plazo, Hogares de EnfermeríaLa interrupción del aislamiento domiciliario para personas con COVID-19CDC ha desplegado equipos multidisciplinarios para apoyar a los departamentos de salud estatales en la identificación de casos, localización de contactos, gestión clínica y comunicaciones públicas. Los CDC han trabajado con socios federales para apoyar el regreso seguro de estadounidenses afectados por COVID-19. Una parte importante del papel de los CDC durante una emergencia de salud pública es desarrollar una prueba para el patógeno y dotar a los laboratorios de salud pública estatales y locales con capacidad de prueba. Los CDC han desarrollado una prueba rRT-PCR para diagnosticar COVID-19. A partir de la noche del 17 de marzo, 89 laboratorios de salud pública estatales y locales en 50 estados, el Distrito de Columbia, Guam y Puerto Rico han verificado con éxito y están utilizando pruebas de diagnóstico Los fabricantes comerciales están produciendo ahora sus propias pruebas. Los CDC han cultivado el virus COVID-19 en cultivo celular, lo cual es necesario para estudios adicionales, incluyendo para la caracterización genética adicional. El virus de cultivo celular fue enviado al repositorio de recursos BEI de NIH para su uso por la amplia comunidad científica. Los CDC también están desarrollando una prueba de serología para COVID-19. Otros recursos disponiblesLos siguientes recursos están disponibles con información sobre COVID-19World Health Organization, Coronavirusexternal icono

¿En qué especie se originó probablemente el virus COVID-19?

Para febrero de 2020, varios países estaban informando de casos importados de SARS-CoV-2, identificando ubicaciones con posibles casos de síndrome respiratorio agudo agudo grave no detectados Coronavirus 2 por medio del uso de predicciones de importación,https://wwwnc.cdc.gov/eid/article/26/7/20-0250_articleVolume 26, Número 7—Julio 2020InvestigaciónPablo Martinez De Salazar1Comentarios al autor, René Niehus, Aimee Taylor1, Caroline O’Flaherty Buckee y Marc LipsitchComentarios al autorAfiliaciones del autor: Harvard T.H. Chan School of Public Health, Boston, Massachusetts, USA Para contener el virus, la detección temprana de casos importados de SARS-CoV-2 es crítica. Utilizamos estimaciones del volumen de viajes aéreos desde Wuhan, China, a destinos internacionales y un modelo de regresión lineal generalizada para identificar lugares que podrían tener casos importados no detectados. Nuestro modelo se puede ajustar para tener en cuenta la exportación de casos desde otros lugares a medida que el virus se propaga y se dispone de más información sobre las importaciones y la transmisión. La detección temprana y las medidas de control adecuadas pueden reducir el riesgo de transmisión en todos los lugares. En diciembre de 2019 se identificó en la ciudad de Wuhan, capital de la provincia de Hubei, China, un nuevo coronavirus, más tarde llamado síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), en diciembre de 2019, donde los casos se confirmaron por primera vez (1). Durante diciembre de 2019–febrero de 2020, el número de casos confirmados aumentó drásticamente. A finales de enero de 2020, se implementaron restricciones de viaje para Wuhan y ciudades vecinas. Sin embargo, el virus se extendió de Wuhan a otras ciudades en China y fuera del país. Para el 4 de febrero de 2020, un total de 23 lugares fuera de China continental reportaron casos, 22 de los cuales reportaron casos importados; España reportó un caso causado por transmisión secundaria (3). La mayoría de los casos importados a otros lugares se han relacionado con la historia reciente de viajes desde China (3), sugiriendo que los viajes aéreos juegan un papel importante en la exportación de casos a lugares fuera de China. Para evitar que otras ciudades y países se conviertan en epicentros de la epidemia del SARS-CoV-2, se requieren intervenciones de salud pública dirigidas para detectar casos y controlar la propagación local del virus. Recopilamos estimaciones del volumen de viajes aéreos desde Wuhan a 194 destinos internacionales. Luego identificamos 49 países que tenían una puntuación de >49,2/100 en la categoría 2, Detección Temprana y Notificación de Epidemias de Posible Preocupación Internacional, del Índice de Seguridad Mundial de la Salud (GHS) (4). Asumimos que estas ubicaciones serían competentes en la detección del SARS-CoV-2 y en la notificación de casos confirmados importados, a los que nos referimos como casos importados y reportados. Ejecutamos un modelo de regresión lineal generalizada en este subconjunto; basado en los resultados, generamos predicciones para el resto de la muestra. Usando estas predicciones, identificamos ubicaciones que podrían no estar detectando casos importados. MétodosPara identificar ubicaciones que reportan menos de lo previsto casos infectados por SARS-CoV-2 importados, ajustamos un modelo a datos de 49 lugares fuera de China continental con alta capacidad de vigilancia de acuerdo con el Índice de GHS (4). Entre éstos, 17 tenían alta conectividad Realizamos una regresión de Poisson utilizando el número acumulado de casos de SARS-CoV-2 importados y reportados en estos 49 países y el número estimado de pasajeros diarios del aeropuerto de Wuhan. Luego comparamos las predicciones de este modelo con casos importados y reportados en 194 ubicaciones del Índice del SMA, excluyendo a China como epicentro del brote. El modelo requiere datos sobre casos importados y reportados de infección por SARS-CoV-2, volumen diario de viajes aéreos y capacidad de vigilancia. Obtuvimos datos sobre casos importados y reportados agregados por destino del informe técnico de la Organización Mundial de la Salud emitido el 4 de febrero de 2020 (3). Asumimos un recuento de casos de 0 para lugares no listados. Utilizamos el 4 de febrero como límite para los casos acumulados importados y reportados porque los casos exportados de la provincia de Hubei disminuyeron rápidamente después de esta fecha (3), probablemente debido a las restricciones de viaje para la provincia Definimos los casos importados y reportados como aquellos con historia de viaje conocida desde China; de ellos, el 83% tenían historia de viaje desde la provincia de Hubei y el 17% viajaban desde lugares desconocidos en China (3). Excluimos los casos reportados probablemente causados por transmisión fuera de China o casos en los que la fuente de transmisión todavía estaba bajo investigación (3). Además, excluimos a Hong Kong, Macao y Taiwán de nuestro modelo porque los casos transmitidos e importados localmente no estaban desglosados en estos lugares. Obtuvimos datos sobre viajes aéreos diarios de un estudio de modelización basado en la red (S. Lai et al., unpub. data, https://doi.org/10.10101/2020.02.02.20020479 Enlace externo) que informó estimaciones mensuales del volumen de viaje aéreo para los 27 lugares fuera de China continental que están más conectados con Wuhan. Estas estimaciones se calcularon a partir de los datos de la Asociación Internacional Para estos 27 lugares, los volúmenes estimados de viajes aéreos son >6 pasajeros/día. Asumimos que los volúmenes de viajes para lugares que no están entre los más conectados son censurados por un límite de detección. Utilizamos un método común para tratar con datos censurados de muestreo ambiental (5), o metabolomics (6), para establecer el volumen diario de viajes aéreos a la mitad del mínimo reportado anteriormente. Por lo tanto, utilizamos 3 pasajeros/día para volúmenes estimados de viajes para los 167 lugares del Índice de SGA no listado por Lai et al. Probamos la robustez de nuestros resultados utilizando un conjunto de valores alternativos de 0,1, 1 y 6 pasajeros/día para los datos censurados. Definimos lugares de alta vigilancia como aquellos con un Índice de SGA para la categoría 2 por encima del cuantil 75. Evaluamos el número de lugares de alta vigilancia, aquellos con 0 casos importados y reportados, y lugares Para nuestro modelo, asumimos que el recuento acumulativo de casos importados y reportados en 49 lugares de alta vigilancia sigue una distribución de Poisson desde el principio de la epidemia hasta el 4 de febrero de 2020. Entonces el recuento esperado de casos es linealmente proporcional al volumen diario de viajes aéreos en la siguiente fórmula:donde denomino la ubicación, Ci denota el recuento de casos importados y reportados en un lugar, ♥i denota el recuento de casos esperados en un lugar, β denota el coeficiente de regresión, y xi denota el volumen diario de viajes aéreos de un lugar.El modelo Poisson asume que los casos son independientes y que la varianza es igual al recuento esperado de casos.Los casos importados y reportados probablemente cumplen con la hipótesis de independencia porque el valor excluye los casos con transmisión local.También comprobamos la solidez de nuestros resultados utilizando un modelo sobredistribuido con una probabilidad binomial negativa. Calculamos el valor p del parámetro de sobredispersión como se muestra en Gelman y Hill (7). Thumbnail of Regression parcela de ubicaciones con posibles casos importados no detectados de síndrome respiratorio agudo grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) por volumen de viaje aéreo desde Wuhan, China. El volumen de viaje aéreo medido en número de personas/día. No. casos se refiere a posibles casos importados no detectados de SARS-CoV-2. La línea sólida indica los recuentos de casos importados y reportados esperados para ubicaciones. Las líneas dañadas representan límites de intervalo de predicción del 95% suavizados para todas las ubicaciones. Los puntos púrpuras indican la ubicaciónFigura 1. Para calcular el volumen de viajes aéreos medido en número de...Utilizamos la versión R 3.6.1 (https://www.r-project.orgExternal Link) para calcular, la estimación de máxima probabilidad de β, y el conteo de casos esperado importado y reportado dado alta vigilancia (Figura 1). También calculamos los límites del intervalo de predicción del 95% (PI) bajo este modelo de alta vigilancia para todos los 194 valores de volumen de viajes aéreos diarios (Figura 1). Primero, generamos un conjunto de datos con trampa de arranque mediante muestreo de n ubicaciones con reemplazo entre lugares de alta vigilancia. Luego, reestimamos β utilizando el conjunto de datos con trampa de arranque. Finalmente, simulamos los recuentos de casos importados y reportados para todos los 194 lugares bajo nuestro modelo utilizando la estimación de β del conjunto de datos con trampa de arranque. Repetimos los 3 pasos 50.000 veces para generar 50.000 recuentos simulados de casos importados y reportados para cada una de las ubicaciones computadas a los límites inferiores y superiores de PI (PI 2,5%-97,5%). Aliviamos los límites de PI 95% utilizando ggplot2 en R (8). Ajustamos los recuentos de casos importados y reportados de los 49 lugares de alta vigilancia al modelo y los trazamos junto con 145 lugares con baja capacidad de vigilancia (Figura 1). Observamos cierta superposición entre los lugares de alta y baja vigilancia (Figura 1). Thumbnail of Analys of imported-and-reported cases and daily air travel volume us used a model to predice locations with potentially undetected cases of severy agripe agripe virus respiratorio 2 (SARS-CoV-2). Volumen de viajes aéreos medido en La línea sólida muestra los recuentos esperados de casos importados y reportados en base a nuestro modelo instalado en lugares de alta vigilancia, indicados por puntos púrpuras. Las líneas rotadas indican el 95% prFigura 2. Análisis de casos importados y reportados y volumen diario de viajes aéreos utilizando un modelo para predecir ubicaciones con casos potencialmente no detectados de virus respiratorio agudo 2 (SARS-CoV-2). Volumen de viajes aéreos medido en...Para evaluar la robustez de nuestros resultados, realizamos 8 análisis adicionales de regresión mediante la implementación de una serie de cambios en el análisis.Los cambios incluyeron los siguientes: establecer el volumen diario de viajes aéreos en 0,1, 1, o 6 pasajeros/día para lugares no listados por Lai et al. (unpub. data, https://doi.org/10.1101/2020.02.20020479 Enlace External) (Figura 2, paneles A–C); eliminar todas las ubicaciones no listado Antes de la instalación (figura 2, panel D); se definieron los lugares de alta vigilancia utilizando un criterio de índice de SGA más indulgente, el cuantil 50 (figura 2, panel E), y un criterio más estricto, el cuantil 95 (figura 2, panel F); se excluyó a Tailandia del modelo porque es un punto de apalancamiento alto (figura 2, panel G); o se utilizó una probabilidad de Poisson sobredispersada con una probabilidad de binomial negativo (figura 2, panel H). Proporcionamos código para estos análisis en GitHub (https://github.com/c2-d2/cov19flightimportExternal Link).Resultados TopSe encontró que el volumen diario de viajes aéreos correlaciona positivamente con los recuentos de casos importados y notificados de infección por SRAS-CoV-2 entre lugares de alta vigilancia (figura 1). Se observó que el aumento del volumen de Además, Singapur e India se encuentran por encima del 95% de PI en nuestro modelo; Singapur tenía 12 casos más importados y reportados (95% PI 6-17 casos) de lo esperado y India tenía 3 (95% PI 1-3 casos) más de lo esperado. Tailandia tiene un volumen de viaje aéreo relativamente alto en comparación con otros lugares, pero se encuentra por debajo del 95% PI, reportando 16 (95% PI 1–40 casos) menos casos importados y reportados de lo esperado bajo el modelo. Indonesia se encuentra por debajo del PI y no tiene casos importados y reportados, pero el recuento de casos esperados es de 5 (95% PI 1–10 casos) en nuestro modelo. La India se mantiene por encima del 95% PI en todos los análisis de robustez excepto cuando utilizamos el más estricto Índice GHS, 95o cuantil, para el ajuste; entonces la India se encuentra en el límite superior del 95% PI (Figura 2, panel F). TopDiscusiónNuestro modelo se puede ajustar para tener en cuenta la exportación de casos desde lugares distintos de Wuhan a medida que se desarrolla el brote y se dispone de más información sobre importaciones y transmisión autosostenida. Una ventaja clave de este modelo es que no se basa en estimaciones de incidencia o prevalencia en el epicentro del brote. Además, utilizamos intencionalmente un modelo lineal simple y generalizado. La linealidad del recuento de casos esperado significa que tenemos sólo 1 coeficiente de regresión en el modelo y ningún parámetro adicional. La probabilidad de Poisson luego captura los muchos conteos de 0 observados para lugares menos altamente conectados, pero también describe la pendiente entre el número de casos y los datos de vuelo entre lugares más conectados. Creemos que este modelo proporciona la descripción fenomenológica más parsimoniosa de los datos. De acuerdo con nuestro modelo, las ubicaciones por encima del 95% de PI de casos importados y reportados podrían tener mayor capacidad de detección de casos. Las ubicaciones por debajo del 95% de PI podrían tener casos no detectados debido a los recuentos de casos importados y reportados bajo alta vigilancia. La detección de casos podría aumentar la propagación internacional del brote porque la cadena de transmisión podría perderse, reduciendo las oportunidades de implementar estrategias de control basadas en casos. Recomendamos el rápido fortalecimiento de los esfuerzos de vigilancia y control de brotes en lugares por debajo del límite inferior del 95% de PI, particularmente Indonesia, para frenar la posible transmisión local. La detección temprana de casos e TopDr. De Salazar es investigador en la Escuela de Salud Pública de Harvard T.H. Chan, trabajando en modelos estadísticos multiescala de enfermedades infecciosas dentro de los modelos de huésped, población y metapoblación. Sus intereses de investigación incluyen métodos de diagnóstico de laboratorio y respuesta de salud pública. TopAgradecimientosAgradecemos a Pamela Martínez, Nicholas Jewel y Stephen Kissler por su valiosa retroalimentación. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de EE.UU. (premio no. U54GM088558). P.M.D. fue apoyado por la Fundación de Becas Ramon Areces. A.R.T. y C.O.B. fueron apoyados por un Premio de Investigación Maximizadora (no. R35GM124715-02) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de EE.UU. Los autores son los únicos responsables de este contenido y no Declaración de intereses: Marc Lipsitch ha recibido honorarios de consultoría de Merck. Todos los demás autores declaran no tener intereses competidores. TopReferenciasZhou P, Yang XL, Wang XG, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. Un brote de neumonía asociado con un nuevo coronavirus de origen probable de murciélagos. Nature. 2020;579:270–3. Wu JT, Leung K, Leung GM. Nowcasting and pronosticing the potencial spread domestic and international propulsure of the 2019-nCoV proceded in Wuhan, China: a modeling study. Lancet. 2020;395:689–97. DOIExternal LinkPubMedExternal LinkWorld Health Organization. Coronavirus disease 2019 (COVID-19) situation report—15, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/20200204-sitrep-15-ncov.pdfExternal LinkNuclear Threat Initiative and Johns Hopkins Center for Health Security. Índice de seguridad sanitaria mundial [citado 2020 Feb 14]. https://www.ghsindex.orgExternal LinkUS Environmental Protection Agency.Evaluación de la calidad de los datos: métodos estadísticos para los profesionales EPA QA/G9-S [citado 2020 Feb 14]. Washington: The Agency; 2006. https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-08/documents/g9s-final.pdfExternal LinkLamichhane S, Sen P, En: Jaumot J, Bedia C, Tauler R, editores. Química analítica integral. Vol. 82. Amsterdam: Elsevier; 2018. p. 387–413. Gelman A, Hill J. Métodos analíticos para la investigación social. En: Análisis de datos utilizando regresión y modelos multinivel/hierrárquicos. Cambridge: Cambridge University Press; 2006. p. 235–236. Wickham H. ggplot2: gráficos elegantes para el análisis de datos. Nueva York: Springer; 2016. Figuras superioresFigura 1. Gráfico de regresión de ubicaciones con posibles casos importados no detectados de síndrome respiratorio agudo grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) por volumen de viajes aéreos de Wuhan, China. Volumen de viajes aéreos medido en... Análisis de casos importados y reportados y volumen diario de viajes aéreos utilizando un modelo para predecir ubicaciones con casos potencialmente no detectados de virus respiratorio agudo grave 2 (SARS-CoV-2). Volumen de viajes aéreos...Tabla. Capacidad de vigilancia de lugares con y sin casos importados y reportados de síndrome respiratorio agudo grave coronavirus 2, 2020TopSugerida cita para este artículo: De Salazar PM, Niehus R, Taylor A, O’Flaherty Buckee C, Lipsitch M. Identificación de ubicaciones con posibles casos no detectados de síndrome respiratorio agudo agudo grave coronavirus 2 mediante el uso de predicciones de importación. Emerg Infect Dis. 2020 Jul [fecha citada]. https://doi.org/10.3201/eid2607.200250DOI: 10.3201/eid2607.200250Fecha de publicación original: 24/03/20201Estos autores contribuyeron igualmente a este Índice – Volumen 26, Número 7—Julio 2020

¿Cuál es el acrónimo SARS-CoV-2?

Para febrero de 2020, varios países estaban informando de casos importados de SARS-CoV-2, identificando ubicaciones con posibles casos de síndrome respiratorio agudo agudo grave no detectados Coronavirus 2 por medio del uso de predicciones de importación,https://wwwnc.cdc.gov/eid/article/26/7/20-0250_articleVolume 26, Número 7—Julio 2020InvestigaciónPablo Martinez De Salazar1Comentarios al autor, René Niehus, Aimee Taylor1, Caroline O’Flaherty Buckee y Marc LipsitchComentarios al autorAfiliaciones del autor: Harvard T.H. Chan School of Public Health, Boston, Massachusetts, USA Para contener el virus, la detección temprana de casos importados de SARS-CoV-2 es crítica. Utilizamos estimaciones del volumen de viajes aéreos desde Wuhan, China, a destinos internacionales y un modelo de regresión lineal generalizada para identificar lugares que podrían tener casos importados no detectados. Nuestro modelo se puede ajustar para tener en cuenta la exportación de casos desde otros lugares a medida que el virus se propaga y se dispone de más información sobre las importaciones y la transmisión. La detección temprana y las medidas de control adecuadas pueden reducir el riesgo de transmisión en todos los lugares. En diciembre de 2019 se identificó en la ciudad de Wuhan, capital de la provincia de Hubei, China, un nuevo coronavirus, más tarde llamado síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), en diciembre de 2019, donde los casos se confirmaron por primera vez (1). Durante diciembre de 2019–febrero de 2020, el número de casos confirmados aumentó drásticamente. A finales de enero de 2020, se implementaron restricciones de viaje para Wuhan y ciudades vecinas. Sin embargo, el virus se extendió de Wuhan a otras ciudades en China y fuera del país. Para el 4 de febrero de 2020, un total de 23 lugares fuera de China continental reportaron casos, 22 de los cuales reportaron casos importados; España reportó un caso causado por transmisión secundaria (3). La mayoría de los casos importados a otros lugares se han relacionado con la historia reciente de viajes desde China (3), sugiriendo que los viajes aéreos juegan un papel importante en la exportación de casos a lugares fuera de China. Para evitar que otras ciudades y países se conviertan en epicentros de la epidemia del SARS-CoV-2, se requieren intervenciones de salud pública dirigidas para detectar casos y controlar la propagación local del virus. Recopilamos estimaciones del volumen de viajes aéreos desde Wuhan a 194 destinos internacionales. Luego identificamos 49 países que tenían una puntuación de >49,2/100 en la categoría 2, Detección Temprana y Notificación de Epidemias de Posible Preocupación Internacional, del Índice de Seguridad Mundial de la Salud (GHS) (4). Asumimos que estas ubicaciones serían competentes en la detección del SARS-CoV-2 y en la notificación de casos confirmados importados, a los que nos referimos como casos importados y reportados. Ejecutamos un modelo de regresión lineal generalizada en este subconjunto; basado en los resultados, generamos predicciones para el resto de la muestra. Usando estas predicciones, identificamos ubicaciones que podrían no estar detectando casos importados. MétodosPara identificar ubicaciones que reportan menos de lo previsto casos infectados por SARS-CoV-2 importados, ajustamos un modelo a datos de 49 lugares fuera de China continental con alta capacidad de vigilancia de acuerdo con el Índice de GHS (4). Entre éstos, 17 tenían alta conectividad Realizamos una regresión de Poisson utilizando el número acumulado de casos de SARS-CoV-2 importados y reportados en estos 49 países y el número estimado de pasajeros diarios del aeropuerto de Wuhan. Luego comparamos las predicciones de este modelo con casos importados y reportados en 194 ubicaciones del Índice del SMA, excluyendo a China como epicentro del brote. El modelo requiere datos sobre casos importados y reportados de infección por SARS-CoV-2, volumen diario de viajes aéreos y capacidad de vigilancia. Obtuvimos datos sobre casos importados y reportados agregados por destino del informe técnico de la Organización Mundial de la Salud emitido el 4 de febrero de 2020 (3). Asumimos un recuento de casos de 0 para lugares no listados. Utilizamos el 4 de febrero como límite para los casos acumulados importados y reportados porque los casos exportados de la provincia de Hubei disminuyeron rápidamente después de esta fecha (3), probablemente debido a las restricciones de viaje para la provincia Definimos los casos importados y reportados como aquellos con historia de viaje conocida desde China; de ellos, el 83% tenían historia de viaje desde la provincia de Hubei y el 17% viajaban desde lugares desconocidos en China (3). Excluimos los casos reportados probablemente causados por transmisión fuera de China o casos en los que la fuente de transmisión todavía estaba bajo investigación (3). Además, excluimos a Hong Kong, Macao y Taiwán de nuestro modelo porque los casos transmitidos e importados localmente no estaban desglosados en estos lugares. Obtuvimos datos sobre viajes aéreos diarios de un estudio de modelización basado en la red (S. Lai et al., unpub. data, https://doi.org/10.10101/2020.02.02.20020479 Enlace externo) que informó estimaciones mensuales del volumen de viaje aéreo para los 27 lugares fuera de China continental que están más conectados con Wuhan. Estas estimaciones se calcularon a partir de los datos de la Asociación Internacional Para estos 27 lugares, los volúmenes estimados de viajes aéreos son >6 pasajeros/día. Asumimos que los volúmenes de viajes para lugares que no están entre los más conectados son censurados por un límite de detección. Utilizamos un método común para tratar con datos censurados de muestreo ambiental (5), o metabolomics (6), para establecer el volumen diario de viajes aéreos a la mitad del mínimo reportado anteriormente. Por lo tanto, utilizamos 3 pasajeros/día para volúmenes estimados de viajes para los 167 lugares del Índice de SGA no listado por Lai et al. Probamos la robustez de nuestros resultados utilizando un conjunto de valores alternativos de 0,1, 1 y 6 pasajeros/día para los datos censurados. Definimos lugares de alta vigilancia como aquellos con un Índice de SGA para la categoría 2 por encima del cuantil 75. Evaluamos el número de lugares de alta vigilancia, aquellos con 0 casos importados y reportados, y lugares Para nuestro modelo, asumimos que el recuento acumulativo de casos importados y reportados en 49 lugares de alta vigilancia sigue una distribución de Poisson desde el principio de la epidemia hasta el 4 de febrero de 2020. Entonces el recuento esperado de casos es linealmente proporcional al volumen diario de viajes aéreos en la siguiente fórmula:donde denomino la ubicación, Ci denota el recuento de casos importados y reportados en un lugar, ♥i denota el recuento de casos esperados en un lugar, β denota el coeficiente de regresión, y xi denota el volumen diario de viajes aéreos de un lugar.El modelo Poisson asume que los casos son independientes y que la varianza es igual al recuento esperado de casos.Los casos importados y reportados probablemente cumplen con la hipótesis de independencia porque el valor excluye los casos con transmisión local.También comprobamos la solidez de nuestros resultados utilizando un modelo sobredistribuido con una probabilidad binomial negativa. Calculamos el valor p del parámetro de sobredispersión como se muestra en Gelman y Hill (7). Thumbnail of Regression parcela de ubicaciones con posibles casos importados no detectados de síndrome respiratorio agudo grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) por volumen de viaje aéreo desde Wuhan, China. El volumen de viaje aéreo medido en número de personas/día. No. casos se refiere a posibles casos importados no detectados de SARS-CoV-2. La línea sólida indica los recuentos de casos importados y reportados esperados para ubicaciones. Las líneas dañadas representan límites de intervalo de predicción del 95% suavizados para todas las ubicaciones. Los puntos púrpuras indican la ubicaciónFigura 1. Para calcular el volumen de viajes aéreos medido en número de...Utilizamos la versión R 3.6.1 (https://www.r-project.orgExternal Link) para calcular, la estimación de máxima probabilidad de β, y el conteo de casos esperado importado y reportado dado alta vigilancia (Figura 1). También calculamos los límites del intervalo de predicción del 95% (PI) bajo este modelo de alta vigilancia para todos los 194 valores de volumen de viajes aéreos diarios (Figura 1). Primero, generamos un conjunto de datos con trampa de arranque mediante muestreo de n ubicaciones con reemplazo entre lugares de alta vigilancia. Luego, reestimamos β utilizando el conjunto de datos con trampa de arranque. Finalmente, simulamos los recuentos de casos importados y reportados para todos los 194 lugares bajo nuestro modelo utilizando la estimación de β del conjunto de datos con trampa de arranque. Repetimos los 3 pasos 50.000 veces para generar 50.000 recuentos simulados de casos importados y reportados para cada una de las ubicaciones computadas a los límites inferiores y superiores de PI (PI 2,5%-97,5%). Aliviamos los límites de PI 95% utilizando ggplot2 en R (8). Ajustamos los recuentos de casos importados y reportados de los 49 lugares de alta vigilancia al modelo y los trazamos junto con 145 lugares con baja capacidad de vigilancia (Figura 1). Observamos cierta superposición entre los lugares de alta y baja vigilancia (Figura 1). Thumbnail of Analys of imported-and-reported cases and daily air travel volume us used a model to predice locations with potentially undetected cases of severy agripe agripe virus respiratorio 2 (SARS-CoV-2). Volumen de viajes aéreos medido en La línea sólida muestra los recuentos esperados de casos importados y reportados en base a nuestro modelo instalado en lugares de alta vigilancia, indicados por puntos púrpuras. Las líneas rotadas indican el 95% prFigura 2. Análisis de casos importados y reportados y volumen diario de viajes aéreos utilizando un modelo para predecir ubicaciones con casos potencialmente no detectados de virus respiratorio agudo 2 (SARS-CoV-2). Volumen de viajes aéreos medido en...Para evaluar la robustez de nuestros resultados, realizamos 8 análisis adicionales de regresión mediante la implementación de una serie de cambios en el análisis.Los cambios incluyeron los siguientes: establecer el volumen diario de viajes aéreos en 0,1, 1, o 6 pasajeros/día para lugares no listados por Lai et al. (unpub. data, https://doi.org/10.1101/2020.02.20020479 Enlace External) (Figura 2, paneles A–C); eliminar todas las ubicaciones no listado Antes de la instalación (figura 2, panel D); se definieron los lugares de alta vigilancia utilizando un criterio de índice de SGA más indulgente, el cuantil 50 (figura 2, panel E), y un criterio más estricto, el cuantil 95 (figura 2, panel F); se excluyó a Tailandia del modelo porque es un punto de apalancamiento alto (figura 2, panel G); o se utilizó una probabilidad de Poisson sobredispersada con una probabilidad de binomial negativo (figura 2, panel H). Proporcionamos código para estos análisis en GitHub (https://github.com/c2-d2/cov19flightimportExternal Link).Resultados TopSe encontró que el volumen diario de viajes aéreos correlaciona positivamente con los recuentos de casos importados y notificados de infección por SRAS-CoV-2 entre lugares de alta vigilancia (figura 1). Se observó que el aumento del volumen de Además, Singapur e India se encuentran por encima del 95% de PI en nuestro modelo; Singapur tenía 12 casos más importados y reportados (95% PI 6-17 casos) de lo esperado y India tenía 3 (95% PI 1-3 casos) más de lo esperado. Tailandia tiene un volumen de viaje aéreo relativamente alto en comparación con otros lugares, pero se encuentra por debajo del 95% PI, reportando 16 (95% PI 1–40 casos) menos casos importados y reportados de lo esperado bajo el modelo. Indonesia se encuentra por debajo del PI y no tiene casos importados y reportados, pero el recuento de casos esperados es de 5 (95% PI 1–10 casos) en nuestro modelo. La India se mantiene por encima del 95% PI en todos los análisis de robustez excepto cuando utilizamos el más estricto Índice GHS, 95o cuantil, para el ajuste; entonces la India se encuentra en el límite superior del 95% PI (Figura 2, panel F). TopDiscusiónNuestro modelo se puede ajustar para tener en cuenta la exportación de casos desde lugares distintos de Wuhan a medida que se desarrolla el brote y se dispone de más información sobre importaciones y transmisión autosostenida. Una ventaja clave de este modelo es que no se basa en estimaciones de incidencia o prevalencia en el epicentro del brote. Además, utilizamos intencionalmente un modelo lineal simple y generalizado. La linealidad del recuento de casos esperado significa que tenemos sólo 1 coeficiente de regresión en el modelo y ningún parámetro adicional. La probabilidad de Poisson luego captura los muchos conteos de 0 observados para lugares menos altamente conectados, pero también describe la pendiente entre el número de casos y los datos de vuelo entre lugares más conectados. Creemos que este modelo proporciona la descripción fenomenológica más parsimoniosa de los datos. De acuerdo con nuestro modelo, las ubicaciones por encima del 95% de PI de casos importados y reportados podrían tener mayor capacidad de detección de casos. Las ubicaciones por debajo del 95% de PI podrían tener casos no detectados debido a los recuentos de casos importados y reportados bajo alta vigilancia. La detección de casos podría aumentar la propagación internacional del brote porque la cadena de transmisión podría perderse, reduciendo las oportunidades de implementar estrategias de control basadas en casos. Recomendamos el rápido fortalecimiento de los esfuerzos de vigilancia y control de brotes en lugares por debajo del límite inferior del 95% de PI, particularmente Indonesia, para frenar la posible transmisión local. La detección temprana de casos e TopDr. De Salazar es investigador en la Escuela de Salud Pública de Harvard T.H. Chan, trabajando en modelos estadísticos multiescala de enfermedades infecciosas dentro de los modelos de huésped, población y metapoblación. Sus intereses de investigación incluyen métodos de diagnóstico de laboratorio y respuesta de salud pública. TopAgradecimientosAgradecemos a Pamela Martínez, Nicholas Jewel y Stephen Kissler por su valiosa retroalimentación. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de EE.UU. (premio no. U54GM088558). P.M.D. fue apoyado por la Fundación de Becas Ramon Areces. A.R.T. y C.O.B. fueron apoyados por un Premio de Investigación Maximizadora (no. R35GM124715-02) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de EE.UU. Los autores son los únicos responsables de este contenido y no Declaración de intereses: Marc Lipsitch ha recibido honorarios de consultoría de Merck. Todos los demás autores declaran no tener intereses competidores. TopReferenciasZhou P, Yang XL, Wang XG, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. Un brote de neumonía asociado con un nuevo coronavirus de origen probable de murciélagos. Nature. 2020;579:270–3. Wu JT, Leung K, Leung GM. Nowcasting and pronosticing the potencial spread domestic and international propulsure of the 2019-nCoV proceded in Wuhan, China: a modeling study. Lancet. 2020;395:689–97. DOIExternal LinkPubMedExternal LinkWorld Health Organization. Coronavirus disease 2019 (COVID-19) situation report—15, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/20200204-sitrep-15-ncov.pdfExternal LinkNuclear Threat Initiative and Johns Hopkins Center for Health Security. Índice de seguridad sanitaria mundial [citado 2020 Feb 14]. https://www.ghsindex.orgExternal LinkUS Environmental Protection Agency.Evaluación de la calidad de los datos: métodos estadísticos para los profesionales EPA QA/G9-S [citado 2020 Feb 14]. Washington: The Agency; 2006. https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-08/documents/g9s-final.pdfExternal LinkLamichhane S, Sen P, En: Jaumot J, Bedia C, Tauler R, editores. Química analítica integral. Vol. 82. Amsterdam: Elsevier; 2018. p. 387–413. Gelman A, Hill J. Métodos analíticos para la investigación social. En: Análisis de datos utilizando regresión y modelos multinivel/hierrárquicos. Cambridge: Cambridge University Press; 2006. p. 235–236. Wickham H. ggplot2: gráficos elegantes para el análisis de datos. Nueva York: Springer; 2016. Figuras superioresFigura 1. Gráfico de regresión de ubicaciones con posibles casos importados no detectados de síndrome respiratorio agudo grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) por volumen de viajes aéreos de Wuhan, China. Volumen de viajes aéreos medido en... Análisis de casos importados y reportados y volumen diario de viajes aéreos utilizando un modelo para predecir ubicaciones con casos potencialmente no detectados de virus respiratorio agudo grave 2 (SARS-CoV-2). Volumen de viajes aéreos...Tabla. Capacidad de vigilancia de lugares con y sin casos importados y reportados de síndrome respiratorio agudo grave coronavirus 2, 2020TopSugerida cita para este artículo: De Salazar PM, Niehus R, Taylor A, O’Flaherty Buckee C, Lipsitch M. Identificación de ubicaciones con posibles casos no detectados de síndrome respiratorio agudo agudo grave coronavirus 2 mediante el uso de predicciones de importación. Emerg Infect Dis. 2020 Jul [fecha citada]. https://doi.org/10.3201/eid2607.200250DOI: 10.3201/eid2607.200250Fecha de publicación original: 24/03/20201Estos autores contribuyeron igualmente a este Índice – Volumen 26, Número 7—Julio 2020

¿Dónde se identificó por primera vez el SARS-CoV-2?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Cuándo ocurrieron los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Dónde ocurrieron los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿De dónde procedía el primer caso que se informó públicamente?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el suero del paciente convaleciente del SARS y esto no pudo resolverse mediante una prueba del NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar de la IFA del virus entero, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún papel profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables para la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos en entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad en el KSA que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, mialgia y tos casi una semana más tarde Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿En qué animales se han encontrado secuencias MERS-CoV?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que fallecen. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

Precisamente, ¿cómo se transmite el virus a los seres humanos?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Qué parece ser un requisito para la transmisión?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Qué es un punto focal de MERS?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Cómo se conoce en su mayoría a MERS?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

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MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el suero del paciente convaleciente del SARS y esto no pudo resolverse mediante una prueba del NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar de la IFA del virus entero, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún papel profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables para la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos en entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad en el KSA que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, mialgia y tos casi una semana más tarde Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

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MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que fallecen. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Cuántos ARN virales o anticuerpos específicos del virus han sido detectados?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Qué requiere la transmisión posterior de MERS-CoV a otros humanos?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el suero del paciente convaleciente del SARS y esto no pudo resolverse mediante una prueba del NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar de la IFA del virus entero, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún papel profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables para la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos en entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad en el KSA que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, mialgia y tos casi una semana más tarde Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Qué es lo que ha identificado la epidemiología y la investigación del receptor celular del MERS-CoV?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Quién recibe una enfermedad más grave de MERS?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el suero del paciente convaleciente del SARS y esto no pudo resolverse mediante una prueba del NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar de la IFA del virus entero, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún papel profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables para la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos en entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad en el KSA que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, mialgia y tos casi una semana más tarde Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Cuál es el período de incubación del MERS?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún papel profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables para la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C pero pasteurización completamente ablatada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se intentó la A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que fallecen. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Cuál es la duración entre cuando la enfermedad comienza en una persona y posteriormente se extiende a otra?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que fallecen. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Cuál es la mediana del tiempo hasta la muerte en caso de enfermedad progresiva?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Qué dice claramente la definición posterior de MERS de la OMS?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿De qué porcentaje de casos ha sido fuente la KSA?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el suero del paciente convaleciente del SARS y esto no pudo resolverse mediante una prueba del NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar de la IFA del virus entero, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún papel profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables para la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos en entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad en el KSA que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, mialgia y tos casi una semana más tarde Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Qué presentan los pacientes a menudo a un hospital con, en casos de MERS?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que fallecen. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Qué porcentaje de todos los casos denunciados habría matado MERS?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que fallecen. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Qué porcentaje de todos los casos denunciados habría muerto MERS en el KSA?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Qué se ha convertido en un objetivo diagnóstico y taxonómico clave para la identificación de especies CoV?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún papel profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables para la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C pero pasteurización completamente ablatada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se intentó la A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que fallecen. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Cuál es la sensibilidad con la que la herramienta inmunocromatográfica podría detectar proteína nucleocápsida recombinante MERS-CoV?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que fallecen. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Cuál es la especificidad con la que la herramienta inmunocromatográfica podría detectar proteína nucleocápsida recombinante MERS-CoV?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que fallecen. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Cuál es un enfoque diferente para la detección?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

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MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún papel profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables para la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C pero pasteurización completamente ablatada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se intentó la A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que fallecen. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Cuándo generalmente la infección MERS no desencadena una respuesta inmune detectable?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Qué se recomienda cuando se va a realizar el muestreo URT?

MERS coronavirus: diagnóstico, epidemiología y transmisiónhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687373/SHA: f6fcf1a99cbd073c5821d1c4ffa3f2c6daf8ae29Autores: Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.Fecha: 2015-12-22DOI: 10.1186/s12985-015-0439-5Licencia: cc-byAbstract: Los primeros casos conocidos de síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), asociados con la infección por un nuevo coronavirus (CoV), se produjeron en 2012 en Jordania, pero se informó retrospectivamente.El primer caso que se informó públicamente fue de Jeddah, en el Reino de Arabia Saudita (KSA). Desde entonces, las secuencias de MERS-CoV se han encontrado en un murciélago y en muchos camellos dromedarios (DC). MERS-CoV es enzoótico en toda la Península Arábiga y en partes de África, causando enfermedades leves del tracto respiratorio superior en su reservorio de camellos y infecciones humanas esporádicas, pero relativamente raras. Precisamente cómo el virus transmite a los seres humanos sigue siendo desconocido, pero la exposición estrecha y prolongada parece ser un requisito. El KSA es el punto focal de MERS, con la mayoría de los casos humanos. En los seres humanos, MERS se conoce principalmente como una enfermedad del tracto respiratorio inferior (RTL) que incluye fiebre, tos, dificultades respiratorias y neumonía que puede progresar a síndrome de dificultad respiratoria aguda, fallo multiorgánico y muerte en un 20% a 40% de los infectados. Sin embargo, MERS-CoV también se ha detectado en enfermedades leves y similares a En comparación con el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), otra enfermedad zoonótica del coronavirus a veces fatal que ha desaparecido desde entonces, el MERS progresa más rápidamente hacia la insuficiencia respiratoria y la lesión renal aguda (también tiene afinidad por el crecimiento de las células renales en condiciones de laboratorio), es más frecuente en los pacientes con enfermedad subyacente y es más a menudo fatal. La mayoría de los casos humanos de MERS se han relacionado con fallos en la prevención y el control de infecciones (IPC) en los entornos de salud, con aproximadamente el 20% de todas las detecciones de virus notificadas entre los trabajadores de la salud (HCWs) y exposiciones más altas en aquellos con ocupaciones que los ponen en estrecho contacto con camellos. Los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) han estado disponibles casi desde el comienzo de la aparición de MERS. Mientras que la virología básica de MERS-CoV ha avanzado en los últimos tres años, la comprensión de la interacción entre camello, medio ambiente y restos humanos limitados. MATERIAL SUPLEMENTO ELECTRÓNICO: La versión en línea de este artículo (doi:10.1186/s12985-015-0439-5) contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados. Texto: Un correo electrónico del Dr. Ali Mohamed Zaki, un virólogo egipcio que trabaja en el Hospital Dr. Soliman Fakeeh en Jeddah en el Reino de Arabia Saudita (KSA) anunció la primera cultura de un nuevo coronavirus al mundo. El correo electrónico fue publicado en el sitio web de la red de enfermedades emergentes profesionales (ProMED) el 20 de septiembre de 2012 [1] (Fig. 1) y describió el primer caso reportado, un hombre de 60 años de edad de Bisha en la KSA. Esta información llevó al rápido descubrimiento de un segundo caso del virus, esta vez en un paciente enfermo en el Reino Unido, que había sido transferido de Qatar para su atención [2]. El nuevo virus fue inicialmente llamado coronavirus nuevo (nCoV) y subsecuentemente titulado el síndrome de respiración del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV). A partir del 2 de septiembre de 2015, ha habido 1.493 detecciones de ARN viral o anticuerpos específicos del virus en 26 países (Fichero adicional 1: Figura S1) confirmado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con más de un tercio de las personas positivas muriendo (al menos 527, 35 %) [3]. Desde ese primer informe, un lento proceso de descubrimiento durante los siguientes dos o tres años reveló un virus que había infectado más del 90 % de los camellos dromedarios adultos (DC; Camelus dromedario) en la KSA [4], también en los países en desarrollo de toda la Península Arábiga y partes de África que son una fuente de importaciones de DC para la KSA [5]. Hasta la fecha, el MERS-CoV no se ha detectado en los países en desarrollo sometidos a pruebas en zoológicos o rebaños de otras partes del mundo [6] [7] [9]. Ocasionalmente, el virus se transmite de los DC infectados a los seres humanos expuestos. La transmisión posterior a otros seres humanos requiere una exposición relativamente cercana y prolongada [10]. Se patentó el primer aislado viral y se planteó la preocupación de que ello limitaría el acceso tanto al virus como a los diagnósticos virales [11, 12]. Sin embargo, los diagnósticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-rtPCR) se describieron rápidamente y el virus se puso a disposición de forma gratuita, sujeto a consideraciones rutinarias de bioseguridad [13]. La epidemiología y la investigación posteriores han identificado al receptor celular como exopeptidasa dipeptidil peptidasa 4 (DPP4; también llamada CD26); que el MERS-CoV tiene un amplio tropismo, replicando mejor en algunas líneas celulares y provocando una respuesta más proinflamatoria que el SARS-CoV; está muy extendido en los DC; tiene el potencial de infectar a otros animales y que el MERS mata a su huésped humano con más frecuencia que el SARS (20-40% frente al 9 % para el SARS [14] ) [15] [16] [17] [19]. El MERS-CoV se propaga esporádicamente entre las personas, causando enfermedades más graves entre los adultos mayores, especialmente los varones, con enfermedades preexistentes.La propagación del MERS-CoV entre los seres humanos se ha asociado a menudo con brotes en los hospitales, con alrededor del 20% de todos los casos hasta la fecha en los que han participado trabajadores de la salud (HCWs).Aunque los DC parecen sufrir el equivalente a un "frío común" de la infección por MERS-CoV, en los seres humanos el virus puede ser un patógeno más grave y oportunista asociado con la muerte de hasta el 40% de los casos notificados. Aún no se ha establecido si las infecciones que se cree que se han adquirido de una fuente animal producen un resultado más grave que los que se propagan entre los seres humanos [20]. Los estudios han establecido que el período medio de incubación para el MERS es de cinco a seis días, que van de dos a 16 días, con 13 a 14 días entre el inicio de la enfermedad en una persona y posteriormente se extiende a otra [21] [22] [23]. Entre aquellos con enfermedad progresiva, la mediana de tiempo hasta la muerte es de 11 a 13 días, que van de cinco a 27 días [23, 24]. La fiebre y los síntomas gastrointestinales pueden formar un pródromo, después de lo cual los síntomas disminuyen, sólo para ser seguidos por un síndrome sistémico y respiratorio más grave [25, 26]. La primera definición de caso de la OMS [27] definió los casos probables de MERS basados en la presencia de enfermedad febril, tos y el requisito de hospitalización con sospecha de compromiso del tracto respiratorio inferior (RTL), incluyendo también roles para el contacto con un caso probable A partir de julio de 2013, la definición revisada del caso de la OMS incluía la importancia de buscar y comprender el papel de los casos asintomáticos y, a partir de junio de 2014, la definición de la OMS indicaba más claramente que un caso confirmado incluía a cualquier persona cuya muestra fuera RT-PCR positiva para MERS-CoV, o que produjera una seroconversión, independientemente de los signos y síntomas clínicos. [28] [30] Aparte de los informes de la OMS y del Ministerio de Salud de la KSA, los casos asintomáticos o subclínicos de infección por MERS-CoV se documentaron en la literatura científica, aunque no siempre tan a menudo como ocurrió a principios de [31, 32]. La definición del caso de la KSA se hizo más estricta el 13 de mayo de 2014, basándose en la presencia de ambas características clínicas y confirmación de laboratorio [33]. Las pruebas de personas asintomáticas fueron recomendadas a partir de diciembre de 2014 [34], reforzadas por una definición de caso publicada por el Ministerio de Salud de la KSA en junio de 2015 [35]. La KSA ha sido la fuente del 79 % de los casos humanos. El MERS severo es notable por su impacto entre los hombres mayores con enfermedades comorbidas, incluyendo diabetes mellitus, cirrosis y diversas afecciones pulmonares, renales y cardíacas [36] [38]. Interesantemente en junio de 2015, un brote en Corea del Sur siguió una distribución similar [39, 40]. Entre los casos confirmados en laboratorio, los signos y síntomas de fiebre, tos y tracto respiratorio superior (URT) generalmente ocurren primero, seguidos en una semana por trastornos progresivos de TL y linfopenia [37]. Los pacientes a menudo se presentan a un hospital con neumonía o peor, y se han notificado infecciones Según se informa, el MERS ha matado aproximadamente el 35 % de todos los casos notificados, el 42 % de los casos en la KSA, pero sólo el 19 % de los casos en Corea del Sur, donde la mortalidad osciló entre el 7 % entre los grupos de edad más jóvenes y el 40 % entre los de 60 años o más [42] ; todos pueden ser valores inflados con infecciones asintomáticas o leves a veces no buscadas o no reportadas [34]. La atención de apoyo general es clave para tratar los casos graves [43]. Rara vez se informa que los niños menores de 14 años son positivos para la MERS-CoV, que comprende sólo el 1,1% (n = 16) del total de casos notificados. Entre el 1 de septiembre de 2012 y el 2 de diciembre de 2013, un estudio describió el recuento de casos pediátricos en la KSA, que se situaba en 11 (dos a 16 En Amman (Jordania), se probaron 1.005 muestras de niños hospitalizados menores de dos años con fiebre y/o signos y síntomas respiratorios, pero ninguna fue positiva para ARN MERS-CoV, a pesar de haber sido recolectadas en un momento similar al primer brote conocido de MERS-CoV en la ciudad vecina de Al-Zarqa [45]. Un segundo trimestre de mortinato ocurrió en una mujer embarazada durante una enfermedad respiratoria aguda y aunque no fue RT-rtPCR positivo, la madre desarrolló posteriormente anticuerpos contra MERS-CoV, sugestivos de infección reciente [46]. Su historia de exposición a un pariente positivo de MERS-CoV RT-rtPCR y un esposo anticuerpo reactivo, su período de incubación y su historia sintomática cumplieron los criterios de la OMS para ser un probable caso de MERS-CoV [46]. Los métodos de diagnóstico se publicaron dentro de los días del correo electrónico ProMED anunciando el primer caso MERS [47], incluyendo varios ensayos RT-rtPCR (Fig. 2 ) y cultivo de virus en células Vero y LLC-MK2 [18, 47, 48]. Un adenocarcinoma colorrectal (Caco-2 ) línea celular epitelial ha sido recomendado desde entonces para el aislamiento de infecciones MERS-CoV [49]. Anteriormente [18].. Los marcos de lectura abiertos se indican como rectángulos amarillos entre corchetes por regiones terminales no traducidas (UTR; rectángulos grises ). FS-frame-shift. Las regiones predictas que abarcan puntos de ruptura de recombinación se indican por píldoras naranjas. Creado utilizando Geneious v8.1 [211] y anotado usando Adobe Illustrator. Bajo este esquema se muestra la ubicación de los imprimadores RT-PCR (las flechas azules indican la dirección) y oligoprobes (rectángulos verdes) utilizados en los primeros ensayos de cribado RT-rtPCR y en los convencionales, seminés (tres imprimaciones) RT-PCR confirmatorios de secuenciación [47, 48]. El orden de publicación se observa por primera [27 de septiembre de 2012; rojo] y segundo [6 de diciembre de 2012; naranja] rectángulos de color; ambos de Corman y otros [47, 48] Los ensayos recomendados por la OMS se destacan debajo por puntos amarillos [53]. El imprimador reverso NSeq ha contenido consistentemente una secuencia incompatibilidad con algunas variantes de MERS-CoV. Una versión alterada de la de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio del Oriente Medio: Una Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con el permiso de Elsevier [5] revisó el amplio tropismo de MERS-CoV [5]. Sin embargo, como se describe bien, el cultivo celular es un método lento, especializado e insensible [50] mientras que las técnicas basadas en PCR son el método preferido para la detección de MERS-CoV. Los primeros marcos de lectura abiertos (ORF 1a y 1b; Fig. 2) se han convertido en un objetivo diagnóstico clave y taxonómico para la identificación de especies CoV. Con menos del 80 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de MERS ORF 1ab y parientes del betacoronavirus, Tylonycteris Bat HKU4 y Pipistrellus Bat HKU5, se puede concluir que es un virus novedoso y distinto. Las proteínas estructurales incluyen el pico (S), la envoltura (E), la membrana (M) y el nucleocápsido (N) [52]. Se prevé que los productos de ORF1a y ORF1b codificarán proteínas no estructurales. La mayoría de los ensayos de muestras realizados hasta la fecha han empleado ensayos RT-rtPCR validados que han demostrado ser sensibles y específicos [47, 48, 53]. El kit de RealStar® utiliza estos ensayos recomendados por la OMS [54]. Las secuencias objetivo de estos ensayos de cribado no han cambiado entre los genomas examinados hasta al menos mediados de 2015 (observación IMM). Otros ensayos RT-rtPCR han sido desarrollados y validados para su uso como herramientas de diagnóstico basadas en laboratorio [55] [56]. Además, los ensayos isotérmicos [58, 59] o recombinasa polimerasa [60] La detección del antígeno MERS-CoV no ha sido común hasta la fecha, pero la combinación de corto tiempo de retorno de la prueba al resultado, alto rendimiento e identificación de proteínas virales hace que esta opción sea atractiva. La detección de proteínas virales en lugar de ARN viral indica la probable presencia de virus infecciosos. La primera herramienta inmunocromatográfica rápida descrita podría detectar proteína nucleocápsida MERS-CoV recombinante de hisopos nasales DC con sensibilidad al 94 % y especificidad al 100 % en comparación con RT-rtPCR [61]. Un enfoque diferente utilizó una captura basada en anticuerpos monoclonales ELISA dirigida a la proteína nucleocápsida MERS-CoV con una sensibilidad de 10 3 CCID 50 y especificidad al 100 % [62]. La demostración de una seroconversión a una infección por MERS-CoV cumple con la definición actual de la OMS de un caso tan optimizado y ampliamente validado que los seroensayos empleados junto con buenas historias clínicas son útiles para identificar la infección por MERS-CoV y ayudar a apoyar estudios de transmisión. Debido a que las pruebas serológicas son, por su naturaleza, retrospectivas, es habitual detectar una huella viral, en forma de anticuerpos, en ausencia de signos o síntomas de enfermedad y a menudo en ausencia de ARN viral [63]. Las seroencuestas estratégicas y generalizadas de seres humanos que utilizan muestras recogidas después de 2012 son infrecuentes. Gran parte de la Península Arábiga y todo el Cuerno de África carecen de datos de referencia que describan la proporción de la comunidad que puede haber sido infectada por un MERS-CoV. Sin embargo, las seroencuestas han tenido un uso Debido a la identidad compartida entre DC y el MERS-CoV humano (ver epidemiología molecular: utilizando genomas para entender brotes), los ensayos serológicos para las seroencuestas de DC deben ser transferibles al cribado humano con una reconfiguración mínima. Además, no se ha encontrado ninguna variación diagnóstica relevante en la actividad de neutralización entre una gama de aislados y seras testados de MERS-CoV circulantes, por lo que los seroensayos de virus enteros o específicos basados en proteínas deben funcionar de manera equivalente en la detección de respuestas serológicas al serotipo único de MERS-CoV [49]. El desarrollo de ensayos serológicos robustos requiere paneles confiables de sueros animales o humanos bien caracterizados, incluidos los positivos para anticuerpos específicos del MERS-CoV, así como para fuentes probables de reacción cruzada [64]. La obtención de estos materiales fue problemática y enlenteció el desarrollo y comercialización de ensayos de detección de anticuerpos para ensayos humanos [64]. Se han liberado varios kits comerciales de ELISA, kits de ensayos inmunofluorescentes (IFA), proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales [31, [65] [66] [68]. Inicialmente, se utilizaron IFAs convencionales para seroencuestas humanas. Estos se basaron en el cultivo celular infectado por MERS-CoV como fuente de antígeno, detectando la presencia de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV IgG, IgM o neutralizantes en muestras humanas [18, 48, 69]. No se encontró ningún signo de anticuerpos MERS-CoV entre 2.400 sueros de pacientes que visitaron el Hospital de Jeddah, desde 2010 hasta 2012, antes de la descripción de MERS-CoV [18]. Los métodos IFA tampoco detectaron ningún signo de infección previa por MERS-CoV entre una pequeña muestra de 130 donantes de sangre sanos de otro hospital de Jeddah (recogida entre enero y diciembre de 2012) [70]. De 226 trabajadores del matadero, sólo ocho (3,5%) fueron positivos por IFA, y los sueros no pudieron ser confirmados por la prueba de neutralización del virus (NT). El estudio indicó que HCoV-HKU1 era una fuente probable de antígenos de reacción cruzada en todo el virus IFA [70]. El virus completo MERS-CoV IFA también sufrió alguna reactividad cruzada con el SRAS convaleciente sera y esto no pudo resolverse mediante una prueba de NT que también fue reactiva [71]. La IFA utilizando proteínas recombinantes en lugar del virus entero IFA, ha demostrado ser una herramienta más específica [31]. Dado que se han postulado zoonosis asintomáticas [72], la ausencia de anticuerpos contra el MERS-CoV entre algunos humanos que tienen contacto regular y estrecho con camellos puede reflejar la rareza de animales infectados activamente en carnicerías, un riesgo de transmisión limitado asociado con DCs de sacrificio [70], un estado inmune cruzado de protección preexistente o algún otro factor(s) que resulta en un bajo riesgo de enfermedad y seroconversión concurrente que se desarrolla después de la exposición en este grupo. IFA usando proteínas recombinantes en su lugar. Algunos seroensayos han pasado por alto los riesgos de trabajar con virus infecciosos al crear células transfectadas que expresan porciones recombinantes de las proteínas nucleocápsidas y punzantes del MERS-CoV [48, 73], o utilizando un lentivirus recombinante que expresa la proteína de pico del MERS-CoV Un ensayo de pseudoneutralización de partículas (ppNT) ha sido ampliamente utilizado en estudios en animales y fue al menos tan sensible como la prueba tradicional de microneutralización (MNT). [10, 74, [76] [77] [78] ] Los estudios que utilizaron pequeños números de muestra y ppNT no encontraron evidencia de anticuerpos neutralizantes MERS-CoV en sueros de 158 niños con infecciones de LRT entre mayo de 2010 y mayo de 2011, 110 sera de 19 a 52 años de edad donantes de sangre masculina y 300 trabajadores autoidentificados de animales de la Región Jazan de la KSA durante 2012 [79, 80]. Del mismo modo, un estudio de cuatro pastores en contacto con una manada infectada de DC en Al-Ahsa, ocho personas que tenían contacto intermitente con la manada, 30 veterinarios y personal de apoyo que no estaban expuestos a la manada, tres trabajadores de mataderos no protegidos en Al-Ahsa y 146 controles que no estaban expuestos a DC en ningún rol profesional, no encontró ninguna evidencia serológica de infección por MERS-CoV en el pasado utilizando el ensayo ppNT [10]. Un retraso en la respuesta de anticuerpos neutralizantes a la infección por MERS-CoV se asoció con un aumento de la gravedad de la enfermedad en los casos de Corea del Sur con la mayoría de las respuestas detectables en la tercera semana de enfermedad, mientras que otros, aunque la enfermedad era grave, no respondieron durante cuatro o más semanas [81]. Las implicaciones para nuestra capacidad de detectar cualquier respuesta en casos leves o asintomáticos no fueron exploradas, pero Un brote jordano de TRT aguda en un hospital en 2012 se encontró retrospectivamente asociado a la infección por MERS-CoV, utilizando inicialmente RT-rtPCR, pero posteriormente, y en una escala mayor, a través de la positividad por ELISA y la prueba IFA o MNT. [46, 82, 83] Este brote fue anterior al primer caso de MERS en la KSA. La ELISA utilizó una proteína nucleocápsida recombinante del grupo 2 betacoronavirus bat-CoV HKU5 para identificar anticuerpos contra la proteína MERS-CoV reactiva equivalente [71]. Se validó utilizando 545 sera recolectada de personas con HCoV-OC43, HCoV-229E, SARS-CoV, HCoV-NL63, HRV, HMPV o influenza A(H1N1), pero fue supuestamente menos específica que la I También se consideró una herramienta aplicable para el cribado de grandes números de muestra [82]. Un microarray de proteína que expresa la subunidad de proteína S1 ha sido validado y ampliamente utilizado para las pruebas de DC [5, 84]. Detección de infección por MERS-CoV usando microarray de proteína ELISA o S1 [84] suele ser seguido por IFA confirmatoria y/ o una neutralización de reducción de placa (PRNT) [69, 70, 85] o MNT test. [74, 85, 86] Este proceso confirmatorio tiene como objetivo asegurar que los anticuerpos detectados sean capaces de neutralizar específicamente el virus previsto y no sean más ampliamente reactivos a otros coronavirus encontrados en DCs (coV bovina, BCoV) o humanos (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS En el estudio más grande de sueros humanos, un proceso de diagnóstico escalonado asignó tanto el SERA positivo recombinante como el SERA ELISA recombinante a la seropositividad 'etapa 1'. Un resultado seropositivo en estadio 2 requirió además un resultado PRNT adecuadamente titulado [87]. El estudio encontró que 15 SERA recolectados en 2012 a 2013 de 10.009 (0,2%) personas en 13 provincias KSA contenían anticuerpos MERS-CoV, pero proporciones significativamente mayores en se produjeron en pastores de camellos (dos de 87; 2,3 %) y trabajadores de mataderos (cinco de 140; 3,6 %) [87]. Se necesitan encuestas contemporáneas. MERS-CoV no parece ser fácilmente transmitido de DCs a los seres humanos, o tal vez es [72], pero generalmente no desencadena una respuesta inmune detectable si sólo se producen enfermedades leves o infecciones asintomáticas. Los ensayos serológicos necesitan una validación adicional en esta área, por lo que es necesario tener cuidado al trasladar algoritmos de serología diagnóstica de reciente desarrollo de un entorno de investigación a uno que informe las decisiones de salud pública, lo que se reforzó cuando un caso falso positivo en EE.UU., supuestamente infectado después de un apretón de manos y dos reuniones cara a cara, no resistió más análisis confirmatorios utilizando un ensayo NT más específico y posteriormente se retractó [88, 89]. La OMS recomienda tomar muestras de la TRL para las pruebas RT-rtPCR del MERS-CoV, especialmente cuando la recolección de muestras se retrasa una semana o más después del inicio de los síntomas. [53] Las muestras de TRL también son mejores para intentar aislar el virus infeccioso, aunque el éxito del cultivo se reduce cuando persiste la enfermedad [49]. Los tipos de muestras recomendados incluyen lavado broncoalveolar (BAL), aspirado traqueal/traqueobronquial, líquido pleural y esputo [53, 90]. Las muestras frescas arrojan mejores resultados diagnósticos que el material refrigerado [69] y si es probable que se produzcan retrasos en las pruebas de ≥72 h, las muestras (excepto sangre) deben congelarse a −70°C [90]. Si se dispone de ellas, también se pueden realizar biopsias pulmonares o tejidos de autopsia [53]. Sin embargo, la TRU es un lugar de muestreo menos invasivo y más conveniente, y se recomienda un hisopo orofaríngeo y de garganta o un aspirado/lavado nasofaríngeo cuando se va a realizar el muestreo de TRU [90]. Los sueros emparejados, recogidos de dos a tres semanas de diferencia son preferibles para las pruebas serológicas, mientras que se sugiere que una muestra única sea suficiente si se recogen dos semanas después de la aparición de la enfermedad o un único suero recogido durante los primeros 10-12 días si se realiza RT-rtPCR [53, 90]. Se ha encontrado que la orina y las heces humanas contienen ARN MERS-CoV 12 a 26 días después de la aparición de los síntomas [25, 69, 91] y se enumeran como muestras que deben considerarse [53, 90]. En dos casos que llegaron a los Países Bajos, la orina fue RT-rtPCR negativa pero las heces fueron débilmente positivas y los sueros fueron RT-rtPCR positivos durante cinco días o más [25]. El hallazgo de ARN viral MERS-CoV en el suero proporciona una vía para estudios retrospectivos basados en PCR La ARNemia también puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad; los signos de virus fueron eliminados del suero de un paciente recuperado, pero se mantuvo hasta la muerte de otro [92]. Los casos de sospecha clínica de MERS pueden devolver resultados negativos por RT-rtPCR. Los datos han demostrado que una o más muestras de URT negativas pueden ser contradichas mediante un muestreo adicional de URT o el uso de muestras de LRT, lo que se prefiere [2, 43, 93]. En la LRT se producen cargas virales más altas que en la URT. [22, 69, 88, 94] Esto concuerda con la observación de que la mayoría de los síntomas de la enfermedad se reportan como enfermedad sistémica y LRT [21]. Sin embargo, en ocasiones incluso los especímenes de LRT de los casos de MERS pueden ser inicialmente negativos, sólo para más tarde ser positivos por RT-PCR [95 Esto puede deberse a una mala toma de muestras cuando la tos está ausente o no es productiva o porque la carga viral es baja [95]. A pesar de esto, tanto los mayores estudios de MERS-CoV humanos [32, [96] [97] [98] y los más pequeños [22, 25, 99], utilizan muestras de la URT. Cabe destacar que un estudio reportó una asociación entre cargas más altas en la URT y peores resultados clínicos incluyendo cuidados intensivos y muerte [94]. Al escribir, no existen datos humanos para definir si el virus se replica única o preferentemente en la LRT o URT, o réplicas en otros tejidos humanos in vivo, aunque el ARN MERS-CoV se ha detectado tanto de la URT como de la LRT en un modelo de mono macaco [100].La distribución de DPP4 en las vías respiratorias superiores humanas tampoco está bien descrita. Los estudios individuales de casos humanos reportan largos periodos de eliminación viral, a veces intermitentes y no necesariamente relacionados con la presencia de síntomas de la enfermedad. [25, 69, 99, 101] En un caso, un HCW arroja ARN viral durante 42 días en ausencia de enfermedad [99]. Es un área de alta prioridad para entender mejor si estos casos son capaces de infectar a otros. Más de tres cuartas partes de los casos de MERS arrojan ARN viral en sus muestras de TL (aspirados traqueales y esputo) durante al menos 30 días, mientras que sólo el 30 % de los contactos seguían arrojando ARN en sus muestras de TRU [91, 102]. En el único estudio para examinar el efecto del tipo de muestra en el análisis molecular, se examinaron 64 aspirados nasofaríngeos (ANP; una muestra de TRU), 30 aspirados traqueales, 13 Los aspirados traqueales y el BAL devolvieron los valores de carga viral más altos seguidos por el NPA y el esputo. Como era de esperar, las cargas virales más altas generalmente coincidían con la secuenciación del genoma completo y el éxito del cultivo y, en las pruebas del NPA, estaban significativamente correlacionadas con enfermedades graves y muerte [49, 94, 103]. Este estudio demostró la importancia del muestreo de LRT para la secuenciación del genoma completo. Cuando se probó, las muestras positivas para el MERS-CoV a menudo son negativas para otros patógenos [25, 93, 104]. Sin embargo, muchos estudios no mencionan pruebas adicionales para virus respiratorios humanos endémicos [21, 23, 73, 105]. Cuando se buscan virus, se han incluido el herpesvirus humano (VHH), los rinovirus (VHR), los enterovirus (VVV), el virus sincitial respiratorio (VRS), el virus parainfluenzavirus tipos 1, 2 y 3 (VIP), los virus de la gripe (VFI), los HCoV endémicos, los adenovirus (VCD) metapneumovirus (VPM) y el virus influenza A\H1N1; en ocasiones se han encontrado codetecciones con MERS-CoV [2, 22, 37, 69, 97]. A veces se incluyen pruebas bacterianas (por ejemplo, para Legionella y Pnemocococcus), pero el impacto de la copresencia bacteriana tampoco está claro [22, [104] [105] [106]. Otras pruebas de la muestra de TRL del primer caso del MERS utilizaron IFA para detectar algunos virus (negativos para IFV, PIV, RSV y AdVs) y RT-PCR para otros (negativos para AdV, EV, MPV y HHVs) [18]. RT-PCR también detectó MERS-CoV. La OMS recomienda encarecidamente pruebas para otros patógenos respiratorios [53] pero con esta recomendación a menudo descontada, hay datos limitados para abordar la ocurrencia y el impacto de coinfecciones o diagnósticos virales alternativos entre ambos casos del MERS y sus contactos. Poco se sabe de otras causas de neumonía similar al MERS en el KSA o de la carga general de enfermedad debido a los virus respiratorios clásicos conocidos. Pruebas de peregrinos adultos que realizan el Hajj en 2012 a 2014 no ha detectado ningún MERS-CoV. En 2012, se realizaron pruebas de hisopos nasales de 154 peregrinos recogidos antes de partir hacia el KSA o partir de él [47]. En 2013, las pruebas se ampliaron significativamente con 5.235 hisopos nasofaríngeos de 3.210 peregrinos entrantes y 2.025 hisopos de peregrinos salientes probados [98]. Cabe señalar que la mayoría de los peregrinos llegaron de países libres de MERS. Se tomaron otros 114 hisopos de peregrinos con enfermedad similar a la gripe [96, 107]. En reuniones anteriores del Hajj, se descubrió que los virus de la gripe circulaban ampliamente, mientras que otros virus, a menudo rinovirus, circulaban de manera más selectiva, interpretando que indicaban su importación junto con peregrinos extranjeros [107] [108] [108] Con el tiempo, el aumento de la vacunación contra la gripe se ha acreditado como una disminución de la prevalencia de enfermedades similares a la gripe entre los peregrinos [110] A menudo no se recoge una muestra de TRL para estos estudios [98, 107, 109], por lo que los hallazgos negativos falsos son una posibilidad, aunque poco se sabe sobre el sitio inicial de infección y replicación del MERS-CoV; se puede haber supuesto que fue la TRL porque la enfermedad se notó por primera vez allí, pero la TRL puede ser el lugar de la replicación más temprana. En Jeddah entre marzo y julio de 2014 (en adelante, el brote de Jeddah-2014; Fig. 3 ), hubo un rápido aumento en los casos del MERS, acompañado de un intenso cribado; aproximadamente 5.000 muestras de dentro y alrededor de la región se probaron en un mes, produciendo alrededor de 140 detecciones del MERS-CoV (prevalencia ~3 %) [111]. Entre los 5.065 individuos muestreados y analizados en la KSA entre octubre de 2012 y septiembre de 2013, se realizaron 108 (2,1%) detecciones en una población hospital-céntrica que incluyeron casos hospitalizados (n = 2.908; 57,4 %), sus familias (n = 462; 9,1 %) y HCW asociados (n = 1.695; 33,5 %) [32]. Entre las detecciones, 19 (17,8 %) eran HCW y 10 (9,3 %) eran contactos familiares [32]. La prevalencia del 2-3 % de infecciones activas por MERS-CoV no es diferente a la prevalencia hospitalaria de otras COV humanas. [112] Sin embargo, la proporción de muertes entre los infectados por MERS-CoV es mucho mayor que la conocida por los HCoV NL63, HKU1, 229E u OC43 en otros países, e incluso superior a la de SRAS-CoV; no es un virus que pueda razonablemente ser descrito como una "tormenta en una taza de té". Es la baja tasa de transmisión que ha evitado la propagación mundial, a pesar de muchas "oportunidades". Muy temprano en el brote de MERS, algunos animales fueron altamente considerados como el reservorio o huésped(s) intermedio(s) de MERS-CoV con tres de los cinco primeros casos que tuvieron contacto con DCs [73, 113, 114]. Hoy en día, las infecciones por MERS-CoV animales deben ser reportadas a la organización mundial para la salud animal como una enfermedad emergente [115]. Un resumen de los primeros casos de MERS reportados por la OMS definió el contacto animal con humanos como directo y dentro de los 10 días previos al inicio de los síntomas [20]. Esta definición no permitió específicamente la adquisición de DCs a través de una vía basada en gotitas, que es muy probable que sea la vía de adquisición de un virus que inicialmente y predominantemente causa enfermedad respiratoria [23]. Se sabe que los camellos producen altos niveles de ARN MERS-CoV en su URT y pulmones [116]. Proporcionando apoyo para una vía de transmisión de gotitas y tal vez indicando la presencia de ARN en núcleos más pequeños y secos de gotitas, se identificó ARN MERS-CoV en una muestra de aire de alto volumen recogida de un granero que alberga un DC infectado [117]. La fuente precisa de la que los humanos adquieren MERS-CoV sigue siendo poco estudiada pero parece probable Estos factores pueden resultar importantes para los casos humanos que no describen ningún contacto DC [119] ni ningún contacto con un caso confirmado. Si la definición de contacto con animales de la OMS es suficiente para identificar la exposición a este virus respiratorio no está clara. La formulación se centra en el consumo de productos DC, pero no atribuye específicamente el riesgo a una vía de gotitas para la adquisición de MERS-CoV desde DC [120]. Algunos pacientes MERS se enumeran en los avisos de enfermedad de la OMS como próximos a los DCs o granjas, pero los individuos no han descrito entrar en contacto con los animales. No se reporta ninguna vía alternativa para adquirir infección en muchos de estos casos. Lo que constituye una definición de "contacto" durante estas entrevistas se ha definido para un estudio [72]. A pesar de esta falta de claridad, la OMS considera que la evidencia que vincula la transmisión de MERS-CoV entre DCs a humanos es irrefu La posibilidad de que los murciélagos fueran un huésped animal de MERS-CoV fue ampliamente discutida inicialmente debido a la diversidad existente de coronavirus conocidos por residir entre ellos [121] [122] [123]. Evidencia concluyente que apoya a los murciélagos como fuente de infecciones humanas por MERS-CoV todavía no se ha encontrado, pero los murciélagos parecen albergar a los representantes ancestrales [53, 125]. Sin embargo, estas no son variantes del mismo virus ni siempre dentro del mismo linaje filogenético que MERS-CoV; cada uno son un virus genéticamente distinto. La infección de murciélago a humano por MERS-CoV es un evento puramente especulativo. La única pieza de evidencia específica del MERS-CoV que apunta a los murciélagos se origina en la amplificación de un fragmento de 190 nt del gen ARN dependiente de la polimerasa del genoma del MERS-CoV, identificado en un pellet fecal de un murciélago insectívoro Emballonuridae, Taphozous perforatus encontrado en Bisha, el KSA [121]. Aunque muy corta, la secuencia del fragmento lo definió como un descubrimiento diagnóstico. Posteriormente se informó de un enlace a los DC [85] y ese enlace ha madurado en una asociación verificada [38, 126] (Fig. 4). (Véase la figura en la página anterior.) Fig. 3 Detecciones mensuales de MERS-CoV (barras azules) y de casos que murieron (barras rojas) con algunas fechas de interés marcadas para 2012 al 4 de septiembre de 2015. Se indica una aproximación de cuando la estación de parto DC [128] y cuando los DC recién nacidos son destetados. La primavera (verde) y el verano (naranja) en la Península Arábiga también están sombreados. Tenga en cuenta la escala del eje y de la izquierda para 2014 y 2015 que es mayor que para 2012/13. Fuentes de estos datos públicos incluyen la OMS, Ministerios de Salud y FluTrackers [207] [209] [209]. Versiones anteriores y posteriores de este gráfico se mantienen en un blog personal [210]. Modificado y reimpreso de Mackay IM, Arden KE. Síndrome respiratorio de Oriente Medio: Una infección por coronavirus emergente rastreada por la multitud. Virus Res 2015 Vol 202:60-88 con permiso de Elsevier [5] Los DCs, que constituyen el 95 % de todos los camellos, tienen una presencia central en la El contacto puede ser común y puede ocurrir de diversas maneras (Fig. 4a). Hay varios grandes festivales, razas, ventas y desfiles bien atendidos que cuentan con DCs y DCs también son mantenidos y criados cerca de áreas pobladas en el KSA [127, 128]. La leche y la carne DC son ampliamente consumidas y el DC más viejo es un animal de importancia ritual después de la peregrinación del Hajj [129]. Sin embargo, la frecuencia de infección del MERS-CoV es mucho menor que el hábito generalizado y frecuente de comer, beber y preparar productos DC. La ingestión diaria de leche DC fresca no pasteurizada es común entre los beduinos del desierto y muchos otros en el KSA. La orina DC también se consume o se utiliza para supuestos beneficios para la salud. A pesar de que la carnicería de camellos es una ocupación local, ni los carniceros ni otros grupos en riesgo son identificables entre los casos de MERS; esto puede ser simplemente un problema de información en lugar de una ausencia inexplicable de MERS. Un pequeño estudio de casos y controles publicado en 2015 identificó el contacto directo con la DC, y no la ingestión de productos, para estar asociado con la aparición de MERS [38]. La primera investigación sero-encuesta de ganado que vive en la región de Oriente Medio se llevó a cabo durante 2012-2013 [85]. Los DCs fueron muestreados a partir de una manada de canarios nacidos principalmente y de DCs omaníes (originalmente importados del Cuerno de África) [85]. b Las infecciones de camello a humano parecen ser poco frecuentes, mientras que la propagación de la infección de ser humano a ser humano se ve facilitada regularmente por una CIP deficiente en los entornos de salud donde se amplifica la transmisión, lo que explica la mayor parte de los casos. Hay casos de MERS humanos que no entran en ninguna de las categorías de origen y no está claro si estas infecciones adquiridas a través de alguna vía totalmente separada, o de casos que escaparon al diagnóstico. c Las formas hipotéticas en las que la subclínica (cuando la infección puede no alcanzar un umbral clínico previamente definido de signos y/o síntomas) o asintomáticas (sin signos obvios ni medidos, observados o recordados de enfermedad) la infección por MERS-CoV puede estar implicada en la transmisión DC sera podría neutralizar MERS-CoV mientras que todas las seras DC de Omán tenían niveles elevados de anticuerpos neutralizantes específicos de MERS- Desde este estudio, una serie de informes revisados por pares han analizado tanto a los DCs como a otros animales, y la posibilidad de que puedan albergar la infección por MERS-CoV. Se han encontrado DCs seropositivos en toda la Península Arábiga, incluyendo Omán, la KSA, Qatar, Jordania, los Emiratos Árabes Unidos (EAU), Kuwait así como Sudán, Somalia, Egipto, Túnez, Nigeria, Kenia y Etiopía en África y las Islas Canarias [85, [130] [133] [133] [134]. Otros animales probados incluyen ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, mulas, aves, búfalos acuáticos, cabras, camellos bactrianos, llamas y guanacos (camélidos suramericanos) pero ninguno tenía anticuerpos neutralizantes detectables contra MERS-CoV [4, 74, 78, 85, 86, 135, 136]. No se han notificado hasta la fecha estudios de virología o serología de muestras humanas procedentes de zonas de África donde hay camellos con antecedentes de MERS-CoV. Sin embargo, la ausencia de neumonía inexplicable que pueda atribuirse a la infección por MERS-CoV puede no indicar la ausencia de virus entre los seres humanos en cada país, sino simplemente reflejar la falta de costosos estudios de epidemiología realizados por países pobres en recursos. Por lo tanto, no está claro si el MERS-CoV, o una CoV relacionada con antígenos, es un patógeno no reconocido en estas regiones, quizás circulando durante más tiempo del que se ha conocido en la Península Arábiga [133]. El ARN del MERS-CoV también se ha detectado en muestras de DC, y también se ha logrado la recuperación del virus infeccioso a partir de muestras de DC [4, 77, 117, 132, [137] [139] De algunos de ellos, se han secuenciado genomas completos o mayoritarios de MERS-CoV [77, 137, 138]. Las versiones DC de MERS-CoV fueron tan similares entre sí, como las variantes detectadas de diferentes seres humanos a lo largo del tiempo y a lo largo de la distancia. Los ensayos de detección de anticuerpos anticuerpos también han detectado anticuerpos cruzados en sera. Estos se identificaron como tales mediante la detección de sera contra virus similares, por ejemplo BCoV o HCoV-OC43 (como facsímil antigénico para BCoV). Es posible que otros virus similares a MERS-CoV también residan dentro de los DCs, pero esto no menoscaba el hallazgo definitivo de secuencias genéticas de MERS-CoV tanto en DCs como en humanos [117, 142, 143]. Los estudios de detección han demostrado que los DC juveniles son más a menudo positivos para el virus o el ARN viral, mientras que los DC mayores son más propensos a ser seropositivos y ARN o virus negativos [76, 77, 144]. En los DC adultos, se ha detectado ARN MERS-CoV entre animales con anticuerpos preexistentes, lo que sugiere que es posible la reinfección [77, 144]. Las cargas virales entre DC positivos pueden ser muy altas [4, 76, 77, 139, 144] y DCs se han encontrado positivos tanto cuando están enfermos con signos respiratorios de TRU [77, 117, 142, 145] o cuando aparentemente sanos [137]. Estos hallazgos indican que los DCs hospedan infecciones naturales MERS-CoV. Además, los sera DC almacenados han revelado signos de MERS-CoV en DCs que datan de hace más de tres décadas (los más tempranos Los sera más viejos no han sido probados y, por lo tanto, cuánto tiempo los DC han sido afectados por MERS-CoV, si el virus es enzoótico entre ellos, introducidos hace décadas o siglos de murciélagos en África o la Península Arábiga, o son objeto de incursiones virales regulares pero de corta duración de un huésped aún desconocido, no pueden ser respondidos. Los investigadores buscaron determinar una dirección para la infección; estaban los DC transmitiendo virus a los seres humanos o estaban los humanos infectando DC? En un sitio de Qatar, un propietario de una granja y su empleado se enfermaron a mediados de octubre de 2013 y dieron positivo para el ARN MERS-CoV en una muestra de esputo y hisopos de garganta, respectivamente. RT-rtPCRs encontró MERS-CoV ARN en 11 de 14 hisobas nasales de DC positivas en la granja; seis (43 %) positivos Los resultados indicaron que se había producido un brote reciente en este rebaño; la primera indicación de ARN MERS-CoV encontrado en DCs con una asociación temporal a infecciones humanas; tres muestras de DC positivas fueron confirmadas por secuenciación de una porción de 358 nt del gen de la espiga; estas secuencias eran idénticas unas a otras, de nuevo con homología cercana a otras secuencias humanas y DC MERS-CoV [138]. Los DCs y contactos humanos produjeron secuencias ORF1a y ORF4b que diferían por un solo nucleótido cada una, agrupando estrechamente con la variante Hafr-Al-Batin_1_2013 [138]. Estudios de casos posteriores encontraron evidencia de una infección humana y DC concurrente y la dirección de esa infección fue inferida a partir de los DCs enfermos y a sus propietarios humanos [117, 142, 146]. Las secuencias del genoma parcial indicaron que un humano y un DC positivo de la RT-RTPCR del MERS-CoV habían sido infectados por una variante del mismo virus, albergando el mismo patrón distinto de polimorfismos de nucleótidos. [142] Todos los nueve DC en la manada del propietario, muestreados en serie, reaccionaron en un antígeno S1 recombinante ELISA, con los dos animales que habían sido positivos de la RT-rtPCR mostrando un pequeño aumento verificable del título de anticuerpos [142]. Un aumento del título teóricamente comienza 10 a 21 días después de la infección de la DC [142]. Los autores sugirieron que el aumento del título en la suera de la DC que ocurrió junto con una disminución de la carga de ARN, mientras que el paciente estaba activamente enfermo y hospitalizado, indicó que los DC fueron infectados primero seguidos por el propietario [117, 142]. Los anticuerpos BCoV también estuvieron presentes, y aumentaron en uno de los dos animales positivos RT-rtPCR, pero ninguno de ellos pudo neutralizar la infección BCoV [142]. La temporada de parto en camellos se produce en los meses de invierno (entre finales de octubre y finales de febrero; Fig. 3 ) y este puede ser un momento en el que existe un mayor riesgo para los seres humanos de derrames debido a nuevas infecciones entre las poblaciones de DC ingenuas [128]. ¿Qué papel podría desempeñar el anticuerpo de camello materna en el retraso de la infección de terneros sigue siendo desconocido [128, 142]. Los DC juveniles parecen tener una infección activa con más frecuencia que los DC adultos y, por lo tanto, el sacrificio de los DC, que debe ser de cinco años de edad o más (llamados a thane), puede no ir acompañado de un riesgo significativo de exposición a la infección. A diferencia de los resultados anteriores, los trabajadores de los mataderos que matan tanto a los DC más jóvenes como a los más viejos, pueden ser un grupo ocupacional con una incidencia significativamente mayor de seropositividad a la MERS-CoV cuando los animales tienen infecciones activas por MERS-CoV [129, 139, [147] [148] [149]. Las investigaciones virológicas ampliadas de los DC africanos pueden dar lugar a animales más seropositivos y zonas geográficas en las que los seres humanos pueden estar en riesgo. Es posible que haya zonas en las que los seres humanos ya albergan infecciones por MERS-CoV que no se han identificado debido a la ausencia de vigilancia de laboratorio. Las investigaciones virológicas de los murciélagos pueden dar lugar a hallazgos de virus ancestrales y "eslabones de pérdida viral" e identificar cualquier otra fuente animal de propagación zoonótica es importante para informar opciones para reducir la exposición humana [56, El MERS-CoV infeccioso añadido a la leche de CC, cabra o vaca y almacenado a 4 °C podría recuperarse al menos 72 h más tarde y, si se almacena a 22 °C, la recuperación fue posible hasta 48 h [150]. El título de MERS-CoV disminuyó un poco cuando se recuperó de la leche a 22 °C, pero la pasteurización completamente ablada Infectividad MERS-CoV [150]. En un estudio posterior, se identificó ARN MERS-CoV en la leche, secreción nasal y heces de DCs de Qatar [151]. Un estudio único ha examinado la capacidad de MERS-CoV para sobrevivir en el medio ambiente [150]. Las superficies plásticas o de acero fueron inoculadas con 10 6 TCID 50 de MERS-CoV a diferente temperatura y humedad relativa (RH) y se A alta temperatura ambiente (30°C) y a baja RH (30 %) MERS-CoV permaneció viable durante 24 h [150]. En comparación, un virus respiratorio bien conocido y eficientemente transmitido, el virus influenza A, no pudo recuperarse en cultivo más allá de cuatro horas bajo ninguna condición [150]. Los experimentos de Aerosol encontraron que la viabilidad del MERS-CoV sólo disminuyó un 7 % a baja RH a 20°C. En comparación, el virus influenza A disminuyó un 95 % [150]. La supervivencia del MERS-CoV es inferior a la demostrada previamente para el SARS-CoV [152]. En el contexto, las bacterias patógenas pueden permanecer viables y en el aire durante 45 minutos en un aerosol tosido y pueden propagarse 4 m. La capacidad de MERS-CoV para permanecer viable durante largos períodos de tiempo le da la capacidad de contaminar completamente las superficies de Se desconoce si el MERS-CoV puede permanecer a la deriva e infeccioso durante períodos prolongados (verdaderamente aerotransportado) y si estos hallazgos amplían nuestra comprensión de las posibilidades de que las gotitas transmitan virus respiratorios en muchos entornos, incluyendo salas de espera hospitalarias, departamentos de emergencia, salas de tratamiento, instalaciones de cuidados intensivos abiertos y salas privadas de pacientes. La naturaleza y calidad del intercambio de aire, circulación y filtración son variables importantes en la medición y reducción del riesgo, así como el uso de salas de presión negativa para contener casos conocidos. Se considera que la propagación de la gota entre humanos es el mecanismo de transmisión humana a humana y se hizo hincapié en la necesidad de precauciones de las gotas después del hospital Al-Ahsa, la KSA y los brotes de Corea del Sur [21, 23, 154, 155]. La provisión de pruebas que apoyen la mejor formulación de equipos de protección personal para ser usados por los HCW que reciben, manejan o realizan procedimientos en casos infecciosos sigue siendo una prioridad. MERS-CoV fue encontrado y caracterizado por su aparente asociación con enfermedades graves, y por lo tanto más obvias, en humanos; éramos canarios en la mina de carbón. Seroensayos y estudios prospectivos de cohortes todavía no han determinado hasta qué punto los casos más leves o asintomáticos contribuyen a las cadenas de transmisión de MERS-CoV. Sin embargo, la transmisión de MERS-CoV se define como esporádica (no sostenida), intrafamiliar, a menudo asociada a la atención médica, ineficiente y que requiere contacto cercano y prolongado [22, 31, 63, 93, 97, 102, 156] En un estudio doméstico, 14 de 280 (5 %) contactos de 26 pacientes con índice positivo de MERS-CoV eran ARN o anticuerpos positivos; la tasa de transmisión general, incluso en brotes es de alrededor del 3 % [31]. Parece que la mayoría de los casos humanos de MERS-CoV, incluso cuando los números parecen aumentar repentinamente, no transmiten fácilmente a más de otro humano hasta la fecha, la epidemia localizada de MERS-CoV no ha sido autosostenible [157] [159] [160] [161]. Es decir, el número básico de reproducción (R 0 ) -el número medio de infecciones causadas por un individuo infectado en una población totalmente susceptible ha estado cerca de uno en varios grupos y brotes. Si R 0 era mayor que 1, se esperaría un aumento sostenido en el número de casos. Algunos cálculos de R o pueden verse afectados por el rastreo incompleto de los contactos de casos, pruebas comunitarias limitadas y cómo se define un caso. El MERS ha tenido una presencia constante en la Península Arábiga desde 2012 se debe a los eventos de derrames esporádicos en curso de DCs amplificados por brotes hospitalarios mal controlados. En marcado contraste, una seroencuesta de HCW que a veces estaba en contacto cercano y prolongado con el primer caso fatal de MERS-CoV en 2012 [162], encontró que ninguno de los HCW se había seroconvertido cuatro meses más tarde, a pesar de la ausencia de protección ocular y el cumplimiento variable de los estándares requeridos de EPP [162]. Al principio de la historia del MERS, las muestras para la prueba fueron recolectadas principalmente de pacientes con enfermedad grave y no de aquellos con infecciones respiratorias agudas más leves. Los contactos de los casos confirmados de MERS fueron a menudo observados para enfermedad clínica, pero no probados. Estas omisiones pueden haber confundido nuestra comprensión de la transmisión del MERS-CoV y sesginar los datos tempranos hacia un mayor número de pacientes gravemente enfermos y hospitalizados, inflando la aparente proporción de casos mortales. A medida que cambiaban los paradigmas de las pruebas y se hacían cada vez más pruebas de los contactos, se reconocían infecciones más asintomáticas y leves [163]. Un aumento en los casos llamados asintomáticos (que amplían el denominador para los cálculos de la proporción de casos mortales, definida en [164] ) dio lugar a una disminución en la proporción de casos mortales durante el brote de Yeddah-2014. Históricamente, tales aumentos son consistentes con la modificación de las definiciones y respuestas de laboratorio y el manejo clínico de una infección por virus recién descubierta que se observó por primera vez sólo entre los enfermos graves. Tras el seguimiento, más de tres cuartas partes de esas personas positivas del ARN del MERS-CoV recordaron haber tenido uno o más síntomas en ese momento, a pesar de que se notificó como asintomática [165], planteando alguna pregunta sobre la fiabilidad de otros datos Aproximadamente el 43 % de los casos MERS (549 de 1277) en la KSA fueron mortales entre 2012 y diciembre de 2015, mientras que el 21 % (72 de 330) fallecieron entre los que se produjeron fuera de la KSA. El número total de casos masculinos siempre supera en número a las mujeres y la proporción de muertes masculinas es siempre mayor que la proporción de mujeres que mueren. Sin embargo, la proporción de muertes masculinas de varones totales con MERS es similar a la de las mujeres. En la KSA, hay una mayor proporción de varones más jóvenes entre los casos y muertes que se observaron en los brotes de Corea del Sur o Jeddah-2014 de 2015 (Fichero adicional 2: Figura S2 ). Por qué estos aspectos han diferido pueden deberse a diferencias en el tiempo de presentación y diagnóstico, la naturaleza y calidad de la atención de apoyo, la forma en que una persona se contagió (habita, exposición a una fuente humana o zoonótica, carga viral, vía de infección) o la medida en que las diferentes poblaciones se ven afectadas por enfermedades subyacentes [40]. Como grupo, los HCW representaron el 16 % de los casos de MERS en la KSA y Corea del Sur. Es evidente que la proporción semanal de HCW infectados aumenta junto con cada fuerte aumento en las detecciones generales (Fig. 5). En mayo de 2013, la OMS publicó directrices para IPC durante el cuidado de casos probables o confirmados de infección por MERS-CoV en un entorno sanitario [166]. Estos aumentos en las detecciones de MERS-CoV pueden disminuir la edad media durante cada evento debido a que los HCW son generalmente más jóvenes que los pacientes internados con MERS. Las instalaciones sanitarias han sido un objetivo regular de mejoras sugeridas para mejorar los procedimientos de prevención y control de infecciones (IPC) [115, 118]. La mayor parte del análisis de la genética MERS-CoV se ha realizado utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento o "profundo" para la deducción completa del genoma [167] [168] [169]. MERS-CoV fue el primer sujeto de un uso tan extendido de secuenciación profunda para estudiar un brote viral emergente con alcance global. La técnica puede producir genómica [207] [209]. Las versiones anteriores y posteriores de esta tabla se mantienen en un blog personal [210] cobertura de longitud en un solo experimento con medición altamente repetitiva de cada posición de nucle A pesar de los ensayos publicados al principio, la secuenciación subgenómica, una vez el pilar de los estudios de brotes virales, se ha publicado con menos frecuencia durante la caracterización de MERS-CoV [48]. A medida que se han caracterizado más genomas tanto de humanos como de DC, se han hecho evidentes dos clados; A y B (Fig. 6). Clade A contiene sólo genomas de MERS-CoV derivados del hombre de Jordania, mientras que Clade B comprende la mayoría de genomas humanos y de camellos deducidos hasta ahora [168]. Dos estudios durante 2015, uno mirando a variantes de Jeddah-2014 MERS-CoV y otro mirando a una variante exportada de Corea del Sur a China, ahora han identificado signos de recombinación genética entre variantes de MERS-CoV. Si bien las secuencias del genoma humano y del genoma entero de camello han conservado una identidad de >99 % entre sí, los miembros de linajes genéticamente distintos pueden intercambiar material genético y lo hacen cuando co-ocurren condiciones adecuadas y co-fecciones [170] [171] [172]. La identidad compartida implica que la principal fuente de adquisición humana es el DC, en lugar de otro animal, aunque se necesitan más pruebas de otras especies animales para confirmar esa conclusión. Durante un mes, un virus de DC secuenciado en diferentes ocasiones no cambió en absoluto indicando un grado de estabilidad genómica en su huésped, apoyando que los DC son el anfitrión natural, en lugar de intermedio, del MERS-CoV que conocemos hoy [77]. Hasta la fecha, la recombinación se ha localizado en puntos de ruptura cerca del límite entre las regiones ORF1a y ORF1b, dentro del gen de pico [170] No es inesperado que la recombinación se produzca ya que es bien conocida entre otras CoVs [124] y porque la mayoría de los genomas enteros del MERS-CoV recogidos a partir de muestras de tres años (2012-2015) y de seres humanos, camellos y diferentes países han mostrado una identidad genética cercana entre sí, con una variación sutil suficiente para apoyar investigaciones de brotes mientras se aplique la secuenciación del genoma completo [52, 77, 135, 138, 168, [173] [174] [175]. Los cambios en la secuencia del genoma pueden anunciar alteraciones en la transmisibilidad del virus, replicación, persistencia, letalidad o respuesta a medicamentos futuros. Si tenemos conocimiento previo del impacto de los cambios genéticos debido a estudios de caracterización exhaustivos, podemos establecer una estrecha relación genética entre las secuencias de nucleótidos del MERS-CoV (cargado desde GenBank utilizando los números de adhesión enumerados y Este árbol de unión vecino fue creado en MEGA v6 utilizando una alineación de las secuencias humanas y DCderivadas de MERS-CoV (Genious v8.1 [211] ). Clades se indican junto a barras verticales azules oscuras (Clade A) o pálidos (Clade B). Los iconos de camello denotan genomas de DC. Los brotes sanitarios o comunitarios se encajonan y etiquetan utilizando esquemas previamente descritos [212, 213] monitorean las regiones genómicas y entienden mejor cualquier cambio en la transmisión o patrones de enfermedad a medida que ocurren. Las mutaciones genéticas observadas durante el mayor de los brotes humanos, Jeddah-2014, no impartieron ningún cambio importante replicativo o inmunomodulador cuando se comparan con las variantes virales anteriores in vitro [156, 176]. Sin embargo, entendemos muy poco de los resultados fenotípicos que resultan del cambio genético sutil en Hasta la fecha no se ha informado de ninguna relevancia clínica ni de cambios in vivo evidentes en la replicación, eliminación o transmisión vírica, o se ha atribuido a mutaciones o a nuevos virus recombinantes [156]. Pero se necesitan vigilancia y estudios más grandes, contemporáneos e in vivo. La secuencia genomática localizada a un clado distinto se identificó a partir de un DC egipcio que probablemente fue importado de Sudán. Esto no encaja en ninguno de los clados actuales [125, 168, 177]. Un virus secuenciado a partir de un murciélago Neoromicia capensis estaba más estrechamente relacionado con el MERS-CoV que otras grandes secuencias derivadas de murciélagos habían estado hasta ese punto, pero el genoma de una variante de un MERS-CoV aún no se ha descubierto y deducido de cualquier murciélago [125]. Los análisis de genomas del MERS-CoV han demostrado que la mayoría de las diferencias nucleó 2), que codifica la proteína de pico y proteínas accesorias [168]. Al menos nueve genomas del MERS-CoV contenían sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a los receptores (RBD) de la proteína de pico y los codones 158 (región N-terminal), 460 (RBD), 1020 (en la repetición de heptad 1), 1202 y 1208 investigación de osos como marcadores de cambio adaptativo [140, 169]. La proteína de pico no había cambiado en el genoma recombinante del MERS-CoV identificado en China en 2015, pero se informó que había variado a un ritmo superior al de genomas completos del MERS-CoV, entre variantes surcoreanas [172, 178]. Esto destaca que las regiones subgenómicas pueden no siempre contener suficiente diversidad genética para ser útiles para diferenciar variantes virales. A pesar de esto, un ensayo que amplificaba un fragmento de nucleótido 615 del gen de dominio S2 de pico para la secuenciación de Sanger coincidió con los resultados generados por la secuenciación de algunos genomas completos y fue útil para definir grupos de secuencias adicionales [177]. La secuencia genómica también se puede utilizar para definir los límites geográficos de un cúmulo o brote y monitorear su progreso, basado en la similitud de las variantes encontradas entre humanos y animales infectados cuando ocurren juntos, o entre diferentes sitios y tiempos (Fig. 6 ) [169]. Este enfoque se utilizó al definir el brote de hospital MERS con limitaciones geográficas en Al-Ahsa, que ocurrió entre el 1 de abril y el 23 de mayo de 2013, así como los cúmulos en Buraidah y un brote comunitario en Hafr Al-Batin, el KSA. La secuenciación genómica identificó que aproximadamente 12 detecciones de MERS-CoV de un brote comunitario en Hafr Al-Batin entre junio y agosto de 2013 pudieron haber sido desencadenadas por un caso índice que se infectó a través del contacto DC [175]. La secuenciación de genomas de MERS-CoV del brote hospitalario de Al-Ahsa de 2013 indicó que múltiples variantes virales contribuyeron a los casos, pero que la mayoría fueron lo suficientemente similares entre sí como para ser consistentes con la transmisión humano-humana. La epidemiología molecular ha revelado enlaces ocultos en cadenas de transmisión que abarcan un período de hasta cinco meses [179]. Sin embargo, la mayoría de los brotes no han continuado durante más de dos a tres meses y por lo tanto las oportunidades para que el virus se adapte más a los seres humanos a través de la coinfección y el tránsito en serie sostenido han sido raras [169]. En Riad-2014, la evidencia genética apoyaba la probabilidad de múltiples introducciones externas de virus, implicando una gama de instalaciones de salud en un caso que de otro modo parecía contiguo [23, 168, 179]. Riad es un nexo para el viaje de camellos y humanos y ha tenido más casos MERS que cualquier otra región de la KSA hasta la fecha, pero también alberga una amplia gama de variantes MERS-CoV [128, 167, 179]. Sin embargo, el brote surcoreano se originó de una sola persona infectada, resultando en tres a cuatro generaciones de casos [180, 181]. Estudios de esta variante viral aparentemente recombinante no encontraron un aumento de la tasa evolutiva y ningún signo de adaptación al virus, por lo que el brote parece haber sido impulsado por circunstancias más que por circunstancias junto con mutación [181]. Para muchos casos MERS detectados fuera de la Península Arábiga, se El rastreo de contacto es esencial para contener la aparición y transmisión de un nuevo virus y hoy en día está apoyado por la epidemiología molecular. Aunque es un proceso costoso y que consume tiempo, el rastreo de contacto puede identificar posibles nuevas infecciones y, a través del monitoreo activo o pasivo, reaccionar más rápidamente si la enfermedad se desarrolla. Los resultados del rastreo de contacto hasta la fecha han encontrado que la transmisión continua entre los seres humanos es un evento poco frecuente. Por ejemplo, hubo 83 contactos, tanto sintomáticos como asintomáticos, de un caso tratado en Alemania que viajó desde los Emiratos Árabes Unidos pero no se encontraron signos de virus o anticuerpos en ninguno de ellos [73]. En un estudio de 123 contactos de un caso tratado en Francia, sólo siete coincidieron con la definición de un posible caso y fueron probados; uno que había compartido una habitación hospitalaria de 20 m2 mientras que en una cama a 1,5 m de distancia del caso índice durante un período prolongado fue positivo [26]. Ninguno de los contactos de los dos primeros casos MERS importados a los EE.UU. en 2014 contenía ninguna huella MERS-CoV [182] y ninguno de los 131 contactos de dos viajeros que regresaron a los Países Bajos desarrolló anticuerpos MERS-CoV o testó ARN positivo [25, 183]. Los análisis de datos públicos revelan muchos casos probables de adquisición nosocomial de infección en la Península Arábiga y estos datos pueden ir acompañados de algunos detalles que señalan el contacto con un caso o instalación conocido. Un ejemplo identificó el papel probable de un paciente con una infección subclínica, presente en un hospital durante su ingreso por otras razones, como el caso índice más probable que desencadena un grupo familiar [93]. El rastreo de contacto fue un factor significativo en la terminación de un brote de 2015 con múltiples hospitales surcoreanos [184]. Estos estudios demuestran la necesidad de encontrar y comprender un papel para los casos leves y asintomáticos, junto con la restricción del contacto cercano o la exposición prolongada de las personas infectadas a otras, especialmente familiares mayores y amigos con enfermedad subyacente (Fig. 4c). El brote asociado al hospital en Jeddah en 2014 fue la acumulación más grande y rápida de las detecciones de MERS-CoV hasta la fecha. El mayor número de detección de MERS-CoV de cualquier mes registrado se produjo en Yeddah en abril. El brote se asoció principalmente (> 60 % de los casos) con la propagación de seres humanos a seres humanos dentro de los entornos hospitalarios y se debió a la falta de prevención y control de las infecciones o a su desorganización [37, 185, 186]. Un aumento de las muertes siguió al rápido aumento del número de casos. En 2015 ocurrieron dos grandes brotes. Corea del Sur fue el lugar del primer brote a gran escala fuera de la Península Arábiga y produjo los primeros casos tanto en Corea del Sur como en China, entre mayo y julio de 2015. Esto fue seguido de cerca por un brote distinto en la provincia de Ar Riyad, en la KSA, que parecía estar bajo control a principios de noviembre. Después de permanecer en Bahréin durante dos semanas, un varón de 68 años (68 M) viajó a Corea del Sur vía Qatar, llegando libre de síntomas el 4 de mayo de 2015 [187]. Desarrolló fiebre, Visitó una clínica como ambulatorio entre los días 12 y 15 de mayo y fue ingresado en el Hospital A el día 15 [188]. Fue dado de alta del Hospital A el día 17 y luego fue ingresado en el servicio de urgencias del Hospital B el día 18. Durante esta segunda estancia, se tomó una muestra de esputo y dio positivo para el MERS-CoV el día 20 [187, 188], desencadenando el traslado al centro de tratamiento de aislamiento designado. Durante un período de 10 días, el caso índice fue visto en tres hospitales diferentes, demostrando una característica clave de "compra hospitalaria" que conformó el brote surcoreano. Aproximadamente 34 personas fueron infectadas durante este tiempo [187]. En total 186 casos fueron generados en este brote, todos vinculados a través de una única cadena de transmisión a 68 M; 37 casos murieron [189]. En Corea del Sur, el sistema nacional de seguro médico prevé una atención médica de costo relativamente bajo, sufragando algunos costos al hacer que los familiares sean responsables de una parte de la administración de los enfermos, lo que a veces los hace permanecer durante largos períodos en las habitaciones que a menudo tienen más de cuatro camas en ellas [24]. Otros factores que se pensaba que habían permitido este brote eran la falta de familiaridad de los médicos locales con MERS, la facilidad con la que el público puede visitar y ser tratado por hospitales terciarios, la costumbre de visitar a amigos y familiares enfermos en hospitales, la naturaleza jerárquica de la sociedad coreana, las salas de emergencia abarrotadas, las medidas deficientes del IPC, la falta de salas de aislamiento de presión negativa y la mala comunicación interhospitalaria de los historiales de enfermedades de los pacientes [24, [190] [191] [192]. Hasta la fecha se han comunicado pocos detalles clínicos sobre estos casos y los detalles sobre la transmisión y el rastreo de los contactos son mínimos. Los hospitales involucrados inicialmente no fueron identificados, la orientación y las acciones gubernamentales produjeron mensajes confusos y hubo una comunicación muy limitada en los primeros tiempos, lo que dio lugar a preocupaciones innecesarias, desconfianza y un impacto económico distinto [191, [196] [197] [198]. Al principio del brote, un viajero infectado, hijo de un caso identificado en Corea del Sur, pasó por Hong Kong en su camino a China, donde estaba ubicado, aislado y atendido en China [91, 199, 200]. No hubo contactos que enfermaran.El brote se puso bajo control a finales de julio/a principios de agosto [201] después de que se emplearan medidas mejoradas del IPC, seguimiento y cuarentena de contactos sólidos, pruebas de laboratorio ampliadas, hospitales fueron mejor asegurados, se envió personal especializado para gestionar los casos Una revisión de los datos públicos mostró que, al igual que en el caso del MERS en la KSA, la edad avanzada y la presencia de enfermedad subyacente se asociaron significativamente con un desenlace fatal en Corea del Sur. [40] Aunque R 0 es <1, los eventos de superdifusión facilitados por circunstancias creadas en entornos de salud y caracterizadas por tamaños de clúster superiores a 150, como este, no son inesperados por la infección por MERS-CoV [204]. La dinámica de un brote depende de la R 0 y de los patrones de eliminación viral de un individuo, el tipo y la frecuencia de contacto, los procedimientos hospitalarios y la estructura y densidad de la población [204]. En la región de Ar Riyad, incluida la capital de Riad, se inició un cúmulo hospitalario dentro de un solo hospital a partir de finales de junio de 2015 [205]. A mediados de septiembre se habían notificado aproximadamente 170 A pesar de la introducción continua y posiblemente estacional del virus en la población humana a través de los DC infectados y tal vez otros animales que aún no se han identificado, la gran mayoría de la transmisión del MERS-CoV se ha producido de seres humanos infectados a no infectados en contacto cercano y prolongado a través de circunstancias creadas por un control deficiente de las infecciones en los entornos de atención de la salud. Este virus oportunista ha tenido su mayor impacto en las personas con enfermedades subyacentes y esas personas vulnerables, que a veces sufren múltiples comorbilidades, se han asociado con mayor frecuencia con los hospitales, creando una tormenta perfecta de exposición, transmisión y mortalidad. No está claro si este grupo se ve afectado de manera única por el MERS-CoV o si otras infecciones respiratorias, incluidas las de los HCoV, producen un impacto igualmente grave. En Corea del Sur, un solo caso importado creó un brote de 185 casos y 36 muertes que tuvieron un impacto desproporcionado en el desempeño económico, el comportamiento de la comunidad y la confianza en el gobierno y el sistema de atención de la salud. La transmisión del hogar de seres humanos a seres humanos se produce, pero también es limitada. Los programas educativos serán herramientas esenciales para combatir la propagación del MERS-CoV tanto dentro de las comunidades urbanas y regionales como para el entorno de atención de la salud. La vigilancia sigue siendo importante para la contención, ya que el MERS-CoV es un virus con una composición genética que se ha observado durante sólo tres años y no es estable. Entre todos los seres humanos que se han notificado que están infectados, casi el 40% han muerto. La secuenciación del genoma completo se ha utilizado extensamente para estudiar el recorrido y la variación del MERS-CoV y aunque sigue siendo una herramienta para expertos, parece ser la mejor herramienta para el trabajo. El MERS y el SRAS tienen algunas similitudes clínicas pero también difieren significativamente [206]. Entre las características definitorias se incluyen el PFC más alto entre los casos del MERS (superior al 50 % en 2013 y actualmente en el 30-40%; muy por encima del 9 % del SRAS) y la asociación más alta entre el MERS mortal y los hombres mayores con comorbilidades subyacentes. Para los virus, el MERS-CoV tiene un tropismo más amplio, crece más rápidamente in vitro, induce más rápidamente cambios citopatógenos, desencadena respuestas transcripcionales distintas, hace uso de un receptor diferente, induce un estado más proinflamatorio y tiene una respuesta antiviral tardía en comparación con el SRAS Parece haber una prevalencia del 2-3 % de MERS-CoV en la KSA con una probabilidad del 5 % de transmisión secundaria dentro del hogar. Hay un mayor riesgo de infección a través de ciertas ocupaciones en ciertos momentos y una probabilidad mucho mayor de propagación a otros seres humanos durante circunstancias creadas por los humanos, lo que impulsa una transmisión más efectiva que cualquier R 0 predeciría sobre el valor facial. Sin embargo, a pesar de las múltiples concentraciones masivas que han proporcionado al virus muchos millones de oportunidades de propagación, no se han reportado brotes de MERS o MERS-CoV durante o inmediatamente después de estos eventos. No hay evidencia de que el MERS-CoV sea un virus de preocupación pandémica. Sin embargo, los entornos hospitalarios continúan describiendo casos y brotes de MERS en la Península Arábiga. Mientras facilitemos la propagación del MERS-CoV entre nuestras poblaciones más vulnerables, el mundo debe permanecer en alerta para los casos que puedan ser exportados con mayor frecuencia cuando un país de acogida con reservorios de camellos infectados está experimentando conglomerados o brotes humanos. El MERS-CoV parece ser un virus enzoótico que infecta a la URT DC con evidencia de recombinación genética reciente. Puede que una vez haya tenido su origen entre los murciélagos, pero falta evidencia y la relevancia de ello para la epidemia actual es académica. Gracias a la acción rápida, las herramientas de diagnóstico molecular sensibles y rápidas necesarias para lograr un objetivo de detección rápido y sensible han sido establecidas y ampliamente disponibles desde que el virus fue reportado en 2012. RT-PCR pruebas de muestras de LRT siguen siendo el estándar de oro para la confirmación del MERS-CoV. Las herramientas serológicas siguen surgiendo pero necesitan una validación adicional utilizando muestras de infecciones leves y asintomáticas y un estudio de cohorte densamente muestreado para seguir los contactos de nuevos casos puede abordar esta necesidad. Del mismo modo, la importante cuestión de si aquellos que eliminan el ARN MERS-CoV durante períodos prolongados son infecciosos mientras aparecen bien, sigue sin respuesta. Incluso no está claro cuántas infecciones 'asintomáticas' se han descrito y reportado correctamente, lo que a su vez plantea preguntas sobre la fiabilidad de la recolección de otros datos clínicos hasta la fecha. Si bien la virología básica del MERS-CoV ha avanzado en el transcurso de los últimos tres años, la comprensión de lo que está sucediendo en, y la interacción entre, camello, medio ambiente y humano todavía está en su infancia.

¿Cuándo se sugiere que una sola muestra sea suficiente?