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Mejora de las propiedades farmacológicas y estructurales del inhibidor de la fusión del VIH AP3 sobre la enfuvirtida: ventajas destacadas de la estrategia artificial de Peptidehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC454141410/SHA: f2fcc16391f946c99717b63ec9a24e5384aac381Autores: Zhu, Xiaojie; Zhu, Yun; Ye, Sheng; Wang, Qian; Xu, Wei; Su, Shan; Sun, Zhiwu; Yu, Fei; Liu, Qi; Wang, Chao; Zhang, Tianhong; Zhang, Zhenqing; Zhang, Xiaoyan; Xu, Jianqing; Du, Lanying; Liu, Keliang; Lu; Zhang, Ro Sin embargo, su aplicación clínica es limitada debido a la corta semivida, resistencia al fármaco y reactividad cruzada con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH. Utilizando una estrategia de péptido artificial, diseñamos un péptido con secuencia de proteínas no nativas, AP3, que mostró una potente actividad antiviral contra un amplio espectro de cepas del VIH-1, incluyendo aquellas resistentes a T20, y tuvo una semivida in vivo notablemente mayor que T20. Mientras que los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH suprimieron significativamente la actividad antiviral de T20, estos anticuerpos no reconocieron AP3 ni atenuaron su actividad anti-VIH-1. Estructuralmente diferentes de T20, AP3 podrían doblarse en una hélice e interactuar con gp41 NHR. Los dos residuos, Met y Thr, en el N-terminal de AP3 forman una estructura similar a gancho para estabilizar Por lo tanto, AP3 tiene potencial de desarrollo como un nuevo inhibidor de la fusión del VIH con mejor eficacia antiviral, perfil de resistencia y propiedades farmacológicas sobre la enfuvirtida. Mientras tanto, este estudio destacó las ventajas de los péptidos diseñados artificialmente, y confirmó que esta estrategia podría utilizarse en el desarrollo de inhibidores de la fusión viral basados en péptidos artificiales contra el VIH y otros virus envueltos. Texto: Las secuencias de péptidos derivados de la NHR-gp41 o CHR. Los residuos correspondientes a la región de bolsillo de la NHR están marcados en rojo. Los residuos de la PBD están marcados en azul, y los residuos de ganglio MT adyacentes al término N de la PBD están marcados en verde. El péptido 5HRu consta de 5 copias de plantilla de secuencia artificial (AEELAKK) subrayado. Los residuos mutantes en la P b) La actividad inhibitoria de AP1, AP2, AP3 y T20 sobre la infección por VIH-1 IIIB (subtipo B, X4) en células MT-2 (panel izquierdo) por HIV-1 Bal (subtipo B, R5) en células M7 (panel derecho); cada muestra se probó por triplicado y el experimento se repitió dos veces; los datos se presentan como medios ± SD. RepoRts científicos 5:13028 DOi: 10.1038/srep13028Para hacer frente a estos obstáculos, se han hecho muchos esfuerzos para optimizar los péptidos derivados de T20 y gp41 CHR. Algunos de estos péptidos tienen mejores actividades inhibitorias contra cepas resistentes a T20 y/o una semivida más larga que T20. Sin embargo, todavía tienen el problema de reaccionar de forma cruzada con los anticuerpos preexistentes en la su Basándonos en la plantilla de péptido artificial universal de 5HRu, hemos diseñado previamente los péptidos artificiales de AP1 (PBD-m4HR) y AP2 (PBDtrp-m4HR), y hemos realizado investigaciones preliminares sobre su actividad inhibitoria contra la fusión de células mediadas por Env VIH-1 16. En el presente estudio, hemos diseñado un nuevo péptido artificial, AP3 (Fig. 1a), con el objetivo de aplicar la estructura "M-T gancho" para estabilizar la interacción del péptido artificial con el bolsillo hidrofóbico en el recortador NHR gp41 17, 18. Después de estudiar exhaustivamente su actividad antiviral, propiedad bioquímica, estructura cristalina, mecanismo funcional, semivida in vivo y, por primera vez, el efecto de anticuerpos preexistentes en el sera de pacientes infectados por VIH, encontramos que el péptido artificial de nuevo diseño, AP3, mostró una mejor actividad antiviral, perfil de resistencia a fármacos y propiedades farmacológicas sobre T20. En particular, los anticuerpos preexistentes en el sera de pacientes infectados por VIH no suprimieron, sino que mejoraron la actividad anti-VIH-1 de AP3. Estos resultados sugieren que el AP3 tiene potencial de desarrollo como un nuevo fármaco anti-VIH y confirman que esta estrategia se puede utilizar para diseñar péptidos antivirales artificiales contra otros virus envueltos, como el SARS-CoV 19, el MERS-CoV 20 y el paramixovirus 21. Nuestros péptidos artificiales AP1 y AP2 previamente diseñados podrían inhibir la fusión de la membrana celular mediada por el VIH-1 16. Él y sus colegas reportaron que la adición de dos aminoácidos de Met y Thr al N-terminal de un CHR-péptido podría mejorar su actividad anti-VIH-1 17, 18. Aquí diseñamos un nuevo péptido artificial, AP3, añadiendo Met y Thr al N-terminal de AP2 (Fig. 1a). Luego comparamos AP3 con AP1, AP2 y T20 para su actividad anti-VIH-1 contra cepas divergentes del VIH-1, incluyendo los virus adaptados al laboratorio, IIIB (subtipo B, X4) y Bal (subtipo B, R5), y una serie de aislamientos primarios del VIH-1, así como las cepas resistentes al T20. 1b, AP3 mostró mayores actividades inhibitorias sobre la infección por cepas HIV-1 IIIB y HIV-1 Bal (IC 50 : 3,06 y 15,09 nM, respectivamente) que AP1 (IC 50 : 86,25 y 396,14 nM, respectivamente), AP2 (IC 50 : 23,05 y 49,95 nM, respectivamente) y T20 (IC 50 : 13,63 y 30,21 nM, respectivamente). La actividad inhibitoria de AP3 sobre la infección por cepas primarias divergentes de VIH-1 con distintos genotipos (subtipos A -E y grupo O) y fenotipos (R5 y X4) también fue superior a la de AP2 y T20 (Tabla 1). Si bien la T20 no fue eficaz frente a cepas de VIH-1 resistentes a T20 a una concentración de hasta 2.000 nM, la AP3 podría efectivamente inhibir la infección de estas cepas con IC 50 en el rango de 13 ~ 90 nM, que era aproximadamente 2 a 4 veces más eficaz que la AP2 (Tabla 1 ). Estos resultados indican que el péptido artificial AP3 ha mejorado notablemente la actividad anti-VIH-1 contra un amplio espectro de cepas de VIH-1, incluyendo variantes resistentes a T20, sobre T20 y los péptidos artificiales AP1 y AP2. Los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1 no reconocieron la AP3 ni atenuaron su actividad anti-VIH-1. Los estudios anteriores han demostrado que los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH-1, incluidos los que reaccionan de forma cruzada con T20 y los específicos para los sitios de unión de T20 en gp120 (por ejemplo, las regiones del bucle C1 y V3) y gp41 (por ejemplo, el dominio NHR), podrían bloquear significativamente la actividad inhibitoria de fusión de T20 14, 15. Aquí investigamos la influencia de anticuerpos preexistentes contra el péptido AP3. Como se muestra en la figura 2a, tanto T20 como C46 reaccionaron con los anticuerpos en sueros de cinco pacientes infectados por el VIH-1; sin embargo, ninguno de los tres péptidos artificiales AP1, AP2 y AP3 fue reconocido por los anticuerpos preexistentes.La actividad inhibitoria de T20 sobre la infección por el VIH-1 IIIB se redujo aproximadamente 1,9 veces a > 3,6 veces en presencia de 2b y Tabla Suplementaria S1), confirmando que los anticuerpos preexistentes en sera de pacientes con VIH/SIDA pueden atenuar la actividad anti-VIH-1 de T20 14, 15. Sin embargo, ninguno de los péptidos artificiales en el presente estudio mostró disminución significativa de la actividad anti-VIH-1 en presencia de sera de pacientes. En cambio, la actividad antiviral de AP3 aumentó en presencia de antisera de pacientes infectados con VIH-1 (fig. 2b y Tabla Suplementaria S1), sugiriendo que los anticuerpos anti-VIH-1 realmente mejoraron la actividad anti-VIH-1 de AP3, posiblemente porque la unión de los anticuerpos a algunos sitios en gp120 o gp41 promueve la interacción de AP3 con la región viral de gp41 NHR. AP3 tuvo una semivida mayor que T20. Aunque la T20 ha demostrado eficacia en la inhibición de la infección por el VIH-1, su principal debilidad radica en su corta semivida en plasma (aproximadamente 2 h) [22] [23]. Como resultado, la T20 debe administrarse por vía subcutánea dos veces al día a 90 mg por dosis, causando a menudo reacciones graves en el lugar de inyección 25, 26. Aquí, se realizaron estudios farmacocinéticos por administración intravenosa de AP3, AP2 y T20, respectivamente, a rata SD a una dosis de 1 mg/kg, para comparar su tiempo de circulación in vivo. Como era de esperar, la T20 mostró una semivida más corta y un AUC menor (0-t) por circulación sistémica, mientras que la AP3 y la AP2 demostraron una concentración mucho mayor y un tiempo de circulación más largo (Tabla 2 ). Los perfiles farmacocinéticos de AP3 y AP2 se ajustaron a un modelo de no-compartimento. La semivida de eliminación in vivo de AP3 (t 1/2 = 6,02 h) fue aproximadamente 2,8 veces mayor que la de T20 (t 1/2 = 1,57 h). Este resultado proporcionó la base teórica para reducir la frecuencia de inyección y la dosis del inhibidor de la fusión, en conjugación con la potencia antiviral mejorada de AP3. Por lo tanto, la sustitución de T20 por AP3 puede reducir significativamente las reacciones en el lugar de inyección y el costo del fármaco, lo que promovería las aplicaciones clínicas del inhibidor de la fusión del VIH en regiones o países pobres en recursos. AP3 fue mucho más resistente que T20 a la degradación proteolítica por proteinasa K y homogenato hepático de rata. Comparamos la estabilidad de T20 y AP3 en presencia de proteinasa K (una proteína de serina de amplio espectro) y homogenato hepático de rata. Después del tratamiento con 20 ng/ml de proteinasa K durante 2 h a 37 °C, sólo quedó el 29% del péptido parental T20, detectado por el análisis LC-MS. Bajo la misma condición, AP3 retuvo el 100% de su prototipo (Fig. 3a ). Además, AP3 mostró una estabilidad metabólica significativamente aumentada sobre T20 in vitro en presencia de homogenato hepático (Fig. 3b). Estos resultados indican que el péptido artificial AP3 es mucho más resistente a la degradación proteolítica que el péptido natural T20, lo que puede contribuir a su significativa vida media in vivo más larga que T20 como se describe anteriormente. AP3 formó un complejo estable α-helical y la formación de bloque gp41 6-HB. Para investigar el mecanismo antiviral de AP3, se comparó la estabilidad térmica del complejo AP3/N36 con la de AP1/N36, AP2/N36, T20/N36 y C34/N36 complejos por espectroscopia circular-dicroísmo (CD) 27. Debido a que T20 carece del dominio de encuadernación de bolsillo (PBD), el complejo T20/N36 no mostró una conformación α-helical típica, en consistencia con nuestros estudios anteriores 8, 9. Similar a la α-helicidad del complejo C34/N36 3, los complejos AP1/N36, AP2/N36 y AP3/N36 formaron un pico negativo en forma de sillín a 208 nm y 222 nm, indicando sus estructuras α-helical (fig. 4a) Fig. 4b), indicando que el complejo helicoidal α formado por AP3 y N36 es el más estable entre los cuatro complejos. Luego comparamos la actividad inhibitoria de AP3 con la de AP1 y AP2 en la formación de 6-HB entre C34 y N36. Como T20 no puede bloquear la formación de 6-HB 8, 9, utilizamos un inhibidor de fusión de pequeña molécula VIH-1, ADS-J1 28, 29, para reemplazar a T20 como un control de inhibición de 6-HB. Como se esperaba, ADS-J1 podría efectivamente inhibir la formación de 6-HB con IC 50 de 2,75 μ M 8, 9, [27] [28]. AP3 fue altamente eficaz contra la formación de 6-HB de forma dosis-dependiente con un valor IC 50 de 0,24 μ M, aproximadamente 30 y 15 veces más potente 4c), confirmando que AP3 puede bloquear potentemente la formación del núcleo de fusión gp41 6-HB, inhibiendo así la fusión del VIH-1 con la membrana celular diana. Base estructural para la potente actividad inhibitoria de fusión del péptido artificial AP3. Para dilucidar los determinantes moleculares de estos péptidos artificiales, resolvimos con éxito las tres estructuras complejas de péptidos AP1/AP2/AP3 que se unen con gp41 NHR. Para AP1 y AP2, un enlace optimizado Cada muestra fue probada por triplicado y el experimento se repitió dos veces. Los datos se presentan como medios ± SD. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. "SGGRGGG" se utilizó para ensamblar el NHR y el péptido artificial en una única proteína recombinante (N Sin embargo, una estrategia similar falló en la cristalización de AP3; por lo tanto, decidimos cocristalizar el péptido sintético N45 y péptido AP3, y finalmente se obtuvieron los cristales complejos. Curiosamente, los cristales de tres inhibidores diferentes pertenecen a tres grupos espaciales distintivos: P2 1 para N36-L6-AP1, R32 para N36-L6-AP2, y P6 3 para N45/AP3. Como era de esperar, las porciones de NHR en tres estructuras forman un núcleo trimérico, mientras que la porción AP1, AP2 o AP3 se pliega en una conformación de una hélice única y se une a NHR-trimer para formar un típico 6-HB, similar a la de la estructura central de HIV-1 gp41 formada por el péptido CHR nativo C34 y N36 (Fig. 5a). Además, los residuos hidrofóbicos conservados, como el W43, el W46 y el I50, en los péptidos artificiales fueron profundamente enterrados en la Tabla 2. Parámetros farmacocinéticos de AP2, AP3 y T20 tras la administración intravenosa a 1 mg/kg en ratas SD macho (n = 2). Figura 3. Sensibilidad de AP3 y T20 a la degradación proteolítica por proteinasa K y homogeneato hepático de rata. a) Después de la digestión por proteinasa K a pH 7,2 y b) homogeneato hepático de rata, la cantidad residual de AP3 y T20 fue detectada mediante análisis LC-MS. El experimento se realizó en triplicado y los datos se presentan como medios ± SD. La inhibición de AP1, AP2, AP3, T20 y ADS-J1 frente a la formación de 6-HB entre N36 y C34 fue detectada por ELISA utilizando el mAb NC-1 específico de 6-HB. Cada muestra se probó por triplicado, y los datos se presentan como media ± DE. surcos formados entre cada par de hélices NHR, similares a los residuos correspondientes de W628, W631 y I635 en la gp41 CHR nativa (Fig. 5b). Los péptidos AP mostraron mejor afinidad contra la Gp41 CHR natural. En C34, que contiene la secuencia CHR natural de W628 a L661, no se encontró interacción fuerte entre I642 y Q565 en el complejo de GP41 NHR-CHR viral (Fig. 5c). Sin embargo, en la secuencia correspondiente (de W43 a K76) de AP1 y AP2, se estableció un enlace de hidrógeno entre S57 (correspondiente a I642 en CHR) y Q18 (correspondiente a Q565 en NHR) en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3. Así, S57 en AP1/AP2/AP3 desempeña un papel en la estabilización de las interacciones entre el inhibidor péptido artificial y su objetivo NHR, resultando en su afinidad de unión más fuerte. Además, en NHR-CHR, L567 y L568 en dos NHR adyacentes forman una ranura hidrofóbica, en la que T639 está enterrado (Fig. Suplemental S1a ). Sin embargo, en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3, I54 (correspondiente a T639 en CHR) puede unirse fuertemente a L20 y L21 a través de interacciones de cadenas laterales totalmente hidrofóbicas. Del mismo modo, la interacción de I64 (correspondiente a S659 en CHR) con L10 y L11 (correspondiente a L567 y L568 en NHR, respectivamente) en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3 se ha mejorado significativamente (Suplementary Fig. S1b ). Al igual que la hélice gp41 CHR, las hélices de AP1, AP2 y AP3 también tienen dos lados diferentes, un lado hidrofóbico orientado hacia la NHR y un lado hidrofílico orientado hacia Se espera que la mejora de la hidrofilia del lado expuesto de los inhibidores pueda aumentar su actividad antiviral y solubilidad. Para lograr este objetivo, los residuos de aminoácidos con hidrofobia, o baja hidrofilia, como N637, S640, L641 y S644 en CHR, fueron cambiados a los residuos de aminoácidos con alta hidrofilia, como E52, K55, K56 y E59 en AP1, AP2 y AP3, respectivamente. Además, el residuo hidrofóbico M629 en CHR fue reemplazado por un residuo hidrofílico E44 en AP2 y AP3 (Figura suplementaria S2 ). Estos residuos hidrofílicos, como ácido glutámico y lisina, pueden aumentar la solubilidad de péptido entero y, por lo tanto, estabilizar el complejo formado por el inhibidor y su objetivo. Se ha demostrado que el puente de sal doble EE-KK puede estabilizar la conformación de la hélice 30. Hemos identificado este tipo de interacción entre i e i + 3 o i + 4 posiciones en las tres estructuras complejas. En N36-L6-AP1, R48 interactúa con E45 y E52 para formar una red de puente de sal. En N36-L6-AP2, E45 interactúa con K48, y E52 se une a K56, mientras que en N45/AP3, K69 se une a E66 ( Suplementary Fig. S2 ). Estos fuertes puentes de sal formados por los residuos cargados opuestamente estabilizan la conformación de péptidos AP, llevando su efecto inhibidor en pleno juego. Como se informó anteriormente, la adición del "gancho M-T" a los péptidos CHR C34 y sifuvertida podría mejorar dramáticamente la actividad Como era de esperar, el N-terminal Met y Thr de AP3 forma una estructura similar a un gancho (Fig. 5d). La cadena lateral de la metionina hidrofóbica de M41 acomoda la ranura entre hélices AP3 y NHR, tapando el bolsillo hidrofóbico. Esta interacción conduce a una serie de cambios conformacionales. La cadena principal de AP3 en W43 se mueve 1,91 Å más cerca de NHR en comparación con AP2 (Suplemental Fig. S3 ). La cadena lateral de W43 en AP3 gira alrededor de 90 grados y está enterrada más profundamente que la de AP2. La cadena lateral de E44 vuelve a interactuar a D47, pero la cadena lateral de E45 retrocede desde K48 e interactúa con T42. Por lo tanto, esta estructura de gancho M-T podría estabilizar aún más la unión entre AP3 y NHR La Enfuvirtida, también conocida como T20, fue aprobada por la FDA como el primer medicamento antiviral basado en el inhibidor de la entrada del VIH para su uso con otros medicamentos anti-VIH para tratar adultos y niños infectados por el VIH-1 a los 6-16 años 23,31,32 (http://www.fuzeon.com). Aunque la T20 es un medicamento anti-VIH indispensable para los pacientes con VIH/SIDA que no han respondido a la terapia antirretroviral actual, sus deficiencias han limitado su aplicación clínica. La T20 tiene una actividad anti-VIH menor y una semivida más corta que otros péptidos de la CHR que contienen PBD, como C34 y C38 8, 9, 33. Además, las variantes resistentes al VIH-1 T20 surgieron en breve (por ejemplo, 14 días) después de su uso en pacientes 34. La mayoría de los virus resistentes a T20 presentaban mutaciones en el motivo GIV (residuos 36-45: GIVQQNNLL) en el dominio Gp41 NHR 10, [34] [35] [36] [37] [38]. La falta de PBD contribuye a las principales debilidades de T20 descritas anteriormente. Dado que el bolsillo hidrofóbico conservado en el trimer de NHR gp41 desempeña un papel crítico en la estabilización de la interacción entre el NHR gp41 y CHR y la formación del núcleo fusogénico de 6-HB 1, 39, 40, el péptido CHR que contiene PBD, como C34, puede unirse al trimer de gp41 viral más fuerte y estable, poseyendo así una actividad anti-VIH más potente que T20, un péptido CHR sin PBD 8, 9. En ausencia de PBD, T20 interactúa principalmente con la región media del dominio NHR que contiene el motivo GIV. Por lo tanto, un virus con mutaciones en este motivo es generalmente resistente a T20 10, [34] [35] [36] [37] [38]. En comparación con otros fármacos anti-VIH, otra debilidad de T20 es su reactividad cruzada con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1. Además de gp41, T20 también podría unirse a algunas regiones en gp120. Los anticuerpos preexistentes específicos para los sitios de unión del T20 en gp120 y gp41 pueden suprimir indirectamente la actividad anti-VIH de T20 14, 15. La adición de PBD al N-terminal de T20, como T-1249, podría mejorar significativamente la potencia anti-VIH-1, la semivida y el perfil de resistencia a fármacos 33, [41] [42] [43]. La adición de la estructura de gancho M-T al N-terminal de un PBD-CHR-péptidos que contienen PBD, como MT-C34 o MT-SFT, podría aumentar aún más la actividad anti-VIH-1 de los correspondientes CHR-péptidos 17, 18. La supresión del dominio GIV-motif-vinculante de un CHR-péptido, como CP621-652 y CP32M, es otro enfoque eficaz para aumentar la barrera genética a la resistencia a drogas 44, 45. Sin embargo, ninguno de los enfoques anteriores es eficaz para prevenir la reacción cruzada de T20 con los anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes con VIH/SIDA, ya que los péptidos previamente modificados contienen principalmente las secuencias nativas del dominio HIV-1 gp41 CHR. Nuestros estudios anteriores han demostrado que AP1 y AP2, péptidos artificiales con secuencias de proteínas no nativas, podrían formar estructura de bobina en espiral para interactuar con gp41 NHR e inhibir la fusión celular mediada por VIH-1 Env 16. En el presente estudio, diseñamos un nuevo péptido artificial, AP3, añadiendo la estructura de gancho M-T al N-terminal de AP2 (Fig. 1a), seguido de investigar la influencia de anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes infectados por VIH en AP3, utilizando AP1, AP2 y T20 como controles. Se demostró que los sueros de los pacientes infectados por el VIH podían unirse a la T20 y reducir significativamente su potencia frente al VIH-1. Sin embargo, estas mismas muestras séricas no interactuaban con los tres péptidos artificiales y apenas afectaban su actividad antiviral. Sorprendentemente, los anticuerpos en el sera incluso podrían mejorar la actividad anti-VIH-1 de AP3 (Fig. 2a,b y Tabla Suplementaria S1). Estos resultados confirmaron, por primera vez, que la sustitución de la secuencia viral nativa en la T20 por una secuencia artificial es un enfoque eficaz para superar una deficiencia clave de la T20, por lo que su actividad anti-VIH podría ser atenuada por anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes con VIH/SIDA. Vale la pena explorar por qué los anticuerpos en la sera son capaces de mejorar la actividad anti-VIH-1 de la AP3. Nuestro estudio reciente ha demostrado que la actividad anti-VIH-1 de T20 se ve aumentada por un anticuerpo no neutralizante dirigido contra el dominio NHR del VIH-1 gp41 46. Por lo tanto, hipotetizamos que algunos de los anticuerpos anti-gp41 en pacientes con VIH/SIDA pueden unirse a un sitio en el dominio NHR adyacente a la región de unión de AP3, lo que resulta en una mayor interacción entre AP3 y NHR-trimer y una mayor actividad antiviral de AP3. Luego comparamos la actividad inhibitoria de AP3 con el gancho M-T y T20/AP2 sin gancho M-T sobre la infección por cepas divergentes del VIH-1. AP3 fue más eficaz que AP2 o T20 en inhibir la infección por cepas adaptadas al laboratorio y los aislamientos primarios del VIH-1, incluyendo los resistentes al T20 (fig. 1b, Tabla Se puede cuestionar si AP3 también puede inducir virus farmacorresistentes en pacientes si se usa en clínicas para tratar pacientes infectados por VIH. Creemos que AP3 tiene una barrera genética mucho mayor a la resistencia que T20 porque AP3 contiene PBD, mientras que T20 carece de PBD. Dwyer et al. 33 utilizaron T2544, un péptido CHR que contiene PBD, para llevar a cabo un experimento de paso, utilizando T20 como control. Demostraron que T20 podría inducir un virus mutante con alta resistencia (81 veces) a T20 en aproximadamente 1 mes, mientras que T2544 no indujo una cepa resistente en más de 2 meses en cultivo. Después de extender el experimento de paso por casi 8 meses, identificaron una cepa con una resistencia débil (8,3 veces) a T-2544, y los sitios de mutación relacionados no estaban en la región de bolsillo gp41, lo que sugiere que los péptidos CHR que contienen PBD, incluyendo AP3, pueden tener dificultad para inducir resistencia al fármaco. AP3 también tuvo una vida media más larga que T20 (Tabla 2), posiblemente porque el péptido artificial AP3 es menos sensible a las enzimas proteolíticas que T20 con la secuencia de proteínas virales nativas. Se espera que la eliminación de los sitios de escisión de enzimas proteolíticas en el péptido AP3 amplíe aún más su vida media. Estos resultados confirmaron que la sustitución de la secuencia de proteínas nativas por secuencia artificial y la adición del gancho M-T al péptido que contiene PBD es una estrategia sólida para diseñar Dado que las estructuras tridimensionales de los péptidos AP no habían sido investigadas antes del presente estudio, la optimización de estos inhibidores de los péptidos artificiales no pudo ser realizada racionalmente. Nuestros estudios estructurales de los péptidos artificiales AP1/AP2/AP3 en complejo con NHR mostraron que los péptidos AP, al igual que el péptido CHR C34, podrían unirse a gp41 NHR para formar una estructura canónica 6-HB (Fig. 5a). Es bien sabido que existe un bolsillo hidrofóbico profundo en cada ranura en la superficie del trimer viral gp41 NHR. Los residuos hidrofóbicos I635, W631 y W628 en la unión gp41 CHR con los residuos hidrofóbicos en la pared de este bolsillo, resultando en la formación de 6-HB estable por la fuerte interacción entre CHR Esta importante característica ha sido bien preservada en las estructuras AP1/AP2/AP3 6-HB (Fig. 5b), que pueden explicar las potentes actividades inhibitorias de la fusión VIH-1 de estos péptidos artificiales. Un nuevo enlace de hidrógeno, que se estableció entre S57 y Q18 en los complejos AP1/AP2/AP3, no existe en el complejo viral gp41 CHR-NHR, sugiriendo que S57 puede jugar un papel importante en la estabilización de las interacciones entre el péptido y NHR, dando lugar a afinidades de unión de AP1/AP2/AP3 que son más fuertes que las de HIV-1 gp41 CHR a NHR. Además, el puente de sal doble EE-KK formado entre las posiciones i e i + 4 en las estructuras AP1/AP2/AP3 podría estabilizar la conformación de la hélice y aumentar el efecto inhibitorio de estos pé En comparación con AP1, las mutaciones en el sitio triple se introdujeron en AP2 y AP3, es decir, M44E, R48K y E49K. Estas sustituciones no sólo aumentan la solubilidad del péptido, sino que también desencadenan una serie de reordenamientos de ciertos puentes de sal intrahelical para mejorar la estabilidad de la estructura de la hélice de la CHR y la actividad inhibidora de la fusión del VIH-1. Anteriormente se demostró que el gancho M-T era un paso efectivo hacia el aumento de la interacción estable entre un péptido de la CHR y el bolsillo del HIV-1 gp41 17, 18. Por lo tanto, AP2 se optimizó aún más mediante la incorporación de Met y Thr en su terminal N. Los resultados de espectroscopia de CD y desnaturalización térmica indican que la incorporación de gancho M-T contribuye a la formación de una Además, el puente salino doble EE-KK formado entre i e i + 4 posiciones en la estructura N36-L6-AP3 contribuyó a aumentar la estabilidad de la hélice CHR y 6-HB, lo que resultó en una mejor potencia de AP3, como se ha observado en estudios de CHR-péptidos con mutaciones dobles EE-KK 30, 33, 47, 48. Además, la actividad de fusión del VIH-1 y la semivida de AP2 pueden haber sido reforzadas y ampliadas, respectivamente, mediante la adición de gancho M-T en el diseño de AP3. En conclusión, AP3, un péptido artificial con estructuras de gancho PBD y M-T, mostró una mejor actividad anti-VIH-1 y perfil de resistencia a fármacos, así como una vida media prolongada. Además, no reaccionó con los anticuerpos preexistentes en la sura de pacientes con VIH/SIDA. Consecuentemente, su actividad antiviral RepoRts Científicos 5:13028 DOi: 10.1038/srep13028 no fue significativamente afectada por estos anticuerpos. Por lo tanto, AP3 muestra la promesa como un candidato para el desarrollo ulterior como un nuevo inhibidor de la fusión del VIH para uso clínico. Este estudio también proporciona información importante de estructura e actividad para el diseño racional de nuevos inhibidores de péptidos artificialmente. Además, nuestros resultados destacaron las ventajas de los péptidos diseñados artificialmente y confirmaron que esta estrategia podría ser ampliamente utilizada en el desarrollo de inhibidores de la fusión de virus basados en péptidos artificiales contra el VIH-1 y otros virus envueltos con proteínas de fusión de membrana de clase I, tales como SARS-CoV 19, MERS-CoV 20, y paramixovirus 49. Este estudio no implicó experimentación humana; los únicos materiales humanos utilizados fueron muestras séricas obtenidas de individuos infectados por el VIH-1 con la aprobación del Comité de Ética del Centro Clínico de Salud Pública de Shanghai, Universidad de Fudan (Protocolo No. SPHCC-125-2). Los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas. Todas estas muestras de sueros procedían de adultos; ningún menor estuvo involucrado en este estudio. Se obtuvo el consentimiento informado escrito para el uso de los especímenes clínicos de todos los pacientes involucrados en este estudio. Síntesis de Peptide. Un panel de péptidos (Fig. 1a), incluyendo T20, C34, C46, AP1, AP2, AP3, así como N-péptidos derivados de NHR, N36 y N45, fueron sintetizados con un método FMOC de fase sólida estándar, como se describió anteriormente 8, 50. Todos los péptidos fueron acetilados en el término N y mediados en el término C. Los péptidos fueron encontrados alrededor del 95% puros por el CLAR y fueron identificados por espectrometría de masas (Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA). Las concentraciones de los péptidos fueron determinadas por la absorbancia UV y un coeficiente de extinción molar calculado teóricamente basado en residuos de triptófano y tirosina. Ensayo de calificación. Los análisis cromatográficos se realizaron utilizando una columna SAO-C8 (5 μ m, 100 mm × 2,0 mm ID) mantenida a temperatura ambiente. La fase móvil se compuso de ácido acetonitrilo-agua-fórmico en la proporción de 50:50:0.1 (v/v/v) a un caudal de 0,3 mL/min. El volumen de inyección de la muestra fue de 10 μ L. El acetonitrilo fue de grado HPLC, y otros reactivos químicos y disolventes fueron de grado analítico. Para el análisis de LC-MS se utilizó un espectrómetro de masa tándem tricuadruple MAX de Thermo TSQ Quantum Discovery MAX equipado con fuente ESI (San José, CA) y una bomba LC Surveyor. Para la adquisición y procesamiento de datos se utilizó el software Xcalibur y el programa de análisis de datos LCQuan 2.0 (Thermo Finnigan), respectivamente. Los parámetros de MS optimizados fueron los siguientes: tensión de pulverización de 4800 V, presión de gas de vaina de 40,0 psi, flujo de válvula auxiliar de 1,0 psi y 300 °C de temperatura capilar. Al ejecutar la disociación inducida por colisión (CID), la El modo de monitoreo de reacción seleccionado (SRM) se utilizó para AP3 mientras que el modo de monitoreo de iones seleccionado (SIM) se preformó para T20. Se registraron las siguientes transiciones: m/z 670.5 para AP3, m/z 1498.6 para T20. Las masas de péptidos sintéticos T20, AP1, AP2 y AP3 fueron determinadas por MALDI-TOF-MS (Fig. Suplementario S4 y S5 ). Expresión y purificación de proteínas de fusión N36-L6-AP1 y N36-L6-AP2. Utilizando PCR superpuesta, el fragmento de ADN que codificaba AP1 o AP2 péptido fue unido al fin 3′ del cDNA de gp41 NHR ("N36", 546-581), con un enlace corto ("L6", SGGRGG) entre ellos. Luego, toda la secuencia se subclonó en el vector pET-28a (Novagen, EE.UU.) con una etiqueta SUMO artificial entre la etiqueta HIS de N-terminal y la proteína diana. Las células E. coli de pET-28a-SUMO-N36-L6-AP1-o pET-28a-SUMO-N36-L6-AP2-transformadas fueron inducidas añadiendo 1 mM IPTG e incubando durante la noche a 16 °C. La proteína de fusión fue purificada por resina de afinidad Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), y la etiqueta His-SUMO fue cortada por el tratamiento enzimático Ulp1 a 4 °C durante 2 h. El recortador purificado N36-L6-AP1 o N36-L6-AP2 fue aplicado a una columna de filtración de gel Superdex-75 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.). Las fracciones que contenían N36-L6-AP1 o N36-L6-AP2 fueron recolectadas y concentradas en diferentes concentraciones por ultrafiltración. Cristalización, recolección de datos y determinación de la estructura. La proteína de fusión N36-L6-AP1 fue cristalizada a 16 °C utilizando el método de gota colgante, difusión de vapor. Las gotas se colocaron en un clip de cubierta siliconizada equilibrando una mezcla que contenía una solución proteica de 1 μ l (25 mg/ml N36-L6-AP1 recortador en 20 mM Tris-HCl pH 8,0 y 150 mM NaCl) y una solución de depósito de 1 μ l (0,1 M Tris-HCl pH 8,5, 32% (p/v) PEG3350 y 0,2 MgCl 2 ) frente a una solución de depósito de 400 μ l. Después de una semana, se formaron cristales únicos y se congelaron por chispa con nitrógeno líquido para la recogida de datos en el futuro. La proteína de fusión N36-L6-AP2 se cristalizó de manera similar con una solución de depósito diferente (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 34% (p/v) PEG3350 y 0,2 MgCl 2 Para obtener el cristal complejo de AP3 y NHR, el AP3 sintetizado se mezcló primero con el péptido N45 a razón de 1:1 molar y luego se aplicó a una columna de filtración de gel Superdex-75 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) para aislar el recortador formado de 6-HB. Se recogieron fracciones que contenían N45/AP3 y se concentraron hasta 30 mg/ml, luego se cristalizaron a 16 °C utilizando la gota colgante, método de difusión de vapor.Las gotas se colocaron en un clip de cubierta siliconizado equilibrando una mezcla que contenía una solución proteica de 1 μ l (20 mM Tris-HCl pH 8.0 y 150 mM NaCl) y una solución de depósito de 1 μ l (0,2 M de sulfato de amonio, 0,1 M Los conjuntos de datos de N36-L6-AP1 se recogieron a 100 K en la línea 19-ID de la fuente avanzada de fotones (Argonne National Laboratory, EE.UU.). Los conjuntos de datos de N36-L6-AP2 se recogieron en una fuente de rayos X interna (MicroMax 007 generador de rayos X, Rigaku, Japón) en el Instituto de Biofísica de la Academia China de Ciencias. Los conjuntos de datos de los cristales complejos AP3/N45 se recolectaron en la línea BL-19U1 de la instalación de radiación sincrotrón de Shanghai, China. Los datos de difracción de rayos X se integraron y escalaron utilizando el programa HKL2000 51. El problema paulatino de las tres estructuras fue resuelto mediante el método de reemplazo molecular utilizando PHENIX.faser 52 con una estructura cristalina de HIV gp41 NHR-CHR (entrada PDB: 1SZT) como modelo de búsqueda. Los modelos finales fueron ajustados manualmente en COOT 53 y refinados con PHENIX.refine 54. Todas las coordenadas fueron depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (N36-L6-AP1: 5CMU; N36-L6-AP2: 5CN0; y N45/AP3: 5CMZ). Las estadísticas de recolección de datos y refinamiento de la estructura se dan en la Tabla Suplementaria S2. Determinación de la reactividad cruzada de los péptidos nativos y artificiales con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1 por el sandwich ELISA. Se realizó un T20, C46, AP1, AP2 y AP3 fueron recubiertos en los pocillos de placas de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) a 10 μ g/ml. Los pocillos fueron bloqueados con gelatina al 1%, seguidos de la adición de 50 μ l de sueros diluidos serialmente de pacientes infectados por VIH-1 e incubación a 37 °C durante 1 h. Luego, se agregaron secuencialmente HRP-IgG antihumano (Abcam, UK) y TMB. Se determinó A450 con un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan). pacientes. Inhibición de péptidos en VIH-1 IIIB (subtipo B, X4)infección en presencia de sera de pacientes infectados por VIH-1 se determinó como se describe anteriormente 55. Brevemente, cada péptido fue mezclado con suero serialmente diluido de un paciente infectado por VIH-1 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, la mezcla de péptido/suero y VIH-1 (100 TCID 50 ) fue añadida a las células MT-2 (1 × 10 5 /ml) en medio RPMI 1640 conteniendo 10% FBS. Después de la incubación a 37 °C durante la noche, los sobrenadantes del cultivo fueron reemplazados por medio de cultivo fresco. Al cuarto día después de la infección, los sobrenadantes del cultivo fueron recolectados para la detección del antígeno p24 por ELISA. Brevemente, cada mezcla de péptido o péptido fue disuelta en solución salina fosfatada (PBS: 50 mM de fosfato sódico y 150 mM de NaCl, pH 7,2) a la concentración final de 10 μ M e incubada a 37 °C durante 30 minutos antes de enfriarse hasta 4 °C. Los espectros CD de cada muestra fueron adquiridos en un espectropolarímetro Jasco (Modelo J-815, Jasco Inc., Japón) a 4 °C utilizando un ancho de banda de 5 nm, resolución de 0,1 nm, longitud de trayectoria de 0,1 cm y un tiempo medio de 5,0 seg. Los espectros fueron corregidos por la sustracción de un blanco correspondiente a la composición solvente de cada muestra. Se utilizó el análisis térmico de punto medio para determinar la temperatura a la que el 50% de los 6-HB formados Se monitorizó a 222 nm de 4 °C a 98 °C aplicando un gradiente térmico de 5 °C/min. Se alisó la curva de fusión, y se calculó el punto medio de los valores de transición de despliegue térmico (Tm) utilizando las utilidades de software de Jasco descritas anteriormente. Inhibición de la formación de haz de seis hélices de gp41 mediante sandwich ELISA. Se determinó la inhibición de la formación de haz de seis hélices de gp41 mediante un péptido de prueba con un sandwich ELISA descrito previamente 57. Brevemente, se preincubaron un péptido de prueba (ADS-J1 como control) a concentraciones graduadas con péptido N36 (1 μ M) a 37 °C durante 30 min, seguido de la adición de péptido C34 (1 La mezcla se añadió a una placa de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) prerevestida con anticuerpos anti-N36/C34 (2 μ g/ml) purificados de antisera de ratón específicamente contra el haz de seis hélices de gp41 58. Luego, se añadieron en orden mAb NC-1, IgG anti-ratón marcado con HRP y TMB. A450 fue determinado por un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan). Las actividades de inhibición de AP1, AP2 y AP3 sobre la infección por VIH-1 fueron determinadas como se describió previamente 57. Para la inhibición de la infección por VIH-1 IIIB (subtipo B, X4), se añadió 100 TCID 50 del virus a 1 × 10 5 /ml de células MT-2 en el medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS en presencia o ausencia del péptido de prueba durante la noche. Luego, los sobrenadantes del cultivo se cambiaron a medios frescos. En el cuarto día después de la infección, los sobrenadantes del cultivo fueron recogidos para la detección del antígeno p24 por ELISA. Para la inhibición de la infección por la cepa VIH-1 Bal (subtipo B, R5), las células M7 (1 × 10 5 /ml) fueron precultivadas durante la noche e infectadas con Bal a 100 TCID 50 en presencia o ausencia del péptido de prueba o proteína durante la noche. Luego, los sobrenadantes del cultivo fueron cambiados a medios frescos. Los sobrenadantes fueron recolectados en el séptimo día post-infección y probados para el antígeno p24 por ELISA como se describió previamente 55. El porcentaje de inhibición de la producción de p24 fue calculado. Análisis de la semivida de los inhibidores de los péptidos. Cuatro ratas SD macho de aproximadamente 200 g cada una fueron obtenidas del Centro de Animales de la Escuela Médica de Shanghai y fueron usadas para el ensayo de semivida. Los animales fueron tratados de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal y la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" (NIH Publication 86-23, revisado 1985). O bien AP2 o AP3 fue inyectado por vía intravenosa a la concentración de 1 mg/ml. Después de la inyección, se obtuvieron muestras de sangre de la órbita de ratas en varios puntos de tiempo (8 y 30 min y 1.5, 3, 6, 9, 12 y 24 h después de la inyección de péptidos) y Para estudiar la farmacocinética de AP2 y AP3 en ratas y proporcionar evidencia experimental de la posible farmacocinética en humanos, se estableció un método de sandwich de doble anticuerpo ELISA para la determinación rápida de AP2 y AP3 en plasma de ratas. Brevemente, las placas de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) fueron prerevestidas con anticuerpos frente a AP2 o AP3 (5 μ g/ml) purificadas a partir de antisera de conejo 59. Luego fueron preincubadas con muestras séricas diluidas 20 veces a 37 °C durante 1 h, seguidas por la adición de anticuerpos anti-AP2 o anti-AP3 (1:1000) purificados a partir de antisera de ratón específicamente frente a AP2 o AP3 59 a 37 °C durante otra 1 h. Luego, se agregaron IgG La absorción a 450 nm fue determinada por un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan), obteniendo primero los parámetros péptidos estándar, determinando las concentraciones de péptidos plasmáticos en función del tiempo, y calculando la semivida utilizando PK Solver para Microsoft Excel para obtener parámetros farmacocinéticos. Evaluación de la sensibilidad de los péptidos a la digestión proteolítica por proteinasa K y enzimas proteolíticas en homogeneato hepático. Los péptidos (10 μ g/ml) se prepararon en PBS pH 7,2 conteniendo 20 ng/ml de proteinasa K. La mezcla resultante fue incubada a 37 °C en un baño de agua y sacada en diferentes intervalos de tiempo (0, 5, 15, 30, 60, 120 minutos), seguida de saturación de las muestras con alcohol etílico y cuantificación de los péptidos Para probar la sensibilidad de los péptidos a las enzimas proteolíticas en el homogeneato hepático, se sacrificaron 3 ratas SD macho (250 ± 20 g) bajo anestesia; se extrajo rápidamente de cada rata todo el hígado, se lavó en PBS helado (50 mM, pH 7,2), se pesaron y cortaron en trozos pequeños, que fueron resuspendidos en PBS a 100 mg de tejido hepático húmedo/2,5 ml de PBS; las muestras fueron agrupadas y homogeneizadas, seguidas de centrifugación a 9.000 g durante 20 minutos a 4 °C; se recolectaron los sobrenadantes; se agregaron los péptidos de prueba al homogeneato hepático a una concentración final de 10 μ g/ml; la mezcla resultante fue incubada 37 °C en un baño de agua, y los péptidos de residuo

¿Cuántas veces se repitió el experimento?

Mejora de las propiedades farmacológicas y estructurales del inhibidor de la fusión del VIH AP3 sobre la enfuvirtida: ventajas destacadas de la estrategia artificial de Peptidehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC454141410/SHA: f2fcc16391f946c99717b63ec9a24e5384aac381Autores: Zhu, Xiaojie; Zhu, Yun; Ye, Sheng; Wang, Qian; Xu, Wei; Su, Shan; Sun, Zhiwu; Yu, Fei; Liu, Qi; Wang, Chao; Zhang, Tianhong; Zhang, Zhenqing; Zhang, Xiaoyan; Xu, Jianqing; Du, Lanying; Liu, Keliang; Lu; Zhang, Ro Sin embargo, su aplicación clínica es limitada debido a la corta semivida, resistencia al fármaco y reactividad cruzada con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH. Utilizando una estrategia de péptido artificial, diseñamos un péptido con secuencia de proteínas no nativas, AP3, que mostró una potente actividad antiviral contra un amplio espectro de cepas del VIH-1, incluyendo aquellas resistentes a T20, y tuvo una semivida in vivo notablemente mayor que T20. Mientras que los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH suprimieron significativamente la actividad antiviral de T20, estos anticuerpos no reconocieron AP3 ni atenuaron su actividad anti-VIH-1. Estructuralmente diferentes de T20, AP3 podrían doblarse en una hélice e interactuar con gp41 NHR. Los dos residuos, Met y Thr, en el N-terminal de AP3 forman una estructura similar a gancho para estabilizar Por lo tanto, AP3 tiene potencial de desarrollo como un nuevo inhibidor de la fusión del VIH con mejor eficacia antiviral, perfil de resistencia y propiedades farmacológicas sobre la enfuvirtida. Mientras tanto, este estudio destacó las ventajas de los péptidos diseñados artificialmente, y confirmó que esta estrategia podría utilizarse en el desarrollo de inhibidores de la fusión viral basados en péptidos artificiales contra el VIH y otros virus envueltos. Texto: Las secuencias de péptidos derivados de la NHR-gp41 o CHR. Los residuos correspondientes a la región de bolsillo de la NHR están marcados en rojo. Los residuos de la PBD están marcados en azul, y los residuos de ganglio MT adyacentes al término N de la PBD están marcados en verde. El péptido 5HRu consta de 5 copias de plantilla de secuencia artificial (AEELAKK) subrayado. Los residuos mutantes en la P b) La actividad inhibitoria de AP1, AP2, AP3 y T20 sobre la infección por VIH-1 IIIB (subtipo B, X4) en células MT-2 (panel izquierdo) por HIV-1 Bal (subtipo B, R5) en células M7 (panel derecho); cada muestra se probó por triplicado y el experimento se repitió dos veces; los datos se presentan como medios ± SD. RepoRts científicos 5:13028 DOi: 10.1038/srep13028Para hacer frente a estos obstáculos, se han hecho muchos esfuerzos para optimizar los péptidos derivados de T20 y gp41 CHR. Algunos de estos péptidos tienen mejores actividades inhibitorias contra cepas resistentes a T20 y/o una semivida más larga que T20. Sin embargo, todavía tienen el problema de reaccionar de forma cruzada con los anticuerpos preexistentes en la su Basándonos en la plantilla de péptido artificial universal de 5HRu, hemos diseñado previamente los péptidos artificiales de AP1 (PBD-m4HR) y AP2 (PBDtrp-m4HR), y hemos realizado investigaciones preliminares sobre su actividad inhibitoria contra la fusión de células mediadas por Env VIH-1 16. En el presente estudio, hemos diseñado un nuevo péptido artificial, AP3 (Fig. 1a), con el objetivo de aplicar la estructura "M-T gancho" para estabilizar la interacción del péptido artificial con el bolsillo hidrofóbico en el recortador NHR gp41 17, 18. Después de estudiar exhaustivamente su actividad antiviral, propiedad bioquímica, estructura cristalina, mecanismo funcional, semivida in vivo y, por primera vez, el efecto de anticuerpos preexistentes en el sera de pacientes infectados por VIH, encontramos que el péptido artificial de nuevo diseño, AP3, mostró una mejor actividad antiviral, perfil de resistencia a fármacos y propiedades farmacológicas sobre T20. En particular, los anticuerpos preexistentes en el sera de pacientes infectados por VIH no suprimieron, sino que mejoraron la actividad anti-VIH-1 de AP3. Estos resultados sugieren que el AP3 tiene potencial de desarrollo como un nuevo fármaco anti-VIH y confirman que esta estrategia se puede utilizar para diseñar péptidos antivirales artificiales contra otros virus envueltos, como el SARS-CoV 19, el MERS-CoV 20 y el paramixovirus 21. Nuestros péptidos artificiales AP1 y AP2 previamente diseñados podrían inhibir la fusión de la membrana celular mediada por el VIH-1 16. Él y sus colegas reportaron que la adición de dos aminoácidos de Met y Thr al N-terminal de un CHR-péptido podría mejorar su actividad anti-VIH-1 17, 18. Aquí diseñamos un nuevo péptido artificial, AP3, añadiendo Met y Thr al N-terminal de AP2 (Fig. 1a). Luego comparamos AP3 con AP1, AP2 y T20 para su actividad anti-VIH-1 contra cepas divergentes del VIH-1, incluyendo los virus adaptados al laboratorio, IIIB (subtipo B, X4) y Bal (subtipo B, R5), y una serie de aislamientos primarios del VIH-1, así como las cepas resistentes al T20. 1b, AP3 mostró mayores actividades inhibitorias sobre la infección por cepas HIV-1 IIIB y HIV-1 Bal (IC 50 : 3,06 y 15,09 nM, respectivamente) que AP1 (IC 50 : 86,25 y 396,14 nM, respectivamente), AP2 (IC 50 : 23,05 y 49,95 nM, respectivamente) y T20 (IC 50 : 13,63 y 30,21 nM, respectivamente). La actividad inhibitoria de AP3 sobre la infección por cepas primarias divergentes de VIH-1 con distintos genotipos (subtipos A -E y grupo O) y fenotipos (R5 y X4) también fue superior a la de AP2 y T20 (Tabla 1). Si bien la T20 no fue eficaz frente a cepas de VIH-1 resistentes a T20 a una concentración de hasta 2.000 nM, la AP3 podría efectivamente inhibir la infección de estas cepas con IC 50 en el rango de 13 ~ 90 nM, que era aproximadamente 2 a 4 veces más eficaz que la AP2 (Tabla 1 ). Estos resultados indican que el péptido artificial AP3 ha mejorado notablemente la actividad anti-VIH-1 contra un amplio espectro de cepas de VIH-1, incluyendo variantes resistentes a T20, sobre T20 y los péptidos artificiales AP1 y AP2. Los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1 no reconocieron la AP3 ni atenuaron su actividad anti-VIH-1. Los estudios anteriores han demostrado que los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH-1, incluidos los que reaccionan de forma cruzada con T20 y los específicos para los sitios de unión de T20 en gp120 (por ejemplo, las regiones del bucle C1 y V3) y gp41 (por ejemplo, el dominio NHR), podrían bloquear significativamente la actividad inhibitoria de fusión de T20 14, 15. Aquí investigamos la influencia de anticuerpos preexistentes contra el péptido AP3. Como se muestra en la figura 2a, tanto T20 como C46 reaccionaron con los anticuerpos en sueros de cinco pacientes infectados por el VIH-1; sin embargo, ninguno de los tres péptidos artificiales AP1, AP2 y AP3 fue reconocido por los anticuerpos preexistentes.La actividad inhibitoria de T20 sobre la infección por el VIH-1 IIIB se redujo aproximadamente 1,9 veces a > 3,6 veces en presencia de 2b y Tabla Suplementaria S1), confirmando que los anticuerpos preexistentes en sera de pacientes con VIH/SIDA pueden atenuar la actividad anti-VIH-1 de T20 14, 15. Sin embargo, ninguno de los péptidos artificiales en el presente estudio mostró disminución significativa de la actividad anti-VIH-1 en presencia de sera de pacientes. En cambio, la actividad antiviral de AP3 aumentó en presencia de antisera de pacientes infectados con VIH-1 (fig. 2b y Tabla Suplementaria S1), sugiriendo que los anticuerpos anti-VIH-1 realmente mejoraron la actividad anti-VIH-1 de AP3, posiblemente porque la unión de los anticuerpos a algunos sitios en gp120 o gp41 promueve la interacción de AP3 con la región viral de gp41 NHR. AP3 tuvo una semivida mayor que T20. Aunque la T20 ha demostrado eficacia en la inhibición de la infección por el VIH-1, su principal debilidad radica en su corta semivida en plasma (aproximadamente 2 h) [22] [23]. Como resultado, la T20 debe administrarse por vía subcutánea dos veces al día a 90 mg por dosis, causando a menudo reacciones graves en el lugar de inyección 25, 26. Aquí, se realizaron estudios farmacocinéticos por administración intravenosa de AP3, AP2 y T20, respectivamente, a rata SD a una dosis de 1 mg/kg, para comparar su tiempo de circulación in vivo. Como era de esperar, la T20 mostró una semivida más corta y un AUC menor (0-t) por circulación sistémica, mientras que la AP3 y la AP2 demostraron una concentración mucho mayor y un tiempo de circulación más largo (Tabla 2 ). Los perfiles farmacocinéticos de AP3 y AP2 se ajustaron a un modelo de no-compartimento. La semivida de eliminación in vivo de AP3 (t 1/2 = 6,02 h) fue aproximadamente 2,8 veces mayor que la de T20 (t 1/2 = 1,57 h). Este resultado proporcionó la base teórica para reducir la frecuencia de inyección y la dosis del inhibidor de la fusión, en conjugación con la potencia antiviral mejorada de AP3. Por lo tanto, la sustitución de T20 por AP3 puede reducir significativamente las reacciones en el lugar de inyección y el costo del fármaco, lo que promovería las aplicaciones clínicas del inhibidor de la fusión del VIH en regiones o países pobres en recursos. AP3 fue mucho más resistente que T20 a la degradación proteolítica por proteinasa K y homogenato hepático de rata. Comparamos la estabilidad de T20 y AP3 en presencia de proteinasa K (una proteína de serina de amplio espectro) y homogenato hepático de rata. Después del tratamiento con 20 ng/ml de proteinasa K durante 2 h a 37 °C, sólo quedó el 29% del péptido parental T20, detectado por el análisis LC-MS. Bajo la misma condición, AP3 retuvo el 100% de su prototipo (Fig. 3a ). Además, AP3 mostró una estabilidad metabólica significativamente aumentada sobre T20 in vitro en presencia de homogenato hepático (Fig. 3b). Estos resultados indican que el péptido artificial AP3 es mucho más resistente a la degradación proteolítica que el péptido natural T20, lo que puede contribuir a su significativa vida media in vivo más larga que T20 como se describe anteriormente. AP3 formó un complejo estable α-helical y la formación de bloque gp41 6-HB. Para investigar el mecanismo antiviral de AP3, se comparó la estabilidad térmica del complejo AP3/N36 con la de AP1/N36, AP2/N36, T20/N36 y C34/N36 complejos por espectroscopia circular-dicroísmo (CD) 27. Debido a que T20 carece del dominio de encuadernación de bolsillo (PBD), el complejo T20/N36 no mostró una conformación α-helical típica, en consistencia con nuestros estudios anteriores 8, 9. Similar a la α-helicidad del complejo C34/N36 3, los complejos AP1/N36, AP2/N36 y AP3/N36 formaron un pico negativo en forma de sillín a 208 nm y 222 nm, indicando sus estructuras α-helical (fig. 4a) Fig. 4b), indicando que el complejo helicoidal α formado por AP3 y N36 es el más estable entre los cuatro complejos. Luego comparamos la actividad inhibitoria de AP3 con la de AP1 y AP2 en la formación de 6-HB entre C34 y N36. Como T20 no puede bloquear la formación de 6-HB 8, 9, utilizamos un inhibidor de fusión de pequeña molécula VIH-1, ADS-J1 28, 29, para reemplazar a T20 como un control de inhibición de 6-HB. Como se esperaba, ADS-J1 podría efectivamente inhibir la formación de 6-HB con IC 50 de 2,75 μ M 8, 9, [27] [28]. AP3 fue altamente eficaz contra la formación de 6-HB de forma dosis-dependiente con un valor IC 50 de 0,24 μ M, aproximadamente 30 y 15 veces más potente 4c), confirmando que AP3 puede bloquear potentemente la formación del núcleo de fusión gp41 6-HB, inhibiendo así la fusión del VIH-1 con la membrana celular diana. Base estructural para la potente actividad inhibitoria de fusión del péptido artificial AP3. Para dilucidar los determinantes moleculares de estos péptidos artificiales, resolvimos con éxito las tres estructuras complejas de péptidos AP1/AP2/AP3 que se unen con gp41 NHR. Para AP1 y AP2, un enlace optimizado Cada muestra fue probada por triplicado y el experimento se repitió dos veces. Los datos se presentan como medios ± SD. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. "SGGRGGG" se utilizó para ensamblar el NHR y el péptido artificial en una única proteína recombinante (N Sin embargo, una estrategia similar falló en la cristalización de AP3; por lo tanto, decidimos cocristalizar el péptido sintético N45 y péptido AP3, y finalmente se obtuvieron los cristales complejos. Curiosamente, los cristales de tres inhibidores diferentes pertenecen a tres grupos espaciales distintivos: P2 1 para N36-L6-AP1, R32 para N36-L6-AP2, y P6 3 para N45/AP3. Como era de esperar, las porciones de NHR en tres estructuras forman un núcleo trimérico, mientras que la porción AP1, AP2 o AP3 se pliega en una conformación de una hélice única y se une a NHR-trimer para formar un típico 6-HB, similar a la de la estructura central de HIV-1 gp41 formada por el péptido CHR nativo C34 y N36 (Fig. 5a). Además, los residuos hidrofóbicos conservados, como el W43, el W46 y el I50, en los péptidos artificiales fueron profundamente enterrados en la Tabla 2. Parámetros farmacocinéticos de AP2, AP3 y T20 tras la administración intravenosa a 1 mg/kg en ratas SD macho (n = 2). Figura 3. Sensibilidad de AP3 y T20 a la degradación proteolítica por proteinasa K y homogeneato hepático de rata. a) Después de la digestión por proteinasa K a pH 7,2 y b) homogeneato hepático de rata, la cantidad residual de AP3 y T20 fue detectada mediante análisis LC-MS. El experimento se realizó en triplicado y los datos se presentan como medios ± SD. La inhibición de AP1, AP2, AP3, T20 y ADS-J1 frente a la formación de 6-HB entre N36 y C34 fue detectada por ELISA utilizando el mAb NC-1 específico de 6-HB. Cada muestra se probó por triplicado, y los datos se presentan como media ± DE. surcos formados entre cada par de hélices NHR, similares a los residuos correspondientes de W628, W631 y I635 en la gp41 CHR nativa (Fig. 5b). Los péptidos AP mostraron mejor afinidad contra la Gp41 CHR natural. En C34, que contiene la secuencia CHR natural de W628 a L661, no se encontró interacción fuerte entre I642 y Q565 en el complejo de GP41 NHR-CHR viral (Fig. 5c). Sin embargo, en la secuencia correspondiente (de W43 a K76) de AP1 y AP2, se estableció un enlace de hidrógeno entre S57 (correspondiente a I642 en CHR) y Q18 (correspondiente a Q565 en NHR) en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3. Así, S57 en AP1/AP2/AP3 desempeña un papel en la estabilización de las interacciones entre el inhibidor péptido artificial y su objetivo NHR, resultando en su afinidad de unión más fuerte. Además, en NHR-CHR, L567 y L568 en dos NHR adyacentes forman una ranura hidrofóbica, en la que T639 está enterrado (Fig. Suplemental S1a ). Sin embargo, en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3, I54 (correspondiente a T639 en CHR) puede unirse fuertemente a L20 y L21 a través de interacciones de cadenas laterales totalmente hidrofóbicas. Del mismo modo, la interacción de I64 (correspondiente a S659 en CHR) con L10 y L11 (correspondiente a L567 y L568 en NHR, respectivamente) en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3 se ha mejorado significativamente (Suplementary Fig. S1b ). Al igual que la hélice gp41 CHR, las hélices de AP1, AP2 y AP3 también tienen dos lados diferentes, un lado hidrofóbico orientado hacia la NHR y un lado hidrofílico orientado hacia Se espera que la mejora de la hidrofilia del lado expuesto de los inhibidores pueda aumentar su actividad antiviral y solubilidad. Para lograr este objetivo, los residuos de aminoácidos con hidrofobia, o baja hidrofilia, como N637, S640, L641 y S644 en CHR, fueron cambiados a los residuos de aminoácidos con alta hidrofilia, como E52, K55, K56 y E59 en AP1, AP2 y AP3, respectivamente. Además, el residuo hidrofóbico M629 en CHR fue reemplazado por un residuo hidrofílico E44 en AP2 y AP3 (Figura suplementaria S2 ). Estos residuos hidrofílicos, como ácido glutámico y lisina, pueden aumentar la solubilidad de péptido entero y, por lo tanto, estabilizar el complejo formado por el inhibidor y su objetivo. Se ha demostrado que el puente de sal doble EE-KK puede estabilizar la conformación de la hélice 30. Hemos identificado este tipo de interacción entre i e i + 3 o i + 4 posiciones en las tres estructuras complejas. En N36-L6-AP1, R48 interactúa con E45 y E52 para formar una red de puente de sal. En N36-L6-AP2, E45 interactúa con K48, y E52 se une a K56, mientras que en N45/AP3, K69 se une a E66 ( Suplementary Fig. S2 ). Estos fuertes puentes de sal formados por los residuos cargados opuestamente estabilizan la conformación de péptidos AP, llevando su efecto inhibidor en pleno juego. Como se informó anteriormente, la adición del "gancho M-T" a los péptidos CHR C34 y sifuvertida podría mejorar dramáticamente la actividad Como era de esperar, el N-terminal Met y Thr de AP3 forma una estructura similar a un gancho (Fig. 5d). La cadena lateral de la metionina hidrofóbica de M41 acomoda la ranura entre hélices AP3 y NHR, tapando el bolsillo hidrofóbico. Esta interacción conduce a una serie de cambios conformacionales. La cadena principal de AP3 en W43 se mueve 1,91 Å más cerca de NHR en comparación con AP2 (Suplemental Fig. S3 ). La cadena lateral de W43 en AP3 gira alrededor de 90 grados y está enterrada más profundamente que la de AP2. La cadena lateral de E44 vuelve a interactuar a D47, pero la cadena lateral de E45 retrocede desde K48 e interactúa con T42. Por lo tanto, esta estructura de gancho M-T podría estabilizar aún más la unión entre AP3 y NHR La Enfuvirtida, también conocida como T20, fue aprobada por la FDA como el primer medicamento antiviral basado en el inhibidor de la entrada del VIH para su uso con otros medicamentos anti-VIH para tratar adultos y niños infectados por el VIH-1 a los 6-16 años 23,31,32 (http://www.fuzeon.com). Aunque la T20 es un medicamento anti-VIH indispensable para los pacientes con VIH/SIDA que no han respondido a la terapia antirretroviral actual, sus deficiencias han limitado su aplicación clínica. La T20 tiene una actividad anti-VIH menor y una semivida más corta que otros péptidos de la CHR que contienen PBD, como C34 y C38 8, 9, 33. Además, las variantes resistentes al VIH-1 T20 surgieron en breve (por ejemplo, 14 días) después de su uso en pacientes 34. La mayoría de los virus resistentes a T20 presentaban mutaciones en el motivo GIV (residuos 36-45: GIVQQNNLL) en el dominio Gp41 NHR 10, [34] [35] [36] [37] [38]. La falta de PBD contribuye a las principales debilidades de T20 descritas anteriormente. Dado que el bolsillo hidrofóbico conservado en el trimer de NHR gp41 desempeña un papel crítico en la estabilización de la interacción entre el NHR gp41 y CHR y la formación del núcleo fusogénico de 6-HB 1, 39, 40, el péptido CHR que contiene PBD, como C34, puede unirse al trimer de gp41 viral más fuerte y estable, poseyendo así una actividad anti-VIH más potente que T20, un péptido CHR sin PBD 8, 9. En ausencia de PBD, T20 interactúa principalmente con la región media del dominio NHR que contiene el motivo GIV. Por lo tanto, un virus con mutaciones en este motivo es generalmente resistente a T20 10, [34] [35] [36] [37] [38]. En comparación con otros fármacos anti-VIH, otra debilidad de T20 es su reactividad cruzada con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1. Además de gp41, T20 también podría unirse a algunas regiones en gp120. Los anticuerpos preexistentes específicos para los sitios de unión del T20 en gp120 y gp41 pueden suprimir indirectamente la actividad anti-VIH de T20 14, 15. La adición de PBD al N-terminal de T20, como T-1249, podría mejorar significativamente la potencia anti-VIH-1, la semivida y el perfil de resistencia a fármacos 33, [41] [42] [43]. La adición de la estructura de gancho M-T al N-terminal de un PBD-CHR-péptidos que contienen PBD, como MT-C34 o MT-SFT, podría aumentar aún más la actividad anti-VIH-1 de los correspondientes CHR-péptidos 17, 18. La supresión del dominio GIV-motif-vinculante de un CHR-péptido, como CP621-652 y CP32M, es otro enfoque eficaz para aumentar la barrera genética a la resistencia a drogas 44, 45. Sin embargo, ninguno de los enfoques anteriores es eficaz para prevenir la reacción cruzada de T20 con los anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes con VIH/SIDA, ya que los péptidos previamente modificados contienen principalmente las secuencias nativas del dominio HIV-1 gp41 CHR. Nuestros estudios anteriores han demostrado que AP1 y AP2, péptidos artificiales con secuencias de proteínas no nativas, podrían formar estructura de bobina en espiral para interactuar con gp41 NHR e inhibir la fusión celular mediada por VIH-1 Env 16. En el presente estudio, diseñamos un nuevo péptido artificial, AP3, añadiendo la estructura de gancho M-T al N-terminal de AP2 (Fig. 1a), seguido de investigar la influencia de anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes infectados por VIH en AP3, utilizando AP1, AP2 y T20 como controles. Se demostró que los sueros de los pacientes infectados por el VIH podrían unirse a la T20 y reducir significativamente su potencia frente al VIH-1. Sin embargo, estas mismas muestras séricas no interactuaron con los tres péptidos artificiales y apenas afectaron su actividad antiviral. Sorprendentemente, los anticuerpos en el sera podrían incluso mejorar la actividad anti-VIH-1 de AP3 (Fig. 2a,b y Tabla Suplementaria S1). Estos resultados confirmaron, por primera vez, que la sustitución de la secuencia viral nativa en la T20 por una secuencia artificial es un enfoque eficaz para superar una deficiencia clave de la T20, por lo que su actividad anti-VIH podría ser atenuada por anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes con VIH/SIDA. Vale la pena explorar por qué los anticuerpos en la sera son capaces de mejorar la actividad anti-VIH-1 de la AP3. Nuestro estudio reciente ha demostrado que la actividad anti-VIH-1 de T20 se ve aumentada por un anticuerpo no neutralizante dirigido contra el dominio NHR del VIH-1 gp41 46. Por lo tanto, hipotetizamos que algunos de los anticuerpos anti-gp41 en pacientes con VIH/SIDA pueden unirse a un sitio en el dominio NHR adyacente a la región de unión de AP3, lo que resulta en una mayor interacción entre AP3 y NHR-trimer y una mayor actividad antiviral de AP3. Luego comparamos la actividad inhibitoria de AP3 con el gancho M-T y T20/AP2 sin gancho M-T sobre la infección por cepas divergentes del VIH-1. AP3 fue más eficaz que AP2 o T20 en inhibir la infección por cepas adaptadas al laboratorio y los aislamientos primarios del VIH-1, incluyendo los resistentes al T20 (fig. 1b, Tabla Se puede cuestionar si AP3 también puede inducir virus farmacorresistentes en pacientes si se usa en clínicas para tratar pacientes infectados por VIH. Creemos que AP3 tiene una barrera genética mucho mayor a la resistencia que T20 porque AP3 contiene PBD, mientras que T20 carece de PBD. Dwyer et al. 33 utilizaron T2544, un péptido CHR que contiene PBD, para llevar a cabo un experimento de paso, utilizando T20 como control. Demostraron que T20 podría inducir un virus mutante con alta resistencia (81 veces) a T20 en aproximadamente 1 mes, mientras que T2544 no indujo una cepa resistente en más de 2 meses en cultivo. Después de extender el experimento de paso por casi 8 meses, identificaron una cepa con una resistencia débil (8,3 veces) a T-2544, y los sitios de mutación relacionados no estaban en la región de bolsillo gp41, lo que sugiere que los péptidos CHR que contienen PBD, incluyendo AP3, pueden tener dificultad para inducir resistencia al fármaco. AP3 también tuvo una vida media más larga que T20 (Tabla 2), posiblemente porque el péptido artificial AP3 es menos sensible a las enzimas proteolíticas que T20 con la secuencia de proteínas virales nativas. Se espera que la eliminación de los sitios de escisión de enzimas proteolíticas en el péptido AP3 amplíe aún más su vida media. Estos resultados confirmaron que la sustitución de la secuencia de proteínas nativas por secuencia artificial y la adición del gancho M-T al péptido que contiene PBD es una estrategia sólida para diseñar Dado que las estructuras tridimensionales de los péptidos AP no habían sido investigadas antes del presente estudio, la optimización de estos inhibidores de los péptidos artificiales no pudo ser realizada racionalmente. Nuestros estudios estructurales de los péptidos artificiales AP1/AP2/AP3 en complejo con NHR mostraron que los péptidos AP, al igual que el péptido CHR C34, podrían unirse a gp41 NHR para formar una estructura canónica 6-HB (Fig. 5a). Es bien sabido que existe un bolsillo hidrofóbico profundo en cada ranura en la superficie del trimer viral gp41 NHR. Los residuos hidrofóbicos I635, W631 y W628 en la unión gp41 CHR con los residuos hidrofóbicos en la pared de este bolsillo, resultando en la formación de 6-HB estable por la fuerte interacción entre CHR Esta importante característica ha sido bien preservada en las estructuras AP1/AP2/AP3 6-HB (Fig. 5b), que pueden explicar las potentes actividades inhibitorias de la fusión VIH-1 de estos péptidos artificiales. Un nuevo enlace de hidrógeno, que se estableció entre S57 y Q18 en los complejos AP1/AP2/AP3, no existe en el complejo viral gp41 CHR-NHR, sugiriendo que S57 puede jugar un papel importante en la estabilización de las interacciones entre el péptido y NHR, dando lugar a afinidades de unión de AP1/AP2/AP3 que son más fuertes que las de HIV-1 gp41 CHR a NHR. Además, el puente de sal doble EE-KK formado entre las posiciones i e i + 4 en las estructuras AP1/AP2/AP3 podría estabilizar la conformación de la hélice y aumentar el efecto inhibitorio de estos pé En comparación con AP1, las mutaciones en el sitio triple se introdujeron en AP2 y AP3, es decir, M44E, R48K y E49K. Estas sustituciones no sólo aumentan la solubilidad del péptido, sino que también desencadenan una serie de reordenamientos de ciertos puentes de sal intrahelical para mejorar la estabilidad de la estructura de la hélice de la CHR y la actividad inhibidora de la fusión del VIH-1. Anteriormente se demostró que el gancho M-T era un paso efectivo hacia el aumento de la interacción estable entre un péptido de la CHR y el bolsillo del HIV-1 gp41 17, 18. Por lo tanto, AP2 se optimizó aún más mediante la incorporación de Met y Thr en su terminal N. Los resultados de espectroscopia de CD y desnaturalización térmica indican que la incorporación de gancho M-T contribuye a la formación de una Además, el puente salino doble EE-KK formado entre i e i + 4 posiciones en la estructura N36-L6-AP3 contribuyó a aumentar la estabilidad de la hélice CHR y 6-HB, lo que resultó en una mejor potencia de AP3, como se ha observado en estudios de CHR-péptidos con mutaciones dobles EE-KK 30, 33, 47, 48. Además, la actividad de fusión del VIH-1 y la semivida de AP2 pueden haber sido reforzadas y ampliadas, respectivamente, mediante la adición de gancho M-T en el diseño de AP3. En conclusión, AP3, un péptido artificial con estructuras de gancho PBD y M-T, mostró una mejor actividad anti-VIH-1 y perfil de resistencia a fármacos, así como una vida media prolongada. Además, no reaccionó con los anticuerpos preexistentes en la sura de pacientes con VIH/SIDA. Consecuentemente, su actividad antiviral RepoRts Científicos 5:13028 DOi: 10.1038/srep13028 no fue significativamente afectada por estos anticuerpos. Por lo tanto, AP3 muestra la promesa como un candidato para el desarrollo ulterior como un nuevo inhibidor de la fusión del VIH para uso clínico. Este estudio también proporciona información importante de estructura e actividad para el diseño racional de nuevos inhibidores de péptidos artificialmente. Además, nuestros resultados destacaron las ventajas de los péptidos diseñados artificialmente y confirmaron que esta estrategia podría ser ampliamente utilizada en el desarrollo de inhibidores de la fusión de virus basados en péptidos artificiales contra el VIH-1 y otros virus envueltos con proteínas de fusión de membrana de clase I, tales como SARS-CoV 19, MERS-CoV 20, y paramixovirus 49. Este estudio no implicó experimentación humana; los únicos materiales humanos utilizados fueron muestras séricas obtenidas de individuos infectados por el VIH-1 con la aprobación del Comité de Ética del Centro Clínico de Salud Pública de Shanghai, Universidad de Fudan (Protocolo No. SPHCC-125-2). Los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas. Todas estas muestras de sueros procedían de adultos; ningún menor estuvo involucrado en este estudio. Se obtuvo el consentimiento informado escrito para el uso de los especímenes clínicos de todos los pacientes involucrados en este estudio. Síntesis de Peptide. Un panel de péptidos (Fig. 1a), incluyendo T20, C34, C46, AP1, AP2, AP3, así como N-péptidos derivados de NHR, N36 y N45, fueron sintetizados con un método FMOC de fase sólida estándar, como se describió anteriormente 8, 50. Todos los péptidos fueron acetilados en el término N y mediados en el término C. Los péptidos fueron encontrados alrededor del 95% puros por el CLAR y fueron identificados por espectrometría de masas (Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA). Las concentraciones de los péptidos fueron determinadas por la absorbancia UV y un coeficiente de extinción molar calculado teóricamente basado en residuos de triptófano y tirosina. Ensayo de calificación. Los análisis cromatográficos se realizaron utilizando una columna SAO-C8 (5 μ m, 100 mm × 2,0 mm ID) mantenida a temperatura ambiente. La fase móvil se compuso de ácido acetonitrilo-agua-fórmico en la proporción de 50:50:0.1 (v/v/v) a un caudal de 0,3 mL/min. El volumen de inyección de la muestra fue de 10 μ L. El acetonitrilo fue de grado HPLC, y otros reactivos químicos y disolventes fueron de grado analítico. Para el análisis de LC-MS se utilizó un espectrómetro de masa tándem tricuadruple MAX de Thermo TSQ Quantum Discovery MAX equipado con fuente ESI (San José, CA) y bomba LC Surveyor. Para la adquisición y procesamiento de datos se utilizó el software Xcalibur y el programa de análisis de datos LCQuan 2.0 (Thermo Finnigan), respectivamente. Los parámetros de MS optimizados fueron inferiores a: tensión de pulverización de 4800 V, presión de gas de vaina de 40,0 psi, flujo de válvula auxiliar de 1,0 psi y 300 °C de temperatura capilar. Al ejecutar la disociación inducida por colisión (CID), la presión El modo de monitoreo de reacción seleccionado (SRM) se utilizó para AP3 mientras que el modo de monitoreo de iones seleccionado (SIM) se preformó para T20. Se registraron las siguientes transiciones: m/z 670.5 para AP3, m/z 1498.6 para T20. Las masas de péptidos sintéticos T20, AP1, AP2 y AP3 fueron determinadas por MALDI-TOF-MS (Fig. Suplementario S4 y S5 ). Expresión y purificación de proteínas de fusión N36-L6-AP1 y N36-L6-AP2. Utilizando PCR superpuesta, el fragmento de ADN que codificaba AP1 o AP2 péptido fue unido al fin 3′ del cDNA de gp41 NHR ("N36", 546-581), con un enlace corto ("L6", SGGRGG) entre ellos. Luego, toda la secuencia se subclonó en el vector pET-28a (Novagen, EE.UU.) con una etiqueta SUMO artificial entre la etiqueta HIS de N-terminal y la proteína diana. Las células E. coli de pET-28a-SUMO-N36-L6-AP1-o pET-28a-SUMO-N36-L6-AP2-transformadas fueron inducidas añadiendo 1 mM IPTG e incubando durante la noche a 16 °C. La proteína de fusión fue purificada por resina de afinidad Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), y la etiqueta His-SUMO fue cortada por el tratamiento enzimático Ulp1 a 4 °C durante 2 h. Se aplicó el recortador purificado N36-L6-AP1 o N36-L6-AP2 a una columna de filtración de gel Superdex-75 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.). Se recolectaron fracciones que contenían N36-L6-AP1 o N36-L6-AP2 y se concentraron en diferentes concentraciones por ultrafiltración. Cristalización, recolección de datos y determinación de la estructura. La proteína de fusión N36-L6-AP1 fue cristalizada a 16 °C utilizando el método de gota colgante, difusión de vapor. Las gotas se colocaron en un clip de cubierta siliconizada equilibrando una mezcla que contenía una solución proteica de 1 μ l (25 mg/ml N36-L6-AP1 recortador en 20 mM Tris-HCl pH 8,0 y 150 mM NaCl) y una solución de depósito de 1 μ l (0,1 M Tris-HCl pH 8,5, 32% (p/v) PEG3350 y 0,2 MgCl 2 ) frente a una solución de depósito de 400 μ l. Después de una semana, se formaron cristales únicos y se congelaron por chispa con nitrógeno líquido para la recogida de datos en el futuro. La proteína de fusión N36-L6-AP2 se cristalizó de manera similar con una solución de depósito diferente (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 34% (p/v) PEG3350 y 0,2 MgCl 2 Para obtener el cristal complejo de AP3 y NHR, el AP3 sintetizado se mezcló primero con el péptido N45 a razón de 1:1 molar y luego se aplicó a una columna de filtración de gel Superdex-75 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) para aislar el recortador formado de 6-HB. Se recogieron fracciones que contenían N45/AP3 y se concentraron hasta 30 mg/ml, luego se cristalizaron a 16 °C utilizando la gota colgante, método de difusión de vapor.Las gotas se colocaron en un clip de cubierta siliconizado equilibrando una mezcla que contenía una solución proteica de 1 μ l (20 mM Tris-HCl pH 8.0 y 150 mM NaCl) y una solución de depósito de 1 μ l (0,2 M de sulfato de amonio, 0,1 M Los conjuntos de datos de N36-L6-AP1 se recogieron a 100 K en la línea 19-ID de la fuente avanzada de fotones (Argonne National Laboratory, EE.UU.). Los conjuntos de datos de N36-L6-AP2 se recogieron en una fuente de rayos X interna (MicroMax 007 generador de rayos X, Rigaku, Japón) en el Instituto de Biofísica de la Academia China de Ciencias. Los conjuntos de datos de los cristales complejos AP3/N45 se recolectaron en la línea BL-19U1 de la instalación de radiación sincrotrón de Shanghai, China. Los datos de difracción de rayos X se integraron y escalaron utilizando el programa HKL2000 51. El problema paulatino de las tres estructuras fue resuelto mediante el método de reemplazo molecular utilizando PHENIX.faser 52 con una estructura cristalina de HIV gp41 NHR-CHR (entrada PDB: 1SZT) como modelo de búsqueda. Los modelos finales fueron ajustados manualmente en COOT 53 y refinados con PHENIX.refine 54. Todas las coordenadas fueron depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (N36-L6-AP1: 5CMU; N36-L6-AP2: 5CN0; y N45/AP3: 5CMZ). Las estadísticas de recolección de datos y refinamiento de la estructura se dan en la Tabla Suplementaria S2. Determinación de la reactividad cruzada de los péptidos nativos y artificiales con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1 por el sandwich ELISA. Se realizó un T20, C46, AP1, AP2 y AP3 fueron recubiertos en los pocillos de placas de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) a 10 μ g/ml. Los pocillos fueron bloqueados con gelatina al 1%, seguidos de la adición de 50 μ l de sueros diluidos serialmente de pacientes infectados por VIH-1 e incubación a 37 °C durante 1 h. Luego, se agregaron secuencialmente HRP-IgG antihumano (Abcam, UK) y TMB. Se determinó A450 con un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan). pacientes. Inhibición de péptidos en VIH-1 IIIB (subtipo B, X4)infección en presencia de sera de pacientes infectados por VIH-1 se determinó como se ha descrito anteriormente 55. Brevemente, cada péptido fue mezclado con suero serialmente diluido de un paciente infectado por VIH-1 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, la mezcla de péptido/suero y VIH-1 (100 TCID 50 ) fue añadida a las células MT-2 (1 × 10 5 /ml) en medio RPMI 1640 conteniendo 10% FBS. Después de la incubación a 37 °C durante la noche, los sobrenadantes del cultivo fueron reemplazados por medio de cultivo fresco. Al cuarto día después de la infección, los sobrenadantes del cultivo fueron recolectados para la detección del antígeno p24 por ELISA. Brevemente, cada mezcla de péptido o péptido fue disuelta en solución salina fosfatada (PBS: 50 mM de fosfato sódico y 150 mM de NaCl, pH 7,2) a la concentración final de 10 μ M e incubada a 37 °C durante 30 minutos antes de enfriarse hasta 4 °C. Los espectros CD de cada muestra fueron adquiridos en un espectropolarímetro Jasco (Modelo J-815, Jasco Inc., Japón) a 4 °C utilizando un ancho de banda de 5 nm, resolución de 0,1 nm, longitud de trayectoria de 0,1 cm y un tiempo medio de 5,0 seg. Los espectros fueron corregidos por la sustracción de un blanco correspondiente a la composición solvente de cada muestra. Se utilizó el análisis térmico de punto medio para determinar la temperatura a la que el 50% de los 6-HB formados Se monitorizó a 222 nm de 4 °C a 98 °C aplicando un gradiente térmico de 5 °C/min. Se alisó la curva de fusión, y se calculó el punto medio de los valores de transición de despliegue térmico (Tm) utilizando las utilidades de software de Jasco descritas anteriormente. Inhibición de la formación de haz de seis hélices de gp41 por sandwich ELISA. Se determinó la inhibición de la formación de haz de seis hélices de gp41 mediante un péptido de prueba con un sandwich ELISA descrito previamente 57. Brevemente, un péptido de prueba (ADS-J1 como control) a concentraciones graduadas fue preincubado con péptido N36 (1 μ M) a 37 °C durante 30 min, seguido de la adición de péptido C34 (1 La mezcla se añadió a una placa de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) prerevestida con anticuerpos anti-N36/C34 (2 μ g/ml) purificados de antisera de ratón específicamente contra el haz de seis hélices de gp41 58. Luego, se añadieron en orden mAb NC-1, IgG anti-ratón marcado con HRP y TMB. A450 fue determinado por un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan). Las actividades de inhibición de AP1, AP2 y AP3 sobre la infección por VIH-1 fueron determinadas como se describió previamente 57. Para la inhibición de la infección por VIH-1 IIIB (subtipo B, X4), se añadió 100 TCID 50 del virus a 1 × 10 5 /ml de células MT-2 en el medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS en presencia o ausencia del péptido de prueba durante la noche. Luego, los sobrenadantes del cultivo se cambiaron a medios frescos. En el cuarto día después de la infección, los sobrenadantes del cultivo fueron recogidos para la detección del antígeno p24 por ELISA. Para la inhibición de la infección por la cepa VIH-1 Bal (subtipo B, R5), las células M7 (1 × 10 5 /ml) fueron precultivadas durante la noche e infectadas con Bal a 100 TCID 50 en presencia o ausencia del péptido de prueba o proteína durante la noche. Luego, los sobrenadantes del cultivo fueron cambiados a medios frescos. Los sobrenadantes fueron recolectados en el séptimo día post-infección y probados para el antígeno p24 por ELISA como se describió previamente 55. El porcentaje de inhibición de la producción de p24 fue calculado. Análisis de la semivida de los inhibidores de los péptidos. Cuatro ratas SD macho de aproximadamente 200 g cada una fueron obtenidas del Centro de Animales de la Escuela Médica de Shanghai y fueron usadas para el ensayo de semivida. Los animales fueron tratados de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal y la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" (NIH Publication 86-23, revisado 1985). O bien AP2 o AP3 fue inyectado por vía intravenosa a la concentración de 1 mg/ml. Después de la inyección, se obtuvieron muestras de sangre de la órbita de ratas en varios puntos de tiempo (8 y 30 min y 1.5, 3, 6, 9, 12 y 24 h después de la inyección de péptidos) y Para estudiar la farmacocinética de AP2 y AP3 en ratas y proporcionar evidencia experimental de la posible farmacocinética en humanos, se estableció un método de sandwich de doble anticuerpo ELISA para la determinación rápida de AP2 y AP3 en plasma de ratas. Brevemente, las placas de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) fueron prerevestidas con anticuerpos frente a AP2 o AP3 (5 μ g/ml) purificadas a partir de antisera de conejo 59. Luego fueron preincubadas con muestras séricas diluidas 20 veces a 37 °C durante 1 h, seguidas por la adición de anticuerpos anti-AP2 o anti-AP3 (1:1000) purificados a partir de antisera de ratón específicamente frente a AP2 o AP3 59 a 37 °C durante otra 1 h. Luego, se agregaron IgG La absorción a 450 nm fue determinada por un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan), obteniendo primero los parámetros péptidos estándar, determinando las concentraciones de péptidos plasmáticos en función del tiempo, y calculando la semivida utilizando PK Solver para Microsoft Excel para obtener parámetros farmacocinéticos. Evaluación de la sensibilidad de los péptidos a la digestión proteolítica por proteinasa K y enzimas proteolíticas en homogeneato hepático. Los péptidos (10 μ g/ml) se prepararon en PBS pH 7,2 conteniendo 20 ng/ml de proteinasa K. La mezcla resultante fue incubada a 37 °C en un baño de agua y sacada en diferentes intervalos de tiempo (0, 5, 15, 30, 60, 120 minutos), seguida de saturación de las muestras con alcohol etílico y cuantificación de los péptidos Para probar la sensibilidad de los péptidos a las enzimas proteolíticas en el homogeneato hepático, se sacrificaron 3 ratas SD macho (250 ± 20 g) bajo anestesia; se extrajo rápidamente de cada rata todo el hígado, se lavó en PBS helado (50 mM, pH 7,2), se pesaron y cortaron en trozos pequeños, que fueron resuspendidos en PBS a 100 mg de tejido hepático húmedo/2,5 ml de PBS; las muestras fueron agrupadas y homogeneizadas, seguidas de centrifugación a 9.000 g durante 20 minutos a 4 °C; se recolectaron los sobrenadantes; se agregaron los péptidos de prueba al homogeneato hepático a una concentración final de 10 μ g/ml; la mezcla resultante fue incubada 37 °C en un baño de agua, y los péptidos de residuo

¿Qué tipo de modelo describe mejor los perfiles farmacocinéticos de AP3 y AP2?

Mejora de las propiedades farmacológicas y estructurales del inhibidor de la fusión del VIH AP3 sobre la enfuvirtida: ventajas destacadas de la estrategia artificial de Peptidehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC454141410/SHA: f2fcc16391f946c99717b63ec9a24e5384aac381Autores: Zhu, Xiaojie; Zhu, Yun; Ye, Sheng; Wang, Qian; Xu, Wei; Su, Shan; Sun, Zhiwu; Yu, Fei; Liu, Qi; Wang, Chao; Zhang, Tianhong; Zhang, Zhenqing; Zhang, Xiaoyan; Xu, Jianqing; Du, Lanying; Liu, Keliang; Lu; Zhang, Ro Sin embargo, su aplicación clínica es limitada debido a la corta semivida, resistencia al fármaco y reactividad cruzada con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH. Utilizando una estrategia de péptido artificial, diseñamos un péptido con secuencia de proteínas no nativas, AP3, que mostró una potente actividad antiviral contra un amplio espectro de cepas del VIH-1, incluyendo aquellas resistentes a T20, y tuvo una semivida in vivo notablemente mayor que T20. Mientras que los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH suprimieron significativamente la actividad antiviral de T20, estos anticuerpos no reconocieron AP3 ni atenuaron su actividad anti-VIH-1. Estructuralmente diferentes de T20, AP3 podrían doblarse en una hélice e interactuar con gp41 NHR. Los dos residuos, Met y Thr, en el N-terminal de AP3 forman una estructura similar a gancho para estabilizar Por lo tanto, AP3 tiene potencial de desarrollo como un nuevo inhibidor de la fusión del VIH con mejor eficacia antiviral, perfil de resistencia y propiedades farmacológicas sobre la enfuvirtida. Mientras tanto, este estudio destacó las ventajas de los péptidos diseñados artificialmente, y confirmó que esta estrategia podría utilizarse en el desarrollo de inhibidores de la fusión viral basados en péptidos artificiales contra el VIH y otros virus envueltos. Texto: Las secuencias de péptidos derivados de la NHR-gp41 o CHR. Los residuos correspondientes a la región de bolsillo de la NHR están marcados en rojo. Los residuos de la PBD están marcados en azul, y los residuos de ganglio MT adyacentes al término N de la PBD están marcados en verde. El péptido 5HRu consta de 5 copias de plantilla de secuencia artificial (AEELAKK) subrayado. Los residuos mutantes en la P b) La actividad inhibitoria de AP1, AP2, AP3 y T20 sobre la infección por VIH-1 IIIB (subtipo B, X4) en células MT-2 (panel izquierdo) por HIV-1 Bal (subtipo B, R5) en células M7 (panel derecho); cada muestra se probó por triplicado y el experimento se repitió dos veces; los datos se presentan como medios ± SD. RepoRts científicos 5:13028 DOi: 10.1038/srep13028Para hacer frente a estos obstáculos, se han hecho muchos esfuerzos para optimizar los péptidos derivados de T20 y gp41 CHR. Algunos de estos péptidos tienen mejores actividades inhibitorias contra cepas resistentes a T20 y/o una semivida más larga que T20. Sin embargo, todavía tienen el problema de reaccionar de forma cruzada con los anticuerpos preexistentes en la su Basándonos en la plantilla de péptido artificial universal de 5HRu, hemos diseñado previamente los péptidos artificiales de AP1 (PBD-m4HR) y AP2 (PBDtrp-m4HR), y hemos realizado investigaciones preliminares sobre su actividad inhibitoria contra la fusión de células mediadas por Env VIH-1 16. En el presente estudio, hemos diseñado un nuevo péptido artificial, AP3 (Fig. 1a), con el objetivo de aplicar la estructura "M-T gancho" para estabilizar la interacción del péptido artificial con el bolsillo hidrofóbico en el recortador NHR gp41 17, 18. Después de estudiar exhaustivamente su actividad antiviral, propiedad bioquímica, estructura cristalina, mecanismo funcional, semivida in vivo y, por primera vez, el efecto de anticuerpos preexistentes en el sera de pacientes infectados por VIH, encontramos que el péptido artificial de nuevo diseño, AP3, mostró una mejor actividad antiviral, perfil de resistencia a fármacos y propiedades farmacológicas sobre T20. En particular, los anticuerpos preexistentes en el sera de pacientes infectados por VIH no suprimieron, sino que mejoraron la actividad anti-VIH-1 de AP3. Estos resultados sugieren que el AP3 tiene potencial de desarrollo como un nuevo fármaco anti-VIH y confirman que esta estrategia se puede utilizar para diseñar péptidos antivirales artificiales contra otros virus envueltos, como el SARS-CoV 19, el MERS-CoV 20 y el paramixovirus 21. Nuestros péptidos artificiales AP1 y AP2 previamente diseñados podrían inhibir la fusión de la membrana celular mediada por el VIH-1 16. Él y sus colegas reportaron que la adición de dos aminoácidos de Met y Thr al N-terminal de un CHR-péptido podría mejorar su actividad anti-VIH-1 17, 18. Aquí diseñamos un nuevo péptido artificial, AP3, añadiendo Met y Thr al N-terminal de AP2 (Fig. 1a). Luego comparamos AP3 con AP1, AP2 y T20 para su actividad anti-VIH-1 contra cepas divergentes del VIH-1, incluyendo los virus adaptados al laboratorio, IIIB (subtipo B, X4) y Bal (subtipo B, R5), y una serie de aislamientos primarios del VIH-1, así como las cepas resistentes al T20. 1b, AP3 mostró mayores actividades inhibitorias sobre la infección por cepas HIV-1 IIIB y HIV-1 Bal (IC 50 : 3,06 y 15,09 nM, respectivamente) que AP1 (IC 50 : 86,25 y 396,14 nM, respectivamente), AP2 (IC 50 : 23,05 y 49,95 nM, respectivamente) y T20 (IC 50 : 13,63 y 30,21 nM, respectivamente). La actividad inhibitoria de AP3 sobre la infección por cepas primarias divergentes de VIH-1 con distintos genotipos (subtipos A -E y grupo O) y fenotipos (R5 y X4) también fue superior a la de AP2 y T20 (Tabla 1). Si bien la T20 no fue eficaz frente a cepas de VIH-1 resistentes a T20 a una concentración de hasta 2.000 nM, la AP3 podría efectivamente inhibir la infección de estas cepas con IC 50 en el rango de 13 ~ 90 nM, que era aproximadamente 2 a 4 veces más eficaz que la AP2 (Tabla 1 ). Estos resultados indican que el péptido artificial AP3 ha mejorado notablemente la actividad anti-VIH-1 contra un amplio espectro de cepas de VIH-1, incluyendo variantes resistentes a T20, sobre T20 y los péptidos artificiales AP1 y AP2. Los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1 no reconocieron la AP3 ni atenuaron su actividad anti-VIH-1. Los estudios anteriores han demostrado que los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH-1, incluidos los que reaccionan de forma cruzada con T20 y los específicos para los sitios de unión de T20 en gp120 (por ejemplo, las regiones del bucle C1 y V3) y gp41 (por ejemplo, el dominio NHR), podrían bloquear significativamente la actividad inhibitoria de fusión de T20 14, 15. Aquí investigamos la influencia de anticuerpos preexistentes contra el péptido AP3. Como se muestra en la figura 2a, tanto T20 como C46 reaccionaron con los anticuerpos en sueros de cinco pacientes infectados por el VIH-1; sin embargo, ninguno de los tres péptidos artificiales AP1, AP2 y AP3 fue reconocido por los anticuerpos preexistentes.La actividad inhibitoria de T20 sobre la infección por el VIH-1 IIIB se redujo aproximadamente 1,9 veces a > 3,6 veces en presencia de 2b y Tabla Suplementaria S1), confirmando que los anticuerpos preexistentes en sera de pacientes con VIH/SIDA pueden atenuar la actividad anti-VIH-1 de T20 14, 15. Sin embargo, ninguno de los péptidos artificiales en el presente estudio mostró disminución significativa de la actividad anti-VIH-1 en presencia de sera de pacientes. En cambio, la actividad antiviral de AP3 aumentó en presencia de antisera de pacientes infectados con VIH-1 (fig. 2b y Tabla Suplementaria S1), sugiriendo que los anticuerpos anti-VIH-1 realmente mejoraron la actividad anti-VIH-1 de AP3, posiblemente porque la unión de los anticuerpos a algunos sitios en gp120 o gp41 promueve la interacción de AP3 con la región viral de gp41 NHR. AP3 tuvo una semivida mayor que T20. Aunque la T20 ha demostrado eficacia en la inhibición de la infección por el VIH-1, su principal debilidad radica en su corta semivida en plasma (aproximadamente 2 h) [22] [23]. Como resultado, la T20 debe administrarse por vía subcutánea dos veces al día a 90 mg por dosis, causando a menudo reacciones graves en el lugar de inyección 25, 26. Aquí, se realizaron estudios farmacocinéticos por administración intravenosa de AP3, AP2 y T20, respectivamente, a rata SD a una dosis de 1 mg/kg, para comparar su tiempo de circulación in vivo. Como era de esperar, la T20 mostró una semivida más corta y un AUC menor (0-t) por circulación sistémica, mientras que la AP3 y la AP2 demostraron una concentración mucho mayor y un tiempo de circulación más largo (Tabla 2 ). Los perfiles farmacocinéticos de AP3 y AP2 se ajustaron a un modelo de no-compartimento. La semivida de eliminación in vivo de AP3 (t 1/2 = 6,02 h) fue aproximadamente 2,8 veces mayor que la de T20 (t 1/2 = 1,57 h). Este resultado proporcionó la base teórica para reducir la frecuencia de inyección y la dosis del inhibidor de la fusión, en conjugación con la potencia antiviral mejorada de AP3. Por lo tanto, la sustitución de T20 por AP3 puede reducir significativamente las reacciones en el lugar de inyección y el costo del fármaco, lo que promovería las aplicaciones clínicas del inhibidor de la fusión del VIH en regiones o países pobres en recursos. AP3 fue mucho más resistente que T20 a la degradación proteolítica por proteinasa K y homogenato hepático de rata. Comparamos la estabilidad de T20 y AP3 en presencia de proteinasa K (una proteína de serina de amplio espectro) y homogenato hepático de rata. Después del tratamiento con 20 ng/ml de proteinasa K durante 2 h a 37 °C, sólo quedó el 29% del péptido parental T20, detectado por el análisis LC-MS. Bajo la misma condición, AP3 retuvo el 100% de su prototipo (Fig. 3a ). Además, AP3 mostró una estabilidad metabólica significativamente aumentada sobre T20 in vitro en presencia de homogenato hepático (Fig. 3b). Estos resultados indican que el péptido artificial AP3 es mucho más resistente a la degradación proteolítica que el péptido natural T20, lo que puede contribuir a su significativa vida media in vivo más larga que T20 como se describe anteriormente. AP3 formó un complejo estable α-helical y la formación de bloque gp41 6-HB. Para investigar el mecanismo antiviral de AP3, se comparó la estabilidad térmica del complejo AP3/N36 con la de AP1/N36, AP2/N36, T20/N36 y C34/N36 complejos por espectroscopia circular-dicroísmo (CD) 27. Debido a que T20 carece del dominio de encuadernación de bolsillo (PBD), el complejo T20/N36 no mostró una conformación α-helical típica, en consistencia con nuestros estudios anteriores 8, 9. Similar a la α-helicidad del complejo C34/N36 3, los complejos AP1/N36, AP2/N36 y AP3/N36 formaron un pico negativo en forma de sillín a 208 nm y 222 nm, indicando sus estructuras α-helical (fig. 4a) Fig. 4b), indicando que el complejo helicoidal α formado por AP3 y N36 es el más estable entre los cuatro complejos. Luego comparamos la actividad inhibitoria de AP3 con la de AP1 y AP2 en la formación de 6-HB entre C34 y N36. Como T20 no puede bloquear la formación de 6-HB 8, 9, utilizamos un inhibidor de fusión de pequeña molécula VIH-1, ADS-J1 28, 29, para reemplazar a T20 como un control de inhibición de 6-HB. Como se esperaba, ADS-J1 podría efectivamente inhibir la formación de 6-HB con IC 50 de 2,75 μ M 8, 9, [27] [28]. AP3 fue altamente eficaz contra la formación de 6-HB de forma dosis-dependiente con un valor IC 50 de 0,24 μ M, aproximadamente 30 y 15 veces más potente 4c), confirmando que AP3 puede bloquear potentemente la formación del núcleo de fusión gp41 6-HB, inhibiendo así la fusión del VIH-1 con la membrana celular diana. Base estructural para la potente actividad inhibitoria de fusión del péptido artificial AP3. Para dilucidar los determinantes moleculares de estos péptidos artificiales, resolvimos con éxito las tres estructuras complejas de péptidos AP1/AP2/AP3 que se unen con gp41 NHR. Para AP1 y AP2, un enlace optimizado Cada muestra fue probada por triplicado y el experimento se repitió dos veces. Los datos se presentan como medios ± SD. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. "SGGRGGG" se utilizó para ensamblar el NHR y el péptido artificial en una única proteína recombinante (N Sin embargo, una estrategia similar falló en la cristalización de AP3; por lo tanto, decidimos cocristalizar el péptido sintético N45 y péptido AP3, y finalmente se obtuvieron los cristales complejos. Curiosamente, los cristales de tres inhibidores diferentes pertenecen a tres grupos espaciales distintivos: P2 1 para N36-L6-AP1, R32 para N36-L6-AP2, y P6 3 para N45/AP3. Como era de esperar, las porciones de NHR en tres estructuras forman un núcleo trimérico, mientras que la porción AP1, AP2 o AP3 se pliega en una conformación de una hélice única y se une a NHR-trimer para formar un típico 6-HB, similar a la de la estructura central de HIV-1 gp41 formada por el péptido CHR nativo C34 y N36 (Fig. 5a). Además, los residuos hidrofóbicos conservados, como el W43, el W46 y el I50, en los péptidos artificiales fueron profundamente enterrados en la Tabla 2. Parámetros farmacocinéticos de AP2, AP3 y T20 tras la administración intravenosa a 1 mg/kg en ratas SD macho (n = 2). Figura 3. Sensibilidad de AP3 y T20 a la degradación proteolítica por proteinasa K y homogeneato hepático de rata. a) Después de la digestión por proteinasa K a pH 7,2 y b) homogeneato hepático de rata, la cantidad residual de AP3 y T20 fue detectada mediante análisis LC-MS. El experimento se realizó en triplicado y los datos se presentan como medios ± SD. La inhibición de AP1, AP2, AP3, T20 y ADS-J1 frente a la formación de 6-HB entre N36 y C34 fue detectada por ELISA utilizando el mAb NC-1 específico de 6-HB. Cada muestra se probó por triplicado, y los datos se presentan como media ± DE. surcos formados entre cada par de hélices NHR, similares a los residuos correspondientes de W628, W631 y I635 en la gp41 CHR nativa (Fig. 5b). Los péptidos AP mostraron mejor afinidad contra la Gp41 CHR natural. En C34, que contiene la secuencia CHR natural de W628 a L661, no se encontró interacción fuerte entre I642 y Q565 en el complejo de GP41 NHR-CHR viral (Fig. 5c). Sin embargo, en la secuencia correspondiente (de W43 a K76) de AP1 y AP2, se estableció un enlace de hidrógeno entre S57 (correspondiente a I642 en CHR) y Q18 (correspondiente a Q565 en NHR) en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3. Así, S57 en AP1/AP2/AP3 desempeña un papel en la estabilización de las interacciones entre el inhibidor péptido artificial y su objetivo NHR, resultando en su afinidad de unión más fuerte. Además, en NHR-CHR, L567 y L568 en dos NHR adyacentes forman una ranura hidrofóbica, en la que T639 está enterrado (Fig. Suplemental S1a ). Sin embargo, en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3, I54 (correspondiente a T639 en CHR) puede unirse fuertemente a L20 y L21 a través de interacciones de cadenas laterales totalmente hidrofóbicas. Del mismo modo, la interacción de I64 (correspondiente a S659 en CHR) con L10 y L11 (correspondiente a L567 y L568 en NHR, respectivamente) en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3 se ha mejorado significativamente (Suplementary Fig. S1b ). Al igual que la hélice gp41 CHR, las hélices de AP1, AP2 y AP3 también tienen dos lados diferentes, un lado hidrofóbico orientado hacia la NHR y un lado hidrofílico orientado hacia Se espera que la mejora de la hidrofilia del lado expuesto de los inhibidores pueda aumentar su actividad antiviral y solubilidad. Para lograr este objetivo, los residuos de aminoácidos con hidrofobia, o baja hidrofilia, como N637, S640, L641 y S644 en CHR, fueron cambiados a los residuos de aminoácidos con alta hidrofilia, como E52, K55, K56 y E59 en AP1, AP2 y AP3, respectivamente. Además, el residuo hidrofóbico M629 en CHR fue reemplazado por un residuo hidrofílico E44 en AP2 y AP3 (Figura suplementaria S2 ). Estos residuos hidrofílicos, como ácido glutámico y lisina, pueden aumentar la solubilidad de péptido entero y, por lo tanto, estabilizar el complejo formado por el inhibidor y su objetivo. Se ha demostrado que el puente de sal doble EE-KK puede estabilizar la conformación de la hélice 30. Hemos identificado este tipo de interacción entre i e i + 3 o i + 4 posiciones en las tres estructuras complejas. En N36-L6-AP1, R48 interactúa con E45 y E52 para formar una red de puente de sal. En N36-L6-AP2, E45 interactúa con K48, y E52 se une a K56, mientras que en N45/AP3, K69 se une a E66 ( Suplementary Fig. S2 ). Estos fuertes puentes de sal formados por los residuos cargados opuestamente estabilizan la conformación de péptidos AP, llevando su efecto inhibidor en pleno juego. Como se informó anteriormente, la adición del "gancho M-T" a los péptidos CHR C34 y sifuvertida podría mejorar dramáticamente la actividad Como era de esperar, el N-terminal Met y Thr de AP3 forma una estructura similar a un gancho (Fig. 5d). La cadena lateral de la metionina hidrofóbica de M41 acomoda la ranura entre hélices AP3 y NHR, tapando el bolsillo hidrofóbico. Esta interacción conduce a una serie de cambios conformacionales. La cadena principal de AP3 en W43 se mueve 1,91 Å más cerca de NHR en comparación con AP2 (Suplemental Fig. S3 ). La cadena lateral de W43 en AP3 gira alrededor de 90 grados y está enterrada más profundamente que la de AP2. La cadena lateral de E44 vuelve a interactuar a D47, pero la cadena lateral de E45 retrocede desde K48 e interactúa con T42. Por lo tanto, esta estructura de gancho M-T podría estabilizar aún más la unión entre AP3 y NHR La Enfuvirtida, también conocida como T20, fue aprobada por la FDA como el primer medicamento antiviral basado en el inhibidor de la entrada del VIH para su uso con otros medicamentos anti-VIH para tratar adultos y niños infectados por el VIH-1 a los 6-16 años 23,31,32 (http://www.fuzeon.com). Aunque la T20 es un medicamento anti-VIH indispensable para los pacientes con VIH/SIDA que no han respondido a la terapia antirretroviral actual, sus deficiencias han limitado su aplicación clínica. La T20 tiene una actividad anti-VIH menor y una semivida más corta que otros péptidos de la CHR que contienen PBD, como C34 y C38 8, 9, 33. Además, las variantes resistentes al VIH-1 T20 surgieron en breve (por ejemplo, 14 días) después de su uso en pacientes 34. La mayoría de los virus resistentes a T20 presentaban mutaciones en el motivo GIV (residuos 36-45: GIVQQNNLL) en el dominio Gp41 NHR 10, [34] [35] [36] [37] [38]. La falta de PBD contribuye a las principales debilidades de T20 descritas anteriormente. Dado que el bolsillo hidrofóbico conservado en el trimer de NHR gp41 desempeña un papel crítico en la estabilización de la interacción entre el NHR gp41 y CHR y la formación del núcleo fusogénico de 6-HB 1, 39, 40, el péptido CHR que contiene PBD, como C34, puede unirse al trimer de gp41 viral más fuerte y estable, poseyendo así una actividad anti-VIH más potente que T20, un péptido CHR sin PBD 8, 9. En ausencia de PBD, T20 interactúa principalmente con la región media del dominio NHR que contiene el motivo GIV. Por lo tanto, un virus con mutaciones en este motivo es generalmente resistente a T20 10, [34] [35] [36] [37] [38]. En comparación con otros fármacos anti-VIH, otra debilidad de T20 es su reactividad cruzada con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1. Además de gp41, T20 también podría unirse a algunas regiones en gp120. Los anticuerpos preexistentes específicos para los sitios de unión del T20 en gp120 y gp41 pueden suprimir indirectamente la actividad anti-VIH de T20 14, 15. La adición de PBD al N-terminal de T20, como T-1249, podría mejorar significativamente la potencia anti-VIH-1, la semivida y el perfil de resistencia a fármacos 33, [41] [42] [43]. La adición de la estructura de gancho M-T al N-terminal de un PBD-CHR-péptidos que contienen PBD, como MT-C34 o MT-SFT, podría aumentar aún más la actividad anti-VIH-1 de los correspondientes CHR-péptidos 17, 18. La supresión del dominio GIV-motif-vinculante de un CHR-péptido, como CP621-652 y CP32M, es otro enfoque eficaz para aumentar la barrera genética a la resistencia a drogas 44, 45. Sin embargo, ninguno de los enfoques anteriores es eficaz para prevenir la reacción cruzada de T20 con los anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes con VIH/SIDA, ya que los péptidos previamente modificados contienen principalmente las secuencias nativas del dominio HIV-1 gp41 CHR. Nuestros estudios anteriores han demostrado que AP1 y AP2, péptidos artificiales con secuencias de proteínas no nativas, podrían formar estructura de bobina en espiral para interactuar con gp41 NHR e inhibir la fusión celular mediada por VIH-1 Env 16. En el presente estudio, diseñamos un nuevo péptido artificial, AP3, añadiendo la estructura de gancho M-T al N-terminal de AP2 (Fig. 1a), seguido de investigar la influencia de anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes infectados por VIH en AP3, utilizando AP1, AP2 y T20 como controles. Se demostró que los sueros de los pacientes infectados por el VIH podían unirse a la T20 y reducir significativamente su potencia frente al VIH-1. Sin embargo, estas mismas muestras séricas no interactuaban con los tres péptidos artificiales y apenas afectaban su actividad antiviral. Sorprendentemente, los anticuerpos en el sera incluso podrían mejorar la actividad anti-VIH-1 de AP3 (Fig. 2a,b y Tabla Suplementaria S1). Estos resultados confirmaron, por primera vez, que la sustitución de la secuencia viral nativa en la T20 por una secuencia artificial es un enfoque eficaz para superar una deficiencia clave de la T20, por lo que su actividad anti-VIH podría ser atenuada por anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes con VIH/SIDA. Vale la pena explorar por qué los anticuerpos en la sera son capaces de mejorar la actividad anti-VIH-1 de la AP3. Nuestro estudio reciente ha demostrado que la actividad anti-VIH-1 de T20 se ve aumentada por un anticuerpo no neutralizante dirigido contra el dominio NHR del VIH-1 gp41 46. Por lo tanto, hipotetizamos que algunos de los anticuerpos anti-gp41 en pacientes con VIH/SIDA pueden unirse a un sitio en el dominio NHR adyacente a la región de unión de AP3, lo que resulta en una mayor interacción entre AP3 y NHR-trimer y una mayor actividad antiviral de AP3. Luego comparamos la actividad inhibitoria de AP3 con el gancho M-T y T20/AP2 sin gancho M-T sobre la infección por cepas divergentes del VIH-1. AP3 fue más eficaz que AP2 o T20 en inhibir la infección por cepas adaptadas al laboratorio y los aislamientos primarios del VIH-1, incluyendo los resistentes al T20 (fig. 1b, Tabla Se puede cuestionar si AP3 también puede inducir virus farmacorresistentes en pacientes si se usa en clínicas para tratar pacientes infectados por VIH. Creemos que AP3 tiene una barrera genética mucho mayor a la resistencia que T20 porque AP3 contiene PBD, mientras que T20 carece de PBD. Dwyer et al. 33 utilizaron T2544, un péptido CHR que contiene PBD, para llevar a cabo un experimento de paso, utilizando T20 como control. Demostraron que T20 podría inducir un virus mutante con alta resistencia (81 veces) a T20 en aproximadamente 1 mes, mientras que T2544 no indujo una cepa resistente en más de 2 meses en cultivo. Después de extender el experimento de paso por casi 8 meses, identificaron una cepa con una resistencia débil (8,3 veces) a T-2544, y los sitios de mutación relacionados no estaban en la región de bolsillo gp41, lo que sugiere que los péptidos CHR que contienen PBD, incluyendo AP3, pueden tener dificultad para inducir resistencia al fármaco. AP3 también tuvo una vida media más larga que T20 (Tabla 2), posiblemente porque el péptido artificial AP3 es menos sensible a las enzimas proteolíticas que T20 con la secuencia de proteínas virales nativas. Se espera que la eliminación de los sitios de escisión de enzimas proteolíticas en el péptido AP3 amplíe aún más su vida media. Estos resultados confirmaron que la sustitución de la secuencia de proteínas nativas por secuencia artificial y la adición del gancho M-T al péptido que contiene PBD es una estrategia sólida para diseñar Dado que las estructuras tridimensionales de los péptidos AP no habían sido investigadas antes del presente estudio, la optimización de estos inhibidores de los péptidos artificiales no pudo ser realizada racionalmente. Nuestros estudios estructurales de los péptidos artificiales AP1/AP2/AP3 en complejo con NHR mostraron que los péptidos AP, al igual que el péptido CHR C34, podrían unirse a gp41 NHR para formar una estructura canónica 6-HB (Fig. 5a). Es bien sabido que existe un bolsillo hidrofóbico profundo en cada ranura en la superficie del trimer viral gp41 NHR. Los residuos hidrofóbicos I635, W631 y W628 en la unión gp41 CHR con los residuos hidrofóbicos en la pared de este bolsillo, resultando en la formación de 6-HB estable por la fuerte interacción entre CHR Esta importante característica ha sido bien preservada en las estructuras AP1/AP2/AP3 6-HB (Fig. 5b), que pueden explicar las potentes actividades inhibitorias de la fusión VIH-1 de estos péptidos artificiales. Un nuevo enlace de hidrógeno, que se estableció entre S57 y Q18 en los complejos AP1/AP2/AP3, no existe en el complejo viral gp41 CHR-NHR, sugiriendo que S57 puede jugar un papel importante en la estabilización de las interacciones entre el péptido y NHR, dando lugar a afinidades de unión de AP1/AP2/AP3 que son más fuertes que las de HIV-1 gp41 CHR a NHR. Además, el puente de sal doble EE-KK formado entre las posiciones i e i + 4 en las estructuras AP1/AP2/AP3 podría estabilizar la conformación de la hélice y aumentar el efecto inhibitorio de estos pé En comparación con AP1, las mutaciones en el sitio triple se introdujeron en AP2 y AP3, es decir, M44E, R48K y E49K. Estas sustituciones no sólo aumentan la solubilidad del péptido, sino que también desencadenan una serie de reordenamientos de ciertos puentes de sal intrahelical para mejorar la estabilidad de la estructura de la hélice de la CHR y la actividad inhibidora de la fusión del VIH-1. Anteriormente se demostró que el gancho M-T era un paso efectivo hacia el aumento de la interacción estable entre un péptido de la CHR y el bolsillo del HIV-1 gp41 17, 18. Por lo tanto, AP2 se optimizó aún más mediante la incorporación de Met y Thr en su terminal N. Los resultados de espectroscopia de CD y desnaturalización térmica indican que la incorporación de gancho M-T contribuye a la formación de una Además, el puente salino doble EE-KK formado entre i e i + 4 posiciones en la estructura N36-L6-AP3 contribuyó a aumentar la estabilidad de la hélice CHR y 6-HB, lo que resultó en una mejor potencia de AP3, como se ha observado en estudios de CHR-péptidos con mutaciones dobles EE-KK 30, 33, 47, 48. Además, la actividad de fusión del VIH-1 y la semivida de AP2 pueden haber sido reforzadas y ampliadas, respectivamente, mediante la adición de gancho M-T en el diseño de AP3. En conclusión, AP3, un péptido artificial con estructuras de gancho PBD y M-T, mostró una mejor actividad anti-VIH-1 y perfil de resistencia a fármacos, así como una vida media prolongada. Además, no reaccionó con los anticuerpos preexistentes en la sura de pacientes con VIH/SIDA. Consecuentemente, su actividad antiviral RepoRts Científicos 5:13028 DOi: 10.1038/srep13028 no fue significativamente afectada por estos anticuerpos. Por lo tanto, AP3 muestra la promesa como un candidato para el desarrollo ulterior como un nuevo inhibidor de la fusión del VIH para uso clínico. Este estudio también proporciona información importante de estructura e actividad para el diseño racional de nuevos inhibidores de péptidos artificialmente. Además, nuestros resultados destacaron las ventajas de los péptidos diseñados artificialmente y confirmaron que esta estrategia podría ser ampliamente utilizada en el desarrollo de inhibidores de la fusión de virus basados en péptidos artificiales contra el VIH-1 y otros virus envueltos con proteínas de fusión de membrana de clase I, tales como SARS-CoV 19, MERS-CoV 20, y paramixovirus 49. Este estudio no implicó experimentación humana; los únicos materiales humanos utilizados fueron muestras séricas obtenidas de individuos infectados por el VIH-1 con la aprobación del Comité de Ética del Centro Clínico de Salud Pública de Shanghai, Universidad de Fudan (Protocolo No. SPHCC-125-2). Los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas. Todas estas muestras de sueros procedían de adultos; ningún menor estuvo involucrado en este estudio. Se obtuvo el consentimiento informado escrito para el uso de los especímenes clínicos de todos los pacientes involucrados en este estudio. Síntesis de Peptide. Un panel de péptidos (Fig. 1a), incluyendo T20, C34, C46, AP1, AP2, AP3, así como N-péptidos derivados de NHR, N36 y N45, fueron sintetizados con un método FMOC de fase sólida estándar, como se describió anteriormente 8, 50. Todos los péptidos fueron acetilados en el término N y mediados en el término C. Los péptidos fueron encontrados alrededor del 95% puros por el CLAR y fueron identificados por espectrometría de masas (Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA). Las concentraciones de los péptidos fueron determinadas por la absorbancia UV y un coeficiente de extinción molar calculado teóricamente basado en residuos de triptófano y tirosina. Ensayo de calificación. Los análisis cromatográficos se realizaron utilizando una columna SAO-C8 (5 μ m, 100 mm × 2,0 mm ID) mantenida a temperatura ambiente. La fase móvil se compuso de ácido acetonitrilo-agua-fórmico en la proporción de 50:50:0.1 (v/v/v) a un caudal de 0,3 mL/min. El volumen de inyección de la muestra fue de 10 μ L. El acetonitrilo fue de grado HPLC, y otros reactivos químicos y disolventes fueron de grado analítico. Para el análisis de LC-MS se utilizó un espectrómetro de masa tándem tricuadruple MAX de Thermo TSQ Quantum Discovery MAX equipado con fuente ESI (San José, CA) y una bomba LC Surveyor. Para la adquisición y procesamiento de datos se utilizó el software Xcalibur y el programa de análisis de datos LCQuan 2.0 (Thermo Finnigan), respectivamente. Los parámetros de MS optimizados fueron los siguientes: tensión de pulverización de 4800 V, presión de gas de vaina de 40,0 psi, flujo de válvula auxiliar de 1,0 psi y 300 °C de temperatura capilar. Al ejecutar la disociación inducida por colisión (CID), la El modo de monitoreo de reacción seleccionado (SRM) se utilizó para AP3 mientras que el modo de monitoreo de iones seleccionado (SIM) se preformó para T20. Se registraron las siguientes transiciones: m/z 670.5 para AP3, m/z 1498.6 para T20. Las masas de péptidos sintéticos T20, AP1, AP2 y AP3 fueron determinadas por MALDI-TOF-MS (Fig. Suplementario S4 y S5 ). Expresión y purificación de proteínas de fusión N36-L6-AP1 y N36-L6-AP2. Utilizando PCR superpuesta, el fragmento de ADN que codificaba AP1 o AP2 péptido fue unido al fin 3′ del cDNA de gp41 NHR ("N36", 546-581), con un enlace corto ("L6", SGGRGG) entre ellos. Luego, toda la secuencia se subclonó en el vector pET-28a (Novagen, EE.UU.) con una etiqueta SUMO artificial entre la etiqueta HIS de N-terminal y la proteína diana. Las células E. coli de pET-28a-SUMO-N36-L6-AP1-o pET-28a-SUMO-N36-L6-AP2-transformadas fueron inducidas añadiendo 1 mM IPTG e incubando durante la noche a 16 °C. La proteína de fusión fue purificada por resina de afinidad Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), y la etiqueta His-SUMO fue cortada por el tratamiento enzimático Ulp1 a 4 °C durante 2 h. El recortador purificado N36-L6-AP1 o N36-L6-AP2 fue aplicado a una columna de filtración de gel Superdex-75 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.). Las fracciones que contenían N36-L6-AP1 o N36-L6-AP2 fueron recolectadas y concentradas en diferentes concentraciones por ultrafiltración. Cristalización, recolección de datos y determinación de la estructura. La proteína de fusión N36-L6-AP1 fue cristalizada a 16 °C utilizando el método de gota colgante, difusión de vapor. Las gotas se colocaron en un clip de cubierta siliconizada equilibrando una mezcla que contenía una solución proteica de 1 μ l (25 mg/ml N36-L6-AP1 recortador en 20 mM Tris-HCl pH 8,0 y 150 mM NaCl) y una solución de depósito de 1 μ l (0,1 M Tris-HCl pH 8,5, 32% (p/v) PEG3350 y 0,2 MgCl 2 ) frente a una solución de depósito de 400 μ l. Después de una semana, se formaron cristales únicos y se congelaron por chispa con nitrógeno líquido para la recogida de datos en el futuro. La proteína de fusión N36-L6-AP2 se cristalizó de manera similar con una solución de depósito diferente (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 34% (p/v) PEG3350 y 0,2 MgCl 2 Para obtener el cristal complejo de AP3 y NHR, el AP3 sintetizado se mezcló primero con el péptido N45 a razón de 1:1 molar y luego se aplicó a una columna de filtración de gel Superdex-75 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) para aislar el recortador formado de 6-HB. Se recogieron fracciones que contenían N45/AP3 y se concentraron hasta 30 mg/ml, luego se cristalizaron a 16 °C utilizando la gota colgante, método de difusión de vapor.Las gotas se colocaron en un clip de cubierta siliconizado equilibrando una mezcla que contenía una solución proteica de 1 μ l (20 mM Tris-HCl pH 8.0 y 150 mM NaCl) y una solución de depósito de 1 μ l (0,2 M de sulfato de amonio, 0,1 M Los conjuntos de datos de N36-L6-AP1 se recogieron a 100 K en la línea 19-ID de la fuente avanzada de fotones (Argonne National Laboratory, EE.UU.). Los conjuntos de datos de N36-L6-AP2 se recogieron en una fuente de rayos X interna (MicroMax 007 generador de rayos X, Rigaku, Japón) en el Instituto de Biofísica de la Academia China de Ciencias. Los conjuntos de datos de los cristales complejos AP3/N45 se recolectaron en la línea BL-19U1 de la instalación de radiación sincrotrón de Shanghai, China. Los datos de difracción de rayos X se integraron y escalaron utilizando el programa HKL2000 51. El problema paulatino de las tres estructuras fue resuelto mediante el método de reemplazo molecular utilizando PHENIX.faser 52 con una estructura cristalina de HIV gp41 NHR-CHR (entrada PDB: 1SZT) como modelo de búsqueda. Los modelos finales fueron ajustados manualmente en COOT 53 y refinados con PHENIX.refine 54. Todas las coordenadas fueron depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (N36-L6-AP1: 5CMU; N36-L6-AP2: 5CN0; y N45/AP3: 5CMZ). Las estadísticas de recolección de datos y refinamiento de la estructura se dan en la Tabla Suplementaria S2. Determinación de la reactividad cruzada de los péptidos nativos y artificiales con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1 por el sandwich ELISA. Se realizó un T20, C46, AP1, AP2 y AP3 fueron recubiertos en los pocillos de placas de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) a 10 μ g/ml. Los pocillos fueron bloqueados con gelatina al 1%, seguidos de la adición de 50 μ l de sueros diluidos serialmente de pacientes infectados por VIH-1 e incubación a 37 °C durante 1 h. Luego, se agregaron secuencialmente HRP-IgG antihumano (Abcam, UK) y TMB. Se determinó A450 con un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan). pacientes. Inhibición de péptidos en VIH-1 IIIB (subtipo B, X4)infección en presencia de sera de pacientes infectados por VIH-1 se determinó como se describe anteriormente 55. Brevemente, cada péptido fue mezclado con suero serialmente diluido de un paciente infectado por VIH-1 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, la mezcla de péptido/suero y VIH-1 (100 TCID 50 ) fue añadida a las células MT-2 (1 × 10 5 /ml) en medio RPMI 1640 conteniendo 10% FBS. Después de la incubación a 37 °C durante la noche, los sobrenadantes del cultivo fueron reemplazados por medio de cultivo fresco. Al cuarto día después de la infección, los sobrenadantes del cultivo fueron recolectados para la detección del antígeno p24 por ELISA. Brevemente, cada mezcla de péptido o péptido fue disuelta en solución salina fosfatada (PBS: 50 mM de fosfato sódico y 150 mM de NaCl, pH 7,2) a la concentración final de 10 μ M e incubada a 37 °C durante 30 minutos antes de enfriarse hasta 4 °C. Los espectros CD de cada muestra fueron adquiridos en un espectropolarímetro Jasco (Modelo J-815, Jasco Inc., Japón) a 4 °C utilizando un ancho de banda de 5 nm, resolución de 0,1 nm, longitud de trayectoria de 0,1 cm y un tiempo medio de 5,0 seg. Los espectros fueron corregidos por la sustracción de un blanco correspondiente a la composición solvente de cada muestra. Se utilizó el análisis térmico de punto medio para determinar la temperatura a la que el 50% de los 6-HB formados Se monitorizó a 222 nm de 4 °C a 98 °C aplicando un gradiente térmico de 5 °C/min. Se alisó la curva de fusión, y se calculó el punto medio de los valores de transición de despliegue térmico (Tm) utilizando las utilidades de software de Jasco descritas anteriormente. Inhibición de la formación de haz de seis hélices de gp41 mediante sandwich ELISA. Se determinó la inhibición de la formación de haz de seis hélices de gp41 mediante un péptido de prueba con un sandwich ELISA descrito previamente 57. Brevemente, se preincubaron un péptido de prueba (ADS-J1 como control) a concentraciones graduadas con péptido N36 (1 μ M) a 37 °C durante 30 min, seguido de la adición de péptido C34 (1 La mezcla se añadió a una placa de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) prerevestida con anticuerpos anti-N36/C34 (2 μ g/ml) purificados de antisera de ratón específicamente contra el haz de seis hélices de gp41 58. Luego, se añadieron en orden mAb NC-1, IgG anti-ratón marcado con HRP y TMB. A450 fue determinado por un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan). Las actividades de inhibición de AP1, AP2 y AP3 sobre la infección por VIH-1 fueron determinadas como se describió previamente 57. Para la inhibición de la infección por VIH-1 IIIB (subtipo B, X4), se añadió 100 TCID 50 del virus a 1 × 10 5 /ml de células MT-2 en el medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS en presencia o ausencia del péptido de prueba durante la noche. Luego, los sobrenadantes del cultivo se cambiaron a medios frescos. En el cuarto día después de la infección, los sobrenadantes del cultivo fueron recogidos para la detección del antígeno p24 por ELISA. Para la inhibición de la infección por la cepa VIH-1 Bal (subtipo B, R5), las células M7 (1 × 10 5 /ml) fueron precultivadas durante la noche e infectadas con Bal a 100 TCID 50 en presencia o ausencia del péptido de prueba o proteína durante la noche. Luego, los sobrenadantes del cultivo fueron cambiados a medios frescos. Los sobrenadantes fueron recolectados en el séptimo día post-infección y probados para el antígeno p24 por ELISA como se describió previamente 55. El porcentaje de inhibición de la producción de p24 fue calculado. Análisis de la semivida de los inhibidores de los péptidos. Cuatro ratas SD macho de aproximadamente 200 g cada una fueron obtenidas del Centro de Animales de la Escuela Médica de Shanghai y fueron usadas para el ensayo de semivida. Los animales fueron tratados de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal y la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" (NIH Publication 86-23, revisado 1985). O bien AP2 o AP3 fue inyectado por vía intravenosa a la concentración de 1 mg/ml. Después de la inyección, se obtuvieron muestras de sangre de la órbita de ratas en varios puntos de tiempo (8 y 30 min y 1.5, 3, 6, 9, 12 y 24 h después de la inyección de péptidos) y Para estudiar la farmacocinética de AP2 y AP3 en ratas y proporcionar evidencia experimental de la posible farmacocinética en humanos, se estableció un método de sandwich de doble anticuerpo ELISA para la determinación rápida de AP2 y AP3 en plasma de ratas. Brevemente, las placas de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) fueron prerevestidas con anticuerpos frente a AP2 o AP3 (5 μ g/ml) purificadas a partir de antisera de conejo 59. Luego fueron preincubadas con muestras séricas diluidas 20 veces a 37 °C durante 1 h, seguidas por la adición de anticuerpos anti-AP2 o anti-AP3 (1:1000) purificados a partir de antisera de ratón específicamente frente a AP2 o AP3 59 a 37 °C durante otra 1 h. Luego, se agregaron IgG La absorción a 450 nm fue determinada por un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan), obteniendo primero los parámetros péptidos estándar, determinando las concentraciones de péptidos plasmáticos en función del tiempo, y calculando la semivida utilizando PK Solver para Microsoft Excel para obtener parámetros farmacocinéticos. Evaluación de la sensibilidad de los péptidos a la digestión proteolítica por proteinasa K y enzimas proteolíticas en homogeneato hepático. Los péptidos (10 μ g/ml) se prepararon en PBS pH 7,2 conteniendo 20 ng/ml de proteinasa K. La mezcla resultante fue incubada a 37 °C en un baño de agua y sacada en diferentes intervalos de tiempo (0, 5, 15, 30, 60, 120 minutos), seguida de saturación de las muestras con alcohol etílico y cuantificación de los péptidos Para probar la sensibilidad de los péptidos a las enzimas proteolíticas en el homogeneato hepático, se sacrificaron 3 ratas SD macho (250 ± 20 g) bajo anestesia; se extrajo rápidamente de cada rata todo el hígado, se lavó en PBS helado (50 mM, pH 7,2), se pesaron y cortaron en trozos pequeños, que fueron resuspendidos en PBS a 100 mg de tejido hepático húmedo/2,5 ml de PBS; las muestras fueron agrupadas y homogeneizadas, seguidas de centrifugación a 9.000 g durante 20 minutos a 4 °C; se recolectaron los sobrenadantes; se agregaron los péptidos de prueba al homogeneato hepático a una concentración final de 10 μ g/ml; la mezcla resultante fue incubada 37 °C en un baño de agua, y los péptidos de residuo

¿Cuál es la semivida de eliminación in vivo de AP3?

Mejora de las propiedades farmacológicas y estructurales del inhibidor de la fusión del VIH AP3 sobre la enfuvirtida: ventajas destacadas de la estrategia artificial de Peptidehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC454141410/SHA: f2fcc16391f946c99717b63ec9a24e5384aac381Autores: Zhu, Xiaojie; Zhu, Yun; Ye, Sheng; Wang, Qian; Xu, Wei; Su, Shan; Sun, Zhiwu; Yu, Fei; Liu, Qi; Wang, Chao; Zhang, Tianhong; Zhang, Zhenqing; Zhang, Xiaoyan; Xu, Jianqing; Du, Lanying; Liu, Keliang; Lu; Zhang, Ro Sin embargo, su aplicación clínica es limitada debido a la corta semivida, resistencia al fármaco y reactividad cruzada con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH. Utilizando una estrategia de péptido artificial, diseñamos un péptido con secuencia de proteínas no nativas, AP3, que mostró una potente actividad antiviral contra un amplio espectro de cepas del VIH-1, incluyendo aquellas resistentes a T20, y tuvo una semivida in vivo notablemente mayor que T20. Mientras que los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH suprimieron significativamente la actividad antiviral de T20, estos anticuerpos no reconocieron AP3 ni atenuaron su actividad anti-VIH-1. Estructuralmente diferentes de T20, AP3 podrían doblarse en una hélice e interactuar con gp41 NHR. Los dos residuos, Met y Thr, en el N-terminal de AP3 forman una estructura similar a gancho para estabilizar Por lo tanto, AP3 tiene potencial de desarrollo como un nuevo inhibidor de la fusión del VIH con mejor eficacia antiviral, perfil de resistencia y propiedades farmacológicas sobre la enfuvirtida. Mientras tanto, este estudio destacó las ventajas de los péptidos diseñados artificialmente, y confirmó que esta estrategia podría utilizarse en el desarrollo de inhibidores de la fusión viral basados en péptidos artificiales contra el VIH y otros virus envueltos. Texto: Las secuencias de péptidos derivados de la NHR-gp41 o CHR. Los residuos correspondientes a la región de bolsillo de la NHR están marcados en rojo. Los residuos de la PBD están marcados en azul, y los residuos de ganglio MT adyacentes al término N de la PBD están marcados en verde. El péptido 5HRu consta de 5 copias de plantilla de secuencia artificial (AEELAKK) subrayado. Los residuos mutantes en la P b) La actividad inhibitoria de AP1, AP2, AP3 y T20 sobre la infección por VIH-1 IIIB (subtipo B, X4) en células MT-2 (panel izquierdo) por HIV-1 Bal (subtipo B, R5) en células M7 (panel derecho); cada muestra se probó por triplicado y el experimento se repitió dos veces; los datos se presentan como medios ± SD. RepoRts científicos 5:13028 DOi: 10.1038/srep13028Para hacer frente a estos obstáculos, se han hecho muchos esfuerzos para optimizar los péptidos derivados de T20 y gp41 CHR. Algunos de estos péptidos tienen mejores actividades inhibitorias contra cepas resistentes a T20 y/o una semivida más larga que T20. Sin embargo, todavía tienen el problema de reaccionar de forma cruzada con los anticuerpos preexistentes en la su Basándonos en la plantilla de péptido artificial universal de 5HRu, hemos diseñado previamente los péptidos artificiales de AP1 (PBD-m4HR) y AP2 (PBDtrp-m4HR), y hemos realizado investigaciones preliminares sobre su actividad inhibitoria contra la fusión de células mediadas por Env VIH-1 16. En el presente estudio, hemos diseñado un nuevo péptido artificial, AP3 (Fig. 1a), con el objetivo de aplicar la estructura "M-T gancho" para estabilizar la interacción del péptido artificial con el bolsillo hidrofóbico en el recortador NHR gp41 17, 18. Después de estudiar exhaustivamente su actividad antiviral, propiedad bioquímica, estructura cristalina, mecanismo funcional, semivida in vivo y, por primera vez, el efecto de anticuerpos preexistentes en el sera de pacientes infectados por VIH, encontramos que el péptido artificial de nuevo diseño, AP3, mostró una mejor actividad antiviral, perfil de resistencia a fármacos y propiedades farmacológicas sobre T20. En particular, los anticuerpos preexistentes en el sera de pacientes infectados por VIH no suprimieron, sino que mejoraron la actividad anti-VIH-1 de AP3. Estos resultados sugieren que el AP3 tiene potencial de desarrollo como un nuevo fármaco anti-VIH y confirman que esta estrategia se puede utilizar para diseñar péptidos antivirales artificiales contra otros virus envueltos, como el SARS-CoV 19, el MERS-CoV 20 y el paramixovirus 21. Nuestros péptidos artificiales AP1 y AP2 previamente diseñados podrían inhibir la fusión de la membrana celular mediada por el VIH-1 16. Él y sus colegas reportaron que la adición de dos aminoácidos de Met y Thr al N-terminal de un CHR-péptido podría mejorar su actividad anti-VIH-1 17, 18. Aquí diseñamos un nuevo péptido artificial, AP3, añadiendo Met y Thr al N-terminal de AP2 (Fig. 1a). Luego comparamos AP3 con AP1, AP2 y T20 para su actividad anti-VIH-1 contra cepas divergentes del VIH-1, incluyendo los virus adaptados al laboratorio, IIIB (subtipo B, X4) y Bal (subtipo B, R5), y una serie de aislamientos primarios del VIH-1, así como las cepas resistentes al T20. 1b, AP3 mostró mayores actividades inhibitorias sobre la infección por cepas HIV-1 IIIB y HIV-1 Bal (IC 50 : 3,06 y 15,09 nM, respectivamente) que AP1 (IC 50 : 86,25 y 396,14 nM, respectivamente), AP2 (IC 50 : 23,05 y 49,95 nM, respectivamente) y T20 (IC 50 : 13,63 y 30,21 nM, respectivamente). La actividad inhibitoria de AP3 sobre la infección por cepas primarias divergentes de VIH-1 con distintos genotipos (subtipos A -E y grupo O) y fenotipos (R5 y X4) también fue superior a la de AP2 y T20 (Tabla 1). Si bien la T20 no fue eficaz frente a cepas de VIH-1 resistentes a T20 a una concentración de hasta 2.000 nM, la AP3 podría efectivamente inhibir la infección de estas cepas con IC 50 en el rango de 13 ~ 90 nM, que era aproximadamente 2 a 4 veces más eficaz que la AP2 (Tabla 1 ). Estos resultados indican que el péptido artificial AP3 ha mejorado notablemente la actividad anti-VIH-1 contra un amplio espectro de cepas de VIH-1, incluyendo variantes resistentes a T20, sobre T20 y los péptidos artificiales AP1 y AP2. Los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1 no reconocieron la AP3 ni atenuaron su actividad anti-VIH-1. Los estudios anteriores han demostrado que los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por el VIH-1, incluidos los que reaccionan de forma cruzada con T20 y los específicos para los sitios de unión de T20 en gp120 (por ejemplo, las regiones del bucle C1 y V3) y gp41 (por ejemplo, el dominio NHR), podrían bloquear significativamente la actividad inhibitoria de fusión de T20 14, 15. Aquí investigamos la influencia de anticuerpos preexistentes contra el péptido AP3. Como se muestra en la figura 2a, tanto T20 como C46 reaccionaron con los anticuerpos en sueros de cinco pacientes infectados por el VIH-1; sin embargo, ninguno de los tres péptidos artificiales AP1, AP2 y AP3 fue reconocido por los anticuerpos preexistentes.La actividad inhibitoria de T20 sobre la infección por el VIH-1 IIIB se redujo aproximadamente 1,9 veces a > 3,6 veces en presencia de 2b y Tabla Suplementaria S1), confirmando que los anticuerpos preexistentes en sera de pacientes con VIH/SIDA pueden atenuar la actividad anti-VIH-1 de T20 14, 15. Sin embargo, ninguno de los péptidos artificiales en el presente estudio mostró disminución significativa de la actividad anti-VIH-1 en presencia de sera de pacientes. En cambio, la actividad antiviral de AP3 aumentó en presencia de antisera de pacientes infectados con VIH-1 (fig. 2b y Tabla Suplementaria S1), sugiriendo que los anticuerpos anti-VIH-1 realmente mejoraron la actividad anti-VIH-1 de AP3, posiblemente porque la unión de los anticuerpos a algunos sitios en gp120 o gp41 promueve la interacción de AP3 con la región viral de gp41 NHR. AP3 tuvo una semivida más larga que T20. Aunque la T20 ha demostrado eficacia en la inhibición de la infección por el VIH-1, su principal debilidad radica en su corta semivida en plasma (aproximadamente 2 h) [22] [23]. Como resultado, la T20 debe administrarse por vía subcutánea dos veces al día a 90 mg por dosis, causando a menudo reacciones graves en el lugar de inyección 25, 26. Aquí, se realizaron estudios farmacocinéticos por administración intravenosa de AP3, AP2 y T20, respectivamente, a rata SD a una dosis de 1 mg/kg, para comparar su tiempo de circulación in vivo. Como era de esperar, la T20 mostró una semivida más corta y un AUC menor (0-t) por circulación sistémica, mientras que la AP3 y la AP2 demostraron una concentración mucho mayor y un tiempo de circulación más largo (Tabla 2 ). Los perfiles farmacocinéticos de AP3 y AP2 se ajustaron a un modelo de no-compartimento. La semivida de eliminación in vivo de AP3 (t 1/2 = 6,02 h) fue aproximadamente 2,8 veces mayor que la de T20 (t 1/2 = 1,57 h). Este resultado proporcionó la base teórica para reducir la frecuencia de inyección y la dosis del inhibidor de la fusión, en conjugación con la potencia antiviral mejorada de AP3. Por lo tanto, la sustitución de T20 por AP3 puede reducir significativamente las reacciones en el lugar de inyección y el costo del fármaco, lo que promovería las aplicaciones clínicas del inhibidor de la fusión del VIH en regiones o países pobres en recursos. AP3 fue mucho más resistente que T20 a la degradación proteolítica por proteinasa K y homogenato hepático de rata. Comparamos la estabilidad de T20 y AP3 en presencia de proteinasa K (una proteína de serina de amplio espectro) y homogenato hepático de rata. Después del tratamiento con 20 ng/ml de proteinasa K durante 2 h a 37 °C, sólo quedó el 29% del péptido parental T20, detectado por el análisis LC-MS. Bajo la misma condición, AP3 retuvo el 100% de su prototipo (Fig. 3a ). Además, AP3 mostró una estabilidad metabólica significativamente aumentada sobre T20 in vitro en presencia de homogenato hepático (Fig. 3b). Estos resultados indican que el péptido artificial AP3 es mucho más resistente a la degradación proteolítica que el péptido natural T20, lo que puede contribuir a su significativa vida media in vivo más larga que T20 como se describe anteriormente. AP3 formó un complejo estable α-helical y la formación de bloque gp41 6-HB. Para investigar el mecanismo antiviral de AP3, se comparó la estabilidad térmica del complejo AP3/N36 con la de AP1/N36, AP2/N36, T20/N36 y C34/N36 complejos por espectroscopia circular-dicroísmo (CD) 27. Debido a que T20 carece del dominio de encuadernación de bolsillo (PBD), el complejo T20/N36 no mostró una conformación α-helical típica, en consistencia con nuestros estudios anteriores 8, 9. Similar a la α-helicidad del complejo C34/N36 3, los complejos AP1/N36, AP2/N36 y AP3/N36 formaron un pico negativo en forma de sillín a 208 nm y 222 nm, indicando sus estructuras α-helical (fig. 4a) Fig. 4b), indicando que el complejo helicoidal α formado por AP3 y N36 es el más estable entre los cuatro complejos. Luego comparamos la actividad inhibitoria de AP3 con la de AP1 y AP2 en la formación de 6-HB entre C34 y N36. Como T20 no puede bloquear la formación de 6-HB 8, 9, utilizamos un inhibidor de fusión de pequeña molécula VIH-1, ADS-J1 28, 29, para reemplazar a T20 como un control de inhibición de 6-HB. Como se esperaba, ADS-J1 podría efectivamente inhibir la formación de 6-HB con IC 50 de 2,75 μ M 8, 9, [27] [28]. AP3 fue altamente eficaz contra la formación de 6-HB de forma dosis-dependiente con un valor IC 50 de 0,24 μ M, aproximadamente 30 y 15 veces más potente 4c), confirmando que AP3 puede bloquear potentemente la formación del núcleo de fusión gp41 6-HB, inhibiendo así la fusión del VIH-1 con la membrana celular diana. Base estructural para la potente actividad inhibitoria de fusión del péptido artificial AP3. Para dilucidar los determinantes moleculares de estos péptidos artificiales, resolvimos con éxito las tres estructuras complejas de péptidos AP1/AP2/AP3 que se unen con gp41 NHR. Para AP1 y AP2, un enlace optimizado Cada muestra fue probada por triplicado y el experimento se repitió dos veces. Los datos se presentan como medios ± SD. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. "SGGRGGG" se utilizó para ensamblar el NHR y el péptido artificial en una única proteína recombinante (N Sin embargo, una estrategia similar falló en la cristalización de AP3; por lo tanto, decidimos cocristalizar el péptido sintético N45 y péptido AP3, y finalmente se obtuvieron los cristales complejos. Curiosamente, los cristales de tres inhibidores diferentes pertenecen a tres grupos espaciales distintivos: P2 1 para N36-L6-AP1, R32 para N36-L6-AP2, y P6 3 para N45/AP3. Como era de esperar, las porciones de NHR en tres estructuras forman un núcleo trimérico, mientras que la porción AP1, AP2 o AP3 se pliega en una conformación de una hélice única y se une a NHR-trimer para formar un típico 6-HB, similar a la de la estructura central de HIV-1 gp41 formada por el péptido CHR nativo C34 y N36 (Fig. 5a). Además, los residuos hidrofóbicos conservados, como el W43, el W46 y el I50, en los péptidos artificiales fueron profundamente enterrados en la Tabla 2. Parámetros farmacocinéticos de AP2, AP3 y T20 tras la administración intravenosa a 1 mg/kg en ratas SD macho (n = 2). Figura 3. Sensibilidad de AP3 y T20 a la degradación proteolítica por proteinasa K y homogeneato hepático de rata. a) Después de la digestión por proteinasa K a pH 7,2 y b) homogeneato hepático de rata, la cantidad residual de AP3 y T20 fue detectada mediante análisis LC-MS. El experimento se realizó en triplicado y los datos se presentan como medios ± SD. La inhibición de AP1, AP2, AP3, T20 y ADS-J1 frente a la formación de 6-HB entre N36 y C34 fue detectada por ELISA utilizando el mAb NC-1 específico de 6-HB. Cada muestra se probó por triplicado, y los datos se presentan como media ± DE. surcos formados entre cada par de hélices NHR, similares a los residuos correspondientes de W628, W631 y I635 en la gp41 CHR nativa (Fig. 5b). Los péptidos AP mostraron mejor afinidad contra la Gp41 CHR natural. En C34, que contiene la secuencia CHR natural de W628 a L661, no se encontró interacción fuerte entre I642 y Q565 en el complejo de GP41 NHR-CHR viral (Fig. 5c). Sin embargo, en la secuencia correspondiente (de W43 a K76) de AP1 y AP2, se estableció un enlace de hidrógeno entre S57 (correspondiente a I642 en CHR) y Q18 (correspondiente a Q565 en NHR) en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3. Así, S57 en AP1/AP2/AP3 desempeña un papel en la estabilización de las interacciones entre el inhibidor péptido artificial y su objetivo NHR, resultando en su afinidad de unión más fuerte. Además, en NHR-CHR, L567 y L568 en dos NHR adyacentes forman una ranura hidrofóbica, en la que T639 está enterrado (Fig. Suplemental S1a ). Sin embargo, en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3, I54 (correspondiente a T639 en CHR) puede unirse fuertemente a L20 y L21 a través de interacciones de cadenas laterales totalmente hidrofóbicas. Del mismo modo, la interacción de I64 (correspondiente a S659 en CHR) con L10 y L11 (correspondiente a L567 y L568 en NHR, respectivamente) en N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 y N45/AP3 se ha mejorado significativamente (Suplementary Fig. S1b ). Al igual que la hélice gp41 CHR, las hélices de AP1, AP2 y AP3 también tienen dos lados diferentes, un lado hidrofóbico orientado hacia la NHR y un lado hidrofílico orientado hacia Se espera que la mejora de la hidrofilia del lado expuesto de los inhibidores pueda aumentar su actividad antiviral y solubilidad. Para lograr este objetivo, los residuos de aminoácidos con hidrofobia, o baja hidrofilia, como N637, S640, L641 y S644 en CHR, fueron cambiados a los residuos de aminoácidos con alta hidrofilia, como E52, K55, K56 y E59 en AP1, AP2 y AP3, respectivamente. Además, el residuo hidrofóbico M629 en CHR fue reemplazado por un residuo hidrofílico E44 en AP2 y AP3 (Figura suplementaria S2 ). Estos residuos hidrofílicos, como ácido glutámico y lisina, pueden aumentar la solubilidad de péptido entero y, por lo tanto, estabilizar el complejo formado por el inhibidor y su objetivo. Se ha demostrado que el puente de sal doble EE-KK puede estabilizar la conformación de la hélice 30. Hemos identificado este tipo de interacción entre i e i + 3 o i + 4 posiciones en las tres estructuras complejas. En N36-L6-AP1, R48 interactúa con E45 y E52 para formar una red de puente de sal. En N36-L6-AP2, E45 interactúa con K48, y E52 se une a K56, mientras que en N45/AP3, K69 se une a E66 ( Suplementary Fig. S2 ). Estos fuertes puentes de sal formados por los residuos cargados opuestamente estabilizan la conformación de péptidos AP, llevando su efecto inhibidor en pleno juego. Como se informó anteriormente, la adición del "gancho M-T" a los péptidos CHR C34 y sifuvertida podría mejorar dramáticamente la actividad Como era de esperar, el N-terminal Met y Thr de AP3 forma una estructura similar a un gancho (Fig. 5d). La cadena lateral de la metionina hidrofóbica de M41 acomoda la ranura entre hélices AP3 y NHR, tapando el bolsillo hidrofóbico. Esta interacción conduce a una serie de cambios conformacionales. La cadena principal de AP3 en W43 se mueve 1,91 Å más cerca de NHR en comparación con AP2 (Suplemental Fig. S3 ). La cadena lateral de W43 en AP3 gira alrededor de 90 grados y está enterrada más profundamente que la de AP2. La cadena lateral de E44 vuelve a interactuar a D47, pero la cadena lateral de E45 retrocede desde K48 e interactúa con T42. Por lo tanto, esta estructura de gancho M-T podría estabilizar aún más la unión entre AP3 y NHR La Enfuvirtida, también conocida como T20, fue aprobada por la FDA como el primer fármaco antiviral basado en el inhibidor de la entrada del VIH para su uso con otros medicamentos anti-VIH para tratar adultos y niños infectados por el VIH-1 a los 6-16 años 23,31,32 (http://www.fuzeon.com). Aunque la T20 es un medicamento anti-VIH indispensable para los pacientes con VIH/SIDA que no han respondido a la terapia antirretroviral actual, sus deficiencias han limitado su aplicación clínica. La T20 tiene una actividad anti-VIH menor y una semivida más corta que otros péptidos de la CHR que contienen PBD, como C34 y C38 8, 9, 33. Además, las variantes resistentes al VIH-1 T20 surgieron en breve (por ejemplo, 14 días) después de su uso en pacientes 34. La mayoría de los virus resistentes a T20 presentaban mutaciones en el motivo GIV (residuos 36-45: GIVQQNNLL) en el dominio Gp41 NHR 10, [34] [35] [36] [37] [38]. La falta de PBD contribuye a las principales debilidades de T20 descritas anteriormente. Dado que el bolsillo hidrofóbico conservado en el trimer de NHR gp41 desempeña un papel crítico en la estabilización de la interacción entre el NHR gp41 y CHR y la formación del núcleo fusogénico de 6-HB 1, 39, 40, el péptido CHR que contiene PBD, como C34, puede unirse al trimer de gp41 viral más fuerte y estable, poseyendo así una actividad anti-VIH más potente que T20, un péptido CHR sin PBD 8, 9. En ausencia de PBD, T20 interactúa principalmente con la región media del dominio NHR que contiene el motivo GIV. Por lo tanto, un virus con mutaciones en este motivo es generalmente resistente a T20 10, [34] [35] [36] [37] [38]. En comparación con otros fármacos anti-VIH, otra debilidad de T20 es su reactividad cruzada con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1. Además de gp41, T20 también podría unirse a algunas regiones en gp120. Los anticuerpos preexistentes específicos para los sitios de unión del T20 en gp120 y gp41 pueden suprimir indirectamente la actividad anti-VIH de T20 14, 15. La adición de PBD al N-terminal de T20, como T-1249, podría mejorar significativamente la potencia anti-VIH-1, la semivida y el perfil de resistencia a fármacos 33, [41] [42] [43]. La adición de la estructura de gancho M-T al N-terminal de un PBD-CHR-péptidos que contienen PBD, como MT-C34 o MT-SFT, podría aumentar aún más la actividad anti-VIH-1 de los correspondientes CHR-péptidos 17, 18. La supresión del dominio GIV-motif-vinculante de un CHR-péptido, como CP621-652 y CP32M, es otro enfoque eficaz para aumentar la barrera genética a la resistencia a drogas 44, 45. Sin embargo, ninguno de los enfoques anteriores es eficaz para prevenir la reacción cruzada de T20 con los anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes con VIH/SIDA, ya que los péptidos previamente modificados contienen principalmente las secuencias nativas del dominio HIV-1 gp41 CHR. Nuestros estudios anteriores han demostrado que AP1 y AP2, péptidos artificiales con secuencias de proteínas no nativas, podrían formar estructura de bobina en espiral para interactuar con gp41 NHR e inhibir la fusión celular mediada por VIH-1 Env 16. En el presente estudio, diseñamos un nuevo péptido artificial, AP3, añadiendo la estructura de gancho M-T al N-terminal de AP2 (Fig. 1a), seguido de investigar la influencia de anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes infectados por VIH en AP3, utilizando AP1, AP2 y T20 como controles. Se demostró que los sueros de los pacientes infectados por el VIH podrían unirse a la T20 y reducir significativamente su potencia frente al VIH-1. Sin embargo, estas mismas muestras séricas no interactuaron con los tres péptidos artificiales y apenas afectaron su actividad antiviral. Sorprendentemente, los anticuerpos en el sera podrían incluso mejorar la actividad anti-VIH-1 de AP3 (Fig. 2a,b y Tabla Suplementaria S1). Estos resultados confirmaron, por primera vez, que la sustitución de la secuencia viral nativa en la T20 por una secuencia artificial es un enfoque eficaz para superar una deficiencia clave de la T20, por lo que su actividad anti-VIH podría ser atenuada por anticuerpos anti-gp41 preexistentes en pacientes con VIH/SIDA. Vale la pena explorar por qué los anticuerpos en la sera son capaces de mejorar la actividad anti-VIH-1 de la AP3. Nuestro estudio reciente ha demostrado que la actividad anti-VIH-1 de T20 se ve aumentada por un anticuerpo no neutralizante dirigido contra el dominio NHR del VIH-1 gp41 46. Por lo tanto, hipotetizamos que algunos de los anticuerpos anti-gp41 en pacientes con VIH/SIDA pueden unirse a un sitio en el dominio NHR adyacente a la región de unión de AP3, lo que resulta en una mayor interacción entre AP3 y NHR-trimer y una mayor actividad antiviral de AP3. Luego comparamos la actividad inhibitoria de AP3 con el gancho M-T y T20/AP2 sin gancho M-T sobre la infección por cepas divergentes del VIH-1. AP3 fue más eficaz que AP2 o T20 en inhibir la infección por cepas adaptadas al laboratorio y los aislamientos primarios del VIH-1, incluyendo los resistentes al T20 (fig. 1b, Tabla Se puede cuestionar si AP3 también puede inducir virus farmacorresistentes en pacientes si se usa en clínicas para tratar pacientes infectados por VIH. Creemos que AP3 tiene una barrera genética mucho mayor a la resistencia que T20 porque AP3 contiene PBD, mientras que T20 carece de PBD. Dwyer et al. 33 utilizaron T2544, un péptido CHR que contiene PBD, para llevar a cabo un experimento de paso, utilizando T20 como control. Demostraron que T20 podría inducir un virus mutante con alta resistencia (81 veces) a T20 en aproximadamente 1 mes, mientras que T2544 no indujo una cepa resistente en más de 2 meses en cultivo. Después de extender el experimento de paso por casi 8 meses, identificaron una cepa con una resistencia débil (8,3 veces) a T-2544, y los sitios de mutación relacionados no estaban en la región de bolsillo gp41, lo que sugiere que los péptidos CHR que contienen PBD, incluyendo AP3, pueden tener dificultad para inducir resistencia al fármaco. AP3 también tuvo una vida media más larga que T20 (Tabla 2), posiblemente porque el péptido artificial AP3 es menos sensible a las enzimas proteolíticas que T20 con la secuencia de proteínas virales nativas. Se espera que la eliminación de los sitios de escisión de enzimas proteolíticas en el péptido AP3 amplíe aún más su vida media. Estos resultados confirmaron que la sustitución de la secuencia de proteínas nativas por secuencia artificial y la adición del gancho M-T al péptido que contiene PBD es una estrategia sólida para diseñar Dado que las estructuras tridimensionales de los péptidos AP no habían sido investigadas antes del presente estudio, la optimización de estos inhibidores de los péptidos artificiales no pudo ser realizada racionalmente. Nuestros estudios estructurales de los péptidos artificiales AP1/AP2/AP3 en complejo con NHR mostraron que los péptidos AP, al igual que el péptido CHR C34, podrían unirse a gp41 NHR para formar una estructura canónica 6-HB (Fig. 5a). Es bien sabido que existe un bolsillo hidrofóbico profundo en cada ranura en la superficie del trimer viral gp41 NHR. Los residuos hidrofóbicos I635, W631 y W628 en la unión gp41 CHR con los residuos hidrofóbicos en la pared de este bolsillo, resultando en la formación de 6-HB estable por la fuerte interacción entre CHR Esta importante característica ha sido bien preservada en las estructuras AP1/AP2/AP3 6-HB (Fig. 5b), que pueden explicar las potentes actividades inhibitorias de la fusión VIH-1 de estos péptidos artificiales. Un nuevo enlace de hidrógeno, que se estableció entre S57 y Q18 en los complejos AP1/AP2/AP3, no existe en el complejo viral gp41 CHR-NHR, sugiriendo que S57 puede jugar un papel importante en la estabilización de las interacciones entre el péptido y NHR, dando lugar a afinidades de unión de AP1/AP2/AP3 que son más fuertes que las de HIV-1 gp41 CHR a NHR. Además, el puente de sal doble EE-KK formado entre las posiciones i e i + 4 en las estructuras AP1/AP2/AP3 podría estabilizar la conformación de la hélice y aumentar el efecto inhibitorio de estos pé En comparación con AP1, las mutaciones en el sitio triple se introdujeron en AP2 y AP3, es decir, M44E, R48K y E49K. Estas sustituciones no sólo aumentan la solubilidad del péptido, sino que también desencadenan una serie de reordenamientos de ciertos puentes de sal intrahelical para mejorar la estabilidad de la estructura de la hélice de la CHR y la actividad inhibidora de la fusión del VIH-1. Anteriormente se demostró que el gancho M-T era un paso efectivo hacia el aumento de la interacción estable entre un péptido de la CHR y el bolsillo del HIV-1 gp41 17, 18. Por lo tanto, AP2 se optimizó aún más mediante la incorporación de Met y Thr en su terminal N. Los resultados de espectroscopia de CD y desnaturalización térmica indican que la incorporación de gancho M-T contribuye a la formación de una Además, el puente salino doble EE-KK formado entre i e i + 4 posiciones en la estructura N36-L6-AP3 contribuyó a aumentar la estabilidad de la hélice CHR y 6-HB, lo que resultó en una mejor potencia de AP3, como se ha observado en estudios de CHR-péptidos con mutaciones dobles EE-KK 30, 33, 47, 48. Además, la actividad de fusión del VIH-1 y la semivida de AP2 pueden haber sido reforzadas y ampliadas, respectivamente, mediante la adición de gancho M-T en el diseño de AP3. En conclusión, AP3, un péptido artificial con estructuras de gancho PBD y M-T, mostró una mejor actividad anti-VIH-1 y perfil de resistencia a fármacos, así como una vida media prolongada. Además, no reaccionó con los anticuerpos preexistentes en la sura de pacientes con VIH/SIDA. Consecuentemente, su actividad antiviral RepoRts Científicos 5:13028 DOi: 10.1038/srep13028 no fue significativamente afectada por estos anticuerpos. Por lo tanto, AP3 muestra la promesa como un candidato para el desarrollo ulterior como un nuevo inhibidor de la fusión del VIH para uso clínico. Este estudio también proporciona información importante de estructura e actividad para el diseño racional de nuevos inhibidores de péptidos artificialmente. Además, nuestros resultados destacaron las ventajas de los péptidos diseñados artificialmente y confirmaron que esta estrategia podría ser ampliamente utilizada en el desarrollo de inhibidores de la fusión de virus basados en péptidos artificiales contra el VIH-1 y otros virus envueltos con proteínas de fusión de membrana de clase I, tales como SARS-CoV 19, MERS-CoV 20, y paramixovirus 49. Este estudio no implicó experimentación humana; los únicos materiales humanos utilizados fueron muestras séricas obtenidas de individuos infectados por el VIH-1 con la aprobación del Comité de Ética del Centro Clínico de Salud Pública de Shanghai, Universidad de Fudan (Protocolo No. SPHCC-125-2). Los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas. Todas estas muestras de sueros procedían de adultos; ningún menor estuvo involucrado en este estudio. Se obtuvo el consentimiento informado escrito para el uso de los especímenes clínicos de todos los pacientes involucrados en este estudio. Síntesis de Peptide. Un panel de péptidos (Fig. 1a), incluyendo T20, C34, C46, AP1, AP2, AP3, así como N-péptidos derivados de NHR, N36 y N45, fueron sintetizados con un método FMOC de fase sólida estándar, como se describió anteriormente 8, 50. Todos los péptidos fueron acetilados en el término N y mediados en el término C. Los péptidos fueron encontrados alrededor del 95% puros por el CLAR y fueron identificados por espectrometría de masas (Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA). Las concentraciones de los péptidos fueron determinadas por la absorbancia UV y un coeficiente de extinción molar calculado teóricamente basado en residuos de triptófano y tirosina. Ensayo de calificación. Los análisis cromatográficos se realizaron utilizando una columna SAO-C8 (5 μ m, 100 mm × 2,0 mm ID) mantenida a temperatura ambiente. La fase móvil se compuso de ácido acetonitrilo-agua-fórmico en la proporción de 50:50:0.1 (v/v/v) a un caudal de 0,3 mL/min. El volumen de inyección de la muestra fue de 10 μ L. El acetonitrilo fue de grado HPLC, y otros reactivos químicos y disolventes fueron de grado analítico. Para el análisis de LC-MS se utilizó un espectrómetro de masa tándem tricuadruple MAX de Thermo TSQ Quantum Discovery MAX equipado con fuente ESI (San José, CA) y una bomba LC Surveyor. Para la adquisición y procesamiento de datos se utilizó el software Xcalibur y el programa de análisis de datos LCQuan 2.0 (Thermo Finnigan), respectivamente. Los parámetros de MS optimizados fueron los siguientes: tensión de pulverización de 4800 V, presión de gas de vaina de 40,0 psi, flujo de válvula auxiliar de 1,0 psi y 300 °C de temperatura capilar. Al ejecutar la disociación inducida por colisión (CID), la El modo de monitoreo de reacción seleccionado (SRM) se utilizó para AP3 mientras que el modo de monitoreo de iones seleccionado (SIM) se preformó para T20. Se registraron las siguientes transiciones: m/z 670.5 para AP3, m/z 1498.6 para T20. Las masas de péptidos sintéticos T20, AP1, AP2 y AP3 fueron determinadas por MALDI-TOF-MS (Fig. Suplementario S4 y S5 ). Expresión y purificación de proteínas de fusión N36-L6-AP1 y N36-L6-AP2. Utilizando PCR superpuesta, el fragmento de ADN que codificaba AP1 o AP2 péptido fue unido al fin 3′ del cDNA de gp41 NHR ("N36", 546-581), con un enlace corto ("L6", SGGRGG) entre ellos. Luego, toda la secuencia se subclonó en el vector pET-28a (Novagen, EE.UU.) con una etiqueta SUMO artificial entre la etiqueta HIS de N-terminal y la proteína diana. Las células E. coli de pET-28a-SUMO-N36-L6-AP1-o pET-28a-SUMO-N36-L6-AP2-transformadas fueron inducidas añadiendo 1 mM IPTG e incubando durante la noche a 16 °C. La proteína de fusión fue purificada por resina de afinidad Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), y la etiqueta His-SUMO fue cortada por el tratamiento enzimático Ulp1 a 4 °C durante 2 h. El recortador purificado N36-L6-AP1 o N36-L6-AP2 fue aplicado a una columna de filtración de gel Superdex-75 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.). Las fracciones que contenían N36-L6-AP1 o N36-L6-AP2 fueron recolectadas y concentradas en diferentes concentraciones por ultrafiltración. Cristalización, recolección de datos y determinación de la estructura. La proteína de fusión N36-L6-AP1 fue cristalizada a 16 °C utilizando el método de gota colgante, difusión de vapor. Las gotas se colocaron en un clip de cubierta siliconizada equilibrando una mezcla que contenía una solución proteica de 1 μ l (25 mg/ml N36-L6-AP1 recortador en 20 mM Tris-HCl pH 8,0 y 150 mM NaCl) y una solución de depósito de 1 μ l (0,1 M Tris-HCl pH 8,5, 32% (p/v) PEG3350 y 0,2 MgCl 2 ) frente a una solución de depósito de 400 μ l. Después de una semana, se formaron cristales únicos y se congelaron por chispa con nitrógeno líquido para la recogida de datos en el futuro. La proteína de fusión N36-L6-AP2 se cristalizó de manera similar con una solución de depósito diferente (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 34% (p/v) PEG3350 y 0,2 MgCl 2 Para obtener el cristal complejo de AP3 y NHR, el AP3 sintetizado se mezcló primero con el péptido N45 a razón de 1:1 molar y luego se aplicó a una columna de filtración de gel Superdex-75 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) para aislar el recortador formado de 6-HB. Se recogieron fracciones que contenían N45/AP3 y se concentraron hasta 30 mg/ml, luego se cristalizaron a 16 °C utilizando la gota colgante, método de difusión de vapor.Las gotas se colocaron en un clip de cubierta siliconizado equilibrando una mezcla que contenía una solución proteica de 1 μ l (20 mM Tris-HCl pH 8.0 y 150 mM NaCl) y una solución de depósito de 1 μ l (0,2 M de sulfato de amonio, 0,1 M Los conjuntos de datos de N36-L6-AP1 se recogieron a 100 K en la línea 19-ID de la fuente avanzada de fotones (Argonne National Laboratory, EE.UU.). Los conjuntos de datos de N36-L6-AP2 se recogieron en una fuente de rayos X interna (MicroMax 007 generador de rayos X, Rigaku, Japón) en el Instituto de Biofísica de la Academia China de Ciencias. Los conjuntos de datos de los cristales complejos AP3/N45 se recolectaron en la línea BL-19U1 de la instalación de radiación sincrotrón de Shanghai, China. Los datos de difracción de rayos X se integraron y escalaron utilizando el programa HKL2000 51. El problema paulatino de las tres estructuras fue resuelto mediante el método de reemplazo molecular utilizando PHENIX.faser 52 con una estructura cristalina de HIV gp41 NHR-CHR (entrada PDB: 1SZT) como modelo de búsqueda. Los modelos finales fueron ajustados manualmente en COOT 53 y refinados con PHENIX.refine 54. Todas las coordenadas fueron depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (N36-L6-AP1: 5CMU; N36-L6-AP2: 5CN0; y N45/AP3: 5CMZ). Las estadísticas de recolección de datos y refinamiento de la estructura se dan en la Tabla Suplementaria S2. Determinación de la reactividad cruzada de los péptidos nativos y artificiales con los anticuerpos preexistentes en pacientes infectados por VIH-1 por el sandwich ELISA. Se realizó un T20, C46, AP1, AP2 y AP3 fueron recubiertos en los pocillos de placas de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) a 10 μ g/ml. Los pocillos fueron bloqueados con gelatina al 1%, seguidos de la adición de 50 μ l de sueros diluidos serialmente de pacientes infectados por VIH-1 e incubación a 37 °C durante 1 h. Luego, se agregaron secuencialmente HRP-IgG antihumano (Abcam, UK) y TMB. Se determinó A450 con un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan). pacientes. Inhibición de péptidos en VIH-1 IIIB (subtipo B, X4)infección en presencia de sera de pacientes infectados por VIH-1 se determinó como se describe anteriormente 55. Brevemente, cada péptido fue mezclado con suero serialmente diluido de un paciente infectado por VIH-1 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, la mezcla de péptido/suero y VIH-1 (100 TCID 50 ) fue añadida a las células MT-2 (1 × 10 5 /ml) en medio RPMI 1640 conteniendo 10% FBS. Después de la incubación a 37 °C durante la noche, los sobrenadantes del cultivo fueron reemplazados por medio de cultivo fresco. Al cuarto día después de la infección, los sobrenadantes del cultivo fueron recolectados para la detección del antígeno p24 por ELISA. Brevemente, cada mezcla de péptido o péptido fue disuelta en solución salina fosfatada (PBS: 50 mM de fosfato sódico y 150 mM de NaCl, pH 7,2) a la concentración final de 10 μ M e incubada a 37 °C durante 30 minutos antes de enfriarse hasta 4 °C. Los espectros CD de cada muestra fueron adquiridos en un espectropolarímetro Jasco (Modelo J-815, Jasco Inc., Japón) a 4 °C utilizando un ancho de banda de 5 nm, resolución de 0,1 nm, longitud de trayectoria de 0,1 cm y un tiempo medio de 5,0 seg. Los espectros fueron corregidos por la sustracción de un blanco correspondiente a la composición solvente de cada muestra. Se utilizó el análisis térmico de punto medio para determinar la temperatura a la que el 50% de los 6-HB formados Se monitorizó a 222 nm de 4 °C a 98 °C aplicando un gradiente térmico de 5 °C/min. Se alisó la curva de fusión, y se calculó el punto medio de los valores de transición de despliegue térmico (Tm) utilizando las utilidades de software de Jasco descritas anteriormente. Inhibición de la formación de haz de seis hélices de gp41 mediante sandwich ELISA. Se determinó la inhibición de la formación de haz de seis hélices de gp41 mediante un péptido de prueba con un sandwich ELISA descrito previamente 57. Brevemente, se preincubaron un péptido de prueba (ADS-J1 como control) a concentraciones graduadas con péptido N36 (1 μ M) a 37 °C durante 30 min, seguido de la adición de péptido C34 (1 La mezcla se añadió a una placa de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) prerevestida con anticuerpos anti-N36/C34 (2 μ g/ml) purificados de antisera de ratón específicamente contra el haz de seis hélices de gp41 58. Luego, se añadieron en orden mAb NC-1, IgG anti-ratón marcado con HRP y TMB. A450 fue determinado por un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan). Las actividades de inhibición de AP1, AP2 y AP3 sobre la infección por VIH-1 fueron determinadas como se describió previamente 57. Para la inhibición de la infección por VIH-1 IIIB (subtipo B, X4), se añadió 100 TCID 50 del virus a 1 × 10 5 /ml de células MT-2 en el medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS en presencia o ausencia del péptido de prueba durante la noche. Luego, los sobrenadantes del cultivo se cambiaron a medios frescos. En el cuarto día después de la infección, los sobrenadantes del cultivo fueron recogidos para la detección del antígeno p24 por ELISA. Para la inhibición de la infección por la cepa VIH-1 Bal (subtipo B, R5), las células M7 (1 × 10 5 /ml) fueron precultivadas durante la noche e infectadas con Bal a 100 TCID 50 en presencia o ausencia del péptido de prueba o proteína durante la noche. Luego, los sobrenadantes del cultivo fueron cambiados a medios frescos. Los sobrenadantes fueron recolectados en el séptimo día post-infección y probados para el antígeno p24 por ELISA como se describió previamente 55. El porcentaje de inhibición de la producción de p24 fue calculado. Análisis de la semivida de los inhibidores de los péptidos. Cuatro ratas SD macho de aproximadamente 200 g cada una fueron obtenidas del Centro de Animales de la Escuela Médica de Shanghai y fueron usadas para el ensayo de semivida. Los animales fueron tratados de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal y la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" (NIH Publication 86-23, revisado 1985). O bien AP2 o AP3 fue inyectado por vía intravenosa a la concentración de 1 mg/ml. Después de la inyección, se obtuvieron muestras de sangre de la órbita de ratas en varios puntos de tiempo (8 y 30 min y 1.5, 3, 6, 9, 12 y 24 h después de la inyección de péptidos) y Para estudiar la farmacocinética de AP2 y AP3 en ratas y proporcionar evidencia experimental de la posible farmacocinética en humanos, se estableció un método de sandwich de doble anticuerpo ELISA para la determinación rápida de AP2 y AP3 en plasma de ratas. Brevemente, las placas de poliestireno de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Corning, NY) fueron prerevestidas con anticuerpos frente a AP2 o AP3 (5 μ g/ml) purificadas a partir de antisera de conejo 59. Luego fueron preincubadas con muestras séricas diluidas 20 veces a 37 °C durante 1 h, seguidas por la adición de anticuerpos anti-AP2 o anti-AP3 (1:1000) purificados a partir de antisera de ratón específicamente frente a AP2 o AP3 59 a 37 °C durante otra 1 h. Luego, se agregaron IgG La absorción a 450 nm fue determinada por un lector de ELISA (Ultra 384, Tecan), obteniendo primero los parámetros péptidos estándar, determinando las concentraciones de péptidos plasmáticos en función del tiempo, y calculando la semivida utilizando PK Solver para Microsoft Excel para obtener parámetros farmacocinéticos. Evaluación de la sensibilidad de los péptidos a la digestión proteolítica por proteinasa K y enzimas proteolíticas en homogeneato hepático. Los péptidos (10 μ g/ml) se prepararon en PBS pH 7,2 conteniendo 20 ng/ml de proteinasa K. La mezcla resultante fue incubada a 37 °C en un baño de agua y sacada en diferentes intervalos de tiempo (0, 5, 15, 30, 60, 120 minutos), seguida de saturación de las muestras con alcohol etílico y cuantificación de los péptidos Para probar la sensibilidad de los péptidos a las enzimas proteolíticas en el homogeneato hepático, se sacrificaron 3 ratas SD macho (250 ± 20 g) bajo anestesia; se extrajo rápidamente de cada rata todo el hígado, se lavó en PBS helado (50 mM, pH 7,2), se pesaron y cortaron en trozos pequeños, que fueron resuspendidos en PBS a 100 mg de tejido hepático húmedo/2,5 ml de PBS; las muestras fueron agrupadas y homogeneizadas, seguidas de centrifugación a 9.000 g durante 20 minutos a 4 °C; se recolectaron los sobrenadantes; se agregaron los péptidos de prueba al homogeneato hepático a una concentración final de 10 μ g/ml; la mezcla resultante fue incubada 37 °C en un baño de agua, y los péptidos de residuo

¿Por qué el complejo T20/N36 no mostró una conformación alfa helicoidal típica?

Virus que causan gastroenteritis: lo conocido, lo nuevo y los más alláhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4776197/SHA: f7b30ee89775bc82607cc6bc87feb5934b47625fAutores: Oude Munnink, Bas B.; van der Hoek, LiaFecha: 2016-02-19DOI: 10.3390/v8020042Licencia: cc-byAbstract: La lista de virus gastrointestinales recientemente descubiertos se está expandiendo rápidamente. Si estos agentes están realmente involucrados en una enfermedad como la diarrea es la pregunta esencial, pero difícil de responder. En esta revisión se presenta un resumen de todos los virus encontrados en la diarrea, junto con el conocimiento actual sobre su conexión con la enfermedad. Texto: El tracto gastrointestinal es un órgano vulnerable para las infecciones ya que hay contacto constante con el exterior, principalmente por vía oral. La inflamación del estómago y los intestinos (gastroenteritis) puede causar náuseas, vómitos y diarrea. La gastroenteritis es responsable de dos a tres millones de muertes cada año, por lo que es una de las causas más comunes de mortalidad [1]. Principalmente los niños en los países en desarrollo, pero también los individuos inmunocomprometidos en los países desarrollados, sufren de diarrea. Mientras que las infecciones gastrointestinales bacterianas y parasitarias están disminuyendo como resultado de la eliminación adecuada de aguas residuales y agua potable, la gastroenteritis viral no está disminuyendo en los países en desarrollo [2]. En el mundo desarrollado, los virus ya son los patógenos más comunes que causan diarrea [3]. Aunque los virus que infectan a los seres humanos ya habían sido descritos desde 1901 [4] y se sospechaba que los virus desempeñaban un papel en la diarrea, duró hasta 1972, cuando se identificó el primer virus causante de gastroenteritis (norovirus) en un brote de diarrea en Norwalk (California, Estados Unidos) [5]. Poco después del descubrimiento de norovirus se descubrieron varios otros virus causantes de gastroenteritis: rotavirus en células epiteliales de niños con gastroenteritis [6], astrovirus en casos de diarrea infantil [7], adenovirus entéricos en las heces de niños con diarrea aguda [8], y sapovirus durante un brote de gastroenteritis en un orfanato de Sapporo, Japón [9]. Todos estos virus se propagan a través de la vía fecal-oral a través de la transmisión de persona a persona y Los norovirus forman parte de la familia Caliciviridae y los brotes de gastroenteritis por norovirus han sido reportados en cruceros, centros de salud, escuelas y militares, pero el norovirus también es responsable de alrededor del 60% de todos los casos de diarrea esporádica (casos de diarrea en los que se pudo encontrar un enteropatógeno), revisados en la literatura [10, 11]. La patogénesis de la infección por norovirus se ha probado in vivo. Se administró norovirus filtrado a voluntarios sanos después de lo cual la mayoría de ellos desarrollaron diarrea [12]. La cultivo del virus, sin embargo, ha sido un problema desde su descubrimiento, pero un estudio ha descrito recientemente el cultivo de norovirus en células B, y ha revelado que los cofactores, como el antígeno de histosangre que expresa bacterias entéricas, son probablemente necesarios antes de que los virus entéricos puedan ser Los sapovirus también son miembros de los Caliciviridae. Hay cinco genogrupos humanos de sapovirus descritos [14] que representan el 2,2%-12,7% de todos los casos de gastroenteritis en todo el mundo [14, 15]. Los brotes de sapovirus ocurren a lo largo del año y pueden transmitirse a través de alimentos [16]. Para los sapovirus se ha descrito que el virus no se encontró antes del inicio de un brote, y que se encontró en el 95% de los pacientes durante un brote, mientras que disminuyó al 50% después de un brote, lo que indica que el virus introduce enfermedad en un huésped naturalmente infectado [17]. La infección por rotavirus es la causa más común de gastroenteritis viral entre los niños; sin embargo, los padres de niños infectados también se enferman a menudo y como resultado el rotavirus es la segunda causa más común de gastroenteritis Los estudios en voluntarios humanos han demostrado que la infección por rotavirus causa diarrea, resulta en el desprendimiento del virus y un aumento en el título antivirus de anticuerpos después de la infección [19]. Además, las infecciones por astrovirus son comunes, representando alrededor del 10% de todos los casos de diarrea esporádica [20]. Astrovirus ha sido aislado de personas enfermas, filtrado y administrado a individuos sanos después de lo cual en algunos voluntarios se observó enfermedad diarreica y se derramó astrovirus en sus heces [21]. El virus puede replicarse en células renales embrionarias humanas y fue detectado por microscopía electrónica (EM) [21]. Los adenovirus son responsables de alrededor del 1,5%-5,4% de los casos de diarrea en niños menores de 2 años, revisados en la literatura [22]. De los 57 tipos de adenovirus identificados [ Junto a estos dos tipos, el adenovirus tipo 52 también puede causar gastroenteritis [25], aunque se ha argumentado si el tipo 52 es en realidad un tipo separado ya que no hay suficiente distancia al adenovirus tipo 41 [26]. Los adenovirus generalmente se pueden propagar en líneas celulares; sin embargo, el adenovirus entérico 40/41 es difícil de cultivar, revisado en la literatura [27]. En los años 80 y 1990 se identificaron algunos agentes virales para los cuales la asociación directa con la enfermedad es menos clara. Los virus Aichi son miembros de los Picornaviridae identificados en muestras fecales de pacientes con gastroenteritis [28]. Desde su descubrimiento, se realizaron dos estudios de casos y controles, pero aunque ambos estudios sólo encontraron virus Aichi en heces de pacientes diarreicos, la prevalencia del virus Aichi (0,5% y 1,8%) fue demasiado baja para encontrar una asociación significativa con la diarrea [30, 31]. En los pacientes inmunocomprometidos el virus se encuentra en mayores cantidades y no está asociado con diarrea [32]. Los torovirus, parte de los Coronaviridae, se identificaron por primera vez en 1984 en heces de niños y adultos con gastroenteritis [33]. La infección por Torovirus se asocia con diarrea [34] y se observa con más frecuencia en pacientes inmunocomprometidos y en individuos nosocomiales infectados [34]. El análisis retrospectivo de la gastroenteritis viral nosocomial en un hospital pediátrico reveló que en el 67% de los casos se podía detectar el torovirus [35]. Sin embargo, sólo un número limitado de estudios reportan la detección de torovirus y por lo tanto la verdadera patogénesis y prevalencia de este virus sigue siendo elusiva. Picobirnavirus pertenecen a los Picobirnaviridae y fueron detectados por primera vez en las heces de niños con gastroenteritis [36]. Desde el descubrimiento inicial, el virus se ha detectado en muestras fecales de varias especies animales, y se ha demostrado que los virus son genéticamente muy diversos sin una clara agrupación de especies, revisado en la literatura [37]. Esta alta diversidad secuencial también se ha observado dentro de brotes particulares de gastroenteritis [38, 39], limitando la probabilidad de que los picobirnavirus estén causando brotes en realidad, ya que no se puede identificar ninguna fuente única de infección. En 1907 se desarrolló el primer sistema de cultivo tisular que fue considerado como el estándar de oro para la detección de virus durante En la década de 1930 se introdujeron la serología y la microscopía electrónica que impulsaron el descubrimiento de nuevos virus. Durante estos años, estos métodos se desarrollaron fructíferamente pero los virus que infectaban el tracto gastrointestinal fueron especialmente difíciles de cultivar. A lo largo de las últimas décadas, se han desarrollado varias técnicas basadas en el ADN para el descubrimiento de virus que impulsaron la identificación de virus nuevos en muestras de heces. Los cuatro métodos más utilizados son: 1. Imprimación universal-PCR [41] ; 2. PCR basado en la primografía aleatoria [42] ; 3. Descubrimiento de virus cDNA, Polimorfismo de longitud del fragmento amplificado (VIDISCA) [43] ; y 4. Amplificación de primer único independiente de secuencia (SISPA) [44]. Primer-PCR universal es una técnica de descubrimiento de virus que utiliza imprimaciones universales diseñadas sobre partes conservadas de una familia viral específica, que se pueden utilizar para detectar variantes novedosas de esta familia viral. PCR basado en imprimación aleatoria es una técnica que amplifica aleatoriamente todos los ácidos nucleicos presentes en las muestras, después de lo cual los productos PCR resultantes se pueden clonar y secuenciar. SISPA y VIDISCA son técnicas de descubrimiento de virus que se basan en la digestión con enzimas de restricción, después de lo cual se pueden ligar adaptadores. Estos métodos han tenido éxito en el descubrimiento de virus nuevos, pero hay algunas limitaciones. Los imprimaciones universales son útiles para descubrir virus nuevos de una familia elegida, pero los imprimadores, basados en nuestros conocimientos actuales de la familia viral, pueden no caber en todas las variantes desconocidas. La desventaja de la PCR, SISPA y VIDISCA al azar es que el virus debe estar presente en una alta concentración, mientras que el ADN y/o ARN de fondo del huésped deben ser mínimos y preferiblemente no complejos. En los últimos años, las técnicas de amplificación independientes de secuencias mejoraron considerablemente mediante el acoplamiento de estas técnicas a plataformas de secuenciación de próxima generación y, como resultado, se han descrito varios virus nuevos en casos de gastroenteritis, como el cosavirus [45], el virus Saffold [46], el virus klasse/salivirus [47], el poliomavirus [49], el bufavirus [50], el tusavirus [51] y el recovirus [52]. Aunque estos virus se encuentran en individuos con diarrea, para la mayoría de ellos el grado de circulación (prevalencia) y la capacidad de causar enfermedades morbosas (patogénesis) queda por determinar, como se describe a continuación (véase también la Tabla 1). Sólo se encuentra en baja prevalencia; **: Sólo se dispone de datos limitados sobre este virus; ***: Se observaron anticuerpos contra el HMO-C del astrovirus, mientras que no se encontraron anticuerpos contra el HMO-A del astrovirus (HMO = astrovirus de tipo humano-mink-ovina); -No se han publicado datos disponibles;•El Picobirnavirus, el tunavirus y el recovirus se identificaron en el tracto gastrointestinal después de la secuenciación de la próxima generación, pero no se dispone de información sobre la respuesta de anticuerpos o la asociación con diarrea. El primer clado consiste en los astrovirus VA-1, VA-2, VA-3, VA-4 y VA-5, que están genéticamente relacionados con los astrovirus felinos y porcinos, mientras que el segundo clado consiste en los astrovirus MLB1, MLB2 y MLB3 y forman un grupo separado [55, 57, [74] [75] [76] [77] [78]. Para estos nuevos clados queda por determinar la patogénesis ya que los virus se han identificado en pacientes con y sin diarrea, y en algunos estudios los virus se asociaron con diarrea mientras que en otros no se pudo encontrar ninguna asociación [55] [56]. Además se observó una respuesta de anticuerpos contra algunos pero no todos los tipos nuevos de astrovirus [54, 58]. Recientemente, también se ha detectado astrovirus MLB2 en el plasma sanguíneo de un niño febril [79] y astrovirus VA1 en una muestra de biopsia de corteza frontal de un paciente con encefalitis [80], lo que sugiere que la infección por astrovirus puede no limitarse al tracto gastrointestinal. En 2008, se observó el virus Saffold en una muestra de heces de un paciente pediátrico con fiebre de origen desconocido [46]. Aunque el virus Saffold tipo 3 fue cultivado en una línea celular epitelial del carcinoma cervical humano (HeLa), se observaron efectos citopáticos y se encontraron anticuerpos neutralizantes en muestras séricas [59], estudios de casos y controles posteriores mostraron que el virus no estaba significativamente asociado con diarrea [53, 60, 61]. Además, en 2008 se identificó el virus cosavirus en un paciente con diarrea [45]. Sin embargo, un estudio de caso-control mostró que este virus también fue detectado en una cantidad sustancial de individuos sin diarrea y no está asociado con diarrea [32, 62, 63]. El virus Klasse/salivirus fue identificado en 2009 en dos muestras fecales de lactantes con trastornos gastrointestinales [47, 48]. En dos estudios la detección de este virus fue asociada con diarrea [48, 53], mientras que en otro estudio no se encontró asociación con enfermedad [65]. Se obtuvo evidencia serológica de infección por klassevirus humano, sugiriendo que el virus infecta células humanas [64]. Con el uso de técnicas de secuenciación de próxima generación, también se identificaron tres poliomavirus nuevos en muestras fecales humanas. El poliomavirus MW se identificó en las heces de un niño sano de Malawi en 2012 [49], y en el mismo año se encontró poliomavirus MX en muestras de heces de pacientes con y sin diarrea de México, Estados Unidos y Chili [68]. Un año después, se encontró poliomavirus STL en las heces de un niño sano de Malawi [71]. Se observó una respuesta de anticuerpos contra el poliomavirus MX [66] y el poliomavirus MW [69], aunque el poliomavirus MW [67] y el poliomavirus STL [70] no se asociaron significativamente con diarrea en dos estudios independientes de control de casos. El bufavirus es miembro del Parvoviridae y fue descrito por primera vez en 2012 [50]. Dos casos de control en Tailandia y Turquía mostraron que el virus sólo se encontró en pacientes con diarrea y no en controles [72, 73] ; sin embargo, debido a la baja prevalencia (respectivamente 0,3% en Tailandia y 1,4% en Turquía), no se encontró ninguna asociación significativa con la enfermedad. Tusavirus, otro miembro recientemente descrito de los Parvoviridae, fue identificado en las heces de un niño de Túnez con diarrea inexplicable [51], y hasta ahora este es el único estudio que describe este virus. Recovirus es un miembro nuevo de los Caliciviridae y se encontró en muestras de diarrea de Bangladesh [52]. Al igual que el tunavirus, este es el único estudio que describe este virus hasta ahora. La identificación de los virus nuevos mencionados sin duda aumentó nuestros conocimientos sobre virus que se pueden encontrar en el tracto gastrointestinal de los humanos, sin embargo se desconoce cuántos de estos virus nuevos son realmente enteropatógenos. Las heces humanas contienen una amplia variedad de virus que se pueden derivar de diferentes hospedadores: Además de los virus humanos genuinos, los virus alimentarios vegetales [32,81] y los virus alimentarios animales [82] también se pueden encontrar en las heces humanas, así como bacteriófagos y virus que infectan a los protozoos [32]. Incluso los virus derivados de otras partes del cuerpo se pueden encontrar en muestras fecales, como el virus del polioma de John Cunningham originario del riñón que termina en heces a través de orina [83], y los rinovirus [84], bocavirus [85] y coronavirus [86] procedentes del tracto respiratorio y probablemente ingeridos. Además, los virus que infectan células sanguíneas como el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1 también se pueden detectar en muestras fecales [87]. Por lo tanto, una vez identificado un virus nuevo en muestras de heces humanas, no se indica que este virus se esté replicando en células intestinales humanas. Koch reconoció ya en 1891 que asociar la presencia de un determinado agente con una determinada enfermedad es complejo, y por lo tanto postula directrices que deben seguirse antes de que un agente pueda ser clasificado como patógeno [88]. Sus postulados pueden resumirse en tres puntos: (1) El microbio ocurre en cada caso de la enfermedad en cuestión y en circunstancias que pueden explicar los cambios patológicos y el curso clínico de la enfermedad; (2) el microbio no ocurre en ninguna otra enfermedad como un parásito fortuito y no patogénico; y (3), después de estar completamente aislado del cuerpo y crecido repetidamente en cultivo puro, el microbio puede inducir la enfermedad de nuevo. Si un microbio ha cumplido estos tres postulados, puede afirmarse que "la aparición del microbio en la enfermedad ya no puede ser accidental, pero en este caso no se puede considerar ninguna otra relación entre ella y la enfermedad, excepto que el microbio es la causa de la enfermedad". Sin embargo, para los virus entéricos, estos postulados no son aplicables. Primero, los virus entéricos no se cultivan fácilmente [89] [90] [91], y, segundo, se ha descrito la vaina prolongada de agentes virales e infección asintomática [92], revisado en la literatura [93]. Aunque se han hecho intentos de ajustar los postulados de Koch específicamente para virus y las metodologías actuales implementadas [94] [95] [96], el cumplimiento de estos postulados todavía no es factible en la mayoría de las ocasiones debido a la falta de un sistema eficiente de cultivo celular, dificultades en la síntesis de antígenos y altos niveles de diversidad genética viral dentro de los grupos virales, revisados en la literatura [97]. Se han hecho varios enfoques para desarrollar una metodología que añade mayor importancia al descubrimiento de un nuevo virus.Un enfoque se basa en el enriquecimiento de virus inmunogénicos antes de la secuenciación de la próxima generación mediante el uso de la captura autóloga de anticuerpos antes de la secuenciación.Este método fue probado y validado en varias muestras fecales que contienen adenovirus, sapovirus y norovirus, y ha demostrado enriquecer virus inmunogénicos, mientras que los virus vegetales y bacteriófagos no se Otro método para enriquecer a los virus relevantes antes de la secuenciación de la próxima generación es la llamada plataforma de secuenciación de captura del viroma para los virus vertebrados (VirCapSeq-VERT) que utiliza ~2 millones de sondas que cubren los genomas de todos los miembros de los taxones virales conocidos por infectar vertebrados [99]. Sin embargo, ambos métodos tienen limitaciones: Para el método de captura de anticuerpos, los virus necesitan estar presentes en cargas virales altas, y la sangre, suero o plasma convalecientes necesita estar disponible. Una desventaja de la técnica VirCapSeq-VERT es que no se identificarán virus completamente nuevos, por ejemplo, virus de una nueva familia de virus. El método más sencillo para demostrar la asociación con la enfermedad es el uso de estudios de casos y controles. Además, mientras que en los últimos años se han realizado estudios de casos y controles utilizando PCR convencionales en tiempo real (RT-PCR), en el futuro se pueden utilizar técnicas de secuenciación independientes de próxima generación para tales estudios de casos y controles. Dado que permite la detección de prácticamente todos los ácidos nucleicos, la secuenciación de la próxima generación tiene varias ventajas en comparación con los RT-PCR específicos. La secuenciación de la próxima generación impide la necesidad de realizar numerosos RT-PCR para detectar todos los virus que se sospecha que están asociados con la enfermedad, y se pueden detectar nuevas variantes de familias virales conocidas actualmente o nuevas especies de virus que pueden ser especialmente beneficiosas si sólo se dispone de unos pocos genomas de referencia. El principal beneficio de esta base de datos es que en el futuro inmediato la pregunta más importante puede ser respondida si se identifica un virus nuevo en casos de diarrea: ¿es probable que el virus cause enfermedad? En conclusión, la Es de esperar que en un futuro próximo se describan varios virus nuevos, ya que la detección de estos agentes utilizando las actuales tecnologías de secuencia de la próxima generación ya no es una dificultad. Por lo tanto, añadir relevancia al descubrimiento de virus nuevos debería ser el objetivo principal para futuros estudios.

¿Cuántas muertes cada año son causadas por gastroenteritis?

Virus que causan gastroenteritis: lo conocido, lo nuevo y los más alláhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4776197/SHA: f7b30ee89775bc82607cc6bc87feb5934b47625fAutores: Oude Munnink, Bas B.; van der Hoek, LiaFecha: 2016-02-19DOI: 10.3390/v8020042Licencia: cc-byAbstract: La lista de virus gastrointestinales recientemente descubiertos se está expandiendo rápidamente. Si estos agentes están realmente involucrados en una enfermedad como la diarrea es la pregunta esencial, pero difícil de responder. En esta revisión se presenta un resumen de todos los virus encontrados en la diarrea, junto con el conocimiento actual sobre su conexión con la enfermedad. Texto: El tracto gastrointestinal es un órgano vulnerable para las infecciones ya que hay contacto constante con el exterior, principalmente por vía oral. La inflamación del estómago y los intestinos (gastroenteritis) puede causar náuseas, vómitos y diarrea. La gastroenteritis es responsable de dos a tres millones de muertes cada año, por lo que es una de las causas más comunes de mortalidad [1]. Principalmente los niños en los países en desarrollo, pero también los individuos inmunocomprometidos en los países desarrollados, sufren de diarrea. Mientras que las infecciones gastrointestinales bacterianas y parasitarias están disminuyendo como resultado de la eliminación adecuada de aguas residuales y agua potable, la gastroenteritis viral no está disminuyendo en los países en desarrollo [2]. En el mundo desarrollado, los virus ya son los patógenos más comunes que causan diarrea [3]. Aunque los virus que infectan a los seres humanos ya habían sido descritos desde 1901 [4] y se sospechaba que los virus desempeñaban un papel en la diarrea, duró hasta 1972, cuando se identificó el primer virus causante de gastroenteritis (norovirus) en un brote de diarrea en Norwalk (California, Estados Unidos) [5]. Poco después del descubrimiento de norovirus se descubrieron varios otros virus causantes de gastroenteritis: rotavirus en células epiteliales de niños con gastroenteritis [6], astrovirus en casos de diarrea infantil [7], adenovirus entéricos en las heces de niños con diarrea aguda [8], y sapovirus durante un brote de gastroenteritis en un orfanato de Sapporo, Japón [9]. Todos estos virus se propagan a través de la vía fecal-oral a través de la transmisión de persona a persona y Los norovirus forman parte de la familia Caliciviridae y los brotes de gastroenteritis por norovirus han sido reportados en cruceros, centros de salud, escuelas y militares, pero el norovirus también es responsable de alrededor del 60% de todos los casos de diarrea esporádica (casos de diarrea en los que se pudo encontrar un enteropatógeno), revisados en la literatura [10, 11]. La patogénesis de la infección por norovirus ha sido probada in vivo. El norovirus filtrado fue administrado a voluntarios sanos después de lo cual la mayoría de ellos desarrollaron diarrea [12]. La cultivo del virus, sin embargo, ha sido un problema desde su descubrimiento, sin embargo, un estudio ha descrito recientemente el cultivo de norovirus en células B, y ha revelado que los cofactores, como el antígeno histosangre que expresa bacterias entéricas, son probablemente necesarios antes de que los virus entéricos Los sapovirus también son miembros de los Caliciviridae. Hay cinco genogrupos humanos de sapovirus descritos [14] que representan el 2,2%-12,7% de todos los casos de gastroenteritis en todo el mundo [14, 15]. Los brotes de sapovirus ocurren a lo largo del año y pueden transmitirse a través de alimentos [16]. Para los sapovirus se ha descrito que el virus no se encontró antes del inicio de un brote, y que se encontró en el 95% de los pacientes durante un brote, mientras que disminuyó al 50% después de un brote, lo que indica que el virus introduce enfermedad en un huésped naturalmente infectado [17]. La infección por rotavirus es la causa más común de gastroenteritis viral entre los niños; sin embargo, los padres de niños infectados también se enferman a menudo y como resultado el rotavirus es la segunda causa más común de gastroenteritis Los estudios en voluntarios humanos han demostrado que la infección por rotavirus causa diarrea, resulta en el desprendimiento del virus y un aumento en el título antivirus de anticuerpos después de la infección [19]. Además, las infecciones por astrovirus son comunes, representando alrededor del 10% de todos los casos de diarrea esporádica [20]. Astrovirus ha sido aislado de personas enfermas, filtrado y administrado a individuos sanos después de lo cual en algunos voluntarios se observó enfermedad diarreica y se derramó astrovirus en sus heces [21]. El virus puede replicarse en células renales embrionarias humanas y fue detectado por microscopía electrónica (EM) [21]. Los adenovirus son responsables de alrededor del 1,5%-5,4% de los casos de diarrea en niños menores de 2 años, revisados en la literatura [22]. De los 57 tipos de adenovirus identificados [ Junto a estos dos tipos, el adenovirus tipo 52 también puede causar gastroenteritis [25], aunque se ha argumentado si el tipo 52 es en realidad un tipo separado ya que no hay suficiente distancia al adenovirus tipo 41 [26]. Los adenovirus generalmente se pueden propagar en líneas celulares; sin embargo, el adenovirus entérico 40/41 es difícil de cultivar, revisado en la literatura [27]. En los años 80 y 1990 se identificaron algunos agentes virales para los cuales la asociación directa con la enfermedad es menos clara. Los virus Aichi son miembros de los Picornaviridae identificados en muestras fecales de pacientes con gastroenteritis [28]. Desde su descubrimiento, se realizaron dos estudios de casos y controles, pero aunque ambos estudios sólo encontraron virus Aichi en heces de pacientes diarreicos, la prevalencia del virus Aichi (0,5% y 1,8%) fue demasiado baja para encontrar una asociación significativa con la diarrea [30, 31]. En los pacientes inmunocomprometidos el virus se encuentra en mayores cantidades y no está asociado con diarrea [32]. Los torovirus, parte de los Coronaviridae, se identificaron por primera vez en 1984 en heces de niños y adultos con gastroenteritis [33]. La infección por Torovirus se asocia con diarrea [34] y se observa con más frecuencia en pacientes inmunocomprometidos y en individuos nosocomiales infectados [34]. El análisis retrospectivo de la gastroenteritis viral nosocomial en un hospital pediátrico reveló que en el 67% de los casos se podía detectar el torovirus [35]. Sin embargo, sólo un número limitado de estudios reportan la detección de torovirus y por lo tanto la verdadera patogénesis y prevalencia de este virus sigue siendo elusiva. Picobirnavirus pertenecen a los Picobirnaviridae y fueron detectados por primera vez en las heces de niños con gastroenteritis [36]. Desde el descubrimiento inicial, el virus se ha detectado en muestras fecales de varias especies animales, y se ha demostrado que los virus son genéticamente muy diversos sin una clara agrupación de especies, revisado en la literatura [37]. Esta alta diversidad secuencial también se ha observado dentro de brotes particulares de gastroenteritis [38, 39], limitando la probabilidad de que los picobirnavirus estén causando brotes en realidad, ya que no se puede identificar ninguna fuente única de infección. En 1907 se desarrolló el primer sistema de cultivo tisular que fue considerado como el estándar de oro para la detección de virus durante En la década de 1930 se introdujeron la serología y la microscopía electrónica que impulsaron el descubrimiento de nuevos virus. Durante estos años, estos métodos se desarrollaron fructíferamente pero los virus que infectaban el tracto gastrointestinal fueron especialmente difíciles de cultivar. A lo largo de las últimas décadas, se han desarrollado varias técnicas basadas en el ADN para el descubrimiento de virus que impulsaron la identificación de virus nuevos en muestras de heces. Los cuatro métodos más utilizados son: 1. Imprimación universal-PCR [41] ; 2. PCR basado en la primografía aleatoria [42] ; 3. Descubrimiento de virus cDNA, Polimorfismo de longitud del fragmento amplificado (VIDISCA) [43] ; y 4. Amplificación de primer único independiente de secuencia (SISPA) [44]. Primer-PCR universal es una técnica de descubrimiento de virus que utiliza imprimaciones universales diseñadas sobre partes conservadas de una familia viral específica, que se pueden utilizar para detectar variantes novedosas de esta familia viral. PCR basado en imprimación aleatoria es una técnica que amplifica aleatoriamente todos los ácidos nucleicos presentes en las muestras, después de lo cual los productos PCR resultantes se pueden clonar y secuenciar. SISPA y VIDISCA son técnicas de descubrimiento de virus que se basan en la digestión con enzimas de restricción, después de lo cual se pueden ligar adaptadores. Estos métodos han tenido éxito en el descubrimiento de virus nuevos, pero hay algunas limitaciones. Los imprimaciones universales son útiles para descubrir virus nuevos de una familia elegida, pero los imprimadores, basados en nuestros conocimientos actuales de la familia viral, pueden no caber en todas las variantes desconocidas. La desventaja de la PCR, SISPA y VIDISCA al azar es que el virus debe estar presente en una alta concentración, mientras que el ADN y/o ARN de fondo del huésped deben ser mínimos y preferiblemente no complejos. En los últimos años, las técnicas de amplificación independientes de secuencias mejoraron considerablemente mediante el acoplamiento de estas técnicas a plataformas de secuenciación de próxima generación y, como resultado, se han descrito varios virus nuevos en casos de gastroenteritis, como el cosavirus [45], el virus Saffold [46], el virus klasse/salivirus [47], el poliomavirus [49], el bufavirus [50], el tusavirus [51] y el recovirus [52]. Aunque estos virus se encuentran en individuos con diarrea, para la mayoría de ellos el grado de circulación (prevalencia) y la capacidad de causar enfermedades morbosas (patogénesis) queda por determinar, como se describe a continuación (véase también la Tabla 1). Sólo se encuentra en baja prevalencia; **: Sólo se dispone de datos limitados sobre este virus; ***: Se observaron anticuerpos contra el HMO-C del astrovirus, mientras que no se encontraron anticuerpos contra el HMO-A del astrovirus (HMO = astrovirus de tipo humano-mink-ovina); -No se han publicado datos disponibles;•El Picobirnavirus, el tunavirus y el recovirus se identificaron en el tracto gastrointestinal después de la secuenciación de la próxima generación, pero no se dispone de información sobre la respuesta de anticuerpos o la asociación con diarrea. El primer clado consiste en los astrovirus VA-1, VA-2, VA-3, VA-4 y VA-5, que están genéticamente relacionados con los astrovirus felinos y porcinos, mientras que el segundo clado consiste en los astrovirus MLB1, MLB2 y MLB3 y forman un grupo separado [55, 57, [74] [75] [76] [77] [78]. Para estos nuevos clados queda por determinar la patogénesis ya que los virus se han identificado en pacientes con y sin diarrea, y en algunos estudios los virus se asociaron con diarrea mientras que en otros no se pudo encontrar ninguna asociación [55] [56]. Además se observó una respuesta de anticuerpos contra algunos pero no todos los tipos nuevos de astrovirus [54, 58]. Recientemente, también se ha detectado astrovirus MLB2 en el plasma sanguíneo de un niño febril [79] y astrovirus VA1 en una muestra de biopsia de corteza frontal de un paciente con encefalitis [80], lo que sugiere que la infección por astrovirus puede no limitarse al tracto gastrointestinal. En 2008, se observó el virus Saffold en una muestra de heces de un paciente pediátrico con fiebre de origen desconocido [46]. Aunque el virus Saffold tipo 3 fue cultivado en una línea celular epitelial del carcinoma cervical humano (HeLa), se observaron efectos citopáticos y se encontraron anticuerpos neutralizantes en muestras séricas [59], estudios de casos y controles posteriores mostraron que el virus no estaba significativamente asociado con diarrea [53, 60, 61]. Además, en 2008 se identificó el virus cosavirus en un paciente con diarrea [45]. Sin embargo, un estudio de caso-control mostró que este virus también fue detectado en una cantidad sustancial de individuos sin diarrea y no está asociado con diarrea [32, 62, 63]. El virus Klasse/salivirus fue identificado en 2009 en dos muestras fecales de lactantes con trastornos gastrointestinales [47, 48]. En dos estudios la detección de este virus fue asociada con diarrea [48, 53], mientras que en otro estudio no se encontró asociación con enfermedad [65]. Se obtuvo evidencia serológica de infección por klassevirus humano, sugiriendo que el virus infecta células humanas [64]. Con el uso de técnicas de secuenciación de próxima generación, también se identificaron tres poliomavirus nuevos en muestras fecales humanas. El poliomavirus MW se identificó en las heces de un niño sano de Malawi en 2012 [49], y en el mismo año se encontró poliomavirus MX en muestras de heces de pacientes con y sin diarrea de México, Estados Unidos y Chili [68]. Un año después, se encontró poliomavirus STL en las heces de un niño sano de Malawi [71]. Se observó una respuesta de anticuerpos contra el poliomavirus MX [66] y el poliomavirus MW [69], aunque el poliomavirus MW [67] y el poliomavirus STL [70] no se asociaron significativamente con diarrea en dos estudios independientes de control de casos. El bufavirus es miembro del Parvoviridae y fue descrito por primera vez en 2012 [50]. Dos casos de control en Tailandia y Turquía mostraron que el virus sólo se encontró en pacientes con diarrea y no en controles [72, 73] ; sin embargo, debido a la baja prevalencia (respectivamente 0,3% en Tailandia y 1,4% en Turquía), no se encontró ninguna asociación significativa con la enfermedad. Tusavirus, otro miembro recientemente descrito de los Parvoviridae, fue identificado en las heces de un niño de Túnez con diarrea inexplicable [51], y hasta ahora este es el único estudio que describe este virus. Recovirus es un miembro nuevo de los Caliciviridae y se encontró en muestras de diarrea de Bangladesh [52]. Al igual que el tunavirus, este es el único estudio que describe este virus hasta ahora. La identificación de los virus nuevos mencionados sin duda aumentó nuestros conocimientos sobre virus que se pueden encontrar en el tracto gastrointestinal de los humanos, sin embargo se desconoce cuántos de estos virus nuevos son realmente enteropatógenos. Las heces humanas contienen una amplia variedad de virus que se pueden derivar de diferentes hospedadores: Además de los virus humanos genuinos, los virus alimentarios vegetales [32,81] y los virus alimentarios animales [82] también se pueden encontrar en las heces humanas, así como bacteriófagos y virus que infectan a los protozoos [32]. Incluso los virus derivados de otras partes del cuerpo se pueden encontrar en muestras fecales, como el virus del polioma de John Cunningham originario del riñón que termina en heces a través de orina [83], y los rinovirus [84], bocavirus [85] y coronavirus [86] procedentes del tracto respiratorio y probablemente ingeridos. Además, los virus que infectan células sanguíneas como el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1 también se pueden detectar en muestras fecales [87]. Por lo tanto, una vez identificado un virus nuevo en muestras de heces humanas, no se indica que este virus se esté replicando en células intestinales humanas. Koch reconoció ya en 1891 que asociar la presencia de un determinado agente con una determinada enfermedad es complejo, y por lo tanto postula directrices que deben seguirse antes de que un agente pueda ser clasificado como patógeno [88]. Sus postulados pueden resumirse en tres puntos: (1) El microbio ocurre en cada caso de la enfermedad en cuestión y en circunstancias que pueden explicar los cambios patológicos y el curso clínico de la enfermedad; (2) el microbio no ocurre en ninguna otra enfermedad como un parásito fortuito y no patogénico; y (3), después de estar completamente aislado del cuerpo y crecido repetidamente en cultivo puro, el microbio puede inducir la enfermedad de nuevo. Si un microbio ha cumplido estos tres postulados, puede afirmarse que "la aparición del microbio en la enfermedad ya no puede ser accidental, pero en este caso no se puede considerar ninguna otra relación entre ella y la enfermedad, excepto que el microbio es la causa de la enfermedad". Sin embargo, para los virus entéricos, estos postulados no son aplicables. Primero, los virus entéricos no se cultivan fácilmente [89] [90] [91], y, segundo, se ha descrito la vaina prolongada de agentes virales e infección asintomática [92], revisado en la literatura [93]. Aunque se han hecho intentos de ajustar los postulados de Koch específicamente para virus y las metodologías actuales implementadas [94] [95] [96], el cumplimiento de estos postulados todavía no es factible en la mayoría de las ocasiones debido a la falta de un sistema eficiente de cultivo celular, dificultades en la síntesis de antígenos y altos niveles de diversidad genética viral dentro de los grupos virales, revisados en la literatura [97]. Se han hecho varios enfoques para desarrollar una metodología que añade mayor importancia al descubrimiento de un nuevo virus.Un enfoque se basa en el enriquecimiento de virus inmunogénicos antes de la secuenciación de la próxima generación mediante el uso de la captura autóloga de anticuerpos antes de la secuenciación.Este método fue probado y validado en varias muestras fecales que contienen adenovirus, sapovirus y norovirus, y ha demostrado enriquecer virus inmunogénicos, mientras que los virus vegetales y bacteriófagos no se Otro método para enriquecer a los virus relevantes antes de la secuenciación de la próxima generación es la llamada plataforma de secuenciación de captura del viroma para los virus vertebrados (VirCapSeq-VERT) que utiliza ~2 millones de sondas que cubren los genomas de todos los miembros de los taxones virales conocidos por infectar vertebrados [99]. Sin embargo, ambos métodos tienen limitaciones: Para el método de captura de anticuerpos, los virus necesitan estar presentes en cargas virales altas, y la sangre, suero o plasma convalecientes necesita estar disponible. Una desventaja de la técnica VirCapSeq-VERT es que no se identificarán virus completamente nuevos, por ejemplo, virus de una nueva familia de virus. El método más sencillo para demostrar la asociación con la enfermedad es el uso de estudios de casos y controles. Además, mientras que en los últimos años se han realizado estudios de casos y controles utilizando PCR convencionales en tiempo real (RT-PCR), en el futuro se pueden utilizar técnicas de secuenciación independientes de próxima generación para tales estudios de casos y controles. Dado que permite la detección de prácticamente todos los ácidos nucleicos, la secuenciación de la próxima generación tiene varias ventajas en comparación con los RT-PCR específicos. La secuenciación de la próxima generación impide la necesidad de realizar numerosos RT-PCR para detectar todos los virus que se sospecha que están asociados con la enfermedad, y se pueden detectar nuevas variantes de familias virales conocidas actualmente o nuevas especies de virus que pueden ser especialmente beneficiosas si sólo se dispone de unos pocos genomas de referencia. El principal beneficio de esta base de datos es que en el futuro inmediato la pregunta más importante puede ser respondida si se identifica un virus nuevo en casos de diarrea: ¿es probable que el virus cause enfermedad? En conclusión, la Es de esperar que en un futuro próximo se describan varios virus nuevos, ya que la detección de estos agentes utilizando las actuales tecnologías de secuencia de la próxima generación ya no es una dificultad. Por lo tanto, añadir relevancia al descubrimiento de virus nuevos debería ser el objetivo principal para futuros estudios.

¿Qué porcentaje de diarrea esporádica es causada por norovirus?

Virus que causan gastroenteritis: lo conocido, lo nuevo y los más alláhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4776197/SHA: f7b30ee89775bc82607cc6bc87feb5934b47625fAutores: Oude Munnink, Bas B.; van der Hoek, LiaFecha: 2016-02-19DOI: 10.3390/v8020042Licencia: cc-byAbstract: La lista de virus gastrointestinales recientemente descubiertos se está expandiendo rápidamente. Si estos agentes están realmente involucrados en una enfermedad como la diarrea es la pregunta esencial, pero difícil de responder. En esta revisión se presenta un resumen de todos los virus encontrados en la diarrea, junto con el conocimiento actual sobre su conexión con la enfermedad. Texto: El tracto gastrointestinal es un órgano vulnerable para las infecciones ya que hay contacto constante con el exterior, principalmente por vía oral. La inflamación del estómago y los intestinos (gastroenteritis) puede causar náuseas, vómitos y diarrea. La gastroenteritis es responsable de dos a tres millones de muertes cada año, por lo que es una de las causas más comunes de mortalidad [1]. Principalmente los niños en los países en desarrollo, pero también los individuos inmunocomprometidos en los países desarrollados, sufren de diarrea. Mientras que las infecciones gastrointestinales bacterianas y parasitarias están disminuyendo como resultado de la eliminación adecuada de aguas residuales y agua potable, la gastroenteritis viral no está disminuyendo en los países en desarrollo [2]. En el mundo desarrollado, los virus ya son los patógenos más comunes que causan diarrea [3]. Aunque los virus que infectan a los seres humanos ya habían sido descritos desde 1901 [4] y se sospechaba que los virus desempeñaban un papel en la diarrea, duró hasta 1972, cuando se identificó el primer virus causante de gastroenteritis (norovirus) en un brote de diarrea en Norwalk (California, Estados Unidos) [5]. Poco después del descubrimiento de norovirus se descubrieron varios otros virus causantes de gastroenteritis: rotavirus en células epiteliales de niños con gastroenteritis [6], astrovirus en casos de diarrea infantil [7], adenovirus entéricos en las heces de niños con diarrea aguda [8], y sapovirus durante un brote de gastroenteritis en un orfanato de Sapporo, Japón [9]. Todos estos virus se propagan a través de la vía fecal-oral a través de la transmisión de persona a persona y Los norovirus forman parte de la familia Caliciviridae y los brotes de gastroenteritis por norovirus han sido reportados en cruceros, centros de salud, escuelas y militares, pero el norovirus también es responsable de alrededor del 60% de todos los casos de diarrea esporádica (casos de diarrea en los que se pudo encontrar un enteropatógeno), revisados en la literatura [10, 11]. La patogénesis de la infección por norovirus ha sido probada in vivo. El norovirus filtrado fue administrado a voluntarios sanos después de lo cual la mayoría de ellos desarrollaron diarrea [12]. La cultivo del virus, sin embargo, ha sido un problema desde su descubrimiento, sin embargo, un estudio ha descrito recientemente el cultivo de norovirus en células B, y ha revelado que los cofactores, como el antígeno histosangre que expresa bacterias entéricas, son probablemente necesarios antes de que los virus entéricos Los sapovirus también son miembros de los Caliciviridae. Hay cinco genogrupos humanos de sapovirus descritos [14] que representan el 2,2%-12,7% de todos los casos de gastroenteritis en todo el mundo [14, 15]. Los brotes de sapovirus ocurren a lo largo del año y pueden transmitirse a través de alimentos [16]. Para los sapovirus se ha descrito que el virus no se encontró antes del inicio de un brote, y que se encontró en el 95% de los pacientes durante un brote, mientras que disminuyó al 50% después de un brote, lo que indica que el virus introduce enfermedad en un huésped naturalmente infectado [17]. La infección por rotavirus es la causa más común de gastroenteritis viral entre los niños; sin embargo, los padres de niños infectados también se enferman a menudo y como resultado el rotavirus es la segunda causa más común de gastroenteritis Los estudios en voluntarios humanos han demostrado que la infección por rotavirus causa diarrea, resulta en el desprendimiento del virus y un aumento en el título antivirus de anticuerpos después de la infección [19]. Además, las infecciones por astrovirus son comunes, representando alrededor del 10% de todos los casos de diarrea esporádica [20]. Astrovirus ha sido aislado de personas enfermas, filtrado y administrado a individuos sanos después de lo cual en algunos voluntarios se observó enfermedad diarreica y se derramó astrovirus en sus heces [21]. El virus puede replicarse en células renales embrionarias humanas y fue detectado por microscopía electrónica (EM) [21]. Los adenovirus son responsables de alrededor del 1,5%-5,4% de los casos de diarrea en niños menores de 2 años, revisados en la literatura [22]. De los 57 tipos de adenovirus identificados [ Junto a estos dos tipos, el adenovirus tipo 52 también puede causar gastroenteritis [25], aunque se ha argumentado si el tipo 52 es en realidad un tipo separado ya que no hay suficiente distancia al adenovirus tipo 41 [26]. Los adenovirus generalmente se pueden propagar en líneas celulares; sin embargo, el adenovirus entérico 40/41 es difícil de cultivar, revisado en la literatura [27]. En los años 80 y 1990 se identificaron algunos agentes virales para los cuales la asociación directa con la enfermedad es menos clara. Los virus Aichi son miembros de los Picornaviridae identificados en muestras fecales de pacientes con gastroenteritis [28]. Desde su descubrimiento, se realizaron dos estudios de casos y controles, pero aunque ambos estudios sólo encontraron virus Aichi en heces de pacientes diarreicos, la prevalencia del virus Aichi (0,5% y 1,8%) fue demasiado baja para encontrar una asociación significativa con la diarrea [30, 31]. En los pacientes inmunocomprometidos el virus se encuentra en mayores cantidades y no está asociado con diarrea [32]. Los torovirus, parte de los Coronaviridae, se identificaron por primera vez en 1984 en heces de niños y adultos con gastroenteritis [33]. La infección por Torovirus se asocia con diarrea [34] y se observa con más frecuencia en pacientes inmunocomprometidos y en individuos nosocomiales infectados [34]. El análisis retrospectivo de la gastroenteritis viral nosocomial en un hospital pediátrico reveló que en el 67% de los casos se podía detectar el torovirus [35]. Sin embargo, sólo un número limitado de estudios reportan la detección de torovirus y por lo tanto la verdadera patogénesis y prevalencia de este virus sigue siendo elusiva. Picobirnavirus pertenecen a los Picobirnaviridae y fueron detectados por primera vez en las heces de niños con gastroenteritis [36]. Desde el descubrimiento inicial, el virus se ha detectado en muestras fecales de varias especies animales, y se ha demostrado que los virus son genéticamente muy diversos sin una clara agrupación de especies, revisado en la literatura [37]. Esta alta diversidad secuencial también se ha observado dentro de brotes particulares de gastroenteritis [38, 39], limitando la probabilidad de que los picobirnavirus estén causando brotes en realidad, ya que no se puede identificar ninguna fuente única de infección. En 1907 se desarrolló el primer sistema de cultivo tisular que fue considerado como el estándar de oro para la detección de virus durante En la década de 1930 se introdujeron la serología y la microscopía electrónica que impulsaron el descubrimiento de nuevos virus. Durante estos años, estos métodos se desarrollaron fructíferamente pero los virus que infectaban el tracto gastrointestinal fueron especialmente difíciles de cultivar. A lo largo de las últimas décadas, se han desarrollado varias técnicas basadas en el ADN para el descubrimiento de virus que impulsaron la identificación de virus nuevos en muestras de heces. Los cuatro métodos más utilizados son: 1. Imprimación universal-PCR [41] ; 2. PCR basado en la primografía aleatoria [42] ; 3. Descubrimiento de virus cDNA, Polimorfismo de longitud del fragmento amplificado (VIDISCA) [43] ; y 4. Amplificación de primer único independiente de secuencia (SISPA) [44]. Primer-PCR universal es una técnica de descubrimiento de virus que utiliza imprimaciones universales diseñadas sobre partes conservadas de una familia viral específica, que se pueden utilizar para detectar variantes novedosas de esta familia viral. PCR basado en imprimación aleatoria es una técnica que amplifica aleatoriamente todos los ácidos nucleicos presentes en las muestras, después de lo cual los productos PCR resultantes se pueden clonar y secuenciar. SISPA y VIDISCA son técnicas de descubrimiento de virus que se basan en la digestión con enzimas de restricción, después de lo cual se pueden ligar adaptadores. Estos métodos han tenido éxito en el descubrimiento de virus nuevos, pero hay algunas limitaciones. Los imprimaciones universales son útiles para descubrir virus nuevos de una familia elegida, pero los imprimadores, basados en nuestros conocimientos actuales de la familia viral, pueden no caber en todas las variantes desconocidas. La desventaja de la PCR, SISPA y VIDISCA al azar es que el virus debe estar presente en una alta concentración, mientras que el ADN y/o ARN de fondo del huésped deben ser mínimos y preferiblemente no complejos. En los últimos años, las técnicas de amplificación independientes de secuencias mejoraron considerablemente mediante el acoplamiento de estas técnicas a plataformas de secuenciación de próxima generación y, como resultado, se han descrito varios virus nuevos en casos de gastroenteritis, como el cosavirus [45], el virus Saffold [46], el virus klasse/salivirus [47], el poliomavirus [49], el bufavirus [50], el tusavirus [51] y el recovirus [52]. Aunque estos virus se encuentran en individuos con diarrea, para la mayoría de ellos el grado de circulación (prevalencia) y la capacidad de causar enfermedades morbosas (patogénesis) queda por determinar, como se describe a continuación (véase también la Tabla 1). Sólo se encuentra en baja prevalencia; **: Sólo se dispone de datos limitados sobre este virus; ***: Se observaron anticuerpos contra el HMO-C del astrovirus, mientras que no se encontraron anticuerpos contra el HMO-A del astrovirus (HMO = astrovirus de tipo humano-mink-ovina); -No se han publicado datos disponibles;•El Picobirnavirus, el tunavirus y el recovirus se identificaron en el tracto gastrointestinal después de la secuenciación de la próxima generación, pero no se dispone de información sobre la respuesta de anticuerpos o la asociación con diarrea. El primer clado consiste en los astrovirus VA-1, VA-2, VA-3, VA-4 y VA-5, que están genéticamente relacionados con los astrovirus felinos y porcinos, mientras que el segundo clado consiste en los astrovirus MLB1, MLB2 y MLB3 y forman un grupo separado [55, 57, [74] [75] [76] [77] [78]. Para estos nuevos clados queda por determinar la patogénesis ya que los virus se han identificado en pacientes con y sin diarrea, y en algunos estudios los virus se asociaron con diarrea mientras que en otros no se pudo encontrar ninguna asociación [55] [56]. Además se observó una respuesta de anticuerpos contra algunos pero no todos los tipos nuevos de astrovirus [54, 58]. Recientemente, también se ha detectado astrovirus MLB2 en el plasma sanguíneo de un niño febril [79] y astrovirus VA1 en una muestra de biopsia de corteza frontal de un paciente con encefalitis [80], lo que sugiere que la infección por astrovirus puede no limitarse al tracto gastrointestinal. En 2008, se observó el virus Saffold en una muestra de heces de un paciente pediátrico con fiebre de origen desconocido [46]. Aunque el virus Saffold tipo 3 fue cultivado en una línea celular epitelial del carcinoma cervical humano (HeLa), se observaron efectos citopáticos y se encontraron anticuerpos neutralizantes en muestras séricas [59], estudios de casos y controles posteriores mostraron que el virus no estaba significativamente asociado con diarrea [53, 60, 61]. Además, en 2008 se identificó el virus cosavirus en un paciente con diarrea [45]. Sin embargo, un estudio de caso-control mostró que este virus también fue detectado en una cantidad sustancial de individuos sin diarrea y no está asociado con diarrea [32, 62, 63]. El virus Klasse/salivirus fue identificado en 2009 en dos muestras fecales de lactantes con trastornos gastrointestinales [47, 48]. En dos estudios la detección de este virus fue asociada con diarrea [48, 53], mientras que en otro estudio no se encontró asociación con enfermedad [65]. Se obtuvo evidencia serológica de infección por klassevirus humano, sugiriendo que el virus infecta células humanas [64]. Con el uso de técnicas de secuenciación de próxima generación, también se identificaron tres poliomavirus nuevos en muestras fecales humanas. El poliomavirus MW se identificó en las heces de un niño sano de Malawi en 2012 [49], y en el mismo año se encontró poliomavirus MX en muestras de heces de pacientes con y sin diarrea de México, Estados Unidos y Chili [68]. Un año después, se encontró poliomavirus STL en las heces de un niño sano de Malawi [71]. Se observó una respuesta de anticuerpos contra el poliomavirus MX [66] y el poliomavirus MW [69], aunque el poliomavirus MW [67] y el poliomavirus STL [70] no se asociaron significativamente con diarrea en dos estudios independientes de control de casos. El bufavirus es miembro del Parvoviridae y fue descrito por primera vez en 2012 [50]. Dos casos de control en Tailandia y Turquía mostraron que el virus sólo se encontró en pacientes con diarrea y no en controles [72, 73] ; sin embargo, debido a la baja prevalencia (respectivamente 0,3% en Tailandia y 1,4% en Turquía), no se encontró ninguna asociación significativa con la enfermedad. Tusavirus, otro miembro recientemente descrito de los Parvoviridae, fue identificado en las heces de un niño de Túnez con diarrea inexplicable [51], y hasta ahora este es el único estudio que describe este virus. Recovirus es un miembro nuevo de los Caliciviridae y se encontró en muestras de diarrea de Bangladesh [52]. Al igual que el tunavirus, este es el único estudio que describe este virus hasta ahora. La identificación de los virus nuevos mencionados sin duda aumentó nuestros conocimientos sobre virus que se pueden encontrar en el tracto gastrointestinal de los humanos, sin embargo se desconoce cuántos de estos virus nuevos son realmente enteropatógenos. Las heces humanas contienen una amplia variedad de virus que se pueden derivar de diferentes hospedadores: Además de los virus humanos genuinos, los virus alimentarios vegetales [32,81] y los virus alimentarios animales [82] también se pueden encontrar en las heces humanas, así como bacteriófagos y virus que infectan a los protozoos [32]. Incluso los virus derivados de otras partes del cuerpo se pueden encontrar en muestras fecales, como el virus del polioma de John Cunningham originario del riñón que termina en heces a través de orina [83], y los rinovirus [84], bocavirus [85] y coronavirus [86] procedentes del tracto respiratorio y probablemente ingeridos. Además, los virus que infectan células sanguíneas como el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1 también se pueden detectar en muestras fecales [87]. Por lo tanto, una vez identificado un virus nuevo en muestras de heces humanas, no se indica que este virus se esté replicando en células intestinales humanas. Koch reconoció ya en 1891 que asociar la presencia de un determinado agente con una determinada enfermedad es complejo, y por lo tanto postula directrices que deben seguirse antes de que un agente pueda ser clasificado como patógeno [88]. Sus postulados pueden resumirse en tres puntos: (1) El microbio ocurre en cada caso de la enfermedad en cuestión y en circunstancias que pueden explicar los cambios patológicos y el curso clínico de la enfermedad; (2) el microbio no ocurre en ninguna otra enfermedad como un parásito fortuito y no patogénico; y (3), después de estar completamente aislado del cuerpo y crecido repetidamente en cultivo puro, el microbio puede inducir la enfermedad de nuevo. Si un microbio ha cumplido estos tres postulados, puede afirmarse que "la aparición del microbio en la enfermedad ya no puede ser accidental, pero en este caso no se puede considerar ninguna otra relación entre ella y la enfermedad, excepto que el microbio es la causa de la enfermedad". Sin embargo, para los virus entéricos, estos postulados no son aplicables. Primero, los virus entéricos no se cultivan fácilmente [89] [90] [91], y, segundo, se ha descrito la vaina prolongada de agentes virales e infección asintomática [92], revisado en la literatura [93]. Aunque se han hecho intentos de ajustar los postulados de Koch específicamente para virus y las metodologías actuales implementadas [94] [95] [96], el cumplimiento de estos postulados todavía no es factible en la mayoría de las ocasiones debido a la falta de un sistema eficiente de cultivo celular, dificultades en la síntesis de antígenos y altos niveles de diversidad genética viral dentro de los grupos virales, revisados en la literatura [97]. Se han hecho varios enfoques para desarrollar una metodología que añade mayor importancia al descubrimiento de un nuevo virus.Un enfoque se basa en el enriquecimiento de virus inmunogénicos antes de la secuenciación de la próxima generación mediante el uso de la captura autóloga de anticuerpos antes de la secuenciación.Este método fue probado y validado en varias muestras fecales que contienen adenovirus, sapovirus y norovirus, y ha demostrado enriquecer virus inmunogénicos, mientras que los virus vegetales y bacteriófagos no se Otro método para enriquecer a los virus relevantes antes de la secuenciación de la próxima generación es la llamada plataforma de secuenciación de captura del viroma para los virus vertebrados (VirCapSeq-VERT) que utiliza ~2 millones de sondas que cubren los genomas de todos los miembros de los taxones virales conocidos por infectar vertebrados [99]. Sin embargo, ambos métodos tienen limitaciones: Para el método de captura de anticuerpos, los virus necesitan estar presentes en cargas virales altas, y la sangre, suero o plasma convalecientes necesita estar disponible. Una desventaja de la técnica VirCapSeq-VERT es que no se identificarán virus completamente nuevos, por ejemplo, virus de una nueva familia de virus. El método más sencillo para demostrar la asociación con la enfermedad es el uso de estudios de casos y controles. Además, mientras que en los últimos años se han realizado estudios de casos y controles utilizando PCR convencionales en tiempo real (RT-PCR), en el futuro se pueden utilizar técnicas de secuenciación independientes de próxima generación para tales estudios de casos y controles. Dado que permite la detección de prácticamente todos los ácidos nucleicos, la secuenciación de la próxima generación tiene varias ventajas en comparación con los RT-PCR específicos. La secuenciación de la próxima generación impide la necesidad de realizar numerosos RT-PCR para detectar todos los virus que se sospecha que están asociados con la enfermedad, y se pueden detectar nuevas variantes de familias virales conocidas actualmente o nuevas especies de virus que pueden ser especialmente beneficiosas si sólo se dispone de unos pocos genomas de referencia. El principal beneficio de esta base de datos es que en el futuro inmediato la pregunta más importante puede ser respondida si se identifica un virus nuevo en casos de diarrea: ¿es probable que el virus cause enfermedad? En conclusión, la Es de esperar que en un futuro próximo se describan varios virus nuevos, ya que la detección de estos agentes utilizando las actuales tecnologías de secuencia de la próxima generación ya no es una dificultad. Por lo tanto, añadir relevancia al descubrimiento de virus nuevos debería ser el objetivo principal para futuros estudios.

¿Cuándo se desarrolló el primer sistema de cultivo de tejidos?

Virus que causan gastroenteritis: lo conocido, lo nuevo y los más alláhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4776197/SHA: f7b30ee89775bc82607cc6bc87feb5934b47625fAutores: Oude Munnink, Bas B.; van der Hoek, LiaFecha: 2016-02-19DOI: 10.3390/v8020042Licencia: cc-byAbstract: La lista de virus gastrointestinales recientemente descubiertos se está expandiendo rápidamente. Si estos agentes están realmente involucrados en una enfermedad como la diarrea es la pregunta esencial, pero difícil de responder. En esta revisión se presenta un resumen de todos los virus encontrados en la diarrea, junto con el conocimiento actual sobre su conexión con la enfermedad. Texto: El tracto gastrointestinal es un órgano vulnerable para las infecciones ya que hay contacto constante con el exterior, principalmente por vía oral. La inflamación del estómago y los intestinos (gastroenteritis) puede causar náuseas, vómitos y diarrea. La gastroenteritis es responsable de dos a tres millones de muertes cada año, por lo que es una de las causas más comunes de mortalidad [1]. Principalmente los niños en los países en desarrollo, pero también los individuos inmunocomprometidos en los países desarrollados, sufren de diarrea. Mientras que las infecciones gastrointestinales bacterianas y parasitarias están disminuyendo como resultado de la eliminación adecuada de aguas residuales y agua potable, la gastroenteritis viral no está disminuyendo en los países en desarrollo [2]. En el mundo desarrollado, los virus ya son los patógenos más comunes que causan diarrea [3]. Aunque los virus que infectan a los seres humanos ya habían sido descritos desde 1901 [4] y se sospechaba que los virus desempeñaban un papel en la diarrea, duró hasta 1972, cuando se identificó el primer virus causante de gastroenteritis (norovirus) en un brote de diarrea en Norwalk (California, Estados Unidos) [5]. Poco después del descubrimiento de norovirus se descubrieron varios otros virus causantes de gastroenteritis: rotavirus en células epiteliales de niños con gastroenteritis [6], astrovirus en casos de diarrea infantil [7], adenovirus entéricos en las heces de niños con diarrea aguda [8], y sapovirus durante un brote de gastroenteritis en un orfanato de Sapporo, Japón [9]. Todos estos virus se propagan a través de la vía fecal-oral a través de la transmisión de persona a persona y Los norovirus forman parte de la familia Caliciviridae y los brotes de gastroenteritis por norovirus han sido reportados en cruceros, centros de salud, escuelas y militares, pero el norovirus también es responsable de alrededor del 60% de todos los casos de diarrea esporádica (casos de diarrea en los que se pudo encontrar un enteropatógeno), revisados en la literatura [10, 11]. La patogénesis de la infección por norovirus ha sido probada in vivo. El norovirus filtrado fue administrado a voluntarios sanos después de lo cual la mayoría de ellos desarrollaron diarrea [12]. La cultivo del virus, sin embargo, ha sido un problema desde su descubrimiento, sin embargo, un estudio ha descrito recientemente el cultivo de norovirus en células B, y ha revelado que los cofactores, como el antígeno histosangre que expresa bacterias entéricas, son probablemente necesarios antes de que los virus entéricos Los sapovirus también son miembros de los Caliciviridae. Hay cinco genogrupos humanos de sapovirus descritos [14] que representan el 2,2%-12,7% de todos los casos de gastroenteritis en todo el mundo [14, 15]. Los brotes de sapovirus ocurren a lo largo del año y pueden transmitirse a través de alimentos [16]. Para los sapovirus se ha descrito que el virus no se encontró antes del inicio de un brote, y que se encontró en el 95% de los pacientes durante un brote, mientras que disminuyó al 50% después de un brote, lo que indica que el virus introduce enfermedad en un huésped naturalmente infectado [17]. La infección por rotavirus es la causa más común de gastroenteritis viral entre los niños; sin embargo, los padres de niños infectados también se enferman a menudo y como resultado el rotavirus es la segunda causa más común de gastroenteritis Los estudios en voluntarios humanos han demostrado que la infección por rotavirus causa diarrea, resulta en el desprendimiento del virus y un aumento en el título antivirus de anticuerpos después de la infección [19]. Además, las infecciones por astrovirus son comunes, representando alrededor del 10% de todos los casos de diarrea esporádica [20]. Astrovirus ha sido aislado de personas enfermas, filtrado y administrado a individuos sanos después de lo cual en algunos voluntarios se observó enfermedad diarreica y se derramó astrovirus en sus heces [21]. El virus puede replicarse en células renales embrionarias humanas y fue detectado por microscopía electrónica (EM) [21]. Los adenovirus son responsables de alrededor del 1,5%-5,4% de los casos de diarrea en niños menores de 2 años, revisados en la literatura [22]. De los 57 tipos de adenovirus identificados [ Junto a estos dos tipos, el adenovirus tipo 52 también puede causar gastroenteritis [25], aunque se ha argumentado si el tipo 52 es en realidad un tipo separado ya que no hay suficiente distancia al adenovirus tipo 41 [26]. Los adenovirus generalmente se pueden propagar en líneas celulares; sin embargo, el adenovirus entérico 40/41 es difícil de cultivar, revisado en la literatura [27]. En los años 80 y 1990 se identificaron algunos agentes virales para los cuales la asociación directa con la enfermedad es menos clara. Los virus Aichi son miembros de los Picornaviridae identificados en muestras fecales de pacientes con gastroenteritis [28]. Desde su descubrimiento, se realizaron dos estudios de casos y controles, pero aunque ambos estudios sólo encontraron virus Aichi en heces de pacientes diarreicos, la prevalencia del virus Aichi (0,5% y 1,8%) fue demasiado baja para encontrar una asociación significativa con la diarrea [30, 31]. En los pacientes inmunocomprometidos el virus se encuentra en mayores cantidades y no está asociado con diarrea [32]. Los torovirus, parte de los Coronaviridae, se identificaron por primera vez en 1984 en heces de niños y adultos con gastroenteritis [33]. La infección por Torovirus se asocia con diarrea [34] y se observa con más frecuencia en pacientes inmunocomprometidos y en individuos nosocomiales infectados [34]. El análisis retrospectivo de la gastroenteritis viral nosocomial en un hospital pediátrico reveló que en el 67% de los casos se podía detectar el torovirus [35]. Sin embargo, sólo un número limitado de estudios reportan la detección de torovirus y por lo tanto la verdadera patogénesis y prevalencia de este virus sigue siendo elusiva. Picobirnavirus pertenecen a los Picobirnaviridae y fueron detectados por primera vez en las heces de niños con gastroenteritis [36]. Desde el descubrimiento inicial, el virus se ha detectado en muestras fecales de varias especies animales, y se ha demostrado que los virus son genéticamente muy diversos sin una clara agrupación de especies, revisado en la literatura [37]. Esta alta diversidad secuencial también se ha observado dentro de brotes particulares de gastroenteritis [38, 39], limitando la probabilidad de que los picobirnavirus estén causando brotes en realidad, ya que no se puede identificar ninguna fuente única de infección. En 1907 se desarrolló el primer sistema de cultivo tisular que fue considerado como el estándar de oro para la detección de virus durante En la década de 1930 se introdujeron la serología y la microscopía electrónica que impulsaron el descubrimiento de nuevos virus. Durante estos años, estos métodos se desarrollaron fructíferamente pero los virus que infectaban el tracto gastrointestinal fueron especialmente difíciles de cultivar. A lo largo de las últimas décadas, se han desarrollado varias técnicas basadas en el ADN para el descubrimiento de virus que impulsaron la identificación de virus nuevos en muestras de heces. Los cuatro métodos más utilizados son: 1. Imprimación universal-PCR [41] ; 2. PCR basado en la primografía aleatoria [42] ; 3. Descubrimiento de virus cDNA, Polimorfismo de longitud del fragmento amplificado (VIDISCA) [43] ; y 4. Amplificación de primer único independiente de secuencia (SISPA) [44]. Primer-PCR universal es una técnica de descubrimiento de virus que utiliza imprimaciones universales diseñadas sobre partes conservadas de una familia viral específica, que se pueden utilizar para detectar variantes novedosas de esta familia viral. PCR basado en imprimación aleatoria es una técnica que amplifica aleatoriamente todos los ácidos nucleicos presentes en las muestras, después de lo cual los productos PCR resultantes se pueden clonar y secuenciar. SISPA y VIDISCA son técnicas de descubrimiento de virus que se basan en la digestión con enzimas de restricción, después de lo cual se pueden ligar adaptadores. Estos métodos han tenido éxito en el descubrimiento de virus nuevos, pero hay algunas limitaciones. Los imprimaciones universales son útiles para descubrir virus nuevos de una familia elegida, pero los imprimadores, basados en nuestros conocimientos actuales de la familia viral, pueden no caber en todas las variantes desconocidas. La desventaja de la PCR, SISPA y VIDISCA al azar es que el virus debe estar presente en una alta concentración, mientras que el ADN y/o ARN de fondo del huésped deben ser mínimos y preferiblemente no complejos. En los últimos años, las técnicas de amplificación independientes de secuencias mejoraron considerablemente mediante el acoplamiento de estas técnicas a plataformas de secuenciación de próxima generación y, como resultado, se han descrito varios virus nuevos en casos de gastroenteritis, como el cosavirus [45], el virus Saffold [46], el virus klasse/salivirus [47], el poliomavirus [49], el bufavirus [50], el tusavirus [51] y el recovirus [52]. Aunque estos virus se encuentran en individuos con diarrea, para la mayoría de ellos el grado de circulación (prevalencia) y la capacidad de causar enfermedades morbosas (patogénesis) queda por determinar, como se describe a continuación (véase también la Tabla 1). Sólo se encuentra en baja prevalencia; **: Sólo se dispone de datos limitados sobre este virus; ***: Se observaron anticuerpos contra el HMO-C del astrovirus, mientras que no se encontraron anticuerpos contra el HMO-A del astrovirus (HMO = astrovirus de tipo humano-mink-ovina); -No se han publicado datos disponibles;•El Picobirnavirus, el tunavirus y el recovirus se identificaron en el tracto gastrointestinal después de la secuenciación de la próxima generación, pero no se dispone de información sobre la respuesta de anticuerpos o la asociación con diarrea. El primer clado consiste en los astrovirus VA-1, VA-2, VA-3, VA-4 y VA-5, que están genéticamente relacionados con los astrovirus felinos y porcinos, mientras que el segundo clado consiste en los astrovirus MLB1, MLB2 y MLB3 y forman un grupo separado [55, 57, [74] [75] [76] [77] [78]. Para estos nuevos clados queda por determinar la patogénesis ya que los virus se han identificado en pacientes con y sin diarrea, y en algunos estudios los virus se asociaron con diarrea mientras que en otros no se pudo encontrar ninguna asociación [55] [56]. Además se observó una respuesta de anticuerpos contra algunos pero no todos los tipos nuevos de astrovirus [54, 58]. Recientemente, también se ha detectado astrovirus MLB2 en el plasma sanguíneo de un niño febril [79] y astrovirus VA1 en una muestra de biopsia de corteza frontal de un paciente con encefalitis [80], lo que sugiere que la infección por astrovirus puede no limitarse al tracto gastrointestinal. En 2008, se observó el virus Saffold en una muestra de heces de un paciente pediátrico con fiebre de origen desconocido [46]. Aunque el virus Saffold tipo 3 fue cultivado en una línea celular epitelial del carcinoma cervical humano (HeLa), se observaron efectos citopáticos y se encontraron anticuerpos neutralizantes en muestras séricas [59], estudios de casos y controles posteriores mostraron que el virus no estaba significativamente asociado con diarrea [53, 60, 61]. Además, en 2008 se identificó el virus cosavirus en un paciente con diarrea [45]. Sin embargo, un estudio de caso-control mostró que este virus también fue detectado en una cantidad sustancial de individuos sin diarrea y no está asociado con diarrea [32, 62, 63]. El virus Klasse/salivirus fue identificado en 2009 en dos muestras fecales de lactantes con trastornos gastrointestinales [47, 48]. En dos estudios la detección de este virus fue asociada con diarrea [48, 53], mientras que en otro estudio no se encontró asociación con enfermedad [65]. Se obtuvo evidencia serológica de infección por klassevirus humano, sugiriendo que el virus infecta células humanas [64]. Con el uso de técnicas de secuenciación de próxima generación, también se identificaron tres poliomavirus nuevos en muestras fecales humanas. El poliomavirus MW se identificó en las heces de un niño sano de Malawi en 2012 [49], y en el mismo año se encontró poliomavirus MX en muestras de heces de pacientes con y sin diarrea de México, Estados Unidos y Chili [68]. Un año después, se encontró poliomavirus STL en las heces de un niño sano de Malawi [71]. Se observó una respuesta de anticuerpos contra el poliomavirus MX [66] y el poliomavirus MW [69], aunque el poliomavirus MW [67] y el poliomavirus STL [70] no se asociaron significativamente con diarrea en dos estudios independientes de control de casos. El bufavirus es miembro del Parvoviridae y fue descrito por primera vez en 2012 [50]. Dos casos de control en Tailandia y Turquía mostraron que el virus sólo se encontró en pacientes con diarrea y no en controles [72, 73] ; sin embargo, debido a la baja prevalencia (respectivamente 0,3% en Tailandia y 1,4% en Turquía), no se encontró ninguna asociación significativa con la enfermedad. Tusavirus, otro miembro recientemente descrito de los Parvoviridae, fue identificado en las heces de un niño de Túnez con diarrea inexplicable [51], y hasta ahora este es el único estudio que describe este virus. Recovirus es un miembro nuevo de los Caliciviridae y se encontró en muestras de diarrea de Bangladesh [52]. Al igual que el tunavirus, este es el único estudio que describe este virus hasta ahora. La identificación de los virus nuevos mencionados sin duda aumentó nuestros conocimientos sobre virus que se pueden encontrar en el tracto gastrointestinal de los humanos, sin embargo se desconoce cuántos de estos virus nuevos son realmente enteropatógenos. Las heces humanas contienen una amplia variedad de virus que se pueden derivar de diferentes hospedadores: Además de los virus humanos genuinos, los virus alimentarios vegetales [32,81] y los virus alimentarios animales [82] también se pueden encontrar en las heces humanas, así como bacteriófagos y virus que infectan a los protozoos [32]. Incluso los virus derivados de otras partes del cuerpo se pueden encontrar en muestras fecales, como el virus del polioma de John Cunningham originario del riñón que termina en heces a través de orina [83], y los rinovirus [84], bocavirus [85] y coronavirus [86] procedentes del tracto respiratorio y probablemente ingeridos. Además, los virus que infectan células sanguíneas como el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1 también se pueden detectar en muestras fecales [87]. Por lo tanto, una vez identificado un virus nuevo en muestras de heces humanas, no se indica que este virus se esté replicando en células intestinales humanas. Koch reconoció ya en 1891 que asociar la presencia de un determinado agente con una determinada enfermedad es complejo, y por lo tanto postula directrices que deben seguirse antes de que un agente pueda ser clasificado como patógeno [88]. Sus postulados pueden resumirse en tres puntos: (1) El microbio ocurre en cada caso de la enfermedad en cuestión y en circunstancias que pueden explicar los cambios patológicos y el curso clínico de la enfermedad; (2) el microbio no ocurre en ninguna otra enfermedad como un parásito fortuito y no patogénico; y (3), después de estar completamente aislado del cuerpo y crecido repetidamente en cultivo puro, el microbio puede inducir la enfermedad de nuevo. Si un microbio ha cumplido estos tres postulados, puede afirmarse que "la aparición del microbio en la enfermedad ya no puede ser accidental, pero en este caso no se puede considerar ninguna otra relación entre ella y la enfermedad, excepto que el microbio es la causa de la enfermedad". Sin embargo, para los virus entéricos, estos postulados no son aplicables. Primero, los virus entéricos no se cultivan fácilmente [89] [90] [91], y, segundo, se ha descrito la vaina prolongada de agentes virales e infección asintomática [92], revisado en la literatura [93]. Aunque se han hecho intentos de ajustar los postulados de Koch específicamente para virus y las metodologías actuales implementadas [94] [95] [96], el cumplimiento de estos postulados todavía no es factible en la mayoría de las ocasiones debido a la falta de un sistema eficiente de cultivo celular, dificultades en la síntesis de antígenos y altos niveles de diversidad genética viral dentro de los grupos virales, revisados en la literatura [97]. Se han hecho varios enfoques para desarrollar una metodología que añade mayor importancia al descubrimiento de un nuevo virus.Un enfoque se basa en el enriquecimiento de virus inmunogénicos antes de la secuenciación de la próxima generación mediante el uso de la captura autóloga de anticuerpos antes de la secuenciación.Este método fue probado y validado en varias muestras fecales que contienen adenovirus, sapovirus y norovirus, y ha demostrado enriquecer virus inmunogénicos, mientras que los virus vegetales y bacteriófagos no se Otro método para enriquecer a los virus relevantes antes de la secuenciación de la próxima generación es la llamada plataforma de secuenciación de captura del viroma para los virus vertebrados (VirCapSeq-VERT) que utiliza ~2 millones de sondas que cubren los genomas de todos los miembros de los taxones virales conocidos por infectar vertebrados [99]. Sin embargo, ambos métodos tienen limitaciones: Para el método de captura de anticuerpos, los virus necesitan estar presentes en cargas virales altas, y la sangre, suero o plasma convalecientes necesita estar disponible. Una desventaja de la técnica VirCapSeq-VERT es que no se identificarán virus completamente nuevos, por ejemplo, virus de una nueva familia de virus. El método más sencillo para demostrar la asociación con la enfermedad es el uso de estudios de casos y controles. Además, mientras que en los últimos años se han realizado estudios de casos y controles utilizando PCR convencionales en tiempo real (RT-PCR), en el futuro se pueden utilizar técnicas de secuenciación independientes de próxima generación para tales estudios de casos y controles. Dado que permite la detección de prácticamente todos los ácidos nucleicos, la secuenciación de la próxima generación tiene varias ventajas en comparación con los RT-PCR específicos. La secuenciación de la próxima generación impide la necesidad de realizar numerosos RT-PCR para detectar todos los virus que se sospecha que están asociados con la enfermedad, y se pueden detectar nuevas variantes de familias virales conocidas actualmente o nuevas especies de virus que pueden ser especialmente beneficiosas si sólo se dispone de unos pocos genomas de referencia. El principal beneficio de esta base de datos es que en el futuro inmediato la pregunta más importante puede ser respondida si se identifica un virus nuevo en casos de diarrea: ¿es probable que el virus cause enfermedad? En conclusión, la Es de esperar que en un futuro próximo se describan varios virus nuevos, ya que la detección de estos agentes utilizando las actuales tecnologías de secuencia de la próxima generación ya no es una dificultad. Por lo tanto, añadir relevancia al descubrimiento de virus nuevos debería ser el objetivo principal para futuros estudios.

¿Para qué se utiliza Universal Primer-PCR en estudios virales?

Virus que causan gastroenteritis: lo conocido, lo nuevo y los más alláhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4776197/SHA: f7b30ee89775bc82607cc6bc87feb5934b47625fAutores: Oude Munnink, Bas B.; van der Hoek, LiaFecha: 2016-02-19DOI: 10.3390/v8020042Licencia: cc-byAbstract: La lista de virus gastrointestinales recientemente descubiertos se está expandiendo rápidamente. Si estos agentes están realmente involucrados en una enfermedad como la diarrea es la pregunta esencial, pero difícil de responder. En esta revisión se presenta un resumen de todos los virus encontrados en la diarrea, junto con el conocimiento actual sobre su conexión con la enfermedad. Texto: El tracto gastrointestinal es un órgano vulnerable para las infecciones ya que hay contacto constante con el exterior, principalmente por vía oral. La inflamación del estómago y los intestinos (gastroenteritis) puede causar náuseas, vómitos y diarrea. La gastroenteritis es responsable de dos a tres millones de muertes cada año, por lo que es una de las causas más comunes de mortalidad [1]. Principalmente los niños en los países en desarrollo, pero también los individuos inmunocomprometidos en los países desarrollados, sufren de diarrea. Mientras que las infecciones gastrointestinales bacterianas y parasitarias están disminuyendo como resultado de la eliminación adecuada de aguas residuales y agua potable, la gastroenteritis viral no está disminuyendo en los países en desarrollo [2]. En el mundo desarrollado, los virus ya son los patógenos más comunes que causan diarrea [3]. Aunque los virus que infectan a los seres humanos ya habían sido descritos desde 1901 [4] y se sospechaba que los virus desempeñaban un papel en la diarrea, duró hasta 1972, cuando se identificó el primer virus causante de gastroenteritis (norovirus) en un brote de diarrea en Norwalk (California, Estados Unidos) [5]. Poco después del descubrimiento de norovirus se descubrieron varios otros virus causantes de gastroenteritis: rotavirus en células epiteliales de niños con gastroenteritis [6], astrovirus en casos de diarrea infantil [7], adenovirus entéricos en las heces de niños con diarrea aguda [8], y sapovirus durante un brote de gastroenteritis en un orfanato de Sapporo, Japón [9]. Todos estos virus se propagan a través de la vía fecal-oral a través de la transmisión de persona a persona y Los norovirus forman parte de la familia Caliciviridae y los brotes de gastroenteritis por norovirus han sido reportados en cruceros, centros de salud, escuelas y militares, pero el norovirus también es responsable de alrededor del 60% de todos los casos de diarrea esporádica (casos de diarrea en los que se pudo encontrar un enteropatógeno), revisados en la literatura [10, 11]. La patogénesis de la infección por norovirus ha sido probada in vivo. El norovirus filtrado fue administrado a voluntarios sanos después de lo cual la mayoría de ellos desarrollaron diarrea [12]. La cultivo del virus, sin embargo, ha sido un problema desde su descubrimiento, sin embargo, un estudio ha descrito recientemente el cultivo de norovirus en células B, y ha revelado que los cofactores, como el antígeno histosangre que expresa bacterias entéricas, son probablemente necesarios antes de que los virus entéricos Los sapovirus también son miembros de los Caliciviridae. Hay cinco genogrupos humanos de sapovirus descritos [14] que representan el 2,2%-12,7% de todos los casos de gastroenteritis en todo el mundo [14, 15]. Los brotes de sapovirus ocurren a lo largo del año y pueden transmitirse a través de alimentos [16]. Para los sapovirus se ha descrito que el virus no se encontró antes del inicio de un brote, y que se encontró en el 95% de los pacientes durante un brote, mientras que disminuyó al 50% después de un brote, lo que indica que el virus introduce enfermedad en un huésped naturalmente infectado [17]. La infección por rotavirus es la causa más común de gastroenteritis viral entre los niños; sin embargo, los padres de niños infectados también se enferman a menudo y como resultado el rotavirus es la segunda causa más común de gastroenteritis Los estudios en voluntarios humanos han demostrado que la infección por rotavirus causa diarrea, resulta en el desprendimiento del virus y un aumento en el título antivirus de anticuerpos después de la infección [19]. Además, las infecciones por astrovirus son comunes, representando alrededor del 10% de todos los casos de diarrea esporádica [20]. Astrovirus ha sido aislado de personas enfermas, filtrado y administrado a individuos sanos después de lo cual en algunos voluntarios se observó enfermedad diarreica y se derramó astrovirus en sus heces [21]. El virus puede replicarse en células renales embrionarias humanas y fue detectado por microscopía electrónica (EM) [21]. Los adenovirus son responsables de alrededor del 1,5%-5,4% de los casos de diarrea en niños menores de 2 años, revisados en la literatura [22]. De los 57 tipos de adenovirus identificados [ Junto a estos dos tipos, el adenovirus tipo 52 también puede causar gastroenteritis [25], aunque se ha argumentado si el tipo 52 es en realidad un tipo separado ya que no hay suficiente distancia al adenovirus tipo 41 [26]. Los adenovirus generalmente se pueden propagar en líneas celulares; sin embargo, el adenovirus entérico 40/41 es difícil de cultivar, revisado en la literatura [27]. En los años 80 y 1990 se identificaron algunos agentes virales para los cuales la asociación directa con la enfermedad es menos clara. Los virus Aichi son miembros de los Picornaviridae identificados en muestras fecales de pacientes con gastroenteritis [28]. Desde su descubrimiento, se realizaron dos estudios de casos y controles, pero aunque ambos estudios sólo encontraron virus Aichi en heces de pacientes diarreicos, la prevalencia del virus Aichi (0,5% y 1,8%) fue demasiado baja para encontrar una asociación significativa con la diarrea [30, 31]. En los pacientes inmunocomprometidos el virus se encuentra en mayores cantidades y no está asociado con diarrea [32]. Los torovirus, parte de los Coronaviridae, se identificaron por primera vez en 1984 en heces de niños y adultos con gastroenteritis [33]. La infección por Torovirus se asocia con diarrea [34] y se observa con más frecuencia en pacientes inmunocomprometidos y en individuos nosocomiales infectados [34]. El análisis retrospectivo de la gastroenteritis viral nosocomial en un hospital pediátrico reveló que en el 67% de los casos se podía detectar el torovirus [35]. Sin embargo, sólo un número limitado de estudios reportan la detección de torovirus y por lo tanto la verdadera patogénesis y prevalencia de este virus sigue siendo elusiva. Picobirnavirus pertenecen a los Picobirnaviridae y fueron detectados por primera vez en las heces de niños con gastroenteritis [36]. Desde el descubrimiento inicial, el virus se ha detectado en muestras fecales de varias especies animales, y se ha demostrado que los virus son genéticamente muy diversos sin una clara agrupación de especies, revisado en la literatura [37]. Esta alta diversidad secuencial también se ha observado dentro de brotes particulares de gastroenteritis [38, 39], limitando la probabilidad de que los picobirnavirus estén causando brotes en realidad, ya que no se puede identificar ninguna fuente única de infección. En 1907 se desarrolló el primer sistema de cultivo tisular que fue considerado como el estándar de oro para la detección de virus durante En la década de 1930 se introdujeron la serología y la microscopía electrónica que impulsaron el descubrimiento de nuevos virus. Durante estos años, estos métodos se desarrollaron fructíferamente pero los virus que infectaban el tracto gastrointestinal fueron especialmente difíciles de cultivar. A lo largo de las últimas décadas, se han desarrollado varias técnicas basadas en el ADN para el descubrimiento de virus que impulsaron la identificación de virus nuevos en muestras de heces. Los cuatro métodos más utilizados son: 1. Imprimación universal-PCR [41] ; 2. PCR basado en la primografía aleatoria [42] ; 3. Descubrimiento de virus cDNA, Polimorfismo de longitud del fragmento amplificado (VIDISCA) [43] ; y 4. Amplificación de primer único independiente de secuencia (SISPA) [44]. Primer-PCR universal es una técnica de descubrimiento de virus que utiliza imprimaciones universales diseñadas sobre partes conservadas de una familia viral específica, que se pueden utilizar para detectar variantes novedosas de esta familia viral. PCR basado en imprimación aleatoria es una técnica que amplifica aleatoriamente todos los ácidos nucleicos presentes en las muestras, después de lo cual los productos PCR resultantes se pueden clonar y secuenciar. SISPA y VIDISCA son técnicas de descubrimiento de virus que se basan en la digestión con enzimas de restricción, después de lo cual se pueden ligar adaptadores. Estos métodos han tenido éxito en el descubrimiento de virus nuevos, pero hay algunas limitaciones. Los imprimaciones universales son útiles para descubrir virus nuevos de una familia elegida, pero los imprimadores, basados en nuestros conocimientos actuales de la familia viral, pueden no caber en todas las variantes desconocidas. La desventaja de la PCR, SISPA y VIDISCA al azar es que el virus debe estar presente en una alta concentración, mientras que el ADN y/o ARN de fondo del huésped deben ser mínimos y preferiblemente no complejos. En los últimos años, las técnicas de amplificación independientes de secuencias mejoraron considerablemente mediante el acoplamiento de estas técnicas a plataformas de secuenciación de próxima generación y, como resultado, se han descrito varios virus nuevos en casos de gastroenteritis, como el cosavirus [45], el virus Saffold [46], el virus klasse/salivirus [47], el poliomavirus [49], el bufavirus [50], el tusavirus [51] y el recovirus [52]. Aunque estos virus se encuentran en individuos con diarrea, para la mayoría de ellos el grado de circulación (prevalencia) y la capacidad de causar enfermedades morbosas (patogénesis) queda por determinar, como se describe a continuación (véase también la Tabla 1). Sólo se encuentra en baja prevalencia; **: Sólo se dispone de datos limitados sobre este virus; ***: Se observaron anticuerpos contra el HMO-C del astrovirus, mientras que no se encontraron anticuerpos contra el HMO-A del astrovirus (HMO = astrovirus de tipo humano-mink-ovina); -No se han publicado datos disponibles;•El Picobirnavirus, el tunavirus y el recovirus se identificaron en el tracto gastrointestinal después de la secuenciación de la próxima generación, pero no se dispone de información sobre la respuesta de anticuerpos o la asociación con diarrea. El primer clado consiste en los astrovirus VA-1, VA-2, VA-3, VA-4 y VA-5, que están genéticamente relacionados con los astrovirus felinos y porcinos, mientras que el segundo clado consiste en los astrovirus MLB1, MLB2 y MLB3 y forman un grupo separado [55, 57, [74] [75] [76] [77] [78]. Para estos nuevos clados queda por determinar la patogénesis ya que los virus se han identificado en pacientes con y sin diarrea, y en algunos estudios los virus se asociaron con diarrea mientras que en otros no se pudo encontrar ninguna asociación [55] [56]. Además se observó una respuesta de anticuerpos contra algunos pero no todos los tipos nuevos de astrovirus [54, 58]. Recientemente, también se ha detectado astrovirus MLB2 en el plasma sanguíneo de un niño febril [79] y astrovirus VA1 en una muestra de biopsia de corteza frontal de un paciente con encefalitis [80], lo que sugiere que la infección por astrovirus puede no limitarse al tracto gastrointestinal. En 2008, se observó el virus Saffold en una muestra de heces de un paciente pediátrico con fiebre de origen desconocido [46]. Aunque el virus Saffold tipo 3 fue cultivado en una línea celular epitelial del carcinoma cervical humano (HeLa), se observaron efectos citopáticos y se encontraron anticuerpos neutralizantes en muestras séricas [59], estudios de casos y controles posteriores mostraron que el virus no estaba significativamente asociado con diarrea [53, 60, 61]. Además, en 2008 se identificó el virus cosavirus en un paciente con diarrea [45]. Sin embargo, un estudio de caso-control mostró que este virus también fue detectado en una cantidad sustancial de individuos sin diarrea y no está asociado con diarrea [32, 62, 63]. El virus Klasse/salivirus fue identificado en 2009 en dos muestras fecales de lactantes con trastornos gastrointestinales [47, 48]. En dos estudios la detección de este virus fue asociada con diarrea [48, 53], mientras que en otro estudio no se encontró asociación con enfermedad [65]. Se obtuvo evidencia serológica de infección por klassevirus humano, sugiriendo que el virus infecta células humanas [64]. Con el uso de técnicas de secuenciación de próxima generación, también se identificaron tres poliomavirus nuevos en muestras fecales humanas. El poliomavirus MW se identificó en las heces de un niño sano de Malawi en 2012 [49], y en el mismo año se encontró poliomavirus MX en muestras de heces de pacientes con y sin diarrea de México, Estados Unidos y Chili [68]. Un año después, se encontró poliomavirus STL en las heces de un niño sano de Malawi [71]. Se observó una respuesta de anticuerpos contra el poliomavirus MX [66] y el poliomavirus MW [69], aunque el poliomavirus MW [67] y el poliomavirus STL [70] no se asociaron significativamente con diarrea en dos estudios independientes de control de casos. El bufavirus es miembro del Parvoviridae y fue descrito por primera vez en 2012 [50]. Dos casos de control en Tailandia y Turquía mostraron que el virus sólo se encontró en pacientes con diarrea y no en controles [72, 73] ; sin embargo, debido a la baja prevalencia (respectivamente 0,3% en Tailandia y 1,4% en Turquía), no se encontró ninguna asociación significativa con la enfermedad. Tusavirus, otro miembro recientemente descrito de los Parvoviridae, fue identificado en las heces de un niño de Túnez con diarrea inexplicable [51], y hasta ahora este es el único estudio que describe este virus. Recovirus es un miembro nuevo de los Caliciviridae y se encontró en muestras de diarrea de Bangladesh [52]. Al igual que el tunavirus, este es el único estudio que describe este virus hasta ahora. La identificación de los virus nuevos mencionados sin duda aumentó nuestros conocimientos sobre virus que se pueden encontrar en el tracto gastrointestinal de los humanos, sin embargo se desconoce cuántos de estos virus nuevos son realmente enteropatógenos. Las heces humanas contienen una amplia variedad de virus que se pueden derivar de diferentes hospedadores: Además de los virus humanos genuinos, los virus alimentarios vegetales [32,81] y los virus alimentarios animales [82] también se pueden encontrar en las heces humanas, así como bacteriófagos y virus que infectan a los protozoos [32]. Incluso los virus derivados de otras partes del cuerpo se pueden encontrar en muestras fecales, como el virus del polioma de John Cunningham originario del riñón que termina en heces a través de orina [83], y los rinovirus [84], bocavirus [85] y coronavirus [86] procedentes del tracto respiratorio y probablemente ingeridos. Además, los virus que infectan células sanguíneas como el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1 también se pueden detectar en muestras fecales [87]. Por lo tanto, una vez identificado un virus nuevo en muestras de heces humanas, no se indica que este virus se esté replicando en células intestinales humanas. Koch reconoció ya en 1891 que asociar la presencia de un determinado agente con una determinada enfermedad es complejo, y por lo tanto postula directrices que deben seguirse antes de que un agente pueda ser clasificado como patógeno [88]. Sus postulados pueden resumirse en tres puntos: (1) El microbio ocurre en cada caso de la enfermedad en cuestión y en circunstancias que pueden explicar los cambios patológicos y el curso clínico de la enfermedad; (2) el microbio no ocurre en ninguna otra enfermedad como un parásito fortuito y no patogénico; y (3), después de estar completamente aislado del cuerpo y crecido repetidamente en cultivo puro, el microbio puede inducir la enfermedad de nuevo. Si un microbio ha cumplido estos tres postulados, puede afirmarse que "la aparición del microbio en la enfermedad ya no puede ser accidental, pero en este caso no se puede considerar ninguna otra relación entre ella y la enfermedad, excepto que el microbio es la causa de la enfermedad". Sin embargo, para los virus entéricos, estos postulados no son aplicables. Primero, los virus entéricos no se cultivan fácilmente [89] [90] [91], y, segundo, se ha descrito la vaina prolongada de agentes virales e infección asintomática [92], revisado en la literatura [93]. Aunque se han hecho intentos de ajustar los postulados de Koch específicamente para virus y las metodologías actuales implementadas [94] [95] [96], el cumplimiento de estos postulados todavía no es factible en la mayoría de las ocasiones debido a la falta de un sistema eficiente de cultivo celular, dificultades en la síntesis de antígenos y altos niveles de diversidad genética viral dentro de los grupos virales, revisados en la literatura [97]. Se han hecho varios enfoques para desarrollar una metodología que añade mayor importancia al descubrimiento de un nuevo virus.Un enfoque se basa en el enriquecimiento de virus inmunogénicos antes de la secuenciación de la próxima generación mediante el uso de la captura autóloga de anticuerpos antes de la secuenciación.Este método fue probado y validado en varias muestras fecales que contienen adenovirus, sapovirus y norovirus, y ha demostrado enriquecer virus inmunogénicos, mientras que los virus vegetales y bacteriófagos no se Otro método para enriquecer a los virus relevantes antes de la secuenciación de la próxima generación es la llamada plataforma de secuenciación de captura del viroma para los virus vertebrados (VirCapSeq-VERT) que utiliza ~2 millones de sondas que cubren los genomas de todos los miembros de los taxones virales conocidos por infectar vertebrados [99]. Sin embargo, ambos métodos tienen limitaciones: Para el método de captura de anticuerpos, los virus necesitan estar presentes en cargas virales altas, y la sangre, suero o plasma convalecientes necesita estar disponible. Una desventaja de la técnica VirCapSeq-VERT es que no se identificarán virus completamente nuevos, por ejemplo, virus de una nueva familia de virus. El método más sencillo para demostrar la asociación con la enfermedad es el uso de estudios de casos y controles. Además, mientras que en los últimos años se han realizado estudios de casos y controles utilizando PCR convencionales en tiempo real (RT-PCR), en el futuro se pueden utilizar técnicas de secuenciación independientes de próxima generación para tales estudios de casos y controles. Dado que permite la detección de prácticamente todos los ácidos nucleicos, la secuenciación de la próxima generación tiene varias ventajas en comparación con los RT-PCR específicos. La secuenciación de la próxima generación impide la necesidad de realizar numerosos RT-PCR para detectar todos los virus que se sospecha que están asociados con la enfermedad, y se pueden detectar nuevas variantes de familias virales conocidas actualmente o nuevas especies de virus que pueden ser especialmente beneficiosas si sólo se dispone de unos pocos genomas de referencia. El principal beneficio de esta base de datos es que en el futuro inmediato la pregunta más importante puede ser respondida si se identifica un virus nuevo en casos de diarrea: ¿es probable que el virus cause enfermedad? En conclusión, la Es de esperar que en un futuro próximo se describan varios virus nuevos, ya que la detección de estos agentes utilizando las actuales tecnologías de secuencia de la próxima generación ya no es una dificultad. Por lo tanto, añadir relevancia al descubrimiento de virus nuevos debería ser el objetivo principal para futuros estudios.

¿Cuál es el primer postulado de Koch?

Virus que causan gastroenteritis: lo conocido, lo nuevo y los más alláhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4776197/SHA: f7b30ee89775bc82607cc6bc87feb5934b47625fAutores: Oude Munnink, Bas B.; van der Hoek, LiaFecha: 2016-02-19DOI: 10.3390/v8020042Licencia: cc-byAbstract: La lista de virus gastrointestinales recientemente descubiertos se está expandiendo rápidamente. Si estos agentes están realmente involucrados en una enfermedad como la diarrea es la pregunta esencial, pero difícil de responder. En esta revisión se presenta un resumen de todos los virus encontrados en la diarrea, junto con el conocimiento actual sobre su conexión con la enfermedad. Texto: El tracto gastrointestinal es un órgano vulnerable para las infecciones ya que hay contacto constante con el exterior, principalmente por vía oral. La inflamación del estómago y los intestinos (gastroenteritis) puede causar náuseas, vómitos y diarrea. La gastroenteritis es responsable de dos a tres millones de muertes cada año, por lo que es una de las causas más comunes de mortalidad [1]. Principalmente los niños en los países en desarrollo, pero también los individuos inmunocomprometidos en los países desarrollados, sufren de diarrea. Mientras que las infecciones gastrointestinales bacterianas y parasitarias están disminuyendo como resultado de la eliminación adecuada de aguas residuales y agua potable, la gastroenteritis viral no está disminuyendo en los países en desarrollo [2]. En el mundo desarrollado, los virus ya son los patógenos más comunes que causan diarrea [3]. Aunque los virus que infectan a los seres humanos ya habían sido descritos desde 1901 [4] y se sospechaba que los virus desempeñaban un papel en la diarrea, duró hasta 1972, cuando se identificó el primer virus causante de gastroenteritis (norovirus) en un brote de diarrea en Norwalk (California, Estados Unidos) [5]. Poco después del descubrimiento de norovirus se descubrieron varios otros virus causantes de gastroenteritis: rotavirus en células epiteliales de niños con gastroenteritis [6], astrovirus en casos de diarrea infantil [7], adenovirus entéricos en las heces de niños con diarrea aguda [8], y sapovirus durante un brote de gastroenteritis en un orfanato de Sapporo, Japón [9]. Todos estos virus se propagan a través de la vía fecal-oral a través de la transmisión de persona a persona y Los norovirus forman parte de la familia Caliciviridae y los brotes de gastroenteritis por norovirus han sido reportados en cruceros, centros de salud, escuelas y militares, pero el norovirus también es responsable de alrededor del 60% de todos los casos de diarrea esporádica (casos de diarrea en los que se pudo encontrar un enteropatógeno), revisados en la literatura [10, 11]. La patogénesis de la infección por norovirus ha sido probada in vivo. El norovirus filtrado fue administrado a voluntarios sanos después de lo cual la mayoría de ellos desarrollaron diarrea [12]. La cultivo del virus, sin embargo, ha sido un problema desde su descubrimiento, sin embargo, un estudio ha descrito recientemente el cultivo de norovirus en células B, y ha revelado que los cofactores, como el antígeno histosangre que expresa bacterias entéricas, son probablemente necesarios antes de que los virus entéricos Los sapovirus también son miembros de los Caliciviridae. Hay cinco genogrupos humanos de sapovirus descritos [14] que representan el 2,2%-12,7% de todos los casos de gastroenteritis en todo el mundo [14, 15]. Los brotes de sapovirus ocurren a lo largo del año y pueden transmitirse a través de alimentos [16]. Para los sapovirus se ha descrito que el virus no se encontró antes del inicio de un brote, y que se encontró en el 95% de los pacientes durante un brote, mientras que disminuyó al 50% después de un brote, lo que indica que el virus introduce enfermedad en un huésped naturalmente infectado [17]. La infección por rotavirus es la causa más común de gastroenteritis viral entre los niños; sin embargo, los padres de niños infectados también se enferman a menudo y como resultado el rotavirus es la segunda causa más común de gastroenteritis Los estudios en voluntarios humanos han demostrado que la infección por rotavirus causa diarrea, resulta en el desprendimiento del virus y un aumento en el título antivirus de anticuerpos después de la infección [19]. Además, las infecciones por astrovirus son comunes, representando alrededor del 10% de todos los casos de diarrea esporádica [20]. Astrovirus ha sido aislado de personas enfermas, filtrado y administrado a individuos sanos después de lo cual en algunos voluntarios se observó enfermedad diarreica y se derramó astrovirus en sus heces [21]. El virus puede replicarse en células renales embrionarias humanas y fue detectado por microscopía electrónica (EM) [21]. Los adenovirus son responsables de alrededor del 1,5%-5,4% de los casos de diarrea en niños menores de 2 años, revisados en la literatura [22]. De los 57 tipos de adenovirus identificados [ Junto a estos dos tipos, el adenovirus tipo 52 también puede causar gastroenteritis [25], aunque se ha argumentado si el tipo 52 es en realidad un tipo separado ya que no hay suficiente distancia al adenovirus tipo 41 [26]. Los adenovirus generalmente se pueden propagar en líneas celulares; sin embargo, el adenovirus entérico 40/41 es difícil de cultivar, revisado en la literatura [27]. En los años 80 y 1990 se identificaron algunos agentes virales para los cuales la asociación directa con la enfermedad es menos clara. Los virus Aichi son miembros de los Picornaviridae identificados en muestras fecales de pacientes con gastroenteritis [28]. Desde su descubrimiento, se realizaron dos estudios de casos y controles, pero aunque ambos estudios sólo encontraron virus Aichi en heces de pacientes diarreicos, la prevalencia del virus Aichi (0,5% y 1,8%) fue demasiado baja para encontrar una asociación significativa con la diarrea [30, 31]. En los pacientes inmunocomprometidos el virus se encuentra en mayores cantidades y no está asociado con diarrea [32]. Los torovirus, parte de los Coronaviridae, se identificaron por primera vez en 1984 en heces de niños y adultos con gastroenteritis [33]. La infección por Torovirus se asocia con diarrea [34] y se observa con más frecuencia en pacientes inmunocomprometidos y en individuos nosocomiales infectados [34]. El análisis retrospectivo de la gastroenteritis viral nosocomial en un hospital pediátrico reveló que en el 67% de los casos se podía detectar el torovirus [35]. Sin embargo, sólo un número limitado de estudios reportan la detección de torovirus y por lo tanto la verdadera patogénesis y prevalencia de este virus sigue siendo elusiva. Picobirnavirus pertenecen a los Picobirnaviridae y fueron detectados por primera vez en las heces de niños con gastroenteritis [36]. Desde el descubrimiento inicial, el virus se ha detectado en muestras fecales de varias especies animales, y se ha demostrado que los virus son genéticamente muy diversos sin una clara agrupación de especies, revisado en la literatura [37]. Esta alta diversidad secuencial también se ha observado dentro de brotes particulares de gastroenteritis [38, 39], limitando la probabilidad de que los picobirnavirus estén causando brotes en realidad, ya que no se puede identificar ninguna fuente única de infección. En 1907 se desarrolló el primer sistema de cultivo tisular que fue considerado como el estándar de oro para la detección de virus durante En la década de 1930 se introdujeron la serología y la microscopía electrónica que impulsaron el descubrimiento de nuevos virus. Durante estos años, estos métodos se desarrollaron fructíferamente pero los virus que infectaban el tracto gastrointestinal fueron especialmente difíciles de cultivar. A lo largo de las últimas décadas, se han desarrollado varias técnicas basadas en el ADN para el descubrimiento de virus que impulsaron la identificación de virus nuevos en muestras de heces. Los cuatro métodos más utilizados son: 1. Imprimación universal-PCR [41] ; 2. PCR basado en la primografía aleatoria [42] ; 3. Descubrimiento de virus cDNA, Polimorfismo de longitud del fragmento amplificado (VIDISCA) [43] ; y 4. Amplificación de primer único independiente de secuencia (SISPA) [44]. Primer-PCR universal es una técnica de descubrimiento de virus que utiliza imprimaciones universales diseñadas sobre partes conservadas de una familia viral específica, que se pueden utilizar para detectar variantes novedosas de esta familia viral. PCR basado en imprimación aleatoria es una técnica que amplifica aleatoriamente todos los ácidos nucleicos presentes en las muestras, después de lo cual los productos PCR resultantes se pueden clonar y secuenciar. SISPA y VIDISCA son técnicas de descubrimiento de virus que se basan en la digestión con enzimas de restricción, después de lo cual se pueden ligar adaptadores. Estos métodos han tenido éxito en el descubrimiento de virus nuevos, pero hay algunas limitaciones. Los imprimaciones universales son útiles para descubrir virus nuevos de una familia elegida, pero los imprimadores, basados en nuestros conocimientos actuales de la familia viral, pueden no caber en todas las variantes desconocidas. La desventaja de la PCR, SISPA y VIDISCA al azar es que el virus debe estar presente en una alta concentración, mientras que el ADN y/o ARN de fondo del huésped deben ser mínimos y preferiblemente no complejos. En los últimos años, las técnicas de amplificación independientes de secuencias mejoraron considerablemente mediante el acoplamiento de estas técnicas a plataformas de secuenciación de próxima generación y, como resultado, se han descrito varios virus nuevos en casos de gastroenteritis, como el cosavirus [45], el virus Saffold [46], el virus klasse/salivirus [47], el poliomavirus [49], el bufavirus [50], el tusavirus [51] y el recovirus [52]. Aunque estos virus se encuentran en individuos con diarrea, para la mayoría de ellos el grado de circulación (prevalencia) y la capacidad de causar enfermedades morbosas (patogénesis) queda por determinar, como se describe a continuación (véase también la Tabla 1). Sólo se encuentra en baja prevalencia; **: Sólo se dispone de datos limitados sobre este virus; ***: Se observaron anticuerpos contra el HMO-C del astrovirus, mientras que no se encontraron anticuerpos contra el HMO-A del astrovirus (HMO = astrovirus de tipo humano-mink-ovina); -No se han publicado datos disponibles;•El Picobirnavirus, el tunavirus y el recovirus se identificaron en el tracto gastrointestinal después de la secuenciación de la próxima generación, pero no se dispone de información sobre la respuesta de anticuerpos o la asociación con diarrea. El primer clado consiste en los astrovirus VA-1, VA-2, VA-3, VA-4 y VA-5, que están genéticamente relacionados con los astrovirus felinos y porcinos, mientras que el segundo clado consiste en los astrovirus MLB1, MLB2 y MLB3 y forman un grupo separado [55, 57, [74] [75] [76] [77] [78]. Para estos nuevos clados queda por determinar la patogénesis ya que los virus se han identificado en pacientes con y sin diarrea, y en algunos estudios los virus se asociaron con diarrea mientras que en otros no se pudo encontrar ninguna asociación [55] [56]. Además se observó una respuesta de anticuerpos contra algunos pero no todos los tipos nuevos de astrovirus [54, 58]. Recientemente, también se ha detectado astrovirus MLB2 en el plasma sanguíneo de un niño febril [79] y astrovirus VA1 en una muestra de biopsia de corteza frontal de un paciente con encefalitis [80], lo que sugiere que la infección por astrovirus puede no limitarse al tracto gastrointestinal. En 2008, se observó el virus Saffold en una muestra de heces de un paciente pediátrico con fiebre de origen desconocido [46]. Aunque el virus Saffold tipo 3 fue cultivado en una línea celular epitelial del carcinoma cervical humano (HeLa), se observaron efectos citopáticos y se encontraron anticuerpos neutralizantes en muestras séricas [59], estudios de casos y controles posteriores mostraron que el virus no estaba significativamente asociado con diarrea [53, 60, 61]. Además, en 2008 se identificó el virus cosavirus en un paciente con diarrea [45]. Sin embargo, un estudio de caso-control mostró que este virus también fue detectado en una cantidad sustancial de individuos sin diarrea y no está asociado con diarrea [32, 62, 63]. El virus Klasse/salivirus fue identificado en 2009 en dos muestras fecales de lactantes con trastornos gastrointestinales [47, 48]. En dos estudios la detección de este virus fue asociada con diarrea [48, 53], mientras que en otro estudio no se encontró asociación con enfermedad [65]. Se obtuvo evidencia serológica de infección por klassevirus humano, sugiriendo que el virus infecta células humanas [64]. Con el uso de técnicas de secuenciación de próxima generación, también se identificaron tres poliomavirus nuevos en muestras fecales humanas. El poliomavirus MW se identificó en las heces de un niño sano de Malawi en 2012 [49], y en el mismo año se encontró poliomavirus MX en muestras de heces de pacientes con y sin diarrea de México, Estados Unidos y Chili [68]. Un año después, se encontró poliomavirus STL en las heces de un niño sano de Malawi [71]. Se observó una respuesta de anticuerpos contra el poliomavirus MX [66] y el poliomavirus MW [69], aunque el poliomavirus MW [67] y el poliomavirus STL [70] no se asociaron significativamente con diarrea en dos estudios independientes de control de casos. El bufavirus es miembro del Parvoviridae y fue descrito por primera vez en 2012 [50]. Dos casos de control en Tailandia y Turquía mostraron que el virus sólo se encontró en pacientes con diarrea y no en controles [72, 73] ; sin embargo, debido a la baja prevalencia (respectivamente 0,3% en Tailandia y 1,4% en Turquía), no se encontró ninguna asociación significativa con la enfermedad. Tusavirus, otro miembro recientemente descrito de los Parvoviridae, fue identificado en las heces de un niño de Túnez con diarrea inexplicable [51], y hasta ahora este es el único estudio que describe este virus. Recovirus es un miembro nuevo de los Caliciviridae y se encontró en muestras de diarrea de Bangladesh [52]. Al igual que el tunavirus, este es el único estudio que describe este virus hasta ahora. La identificación de los virus nuevos mencionados sin duda aumentó nuestros conocimientos sobre virus que se pueden encontrar en el tracto gastrointestinal de los humanos, sin embargo se desconoce cuántos de estos virus nuevos son realmente enteropatógenos. Las heces humanas contienen una amplia variedad de virus que se pueden derivar de diferentes hospedadores: Además de los virus humanos genuinos, los virus alimentarios vegetales [32,81] y los virus alimentarios animales [82] también se pueden encontrar en las heces humanas, así como bacteriófagos y virus que infectan a los protozoos [32]. Incluso los virus derivados de otras partes del cuerpo se pueden encontrar en muestras fecales, como el virus del polioma de John Cunningham originario del riñón que termina en heces a través de orina [83], y los rinovirus [84], bocavirus [85] y coronavirus [86] procedentes del tracto respiratorio y probablemente ingeridos. Además, los virus que infectan células sanguíneas como el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1 también se pueden detectar en muestras fecales [87]. Por lo tanto, una vez identificado un virus nuevo en muestras de heces humanas, no se indica que este virus se esté replicando en células intestinales humanas. Koch reconoció ya en 1891 que asociar la presencia de un determinado agente con una determinada enfermedad es complejo, y por lo tanto postula directrices que deben seguirse antes de que un agente pueda ser clasificado como patógeno [88]. Sus postulados pueden resumirse en tres puntos: (1) El microbio ocurre en cada caso de la enfermedad en cuestión y en circunstancias que pueden explicar los cambios patológicos y el curso clínico de la enfermedad; (2) el microbio no ocurre en ninguna otra enfermedad como un parásito fortuito y no patogénico; y (3), después de estar completamente aislado del cuerpo y crecido repetidamente en cultivo puro, el microbio puede inducir la enfermedad de nuevo. Si un microbio ha cumplido estos tres postulados, puede afirmarse que "la aparición del microbio en la enfermedad ya no puede ser accidental, pero en este caso no se puede considerar ninguna otra relación entre ella y la enfermedad, excepto que el microbio es la causa de la enfermedad". Sin embargo, para los virus entéricos, estos postulados no son aplicables. Primero, los virus entéricos no se cultivan fácilmente [89] [90] [91], y, segundo, se ha descrito la vaina prolongada de agentes virales e infección asintomática [92], revisado en la literatura [93]. Aunque se han hecho intentos de ajustar los postulados de Koch específicamente para virus y las metodologías actuales implementadas [94] [95] [96], el cumplimiento de estos postulados todavía no es factible en la mayoría de las ocasiones debido a la falta de un sistema eficiente de cultivo celular, dificultades en la síntesis de antígenos y altos niveles de diversidad genética viral dentro de los grupos virales, revisados en la literatura [97]. Se han hecho varios enfoques para desarrollar una metodología que añade mayor importancia al descubrimiento de un nuevo virus.Un enfoque se basa en el enriquecimiento de virus inmunogénicos antes de la secuenciación de la próxima generación mediante el uso de la captura autóloga de anticuerpos antes de la secuenciación.Este método fue probado y validado en varias muestras fecales que contienen adenovirus, sapovirus y norovirus, y ha demostrado enriquecer virus inmunogénicos, mientras que los virus vegetales y bacteriófagos no se Otro método para enriquecer a los virus relevantes antes de la secuenciación de la próxima generación es la llamada plataforma de secuenciación de captura del viroma para los virus vertebrados (VirCapSeq-VERT) que utiliza ~2 millones de sondas que cubren los genomas de todos los miembros de los taxones virales conocidos por infectar vertebrados [99]. Sin embargo, ambos métodos tienen limitaciones: Para el método de captura de anticuerpos, los virus necesitan estar presentes en cargas virales altas, y la sangre, suero o plasma convalecientes necesita estar disponible. Una desventaja de la técnica VirCapSeq-VERT es que no se identificarán virus completamente nuevos, por ejemplo, virus de una nueva familia de virus. El método más sencillo para demostrar la asociación con la enfermedad es el uso de estudios de casos y controles. Además, mientras que en los últimos años se han realizado estudios de casos y controles utilizando PCR convencionales en tiempo real (RT-PCR), en el futuro se pueden utilizar técnicas de secuenciación independientes de próxima generación para tales estudios de casos y controles. Dado que permite la detección de prácticamente todos los ácidos nucleicos, la secuenciación de la próxima generación tiene varias ventajas en comparación con los RT-PCR específicos. La secuenciación de la próxima generación impide la necesidad de realizar numerosos RT-PCR para detectar todos los virus que se sospecha que están asociados con la enfermedad, y se pueden detectar nuevas variantes de familias virales conocidas actualmente o nuevas especies de virus que pueden ser especialmente beneficiosas si sólo se dispone de unos pocos genomas de referencia. El principal beneficio de esta base de datos es que en el futuro inmediato la pregunta más importante puede ser respondida si se identifica un virus nuevo en casos de diarrea: ¿es probable que el virus cause enfermedad? En conclusión, la Es de esperar que en un futuro próximo se describan varios virus nuevos, ya que la detección de estos agentes utilizando las actuales tecnologías de secuencia de la próxima generación ya no es una dificultad. Por lo tanto, añadir relevancia al descubrimiento de virus nuevos debería ser el objetivo principal para futuros estudios.

Si los tres postulados de Koch se cumplen, ¿qué indica esto?

Neutralización Interfiriendo Anticuerpos: ¿Un “Novela” Ejemplo de Disfunción Inmune Humoral Facilitando la Escape Viral? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499828/SHA: f4f75af02b7226c5b2363de1a75821a4b9b20412Autores: Nicasio, Mancini; Sautto, Giuseppe; Clementi, Nicola; Diotti, Roberta A.; Criscuolo, Elena; Castelli, Matteo; Solforosi, Laura; Clementi, Massimo; Burioni, RobertoFecha: 2012-09-24DOI: 10.3390/v4091731Licencia: cc-byAbstract: La respuesta inmune contra algunos patógenos virales, en particular aquellos que causan infecciones crónicas, es a menudo ineficaz a pesar de una respuesta neutralizante humoral robusta. Se han descrito varios mecanismos de evasión capaces de subvertir la actividad de los anticuerpos neutralizantes (nAbs), entre los que se encuentra la hipótesis de la excitación de los Abs no neutralizantes e interferentes. Recientemente, este mecanismo de evasión ha adquirido un interés creciente por su posible impacto en los nuevos enfoques antivirales terapéuticos y profilácticos basados en nAb. En esta revisión, ilustramos los mecanismos de interferencia mediada por Ab y los patógenos virales descritos en la literatura como capaces de adoptar esta estrategia de evasión “novela”. Texto: Los virus hipervariables adoptan varios mecanismos para hacer frente a la respuesta inmune humoral del huésped. El mecanismo más estudiado es la acumulación de mutaciones puntuales en regiones inmunodominantes de proteínas superficiales, lo que ya no son reconocibles por anticuerpos neutralizantes (nAbs) [1] [2] [4]. Otros mecanismos de escape que involucran proteínas superficiales incluyen la glicosilación de residuos funcionalmente pivotales (el escudo de glicanos) o su asociación con componentes séricos del huésped (por ejemplo, lipoproteínas) con el fin de ocultarlos del sistema inmunitario [5] [6] [7] [9] (Figura 1A ). Otros mecanismos de escape conocidos son: i) una especie de vía protegida de propagación del virus, como la transmisión de células a células [10, 11] ; ii) la mímica molecular entre las proteínas virales y los autoantígenos del huésped o iii) la estimulación inducida por virus de anticuerpos subfamiliares restringidos (Abs), ambas con implicaciones obvias en enfermedades autoinmunes inducidas por virus como la crioglobulinemia para el VHC [12] [13] [14]. El posible efecto de interferencia de los abs no neutralizantes (nonabs) fue propuesto originalmente por Dul en 1956 [15], para explicar la aparente inhibición de la neutralización del virus ejercida por algunas muestras séricas. Recientemente, este mecanismo de escape inmune propuesto ha readquirido un interés relevante, especialmente teniendo en cuenta el uso clínico potencial de nAbs antiinfeccioso neutralizante o el diseño de aproximaciones vaccinales basadas en epitopes [16]. Hasta la fecha, se han propuesto dos mecanismos principales para los efectos de interferencia de nonAbs: (i) interferencia de unión directa por obstáculo esterínico, (ii) inhibición de la unión tras cambios conformacionales del antígeno viral unido por interferir nonAbs. Además, se ha especulado que, incluso cuando no interfiere directamente con la unión de nAbs, nonAbs puede conducir también a la mejora de la infección viral a través de la interacción con receptores Fc o receptores de complemento [17]. En general, los no-nAbs posiblemente provocados en individuos infectados o vacunados pueden interferir con el potencial neutralizante de los nAbs. En más detalle, estos Abs interferentes son capaces de unirse a proteínas virales a nivel de inmunodominante pero funcionalmente irrelevantes regiones de proteínas virales, disminuyendo o bloqueando la unión de nAbs a epítopos virales cruciales (por ejemplo, dominios de unión a receptores) (Figura 1B ) [18]. Un anticuerpo monoclonal antiviral candidato (mAb) o preparación policlonal no debe ser sometido a este mecanismo de interferencia, o a los otros mecanismos de escape mencionados anteriormente. Del mismo modo, nuevos enfoques vaccinales deben evitar la excitación de los Abs interferentes que incluso podrían empeorar la enfermedad en caso de una infección real. En los siguientes párrafos discutimos estos mecanismos con ejemplos específicos de su papel en el El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus envuelto de ARN de sentido positivo que causa hepatitis crónica en la mayoría de los pacientes no tratados (alrededor del 80%), con el consiguiente riesgo de desarrollar cirrosis y carcinoma hepatocelular. Más de 170 millones de personas (2%-3% de la población mundial) están infectadas en todo el mundo, y todavía no se dispone de una vacuna protectora, mientras que las opciones terapéuticas siguen siendo limitadas y no son completamente eficaces [19]. Por estas razones, la infección crónica por VHC representa la principal indicación de trasplante hepático en Europa y Estados Unidos. Además, los receptores trasplantados están sujetos a un alto riesgo de reinfección del injerto y a una progresión más severa y rápida de la enfermedad hepática [20]. Representación esquemática de los mecanismos de escape viral de la respuesta inmune humoral frente a proteínas virales superficiales: mutaciones puntuales en regiones inmunodominantes, glicosilación de residuos funcionalmente pivotales (escudo glucano) de las proteínas superficiales virales y asociación del virus con los componentes séricos del huésped (por ejemplo, lipoproteínas) (B) Mecanismos de interferencia en la neutralización del virus mediado por nAb mediante la unión de los Abs non-n-n-Abs interferentes: los Abs noneutralizantes/interferentes pueden interferir en la unión de nAbs por un obstáculo estéril tras una ocupación espacial de su epítopo o una competencia por la unión; de lo contrario, la unión de los Abs noneutralizantes/interferentes puede inducir cambios conformacionales en la proteína viral, afectando así la unión de nAbs al El genoma del VHC codifica una sola poliproteína de unos 3.000 aminoácidos que es procesada por las proteasasas del huésped y virales en al menos 3 proteínas estructurales (núcleo, E1 y E2) y 7 no estructurales (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) [21, 22]. En particular, las glicoproteínas de membrana de tipo I E1 y E2 forman heterodímeros no covalentes en la superficie de la envoltura del VHC y permiten que la endocitosis viral mediada por clatrina interactúe consecutivamente con varios factores celulares de entrada tales como los glicosaminoglicanos [23] [24] [25], el receptor de lipoproteínas de baja densidad [26, 27], el receptor de la clase B del escavenger tipo I [28], el CD81 de tetraspanina [29], las proteínas de unión estrecha claudin-1 y ocludin, y el recientemente descrito receptor de absorción de colesterol Niemann-Pick C1 similar a [30] [31] [33] [34]. El desarrollo de enfoques profilácticos y terapéuticos eficaces contra este virus se ha visto obstaculizado principalmente por su alta tasa de mutación que da lugar a variantes virales altamente diversificadas, incluso dentro de un solo paciente (cuasiespecies) [35]. De hecho, siete genotipos principales, que varían hasta un 30% en la secuencia de nucleótidos, y varios subtipos son reconocidos, cada uno caracterizado por diferentes características clínicas tales como diferentes tasas evolutivas a las enfermedades hepáticas crónicas o diferente respuesta a las terapias antivirales disponibles [21, 36, 37]. El desarrollo y uso de mAbs anti-VHC capaces de dirigir regiones estructural y funcionalmente conservadas de las partículas virales altamente variables se consideran como nuevas herramientas terapéuticas [38] [39] [40] [42] [43]. En particular, se ha demostrado que la producción de nAbs potentes en infecciones Además, en los chimpancés vacunados, una respuesta sostenida de Ab a las glicoproteínas envolventes E1 y E2 se correlaciona con una viremia reducida [45], mientras que la administración pasiva de mAbs neutralizante en un modelo de infección de ratón quimérico uPA-SCID fue capaz de proteger contra el desafío con un inóculo de cuasiespecie del VHC [46]. Los mAbs ampliamente neutralizantes humanos dirigidos contra la glicoproteína superficial E2 del VHC (HCV/E2) se dirigen típicamente contra regiones funcionalmente importantes dentro del sitio de unión CD81 [47] [48] [48] [50] [51] [52] [53] [54], así como contra otros residuos críticos altamente conservados entre diferentes genotipos [55, 56]. Este aspecto es crucial para el posible uso terapéutico in vivo de estos mAbs, pero puede no ser suficiente ya que recientemente se ha supuesto que otras poblaciones nonAb pueden interferir con su actividad neutralizante [39, [57] [58] [59] [61]. De hecho, en los individuos persistentemente infectados contra el VHC/E2 los abdominales cruzados generalmente son provocados en un título bajo y en una etapa tardía de la infección, lo que conduce a un pobre control de la viremia, mientras que el uso in vivo de preparados de inmunoglobulina policlonal anti-VHC tanto en chimpancés como en humanos ha sido decepcionante, y los estudios clínicos han demostrado que estos preparados no previenen infecciones recurrentes en pacientes después del trasplante hepático [63]. A este respecto, un documento reciente ha sugerido que el efecto de algunos de estos nAbs, dirigidos contra residuos funcionalmente importantes involucrados en la unión viral al CD81 (dentro del epítopo I, que abarca residuos aminoácidos 412-426), podría verse obstaculizado por la presencia de residuos no nAbs vinculantes dentro del epítopo II en el VHC/E2 (residuos aminoácidos 434-446) [58]. En particular, el bloqueo de estos Abs específicos del epítopo II interferentes no sólo aumentó el título neutralizante del suero que contiene tanto el epítopopopo I como el Abs específico del epítopo II, sino que también descubrió una respuesta más amplia neutralizante del genotipo cruzado [58]. Sin embargo, el papel (y la existencia misma) de estos Abs interferentes en la influencia de la infección por medio de ensayos de neutralización in vitro utilizando VHC derivados del suero del genotipo 4a y Abs policlonales derivados de cabras inmunizadas con diferentes péptidos conservados que abarcan residuos aminoácidos 412-419, 430-447 y 517-531 de glucoproteína VHC/E2 [64]. En particular, este grupo encontró una actividad interferida ejercida por los débiles neutralizantes 430-447-eliminados Abs sobre la actividad neutralizante tanto de la 412-419 como de la 517-531-eliminada Abs [64]. Curiosamente, de acuerdo con el modelo putativo para plegado E2, las tres regiones mencionadas estarían unas junto a otras en la glucoproteína [48]. Por lo tanto, esta predicción estructural posiblemente apoya el efecto interferente del epitopope II dirigido Abs. Sin embargo, mientras Con este fin, la disponibilidad de cristal E1-E2 sin duda acelerará la dilucidación fina de las proximidades espaciales de neutralización e interferencia de mAbs en la estructura E1-E2 y, en consecuencia, el progreso de la vacuna basada en la estructura. Además, cabe destacar que los individuos con Abs que se dirigen a la región de E2 que abarca el epítopo I albergan frecuentemente Abs que reconocen la región que contiene el epítopo II, confirmando así la co-inmunogenicidad de estos epitopes [58]. Por último, se ha demostrado tanto una baja prevalencia (menos del 2,5%) y un bajo título de Epítopo I-reactiva Abs en suera de infecciones crónicas y agudas resueltas, apoyando así la hipótesis de un enmascaramiento conformacional por regiones adyacentes como la que contiene el epítopo II [65]. Al principio se planteó la idea de que una vez que el epítopo II se une a un Ab, el sitio del epítopo I se enmascara y ya no puede ser reconocido por nAbs específicos. De hecho, el agotamiento de Abs al epítopo II en plasma de un paciente con VHC crónicamente infectado y chimpancés vacunados recuperó una actividad neutralizante de otro genotipo cruzado indetectable [58]. Otra posibilidad es que la unión inicial de Abs a la región que contiene el epítopo II puede inducir cambios conformacionales en E2 que inhiben la unión por el epítopopeo I-dirigido Abs, como recientemente sugirió Lapierre et al. para otros anti-HCV/E2 Abs [66]. Por el contrario, estas conclusiones no fueron apoyadas en un estudio reciente de Tarr et al. utilizando murina (AP33) y ratas (2/69a) mAbs, así como fracciones de inmunoglobulina humana de afinidad purificada en péptidos lineales que representan dominios distintos VHC/E2 agrupados dentro de las regiones 412-426 y 434-446 [67]. Aunque confirmando la co-inmunogenicidad previamente reportada de estas dos regiones, los autores no demostraron ninguna inhibición entre estos dos grupos de Abs. Teniendo en cuenta sus resultados, los autores sugirieron de hecho que la interferencia de non-Abs, al menos en la región que abarca residuos 434-446, no es un mecanismo posible para la persistencia del VHC en individuos infectados crónicamente, como había sido propuesto originalmente por Zhang y otros. De acuerdo con los hallazgos de Tarr y colegas, Keck et al. describieron anti-HCV/E2 mAbs encuadernación epítopos Estos mAbs son ampliamente neutralizantes y no conducen a mutantes de escape viral, demostrando la importancia funcional de sus epítopos. Los autores concluyen que no todos los Abs dirigidos contra el epítopo II están interfiriendo, pero también especulan que la actividad de interferencia podría limitarse a Abs reconociendo epitopes lineales dentro de él [56]. Recientemente, hemos confirmado en parte las observaciones de Zhang et al. utilizando un panel de anti-HCV/E2 mAbs: el ratón bien caracterizado anti-HCV/E2 mAb AP33, cuyo epítopo abarca el epítopo I (residuos aminoácidos 412-423), y un anti-HCV/E2 mAb humano débilmente neutralizante (llamado e509), cuyo epítopo abarca el epítopo II [68]. En particular, encontramos que e509 es capaz de interferir con la actividad neutralizante de AP33 en el virus del genotipo 1a (cepa H77). En cambio, encontramos que e509 no interfiere mínimamente con la actividad de otros dos seres humanos ampliamente neutralizantes anti-VHC/E2 mAbs, llamados e20 y e137 [49, 69]. Curiosamente, encontramos que tanto e20 y e137 se unen también a residuos dentro del epitope II, a una afinidad más alta que e509, desplazándolo así del epitope interferente y, por lo tanto, manteniendo inalterada su actividad neutralizante. Así, en nuestra opinión, las observaciones divergentes descritas anteriormente pueden depender de las diferentes especificidades Ab presentes en las preparaciones policlonales utilizadas y, probablemente, también en los diferentes genotipos VHC que infectan a los pacientes estudiados [68 Además, las diferentes estrategias adoptadas para aislar el epítopo I y el epítopo II Abs, seguidas en los estudios anteriores, podrían explicar los diferentes datos obtenidos. De hecho, las inmunoglobulinas purificadas en péptidos que representan distintas regiones del VHC/E2 [67] están obviamente dirigidas contra epítopos lineales; estos preparados son ciertamente diferentes de mAbs clonados utilizando una glucoproteína VHC/E2 de larga duración, que son más probablemente dirigidas contra epítopos conformacionales incluyendo también residuos fuera de las regiones lineales investigadas [54]. En resumen, en el campo del VHC varios trabajos apoyan la existencia de poblaciones de Ab que interfieren e hipotetizan su posible papel en la persistencia del VHC, como se demostró con preparados de inmunoglobulina derivados del plasma humano, mAbs humanos y sura de animales vacunados con pé El posible mecanismo que conduce a la interferencia sigue siendo controversial, pero tanto el obstáculo esterico directo como los cambios conformacionales inducidos por antígenos han sido hipotetizados. Por otro lado, otros documentos no confirman estos hallazgos, sugiriendo que el epítopo interferente putativo II puede ser dirigido por Abs dotados de una actividad ampliamente neutralizante. Nuestro artículo reciente, utilizando bien caracterizado mAbs [68], muestra que los Abs interferentes existen pero que su efecto global puede estar sesgado por la presencia de nAbs con diferentes características de unión y por el genotipo del VHC infectado. Los trabajos futuros que investigan el papel in vivo de estas subpoblaciones interferentes en la persistencia del VHC sin duda serán muy útiles. Los virus de la gripe circulan por todo el mundo en depósitos de animales, especialmente aves acuáticas, que pueden afectar a los seres humanos de cualquier grupo de edad. El tipo más clínicamente relevante y variable es la gripe A, que se divide en varios subtipos, según la característica antigénica de las dos glicoproteínas envolventes, y causa infecciones epidémicas y pandémicas [70]. Las epidemias anuales recurrentes de gripe se asocian con morbilidad y mortalidad significativas, particularmente entre los grupos de riesgo (como personas de edad avanzada o con enfermedades crónicas, mujeres embarazadas y niños) [71] ; la propagación mundial de virus de gripe pandémica puede causar millones de muertes [72]. Dentro del virio de gripe envuelto ocho segmentos de ARN de una sola cadena negativa están protegidos por la proteína nucleocápsida, formando la ribonucleoproteína (RNP). Los primeros seis segmentos de ARN cada uno para una sola proteína: PB2, PB1 y PA (todos constituyen la polimerasa ARN dependiente de ARN), la hemaglutinina (HA), la nucleoproteína (NP), la neuraminidasa (NA). Los últimos dos segmentos cada uno para dos proteínas diferentes: las proteínas de la matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2). Tres proteínas diferentes (HA, NA y M2) están presentes en la envoltura viral. La glucoproteína HA es la más abundante y es el objetivo principal de la respuesta inmune humoral. Junto con la glucoproteína transmembrana NA, HA es capaz de provocar una respuesta inmune subtipo-específica que es totalmente protectora dentro, pero sólo parcialmente protectora a través de diferentes subtipos [73]. La HA se sintetiza como precursor inactivo que pasa a su forma activa sobre la escisión por proteasasas de células huésped, y que está presente en la membrana viral como homotrimeros. Los recortadores de HA se unen a moléculas de ácido siálico 2,6 vinculadas a proteínas de membrana celular o lípidos a través de dominios ubicados en la cabeza globular de cada monómero. Posteriormente, la envoltura viral se fusiona por mecanismos dependientes de clatrina e independientes con la membrana de vesícula endocítica a través del péptido de fusión de HA ubicado en la región madre de cada monómero. Como consecuencia, los componentes virales se liberan en la célula huésped y pueden subvertir las capacidades sintéticas de la célula huésped para la producción y liberación de partículas de progenie [74]. La inmunidad humoral juega un papel importante en la defensa del huésped contra la infección por el virus de la gripe, ya que la mayoría de los virus de la gripe neutralizan el Abs y, por lo tanto, limitan la infección [75] [77] [78]. De hecho, un gran cuerpo de trabajos experimentales sugiere que la oclusión del sitio de unión del receptor en la HA por Abs es el principal mecanismo de neutralización viral de la gripe. Menos común, pero más ampliamente nAbs puede neutralizar el virus de la gripe al inhibir la fusión de la envoltura viral con la membrana endocítica-vesícula [50, [79] [80] [81] [82] [83]. Los cambios aminoácidos en la HA, más frecuentes en la cabeza globular inmunodominante, tienen efectos complejos sobre la neutralización viral por Abs, generalmente permitiendo que las variantes mutadas escapen de Los estudios clásicos utilizando mAbs de ratón neutralizante identificaron cinco sitios antigénicos distintos (A-E) en la región globular de la cabeza HA1 en la estructura tridimensional de la molécula H3 HA (A/Hong Kong/1/68) [85] [86] [87] así como en los subtipos H1 [88] y H2 [89]. Durante los primeros días de una infección, el título de nAb es a menudo bajo, mientras que el título de nonAbs es más alto y puede desempeñar un papel en el resultado de una infección, como se ha observado recientemente en los pacientes infectados por el virus pandémico influenza A/2009 H1N1 por To et al. [90]. En particular, este grupo encontró que la cantidad, así como la avidez, de nonAbs eran mayores para los pacientes con enfermedad grave que para aquellos con enfermedad leve. Los autores concluyeron que una respuesta no-nAb exagerada durante la etapa temprana de la infección se asoció con enfermedad grave [90]. Además, los autores especularon que los no-nAbs presentes en los sueros de los pacientes durante la etapa temprana de la infección eran probablemente preexistentes o el resultado de una respuesta inmune humoral heterosubtípica secundaria contra epítopos más conservados en varias proteínas de la gripe [91]. Esta respuesta humoral temprana puede ser provocada dentro de unos pocos días después de la infección, debido a la inmunidad por la exposición previa a epitopos virales compartidos. De hecho, las proteínas matrices y nucleoproteínas han conservado secuencias aminoácidos, y por lo tanto Abs contra estas proteínas de la infección anterior del virus de la gripe estacional o vacunación podría ser inducido [92]. De hecho, tras la infección por el virus de la gripe, las células B de la memoria pueden proliferar rápidamente y generar una gran cantidad de estas avidez non-Abs, especialmente en pacientes con enfermedad grave, lo que concuerda con la observación de que el número de células B de sangre periférica es mayor en pacientes con enfermedad grave que en aquellos con enfermedad leve durante la fase temprana de la infección. El mecanismo de interferencia de neutralización de Ab también ha sido especulado indirectamente por Ndifon et al., quienes observaron que algunos cambios aminoácidos en la HA en realidad aumentan la eficiencia de neutralización de variantes de escape por Abs previamente generados, aunque no influyan directamente en su unión [93]. En detalle, este grupo sugirió que el aumento de la actividad neutralizante después de la mutación de HA podría ser el resultado de una menor interferencia estéril entre Abs. Específicamente, si hay una competencia esterical para la unión a la HA por Abs con diferente eficiencia de neutralización, entonces una mutación que reduce la unión de Abs con baja actividad neutralizante podría aumentar la neutralización viral general. De hecho, al igual que lo que se ha especulado para el VHC, Abs que se unen a los epítopos de HA ubicados a una distancia del sitio de unión al receptor puede por lo tanto no ocupar este sitio de manera eficiente, lo que conduce a una disminución de la neutralización viral. Además, se ha demostrado que Abs que se unen a un determinado epítopope de HA puede impedir una mayor unión de Abs a otros epítopos de la misma proteína de HA, e incluso a los epítopos encontrados en proteínas de HA adyacentes. Las observaciones anteriores sugieren que Abs que se unen a los epítopos de baja eficiencia de neutralización de Considerando la estructura de la HA, la unión de los Abs interferentes estaría en el nivel del epítopo C y E situado lejos del sitio de unión del receptor en la cabeza globular de la HA. Sin embargo, la unión de estos Abs puede influir en la unión de nAbs a los epítopos A, B y D, situados más cerca del sitio de unión del receptor [93]. A este respecto, los cambios en el epítopo A, B y D podrían ser muy favorecidos por la selección natural, mientras que los cambios en los epítopos C y E podrían ser desfavorables a los virus de la gripe [93]. De hecho, los obstáculos estericos por Abs que unen estos epítopos podrían reducir en gran medida el grado de mutación necesario para que un virus evada la neutralización por el huésped Abs. En consecuencia, una disminución en la afinidad de Abs por los epítopos con una eficiencia de baja neutralización podría conducir a un aumento en la neutralización viral. Esto sugiere un posible enfoque para diseñar vacunas de "baja interferencia" que podrían disminuir en gran medida el impacto de la interferencia Ab. Estos inmunogenes son modificados genéticamente desde el objetivo viral sólo en el nivel de los epítopos de baja eficiencia de neutralización. De hecho, los abs inducidos por la vacuna sólo reconocen epitopes de alta eficiencia de neutralización del objetivo y los abs inducidos por la cepa vacuna de baja interferencia tienen baja afinidad por los epítopos de baja eficiencia de neutralización de la cepa de virus circulante objetivo. En consecuencia, limitando la interferencia mediada por Ab, el virus diana no puede escapar del Abs inducido por la vacuna a través de pequeños cambios epitópicos. Alternativamente, las vacunas podrían ser diseñadas para incluir solamente aquellas regiones que corresponden a epítopos con alta eficiencia de neutralización. Además, los fármacos antivirales podrían ser diseñados para incluir proteínas virales que transportan modificaciones a nivel de epítopos de alta eficiencia de neutralización; estas proteínas "decoy" competirían con el virus por la unión a la eficiencia de baja neutralización Abs de una manera similar a la que juegan los inhibidores de la neuraminidasa. En síntesis, la disponibilidad de la estructura cristalina de HA ha ayudado a confirmar la existencia y explicar los mecanismos de interferencia por anti-HA Abs no o débilmente neutralizantes. [90] evidenciando que una respuesta non-Ab durante la fase temprana de la infección está asociada con una enfermedad grave, puede ser la primera prueba del papel de estos Abs interferentes en el curso de una infección natural. Los [94]. Más de 8.000 casos, incluyendo casi 800 muertes, fueron reportados durante el período del brote y el aumento de la edad y la comorbilidad fueron factores de riesgo de enfermedad grave y muerte [95]. Desde 2003, sólo se han reportado casos esporádicos; sin embargo, la posibilidad de que brotes de SARS puedan reaparecer de forma natural o ser liberados deliberadamente es un problema de salud pública. Al igual que los virus de la gripe, el SARS-CoV circula en depósitos de animales, con murciélagos que se cree que transmiten el virus a pequeños mamíferos con exposición a estos pequeños animales como fuente de infecciones humanas [96]. La enfermedad clínica es similar a otras infecciones respiratorias agudas graves, incluyendo la gripe, y la definición de caso SRAS incluye criterios clínicos, epidemiológicos y de laboratorio [97, 98]. La organización básica del genoma y el ciclo replicativo es similar para todas las CoVs. Gene 1 codifica todas las proteínas predichas de replicase/transcriptasa, que se traducen a partir de ARN genómico de entrada, mientras que los genes 2-9 codifican proteínas estructurales y accesorias, incluyendo la proteína de pico de sobre (S), que se traducen a partir de ARNm subgenómicos separados. Las CoVs utilizan un mecanismo discontinuado único para transcribir una serie de ARNm subgenómicos progresivamente más grandes, y cada una contiene una secuencia de ARN líder que se deriva del extremo 5' del genoma [99]. La proteína S de CoVs se inserta en la envoltura de los eventos de unión y fusión del virión necesarios para la infección, y es el objetivo principal de la inmunidad protectora humoral [100]. Aunque la proteína S de SARS-CoV (SARS-S) comparte poca identidad aminoácida (aproximadamente 20%-27%), comparte características estructurales comunes con las proteínas S de los otros miembros de la familia Coronaviridae. La proteína SRAS-S es una glicoproteína transmembrana tipo I de aproximadamente 1.255 aminoácidos en longitud y dividida en dos dominios funcionales: S1 (residuos aminoácidos 15-680) y S2 (residuos aminoácidos 681-1,255) [101]. En muchas CoVs, la proteína S se escinde durante la biogénesis y estos dos dominios funcionales se mantienen juntos no covalentes; sin embargo, como en el caso de la CoV humana 229E, la proteína S no se escinde en el SARS-CoV [102]. El dominio S1 forma una estructura globular que media la interacción de la proteína S con su receptor principal, la enzima de conversión de la angiotensina 2 (ACE2), mientras que el dominio S2 media la fusión y contiene el péptido de fusión putativa y dos regiones helicoidales conservadas (HR1 y HR2) que sobre la escisión por la catepsina proteasa endosomal L forman el núcleo de fusión de seis paquetes de hélice [103]. Sin embargo, tal estrategia plantea un dilema singular para las COV, ya que los protocolos de vacunación anteriores han puesto de relieve la posibilidad de una mejora inmunomediada de la enfermedad [104]. A este respecto, el grupo de Zhong et al. investigaron el papel de los ABS interferentes no neutralizantes también en el caso de la infección por SARS-CoV [105]. En particular, encontraron que dos mAbs dirigidos contra la región que abarca residuos aminoácidos 491-510 de SARS-S (341C y 540C) actúan sinérgicamente para inhibir in vitro la infección por SARS-CoV, mientras que un mAb (240C) no neutralizante, cuyo epítopo abarca la región mencionada, interrumpió la actividad neutralizante de 341C y 540C [105, 106]. Al analizar la estructura cristalina de la proteína SARS-S, los autores propusieron una posible explicación a lo observado, evidenciando que los epítopos de todos los mAbs están estrechamente empaquetados y proximales entre sí pero distales del sitio de unión del receptor ACE2 [105]. Además, el epítopo del mAb 240C no neutralizante se superpone parcialmente por al menos 2 aminoácidos (P507 y A508) con el del mAb 341C neutralizante. Como consecuencia, mAb 240C podría inhibir la unión de mAb 341C de manera relacionada con el equilibrio. Por otro lado, los autores encontraron que los 240C mAb podrían interferir estericamente con la unión del mAb 540C a través del mecanismo propuesto de ocupación espacial (Figura 1B). De hecho, la accesibilidad de mAb 540C a su epítopo puede ser bloqueada por la unión mAb 240C que enmascara la superficie que lo contiene. De hecho, como especulan Davies y Cohen, la zona enterrada de un Ab puede variar de 500 Å 2 a más de 800 Å 2 correspondiente a 21-32 aminoácidos, aunque sólo 9-20 residuos de aminoácidos (el epítopo real) hacen contacto directo con el Ab [107]. De hecho, como se observó anteriormente para el VHC, la gripe y otros virus humanos y animales [108], uno de los posibles mecanismos es que el bloque esterico por non-Abs reduce la unión de nAbs en la neutralización de la proteína SRAS. Por el contrario, a pesar de los epítopos de mAbs 341C y 540C se encuentran en un solo lazo; se separan espacialmente proporcionando interfaces distintas para la unión independiente de Ab. Para concluir, el SARS-CoV puede provocar potencialmente interferencias non-Abs presentando en su superficie regiones estrechamente embalados con diferentes características biológicas. Por otro lado, el huésped puede montar una vigorosa respuesta humoral neutralizante produciendo Abs que reconocen diferentes epitopes y actúan sinérgicamente. En particular, estos resultados sugieren que un cóctel de mAb humano neutralizante que puede unirse a epitopes únicos y tener diferentes mecanismos de acción podría ser de utilidad clínica contra la infección por SARS-CoV, e indicar que se puede aplicar un enfoque similar para tratar otras infecciones virales [109]. El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus positivo del ARN de una sola cadena, que causa morbilidad y mortalidad considerables en todo el mundo, especialmente en los países en desarrollo. Los virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 y 2 (VIH-1 y VIH-2) son los resultados de las transmisiones de múltiples especies del virus del simio al ser humano. La prevalencia del VIH-2 es baja y hay una mayor proporción de personas infectadas por el VIH-2 que no progresan hacia el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en comparación con las infectadas por el VIH-1 [110]. Los virus del VIH-1 son muy divergentes y se clasifican en cuatro grupos: M, N, O y P. En particular, el grupo M se subdivide en nueve subtipos y numerosas formas recombinantes circulantes [111]. El genoma de todos los retrovirus codifica las proteínas estructurales Gag, Pol y Env. Entre las proteínas estructurales del VIH, gp120 y gp41 envuelven la superficie glicoproteínas forman heterodímeros que se organizan como recortadores en la superficie de la membrana viral. La entrada del VIH-1 en las células diana se inicia por la interacción de estas glicoproteínas envolventes superficiales con CD4 y un co-receptor (típicamente CCR5 o CXCR4) en las células diana [112]. La porción gp120 une los receptores de las células diana, mientras que gp41 promueve la fusión de membranas virales y celulares [113]. Al unirse al receptor CD4, gp120 sufre un cambio conformacional, resultando en la exposición de epitopos que pueden ser unidos por moléculas co-receptoras y en la eventual formación de la conformación intermedia pre-pirpina transitoria [114] [115] [116]. En el intermedio pre-hairpin, las moléculas gp41 se reorganizan para que los péptidos N-terminales formen un recortador de hélices que exponen el péptido de fusión a la célula diana, mientras que los hélices C-terminales permanecen anclados a la membrana viral [113]. Esta etapa es vulnerable a un número de nAbs y péptidos capaces de unir los péptidos N-o C-terminales [117, 118]. Tras la fusión con la membrana celular diana, una mayor reorganización de gp41 resulta en la asociación de N-y C-terminales para crear un haz de seis hélices post-fusión [119]. Después de la fusión y la entrega del capsid viral en el citoplasma, el descubrimiento conduce a la liberación de enzimas virales, proteínas y ARN genómico dentro de la A continuación, se inicia la transcripción inversa del ARN positivo genómico viral de una sola cadena para producir un ADN proviral de doble cadena para ser importado en el núcleo e integrado en el cromosoma huésped. La transcripción activa del ADN proviral integrado se produce en presencia de NF-B y Tat viral. El empalme del ARNm viral produce proteínas accesorias tempranas como Tat, Rev y Nef, que ayudan en la transcripción, empalme y modificación de la maquinaria celular, respectivamente. La acumulación de Rev protege el ARNm viral de la empalme, lo que produce ARNm cada vez más largos capaces de codificar proteínas estructurales y envolventes, y finalmente los ARN genómicos virales están listos para ser cautivados [111]. La terapia antirretroviral para el VIH es altamente eficaz en el control de la infección; sin embargo, la erradicación de este virus es actualmente imposible y el Una vacuna es ampliamente considerada como crucial para el control de la epidemia, pero varios esfuerzos avanzados para desarrollar una profilaxis efectiva resultaron infructuosos [120, 121]. Uno de los mayores desafíos en el desarrollo de una vacuna contra el VIH es superar su capacidad de mutar constantemente y escapar de las respuestas inmunitarias anti-VIH [122]. Esta alta tasa de mutación es un resultado directo de la presencia de ARN polimerasa de baja fidelidad del virus, así como los altos niveles de recombinación que sufre y el escudo glucano en constante evolución de las glucoproteínas de envoltorio [123] [124] [125]. A este respecto, tanto los linfocitos citotóxicos como los nAbs han sido reportados durante mucho tiempo para seleccionar variantes de escape inmune durante el curso de la infección por el VIH-1 [126] [127]. Una inmunoterapia pasiva candidata podría consistir, como se sugirió anteriormente para la infección por SARS-CoV, en la administración de un cóctel de mAbs ampliamente neutralizante, que podría minimizar la aparición de mutantes de escape viral [129]. Se han estudiado varias combinaciones de mAbs humanos en los últimos años que han mostrado efectos aditivos, sinérgicos o antagónicos en la neutralización del VIH-1 [130] [133] [133] [134] [135]. El efecto antagonista en la neutralización del VIH-1 se ha reportado previamente con un par de anti-gp120 mAbs dirigidos contra el V3-lazo y el sitio de unión CD4, respectivamente [136]. Los mecanismos moleculares que determinan el antagonismo no han sido estudiados en detalle. El único estudio que describió por primera vez a nivel molecular un posible mecanismo de interferencia también para el VIH se realizó utilizando combinaciones de pares de anti-gp41 mAbs [137]. Más en detalle, los autores observaron un efecto antagonista cuando los anti-gp41 neutralizantes mAbs 2F5 o 50-69 se combinaron con los anti-gp41 mAb 98-6 [137]. En particular mAbs 50-69 y 98-6 reconocen diferentes epítopos gp41 ubicados dentro del grupo I (residuos aminoácidos 579-613) y el grupo II (residuos aminoácidos 644-667), respectivamente. Por otro lado, mAb 2F5 reconocen un epítope diferente de mAb 98-6, dentro de la región externa proximal de membrana gp41 (MPER), en una porción adyacente al grupo II de gp41. Además, hay cierta superposición entre los epítopos del grupo II y el epítopo reconocido por mAb 2F5 [138], explicando la inhibición de la unión de mAb 2F5 por mAb 98-6 [137, 139]. Así, en el caso del antagonismo entre mAbs 2F5 y 98-6 el autor hipoteticó un mecanismo de obstáculo esterico entre los dos mAbs, ya que podían unir péptidos y complejos péptidos que representaban las formas prefusogénicas y fusogénicas de gp41 [140]. En particular, mAb 98-6 tenía una afinidad más alta por los complejos péptidos que representaban la forma fusogénica, que 2F5. Así, la unión de 98-6, que no neutraliza el aislado del VIH-1 89.6 (VIH-1 89.6 ), podría interferir con la unión de 2F5, En contraste, mAbs 50-69 y 2F5 reconocen epítopos distintos en gp41, y muestran reactividad independiente (additiva) contra el VIH-1 89.6 en combinación con la mayoría de los otros anti-gp41 y anti-gp120 mAbs probados [137]. Para concluir, los anti-gp120 y anti-gp41 Abs son inducidos en individuos infectados por VIH-1 pero son predominantemente no neutralizantes, ya que las regiones funcionalmente importantes de proteínas superficiales del VIH están casi completamente ocultas al sistema inmune [139]. Una hipótesis intrigante es que, junto con otros mecanismos de escape del VIH, el efecto de los extremadamente raros anti-gp41 y anti-gp120 nAbs también puede verse obstaculizado por la cantidad abrumadora de no-nabs que interfieren. Hasta la fecha, la existencia de interferencias no-n-Abs se ha evidenciado claramente sólo utilizando anti-gp41 mAbs con diferentes características biológicas, mientras que no se han generado datos utilizando anti-gp120 mAbs. El posible papel de interferencias no-n-Abmediated en facilitar la fuga del VIH en el curso de la infección natural ciertamente merece estudios futuros. Enfoques inmunoprofilácticos o inmunoterapéuticos con mAbs todavía se consideran una posible herramienta de apoyo en el manejo de enfermedades infecciosas. En particular, la disponibilidad de mAbs ampliamente neutralizantes dirigidos contra patógenos virales, cuyos enfoques profilácticos y terapéuticos reales están lejos de ser efectivos, ha llevado a muchos ensayos clínicos en curso. Sin embargo, la evidencia reportada en esta revisión sugiere que los mAbs candidatos para ser posiblemente utilizados en enfoques de inmunización pasiva antiviral, o para ser provocados por futuras estrategias de vacunación, no sólo tienen que ser moléculas altamente neutralizantes [141, 142], sino también moléculas a medida cuya actividad no está influenciada por posibles Abs interferentes producidos en el curso de la infección. Para ello, deben estar dirigidas contra epitopes altamente neutralizantes no sujetos al mecanismo de interferencia, o deben tener una alta afinidad por el antígeno para desplazar la unión de posibles Abs interferentes [51, 68].

¿Qué tan grande es el genoma del VHC?

Neutralización Interfiriendo Anticuerpos: ¿Un “Novela” Ejemplo de Disfunción Inmune Humoral Facilitando la Escape Viral? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499828/SHA: f4f75af02b7226c5b2363de1a75821a4b9b20412Autores: Nicasio, Mancini; Sautto, Giuseppe; Clementi, Nicola; Diotti, Roberta A.; Criscuolo, Elena; Castelli, Matteo; Solforosi, Laura; Clementi, Massimo; Burioni, RobertoFecha: 2012-09-24DOI: 10.3390/v4091731Licencia: cc-byAbstract: La respuesta inmune contra algunos patógenos virales, en particular aquellos que causan infecciones crónicas, es a menudo ineficaz a pesar de una respuesta neutralizante humoral robusta. Se han descrito varios mecanismos de evasión capaces de subvertir la actividad de los anticuerpos neutralizantes (nAbs), entre los que se encuentra la hipótesis de la excitación de los Abs no neutralizantes e interferentes. Recientemente, este mecanismo de evasión ha adquirido un interés creciente por su posible impacto en los nuevos enfoques antivirales terapéuticos y profilácticos basados en nAb. En esta revisión, ilustramos los mecanismos de interferencia mediada por Ab y los patógenos virales descritos en la literatura como capaces de adoptar esta estrategia de evasión “novela”. Texto: Los virus hipervariables adoptan varios mecanismos para hacer frente a la respuesta inmune humoral del huésped. El mecanismo más estudiado es la acumulación de mutaciones puntuales en regiones inmunodominantes de proteínas superficiales, lo que ya no son reconocibles por anticuerpos neutralizantes (nAbs) [1] [2] [4]. Otros mecanismos de escape que involucran proteínas superficiales incluyen la glicosilación de residuos funcionalmente pivotales (el escudo de glicanos) o su asociación con componentes séricos del huésped (por ejemplo, lipoproteínas) con el fin de ocultarlos del sistema inmunitario [5] [6] [7] [9] (Figura 1A ). Otros mecanismos de escape conocidos son: i) una especie de vía protegida de propagación del virus, como la transmisión de células a células [10, 11] ; ii) la mímica molecular entre las proteínas virales y los autoantígenos del huésped o iii) la estimulación inducida por virus de anticuerpos subfamiliares restringidos (Abs), ambas con implicaciones obvias en enfermedades autoinmunes inducidas por virus como la crioglobulinemia para el VHC [12] [13] [14]. El posible efecto de interferencia de los abs no neutralizantes (nonabs) fue propuesto originalmente por Dul en 1956 [15], para explicar la aparente inhibición de la neutralización del virus ejercida por algunas muestras séricas. Recientemente, este mecanismo de escape inmune propuesto ha readquirido un interés relevante, especialmente teniendo en cuenta el uso clínico potencial de nAbs antiinfeccioso neutralizante o el diseño de aproximaciones vaccinales basadas en epitopes [16]. Hasta la fecha, se han propuesto dos mecanismos principales para los efectos de interferencia de nonAbs: (i) interferencia de unión directa por obstáculo esterínico, (ii) inhibición de la unión tras cambios conformacionales del antígeno viral unido por interferir nonAbs. Además, se ha especulado que, incluso cuando no interfiere directamente con la unión de nAbs, nonAbs puede conducir también a la mejora de la infección viral a través de la interacción con receptores Fc o receptores de complemento [17]. En general, los no-nAbs posiblemente provocados en individuos infectados o vacunados pueden interferir con el potencial neutralizante de los nAbs. En más detalle, estos Abs interferentes son capaces de unirse a proteínas virales a nivel de inmunodominante pero funcionalmente irrelevantes regiones de proteínas virales, disminuyendo o bloqueando la unión de nAbs a epítopos virales cruciales (por ejemplo, dominios de unión a receptores) (Figura 1B ) [18]. Un anticuerpo monoclonal antiviral candidato (mAb) o preparación policlonal no debe ser sometido a este mecanismo de interferencia, o a los otros mecanismos de escape mencionados anteriormente. Del mismo modo, nuevos enfoques vaccinales deben evitar la excitación de los Abs interferentes que incluso podrían empeorar la enfermedad en caso de una infección real. En los siguientes párrafos discutimos estos mecanismos con ejemplos específicos de su papel en el El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus envuelto de ARN de sentido positivo que causa hepatitis crónica en la mayoría de los pacientes no tratados (alrededor del 80%), con el consiguiente riesgo de desarrollar cirrosis y carcinoma hepatocelular. Más de 170 millones de personas (2%-3% de la población mundial) están infectadas en todo el mundo, y todavía no se dispone de una vacuna protectora, mientras que las opciones terapéuticas siguen siendo limitadas y no son completamente eficaces [19]. Por estas razones, la infección crónica por VHC representa la principal indicación de trasplante hepático en Europa y Estados Unidos. Además, los receptores trasplantados están sujetos a un alto riesgo de reinfección del injerto y a una progresión más severa y rápida de la enfermedad hepática [20]. Representación esquemática de los mecanismos de escape viral de la respuesta inmune humoral frente a las proteínas virales superficiales: mutaciones puntuales en regiones inmunodominantes, glicosilación de residuos funcionales pivotales (escudo glucano) de las proteínas superficiales virales y asociación viral con los componentes séricos del huésped (por ejemplo, lipoproteínas) (B) Mecanismos de interferencia en la neutralización del virus mediado por nAb mediante la unión de los Abs no-n-n-Abs interferentes: los Abs no neutralizantes/interferentes pueden interferir en la unión de nAbs por un obstáculo estéril tras una ocupación espacial de su epítopo o una competencia por la unión; de lo contrario, la unión de los Abs no neutralizantes/interferentes puede inducir cambios conformacionales en la proteína viral, afectando así la unión de nAbs al antígeno. Los Abs no neutralizantes El genoma del VHC codifica una sola poliproteína de unos 3.000 aminoácidos que es procesada por las proteasasas del huésped y virales en al menos 3 proteínas estructurales (núcleo, E1 y E2) y 7 no estructurales (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) [21, 22]. En particular, las glicoproteínas de membrana de tipo I E1 y E2 forman heterodímeros no covalentes en la superficie de la envoltura del VHC y permiten que la endocitosis viral mediada por clatrina interactúe consecutivamente con varios factores celulares de entrada tales como los glicosaminoglicanos [23] [24] [25], el receptor de lipoproteínas de baja densidad [26, 27], el receptor de la clase B del escavenger tipo I [28], el CD81 de tetraspanina [29], las proteínas de unión estrecha claudin-1 y ocludin, y el recientemente descrito receptor de absorción de colesterol Niemann-Pick C1 similar a [30] [31] [33] [34]. El desarrollo de enfoques profilácticos y terapéuticos eficaces contra este virus se ha visto obstaculizado principalmente por su alta tasa de mutación que da lugar a variantes virales altamente diversificadas, incluso dentro de un solo paciente (cuasiespecies) [35]. De hecho, siete genotipos principales, que varían hasta un 30% en la secuencia de nucleótidos, y varios subtipos son reconocidos, cada uno caracterizado por diferentes características clínicas tales como diferentes tasas evolutivas a las enfermedades hepáticas crónicas o diferente respuesta a las terapias antivirales disponibles [21, 36, 37]. El desarrollo y uso de mAbs anti-VHC capaces de dirigir regiones estructural y funcionalmente conservadas de las partículas virales altamente variables se consideran como nuevas herramientas terapéuticas [38] [39] [40] [42] [43]. En particular, se ha demostrado que la producción de nAbs potentes en infecciones Además, en los chimpancés vacunados, una respuesta sostenida de Ab a las glicoproteínas envolventes E1 y E2 se correlaciona con una viremia reducida [45], mientras que la administración pasiva de mAbs neutralizante en un modelo de infección de ratón quimérico uPA-SCID fue capaz de proteger contra el desafío con un inóculo de cuasiespecie del VHC [46]. Los mAbs ampliamente neutralizantes humanos dirigidos contra la glicoproteína superficial E2 del VHC (HCV/E2) se dirigen típicamente contra regiones funcionalmente importantes dentro del sitio de unión CD81 [47] [48] [48] [50] [51] [52] [53] [54], así como contra otros residuos críticos altamente conservados entre diferentes genotipos [55, 56]. Este aspecto es crucial para el posible uso terapéutico in vivo de estos mAbs, pero puede no ser suficiente ya que recientemente se ha supuesto que otras poblaciones nonAb pueden interferir con su actividad neutralizante [39, [57] [58] [59] [61]. De hecho, en los individuos persistentemente infectados contra el VHC/E2 los abdominales cruzados generalmente son provocados en un título bajo y en una etapa tardía de la infección, lo que conduce a un pobre control de la viremia, mientras que el uso in vivo de preparados de inmunoglobulina policlonal anti-VHC tanto en chimpancés como en humanos ha sido decepcionante, y los estudios clínicos han demostrado que estos preparados no previenen infecciones recurrentes en pacientes después del trasplante hepático [63]. A este respecto, un documento reciente ha sugerido que el efecto de algunos de estos nAbs, dirigidos contra residuos funcionalmente importantes involucrados en la unión viral al CD81 (dentro del epítopo I, que abarca residuos aminoácidos 412-426), podría verse obstaculizado por la presencia de residuos no nAbs vinculantes dentro del epítopo II en el VHC/E2 (residuos aminoácidos 434-446) [58]. En particular, el bloqueo de estos Abs específicos del epítopo II interferentes no sólo aumentó el título neutralizante del suero que contiene tanto el epítopopopo I como el Abs específico del epítopo II, sino que también descubrió una respuesta más amplia neutralizante del genotipo cruzado [58]. Sin embargo, el papel (y la existencia misma) de estos Abs interferentes en la influencia de la infección por medio de ensayos de neutralización in vitro utilizando VHC derivados del suero del genotipo 4a y Abs policlonales derivados de cabras inmunizadas con diferentes péptidos conservados que abarcan residuos aminoácidos 412-419, 430-447 y 517-531 de glucoproteína VHC/E2 [64]. En particular, este grupo encontró una actividad interferida ejercida por los débiles neutralizantes 430-447-eliminados Abs sobre la actividad neutralizante tanto de la 412-419 como de la 517-531-eliminada Abs [64]. Curiosamente, de acuerdo con el modelo putativo para plegado E2, las tres regiones mencionadas estarían unas junto a otras en la glucoproteína [48]. Por lo tanto, esta predicción estructural posiblemente apoya el efecto interferente del epitopope II-directo Abs. Sin embargo Con este fin, la disponibilidad de cristal E1-E2 sin duda acelerará la dilucidación fina de las proximidades espaciales de neutralización e interferencia de mAbs en la estructura E1-E2 y, en consecuencia, el progreso de la vacuna basada en la estructura. Además, cabe destacar que los individuos con Abs que se dirigen a la región de E2 que abarca el epítopo I albergan frecuentemente Abs que reconocen la región que contiene el epítopo II, confirmando así la co-inmunogenicidad de estos epitopes [58]. Por último, se ha demostrado tanto una baja prevalencia (menos del 2,5%) y un bajo título de Epítopo I-reactiva Abs en suera de infecciones crónicas y agudas resueltas, apoyando así la hipótesis de un enmascaramiento conformacional por regiones adyacentes como la que contiene el epítopo II [65]. Al principio se planteó la idea de que una vez que el epítopo II se une a un Ab, el sitio del epítopo I se enmascara y ya no puede ser reconocido por nAbs específicos. De hecho, el agotamiento de Abs al epítopo II en plasma de un paciente con VHC crónicamente infectado y chimpancés vacunados recuperó una actividad neutralizante de otro genotipo cruzado indetectable [58]. Otra posibilidad es que la unión inicial de Abs a la región que contiene el epítopo II puede inducir cambios conformacionales en E2 que inhiben la unión por el epítopopeo I-dirigido Abs, como recientemente sugirió Lapierre et al. para otros anti-HCV/E2 Abs [66]. Por el contrario, estas conclusiones no fueron apoyadas en un estudio reciente de Tarr et al. utilizando murina (AP33) y ratas (2/69a) mAbs, así como fracciones de inmunoglobulina humana de afinidad purificada en péptidos lineales que representan dominios distintos VHC/E2 agrupados dentro de las regiones 412-426 y 434-446 [67]. Aunque confirmando la co-inmunogenicidad previamente reportada de estas dos regiones, los autores no demostraron ninguna inhibición entre estos dos grupos de Abs. Teniendo en cuenta sus resultados, los autores sugirieron de hecho que la interferencia de non-Abs, al menos en la región que abarca residuos 434-446, no es un mecanismo posible para la persistencia del VHC en individuos infectados crónicamente, como había sido propuesto originalmente por Zhang y otros. De acuerdo con los hallazgos de Tarr y colegas, Keck et al. describieron anti-HCV/E2 mAbs encuadernación epítopos Estos mAbs son ampliamente neutralizantes y no conducen a mutantes de escape viral, demostrando la importancia funcional de sus epítopos. Los autores concluyen que no todos los Abs dirigidos contra el epítopo II están interfiriendo, pero también especulan que la actividad de interferencia podría limitarse a Abs reconociendo epitopes lineales dentro de él [56]. Recientemente, hemos confirmado en parte las observaciones de Zhang et al. utilizando un panel de anti-HCV/E2 mAbs: el ratón bien caracterizado anti-HCV/E2 mAb AP33, cuyo epítopo abarca el epítopo I (residuos aminoácidos 412-423), y un anti-HCV/E2 mAb humano débilmente neutralizante (llamado e509), cuyo epítopo abarca el epítopo II [68]. En particular, encontramos que e509 es capaz de interferir con la actividad neutralizante de AP33 en el virus del genotipo 1a (cepa H77). En cambio, encontramos que e509 no interfiere mínimamente con la actividad de otros dos seres humanos ampliamente neutralizantes anti-VHC/E2 mAbs, llamados e20 y e137 [49, 69]. Curiosamente, encontramos que tanto e20 y e137 se unen también a residuos dentro del epitope II, a una afinidad más alta que e509, desplazándolo así del epitope interferente y, por lo tanto, manteniendo inalterada su actividad neutralizante. Así, en nuestra opinión, las observaciones divergentes descritas anteriormente pueden depender de las diferentes especificidades Ab presentes en las preparaciones policlonales utilizadas y, probablemente, también en los diferentes genotipos VHC que infectan a los pacientes estudiados [68 Además, las diferentes estrategias adoptadas para aislar el epítopo I y el epítopo II Abs, seguidas en los estudios anteriores, podrían explicar los diferentes datos obtenidos. De hecho, las inmunoglobulinas purificadas en péptidos que representan distintas regiones del VHC/E2 [67] están obviamente dirigidas contra epítopos lineales; estos preparados son ciertamente diferentes de mAbs clonados utilizando una glucoproteína VHC/E2 de larga duración, que son más probablemente dirigidas contra epítopos conformacionales incluyendo también residuos fuera de las regiones lineales investigadas [54]. En resumen, en el campo del VHC varios trabajos apoyan la existencia de poblaciones de Ab que interfieren e hipotetizan su posible papel en la persistencia del VHC, como se demostró con preparados de inmunoglobulina derivados del plasma humano, mAbs humanos y sura de animales vacunados con pé El posible mecanismo que conduce a la interferencia sigue siendo controvertido, pero tanto el obstáculo esterico directo como los cambios conformacionales inducidos por antígenos han sido hipotetizados. Por otro lado, otros documentos no confirman estos hallazgos, sugiriendo que el epítopo interferente putativo II puede ser dirigido por Abs dotados de una actividad ampliamente neutralizante. Nuestro artículo reciente, utilizando bien caracterizado mAbs [68], muestra que los Abs interferentes existen pero que su efecto global puede estar sesgado por la presencia de nAbs con diferentes características de unión y por el genotipo del VHC infectado. Los trabajos futuros que investigan el papel in vivo de estas subpoblaciones interferentes en la persistencia del VHC sin duda serán muy útiles. Los virus de la gripe circulan por todo el mundo en depósitos de animales, especialmente aves acuáticas, que pueden afectar a los seres humanos de cualquier grupo de edad. Los virus El tipo más clínicamente relevante y variable es la gripe A, que se divide en varios subtipos, según la característica antigénica de las dos glicoproteínas envolventes, y causa infecciones epidémicas y pandémicas [70]. Las epidemias anuales recurrentes de gripe se asocian con morbilidad y mortalidad significativas, particularmente entre los grupos de riesgo (como personas de edad avanzada o con enfermedades crónicas, mujeres embarazadas y niños) [71] ; la propagación mundial de virus de gripe pandémica puede causar millones de muertes [72]. Dentro del virio de gripe envuelto ocho segmentos de ARN de una sola cadena negativa están protegidos por la proteína nucleocápsida, formando la ribonucleoproteína (RNP). Los primeros seis segmentos de ARN cada uno para una sola proteína: PB2, PB1 y PA (todos constituyen la polimerasa ARN dependiente de ARN), la hemaglutinina (HA), la nucleoproteína (NP), la neuraminidasa (NA). Los últimos dos segmentos cada uno para dos proteínas diferentes: las proteínas de la matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2). Tres proteínas diferentes (HA, NA y M2) están presentes en la envoltura viral. La glucoproteína HA es la más abundante y es el objetivo principal de la respuesta inmune humoral. Junto con la glucoproteína transmembrana NA, HA es capaz de provocar una respuesta inmune subtipo-específica que es totalmente protectora dentro, pero sólo parcialmente protectora a través de diferentes subtipos [73]. La HA se sintetiza como precursor inactivo que pasa a su forma activa sobre la escisión por proteasasas de células huésped, y que está presente en la membrana viral como homotrimeros. Los recortadores de HA se unen a moléculas de ácido siálico ligadas a 2,6 en proteínas de membrana celular o lípidos a través de dominios ubicados en la cabeza globular de cada monómero. Posteriormente, la envoltura viral se fusiona por mecanismos dependientes de clatrina e independientes con la membrana de vesícula endocítica a través del péptido de fusión de HA ubicado en la región madre de cada monómero. Como consecuencia, los componentes virales se liberan en la célula huésped y pueden subvertir las capacidades sintéticas de la célula huésped para la producción y liberación de partículas de progenie [74]. La inmunidad humoral juega un papel importante en la defensa del huésped contra la infección por el virus de la gripe, ya que la mayoría de los virus de la gripe neutralizan el Abs y, por lo tanto, limitan la infección [75] [77] [78]. De hecho, un gran cuerpo de trabajos experimentales sugiere que la oclusión del sitio de unión del receptor en la HA por Abs es el principal mecanismo de neutralización viral de la gripe. Menos común, pero más ampliamente nAbs puede neutralizar el virus de la gripe al inhibir la fusión de la envoltura viral con la membrana endocítica-vesícula [50, [79] [80] [81] [82] [83]. Los cambios aminoácidos en la HA, más frecuentes en la cabeza globular inmunodominante, tienen efectos complejos sobre la neutralización viral por Abs, generalmente permitiendo que las variantes mutadas escapen de Los estudios clásicos utilizando mAbs de ratón neutralizante identificaron cinco sitios antigénicos distintos (A-E) en la región globular de la cabeza HA1 en la estructura tridimensional de la molécula H3 HA (A/Hong Kong/1/68) [85] [86] [87] así como en los subtipos H1 [88] y H2 [89]. Durante los primeros días de una infección, el título de nAb es a menudo bajo, mientras que el título de nonAbs es más alto y puede desempeñar un papel en el resultado de una infección, como se ha observado recientemente en los pacientes infectados por el virus pandémico influenza A/2009 H1N1 por To et al. [90]. En particular, este grupo encontró que la cantidad, así como la avidez, de nonAbs eran mayores para los pacientes con enfermedad grave que para aquellos con enfermedad leve. Los autores concluyeron que una respuesta no-nAb exagerada durante la etapa temprana de la infección se asoció con enfermedad grave [90]. Además, los autores especularon que los no-nAbs presentes en los sueros de los pacientes durante la etapa temprana de la infección eran probablemente preexistentes o el resultado de una respuesta inmune humoral heterosubtípica secundaria contra epítopos más conservados en varias proteínas de la gripe [91]. Esta respuesta humoral temprana puede ser provocada dentro de unos pocos días después de la infección, debido a la inmunidad por la exposición previa a epitopos virales compartidos. De hecho, las proteínas matrices y nucleoproteínas han conservado secuencias aminoácidos, y por lo tanto Abs contra estas proteínas de la infección anterior del virus de la gripe estacional o vacunación podría ser inducido [92]. De hecho, tras la infección por el virus de la gripe, las células B de la memoria pueden proliferar rápidamente y generar una gran cantidad de estas avidez non-Abs, especialmente en pacientes con enfermedad grave, lo que concuerda con la observación de que el número de células B de sangre periférica es mayor en pacientes con enfermedad grave que en aquellos con enfermedad leve durante la fase temprana de la infección. El mecanismo de interferencia de neutralización de Ab también ha sido especulado indirectamente por Ndifon et al., quienes observaron que algunos cambios aminoácidos en la HA en realidad aumentan la eficiencia de neutralización de variantes de escape por Abs previamente generados, aunque no influyan directamente en su unión [93]. En detalle, este grupo sugirió que el aumento de la actividad neutralizante después de la mutación de HA podría ser el resultado de una menor interferencia estéril entre Abs. Específicamente, si hay una competencia esterical para la unión a la HA por Abs con diferente eficiencia de neutralización, entonces una mutación que reduce la unión de Abs con baja actividad neutralizante podría aumentar la neutralización viral general. De hecho, al igual que lo que se ha especulado para el VHC, Abs que se unen a los epítopos de HA ubicados a una distancia del sitio de unión al receptor puede por lo tanto no ocupar este sitio de manera eficiente, lo que conduce a una disminución de la neutralización viral. Además, se ha demostrado que Abs que se unen a un determinado epítopope de HA puede impedir una mayor unión de Abs a otros epítopos de la misma proteína de HA, e incluso a los epítopos encontrados en proteínas de HA adyacentes. Las observaciones anteriores sugieren que Abs que se unen a los epítopos de baja eficiencia de neutralización de Considerando la estructura de la HA, la unión de los Abs interferentes estaría en el nivel del epítopo C y E situado lejos del sitio de unión del receptor en la cabeza globular de la HA. Sin embargo, la unión de estos Abs puede influir en la unión de nAbs a los epítopos A, B y D, situados más cerca del sitio de unión del receptor [93]. A este respecto, los cambios en el epítopo A, B y D podrían ser muy favorecidos por la selección natural, mientras que los cambios en los epítopos C y E podrían ser desfavorables a los virus de la gripe [93]. De hecho, los obstáculos estericos por Abs que unen estos epítopos podrían reducir en gran medida el grado de mutación necesario para que un virus evada la neutralización por el huésped Abs. En consecuencia, una disminución en la afinidad de Abs por los epítopos con una eficiencia de baja neutralización podría conducir a un aumento en la neutralización viral. Esto sugiere un posible enfoque para diseñar vacunas de "baja interferencia" que podrían disminuir en gran medida el impacto de la interferencia Ab. Estos inmunogenes son modificados genéticamente desde el objetivo viral sólo en el nivel de los epítopos de baja eficiencia de neutralización. De hecho, los abs inducidos por la vacuna sólo reconocen epitopes de alta eficiencia de neutralización del objetivo y los abs inducidos por la cepa vacuna de baja interferencia tienen baja afinidad por los epítopos de baja eficiencia de neutralización de la cepa de virus circulante objetivo. En consecuencia, limitando la interferencia mediada por Ab, el virus diana no puede escapar del Abs inducido por la vacuna a través de pequeños cambios epitópicos. Alternativamente, las vacunas podrían ser diseñadas para incluir solamente aquellas regiones que corresponden a epítopos con alta eficiencia de neutralización. Además, los fármacos antivirales podrían ser diseñados para incluir proteínas virales que transportan modificaciones a nivel de epítopos de alta eficiencia de neutralización; estas proteínas "decoy" competirían con el virus por la unión a la eficiencia de baja neutralización Abs de una manera similar a la que juegan los inhibidores de la neuraminidasa. En síntesis, la disponibilidad de la estructura cristalina de HA ha ayudado a confirmar la existencia y explicar los mecanismos de interferencia por anti-HA Abs no o débilmente neutralizantes. [90] evidenciando que una respuesta non-Ab durante la fase temprana de la infección está asociada con una enfermedad grave, puede ser la primera prueba del papel de estos Abs interferentes en el curso de una infección natural. Los [94]. Más de 8.000 casos, incluyendo casi 800 muertes, fueron reportados durante el período del brote y el aumento de la edad y la comorbilidad fueron factores de riesgo de enfermedad grave y muerte [95]. Desde 2003, sólo se han reportado casos esporádicos; sin embargo, la posibilidad de que brotes de SARS puedan reaparecer de forma natural o ser liberados deliberadamente es un problema de salud pública. Al igual que los virus de la gripe, el SARS-CoV circula en depósitos de animales, con murciélagos que se cree que transmiten el virus a pequeños mamíferos con exposición a estos pequeños animales como fuente de infecciones humanas [96]. La enfermedad clínica es similar a otras infecciones respiratorias agudas graves, incluyendo la gripe, y la definición de caso SRAS incluye criterios clínicos, epidemiológicos y de laboratorio [97, 98]. La organización básica del genoma y el ciclo replicativo es similar para todas las CoVs. Gene 1 codifica todas las proteínas predichas de replicase/transcriptasa, que se traducen a partir de ARN genómico de entrada, mientras que los genes 2-9 codifican proteínas estructurales y accesorias, incluyendo la proteína de pico de sobre (S), que se traducen a partir de ARNm subgenómicos separados. Las CoVs utilizan un mecanismo discontinuado único para transcribir una serie de ARNm subgenómicos progresivamente más grandes, y cada una contiene una secuencia de ARN líder que se deriva del extremo 5' del genoma [99]. La proteína S de CoVs se inserta en la envoltura de los eventos de unión y fusión del virión necesarios para la infección, y es el objetivo principal de la inmunidad protectora humoral [100]. Aunque la proteína S de SARS-CoV (SARS-S) comparte poca identidad aminoácida (aproximadamente 20%-27%), comparte características estructurales comunes con las proteínas S de los otros miembros de la familia Coronaviridae. La proteína SRAS-S es una glicoproteína transmembrana tipo I de aproximadamente 1.255 aminoácidos en longitud y dividida en dos dominios funcionales: S1 (residuos aminoácidos 15-680) y S2 (residuos aminoácidos 681-1,255) [101]. En muchas CoVs, la proteína S se escinde durante la biogénesis y estos dos dominios funcionales se mantienen juntos no covalentes; sin embargo, como en el caso de la CoV humana 229E, la proteína S no se escinde en el SARS-CoV [102]. El dominio S1 forma una estructura globular que media la interacción de la proteína S con su receptor principal, la enzima de conversión de la angiotensina 2 (ACE2), mientras que el dominio S2 media la fusión y contiene el péptido de fusión putativa y dos regiones helicoidales conservadas (HR1 y HR2) que sobre la escisión por la catepsina proteasa endosomal L forman el núcleo de fusión de seis paquetes de hélice [103]. Sin embargo, tal estrategia plantea un dilema singular para las COV, ya que los protocolos de vacunación anteriores han puesto de relieve la posibilidad de una mejora inmunomediada de la enfermedad [104]. A este respecto, el grupo de Zhong et al. investigaron el papel de los ABS interferentes no neutralizantes también en el caso de la infección por SARS-CoV [105]. En particular, encontraron que dos mAbs dirigidos contra la región que abarca residuos aminoácidos 491-510 de SARS-S (341C y 540C) actúan sinérgicamente para inhibir in vitro la infección por SARS-CoV, mientras que un mAb (240C) no neutralizante, cuyo epítopo abarca la región mencionada, interrumpió la actividad neutralizante de 341C y 540C [105, 106]. Al analizar la estructura cristalina de la proteína SARS-S, los autores propusieron una posible explicación a lo observado, evidenciando que los epítopos de todos los mAbs están estrechamente empaquetados y proximales entre sí pero distales del sitio de unión del receptor ACE2 [105]. Además, el epítopo del mAb 240C no neutralizante se superpone parcialmente por al menos 2 aminoácidos (P507 y A508) con el del mAb 341C neutralizante. Como consecuencia, mAb 240C podría inhibir la unión de mAb 341C de manera relacionada con el equilibrio. Por otro lado, los autores encontraron que los 240C mAb podrían interferir estericamente con la unión del mAb 540C a través del mecanismo propuesto de ocupación espacial (Figura 1B). De hecho, la accesibilidad de mAb 540C a su epítopo puede ser bloqueada por la unión mAb 240C que enmascara la superficie que lo contiene. De hecho, como especulan Davies y Cohen, la zona enterrada de un Ab puede variar de 500 Å 2 a más de 800 Å 2 correspondiente a 21-32 aminoácidos, aunque sólo 9-20 residuos de aminoácidos (el epítopo real) hacen contacto directo con el Ab [107]. De hecho, como se observó anteriormente para el VHC, la gripe y otros virus humanos y animales [108], uno de los posibles mecanismos es que el bloque esterico por non-Abs reduce la unión de nAbs en la neutralización de la proteína SRAS. Por el contrario, a pesar de los epítopos de mAbs 341C y 540C se encuentran en un solo lazo; se separan espacialmente proporcionando interfaces distintas para la unión independiente de Ab. Para concluir, el SARS-CoV puede provocar potencialmente interferencias non-Abs presentando en su superficie regiones estrechamente embalados con diferentes características biológicas. Por otro lado, el huésped puede montar una vigorosa respuesta humoral neutralizante produciendo Abs que reconocen diferentes epitopes y actúan sinérgicamente. En particular, estos resultados sugieren que un cóctel de mAb humano neutralizante que puede unirse a epitopes únicos y tener diferentes mecanismos de acción podría ser de utilidad clínica contra la infección por SARS-CoV, e indicar que se puede aplicar un enfoque similar para tratar otras infecciones virales [109]. El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus positivo del ARN de una sola cadena, que causa morbilidad y mortalidad considerables en todo el mundo, especialmente en los países en desarrollo. Los virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 y 2 (VIH-1 y VIH-2) son los resultados de las transmisiones de múltiples especies del virus del simio al ser humano. La prevalencia del VIH-2 es baja y hay una mayor proporción de personas infectadas por el VIH-2 que no progresan hacia el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en comparación con las infectadas por el VIH-1 [110]. Los virus del VIH-1 son muy divergentes y se clasifican en cuatro grupos: M, N, O y P. En particular, el grupo M se subdivide en nueve subtipos y numerosas formas recombinantes circulantes [111]. El genoma de todos los retrovirus codifica las proteínas estructurales Gag, Pol y Env. Entre las proteínas estructurales del VIH, gp120 y gp41 envuelven la superficie glicoproteínas forman heterodímeros que se organizan como recortadores en la superficie de la membrana viral. La entrada del VIH-1 en las células diana se inicia por la interacción de estas glicoproteínas envolventes superficiales con CD4 y un co-receptor (típicamente CCR5 o CXCR4) en las células diana [112]. La porción gp120 une los receptores de las células diana, mientras que gp41 promueve la fusión de membranas virales y celulares [113]. Al unirse al receptor CD4, gp120 sufre un cambio conformacional, resultando en la exposición de epitopos que pueden ser unidos por moléculas co-receptoras y en la eventual formación de la conformación intermedia pre-pirpina transitoria [114] [115] [116]. En el intermedio pre-hairpin, las moléculas gp41 se reorganizan para que los péptidos N-terminales formen un recortador de hélices que exponen el péptido de fusión a la célula diana, mientras que los hélices C-terminales permanecen anclados a la membrana viral [113]. Esta etapa es vulnerable a un número de nAbs y péptidos capaces de unir los péptidos N-o C-terminales [117, 118]. Tras la fusión con la membrana celular diana, una mayor reorganización de gp41 resulta en la asociación de N-y C-terminales para crear un haz de seis hélices post-fusión [119]. Después de la fusión y la entrega del capsid viral en el citoplasma, el descubrimiento conduce a la liberación de enzimas virales, proteínas y ARN genómico dentro de la A continuación, se inicia la transcripción inversa del ARN positivo genómico viral de una sola cadena para producir un ADN proviral de doble cadena para ser importado en el núcleo e integrado en el cromosoma huésped. La transcripción activa del ADN proviral integrado se produce en presencia de NF-B y Tat viral. El empalme del ARNm viral produce proteínas accesorias tempranas como Tat, Rev y Nef, que ayudan en la transcripción, empalme y modificación de la maquinaria celular, respectivamente. La acumulación de Rev protege el ARNm viral de la empalme, lo que produce ARNm cada vez más largos capaces de codificar proteínas estructurales y envolventes, y finalmente los ARN genómicos virales están listos para ser cautivados [111]. La terapia antirretroviral para el VIH es altamente eficaz en el control de la infección; sin embargo, la erradicación de este virus es actualmente imposible y el Una vacuna es ampliamente considerada como crucial para el control de la epidemia, pero varios esfuerzos avanzados para desarrollar una profilaxis efectiva resultaron infructuosos [120, 121]. Uno de los mayores desafíos en el desarrollo de una vacuna contra el VIH es superar su capacidad de mutar constantemente y escapar de las respuestas inmunitarias anti-VIH [122]. Esta alta tasa de mutación es un resultado directo de la presencia de ARN polimerasa de baja fidelidad del virus, así como los altos niveles de recombinación que sufre y el escudo glucano en constante evolución de las glucoproteínas de envoltorio [123] [124] [125]. A este respecto, tanto los linfocitos citotóxicos como los nAbs han sido reportados durante mucho tiempo para seleccionar variantes de escape inmune durante el curso de la infección por el VIH-1 [126] [127]. Una inmunoterapia pasiva candidata podría consistir, como se sugirió anteriormente para la infección por SARS-CoV, en la administración de un cóctel de mAbs ampliamente neutralizante, que podría minimizar la aparición de mutantes de escape viral [129]. Se han estudiado varias combinaciones de mAbs humanos en los últimos años que han mostrado efectos aditivos, sinérgicos o antagónicos en la neutralización del VIH-1 [130] [133] [133] [134] [135]. El efecto antagonista en la neutralización del VIH-1 se ha reportado previamente con un par de anti-gp120 mAbs dirigidos contra el V3-lazo y el sitio de unión CD4, respectivamente [136]. Los mecanismos moleculares que determinan el antagonismo no han sido estudiados en detalle. El único estudio que describió por primera vez a nivel molecular un posible mecanismo de interferencia también para el VIH se realizó utilizando combinaciones de pares de anti-gp41 mAbs [137]. Más en detalle, los autores observaron un efecto antagonista cuando los anti-gp41 neutralizantes mAbs 2F5 o 50-69 se combinaron con los anti-gp41 mAb 98-6 [137]. En particular mAbs 50-69 y 98-6 reconocen diferentes epítopos gp41 ubicados dentro del grupo I (residuos aminoácidos 579-613) y el grupo II (residuos aminoácidos 644-667), respectivamente. Por otro lado, mAb 2F5 reconocen un epítope diferente de mAb 98-6, dentro de la región externa proximal de membrana gp41 (MPER), en una porción adyacente al grupo II de gp41. Además, hay cierta superposición entre los epítopos del grupo II y el epítopo reconocido por mAb 2F5 [138], explicando la inhibición de la unión de mAb 2F5 por mAb 98-6 [137, 139]. Así, en el caso del antagonismo entre mAbs 2F5 y 98-6 el autor hipoteticó un mecanismo de obstáculo esterico entre los dos mAbs, ya que podían unir péptidos y complejos péptidos que representaban las formas prefusogénicas y fusogénicas de gp41 [140]. En particular, mAb 98-6 tenía una afinidad más alta por los complejos péptidos que representaban la forma fusogénica, que 2F5. Así, la unión de 98-6, que no neutraliza el aislado del VIH-1 89.6 (VIH-1 89.6 ), podría interferir con la unión de 2F5, En contraste, mAbs 50-69 y 2F5 reconocen epítopos distintos en gp41, y muestran reactividad independiente (additiva) contra el VIH-1 89.6 en combinación con la mayoría de los otros anti-gp41 y anti-gp120 mAbs probados [137]. Para concluir, los anti-gp120 y anti-gp41 Abs son inducidos en individuos infectados por VIH-1 pero son predominantemente no neutralizantes, ya que las regiones funcionalmente importantes de proteínas superficiales del VIH están casi completamente ocultas al sistema inmune [139]. Una hipótesis intrigante es que, junto con otros mecanismos de escape del VIH, el efecto de los extremadamente raros anti-gp41 y anti-gp120 nAbs también puede verse obstaculizado por la cantidad abrumadora de no-nabs que interfieren. Hasta la fecha, la existencia de interferencias no-n-Abs se ha evidenciado claramente sólo utilizando anti-gp41 mAbs con diferentes características biológicas, mientras que no se han generado datos utilizando anti-gp120 mAbs. El posible papel de interferencias no-n-Abmediated en facilitar la fuga del VIH en el curso de la infección natural ciertamente merece estudios futuros. Enfoques inmunoprofilácticos o inmunoterapéuticos con mAbs todavía se consideran una posible herramienta de apoyo en el manejo de enfermedades infecciosas. En particular, la disponibilidad de mAbs ampliamente neutralizantes dirigidos contra patógenos virales, cuyos enfoques profilácticos y terapéuticos reales están lejos de ser efectivos, ha llevado a muchos ensayos clínicos en curso. Sin embargo, la evidencia reportada en esta revisión sugiere que los mAbs candidatos para ser posiblemente utilizados en enfoques de inmunización pasiva antiviral, o para ser provocados por futuras estrategias de vacunación, no sólo tienen que ser moléculas altamente neutralizantes [141, 142], sino también moléculas a medida cuya actividad no está influenciada por posibles Abs interferentes producidos en el curso de la infección. Para ello, deben estar dirigidas contra epitopes altamente neutralizantes no sujetos al mecanismo de interferencia, o deben tener una alta afinidad por el antígeno para desplazar la unión de posibles Abs interferentes [51, 68].

¿Cuáles son las proteínas no estructurales codificadas por el genoma del VHC?

Neutralización Interfiriendo Anticuerpos: ¿Un “Novela” Ejemplo de Disfunción Inmune Humoral Facilitando la Escape Viral? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499828/SHA: f4f75af02b7226c5b2363de1a75821a4b9b20412Autores: Nicasio, Mancini; Sautto, Giuseppe; Clementi, Nicola; Diotti, Roberta A.; Criscuolo, Elena; Castelli, Matteo; Solforosi, Laura; Clementi, Massimo; Burioni, RobertoFecha: 2012-09-24DOI: 10.3390/v4091731Licencia: cc-byAbstract: La respuesta inmune contra algunos patógenos virales, en particular aquellos que causan infecciones crónicas, es a menudo ineficaz a pesar de una respuesta neutralizante humoral robusta. Se han descrito varios mecanismos de evasión capaces de subvertir la actividad de los anticuerpos neutralizantes (nAbs), entre los que se encuentra la hipótesis de la excitación de los Abs no neutralizantes e interferentes. Recientemente, este mecanismo de evasión ha adquirido un interés creciente por su posible impacto en los nuevos enfoques antivirales terapéuticos y profilácticos basados en nAb. En esta revisión, ilustramos los mecanismos de interferencia mediada por Ab y los patógenos virales descritos en la literatura como capaces de adoptar esta estrategia de evasión “novela”. Texto: Los virus hipervariables adoptan varios mecanismos para hacer frente a la respuesta inmune humoral del huésped. El mecanismo más estudiado es la acumulación de mutaciones puntuales en regiones inmunodominantes de proteínas superficiales, lo que ya no son reconocibles por anticuerpos neutralizantes (nAbs) [1] [2] [4]. Otros mecanismos de escape que involucran proteínas superficiales incluyen la glicosilación de residuos funcionalmente pivotales (el escudo de glicanos) o su asociación con componentes séricos del huésped (por ejemplo, lipoproteínas) con el fin de ocultarlos del sistema inmunitario [5] [6] [7] [9] (Figura 1A ). Otros mecanismos de escape conocidos son: i) una especie de vía protegida de propagación del virus, como la transmisión de células a células [10, 11] ; ii) la mímica molecular entre las proteínas virales y los autoantígenos del huésped o iii) la estimulación inducida por virus de anticuerpos subfamiliares restringidos (Abs), ambas con implicaciones obvias en enfermedades autoinmunes inducidas por virus como la crioglobulinemia para el VHC [12] [13] [14]. El posible efecto de interferencia de los abs no neutralizantes (nonabs) fue propuesto originalmente por Dul en 1956 [15], para explicar la aparente inhibición de la neutralización del virus ejercida por algunas muestras séricas. Recientemente, este mecanismo de escape inmune propuesto ha readquirido un interés relevante, especialmente teniendo en cuenta el uso clínico potencial de nAbs antiinfeccioso neutralizante o el diseño de aproximaciones vaccinales basadas en epitopes [16]. Hasta la fecha, se han propuesto dos mecanismos principales para los efectos de interferencia de nonAbs: (i) interferencia de unión directa por obstáculo esterínico, (ii) inhibición de la unión tras cambios conformacionales del antígeno viral unido por interferir nonAbs. Además, se ha especulado que, incluso cuando no interfiere directamente con la unión de nAbs, nonAbs puede conducir también a la mejora de la infección viral a través de la interacción con receptores Fc o receptores de complemento [17]. En general, los no-nAbs posiblemente provocados en individuos infectados o vacunados pueden interferir con el potencial neutralizante de los nAbs. En más detalle, estos Abs interferentes son capaces de unirse a proteínas virales a nivel de inmunodominante pero funcionalmente irrelevantes regiones de proteínas virales, disminuyendo o bloqueando la unión de nAbs a epítopos virales cruciales (por ejemplo, dominios de unión a receptores) (Figura 1B ) [18]. Un anticuerpo monoclonal antiviral candidato (mAb) o preparación policlonal no debe ser sometido a este mecanismo de interferencia, o a los otros mecanismos de escape mencionados anteriormente. Del mismo modo, nuevos enfoques vaccinales deben evitar la excitación de los Abs interferentes que incluso podrían empeorar la enfermedad en caso de una infección real. En los siguientes párrafos discutimos estos mecanismos con ejemplos específicos de su papel en el El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus envuelto de ARN de sentido positivo que causa hepatitis crónica en la mayoría de los pacientes no tratados (alrededor del 80%), con el consiguiente riesgo de desarrollar cirrosis y carcinoma hepatocelular. Más de 170 millones de personas (2%-3% de la población mundial) están infectadas en todo el mundo, y todavía no se dispone de una vacuna protectora, mientras que las opciones terapéuticas siguen siendo limitadas y no son completamente eficaces [19]. Por estas razones, la infección crónica por VHC representa la principal indicación de trasplante hepático en Europa y Estados Unidos. Además, los receptores trasplantados están sujetos a un alto riesgo de reinfección del injerto y a una progresión más severa y rápida de la enfermedad hepática [20]. Representación esquemática de los mecanismos de escape viral de la respuesta inmune humoral frente a proteínas virales superficiales: mutaciones puntuales en regiones inmunodominantes, glicosilación de residuos funcionalmente pivotales (escudo glucano) de las proteínas superficiales virales y asociación del virus con los componentes séricos del huésped (por ejemplo, lipoproteínas) (B) Mecanismos de interferencia en la neutralización del virus mediado por nAb mediante la unión de los Abs non-n-n-Abs interferentes: los Abs noneutralizantes/interferentes pueden interferir en la unión de nAbs por un obstáculo estéril tras una ocupación espacial de su epítopo o una competencia por la unión; de lo contrario, la unión de los Abs noneutralizantes/interferentes puede inducir cambios conformacionales en la proteína viral, afectando así la unión de nAbs al El genoma del VHC codifica una sola poliproteína de unos 3.000 aminoácidos que es procesada por las proteasasas del huésped y virales en al menos 3 proteínas estructurales (núcleo, E1 y E2) y 7 no estructurales (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) [21, 22]. En particular, las glicoproteínas de membrana de tipo I E1 y E2 forman heterodímeros no covalentes en la superficie de la envoltura del VHC y permiten que la endocitosis viral mediada por clatrina interactúe consecutivamente con varios factores celulares de entrada tales como los glicosaminoglicanos [23] [24] [25], el receptor de lipoproteínas de baja densidad [26, 27], el receptor de la clase B del escavenger tipo I [28], el CD81 de tetraspanina [29], las proteínas de unión estrecha claudin-1 y ocludin, y el recientemente descrito receptor de absorción de colesterol Niemann-Pick C1 similar a [30] [31] [33] [34]. El desarrollo de enfoques profilácticos y terapéuticos eficaces contra este virus se ha visto obstaculizado principalmente por su alta tasa de mutación que da lugar a variantes virales altamente diversificadas, incluso dentro de un solo paciente (cuasiespecies) [35]. De hecho, siete genotipos principales, que varían hasta un 30% en la secuencia de nucleótidos, y varios subtipos son reconocidos, cada uno caracterizado por diferentes características clínicas tales como diferentes tasas evolutivas a las enfermedades hepáticas crónicas o diferente respuesta a las terapias antivirales disponibles [21, 36, 37]. El desarrollo y uso de mAbs anti-VHC capaces de dirigir regiones estructural y funcionalmente conservadas de las partículas virales altamente variables se consideran como nuevas herramientas terapéuticas [38] [39] [40] [42] [43]. En particular, se ha demostrado que la producción de nAbs potentes en infecciones Además, en los chimpancés vacunados, una respuesta sostenida de Ab a las glicoproteínas envolventes E1 y E2 se correlaciona con una viremia reducida [45], mientras que la administración pasiva de mAbs neutralizante en un modelo de infección de ratón quimérico uPA-SCID fue capaz de proteger contra el desafío con un inóculo de cuasiespecie del VHC [46]. Los mAbs ampliamente neutralizantes humanos dirigidos contra la glicoproteína superficial E2 del VHC (HCV/E2) se dirigen típicamente contra regiones funcionalmente importantes dentro del sitio de unión CD81 [47] [48] [48] [50] [51] [52] [53] [54], así como contra otros residuos críticos altamente conservados entre diferentes genotipos [55, 56]. Este aspecto es crucial para el posible uso terapéutico in vivo de estos mAbs, pero puede no ser suficiente ya que recientemente se ha supuesto que otras poblaciones nonAb pueden interferir con su actividad neutralizante [39, [57] [58] [59] [61]. De hecho, en los individuos persistentemente infectados contra el VHC/E2 los abdominales cruzados generalmente son provocados en un título bajo y en una etapa tardía de la infección, lo que conduce a un pobre control de la viremia, mientras que el uso in vivo de preparados de inmunoglobulina policlonal anti-VHC tanto en chimpancés como en humanos ha sido decepcionante, y los estudios clínicos han demostrado que estos preparados no previenen infecciones recurrentes en pacientes después del trasplante hepático [63]. A este respecto, un documento reciente ha sugerido que el efecto de algunos de estos nAbs, dirigidos contra residuos funcionalmente importantes involucrados en la unión viral al CD81 (dentro del epítopo I, que abarca residuos aminoácidos 412-426), podría verse obstaculizado por la presencia de residuos no nAbs vinculantes dentro del epítopo II en el VHC/E2 (residuos aminoácidos 434-446) [58]. En particular, el bloqueo de estos Abs específicos del epítopo II interferentes no sólo aumentó el título neutralizante del suero que contiene tanto el epítopopopo I como el Abs específico del epítopo II, sino que también descubrió una respuesta más amplia neutralizante del genotipo cruzado [58]. Sin embargo, el papel (y la existencia misma) de estos Abs interferentes en la influencia de la infección por medio de ensayos de neutralización in vitro utilizando VHC derivados del suero del genotipo 4a y Abs policlonales derivados de cabras inmunizadas con diferentes péptidos conservados que abarcan residuos aminoácidos 412-419, 430-447 y 517-531 de glucoproteína VHC/E2 [64]. En particular, este grupo encontró una actividad interferida ejercida por los débiles neutralizantes 430-447-eliminados Abs sobre la actividad neutralizante tanto de la 412-419 como de la 517-531-eliminada Abs [64]. Curiosamente, de acuerdo con el modelo putativo para plegado E2, las tres regiones mencionadas estarían unas junto a otras en la glucoproteína [48]. Por lo tanto, esta predicción estructural posiblemente apoya el efecto interferente del epitopope II dirigido Abs. Sin embargo, mientras Con este fin, la disponibilidad de cristal E1-E2 sin duda acelerará la dilucidación fina de las proximidades espaciales de neutralización e interferencia de mAbs en la estructura E1-E2 y, en consecuencia, el progreso de la vacuna basada en la estructura. Además, cabe destacar que los individuos con Abs que se dirigen a la región de E2 que abarca el epítopo I albergan frecuentemente Abs que reconocen la región que contiene el epítopo II, confirmando así la co-inmunogenicidad de estos epitopes [58]. Por último, se ha demostrado tanto una baja prevalencia (menos del 2,5%) y un bajo título de Epítopo I-reactiva Abs en suera de infecciones crónicas y agudas resueltas, apoyando así la hipótesis de un enmascaramiento conformacional por regiones adyacentes como la que contiene el epítopo II [65]. Al principio se planteó la idea de que una vez que el epítopo II se une a un Ab, el sitio del epítopo I se enmascara y ya no puede ser reconocido por nAbs específicos. De hecho, el agotamiento de Abs al epítopo II en plasma de un paciente con VHC crónicamente infectado y chimpancés vacunados recuperó una actividad neutralizante de otro genotipo cruzado indetectable [58]. Otra posibilidad es que la unión inicial de Abs a la región que contiene el epítopo II puede inducir cambios conformacionales en E2 que inhiben la unión por el epítopopeo I-dirigido Abs, como recientemente sugirió Lapierre et al. para otros anti-HCV/E2 Abs [66]. Por el contrario, estas conclusiones no fueron apoyadas en un estudio reciente de Tarr et al. utilizando murina (AP33) y ratas (2/69a) mAbs, así como fracciones de inmunoglobulina humana de afinidad purificada en péptidos lineales que representan dominios distintos VHC/E2 agrupados dentro de las regiones 412-426 y 434-446 [67]. Aunque confirmando la co-inmunogenicidad previamente reportada de estas dos regiones, los autores no demostraron ninguna inhibición entre estos dos grupos de Abs. Teniendo en cuenta sus resultados, los autores sugirieron de hecho que la interferencia de non-Abs, al menos en la región que abarca residuos 434-446, no es un mecanismo posible para la persistencia del VHC en individuos infectados crónicamente, como había sido propuesto originalmente por Zhang y otros. De acuerdo con los hallazgos de Tarr y colegas, Keck et al. describieron anti-HCV/E2 mAbs encuadernación epítopos Estos mAbs son ampliamente neutralizantes y no conducen a mutantes de escape viral, demostrando la importancia funcional de sus epítopos. Los autores concluyen que no todos los Abs dirigidos contra el epítopo II están interfiriendo, pero también especulan que la actividad de interferencia podría limitarse a Abs reconociendo epitopes lineales dentro de él [56]. Recientemente, hemos confirmado en parte las observaciones de Zhang et al. utilizando un panel de anti-HCV/E2 mAbs: el ratón bien caracterizado anti-HCV/E2 mAb AP33, cuyo epítopo abarca el epítopo I (residuos aminoácidos 412-423), y un anti-HCV/E2 mAb humano débilmente neutralizante (llamado e509), cuyo epítopo abarca el epítopo II [68]. En particular, encontramos que e509 es capaz de interferir con la actividad neutralizante de AP33 en el virus del genotipo 1a (cepa H77). En cambio, encontramos que e509 no interfiere mínimamente con la actividad de otros dos seres humanos ampliamente neutralizantes anti-VHC/E2 mAbs, llamados e20 y e137 [49, 69]. Curiosamente, encontramos que tanto e20 y e137 se unen también a residuos dentro del epitope II, a una afinidad más alta que e509, desplazándolo así del epitope interferente y, por lo tanto, manteniendo inalterada su actividad neutralizante. Así, en nuestra opinión, las observaciones divergentes descritas anteriormente pueden depender de las diferentes especificidades Ab presentes en las preparaciones policlonales utilizadas y, probablemente, también en los diferentes genotipos VHC que infectan a los pacientes estudiados [68 Además, las diferentes estrategias adoptadas para aislar el epítopo I y el epítopo II Abs, seguidas en los estudios anteriores, podrían explicar los diferentes datos obtenidos. De hecho, las inmunoglobulinas purificadas en péptidos que representan distintas regiones del VHC/E2 [67] están obviamente dirigidas contra epítopos lineales; estos preparados son ciertamente diferentes de mAbs clonados utilizando una glucoproteína VHC/E2 de larga duración, que son más probablemente dirigidas contra epítopos conformacionales incluyendo también residuos fuera de las regiones lineales investigadas [54]. En resumen, en el campo del VHC varios trabajos apoyan la existencia de poblaciones de Ab que interfieren e hipotetizan su posible papel en la persistencia del VHC, como se demostró con preparados de inmunoglobulina derivados del plasma humano, mAbs humanos y sura de animales vacunados con pé El posible mecanismo que conduce a la interferencia sigue siendo controversial, pero tanto el obstáculo esterico directo como los cambios conformacionales inducidos por antígenos han sido hipotetizados. Por otro lado, otros documentos no confirman estos hallazgos, sugiriendo que el epítopo interferente putativo II puede ser dirigido por Abs dotados de una actividad ampliamente neutralizante. Nuestro artículo reciente, utilizando bien caracterizado mAbs [68], muestra que los Abs interferentes existen pero que su efecto global puede estar sesgado por la presencia de nAbs con diferentes características de unión y por el genotipo del VHC infectado. Los trabajos futuros que investigan el papel in vivo de estas subpoblaciones interferentes en la persistencia del VHC sin duda serán muy útiles. Los virus de la gripe circulan por todo el mundo en depósitos de animales, especialmente aves acuáticas, que pueden afectar a los seres humanos de cualquier grupo de edad. El tipo más clínicamente relevante y variable es la gripe A, que se divide en varios subtipos, según la característica antigénica de las dos glicoproteínas envolventes, y causa infecciones epidémicas y pandémicas [70]. Las epidemias anuales recurrentes de gripe se asocian con morbilidad y mortalidad significativas, particularmente entre los grupos de riesgo (como personas de edad avanzada o con enfermedades crónicas, mujeres embarazadas y niños) [71] ; la propagación mundial de virus de gripe pandémica puede causar millones de muertes [72]. Dentro del virio de gripe envuelto ocho segmentos de ARN de una sola cadena negativa están protegidos por la proteína nucleocápsida, formando la ribonucleoproteína (RNP). Los primeros seis segmentos de ARN cada uno para una sola proteína: PB2, PB1 y PA (todos constituyen la polimerasa ARN dependiente de ARN), la hemaglutinina (HA), la nucleoproteína (NP), la neuraminidasa (NA). Los últimos dos segmentos cada uno para dos proteínas diferentes: las proteínas de la matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2). Tres proteínas diferentes (HA, NA y M2) están presentes en la envoltura viral. La glucoproteína HA es la más abundante y es el objetivo principal de la respuesta inmune humoral. Junto con la glucoproteína transmembrana NA, HA es capaz de provocar una respuesta inmune subtipo-específica que es totalmente protectora dentro, pero sólo parcialmente protectora a través de diferentes subtipos [73]. La HA se sintetiza como precursor inactivo que pasa a su forma activa sobre la escisión por proteasasas de células huésped, y que está presente en la membrana viral como homotrimeros. Los recortadores de HA se unen a moléculas de ácido siálico 2,6 vinculadas a proteínas de membrana celular o lípidos a través de dominios ubicados en la cabeza globular de cada monómero. Posteriormente, la envoltura viral se fusiona por mecanismos dependientes de clatrina e independientes con la membrana de vesícula endocítica a través del péptido de fusión de HA ubicado en la región madre de cada monómero. Como consecuencia, los componentes virales se liberan en la célula huésped y pueden subvertir las capacidades sintéticas de la célula huésped para la producción y liberación de partículas de progenie [74]. La inmunidad humoral juega un papel importante en la defensa del huésped contra la infección por el virus de la gripe, ya que la mayoría de los virus de la gripe neutralizan el Abs y, por lo tanto, limitan la infección [75] [77] [78]. De hecho, un gran cuerpo de trabajos experimentales sugiere que la oclusión del sitio de unión del receptor en la HA por Abs es el principal mecanismo de neutralización viral de la gripe. Menos común, pero más ampliamente nAbs puede neutralizar el virus de la gripe al inhibir la fusión de la envoltura viral con la membrana endocítica-vesícula [50, [79] [80] [81] [82] [83]. Los cambios aminoácidos en la HA, más frecuentes en la cabeza globular inmunodominante, tienen efectos complejos sobre la neutralización viral por Abs, generalmente permitiendo que las variantes mutadas escapen de Los estudios clásicos utilizando mAbs de ratón neutralizante identificaron cinco sitios antigénicos distintos (A-E) en la región globular de la cabeza HA1 en la estructura tridimensional de la molécula H3 HA (A/Hong Kong/1/68) [85] [86] [87] así como en los subtipos H1 [88] y H2 [89]. Durante los primeros días de una infección, el título de nAb es a menudo bajo, mientras que el título de nonAbs es más alto y puede desempeñar un papel en el resultado de una infección, como se ha observado recientemente en los pacientes infectados por el virus pandémico influenza A/2009 H1N1 por To et al. [90]. En particular, este grupo encontró que la cantidad, así como la avidez, de nonAbs eran mayores para los pacientes con enfermedad grave que para aquellos con enfermedad leve. Los autores concluyeron que una respuesta no-nAb exagerada durante la etapa temprana de la infección se asoció con enfermedad grave [90]. Además, los autores especularon que los no-nAbs presentes en los sueros de los pacientes durante la etapa temprana de la infección eran probablemente preexistentes o el resultado de una respuesta inmune humoral heterosubtípica secundaria contra epítopos más conservados en varias proteínas de la gripe [91]. Esta respuesta humoral temprana puede ser provocada dentro de unos pocos días después de la infección, debido a la inmunidad por la exposición previa a epitopos virales compartidos. De hecho, las proteínas matrices y nucleoproteínas han conservado secuencias aminoácidos, y por lo tanto Abs contra estas proteínas de la infección anterior del virus de la gripe estacional o vacunación podría ser inducido [92]. De hecho, tras la infección por el virus de la gripe, las células B de la memoria pueden proliferar rápidamente y generar una gran cantidad de estas avidez non-Abs, especialmente en pacientes con enfermedad grave, lo que concuerda con la observación de que el número de células B de sangre periférica es mayor en pacientes con enfermedad grave que en aquellos con enfermedad leve durante la fase temprana de la infección. El mecanismo de interferencia de neutralización de Ab también ha sido especulado indirectamente por Ndifon et al., quienes observaron que algunos cambios aminoácidos en la HA en realidad aumentan la eficiencia de neutralización de variantes de escape por Abs previamente generados, aunque no influyan directamente en su unión [93]. En detalle, este grupo sugirió que el aumento de la actividad neutralizante después de la mutación de HA podría ser el resultado de una menor interferencia estéril entre Abs. Específicamente, si hay una competencia esterical para la unión a la HA por Abs con diferente eficiencia de neutralización, entonces una mutación que reduce la unión de Abs con baja actividad neutralizante podría aumentar la neutralización viral general. De hecho, al igual que lo que se ha especulado para el VHC, Abs que se unen a los epítopos de HA ubicados a una distancia del sitio de unión al receptor puede por lo tanto no ocupar este sitio de manera eficiente, lo que conduce a una disminución de la neutralización viral. Además, se ha demostrado que Abs que se unen a un determinado epítopope de HA puede impedir una mayor unión de Abs a otros epítopos de la misma proteína de HA, e incluso a los epítopos encontrados en proteínas de HA adyacentes. Las observaciones anteriores sugieren que Abs que se unen a los epítopos de baja eficiencia de neutralización de Considerando la estructura de la HA, la unión de los Abs interferentes estaría en el nivel del epítopo C y E situado lejos del sitio de unión del receptor en la cabeza globular de la HA. Sin embargo, la unión de estos Abs puede influir en la unión de nAbs a los epítopos A, B y D, situados más cerca del sitio de unión del receptor [93]. A este respecto, los cambios en el epítopo A, B y D podrían ser muy favorecidos por la selección natural, mientras que los cambios en los epítopos C y E podrían ser desfavorables a los virus de la gripe [93]. De hecho, los obstáculos estericos por Abs que unen estos epítopos podrían reducir en gran medida el grado de mutación necesario para que un virus evada la neutralización por el huésped Abs. En consecuencia, una disminución en la afinidad de Abs por los epítopos con una eficiencia de baja neutralización podría conducir a un aumento en la neutralización viral. Esto sugiere un posible enfoque para diseñar vacunas de "baja interferencia" que podrían disminuir en gran medida el impacto de la interferencia Ab. Estos inmunogenes son modificados genéticamente desde el objetivo viral sólo en el nivel de los epítopos de baja eficiencia de neutralización. De hecho, los abs inducidos por la vacuna sólo reconocen epitopes de alta eficiencia de neutralización del objetivo y los abs inducidos por la cepa vacuna de baja interferencia tienen baja afinidad por los epítopos de baja eficiencia de neutralización de la cepa de virus circulante objetivo. En consecuencia, limitando la interferencia mediada por Ab, el virus diana no puede escapar del Abs inducido por la vacuna a través de pequeños cambios epitópicos. Alternativamente, las vacunas podrían ser diseñadas para incluir solamente aquellas regiones que corresponden a epítopos con alta eficiencia de neutralización. Además, los fármacos antivirales podrían ser diseñados para incluir proteínas virales que transportan modificaciones a nivel de epítopos de alta eficiencia de neutralización; estas proteínas "decoy" competirían con el virus por la unión a la eficiencia de baja neutralización Abs de una manera similar a la que juegan los inhibidores de la neuraminidasa. En síntesis, la disponibilidad de la estructura cristalina de HA ha ayudado a confirmar la existencia y explicar los mecanismos de interferencia por anti-HA Abs no o débilmente neutralizantes. [90] evidenciando que una respuesta non-Ab durante la fase temprana de la infección está asociada con una enfermedad grave, puede ser la primera prueba del papel de estos Abs interferentes en el curso de una infección natural. Los [94]. Más de 8.000 casos, incluyendo casi 800 muertes, fueron reportados durante el período del brote y el aumento de la edad y la comorbilidad fueron factores de riesgo de enfermedad grave y muerte [95]. Desde 2003, sólo se han reportado casos esporádicos; sin embargo, la posibilidad de que brotes de SARS puedan reaparecer de forma natural o ser liberados deliberadamente es un problema de salud pública. Al igual que los virus de la gripe, el SARS-CoV circula en depósitos de animales, con murciélagos que se cree que transmiten el virus a pequeños mamíferos con exposición a estos pequeños animales como fuente de infecciones humanas [96]. La enfermedad clínica es similar a otras infecciones respiratorias agudas graves, incluyendo la gripe, y la definición de caso SRAS incluye criterios clínicos, epidemiológicos y de laboratorio [97, 98]. La organización básica del genoma y el ciclo replicativo es similar para todas las CoVs. Gene 1 codifica todas las proteínas predichas de replicase/transcriptasa, que se traducen a partir de ARN genómico de entrada, mientras que los genes 2-9 codifican proteínas estructurales y accesorias, incluyendo la proteína de pico de sobre (S), que se traducen a partir de ARNm subgenómicos separados. Las CoVs utilizan un mecanismo discontinuado único para transcribir una serie de ARNm subgenómicos progresivamente más grandes, y cada una contiene una secuencia de ARN líder que se deriva del extremo 5' del genoma [99]. La proteína S de CoVs se inserta en la envoltura de los eventos de unión y fusión del virión necesarios para la infección, y es el objetivo principal de la inmunidad protectora humoral [100]. Aunque la proteína S de SARS-CoV (SARS-S) comparte poca identidad aminoácida (aproximadamente 20%-27%), comparte características estructurales comunes con las proteínas S de los otros miembros de la familia Coronaviridae. La proteína SRAS-S es una glicoproteína transmembrana tipo I de aproximadamente 1.255 aminoácidos en longitud y dividida en dos dominios funcionales: S1 (residuos aminoácidos 15-680) y S2 (residuos aminoácidos 681-1,255) [101]. En muchas CoVs, la proteína S se escinde durante la biogénesis y estos dos dominios funcionales se mantienen juntos no covalentes; sin embargo, como en el caso de la CoV humana 229E, la proteína S no se escinde en el SARS-CoV [102]. El dominio S1 forma una estructura globular que media la interacción de la proteína S con su receptor principal, la enzima de conversión de la angiotensina 2 (ACE2), mientras que el dominio S2 media la fusión y contiene el péptido de fusión putativa y dos regiones helicoidales conservadas (HR1 y HR2) que sobre la escisión por la catepsina proteasa endosomal L forman el núcleo de fusión de seis paquetes de hélice [103]. Sin embargo, tal estrategia plantea un dilema singular para las COV, ya que los protocolos de vacunación anteriores han puesto de relieve la posibilidad de una mejora inmunomediada de la enfermedad [104]. A este respecto, el grupo de Zhong et al. investigaron el papel de los ABS interferentes no neutralizantes también en el caso de la infección por SARS-CoV [105]. En particular, encontraron que dos mAbs dirigidos contra la región que abarca residuos aminoácidos 491-510 de SARS-S (341C y 540C) actúan sinérgicamente para inhibir in vitro la infección por SARS-CoV, mientras que un mAb (240C) no neutralizante, cuyo epítopo abarca la región mencionada, interrumpió la actividad neutralizante de 341C y 540C [105, 106]. Al analizar la estructura cristalina de la proteína SARS-S, los autores propusieron una posible explicación a lo observado, evidenciando que los epítopos de todos los mAbs están estrechamente empaquetados y proximales entre sí pero distales del sitio de unión del receptor ACE2 [105]. Además, el epítopo del mAb 240C no neutralizante se superpone parcialmente por al menos 2 aminoácidos (P507 y A508) con el del mAb 341C neutralizante. Como consecuencia, mAb 240C podría inhibir la unión de mAb 341C de manera relacionada con el equilibrio. Por otro lado, los autores encontraron que los 240C mAb podrían interferir estericamente con la unión del mAb 540C a través del mecanismo propuesto de ocupación espacial (Figura 1B). De hecho, la accesibilidad de mAb 540C a su epítopo puede ser bloqueada por la unión mAb 240C que enmascara la superficie que lo contiene. De hecho, como especulan Davies y Cohen, la zona enterrada de un Ab puede variar de 500 Å 2 a más de 800 Å 2 correspondiente a 21-32 aminoácidos, aunque sólo 9-20 residuos de aminoácidos (el epítopo real) hacen contacto directo con el Ab [107]. De hecho, como se observó anteriormente para el VHC, la gripe y otros virus humanos y animales [108], uno de los posibles mecanismos es que el bloque esterico por non-Abs reduce la unión de nAbs en la neutralización de la proteína SRAS. Por el contrario, a pesar de los epítopos de mAbs 341C y 540C se encuentran en un solo lazo; se separan espacialmente proporcionando interfaces distintas para la unión independiente de Ab. Para concluir, el SARS-CoV puede provocar potencialmente interferencias non-Abs presentando en su superficie regiones estrechamente embalados con diferentes características biológicas. Por otro lado, el huésped puede montar una vigorosa respuesta humoral neutralizante produciendo Abs que reconocen diferentes epitopes y actúan sinérgicamente. En particular, estos resultados sugieren que un cóctel de mAb humano neutralizante que puede unirse a epitopes únicos y tener diferentes mecanismos de acción podría ser de utilidad clínica contra la infección por SARS-CoV, e indicar que se puede aplicar un enfoque similar para tratar otras infecciones virales [109]. El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus positivo del ARN de una sola cadena, que causa morbilidad y mortalidad considerables en todo el mundo, especialmente en los países en desarrollo. Los virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 y 2 (VIH-1 y VIH-2) son los resultados de las transmisiones de múltiples especies del virus del simio al ser humano. La prevalencia del VIH-2 es baja y hay una mayor proporción de personas infectadas por el VIH-2 que no progresan hacia el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en comparación con las infectadas por el VIH-1 [110]. Los virus del VIH-1 son muy divergentes y se clasifican en cuatro grupos: M, N, O y P. En particular, el grupo M se subdivide en nueve subtipos y numerosas formas recombinantes circulantes [111]. El genoma de todos los retrovirus codifica las proteínas estructurales Gag, Pol y Env. Entre las proteínas estructurales del VIH, gp120 y gp41 envuelven la superficie glicoproteínas forman heterodímeros que se organizan como recortadores en la superficie de la membrana viral. La entrada del VIH-1 en las células diana se inicia por la interacción de estas glicoproteínas envolventes superficiales con CD4 y un co-receptor (típicamente CCR5 o CXCR4) en las células diana [112]. La porción gp120 une los receptores de las células diana, mientras que gp41 promueve la fusión de membranas virales y celulares [113]. Al unirse al receptor CD4, gp120 sufre un cambio conformacional, resultando en la exposición de epitopos que pueden ser unidos por moléculas co-receptoras y en la eventual formación de la conformación intermedia pre-pirpina transitoria [114] [115] [116]. En el intermedio pre-hairpin, las moléculas gp41 se reorganizan para que los péptidos N-terminales formen un recortador de hélices que exponen el péptido de fusión a la célula diana, mientras que los hélices C-terminales permanecen anclados a la membrana viral [113]. Esta etapa es vulnerable a un número de nAbs y péptidos capaces de unir los péptidos N-o C-terminales [117, 118]. Tras la fusión con la membrana celular diana, una mayor reorganización de gp41 resulta en la asociación de N-y C-terminales para crear un haz de seis hélices post-fusión [119]. Después de la fusión y la entrega del capsid viral en el citoplasma, el descubrimiento conduce a la liberación de enzimas virales, proteínas y ARN genómico dentro de la A continuación, se inicia la transcripción inversa del ARN positivo genómico viral de una sola cadena para producir un ADN proviral de doble cadena para ser importado en el núcleo e integrado en el cromosoma huésped. La transcripción activa del ADN proviral integrado se produce en presencia de NF-B y Tat viral. El empalme del ARNm viral produce proteínas accesorias tempranas como Tat, Rev y Nef, que ayudan en la transcripción, empalme y modificación de la maquinaria celular, respectivamente. La acumulación de Rev protege el ARNm viral de la empalme, lo que produce ARNm cada vez más largos capaces de codificar proteínas estructurales y envolventes, y finalmente los ARN genómicos virales están listos para ser cautivados [111]. La terapia antirretroviral para el VIH es altamente eficaz en el control de la infección; sin embargo, la erradicación de este virus es actualmente imposible y el Una vacuna es ampliamente considerada como crucial para el control de la epidemia, pero varios esfuerzos avanzados para desarrollar una profilaxis efectiva resultaron infructuosos [120, 121]. Uno de los mayores desafíos en el desarrollo de una vacuna contra el VIH es superar su capacidad de mutar constantemente y escapar de las respuestas inmunitarias anti-VIH [122]. Esta alta tasa de mutación es un resultado directo de la presencia de ARN polimerasa de baja fidelidad del virus, así como los altos niveles de recombinación que sufre y el escudo glucano en constante evolución de las glucoproteínas de envoltorio [123] [124] [125]. A este respecto, tanto los linfocitos citotóxicos como los nAbs han sido reportados durante mucho tiempo para seleccionar variantes de escape inmune durante el curso de la infección por el VIH-1 [126] [127]. Una inmunoterapia pasiva candidata podría consistir, como se sugirió anteriormente para la infección por SARS-CoV, en la administración de un cóctel de mAbs ampliamente neutralizante, que podría minimizar la aparición de mutantes de escape viral [129]. Se han estudiado varias combinaciones de mAbs humanos en los últimos años que han mostrado efectos aditivos, sinérgicos o antagónicos en la neutralización del VIH-1 [130] [133] [133] [134] [135]. El efecto antagonista en la neutralización del VIH-1 se ha reportado previamente con un par de anti-gp120 mAbs dirigidos contra el V3-lazo y el sitio de unión CD4, respectivamente [136]. Los mecanismos moleculares que determinan el antagonismo no han sido estudiados en detalle. El único estudio que describió por primera vez a nivel molecular un posible mecanismo de interferencia también para el VIH se realizó utilizando combinaciones de pares de anti-gp41 mAbs [137]. Más en detalle, los autores observaron un efecto antagonista cuando los anti-gp41 neutralizantes mAbs 2F5 o 50-69 se combinaron con los anti-gp41 mAb 98-6 [137]. En particular mAbs 50-69 y 98-6 reconocen diferentes epítopos gp41 ubicados dentro del grupo I (residuos aminoácidos 579-613) y el grupo II (residuos aminoácidos 644-667), respectivamente. Por otro lado, mAb 2F5 reconocen un epítope diferente de mAb 98-6, dentro de la región externa proximal de membrana gp41 (MPER), en una porción adyacente al grupo II de gp41. Además, hay cierta superposición entre los epítopos del grupo II y el epítopo reconocido por mAb 2F5 [138], explicando la inhibición de la unión de mAb 2F5 por mAb 98-6 [137, 139]. Así, en el caso del antagonismo entre mAbs 2F5 y 98-6 el autor hipoteticó un mecanismo de obstáculo esterico entre los dos mAbs, ya que podían unir péptidos y complejos péptidos que representaban las formas prefusogénicas y fusogénicas de gp41 [140]. En particular, mAb 98-6 tenía una afinidad más alta por los complejos péptidos que representaban la forma fusogénica, que 2F5. Así, la unión de 98-6, que no neutraliza el aislado del VIH-1 89.6 (VIH-1 89.6 ), podría interferir con la unión de 2F5, En contraste, mAbs 50-69 y 2F5 reconocen epítopos distintos en gp41, y muestran reactividad independiente (additiva) contra el VIH-1 89.6 en combinación con la mayoría de los otros anti-gp41 y anti-gp120 mAbs probados [137]. Para concluir, los anti-gp120 y anti-gp41 Abs son inducidos en individuos infectados por VIH-1 pero son predominantemente no neutralizantes, ya que las regiones funcionalmente importantes de proteínas superficiales del VIH están casi completamente ocultas al sistema inmune [139]. Una hipótesis intrigante es que, junto con otros mecanismos de escape del VIH, el efecto de los extremadamente raros anti-gp41 y anti-gp120 nAbs también puede verse obstaculizado por la cantidad abrumadora de no-nabs que interfieren. Hasta la fecha, la existencia de interferencias no-n-Abs se ha evidenciado claramente sólo utilizando anti-gp41 mAbs con diferentes características biológicas, mientras que no se han generado datos utilizando anti-gp120 mAbs. El posible papel de interferencias no-n-Abmediated en facilitar la fuga del VIH en el curso de la infección natural ciertamente merece estudios futuros. Enfoques inmunoprofilácticos o inmunoterapéuticos con mAbs todavía se consideran una posible herramienta de apoyo en el manejo de enfermedades infecciosas. En particular, la disponibilidad de mAbs ampliamente neutralizantes dirigidos contra patógenos virales, cuyos enfoques profilácticos y terapéuticos reales están lejos de ser efectivos, ha llevado a muchos ensayos clínicos en curso. Sin embargo, la evidencia reportada en esta revisión sugiere que los mAbs candidatos para ser posiblemente utilizados en enfoques de inmunización pasiva antiviral, o para ser provocados por futuras estrategias de vacunación, no sólo tienen que ser moléculas altamente neutralizantes [141, 142], sino también moléculas a medida cuya actividad no está influenciada por posibles Abs interferentes producidos en el curso de la infección. Para ello, deben estar dirigidas contra epitopes altamente neutralizantes no sujetos al mecanismo de interferencia, o deben presentar una alta afinidad por el antígeno para desplazar la unión de posibles Abs interferentes [51, 68].

¿Por qué ha sido difícil desarrollar una terapia para el virus de la hepatitis C?

Neutralización Interfiriendo Anticuerpos: ¿Un “Novela” Ejemplo de Disfunción Inmune Humoral Facilitando la Escape Viral? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499828/SHA: f4f75af02b7226c5b2363de1a75821a4b9b20412Autores: Nicasio, Mancini; Sautto, Giuseppe; Clementi, Nicola; Diotti, Roberta A.; Criscuolo, Elena; Castelli, Matteo; Solforosi, Laura; Clementi, Massimo; Burioni, RobertoFecha: 2012-09-24DOI: 10.3390/v4091731Licencia: cc-byAbstract: La respuesta inmune contra algunos patógenos virales, en particular aquellos que causan infecciones crónicas, es a menudo ineficaz a pesar de una respuesta neutralizante humoral robusta. Se han descrito varios mecanismos de evasión capaces de subvertir la actividad de los anticuerpos neutralizantes (nAbs), entre los que se encuentra la hipótesis de la excitación de los Abs no neutralizantes e interferentes. Recientemente, este mecanismo de evasión ha adquirido un interés creciente por su posible impacto en los nuevos enfoques antivirales terapéuticos y profilácticos basados en nAb. En esta revisión, ilustramos los mecanismos de interferencia mediada por Ab y los patógenos virales descritos en la literatura como capaces de adoptar esta estrategia de evasión “novela”. Texto: Los virus hipervariables adoptan varios mecanismos para hacer frente a la respuesta inmune humoral del huésped. El mecanismo más estudiado es la acumulación de mutaciones puntuales en regiones inmunodominantes de proteínas superficiales, lo que ya no son reconocibles por anticuerpos neutralizantes (nAbs) [1] [2] [4]. Otros mecanismos de escape que involucran proteínas superficiales incluyen la glicosilación de residuos funcionalmente pivotales (el escudo de glicanos) o su asociación con componentes séricos del huésped (por ejemplo, lipoproteínas) con el fin de ocultarlos del sistema inmunitario [5] [6] [7] [9] (Figura 1A ). Otros mecanismos de escape conocidos son: i) una especie de vía protegida de propagación del virus, como la transmisión de células a células [10, 11] ; ii) la mímica molecular entre las proteínas virales y los autoantígenos del huésped o iii) la estimulación inducida por virus de anticuerpos subfamiliares restringidos (Abs), ambas con implicaciones obvias en enfermedades autoinmunes inducidas por virus como la crioglobulinemia para el VHC [12] [13] [14]. El posible efecto de interferencia de los abs no neutralizantes (nonabs) fue propuesto originalmente por Dul en 1956 [15], para explicar la aparente inhibición de la neutralización del virus ejercida por algunas muestras séricas. Recientemente, este mecanismo de escape inmune propuesto ha readquirido un interés relevante, especialmente teniendo en cuenta el uso clínico potencial de nAbs antiinfeccioso neutralizante o el diseño de aproximaciones vaccinales basadas en epitopes [16]. Hasta la fecha, se han propuesto dos mecanismos principales para los efectos de interferencia de nonAbs: (i) interferencia de unión directa por obstáculo esterínico, (ii) inhibición de la unión tras cambios conformacionales del antígeno viral unido por interferir nonAbs. Además, se ha especulado que, incluso cuando no interfiere directamente con la unión de nAbs, nonAbs puede conducir también a la mejora de la infección viral a través de la interacción con receptores Fc o receptores de complemento [17]. En general, los no-nAbs posiblemente provocados en individuos infectados o vacunados pueden interferir con el potencial neutralizante de los nAbs. En más detalle, estos Abs interferentes son capaces de unirse a proteínas virales a nivel de inmunodominante pero funcionalmente irrelevantes regiones de proteínas virales, disminuyendo o bloqueando la unión de nAbs a epítopos virales cruciales (por ejemplo, dominios de unión a receptores) (Figura 1B ) [18]. Un anticuerpo monoclonal antiviral candidato (mAb) o preparación policlonal no debe ser sometido a este mecanismo de interferencia, o a los otros mecanismos de escape mencionados anteriormente. Del mismo modo, nuevos enfoques vaccinales deben evitar la excitación de los Abs interferentes que incluso podrían empeorar la enfermedad en caso de una infección real. En los siguientes párrafos discutimos estos mecanismos con ejemplos específicos de su papel en el El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus envuelto de ARN de sentido positivo que causa hepatitis crónica en la mayoría de los pacientes no tratados (alrededor del 80%), con el consiguiente riesgo de desarrollar cirrosis y carcinoma hepatocelular. Más de 170 millones de personas (2%-3% de la población mundial) están infectadas en todo el mundo, y todavía no se dispone de una vacuna protectora, mientras que las opciones terapéuticas siguen siendo limitadas y no son completamente eficaces [19]. Por estas razones, la infección crónica por VHC representa la principal indicación de trasplante hepático en Europa y Estados Unidos. Además, los receptores trasplantados están sujetos a un alto riesgo de reinfección del injerto y a una progresión más severa y rápida de la enfermedad hepática [20]. Representación esquemática de los mecanismos de escape viral de la respuesta inmune humoral frente a proteínas virales superficiales: mutaciones puntuales en regiones inmunodominantes, glicosilación de residuos funcionalmente pivotales (escudo glucano) de las proteínas superficiales virales y asociación del virus con los componentes séricos del huésped (por ejemplo, lipoproteínas) (B) Mecanismos de interferencia en la neutralización del virus mediado por nAb mediante la unión de los Abs non-n-n-Abs interferentes: los Abs noneutralizantes/interferentes pueden interferir en la unión de nAbs por un obstáculo estéril tras una ocupación espacial de su epítopo o una competencia por la unión; de lo contrario, la unión de los Abs noneutralizantes/interferentes puede inducir cambios conformacionales en la proteína viral, afectando así la unión de nAbs al El genoma del VHC codifica una sola poliproteína de unos 3.000 aminoácidos que es procesada por las proteasasas del huésped y virales en al menos 3 proteínas estructurales (núcleo, E1 y E2) y 7 no estructurales (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) [21, 22]. En particular, las glicoproteínas de membrana de tipo I E1 y E2 forman heterodímeros no covalentes en la superficie de la envoltura del VHC y permiten que la endocitosis viral mediada por clatrina interactúe consecutivamente con varios factores celulares de entrada tales como los glicosaminoglicanos [23] [24] [25], el receptor de lipoproteínas de baja densidad [26, 27], el receptor de la clase B del escavenger tipo I [28], el CD81 de tetraspanina [29], las proteínas de unión estrecha claudin-1 y ocludin, y el recientemente descrito receptor de absorción de colesterol Niemann-Pick C1 similar a [30] [31] [33] [34]. El desarrollo de enfoques profilácticos y terapéuticos eficaces contra este virus se ha visto obstaculizado principalmente por su alta tasa de mutación que da lugar a variantes virales altamente diversificadas, incluso dentro de un solo paciente (cuasiespecies) [35]. De hecho, siete genotipos principales, que varían hasta un 30% en la secuencia de nucleótidos, y varios subtipos son reconocidos, cada uno caracterizado por diferentes características clínicas tales como diferentes tasas evolutivas a las enfermedades hepáticas crónicas o diferente respuesta a las terapias antivirales disponibles [21, 36, 37]. El desarrollo y uso de mAbs anti-VHC capaces de dirigir regiones estructural y funcionalmente conservadas de las partículas virales altamente variables se consideran como nuevas herramientas terapéuticas [38] [39] [40] [42] [43]. En particular, se ha demostrado que la producción de nAbs potentes en infecciones Además, en los chimpancés vacunados, una respuesta sostenida de Ab a las glicoproteínas envolventes E1 y E2 se correlaciona con una viremia reducida [45], mientras que la administración pasiva de mAbs neutralizante en un modelo de infección de ratón quimérico uPA-SCID fue capaz de proteger contra el desafío con un inóculo de cuasiespecie del VHC [46]. Los mAbs ampliamente neutralizantes humanos dirigidos contra la glicoproteína superficial E2 del VHC (HCV/E2) se dirigen típicamente contra regiones funcionalmente importantes dentro del sitio de unión CD81 [47] [48] [48] [50] [51] [52] [53] [54], así como contra otros residuos críticos altamente conservados entre diferentes genotipos [55, 56]. Este aspecto es crucial para el posible uso terapéutico in vivo de estos mAbs, pero puede no ser suficiente ya que recientemente se ha supuesto que otras poblaciones nonAb pueden interferir con su actividad neutralizante [39, [57] [58] [59] [61]. De hecho, en los individuos persistentemente infectados contra el VHC/E2 los abdominales cruzados generalmente son provocados en un título bajo y en una etapa tardía de la infección, lo que conduce a un pobre control de la viremia, mientras que el uso in vivo de preparados de inmunoglobulina policlonal anti-VHC tanto en chimpancés como en humanos ha sido decepcionante, y los estudios clínicos han demostrado que estos preparados no previenen infecciones recurrentes en pacientes después del trasplante hepático [63]. A este respecto, un documento reciente ha sugerido que el efecto de algunos de estos nAbs, dirigidos contra residuos funcionalmente importantes involucrados en la unión viral al CD81 (dentro del epítopo I, que abarca residuos aminoácidos 412-426), podría verse obstaculizado por la presencia de residuos no nAbs vinculantes dentro del epítopo II en el VHC/E2 (residuos aminoácidos 434-446) [58]. En particular, el bloqueo de estos Abs específicos del epítopo II interferentes no sólo aumentó el título neutralizante del suero que contiene tanto el epítopopopo I como el Abs específico del epítopo II, sino que también descubrió una respuesta más amplia neutralizante del genotipo cruzado [58]. Sin embargo, el papel (y la existencia misma) de estos Abs interferentes en la influencia de la infección por medio de ensayos de neutralización in vitro utilizando VHC derivados del suero del genotipo 4a y Abs policlonales derivados de cabras inmunizadas con diferentes péptidos conservados que abarcan residuos aminoácidos 412-419, 430-447 y 517-531 de glucoproteína VHC/E2 [64]. En particular, este grupo encontró una actividad interferida ejercida por los débiles neutralizantes 430-447-eliminados Abs sobre la actividad neutralizante tanto de la 412-419 como de la 517-531-eliminada Abs [64]. Curiosamente, de acuerdo con el modelo putativo para plegado E2, las tres regiones mencionadas estarían unas junto a otras en la glucoproteína [48]. Por lo tanto, esta predicción estructural posiblemente apoya el efecto interferente del epitopope II dirigido Abs. Sin embargo, mientras Con este fin, la disponibilidad de cristal E1-E2 sin duda acelerará la dilucidación fina de las proximidades espaciales de neutralización e interferencia de mAbs en la estructura E1-E2 y, en consecuencia, el progreso de la vacuna basada en la estructura. Además, cabe destacar que los individuos con Abs que se dirigen a la región de E2 que abarca el epítopo I albergan frecuentemente Abs que reconocen la región que contiene el epítopo II, confirmando así la co-inmunogenicidad de estos epitopes [58]. Por último, se ha demostrado tanto una baja prevalencia (menos del 2,5%) y un bajo título de Epítopo I-reactiva Abs en suera de infecciones crónicas y agudas resueltas, apoyando así la hipótesis de un enmascaramiento conformacional por regiones adyacentes como la que contiene el epítopo II [65]. Al principio se planteó la idea de que una vez que el epítopo II se une a un Ab, el sitio del epítopo I se enmascara y ya no puede ser reconocido por nAbs específicos. De hecho, el agotamiento de Abs al epítopo II en plasma de un paciente con VHC crónicamente infectado y chimpancés vacunados recuperó una actividad neutralizante de otro genotipo cruzado indetectable [58]. Otra posibilidad es que la unión inicial de Abs a la región que contiene el epítopo II puede inducir cambios conformacionales en E2 que inhiben la unión por el epítopopeo I-dirigido Abs, como recientemente sugirió Lapierre et al. para otros anti-HCV/E2 Abs [66]. Por el contrario, estas conclusiones no fueron apoyadas en un estudio reciente de Tarr et al. utilizando murina (AP33) y ratas (2/69a) mAbs, así como fracciones de inmunoglobulina humana de afinidad purificada en péptidos lineales que representan dominios distintos VHC/E2 agrupados dentro de las regiones 412-426 y 434-446 [67]. Aunque confirmando la co-inmunogenicidad previamente reportada de estas dos regiones, los autores no demostraron ninguna inhibición entre estos dos grupos de Abs. Teniendo en cuenta sus resultados, los autores sugirieron de hecho que la interferencia de non-Abs, al menos en la región que abarca residuos 434-446, no es un mecanismo posible para la persistencia del VHC en individuos infectados crónicamente, como había sido propuesto originalmente por Zhang y otros. De acuerdo con los hallazgos de Tarr y colegas, Keck et al. describieron anti-HCV/E2 mAbs encuadernación epítopos Estos mAbs son ampliamente neutralizantes y no conducen a mutantes de escape viral, demostrando la importancia funcional de sus epítopos. Los autores concluyen que no todos los Abs dirigidos contra el epítopo II están interfiriendo, pero también especulan que la actividad de interferencia podría limitarse a Abs reconociendo epitopes lineales dentro de él [56]. Recientemente, hemos confirmado en parte las observaciones de Zhang et al. utilizando un panel de anti-HCV/E2 mAbs: el ratón bien caracterizado anti-HCV/E2 mAb AP33, cuyo epítopo abarca el epítopo I (residuos aminoácidos 412-423), y un anti-HCV/E2 mAb humano débilmente neutralizante (llamado e509), cuyo epítopo abarca el epítopo II [68]. En particular, encontramos que e509 es capaz de interferir con la actividad neutralizante de AP33 en el virus del genotipo 1a (cepa H77). En cambio, encontramos que e509 no interfiere mínimamente con la actividad de otros dos seres humanos ampliamente neutralizantes anti-VHC/E2 mAbs, llamados e20 y e137 [49, 69]. Curiosamente, encontramos que tanto e20 y e137 se unen también a residuos dentro del epitope II, a una afinidad más alta que e509, desplazándolo así del epitope interferente y, por lo tanto, manteniendo inalterada su actividad neutralizante. Así, en nuestra opinión, las observaciones divergentes descritas anteriormente pueden depender de las diferentes especificidades Ab presentes en las preparaciones policlonales utilizadas y, probablemente, también en los diferentes genotipos VHC que infectan a los pacientes estudiados [68 Además, las diferentes estrategias adoptadas para aislar el epítopo I y el epítopo II Abs, seguidas en los estudios anteriores, podrían explicar los diferentes datos obtenidos. De hecho, las inmunoglobulinas purificadas en péptidos que representan distintas regiones del VHC/E2 [67] están obviamente dirigidas contra epítopos lineales; estos preparados son ciertamente diferentes de mAbs clonados utilizando una glucoproteína VHC/E2 de larga duración, que son más probablemente dirigidas contra epítopos conformacionales incluyendo también residuos fuera de las regiones lineales investigadas [54]. En resumen, en el campo del VHC varios trabajos apoyan la existencia de poblaciones de Ab que interfieren e hipotetizan su posible papel en la persistencia del VHC, como se demostró con preparados de inmunoglobulina derivados del plasma humano, mAbs humanos y sura de animales vacunados con pé El posible mecanismo que conduce a la interferencia sigue siendo controversial, pero tanto el obstáculo esterico directo como los cambios conformacionales inducidos por antígenos han sido hipotetizados. Por otro lado, otros documentos no confirman estos hallazgos, sugiriendo que el epítopo interferente putativo II puede ser dirigido por Abs dotados de una actividad ampliamente neutralizante. Nuestro artículo reciente, utilizando bien caracterizado mAbs [68], muestra que los Abs interferentes existen pero que su efecto global puede estar sesgado por la presencia de nAbs con diferentes características de unión y por el genotipo del VHC infectado. Los trabajos futuros que investigan el papel in vivo de estas subpoblaciones interferentes en la persistencia del VHC sin duda serán muy útiles. Los virus de la gripe circulan por todo el mundo en depósitos de animales, especialmente aves acuáticas, que pueden afectar a los seres humanos de cualquier grupo de edad. El tipo más clínicamente relevante y variable es la gripe A, que se divide en varios subtipos, según la característica antigénica de las dos glicoproteínas envolventes, y causa infecciones epidémicas y pandémicas [70]. Las epidemias anuales recurrentes de gripe se asocian con morbilidad y mortalidad significativas, particularmente entre los grupos de riesgo (como personas de edad avanzada o con enfermedades crónicas, mujeres embarazadas y niños) [71] ; la propagación mundial de virus de gripe pandémica puede causar millones de muertes [72]. Dentro del virio de gripe envuelto ocho segmentos de ARN de una sola cadena negativa están protegidos por la proteína nucleocápsida, formando la ribonucleoproteína (RNP). Los primeros seis segmentos de ARN cada uno para una sola proteína: PB2, PB1 y PA (todos constituyen la polimerasa ARN dependiente de ARN), la hemaglutinina (HA), la nucleoproteína (NP), la neuraminidasa (NA). Los últimos dos segmentos cada uno para dos proteínas diferentes: las proteínas de la matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2). Tres proteínas diferentes (HA, NA y M2) están presentes en la envoltura viral. La glucoproteína HA es la más abundante y es el objetivo principal de la respuesta inmune humoral. Junto con la glucoproteína transmembrana NA, HA es capaz de provocar una respuesta inmune subtipo-específica que es totalmente protectora dentro, pero sólo parcialmente protectora a través de diferentes subtipos [73]. La HA se sintetiza como precursor inactivo que pasa a su forma activa sobre la escisión por proteasasas de células huésped, y que está presente en la membrana viral como homotrimeros. Los recortadores de HA se unen a moléculas de ácido siálico 2,6 vinculadas a proteínas de membrana celular o lípidos a través de dominios ubicados en la cabeza globular de cada monómero. Posteriormente, la envoltura viral se fusiona por mecanismos dependientes de clatrina e independientes con la membrana de vesícula endocítica a través del péptido de fusión de HA ubicado en la región madre de cada monómero. Como consecuencia, los componentes virales se liberan en la célula huésped y pueden subvertir las capacidades sintéticas de la célula huésped para la producción y liberación de partículas de progenie [74]. La inmunidad humoral juega un papel importante en la defensa del huésped contra la infección por el virus de la gripe, ya que la mayoría de los virus de la gripe neutralizan el Abs y, por lo tanto, limitan la infección [75] [77] [78]. De hecho, un gran cuerpo de trabajos experimentales sugiere que la oclusión del sitio de unión del receptor en la HA por Abs es el principal mecanismo de neutralización viral de la gripe. Menos común, pero más ampliamente nAbs puede neutralizar el virus de la gripe al inhibir la fusión de la envoltura viral con la membrana endocítica-vesícula [50, [79] [80] [81] [82] [83]. Los cambios aminoácidos en la HA, más frecuentes en la cabeza globular inmunodominante, tienen efectos complejos sobre la neutralización viral por Abs, generalmente permitiendo que las variantes mutadas escapen de Los estudios clásicos utilizando mAbs de ratón neutralizante identificaron cinco sitios antigénicos distintos (A-E) en la región globular de la cabeza HA1 en la estructura tridimensional de la molécula H3 HA (A/Hong Kong/1/68) [85] [86] [87] así como en los subtipos H1 [88] y H2 [89]. Durante los primeros días de una infección, el título de nAb es a menudo bajo, mientras que el título de nonAbs es más alto y puede desempeñar un papel en el resultado de una infección, como se ha observado recientemente en los pacientes infectados por el virus pandémico influenza A/2009 H1N1 por To et al. [90]. En particular, este grupo encontró que la cantidad, así como la avidez, de nonAbs eran mayores para los pacientes con enfermedad grave que para aquellos con enfermedad leve. Los autores concluyeron que una respuesta no-nAb exagerada durante la etapa temprana de la infección se asoció con enfermedad grave [90]. Además, los autores especularon que los no-nAbs presentes en los sueros de los pacientes durante la etapa temprana de la infección eran probablemente preexistentes o el resultado de una respuesta inmune humoral heterosubtípica secundaria contra epítopos más conservados en varias proteínas de la gripe [91]. Esta respuesta humoral temprana puede ser provocada dentro de unos pocos días después de la infección, debido a la inmunidad por la exposición previa a epitopos virales compartidos. De hecho, las proteínas matrices y nucleoproteínas han conservado secuencias aminoácidos, y por lo tanto Abs contra estas proteínas de la infección anterior del virus de la gripe estacional o vacunación podría ser inducido [92]. De hecho, tras la infección por el virus de la gripe, las células B de la memoria pueden proliferar rápidamente y generar una gran cantidad de estas avidez non-Abs, especialmente en pacientes con enfermedad grave, lo que concuerda con la observación de que el número de células B de sangre periférica es mayor en pacientes con enfermedad grave que en aquellos con enfermedad leve durante la fase temprana de la infección. El mecanismo de interferencia de neutralización de Ab también ha sido especulado indirectamente por Ndifon et al., quienes observaron que algunos cambios aminoácidos en la HA en realidad aumentan la eficiencia de neutralización de variantes de escape por Abs previamente generados, aunque no influyan directamente en su unión [93]. En detalle, este grupo sugirió que el aumento de la actividad neutralizante después de la mutación de HA podría ser el resultado de una menor interferencia estéril entre Abs. Específicamente, si hay una competencia esterical para la unión a la HA por Abs con diferente eficiencia de neutralización, entonces una mutación que reduce la unión de Abs con baja actividad neutralizante podría aumentar la neutralización viral general. De hecho, al igual que lo que se ha especulado para el VHC, Abs que se unen a los epítopos de HA ubicados a una distancia del sitio de unión al receptor puede por lo tanto no ocupar este sitio de manera eficiente, lo que conduce a una disminución de la neutralización viral. Además, se ha demostrado que Abs que se unen a un determinado epítopope de HA puede impedir una mayor unión de Abs a otros epítopos de la misma proteína de HA, e incluso a los epítopos encontrados en proteínas de HA adyacentes. Las observaciones anteriores sugieren que Abs que se unen a los epítopos de baja eficiencia de neutralización de Considerando la estructura de la HA, la unión de los Abs interferentes estaría en el nivel del epítopo C y E situado lejos del sitio de unión del receptor en la cabeza globular de la HA. Sin embargo, la unión de estos Abs puede influir en la unión de nAbs a los epítopos A, B y D, situados más cerca del sitio de unión del receptor [93]. A este respecto, los cambios en el epítopo A, B y D podrían ser muy favorecidos por la selección natural, mientras que los cambios en los epítopos C y E podrían ser desfavorables a los virus de la gripe [93]. De hecho, los obstáculos estericos por Abs que unen estos epítopos podrían reducir en gran medida el grado de mutación necesario para que un virus evada la neutralización por el huésped Abs. En consecuencia, una disminución en la afinidad de Abs por los epítopos con una eficiencia de baja neutralización podría conducir a un aumento en la neutralización viral. Esto sugiere un posible enfoque para diseñar vacunas de "baja interferencia" que podrían disminuir en gran medida el impacto de la interferencia Ab. Estos inmunogenes son modificados genéticamente desde el objetivo viral sólo en el nivel de los epítopos de baja eficiencia de neutralización. De hecho, los abs inducidos por la vacuna sólo reconocen epitopes de alta eficiencia de neutralización del objetivo y los abs inducidos por la cepa vacuna de baja interferencia tienen baja afinidad por los epítopos de baja eficiencia de neutralización de la cepa de virus circulante objetivo. En consecuencia, limitando la interferencia mediada por Ab, el virus diana no puede escapar del Abs inducido por la vacuna a través de pequeños cambios epitópicos. Alternativamente, las vacunas podrían ser diseñadas para incluir solamente aquellas regiones que corresponden a epítopos con alta eficiencia de neutralización. Además, los fármacos antivirales podrían ser diseñados para incluir proteínas virales que transportan modificaciones a nivel de epítopos de alta eficiencia de neutralización; estas proteínas "decoy" competirían con el virus por la unión a la eficiencia de baja neutralización Abs de una manera similar a la que juegan los inhibidores de la neuraminidasa. En síntesis, la disponibilidad de la estructura cristalina de HA ha ayudado a confirmar la existencia y explicar los mecanismos de interferencia por anti-HA Abs no o débilmente neutralizantes. [90] evidenciando que una respuesta non-Ab durante la fase temprana de la infección está asociada con una enfermedad grave, puede ser la primera prueba del papel de estos Abs interferentes en el curso de una infección natural. Los [94]. Más de 8.000 casos, incluyendo casi 800 muertes, fueron reportados durante el período del brote y el aumento de la edad y la comorbilidad fueron factores de riesgo de enfermedad grave y muerte [95]. Desde 2003, sólo se han reportado casos esporádicos; sin embargo, la posibilidad de que brotes de SARS puedan reaparecer de forma natural o ser liberados deliberadamente es un problema de salud pública. Al igual que los virus de la gripe, el SARS-CoV circula en depósitos de animales, con murciélagos que se cree que transmiten el virus a pequeños mamíferos con exposición a estos pequeños animales como fuente de infecciones humanas [96]. La enfermedad clínica es similar a otras infecciones respiratorias agudas graves, incluyendo la gripe, y la definición de caso SRAS incluye criterios clínicos, epidemiológicos y de laboratorio [97, 98]. La organización básica del genoma y el ciclo replicativo es similar para todas las CoVs. Gene 1 codifica todas las proteínas predichas de replicase/transcriptasa, que se traducen a partir de ARN genómico de entrada, mientras que los genes 2-9 codifican proteínas estructurales y accesorias, incluyendo la proteína de pico de sobre (S), que se traducen a partir de ARNm subgenómicos separados. Las CoVs utilizan un mecanismo discontinuado único para transcribir una serie de ARNm subgenómicos progresivamente más grandes, y cada una contiene una secuencia de ARN líder que se deriva del extremo 5' del genoma [99]. La proteína S de CoVs se inserta en la envoltura de los eventos de unión y fusión del virión necesarios para la infección, y es el objetivo principal de la inmunidad protectora humoral [100]. Aunque la proteína S de SARS-CoV (SARS-S) comparte poca identidad aminoácida (aproximadamente 20%-27%), comparte características estructurales comunes con las proteínas S de los otros miembros de la familia Coronaviridae. La proteína SRAS-S es una glicoproteína transmembrana tipo I de aproximadamente 1.255 aminoácidos en longitud y dividida en dos dominios funcionales: S1 (residuos aminoácidos 15-680) y S2 (residuos aminoácidos 681-1,255) [101]. En muchas CoVs, la proteína S se escinde durante la biogénesis y estos dos dominios funcionales se mantienen juntos no covalentes; sin embargo, como en el caso de la CoV humana 229E, la proteína S no se escinde en el SARS-CoV [102]. El dominio S1 forma una estructura globular que media la interacción de la proteína S con su receptor principal, la enzima de conversión de la angiotensina 2 (ACE2), mientras que el dominio S2 media la fusión y contiene el péptido de fusión putativa y dos regiones helicoidales conservadas (HR1 y HR2) que sobre la escisión por la catepsina proteasa endosomal L forman el núcleo de fusión de seis paquetes de hélice [103]. Sin embargo, tal estrategia plantea un dilema singular para las COV, ya que los protocolos de vacunación anteriores han puesto de relieve la posibilidad de una mejora inmunomediada de la enfermedad [104]. A este respecto, el grupo de Zhong et al. investigaron el papel de los ABS interferentes no neutralizantes también en el caso de la infección por SARS-CoV [105]. En particular, encontraron que dos mAbs dirigidos contra la región que abarca residuos aminoácidos 491-510 de SARS-S (341C y 540C) actúan sinérgicamente para inhibir in vitro la infección por SARS-CoV, mientras que un mAb (240C) no neutralizante, cuyo epítopo abarca la región mencionada, interrumpió la actividad neutralizante de 341C y 540C [105, 106]. Al analizar la estructura cristalina de la proteína SARS-S, los autores propusieron una posible explicación a lo observado, evidenciando que los epítopos de todos los mAbs están estrechamente empaquetados y proximales entre sí pero distales del sitio de unión del receptor ACE2 [105]. Además, el epítopo del mAb 240C no neutralizante se superpone parcialmente por al menos 2 aminoácidos (P507 y A508) con el del mAb 341C neutralizante. Como consecuencia, mAb 240C podría inhibir la unión de mAb 341C de manera relacionada con el equilibrio. Por otro lado, los autores encontraron que los 240C mAb podrían interferir estericamente con la unión del mAb 540C a través del mecanismo propuesto de ocupación espacial (Figura 1B). De hecho, la accesibilidad de mAb 540C a su epítopo puede ser bloqueada por la unión mAb 240C que enmascara la superficie que lo contiene. De hecho, como especulan Davies y Cohen, la zona enterrada de un Ab puede variar de 500 Å 2 a más de 800 Å 2 correspondiente a 21-32 aminoácidos, aunque sólo 9-20 residuos de aminoácidos (el epítopo real) hacen contacto directo con el Ab [107]. De hecho, como se observó anteriormente para el VHC, la gripe y otros virus humanos y animales [108], uno de los posibles mecanismos es que el bloque esterico por non-Abs reduce la unión de nAbs en la neutralización de la proteína SRAS. Por el contrario, a pesar de los epítopos de mAbs 341C y 540C se encuentran en un solo lazo; se separan espacialmente proporcionando interfaces distintas para la unión independiente de Ab. Para concluir, el SARS-CoV puede provocar potencialmente interferencias non-Abs presentando en su superficie regiones estrechamente embalados con diferentes características biológicas. Por otro lado, el huésped puede montar una vigorosa respuesta humoral neutralizante produciendo Abs que reconocen diferentes epitopes y actúan sinérgicamente. En particular, estos resultados sugieren que un cóctel de mAb humano neutralizante que puede unirse a epitopes únicos y tener diferentes mecanismos de acción podría ser de utilidad clínica contra la infección por SARS-CoV, e indicar que se puede aplicar un enfoque similar para tratar otras infecciones virales [109]. El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus positivo del ARN de una sola cadena, que causa morbilidad y mortalidad considerables en todo el mundo, especialmente en los países en desarrollo. Los virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 y 2 (VIH-1 y VIH-2) son los resultados de las transmisiones de múltiples especies del virus del simio al ser humano. La prevalencia del VIH-2 es baja y hay una mayor proporción de personas infectadas por el VIH-2 que no progresan hacia el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en comparación con las infectadas por el VIH-1 [110]. Los virus del VIH-1 son muy divergentes y se clasifican en cuatro grupos: M, N, O y P. En particular, el grupo M se subdivide en nueve subtipos y numerosas formas recombinantes circulantes [111]. El genoma de todos los retrovirus codifica las proteínas estructurales Gag, Pol y Env. Entre las proteínas estructurales del VIH, gp120 y gp41 envuelven la superficie glicoproteínas forman heterodímeros que se organizan como recortadores en la superficie de la membrana viral. La entrada del VIH-1 en las células diana se inicia por la interacción de estas glicoproteínas envolventes superficiales con CD4 y un co-receptor (típicamente CCR5 o CXCR4) en las células diana [112]. La porción gp120 une los receptores de las células diana, mientras que gp41 promueve la fusión de membranas virales y celulares [113]. Al unirse al receptor CD4, gp120 sufre un cambio conformacional, resultando en la exposición de epitopos que pueden ser unidos por moléculas co-receptoras y en la eventual formación de la conformación intermedia pre-pirpina transitoria [114] [115] [116]. En el intermedio pre-hairpin, las moléculas gp41 se reorganizan para que los péptidos N-terminales formen un recortador de hélices que exponen el péptido de fusión a la célula diana, mientras que los hélices C-terminales permanecen anclados a la membrana viral [113]. Esta etapa es vulnerable a un número de nAbs y péptidos capaces de unir los péptidos N-o C-terminales [117, 118]. Tras la fusión con la membrana celular diana, una mayor reorganización de gp41 resulta en la asociación de N-y C-terminales para crear un haz de seis hélices post-fusión [119]. Después de la fusión y la entrega del capsid viral en el citoplasma, el descubrimiento conduce a la liberación de enzimas virales, proteínas y ARN genómico dentro de la A continuación, se inicia la transcripción inversa del ARN positivo genómico viral de una sola cadena para producir un ADN proviral de doble cadena para ser importado en el núcleo e integrado en el cromosoma huésped. La transcripción activa del ADN proviral integrado se produce en presencia de NF-B y Tat viral. El empalme del ARNm viral produce proteínas accesorias tempranas como Tat, Rev y Nef, que ayudan en la transcripción, empalme y modificación de la maquinaria celular, respectivamente. La acumulación de Rev protege el ARNm viral de la empalme, lo que produce ARNm cada vez más largos capaces de codificar proteínas estructurales y envolventes, y finalmente los ARN genómicos virales están listos para ser cautivados [111]. La terapia antirretroviral para el VIH es altamente eficaz en el control de la infección; sin embargo, la erradicación de este virus es actualmente imposible y el Una vacuna es ampliamente considerada como crucial para el control de la epidemia, pero varios esfuerzos avanzados para desarrollar una profilaxis efectiva resultaron infructuosos [120, 121]. Uno de los mayores desafíos en el desarrollo de una vacuna contra el VIH es superar su capacidad de mutar constantemente y escapar de las respuestas inmunitarias anti-VIH [122]. Esta alta tasa de mutación es un resultado directo de la presencia de ARN polimerasa de baja fidelidad del virus, así como los altos niveles de recombinación que sufre y el escudo glucano en constante evolución de las glucoproteínas de envoltorio [123] [124] [125]. A este respecto, tanto los linfocitos citotóxicos como los nAbs han sido reportados durante mucho tiempo para seleccionar variantes de escape inmune durante el curso de la infección por el VIH-1 [126] [127]. Una inmunoterapia pasiva candidata podría consistir, como se sugirió anteriormente para la infección por SARS-CoV, en la administración de un cóctel de mAbs ampliamente neutralizante, que podría minimizar la aparición de mutantes de escape viral [129]. Se han estudiado varias combinaciones de mAbs humanos en los últimos años que han mostrado efectos aditivos, sinérgicos o antagónicos en la neutralización del VIH-1 [130] [133] [133] [134] [135]. El efecto antagonista en la neutralización del VIH-1 se ha reportado previamente con un par de anti-gp120 mAbs dirigidos contra el V3-lazo y el sitio de unión CD4, respectivamente [136]. Los mecanismos moleculares que determinan el antagonismo no han sido estudiados en detalle. El único estudio que describió por primera vez a nivel molecular un posible mecanismo de interferencia también para el VIH se realizó utilizando combinaciones de pares de anti-gp41 mAbs [137]. Más en detalle, los autores observaron un efecto antagonista cuando los anti-gp41 neutralizantes mAbs 2F5 o 50-69 se combinaron con los anti-gp41 mAb 98-6 [137]. En particular mAbs 50-69 y 98-6 reconocen diferentes epítopos gp41 ubicados dentro del grupo I (residuos aminoácidos 579-613) y el grupo II (residuos aminoácidos 644-667), respectivamente. Por otro lado, mAb 2F5 reconocen un epítope diferente de mAb 98-6, dentro de la región externa proximal de membrana gp41 (MPER), en una porción adyacente al grupo II de gp41. Además, hay cierta superposición entre los epítopos del grupo II y el epítopo reconocido por mAb 2F5 [138], explicando la inhibición de la unión de mAb 2F5 por mAb 98-6 [137, 139]. Así, en el caso del antagonismo entre mAbs 2F5 y 98-6 el autor hipoteticó un mecanismo de obstáculo esterico entre los dos mAbs, ya que podían unir péptidos y complejos péptidos que representaban las formas prefusogénicas y fusogénicas de gp41 [140]. En particular, mAb 98-6 tenía una afinidad más alta por los complejos péptidos que representaban la forma fusogénica, que 2F5. Así, la unión de 98-6, que no neutraliza el aislado del VIH-1 89.6 (VIH-1 89.6 ), podría interferir con la unión de 2F5, En contraste, mAbs 50-69 y 2F5 reconocen epítopos distintos en gp41, y muestran reactividad independiente (additiva) contra el VIH-1 89.6 en combinación con la mayoría de los otros anti-gp41 y anti-gp120 mAbs probados [137]. Para concluir, los anti-gp120 y anti-gp41 Abs son inducidos en individuos infectados por VIH-1 pero son predominantemente no neutralizantes, ya que las regiones funcionalmente importantes de proteínas superficiales del VIH están casi completamente ocultas al sistema inmune [139]. Una hipótesis intrigante es que, junto con otros mecanismos de escape del VIH, el efecto de los extremadamente raros anti-gp41 y anti-gp120 nAbs también puede verse obstaculizado por la cantidad abrumadora de no-nabs que interfieren. Hasta la fecha, la existencia de interferencias no-n-Abs se ha evidenciado claramente sólo utilizando anti-gp41 mAbs con diferentes características biológicas, mientras que no se han generado datos utilizando anti-gp120 mAbs. El posible papel de interferencias no-n-Abmediated en facilitar la fuga del VIH en el curso de la infección natural ciertamente merece estudios futuros. Enfoques inmunoprofilácticos o inmunoterapéuticos con mAbs todavía se consideran una posible herramienta de apoyo en el manejo de enfermedades infecciosas. En particular, la disponibilidad de mAbs ampliamente neutralizantes dirigidos contra patógenos virales, cuyos enfoques profilácticos y terapéuticos reales están lejos de ser efectivos, ha llevado a muchos ensayos clínicos en curso. Sin embargo, la evidencia reportada en esta revisión sugiere que los mAbs candidatos para ser posiblemente utilizados en enfoques de inmunización pasiva antiviral, o para ser provocados por futuras estrategias de vacunación, no sólo tienen que ser moléculas altamente neutralizantes [141, 142], sino también moléculas a medida cuya actividad no está influenciada por posibles Abs interferentes producidos en el curso de la infección. Para ello, deben estar dirigidas contra epitopes altamente neutralizantes no sujetos al mecanismo de interferencia, o deben tener una alta afinidad por el antígeno para desplazar la unión de posibles Abs interferentes [51, 68].

¿Qué tipo de gripe causa epidemias y pandemias?

La dinámica evolutiva del león Panthera leo Revelado por Host and Viral Population Genomicshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2572142/SHA: f2af8027b6801850481d09ad0d4c5eb8e31c7d7fAutores: Antunes, Agostinho; Troyer, Jennifer L.; Roelke, Melody E.; Pecon-Slattery, Jill; Packer, Craig; Winterbach, Christiaan; Winterbach, Hanlie; Hemson, Graham; Frank, Laurence; Stander, Philip; Siefert, Ludwig; Driciru, Margaret; Funston, Paul J.; Alexander, Kathy A.; Prager, Katherine C.; Mills En este caso, se utilizó un gran conjunto de datos de 357 leones que comprendían 1,13 megabases de datos secuenciales y genotipos de 22 loci microsatélites para caracterizar su historia evolutiva reciente. Se compararon patrones de variación genética molecular en múltiples marcadores genéticos maternos (mtDNA), paternos (y-cromosoma) y biparentales nucleares (nDNA) con patrones de secuencia y variación subtipo del virus de inmunodeficiencia felina del león (FIV(Ple)), un lentivirus análogo al virus de inmunodeficiencia humana (VIH). A pesar de la capacidad de los leones para dispersar largas distancias, los patrones de diversidad genética del león sugieren una importante subdivisión poblacional (mtDNA Φ(ST) = 0,92; nDNA F (ST) = 0,18), y un flujo genético reducido, lo que, junto con grandes diferencias en la prevalencia de seis subtipos distintos de la FIV (Ple) entre las poblaciones de leones, refutan la hipótesis de que los leones africanos consisten en una sola población panmíctica. Nuestros resultados sugieren que las poblaciones de leones existentes derivan de varias refugias del Pleistoceno en África Oriental y Meridional (hace 324.000–169.000 años), que se expandieron durante el Pleistoceno Tardío (hace 100.000 años) hacia África Central y Septentrional y Asia. Durante la transición del Pleistoceno/Holoceno (de 14.000–7.000 años), se produjo otra expansión En particular, la variación León y FIV (Ple) afirma que la gran población de leones bien estudiada que ocupa el gran ecosistema Serengeti se deriva de tres poblaciones distintas que se mezclaron recientemente. Texto: Los fósiles León trazan el Plioceno Tardío en África Oriental y el Pleistoceno Temprano en África Oriental y Meridional coinciden con el florecimiento de pastizales, hace 2-1,5 millones de años [1, 2]. Por Pleistoceno Medio (500.000 años atrás), los leones ocuparon Europa y por Pleistoceno Tardío (130,000-10000 años atrás) los leones tuvieron la mayor distribución intercontinental para un gran mamífero terrestre (excluido el hombre), que va desde África hasta Eurasia y las Américas [3]. Los leones fueron extirpados de Europa hace 2.000 años y dentro de los últimos 150 años desde Oriente Medio y África del Norte. Hoy en día, hay menos de 50.000 leones de libre alcance [4] que sólo ocurren en el África subsahariana y el Bosque Gir, India (Figura 1A).Comprender los aspectos más amplios de la historia evolutiva del león se ha visto obstaculizado por la falta de muestreo completo y marcadores genéticos adecuadamente informativos [5] [6] [7] [9], que en especies de félidos modernos requieren grandes conjuntos de datos multigénicos debido a su especiación generalmente rápida y muy reciente [10, 11]. Sin embargo, la ecología social única de los leones [12] [13] [14] y el hecho de que los leones hayan experimentado brotes de enfermedades infecciosas bien documentados, como el virus del distemper canino, el parvovirus felino, el calicivirus, el coronavirus y el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV Ple ) [15] [16] [17] [18] proporcionan una buena oportunidad para estudiar la historia De hecho, la genética de la población de patógenos transmitidos puede reflejar con precisión la historia demográfica de sus huéspedes [19, 20]. A diferencia de otras 36 especies de gatos, los leones tienen un sistema social cooperativo (prides de 2-18 hembras adultas y 1-9 machos) y sus poblaciones pueden tener altas frecuencias de FIV Ple, un lentivirus análogo al virus de inmunodeficiencia humana (VIH), que causa una enfermedad de inmunodeficiencia similar al SIDA en los gatos domésticos. FIV Ple es un retrovirus que se integra en el genoma del huésped y se transmite por contacto celular-celular, que en los felides se produce durante el apareamiento, la lucha y las interacciones madre-hierba. Así, la diseminación viral es una función en parte de la frecuencia de contacto entre leones infectados y naïve dentro y entre las poblaciones. El virus es genéticamente diverso en leones [15, 18] Para desentrañar la historia demográfica de la población de leones se utilizó un gran conjunto de datos multigénicos.Distintos conjuntos de marcadores pueden no necesariamenteEl león Panthera leo, un formidable carnívoro con un complejo sistema social cooperativo, ha fascinado a la humanidad desde tiempos prehistóricos, inspirando cientos de alusiones religiosas y culturales. Aquí, utilizamos una muestra completa de 357 individuos de la mayoría de las principales poblaciones de leones en África y Asia. Ensayamos adecuadamente información autosómica, cromosoma Y y marcadores genéticos mitocondriales, y evaluamos la prevalencia y variación genética del virus de la inmunodeficiencia felina específica del león (FIV Ple ), un lentivirus análogo al virus de inmunodeficiencia humana (VIH) que causa la enfermedad de inmunodeficiencia similar al SIDA en gatos domésticos. Comparamos los grandes conjuntos de datos multigénicos de leones con patrones de variación genética Rechazamos la hipótesis de que los leones africanos consisten en una sola población panmíctica, destacando la importancia de preservar a las poblaciones en declive en lugar de priorizar esfuerzos de conservación a mayor escala. Curiosamente, la variación León y FIV Ple reveló evidencia de una insospechada diversidad genética incluso en la bien estudiada población de leones del ecosistema Serengeti, que consiste en animales recientemente mezclados derivados de tres diferentes grupos genéticos. Un código de tres letras que señala un círculo punteado en blanco representa la ubicación geográfica de las 11 poblaciones de leones determinadas por los análisis bayesianos [22] y los análisis de correspondencia factorial [23] de las características genéticas de 357 muestras de leones (véase el texto): GIR, Gir Forest, India; UGA, Uganda (Parque Nacional Queen Elizabeth); KEN, Kenya (Laikipia), SER, Serengeti National Park, Tanzania; NGC, Ngorongoro Crater, Tanzania; KRU, Kruger National Park, Sudáfrica; BOT-I, Botswana meridional y Kalahari, Sudáfrica; BOT-II, Botswana septentrional; y NAM, Namibia. Las plazas verdes representan muestras individuales cautivas para explorar la relación de leones de zonas más aisladas/en peligro de extinción/depleta: ATL, Morocco Atlas leones (n = 4 Las expansiones históricas deducidas (M1 y M2) están representadas por flechas rojas (ver texto). (B) Frecuencias de haplotipo observadas en las 11 poblaciones de león para genes nDNA (ADA y TF) y mtDNA (12S-16S), paralelas con las frecuencias de prevalencia sérica FIV Ple (negro-sero-positivo; gris-indeterminado; blanco-sero-negativo).Los tamaños de las muestras de población se indican entre paréntesis. (C) Redes de parsimonia estadística de haplotipos de león ADA, TF y 12S-16S. El tamaño del círculo es proporcional a la frecuencia de haplotipo y las barras transversales representan el número de mutaciones de pasos que conectan haplotipos. Los haplotipos de mtDNA H5 y H6 son grises sombreados ya que fueron detectados sólo en las muestras individuales de ANG, ATL y ZBW, que no se agrupan en grupos de población únicos (ver texto). doi:10.1371/journal.pgen.1000251.g001 producen inferencias similares de la historia de la población, ya que los tiempos carbonescentes varían en función de su patrón de herencia [21]. También hay una gran variación en los tiempos carbonescentes a través de loci que comparten un patrón común de herencia, especialmente en historias demográficas complejas (Tabla 1). Sin embargo, la interpretación precisa de las diferencias entre los loci puede proporcionar una historia de población más resuelta y coherente, proporcionando perspectivas más nutridas sobre procesos demográficos pasados, niveles de mezcla, cuestiones taxonómicas, y sobre los pasos más apropiados para la conservación El objetivo de este estudio fue evaluar la historia evolutiva del león mediante (1) caracterizar la estructura de la población del león en relación con los patrones de variación genética FIV Ple, (2) detectar firmas de migración utilizando genómica tanto de la población huésped como viral, y (3) reconstruir la historia demográfica del león y discutir sus implicaciones para la conservación del león. Evaluamos la variación genética de 357 leones de la mayor parte de su distribución actual, incluyendo secuencias mitocondriales (mtDNA; 12S-16S, 1.882 bp), nucleares (nDNA) cromosoma Y (SRY, 1.322 bp) y autosómicas (ADA, 427 bp; TF, 169 bp) y 22 marcadores microsatélites. Los análisis genéticos de 357 leones de toda la gama de especies existentes mostraron que la variación de la secuencia de nDNA (SRY) hereditaria paternal y materna hereditaria (mtDNA) fue generalmente baja (sólo un haplotipo de SRY paterno y 12 haplotipos de 12 mtDNA; p = 0,0066) (Figura 1 ; Figura S1 ; Tablas S1 y S2). Las secuencias de mtDNA haplotipo H11 más comunes fueron ubicuas en Uganda/Tanzanía y partes de Botswana/Sudáfrica, H1 fue común en el sur de África, y H7 y H8 fueron únicas en los leones asiáticos. Las secuencias de nDNA autosómica mostraron patrones de variación bastante distintos (Figura 1 ; Figura S1 ). De los cinco haplotipos de ADA, A2 fue la más común Los otros cuatro haplotipos, derivados y mucho menos comunes, incluían uno (A5) fijado en leones asiáticos. Los tres haplotipos de la TF estaban distribuidos de manera más amplia y uniforme. Los niveles de subdivisión de población entre leones se evaluaron utilizando datos de microsatélite y secuenciación. Se identificaron 11 grupos utilizando análisis bayesianos [22] y análisis de correspondencia factorial tridimensional [23] (Figura 2 ; Tabla S3 ). La mayoría de los grupos representaban poblaciones geográficamente circunscritas: Namibia (NAM), Parque Nacional Kruger (KRU), Cráter Ngorongoro (NGC), Kenya (KEN), Uganda (UGA) y Gir (GIR). Se encontraron dos grupos distintos en Botswana, BOT-I que incluían leones del sur de Botswana y Kalahari (Sudáfrica) (F k = 0,24) y BOT-II Sorprendentemente, se encontraron tres grupos distintos en una sola localidad geográfica (aproximadamente 60640 km cuadrados) en la gran población panmítica del Parque Nacional del Serengeti (SER-I/SER-II/SER-III) (F k = 0,18, 0,21 y 0,15, respectivamente). Dos leones cautivos de Angola (ANG), uno de Zimbabwe (ZBW) y cuatro leones del Zoo Atlas de Marruecos (ATL; actualmente extintos de la naturaleza) (Figura 1A) fueron incluidos en los análisis para explorar la relación de los leones de zonas más aisladas, amenazadas o agotadas. Los leones ANG y ZBW fueron asignados a BOT-II (q = 0,90 y 0,87; 90%CI: 0,47-1,00) y KRU (q = 0,85; 90%CI: 0,52-1,00) (análisis bayesianos [22] Sin embargo, estos leones difirieron de BOT-II y KRU por mutaciones de hasta 8 mtDNA, compartiendo haplotipos con los leones ATL (H5 en ANG y H6 en ZBW) (Figura 1B y 1C). Los leones ATL no se agruparon en un cúmulo único. Tanto el nDNA como el mtDNA distancias genéticas en pares entre las 11 poblaciones de leones mostraron una relación significativa con la distancia geográfica (R 2 = 0,75; prueba de Mantel, P = 0,0097; y R 2 = 0,15; prueba de Mantel, P = 0,0369; respectivamente) (Figura 3 ). La correlación positiva y monotónica significativa entre todas las comparaciones de par de plotes dispersos para los marcadores de nDNA (biparental) fue consistente con el aislamiento-distancia Sin embargo, la correlación entre el nDNA F ST y la distancia geográfica disminuyó considerablemente cuando se eliminó la población asiática GIR (R 2 = 0,19; prueba de Mantel, P = 0,0065) sugiriendo que se debe tener precaución en la interpretación del patrón de aislamiento por distancia en leones. Se comparó además las estimaciones linealizadas de F ST [24] trazadas tanto en relación con la distancia geográfica (modelo asumiendo que el hábitat debe estar alineado en una celosía unidimensional infinita) y la distancia geográfica logarítmica (modelo asumiendo una celosía bidimensional infinita). La amplia distribución de leones podría sugerir a priori que un modelo de aislamiento por distancia bidimensional proporcionaría el mejor ajuste para los datos del nDNA (R 2 = 0,25; prueba de Mantel, P = 0,0022), pero en cambio el modelo de aislamiento por distancia unidimensional se realizó mejor (R 2 El patrón observado para el ADNmt (maternal) fue más complejo, si bien hubo una relación significativa entre el ADNmt F ST y la distancia geográfica, hubo un patrón inconsistente a través de distancias geográficas más amplias (Figura 3 ). Esto se debe en parte a la fijación o fijación cercana del haplotipo H11 en seis poblaciones y a la fijación de un haplotipo H4 muy divergente en la población KEN (Figura 1B y 1C). La eliminación de la población KEN aumentó considerablemente la correlación entre el ADNmt F ST y la distancia geográfica (R 2 = 0,27; test de Mantel, P = 0,0035). Así, se rechaza la hipótesis nula de equilibrio regional para el ADNmt en toda la región muestreada, a pesar de la posibilidad de que el aislamiento por distancia pueda ocurrir regionalmente. Estos resultados contrastantes de ADNn y ADNn mt pueden ser indicativos de diferencias en los patrones de dispersión entre machos y hembras, lo que sería consistente con evidencia de que las hembras son más filopátricas que los machos. Alternativamente, se ha sugerido un proceso similar en ballenas (p = 0,0007) [25] y elefantes de sabana africana (p = 0,0200) [26], donde ambas especies tienen filopatía femenina y como leones, una estructura social matriarcal. Sin embargo, la deriva genética tiende a la selección sobrecogedora en poblaciones pequeñas aisladas, afectando predominantemente a elementos haploides debido a su menor tamaño poblacional efectivo (Tabla 1). Por lo tanto, sugerimos que los resultados contrastantes obtenidos para el nDNA y el mtDNA son más probables evidencia adicional de que las poblaciones de león sufrieron estrangulamientos severos. Las matrilinas de león altamente estructuradas comprenden cuatro grupos haplo-mtDNA monofiléticos (Figura 4A; Figura S3 ). El linaje I consistió en un haplotipo H4 divergente de KEN, linaje II se observó en la mayoría de las poblaciones de África meridional, linaje III fue ampliamente distribuido desde África central y septentrional a Asia, y linaje IV ocurrió en África meridional y oriental. Los estudios de seroprevalencia indican que la FIV Ple es endémica en ocho de las 11 poblaciones, pero ausente de los leones GIR asiáticos en la India y en Namibia y en las regiones meridionales de Botswana/Kalahari (NAM/ BOT-I) en África sudoccidental (Fi El análisis filogenético de la región de pol-RT conservada en 117 leones infectados por FIV representa linajes monofiléticos [15, 18] que afirman seis subtipos distintos (A-F) que se distribuyen geográficamente en tres patrones distintos (Figura 4B; Figura S4 ). En primer lugar, los subtipos múltiples pueden circular dentro de la misma población como ejemplificados por los subtipos A, B y C todos ubicuos dentro de las tres poblaciones de león del Serengeti (SER-I, SER-II y SER-III) y los subtipos A y E dentro de los leones de Botswana (BOT-II) (Figuras 4B y 4C y Figura S4 ). En segundo lugar, los subtipos únicos FIV Ple pueden restringirse a un lugar como subtipo F en Kenya, subtipo E en Botswana (BOT-II), subtipo C en Serengeti y subtipo D en Krugar Park (figuras 4B y 4C y figura S4). En tercer lugar, las cepas intrasubtipo se agrupan geográficamente, como lo muestran distintos clados dentro del subtipo A que se restringieron a leones dentro de Krugar Park, Botswana y Serengeti y dentro del subtipo B que correspondían a Uganda, Serengeti y Ngorongoro Crater (figuras 4B y 4C y figura S4). No inesperadamente, las distancias genéticas FIV Ple, representadas como población F ST entre las ocho poblaciones infectadas por FIV de león, no se correlacionaron significativamente con la distancia geográfica (R 2 = 0,08; test de Mantel, P = 0,165) (Figura 3 ), y afirma que los patrones de diseminación viral no se ajustan a un modelo estricto de aislamiento por distancia. Más bien, los dos cúmulos distintos observados (Figura 3 ) reflejan la distribución compleja de FIV Ple entre los leones africanos. De hecho, a pesar de la baja distancia geográfica entre las poblaciones de leones de África Oriental, la divergencia genética FIV Ple mostró un rango más amplio en F ST (0,03 a 0,79 para la mayor parte del primer racimo; Figura 3 ). Por el contrario, aproximadamente la mitad del rango en F ST (0,26 a 0,69 para el segundo grupo; Figura 3 ) se En contraste con los patrones observados en los leones, las estimaciones linealizadas de F ST [24] para FIV Ple se correlacionaron mejor con la distancia geográfica logarítmica (modelo de celosía bidimensional) (R 2 = 0.15) que con la distancia geográfica (modelo unidimensional) (R 2 = 0.02), aunque en ambos casos la prueba del Mantel no fue significativa (P.0.2474) (Figura S2). La datación de la carbonescencia de mtDNA sugirió que el linaje de África Oriental I (haplotipo KEN H4) tenía un origen antiguo de 324.000 años (IC 95%: 145.000-502.000). Además, la diversidad del subtipo FIV Ple fue mayor en los clados de África Oriental (exhibiendo cuatro de las seis cepas virales conocidas), incluyendo el subtipo C más divergente de FIV Ple (Figuras 4B y 4C). Estos datos genéticos de leones y FIV Ple concuerdan con el origen más antiguo de los leones existentes de África Oriental, que es apoyado además por los fósiles de león más antiguos descubiertos en África Oriental [1]. El linaje II, encontrado en NAM, BOT-II y KRU tiene una coalescencia estimada de 169.000 años (IC 95%: 34.000-304.000) y el linaje IV más extendido encontrado en las poblaciones meridionales de BOT-I, BOT-II y KRU, así como las poblaciones orientales de SER (I, II y III), NGC y UGA, coalesces hace 101.000 años (IC 95%: 11.000-191.000). Sin embargo, los niveles similares de diversidad genética nDNA, la ocurrencia de un linaje exclusivamente sureño de mtDNA II y subtipos FIV Ple altamente divergentes, subtipo FIV Ple encontrado sólo en KRU y subtipo E exclusivo de BOT-II, sugieren que tanto África Oriental como África Meridional fueron importantes para los leones durante el Pleistoceno. Por lo tanto, la co-ocurrencia de haplotipos de ADNmt divergentes (6 a 10 mutaciones; Figuras 1B y 1C) en poblaciones del sur puede ser la consecuencia de un mayor aislamiento dentro de la refugia durante períodos climáticos más fríos. La fragmentación contemporánea de las poblaciones de leones podría explicar aún más los resultados del análisis filogeográfico de las capas anidadas (NCPA [27] ) (Figura S5 ), que indujo un flujo genético restringido con aislamiento por distancia entre los haplotipos H9 (BOT-II) y H10 (KRU) (x 2 = 10.00, P = 0.0200), entre los haplotipos H1 (BOT-II/NAM) y H2 (KRU) (x 2 = 71,00, P#0,0001), y entre los haplotipos H9-H10 (BOT-II/KRU) y los haplotipos H11-H12 (BOT-I/KRU/NGC/UGA) (x 2 = 187,83, P#0,0001). Esto lo sugieren el característico haplotipo H4 del ADNmt y el único subtipo FIV Ple que se encuentra en la población de Kenia, que puede haber resultado de la reducción del flujo genético a través del valle del Rift, un escenario que se ha sugerido para varias poblaciones bóvidas y carnívoras (véase [28] y referencias en él). El mejor ejemplo de concordancia entre los marcadores del genoma del huésped y los patrones de transmisión viral se observa en el Parque Nacional del Serengeti en Tanzania. Nuestros hallazgos anteriores describieron niveles notablemente altos de subtipos A, B y C del FIV Ple que circulan dentro de la población de león del Serengeti hasta tal punto que el 43% de los leones muestreados fueron infectados por dos o tres subtipos [15, 18] y fueron hipotetizados para representar una mezcla reciente de tres poblaciones anteriormente separadas. Además, aunque los leones dentro del Serengeti pueden ser asignados a una de las tres poblaciones (SER-I, SER-II o SER-III) por marcadores genómicos del huésped, los subtipos FIV Ple se distribuyen ubicuamente en los tres, característicos de la rápida transmisión retroviral horizontal posterior a la mezcla de población huésped. El posible mecanismo de aislamiento queda por dilucidar, ya que no hay barrera aparente al flujo genético en este ecosistema. Basado en patrones de diversidad genética y análisis filogenético de marcadores de león nDNA/mtDNA y FIV Ple, proponemos un escenario de un período de refugia/aislamiento en el Pleistoceno Tardío seguido de dos grandes expansiones del león en África y Asia. La primera expansión, apoyada por el mtDNA NCPA [27] (x 2 = 690,00, P#0,0001; Figura S5 ), fue una colonización a larga distancia del linaje mtDNA-III (GIR/ATL/ANG/ZBW) hace unos 118.000 años (IC 95%: 28.000-208.000), con la posterior fragmentación de los haplotipos H5-H6 en África Central y Norte y los haplotipos H7-H8 en Asia Occidental (M1-Figura 1A). El apoyo para esta expansión inicial también se encuentra en el nDNA. El haplotipo ADA A5 fijado en el GIR también presente en KEN, SER-II y SER-III, sugiriendo que los leones probablemente colonizaron Asia Occidental desde la refugia de África Oriental (Figura 1B). Tal expansión podría haber sido favorecida por el inicio de un período más cálido y menos árido en África hace 130.000-70.000 años [29]. Este "evento fuera de África" habría ocurrido mucho más tarde que la expansión inicial del león a través de Eurasia basada en fósiles (,500.000 años atrás) [3]. Es probable que se produjeran múltiples expansiones del león en el Pleistoceno, como ocurrió con los humanos [21]. Una segunda expansión más reciente del león probablemente ocurrió en la transición del Pleistoceno/Holoceno, ésta desde el sur de África hacia África oriental (M2-Figura 1A, Figura 3 ). Esto se refleja en el linaje del ADNmt IV, donde los haplotipos presentes en los leones del sur son basales (más antiguos) a los encontrados en el este. En general, la diversidad de los nucleótidos de la población de mtDNA disminuye de África meridional a África oriental (Figuras 1B y 1C), un hallazgo apoyado por el análisis de desajuste entre pares [30] (ragitud, r = 0,086; P,0.001). La fijación del haplotipo de mtDNA H11 en las poblaciones de BOT-I (de otro modo fijado sólo en las poblaciones de África oriental) sugiere que los leones colonizadores se expandieron hacia el norte desde el desierto de Kalahari, que incluyó hábitats de arbustos, bosques y sabanas durante las fluctuaciones climáticas del Pleistoceno [31]. Esta expansión también se apoya en el subtipo A de la FIV Ple, donde los haplotipos presentes en los leones del sur (KRU y BOT-I) son basales a los encontrados en el este (SER-I, SER-II y SER-III) y se observa una disminución de la diversidad nucleótida de este subtipo de la FIV Ple desde el sur (p = 0.15) hasta el este de África (p = 0.03) (Figura 3B ). Curiosamente, se ha sugerido un proceso de colonización similar hacia el norte desde el sur de África para algunas de las presas del león, a saber, el impala, el mayor kudu y el ñúñeco [32, 33]. Si hubiéramos limitado nuestras inferencias al ADNmt, podríamos haber llegado a la conclusión de que las poblaciones de leones de África oriental, que están fijas o casi fijadas para el haplotipo H11, se extinguieron durante la transición del Pleistoceno/Holoceno (similar a las bien conocidas extinciones de megafauna del Pleistoceno tardío [34] ) y luego fueron colonizadas por poblaciones del Sur. Sin embargo, nuestros datos de genómica poblacional se ajustan mejor a un escenario de expansión de la población del león y de entrecruzamiento en lugar de un simple reemplazo. En segundo lugar, los leones SER llevan dos diversos subtipos FIV Ple encontrados solamente en África Oriental (B-C), y no sólo el subtipo A de FIV Ple, que presumiblemente fue introducido en África Oriental coincidiendo con el evento de expansión de mtDNA hacia el norte desde el sur. En tercer lugar, el subtipo B de FIV Ple de África Oriental encontrado en UGA/SER-I/SER-II/SER-III/NGC mostró evidencia de una expansión poblacional (ragitud, r = 0,004; P,0.01; F s = 220.37; P,0,00001) y la mayor diversidad de nucleótidos observada dentro de los subtipos FIV Ple (p = 0.09). Cuatro, la diversidad de subtipo FIV Ple es mayor en los clados de África Oriental (cuatro de las seis cepas virales). La utilidad de la FIV Ple pol-RT como marcador de la estructura de la población del león y la historia natural es que puede ser informativa en una escala de tiempo contemporánea, aunque puede ser menos útil para capturar eventos demográficos más antiguos. La extrema divergencia entre los subtipos FIV Ple, considerados con alta prevalencia en ocho de las 11 poblaciones del león, y combinados con patrones de concordancia geográfica, apoyan la hipótesis de que la FIV Ple no es una aparición reciente dentro de los leones modernos [35]. Poblaciones que albergan un subtipo privado FIV Ple como KEN (subtipo F), BOT-II (subtipo E) y KRU (subtipo D) deben haber estado suficientemente aisladas por tiempo suficiente para que el virus evolucione a subtipos únicos, un resultado corroborado por la alta estructura genética nDNA y mtDNA presente en estas poblaciones del león (Figura 4 ). Así, es posible que la aparición inicial de la FIV Ple sea anterior a las expansiones del Pleistoceno tardío de las poblaciones de león contemporáneo [36], pero las distribuciones actuales son indicadores más útiles de la dinámica de la población huésped muy reciente, resultado también observado con la FIV Pco en una población panmíctica de pumas en el oeste de América del Norte [19]. La interpretación precisa de los escenarios demográficos pasados y contemporáneos es un objetivo principal para la conservación efectiva de las especies en peligro de extinción.En este estudio, encontramos importantes subdivisiones poblacionales, flujo genético reducido y grandes diferencias en la secuencia y seroprevalencia de la FIV Ple entre las poblaciones de león, así como evidencia de contacto secundario histórico entre las poblaciones (Figura 3C ; Tabla S4 a S9). El nivel muy bajo de población de la diversidad de nucleótidos del ADNmt, el número de haplotipos privados a una sola población (Figura 1) y probablemente también la falta de variación genética del SRY en todos los leones machos (haplotipo S1, n = 183) sugieren que el número de leones disminuyó considerablemente después del Pleistoceno tardío. La reducción del siglo pasado en la distribución del león erosionó aún más su diversidad genómica, y la variación microsatélite sugirió estrangulamientos recientes de población en siete de las 11 poblaciones (prueba de diferencias estandarizadas, P,0,05; Tabla S5 ) [37]. Aunque no tratamos explícitamente de abordar la adecuación de las designaciones de subespecies de león (actualmente sólo una subespecie africana es ampliamente reconocida) [38, 39], proporcionamos pruebas contundentes de que no hay evidencia de un intercambio genético sustancial de matrilinas entre las poblaciones existentes, ya que el componente AMOVA [40] dentro de la población era uniformemente alto en todos los escenarios de subdivisión distintos (W ST <0,920; P,0,0001; tres grupos de seis; Tabla S6 ). Del mismo modo, se detectó una estructura poblacional significativa a partir del nDNA (F ST = 0,18), con bajos niveles de mezcla evidentes a partir del análisis bayesiano [22] (a = 0,033). Por lo tanto, utilizando una perspectiva ascendente que prioriza a las poblaciones, en lugar de unidades de gran escala (por ejemplo, todos los leones africanos), podría preservar y mantener la Se obtuvo un total de 357 individuos en la mayor parte de la gama de leones en África y Asia (Figura 1A ; Tabla S1 ). La variación genética entre los especímenes de leones se evaluó utilizando genes maternos (12S y 16S), paternos (gen SRY) y autosómicos biparentales (22 loci microsatelita, y los genes ADA y TF) marcadores (Números de adhesión de GenBank: FJ151632-FJ151652). Los análisis de mtDNA en especies Panthera se complican por la presencia de una integración de 12.5 kb mtDNA en cromosoma F2 [42]. En consecuencia, los imprimadores específicos de mtDNA fueron diseñados para los genes 12S y 16S (Tabla S2 ) y utilizamos amplificación de PCR de largo alcance. Se diseñaron imprimaciones para amplificar segmentos del ADA (exon 10 e intron 10) y los genes del TF (intrón 3) (tabla S2), dos de los loci de proteína más variables en poblaciones de león [5], localizados en el gato doméstico Felis catus cromosoma A3p y C2q, respectivamente. El gen del cromosoma Y SRY-39UTR también fue amplificado [43]. Los productos PCR fueron amplificados a partir de 50 ng de ADN genómico en un sistema de reacción de 25 mL que contenía 1,5 mM MgCl 2, 1,0 mM dNTPs, 0,25 unidades de AmpliTaq Gold DNA polimerasa (Aplicado Biosistemas), y 16 PCR buffer II; el protocolo de amplificación fue: desnaturalización 10 min a 95uC, un ciclo de touch-down de 95uC para 30 s, 52uC para 60 s disminuyó 1uC en el siguiente ciclo durante 10 ciclos, 72uC para 120 s, luego 35 ciclos de amplificación de 95uC para 30 s, 52uC para 60 s, y 72uC para 120 s, seguido de una extensión de 10 min a 72uC. Los productos PCR fueron secuenciados en un ABI 377. Las secuencias fueron alineadas Veintidós loci de microsatélites polimórficos (20 repeticiones de dinucleótidos: FCA006, FCA008, FCA014, FCA069, FCA077, FCA085, FCA091, FCA098, FCA105, FCA126, FCA129, FCA139, FCA205, FCA208, FCA211, FCA224, FCA229, FCA230, FCA247 y FCA281; y dos repeticiones de tetranucleótidos: FCA391 y FCA441) fueron amplificadas [44]. Los microsatélites fueron puntuados en un ABI 377 y analizados utilizando GENESCAN 2.1 y GENOTYPER 2.5. Estos loci se encuentran en 11 de los cromosomas de 19 F. catus, que se producen en diferentes grupos de El sobrenadante de células infectadas por virus fue centrifugado a 200 g durante 10 min a 5uC. El sobrenadante resultante fue centrifugado a 150.000 g a 4uC durante 2 horas. Las proteínas virales peladas fueron resucitadas en 1/20 o del volumen original y el contenido total de proteínas fue evaluado utilizando el Ensayo de Proteínas de Biorad. Veinte mg de proteína viral se ejecutaron en geles Tris-Glycine 4-20% y se transfirieron a membranas PDVF (BioRad). Las tiras de membrana fueron expuestas 2-12 h a una dilución de suero o plasma de 1:25 ó 1:200. Después del lavado, las muestras fueron etiquetadas con HRP anti-cat de cabra o anticuerpo conjugado de fosfato (laboratorios KPL) en una dilución 1:2000, lavadas e incubadas en reactivos de detección de ECL Western Blotting (Amersham Biosciences) durante 2 minutos, luego expuestas a la película de detección quimioluminiscente Lumi-Film (Boehringer Mannheim) o incubadas en sustrato de fosfatasa BCIP/NBP (laboratorios KPL) durante 15 minutos [46] [47] [48]. Los resultados fueron visualizados y anotados manualmente en base a la presencia e intensidad de anticuerpos que se unen a la proteína capsid de gag p24. Se realizó amplificación PCR Nested de FIV Ple parcial pol-RT [18, 46]. Brevemente, las reacciones PCR de primera vuelta utilizaron 100 ng de ADN genómico, 2,5 mMgCl 2 y una temperatura de recocido de 52uC. Las reacciones PCR de segunda vuelta utilizaron condiciones idénticas con 1-5 ml de producto de primera vuelta como plantilla. Todos los productos PCR fueron secuenciados como se describe anteriormente para los análisis genéticos del león (números de adhesión GenBank: AY549217-AY552683; AY878208-AY878235; FJ225347-FJ225382). Utilizamos el GENETIX 4.02 [49], GENEPOP 3.3 [50], MICROSAT [51], y DNASP 4.10 [52] para calcular las siguientes estadísticas descriptivas: i) porcentaje de loci polimórfico (P 95 ), número de alelos por locus (A), heterocigosidad observada y esperada (H E y H O ), y número de alelos únicos (A U ); ii) evaluación de desviaciones de HWE; iii) estimación del coeficiente de diferenciación (F ST ), y iv) diversidad de nucleótidos (p) y haplotipo (h). Probamos la hipótesis de que todos los loci están evolucionando bajo neutralidad tanto para el león como para los datos FIV Ple. Para los datos de frecuencia, se utilizó el método descrito por Beaumont y Nichols [53] e implementado en FDIST (http://www.rubic.rdg.ac.uk/mab/software.html). Los valores de F ST estimados a partir de loci microsatélites trazados contra la heterocigosidad mostraron que todos los valores caen dentro del límite de confianza esperado del 95% y, por consiguiente, no se identificó ningún locus atípico.Para los datos de secuencia (lion nDNA/ mtDNA y FIV Ple pol-RT), descartamos cualquier evidencia significativa para el autostop genético y la selección de antecedentes mediante la evaluación de las pruebas D* y F* de Fu y Li [54] y las estadísticas F S de Fu [55]. Se utilizó un método de agrupamiento bayesiano implementado en el programa ESTRUCTURA [22] para inferir el número de poblaciones y asignar leones individuales a poblaciones basadas en el genotipo multilocus (microsatélites) y datos secuenciales ( genes ADA, TF y mtDNA) y sin incorporar el origen de la muestra. Para los datos haploid mtDNA, cada haplotipo observado fue codificado con un número entero único (por ejemplo, 100, 110) para el primer alelo y los datos faltantes para el segundo (ESTRUCTURA [22] análisis con o sin los datos mtDNA fueron esencialmente idénticos). Para los grupos de población K, el programa estima la probabilidad de los datos, Pr(XK), y la probabilidad de membresía individual en cada grupo utilizando un método Markov chain Monte Carlo bajo el supuesto de equilibrio Hardy- Las pruebas iniciales de la HWE en cada una de las poblaciones definidas por el origen geográfico del muestreo no revelaron ninguna desviación significativa de las expectativas de HW con la excepción de la población SER y BOT (más tarde subdividida por ESTRUCTURA [22] en 3 y 2 grupos, respectivamente; tales desviaciones de las expectativas de HW fueron interpretadas como evidencia de una mayor estructuración poblacional). Realizamos seis carreras independientes con K = 1-20 para guiar una estimación empírica del número de poblaciones identificables, asumiendo un modelo de mezcla con frecuencias de alelos correlacionadas y con valores de quemadura y replicación establecidos en 30.000 y 10 6, respectivamente. ESTRUCTURA también estima frecuencias de alelos de una población ancestral hipotética y un valor alfa que mide individuos mezclados en el conjunto de datos. La asignación de individuos mezclados a poblaciones utilizando ESTRUCTURA [22] ha sido considerada en análisis posteriores Para cada grupo de población k, el programa estima F k, una cantidad análoga a la F ST de Wright, pero que describe el grado de diferenciación genética de la población k de la población ancestral. Patrones de flujo genético y divergencia entre las poblaciones fueron descritos utilizando una variedad de pruebas. Primero, para visualizar relaciones sutiles entre los genotipos autosómicos individuales, análisis de correspondencia factorial tridimensional [23] (FCA) se realizaron en GENETIX [49], que proyecta gráficamente a los individuos en el espacio factorial definido por la similitud de sus estados alélicos. Segundo, análisis de unión vecina (NJ) implementando la distancia genética de acordes de Cavalli-Sforza & Edwards [56] (D CE ) fueron estimados en PHYLIP 3.6 [57], y el soporte de topología de árboles fue evaluado por 100 bootstraps. En tercer lugar, se comparó la diferencia en la media de H O y A entre los grupos de población mediante una prueba bilateral en FSTAT 2.9.3.2 [58], que permite evaluar la significación de la estadística OS x utilizando 1.000 aleatorizaciones. En cuarto lugar, se probó el equilibrio entre deriva y flujo genético utilizando una regresión de la F ST binaria en la matriz de distancia geográfica entre todas las poblaciones para datos nDNA(microsatélites)/mtDNA y FIV Ple. Se utilizó una prueba de Mantel [59] para estimar la probabilidad superior del 95% para cada correlación de matriz. Suponiendo que un modelo gradual de migración donde el flujo genético es más probable entre las poblaciones adyacentes, se puede rechazar la hipótesis nula de que las poblaciones de una región están en equilibrio si (1) hay una asociación no significativa entre distancias genéticas y geográficas, y/o (2) un diagrama de dispersión de las distancias También evaluamos el F ST linealizado [es decir, F ST /(12F ST )] [24] entre las poblaciones. Probamos dos modelos competidores de aislamiento por distancia, uno asumiendo que el hábitat debe ser arraigado en una celosía unidimensional infinita y otro asumiendo una celosía bidimensional infinita. Ambos modelos mostraron que la diferenciación genética aumentó con distancias euclidianas crudas y logtransformadas, respectivamente [24]. Determinamos el valor del intervalo de confianza de la pendiente de la regresión para los datos nDNA utilizando un boottrap ABC no paramétrico [61] en GENEPOP 4.0 [62]. La historia demográfica de las poblaciones se comparó utilizando una variedad de estimadores basados en la teoría de la carbonescencia. Primero, se investigaron firmas de la antigua expansión demográfica de la población para mtDNA y FIV Ple pol-RT haplotipos utilizando La bondad de ajuste de los datos observados a un modelo simulado de expansión se probó con el índice de ragidez (r) [64]. En segundo lugar, se evaluó la aparición de cuellos de botella recientes para datos microsatélites utilizando el método de Cornuet & Luikart [37] en BOTTELENECK [65] y utilizando 10.000 iteración. Este enfoque, que aprovecha el hecho de que los alelos raros generalmente se pierden primero por deriva genética después de la reducción del tamaño de la población, emplea la prueba de diferencias de estandarización, que es la más apropiada y potente cuando se utilizan 20 o más loci polimórficos [37]. Se realizaron pruebas utilizando el modelo de mutación gradual (SMM), que es un modelo de mutación conservador para la detección de firmas de cuello de botella con microsatélites [66]. En tercer lugar, para discriminar entre el flujo génico recurrente y los eventos históricos se utilizó el análisis filogeográfico de clase anidada [27, 67] (NCPA) para los datos del ADNmt. Cuando se rechaza la nullhypothesis de ninguna correlación entre genealogía y geografía, se extraen inferencias biológicas utilizando criterios a priori. La NCPA comenzó con la estimación de una red de parsimonía estadística del 95% [68] mtDNA en TCS 1,20 [69]. Las ambigüedades de los árboles se resolvieron aún más utilizando un criterio de coalescencia [70]. La red se convirtió en una serie de ramas anidadas (clades) [71, 72], que luego se probaron en su ubicación geográfica mediante un análisis de contingencia permutacional en GEODIS 2.2 [73]. Las inferencias obtenidas también fueron corroboradas con la Para abordar posibles debilidades en algunos aspectos del análisis de la NCPA [75, 76], se validó además las inferencias de la NCPA con métodos independientes para detectar el flujo genético restringido/aislamiento por distancia (utilizando la correlación matricial del ST del par y la distancia geográfica) y la expansión de la población (utilizando las distribuciones de desajustes entre pares). Cuatro, para probar la significación de la varianza genética total del ADNmt, se realizaron análisis jerárquicos de la varianza molecular [40] (AMOVA) utilizando ARLEQUIN 2.0 [77]. La variación genética total se dividió para comparar la cantidad de diferencias entre los grupos de población, entre las poblaciones dentro de cada grupo y dentro de las poblaciones. Las relaciones filogenéticas entre las secuencias de mtDNA y FIV Ple pol-RT se evaluaron utilizando enfoques de evolución mínima (ME), par El análisis ME para mtDNA consistió en árboles NJ construidos a partir de distancias de dos parámetros de Kimura seguidas de un procedimiento de intercambio de ramas y para los datos FIV Ple utilizaron las mismas estimaciones de parámetros que se utilizaron en el análisis ML. El análisis MP se llevó a cabo mediante una búsqueda heurística, con agregados aleatorios de intercambio de ramas de taxones y bisección de árboles. El análisis ML se realizó después de seleccionar el mejor modelo evolutivo que se ajustaba a los datos utilizando MODELTEST 3.7 [79]. La fiabilidad de las topologías de árboles fue evaluada por 100 bootstraps. Para los datos FIV Ple, la confiabilidad de la topología de árboles fue evaluada posteriormente mediante análisis adicionales utilizando 520 bp de secuencias FIV Ple pol-RT en un subconjunto representativo de individuos. El tiempo hasta el ancestro común más reciente (TMRCA [80], donde calculamos la relación de las diferencias medias de nucleótidos dentro de la muestra de león a la mitad de la diferencia media de nucleótidos entre leopardos (P. pardus) y leones y multiplicamos la relación por una estimación del tiempo de divergencia entre leones y leopardos (2 millones de años basado en fósiles de león indiscutibles en África) [81, 82]. El mtDNA TMRCA fue estimado con un método de árbol linealizado en LINTREE [83] y utilizando la ecuación H = 2mT, donde H era la altura de la rama (correlacionada con la distancia media paritaria entre los haplotipos), m la tasa de sustitución, y T el tiempo de divergencia. Se utilizaron secuencias de leopardo y leopardo de nieve (P. uncia) como outgroups. Inferencia [6] donde la estimación de la varianza de microsatélites en el tamaño medio de repetición de alelos se utilizó como sustituto para el tiempo evolutivo basado en la tasa de reconstitución del rango de alelos posterior a un efecto fundador severo. Se ha demostrado que la varianza de alelos microsatélites es un estimador fiable para la evolución de los microsatélites y la inferencia demográfica en las especies félidas [6]. [24] para el león (nDNA y mtDNA) y los datos genéticos FIV Ple (pol-RT) trazados tanto en relación con la distancia geográfica (modelo asumiendo que el hábitat se arquea en una celosía unidimensional infinita; aislamiento de una dimensión por distancia [IBD]) y la distancia geográfica logarít (mo asumiendo una celosía bidimensional infinita; aislamiento de dos dimensiones por distancia) en la distancia geográfica. Se encuentra en: doi:10.1371/journal.pgen.1000251.s002 (0,13 MB PDF) Figura S3 Relaciones filogenéticas de los haplotipos de león 12S-16S mtDNA. Árbol de unión de vecinos de las secuencias 12S-16S mtDNA de 1.882 bp. Los valores de arranque se colocan en cada punto de rama para los análisis de evolución/ parsimonia máxima/máxima probabilidad, respectivamente (ME/MP/ML). Outgroups: Ppaleopard, Panthera pardus; Pun -snow-leopard, Panthera uncia. El símbolo (N) representa nodos con soporte de bootstrap,50 o una politomía inferida en el árbol de consenso de mayoría de reglas de bootstrap 50%.

¿Cuál era el propósito de este estudio?

Más allá de la visualización de los fagos: aplicaciones no tradicionales del bacteriofago filamentoso como portador de vacunas, andamio biológico terapéutico y bioconjugadorhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4523942/SHA: f00f183d0bce0091a02349ec1eab44a76a9bc4Autores: Henry, Kevin A.; Arbabi-Ghahroudi, Mehdi; Scott, Jamie K.Fecha: 2015-08-04DOI: 10.3389/fmicb.2015.00755Licencia: cc-byAbstract: Durante los últimos 25 años, la tecnología de exhibición de fagos ha sido una herramienta inestimable para los estudios de interacciones proteína-proteína. Sin embargo, las propiedades biológicas, bioquímicas y biofísicas inherentes al bacteriofago filamentoso, así como la facilidad de su manipulación genética, también lo convierten en una plataforma atractiva fuera del canon de exhibición tradicional de fagos. Esta revisión se centrará en las propiedades únicas del bacteriofago filamentoso y destacará sus diversas aplicaciones en la investigación actual. Se ponen énfasis en: (i) las ventajas del fago como portador de la vacuna, incluyendo su alta inmunogenicidad, relativa simplicidad antigénica y capacidad para activar una gama de respuestas inmunes, (ii) el potencial del fago como agente profiláctico y terapéutico para enfermedades infecciosas y crónicas, (iii) la regularidad de la retícula de la proteína de la capa principal del virio, que permite una variedad de bioconjugación y aplicaciones de química de la superficie, particularmente en nanomateriales, y (iv) el gran tamaño de la población del fago y los tiempos de generación rápidos, que lo convierten en un excelente sistema modelo para la evolución de proteínas dirigidas. A pesar de su ubicuidad en la biosfera, el trabajo metagenómico apenas está comenzando a explorar la ecología del fago filamentoso y su papel en la evolución de las poblaciones bacterianas. Así, el fago filamentoso representa un microorganismo robusto, barato y versátil cuyas aplicaciones de bioingeniería continúan expandiéndose en nuevas direcciones, aunque sus limitaciones en algunas esferas imponen obstáculos a su adopción y uso generalizados. Texto: El bacteriofago filamentoso (genera Inovirus y Plactrovirus) son virus no envueltos en forma de varilla de Escherichia coli, cuyos largos capsidios helicoidales encapsulan un genoma circular de ADN de una sola cadena. Después del descubrimiento independiente de bacteriofago por Twort (1915) y d 'Hérelle (1917), el primer fago filamentoso, f1, fue aislado en Loeb (1960) y más tarde caracterizado como un miembro de un grupo más grande de fago (Ff, incluyendo f1, M13, y fd fago) específico para el E. coli conjugativo F pilus (Hofschneider y Mueller-Jensen, 1963; Marvin y Hoffmann-Berling, 1963; Zinder et al., 1963; Salivar et al., 1964). Poco después, se descubrió un fago filamentoso que no utiliza F-pili para la entrada (If y Ike; Meynell y Lawn, 1968; Khatoon et al., 1972), y con el tiempo la lista de fago filamentoso conocido se ha expandido a más de 60 miembros (Fauquet et al., 2005), incluyendo especies templadas y grampositivas. El trabajo de varios grupos en los últimos 50 años ha contribuido a una comprensión relativamente sofisticada de la estructura filamentosa, biología y ciclo vital (revisado en Marvin, 1998; Rakonjac et al., 2011; Rakonjac, 2012). A mediados de la década de 1980, el principio de modificar el genoma de fago filamentoso para mostrar polipéptidos como fusiones para cubrir proteínas en la superficie del virión fue inventado por Smith y colegas (Smith Sobre la base de las ideas descritas en Parmley y Smith (1988), los grupos de California, Alemania y el Reino Unido desarrollaron plataformas de fage-display para crear y proyectar bibliotecas de variantes de péptidos y proteínas plegadas (Bass et al., 1990; Devlin et al., 1990; McCafferty et al., 1990; Scott y Smith, 1990; Breitling et al., 1991; Kang et al., 1991). Esta tecnología permitió, por primera vez, la capacidad de conectar sin problemas la información genética con la función proteica para un gran número de variantes proteicas simultáneamente, y ha sido ampliamente y productivamente explotada en estudios de interacciones proteicas. Muchas excelentes revisiones están disponibles en bibliotecas de fage-display y sus aplicaciones (Kehoe y Kay, 2005; Bratkovic, 2010; Pande et al., 2010). Sin embargo, el fago tiene también una serie de propiedades estructurales y biológicas únicas que lo hacen altamente útil en áreas de investigación que han recibido mucha menos atención. Así, el propósito de esta revisión es destacar el trabajo reciente y actual utilizando fago filamentoso en aplicaciones nuevas y no tradicionales. Específicamente, nos referimos a proyectos que se basan en el fago filamentoso como un elemento clave, pero cuyo propósito principal no es la generación o cribado de bibliotecas fagodisplayed para obtener ligandos polipéptidos de unión. Estos tienden a caer en cuatro categorías principales de uso: i) fago filamentoso como portador de vacuna; ii) fago filamentoso diseñado como un agente biológico terapéutico en enfermedades infecciosas y crónicas; iii) fago filamentoso como un andamio para bioconjugación y química superficial; y iv) fago filamentoso como un motor para la evolución de variantes de proteínas exhibi Una sección final está dedicada a los últimos desarrollos en la ecología fagosa filamentosa y las interacciones fagosas-anfitriona. Los temas comunes compartidos entre todas estas aplicaciones incluyen las propiedades biológicas, inmunológicas y fisicoquímicas únicas del fago, su capacidad para mostrar una variedad de biomoléculas de forma modular, y su relativa simplicidad y facilidad de manipulación. Casi todas las aplicaciones del fago filamentoso dependen de su capacidad para mostrar polipéptidos en la superficie del virio como fusiones a proteínas de la capa de fago (Tabla 1). El modo de visualización determina el tamaño máximo tolerado del polipéptido fusionado, su número de copia en el fago, y potencialmente, la estructura del polipéptido mostrado. La visualización se puede lograr fusionando ADN codificando un polipéptido de interés directamente para el gen codificando una proteína de la capa dentro del genoma fago Sin embargo, con mucha más frecuencia, sólo se modifica una copia de la proteína de la capa en presencia de una segunda copia de tipo salvaje (por ejemplo, se muestra el tipo 88 si tanto los genes de tipo recombinante como los de tipo salvaje pVIII están en el genoma de los fagos, se muestra el tipo 8+8 si el Parmley y Smith (1988), McConnell et al. (1994), Rondot et al. (2001) Híbrido (sistemas de tipo 33 y 3+3) Sistema del tipo 3+3 <1 2 Smith y Scott (1993), Smith y Petrenko (1997) pVI Híbrido (sistema del tipo 6+6) Sí <1 2 > 25 kDa Hufton et al. (1999) pVII Sistema totalmente recombinante (sistema del tipo 7) No 5 > 25 kDa Kwasnikowski et al. (2005) Híbrido (sistema del tipo 7+7) (1999) pVIII Totalmente recombinante (fago paisajístico; sistema del tipo 8)No 2700 3 5-8 residuos Kishchenko et al. (1994), Petrenko et al. (1996) Híbrido (sistemas del tipo 88 y 8+8) Sistema del tipo 8+8 +1300 2 >50 kDa Scott and Smith (1990), Greenwood et al. (1991), Smith and Fernandez (2004) piX Totalmente recombinante (sistema del tipo 9+9 *) Sí 5 > 25 kDa Gao et al. (2002) Híbrido (sistema del tipo 9+9) No <1 2 Gao et al. (1999), Shi et al. (2010), Tornetta et al. (2010) 1 Los asteriscos indican la presencia de copias no funcionales de la proteína de la capa en el genoma del fago de ayuda utilizado para rescatar a un phagemid cuya proteína de capa se ha fusiona 2 El número de copia depende del tamaño del polipéptido; típicamente <1 copia por partícula de fago, pero para la visualización del péptido pVIII puede ser de hasta un 15% de moléculas de pVIII en viriones híbridos. 3 El número total de moléculas de pVIII depende del tamaño del genoma del fago; se añade una molécula de pVIII por cada 2,3 nucleótidos en el genoma viral. El gen recombinante 8 se encuentra en un plásmido con un origen fago de replicación) resultando en un virión híbrido con dos tipos diferentes de proteína de capa dada. Con mucho, las proteínas de capa más comúnmente utilizadas para la visualización son la proteína de capa principal, pVIII, y la proteína de capa menor, pIII, con la mayor ventaja de que la primera es la visualización de número de copia más alto (hasta un 15% de moléculas de capa recombinante en un virión híbrido, al menos para fusiones cortas de péptidos), y de que esta última es la capacidad de mostrar algunas proteínas plegadas en un número de copia apreciable (1-5 por partícula de fago). Si bien pVIII muestra proteínas plegadas en un fago híbrido es posible, normalmente resulta en un número de copia de mucho menos de 1 por virio (Sidhu et al., 2000). Para los fines de esta revisión, utilizamos el término "exhibición de fagos" para referirse a un fago filamentoso recombinante que muestra una sola secuencia de polipéptidos en su superficie (o más raramente, visualización biespecífica lograda mediante la fusión de polipéptidos a dos proteínas capsidas diferentes), y el término "biblioteca de fagotismo" para referirse a un grupo diverso de fagobios filamentosos recombinantes que muestran una serie de variantes de polipéptidos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos; péptidos). Tales bibliotecas son normalmente examinadas por ciclos iterativos de panificación contra una proteína de interés inmovilizada (por ejemplo, antígeno para bibliotecas de anticuerpos visualizadas por fago; anticuerpo para bibliotecas de péptidos visualizadas por fago) seguidos de amplificación del fago unido en células coli. El trabajo temprano con antifagos antisera generado para la clasificación de especies demostró que el fago virión filamentoso es altamente inmunogénico en ausencia de adyuvantes (Meynell y Lawn, 1968 ) y que sólo la proteína principal de la capa, pVIII, y la proteína menor de la capa, pIII, son blanco de anticuerpos (Pratt et al., 1969; Woolford et al., 1977). Así, la idea de utilizar el fago como portador para obtener anticuerpos contra haptens o polipéptidos poco inmunogénicos fue una extensión natural de la capacidad de mostrar secuencias exógenas recombinantes en su superficie, que fue demostrada por primera vez por de la Cruz et al. (1988). El bajo costo de producción de la partícula de fago, la alta estabilidad y el potencial para la exhibición de alta valencia del antígeno extraño (a través de la pantalla pVIII) también la hicieron atractiva como portadora de la vacuna, especialmente durante las primeras etapas de desarrollo de la tecnología proteica recombinante. Sobre la base de la tecnología existente de portador de péptidos, los primeros inmunogenes de la vacuna filamentosa a base de fago mostraron secuencias cortas de aminoácidos derivadas directamente de proteínas de interés como fusiones recombinantes a pVIII o pIII (de la Cruz et al., 1988). A medida que se desarrollaba y refinaba la tecnología bibliotecaria, los antígenos basados en fagos que mostraban ligandos péptidos de anticuerpos monoclonales (seleccionados de bibliotecas de péptidos aleatorias utilizando el anticuerpo, simulando así con diversos grados de éxito el epítopo plegado del anticuerpo en su antígeno cognado; Geysen et al., 1986; Knittelfelder et al., 2009) también se generaban con fines de inmunización, con el objetivo de provocar anticuerpos antipéptidos que también reconocían la proteína nativa. Cuando se muestran en los fagos, los péptidos que codifican las regiones repetitivas de la proteína de circunsporozoita malarial y la proteína de superficie de merozoita 1 fueron inmunogénicos en ratones y conejos (de la Cruz et al., 1988; Greenwood et al., 1991; Willis et al., 1993; Demangel et al., 1996), y anticuerpos levantados contra esta última reacción cruzada con la proteína de larga duración. Varios determinantes péptidos (o imitaciones de los mismos) del VIH-1 gp120, gp41, gag y transcriptasa inversa fueron inmunogénicos cuando se exhibieron o conjugaron con proteínas de la capa de los fagos (Minenkova et al., 1993; di Marzo Veronese et al., 1994; De Berardinis et al., 1999; Scala et al., 1999; Chen et al., 2001; van Houten et al., 2006 van Houten et al.,, 2010, y en algunos casos provocaron anticuerpos que fueron capaces de neutralizar débilmente virus adaptados al laboratorio (di Marzo Veronese et al., 1994; Scala et al., 1999). La lista de infecciones animales y humanas para las que se han desarrollado inmunogenes péptidos fagosos a medida que las vacunas conducen continúa expandiéndose e incluye patógenos bacterianos, fúngicos, virales y parasitarios (Tabla 2). Si bien en algunos casos los resultados de estos estudios han sido prometedores, las vacunas péptidas basadas en anticuerpos epitópicos ya no son un área de investigación activa por varias razones: i) en muchos casos, los péptidos imitan de forma incompleta o inadecuada epítopos en proteínas plegadas (Irving et al., 2010; véase más adelante); ii) los anticuerpos contra un solo epítopo puede ser de utilidad limitada, especialmente para patógenos altamente variables (Van Regenmortel, 2012); y iii) para patógenos para los que se generan respuestas inmunes protectoras de manera eficiente durante la infección natural, las Más recientemente, los fagos péptidos han sido utilizados en intentos de generar respuestas terapéuticas de anticuerpos para enfermedades crónicas, cáncer, inmunoterapia e inmunocontracepción. Inmunización con fagos que muestran la enfermedad de Alzheimer Los péptidos fibriles β-amiloide produjeron anticuerpos antiagregantes en ratones y cobayas (Frenkel et al., 2000 (Frenkel et al., 2003 Esposito et al., 2008; Tanaka et al., 2011), posiblemente redujo la formación de placa amiloide en ratones (Frenkel et al., 2003; Solomon, 2005; Esposito et al., 2008), y pudo haber ayudado a mantener las habilidades cognitivas en un modelo transgénico de ratón de la enfermedad de Alzheimer (Lavie et al., 2004) ; sin embargo, no está claro cómo se proponen estos anticuerpos para cruzar la barrera hematoencefá (2001) encontró que los anticuerpos criados en ratones contra un péptido ERBB2/HER2 podrían inhibir la proliferación de células de cáncer de mama. Fage mostrando ligandos péptidos de un anticuerpo anti-IgE provocó anticuerpos que unieron moléculas purificadas de IgE (Rudolf et al., 1998), que pueden ser útiles en inmunoterapia de alergia. Varias estrategias para las vacunas anticonceptivas basadas en fagos se han propuesto para el control de las poblaciones animales. Por ejemplo, la inmunización con fagos que muestran péptidos hormonales estimulantes de folículos en pVIII provocó anticuerpos que afectaron la fertilidad de ratones y ovejas (Abdennebi et al., 1999). También se encuentran en desarrollo los péptidos de los antígenos espermáticos (Samoylova et al., 2012a,b) y la hormona liberadora de gonadotropina (Samoylov et al., 2012). En su mayor parte, los péptidos que se muestran en los fagos provocan anticuerpos en animales experimentales (Tabla 2), aunque esto depende de las características del péptido y del método de su exhibición: las fusiones pIII tienden hacia una inmunogenicidad menor que las fusiones pVIII (Greenwood et al., 1991) posiblemente debido a diferencias en el número de copias (pIII: 1-5 copias vs. pVIII: estimadas en varios cientos de copias; Malik et al., 1996). De hecho, el fago es al menos tan inmunogénico como las proteínas portadoras tradicionales, como la albúmina sérica bovina (BSA) y la hemocianina de la cojera de ojo de llave (KLH; Melzer et al., 2003; Su et al., 2007), y tiene comparativamente pocos epítopos de células B endógenas para desviar la respuesta de anticuerpos de su objetivo previsto (Henry et al., 2011). Excepto los epítopos pequeños que pueden ser representados con precisión por una secuencia de aminoácidos cortos contiguos, sin embargo, ha sido extremadamente difícil provocar respuestas de anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con epitopos de proteínas nativas utilizando péptidos. El cuadro general es considerablemente más sombrío que el descrito en la Tabla 2, ya que en varios estudios: (i) los ligandos péptidos seleccionados de las bibliotecas de los fagos fueron clasificados por los autores como imitaciones de epitopos discontinuos si no presentaban una secuencia homológica obvia a la proteína nativa, lo que es una débil evidencia de no linealidad, o (ii) la evidencia de reactividad cruzada de anticuerpos provocada por la inmunización con péptidos discontinuados con proteína nativa no fue obligatoria. Irving et al. (2010) describen al menos una razón de esta falta de éxito: parece que los antígenos péptidos provocan un conjunto de anticuerpos topológicamente restringidos que son en gran medida incapaces de reconocer epitopos discontinuas o complejos en las biomoléculas más grandes. Mientras que el péptido puede imitar la química de un epítopo dado en una proteína plegada (permitiendo que se cruce con un anticuerpo dirigido), siendo una molécula más pequeña, no puede imitar la topología del epítopo completo de ese anticuerpo. A pesar de esto, el fago filamentoso sigue siendo muy útil como portador de péptidos con estructuras secundarias relativamente simples, que pueden ser estabilizados mediante el anclaje a las proteínas de la capa (Henry et al., 2011). Esto puede ser especialmente cierto de los péptidos con mala inmunogenicidad inherente, que puede aumentarse por la visualización de alta valencia y adyuvante asociado a los fago (véase Mecanismos inmunológicos de la vacunación con fago filamentoso más abajo). El fago filamentoso se ha utilizado en menor medida como portador de epítopos péptidos de células T, principalmente El trabajo temprano, que demostró que la inmunización con fage obtuvo ayuda de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993), fue confirmado por varios estudios posteriores (De Berardinis et al., 1999; Ulivieri et al., 2008). Desde la perspectiva de la vacunación contra enfermedades infecciosas, De Berardinis et al. (2000) mostraron que un epitope citotóxico de células T (CTL) de la transcriptasa inversa VIH-1 podría provocar CTLs específicos de antígenos in vitro e in vivo sin adición de epitopos de células T de ayuda exógenas, presumiblemente porque ya están presentes en las proteínas de la capa de fago (Mascolo et al., 2007). Del mismo modo, se observó un uso eficiente de CTLs frente a los epítopos de células T de los fagos mostrados por el virus de la hepatitis B (Wan et al., 2001) y Candida albicans (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2006 Wang et al., 2014d, que, junto con otros tipos de respuestas inmunes, protegían a los ratones contra la candidiasis sistémica. La vacunación con una combinación de péptidos phagedisplayed provocó CTLs específicos de antígenos que resultaron eficaces en la reducción de la cisticercosis porcina en un ensayo controlado aleatorizado (Manoutcharian et al., 2004; Morales et al., 2008). Mientras que las correlaciones de la protección inmune inducida por la vacuna para las enfermedades infecciosas, donde se conocen, son casi exclusivamente anticuerpos séricos o mucosas (Plotkin, 2010), En ciertas aplicaciones de la vacuna, el fago filamentoso se ha utilizado como portador de moléculas más grandes que serían inmunogénicas incluso en aislamiento. Inicialmente, las principales ventajas de la exhibición de estos antígenos de los fago eran la velocidad, facilidad de purificación y bajo costo de producción (Gram et al., 1993). E. coli F17a-G adhesin (Van Gerven et al., 2008), antígeno del núcleo de la hepatitis B (Bahadir et al., 2011), y antígeno de la superficie de la hepatitis B (Balcioglu et al., 2014) todas produjeron respuestas de anticuerpos cuando se exhibieron en la pIII, aunque ninguno de estos estudios comparó la inmunogenicidad de las Phage que muestra Schistosoma mansoni glutatión S-transferasa en pIII provocó una respuesta de anticuerpos que fue tanto más alta en el título como de diferentes isotipos en comparación con la inmunización con la proteína sola (Rao et al., 2003). Dos estudios de vacunas antiidiotípicas han utilizado el fago como portador de fragmentos de anticuerpos que contienen idiotipos inmunogénicos. Inmunización con fago que muestra el 1E10 idiotaype scFv (mimicking a Vibrio anguillarum surface epitope) provocó anticuerpos que protegían a los peces babosos de Vibrio anguillarum challenge (Xia et al., 2005). Una vacuna de idiotipo de tumor específico de phage-BCL1 vinculada químicamente fue débilmente inmunogénica en ratones pero extendió el tiempo de supervivencia en un modelo de linfoma de células B (Roehnisch et al., 2013), y fue bien tolerada e inmunogénica en pacientes con mieloma múltiple (Roehnisch et al., 2014). Un estudio de vacunación de ADN con antilaminarina scFv encontró que el ADN codificando una proteína de fusión pIII-scFv provocó respuestas inmunes humorales y mediadas por células más fuertes que el ADN codificando el scFv solo (Cuesta et al., 2006), sugiriendo que bajo algunas circunstancias, los epitopos de células T de fago endógeno pueden mejorar la inmunogenicidad de proteínas asociadas. Tomados en conjunto, los resultados de estos estudios muestran que como partícula similar a un virus de partículas, el fago filamentoso probablemente desencadena diferentes tipos de respuestas inmunitarias que los antígenos de proteínas recombinantes, y proporciona ayuda adicional de células T a las proteínas exhibidas o conjugadas. Sin embargo, el bajo número de copias de proteínas visualizadas pIII, así como la adyuvancia potencialmente no deseada asociada a los fagos, pueden hacer de la exhibición de proteínas recombinantes por fago una elección vacunal subóptima. Aunque nuestra comprensión de la respuesta inmune contra los palidezes fagosas filamentosas en comparación con antígenos modelo clásicos como la ovalbúmina, los últimos trabajos han comenzado a arrojar luz sobre los mecanismos inmunes activados en respuesta a la vacunación de los fagos (Figura 1). La partícula del fago es inmunogénica sin adyuvante en todas las especies probadas hasta la fecha, incluyendo ratones (Willis et al., 1993), ratas (Dente et al., 1994), conejos (de la Cruz et al., 1988), cobayas (Frenkel et al., 2000; Kim et al., 2004), peces (Coull et al., 1996; Xia et al., 2005), primates no humanos (Chen et al., 2001) y humanos (Roehnisch et al., 2014). Se han empleado varias vías de inmunización, incluyendo administración oral (Delmastro et al., 1997) así como subcutánea (Grabowska et al., 2000), intraperitoneal (van Houten et al., 2006), intramuscular (Samoylova et al., 2012a), intravenosa (Vaks y Benhar, 2011), e inyección intradérmica (Roehnisch et al., 2013); ningún estudio publicado ha comparado directamente el efecto de la vía de administración sobre la inmunogenicidad fagosa filamentosa. Los anticuerpos se generan contra sólo tres sitios principales en el virión: (i) los N-terminal expuestos a la superficie 12 de la retícula monomérica pVIII (Terry et al., 1997; Kneissel et al., 1999) ; (ii) los dominios N-terminal N1 y N2 de la pIII (van Houten et al., 2010); y (iii) lipopolisacárido bacteriano (LPS) incrustado en la capa de fago (Henry et al., 2011). En ratones, los títulos de anticuerpos séricos contra el fago suelen alcanzar 1:10 5 -1:10 6 después de 2-3 inmunizaciones, y se mantienen durante al menos 1 año postinmunización (Frenkel et al., 2000). Las respuestas primarias de anticuerpos contra el fago parecen estar compuestas por una mezcla de isotipos IgM e IgG2b en ratones C57BL/6, mientras que las respuestas secundarias de anticuerpos están compuestas principalmente de isotipos IgG1 e IgG2b, con una menor contribución de isotipos IgG2c e IgG3 (Hashiguchi et al., 2010). La supresión de los dominios N1 y N2 expuestos a la superficie de pIII produce una forma truncada de esta proteína que no provoca anticuerpos, sino que también produce una partícula de fago no infecciosa con menor inmunogenicidad general (van Houten et al., 2010). Como partícula similar a un virus, el fago filamentoso envuelve múltiples brazos del sistema inmune, comenzando con efectores celulares de inmunidad innata (macrofagos, neutrófilos y posiblemente células asesinas naturales), que son reclutados en sitios tumorales por fago que muestran moieties tumorales. El fago probablemente activa las respuestas de anticuerpos independientes de células T, ya sea a través de ligandos TLR asociados a los fagoes o enlaces cruzados por la celosía pVIII. Después del procesamiento por células que presentan antígenos, los péptidos derivados de los fagotes se presentan en la clase II de la MHC y en la clase I de la MHC, resultando en la activación de CTL de corta duración y una serie de tipos de células T ayudantes, que ayudan a la memoria primaria CTL y respuestas de células B de alta afinidad. Las fronteras en la microbiología www.fronterizosin.orgAunque los títulos de anticuerpos antifagos séricos parecen ser al menos parcialmente dependientes de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993; De Berardinis et al., 1999; van Houten et al., 2010), muchas células B específicas de pVIII circulantes en la sangre carecen de mutación somática incluso después de repetidas inmunizaciones quincenales, lo que sugiere que bajo estas condiciones, el fago activa respuestas de células B independientes de células T además de respuestas dependientes de células T de alta afinidad (Murira, 2014). Las partículas filamentarias de fagos pueden ser procesadas por células presentadoras de antígenos y presentadas en moléculas de clase II de MHC (Gaubin et al., 2003; Ulivieri et al., 2008) y pueden activar T H 1, T H 2 y T H 17 células T ayudantes (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2014d). Las respuestas antifagos T H 2 se mejoraron mediante la visualización de péptidos CTLA-4 fusionados con pIII (Kajihara et al., 2000). Las proteínas de Phage también pueden presentarse de forma cruzada en moléculas de clase I de MHC (Wan et al., 2005) y pueden producir dos ondas de respuestas CTL, que consisten primero en CTL de corta duración y después de CTL de memoria de larga duración que requieren ayuda de células CD4 + T (Del Pozzo et al., Estos últimos CTLs median una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (Fang et al., 2005; Del Pozzo et al., 2010). La partícula de fago es autoadyuvante a través de múltiples mecanismos. El LPS derivado de la pared de la célula huésped realza la inmunogenicidad del virión, y su eliminación por cromatografía de polimixina B reduce los títulos de anticuerpos contra las proteínas de capa de fago (Grabowska et al., 2000). El genoma de ADN singlestranded del fago contiene motivos CpG y también puede tener un efecto adyuvante. La respuesta de anticuerpos contra el fago es totalmente dependiente de la señalización de MyD88 y se modula mediante la estimulación de varios receptores de tipo peaje (Hashiguchi et al., 2010), indicando que la inmunidad innata juega un papel importante pero en gran Los estudios de biodistribución del fago después de la inyección intravenosa muestran que se elimina de la sangre en cuestión de horas a través del sistema reticuloendotelial (Molenaar et al., 2002), particularmente del hígado y el bazo, donde se retiene durante días (Zou et al., 2004), potencialmente activando respuestas de células B de zona marginal. Por lo tanto, el fago filamentoso no sólo es un portador altamente inmunogénico, sino que, gracias a la activación de una gama de respuestas inmunes innatas y adaptativas, sirve como un excelente modelo de antígeno de partícula similar al virus. Mucho antes de la identificación del fago filamentoso, otros tipos de bacteriofago ya se estaban utilizando para la terapia antibacteriana en la antigua Unión Soviética y Europa Oriental (revisado en Sulakvelidze et al., 2001). El fago filamentoso, con su ciclo de vida no lítico, tiene usos clínicos menos obvios, a pesar de que la especificidad del huésped de Inovirus y Plectrovirus incluye muchos patógenos de importancia médica, incluyendo Salmonella, E. coli, Shigella, Pseudomonas, Clostridium y Micoplasma. En un esfuerzo por mejorar su actividad bactericida, los fagoces filamentosos genéticamente modificados se han utilizado como "caballo de Troya" para introducir diversos agentes antibacterianos en las células. Los fagos M13 y Pf3 fueron diseñados para expresar la restricción BglII endonucleasa (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004), lambda fage S holin (Hagens y Blasi, 2003) o una proteína activadora letal del gen catabolita (Moradpour et al., 2009) que mató eficazmente a las células E. coli y Pseudomonas aeruginosa, respectivamente, sin liberación concomitante de LPS (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004). Lamentablemente, la rápida aparición de bacterias resistentes con pili F modificado representa un obstáculo importante y posiblemente insuperable a este enfoque. Sin embargo, hay algunos indicios de que los fagos filamentosos pueden ejercer efectos útiles pero más sutiles sobre sus hospedadores bacterianos que pueden no resultar en el desarrollo de resistencia a la infección. Varios estudios han reportado aumento de la sensibilidad antibiótica en poblaciones bacterianas infectadas simultáneamente con fago filamentoso tipo salvaje (Hagens et al., 2006) o fago diseñado para reprimir la respuesta celular SOS (Lu y Collins, 2009). La infección filamentosa f1 inhibió la formación de biopelículas en E. coli, pero no madura (May et al., 2011). Así, los fago filamentosos no modificados pueden ser de interés futuro como elementos de terapia combinada contra ciertas infecciones resistentes a fármacos. Las aplicaciones terapéuticas más avanzadas del fago filamentoso emergen cuando se modifica para expresar una fracción dirigida específica para células patógenas y/o proteínas para el tratamiento de enfermedades infecciosas, cáncer y autoinmunidad (Figura 2). El primer trabajo en esta área mostró como prueba de concepto que los fagos codificando un cassette de expresión GFP y mostrando un HER2specific scFv en todas las copias de pIII fueron internalizados en células tumorales de mama, resultando en la expresión GFP (Poul y Marks, 1999). M13 o fd fagos mostrando un péptido objetivo o fragmento de anticuerpos y amarrados a cloranfenicol por un crosslinker lábil eran inhibidores más potentes del crecimiento de Staphylococcus aureus que el cloranfenicol libre de alta concentración (Yacoby et al., 2006; Vaks y Benhar, 2011). M13 fagos cargados con doxorubicina y mostrando un péptido objetivo en células de cáncer de próstata específicamente muertas en pIII in vitro (Ghosh et al., péptido tumoral específico: proteínas de fusión de pVIII seleccionadas de "paisaje" fage (Romanov et al., 2001; Abbineni et al., 2010; Fagbohun et al., 2012 Fagbohun et al., 2013 Lang et al., 2014; Wang et al., 2014a) fueron capaces de dirigir y entregar siRNA-, paclitaxel-, y liposomas que contienen doxorubicina a las células tumorales (Jayanna et al., 2010a; Wang et al., 2010a Wang et al.,, b, c, 2014b Bedi et al., 2011 Bedi et al.,, 2013 Bedi et al.,, 2014 ; eran tasas de remisión tumoral no tóxicas y aumentadas en modelos de ratón (Jayanna et al., 2010b; Wang et Usando el modelo de tumor B16-OVA, Eriksson et al. (2007) mostraron que los fagos que mostraban péptidos y/o Fabs específicos para antígenos tumorales retrasaron el crecimiento del tumor y mejoraron la supervivencia, debido en gran parte a la activación de macrófagos asociados al tumor y al reclutamiento de neutrófilos en el sitio del tumor (Eriksson et al., 2009). Phage mostrando un scFv frente a fibriles β-amiloide mostró promesa como diagnóstico (Frenkel y Solomon, 2002) y terapéutico (Solomon, 2008) reactivo para la enfermedad de Alzheimer y Parkinson debido a la capacidad imprevista del fago para penetrar en el tejido cerebral (Ksendzovsky et al., 2012). Del mismo modo, los fagos que muestran un epítopo péptido inmunodominante derivado de la mielina oligodendrocyte glucoproteína desmielinizantes patógenos agotados anticuerpos en el tejido cerebral en el modelo murina experimental de encefalomielitis autoinmune de esclerosis múltiple (Rakover et al., 2010). Las ventajas del fago filamentoso en este contexto sobre los conjugados tradicionales anticuerpo-fármaco o proteico-péptido son: i) su capacidad para transportar cantidades muy altas de fármaco o péptido, y ii) su capacidad para acceder a compartimentos anatómicos que generalmente no pueden ser alcanzados por la administración sistémica de una proteína. A diferencia de la mayoría de los biológicos terapéuticos, la producción del fago filamentoso en bacterias complica su uso en los seres humanos de varias maneras. En primer lugar, los preparados crudos de fago filamentoso suelen contener niveles muy altos de SLP contaminante, en el rango de 10 unidades de endotoxina 2-10 4 (EU)/ml (Boratynski et al., 2004; Branston et al., 2015), que tienen el potencial de causar reacciones adversas graves. LPS no se elimina completamente por precipitación de polietilenglicol o centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio (Smith y Gingrich, 2005; Branston et al., 2015), pero sus niveles se pueden reducir drásticamente utilizando pasos de purificación adicionales como cromatografía de exclusión de tamaño (Boratynski et al., 2004; Zakharova et al., 2005), cromatografía de polimixina B (Grabowska et al., 2000), y tratamiento con detergentes como Triton X-100 o Triton X-114 (Roehnisch et al., 2014; Branston et al., 2015). Estas estrategias alcanzan de forma rutinaria niveles de endotoxina < 1 EU/ml medidos por el lisato de limulo amebocito (LAL), muy por debajo del límite de la FDA para la administración parenteral de 5 EU/kg de peso corporal/dosis, aunque sigue habiendo preocupaciones con respecto a la presencia de LPS residuales asociadas al virión que pueden ser indetectables.Una segunda consecuencia, y tal vez inevitable, de la producción bacteriana del fago filamentoso es la heterogeneidad inherente del tamaño de las partículas y el espectro de contaminantes solubles y asociados al virión del huésped, que pueden ser causa de problemas de seguridad y restringir su uso a los grupos de alto riesgo. Se han propuesto muchos tipos de variantes de bacteriofago y fagos diseñados, incluido el fago filamentoso, para uso profiláctico ex vivo en seguridad alimentaria, ya sea en la tubería de producción (revisado en Dalmasso et al., 2014) o para la detección de patógenos transmitidos por alimentos postproducción (revisado en Schmelcher y Loessner, 2014). Fago filamentoso que muestra una etiqueta de tetracisteína en pIII se utilizaron para detectar células E. coli a través de tinción con tinte biarsenical. Biosensores basados en resonancia de plasmón superficial (Nanduri et al., 2007), transductores piezoeléctricos (Olsen et al., 2006), dicroísmo lineal (Pacheco-Gomez et al., 2012), y tecnología de sensores magnetoelásticos (Lakshmanan et al., 2007; Huang et al., 2009) fueron ideados utilizando fagos filamentosos que muestran scFv o conjugados a IgG enteros contra E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium y Bacillus anthracis con límites de detección en el orden de 10 2-10 6 células bacterianas/ml. Prueba de concepto ha sido demostrado para el uso de tales biosensores a base de fagos para detectar contaminación bacteriana de productos vivos (Li et al., 2010 La partícula fagosa filamentosa está encerrada por un capsid de proteína similar a la varilla, de 1000 nm de largo y 5 nm de ancho, formado casi enteramente por monómeros de pVIII superpuestos, cada uno de los cuales se encuentra en 27 angstroms de su vecino más cercano y expone dos grupos de aminas, así como al menos tres grupos de carboxilo (Henry et al., 2011). La regularidad de la celosía de pVIII de fagos y su diversidad de grupos químicamente direccionables la convierten en un andamio ideal para la bioconjugación (Figura 3). El enfoque más utilizado es la funcionalización de grupos de aminas con ésteres NHS (van Houten et al., 2006 (van Houten et al., 2010 Yacoby et al., 2006), aunque esto puede resultar en una a Los grupos de carboxilo y los residuos de tirosina también se pueden funcionalizar utilizando acoplamiento de carbodiimida y acoplamiento de diazonio, respectivamente (Li et al., 2010a). Carrico et al. (2012) desarrollaron métodos para etiquetar específicamente pVIII N-termina sin modificación de residuos de lisina expuestos a través de una reacción de formación de transaminación-oxima en dos pasos. La modificación específica de las proteínas de la capa de fago es aún más fácil de lograr usando péptidos modificados genéticamente (Ng et al., 2012) o enzimas (Chen et al., 2007; Hess et al., 2012), pero esto puede ser engorroso y es menos general en aplicación. Durante más de una década, el interés en el fago filamentoso como bloque de construcción de nanomateriales ha ido creciendo debido a sus propiedades fisicoquímicas únicas, con aplicaciones emergentes en magnet Desde hace mucho tiempo se sabe que por encima de un determinado umbral de concentración, el fago puede formar suspensiones cristalinas ordenadas (Welsh et al., 1996). Lee et al. (2002) diseñaron un fago M13 para mostrar un péptido de unión ZnS en pIII y demostraron que, en presencia de nanopartículas ZnS, se autoensamblan en biomateriales de película altamente ordenados que se pueden alinear utilizando campos magnéticos. Aprovechando la capacidad de mostrar péptidos específicos de sustratos en lugares conocidos en el filamento fagotico Hess et al., 2012), este pionero FIGURE 3 Grupos químicamente direccionables de la capa principal de bacteriofago filamentoso. El virión del fago filamentoso se compone de 2.500-4.000 copias superpuestas de la proteína 50-residue Cada monómero tiene una serie de grupos químicamente direccionables disponibles para la conjugación bioortogonal, incluyendo dos grupos de aminas primarias (mostradas en rojo), tres grupos de carboxilo (mostradas en azul) y dos grupos de hidroxilo (mostradas en verde). Los 12 residuos N-terminales generalmente expuestos al sistema inmune para la unión de anticuerpos están en negrita subrayado. Figura adaptada a partir de datos estructurales de Marvin, 1990, disponible libremente en bases de datos PDB y SCOPe. el trabajo se convirtió en la base para la construcción de nanomateriales bidimensionales y tridimensionales con arquitecturas más avanzadas, incluyendo nanohilos semiconductores (Mao et al., 2003 (Mao et al.,, 2004, nanopartículas, y nanocomposites (Oh et al., 2012; Chen et al., 2014). Utilizando los péptidos híbridos de unión de oro y Co 3 O 4 en pVIII como andamio para ensamblar nanohilos en multicapas de polielectrolitos, Nam et al. (2006) produjeron una batería de iones de litio delgada y flexible, que podía ser estampada en colectores de corriente de microbanda de platino (Nam et al., 2008). Las propiedades electroquímicas de estas baterías se mejoraron aún más a través de la visualización pIII de péptidos de unión de nanotubos de carbono de una sola pared (Lee et al., 2009), ofreciendo un enfoque para la producción sostenible de electrodos nanoestructurados a partir de materiales de partida mal conductivos. Los nanomateriales a base de fage han encontrado aplicaciones en la imagen del cáncer (Ghosh et al., 2012b; Yi et al., 2012), la división del agua fotocatalítica (Nam et al., 2010a; Neltner et al., 2010), la recolección de luz (Nam et al., 2010b; Chen et al., 2013), las tecnologías fotorespuestas (Murugesan et al., 2013), los electrodos neuronales (Kim et al., 2014), y la generación de energía piezoeléctrica (Murugesan et al., 2013). Así, las propiedades fisicoquímicas únicas del fago, en combinación con la visualización modular de péptidos y proteínas con especificidad de unión conocida, han desove materiales totalmente nuevos con diversas aplicaciones. Vale la pena señalar que las propiedades bio La alineación magnética de los fagos filamentosos de alta concentración en solución puede ordenar parcialmente el ADN, el ARN, las proteínas y otras biomoléculas para la medición de las interacciones de acoplamiento dipolar (Hansen et al., 1998 (Hansen et al., 2000 Dahlke Ojennus et al., 1999) en espectroscopia NMR. Debido a su gran tamaño de población, tiempos de generación cortos, tamaños de genoma pequeños y facilidad de manipulación, diversos bacteriófagos filamentosos y no filamentosos se han utilizado como modelos de evolución experimental (revisado en Husimi, 1989; Wichman y Brown, 2010; Kawecki et al., 2012; Hall et al., 2013). El fago filamentoso tiene usos prácticos adicionales en ingeniería proteica y evolución proteica dirigida, debido a su tolerancia única de modificaciones genéticas que permiten mostrar biomolécula En primer lugar, entre estas aplicaciones se encuentra la maduración in vitro de la afinidad de los fragmentos de anticuerpos mostrados en pIII. Las bibliotecas de variantes Fabs y anticuerpos de cadena única pueden generarse mediante mutagenesis aleatoria o sitedirected y seleccionarse sobre la base de una unión mejorada o alterada, imitando más o menos la estrategia de evolución somática del sistema inmunitario (Marks et al., 1992; Bradbury et al., 2011). Sin embargo, otros sistemas de visualización in vitro, como la visualización de levaduras, tienen importantes ventajas sobre el fago filamentoso para la maduración de afinidad (aunque cada tecnología de visualización tiene fortalezas complementarias; Koide y Koide, 2012) y, independientemente del método de visualización, la selección de variantes "mejoradas" puede ser lenta y engorrosa. Se han desarrollado métodos iterativos para combinar mutaciones de diseño computacional (Lippow et Recientemente, Esvelt et al. (2011) desarrollaron una nueva estrategia para la evolución dirigida de las proteínas fagosas filamentosas, denominadas evolución continua asistida por fagos (PACE), que permite múltiples rondas de evolución por día con poca intervención experimental.Los autores diseñaron el fago M13 para codificar una proteína exógena (sujeto a la evolución dirigida), cuya actividad funcional desencadena la expresión del gen III de un plasmido accesorio; variantes de la proteína exógena surgen por mutagenesis aleatoria durante la replicación de fagos, cuya tasa puede aumentarse mediante la expresión inducible de polimerasas de ADN propensas a errores. Al suministrar cantidades limitadas de células E. coli receptivas a las variantes de fagosas diseñadas, Esvelt et al. (2011) vincula elegantemente la infectividad y producción de fagos con la presencia de un fenotipo proteico deseado. Carlson et al. (2014) más tarde mostró que la severidad de selección PACE podría ser modulada proporcionando pequeñas cantidades de pIII independientemente del fenotipo proteico, y funciones proteicas indeseables seleccionadas negativamente al vincularlas a la expresión de una variante pIII truncada que altera la infectividad en una forma negativa dominante. PACE se limita actualmente a funciones proteicas que pueden estar vinculadas de alguna manera a la expresión de un reportero del gen III, tales como interacción proteína-proteína, recombinación, unión ADN o ARN, y catálisis enzimática (Meyer y Ellington, 2011). Este enfoque representa una vía prometedora para la investigación básica en evolución molecular (Dickinson et al., 2013) y biología sintética, incluyendo ingeniería de anticuerpos. El bacteriofago filamentario se ha recuperado de diversas fuentes ambientales, incluyendo el suelo (Murugaiyan et al., 2011), el agua dulce costera (Xue et al., 2012), los lagos alpinos (Hofer y Sommaruga, 2001) y las bacterias del mar profundo (Jian et al., 2012), pero tal vez no sorprendentemente el intestino humano (Kim et al., 2011). El "fageoma" ambiental en el suelo y el agua representan la mayor fuente de replicación de ADN en el planeta, y se estima que contiene más de 10 30 partículas virales (Ashelford et al., 2003; Chibani-Chennoufi et al., 2004; Suttle, 2005). Los pocos estudios que intentan investigar la ecología ambiental de los fagos filamentosos utilizando técnicas clásicas de microbiología ambiental (normalmente observación directa por microscopía electrónica) encontraron que los fagos filamentosos constituían entre el 0 y el 100% de todas las partículas virales (Demuth et al., 1993; Pina et al., 1998; Hofer y Sommaruga, 2001). Hubo alguna evidencia de fluctuación estacional de poblaciones de fagos filamentosos junto con la abundancia relativa de bacterias heterotróficas libres (Hofer y Sommaruga, 2001). Los datos existentes sugieren que los fagos filamentosos son constituyentes menores de comunidades virales en agua dulce (Roux et al., 2012) y agua recuperada y potable (Rosario et al., 2009), pero tienen frecuencias mucho más altas en aguas residuales y aguas residuales (Cantalupo et al., 2011; Alhamlan et al., 2013), con la salvedad de que los sesgos inherentes a las metodologías para determinar estos datos (purificación de partículas virales, sesgos de secuenciación) no han sido bien validados. No hay datos que describan la dinámica poblacional de los fagos filamentosos y sus especies hospedantes en el entorno natural. A nivel individual de virus-bacterio, está claro que los fagos filamentosos pueden modular el fenotipo huésped, incluyendo la virulencia de importantes patógenos humanos y de cultivos. Esto puede ocurrir ya sea a través de efectos directos de replicación de fagos en el crecimiento celular y la fisiología, o, más típicamente, por transferencia horizontal de material genético contenido en episomas y/o profagos cromosómicamente integrados. Fago filamentoso templado también puede jugar un papel en la evolución del genoma (revisado en Canchaya et al., 2003). Tal vez el ejemplo mejor estudiado de modulación de virulencia por fago filamentoso es el de Vibrio cholerae, cuya virulencia completa requiere conversión lisogénica por la toxina del cólera codificante CTX La integración de los fagos CTXo se produce en sitios específicos del genoma; estas secuencias se introducen a través de la acción combinada de otro fagos filamentoso, fs2o, y un fagoso filamentoso satelital, TLC-KnŁo1 (Hassan et al., 2010). Así, las especies de fagos filamentosos interactúan y coevolucionan entre sí, además de sus anfitriones. La infección por fagos filamentosos se ha implicado en la virulencia de Yersinia pestis (Derbise et al., 2007), Neisseria meningitidis (Bille et al., 2005 (Bille et al., 2008, Vibrio parahemolyticus (Iida et al., 2001), E. coli 018:K1:H7 (Gonzalez et al., 2002), Xanthomonas campestris (Kamiunten and Wakimoto, 1982), y P. aeruginosa (Webb et al., 2004), aunque en la mayoría de estos casos, los mecanismos específicos que modulan la virulencia no son claros. La infección por fage puede potenciar o reprimir la virulencia dependiendo de las características del fago, la bacteria huésped y el medio ambiente, como es el caso del patógeno de la marchitez bacteriana Ralstonia solanacearum (Yamada, 2013). Dado que la infección resulta en la regulación de los pili utilizados para la entrada viral, el tratamiento del fago filamentoso se ha propuesto como un medio hipotético para inhibir la conjugación bacteriana y la transferencia génica horizontal, a fin de evitar la propagación de genes de resistencia a antibióticos (Lin et al., 2011). Finalmente, el fago filamentoso también puede desempeñar un papel futuro en la preservación de la biodiversidad de otros organismos en ecosistemas de riesgo. Se ha propuesto el uso del fago artificial en la biorremediación, ya sea mostrando fragmentos de anticuerpos de la especificidad deseada para la filtración de toxinas y contaminantes ambientales (Petrenko y Makowski, 1993), o como polímeros biodegradables que muestran péptidos seleccionados por su capacidad para agregar contaminantes, tales como residuos de arenas oleaginosas (Curtis et al., 2011 (Curtis et al., 2013 ). También se ha propuesto el uso de péptidos diseñados que se unen específicamente a materiales inorgánicos en tecnologías de separación mineral más avanzadas y menos intrusivas (Curtis et al., 2009 ). El fago filamentoso representa un organismo altamente versátil cuyos usos van mucho más allá de la exhibición tradicional de fago y la selección de afinidad de anticuerpos y polipéptidos de especificidad deseada. Su alta inmunogenicidad y su capacidad para mostrar una variedad de antígenos superficiales hacen que el fago sea un excelente portador de la vacuna antipartículas, aunque su producción y preparación bacterianas probablemente limiten sus aplicaciones en vacunas humanas en la actualidad, a pesar de ser aparentemente seguros y bien tolerados en animales y personas. Las características imprevistas de la partícula antifago, como el cruce de la barrera hematoencefálica y la formación de fases cristalinas líquidas altamente ordenadas, han abierto nuevas vías de investigación en terapias para enfermedades crónicas y el diseño de nanomateriales. Nuestra comprensión comparativamente detallada de las interacciones del fagotismo filamentoso modelo con sus huéspedes bacterianos ha permitido a los investigadores aprovechar el ciclo de vida del fago para dirigir la evolución proteica en el laboratorio. Esperamos que un conocimiento más profundo de las interacciones entre los hospederos de fago a nivel ecológico pueda producir estrategias novedosas para controlar la pato Mientras se siguen desarrollando nuevas aplicaciones del fago filamentoso, es probable que el fago conserve su posición como caballo de batalla para el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos durante muchos años, incluso con el advenimiento de tecnologías competidoras. KH y JS concibieron y escribieron el manuscrito. MA-G leyó el manuscrito y comentó sobre el texto.

¿Cuál ha sido la aplicación de la tecnología de visualización de fagos?

Más allá de la visualización de los fagos: aplicaciones no tradicionales del bacteriofago filamentoso como portador de vacunas, andamio biológico terapéutico y bioconjugadorhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4523942/SHA: f00f183d0bce0091a02349ec1eab44a76a9bc4Autores: Henry, Kevin A.; Arbabi-Ghahroudi, Mehdi; Scott, Jamie K.Fecha: 2015-08-04DOI: 10.3389/fmicb.2015.00755Licencia: cc-byAbstract: Durante los últimos 25 años, la tecnología de exhibición de fagos ha sido una herramienta inestimable para los estudios de interacciones proteína-proteína. Sin embargo, las propiedades biológicas, bioquímicas y biofísicas inherentes al bacteriofago filamentoso, así como la facilidad de su manipulación genética, también lo convierten en una plataforma atractiva fuera del canon de exhibición tradicional de fagos. Esta revisión se centrará en las propiedades únicas del bacteriofago filamentoso y destacará sus diversas aplicaciones en la investigación actual. Se ponen énfasis en: (i) las ventajas del fago como portador de la vacuna, incluyendo su alta inmunogenicidad, relativa simplicidad antigénica y capacidad para activar una gama de respuestas inmunes, (ii) el potencial del fago como agente profiláctico y terapéutico para enfermedades infecciosas y crónicas, (iii) la regularidad de la retícula de la proteína de la capa principal del virio, que permite una variedad de bioconjugación y aplicaciones de química de la superficie, particularmente en nanomateriales, y (iv) el gran tamaño de la población del fago y los tiempos de generación rápidos, que lo convierten en un excelente sistema modelo para la evolución de proteínas dirigidas. A pesar de su ubicuidad en la biosfera, el trabajo metagenómico apenas está comenzando a explorar la ecología del fago filamentoso y su papel en la evolución de las poblaciones bacterianas. Así, el fago filamentoso representa un microorganismo robusto, barato y versátil cuyas aplicaciones de bioingeniería continúan expandiéndose en nuevas direcciones, aunque sus limitaciones en algunas esferas imponen obstáculos a su adopción y uso generalizados. Texto: El bacteriofago filamentoso (genera Inovirus y Plactrovirus) son virus no envueltos en forma de varilla de Escherichia coli, cuyos largos capsidios helicoidales encapsulan un genoma circular de ADN de una sola cadena. Después del descubrimiento independiente de bacteriofago por Twort (1915) y d 'Hérelle (1917), el primer fago filamentoso, f1, fue aislado en Loeb (1960) y más tarde caracterizado como un miembro de un grupo más grande de fago (Ff, incluyendo f1, M13, y fd fago) específico para el E. coli conjugativo F pilus (Hofschneider y Mueller-Jensen, 1963; Marvin y Hoffmann-Berling, 1963; Zinder et al., 1963; Salivar et al., 1964). Poco después, se descubrió un fago filamentoso que no utiliza F-pili para la entrada (If y Ike; Meynell y Lawn, 1968; Khatoon et al., 1972), y con el tiempo la lista de fago filamentoso conocido se ha expandido a más de 60 miembros (Fauquet et al., 2005), incluyendo especies templadas y grampositivas. El trabajo de varios grupos en los últimos 50 años ha contribuido a una comprensión relativamente sofisticada de la estructura filamentosa, biología y ciclo vital (revisado en Marvin, 1998; Rakonjac et al., 2011; Rakonjac, 2012). A mediados de la década de 1980, el principio de modificar el genoma de fago filamentoso para mostrar polipéptidos como fusiones para cubrir proteínas en la superficie del virión fue inventado por Smith y colegas (Smith Sobre la base de las ideas descritas en Parmley y Smith (1988), los grupos de California, Alemania y el Reino Unido desarrollaron plataformas de fage-display para crear y proyectar bibliotecas de variantes de péptidos y proteínas plegadas (Bass et al., 1990; Devlin et al., 1990; McCafferty et al., 1990; Scott y Smith, 1990; Breitling et al., 1991; Kang et al., 1991). Esta tecnología permitió, por primera vez, la capacidad de conectar sin problemas la información genética con la función proteica para un gran número de variantes proteicas simultáneamente, y ha sido ampliamente y productivamente explotada en estudios de interacciones proteicas. Muchas excelentes revisiones están disponibles en bibliotecas de fage-display y sus aplicaciones (Kehoe y Kay, 2005; Bratkovic, 2010; Pande et al., 2010). Sin embargo, el fago tiene también una serie de propiedades estructurales y biológicas únicas que lo hacen altamente útil en áreas de investigación que han recibido mucha menos atención. Así, el propósito de esta revisión es destacar el trabajo reciente y actual utilizando fago filamentoso en aplicaciones nuevas y no tradicionales. Específicamente, nos referimos a proyectos que se basan en el fago filamentoso como un elemento clave, pero cuyo propósito principal no es la generación o cribado de bibliotecas fagodisplayed para obtener ligandos polipéptidos de unión. Estos tienden a caer en cuatro categorías principales de uso: i) fago filamentoso como portador de vacuna; ii) fago filamentoso diseñado como un agente biológico terapéutico en enfermedades infecciosas y crónicas; iii) fago filamentoso como un andamio para bioconjugación y química superficial; y iv) fago filamentoso como un motor para la evolución de variantes de proteínas exhibi Una sección final está dedicada a los últimos desarrollos en la ecología fagosa filamentosa y las interacciones fagosas-anfitriona. Los temas comunes compartidos entre todas estas aplicaciones incluyen las propiedades biológicas, inmunológicas y fisicoquímicas únicas del fago, su capacidad para mostrar una variedad de biomoléculas de forma modular, y su relativa simplicidad y facilidad de manipulación. Casi todas las aplicaciones del fago filamentoso dependen de su capacidad para mostrar polipéptidos en la superficie del virio como fusiones a proteínas de la capa de fago (Tabla 1). El modo de visualización determina el tamaño máximo tolerado del polipéptido fusionado, su número de copia en el fago, y potencialmente, la estructura del polipéptido mostrado. La visualización se puede lograr fusionando ADN codificando un polipéptido de interés directamente para el gen codificando una proteína de la capa dentro del genoma fago Sin embargo, con mucha más frecuencia, sólo se modifica una copia de la proteína de la capa en presencia de una segunda copia de tipo salvaje (por ejemplo, se muestra el tipo 88 si tanto los genes de tipo recombinante como los de tipo salvaje pVIII están en el genoma de los fagos, se muestra el tipo 8+8 si el Parmley y Smith (1988), McConnell et al. (1994), Rondot et al. (2001) Híbrido (sistemas de tipo 33 y 3+3) Sistema del tipo 3+3 <1 2 Smith y Scott (1993), Smith y Petrenko (1997) pVI Híbrido (sistema del tipo 6+6) Sí <1 2 > 25 kDa Hufton et al. (1999) pVII Sistema totalmente recombinante (sistema del tipo 7) No 5 > 25 kDa Kwasnikowski et al. (2005) Híbrido (sistema del tipo 7+7) (1999) pVIII Totalmente recombinante (fago paisajístico; sistema del tipo 8)No 2700 3 5-8 residuos Kishchenko et al. (1994), Petrenko et al. (1996) Híbrido (sistemas del tipo 88 y 8+8) Sistema del tipo 8+8 +1300 2 >50 kDa Scott and Smith (1990), Greenwood et al. (1991), Smith and Fernandez (2004) piX Totalmente recombinante (sistema del tipo 9+9 *) Sí 5 > 25 kDa Gao et al. (2002) Híbrido (sistema del tipo 9+9) No <1 2 Gao et al. (1999), Shi et al. (2010), Tornetta et al. (2010) 1 Los asteriscos indican la presencia de copias no funcionales de la proteína de la capa en el genoma del fago de ayuda utilizado para rescatar a un phagemid cuya proteína de capa se ha fusiona 2 El número de copia depende del tamaño del polipéptido; típicamente <1 copia por partícula de fago, pero para la visualización del péptido pVIII puede ser de hasta un 15% de moléculas de pVIII en viriones híbridos. 3 El número total de moléculas de pVIII depende del tamaño del genoma del fago; se añade una molécula de pVIII por cada 2,3 nucleótidos en el genoma viral. El gen recombinante 8 se encuentra en un plásmido con un origen fago de replicación) resultando en un virión híbrido con dos tipos diferentes de proteína de capa dada. Con mucho, las proteínas de capa más comúnmente utilizadas para la visualización son la proteína de capa principal, pVIII, y la proteína de capa menor, pIII, con la mayor ventaja de que la primera es la visualización de número de copia más alto (hasta un 15% de moléculas de capa recombinante en un virión híbrido, al menos para fusiones cortas de péptidos), y de que esta última es la capacidad de mostrar algunas proteínas plegadas en un número de copia apreciable (1-5 por partícula de fago). Si bien pVIII muestra proteínas plegadas en un fago híbrido es posible, normalmente resulta en un número de copia de mucho menos de 1 por virio (Sidhu et al., 2000). Para los fines de esta revisión, utilizamos el término "exhibición de fagos" para referirse a un fago filamentoso recombinante que muestra una sola secuencia de polipéptidos en su superficie (o más raramente, visualización biespecífica lograda mediante la fusión de polipéptidos a dos proteínas capsidas diferentes), y el término "biblioteca de fagotismo" para referirse a un grupo diverso de fagobios filamentosos recombinantes que muestran una serie de variantes de polipéptidos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos; péptidos). Tales bibliotecas son normalmente examinadas por ciclos iterativos de panificación contra una proteína de interés inmovilizada (por ejemplo, antígeno para bibliotecas de anticuerpos visualizadas por fago; anticuerpo para bibliotecas de péptidos visualizadas por fago) seguidos de amplificación del fago unido en células coli. El trabajo temprano con antifagos antisera generado para la clasificación de especies demostró que el fago virión filamentoso es altamente inmunogénico en ausencia de adyuvantes (Meynell y Lawn, 1968 ) y que sólo la proteína principal de la capa, pVIII, y la proteína menor de la capa, pIII, son blanco de anticuerpos (Pratt et al., 1969; Woolford et al., 1977). Así, la idea de utilizar el fago como portador para obtener anticuerpos contra haptens o polipéptidos poco inmunogénicos fue una extensión natural de la capacidad de mostrar secuencias exógenas recombinantes en su superficie, que fue demostrada por primera vez por de la Cruz et al. (1988). El bajo costo de producción de la partícula de fago, la alta estabilidad y el potencial para la exhibición de alta valencia del antígeno extraño (a través de la pantalla pVIII) también la hicieron atractiva como portadora de la vacuna, especialmente durante las primeras etapas de desarrollo de la tecnología proteica recombinante. Sobre la base de la tecnología existente de portador de péptidos, los primeros inmunogenes de la vacuna filamentosa a base de fago mostraron secuencias cortas de aminoácidos derivadas directamente de proteínas de interés como fusiones recombinantes a pVIII o pIII (de la Cruz et al., 1988). A medida que se desarrollaba y refinaba la tecnología bibliotecaria, los antígenos basados en fagos que mostraban ligandos péptidos de anticuerpos monoclonales (seleccionados de bibliotecas de péptidos aleatorias utilizando el anticuerpo, simulando así con diversos grados de éxito el epítopo plegado del anticuerpo en su antígeno cognado; Geysen et al., 1986; Knittelfelder et al., 2009) también se generaban con fines de inmunización, con el objetivo de provocar anticuerpos antipéptidos que también reconocían la proteína nativa. Cuando se muestran en los fagos, los péptidos que codifican las regiones repetitivas de la proteína de circunsporozoita malarial y la proteína de superficie de merozoita 1 fueron inmunogénicos en ratones y conejos (de la Cruz et al., 1988; Greenwood et al., 1991; Willis et al., 1993; Demangel et al., 1996), y anticuerpos levantados contra esta última reacción cruzada con la proteína de larga duración. Varios determinantes péptidos (o imitaciones de los mismos) del VIH-1 gp120, gp41, gag y transcriptasa inversa fueron inmunogénicos cuando se exhibieron o conjugaron con proteínas de la capa de los fagos (Minenkova et al., 1993; di Marzo Veronese et al., 1994; De Berardinis et al., 1999; Scala et al., 1999; Chen et al., 2001; van Houten et al., 2006 van Houten et al.,, 2010, y en algunos casos provocaron anticuerpos que fueron capaces de neutralizar débilmente virus adaptados al laboratorio (di Marzo Veronese et al., 1994; Scala et al., 1999). La lista de infecciones animales y humanas para las que se han desarrollado inmunogenes péptidos fagosos a medida que las vacunas conducen continúa expandiéndose e incluye patógenos bacterianos, fúngicos, virales y parasitarios (Tabla 2). Si bien en algunos casos los resultados de estos estudios han sido prometedores, las vacunas péptidas basadas en anticuerpos epitópicos ya no son un área de investigación activa por varias razones: i) en muchos casos, los péptidos imitan de forma incompleta o inadecuada epítopos en proteínas plegadas (Irving et al., 2010; véase más adelante); ii) los anticuerpos contra un solo epítopo puede ser de utilidad limitada, especialmente para patógenos altamente variables (Van Regenmortel, 2012); y iii) para patógenos para los que se generan respuestas inmunes protectoras de manera eficiente durante la infección natural, las Más recientemente, los fagos péptidos han sido utilizados en intentos de generar respuestas terapéuticas de anticuerpos para enfermedades crónicas, cáncer, inmunoterapia e inmunocontracepción. Inmunización con fagos que muestran la enfermedad de Alzheimer Los péptidos fibriles β-amiloide produjeron anticuerpos antiagregantes en ratones y cobayas (Frenkel et al., 2000 (Frenkel et al., 2003 Esposito et al., 2008; Tanaka et al., 2011), posiblemente redujo la formación de placa amiloide en ratones (Frenkel et al., 2003; Solomon, 2005; Esposito et al., 2008), y pudo haber ayudado a mantener las habilidades cognitivas en un modelo transgénico de ratón de la enfermedad de Alzheimer (Lavie et al., 2004) ; sin embargo, no está claro cómo se proponen estos anticuerpos para cruzar la barrera hematoencefá (2001) encontró que los anticuerpos criados en ratones contra un péptido ERBB2/HER2 podrían inhibir la proliferación de células de cáncer de mama. Fage mostrando ligandos péptidos de un anticuerpo anti-IgE provocó anticuerpos que unieron moléculas purificadas de IgE (Rudolf et al., 1998), que pueden ser útiles en inmunoterapia de alergia. Varias estrategias para las vacunas anticonceptivas basadas en fagos se han propuesto para el control de las poblaciones animales. Por ejemplo, la inmunización con fagos que muestran péptidos hormonales estimulantes de folículos en pVIII provocó anticuerpos que afectaron la fertilidad de ratones y ovejas (Abdennebi et al., 1999). También se encuentran en desarrollo los péptidos de los antígenos espermáticos (Samoylova et al., 2012a,b) y la hormona liberadora de gonadotropina (Samoylov et al., 2012). En su mayor parte, los péptidos que se muestran en los fagos provocan anticuerpos en animales experimentales (Tabla 2), aunque esto depende de las características del péptido y del método de su exhibición: las fusiones pIII tienden hacia una inmunogenicidad menor que las fusiones pVIII (Greenwood et al., 1991) posiblemente debido a diferencias en el número de copias (pIII: 1-5 copias vs. pVIII: estimadas en varios cientos de copias; Malik et al., 1996). De hecho, el fago es al menos tan inmunogénico como las proteínas portadoras tradicionales, como la albúmina sérica bovina (BSA) y la hemocianina de la cojera de ojo de llave (KLH; Melzer et al., 2003; Su et al., 2007), y tiene comparativamente pocos epítopos de células B endógenas para desviar la respuesta de anticuerpos de su objetivo previsto (Henry et al., 2011). Excepto los epítopos pequeños que pueden ser representados con precisión por una secuencia de aminoácidos cortos contiguos, sin embargo, ha sido extremadamente difícil provocar respuestas de anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con epitopos de proteínas nativas utilizando péptidos. El cuadro general es considerablemente más sombrío que el descrito en la Tabla 2, ya que en varios estudios: (i) los ligandos péptidos seleccionados de las bibliotecas de los fagos fueron clasificados por los autores como imitaciones de epitopos discontinuos si no presentaban una secuencia homológica obvia a la proteína nativa, lo que es una débil evidencia de no linealidad, o (ii) la evidencia de reactividad cruzada de anticuerpos provocada por la inmunización con péptidos discontinuados con proteína nativa no fue obligatoria. Irving et al. (2010) describen al menos una razón de esta falta de éxito: parece que los antígenos péptidos provocan un conjunto de anticuerpos topológicamente restringidos que son en gran medida incapaces de reconocer epitopos discontinuas o complejos en las biomoléculas más grandes. Mientras que el péptido puede imitar la química de un epítopo dado en una proteína plegada (permitiendo que se cruce con un anticuerpo dirigido), siendo una molécula más pequeña, no puede imitar la topología del epítopo completo de ese anticuerpo. A pesar de esto, el fago filamentoso sigue siendo muy útil como portador de péptidos con estructuras secundarias relativamente simples, que pueden ser estabilizados mediante el anclaje a las proteínas de la capa (Henry et al., 2011). Esto puede ser especialmente cierto de los péptidos con mala inmunogenicidad inherente, que puede aumentarse por la visualización de alta valencia y adyuvante asociado a los fago (véase Mecanismos inmunológicos de la vacunación con fago filamentoso más abajo). El fago filamentoso se ha utilizado en menor medida como portador de epítopos péptidos de células T, principalmente El trabajo temprano, que demostró que la inmunización con fage obtuvo ayuda de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993), fue confirmado por varios estudios posteriores (De Berardinis et al., 1999; Ulivieri et al., 2008). Desde la perspectiva de la vacunación contra enfermedades infecciosas, De Berardinis et al. (2000) mostraron que un epitope citotóxico de células T (CTL) de la transcriptasa inversa VIH-1 podría provocar CTLs específicos de antígenos in vitro e in vivo sin adición de epitopos de células T de ayuda exógena, presumiblemente ya que están presentes en las proteínas de la capa de fago (Mascolo et al., 2007). Del mismo modo, se observó un uso eficiente de CTLs frente a los epítopos de células T de los fagos de virus de la hepatitis B (Wan et al., 2001) y Candida albicans (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2006 Wang et al., 2014d, que, junto con otros tipos de respuestas inmunes, protegían a los ratones contra la candidiasis sistémica. La vacunación con una combinación de péptidos phagedisplayed provocó CTLs específicos de antígenos que resultaron eficaces en la reducción de la cisticercosis porcina en un ensayo controlado aleatorio (Manoutcharian et al., 2004; Morales et al., 2008). Mientras que las correlaciones de la protección inmune inducida por la vacuna para las enfermedades infecciosas, donde se conocen, son casi exclusivamente anticuerpos séricos o mucosas (Plotkin, 2010), En ciertas aplicaciones de la vacuna, el fago filamentoso se ha utilizado como portador de moléculas más grandes que serían inmunogénicas incluso en aislamiento. Inicialmente, las principales ventajas de la exhibición de estos antígenos de los fago eran la velocidad, facilidad de purificación y bajo costo de producción (Gram et al., 1993). E. coli F17a-G adhesin (Van Gerven et al., 2008), antígeno del núcleo de la hepatitis B (Bahadir et al., 2011), y antígeno de la superficie de la hepatitis B (Balcioglu et al., 2014) todas produjeron respuestas de anticuerpos cuando se exhibieron en la pIII, aunque ninguno de estos estudios comparó la inmunogenicidad de las Phage que muestra Schistosoma mansoni glutatión S-transferasa en pIII provocó una respuesta de anticuerpos que fue tanto más alta en el título como de diferentes isotipos en comparación con la inmunización con la proteína sola (Rao et al., 2003). Dos estudios de vacunas antiidiotípicas han utilizado el fago como portador de fragmentos de anticuerpos que contienen idiotipos inmunogénicos. Inmunización con fago que muestra el 1E10 idiotaype scFv (mimicking a Vibrio anguillarum surface epitope) provocó anticuerpos que protegían a los peces babosos de Vibrio anguillarum challenge (Xia et al., 2005). Una vacuna de idiotipo de tumor específico de phage-BCL1 vinculada químicamente fue débilmente inmunogénica en ratones pero extendió el tiempo de supervivencia en un modelo de linfoma de células B (Roehnisch et al., 2013), y fue bien tolerada e inmunogénica en pacientes con mieloma múltiple (Roehnisch et al., 2014). Un estudio de vacunación de ADN con antilaminarina scFv encontró que el ADN codificando una proteína de fusión pIII-scFv provocó respuestas inmunes humorales y mediadas por células más fuertes que el ADN codificando el scFv solo (Cuesta et al., 2006), sugiriendo que bajo algunas circunstancias, los epitopos de células T de fago endógeno pueden mejorar la inmunogenicidad de proteínas asociadas. Tomados en conjunto, los resultados de estos estudios muestran que como partícula similar a un virus de partículas, el fago filamentoso probablemente desencadena diferentes tipos de respuestas inmunitarias que los antígenos de proteínas recombinantes, y proporciona ayuda adicional de células T a las proteínas exhibidas o conjugadas. Sin embargo, el bajo número de copias de proteínas visualizadas pIII, así como la adyuvancia potencialmente no deseada asociada a los fagos, pueden hacer de la exhibición de proteínas recombinantes por fago una elección vacunal subóptima. Aunque nuestra comprensión de la respuesta inmune contra los palidezes fagosas filamentosas en comparación con antígenos modelo clásicos como la ovalbúmina, los últimos trabajos han comenzado a arrojar luz sobre los mecanismos inmunes activados en respuesta a la vacunación de los fagos (Figura 1). La partícula del fago es inmunogénica sin adyuvante en todas las especies probadas hasta la fecha, incluyendo ratones (Willis et al., 1993), ratas (Dente et al., 1994), conejos (de la Cruz et al., 1988), cobayas (Frenkel et al., 2000; Kim et al., 2004), peces (Coull et al., 1996; Xia et al., 2005), primates no humanos (Chen et al., 2001) y humanos (Roehnisch et al., 2014). Se han empleado varias vías de inmunización, incluyendo administración oral (Delmastro et al., 1997) así como subcutánea (Grabowska et al., 2000), intraperitoneal (van Houten et al., 2006), intramuscular (Samoylova et al., 2012a), intravenosa (Vaks y Benhar, 2011), e inyección intradérmica (Roehnisch et al., 2013); ningún estudio publicado ha comparado directamente el efecto de la vía de administración sobre la inmunogenicidad fagosa filamentosa. Los anticuerpos se generan contra sólo tres sitios principales en el virión: (i) los N-terminal expuestos a la superficie 12 de la retícula monomérica pVIII (Terry et al., 1997; Kneissel et al., 1999) ; (ii) los dominios N-terminal N1 y N2 de la pIII (van Houten et al., 2010); y (iii) lipopolisacárido bacteriano (LPS) incrustado en la capa de fago (Henry et al., 2011). En ratones, los títulos de anticuerpos séricos contra el fago suelen alcanzar 1:10 5 -1:10 6 después de 2-3 inmunizaciones, y se mantienen durante al menos 1 año postinmunización (Frenkel et al., 2000). Las respuestas primarias de anticuerpos contra el fago parecen estar compuestas por una mezcla de isotipos IgM e IgG2b en ratones C57BL/6, mientras que las respuestas secundarias de anticuerpos están compuestas principalmente de isotipos IgG1 e IgG2b, con una menor contribución de isotipos IgG2c e IgG3 (Hashiguchi et al., 2010). La supresión de los dominios N1 y N2 expuestos a la superficie de pIII produce una forma truncada de esta proteína que no provoca anticuerpos, sino que también produce una partícula de fago no infecciosa con menor inmunogenicidad general (van Houten et al., 2010). Como partícula similar a un virus, el fago filamentoso envuelve múltiples brazos del sistema inmune, comenzando con efectores celulares de inmunidad innata (macrofagos, neutrófilos y posiblemente células asesinas naturales), que son reclutados en sitios tumorales por fago que muestran moieties tumorales. El fago probablemente activa las respuestas de anticuerpos independientes de células T, ya sea a través de ligandos TLR asociados a los fagoes o enlaces cruzados por la celosía pVIII. Después del procesamiento por células que presentan antígenos, los péptidos derivados de los fagotes se presentan en la clase II de la MHC y en la clase I de la MHC, resultando en la activación de CTL de corta duración y una serie de tipos de células T ayudantes, que ayudan a la memoria primaria CTL y respuestas de células B de alta afinidad. Las fronteras en la microbiología www.fronterizosin.orgAunque los títulos de anticuerpos antifagos séricos parecen ser al menos parcialmente dependientes de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993; De Berardinis et al., 1999; van Houten et al., 2010), muchas células B específicas de pVIII circulantes en la sangre carecen de mutación somática incluso después de repetidas inmunizaciones quincenales, lo que sugiere que bajo estas condiciones, el fago activa respuestas de células B independientes de células T además de respuestas dependientes de células T de alta afinidad (Murira, 2014). Las partículas filamentarias de fagos pueden ser procesadas por células presentadoras de antígenos y presentadas en moléculas de clase II de MHC (Gaubin et al., 2003; Ulivieri et al., 2008) y pueden activar T H 1, T H 2 y T H 17 células T ayudantes (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2014d). Las respuestas antifagos T H 2 se mejoraron mediante la visualización de péptidos CTLA-4 fusionados con pIII (Kajihara et al., 2000). Las proteínas de Phage también pueden presentarse de forma cruzada en moléculas de clase I de MHC (Wan et al., 2005) y pueden producir dos ondas de respuestas CTL, que consisten primero en CTL de corta duración y después de CTL de memoria de larga duración que requieren ayuda de células CD4 + T (Del Pozzo et al., Estos últimos CTLs median una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (Fang et al., 2005; Del Pozzo et al., 2010). La partícula de fago es autoadyuvante a través de múltiples mecanismos. El LPS derivado de la pared de la célula huésped realza la inmunogenicidad del virión, y su eliminación por cromatografía de polimixina B reduce los títulos de anticuerpos contra las proteínas de capa de fago (Grabowska et al., 2000). El genoma de ADN singlestranded del fago contiene motivos CpG y también puede tener un efecto adyuvante. La respuesta de anticuerpos contra el fago es totalmente dependiente de la señalización de MyD88 y se modula mediante la estimulación de varios receptores de tipo peaje (Hashiguchi et al., 2010), indicando que la inmunidad innata juega un papel importante pero en gran Los estudios de biodistribución del fago después de la inyección intravenosa muestran que se elimina de la sangre en cuestión de horas a través del sistema reticuloendotelial (Molenaar et al., 2002), particularmente del hígado y el bazo, donde se retiene durante días (Zou et al., 2004), potencialmente activando respuestas de células B de zona marginal. Por lo tanto, el fago filamentoso no sólo es un portador altamente inmunogénico, sino que, gracias a la activación de una gama de respuestas inmunes innatas y adaptativas, sirve como un excelente modelo de antígeno de partícula similar al virus. Mucho antes de la identificación del fago filamentoso, otros tipos de bacteriofago ya se estaban utilizando para la terapia antibacteriana en la antigua Unión Soviética y Europa Oriental (revisado en Sulakvelidze et al., 2001). El fago filamentoso, con su ciclo de vida no lítico, tiene usos clínicos menos obvios, a pesar de que la especificidad del huésped de Inovirus y Plectrovirus incluye muchos patógenos de importancia médica, incluyendo Salmonella, E. coli, Shigella, Pseudomonas, Clostridium y Micoplasma. En un esfuerzo por mejorar su actividad bactericida, los fagoces filamentosos genéticamente modificados se han utilizado como "caballo de Troya" para introducir diversos agentes antibacterianos en las células. Los fagos M13 y Pf3 fueron diseñados para expresar la restricción BglII endonucleasa (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004), lambda fage S holin (Hagens y Blasi, 2003) o una proteína activadora letal del gen catabolita (Moradpour et al., 2009) que mató eficazmente a las células E. coli y Pseudomonas aeruginosa, respectivamente, sin liberación concomitante de LPS (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004). Lamentablemente, la rápida aparición de bacterias resistentes con pili F modificado representa un obstáculo importante y posiblemente insuperable a este enfoque. Sin embargo, hay algunos indicios de que los fagos filamentosos pueden ejercer efectos útiles pero más sutiles sobre sus hospedadores bacterianos que pueden no resultar en el desarrollo de resistencia a la infección. Varios estudios han reportado aumento de la sensibilidad antibiótica en poblaciones bacterianas infectadas simultáneamente con fago filamentoso tipo salvaje (Hagens et al., 2006) o fago diseñado para reprimir la respuesta celular SOS (Lu y Collins, 2009). La infección filamentosa f1 inhibió la formación de biopelículas en E. coli, pero no madura (May et al., 2011). Así, los fago filamentosos no modificados pueden ser de interés futuro como elementos de terapia combinada contra ciertas infecciones resistentes a fármacos. Las aplicaciones terapéuticas más avanzadas del fago filamentoso emergen cuando se modifica para expresar una fracción dirigida específica para células patógenas y/o proteínas para el tratamiento de enfermedades infecciosas, cáncer y autoinmunidad (Figura 2). El primer trabajo en esta área mostró como prueba de concepto que los fagos codificando un cassette de expresión GFP y mostrando un HER2specific scFv en todas las copias de pIII fueron internalizados en células tumorales de mama, resultando en la expresión GFP (Poul y Marks, 1999). M13 o fd fagos mostrando un péptido objetivo o fragmento de anticuerpos y amarrados a cloranfenicol por un crosslinker lábil eran inhibidores más potentes del crecimiento de Staphylococcus aureus que el cloranfenicol libre de alta concentración (Yacoby et al., 2006; Vaks y Benhar, 2011). M13 fagos cargados con doxorubicina y mostrando un péptido objetivo en células de cáncer de próstata específicamente muertas en pIII in vitro (Ghosh et al., péptido tumoral específico: proteínas de fusión de pVIII seleccionadas de "paisaje" fage (Romanov et al., 2001; Abbineni et al., 2010; Fagbohun et al., 2012 Fagbohun et al., 2013 Lang et al., 2014; Wang et al., 2014a) fueron capaces de dirigir y entregar siRNA-, paclitaxel-, y liposomas que contienen doxorubicina a las células tumorales (Jayanna et al., 2010a; Wang et al., 2010a Wang et al.,, b, c, 2014b Bedi et al., 2011 Bedi et al.,, 2013 Bedi et al.,, 2014 ; eran tasas de remisión tumoral no tóxicas y aumentadas en modelos de ratón (Jayanna et al., 2010b; Wang et Usando el modelo de tumor B16-OVA, Eriksson et al. (2007) mostraron que los fagos que mostraban péptidos y/o Fabs específicos para antígenos tumorales retrasaron el crecimiento del tumor y mejoraron la supervivencia, debido en gran parte a la activación de macrófagos asociados al tumor y al reclutamiento de neutrófilos en el sitio del tumor (Eriksson et al., 2009). Phage mostrando un scFv frente a fibriles β-amiloide mostró promesa como diagnóstico (Frenkel y Solomon, 2002) y terapéutico (Solomon, 2008) reactivo para la enfermedad de Alzheimer y Parkinson debido a la capacidad imprevista del fago para penetrar en el tejido cerebral (Ksendzovsky et al., 2012). Del mismo modo, los fagos que muestran un epítopo péptido inmunodominante derivado de la mielina oligodendrocyte glucoproteína desmielinizantes patógenos agotados anticuerpos en el tejido cerebral en el modelo murina experimental de encefalomielitis autoinmune de esclerosis múltiple (Rakover et al., 2010). Las ventajas del fago filamentoso en este contexto sobre los conjugados tradicionales anticuerpo-fármaco o proteico-péptido son: i) su capacidad para transportar cantidades muy altas de fármaco o péptido, y ii) su capacidad para acceder a compartimentos anatómicos que generalmente no pueden ser alcanzados por la administración sistémica de una proteína. A diferencia de la mayoría de los biológicos terapéuticos, la producción del fago filamentoso en bacterias complica su uso en los seres humanos de varias maneras. En primer lugar, los preparados crudos de fago filamentoso suelen contener niveles muy altos de SLP contaminante, en el rango de 10 unidades de endotoxina 2-10 4 (EU)/ml (Boratynski et al., 2004; Branston et al., 2015), que tienen el potencial de causar reacciones adversas graves. LPS no se elimina completamente por precipitación de polietilenglicol o centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio (Smith y Gingrich, 2005; Branston et al., 2015), pero sus niveles se pueden reducir drásticamente utilizando pasos de purificación adicionales como cromatografía de exclusión de tamaño (Boratynski et al., 2004; Zakharova et al., 2005), cromatografía de polimixina B (Grabowska et al., 2000), y tratamiento con detergentes como Triton X-100 o Triton X-114 (Roehnisch et al., 2014; Branston et al., 2015). Estas estrategias alcanzan de forma rutinaria niveles de endotoxina < 1 EU/ml medidos por el lisato de limulo amebocito (LAL), muy por debajo del límite de la FDA para la administración parenteral de 5 EU/kg de peso corporal/dosis, aunque sigue habiendo preocupaciones con respecto a la presencia de LPS residuales asociadas al virión que pueden ser indetectables.Una segunda consecuencia, y tal vez inevitable, de la producción bacteriana del fago filamentoso es la heterogeneidad inherente del tamaño de las partículas y el espectro de contaminantes solubles y asociados al virión del huésped, que pueden ser causa de problemas de seguridad y restringir su uso a los grupos de alto riesgo. Se han propuesto muchos tipos de variantes de bacteriofago y fagos diseñados, incluido el fago filamentoso, para uso profiláctico ex vivo en seguridad alimentaria, ya sea en la tubería de producción (revisado en Dalmasso et al., 2014) o para la detección de patógenos transmitidos por alimentos postproducción (revisado en Schmelcher y Loessner, 2014). Fago filamentoso que muestra una etiqueta de tetracisteína en pIII se utilizaron para detectar células E. coli a través de tinción con tinte biarsenical. Biosensores basados en resonancia de plasmón superficial (Nanduri et al., 2007), transductores piezoeléctricos (Olsen et al., 2006), dicroísmo lineal (Pacheco-Gomez et al., 2012), y tecnología de sensores magnetoelásticos (Lakshmanan et al., 2007; Huang et al., 2009) fueron ideados utilizando fagos filamentosos que muestran scFv o conjugados a IgG enteros contra E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium y Bacillus anthracis con límites de detección en el orden de 10 2-10 6 células bacterianas/ml. Prueba de concepto ha sido demostrado para el uso de tales biosensores a base de fagos para detectar contaminación bacteriana de productos vivos (Li et al., 2010 La partícula fagosa filamentosa está encerrada por un capsid de proteína similar a la varilla, de 1000 nm de largo y 5 nm de ancho, formado casi enteramente por monómeros de pVIII superpuestos, cada uno de los cuales se encuentra en 27 angstroms de su vecino más cercano y expone dos grupos de aminas, así como al menos tres grupos de carboxilo (Henry et al., 2011). La regularidad de la celosía de pVIII de fagos y su diversidad de grupos químicamente direccionables la convierten en un andamio ideal para la bioconjugación (Figura 3). El enfoque más utilizado es la funcionalización de grupos de aminas con ésteres NHS (van Houten et al., 2006 (van Houten et al., 2010 Yacoby et al., 2006), aunque esto puede resultar en una a Los grupos de carboxilo y los residuos de tirosina también se pueden funcionalizar utilizando acoplamiento de carbodiimida y acoplamiento de diazonio, respectivamente (Li et al., 2010a). Carrico et al. (2012) desarrollaron métodos para etiquetar específicamente pVIII N-termina sin modificación de residuos de lisina expuestos a través de una reacción de formación de transaminación-oxima en dos pasos. La modificación específica de las proteínas de la capa de fago es aún más fácil de lograr usando péptidos modificados genéticamente (Ng et al., 2012) o enzimas (Chen et al., 2007; Hess et al., 2012), pero esto puede ser engorroso y es menos general en aplicación. Durante más de una década, el interés en el fago filamentoso como bloque de construcción de nanomateriales ha ido creciendo debido a sus propiedades fisicoquímicas únicas, con aplicaciones emergentes en magnet Desde hace mucho tiempo se sabe que por encima de un determinado umbral de concentración, el fago puede formar suspensiones cristalinas ordenadas (Welsh et al., 1996). Lee et al. (2002) diseñaron un fago M13 para mostrar un péptido de unión ZnS en pIII y demostraron que, en presencia de nanopartículas ZnS, se autoensamblan en biomateriales de película altamente ordenados que se pueden alinear utilizando campos magnéticos. Aprovechando la capacidad de mostrar péptidos específicos de sustratos en lugares conocidos en el filamento fagotico Hess et al., 2012), este pionero FIGURE 3 Grupos químicamente direccionables de la capa principal de bacteriofago filamentoso. El virión del fago filamentoso se compone de 2.500-4.000 copias superpuestas de la proteína 50-residue Cada monómero tiene una serie de grupos químicamente direccionables disponibles para la conjugación bioortogonal, incluyendo dos grupos de aminas primarias (mostradas en rojo), tres grupos de carboxilo (mostradas en azul) y dos grupos de hidroxilo (mostradas en verde). Los 12 residuos N-terminales generalmente expuestos al sistema inmune para la unión de anticuerpos están en negrita subrayado. Figura adaptada a partir de datos estructurales de Marvin, 1990, disponible libremente en bases de datos PDB y SCOPe. el trabajo se convirtió en la base para la construcción de nanomateriales bidimensionales y tridimensionales con arquitecturas más avanzadas, incluyendo nanohilos semiconductores (Mao et al., 2003 (Mao et al.,, 2004, nanopartículas, y nanocomposites (Oh et al., 2012; Chen et al., 2014). Utilizando los péptidos híbridos de unión de oro y Co 3 O 4 en pVIII como andamio para ensamblar nanohilos en multicapas de polielectrolitos, Nam et al. (2006) produjeron una batería de iones de litio delgada y flexible, que podía ser estampada en colectores de corriente de microbanda de platino (Nam et al., 2008). Las propiedades electroquímicas de estas baterías se mejoraron aún más a través de la visualización pIII de péptidos de unión de nanotubos de carbono de una sola pared (Lee et al., 2009), ofreciendo un enfoque para la producción sostenible de electrodos nanoestructurados a partir de materiales de partida mal conductivos. Los nanomateriales a base de fage han encontrado aplicaciones en la imagen del cáncer (Ghosh et al., 2012b; Yi et al., 2012), la división del agua fotocatalítica (Nam et al., 2010a; Neltner et al., 2010), la recolección de luz (Nam et al., 2010b; Chen et al., 2013), las tecnologías fotorespuestas (Murugesan et al., 2013), los electrodos neuronales (Kim et al., 2014), y la generación de energía piezoeléctrica (Murugesan et al., 2013). Así, las propiedades fisicoquímicas únicas del fago, en combinación con la visualización modular de péptidos y proteínas con especificidad de unión conocida, han desove materiales totalmente nuevos con diversas aplicaciones. Vale la pena señalar que las propiedades bio La alineación magnética de los fagos filamentosos de alta concentración en solución puede ordenar parcialmente el ADN, el ARN, las proteínas y otras biomoléculas para la medición de las interacciones de acoplamiento dipolar (Hansen et al., 1998 (Hansen et al., 2000 Dahlke Ojennus et al., 1999) en espectroscopia NMR. Debido a su gran tamaño de población, tiempos de generación cortos, tamaños de genoma pequeños y facilidad de manipulación, diversos bacteriófagos filamentosos y no filamentosos se han utilizado como modelos de evolución experimental (revisado en Husimi, 1989; Wichman y Brown, 2010; Kawecki et al., 2012; Hall et al., 2013). El fago filamentoso tiene usos prácticos adicionales en ingeniería proteica y evolución proteica dirigida, debido a su tolerancia única de modificaciones genéticas que permiten mostrar biomolécula En primer lugar, entre estas aplicaciones se encuentra la maduración in vitro de la afinidad de los fragmentos de anticuerpos mostrados en pIII. Las bibliotecas de variantes Fabs y anticuerpos de cadena única pueden generarse mediante mutagenesis aleatoria o sitedirected y seleccionarse sobre la base de una unión mejorada o alterada, imitando más o menos la estrategia de evolución somática del sistema inmunitario (Marks et al., 1992; Bradbury et al., 2011). Sin embargo, otros sistemas de visualización in vitro, como la visualización de levaduras, tienen importantes ventajas sobre el fago filamentoso para la maduración de afinidad (aunque cada tecnología de visualización tiene fortalezas complementarias; Koide y Koide, 2012) y, independientemente del método de visualización, la selección de variantes "mejoradas" puede ser lenta y engorrosa. Se han desarrollado métodos iterativos para combinar mutaciones de diseño computacional (Lippow et Recientemente, Esvelt et al. (2011) desarrollaron una nueva estrategia para la evolución dirigida de las proteínas fagosas filamentosas, denominadas evolución continua asistida por fagos (PACE), que permite múltiples rondas de evolución por día con poca intervención experimental.Los autores diseñaron el fago M13 para codificar una proteína exógena (sujeto a la evolución dirigida), cuya actividad funcional desencadena la expresión del gen III de un plasmido accesorio; variantes de la proteína exógena surgen por mutagenesis aleatoria durante la replicación de fagos, cuya tasa puede aumentarse mediante la expresión inducible de polimerasas de ADN propensas a errores. Al suministrar cantidades limitadas de células E. coli receptivas a las variantes de fagosas diseñadas, Esvelt et al. (2011) vincula elegantemente la infectividad y producción de fagos con la presencia de un fenotipo proteico deseado. Carlson et al. (2014) más tarde mostró que la severidad de selección PACE podría ser modulada proporcionando pequeñas cantidades de pIII independientemente del fenotipo proteico, y funciones proteicas indeseables seleccionadas negativamente al vincularlas a la expresión de una variante pIII truncada que altera la infectividad en una forma negativa dominante. PACE se limita actualmente a funciones proteicas que pueden estar vinculadas de alguna manera a la expresión de un reportero del gen III, tales como interacción proteína-proteína, recombinación, unión ADN o ARN, y catálisis enzimática (Meyer y Ellington, 2011). Este enfoque representa una vía prometedora para la investigación básica en evolución molecular (Dickinson et al., 2013) y biología sintética, incluyendo ingeniería de anticuerpos. El bacteriofago filamentario se ha recuperado de diversas fuentes ambientales, incluyendo el suelo (Murugaiyan et al., 2011), el agua dulce costera (Xue et al., 2012), los lagos alpinos (Hofer y Sommaruga, 2001) y las bacterias del mar profundo (Jian et al., 2012), pero tal vez no sorprendentemente el intestino humano (Kim et al., 2011). El "fageoma" ambiental en el suelo y el agua representan la mayor fuente de replicación de ADN en el planeta, y se estima que contiene más de 10 30 partículas virales (Ashelford et al., 2003; Chibani-Chennoufi et al., 2004; Suttle, 2005). Los pocos estudios que intentan investigar la ecología ambiental de los fagos filamentosos utilizando técnicas clásicas de microbiología ambiental (normalmente observación directa por microscopía electrónica) encontraron que los fagos filamentosos constituían entre el 0 y el 100% de todas las partículas virales (Demuth et al., 1993; Pina et al., 1998; Hofer y Sommaruga, 2001). Hubo alguna evidencia de fluctuación estacional de poblaciones de fagos filamentosos junto con la abundancia relativa de bacterias heterotróficas libres (Hofer y Sommaruga, 2001). Los datos existentes sugieren que los fagos filamentosos son constituyentes menores de comunidades virales en agua dulce (Roux et al., 2012) y agua recuperada y potable (Rosario et al., 2009), pero tienen frecuencias mucho más altas en aguas residuales y aguas residuales (Cantalupo et al., 2011; Alhamlan et al., 2013), con la salvedad de que los sesgos inherentes a las metodologías para determinar estos datos (purificación de partículas virales, sesgos de secuenciación) no han sido bien validados. No hay datos que describan la dinámica poblacional de los fagos filamentosos y sus especies hospedantes en el entorno natural. A nivel individual de virus-bacterio, está claro que los fagos filamentosos pueden modular el fenotipo huésped, incluyendo la virulencia de importantes patógenos humanos y de cultivos. Esto puede ocurrir ya sea a través de efectos directos de replicación de fagos en el crecimiento celular y la fisiología, o, más típicamente, por transferencia horizontal de material genético contenido en episomas y/o profagos cromosómicamente integrados. Fago filamentoso templado también puede jugar un papel en la evolución del genoma (revisado en Canchaya et al., 2003). Tal vez el ejemplo mejor estudiado de modulación de virulencia por fago filamentoso es el de Vibrio cholerae, cuya virulencia completa requiere conversión lisogénica por la toxina del cólera codificante CTX La integración de los fagos CTXo se produce en sitios específicos del genoma; estas secuencias se introducen a través de la acción combinada de otro fagos filamentoso, fs2o, y un fagoso filamentoso satelital, TLC-KnŁo1 (Hassan et al., 2010). Así, las especies de fagos filamentosos interactúan y coevolucionan entre sí, además de sus anfitriones. La infección por fagos filamentosos se ha implicado en la virulencia de Yersinia pestis (Derbise et al., 2007), Neisseria meningitidis (Bille et al., 2005 (Bille et al., 2008, Vibrio parahemolyticus (Iida et al., 2001), E. coli 018:K1:H7 (Gonzalez et al., 2002), Xanthomonas campestris (Kamiunten and Wakimoto, 1982), y P. aeruginosa (Webb et al., 2004), aunque en la mayoría de estos casos, los mecanismos específicos que modulan la virulencia no son claros. La infección por fage puede potenciar o reprimir la virulencia dependiendo de las características del fago, la bacteria huésped y el medio ambiente, como es el caso del patógeno de la marchitez bacteriana Ralstonia solanacearum (Yamada, 2013). Dado que la infección resulta en la regulación de los pili utilizados para la entrada viral, el tratamiento del fago filamentoso se ha propuesto como un medio hipotético para inhibir la conjugación bacteriana y la transferencia génica horizontal, a fin de evitar la propagación de genes de resistencia a antibióticos (Lin et al., 2011). Finalmente, el fago filamentoso también puede desempeñar un papel futuro en la preservación de la biodiversidad de otros organismos en ecosistemas de riesgo. Se ha propuesto el uso del fago artificial en la biorremediación, ya sea mostrando fragmentos de anticuerpos de la especificidad deseada para la filtración de toxinas y contaminantes ambientales (Petrenko y Makowski, 1993), o como polímeros biodegradables que muestran péptidos seleccionados por su capacidad para agregar contaminantes, tales como residuos de arenas oleaginosas (Curtis et al., 2011 (Curtis et al., 2013 ). También se ha propuesto el uso del fago artificial que muestra péptidos que se unen específicamente a materiales inorgánicos en tecnologías de separación mineral más avanzadas y menos intrusivas (Curtis et al., 2009 ). El fago filamentoso representa un organismo altamente versátil cuyos usos van mucho más allá de la exhibición tradicional de fago y la selección de afinidad de anticuerpos y polipéptidos de especificidad deseada. Su alta inmunogenicidad y su capacidad para mostrar una variedad de antígenos superficiales hacen que el fago sea un excelente portador de la vacuna antipartículas, aunque su producción y preparación bacterianas probablemente limiten sus aplicaciones en vacunas humanas en la actualidad, a pesar de ser aparentemente seguros y bien tolerados en animales y personas. Las características imprevistas de la partícula antifago, como el cruce de la barrera hematoencefálica y la formación de fases cristalinas líquidas altamente ordenadas, han abierto nuevas vías de investigación en terapias para enfermedades crónicas y el diseño de nanomateriales. Nuestra comprensión comparativamente detallada de las interacciones del fagotismo filamentoso modelo con sus huéspedes bacterianos ha permitido a los investigadores aprovechar el ciclo de vida del fago para dirigir la evolución proteica en el laboratorio. Esperamos que un conocimiento más profundo de las interacciones entre los hospederos de fago a nivel ecológico pueda producir estrategias novedosas para controlar la pato Mientras se siguen desarrollando nuevas aplicaciones del fago filamentoso, es probable que el fago conserve su posición como caballo de batalla para el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos durante muchos años, incluso con el advenimiento de tecnologías competidoras. KH y JS concibieron y escribieron el manuscrito. MA-G leyó el manuscrito y comentó sobre el texto.

¿Qué hace que la tecnología de visualización de fage sea útil para otras aplicaciones?

Más allá de la visualización de los fagos: aplicaciones no tradicionales del bacteriofago filamentoso como portador de vacunas, andamio biológico terapéutico y bioconjugadorhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4523942/SHA: f00f183d0bce0091a02349ec1eab44a76a9bc4Autores: Henry, Kevin A.; Arbabi-Ghahroudi, Mehdi; Scott, Jamie K.Fecha: 2015-08-04DOI: 10.3389/fmicb.2015.00755Licencia: cc-byAbstract: Durante los últimos 25 años, la tecnología de exhibición de fagos ha sido una herramienta inestimable para los estudios de interacciones proteína-proteína. Sin embargo, las propiedades biológicas, bioquímicas y biofísicas inherentes al bacteriofago filamentoso, así como la facilidad de su manipulación genética, también lo convierten en una plataforma atractiva fuera del canon de exhibición tradicional de fagos. Esta revisión se centrará en las propiedades únicas del bacteriofago filamentoso y destacará sus diversas aplicaciones en la investigación actual. Se ponen énfasis en: (i) las ventajas del fago como portador de la vacuna, incluyendo su alta inmunogenicidad, relativa simplicidad antigénica y capacidad para activar una gama de respuestas inmunes, (ii) el potencial del fago como agente profiláctico y terapéutico para enfermedades infecciosas y crónicas, (iii) la regularidad de la retícula de la proteína de la capa principal del virio, que permite una variedad de bioconjugación y aplicaciones de química de la superficie, particularmente en nanomateriales, y (iv) el gran tamaño de la población del fago y los tiempos de generación rápidos, que lo convierten en un excelente sistema modelo para la evolución de proteínas dirigidas. A pesar de su ubicuidad en la biosfera, el trabajo metagenómico apenas está comenzando a explorar la ecología del fago filamentoso y su papel en la evolución de las poblaciones bacterianas. Así, el fago filamentoso representa un microorganismo robusto, barato y versátil cuyas aplicaciones de bioingeniería continúan expandiéndose en nuevas direcciones, aunque sus limitaciones en algunas esferas imponen obstáculos a su adopción y uso generalizados. Texto: El bacteriofago filamentoso (genera Inovirus y Plactrovirus) son virus no envueltos en forma de varilla de Escherichia coli, cuyos largos capsidios helicoidales encapsulan un genoma circular de ADN de una sola cadena. Después del descubrimiento independiente de bacteriofago por Twort (1915) y d 'Hérelle (1917), el primer fago filamentoso, f1, fue aislado en Loeb (1960) y más tarde caracterizado como un miembro de un grupo más grande de fago (Ff, incluyendo f1, M13, y fd fago) específico para el E. coli conjugativo F pilus (Hofschneider y Mueller-Jensen, 1963; Marvin y Hoffmann-Berling, 1963; Zinder et al., 1963; Salivar et al., 1964). Poco después, se descubrió un fago filamentoso que no utiliza F-pili para la entrada (If y Ike; Meynell y Lawn, 1968; Khatoon et al., 1972), y con el tiempo la lista de fago filamentoso conocido se ha expandido a más de 60 miembros (Fauquet et al., 2005), incluyendo especies templadas y grampositivas. El trabajo de varios grupos en los últimos 50 años ha contribuido a una comprensión relativamente sofisticada de la estructura filamentosa, biología y ciclo vital (revisado en Marvin, 1998; Rakonjac et al., 2011; Rakonjac, 2012). A mediados de la década de 1980, el principio de modificar el genoma de fago filamentoso para mostrar polipéptidos como fusiones para cubrir proteínas en la superficie del virión fue inventado por Smith y colegas (Smith, 1985 Sobre la base de las ideas descritas en Parmley y Smith (1988), los grupos de California, Alemania y el Reino Unido desarrollaron plataformas de fage-display para crear y proyectar bibliotecas de variantes de péptidos y proteínas plegadas (Bass et al., 1990; Devlin et al., 1990; McCafferty et al., 1990; Scott and Smith, 1990; Breitling et al., 1991; Kang et al., 1991). Esta tecnología permitió, por primera vez, la capacidad de conectar sin problemas la información genética con la función proteica para un gran número de variantes proteicas simultáneamente, y ha sido ampliamente y productivamente explotada en estudios de interacciones proteicas. Muchas excelentes revisiones están disponibles en bibliotecas de fage-display y sus aplicaciones (Kehoe y Kay, 2005; Bratkovic, 2010; Pande et al., 2010). Sin embargo, el fago tiene también una serie de propiedades estructurales y biológicas únicas que lo hacen altamente útil en áreas de investigación que han recibido mucha menos atención. Así, el propósito de esta revisión es destacar el trabajo reciente y actual utilizando fago filamentoso en aplicaciones nuevas y no tradicionales. Específicamente, nos referimos a proyectos que se basan en el fago filamentoso como un elemento clave, pero cuyo propósito principal no es la generación o cribado de bibliotecas fagodisplayed para obtener ligandos polipéptidos de unión. Estos tienden a caer en cuatro categorías principales de uso: i) fago filamentoso como portador de vacuna; ii) fago filamentoso diseñado como un agente biológico terapéutico en enfermedades infecciosas y crónicas; iii) fago filamentoso como un andamio para bioconjugación y química superficial; y iv) fago filamentoso como un motor para la evolución de variantes de proteínas exhibi Una sección final está dedicada a los últimos desarrollos en la ecología fagosa filamentosa y las interacciones fagosas-anfitriona. Los temas comunes compartidos entre todas estas aplicaciones incluyen las propiedades biológicas, inmunológicas y fisicoquímicas únicas del fago, su capacidad para mostrar una variedad de biomoléculas de forma modular, y su relativa simplicidad y facilidad de manipulación. Casi todas las aplicaciones del fago filamentoso dependen de su capacidad para mostrar polipéptidos en la superficie del virio como fusiones a proteínas de la capa de fago (Tabla 1). El modo de visualización determina el tamaño máximo tolerado del polipéptido fusionado, su número de copia en el fago, y potencialmente, la estructura del polipéptido mostrado. La visualización se puede lograr fusionando ADN codificando un polipéptido de interés directamente para el gen codificando una proteína de la capa dentro del genoma fago Sin embargo, con mucha más frecuencia, sólo se modifica una copia de la proteína de la capa en presencia de una segunda copia de tipo salvaje (por ejemplo, se muestra el tipo 88 si tanto los genes de tipo recombinante como los de tipo salvaje pVIII están en el genoma de los fagos, se muestra el tipo 8+8 si el Parmley y Smith (1988), McConnell et al. (1994), Rondot et al. (2001) Híbrido (sistemas de tipo 33 y 3+3) Sistema del tipo 3+3 <1 2 Smith y Scott (1993), Smith y Petrenko (1997) pVI Híbrido (sistema del tipo 6+6) Sí <1 2 > 25 kDa Hufton et al. (1999) pVII Sistema totalmente recombinante (sistema del tipo 7) No 5 > 25 kDa Kwasnikowski et al. (2005) Híbrido (sistema del tipo 7+7) (1999) pVIII Totalmente recombinante (fago paisajístico; sistema del tipo 8)No 2700 3 5-8 residuos Kishchenko et al. (1994), Petrenko et al. (1996) Híbrido (sistemas del tipo 88 y 8+8) Sistema del tipo 8+8 +1300 2 >50 kDa Scott and Smith (1990), Greenwood et al. (1991), Smith and Fernandez (2004) piX Totalmente recombinante (sistema del tipo 9+9 *) Sí 5 > 25 kDa Gao et al. (2002) Híbrido (sistema del tipo 9+9) No <1 2 Gao et al. (1999), Shi et al. (2010), Tornetta et al. (2010) 1 Los asteriscos indican la presencia de copias no funcionales de la proteína de la capa en el genoma del fago de ayuda utilizado para rescatar a un phagemid cuya proteína de capa se ha fusiona 2 El número de copia depende del tamaño del polipéptido; típicamente <1 copia por partícula de fago, pero para la visualización del péptido pVIII puede ser de hasta un 15% de moléculas de pVIII en viriones híbridos. 3 El número total de moléculas de pVIII depende del tamaño del genoma del fago; se añade una molécula de pVIII por cada 2,3 nucleótidos en el genoma viral. El gen recombinante 8 se encuentra en un plásmido con un origen fago de replicación) resultando en un virión híbrido con dos tipos diferentes de proteína de capa dada. Con mucho, las proteínas de capa más comúnmente utilizadas para la visualización son la proteína de capa principal, pVIII, y la proteína de capa menor, pIII, con la mayor ventaja de que la primera es la visualización de número de copia más alto (hasta un 15% de moléculas de capa recombinante en un virión híbrido, al menos para fusiones cortas de péptidos), y de que esta última es la capacidad de mostrar algunas proteínas plegadas en un número de copia apreciable (1-5 por partícula de fago). Si bien pVIII muestra proteínas plegadas en un fago híbrido es posible, normalmente resulta en un número de copia de mucho menos de 1 por virio (Sidhu et al., 2000). Para los fines de esta revisión, utilizamos el término "exhibición de fagos" para referirse a un fago filamentoso recombinante que muestra una sola secuencia de polipéptidos en su superficie (o más raramente, visualización biespecífica lograda mediante la fusión de polipéptidos a dos proteínas capsidas diferentes), y el término "biblioteca de fagotismo" para referirse a un grupo diverso de fagobios filamentosos recombinantes que muestran una serie de variantes de polipéptidos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos; péptidos). Tales bibliotecas son normalmente examinadas por ciclos iterativos de panificación contra una proteína de interés inmovilizada (por ejemplo, antígeno para bibliotecas de anticuerpos visualizadas por fago; anticuerpo para bibliotecas de péptidos visualizadas por fago) seguidos de amplificación del fago unido en células coli. El trabajo temprano con antifagos antisera generado para la clasificación de especies demostró que el fago virión filamentoso es altamente inmunogénico en ausencia de adyuvantes (Meynell y Lawn, 1968 ) y que sólo la proteína principal de la capa, pVIII, y la proteína menor de la capa, pIII, son blanco de anticuerpos (Pratt et al., 1969; Woolford et al., 1977). Así, la idea de utilizar el fago como portador para obtener anticuerpos contra haptens o polipéptidos poco inmunogénicos fue una extensión natural de la capacidad de mostrar secuencias exógenas recombinantes en su superficie, que fue demostrada por primera vez por de la Cruz et al. (1988). El bajo costo de producción de la partícula de fago, la alta estabilidad y el potencial para la exhibición de alta valencia del antígeno extraño (a través de la pantalla pVIII) también la hicieron atractiva como portadora de la vacuna, especialmente durante las primeras etapas de desarrollo de la tecnología proteica recombinante. Sobre la base de la tecnología existente de portador de péptidos, los primeros inmunogenes de la vacuna filamentosa a base de fago mostraron secuencias cortas de aminoácidos derivadas directamente de proteínas de interés como fusiones recombinantes a pVIII o pIII (de la Cruz et al., 1988). A medida que se desarrollaba y refinaba la tecnología bibliotecaria, los antígenos basados en fagos que mostraban ligandos péptidos de anticuerpos monoclonales (seleccionados de bibliotecas de péptidos aleatorias utilizando el anticuerpo, simulando así con diversos grados de éxito el epítopo plegado del anticuerpo en su antígeno cognado; Geysen et al., 1986; Knittelfelder et al., 2009) también se generaban con fines de inmunización, con el objetivo de provocar anticuerpos antipéptidos que también reconocían la proteína nativa. Cuando se muestran en los fagos, los péptidos que codifican las regiones repetitivas de la proteína de circunsporozoita malarial y la proteína de superficie de merozoita 1 fueron inmunogénicos en ratones y conejos (de la Cruz et al., 1988; Greenwood et al., 1991; Willis et al., 1993; Demangel et al., 1996), y anticuerpos levantados contra esta última reacción cruzada con la proteína de larga duración. Varios determinantes péptidos (o imitaciones de los mismos) del VIH-1 gp120, gp41, gag y transcriptasa inversa fueron inmunogénicos cuando se exhibieron o conjugaron con proteínas de la capa de los fagos (Minenkova et al., 1993; di Marzo Veronese et al., 1994; De Berardinis et al., 1999; Scala et al., 1999; Chen et al., 2001; van Houten et al., 2006 van Houten et al.,, 2010, y en algunos casos provocaron anticuerpos que fueron capaces de neutralizar débilmente virus adaptados al laboratorio (di Marzo Veronese et al., 1994; Scala et al., 1999). La lista de infecciones animales y humanas para las que se han desarrollado inmunogenes péptidos fagosos a medida que las vacunas conducen continúa expandiéndose e incluye patógenos bacterianos, fúngicos, virales y parasitarios (Tabla 2). Si bien en algunos casos los resultados de estos estudios han sido prometedores, las vacunas péptidas basadas en anticuerpos epitópicos ya no son un área de investigación activa por varias razones: i) en muchos casos, los péptidos imitan de forma incompleta o inadecuada epítopos en proteínas plegadas (Irving et al., 2010; véase más adelante); ii) los anticuerpos contra un solo epítopo puede ser de utilidad limitada, especialmente para patógenos altamente variables (Van Regenmortel, 2012); y iii) para patógenos para los que se generan respuestas inmunes protectoras de manera eficiente durante la infección natural, las Más recientemente, los fagos péptidos han sido utilizados en intentos de generar respuestas terapéuticas de anticuerpos para enfermedades crónicas, cáncer, inmunoterapia e inmunocontracepción. Inmunización con fagos que muestran la enfermedad de Alzheimer Los péptidos fibriles β-amiloide produjeron anticuerpos antiagregantes en ratones y cobayas (Frenkel et al., 2000 (Frenkel et al., 2003 Esposito et al., 2008; Tanaka et al., 2011), posiblemente redujo la formación de placa amiloide en ratones (Frenkel et al., 2003; Solomon, 2005; Esposito et al., 2008), y pudo haber ayudado a mantener las habilidades cognitivas en un modelo transgénico de ratón de la enfermedad de Alzheimer (Lavie et al., 2004) ; sin embargo, no está claro cómo se proponen estos anticuerpos para cruzar la barrera hematoencefá (2001) encontró que los anticuerpos criados en ratones contra un péptido ERBB2/HER2 podrían inhibir la proliferación de células de cáncer de mama. Fage mostrando ligandos péptidos de un anticuerpo anti-IgE provocó anticuerpos que unieron moléculas purificadas de IgE (Rudolf et al., 1998), que pueden ser útiles en inmunoterapia de alergia. Varias estrategias para las vacunas anticonceptivas basadas en fagos se han propuesto para el control de las poblaciones animales. Por ejemplo, la inmunización con fagos que muestran péptidos hormonales estimulantes de folículos en pVIII provocó anticuerpos que afectaron la fertilidad de ratones y ovejas (Abdennebi et al., 1999). También se encuentran en desarrollo los péptidos de los antígenos espermáticos (Samoylova et al., 2012a,b) y la hormona liberadora de gonadotropina (Samoylov et al., 2012). En su mayor parte, los péptidos que se muestran en los fagos provocan anticuerpos en animales experimentales (Tabla 2), aunque esto depende de las características del péptido y del método de su exhibición: las fusiones pIII tienden hacia una inmunogenicidad menor que las fusiones pVIII (Greenwood et al., 1991) posiblemente debido a diferencias en el número de copias (pIII: 1-5 copias vs. pVIII: estimadas en varios cientos de copias; Malik et al., 1996). De hecho, el fago es al menos tan inmunogénico como las proteínas portadoras tradicionales, como la albúmina sérica bovina (BSA) y la hemocianina de la cojera de ojo de llave (KLH; Melzer et al., 2003; Su et al., 2007), y tiene comparativamente pocos epítopos de células B endógenas para desviar la respuesta de anticuerpos de su objetivo previsto (Henry et al., 2011). Excepto los epítopos pequeños que pueden ser representados con precisión por una secuencia de aminoácidos cortos contiguos, sin embargo, ha sido extremadamente difícil provocar respuestas de anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con epitopos de proteínas nativas utilizando péptidos. El cuadro general es considerablemente más sombrío que el descrito en la Tabla 2, ya que en varios estudios: (i) los ligandos péptidos seleccionados de las bibliotecas de los fagos fueron clasificados por los autores como imitaciones de epitopos discontinuos si no presentaban una secuencia homológica obvia a la proteína nativa, lo que es una débil evidencia de no linealidad, o (ii) la evidencia de reactividad cruzada de anticuerpos provocada por la inmunización con péptidos discontinuados con proteína nativa no fue obligatoria. Irving et al. (2010) describen al menos una razón de esta falta de éxito: parece que los antígenos péptidos provocan un conjunto de anticuerpos topológicamente restringidos que son en gran medida incapaces de reconocer epitopos discontinuas o complejos en las biomoléculas más grandes. Mientras que el péptido puede imitar la química de un epítopo dado en una proteína plegada (permitiendo que se cruce con un anticuerpo dirigido), siendo una molécula más pequeña, no puede imitar la topología del epítopo completo de ese anticuerpo. A pesar de esto, el fago filamentoso sigue siendo muy útil como portador de péptidos con estructuras secundarias relativamente simples, que pueden ser estabilizados mediante el anclaje a las proteínas de la capa (Henry et al., 2011). Esto puede ser especialmente cierto de los péptidos con mala inmunogenicidad inherente, que puede aumentarse por la visualización de alta valencia y adyuvante asociado a los fago (véase Mecanismos inmunológicos de la vacunación con fago filamentoso más abajo). El fago filamentoso se ha utilizado en menor medida como portador de epítopos péptidos de células T, principalmente El trabajo temprano, que demostró que la inmunización con fage obtuvo ayuda de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993), fue confirmado por varios estudios posteriores (De Berardinis et al., 1999; Ulivieri et al., 2008). Desde la perspectiva de la vacunación contra enfermedades infecciosas, De Berardinis et al. (2000) mostraron que un epitope citotóxico de células T (CTL) de la transcriptasa inversa VIH-1 podría provocar CTLs específicos de antígenos in vitro e in vivo sin adición de epitopos de células T de ayuda exógena, presumiblemente ya que están presentes en las proteínas de la capa de fago (Mascolo et al., 2007). Del mismo modo, se observó un uso eficiente de CTLs frente a los epítopos de células T de los fagos de virus de la hepatitis B (Wan et al., 2001) y Candida albicans (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2006 Wang et al., 2014d, que, junto con otros tipos de respuestas inmunes, protegían a los ratones contra la candidiasis sistémica. La vacunación con una combinación de péptidos phagedisplayed provocó CTLs específicos de antígenos que resultaron eficaces en la reducción de la cisticercosis porcina en un ensayo controlado aleatorio (Manoutcharian et al., 2004; Morales et al., 2008). Mientras que las correlaciones de la protección inmune inducida por la vacuna para las enfermedades infecciosas, donde se conocen, son casi exclusivamente anticuerpos séricos o mucosas (Plotkin, 2010), En ciertas aplicaciones de la vacuna, el fago filamentoso se ha utilizado como portador de moléculas más grandes que serían inmunogénicas incluso en aislamiento. Inicialmente, las principales ventajas de la exhibición de estos antígenos de los fago eran la velocidad, facilidad de purificación y bajo costo de producción (Gram et al., 1993). E. coli F17a-G adhesin (Van Gerven et al., 2008), antígeno del núcleo de la hepatitis B (Bahadir et al., 2011), y antígeno de la superficie de la hepatitis B (Balcioglu et al., 2014) todas produjeron respuestas de anticuerpos cuando se exhibieron en la pIII, aunque ninguno de estos estudios comparó la inmunogenicidad de las Phage que muestra Schistosoma mansoni glutatión S-transferasa en pIII provocó una respuesta de anticuerpos que fue tanto más alta en el título como de diferentes isotipos en comparación con la inmunización con la proteína sola (Rao et al., 2003). Dos estudios de vacunas antiidiotípicas han utilizado el fago como portador de fragmentos de anticuerpos que contienen idiotipos inmunogénicos. Inmunización con fago que muestra el 1E10 idiotaype scFv (mimicking a Vibrio anguillarum surface epitope) provocó anticuerpos que protegían a los peces babosos de Vibrio anguillarum challenge (Xia et al., 2005). Una vacuna de idiotipo de tumor específico de phage-BCL1 vinculada químicamente fue débilmente inmunogénica en ratones pero extendió el tiempo de supervivencia en un modelo de linfoma de células B (Roehnisch et al., 2013), y fue bien tolerada e inmunogénica en pacientes con mieloma múltiple (Roehnisch et al., 2014). Un estudio de vacunación de ADN con antilaminarina scFv encontró que el ADN codificando una proteína de fusión pIII-scFv provocó respuestas inmunes humorales y mediadas por células más fuertes que el ADN codificando el scFv solo (Cuesta et al., 2006), sugiriendo que bajo algunas circunstancias, los epitopos de células T de fago endógeno pueden mejorar la inmunogenicidad de proteínas asociadas. Tomados en conjunto, los resultados de estos estudios muestran que como partícula similar a un virus de partículas, el fago filamentoso probablemente desencadena diferentes tipos de respuestas inmunitarias que los antígenos de proteínas recombinantes, y proporciona ayuda adicional de células T a las proteínas exhibidas o conjugadas. Sin embargo, el bajo número de copias de proteínas visualizadas pIII, así como la adyuvancia potencialmente no deseada asociada a los fagos, pueden hacer de la exhibición de proteínas recombinantes por fago una elección vacunal subóptima. Aunque nuestra comprensión de la respuesta inmune contra los palidezes fagosas filamentosas en comparación con antígenos modelo clásicos como la ovalbúmina, los últimos trabajos han comenzado a arrojar luz sobre los mecanismos inmunes activados en respuesta a la vacunación de los fagos (Figura 1). La partícula del fago es inmunogénica sin adyuvante en todas las especies probadas hasta la fecha, incluyendo ratones (Willis et al., 1993), ratas (Dente et al., 1994), conejos (de la Cruz et al., 1988), cobayas (Frenkel et al., 2000; Kim et al., 2004), peces (Coull et al., 1996; Xia et al., 2005), primates no humanos (Chen et al., 2001) y humanos (Roehnisch et al., 2014). Se han empleado varias vías de inmunización, incluyendo administración oral (Delmastro et al., 1997) así como subcutánea (Grabowska et al., 2000), intraperitoneal (van Houten et al., 2006), intramuscular (Samoylova et al., 2012a), intravenosa (Vaks y Benhar, 2011), e inyección intradérmica (Roehnisch et al., 2013); ningún estudio publicado ha comparado directamente el efecto de la vía de administración sobre la inmunogenicidad fagosa filamentosa. Los anticuerpos se generan contra sólo tres sitios principales en el virión: (i) los N-terminal expuestos a la superficie 12 de la retícula monomérica pVIII (Terry et al., 1997; Kneissel et al., 1999) ; (ii) los dominios N-terminal N1 y N2 de la pIII (van Houten et al., 2010); y (iii) lipopolisacárido bacteriano (LPS) incrustado en la capa de fago (Henry et al., 2011). En ratones, los títulos de anticuerpos séricos contra el fago suelen alcanzar 1:10 5 -1:10 6 después de 2-3 inmunizaciones, y se mantienen durante al menos 1 año postinmunización (Frenkel et al., 2000). Las respuestas primarias de anticuerpos contra el fago parecen estar compuestas por una mezcla de isotipos IgM e IgG2b en ratones C57BL/6, mientras que las respuestas secundarias de anticuerpos están compuestas principalmente de isotipos IgG1 e IgG2b, con una menor contribución de isotipos IgG2c e IgG3 (Hashiguchi et al., 2010). La supresión de los dominios N1 y N2 expuestos a la superficie de pIII produce una forma truncada de esta proteína que no provoca anticuerpos, sino que también produce una partícula de fago no infecciosa con menor inmunogenicidad general (van Houten et al., 2010). Como partícula similar a un virus, el fago filamentoso envuelve múltiples brazos del sistema inmune, comenzando con efectores celulares de inmunidad innata (macrofagos, neutrófilos y posiblemente células asesinas naturales), que son reclutados en sitios tumorales por fago que muestran moieties tumorales. El fago probablemente activa las respuestas de anticuerpos independientes de células T, ya sea a través de ligandos TLR asociados a los fagoes o enlaces cruzados por la celosía pVIII. Después del procesamiento por células que presentan antígenos, los péptidos derivados de los fagotes se presentan en la clase II de la MHC y en la clase I de la MHC, resultando en la activación de CTL de corta duración y una serie de tipos de células T ayudantes, que ayudan a la memoria primaria CTL y respuestas de células B de alta afinidad. Las fronteras en la microbiología www.fronterizosin.orgAunque los títulos de anticuerpos antifagos séricos parecen ser al menos parcialmente dependientes de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993; De Berardinis et al., 1999; van Houten et al., 2010), muchas células B específicas de pVIII circulantes en la sangre carecen de mutación somática incluso después de repetidas inmunizaciones quincenales, lo que sugiere que bajo estas condiciones, el fago activa respuestas de células B independientes de células T además de respuestas dependientes de células T de alta afinidad (Murira, 2014). Las partículas filamentarias de fagos pueden ser procesadas por células presentadoras de antígenos y presentadas en moléculas de clase II de MHC (Gaubin et al., 2003; Ulivieri et al., 2008) y pueden activar T H 1, T H 2 y T H 17 células T ayudantes (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2014d). Las respuestas antifagos T H 2 se mejoraron mediante la visualización de péptidos CTLA-4 fusionados con pIII (Kajihara et al., 2000). Las proteínas de Phage también pueden presentarse de forma cruzada en moléculas de clase I de MHC (Wan et al., 2005) y pueden producir dos ondas de respuestas CTL, que consisten primero en CTL de corta duración y después de CTL de memoria de larga duración que requieren ayuda de células CD4 + T (Del Pozzo et al., Estos últimos CTLs median una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (Fang et al., 2005; Del Pozzo et al., 2010). La partícula de fago es autoadyuvante a través de múltiples mecanismos. El LPS derivado de la pared de la célula huésped realza la inmunogenicidad del virión, y su eliminación por cromatografía de polimixina B reduce los títulos de anticuerpos contra las proteínas de capa de fago (Grabowska et al., 2000). El genoma de ADN singlestranded del fago contiene motivos CpG y también puede tener un efecto adyuvante. La respuesta de anticuerpos contra el fago es totalmente dependiente de la señalización de MyD88 y se modula mediante la estimulación de varios receptores de tipo peaje (Hashiguchi et al., 2010), indicando que la inmunidad innata juega un papel importante pero en gran Los estudios de biodistribución del fago después de la inyección intravenosa muestran que se elimina de la sangre en cuestión de horas a través del sistema reticuloendotelial (Molenaar et al., 2002), particularmente del hígado y el bazo, donde se retiene durante días (Zou et al., 2004), potencialmente activando respuestas de células B de zona marginal. Por lo tanto, el fago filamentoso no sólo es un portador altamente inmunogénico, sino que, gracias a la activación de una gama de respuestas inmunes innatas y adaptativas, sirve como un excelente modelo de antígeno de partícula similar al virus. Mucho antes de la identificación del fago filamentoso, otros tipos de bacteriofago ya se estaban utilizando para la terapia antibacteriana en la antigua Unión Soviética y Europa Oriental (revisado en Sulakvelidze et al., 2001). El fago filamentoso, con su ciclo de vida no lítico, tiene usos clínicos menos obvios, a pesar de que la especificidad del huésped de Inovirus y Plectrovirus incluye muchos patógenos de importancia médica, incluyendo Salmonella, E. coli, Shigella, Pseudomonas, Clostridium y Micoplasma. En un esfuerzo por mejorar su actividad bactericida, los fagoces filamentosos genéticamente modificados se han utilizado como "caballo de Troya" para introducir diversos agentes antibacterianos en las células. Los fagos M13 y Pf3 fueron diseñados para expresar la restricción BglII endonucleasa (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004), lambda fage S holin (Hagens y Blasi, 2003) o una proteína activadora letal del gen catabolita (Moradpour et al., 2009) que mató eficazmente a las células E. coli y Pseudomonas aeruginosa, respectivamente, sin liberación concomitante de LPS (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004). Lamentablemente, la rápida aparición de bacterias resistentes con pili F modificado representa un obstáculo importante y posiblemente insuperable a este enfoque. Sin embargo, hay algunos indicios de que los fagos filamentosos pueden ejercer efectos útiles pero más sutiles sobre sus hospedadores bacterianos que pueden no resultar en el desarrollo de resistencia a la infección. Varios estudios han reportado aumento de la sensibilidad antibiótica en poblaciones bacterianas infectadas simultáneamente con fago filamentoso tipo salvaje (Hagens et al., 2006) o fago diseñado para reprimir la respuesta celular SOS (Lu y Collins, 2009). La infección filamentosa f1 inhibió la formación de biopelículas en E. coli, pero no madura (May et al., 2011). Así, los fago filamentosos no modificados pueden ser de interés futuro como elementos de terapia combinada contra ciertas infecciones resistentes a fármacos. Las aplicaciones terapéuticas más avanzadas del fago filamentoso emergen cuando se modifica para expresar una fracción dirigida específica para células patógenas y/o proteínas para el tratamiento de enfermedades infecciosas, cáncer y autoinmunidad (Figura 2). El primer trabajo en esta área mostró como prueba de concepto que los fagos codificando un cassette de expresión GFP y mostrando un HER2specific scFv en todas las copias de pIII fueron internalizados en células tumorales de mama, resultando en la expresión GFP (Poul y Marks, 1999). M13 o fd fagos mostrando un péptido objetivo o fragmento de anticuerpos y amarrados a cloranfenicol por un crosslinker lábil eran inhibidores más potentes del crecimiento de Staphylococcus aureus que el cloranfenicol libre de alta concentración (Yacoby et al., 2006; Vaks y Benhar, 2011). M13 fagos cargados con doxorubicina y mostrando un péptido objetivo en células de cáncer de próstata específicamente muertas en pIII in vitro (Ghosh et al., péptido tumoral específico: proteínas de fusión de pVIII seleccionadas de "paisaje" fage (Romanov et al., 2001; Abbineni et al., 2010; Fagbohun et al., 2012 Fagbohun et al., 2013 Lang et al., 2014; Wang et al., 2014a) fueron capaces de dirigir y entregar siRNA-, paclitaxel-, y liposomas que contienen doxorubicina a las células tumorales (Jayanna et al., 2010a; Wang et al., 2010a Wang et al.,, b, c, 2014b Bedi et al., 2011 Bedi et al.,, 2013 Bedi et al.,, 2014 ; eran tasas de remisión tumoral no tóxicas y aumentadas en modelos de ratón (Jayanna et al., 2010b; Wang et Usando el modelo de tumor B16-OVA, Eriksson et al. (2007) mostraron que los fagos que mostraban péptidos y/o Fabs específicos para antígenos tumorales retrasaron el crecimiento del tumor y mejoraron la supervivencia, debido en gran parte a la activación de macrófagos asociados al tumor y al reclutamiento de neutrófilos en el sitio del tumor (Eriksson et al., 2009). Phage mostrando un scFv frente a fibriles β-amiloide mostró promesa como diagnóstico (Frenkel y Solomon, 2002) y terapéutico (Solomon, 2008) reactivo para la enfermedad de Alzheimer y Parkinson debido a la capacidad imprevista del fago para penetrar en el tejido cerebral (Ksendzovsky et al., 2012). Del mismo modo, los fagos que muestran un epítopo péptido inmunodominante derivado de la mielina oligodendrocyte glucoproteína desmielinizantes patógenos agotados anticuerpos en el tejido cerebral en el modelo murina experimental de encefalomielitis autoinmune de esclerosis múltiple (Rakover et al., 2010). Las ventajas del fago filamentoso en este contexto sobre los conjugados tradicionales anticuerpo-fármaco o proteico-péptido son: i) su capacidad para transportar cantidades muy altas de fármaco o péptido, y ii) su capacidad para acceder a compartimentos anatómicos que generalmente no pueden ser alcanzados por la administración sistémica de una proteína. A diferencia de la mayoría de los biológicos terapéuticos, la producción del fago filamentoso en bacterias complica su uso en los seres humanos de varias maneras. En primer lugar, los preparados crudos de fago filamentoso suelen contener niveles muy altos de SLP contaminante, en el rango de 10 unidades de endotoxina 2-10 4 (EU)/ml (Boratynski et al., 2004; Branston et al., 2015), que tienen el potencial de causar reacciones adversas graves. LPS no se elimina completamente por precipitación de polietilenglicol o centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio (Smith y Gingrich, 2005; Branston et al., 2015), pero sus niveles se pueden reducir drásticamente utilizando pasos de purificación adicionales como cromatografía de exclusión de tamaño (Boratynski et al., 2004; Zakharova et al., 2005), cromatografía de polimixina B (Grabowska et al., 2000), y tratamiento con detergentes como Triton X-100 o Triton X-114 (Roehnisch et al., 2014; Branston et al., 2015). Estas estrategias alcanzan de forma rutinaria niveles de endotoxina < 1 EU/ml medidos por el lisato de limulo amebocito (LAL), muy por debajo del límite de la FDA para la administración parenteral de 5 EU/kg de peso corporal/dosis, aunque sigue habiendo preocupaciones con respecto a la presencia de LPS residuales asociadas al virión que pueden ser indetectables.Una segunda consecuencia, y tal vez inevitable, de la producción bacteriana del fago filamentoso es la heterogeneidad inherente del tamaño de las partículas y el espectro de contaminantes solubles y asociados al virión del huésped, que pueden ser causa de problemas de seguridad y restringir su uso a los grupos de alto riesgo. Se han propuesto muchos tipos de variantes de bacteriofago y fagos diseñados, incluido el fago filamentoso, para uso profiláctico ex vivo en seguridad alimentaria, ya sea en la tubería de producción (revisado en Dalmasso et al., 2014) o para la detección de patógenos transmitidos por alimentos postproducción (revisado en Schmelcher y Loessner, 2014). Fago filamentoso que muestra una etiqueta de tetracisteína en pIII se utilizaron para detectar células E. coli a través de tinción con tinte biarsenical. Biosensores basados en resonancia de plasmón superficial (Nanduri et al., 2007), transductores piezoeléctricos (Olsen et al., 2006), dicroísmo lineal (Pacheco-Gomez et al., 2012), y tecnología de sensores magnetoelásticos (Lakshmanan et al., 2007; Huang et al., 2009) fueron ideados utilizando fagos filamentosos que muestran scFv o conjugados a IgG enteros contra E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium y Bacillus anthracis con límites de detección en el orden de 10 2-10 6 células bacterianas/ml. Prueba de concepto ha sido demostrado para el uso de tales biosensores a base de fagos para detectar contaminación bacteriana de productos vivos (Li et al., 2010 La partícula fagosa filamentosa está encerrada por un capsid de proteína similar a la varilla, de 1000 nm de largo y 5 nm de ancho, formado casi enteramente por monómeros de pVIII superpuestos, cada uno de los cuales se encuentra en 27 angstroms de su vecino más cercano y expone dos grupos de aminas, así como al menos tres grupos de carboxilo (Henry et al., 2011). La regularidad de la celosía de pVIII de fagos y su diversidad de grupos químicamente direccionables la convierten en un andamio ideal para la bioconjugación (Figura 3). El enfoque más utilizado es la funcionalización de grupos de aminas con ésteres NHS (van Houten et al., 2006 (van Houten et al., 2010 Yacoby et al., 2006), aunque esto puede resultar en una a Los grupos de carboxilo y los residuos de tirosina también se pueden funcionalizar utilizando acoplamiento de carbodiimida y acoplamiento de diazonio, respectivamente (Li et al., 2010a). Carrico et al. (2012) desarrollaron métodos para etiquetar específicamente pVIII N-termina sin modificación de residuos de lisina expuestos a través de una reacción de formación de transaminación-oxima en dos pasos. La modificación específica de las proteínas de la capa de fago es aún más fácil de lograr usando péptidos modificados genéticamente (Ng et al., 2012) o enzimas (Chen et al., 2007; Hess et al., 2012), pero esto puede ser engorroso y es menos general en aplicación. Durante más de una década, el interés en el fago filamentoso como bloque de construcción de nanomateriales ha ido creciendo debido a sus propiedades fisicoquímicas únicas, con aplicaciones emergentes en magnet Desde hace mucho tiempo se sabe que por encima de un determinado umbral de concentración, el fago puede formar suspensiones cristalinas ordenadas (Welsh et al., 1996). Lee et al. (2002) diseñaron un fago M13 para mostrar un péptido de unión ZnS en pIII y demostraron que, en presencia de nanopartículas ZnS, se autoensamblan en biomateriales de película altamente ordenados que se pueden alinear utilizando campos magnéticos. Aprovechando la capacidad de mostrar péptidos específicos de sustratos en lugares conocidos en el filamento fagotico Hess et al., 2012), este pionero FIGURE 3 Grupos químicamente direccionables de la capa principal de bacteriofago filamentoso. El virión del fago filamentoso se compone de 2.500-4.000 copias superpuestas de la proteína 50-residue Cada monómero tiene una serie de grupos químicamente direccionables disponibles para la conjugación bioortogonal, incluyendo dos grupos de aminas primarias (mostradas en rojo), tres grupos de carboxilo (mostradas en azul) y dos grupos de hidroxilo (mostradas en verde). Los 12 residuos N-terminales generalmente expuestos al sistema inmune para la unión de anticuerpos están en negrita subrayado. Figura adaptada a partir de datos estructurales de Marvin, 1990, disponible libremente en bases de datos PDB y SCOPe. el trabajo se convirtió en la base para la construcción de nanomateriales bidimensionales y tridimensionales con arquitecturas más avanzadas, incluyendo nanohilos semiconductores (Mao et al., 2003 (Mao et al.,, 2004, nanopartículas, y nanocomposites (Oh et al., 2012; Chen et al., 2014). Utilizando los péptidos híbridos de unión de oro y Co 3 O 4 en pVIII como andamio para ensamblar nanohilos en multicapas de polielectrolitos, Nam et al. (2006) produjeron una batería de iones de litio delgada y flexible, que podía ser estampada en colectores de corriente de microbanda de platino (Nam et al., 2008). Las propiedades electroquímicas de estas baterías se mejoraron aún más a través de la visualización pIII de péptidos de unión de nanotubos de carbono de una sola pared (Lee et al., 2009), ofreciendo un enfoque para la producción sostenible de electrodos nanoestructurados a partir de materiales de partida mal conductivos. Los nanomateriales a base de fage han encontrado aplicaciones en la imagen del cáncer (Ghosh et al., 2012b; Yi et al., 2012), la división del agua fotocatalítica (Nam et al., 2010a; Neltner et al., 2010), la recolección de luz (Nam et al., 2010b; Chen et al., 2013), las tecnologías fotorespuestas (Murugesan et al., 2013), los electrodos neuronales (Kim et al., 2014), y la generación de energía piezoeléctrica (Murugesan et al., 2013). Así, las propiedades fisicoquímicas únicas del fago, en combinación con la visualización modular de péptidos y proteínas con especificidad de unión conocida, han desove materiales totalmente nuevos con diversas aplicaciones. Vale la pena señalar que las propiedades bio La alineación magnética de los fagos filamentosos de alta concentración en solución puede ordenar parcialmente el ADN, el ARN, las proteínas y otras biomoléculas para la medición de las interacciones de acoplamiento dipolar (Hansen et al., 1998 (Hansen et al., 2000 Dahlke Ojennus et al., 1999) en espectroscopia NMR. Debido a su gran tamaño de población, tiempos de generación cortos, tamaños de genoma pequeños y facilidad de manipulación, diversos bacteriófagos filamentosos y no filamentosos se han utilizado como modelos de evolución experimental (revisado en Husimi, 1989; Wichman y Brown, 2010; Kawecki et al., 2012; Hall et al., 2013). El fago filamentoso tiene usos prácticos adicionales en ingeniería proteica y evolución proteica dirigida, debido a su tolerancia única de modificaciones genéticas que permiten mostrar biomolécula En primer lugar, entre estas aplicaciones se encuentra la maduración in vitro de la afinidad de los fragmentos de anticuerpos mostrados en pIII. Las bibliotecas de variantes Fabs y anticuerpos de cadena única pueden generarse mediante mutagenesis aleatoria o sitedirected y seleccionarse sobre la base de una unión mejorada o alterada, imitando más o menos la estrategia de evolución somática del sistema inmunitario (Marks et al., 1992; Bradbury et al., 2011). Sin embargo, otros sistemas de visualización in vitro, como la visualización de levaduras, tienen importantes ventajas sobre el fago filamentoso para la maduración de afinidad (aunque cada tecnología de visualización tiene fortalezas complementarias; Koide y Koide, 2012) y, independientemente del método de visualización, la selección de variantes "mejoradas" puede ser lenta y engorrosa. Se han desarrollado métodos iterativos para combinar mutaciones de diseño computacional (Lippow et Recientemente, Esvelt et al. (2011) desarrollaron una nueva estrategia para la evolución dirigida de las proteínas fagosas filamentosas, denominadas evolución continua asistida por fagos (PACE), que permite múltiples rondas de evolución por día con poca intervención experimental.Los autores diseñaron el fago M13 para codificar una proteína exógena (sujeto a la evolución dirigida), cuya actividad funcional desencadena la expresión del gen III de un plasmido accesorio; variantes de la proteína exógena surgen por mutagenesis aleatoria durante la replicación de fagos, cuya tasa puede aumentarse mediante la expresión inducible de polimerasas de ADN propensas a errores. Al suministrar cantidades limitadas de células E. coli receptivas a las variantes de fagosas diseñadas, Esvelt et al. (2011) vincula elegantemente la infectividad y producción de fagos con la presencia de un fenotipo proteico deseado. Carlson et al. (2014) más tarde mostró que la severidad de selección PACE podría ser modulada proporcionando pequeñas cantidades de pIII independientemente del fenotipo proteico, y funciones proteicas indeseables seleccionadas negativamente al vincularlas a la expresión de una variante pIII truncada que altera la infectividad en una forma negativa dominante. PACE se limita actualmente a funciones proteicas que pueden estar vinculadas de alguna manera a la expresión de un reportero del gen III, tales como interacción proteína-proteína, recombinación, unión ADN o ARN, y catálisis enzimática (Meyer y Ellington, 2011). Este enfoque representa una vía prometedora para la investigación básica en evolución molecular (Dickinson et al., 2013) y biología sintética, incluyendo ingeniería de anticuerpos. El bacteriofago filamentario se ha recuperado de diversas fuentes ambientales, incluyendo el suelo (Murugaiyan et al., 2011), el agua dulce costera (Xue et al., 2012), los lagos alpinos (Hofer y Sommaruga, 2001) y las bacterias del mar profundo (Jian et al., 2012), pero tal vez no sorprendentemente el intestino humano (Kim et al., 2011). El "fageoma" ambiental en el suelo y el agua representan la mayor fuente de replicación de ADN en el planeta, y se estima que contiene más de 10 30 partículas virales (Ashelford et al., 2003; Chibani-Chennoufi et al., 2004; Suttle, 2005). Los pocos estudios que intentan investigar la ecología ambiental de los fagos filamentosos utilizando técnicas clásicas de microbiología ambiental (normalmente observación directa por microscopía electrónica) encontraron que los fagos filamentosos constituían entre el 0 y el 100% de todas las partículas virales (Demuth et al., 1993; Pina et al., 1998; Hofer y Sommaruga, 2001). Hubo alguna evidencia de fluctuación estacional de poblaciones de fagos filamentosos junto con la abundancia relativa de bacterias heterotróficas libres (Hofer y Sommaruga, 2001). Los datos existentes sugieren que los fagos filamentosos son constituyentes menores de comunidades virales en agua dulce (Roux et al., 2012) y agua recuperada y potable (Rosario et al., 2009), pero tienen frecuencias mucho más altas en aguas residuales y aguas residuales (Cantalupo et al., 2011; Alhamlan et al., 2013), con la salvedad de que los sesgos inherentes a las metodologías para determinar estos datos (purificación de partículas virales, sesgos de secuenciación) no han sido bien validados. No hay datos que describan la dinámica poblacional de los fagos filamentosos y sus especies hospedantes en el entorno natural. A nivel individual de virus-bacterio, está claro que los fagos filamentosos pueden modular el fenotipo huésped, incluyendo la virulencia de importantes patógenos humanos y de cultivos. Esto puede ocurrir ya sea a través de efectos directos de replicación de fagos en el crecimiento celular y la fisiología, o, más típicamente, por transferencia horizontal de material genético contenido en episomas y/o profagos cromosómicamente integrados. Fago filamentoso templado también puede jugar un papel en la evolución del genoma (revisado en Canchaya et al., 2003). Tal vez el ejemplo mejor estudiado de modulación de virulencia por fago filamentoso es el de Vibrio cholerae, cuya virulencia completa requiere conversión lisogénica por la toxina del cólera codificante CTX La integración de los fagos CTXo se produce en sitios específicos del genoma; estas secuencias se introducen a través de la acción combinada de otro fagos filamentoso, fs2o, y un fagoso filamentoso satelital, TLC-KnŁo1 (Hassan et al., 2010). Así, las especies de fagos filamentosos interactúan y coevolucionan entre sí, además de sus anfitriones. La infección por fagos filamentosos se ha implicado en la virulencia de Yersinia pestis (Derbise et al., 2007), Neisseria meningitidis (Bille et al., 2005 (Bille et al., 2008, Vibrio parahemolyticus (Iida et al., 2001), E. coli 018:K1:H7 (Gonzalez et al., 2002), Xanthomonas campestris (Kamiunten and Wakimoto, 1982), y P. aeruginosa (Webb et al., 2004), aunque en la mayoría de estos casos, los mecanismos específicos que modulan la virulencia no son claros. La infección por fage puede potenciar o reprimir la virulencia dependiendo de las características del fago, la bacteria huésped y el medio ambiente, como es el caso del patógeno de la marchitez bacteriana Ralstonia solanacearum (Yamada, 2013). Dado que la infección resulta en la regulación de los pili utilizados para la entrada viral, el tratamiento del fago filamentoso se ha propuesto como un medio hipotético para inhibir la conjugación bacteriana y la transferencia génica horizontal, a fin de evitar la propagación de genes de resistencia a antibióticos (Lin et al., 2011). Finalmente, el fago filamentoso también puede desempeñar un papel futuro en la preservación de la biodiversidad de otros organismos en ecosistemas de riesgo. Se ha propuesto el uso del fago artificial en la biorremediación, ya sea mostrando fragmentos de anticuerpos de la especificidad deseada para la filtración de toxinas y contaminantes ambientales (Petrenko y Makowski, 1993), o como polímeros biodegradables que muestran péptidos seleccionados por su capacidad para agregar contaminantes, tales como residuos de arenas oleaginosas (Curtis et al., 2011 (Curtis et al., 2013 ). También se ha propuesto el uso de péptidos diseñados que se unen específicamente a materiales inorgánicos en tecnologías de separación mineral más avanzadas y menos intrusivas (Curtis et al., 2009 ). El fago filamentoso representa un organismo altamente versátil cuyos usos van mucho más allá de la exhibición tradicional de fago y la selección de afinidad de anticuerpos y polipéptidos de especificidad deseada. Su alta inmunogenicidad y su capacidad para mostrar una variedad de antígenos superficiales hacen que el fago sea un excelente portador de la vacuna antipartículas, aunque su producción y preparación bacterianas probablemente limiten sus aplicaciones en vacunas humanas en la actualidad, a pesar de ser aparentemente seguros y bien tolerados en animales y personas. Las características imprevistas de la partícula antifago, como el cruce de la barrera hematoencefálica y la formación de fases cristalinas líquidas altamente ordenadas, han abierto nuevas vías de investigación en terapias para enfermedades crónicas y el diseño de nanomateriales. Nuestra comprensión comparativamente detallada de las interacciones del fagotismo filamentoso modelo con sus huéspedes bacterianos ha permitido a los investigadores aprovechar el ciclo de vida del fago para dirigir la evolución proteica en el laboratorio. Esperamos que un conocimiento más profundo de las interacciones entre los hospederos de fago a nivel ecológico pueda producir estrategias novedosas para controlar la pato Mientras se siguen desarrollando nuevas aplicaciones del fago filamentoso, es probable que el fago conserve su posición como caballo de batalla para el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos durante muchos años, incluso con el advenimiento de tecnologías competidoras. KH y JS concibieron y escribieron el manuscrito. MA-G leyó el manuscrito y comentó sobre el texto.

¿Cuál es el potencial de los fagos para las enfermedades infecciosas y crónicas?

Más allá de la visualización de los fagos: aplicaciones no tradicionales del bacteriofago filamentoso como portador de vacunas, andamio biológico terapéutico y bioconjugadorhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4523942/SHA: f00f183d0bce0091a02349ec1eab44a76a9bc4Autores: Henry, Kevin A.; Arbabi-Ghahroudi, Mehdi; Scott, Jamie K.Fecha: 2015-08-04DOI: 10.3389/fmicb.2015.00755Licencia: cc-byAbstract: Durante los últimos 25 años, la tecnología de exhibición de fagos ha sido una herramienta inestimable para los estudios de interacciones proteína-proteína. Sin embargo, las propiedades biológicas, bioquímicas y biofísicas inherentes al bacteriofago filamentoso, así como la facilidad de su manipulación genética, también lo convierten en una plataforma atractiva fuera del canon de exhibición tradicional de fagos. Esta revisión se centrará en las propiedades únicas del bacteriofago filamentoso y destacará sus diversas aplicaciones en la investigación actual. Se ponen énfasis en: (i) las ventajas del fago como portador de la vacuna, incluyendo su alta inmunogenicidad, relativa simplicidad antigénica y capacidad para activar una gama de respuestas inmunes, (ii) el potencial del fago como agente profiláctico y terapéutico para enfermedades infecciosas y crónicas, (iii) la regularidad de la retícula de la proteína de la capa principal del virio, que permite una variedad de bioconjugación y aplicaciones de química de la superficie, particularmente en nanomateriales, y (iv) el gran tamaño de la población del fago y los tiempos de generación rápidos, que lo convierten en un excelente sistema modelo para la evolución de proteínas dirigidas. A pesar de su ubicuidad en la biosfera, el trabajo metagenómico apenas está comenzando a explorar la ecología del fago filamentoso y su papel en la evolución de las poblaciones bacterianas. Así, el fago filamentoso representa un microorganismo robusto, barato y versátil cuyas aplicaciones de bioingeniería continúan expandiéndose en nuevas direcciones, aunque sus limitaciones en algunas esferas imponen obstáculos a su adopción y uso generalizados. Texto: El bacteriofago filamentoso (genera Inovirus y Plactrovirus) son virus no envueltos en forma de varilla de Escherichia coli, cuyos largos capsidios helicoidales encapsulan un genoma circular de ADN de una sola cadena. Después del descubrimiento independiente de bacteriofago por Twort (1915) y d 'Hérelle (1917), el primer fago filamentoso, f1, fue aislado en Loeb (1960) y más tarde caracterizado como un miembro de un grupo más grande de fago (Ff, incluyendo f1, M13, y fd fago) específico para el E. coli conjugativo F pilus (Hofschneider y Mueller-Jensen, 1963; Marvin y Hoffmann-Berling, 1963; Zinder et al., 1963; Salivar et al., 1964). Poco después, se descubrió un fago filamentoso que no utiliza F-pili para la entrada (If y Ike; Meynell y Lawn, 1968; Khatoon et al., 1972), y con el tiempo la lista de fago filamentoso conocido se ha expandido a más de 60 miembros (Fauquet et al., 2005), incluyendo especies templadas y grampositivas. El trabajo de varios grupos en los últimos 50 años ha contribuido a una comprensión relativamente sofisticada de la estructura filamentosa, biología y ciclo vital (revisado en Marvin, 1998; Rakonjac et al., 2011; Rakonjac, 2012). A mediados de la década de 1980, el principio de modificar el genoma de fago filamentoso para mostrar polipéptidos como fusiones para cubrir proteínas en la superficie del virión fue inventado por Smith y colegas (Smith Sobre la base de las ideas descritas en Parmley y Smith (1988), los grupos de California, Alemania y el Reino Unido desarrollaron plataformas de fage-display para crear y proyectar bibliotecas de variantes de péptidos y proteínas plegadas (Bass et al., 1990; Devlin et al., 1990; McCafferty et al., 1990; Scott y Smith, 1990; Breitling et al., 1991; Kang et al., 1991). Esta tecnología permitió, por primera vez, la capacidad de conectar sin problemas la información genética con la función proteica para un gran número de variantes proteicas simultáneamente, y ha sido ampliamente y productivamente explotada en estudios de interacciones proteicas. Muchas excelentes revisiones están disponibles en bibliotecas de fage-display y sus aplicaciones (Kehoe y Kay, 2005; Bratkovic, 2010; Pande et al., 2010). Sin embargo, el fago tiene también una serie de propiedades estructurales y biológicas únicas que lo hacen altamente útil en áreas de investigación que han recibido mucha menos atención. Así, el propósito de esta revisión es destacar el trabajo reciente y actual utilizando fago filamentoso en aplicaciones nuevas y no tradicionales. Específicamente, nos referimos a proyectos que se basan en el fago filamentoso como un elemento clave, pero cuyo propósito principal no es la generación o cribado de bibliotecas fagodisplayed para obtener ligandos polipéptidos de unión. Estos tienden a caer en cuatro categorías principales de uso: i) fago filamentoso como portador de vacuna; ii) fago filamentoso diseñado como un agente biológico terapéutico en enfermedades infecciosas y crónicas; iii) fago filamentoso como un andamio para bioconjugación y química superficial; y iv) fago filamentoso como un motor para la evolución de variantes de proteínas exhibi Una sección final está dedicada a los últimos desarrollos en la ecología fagosa filamentosa y las interacciones fagosas-anfitriona. Los temas comunes compartidos entre todas estas aplicaciones incluyen las propiedades biológicas, inmunológicas y fisicoquímicas únicas del fago, su capacidad para mostrar una variedad de biomoléculas de forma modular, y su relativa simplicidad y facilidad de manipulación. Casi todas las aplicaciones del fago filamentoso dependen de su capacidad para mostrar polipéptidos en la superficie del virio como fusiones a proteínas de la capa de fago (Tabla 1). El modo de visualización determina el tamaño máximo tolerado del polipéptido fusionado, su número de copia en el fago, y potencialmente, la estructura del polipéptido mostrado. La visualización se puede lograr fusionando ADN codificando un polipéptido de interés directamente para el gen codificando una proteína de la capa dentro del genoma fago Sin embargo, con mucha más frecuencia, sólo se modifica una copia de la proteína de la capa en presencia de una segunda copia de tipo salvaje (por ejemplo, se muestra el tipo 88 si tanto los genes de tipo recombinante como los de tipo salvaje pVIII están en el genoma de los fagos, se muestra el tipo 8+8 si el Parmley y Smith (1988), McConnell et al. (1994), Rondot et al. (2001) Híbrido (sistemas de tipo 33 y 3+3) Sistema del tipo 3+3 <1 2 Smith y Scott (1993), Smith y Petrenko (1997) pVI Híbrido (sistema del tipo 6+6) Sí <1 2 > 25 kDa Hufton et al. (1999) pVII Sistema totalmente recombinante (sistema del tipo 7) No 5 > 25 kDa Kwasnikowski et al. (2005) Híbrido (sistema del tipo 7+7) (1999) pVIII Totalmente recombinante (fago paisajístico; sistema del tipo 8)No 2700 3 5-8 residuos Kishchenko et al. (1994), Petrenko et al. (1996) Híbrido (sistemas del tipo 88 y 8+8) Sistema del tipo 8+8 +1300 2 >50 kDa Scott and Smith (1990), Greenwood et al. (1991), Smith and Fernandez (2004) piX Totalmente recombinante (sistema del tipo 9+9 *) Sí 5 > 25 kDa Gao et al. (2002) Híbrido (sistema del tipo 9+9) No <1 2 Gao et al. (1999), Shi et al. (2010), Tornetta et al. (2010) 1 Los asteriscos indican la presencia de copias no funcionales de la proteína de la capa en el genoma del fago de ayuda utilizado para rescatar a un phagemid cuya proteína de capa se ha fusiona 2 El número de copia depende del tamaño del polipéptido; típicamente <1 copia por partícula de fago, pero para la visualización del péptido pVIII puede ser de hasta un 15% de moléculas de pVIII en viriones híbridos. 3 El número total de moléculas de pVIII depende del tamaño del genoma del fago; se añade una molécula de pVIII por cada 2,3 nucleótidos en el genoma viral. El gen recombinante 8 se encuentra en un plásmido con un origen fago de replicación) resultando en un virión híbrido con dos tipos diferentes de proteína de capa dada. Con mucho, las proteínas de capa más comúnmente utilizadas para la visualización son la proteína de capa principal, pVIII, y la proteína de capa menor, pIII, con la mayor ventaja de que la primera es la visualización de número de copia más alto (hasta un 15% de moléculas de capa recombinante en un virión híbrido, al menos para fusiones cortas de péptidos), y de que esta última es la capacidad de mostrar algunas proteínas plegadas en un número de copia apreciable (1-5 por partícula de fago). Si bien pVIII muestra proteínas plegadas en un fago híbrido es posible, normalmente resulta en un número de copia de mucho menos de 1 por virio (Sidhu et al., 2000). Para los fines de esta revisión, utilizamos el término "exhibición de fagos" para referirse a un fago filamentoso recombinante que muestra una sola secuencia de polipéptidos en su superficie (o más raramente, visualización biespecífica lograda mediante la fusión de polipéptidos a dos proteínas capsidas diferentes), y el término "biblioteca de fagotismo" para referirse a un grupo diverso de fagobios filamentosos recombinantes que muestran una serie de variantes de polipéptidos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos; péptidos). Tales bibliotecas son normalmente examinadas por ciclos iterativos de panificación contra una proteína de interés inmovilizada (por ejemplo, antígeno para bibliotecas de anticuerpos visualizadas por fago; anticuerpo para bibliotecas de péptidos visualizadas por fago) seguidos de amplificación del fago unido en células coli. El trabajo temprano con antifagos antisera generado para la clasificación de especies demostró que el fago virión filamentoso es altamente inmunogénico en ausencia de adyuvantes (Meynell y Lawn, 1968 ) y que sólo la proteína principal de la capa, pVIII, y la proteína menor de la capa, pIII, son blanco de anticuerpos (Pratt et al., 1969; Woolford et al., 1977). Así, la idea de utilizar el fago como portador para obtener anticuerpos contra haptens o polipéptidos poco inmunogénicos fue una extensión natural de la capacidad de mostrar secuencias exógenas recombinantes en su superficie, que fue demostrada por primera vez por de la Cruz et al. (1988). El bajo costo de producción de la partícula de fago, la alta estabilidad y el potencial para la exhibición de alta valencia del antígeno extraño (a través de la pantalla pVIII) también la hicieron atractiva como portadora de la vacuna, especialmente durante las primeras etapas de desarrollo de la tecnología proteica recombinante. Sobre la base de la tecnología existente de portador de péptidos, los primeros inmunogenes de la vacuna filamentosa a base de fago mostraron secuencias cortas de aminoácidos derivadas directamente de proteínas de interés como fusiones recombinantes a pVIII o pIII (de la Cruz et al., 1988). A medida que se desarrollaba y refinaba la tecnología bibliotecaria, los antígenos basados en fagos que mostraban ligandos péptidos de anticuerpos monoclonales (seleccionados de bibliotecas de péptidos aleatorias utilizando el anticuerpo, simulando así con diversos grados de éxito el epítopo plegado del anticuerpo en su antígeno cognado; Geysen et al., 1986; Knittelfelder et al., 2009) también se generaban con fines de inmunización, con el objetivo de provocar anticuerpos antipéptidos que también reconocían la proteína nativa. Cuando se muestran en los fagos, los péptidos que codifican las regiones repetitivas de la proteína de circunsporozoita malarial y la proteína de superficie de merozoita 1 fueron inmunogénicos en ratones y conejos (de la Cruz et al., 1988; Greenwood et al., 1991; Willis et al., 1993; Demangel et al., 1996), y anticuerpos levantados contra esta última reacción cruzada con la proteína de larga duración. Varios determinantes péptidos (o imitaciones de los mismos) del VIH-1 gp120, gp41, gag y transcriptasa inversa fueron inmunogénicos cuando se exhibieron o conjugaron con proteínas de la capa de los fagos (Minenkova et al., 1993; di Marzo Veronese et al., 1994; De Berardinis et al., 1999; Scala et al., 1999; Chen et al., 2001; van Houten et al., 2006 van Houten et al.,, 2010, y en algunos casos provocaron anticuerpos que fueron capaces de neutralizar débilmente virus adaptados al laboratorio (di Marzo Veronese et al., 1994; Scala et al., 1999). La lista de infecciones animales y humanas para las que se han desarrollado inmunogenes péptidos fagosos a medida que las vacunas conducen continúa expandiéndose e incluye patógenos bacterianos, fúngicos, virales y parasitarios (Tabla 2). Si bien en algunos casos los resultados de estos estudios han sido prometedores, las vacunas péptidas basadas en anticuerpos epitópicos ya no son un área de investigación activa por varias razones: i) en muchos casos, los péptidos imitan de forma incompleta o inadecuada epítopos en proteínas plegadas (Irving et al., 2010; véase más adelante); ii) los anticuerpos contra un solo epítopo puede ser de utilidad limitada, especialmente para patógenos altamente variables (Van Regenmortel, 2012); y iii) para patógenos para los que se generan respuestas inmunes protectoras de manera eficiente durante la infección natural, las Más recientemente, los fagos péptidos han sido utilizados en intentos de generar respuestas terapéuticas de anticuerpos para enfermedades crónicas, cáncer, inmunoterapia e inmunocontracepción. Inmunización con fagos que muestran la enfermedad de Alzheimer Los péptidos fibriles β-amiloide produjeron anticuerpos antiagregantes en ratones y cobayas (Frenkel et al., 2000 (Frenkel et al., 2003 Esposito et al., 2008; Tanaka et al., 2011), posiblemente redujo la formación de placa amiloide en ratones (Frenkel et al., 2003; Solomon, 2005; Esposito et al., 2008), y pudo haber ayudado a mantener las habilidades cognitivas en un modelo transgénico de ratón de la enfermedad de Alzheimer (Lavie et al., 2004) ; sin embargo, no está claro cómo se proponen estos anticuerpos para cruzar la barrera hematoencefá (2001) encontró que los anticuerpos criados en ratones contra un péptido ERBB2/HER2 podrían inhibir la proliferación de células de cáncer de mama. Fage mostrando ligandos péptidos de un anticuerpo anti-IgE provocó anticuerpos que unieron moléculas purificadas de IgE (Rudolf et al., 1998), que pueden ser útiles en inmunoterapia de alergia. Varias estrategias para las vacunas anticonceptivas basadas en fagos se han propuesto para el control de las poblaciones animales. Por ejemplo, la inmunización con fagos que muestran péptidos hormonales estimulantes de folículos en pVIII provocó anticuerpos que afectaron la fertilidad de ratones y ovejas (Abdennebi et al., 1999). También se encuentran en desarrollo los péptidos de los antígenos espermáticos (Samoylova et al., 2012a,b) y la hormona liberadora de gonadotropina (Samoylov et al., 2012). En su mayor parte, los péptidos que se muestran en los fagos provocan anticuerpos en animales experimentales (Tabla 2), aunque esto depende de las características del péptido y del método de su exhibición: las fusiones pIII tienden hacia una inmunogenicidad menor que las fusiones pVIII (Greenwood et al., 1991) posiblemente debido a diferencias en el número de copias (pIII: 1-5 copias vs. pVIII: estimadas en varios cientos de copias; Malik et al., 1996). De hecho, el fago es al menos tan inmunogénico como las proteínas portadoras tradicionales, como la albúmina sérica bovina (BSA) y la hemocianina de la cojera de ojo de llave (KLH; Melzer et al., 2003; Su et al., 2007), y tiene comparativamente pocos epítopos de células B endógenas para desviar la respuesta de anticuerpos de su objetivo previsto (Henry et al., 2011). Excepto los epítopos pequeños que pueden ser representados con precisión por una secuencia de aminoácidos cortos contiguos, sin embargo, ha sido extremadamente difícil provocar respuestas de anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con epitopos de proteínas nativas utilizando péptidos. El cuadro general es considerablemente más sombrío que el descrito en la Tabla 2, ya que en varios estudios: (i) los ligandos péptidos seleccionados de las bibliotecas de los fagos fueron clasificados por los autores como imitaciones de epitopos discontinuos si no presentaban una secuencia homológica obvia a la proteína nativa, lo que es una débil evidencia de no linealidad, o (ii) la evidencia de reactividad cruzada de anticuerpos provocada por la inmunización con péptidos discontinuados con proteína nativa no fue obligatoria. Irving et al. (2010) describen al menos una razón de esta falta de éxito: parece que los antígenos péptidos provocan un conjunto de anticuerpos topológicamente restringidos que son en gran medida incapaces de reconocer epitopos discontinuas o complejos en las biomoléculas más grandes. Mientras que el péptido puede imitar la química de un epítopo dado en una proteína plegada (permitiendo que se cruce con un anticuerpo dirigido), siendo una molécula más pequeña, no puede imitar la topología del epítopo completo de ese anticuerpo. A pesar de esto, el fago filamentoso sigue siendo muy útil como portador de péptidos con estructuras secundarias relativamente simples, que pueden ser estabilizados mediante el anclaje a las proteínas de la capa (Henry et al., 2011). Esto puede ser especialmente cierto de los péptidos con mala inmunogenicidad inherente, que puede aumentarse por la visualización de alta valencia y adyuvante asociado a los fago (véase Mecanismos inmunológicos de la vacunación con fago filamentoso más abajo). El fago filamentoso se ha utilizado en menor medida como portador de epítopos péptidos de células T, principalmente El trabajo temprano, que demostró que la inmunización con fage obtuvo ayuda de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993), fue confirmado por varios estudios posteriores (De Berardinis et al., 1999; Ulivieri et al., 2008). Desde la perspectiva de la vacunación contra enfermedades infecciosas, De Berardinis et al. (2000) mostraron que un epitope citotóxico de células T (CTL) de la transcriptasa inversa VIH-1 podría provocar CTLs específicos de antígenos in vitro e in vivo sin adición de epitopos de células T de ayuda exógenas, presumiblemente porque ya están presentes en las proteínas de la capa de fago (Mascolo et al., 2007). Del mismo modo, se observó un uso eficiente de CTLs frente a los epítopos de células T de los fagos de virus de la hepatitis B (Wan et al., 2001) y Candida albicans (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2006 Wang et al., 2014d, que, junto con otros tipos de respuestas inmunes, protegían a los ratones contra la candidiasis sistémica. La vacunación con una combinación de péptidos phagedisplayed provocó CTLs específicos de antígenos que resultaron eficaces en la reducción de la cisticercosis porcina en un ensayo controlado aleatorio (Manoutcharian et al., 2004; Morales et al., 2008). Mientras que las correlaciones de la protección inmune inducida por la vacuna para las enfermedades infecciosas, donde se conocen, son casi exclusivamente anticuerpos séricos o mucosas (Plotkin, 2010), En ciertas aplicaciones de la vacuna, el fago filamentoso se ha utilizado como portador de moléculas más grandes que serían inmunogénicas incluso en aislamiento. Inicialmente, las principales ventajas de la exhibición de estos antígenos de los fago eran la velocidad, facilidad de purificación y bajo costo de producción (Gram et al., 1993). E. coli F17a-G adhesin (Van Gerven et al., 2008), antígeno del núcleo de la hepatitis B (Bahadir et al., 2011), y antígeno de la superficie de la hepatitis B (Balcioglu et al., 2014) todas produjeron respuestas de anticuerpos cuando se exhibieron en la pIII, aunque ninguno de estos estudios comparó la inmunogenicidad de las Phage que muestra Schistosoma mansoni glutatión S-transferasa en pIII provocó una respuesta de anticuerpos que fue tanto más alta en el título como de diferentes isotipos en comparación con la inmunización con la proteína sola (Rao et al., 2003). Dos estudios de vacunas antiidiotípicas han utilizado el fago como portador de fragmentos de anticuerpos que contienen idiotipos inmunogénicos. Inmunización con fago que muestra el 1E10 idiotaype scFv (mimicking a Vibrio anguillarum surface epitope) provocó anticuerpos que protegían a los peces babosos de Vibrio anguillarum challenge (Xia et al., 2005). Una vacuna de idiotipo de tumor específico de phage-BCL1 vinculada químicamente fue débilmente inmunogénica en ratones pero extendió el tiempo de supervivencia en un modelo de linfoma de células B (Roehnisch et al., 2013), y fue bien tolerada e inmunogénica en pacientes con mieloma múltiple (Roehnisch et al., 2014). Un estudio de vacunación de ADN con antilaminarina scFv encontró que el ADN codificando una proteína de fusión pIII-scFv provocó respuestas inmunes humorales y mediadas por células más fuertes que el ADN codificando el scFv solo (Cuesta et al., 2006), sugiriendo que bajo algunas circunstancias, los epitopos de células T de fago endógeno pueden mejorar la inmunogenicidad de proteínas asociadas. Tomados en conjunto, los resultados de estos estudios muestran que como partícula similar a un virus de partículas, el fago filamentoso probablemente desencadena diferentes tipos de respuestas inmunitarias que los antígenos de proteínas recombinantes, y proporciona ayuda adicional de células T a las proteínas exhibidas o conjugadas. Sin embargo, el bajo número de copias de proteínas visualizadas pIII, así como la adyuvancia potencialmente no deseada asociada a los fagos, pueden hacer de la exhibición de proteínas recombinantes por fago una elección vacunal subóptima. Aunque nuestra comprensión de la respuesta inmune contra los palidezes fagosas filamentosas en comparación con antígenos modelo clásicos como la ovalbúmina, los últimos trabajos han comenzado a arrojar luz sobre los mecanismos inmunes activados en respuesta a la vacunación de los fagos (Figura 1). La partícula del fago es inmunogénica sin adyuvante en todas las especies probadas hasta la fecha, incluyendo ratones (Willis et al., 1993), ratas (Dente et al., 1994), conejos (de la Cruz et al., 1988), cobayas (Frenkel et al., 2000; Kim et al., 2004), peces (Coull et al., 1996; Xia et al., 2005), primates no humanos (Chen et al., 2001) y humanos (Roehnisch et al., 2014). Se han empleado varias vías de inmunización, incluyendo administración oral (Delmastro et al., 1997) así como subcutánea (Grabowska et al., 2000), intraperitoneal (van Houten et al., 2006), intramuscular (Samoylova et al., 2012a), intravenosa (Vaks y Benhar, 2011), e inyección intradérmica (Roehnisch et al., 2013); ningún estudio publicado ha comparado directamente el efecto de la vía de administración sobre la inmunogenicidad fagosa filamentosa. Los anticuerpos se generan contra sólo tres sitios principales en el virión: (i) los N-terminal expuestos a la superficie 12 de la retícula monomérica pVIII (Terry et al., 1997; Kneissel et al., 1999) ; (ii) los dominios N-terminal N1 y N2 de la pIII (van Houten et al., 2010); y (iii) lipopolisacárido bacteriano (LPS) incrustado en la capa de fago (Henry et al., 2011). En ratones, los títulos de anticuerpos séricos contra el fago suelen alcanzar 1:10 5 -1:10 6 después de 2-3 inmunizaciones, y se mantienen durante al menos 1 año postinmunización (Frenkel et al., 2000). Las respuestas primarias de anticuerpos contra el fago parecen estar compuestas por una mezcla de isotipos IgM e IgG2b en ratones C57BL/6, mientras que las respuestas secundarias de anticuerpos están compuestas principalmente de isotipos IgG1 e IgG2b, con una menor contribución de isotipos IgG2c e IgG3 (Hashiguchi et al., 2010). La supresión de los dominios N1 y N2 expuestos a la superficie de pIII produce una forma truncada de esta proteína que no provoca anticuerpos, sino que también produce una partícula de fago no infecciosa con menor inmunogenicidad general (van Houten et al., 2010). Como partícula similar a un virus, el fago filamentoso envuelve múltiples brazos del sistema inmune, comenzando con efectores celulares de inmunidad innata (macrofagos, neutrófilos y posiblemente células asesinas naturales), que son reclutados en sitios tumorales por fago que muestran moieties tumorales. El fago probablemente activa las respuestas de anticuerpos independientes de células T, ya sea a través de ligandos TLR asociados a los fagoes o enlaces cruzados por la celosía pVIII. Después del procesamiento por células que presentan antígenos, los péptidos derivados de los fagotes se presentan en la clase II de la MHC y en la clase I de la MHC, resultando en la activación de CTL de corta duración y una serie de tipos de células T ayudantes, que ayudan a la memoria primaria CTL y respuestas de células B de alta afinidad. Las fronteras en la microbiología www.fronterizosin.orgAunque los títulos de anticuerpos antifagos séricos parecen ser al menos parcialmente dependientes de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993; De Berardinis et al., 1999; van Houten et al., 2010), muchas células B específicas de pVIII circulantes en la sangre carecen de mutación somática incluso después de repetidas inmunizaciones quincenales, lo que sugiere que bajo estas condiciones, el fago activa respuestas de células B independientes de células T además de respuestas dependientes de células T de alta afinidad (Murira, 2014). Las partículas filamentarias de fagos pueden ser procesadas por células presentadoras de antígenos y presentadas en moléculas de clase II de MHC (Gaubin et al., 2003; Ulivieri et al., 2008) y pueden activar T H 1, T H 2 y T H 17 células T ayudantes (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2014d). Las respuestas antifagos T H 2 se mejoraron mediante la visualización de péptidos CTLA-4 fusionados con pIII (Kajihara et al., 2000). Las proteínas de Phage también pueden presentarse de forma cruzada en moléculas de clase I de MHC (Wan et al., 2005) y pueden producir dos ondas de respuestas CTL, que consisten primero en CTL de corta duración y después de CTL de memoria de larga duración que requieren ayuda de células CD4 + T (Del Pozzo et al., Estos últimos CTLs median una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (Fang et al., 2005; Del Pozzo et al., 2010). La partícula de fago es autoadyuvante a través de múltiples mecanismos. El LPS derivado de la pared de la célula huésped realza la inmunogenicidad del virión, y su eliminación por cromatografía de polimixina B reduce los títulos de anticuerpos contra las proteínas de capa de fago (Grabowska et al., 2000). El genoma de ADN singlestranded del fago contiene motivos CpG y también puede tener un efecto adyuvante. La respuesta de anticuerpos contra el fago es totalmente dependiente de la señalización de MyD88 y se modula mediante la estimulación de varios receptores de tipo peaje (Hashiguchi et al., 2010), indicando que la inmunidad innata juega un papel importante pero en gran Los estudios de biodistribución del fago después de la inyección intravenosa muestran que se elimina de la sangre en cuestión de horas a través del sistema reticuloendotelial (Molenaar et al., 2002), particularmente del hígado y el bazo, donde se retiene durante días (Zou et al., 2004), potencialmente activando respuestas de células B de zona marginal. Por lo tanto, el fago filamentoso no sólo es un portador altamente inmunogénico, sino que, gracias a la activación de una gama de respuestas inmunes innatas y adaptativas, sirve como un excelente modelo de antígeno de partícula similar al virus. Mucho antes de la identificación del fago filamentoso, otros tipos de bacteriofago ya se estaban utilizando para la terapia antibacteriana en la antigua Unión Soviética y Europa Oriental (revisado en Sulakvelidze et al., 2001). El fago filamentoso, con su ciclo de vida no lítico, tiene usos clínicos menos obvios, a pesar de que la especificidad del huésped de Inovirus y Plectrovirus incluye muchos patógenos de importancia médica, incluyendo Salmonella, E. coli, Shigella, Pseudomonas, Clostridium y Micoplasma. En un esfuerzo por mejorar su actividad bactericida, los fagoces filamentosos genéticamente modificados se han utilizado como "caballo de Troya" para introducir diversos agentes antibacterianos en las células. Los fagos M13 y Pf3 fueron diseñados para expresar la restricción BglII endonucleasa (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004), lambda fage S holin (Hagens y Blasi, 2003) o una proteína activadora letal del gen catabolita (Moradpour et al., 2009) que mató eficazmente a las células E. coli y Pseudomonas aeruginosa, respectivamente, sin liberación concomitante de LPS (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004). Lamentablemente, la rápida aparición de bacterias resistentes con pili F modificado representa un obstáculo importante y posiblemente insuperable a este enfoque. Sin embargo, hay algunos indicios de que los fagos filamentosos pueden ejercer efectos útiles pero más sutiles sobre sus hospedadores bacterianos que pueden no resultar en el desarrollo de resistencia a la infección. Varios estudios han reportado aumento de la sensibilidad antibiótica en poblaciones bacterianas infectadas simultáneamente con fago filamentoso tipo salvaje (Hagens et al., 2006) o fago diseñado para reprimir la respuesta celular SOS (Lu y Collins, 2009). La infección filamentosa f1 inhibió la formación de biopelículas en E. coli, pero no madura (May et al., 2011). Así, los fago filamentosos no modificados pueden ser de interés futuro como elementos de terapia combinada contra ciertas infecciones resistentes a fármacos. Las aplicaciones terapéuticas más avanzadas del fago filamentoso emergen cuando se modifica para expresar una fracción dirigida específica para células patógenas y/o proteínas para el tratamiento de enfermedades infecciosas, cáncer y autoinmunidad (Figura 2). El primer trabajo en esta área mostró como prueba de concepto que los fagos codificando un cassette de expresión GFP y mostrando un HER2specific scFv en todas las copias de pIII fueron internalizados en células tumorales de mama, resultando en la expresión GFP (Poul y Marks, 1999). M13 o fd fagos mostrando un péptido objetivo o fragmento de anticuerpos y amarrados a cloranfenicol por un crosslinker lábil eran inhibidores más potentes del crecimiento de Staphylococcus aureus que el cloranfenicol libre de alta concentración (Yacoby et al., 2006; Vaks y Benhar, 2011). M13 fagos cargados con doxorubicina y mostrando un péptido objetivo en células de cáncer de próstata específicamente muertas en pIII in vitro (Ghosh et al., péptido tumoral específico: proteínas de fusión de pVIII seleccionadas de "paisaje" fage (Romanov et al., 2001; Abbineni et al., 2010; Fagbohun et al., 2012 Fagbohun et al., 2013 Lang et al., 2014; Wang et al., 2014a) fueron capaces de dirigir y entregar siRNA-, paclitaxel-, y liposomas que contienen doxorubicina a las células tumorales (Jayanna et al., 2010a; Wang et al., 2010a Wang et al.,, b, c, 2014b Bedi et al., 2011 Bedi et al.,, 2013 Bedi et al.,, 2014 ; eran tasas de remisión tumoral no tóxicas y aumentadas en modelos de ratón (Jayanna et al., 2010b; Wang et Usando el modelo de tumor B16-OVA, Eriksson et al. (2007) mostraron que los fagos que mostraban péptidos y/o Fabs específicos para antígenos tumorales retrasaron el crecimiento del tumor y mejoraron la supervivencia, debido en gran parte a la activación de macrófagos asociados al tumor y al reclutamiento de neutrófilos en el sitio del tumor (Eriksson et al., 2009). Phage mostrando un scFv frente a fibriles β-amiloide mostró promesa como diagnóstico (Frenkel y Solomon, 2002) y terapéutico (Solomon, 2008) reactivo para la enfermedad de Alzheimer y Parkinson debido a la capacidad imprevista del fago para penetrar en el tejido cerebral (Ksendzovsky et al., 2012). Del mismo modo, los fagos que muestran un epítopo péptido inmunodominante derivado de la mielina oligodendrocyte glucoproteína desmielinizantes patógenos agotados anticuerpos en el tejido cerebral en el modelo murina experimental de encefalomielitis autoinmune de esclerosis múltiple (Rakover et al., 2010). Las ventajas del fago filamentoso en este contexto sobre los conjugados tradicionales anticuerpo-fármaco o proteico-péptido son: i) su capacidad para transportar cantidades muy altas de fármaco o péptido, y ii) su capacidad para acceder a compartimentos anatómicos que generalmente no pueden ser alcanzados por la administración sistémica de una proteína. A diferencia de la mayoría de los biológicos terapéuticos, la producción del fago filamentoso en bacterias complica su uso en los seres humanos de varias maneras. En primer lugar, los preparados crudos de fago filamentoso suelen contener niveles muy altos de SLP contaminante, en el rango de 10 unidades de endotoxina 2-10 4 (EU)/ml (Boratynski et al., 2004; Branston et al., 2015), que tienen el potencial de causar reacciones adversas graves. LPS no se elimina completamente por precipitación de polietilenglicol o centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio (Smith y Gingrich, 2005; Branston et al., 2015), pero sus niveles se pueden reducir drásticamente utilizando pasos de purificación adicionales como cromatografía de exclusión de tamaño (Boratynski et al., 2004; Zakharova et al., 2005), cromatografía de polimixina B (Grabowska et al., 2000), y tratamiento con detergentes como Triton X-100 o Triton X-114 (Roehnisch et al., 2014; Branston et al., 2015). Estas estrategias alcanzan de forma rutinaria niveles de endotoxina < 1 EU/ml medidos por el lisato de limulo amebocito (LAL), muy por debajo del límite de la FDA para la administración parenteral de 5 EU/kg de peso corporal/dosis, aunque sigue habiendo preocupaciones con respecto a la presencia de LPS residuales asociadas al virión que pueden ser indetectables.Una segunda consecuencia, y tal vez inevitable, de la producción bacteriana del fago filamentoso es la heterogeneidad inherente del tamaño de las partículas y el espectro de contaminantes solubles y asociados al virión del huésped, que pueden ser causa de problemas de seguridad y restringir su uso a los grupos de alto riesgo. Se han propuesto muchos tipos de variantes de bacteriofago y fagos diseñados, incluido el fago filamentoso, para uso profiláctico ex vivo en seguridad alimentaria, ya sea en la tubería de producción (revisado en Dalmasso et al., 2014) o para la detección de patógenos transmitidos por alimentos postproducción (revisado en Schmelcher y Loessner, 2014). Fago filamentoso que muestra una etiqueta de tetracisteína en pIII se utilizaron para detectar células E. coli a través de tinción con tinte biarsenical. Biosensores basados en resonancia de plasmón superficial (Nanduri et al., 2007), transductores piezoeléctricos (Olsen et al., 2006), dicroísmo lineal (Pacheco-Gomez et al., 2012), y tecnología de sensores magnetoelásticos (Lakshmanan et al., 2007; Huang et al., 2009) fueron ideados utilizando fagos filamentosos que muestran scFv o conjugados a IgG enteros contra E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium y Bacillus anthracis con límites de detección en el orden de 10 2-10 6 células bacterianas/ml. Prueba de concepto ha sido demostrado para el uso de tales biosensores a base de fagos para detectar contaminación bacteriana de productos vivos (Li et al., 2010 La partícula fagosa filamentosa está encerrada por un capsid de proteína similar a la varilla, de 1000 nm de largo y 5 nm de ancho, formado casi enteramente por monómeros de pVIII superpuestos, cada uno de los cuales se encuentra en 27 angstroms de su vecino más cercano y expone dos grupos de aminas, así como al menos tres grupos de carboxilo (Henry et al., 2011). La regularidad de la celosía de pVIII de fagos y su diversidad de grupos químicamente direccionables la convierten en un andamio ideal para la bioconjugación (Figura 3). El enfoque más utilizado es la funcionalización de grupos de aminas con ésteres NHS (van Houten et al., 2006 (van Houten et al., 2010 Yacoby et al., 2006), aunque esto puede resultar en una a Los grupos de carboxilo y los residuos de tirosina también se pueden funcionalizar utilizando acoplamiento de carbodiimida y acoplamiento de diazonio, respectivamente (Li et al., 2010a). Carrico et al. (2012) desarrollaron métodos para etiquetar específicamente pVIII N-termina sin modificación de residuos de lisina expuestos a través de una reacción de formación de transaminación-oxima en dos pasos. La modificación específica de las proteínas de la capa de fago es aún más fácil de lograr usando péptidos modificados genéticamente (Ng et al., 2012) o enzimas (Chen et al., 2007; Hess et al., 2012), pero esto puede ser engorroso y es menos general en aplicación. Durante más de una década, el interés en el fago filamentoso como bloque de construcción de nanomateriales ha ido creciendo debido a sus propiedades fisicoquímicas únicas, con aplicaciones emergentes en magnet Desde hace mucho tiempo se sabe que por encima de un determinado umbral de concentración, el fago puede formar suspensiones cristalinas ordenadas (Welsh et al., 1996). Lee et al. (2002) diseñaron un fago M13 para mostrar un péptido de unión ZnS en pIII y demostraron que, en presencia de nanopartículas ZnS, se autoensamblan en biomateriales de película altamente ordenados que se pueden alinear utilizando campos magnéticos. Aprovechando la capacidad de mostrar péptidos específicos de sustratos en lugares conocidos en el filamento fagotico Hess et al., 2012), este pionero FIGURE 3 Grupos químicamente direccionables de la capa principal de bacteriofago filamentoso. El virión del fago filamentoso se compone de 2.500-4.000 copias superpuestas de la proteína 50-residue Cada monómero tiene una serie de grupos químicamente direccionables disponibles para la conjugación bioortogonal, incluyendo dos grupos de aminas primarias (mostradas en rojo), tres grupos de carboxilo (mostradas en azul) y dos grupos de hidroxilo (mostradas en verde). Los 12 residuos N-terminales generalmente expuestos al sistema inmune para la unión de anticuerpos están en negrita subrayado. Figura adaptada a partir de datos estructurales de Marvin, 1990, disponible libremente en bases de datos PDB y SCOPe. el trabajo se convirtió en la base para la construcción de nanomateriales bidimensionales y tridimensionales con arquitecturas más avanzadas, incluyendo nanohilos semiconductores (Mao et al., 2003 (Mao et al.,, 2004, nanopartículas, y nanocomposites (Oh et al., 2012; Chen et al., 2014). Utilizando los péptidos híbridos de unión de oro y Co 3 O 4 en pVIII como andamio para ensamblar nanohilos en multicapas de polielectrolitos, Nam et al. (2006) produjeron una batería de iones de litio delgada y flexible, que podía ser estampada en colectores de corriente de microbanda de platino (Nam et al., 2008). Las propiedades electroquímicas de estas baterías se mejoraron aún más a través de la visualización pIII de péptidos de unión de nanotubos de carbono de una sola pared (Lee et al., 2009), ofreciendo un enfoque para la producción sostenible de electrodos nanoestructurados a partir de materiales de partida mal conductivos. Los nanomateriales a base de fage han encontrado aplicaciones en la imagen del cáncer (Ghosh et al., 2012b; Yi et al., 2012), la división del agua fotocatalítica (Nam et al., 2010a; Neltner et al., 2010), la recolección de luz (Nam et al., 2010b; Chen et al., 2013), las tecnologías fotorespuestas (Murugesan et al., 2013), los electrodos neuronales (Kim et al., 2014), y la generación de energía piezoeléctrica (Murugesan et al., 2013). Así, las propiedades fisicoquímicas únicas del fago, en combinación con la visualización modular de péptidos y proteínas con especificidad de unión conocida, han desove materiales totalmente nuevos con diversas aplicaciones. Vale la pena señalar que las propiedades bio La alineación magnética de los fagos filamentosos de alta concentración en solución puede ordenar parcialmente el ADN, el ARN, las proteínas y otras biomoléculas para la medición de las interacciones de acoplamiento dipolar (Hansen et al., 1998 (Hansen et al., 2000 Dahlke Ojennus et al., 1999) en espectroscopia NMR. Debido a su gran tamaño de población, tiempos de generación cortos, tamaños de genoma pequeños y facilidad de manipulación, diversos bacteriófagos filamentosos y no filamentosos se han utilizado como modelos de evolución experimental (revisado en Husimi, 1989; Wichman y Brown, 2010; Kawecki et al., 2012; Hall et al., 2013). El fago filamentoso tiene usos prácticos adicionales en ingeniería proteica y evolución proteica dirigida, debido a su tolerancia única de modificaciones genéticas que permiten mostrar biomolécula En primer lugar, entre estas aplicaciones se encuentra la maduración in vitro de la afinidad de los fragmentos de anticuerpos mostrados en pIII. Las bibliotecas de variantes Fabs y anticuerpos de cadena única pueden generarse mediante mutagenesis aleatoria o sitedirected y seleccionarse sobre la base de una unión mejorada o alterada, imitando más o menos la estrategia de evolución somática del sistema inmunitario (Marks et al., 1992; Bradbury et al., 2011). Sin embargo, otros sistemas de visualización in vitro, como la visualización de levaduras, tienen importantes ventajas sobre el fago filamentoso para la maduración de afinidad (aunque cada tecnología de visualización tiene fortalezas complementarias; Koide y Koide, 2012) y, independientemente del método de visualización, la selección de variantes "mejoradas" puede ser lenta y engorrosa. Se han desarrollado métodos iterativos para combinar mutaciones de diseño computacional (Lippow et Recientemente, Esvelt et al. (2011) desarrollaron una nueva estrategia para la evolución dirigida de las proteínas fagosas filamentosas, denominadas evolución continua asistida por fagos (PACE), que permite múltiples rondas de evolución por día con poca intervención experimental.Los autores diseñaron el fago M13 para codificar una proteína exógena (sujeto a la evolución dirigida), cuya actividad funcional desencadena la expresión del gen III de un plasmido accesorio; variantes de la proteína exógena surgen por mutagenesis aleatoria durante la replicación de fagos, cuya tasa puede aumentarse mediante la expresión inducible de polimerasas de ADN propensas a errores. Al suministrar cantidades limitadas de células E. coli receptivas a las variantes de fagosas diseñadas, Esvelt et al. (2011) vincula elegantemente la infectividad y producción de fagos con la presencia de un fenotipo proteico deseado. Carlson et al. (2014) más tarde mostró que la severidad de selección PACE podría ser modulada proporcionando pequeñas cantidades de pIII independientemente del fenotipo proteico, y funciones proteicas indeseables seleccionadas negativamente al vincularlas a la expresión de una variante pIII truncada que altera la infectividad en una forma negativa dominante. PACE se limita actualmente a funciones proteicas que pueden estar vinculadas de alguna manera a la expresión de un reportero del gen III, tales como interacción proteína-proteína, recombinación, unión ADN o ARN, y catálisis enzimática (Meyer y Ellington, 2011). Este enfoque representa una vía prometedora para la investigación básica en evolución molecular (Dickinson et al., 2013) y biología sintética, incluyendo ingeniería de anticuerpos. El bacteriofago filamentario se ha recuperado de diversas fuentes ambientales, incluyendo el suelo (Murugaiyan et al., 2011), el agua dulce costera (Xue et al., 2012), los lagos alpinos (Hofer y Sommaruga, 2001) y las bacterias del mar profundo (Jian et al., 2012), pero tal vez no sorprendentemente el intestino humano (Kim et al., 2011). El "fageoma" ambiental en el suelo y el agua representan la mayor fuente de replicación de ADN en el planeta, y se estima que contiene más de 10 30 partículas virales (Ashelford et al., 2003; Chibani-Chennoufi et al., 2004; Suttle, 2005). Los pocos estudios que intentan investigar la ecología ambiental de los fagos filamentosos utilizando técnicas clásicas de microbiología ambiental (normalmente observación directa por microscopía electrónica) encontraron que los fagos filamentosos constituían entre el 0 y el 100% de todas las partículas virales (Demuth et al., 1993; Pina et al., 1998; Hofer y Sommaruga, 2001). Hubo alguna evidencia de fluctuación estacional de poblaciones de fagos filamentosos junto con la abundancia relativa de bacterias heterotróficas libres (Hofer y Sommaruga, 2001). Los datos existentes sugieren que los fagos filamentosos son constituyentes menores de comunidades virales en agua dulce (Roux et al., 2012) y agua recuperada y potable (Rosario et al., 2009), pero tienen frecuencias mucho más altas en aguas residuales y aguas residuales (Cantalupo et al., 2011; Alhamlan et al., 2013), con la salvedad de que los sesgos inherentes a las metodologías para determinar estos datos (purificación de partículas virales, sesgos de secuenciación) no han sido bien validados. No hay datos que describan la dinámica poblacional de los fagos filamentosos y sus especies hospedantes en el entorno natural. A nivel individual de virus-bacterio, está claro que los fagos filamentosos pueden modular el fenotipo huésped, incluyendo la virulencia de importantes patógenos humanos y de cultivos. Esto puede ocurrir ya sea a través de efectos directos de replicación de fagos en el crecimiento celular y la fisiología, o, más típicamente, por transferencia horizontal de material genético contenido en episomas y/o profagos cromosómicamente integrados. Fago filamentoso templado también puede jugar un papel en la evolución del genoma (revisado en Canchaya et al., 2003). Tal vez el ejemplo mejor estudiado de modulación de virulencia por fago filamentoso es el de Vibrio cholerae, cuya virulencia completa requiere conversión lisogénica por la toxina del cólera codificante CTX La integración de los fagos CTXo se produce en sitios específicos del genoma; estas secuencias se introducen a través de la acción combinada de otro fagos filamentoso, fs2o, y un fagoso filamentoso satelital, TLC-KnŁo1 (Hassan et al., 2010). Así, las especies de fagos filamentosos interactúan y coevolucionan entre sí, además de sus anfitriones. La infección por fagos filamentosos se ha implicado en la virulencia de Yersinia pestis (Derbise et al., 2007), Neisseria meningitidis (Bille et al., 2005 (Bille et al., 2008, Vibrio parahemolyticus (Iida et al., 2001), E. coli 018:K1:H7 (Gonzalez et al., 2002), Xanthomonas campestris (Kamiunten and Wakimoto, 1982), y P. aeruginosa (Webb et al., 2004), aunque en la mayoría de estos casos, los mecanismos específicos que modulan la virulencia no son claros. La infección por fage puede potenciar o reprimir la virulencia dependiendo de las características del fago, la bacteria huésped y el medio ambiente, como es el caso del patógeno de la marchitez bacteriana Ralstonia solanacearum (Yamada, 2013). Dado que la infección resulta en la regulación de los pili utilizados para la entrada viral, el tratamiento del fago filamentoso se ha propuesto como un medio hipotético para inhibir la conjugación bacteriana y la transferencia génica horizontal, a fin de evitar la propagación de genes de resistencia a antibióticos (Lin et al., 2011). Finalmente, el fago filamentoso también puede desempeñar un papel futuro en la preservación de la biodiversidad de otros organismos en ecosistemas de riesgo. Se ha propuesto el uso del fago artificial en la biorremediación, ya sea mostrando fragmentos de anticuerpos de la especificidad deseada para la filtración de toxinas y contaminantes ambientales (Petrenko y Makowski, 1993), o como polímeros biodegradables que muestran péptidos seleccionados por su capacidad para agregar contaminantes, tales como residuos de arenas oleaginosas (Curtis et al., 2011 (Curtis et al., 2013 ). También se ha propuesto el uso de péptidos diseñados que se unen específicamente a materiales inorgánicos en tecnologías de separación mineral más avanzadas y menos intrusivas (Curtis et al., 2009 ). El fago filamentoso representa un organismo altamente versátil cuyos usos van mucho más allá de la exhibición tradicional de fago y la selección de afinidad de anticuerpos y polipéptidos de especificidad deseada. Su alta inmunogenicidad y su capacidad para mostrar una variedad de antígenos superficiales hacen que el fago sea un excelente portador de la vacuna antipartículas, aunque su producción y preparación bacterianas probablemente limiten sus aplicaciones en vacunas humanas en la actualidad, a pesar de ser aparentemente seguros y bien tolerados en animales y personas. Las características imprevistas de la partícula antifago, como el cruce de la barrera hematoencefálica y la formación de fases cristalinas líquidas altamente ordenadas, han abierto nuevas vías de investigación en terapias para enfermedades crónicas y el diseño de nanomateriales. Nuestra comprensión comparativamente detallada de las interacciones del fagotismo filamentoso modelo con sus huéspedes bacterianos ha permitido a los investigadores aprovechar el ciclo de vida del fago para dirigir la evolución proteica en el laboratorio. Esperamos que un conocimiento más profundo de las interacciones entre los hospederos de fago a nivel ecológico pueda producir estrategias novedosas para controlar la pato Mientras se siguen desarrollando nuevas aplicaciones del fago filamentoso, es probable que el fago conserve su posición como caballo de batalla para el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos durante muchos años, incluso con el advenimiento de tecnologías competidoras. KH y JS concibieron y escribieron el manuscrito. MA-G leyó el manuscrito y comentó sobre el texto.

¿Qué ha permitido la tecnología de los bacterifagos y la biblioteca de variantes de proteínas plegadas?

Más allá de la visualización de los fagos: aplicaciones no tradicionales del bacteriofago filamentoso como portador de vacunas, andamio biológico terapéutico y bioconjugadorhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4523942/SHA: f00f183d0bce0091a02349ec1eab44a76a9bc4Autores: Henry, Kevin A.; Arbabi-Ghahroudi, Mehdi; Scott, Jamie K.Fecha: 2015-08-04DOI: 10.3389/fmicb.2015.00755Licencia: cc-byAbstract: Durante los últimos 25 años, la tecnología de exhibición de fagos ha sido una herramienta inestimable para los estudios de interacciones proteína-proteína. Sin embargo, las propiedades biológicas, bioquímicas y biofísicas inherentes al bacteriofago filamentoso, así como la facilidad de su manipulación genética, también lo convierten en una plataforma atractiva fuera del canon de exhibición tradicional de fagos. Esta revisión se centrará en las propiedades únicas del bacteriofago filamentoso y destacará sus diversas aplicaciones en la investigación actual. Se ponen énfasis en: (i) las ventajas del fago como portador de la vacuna, incluyendo su alta inmunogenicidad, relativa simplicidad antigénica y capacidad para activar una gama de respuestas inmunes, (ii) el potencial del fago como agente profiláctico y terapéutico para enfermedades infecciosas y crónicas, (iii) la regularidad de la retícula de la proteína de la capa principal del virio, que permite una variedad de bioconjugación y aplicaciones de química de la superficie, particularmente en nanomateriales, y (iv) el gran tamaño de la población del fago y los tiempos de generación rápidos, que lo convierten en un excelente sistema modelo para la evolución de proteínas dirigidas. A pesar de su ubicuidad en la biosfera, el trabajo metagenómico apenas está comenzando a explorar la ecología del fago filamentoso y su papel en la evolución de las poblaciones bacterianas. Así, el fago filamentoso representa un microorganismo robusto, barato y versátil cuyas aplicaciones de bioingeniería continúan expandiéndose en nuevas direcciones, aunque sus limitaciones en algunas esferas imponen obstáculos a su adopción y uso generalizados. Texto: El bacteriofago filamentoso (genera Inovirus y Plactrovirus) son virus no envueltos en forma de varilla de Escherichia coli, cuyos largos capsidios helicoidales encapsulan un genoma circular de ADN de una sola cadena. Después del descubrimiento independiente de bacteriofago por Twort (1915) y d 'Hérelle (1917), el primer fago filamentoso, f1, fue aislado en Loeb (1960) y más tarde caracterizado como un miembro de un grupo más grande de fago (Ff, incluyendo f1, M13, y fd fago) específico para el E. coli conjugativo F pilus (Hofschneider y Mueller-Jensen, 1963; Marvin y Hoffmann-Berling, 1963; Zinder et al., 1963; Salivar et al., 1964). Poco después, se descubrió un fago filamentoso que no utiliza F-pili para la entrada (If y Ike; Meynell y Lawn, 1968; Khatoon et al., 1972), y con el tiempo la lista de fago filamentoso conocido se ha expandido a más de 60 miembros (Fauquet et al., 2005), incluyendo especies templadas y grampositivas. El trabajo de varios grupos en los últimos 50 años ha contribuido a una comprensión relativamente sofisticada de la estructura filamentosa, biología y ciclo vital (revisado en Marvin, 1998; Rakonjac et al., 2011; Rakonjac, 2012). A mediados de la década de 1980, el principio de modificar el genoma de fago filamentoso para mostrar polipéptidos como fusiones para cubrir proteínas en la superficie del virión fue inventado por Smith y colegas (Smith Sobre la base de las ideas descritas en Parmley y Smith (1988), los grupos de California, Alemania y el Reino Unido desarrollaron plataformas de fage-display para crear y proyectar bibliotecas de variantes de péptidos y proteínas plegadas (Bass et al., 1990; Devlin et al., 1990; McCafferty et al., 1990; Scott y Smith, 1990; Breitling et al., 1991; Kang et al., 1991). Esta tecnología permitió, por primera vez, la capacidad de conectar sin problemas la información genética con la función proteica para un gran número de variantes proteicas simultáneamente, y ha sido ampliamente y productivamente explotada en estudios de interacciones proteicas. Muchas excelentes revisiones están disponibles en bibliotecas de fage-display y sus aplicaciones (Kehoe y Kay, 2005; Bratkovic, 2010; Pande et al., 2010). Sin embargo, el fago tiene también una serie de propiedades estructurales y biológicas únicas que lo hacen altamente útil en áreas de investigación que han recibido mucha menos atención. Así, el propósito de esta revisión es destacar el trabajo reciente y actual utilizando fago filamentoso en aplicaciones nuevas y no tradicionales. Específicamente, nos referimos a proyectos que se basan en el fago filamentoso como un elemento clave, pero cuyo propósito principal no es la generación o cribado de bibliotecas fagodisplayed para obtener ligandos polipéptidos de unión. Estos tienden a caer en cuatro categorías principales de uso: i) fago filamentoso como portador de vacuna; ii) fago filamentoso diseñado como un agente biológico terapéutico en enfermedades infecciosas y crónicas; iii) fago filamentoso como un andamio para bioconjugación y química superficial; y iv) fago filamentoso como un motor para la evolución de variantes de proteínas exhibi Una sección final está dedicada a los últimos desarrollos en la ecología fagosa filamentosa y las interacciones fagosas-anfitriona. Los temas comunes compartidos entre todas estas aplicaciones incluyen las propiedades biológicas, inmunológicas y fisicoquímicas únicas del fago, su capacidad para mostrar una variedad de biomoléculas de forma modular, y su relativa simplicidad y facilidad de manipulación. Casi todas las aplicaciones del fago filamentoso dependen de su capacidad para mostrar polipéptidos en la superficie del virio como fusiones a proteínas de la capa de fago (Tabla 1). El modo de visualización determina el tamaño máximo tolerado del polipéptido fusionado, su número de copia en el fago, y potencialmente, la estructura del polipéptido mostrado. La visualización se puede lograr fusionando ADN codificando un polipéptido de interés directamente para el gen codificando una proteína de la capa dentro del genoma fago Sin embargo, con mucha más frecuencia, sólo se modifica una copia de la proteína de la capa en presencia de una segunda copia de tipo salvaje (por ejemplo, se muestra el tipo 88 si tanto los genes de tipo recombinante como los de tipo salvaje pVIII están en el genoma de los fagos, se muestra el tipo 8+8 si el Parmley y Smith (1988), McConnell et al. (1994), Rondot et al. (2001) Híbrido (sistemas de tipo 33 y 3+3) Sistema del tipo 3+3 <1 2 Smith y Scott (1993), Smith y Petrenko (1997) pVI Híbrido (sistema del tipo 6+6) Sí <1 2 > 25 kDa Hufton et al. (1999) pVII Sistema totalmente recombinante (sistema del tipo 7) No 5 > 25 kDa Kwasnikowski et al. (2005) Híbrido (sistema del tipo 7+7) (1999) pVIII Totalmente recombinante (fago paisajístico; sistema del tipo 8)No 2700 3 5-8 residuos Kishchenko et al. (1994), Petrenko et al. (1996) Híbrido (sistemas del tipo 88 y 8+8) Sistema del tipo 8+8 +1300 2 >50 kDa Scott and Smith (1990), Greenwood et al. (1991), Smith and Fernandez (2004) piX Totalmente recombinante (sistema del tipo 9+9 *) Sí 5 > 25 kDa Gao et al. (2002) Híbrido (sistema del tipo 9+9) No <1 2 Gao et al. (1999), Shi et al. (2010), Tornetta et al. (2010) 1 Los asteriscos indican la presencia de copias no funcionales de la proteína de la capa en el genoma del fago de ayuda utilizado para rescatar a un phagemid cuya proteína de capa se ha fusiona 2 El número de copia depende del tamaño del polipéptido; típicamente <1 copia por partícula de fago, pero para la visualización del péptido pVIII puede ser de hasta un 15% de moléculas de pVIII en viriones híbridos. 3 El número total de moléculas de pVIII depende del tamaño del genoma del fago; se añade una molécula de pVIII por cada 2,3 nucleótidos en el genoma viral. El gen recombinante 8 se encuentra en un plásmido con un origen fago de replicación) resultando en un virión híbrido con dos tipos diferentes de proteína de capa dada. Con mucho, las proteínas de capa más comúnmente utilizadas para la visualización son la proteína de capa principal, pVIII, y la proteína de capa menor, pIII, con la mayor ventaja de que la primera es la visualización de número de copia más alto (hasta un 15% de moléculas de capa recombinante en un virión híbrido, al menos para fusiones cortas de péptidos), y de que esta última es la capacidad de mostrar algunas proteínas plegadas en un número de copia apreciable (1-5 por partícula de fago). Si bien pVIII muestra proteínas plegadas en un fago híbrido es posible, normalmente resulta en un número de copia de mucho menos de 1 por virio (Sidhu et al., 2000). Para los fines de esta revisión, utilizamos el término "exhibición de fagos" para referirse a un fago filamentoso recombinante que muestra una sola secuencia de polipéptidos en su superficie (o más raramente, visualización biespecífica lograda mediante la fusión de polipéptidos a dos proteínas capsidas diferentes), y el término "biblioteca de fagotismo" para referirse a un grupo diverso de fagobios filamentosos recombinantes que muestran una serie de variantes de polipéptidos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos; péptidos). Tales bibliotecas son normalmente examinadas por ciclos iterativos de panificación contra una proteína de interés inmovilizada (por ejemplo, antígeno para bibliotecas de anticuerpos visualizadas por fago; anticuerpo para bibliotecas de péptidos visualizadas por fago) seguidos de amplificación del fago unido en células coli. El trabajo temprano con antifagos antisera generado para la clasificación de especies demostró que el fago virión filamentoso es altamente inmunogénico en ausencia de adyuvantes (Meynell y Lawn, 1968 ) y que sólo la proteína principal de la capa, pVIII, y la proteína menor de la capa, pIII, son blanco de anticuerpos (Pratt et al., 1969; Woolford et al., 1977). Así, la idea de utilizar el fago como portador para obtener anticuerpos contra haptens o polipéptidos poco inmunogénicos fue una extensión natural de la capacidad de mostrar secuencias exógenas recombinantes en su superficie, que fue demostrada por primera vez por de la Cruz et al. (1988). El bajo costo de producción de la partícula de fago, la alta estabilidad y el potencial para la exhibición de alta valencia del antígeno extraño (a través de la pantalla pVIII) también la hicieron atractiva como portadora de la vacuna, especialmente durante las primeras etapas de desarrollo de la tecnología proteica recombinante. Sobre la base de la tecnología existente de portador de péptidos, los primeros inmunogenes de la vacuna filamentosa a base de fago mostraron secuencias cortas de aminoácidos derivadas directamente de proteínas de interés como fusiones recombinantes a pVIII o pIII (de la Cruz et al., 1988). A medida que se desarrollaba y refinaba la tecnología bibliotecaria, los antígenos basados en fagos que mostraban ligandos péptidos de anticuerpos monoclonales (seleccionados de bibliotecas de péptidos aleatorias utilizando el anticuerpo, simulando así con diversos grados de éxito el epítopo plegado del anticuerpo en su antígeno cognado; Geysen et al., 1986; Knittelfelder et al., 2009) también se generaban con fines de inmunización, con el objetivo de provocar anticuerpos antipéptidos que también reconocían la proteína nativa. Cuando se muestran en los fagos, los péptidos que codifican las regiones repetitivas de la proteína de circunsporozoita malarial y la proteína de superficie de merozoita 1 fueron inmunogénicos en ratones y conejos (de la Cruz et al., 1988; Greenwood et al., 1991; Willis et al., 1993; Demangel et al., 1996), y anticuerpos levantados contra esta última reacción cruzada con la proteína de larga duración. Varios determinantes péptidos (o imitaciones de los mismos) del VIH-1 gp120, gp41, gag y transcriptasa inversa fueron inmunogénicos cuando se exhibieron o conjugaron con proteínas de la capa de los fagos (Minenkova et al., 1993; di Marzo Veronese et al., 1994; De Berardinis et al., 1999; Scala et al., 1999; Chen et al., 2001; van Houten et al., 2006 van Houten et al.,, 2010, y en algunos casos provocaron anticuerpos que fueron capaces de neutralizar débilmente virus adaptados al laboratorio (di Marzo Veronese et al., 1994; Scala et al., 1999). La lista de infecciones animales y humanas para las que se han desarrollado inmunogenes péptidos fagosos a medida que las vacunas conducen continúa expandiéndose e incluye patógenos bacterianos, fúngicos, virales y parasitarios (Tabla 2). Si bien en algunos casos los resultados de estos estudios han sido prometedores, las vacunas péptidas basadas en anticuerpos epitópicos ya no son un área de investigación activa por varias razones: i) en muchos casos, los péptidos imitan de forma incompleta o inadecuada epítopos en proteínas plegadas (Irving et al., 2010; véase más adelante); ii) los anticuerpos contra un solo epítopo puede ser de utilidad limitada, especialmente para patógenos altamente variables (Van Regenmortel, 2012); y iii) para patógenos para los que se generan respuestas inmunes protectoras de manera eficiente durante la infección natural, las Más recientemente, los fagos péptidos han sido utilizados en intentos de generar respuestas terapéuticas de anticuerpos para enfermedades crónicas, cáncer, inmunoterapia e inmunocontracepción. Inmunización con fagos que muestran la enfermedad de Alzheimer Los péptidos fibriles β-amiloide produjeron anticuerpos antiagregantes en ratones y cobayas (Frenkel et al., 2000 (Frenkel et al., 2003 Esposito et al., 2008; Tanaka et al., 2011), posiblemente redujo la formación de placa amiloide en ratones (Frenkel et al., 2003; Solomon, 2005; Esposito et al., 2008), y pudo haber ayudado a mantener las habilidades cognitivas en un modelo transgénico de ratón de la enfermedad de Alzheimer (Lavie et al., 2004) ; sin embargo, no está claro cómo se proponen estos anticuerpos para cruzar la barrera hematoencefá (2001) encontró que los anticuerpos criados en ratones contra un péptido ERBB2/HER2 podrían inhibir la proliferación de células de cáncer de mama. Fage mostrando ligandos péptidos de un anticuerpo anti-IgE provocó anticuerpos que unieron moléculas purificadas de IgE (Rudolf et al., 1998), que pueden ser útiles en inmunoterapia de alergia. Varias estrategias para las vacunas anticonceptivas basadas en fagos se han propuesto para el control de las poblaciones animales. Por ejemplo, la inmunización con fagos que muestran péptidos hormonales estimulantes de folículos en pVIII provocó anticuerpos que afectaron la fertilidad de ratones y ovejas (Abdennebi et al., 1999). También se encuentran en desarrollo los péptidos de los antígenos espermáticos (Samoylova et al., 2012a,b) y la hormona liberadora de gonadotropina (Samoylov et al., 2012). En su mayor parte, los péptidos que se muestran en los fagos provocan anticuerpos en animales experimentales (Tabla 2), aunque esto depende de las características del péptido y del método de su exhibición: las fusiones pIII tienden hacia una inmunogenicidad menor que las fusiones pVIII (Greenwood et al., 1991) posiblemente debido a diferencias en el número de copias (pIII: 1-5 copias vs. pVIII: estimadas en varios cientos de copias; Malik et al., 1996). De hecho, el fago es al menos tan inmunogénico como las proteínas portadoras tradicionales, como la albúmina sérica bovina (BSA) y la hemocianina de la cojera de ojo de llave (KLH; Melzer et al., 2003; Su et al., 2007), y tiene comparativamente pocos epítopos de células B endógenas para desviar la respuesta de anticuerpos de su objetivo previsto (Henry et al., 2011). Excepto los epítopos pequeños que pueden ser representados con precisión por una secuencia de aminoácidos cortos contiguos, sin embargo, ha sido extremadamente difícil provocar respuestas de anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con epitopos de proteínas nativas utilizando péptidos. El cuadro general es considerablemente más sombrío que el descrito en la Tabla 2, ya que en varios estudios: (i) los ligandos péptidos seleccionados de las bibliotecas de los fagos fueron clasificados por los autores como imitaciones de epitopos discontinuos si no presentaban una secuencia homológica obvia a la proteína nativa, lo que es una débil evidencia de no linealidad, o (ii) la evidencia de reactividad cruzada de anticuerpos provocada por la inmunización con péptidos discontinuados con proteína nativa no fue obligatoria. Irving et al. (2010) describen al menos una razón de esta falta de éxito: parece que los antígenos péptidos provocan un conjunto de anticuerpos topológicamente restringidos que son en gran medida incapaces de reconocer epitopos discontinuas o complejos en las biomoléculas más grandes. Mientras que el péptido puede imitar la química de un epítopo dado en una proteína plegada (permitiendo que se cruce con un anticuerpo dirigido), siendo una molécula más pequeña, no puede imitar la topología del epítopo completo de ese anticuerpo. A pesar de esto, el fago filamentoso sigue siendo muy útil como portador de péptidos con estructuras secundarias relativamente simples, que pueden ser estabilizados mediante el anclaje a las proteínas de la capa (Henry et al., 2011). Esto puede ser especialmente cierto de los péptidos con mala inmunogenicidad inherente, que puede aumentarse por la visualización de alta valencia y adyuvante asociado a los fago (véase Mecanismos inmunológicos de la vacunación con fago filamentoso más abajo). El fago filamentoso se ha utilizado en menor medida como portador de epítopos péptidos de células T, principalmente El trabajo temprano, que demostró que la inmunización con fage obtuvo ayuda de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993), fue confirmado por varios estudios posteriores (De Berardinis et al., 1999; Ulivieri et al., 2008). Desde la perspectiva de la vacunación contra enfermedades infecciosas, De Berardinis et al. (2000) mostraron que un epitope citotóxico de células T (CTL) de la transcriptasa inversa VIH-1 podría provocar CTLs específicos de antígenos in vitro e in vivo sin adición de epitopos de células T de ayuda exógena, presumiblemente ya que están presentes en las proteínas de la capa de fago (Mascolo et al., 2007). Del mismo modo, se observó un uso eficiente de CTLs frente a los epítopos de células T de los fagos de virus de la hepatitis B (Wan et al., 2001) y Candida albicans (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2006 Wang et al., 2014d, que, junto con otros tipos de respuestas inmunes, protegían a los ratones contra la candidiasis sistémica. La vacunación con una combinación de péptidos phagedisplayed provocó CTLs específicos de antígenos que resultaron eficaces en la reducción de la cisticercosis porcina en un ensayo controlado aleatorio (Manoutcharian et al., 2004; Morales et al., 2008). Mientras que las correlaciones de la protección inmune inducida por la vacuna para las enfermedades infecciosas, donde se conocen, son casi exclusivamente anticuerpos séricos o mucosas (Plotkin, 2010), En ciertas aplicaciones de la vacuna, el fago filamentoso se ha utilizado como portador de moléculas más grandes que serían inmunogénicas incluso en aislamiento. Inicialmente, las principales ventajas de la exhibición de estos antígenos de los fago eran la velocidad, facilidad de purificación y bajo costo de producción (Gram et al., 1993). E. coli F17a-G adhesin (Van Gerven et al., 2008), antígeno del núcleo de la hepatitis B (Bahadir et al., 2011), y antígeno de la superficie de la hepatitis B (Balcioglu et al., 2014) todas produjeron respuestas de anticuerpos cuando se exhibieron en la pIII, aunque ninguno de estos estudios comparó la inmunogenicidad de las Phage que muestra Schistosoma mansoni glutatión S-transferasa en pIII provocó una respuesta de anticuerpos que fue tanto más alta en el título como de diferentes isotipos en comparación con la inmunización con la proteína sola (Rao et al., 2003). Dos estudios de vacunas antiidiotípicas han utilizado el fago como portador de fragmentos de anticuerpos que contienen idiotipos inmunogénicos. Inmunización con fago que muestra el 1E10 idiotaype scFv (mimicking a Vibrio anguillarum surface epitope) provocó anticuerpos que protegían a los peces babosos de Vibrio anguillarum challenge (Xia et al., 2005). Una vacuna de idiotipo de tumor específico de phage-BCL1 vinculada químicamente fue débilmente inmunogénica en ratones pero extendió el tiempo de supervivencia en un modelo de linfoma de células B (Roehnisch et al., 2013), y fue bien tolerada e inmunogénica en pacientes con mieloma múltiple (Roehnisch et al., 2014). Un estudio de vacunación de ADN con antilaminarina scFv encontró que el ADN codificando una proteína de fusión pIII-scFv provocó respuestas inmunes humorales y mediadas por células más fuertes que el ADN codificando el scFv solo (Cuesta et al., 2006), sugiriendo que bajo algunas circunstancias, los epitopos de células T de fago endógeno pueden mejorar la inmunogenicidad de proteínas asociadas. Tomados en conjunto, los resultados de estos estudios muestran que como partícula similar a un virus de partículas, el fago filamentoso probablemente desencadena diferentes tipos de respuestas inmunitarias que los antígenos de proteínas recombinantes, y proporciona ayuda adicional de células T a las proteínas exhibidas o conjugadas. Sin embargo, el bajo número de copias de proteínas visualizadas pIII, así como la adyuvancia potencialmente no deseada asociada a los fagos, pueden hacer de la exhibición de proteínas recombinantes por fago una elección vacunal subóptima. Aunque nuestra comprensión de la respuesta inmune contra los palidezes fagosas filamentosas en comparación con antígenos modelo clásicos como la ovalbúmina, los últimos trabajos han comenzado a arrojar luz sobre los mecanismos inmunes activados en respuesta a la vacunación de los fagos (Figura 1). La partícula del fago es inmunogénica sin adyuvante en todas las especies probadas hasta la fecha, incluyendo ratones (Willis et al., 1993), ratas (Dente et al., 1994), conejos (de la Cruz et al., 1988), cobayas (Frenkel et al., 2000; Kim et al., 2004), peces (Coull et al., 1996; Xia et al., 2005), primates no humanos (Chen et al., 2001) y humanos (Roehnisch et al., 2014). Se han empleado varias vías de inmunización, incluyendo administración oral (Delmastro et al., 1997) así como subcutánea (Grabowska et al., 2000), intraperitoneal (van Houten et al., 2006), intramuscular (Samoylova et al., 2012a), intravenosa (Vaks y Benhar, 2011), e inyección intradérmica (Roehnisch et al., 2013); ningún estudio publicado ha comparado directamente el efecto de la vía de administración sobre la inmunogenicidad fagosa filamentosa. Los anticuerpos se generan contra sólo tres sitios principales en el virión: (i) los N-terminal expuestos a la superficie 12 de la retícula monomérica pVIII (Terry et al., 1997; Kneissel et al., 1999) ; (ii) los dominios N-terminal N1 y N2 de la pIII (van Houten et al., 2010); y (iii) lipopolisacárido bacteriano (LPS) incrustado en la capa de fago (Henry et al., 2011). En ratones, los títulos de anticuerpos séricos contra el fago suelen alcanzar 1:10 5 -1:10 6 después de 2-3 inmunizaciones, y se mantienen durante al menos 1 año postinmunización (Frenkel et al., 2000). Las respuestas primarias de anticuerpos contra el fago parecen estar compuestas por una mezcla de isotipos IgM e IgG2b en ratones C57BL/6, mientras que las respuestas secundarias de anticuerpos están compuestas principalmente de isotipos IgG1 e IgG2b, con una menor contribución de isotipos IgG2c e IgG3 (Hashiguchi et al., 2010). La supresión de los dominios N1 y N2 expuestos a la superficie de pIII produce una forma truncada de esta proteína que no provoca anticuerpos, sino que también produce una partícula de fago no infecciosa con menor inmunogenicidad general (van Houten et al., 2010). Como partícula similar a un virus, el fago filamentoso envuelve múltiples brazos del sistema inmune, comenzando con efectores celulares de inmunidad innata (macrofagos, neutrófilos y posiblemente células asesinas naturales), que son reclutados en sitios tumorales por fago que muestran moieties tumorales. El fago probablemente activa las respuestas de anticuerpos independientes de células T, ya sea a través de ligandos TLR asociados a los fagoes o enlaces cruzados por la celosía pVIII. Después del procesamiento por células que presentan antígenos, los péptidos derivados de los fagotes se presentan en la clase II de la MHC y en la clase I de la MHC, resultando en la activación de CTL de corta duración y una serie de tipos de células T ayudantes, que ayudan a la memoria primaria CTL y respuestas de células B de alta afinidad. Las fronteras en la microbiología www.fronterizosin.orgAunque los títulos de anticuerpos antifagos séricos parecen ser al menos parcialmente dependientes de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993; De Berardinis et al., 1999; van Houten et al., 2010), muchas células B específicas de pVIII circulantes en la sangre carecen de mutación somática incluso después de repetidas inmunizaciones quincenales, lo que sugiere que bajo estas condiciones, el fago activa respuestas de células B independientes de células T además de respuestas dependientes de células T de alta afinidad (Murira, 2014). Las partículas filamentarias de fagos pueden ser procesadas por células presentadoras de antígenos y presentadas en moléculas de clase II de MHC (Gaubin et al., 2003; Ulivieri et al., 2008) y pueden activar T H 1, T H 2 y T H 17 células T ayudantes (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2014d). Las respuestas antifagos T H 2 se mejoraron mediante la visualización de péptidos CTLA-4 fusionados con pIII (Kajihara et al., 2000). Las proteínas de Phage también pueden presentarse de forma cruzada en moléculas de clase I de MHC (Wan et al., 2005) y pueden producir dos ondas de respuestas CTL, que consisten primero en CTL de corta duración y después de CTL de memoria de larga duración que requieren ayuda de células CD4 + T (Del Pozzo et al., Estos últimos CTLs median una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (Fang et al., 2005; Del Pozzo et al., 2010). La partícula de fago es autoadyuvante a través de múltiples mecanismos. El LPS derivado de la pared de la célula huésped realza la inmunogenicidad del virión, y su eliminación por cromatografía de polimixina B reduce los títulos de anticuerpos contra las proteínas de capa de fago (Grabowska et al., 2000). El genoma de ADN singlestranded del fago contiene motivos CpG y también puede tener un efecto adyuvante. La respuesta de anticuerpos contra el fago es totalmente dependiente de la señalización de MyD88 y se modula mediante la estimulación de varios receptores de tipo peaje (Hashiguchi et al., 2010), indicando que la inmunidad innata juega un papel importante pero en gran Los estudios de biodistribución del fago después de la inyección intravenosa muestran que se elimina de la sangre en cuestión de horas a través del sistema reticuloendotelial (Molenaar et al., 2002), particularmente del hígado y el bazo, donde se retiene durante días (Zou et al., 2004), potencialmente activando respuestas de células B de zona marginal. Por lo tanto, el fago filamentoso no sólo es un portador altamente inmunogénico, sino que, gracias a la activación de una gama de respuestas inmunes innatas y adaptativas, sirve como un excelente modelo de antígeno de partícula similar al virus. Mucho antes de la identificación del fago filamentoso, otros tipos de bacteriofago ya se estaban utilizando para la terapia antibacteriana en la antigua Unión Soviética y Europa Oriental (revisado en Sulakvelidze et al., 2001). El fago filamentoso, con su ciclo de vida no lítico, tiene usos clínicos menos obvios, a pesar de que la especificidad del huésped de Inovirus y Plectrovirus incluye muchos patógenos de importancia médica, incluyendo Salmonella, E. coli, Shigella, Pseudomonas, Clostridium y Micoplasma. En un esfuerzo por mejorar su actividad bactericida, los fagoces filamentosos genéticamente modificados se han utilizado como "caballo de Troya" para introducir diversos agentes antibacterianos en las células. Los fagos M13 y Pf3 fueron diseñados para expresar la restricción BglII endonucleasa (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004), lambda fage S holin (Hagens y Blasi, 2003) o una proteína activadora letal del gen catabolita (Moradpour et al., 2009) que mató eficazmente a las células E. coli y Pseudomonas aeruginosa, respectivamente, sin liberación concomitante de LPS (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004). Lamentablemente, la rápida aparición de bacterias resistentes con pili F modificado representa un obstáculo importante y posiblemente insuperable a este enfoque. Sin embargo, hay algunos indicios de que los fagos filamentosos pueden ejercer efectos útiles pero más sutiles sobre sus hospedadores bacterianos que pueden no resultar en el desarrollo de resistencia a la infección. Varios estudios han reportado aumento de la sensibilidad antibiótica en poblaciones bacterianas infectadas simultáneamente con fago filamentoso tipo salvaje (Hagens et al., 2006) o fago diseñado para reprimir la respuesta celular SOS (Lu y Collins, 2009). La infección filamentosa f1 inhibió la formación de biopelículas en E. coli, pero no madura (May et al., 2011). Así, los fago filamentosos no modificados pueden ser de interés futuro como elementos de terapia combinada contra ciertas infecciones resistentes a fármacos. Las aplicaciones terapéuticas más avanzadas del fago filamentoso emergen cuando se modifica para expresar una fracción dirigida específica para células patógenas y/o proteínas para el tratamiento de enfermedades infecciosas, cáncer y autoinmunidad (Figura 2). El primer trabajo en esta área mostró como prueba de concepto que los fagos codificando un cassette de expresión GFP y mostrando un HER2specific scFv en todas las copias de pIII fueron internalizados en células tumorales de mama, resultando en la expresión GFP (Poul y Marks, 1999). M13 o fd fagos mostrando un péptido objetivo o fragmento de anticuerpos y amarrados a cloranfenicol por un crosslinker lábil eran inhibidores más potentes del crecimiento de Staphylococcus aureus que el cloranfenicol libre de alta concentración (Yacoby et al., 2006; Vaks y Benhar, 2011). M13 fagos cargados con doxorubicina y mostrando un péptido objetivo en células de cáncer de próstata específicamente muertas en pIII in vitro (Ghosh et al., péptido tumoral específico: proteínas de fusión de pVIII seleccionadas de "paisaje" fage (Romanov et al., 2001; Abbineni et al., 2010; Fagbohun et al., 2012 Fagbohun et al., 2013 Lang et al., 2014; Wang et al., 2014a) fueron capaces de dirigir y entregar siRNA-, paclitaxel-, y liposomas que contienen doxorubicina a las células tumorales (Jayanna et al., 2010a; Wang et al., 2010a Wang et al.,, b, c, 2014b Bedi et al., 2011 Bedi et al.,, 2013 Bedi et al.,, 2014 ; eran tasas de remisión tumoral no tóxicas y aumentadas en modelos de ratón (Jayanna et al., 2010b; Wang et Usando el modelo de tumor B16-OVA, Eriksson et al. (2007) mostraron que los fagos que mostraban péptidos y/o Fabs específicos para antígenos tumorales retrasaron el crecimiento del tumor y mejoraron la supervivencia, debido en gran parte a la activación de macrófagos asociados al tumor y al reclutamiento de neutrófilos en el sitio del tumor (Eriksson et al., 2009). Phage mostrando un scFv frente a fibriles β-amiloide mostró promesa como diagnóstico (Frenkel y Solomon, 2002) y terapéutico (Solomon, 2008) reactivo para la enfermedad de Alzheimer y Parkinson debido a la capacidad imprevista del fago para penetrar en el tejido cerebral (Ksendzovsky et al., 2012). Del mismo modo, los fagos que muestran un epítopo péptido inmunodominante derivado de la mielina oligodendrocyte glucoproteína desmielinizantes patógenos agotados anticuerpos en el tejido cerebral en el modelo murina experimental de encefalomielitis autoinmune de esclerosis múltiple (Rakover et al., 2010). Las ventajas del fago filamentoso en este contexto sobre los conjugados tradicionales anticuerpo-fármaco o proteico-péptido son: i) su capacidad para transportar cantidades muy altas de fármaco o péptido, y ii) su capacidad para acceder a compartimentos anatómicos que generalmente no pueden ser alcanzados por la administración sistémica de una proteína. A diferencia de la mayoría de los biológicos terapéuticos, la producción del fago filamentoso en bacterias complica su uso en los seres humanos de varias maneras. En primer lugar, los preparados crudos de fago filamentoso suelen contener niveles muy altos de SLP contaminante, en el rango de 10 unidades de endotoxina 2-10 4 (EU)/ml (Boratynski et al., 2004; Branston et al., 2015), que tienen el potencial de causar reacciones adversas graves. LPS no se elimina completamente por precipitación de polietilenglicol o centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio (Smith y Gingrich, 2005; Branston et al., 2015), pero sus niveles se pueden reducir drásticamente utilizando pasos de purificación adicionales como cromatografía de exclusión de tamaño (Boratynski et al., 2004; Zakharova et al., 2005), cromatografía de polimixina B (Grabowska et al., 2000), y tratamiento con detergentes como Triton X-100 o Triton X-114 (Roehnisch et al., 2014; Branston et al., 2015). Estas estrategias alcanzan de forma rutinaria niveles de endotoxina < 1 EU/ml medidos por el lisato de limulo amebocito (LAL), muy por debajo del límite de la FDA para la administración parenteral de 5 EU/kg de peso corporal/dosis, aunque sigue habiendo preocupaciones con respecto a la presencia de LPS residuales asociadas al virión que pueden ser indetectables.Una segunda consecuencia, y tal vez inevitable, de la producción bacteriana del fago filamentoso es la heterogeneidad inherente del tamaño de las partículas y el espectro de contaminantes solubles y asociados al virión del huésped, que pueden ser causa de problemas de seguridad y restringir su uso a los grupos de alto riesgo. Se han propuesto muchos tipos de variantes de bacteriofago y fagos diseñados, incluido el fago filamentoso, para uso profiláctico ex vivo en seguridad alimentaria, ya sea en la tubería de producción (revisado en Dalmasso et al., 2014) o para la detección de patógenos transmitidos por alimentos postproducción (revisado en Schmelcher y Loessner, 2014). Fago filamentoso que muestra una etiqueta de tetracisteína en pIII se utilizaron para detectar células E. coli a través de tinción con tinte biarsenical. Biosensores basados en resonancia de plasmón superficial (Nanduri et al., 2007), transductores piezoeléctricos (Olsen et al., 2006), dicroísmo lineal (Pacheco-Gomez et al., 2012), y tecnología de sensores magnetoelásticos (Lakshmanan et al., 2007; Huang et al., 2009) fueron ideados utilizando fagos filamentosos que muestran scFv o conjugados a IgG enteros contra E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium y Bacillus anthracis con límites de detección en el orden de 10 2-10 6 células bacterianas/ml. Prueba de concepto ha sido demostrado para el uso de tales biosensores a base de fagos para detectar contaminación bacteriana de productos vivos (Li et al., 2010 La partícula fagosa filamentosa está encerrada por un capsid de proteína similar a la varilla, de 1000 nm de largo y 5 nm de ancho, formado casi enteramente por monómeros de pVIII superpuestos, cada uno de los cuales se encuentra en 27 angstroms de su vecino más cercano y expone dos grupos de aminas, así como al menos tres grupos de carboxilo (Henry et al., 2011). La regularidad de la celosía de pVIII de fagos y su diversidad de grupos químicamente direccionables la convierten en un andamio ideal para la bioconjugación (Figura 3). El enfoque más utilizado es la funcionalización de grupos de aminas con ésteres NHS (van Houten et al., 2006 (van Houten et al., 2010 Yacoby et al., 2006), aunque esto puede resultar en una a Los grupos de carboxilo y los residuos de tirosina también se pueden funcionalizar utilizando acoplamiento de carbodiimida y acoplamiento de diazonio, respectivamente (Li et al., 2010a). Carrico et al. (2012) desarrollaron métodos para etiquetar específicamente pVIII N-termina sin modificación de residuos de lisina expuestos a través de una reacción de formación de transaminación-oxima en dos pasos. La modificación específica de las proteínas de la capa de fago es aún más fácil de lograr usando péptidos modificados genéticamente (Ng et al., 2012) o enzimas (Chen et al., 2007; Hess et al., 2012), pero esto puede ser engorroso y es menos general en aplicación. Durante más de una década, el interés en el fago filamentoso como bloque de construcción de nanomateriales ha ido creciendo debido a sus propiedades fisicoquímicas únicas, con aplicaciones emergentes en magnet Desde hace mucho tiempo se sabe que por encima de un determinado umbral de concentración, el fago puede formar suspensiones cristalinas ordenadas (Welsh et al., 1996). Lee et al. (2002) diseñaron un fago M13 para mostrar un péptido de unión ZnS en pIII y demostraron que, en presencia de nanopartículas ZnS, se autoensamblan en biomateriales de película altamente ordenados que se pueden alinear utilizando campos magnéticos. Aprovechando la capacidad de mostrar péptidos específicos de sustratos en lugares conocidos en el filamento fagotico Hess et al., 2012), este pionero FIGURE 3 Grupos químicamente direccionables de la capa principal de bacteriofago filamentoso. El virión del fago filamentoso se compone de 2.500-4.000 copias superpuestas de la proteína 50-residue Cada monómero tiene una serie de grupos químicamente direccionables disponibles para la conjugación bioortogonal, incluyendo dos grupos de aminas primarias (mostradas en rojo), tres grupos de carboxilo (mostradas en azul) y dos grupos de hidroxilo (mostradas en verde). Los 12 residuos N-terminales generalmente expuestos al sistema inmune para la unión de anticuerpos están en negrita subrayado. Figura adaptada a partir de datos estructurales de Marvin, 1990, disponible libremente en bases de datos PDB y SCOPe. el trabajo se convirtió en la base para la construcción de nanomateriales bidimensionales y tridimensionales con arquitecturas más avanzadas, incluyendo nanohilos semiconductores (Mao et al., 2003 (Mao et al.,, 2004, nanopartículas, y nanocomposites (Oh et al., 2012; Chen et al., 2014). Utilizando los péptidos híbridos de unión de oro y Co 3 O 4 en pVIII como andamio para ensamblar nanohilos en multicapas de polielectrolitos, Nam et al. (2006) produjeron una batería de iones de litio delgada y flexible, que podía ser estampada en colectores de corriente de microbanda de platino (Nam et al., 2008). Las propiedades electroquímicas de estas baterías se mejoraron aún más a través de la visualización pIII de péptidos de unión de nanotubos de carbono de una sola pared (Lee et al., 2009), ofreciendo un enfoque para la producción sostenible de electrodos nanoestructurados a partir de materiales de partida mal conductivos. Los nanomateriales a base de fage han encontrado aplicaciones en la imagen del cáncer (Ghosh et al., 2012b; Yi et al., 2012), la división del agua fotocatalítica (Nam et al., 2010a; Neltner et al., 2010), la recolección de luz (Nam et al., 2010b; Chen et al., 2013), las tecnologías fotorespuestas (Murugesan et al., 2013), los electrodos neuronales (Kim et al., 2014), y la generación de energía piezoeléctrica (Murugesan et al., 2013). Así, las propiedades fisicoquímicas únicas del fago, en combinación con la visualización modular de péptidos y proteínas con especificidad de unión conocida, han desove materiales totalmente nuevos con diversas aplicaciones. Vale la pena señalar que las propiedades bio La alineación magnética de los fagos filamentosos de alta concentración en solución puede ordenar parcialmente el ADN, el ARN, las proteínas y otras biomoléculas para la medición de las interacciones de acoplamiento dipolar (Hansen et al., 1998 (Hansen et al., 2000 Dahlke Ojennus et al., 1999) en espectroscopia NMR. Debido a su gran tamaño de población, tiempos de generación cortos, tamaños de genoma pequeños y facilidad de manipulación, diversos bacteriófagos filamentosos y no filamentosos se han utilizado como modelos de evolución experimental (revisado en Husimi, 1989; Wichman y Brown, 2010; Kawecki et al., 2012; Hall et al., 2013). El fago filamentoso tiene usos prácticos adicionales en ingeniería proteica y evolución proteica dirigida, debido a su tolerancia única de modificaciones genéticas que permiten mostrar biomolécula En primer lugar, entre estas aplicaciones se encuentra la maduración in vitro de la afinidad de los fragmentos de anticuerpos mostrados en pIII. Las bibliotecas de variantes Fabs y anticuerpos de cadena única pueden generarse mediante mutagenesis aleatoria o sitedirected y seleccionarse sobre la base de una unión mejorada o alterada, imitando más o menos la estrategia de evolución somática del sistema inmunitario (Marks et al., 1992; Bradbury et al., 2011). Sin embargo, otros sistemas de visualización in vitro, como la visualización de levaduras, tienen importantes ventajas sobre el fago filamentoso para la maduración de afinidad (aunque cada tecnología de visualización tiene fortalezas complementarias; Koide y Koide, 2012) y, independientemente del método de visualización, la selección de variantes "mejoradas" puede ser lenta y engorrosa. Se han desarrollado métodos iterativos para combinar mutaciones de diseño computacional (Lippow et Recientemente, Esvelt et al. (2011) desarrollaron una nueva estrategia para la evolución dirigida de las proteínas fagosas filamentosas, denominadas evolución continua asistida por fagos (PACE), que permite múltiples rondas de evolución por día con poca intervención experimental.Los autores diseñaron el fago M13 para codificar una proteína exógena (sujeto a la evolución dirigida), cuya actividad funcional desencadena la expresión del gen III de un plasmido accesorio; variantes de la proteína exógena surgen por mutagenesis aleatoria durante la replicación de fagos, cuya tasa puede aumentarse mediante la expresión inducible de polimerasas de ADN propensas a errores. Al suministrar cantidades limitadas de células E. coli receptivas a las variantes de fagosas diseñadas, Esvelt et al. (2011) vincula elegantemente la infectividad y producción de fagos con la presencia de un fenotipo proteico deseado. Carlson et al. (2014) más tarde mostró que la severidad de selección PACE podría ser modulada proporcionando pequeñas cantidades de pIII independientemente del fenotipo proteico, y funciones proteicas indeseables seleccionadas negativamente al vincularlas a la expresión de una variante pIII truncada que altera la infectividad en una forma negativa dominante. PACE se limita actualmente a funciones proteicas que pueden estar vinculadas de alguna manera a la expresión de un reportero del gen III, tales como interacción proteína-proteína, recombinación, unión ADN o ARN, y catálisis enzimática (Meyer y Ellington, 2011). Este enfoque representa una vía prometedora para la investigación básica en evolución molecular (Dickinson et al., 2013) y biología sintética, incluyendo ingeniería de anticuerpos. El bacteriofago filamentario se ha recuperado de diversas fuentes ambientales, incluyendo el suelo (Murugaiyan et al., 2011), el agua dulce costera (Xue et al., 2012), los lagos alpinos (Hofer y Sommaruga, 2001) y las bacterias del mar profundo (Jian et al., 2012), pero tal vez no sorprendentemente el intestino humano (Kim et al., 2011). El "fageoma" ambiental en el suelo y el agua representan la mayor fuente de replicación de ADN en el planeta, y se estima que contiene más de 10 30 partículas virales (Ashelford et al., 2003; Chibani-Chennoufi et al., 2004; Suttle, 2005). Los pocos estudios que intentan investigar la ecología ambiental de los fagos filamentosos utilizando técnicas clásicas de microbiología ambiental (normalmente observación directa por microscopía electrónica) encontraron que los fagos filamentosos constituían entre el 0 y el 100% de todas las partículas virales (Demuth et al., 1993; Pina et al., 1998; Hofer y Sommaruga, 2001). Hubo alguna evidencia de fluctuación estacional de poblaciones de fagos filamentosos junto con la abundancia relativa de bacterias heterotróficas libres (Hofer y Sommaruga, 2001). Los datos existentes sugieren que los fagos filamentosos son constituyentes menores de comunidades virales en agua dulce (Roux et al., 2012) y agua recuperada y potable (Rosario et al., 2009), pero tienen frecuencias mucho más altas en aguas residuales y aguas residuales (Cantalupo et al., 2011; Alhamlan et al., 2013), con la salvedad de que los sesgos inherentes a las metodologías para determinar estos datos (purificación de partículas virales, sesgos de secuenciación) no han sido bien validados. No hay datos que describan la dinámica poblacional de los fagos filamentosos y sus especies hospedantes en el entorno natural. A nivel individual de virus-bacterio, está claro que los fagos filamentosos pueden modular el fenotipo huésped, incluyendo la virulencia de importantes patógenos humanos y de cultivos. Esto puede ocurrir ya sea a través de efectos directos de replicación de fagos en el crecimiento celular y la fisiología, o, más típicamente, por transferencia horizontal de material genético contenido en episomas y/o profagos cromosómicamente integrados. Fago filamentoso templado también puede jugar un papel en la evolución del genoma (revisado en Canchaya et al., 2003). Tal vez el ejemplo mejor estudiado de modulación de virulencia por fago filamentoso es el de Vibrio cholerae, cuya virulencia completa requiere conversión lisogénica por la toxina del cólera codificante CTX La integración de los fagos CTXo se produce en sitios específicos del genoma; estas secuencias se introducen a través de la acción combinada de otro fagos filamentoso, fs2o, y un fagoso filamentoso satelital, TLC-KnŁo1 (Hassan et al., 2010). Así, las especies de fagos filamentosos interactúan y coevolucionan entre sí, además de sus anfitriones. La infección por fagos filamentosos se ha implicado en la virulencia de Yersinia pestis (Derbise et al., 2007), Neisseria meningitidis (Bille et al., 2005 (Bille et al., 2008, Vibrio parahemolyticus (Iida et al., 2001), E. coli 018:K1:H7 (Gonzalez et al., 2002), Xanthomonas campestris (Kamiunten and Wakimoto, 1982), y P. aeruginosa (Webb et al., 2004), aunque en la mayoría de estos casos, los mecanismos específicos que modulan la virulencia no son claros. La infección por fage puede potenciar o reprimir la virulencia dependiendo de las características del fago, la bacteria huésped y el medio ambiente, como es el caso del patógeno de la marchitez bacteriana Ralstonia solanacearum (Yamada, 2013). Dado que la infección resulta en la regulación de los pili utilizados para la entrada viral, el tratamiento del fago filamentoso se ha propuesto como un medio hipotético para inhibir la conjugación bacteriana y la transferencia génica horizontal, a fin de evitar la propagación de genes de resistencia a antibióticos (Lin et al., 2011). Finalmente, el fago filamentoso también puede desempeñar un papel futuro en la preservación de la biodiversidad de otros organismos en ecosistemas de riesgo. Se ha propuesto el uso del fago artificial en la biorremediación, ya sea mostrando fragmentos de anticuerpos de la especificidad deseada para la filtración de toxinas y contaminantes ambientales (Petrenko y Makowski, 1993), o como polímeros biodegradables que muestran péptidos seleccionados por su capacidad para agregar contaminantes, tales como residuos de arenas oleaginosas (Curtis et al., 2011 (Curtis et al., 2013 ). También se ha propuesto el uso del fago artificial que muestra péptidos que se unen específicamente a materiales inorgánicos en tecnologías de separación mineral más avanzadas y menos intrusivas (Curtis et al., 2009 ). El fago filamentoso representa un organismo altamente versátil cuyos usos van mucho más allá de la exhibición tradicional de fago y la selección de afinidad de anticuerpos y polipéptidos de especificidad deseada. Su alta inmunogenicidad y su capacidad para mostrar una variedad de antígenos superficiales hacen que el fago sea un excelente portador de la vacuna antipartículas, aunque su producción y preparación bacterianas probablemente limiten sus aplicaciones en vacunas humanas en la actualidad, a pesar de ser aparentemente seguros y bien tolerados en animales y personas. Las características imprevistas de la partícula antifago, como el cruce de la barrera hematoencefálica y la formación de fases cristalinas líquidas altamente ordenadas, han abierto nuevas vías de investigación en terapias para enfermedades crónicas y el diseño de nanomateriales. Nuestra comprensión comparativamente detallada de las interacciones del fagotismo filamentoso modelo con sus huéspedes bacterianos ha permitido a los investigadores aprovechar el ciclo de vida del fago para dirigir la evolución proteica en el laboratorio. Esperamos que un conocimiento más profundo de las interacciones entre los hospederos de fago a nivel ecológico pueda producir estrategias novedosas para controlar la pato Mientras se siguen desarrollando nuevas aplicaciones del fago filamentoso, es probable que el fago conserve su posición como caballo de batalla para el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos durante muchos años, incluso con el advenimiento de tecnologías competidoras. KH y JS concibieron y escribieron el manuscrito. MA-G leyó el manuscrito y comentó sobre el texto.

¿Qué características determina el modo de visualización?

Más allá de la visualización de los fagos: aplicaciones no tradicionales del bacteriofago filamentoso como portador de vacunas, andamio biológico terapéutico y bioconjugadorhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4523942/SHA: f00f183d0bce0091a02349ec1eab44a76a9bc4Autores: Henry, Kevin A.; Arbabi-Ghahroudi, Mehdi; Scott, Jamie K.Fecha: 2015-08-04DOI: 10.3389/fmicb.2015.00755Licencia: cc-byAbstract: Durante los últimos 25 años, la tecnología de exhibición de fagos ha sido una herramienta inestimable para los estudios de interacciones proteína-proteína. Sin embargo, las propiedades biológicas, bioquímicas y biofísicas inherentes al bacteriofago filamentoso, así como la facilidad de su manipulación genética, también lo convierten en una plataforma atractiva fuera del canon de exhibición tradicional de fagos. Esta revisión se centrará en las propiedades únicas del bacteriofago filamentoso y destacará sus diversas aplicaciones en la investigación actual. Se ponen énfasis en: (i) las ventajas del fago como portador de la vacuna, incluyendo su alta inmunogenicidad, relativa simplicidad antigénica y capacidad para activar una gama de respuestas inmunes, (ii) el potencial del fago como agente profiláctico y terapéutico para enfermedades infecciosas y crónicas, (iii) la regularidad de la retícula de la proteína de la capa principal del virio, que permite una variedad de bioconjugación y aplicaciones de química de la superficie, particularmente en nanomateriales, y (iv) el gran tamaño de la población del fago y los tiempos de generación rápidos, que lo convierten en un excelente sistema modelo para la evolución de proteínas dirigidas. A pesar de su ubicuidad en la biosfera, el trabajo metagenómico apenas está comenzando a explorar la ecología del fago filamentoso y su papel en la evolución de las poblaciones bacterianas. Así, el fago filamentoso representa un microorganismo robusto, barato y versátil cuyas aplicaciones de bioingeniería continúan expandiéndose en nuevas direcciones, aunque sus limitaciones en algunas esferas imponen obstáculos a su adopción y uso generalizados. Texto: El bacteriofago filamentoso (genera Inovirus y Plactrovirus) son virus no envueltos en forma de varilla de Escherichia coli, cuyos largos capsidios helicoidales encapsulan un genoma circular de ADN de una sola cadena. Después del descubrimiento independiente de bacteriofago por Twort (1915) y d 'Hérelle (1917), el primer fago filamentoso, f1, fue aislado en Loeb (1960) y más tarde caracterizado como un miembro de un grupo más grande de fago (Ff, incluyendo f1, M13, y fd fago) específico para el E. coli conjugativo F pilus (Hofschneider y Mueller-Jensen, 1963; Marvin y Hoffmann-Berling, 1963; Zinder et al., 1963; Salivar et al., 1964). Poco después, se descubrió un fago filamentoso que no utiliza F-pili para la entrada (If y Ike; Meynell y Lawn, 1968; Khatoon et al., 1972), y con el tiempo la lista de fago filamentoso conocido se ha expandido a más de 60 miembros (Fauquet et al., 2005), incluyendo especies templadas y grampositivas. El trabajo de varios grupos en los últimos 50 años ha contribuido a una comprensión relativamente sofisticada de la estructura filamentosa, biología y ciclo vital (revisado en Marvin, 1998; Rakonjac et al., 2011; Rakonjac, 2012). A mediados de la década de 1980, el principio de modificar el genoma de fago filamentoso para mostrar polipéptidos como fusiones para cubrir proteínas en la superficie del virión fue inventado por Smith y colegas (Smith Sobre la base de las ideas descritas en Parmley y Smith (1988), los grupos de California, Alemania y el Reino Unido desarrollaron plataformas de fage-display para crear y proyectar bibliotecas de variantes de péptidos y proteínas plegadas (Bass et al., 1990; Devlin et al., 1990; McCafferty et al., 1990; Scott y Smith, 1990; Breitling et al., 1991; Kang et al., 1991). Esta tecnología permitió, por primera vez, la capacidad de conectar sin problemas la información genética con la función proteica para un gran número de variantes proteicas simultáneamente, y ha sido ampliamente y productivamente explotada en estudios de interacciones proteicas. Muchas excelentes revisiones están disponibles en bibliotecas de fage-display y sus aplicaciones (Kehoe y Kay, 2005; Bratkovic, 2010; Pande et al., 2010). Sin embargo, el fago tiene también una serie de propiedades estructurales y biológicas únicas que lo hacen altamente útil en áreas de investigación que han recibido mucha menos atención. Así, el propósito de esta revisión es destacar el trabajo reciente y actual utilizando fago filamentoso en aplicaciones nuevas y no tradicionales. Específicamente, nos referimos a proyectos que se basan en el fago filamentoso como un elemento clave, pero cuyo propósito principal no es la generación o cribado de bibliotecas fagodisplayed para obtener ligandos polipéptidos de unión. Estos tienden a caer en cuatro categorías principales de uso: i) fago filamentoso como portador de vacuna; ii) fago filamentoso diseñado como un agente biológico terapéutico en enfermedades infecciosas y crónicas; iii) fago filamentoso como un andamio para bioconjugación y química superficial; y iv) fago filamentoso como un motor para la evolución de variantes de proteínas exhibi Una sección final está dedicada a los últimos desarrollos en la ecología fagosa filamentosa y las interacciones fagosas-anfitriona. Los temas comunes compartidos entre todas estas aplicaciones incluyen las propiedades biológicas, inmunológicas y fisicoquímicas únicas del fago, su capacidad para mostrar una variedad de biomoléculas de forma modular, y su relativa simplicidad y facilidad de manipulación. Casi todas las aplicaciones del fago filamentoso dependen de su capacidad para mostrar polipéptidos en la superficie del virio como fusiones a proteínas de la capa de fago (Tabla 1). El modo de visualización determina el tamaño máximo tolerado del polipéptido fusionado, su número de copia en el fago, y potencialmente, la estructura del polipéptido mostrado. La visualización se puede lograr fusionando ADN codificando un polipéptido de interés directamente para el gen codificando una proteína de la capa dentro del genoma fago Sin embargo, con mucha más frecuencia, sólo se modifica una copia de la proteína de la capa en presencia de una segunda copia de tipo salvaje (por ejemplo, se muestra el tipo 88 si tanto los genes de tipo recombinante como los de tipo salvaje pVIII están en el genoma de los fagos, se muestra el tipo 8+8 si el Parmley y Smith (1988), McConnell et al. (1994), Rondot et al. (2001) Híbrido (sistemas de tipo 33 y 3+3) Sistema del tipo 3+3 <1 2 Smith y Scott (1993), Smith y Petrenko (1997) pVI Híbrido (sistema del tipo 6+6) Sí <1 2 > 25 kDa Hufton et al. (1999) pVII Sistema totalmente recombinante (sistema del tipo 7) No 5 > 25 kDa Kwasnikowski et al. (2005) Híbrido (sistema del tipo 7+7) (1999) pVIII Totalmente recombinante (fago paisajístico; sistema del tipo 8)No 2700 3 5-8 residuos Kishchenko et al. (1994), Petrenko et al. (1996) Híbrido (sistemas del tipo 88 y 8+8) Sistema del tipo 8+8 +1300 2 >50 kDa Scott and Smith (1990), Greenwood et al. (1991), Smith and Fernandez (2004) piX Totalmente recombinante (sistema del tipo 9+9 *) Sí 5 > 25 kDa Gao et al. (2002) Híbrido (sistema del tipo 9+9) No <1 2 Gao et al. (1999), Shi et al. (2010), Tornetta et al. (2010) 1 Los asteriscos indican la presencia de copias no funcionales de la proteína de la capa en el genoma del fago de ayuda utilizado para rescatar a un phagemid cuya proteína de capa se ha fusiona 2 El número de copia depende del tamaño del polipéptido; típicamente <1 copia por partícula de fago, pero para la visualización del péptido pVIII puede ser de hasta un 15% de moléculas de pVIII en viriones híbridos. 3 El número total de moléculas de pVIII depende del tamaño del genoma del fago; se añade una molécula de pVIII por cada 2,3 nucleótidos en el genoma viral. El gen recombinante 8 se encuentra en un plásmido con un origen fago de replicación) resultando en un virión híbrido con dos tipos diferentes de proteína de capa dada. Con mucho, las proteínas de capa más comúnmente utilizadas para la visualización son la proteína de capa principal, pVIII, y la proteína de capa menor, pIII, con la mayor ventaja de que la primera es la visualización de número de copia más alto (hasta un 15% de moléculas de capa recombinante en un virión híbrido, al menos para fusiones cortas de péptidos), y de que esta última es la capacidad de mostrar algunas proteínas plegadas en un número de copia apreciable (1-5 por partícula de fago). Si bien pVIII muestra proteínas plegadas en un fago híbrido es posible, normalmente resulta en un número de copia de mucho menos de 1 por virio (Sidhu et al., 2000). Para los fines de esta revisión, utilizamos el término "exhibición de fagos" para referirse a un fago filamentoso recombinante que muestra una sola secuencia de polipéptidos en su superficie (o más raramente, visualización biespecífica lograda mediante la fusión de polipéptidos a dos proteínas capsidas diferentes), y el término "biblioteca de fagotismo" para referirse a un grupo diverso de fagobios filamentosos recombinantes que muestran una serie de variantes de polipéptidos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos; péptidos). Tales bibliotecas son normalmente examinadas por ciclos iterativos de panificación contra una proteína de interés inmovilizada (por ejemplo, antígeno para bibliotecas de anticuerpos visualizadas por fago; anticuerpo para bibliotecas de péptidos visualizadas por fago) seguidos de amplificación del fago unido en células coli. El trabajo temprano con antifagos antisera generado para la clasificación de especies demostró que el fago virión filamentoso es altamente inmunogénico en ausencia de adyuvantes (Meynell y Lawn, 1968 ) y que sólo la proteína principal de la capa, pVIII, y la proteína menor de la capa, pIII, son blanco de anticuerpos (Pratt et al., 1969; Woolford et al., 1977). Así, la idea de utilizar el fago como portador para obtener anticuerpos contra haptens o polipéptidos poco inmunogénicos fue una extensión natural de la capacidad de mostrar secuencias exógenas recombinantes en su superficie, que fue demostrada por primera vez por de la Cruz et al. (1988). El bajo costo de producción de la partícula de fago, la alta estabilidad y el potencial para la exhibición de alta valencia del antígeno extraño (a través de la pantalla pVIII) también la hicieron atractiva como portadora de la vacuna, especialmente durante las primeras etapas de desarrollo de la tecnología proteica recombinante. Sobre la base de la tecnología existente de portador de péptidos, los primeros inmunogenes de la vacuna filamentosa a base de fago mostraron secuencias cortas de aminoácidos derivadas directamente de proteínas de interés como fusiones recombinantes a pVIII o pIII (de la Cruz et al., 1988). A medida que se desarrollaba y refinaba la tecnología bibliotecaria, los antígenos basados en fagos que mostraban ligandos péptidos de anticuerpos monoclonales (seleccionados de bibliotecas de péptidos aleatorias utilizando el anticuerpo, simulando así con diversos grados de éxito el epítopo plegado del anticuerpo en su antígeno cognado; Geysen et al., 1986; Knittelfelder et al., 2009) también se generaban con fines de inmunización, con el objetivo de provocar anticuerpos antipéptidos que también reconocían la proteína nativa. Cuando se muestran en los fagos, los péptidos que codifican las regiones repetitivas de la proteína de circunsporozoita malarial y la proteína de superficie de merozoita 1 fueron inmunogénicos en ratones y conejos (de la Cruz et al., 1988; Greenwood et al., 1991; Willis et al., 1993; Demangel et al., 1996), y anticuerpos levantados contra esta última reacción cruzada con la proteína de larga duración. Varios determinantes péptidos (o imitaciones de los mismos) del VIH-1 gp120, gp41, gag y transcriptasa inversa fueron inmunogénicos cuando se exhibieron o conjugaron con proteínas de la capa de los fagos (Minenkova et al., 1993; di Marzo Veronese et al., 1994; De Berardinis et al., 1999; Scala et al., 1999; Chen et al., 2001; van Houten et al., 2006 van Houten et al.,, 2010, y en algunos casos provocaron anticuerpos que fueron capaces de neutralizar débilmente virus adaptados al laboratorio (di Marzo Veronese et al., 1994; Scala et al., 1999). La lista de infecciones animales y humanas para las que se han desarrollado inmunogenes péptidos fagosos a medida que las vacunas conducen continúa expandiéndose e incluye patógenos bacterianos, fúngicos, virales y parasitarios (Tabla 2). Si bien en algunos casos los resultados de estos estudios han sido prometedores, las vacunas péptidas basadas en anticuerpos epitópicos ya no son un área de investigación activa por varias razones: i) en muchos casos, los péptidos imitan de forma incompleta o inadecuada epítopos en proteínas plegadas (Irving et al., 2010; véase más adelante); ii) los anticuerpos contra un solo epítopo puede ser de utilidad limitada, especialmente para patógenos altamente variables (Van Regenmortel, 2012); y iii) para patógenos para los que se generan respuestas inmunes protectoras de manera eficiente durante la infección natural, las Más recientemente, los fagos péptidos han sido utilizados en intentos de generar respuestas terapéuticas de anticuerpos para enfermedades crónicas, cáncer, inmunoterapia e inmunocontracepción. Inmunización con fagos que muestran la enfermedad de Alzheimer Los péptidos fibriles β-amiloide produjeron anticuerpos antiagregantes en ratones y cobayas (Frenkel et al., 2000 (Frenkel et al., 2003 Esposito et al., 2008; Tanaka et al., 2011), posiblemente redujo la formación de placa amiloide en ratones (Frenkel et al., 2003; Solomon, 2005; Esposito et al., 2008), y pudo haber ayudado a mantener las habilidades cognitivas en un modelo transgénico de ratón de la enfermedad de Alzheimer (Lavie et al., 2004) ; sin embargo, no está claro cómo se proponen estos anticuerpos para cruzar la barrera hematoencefá (2001) encontró que los anticuerpos criados en ratones contra un péptido ERBB2/HER2 podrían inhibir la proliferación de células de cáncer de mama. Fage mostrando ligandos péptidos de un anticuerpo anti-IgE provocó anticuerpos que unieron moléculas purificadas de IgE (Rudolf et al., 1998), que pueden ser útiles en inmunoterapia de alergia. Varias estrategias para las vacunas anticonceptivas basadas en fagos se han propuesto para el control de las poblaciones animales. Por ejemplo, la inmunización con fagos que muestran péptidos hormonales estimulantes de folículos en pVIII provocó anticuerpos que afectaron la fertilidad de ratones y ovejas (Abdennebi et al., 1999). También se encuentran en desarrollo los péptidos de los antígenos espermáticos (Samoylova et al., 2012a,b) y la hormona liberadora de gonadotropina (Samoylov et al., 2012). En su mayor parte, los péptidos que se muestran en los fagos provocan anticuerpos en animales experimentales (Tabla 2), aunque esto depende de las características del péptido y del método de su exhibición: las fusiones pIII tienden hacia una inmunogenicidad menor que las fusiones pVIII (Greenwood et al., 1991) posiblemente debido a diferencias en el número de copias (pIII: 1-5 copias vs. pVIII: estimadas en varios cientos de copias; Malik et al., 1996). De hecho, el fago es al menos tan inmunogénico como las proteínas portadoras tradicionales, como la albúmina sérica bovina (BSA) y la hemocianina de la cojera de ojo de llave (KLH; Melzer et al., 2003; Su et al., 2007), y tiene comparativamente pocos epítopos de células B endógenas para desviar la respuesta de anticuerpos de su objetivo previsto (Henry et al., 2011). Excepto los epítopos pequeños que pueden ser representados con precisión por una secuencia de aminoácidos cortos contiguos, sin embargo, ha sido extremadamente difícil provocar respuestas de anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con epitopos de proteínas nativas utilizando péptidos. El cuadro general es considerablemente más sombrío que el descrito en la Tabla 2, ya que en varios estudios: (i) los ligandos péptidos seleccionados de las bibliotecas de los fagos fueron clasificados por los autores como imitaciones de epitopos discontinuos si no presentaban una secuencia homológica obvia a la proteína nativa, lo que es una débil evidencia de no linealidad, o (ii) la evidencia de reactividad cruzada de anticuerpos provocada por la inmunización con péptidos discontinuados con proteína nativa no fue obligatoria. Irving et al. (2010) describen al menos una razón de esta falta de éxito: parece que los antígenos péptidos provocan un conjunto de anticuerpos topológicamente restringidos que son en gran medida incapaces de reconocer epitopos discontinuas o complejos en las biomoléculas más grandes. Mientras que el péptido puede imitar la química de un epítopo dado en una proteína plegada (permitiendo que se cruce con un anticuerpo dirigido), siendo una molécula más pequeña, no puede imitar la topología del epítopo completo de ese anticuerpo. A pesar de esto, el fago filamentoso sigue siendo muy útil como portador de péptidos con estructuras secundarias relativamente simples, que pueden ser estabilizados mediante el anclaje a las proteínas de la capa (Henry et al., 2011). Esto puede ser especialmente cierto de los péptidos con mala inmunogenicidad inherente, que puede aumentarse por la visualización de alta valencia y adyuvante asociado a los fago (véase Mecanismos inmunológicos de la vacunación con fago filamentoso más abajo). El fago filamentoso se ha utilizado en menor medida como portador de epítopos péptidos de células T, principalmente El trabajo temprano, que demostró que la inmunización con fage obtuvo ayuda de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993), fue confirmado por varios estudios posteriores (De Berardinis et al., 1999; Ulivieri et al., 2008). Desde la perspectiva de la vacunación contra enfermedades infecciosas, De Berardinis et al. (2000) mostraron que un epitope citotóxico de células T (CTL) de la transcriptasa inversa VIH-1 podría provocar CTLs específicos de antígenos in vitro e in vivo sin adición de epitopos de células T de ayuda exógena, presumiblemente ya que están presentes en las proteínas de la capa de fago (Mascolo et al., 2007). Del mismo modo, se observó un uso eficiente de CTLs frente a los epítopos de células T de los fagos de virus de la hepatitis B (Wan et al., 2001) y Candida albicans (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2006 Wang et al., 2014d, que, junto con otros tipos de respuestas inmunes, protegían a los ratones contra la candidiasis sistémica. La vacunación con una combinación de péptidos phagedisplayed provocó CTLs específicos de antígenos que resultaron eficaces en la reducción de la cisticercosis porcina en un ensayo controlado aleatorio (Manoutcharian et al., 2004; Morales et al., 2008). Mientras que las correlaciones de la protección inmune inducida por la vacuna para las enfermedades infecciosas, donde se conocen, son casi exclusivamente anticuerpos séricos o mucosas (Plotkin, 2010), En ciertas aplicaciones de la vacuna, el fago filamentoso se ha utilizado como portador de moléculas más grandes que serían inmunogénicas incluso en aislamiento. Inicialmente, las principales ventajas de la exhibición de estos antígenos de los fago eran la velocidad, facilidad de purificación y bajo costo de producción (Gram et al., 1993). E. coli F17a-G adhesin (Van Gerven et al., 2008), antígeno del núcleo de la hepatitis B (Bahadir et al., 2011), y antígeno de la superficie de la hepatitis B (Balcioglu et al., 2014) todas produjeron respuestas de anticuerpos cuando se exhibieron en la pIII, aunque ninguno de estos estudios comparó la inmunogenicidad de las Phage que muestra Schistosoma mansoni glutatión S-transferasa en pIII provocó una respuesta de anticuerpos que fue tanto más alta en el título como de diferentes isotipos en comparación con la inmunización con la proteína sola (Rao et al., 2003). Dos estudios de vacunas antiidiotípicas han utilizado el fago como portador de fragmentos de anticuerpos que contienen idiotipos inmunogénicos. Inmunización con fago que muestra el 1E10 idiotaype scFv (mimicking a Vibrio anguillarum surface epitope) provocó anticuerpos que protegían a los peces babosos de Vibrio anguillarum challenge (Xia et al., 2005). Una vacuna de idiotipo de tumor específico de phage-BCL1 vinculada químicamente fue débilmente inmunogénica en ratones pero extendió el tiempo de supervivencia en un modelo de linfoma de células B (Roehnisch et al., 2013), y fue bien tolerada e inmunogénica en pacientes con mieloma múltiple (Roehnisch et al., 2014). Un estudio de vacunación de ADN con antilaminarina scFv encontró que el ADN codificando una proteína de fusión pIII-scFv provocó respuestas inmunes humorales y mediadas por células más fuertes que el ADN codificando el scFv solo (Cuesta et al., 2006), sugiriendo que bajo algunas circunstancias, los epitopos de células T de fago endógeno pueden mejorar la inmunogenicidad de proteínas asociadas. Tomados en conjunto, los resultados de estos estudios muestran que como partícula similar a un virus de partículas, el fago filamentoso probablemente desencadena diferentes tipos de respuestas inmunitarias que los antígenos de proteínas recombinantes, y proporciona ayuda adicional de células T a las proteínas exhibidas o conjugadas. Sin embargo, el bajo número de copias de proteínas visualizadas pIII, así como la adyuvancia potencialmente no deseada asociada a los fagos, pueden hacer de la exhibición de proteínas recombinantes por fago una elección vacunal subóptima. Aunque nuestra comprensión de la respuesta inmune contra los palidezes fagosas filamentosas en comparación con antígenos modelo clásicos como la ovalbúmina, los últimos trabajos han comenzado a arrojar luz sobre los mecanismos inmunes activados en respuesta a la vacunación de los fagos (Figura 1). La partícula del fago es inmunogénica sin adyuvante en todas las especies probadas hasta la fecha, incluyendo ratones (Willis et al., 1993), ratas (Dente et al., 1994), conejos (de la Cruz et al., 1988), cobayas (Frenkel et al., 2000; Kim et al., 2004), peces (Coull et al., 1996; Xia et al., 2005), primates no humanos (Chen et al., 2001) y humanos (Roehnisch et al., 2014). Se han empleado varias vías de inmunización, incluyendo administración oral (Delmastro et al., 1997) así como subcutánea (Grabowska et al., 2000), intraperitoneal (van Houten et al., 2006), intramuscular (Samoylova et al., 2012a), intravenosa (Vaks y Benhar, 2011), e inyección intradérmica (Roehnisch et al., 2013); ningún estudio publicado ha comparado directamente el efecto de la vía de administración sobre la inmunogenicidad fagosa filamentosa. Los anticuerpos se generan contra sólo tres sitios principales en el virión: (i) los N-terminal expuestos a la superficie 12 de la retícula monomérica pVIII (Terry et al., 1997; Kneissel et al., 1999) ; (ii) los dominios N-terminal N1 y N2 de la pIII (van Houten et al., 2010); y (iii) lipopolisacárido bacteriano (LPS) incrustado en la capa de fago (Henry et al., 2011). En ratones, los títulos de anticuerpos séricos contra el fago suelen alcanzar 1:10 5 -1:10 6 después de 2-3 inmunizaciones, y se mantienen durante al menos 1 año postinmunización (Frenkel et al., 2000). Las respuestas primarias de anticuerpos contra el fago parecen estar compuestas por una mezcla de isotipos IgM e IgG2b en ratones C57BL/6, mientras que las respuestas secundarias de anticuerpos están compuestas principalmente de isotipos IgG1 e IgG2b, con una menor contribución de isotipos IgG2c e IgG3 (Hashiguchi et al., 2010). La supresión de los dominios N1 y N2 expuestos a la superficie de pIII produce una forma truncada de esta proteína que no provoca anticuerpos, sino que también produce una partícula de fago no infecciosa con menor inmunogenicidad general (van Houten et al., 2010). Como partícula similar a un virus, el fago filamentoso envuelve múltiples brazos del sistema inmune, comenzando con efectores celulares de inmunidad innata (macrofagos, neutrófilos y posiblemente células asesinas naturales), que son reclutados en sitios tumorales por fago que muestran moieties tumorales. El fago probablemente activa las respuestas de anticuerpos independientes de células T, ya sea a través de ligandos TLR asociados a los fagoes o enlaces cruzados por la celosía pVIII. Después del procesamiento por células que presentan antígenos, los péptidos derivados de los fagotes se presentan en la clase II de la MHC y en la clase I de la MHC, resultando en la activación de CTL de corta duración y una serie de tipos de células T ayudantes, que ayudan a la memoria primaria CTL y respuestas de células B de alta afinidad. Las fronteras en la microbiología www.fronterizosin.orgAunque los títulos de anticuerpos antifagos séricos parecen ser al menos parcialmente dependientes de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993; De Berardinis et al., 1999; van Houten et al., 2010), muchas células B específicas de pVIII circulantes en la sangre carecen de mutación somática incluso después de repetidas inmunizaciones quincenales, lo que sugiere que bajo estas condiciones, el fago activa respuestas de células B independientes de células T además de respuestas dependientes de células T de alta afinidad (Murira, 2014). Las partículas filamentarias de fagos pueden ser procesadas por células presentadoras de antígenos y presentadas en moléculas de clase II de MHC (Gaubin et al., 2003; Ulivieri et al., 2008) y pueden activar T H 1, T H 2 y T H 17 células T ayudantes (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2014d). Las respuestas antifagos T H 2 se mejoraron mediante la visualización de péptidos CTLA-4 fusionados con pIII (Kajihara et al., 2000). Las proteínas de Phage también pueden presentarse de forma cruzada en moléculas de clase I de MHC (Wan et al., 2005) y pueden producir dos ondas de respuestas CTL, que consisten primero en CTL de corta duración y después de CTL de memoria de larga duración que requieren ayuda de células CD4 + T (Del Pozzo et al., Estos últimos CTLs median una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (Fang et al., 2005; Del Pozzo et al., 2010). La partícula de fago es autoadyuvante a través de múltiples mecanismos. El LPS derivado de la pared de la célula huésped realza la inmunogenicidad del virión, y su eliminación por cromatografía de polimixina B reduce los títulos de anticuerpos contra las proteínas de capa de fago (Grabowska et al., 2000). El genoma de ADN singlestranded del fago contiene motivos CpG y también puede tener un efecto adyuvante. La respuesta de anticuerpos contra el fago es totalmente dependiente de la señalización de MyD88 y se modula mediante la estimulación de varios receptores de tipo peaje (Hashiguchi et al., 2010), indicando que la inmunidad innata juega un papel importante pero en gran Los estudios de biodistribución del fago después de la inyección intravenosa muestran que se elimina de la sangre en cuestión de horas a través del sistema reticuloendotelial (Molenaar et al., 2002), particularmente del hígado y el bazo, donde se retiene durante días (Zou et al., 2004), potencialmente activando respuestas de células B de zona marginal. Por lo tanto, el fago filamentoso no sólo es un portador altamente inmunogénico, sino que, gracias a la activación de una gama de respuestas inmunes innatas y adaptativas, sirve como un excelente modelo de antígeno de partícula similar al virus. Mucho antes de la identificación del fago filamentoso, otros tipos de bacteriofago ya se estaban utilizando para la terapia antibacteriana en la antigua Unión Soviética y Europa Oriental (revisado en Sulakvelidze et al., 2001). El fago filamentoso, con su ciclo de vida no lítico, tiene usos clínicos menos obvios, a pesar de que la especificidad del huésped de Inovirus y Plectrovirus incluye muchos patógenos de importancia médica, incluyendo Salmonella, E. coli, Shigella, Pseudomonas, Clostridium y Micoplasma. En un esfuerzo por mejorar su actividad bactericida, los fagoces filamentosos genéticamente modificados se han utilizado como "caballo de Troya" para introducir diversos agentes antibacterianos en las células. Los fagos M13 y Pf3 fueron diseñados para expresar la restricción BglII endonucleasa (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004), lambda fage S holin (Hagens y Blasi, 2003) o una proteína activadora letal del gen catabolita (Moradpour et al., 2009) que mató eficazmente a las células E. coli y Pseudomonas aeruginosa, respectivamente, sin liberación concomitante de LPS (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004). Lamentablemente, la rápida aparición de bacterias resistentes con pili F modificado representa un obstáculo importante y posiblemente insuperable a este enfoque. Sin embargo, hay algunos indicios de que los fagos filamentosos pueden ejercer efectos útiles pero más sutiles sobre sus hospedadores bacterianos que pueden no resultar en el desarrollo de resistencia a la infección. Varios estudios han reportado aumento de la sensibilidad antibiótica en poblaciones bacterianas infectadas simultáneamente con fago filamentoso tipo salvaje (Hagens et al., 2006) o fago diseñado para reprimir la respuesta celular SOS (Lu y Collins, 2009). La infección filamentosa f1 inhibió la formación de biopelículas en E. coli, pero no madura (May et al., 2011). Así, los fago filamentosos no modificados pueden ser de interés futuro como elementos de terapia combinada contra ciertas infecciones resistentes a fármacos. Las aplicaciones terapéuticas más avanzadas del fago filamentoso emergen cuando se modifica para expresar una fracción dirigida específica para células patógenas y/o proteínas para el tratamiento de enfermedades infecciosas, cáncer y autoinmunidad (Figura 2). El primer trabajo en esta área mostró como prueba de concepto que los fagos codificando un cassette de expresión GFP y mostrando un HER2specific scFv en todas las copias de pIII fueron internalizados en células tumorales de mama, resultando en la expresión GFP (Poul y Marks, 1999). M13 o fd fagos mostrando un péptido objetivo o fragmento de anticuerpos y amarrados a cloranfenicol por un crosslinker lábil eran inhibidores más potentes del crecimiento de Staphylococcus aureus que el cloranfenicol libre de alta concentración (Yacoby et al., 2006; Vaks y Benhar, 2011). M13 fagos cargados con doxorubicina y mostrando un péptido objetivo en células de cáncer de próstata específicamente muertas en pIII in vitro (Ghosh et al., péptido tumoral específico: proteínas de fusión de pVIII seleccionadas de "paisaje" fage (Romanov et al., 2001; Abbineni et al., 2010; Fagbohun et al., 2012 Fagbohun et al., 2013 Lang et al., 2014; Wang et al., 2014a) fueron capaces de dirigir y entregar siRNA-, paclitaxel-, y liposomas que contienen doxorubicina a las células tumorales (Jayanna et al., 2010a; Wang et al., 2010a Wang et al.,, b, c, 2014b Bedi et al., 2011 Bedi et al.,, 2013 Bedi et al.,, 2014 ; eran tasas de remisión tumoral no tóxicas y aumentadas en modelos de ratón (Jayanna et al., 2010b; Wang et Usando el modelo de tumor B16-OVA, Eriksson et al. (2007) mostraron que los fagos que mostraban péptidos y/o Fabs específicos para antígenos tumorales retrasaron el crecimiento del tumor y mejoraron la supervivencia, debido en gran parte a la activación de macrófagos asociados al tumor y al reclutamiento de neutrófilos en el sitio del tumor (Eriksson et al., 2009). Phage mostrando un scFv frente a fibriles β-amiloide mostró promesa como diagnóstico (Frenkel y Solomon, 2002) y terapéutico (Solomon, 2008) reactivo para la enfermedad de Alzheimer y Parkinson debido a la capacidad imprevista del fago para penetrar en el tejido cerebral (Ksendzovsky et al., 2012). Del mismo modo, los fagos que muestran un epítopo péptido inmunodominante derivado de la mielina oligodendrocyte glucoproteína desmielinizantes patógenos agotados anticuerpos en el tejido cerebral en el modelo murina experimental de encefalomielitis autoinmune de esclerosis múltiple (Rakover et al., 2010). Las ventajas del fago filamentoso en este contexto sobre los conjugados tradicionales anticuerpo-fármaco o proteico-péptido son: i) su capacidad para transportar cantidades muy altas de fármaco o péptido, y ii) su capacidad para acceder a compartimentos anatómicos que generalmente no pueden ser alcanzados por la administración sistémica de una proteína. A diferencia de la mayoría de los biológicos terapéuticos, la producción del fago filamentoso en bacterias complica su uso en los seres humanos de varias maneras. En primer lugar, los preparados crudos de fago filamentoso suelen contener niveles muy altos de SLP contaminante, en el rango de 10 unidades de endotoxina 2-10 4 (EU)/ml (Boratynski et al., 2004; Branston et al., 2015), que tienen el potencial de causar reacciones adversas graves. LPS no se elimina completamente por precipitación de polietilenglicol o centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio (Smith y Gingrich, 2005; Branston et al., 2015), pero sus niveles se pueden reducir drásticamente utilizando pasos de purificación adicionales como cromatografía de exclusión de tamaño (Boratynski et al., 2004; Zakharova et al., 2005), cromatografía de polimixina B (Grabowska et al., 2000), y tratamiento con detergentes como Triton X-100 o Triton X-114 (Roehnisch et al., 2014; Branston et al., 2015). Estas estrategias alcanzan de forma rutinaria niveles de endotoxina < 1 EU/ml medidos por el lisato de limulo amebocito (LAL), muy por debajo del límite de la FDA para la administración parenteral de 5 EU/kg de peso corporal/dosis, aunque sigue habiendo preocupaciones con respecto a la presencia de LPS residuales asociadas al virión que pueden ser indetectables.Una segunda consecuencia, y tal vez inevitable, de la producción bacteriana del fago filamentoso es la heterogeneidad inherente del tamaño de las partículas y el espectro de contaminantes solubles y asociados al virión del huésped, que pueden ser causa de problemas de seguridad y restringir su uso a los grupos de alto riesgo. Se han propuesto muchos tipos de variantes de bacteriofago y fagos diseñados, incluido el fago filamentoso, para uso profiláctico ex vivo en seguridad alimentaria, ya sea en la tubería de producción (revisado en Dalmasso et al., 2014) o para la detección de patógenos transmitidos por alimentos postproducción (revisado en Schmelcher y Loessner, 2014). Fago filamentoso que muestra una etiqueta de tetracisteína en pIII se utilizaron para detectar células E. coli a través de tinción con tinte biarsenical. Biosensores basados en resonancia de plasmón superficial (Nanduri et al., 2007), transductores piezoeléctricos (Olsen et al., 2006), dicroísmo lineal (Pacheco-Gomez et al., 2012), y tecnología de sensores magnetoelásticos (Lakshmanan et al., 2007; Huang et al., 2009) fueron ideados utilizando fagos filamentosos que muestran scFv o conjugados a IgG enteros contra E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium y Bacillus anthracis con límites de detección en el orden de 10 2-10 6 células bacterianas/ml. Prueba de concepto ha sido demostrado para el uso de tales biosensores a base de fagos para detectar contaminación bacteriana de productos vivos (Li et al., 2010 La partícula fagosa filamentosa está encerrada por un capsid de proteína similar a la varilla, de 1000 nm de largo y 5 nm de ancho, formado casi enteramente por monómeros de pVIII superpuestos, cada uno de los cuales se encuentra en 27 angstroms de su vecino más cercano y expone dos grupos de aminas, así como al menos tres grupos de carboxilo (Henry et al., 2011). La regularidad de la celosía de pVIII de fagos y su diversidad de grupos químicamente direccionables la convierten en un andamio ideal para la bioconjugación (Figura 3). El enfoque más utilizado es la funcionalización de grupos de aminas con ésteres NHS (van Houten et al., 2006 (van Houten et al., 2010 Yacoby et al., 2006), aunque esto puede resultar en una a Los grupos de carboxilo y los residuos de tirosina también se pueden funcionalizar utilizando acoplamiento de carbodiimida y acoplamiento de diazonio, respectivamente (Li et al., 2010a). Carrico et al. (2012) desarrollaron métodos para etiquetar específicamente pVIII N-termina sin modificación de residuos de lisina expuestos a través de una reacción de formación de transaminación-oxima en dos pasos. La modificación específica de las proteínas de la capa de fago es aún más fácil de lograr usando péptidos modificados genéticamente (Ng et al., 2012) o enzimas (Chen et al., 2007; Hess et al., 2012), pero esto puede ser engorroso y es menos general en aplicación. Durante más de una década, el interés en el fago filamentoso como bloque de construcción de nanomateriales ha ido creciendo debido a sus propiedades fisicoquímicas únicas, con aplicaciones emergentes en magnet Desde hace mucho tiempo se sabe que por encima de un determinado umbral de concentración, el fago puede formar suspensiones cristalinas ordenadas (Welsh et al., 1996). Lee et al. (2002) diseñaron un fago M13 para mostrar un péptido de unión ZnS en pIII y demostraron que, en presencia de nanopartículas ZnS, se autoensamblan en biomateriales de película altamente ordenados que se pueden alinear utilizando campos magnéticos. Aprovechando la capacidad de mostrar péptidos específicos de sustratos en lugares conocidos en el filamento fagotico Hess et al., 2012), este pionero FIGURE 3 Grupos químicamente direccionables de la capa principal de bacteriofago filamentoso. El virión del fago filamentoso se compone de 2.500-4.000 copias superpuestas de la proteína 50-residue Cada monómero tiene una serie de grupos químicamente direccionables disponibles para la conjugación bioortogonal, incluyendo dos grupos de aminas primarias (mostradas en rojo), tres grupos de carboxilo (mostradas en azul) y dos grupos de hidroxilo (mostradas en verde). Los 12 residuos N-terminales generalmente expuestos al sistema inmune para la unión de anticuerpos están en negrita subrayado. Figura adaptada a partir de datos estructurales de Marvin, 1990, disponible libremente en bases de datos PDB y SCOPe. el trabajo se convirtió en la base para la construcción de nanomateriales bidimensionales y tridimensionales con arquitecturas más avanzadas, incluyendo nanohilos semiconductores (Mao et al., 2003 (Mao et al.,, 2004, nanopartículas, y nanocomposites (Oh et al., 2012; Chen et al., 2014). Utilizando los péptidos híbridos de unión de oro y Co 3 O 4 en pVIII como andamio para ensamblar nanohilos en multicapas de polielectrolitos, Nam et al. (2006) produjeron una batería de iones de litio delgada y flexible, que podía ser estampada en colectores de corriente de microbanda de platino (Nam et al., 2008). Las propiedades electroquímicas de estas baterías se mejoraron aún más a través de la visualización pIII de péptidos de unión de nanotubos de carbono de una sola pared (Lee et al., 2009), ofreciendo un enfoque para la producción sostenible de electrodos nanoestructurados a partir de materiales de partida mal conductivos. Los nanomateriales a base de fage han encontrado aplicaciones en la imagen del cáncer (Ghosh et al., 2012b; Yi et al., 2012), la división del agua fotocatalítica (Nam et al., 2010a; Neltner et al., 2010), la recolección de luz (Nam et al., 2010b; Chen et al., 2013), las tecnologías fotorespuestas (Murugesan et al., 2013), los electrodos neuronales (Kim et al., 2014), y la generación de energía piezoeléctrica (Murugesan et al., 2013). Así, las propiedades fisicoquímicas únicas del fago, en combinación con la visualización modular de péptidos y proteínas con especificidad de unión conocida, han desove materiales totalmente nuevos con diversas aplicaciones. Vale la pena señalar que las propiedades bio La alineación magnética de los fagos filamentosos de alta concentración en solución puede ordenar parcialmente el ADN, el ARN, las proteínas y otras biomoléculas para la medición de las interacciones de acoplamiento dipolar (Hansen et al., 1998 (Hansen et al., 2000 Dahlke Ojennus et al., 1999) en espectroscopia NMR. Debido a su gran tamaño de población, tiempos de generación cortos, tamaños de genoma pequeños y facilidad de manipulación, diversos bacteriófagos filamentosos y no filamentosos se han utilizado como modelos de evolución experimental (revisado en Husimi, 1989; Wichman y Brown, 2010; Kawecki et al., 2012; Hall et al., 2013). El fago filamentoso tiene usos prácticos adicionales en ingeniería proteica y evolución proteica dirigida, debido a su tolerancia única de modificaciones genéticas que permiten mostrar biomolécula En primer lugar, entre estas aplicaciones se encuentra la maduración in vitro de la afinidad de los fragmentos de anticuerpos mostrados en pIII. Las bibliotecas de variantes Fabs y anticuerpos de cadena única pueden generarse mediante mutagenesis aleatoria o sitedirected y seleccionarse sobre la base de una unión mejorada o alterada, imitando más o menos la estrategia de evolución somática del sistema inmunitario (Marks et al., 1992; Bradbury et al., 2011). Sin embargo, otros sistemas de visualización in vitro, como la visualización de levaduras, tienen importantes ventajas sobre el fago filamentoso para la maduración de afinidad (aunque cada tecnología de visualización tiene fortalezas complementarias; Koide y Koide, 2012) y, independientemente del método de visualización, la selección de variantes "mejoradas" puede ser lenta y engorrosa. Se han desarrollado métodos iterativos para combinar mutaciones de diseño computacional (Lippow et Recientemente, Esvelt et al. (2011) desarrollaron una nueva estrategia para la evolución dirigida de las proteínas fagosas filamentosas, denominadas evolución continua asistida por fagos (PACE), que permite múltiples rondas de evolución por día con poca intervención experimental.Los autores diseñaron el fago M13 para codificar una proteína exógena (sujeto a la evolución dirigida), cuya actividad funcional desencadena la expresión del gen III de un plasmido accesorio; variantes de la proteína exógena surgen por mutagenesis aleatoria durante la replicación de fagos, cuya tasa puede aumentarse mediante la expresión inducible de polimerasas de ADN propensas a errores. Al suministrar cantidades limitadas de células E. coli receptivas a las variantes de fagosas diseñadas, Esvelt et al. (2011) vincula elegantemente la infectividad y producción de fagos con la presencia de un fenotipo proteico deseado. Carlson et al. (2014) más tarde mostró que la severidad de selección PACE podría ser modulada proporcionando pequeñas cantidades de pIII independientemente del fenotipo proteico, y funciones proteicas indeseables seleccionadas negativamente al vincularlas a la expresión de una variante pIII truncada que altera la infectividad en una forma negativa dominante. PACE se limita actualmente a funciones proteicas que pueden estar vinculadas de alguna manera a la expresión de un reportero del gen III, tales como interacción proteína-proteína, recombinación, unión ADN o ARN, y catálisis enzimática (Meyer y Ellington, 2011). Este enfoque representa una vía prometedora para la investigación básica en evolución molecular (Dickinson et al., 2013) y biología sintética, incluyendo ingeniería de anticuerpos. El bacteriofago filamentario se ha recuperado de diversas fuentes ambientales, incluyendo el suelo (Murugaiyan et al., 2011), el agua dulce costera (Xue et al., 2012), los lagos alpinos (Hofer y Sommaruga, 2001) y las bacterias del mar profundo (Jian et al., 2012), pero tal vez no sorprendentemente el intestino humano (Kim et al., 2011). El "fageoma" ambiental en el suelo y el agua representan la mayor fuente de replicación de ADN en el planeta, y se estima que contiene más de 10 30 partículas virales (Ashelford et al., 2003; Chibani-Chennoufi et al., 2004; Suttle, 2005). Los pocos estudios que intentan investigar la ecología ambiental de los fagos filamentosos utilizando técnicas clásicas de microbiología ambiental (normalmente observación directa por microscopía electrónica) encontraron que los fagos filamentosos constituían entre el 0 y el 100% de todas las partículas virales (Demuth et al., 1993; Pina et al., 1998; Hofer y Sommaruga, 2001). Hubo alguna evidencia de fluctuación estacional de poblaciones de fagos filamentosos junto con la abundancia relativa de bacterias heterotróficas libres (Hofer y Sommaruga, 2001). Los datos existentes sugieren que los fagos filamentosos son constituyentes menores de comunidades virales en agua dulce (Roux et al., 2012) y agua recuperada y potable (Rosario et al., 2009), pero tienen frecuencias mucho más altas en aguas residuales y aguas residuales (Cantalupo et al., 2011; Alhamlan et al., 2013), con la salvedad de que los sesgos inherentes a las metodologías para determinar estos datos (purificación de partículas virales, sesgos de secuenciación) no han sido bien validados. No hay datos que describan la dinámica poblacional de los fagos filamentosos y sus especies hospedantes en el entorno natural. A nivel individual de virus-bacterio, está claro que los fagos filamentosos pueden modular el fenotipo huésped, incluyendo la virulencia de importantes patógenos humanos y de cultivos. Esto puede ocurrir ya sea a través de efectos directos de replicación de fagos en el crecimiento celular y la fisiología, o, más típicamente, por transferencia horizontal de material genético contenido en episomas y/o profagos cromosómicamente integrados. Fago filamentoso templado también puede jugar un papel en la evolución del genoma (revisado en Canchaya et al., 2003). Tal vez el ejemplo mejor estudiado de modulación de virulencia por fago filamentoso es el de Vibrio cholerae, cuya virulencia completa requiere conversión lisogénica por la toxina del cólera codificante CTX La integración de los fagos CTXo se produce en sitios específicos del genoma; estas secuencias se introducen a través de la acción combinada de otro fagos filamentoso, fs2o, y un fagoso filamentoso satelital, TLC-KnŁo1 (Hassan et al., 2010). Así, las especies de fagos filamentosos interactúan y coevolucionan entre sí, además de sus anfitriones. La infección por fagos filamentosos se ha implicado en la virulencia de Yersinia pestis (Derbise et al., 2007), Neisseria meningitidis (Bille et al., 2005 (Bille et al., 2008, Vibrio parahemolyticus (Iida et al., 2001), E. coli 018:K1:H7 (Gonzalez et al., 2002), Xanthomonas campestris (Kamiunten and Wakimoto, 1982), y P. aeruginosa (Webb et al., 2004), aunque en la mayoría de estos casos, los mecanismos específicos que modulan la virulencia no son claros. La infección por fage puede potenciar o reprimir la virulencia dependiendo de las características del fago, la bacteria huésped y el medio ambiente, como es el caso del patógeno de la marchitez bacteriana Ralstonia solanacearum (Yamada, 2013). Dado que la infección resulta en la regulación de los pili utilizados para la entrada viral, el tratamiento del fago filamentoso se ha propuesto como un medio hipotético para inhibir la conjugación bacteriana y la transferencia génica horizontal, a fin de evitar la propagación de genes de resistencia a antibióticos (Lin et al., 2011). Finalmente, el fago filamentoso también puede desempeñar un papel futuro en la preservación de la biodiversidad de otros organismos en ecosistemas de riesgo. Se ha propuesto el uso del fago artificial en la biorremediación, ya sea mostrando fragmentos de anticuerpos de la especificidad deseada para la filtración de toxinas y contaminantes ambientales (Petrenko y Makowski, 1993), o como polímeros biodegradables que muestran péptidos seleccionados por su capacidad para agregar contaminantes, tales como residuos de arenas oleaginosas (Curtis et al., 2011 (Curtis et al., 2013 ). También se ha propuesto el uso del fago artificial que muestra péptidos que se unen específicamente a materiales inorgánicos en tecnologías de separación mineral más avanzadas y menos intrusivas (Curtis et al., 2009 ). El fago filamentoso representa un organismo altamente versátil cuyos usos van mucho más allá de la exhibición tradicional de fago y la selección de afinidad de anticuerpos y polipéptidos de especificidad deseada. Su alta inmunogenicidad y su capacidad para mostrar una variedad de antígenos superficiales hacen que el fago sea un excelente portador de la vacuna antipartículas, aunque su producción y preparación bacterianas probablemente limiten sus aplicaciones en vacunas humanas en la actualidad, a pesar de ser aparentemente seguros y bien tolerados en animales y personas. Las características imprevistas de la partícula antifago, como el cruce de la barrera hematoencefálica y la formación de fases cristalinas líquidas altamente ordenadas, han abierto nuevas vías de investigación en terapias para enfermedades crónicas y el diseño de nanomateriales. Nuestra comprensión comparativamente detallada de las interacciones del fagotismo filamentoso modelo con sus huéspedes bacterianos ha permitido a los investigadores aprovechar el ciclo de vida del fago para dirigir la evolución proteica en el laboratorio. Esperamos que un conocimiento más profundo de las interacciones entre los hospederos de fago a nivel ecológico pueda producir estrategias novedosas para controlar la pato Mientras se siguen desarrollando nuevas aplicaciones del fago filamentoso, es probable que el fago conserve su posición como caballo de batalla para el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos durante muchos años, incluso con el advenimiento de tecnologías competidoras. KH y JS concibieron y escribieron el manuscrito. MA-G leyó el manuscrito y comentó sobre el texto.

¿Qué determina el modo de visualización?

Más allá de la visualización de los fagos: aplicaciones no tradicionales del bacteriofago filamentoso como portador de vacunas, andamio biológico terapéutico y bioconjugadorhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4523942/SHA: f00f183d0bce0091a02349ec1eab44a76a9bc4Autores: Henry, Kevin A.; Arbabi-Ghahroudi, Mehdi; Scott, Jamie K.Fecha: 2015-08-04DOI: 10.3389/fmicb.2015.00755Licencia: cc-byAbstract: Durante los últimos 25 años, la tecnología de exhibición de fagos ha sido una herramienta inestimable para los estudios de interacciones proteína-proteína. Sin embargo, las propiedades biológicas, bioquímicas y biofísicas inherentes al bacteriofago filamentoso, así como la facilidad de su manipulación genética, también lo convierten en una plataforma atractiva fuera del canon de exhibición tradicional de fagos. Esta revisión se centrará en las propiedades únicas del bacteriofago filamentoso y destacará sus diversas aplicaciones en la investigación actual. Se ponen énfasis en: (i) las ventajas del fago como portador de la vacuna, incluyendo su alta inmunogenicidad, relativa simplicidad antigénica y capacidad para activar una gama de respuestas inmunes, (ii) el potencial del fago como agente profiláctico y terapéutico para enfermedades infecciosas y crónicas, (iii) la regularidad de la retícula de la proteína de la capa principal del virio, que permite una variedad de bioconjugación y aplicaciones de química de la superficie, particularmente en nanomateriales, y (iv) el gran tamaño de la población del fago y los tiempos de generación rápidos, que lo convierten en un excelente sistema modelo para la evolución de proteínas dirigidas. A pesar de su ubicuidad en la biosfera, el trabajo metagenómico apenas está comenzando a explorar la ecología del fago filamentoso y su papel en la evolución de las poblaciones bacterianas. Así, el fago filamentoso representa un microorganismo robusto, barato y versátil cuyas aplicaciones de bioingeniería continúan expandiéndose en nuevas direcciones, aunque sus limitaciones en algunas esferas imponen obstáculos a su adopción y uso generalizados. Texto: El bacteriofago filamentoso (genera Inovirus y Plactrovirus) son virus no envueltos en forma de varilla de Escherichia coli, cuyos largos capsidios helicoidales encapsulan un genoma circular de ADN de una sola cadena. Después del descubrimiento independiente de bacteriofago por Twort (1915) y d 'Hérelle (1917), el primer fago filamentoso, f1, fue aislado en Loeb (1960) y más tarde caracterizado como un miembro de un grupo más grande de fago (Ff, incluyendo f1, M13, y fd fago) específico para el E. coli conjugativo F pilus (Hofschneider y Mueller-Jensen, 1963; Marvin y Hoffmann-Berling, 1963; Zinder et al., 1963; Salivar et al., 1964). Poco después, se descubrió un fago filamentoso que no utiliza F-pili para la entrada (If y Ike; Meynell y Lawn, 1968; Khatoon et al., 1972), y con el tiempo la lista de fago filamentoso conocido se ha expandido a más de 60 miembros (Fauquet et al., 2005), incluyendo especies templadas y grampositivas. El trabajo de varios grupos en los últimos 50 años ha contribuido a una comprensión relativamente sofisticada de la estructura filamentosa, biología y ciclo vital (revisado en Marvin, 1998; Rakonjac et al., 2011; Rakonjac, 2012). A mediados de la década de 1980, el principio de modificar el genoma de fago filamentoso para mostrar polipéptidos como fusiones para cubrir proteínas en la superficie del virión fue inventado por Smith y colegas (Smith, 1985 Sobre la base de las ideas descritas en Parmley y Smith (1988), los grupos de California, Alemania y el Reino Unido desarrollaron plataformas de fage-display para crear y proyectar bibliotecas de variantes de péptidos y proteínas plegadas (Bass et al., 1990; Devlin et al., 1990; McCafferty et al., 1990; Scott and Smith, 1990; Breitling et al., 1991; Kang et al., 1991). Esta tecnología permitió, por primera vez, la capacidad de conectar sin problemas la información genética con la función proteica para un gran número de variantes proteicas simultáneamente, y ha sido ampliamente y productivamente explotada en estudios de interacciones proteicas. Muchas excelentes revisiones están disponibles en bibliotecas de fage-display y sus aplicaciones (Kehoe y Kay, 2005; Bratkovic, 2010; Pande et al., 2010). Sin embargo, el fago tiene también una serie de propiedades estructurales y biológicas únicas que lo hacen altamente útil en áreas de investigación que han recibido mucha menos atención. Así, el propósito de esta revisión es destacar el trabajo reciente y actual utilizando fago filamentoso en aplicaciones nuevas y no tradicionales. Específicamente, nos referimos a proyectos que se basan en el fago filamentoso como un elemento clave, pero cuyo propósito principal no es la generación o cribado de bibliotecas fagodisplayed para obtener ligandos polipéptidos de unión. Estos tienden a caer en cuatro categorías principales de uso: i) fago filamentoso como portador de vacuna; ii) fago filamentoso diseñado como un agente biológico terapéutico en enfermedades infecciosas y crónicas; iii) fago filamentoso como un andamio para bioconjugación y química superficial; y iv) fago filamentoso como un motor para la evolución de variantes de proteínas exhibi Una sección final está dedicada a los últimos desarrollos en la ecología fagosa filamentosa y las interacciones fagosas-anfitriona. Los temas comunes compartidos entre todas estas aplicaciones incluyen las propiedades biológicas, inmunológicas y fisicoquímicas únicas del fago, su capacidad para mostrar una variedad de biomoléculas de forma modular, y su relativa simplicidad y facilidad de manipulación. Casi todas las aplicaciones del fago filamentoso dependen de su capacidad para mostrar polipéptidos en la superficie del virio como fusiones a proteínas de la capa de fago (Tabla 1). El modo de visualización determina el tamaño máximo tolerado del polipéptido fusionado, su número de copia en el fago, y potencialmente, la estructura del polipéptido mostrado. La visualización se puede lograr fusionando ADN codificando un polipéptido de interés directamente para el gen codificando una proteína de la capa dentro del genoma fago Sin embargo, con mucha más frecuencia, sólo se modifica una copia de la proteína de la capa en presencia de una segunda copia de tipo salvaje (por ejemplo, se muestra el tipo 88 si tanto los genes de tipo recombinante como los de tipo salvaje pVIII están en el genoma de los fagos, se muestra el tipo 8+8 si el Parmley y Smith (1988), McConnell et al. (1994), Rondot et al. (2001) Híbrido (sistemas de tipo 33 y 3+3) Sistema del tipo 3+3 <1 2 Smith y Scott (1993), Smith y Petrenko (1997) pVI Híbrido (sistema del tipo 6+6) Sí <1 2 > 25 kDa Hufton et al. (1999) pVII Sistema totalmente recombinante (sistema del tipo 7) No 5 > 25 kDa Kwasnikowski et al. (2005) Híbrido (sistema del tipo 7+7) (1999) pVIII Totalmente recombinante (fago paisajístico; sistema del tipo 8)No 2700 3 5-8 residuos Kishchenko et al. (1994), Petrenko et al. (1996) Híbrido (sistemas del tipo 88 y 8+8) Sistema del tipo 8+8 +1300 2 >50 kDa Scott and Smith (1990), Greenwood et al. (1991), Smith and Fernandez (2004) piX Totalmente recombinante (sistema del tipo 9+9 *) Sí 5 > 25 kDa Gao et al. (2002) Híbrido (sistema del tipo 9+9) No <1 2 Gao et al. (1999), Shi et al. (2010), Tornetta et al. (2010) 1 Los asteriscos indican la presencia de copias no funcionales de la proteína de la capa en el genoma del fago de ayuda utilizado para rescatar a un phagemid cuya proteína de capa se ha fusiona 2 El número de copia depende del tamaño del polipéptido; típicamente <1 copia por partícula de fago, pero para la visualización del péptido pVIII puede ser de hasta un 15% de moléculas de pVIII en viriones híbridos. 3 El número total de moléculas de pVIII depende del tamaño del genoma del fago; se añade una molécula de pVIII por cada 2,3 nucleótidos en el genoma viral. El gen recombinante 8 se encuentra en un plásmido con un origen fago de replicación) resultando en un virión híbrido con dos tipos diferentes de proteína de capa dada. Con mucho, las proteínas de capa más comúnmente utilizadas para la visualización son la proteína de capa principal, pVIII, y la proteína de capa menor, pIII, con la mayor ventaja de que la primera es la visualización de número de copia más alto (hasta un 15% de moléculas de capa recombinante en un virión híbrido, al menos para fusiones cortas de péptidos), y de que esta última es la capacidad de mostrar algunas proteínas plegadas en un número de copia apreciable (1-5 por partícula de fago). Si bien pVIII muestra proteínas plegadas en un fago híbrido es posible, normalmente resulta en un número de copia de mucho menos de 1 por virio (Sidhu et al., 2000). Para los fines de esta revisión, utilizamos el término "exhibición de fagos" para referirse a un fago filamentoso recombinante que muestra una sola secuencia de polipéptidos en su superficie (o más raramente, visualización biespecífica lograda mediante la fusión de polipéptidos a dos proteínas capsidas diferentes), y el término "biblioteca de fagotismo" para referirse a un grupo diverso de fagobios filamentosos recombinantes que muestran una serie de variantes de polipéptidos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos; péptidos). Tales bibliotecas son normalmente examinadas por ciclos iterativos de panificación contra una proteína de interés inmovilizada (por ejemplo, antígeno para bibliotecas de anticuerpos visualizadas por fago; anticuerpo para bibliotecas de péptidos visualizadas por fago) seguidos de amplificación del fago unido en células coli. El trabajo temprano con antifagos antisera generado para la clasificación de especies demostró que el fago virión filamentoso es altamente inmunogénico en ausencia de adyuvantes (Meynell y Lawn, 1968 ) y que sólo la proteína principal de la capa, pVIII, y la proteína menor de la capa, pIII, son blanco de anticuerpos (Pratt et al., 1969; Woolford et al., 1977). Así, la idea de utilizar el fago como portador para obtener anticuerpos contra haptens o polipéptidos poco inmunogénicos fue una extensión natural de la capacidad de mostrar secuencias exógenas recombinantes en su superficie, que fue demostrada por primera vez por de la Cruz et al. (1988). El bajo costo de producción de la partícula de fago, la alta estabilidad y el potencial para la exhibición de alta valencia del antígeno extraño (a través de la pantalla pVIII) también la hicieron atractiva como portadora de la vacuna, especialmente durante las primeras etapas de desarrollo de la tecnología proteica recombinante. Sobre la base de la tecnología existente de portador de péptidos, los primeros inmunogenes de la vacuna filamentosa a base de fago mostraron secuencias cortas de aminoácidos derivadas directamente de proteínas de interés como fusiones recombinantes a pVIII o pIII (de la Cruz et al., 1988). A medida que se desarrollaba y refinaba la tecnología bibliotecaria, los antígenos basados en fagos que mostraban ligandos péptidos de anticuerpos monoclonales (seleccionados de bibliotecas de péptidos aleatorias utilizando el anticuerpo, simulando así con diversos grados de éxito el epítopo plegado del anticuerpo en su antígeno cognado; Geysen et al., 1986; Knittelfelder et al., 2009) también se generaban con fines de inmunización, con el objetivo de provocar anticuerpos antipéptidos que también reconocían la proteína nativa. Cuando se muestran en los fagos, los péptidos que codifican las regiones repetitivas de la proteína de circunsporozoita malarial y la proteína de superficie de merozoita 1 fueron inmunogénicos en ratones y conejos (de la Cruz et al., 1988; Greenwood et al., 1991; Willis et al., 1993; Demangel et al., 1996), y anticuerpos levantados contra esta última reacción cruzada con la proteína de larga duración. Varios determinantes péptidos (o imitaciones de los mismos) del VIH-1 gp120, gp41, gag y transcriptasa inversa fueron inmunogénicos cuando se exhibieron o conjugaron con proteínas de la capa de los fagos (Minenkova et al., 1993; di Marzo Veronese et al., 1994; De Berardinis et al., 1999; Scala et al., 1999; Chen et al., 2001; van Houten et al., 2006 van Houten et al.,, 2010, y en algunos casos provocaron anticuerpos que fueron capaces de neutralizar débilmente virus adaptados al laboratorio (di Marzo Veronese et al., 1994; Scala et al., 1999). La lista de infecciones animales y humanas para las que se han desarrollado inmunogenes péptidos fagosos a medida que las vacunas conducen continúa expandiéndose e incluye patógenos bacterianos, fúngicos, virales y parasitarios (Tabla 2). Si bien en algunos casos los resultados de estos estudios han sido prometedores, las vacunas péptidas basadas en anticuerpos epitópicos ya no son un área de investigación activa por varias razones: i) en muchos casos, los péptidos imitan de forma incompleta o inadecuada epítopos en proteínas plegadas (Irving et al., 2010; véase más adelante); ii) los anticuerpos contra un solo epítopo puede ser de utilidad limitada, especialmente para patógenos altamente variables (Van Regenmortel, 2012); y iii) para patógenos para los que se generan respuestas inmunes protectoras de manera eficiente durante la infección natural, las Más recientemente, los fagos péptidos han sido utilizados en intentos de generar respuestas terapéuticas de anticuerpos para enfermedades crónicas, cáncer, inmunoterapia e inmunocontracepción. Inmunización con fagos que muestran la enfermedad de Alzheimer Los péptidos fibriles β-amiloide produjeron anticuerpos antiagregantes en ratones y cobayas (Frenkel et al., 2000 (Frenkel et al., 2003 Esposito et al., 2008; Tanaka et al., 2011), posiblemente redujo la formación de placa amiloide en ratones (Frenkel et al., 2003; Solomon, 2005; Esposito et al., 2008), y pudo haber ayudado a mantener las habilidades cognitivas en un modelo transgénico de ratón de la enfermedad de Alzheimer (Lavie et al., 2004) ; sin embargo, no está claro cómo se proponen estos anticuerpos para cruzar la barrera hematoencefá (2001) encontró que los anticuerpos criados en ratones contra un péptido ERBB2/HER2 podrían inhibir la proliferación de células de cáncer de mama. Fage mostrando ligandos péptidos de un anticuerpo anti-IgE provocó anticuerpos que unieron moléculas purificadas de IgE (Rudolf et al., 1998), que pueden ser útiles en inmunoterapia de alergia. Varias estrategias para las vacunas anticonceptivas basadas en fagos se han propuesto para el control de las poblaciones animales. Por ejemplo, la inmunización con fagos que muestran péptidos hormonales estimulantes de folículos en pVIII provocó anticuerpos que afectaron la fertilidad de ratones y ovejas (Abdennebi et al., 1999). También se encuentran en desarrollo los péptidos de los antígenos espermáticos (Samoylova et al., 2012a,b) y la hormona liberadora de gonadotropina (Samoylov et al., 2012). En su mayor parte, los péptidos que se muestran en los fagos provocan anticuerpos en animales experimentales (Tabla 2), aunque esto depende de las características del péptido y del método de su exhibición: las fusiones pIII tienden hacia una inmunogenicidad menor que las fusiones pVIII (Greenwood et al., 1991) posiblemente debido a diferencias en el número de copias (pIII: 1-5 copias vs. pVIII: estimadas en varios cientos de copias; Malik et al., 1996). De hecho, el fago es al menos tan inmunogénico como las proteínas portadoras tradicionales, como la albúmina sérica bovina (BSA) y la hemocianina de la cojera de ojo de llave (KLH; Melzer et al., 2003; Su et al., 2007), y tiene comparativamente pocos epítopos de células B endógenas para desviar la respuesta de anticuerpos de su objetivo previsto (Henry et al., 2011). Excepto los epítopos pequeños que pueden ser representados con precisión por una secuencia de aminoácidos cortos contiguos, sin embargo, ha sido extremadamente difícil provocar respuestas de anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con epitopos de proteínas nativas utilizando péptidos. El cuadro general es considerablemente más sombrío que el descrito en la Tabla 2, ya que en varios estudios: (i) los ligandos péptidos seleccionados de las bibliotecas de los fagos fueron clasificados por los autores como imitaciones de epitopos discontinuos si no presentaban una secuencia homológica obvia a la proteína nativa, lo que es una débil evidencia de no linealidad, o (ii) la evidencia de reactividad cruzada de anticuerpos provocada por la inmunización con péptidos discontinuados con proteína nativa no fue obligatoria. Irving et al. (2010) describen al menos una razón de esta falta de éxito: parece que los antígenos péptidos provocan un conjunto de anticuerpos topológicamente restringidos que son en gran medida incapaces de reconocer epitopos discontinuas o complejos en las biomoléculas más grandes. Mientras que el péptido puede imitar la química de un epítopo dado en una proteína plegada (permitiendo que se cruce con un anticuerpo dirigido), siendo una molécula más pequeña, no puede imitar la topología del epítopo completo de ese anticuerpo. A pesar de esto, el fago filamentoso sigue siendo muy útil como portador de péptidos con estructuras secundarias relativamente simples, que pueden ser estabilizados mediante el anclaje a las proteínas de la capa (Henry et al., 2011). Esto puede ser especialmente cierto de los péptidos con mala inmunogenicidad inherente, que puede aumentarse por la visualización de alta valencia y adyuvante asociado a los fago (véase Mecanismos inmunológicos de la vacunación con fago filamentoso más abajo). El fago filamentoso se ha utilizado en menor medida como portador de epítopos péptidos de células T, principalmente El trabajo temprano, que demostró que la inmunización con fage obtuvo ayuda de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993), fue confirmado por varios estudios posteriores (De Berardinis et al., 1999; Ulivieri et al., 2008). Desde la perspectiva de la vacunación contra enfermedades infecciosas, De Berardinis et al. (2000) mostraron que un epitope citotóxico de células T (CTL) de la transcriptasa inversa VIH-1 podría provocar CTLs específicos de antígenos in vitro e in vivo sin adición de epitopos de células T de ayuda exógena, presumiblemente ya que están presentes en las proteínas de la capa de fago (Mascolo et al., 2007). Del mismo modo, se observó un uso eficiente de CTLs frente a los epítopos de células T de los fagos de virus de la hepatitis B (Wan et al., 2001) y Candida albicans (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2006 Wang et al., 2014d, que, junto con otros tipos de respuestas inmunes, protegían a los ratones contra la candidiasis sistémica. La vacunación con una combinación de péptidos phagedisplayed provocó CTLs específicos de antígenos que resultaron eficaces en la reducción de la cisticercosis porcina en un ensayo controlado aleatorio (Manoutcharian et al., 2004; Morales et al., 2008). Mientras que las correlaciones de la protección inmune inducida por la vacuna para las enfermedades infecciosas, donde se conocen, son casi exclusivamente anticuerpos séricos o mucosas (Plotkin, 2010), En ciertas aplicaciones de la vacuna, el fago filamentoso se ha utilizado como portador de moléculas más grandes que serían inmunogénicas incluso en aislamiento. Inicialmente, las principales ventajas de la exhibición de estos antígenos de los fago eran la velocidad, facilidad de purificación y bajo costo de producción (Gram et al., 1993). E. coli F17a-G adhesin (Van Gerven et al., 2008), antígeno del núcleo de la hepatitis B (Bahadir et al., 2011), y antígeno de la superficie de la hepatitis B (Balcioglu et al., 2014) todas produjeron respuestas de anticuerpos cuando se exhibieron en la pIII, aunque ninguno de estos estudios comparó la inmunogenicidad de las Phage que muestra Schistosoma mansoni glutatión S-transferasa en pIII provocó una respuesta de anticuerpos que fue tanto más alta en el título como de diferentes isotipos en comparación con la inmunización con la proteína sola (Rao et al., 2003). Dos estudios de vacunas antiidiotípicas han utilizado el fago como portador de fragmentos de anticuerpos que contienen idiotipos inmunogénicos. Inmunización con fago que muestra el 1E10 idiotaype scFv (mimicking a Vibrio anguillarum surface epitope) provocó anticuerpos que protegían a los peces babosos de Vibrio anguillarum challenge (Xia et al., 2005). Una vacuna de idiotipo de tumor específico de phage-BCL1 vinculada químicamente fue débilmente inmunogénica en ratones pero extendió el tiempo de supervivencia en un modelo de linfoma de células B (Roehnisch et al., 2013), y fue bien tolerada e inmunogénica en pacientes con mieloma múltiple (Roehnisch et al., 2014). Un estudio de vacunación de ADN con antilaminarina scFv encontró que el ADN codificando una proteína de fusión pIII-scFv provocó respuestas inmunes humorales y mediadas por células más fuertes que el ADN codificando el scFv solo (Cuesta et al., 2006), sugiriendo que bajo algunas circunstancias, los epitopos de células T de fago endógeno pueden mejorar la inmunogenicidad de proteínas asociadas. Tomados en conjunto, los resultados de estos estudios muestran que como partícula similar a un virus de partículas, el fago filamentoso probablemente desencadena diferentes tipos de respuestas inmunitarias que los antígenos de proteínas recombinantes, y proporciona ayuda adicional de células T a las proteínas exhibidas o conjugadas. Sin embargo, el bajo número de copias de proteínas visualizadas pIII, así como la adyuvancia potencialmente no deseada asociada a los fagos, pueden hacer de la exhibición de proteínas recombinantes por fago una elección vacunal subóptima. Aunque nuestra comprensión de la respuesta inmune contra los palidezes fagosas filamentosas en comparación con antígenos modelo clásicos como la ovalbúmina, los últimos trabajos han comenzado a arrojar luz sobre los mecanismos inmunes activados en respuesta a la vacunación de los fagos (Figura 1). La partícula del fago es inmunogénica sin adyuvante en todas las especies probadas hasta la fecha, incluyendo ratones (Willis et al., 1993), ratas (Dente et al., 1994), conejos (de la Cruz et al., 1988), cobayas (Frenkel et al., 2000; Kim et al., 2004), peces (Coull et al., 1996; Xia et al., 2005), primates no humanos (Chen et al., 2001) y humanos (Roehnisch et al., 2014). Se han empleado varias vías de inmunización, incluyendo administración oral (Delmastro et al., 1997) así como subcutánea (Grabowska et al., 2000), intraperitoneal (van Houten et al., 2006), intramuscular (Samoylova et al., 2012a), intravenosa (Vaks y Benhar, 2011), e inyección intradérmica (Roehnisch et al., 2013); ningún estudio publicado ha comparado directamente el efecto de la vía de administración sobre la inmunogenicidad fagosa filamentosa. Los anticuerpos se generan contra sólo tres sitios principales en el virión: (i) los N-terminal expuestos a la superficie 12 de la retícula monomérica pVIII (Terry et al., 1997; Kneissel et al., 1999) ; (ii) los dominios N-terminal N1 y N2 de la pIII (van Houten et al., 2010); y (iii) lipopolisacárido bacteriano (LPS) incrustado en la capa de fago (Henry et al., 2011). En ratones, los títulos de anticuerpos séricos contra el fago suelen alcanzar 1:10 5 -1:10 6 después de 2-3 inmunizaciones, y se mantienen durante al menos 1 año postinmunización (Frenkel et al., 2000). Las respuestas primarias de anticuerpos contra el fago parecen estar compuestas por una mezcla de isotipos IgM e IgG2b en ratones C57BL/6, mientras que las respuestas secundarias de anticuerpos están compuestas principalmente de isotipos IgG1 e IgG2b, con una menor contribución de isotipos IgG2c e IgG3 (Hashiguchi et al., 2010). La supresión de los dominios N1 y N2 expuestos a la superficie de pIII produce una forma truncada de esta proteína que no provoca anticuerpos, sino que también produce una partícula de fago no infecciosa con menor inmunogenicidad general (van Houten et al., 2010). Como partícula similar a un virus, el fago filamentoso envuelve múltiples brazos del sistema inmune, comenzando con efectores celulares de inmunidad innata (macrofagos, neutrófilos y posiblemente células asesinas naturales), que son reclutados en sitios tumorales por fago que muestran moieties tumorales. El fago probablemente activa las respuestas de anticuerpos independientes de células T, ya sea a través de ligandos TLR asociados a los fagoes o enlaces cruzados por la celosía pVIII. Después del procesamiento por células que presentan antígenos, los péptidos derivados de los fagotes se presentan en la clase II de la MHC y en la clase I de la MHC, resultando en la activación de CTL de corta duración y una serie de tipos de células T ayudantes, que ayudan a la memoria primaria CTL y respuestas de células B de alta afinidad. Las fronteras en la microbiología www.fronterizosin.orgAunque los títulos de anticuerpos antifagos séricos parecen ser al menos parcialmente dependientes de células T (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993; De Berardinis et al., 1999; van Houten et al., 2010), muchas células B específicas de pVIII circulantes en la sangre carecen de mutación somática incluso después de repetidas inmunizaciones quincenales, lo que sugiere que bajo estas condiciones, el fago activa respuestas de células B independientes de células T además de respuestas dependientes de células T de alta afinidad (Murira, 2014). Las partículas filamentarias de fagos pueden ser procesadas por células presentadoras de antígenos y presentadas en moléculas de clase II de MHC (Gaubin et al., 2003; Ulivieri et al., 2008) y pueden activar T H 1, T H 2 y T H 17 células T ayudantes (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2014d). Las respuestas antifagos T H 2 se mejoraron mediante la visualización de péptidos CTLA-4 fusionados con pIII (Kajihara et al., 2000). Las proteínas de Phage también pueden presentarse de forma cruzada en moléculas de clase I de MHC (Wan et al., 2005) y pueden producir dos ondas de respuestas CTL, que consisten primero en CTL de corta duración y después de CTL de memoria de larga duración que requieren ayuda de células CD4 + T (Del Pozzo et al., Estos últimos CTLs median una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (Fang et al., 2005; Del Pozzo et al., 2010). La partícula de fago es autoadyuvante a través de múltiples mecanismos. El LPS derivado de la pared de la célula huésped realza la inmunogenicidad del virión, y su eliminación por cromatografía de polimixina B reduce los títulos de anticuerpos contra las proteínas de capa de fago (Grabowska et al., 2000). El genoma de ADN singlestranded del fago contiene motivos CpG y también puede tener un efecto adyuvante. La respuesta de anticuerpos contra el fago es totalmente dependiente de la señalización de MyD88 y se modula mediante la estimulación de varios receptores de tipo peaje (Hashiguchi et al., 2010), indicando que la inmunidad innata juega un papel importante pero en gran Los estudios de biodistribución del fago después de la inyección intravenosa muestran que se elimina de la sangre en cuestión de horas a través del sistema reticuloendotelial (Molenaar et al., 2002), particularmente del hígado y el bazo, donde se retiene durante días (Zou et al., 2004), potencialmente activando respuestas de células B de zona marginal. Por lo tanto, el fago filamentoso no sólo es un portador altamente inmunogénico, sino que, gracias a la activación de una gama de respuestas inmunes innatas y adaptativas, sirve como un excelente modelo de antígeno de partícula similar al virus. Mucho antes de la identificación del fago filamentoso, otros tipos de bacteriofago ya se estaban utilizando para la terapia antibacteriana en la antigua Unión Soviética y Europa Oriental (revisado en Sulakvelidze et al., 2001). El fago filamentoso, con su ciclo de vida no lítico, tiene usos clínicos menos obvios, a pesar de que la especificidad del huésped de Inovirus y Plectrovirus incluye muchos patógenos de importancia médica, incluyendo Salmonella, E. coli, Shigella, Pseudomonas, Clostridium y Micoplasma. En un esfuerzo por mejorar su actividad bactericida, los fagoces filamentosos genéticamente modificados se han utilizado como "caballo de Troya" para introducir diversos agentes antibacterianos en las células. Los fagos M13 y Pf3 fueron diseñados para expresar la restricción BglII endonucleasa (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004), lambda fage S holin (Hagens y Blasi, 2003) o una proteína activadora letal del gen catabolita (Moradpour et al., 2009) que mató eficazmente a las células E. coli y Pseudomonas aeruginosa, respectivamente, sin liberación concomitante de LPS (Hagens y Blasi, 2003; Hagens et al., 2004). Lamentablemente, la rápida aparición de bacterias resistentes con pili F modificado representa un obstáculo importante y posiblemente insuperable a este enfoque. Sin embargo, hay algunos indicios de que los fagos filamentosos pueden ejercer efectos útiles pero más sutiles sobre sus hospedadores bacterianos que pueden no resultar en el desarrollo de resistencia a la infección. Varios estudios han reportado aumento de la sensibilidad antibiótica en poblaciones bacterianas infectadas simultáneamente con fago filamentoso tipo salvaje (Hagens et al., 2006) o fago diseñado para reprimir la respuesta celular SOS (Lu y Collins, 2009). La infección filamentosa f1 inhibió la formación de biopelículas en E. coli, pero no madura (May et al., 2011). Así, los fago filamentosos no modificados pueden ser de interés futuro como elementos de terapia combinada contra ciertas infecciones resistentes a fármacos. Las aplicaciones terapéuticas más avanzadas del fago filamentoso emergen cuando se modifica para expresar una fracción dirigida específica para células patógenas y/o proteínas para el tratamiento de enfermedades infecciosas, cáncer y autoinmunidad (Figura 2). El primer trabajo en esta área mostró como prueba de concepto que los fagos codificando un cassette de expresión GFP y mostrando un HER2specific scFv en todas las copias de pIII fueron internalizados en células tumorales de mama, resultando en la expresión GFP (Poul y Marks, 1999). M13 o fd fagos mostrando un péptido objetivo o fragmento de anticuerpos y amarrados a cloranfenicol por un crosslinker lábil eran inhibidores más potentes del crecimiento de Staphylococcus aureus que el cloranfenicol libre de alta concentración (Yacoby et al., 2006; Vaks y Benhar, 2011). M13 fagos cargados con doxorubicina y mostrando un péptido objetivo en células de cáncer de próstata específicamente muertas en pIII in vitro (Ghosh et al., péptido tumoral específico: proteínas de fusión de pVIII seleccionadas de "paisaje" fage (Romanov et al., 2001; Abbineni et al., 2010; Fagbohun et al., 2012 Fagbohun et al., 2013 Lang et al., 2014; Wang et al., 2014a) fueron capaces de dirigir y entregar siRNA-, paclitaxel-, y liposomas que contienen doxorubicina a las células tumorales (Jayanna et al., 2010a; Wang et al., 2010a Wang et al.,, b, c, 2014b Bedi et al., 2011 Bedi et al.,, 2013 Bedi et al.,, 2014 ; eran tasas de remisión tumoral no tóxicas y aumentadas en modelos de ratón (Jayanna et al., 2010b; Wang et Usando el modelo de tumor B16-OVA, Eriksson et al. (2007) mostraron que los fagos que mostraban péptidos y/o Fabs específicos para antígenos tumorales retrasaron el crecimiento del tumor y mejoraron la supervivencia, debido en gran parte a la activación de macrófagos asociados al tumor y al reclutamiento de neutrófilos en el sitio del tumor (Eriksson et al., 2009). Phage mostrando un scFv frente a fibriles β-amiloide mostró promesa como diagnóstico (Frenkel y Solomon, 2002) y terapéutico (Solomon, 2008) reactivo para la enfermedad de Alzheimer y Parkinson debido a la capacidad imprevista del fago para penetrar en el tejido cerebral (Ksendzovsky et al., 2012). Del mismo modo, los fagos que muestran un epítopo péptido inmunodominante derivado de la mielina oligodendrocyte glucoproteína desmielinizantes patógenos agotados anticuerpos en el tejido cerebral en el modelo murina experimental de encefalomielitis autoinmune de esclerosis múltiple (Rakover et al., 2010). Las ventajas del fago filamentoso en este contexto sobre los conjugados tradicionales anticuerpo-fármaco o proteico-péptido son: i) su capacidad para transportar cantidades muy altas de fármaco o péptido, y ii) su capacidad para acceder a compartimentos anatómicos que generalmente no pueden ser alcanzados por la administración sistémica de una proteína. A diferencia de la mayoría de los biológicos terapéuticos, la producción del fago filamentoso en bacterias complica su uso en los seres humanos de varias maneras. En primer lugar, los preparados crudos de fago filamentoso suelen contener niveles muy altos de SLP contaminante, en el rango de 10 unidades de endotoxina 2-10 4 (EU)/ml (Boratynski et al., 2004; Branston et al., 2015), que tienen el potencial de causar reacciones adversas graves. LPS no se elimina completamente por precipitación de polietilenglicol o centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio (Smith y Gingrich, 2005; Branston et al., 2015), pero sus niveles se pueden reducir drásticamente utilizando pasos de purificación adicionales como cromatografía de exclusión de tamaño (Boratynski et al., 2004; Zakharova et al., 2005), cromatografía de polimixina B (Grabowska et al., 2000), y tratamiento con detergentes como Triton X-100 o Triton X-114 (Roehnisch et al., 2014; Branston et al., 2015). Estas estrategias alcanzan de forma rutinaria niveles de endotoxina < 1 EU/ml medidos por el lisato de limulo amebocito (LAL), muy por debajo del límite de la FDA para la administración parenteral de 5 EU/kg de peso corporal/dosis, aunque sigue habiendo preocupaciones con respecto a la presencia de LPS residuales asociadas al virión que pueden ser indetectables.Una segunda consecuencia, y tal vez inevitable, de la producción bacteriana del fago filamentoso es la heterogeneidad inherente del tamaño de las partículas y el espectro de contaminantes solubles y asociados al virión del huésped, que pueden ser causa de problemas de seguridad y restringir su uso a los grupos de alto riesgo. Se han propuesto muchos tipos de variantes de bacteriofago y fagos diseñados, incluido el fago filamentoso, para uso profiláctico ex vivo en seguridad alimentaria, ya sea en la tubería de producción (revisado en Dalmasso et al., 2014) o para la detección de patógenos transmitidos por alimentos postproducción (revisado en Schmelcher y Loessner, 2014). Fago filamentoso que muestra una etiqueta de tetracisteína en pIII se utilizaron para detectar células E. coli a través de tinción con tinte biarsenical. Biosensores basados en resonancia de plasmón superficial (Nanduri et al., 2007), transductores piezoeléctricos (Olsen et al., 2006), dicroísmo lineal (Pacheco-Gomez et al., 2012), y tecnología de sensores magnetoelásticos (Lakshmanan et al., 2007; Huang et al., 2009) fueron ideados utilizando fagos filamentosos que muestran scFv o conjugados a IgG enteros contra E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium y Bacillus anthracis con límites de detección en el orden de 10 2-10 6 células bacterianas/ml. Prueba de concepto ha sido demostrado para el uso de tales biosensores a base de fagos para detectar contaminación bacteriana de productos vivos (Li et al., 2010 La partícula fagosa filamentosa está encerrada por un capsid de proteína similar a la varilla, de 1000 nm de largo y 5 nm de ancho, formado casi enteramente por monómeros de pVIII superpuestos, cada uno de los cuales se encuentra en 27 angstroms de su vecino más cercano y expone dos grupos de aminas, así como al menos tres grupos de carboxilo (Henry et al., 2011). La regularidad de la celosía de pVIII de fagos y su diversidad de grupos químicamente direccionables la convierten en un andamio ideal para la bioconjugación (Figura 3). El enfoque más utilizado es la funcionalización de grupos de aminas con ésteres NHS (van Houten et al., 2006 (van Houten et al., 2010 Yacoby et al., 2006), aunque esto puede resultar en una a Los grupos de carboxilo y los residuos de tirosina también se pueden funcionalizar utilizando acoplamiento de carbodiimida y acoplamiento de diazonio, respectivamente (Li et al., 2010a). Carrico et al. (2012) desarrollaron métodos para etiquetar específicamente pVIII N-termina sin modificación de residuos de lisina expuestos a través de una reacción de formación de transaminación-oxima en dos pasos. La modificación específica de las proteínas de la capa de fago es aún más fácil de lograr usando péptidos modificados genéticamente (Ng et al., 2012) o enzimas (Chen et al., 2007; Hess et al., 2012), pero esto puede ser engorroso y es menos general en aplicación. Durante más de una década, el interés en el fago filamentoso como bloque de construcción de nanomateriales ha ido creciendo debido a sus propiedades fisicoquímicas únicas, con aplicaciones emergentes en magnet Desde hace mucho tiempo se sabe que por encima de un determinado umbral de concentración, el fago puede formar suspensiones cristalinas ordenadas (Welsh et al., 1996). Lee et al. (2002) diseñaron un fago M13 para mostrar un péptido de unión ZnS en pIII y demostraron que, en presencia de nanopartículas ZnS, se autoensamblan en biomateriales de película altamente ordenados que se pueden alinear utilizando campos magnéticos. Aprovechando la capacidad de mostrar péptidos específicos de sustratos en lugares conocidos en el filamento fagotico Hess et al., 2012), este pionero FIGURE 3 Grupos químicamente direccionables de la capa principal de bacteriofago filamentoso. El virión del fago filamentoso se compone de 2.500-4.000 copias superpuestas de la proteína 50-residue Cada monómero tiene una serie de grupos químicamente direccionables disponibles para la conjugación bioortogonal, incluyendo dos grupos de aminas primarias (mostradas en rojo), tres grupos de carboxilo (mostradas en azul) y dos grupos de hidroxilo (mostradas en verde). Los 12 residuos N-terminales generalmente expuestos al sistema inmune para la unión de anticuerpos están en negrita subrayado. Figura adaptada a partir de datos estructurales de Marvin, 1990, disponible libremente en bases de datos PDB y SCOPe. el trabajo se convirtió en la base para la construcción de nanomateriales bidimensionales y tridimensionales con arquitecturas más avanzadas, incluyendo nanohilos semiconductores (Mao et al., 2003 (Mao et al.,, 2004, nanopartículas, y nanocomposites (Oh et al., 2012; Chen et al., 2014). Utilizando los péptidos híbridos de unión de oro y Co 3 O 4 en pVIII como andamio para ensamblar nanohilos en multicapas de polielectrolitos, Nam et al. (2006) produjeron una batería de iones de litio delgada y flexible, que podía ser estampada en colectores de corriente de microbanda de platino (Nam et al., 2008). Las propiedades electroquímicas de estas baterías se mejoraron aún más a través de la visualización pIII de péptidos de unión de nanotubos de carbono de una sola pared (Lee et al., 2009), ofreciendo un enfoque para la producción sostenible de electrodos nanoestructurados a partir de materiales de partida mal conductivos. Los nanomateriales a base de fage han encontrado aplicaciones en la imagen del cáncer (Ghosh et al., 2012b; Yi et al., 2012), la división del agua fotocatalítica (Nam et al., 2010a; Neltner et al., 2010), la recolección de luz (Nam et al., 2010b; Chen et al., 2013), las tecnologías fotorespuestas (Murugesan et al., 2013), los electrodos neuronales (Kim et al., 2014), y la generación de energía piezoeléctrica (Murugesan et al., 2013). Así, las propiedades fisicoquímicas únicas del fago, en combinación con la visualización modular de péptidos y proteínas con especificidad de unión conocida, han desove materiales totalmente nuevos con diversas aplicaciones. Vale la pena señalar que las propiedades bio La alineación magnética de los fagos filamentosos de alta concentración en solución puede ordenar parcialmente el ADN, el ARN, las proteínas y otras biomoléculas para la medición de las interacciones de acoplamiento dipolar (Hansen et al., 1998 (Hansen et al., 2000 Dahlke Ojennus et al., 1999) en espectroscopia NMR. Debido a su gran tamaño de población, tiempos de generación cortos, tamaños de genoma pequeños y facilidad de manipulación, diversos bacteriófagos filamentosos y no filamentosos se han utilizado como modelos de evolución experimental (revisado en Husimi, 1989; Wichman y Brown, 2010; Kawecki et al., 2012; Hall et al., 2013). El fago filamentoso tiene usos prácticos adicionales en ingeniería proteica y evolución proteica dirigida, debido a su tolerancia única de modificaciones genéticas que permiten mostrar biomolécula En primer lugar, entre estas aplicaciones se encuentra la maduración in vitro de la afinidad de los fragmentos de anticuerpos mostrados en pIII. Las bibliotecas de variantes Fabs y anticuerpos de cadena única pueden generarse mediante mutagenesis aleatoria o sitedirected y seleccionarse sobre la base de una unión mejorada o alterada, imitando más o menos la estrategia de evolución somática del sistema inmunitario (Marks et al., 1992; Bradbury et al., 2011). Sin embargo, otros sistemas de visualización in vitro, como la visualización de levaduras, tienen importantes ventajas sobre el fago filamentoso para la maduración de afinidad (aunque cada tecnología de visualización tiene fortalezas complementarias; Koide y Koide, 2012) y, independientemente del método de visualización, la selección de variantes "mejoradas" puede ser lenta y engorrosa. Se han desarrollado métodos iterativos para combinar mutaciones de diseño computacional (Lippow et Recientemente, Esvelt et al. (2011) desarrollaron una nueva estrategia para la evolución dirigida de las proteínas fagosas filamentosas, denominadas evolución continua asistida por fagos (PACE), que permite múltiples rondas de evolución por día con poca intervención experimental.Los autores diseñaron el fago M13 para codificar una proteína exógena (sujeto a la evolución dirigida), cuya actividad funcional desencadena la expresión del gen III de un plasmido accesorio; variantes de la proteína exógena surgen por mutagenesis aleatoria durante la replicación de fagos, cuya tasa puede aumentarse mediante la expresión inducible de polimerasas de ADN propensas a errores. Al suministrar cantidades limitadas de células E. coli receptivas a las variantes de fagosas diseñadas, Esvelt et al. (2011) vincula elegantemente la infectividad y producción de fagos con la presencia de un fenotipo proteico deseado. Carlson et al. (2014) más tarde mostró que la severidad de selección PACE podría ser modulada proporcionando pequeñas cantidades de pIII independientemente del fenotipo proteico, y funciones proteicas indeseables seleccionadas negativamente al vincularlas a la expresión de una variante pIII truncada que altera la infectividad en una forma negativa dominante. PACE se limita actualmente a funciones proteicas que pueden estar vinculadas de alguna manera a la expresión de un reportero del gen III, tales como interacción proteína-proteína, recombinación, unión ADN o ARN, y catálisis enzimática (Meyer y Ellington, 2011). Este enfoque representa una vía prometedora para la investigación básica en evolución molecular (Dickinson et al., 2013) y biología sintética, incluyendo ingeniería de anticuerpos. El bacteriofago filamentario se ha recuperado de diversas fuentes ambientales, incluyendo el suelo (Murugaiyan et al., 2011), el agua dulce costera (Xue et al., 2012), los lagos alpinos (Hofer y Sommaruga, 2001) y las bacterias del mar profundo (Jian et al., 2012), pero tal vez no sorprendentemente el intestino humano (Kim et al., 2011). El "fageoma" ambiental en el suelo y el agua representan la mayor fuente de replicación de ADN en el planeta, y se estima que contiene más de 10 30 partículas virales (Ashelford et al., 2003; Chibani-Chennoufi et al., 2004; Suttle, 2005). Los pocos estudios que intentan investigar la ecología ambiental de los fagos filamentosos utilizando técnicas clásicas de microbiología ambiental (normalmente observación directa por microscopía electrónica) encontraron que los fagos filamentosos constituían entre el 0 y el 100% de todas las partículas virales (Demuth et al., 1993; Pina et al., 1998; Hofer y Sommaruga, 2001). Hubo alguna evidencia de fluctuación estacional de poblaciones de fagos filamentosos junto con la abundancia relativa de bacterias heterotróficas libres (Hofer y Sommaruga, 2001). Los datos existentes sugieren que los fagos filamentosos son constituyentes menores de comunidades virales en agua dulce (Roux et al., 2012) y agua recuperada y potable (Rosario et al., 2009), pero tienen frecuencias mucho más altas en aguas residuales y aguas residuales (Cantalupo et al., 2011; Alhamlan et al., 2013), con la salvedad de que los sesgos inherentes a las metodologías para determinar estos datos (purificación de partículas virales, sesgos de secuenciación) no han sido bien validados. No hay datos que describan la dinámica poblacional de los fagos filamentosos y sus especies hospedantes en el entorno natural. A nivel individual de virus-bacterio, está claro que los fagos filamentosos pueden modular el fenotipo huésped, incluyendo la virulencia de importantes patógenos humanos y de cultivos. Esto puede ocurrir ya sea a través de efectos directos de replicación de fagos en el crecimiento celular y la fisiología, o, más típicamente, por transferencia horizontal de material genético contenido en episomas y/o profagos cromosómicamente integrados. Fago filamentoso templado también puede jugar un papel en la evolución del genoma (revisado en Canchaya et al., 2003). Tal vez el ejemplo mejor estudiado de modulación de virulencia por fago filamentoso es el de Vibrio cholerae, cuya virulencia completa requiere conversión lisogénica por la toxina del cólera codificante CTX La integración de los fagos CTXo se produce en sitios específicos del genoma; estas secuencias se introducen a través de la acción combinada de otro fagos filamentoso, fs2o, y un fagoso filamentoso satelital, TLC-KnŁo1 (Hassan et al., 2010). Así, las especies de fagos filamentosos interactúan y coevolucionan entre sí, además de sus anfitriones. La infección por fagos filamentosos se ha implicado en la virulencia de Yersinia pestis (Derbise et al., 2007), Neisseria meningitidis (Bille et al., 2005 (Bille et al., 2008, Vibrio parahemolyticus (Iida et al., 2001), E. coli 018:K1:H7 (Gonzalez et al., 2002), Xanthomonas campestris (Kamiunten and Wakimoto, 1982), y P. aeruginosa (Webb et al., 2004), aunque en la mayoría de estos casos, los mecanismos específicos que modulan la virulencia no son claros. La infección por fage puede potenciar o reprimir la virulencia dependiendo de las características del fago, la bacteria huésped y el medio ambiente, como es el caso del patógeno de la marchitez bacteriana Ralstonia solanacearum (Yamada, 2013). Dado que la infección resulta en la regulación de los pili utilizados para la entrada viral, el tratamiento del fago filamentoso se ha propuesto como un medio hipotético para inhibir la conjugación bacteriana y la transferencia génica horizontal, a fin de evitar la propagación de genes de resistencia a antibióticos (Lin et al., 2011). Finalmente, el fago filamentoso también puede desempeñar un papel futuro en la preservación de la biodiversidad de otros organismos en ecosistemas de riesgo. Se ha propuesto el uso del fago artificial en la biorremediación, ya sea mostrando fragmentos de anticuerpos de la especificidad deseada para la filtración de toxinas y contaminantes ambientales (Petrenko y Makowski, 1993), o como polímeros biodegradables que muestran péptidos seleccionados por su capacidad para agregar contaminantes, tales como residuos de arenas oleaginosas (Curtis et al., 2011 (Curtis et al., 2013 ). También se ha propuesto el uso de péptidos diseñados que se unen específicamente a materiales inorgánicos en tecnologías de separación mineral más avanzadas y menos intrusivas (Curtis et al., 2009 ). El fago filamentoso representa un organismo altamente versátil cuyos usos van mucho más allá de la exhibición tradicional de fago y la selección de afinidad de anticuerpos y polipéptidos de especificidad deseada. Su alta inmunogenicidad y su capacidad para mostrar una variedad de antígenos superficiales hacen que el fago sea un excelente portador de la vacuna antipartículas, aunque su producción y preparación bacterianas probablemente limiten sus aplicaciones en vacunas humanas en la actualidad, a pesar de ser aparentemente seguros y bien tolerados en animales y personas. Las características imprevistas de la partícula antifago, como el cruce de la barrera hematoencefálica y la formación de fases cristalinas líquidas altamente ordenadas, han abierto nuevas vías de investigación en terapias para enfermedades crónicas y el diseño de nanomateriales. Nuestra comprensión comparativamente detallada de las interacciones del fagotismo filamentoso modelo con sus huéspedes bacterianos ha permitido a los investigadores aprovechar el ciclo de vida del fago para dirigir la evolución proteica en el laboratorio. Esperamos que un conocimiento más profundo de las interacciones entre los hospederos de fago a nivel ecológico pueda producir estrategias novedosas para controlar la pato Mientras se siguen desarrollando nuevas aplicaciones del fago filamentoso, es probable que el fago conserve su posición como caballo de batalla para el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos durante muchos años, incluso con el advenimiento de tecnologías competidoras. KH y JS concibieron y escribieron el manuscrito. MA-G leyó el manuscrito y comentó sobre el texto.

¿Qué muestran los estudios de biodistribución del fago después de la inyección intravenosa?

La secuenciación de nanoporos como herramienta de diagnóstico revolucionaria para complejos de enfermedades entéricas virales porcinas identifica el kobuvirus porcino como un virus entérico importantehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6026206/SHA: eff8bed68ef6109e8f0c51a8b1ec4b6ca5b6329eAutores: Theuns, Sebastiana; Vanmechelen, Bert; Bernaert, Quinten; Deboutte, Ward; Vandenhole, Marilou; Beller, Leen; Matthijnssens, Jelle; Maes, Piet; Nauwynck, Hans J. Fecha: 2018-06-29DOI: 10.1038/s41598-018-28180-9Licencia: cc-byAbstract: Las enfermedades entéricas en los cerdos a menudo son causadas por diferentes patógenos y por lo tanto la metagenómica son una herramienta útil para el diagnóstico. Las capacidades de secuenciación de nanoporos para diagnósticos virales fueron investigadas aquí. Primero, el virus de la diarrea epidémica porcina de cultivo celular y el rotavirus A fueron agrupados y secuenciados en un Minion. Las lecturas ya fueron detectadas a los 7 segundos del inicio de la secuenciación, resultando en profundidades de alta secuenciación (19.2 a 103.5X) después de 3 h. A continuación, se analizaron las heces diarreicas de un cerdito de una semana de edad. Casi todas las lecturas (99%) pertenecían a bacteriófagos, que pueden haber modificado el microbioma del cer Por otra parte, el kobuvirus porcino se descubrió en las heces por primera vez en Bélgica. Los lechones chupadores eliminan el kobuvirus a partir de una semana de edad, pero durante un estudio de seguimiento no se observaron signos diarreicos y una asociación entre el pico de eliminación viral (10(6.42)–10(7.01) copias/swab) y signos diarreicos. El análisis retrospectivo mostró la difusión (n = 25.56.8% positivo) de kobuvirus genéticamente moderadamente relacionados entre los lechones diarreicos belgas. Minion permite la detección rápida de virus entéricos. Estas nuevas metodologías cambiarán los diagnósticos, pero se deben realizar validaciones más extensas. Debe cuestionarse la verdadera patogenicidad entérica del kobuvirus porcino, mientras que su importancia subclínica no puede excluirse. Texto: la metagenómica es un activo valioso para el diagnóstico en cerdos, lo que lleva al descubrimiento de nuevos virus e identificación de complejos de enfermedades entéricas virales porcinas. Aunque se han desarrollado procedimientos estandarizados para estudiar los metagenomas virales en muestras fecales, todavía requieren una extensa preparación de muestras, incluyendo preamplificación aleatoria o dirigida de genomas virales presentes en la muestra 13. La mayoría de las plataformas de secuenciación todavía requieren inversiones de capital y altas tasas de rotación de muestras para ser rentables. Realizar los análisis necesarios a menudo resulta en largos períodos de tiempo entre la llegada de la muestra y la notificación diagnóstica, ya que los resultados sólo pueden procesarse después de terminar la secuenciación. La secuenciación de tercera generación utilizando Minion (Oxford Nanopore Technologies, ONT) podría ser una herramienta de diagnóstico útil y asequible para la medicina veterinaria porcina, ya que Las células de flujo utilizadas para la secuenciación consisten en una membrana que contiene múltiples proteínas CsgG nanoporas de Escherichia coli 14. Se establece una corriente de iones a través de este poro que resulta en cambios típicos de la corriente tras el paso de nucleótidos específicos. Esta señal se convierte en una secuencia de nucleótidos mediante algoritmos computacionales (basecalling). Desde la liberación de la tecnología Minion, se han hecho grandes avances en cuanto al número y la calidad de las lecturas generadas 15. En el campo de la virología, la tecnología se ha aplicado principalmente en la medicina humana. Utilizando la secuenciación nanopora, fue posible distinguir tres poxvirus con similitud de nucleótidos del 98% a nivel de cepa 16. Minion también se ha utilizado como herramienta diagnóstica durante los recientes brotes de Ébolavirus Junto a un flujo de trabajo de bioinformática basado en ordenador portátil, Minion pudo detectar el virus de Chikungunya, el virus del Ébola y el virus de la hepatitis C en menos de 6 horas utilizando versiones anteriores de la tecnología 19. Un método multiplex PCR para la secuenciación completa del genoma del Zikavirus in situ en muestras con bajas cargas virales ha sido desarrollado recientemente por Quick y compañeros de trabajo 20. Los genomas parciales del virus del dengue fueron amplificados isotérmicamente seguidos de secuenciación, permitiendo la clasificación de cepas en serotipos 21. En la virología veterinaria, el uso de secuenciación del nanoporo está creciendo. Se identificó una nueva especie de papilomavirus en verrugas de jirafas, utilizando amplificación del círculo rodante y secuenciación del nanoporo 22. El genoma completo de un parapoxvirus aislado Un estudio ha reportado la detección del virus de la encefalitis equina venezolana a partir de ARNc no amplificado creado a partir de ARNc poli-A mediante virus cultivados en cultivos celulares 24. Según el conocimiento del autor, el presente estudio es el primero que utiliza Minion como ayuda en el manejo de la salud porcina, con el objetivo de explorar las posibilidades de Minion como herramienta de diagnóstico rápida y fácil de usar en el manejo de la salud porcina para el diagnóstico de complejos de enfermedades entéricas virales. Se evaluó la capacidad de detectar altas cargas de rotavirus y coronavirus cultivados en cultivos celulares, imitando cantidades de derrame observadas en lechones diarreicos. En un segundo caso, se investigó la capacidad de detectar virus (novela) en heces diarreicas de un cerdito de una semana de edad con diarrea. No se realizó preamplificación génica o aleatoria de ácidos nucleicos En este último caso se descubrió un kobuvirus porcino y en adelante se realizó un estudio longitudinal de campo para dilucidar los patrones de eliminación de este virus. Además, se investigaron muestras fecales de archivos (2014) de lechones lacrimógenos diarreicos de menos de dos semanas de edad para la presencia de kobuvirus, para estudiar su epidemiología en Bélgica. se realizaron 243.313 lecturas con una longitud media de 740 nucleótidos. Se filtraron lecturas con una puntuación q inferior a 7, resultando en 177.015 secuencias restantes (longitud media 816 nt) para su uso en análisis aguas abajo. Resultados de la secuenciación, incluyendo clasificación taxonómica y mapeo de lecturas contra genomas de referencia PEDV y rotavirus A (RVA) se muestran en la Fig. 1A. Después de 24 horas de secuenciación, un total de 15.232 lecturas fueron clasificadas como virales por comparación tBLASTx sensible frente a una base de datos viral completa. De éstas, el 39,3% (n = 5.985) y el 10,3% (n = 1.564) fueron asignadas a familias virales que incluían el virus de la diarrea epidémica porcina (familia Coronaviridae) y Rotavirus (familia Reoviridae, subfamilia Sedoreovirinae), respectivamente. Una fracción de las lecturas (29,3%, n = 4.468) fueron asignadas al orden Caudovirales. Estas lecturas se originaron en el ADN del fago lambda utilizado en un control previo en la misma célula de flujo. A los 7,5 y 24,2 segundos después del inicio de la secuenciación, respectivamente, las primeras lecturas coinciden con PEDV y RVA fueron translocadas a través de un 1B). Las secuencias PEDV y RVA fueron extraídas del conjunto de datos y cartografiadas con genes de referencia viral para calcular las profundidades de secuenciación en el tiempo (Fig. 1C). Después de una hora, las profundidades de secuenciación fueron mayores para PEDV (43.0X) que para RVA (4.9 a 22.1X). Se adquirieron profundidades de alta secuenciación después de tres horas de secuenciación para PEDV (103.5X) y para la mayoría de segmentos de genes RVA (19.2 a 48.2X). El ensamblaje de novo se ejecutó en las lecturas filtradas de calidad antes de la identificación (tBLASTx) para recuperar genomas virales, lo que resultó en la recuperación de los segmentos de genoma y gen PEDV casi completos con identidades que variaban entre 95 y 99% en comparación con los genes de referencia (Tabla 1). Sin embargo, la ejecución de ensamblaje de novo antes de la clasificación taxonómica (tBLASTx) redujo el tiempo para identificar genomas virales enteros en el conjunto de datos. La composición del viroma de un cerdito diarreico joven utilizando secuenciación nanopora. Se generaron un total de 30.088 lecturas mediante secuenciación de la muestra fecal diarreica durante tres horas. De éstas, 25.466 lecturas (q-score > 7, longitud media de lectura 653 nt) se utilizaron para análisis adicionales. Se utilizaron diferentes métodos para comparar las lecturas con una base de datos virales utilizando el grupo HPC de la Universidad de Gante y los resultados se muestran en la Fig. 2. La comparación con una base de datos viral completa resultó en la detección de 6.781 a 8.677 lecturas virales potenciales, dependiendo de la configuración BLAST. BLASTn resultó en una rápida Sin embargo, hubo una diferencia muy alta entre los tiempos de pared en el grupo HPC, con sólo 26 segundos de tiempo de análisis para BLASTn, frente a casi 24 horas para tBLASTx. La mayoría de las secuencias fueron asignadas a bacteriófagos dentro del orden Caudovirales y familias Siphoviridae (n = 3.213 a 4.163 lecturas), Podoviridae (n = 2.506 a 3.002 lecturas) y Myoviridae (n = 912 a 1.202 lecturas). Un conjunto de novo fue ejecutado en la base llamada, lecturas filtradas de calidad y los contigs resultantes fueron utilizados como material de entrada para el análisis VirSorter. Diecinueve contigs fueron clasificados como seguros (n = 4; categoría 1), algo seguro (=14; categoría 2) y no tan seguro (=1; categoría 3) ser contigs tipo fago (Fig La comparación de estos contigs con la base de datos de GenBank mediante BLAST permitió su clasificación en cuatro grupos diferentes. Diez contigs mostraron similitudes entre moderados y altos nucleótidos con el fago B124-14 de Bacteroides, sugiriendo que todos pertenecían a un genoma de fagotes. Esto también fue apoyado por el hecho de que todos estos contigs mapeados muy bien distribuidos a través del genoma de referencia de Bacteroides fago B124-14 (datos no mostrados). El contig más largo con un tamaño de 39,069 nucleótidos, junto con otros cuatro contigs mostraron similitudes (95% nt identidad) a diferentes fagotes de Escherichia. Dos contigs mostraron poca similitud tanto con el Enterococcus fage vB_EfaS_IME_196, aislado de las aguas residuales hospitalarias en China de una cepa de Enterococcus faecalis, como con el genoma bacteriano Enterococcus hirae. Este último podría ser un profago insertado en el genoma bacteriano. Curiosamente, se identificaron tres contigs para los cuales no se encontraron similitudes con virus existentes en GenBank, pero contig 0105 cartografiado al genoma de referencia del Enterococcus fage vB_EfaS_IME196 (datos no mostrados). Estos podrían ser fagos novedosos o variantes divergentes de los fagos existentes presentes en GenBank. Tres virus porcinos eucariotas, kobuvirus porcino (n = 18 a 22 lecturas), enterovirus G Los géneros Kobuvirus y Enterovirus pertenecen a la familia Picornaviridae, mientras que el género Mamastrovirus pertenece a la familia Astroviridae. Kobuvirus lee que fueron cartografiados contra una cepa europea de referencia S-1/HUN/2007/Hungría, como se muestra en la Fig. 2C. Sin embargo, no se obtuvo cobertura completa del genoma a alta profundidad de secuenciación. Cosechado de kobuvirus porcino y rotavirus en lechones lactantes. La eliminación de kobuvirus porcino, RVA y rotavirus C (RVC) se investigó cuantitativamente en 5 cerdos lactantes de la misma granja de la que se originaron las heces diarreicas. Los patrones de derrame fecal de los diferentes virus y la presencia de signos diarreicos se muestran en la Fig. 3A. Todos los lechones comenzaron a derramar kobuvirus porcino al final de En dos lechones (A y D) el desprendimiento se mantuvo y duró por lo menos 2 semanas (por encima del límite de cuantificación). Los títulos de desprendimiento máximo del kobuvirus porcino variaron entre 6,42 y 7,01 log 10 copias/swab, que es generalmente menor que el desprendimiento máximo observado para virus entéricos típicos como el rotavirus y el PEDV. Además, el pico de desprendimiento no se relacionó con episodios diarreicos, cuestionando el papel de este virus en la patogénesis de la diarrea en la granja. Los signos diarreicos sólo se observaron en dos lechones (A y B). En el lecho B, se observó una asociación entre el desprendimiento alto de VCR y episodios diarreicos. En contraste, no hubo asociación directa entre el desprendimiento máximo de kobuvirus y episodios Curiosamente, se observó un pico en el derrame de kobuvirus en el lechoncito C en el día 11 post-estrechamiento. Este animal murió en breve, pero no estaba claro si esto puede ser atribuible a la infección por kobuvirus. El derrame agudo de RVA se observó al final del período de lactancia en tres de cinco lechones, aunque todas las cerdas fueron vacunadas antes del parto utilizando una vacuna contra el rotavirus inactivada bovina. Análisis retrospectivo de los kobuvirus porcinos que se derramaron en cerdos lactantes diarreicos belgas y análisis filogenético. Un total de 44 muestras fecales diarreicas recogidas en 2014 fueron examinadas para detectar la presencia de kobuvirus utilizando el nuevo RT-qPCR. De estas, 25 muestras (56,8%) probaron positivas y 18 muestras mostraron cargas virales cuantificables (4,31 a 6,83 log 10 copias Siete muestras fueron positivas, pero las cargas virales fueron demasiado bajas para permitir una cuantificación precisa. La presencia de RVA y RVC había sido evaluada cuantitativamente en estas muestras en un estudio previo y la ocurrencia de coinfecciones entre rotavirus y kobuvirus se muestra en la Fig. 3B 25. Kobuvirus se encontró en proporciones iguales en muestras rotavirus negativos y positivos. Doce muestras contenían una única infección por rotavirus con una alta carga de RVA y en cuatro de ellas se observó una alta carga de kobuvirus (5.16 a 5.42 log 10 copias/g). Se encontró una única infección por RVC en siete muestras y en cuatro de ellas se demostró positiva para kobuvirus a altas cargas (4.31 a 5.59 log 10 copias/g). Se observó una infección por RVC/RVC doble en dos muestras, pero no contenía cargas cuantificables por kobuvirus. Muchas (n = 10) de las muestras negativas de rotavirus contenían altas cargas de kobuvirus. La cepa 17V079 mostró una gran similitud con otros aislados belgas de kobuvirus porcino desde 2014 (92,1 a 94,0% de identidad de secuencia de nucleótidos) y con la cepa de referencia húngara S-1/Hun/2017 (93,4%). Además, hubo un alto nivel de variabilidad genética entre los aislados belgas de kobuvirus porcino de 2014, con identidades de secuencia de nucleótidos que oscilaban entre 90,1 y 97,2%. Un análisis filogenético, utilizando el gen 3D de 17V079 y doce aislados belgas de 2014 (fig. 3C), muestra las cepas belgas que se agrupan entre cepas de diferentes lugares geográficos. La prevención y el tratamiento de problemas de enfermedades entéricas en lechones jóvenes se ve frecuentemente obstaculizado Los veterinarios están restringidos a una lista corta de virus conocidos, bacterias, parásitos y factores de manejo para definir un diagnóstico diferencial. Sólo las causas más probables de la enfermedad serán investigadas diagnósticamente, lo que a menudo conduce a resultados negativos, no concluyentes o incompletos. Sin embargo, los estudios de metagenomía han indicado la existencia de complejos de enfermedades entéricas virales, potencialmente involucrando múltiples virus conocidos y novedosos 3, 4, 6, 7, 9, 10. La detección de ácidos nucleicos a partir de patógenos utilizando enfoques metagenómicos basados en NGS es una solución parcial a problemas de pruebas diagnósticas y puede proporcionar una lectura completa de virus y otros patógenos presentes en una muestra. Sin embargo, la mayoría de las plataformas NGS requieren grandes inversiones y el procesamiento de las lecturas sólo puede comenzar al final de la secuenciación. La metagenómica viral también requiere extensas preparaciones de laboratorio, incluyendo centrifugación, filtración y tratamiento de nucleasas para descartar los ácidos nucleicos bacterianos y hospedantes que constituyen la mayor parte de los ácidos nucleicos presentes 13. Además, la cantidad de ácidos nucleicos virales en una muestra es muy baja, requiriendo amplificación específica o aleatoria de estos genomas antes del análisis de NGS. La amplificación puede inducir sesgo y dificulta el desarrollo de tuberías de diagnóstico rápido debido a una pérdida de tiempo considerable. Todos estos factores conducen a un largo tiempo de rotación entre la recolección de muestras y la notificación diagnóstica. El dispositivo de secuenciación de tercera generación Minion (ONT), mantiene la promesa como plataforma diagnóstica, ya que permite secuenciar y análisis en tiempo real de todo el ADN/RN en una muestra, teóricamente sin necesidad de preampl Fue el objetivo del presente estudio evaluar esta tecnología para su uso como herramienta rápida para la identificación del complejo de la enfermedad entérica viral porcina, sin la conducción de amplificación del ácido nucleico viral. En un primer experimento, el cultivo celular de PEDV y RVA, conocidos por inducir diarrea en cerdos jóvenes, fueron agrupados a altas cargas imitando cantidades de derrame en lechones diarreicos. La secuenciación de esta muestra agrupada con el Minion resultó en una rápida identificación de ambos virus. El análisis en tiempo real de las lecturas de secuencia no fue realizado, pero es alcanzable como lo demostraron previamente Greninger y colegas utilizando la tubería de análisis SURPI para la rápida identificación de virus humanos de diferentes matrices clínicas 19. Interesantemente, la primera lectura coincide con PEDV y RVA fueron generadas respectivamente después de 7 y 24 segundos de secuenciación. Se adquirieron profundidades de alta secuenciación (43,0X) dentro de una hora de secuenciación para el PEDV y dentro de tres horas para la mayoría de los once segmentos genéticos del RVA (19,2-48,2X). En general, se generaron profundidades de secuenciación más altas para el PEDV que podrían indicar que la secuenciación de genomas virales más largos está favorecida sobre segmentos genéticos más pequeños, ya que el PEDV tiene un tamaño del genoma de aproximadamente 28 kb, y los segmentos genéticos del RVA son más cortos (0,6 a 3,3 kb). Este sesgo podría haberse introducido durante la ligadura de los adaptadores de secuenciación a los ácidos nucleicos virales. Se puede suponer que los adaptadores están más fácilmente unidos a fragmentos de ADN más largos, y se debe evitar el sesgo mediante la estandarización de la longitud de entrada de ácido nucleico viral. Mientras que la tecnología puede ser útil para dar lecturas rápidas de virus (<3 horas) presentes en una muestra, validación completa, utilizando existencias de virus bien definidas, experimentos de spiking en matrices (por ejemplo, heces) y muestras clínicas reales es necesario para asegurarse de que todos los miembros del complejo de la enfermedad entérica viral porcina están siendo diagnosticados con precisión. Además, la precisión de la tecnología necesita mayor mejora, ya que las tasas de error de los contigs de los conjuntos de novo todavía oscilaban entre 1 y 5%, obstaculizando el análisis preciso de mutaciones sutiles pero importantes en el genoma viral. Después de la identificación exitosa de los virus cultivados por células, el rendimiento de la Minion fue explorado más a fondo mediante el análisis de una muestra fecal diarreica de un lecho de leche de una semana de edad. Se realizaron análisis de PCR en tiempo real para RVA, RVC, PEDV Enterococcus hirae se aisló en un laboratorio de diagnóstico privado, pero esta especie bacteriana no se considera una causa típica de enfermedad diarreica en cerdos 26. La metagenómica viral se realizó en esta muestra utilizando el Minion y se utilizaron dos algoritmos de búsqueda BLAST diferentes para identificar taxonómicamente las lecturas comparándolas con una base de datos viral completa. En general, tBLASTx con un valor e de 10 −3 fue capaz de identificar las lecturas más virales en comparación con otras opciones de búsqueda realizadas. Sin embargo, las opciones de búsqueda de BLASTn también alcanzaron una alta sensibilidad, pero con un costo de tiempo mucho menor: 26 segundos en lugar de casi 24 horas. Para el análisis de lectura rápida y la búsqueda de secuencias virales no divergentes estrechamente relacionadas, BLASTn u otra metodología rápida debería utilizarse de manera preferente. Sin embargo, tBLASTx En la muestra 17V079 se identificaron tres virus porcinos, incluyendo el kobuvirus porcino, el mamastrovirus porcino y el enterovirus G. En un estudio reciente realizado en Tailandia, la diferencia en la prevalencia del astrovirus en las heces diarreicas y no diarreicas de cerdos belgas y en las heces de cerdos de todo el mundo 9,10,27. En un estudio reciente realizado en Tailandia, la diferencia en la prevalencia del astrovirus en las heces diarreicas (8,4%) frente a las no diarreicas (4,6%), los lechones de menos de 4 semanas de edad no fueron estadísticamente significativos. Asimismo, otros estudios han demostrado que el papel del astrovirus porcino en la patogénesis de la diarrea porcina no es completamente claro 28. En contraste, se han establecido asociaciones entre la diarrea y las infecciones por astrovirus humanos 29. Un estudio reciente realizado en 5 países europeos (Hungría, España, Alemania, Austria y Suecia) ha indicado la propagación de los astrovirus porcinos en la población porcina. Se ha encontrado una prevalencia de astrovirus cien veces mayor en cerdos diarreicos y no diarreicos de Austria y España. Los astrovirus porcinos también se han relacionado recientemente con brotes de trastornos neurológicos en lechones destetados de Hungría, y en cerdos y cerdas de 5 semanas de edad en los Estados Unidos 30, 31. El intestino podría ser un puerto hipotético de entrada para tales infecciones neurológicas por astrovirus. Los enterovirus se han relacionado más generalmente con trastornos neurológicos en cerdos, aunque se encuentran comúnmente en heces también 11, 12, [33]. En un estudio de Vietnam, no se encontró ninguna correlación significativa entre el estado de diarrea y la presencia de enterovirus G en heces 35. La participación de los astrovirus y enterovirus en la patogénesis de los trastornos entéricos puede ser cuestionada aquí, pero no se puede descartar completamente. Además, aunque se utilizaron aquí búsquedas sensibles tBLASTx, todavía existe la posibilidad de que un virus completamente nuevo esté presente en la materia oscura de la secuencia lee. Sin embargo, el reporte de un kobuvirus porcino en lechones belgas con Minion es único. En Bélgica, los kobuvirus sólo se habían encontrado anteriormente en muestras diarreicas de terneros y ganado joven en Bélgica 36. En el presente estudio, un nuevo ensayo RT-qPCR, dirigido al gen 3D conservado que codifica la ARN-ARN-polimerasa, fue desarrollado y utilizado para evaluar, por primera vez, la cinética cuantitativa longitudinal de derrame de kobuvirus porcino en cerdos en condiciones de campo. También se analizaron cinéticas similares para el rotavirus porcino A y C. Mientras los lechones lactantes comenzaron a despojarse del kobuvirus porcino a partir de una semana de edad, asociación entre el pico de despojamiento viral (6,42 a 7,01 log 10 copias/swab) y signos diarreicos. En un cerdo, se realizó una asociación entre episodios diarreicos y el pico de despojamiento del rotavirus C, un patógeno entérico bien conocido 37, 38. Muy interesantemente, las cargas fecales del kobuvirus fueron típicamente inferiores a las reportadas de virus entéricos bien descritos de los cuales la patogenicidad ha sido probada utilizando modelos de infección por cerdas, como PEDV y rotavirus [39] [40] [41]. También se encontraron cargas virales similares para el kobuvirus porcino (4,60 ± 1,76 copias/reacción de qPCR) y para el control de cerdos (4,79 ± 1,72 copias/reacción de qPCR) durante un reciente estudio danés para evaluar el papel de los virus en la patogénesis del nuevo síndrome de diarrea porcina neonatal. El estudio demostró que el kobuvirus, el astrovirus, el rotavirus A, el teschovirus porcino, el norovirus porcino y los coronavirus porcinos no estaban involucrados en la patogénesis del síndrome 42. El hallazgo de bajas cargas de kobuvirus en las heces arroja dudas sobre el verdadero tropismo patógeno entérico del virus. Hipotéticamente, es probable que su replicación no se distribuya a través de toda la vellosidad, sino que se limita a enterocitos en las extremidades de la vellosis La presencia de ARN del kobuvirus en el suero también se ha demostrado en cerdos húngaros, pero no se sabía si el virus también se está replicando en otros órganos 43. Tanto la vía orofecal como la alimentación de leche para lactantes cerdos podrían estar involucrados en la transmisión del virus. Las tasas más altas de infección se observaron en lechones lactantes, en comparación con cerdos mayores, en otros países [44] [45] [46]. En nuestro estudio, se observó un derrame relativamente largo de kobuvirus porcino en tres de cada cinco animales, lo que puede indicar que este virus puede inducir infecciones persistentes. Un estudio brasileño de 2011 demostró la presencia de ARN del kobuvirus en el suero de lechones de 3 días, que habían desaparecido para el día 21, indicando el aclaramiento viral de la sangre y excluyendo la persistencia sistémica 45. No se puede excluir una falta total de patogenicidad, ya que los kobuvirus porcinos pueden jugar un papel como virus subclínicamente importante. Estas propiedades subclínicas, aunque inmunosupresoras, se han atribuido al circovirus porcino porcino de importancia económica 47. De interés, uno de los lechones murió en el pico del derrame de kobuvirus, aunque no estaba claro si había causalidad entre la replicación del virus y la muerte del cerdito. Los experimentos in vivo con animales en un modelo de lechones neonatales, convencionales kobuvirus negativos se deben llevar a cabo para elucidar la patogénesis de los kobuvirus porcinos. Se intentó aislar el virus en diferentes líneas celulares (MA104, ST y SK), y células mononucleares de la sangre periférica. No hubo evidencia de efecto citopatógeno después de varios días de incubación. No se disponía de anticuerpos para visualizar la expresión de antígenos y, por lo tanto, no se puede descartar la posibilidad de replicación sin los informes científicos (2018) 8:9830 DOI:10.1038/s41598-018-28180-9 efecto citopatógeno evidente. Se intentará aislar el virus en cultivos enterocíticos primarios porcinos, una vez disponible. Para evaluar más ampliamente la prevalencia del kobuvirus en la industria porcina belga, se realizó un análisis retrospectivo de muestras diarreicas de lechones lactantes de menos de dos semanas de edad. Una proporción elevada (40,9%) de las muestras (n = 44) contenía cargas virales cuantificables que oscilaban entre 4,31 y 6,83 log 10 copias/g de heces. Las cargas virales encontradas fueron comparables a las cargas excretadas por lechones en el análisis longitudinal y el estudio mencionado de Dinamarca, demostrando la presencia endémica del virus en En el presente estudio, no se incluyeron lechones no diarreicos y, por lo tanto, no se puede establecer ninguna asociación entre la prevalencia del kobuvirus y la enfermedad. Sin embargo, la prevalencia del kobuvirus ha sido ampliamente descrita en cerdos de varios países europeos (Países Bajos (16,7%), Eslovaquia (63,4%), Hungría (81,0%), República Checa (87,3%), Austria (46,2%), Italia (52,4%), Alemania (54,5%) y Suecia (45,0%)), países americanos (Estados Unidos (21,9%) y Brasil (53,0%)), países africanos (Kenya (14,9%) y Uganda (15,5%) y países asiáticos (Tailandia (99%), Corea del Sur (52,1%) y Vietnam (29,3%) [44] [45] [46] [48] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [53]. En una pequeña proporción de estos estudios, se demostraron asociaciones estadísticamente significativas entre la prevalencia de kobuvirus y la diarrea en cerdos, como en Hungría (prevalencia de 54,5% en cerdos sanos frente a 92,3% en cerdos diarreicos), España (47,5% en sanos frente a 74,4% en diarreicos), Brasil (41% frente a 78,4%), Tailandia (19,3% frente a 84,5%) y Vietnam (27,6% frente a 40,9%) 35, 45, 46, 52. De hecho, es difícil establecer correlaciones entre la prevalencia del virus y la diarrea, ya que la patogenicidad del virus podría estar influenciada en gran medida por otros factores como las coinfecciones con otros virus entéricos, la microbiota y los factores de manejo. Los aislados belgas mostraron una variabilidad genética moderada a alta, con identidades nucleótidas entre 90,1 y 97,2%. Además, se agruparon difusamente entre cepas de diferentes países del mundo, lo que indica que las cepas no se distinguen por su origen geográfico. Debido a que la mayor parte (99%) de las lecturas generadas durante la secuenciación de la muestra fecal 17V079 emparejaron bacteriófagos tras el análisis con BLAST, los bacteriófagos pueden haber jugado un papel importante en la patogénesis de la enfermedad diarreica. De novo se analizaron contigs ensamblados utilizando VirSorter, un paquete de software para extraer señales virales de datos genómicos microbianos. Tales herramientas permiten maximizar la posibilidad de detectar frágidos dsDNA 54. Varios contigs mostraron similitudes altas con el phage B124-14 de Bacteroides, encontrado en las aguas residuales municipales y muestras fecales humanas. Se demostró que estaba ausente en 30 muestras recogidas de El hallazgo de varios contigs, genéticamente similares a los fagos B124 y probablemente pertenecientes a un genoma de fagos, indica que este fago encontrado en la muestra fecal de cerdo también puede replicarse en el microbioma del intestino del cerdo joven y no sólo en humanos. Sin embargo, es posible que la capacidad de replicación del fago en el intestino del cerdo sea dependiente de la edad y que los grupos de edad muy jóvenes no fueron muestreados en estudios previos. Curiosamente, varios de los contigs encontrados también mostraron similitudes con los fagos de Escherichia. Dos de los contigs fueron similares a los fagos de Escherichia PhAPEC5 y PhAPEC7, aislados de ríos belgas en el barrio de avellanas y conocidos por causar infecciones líticas en Escherichia coli aviar. Las imágenes microscópicas de los fagos PhAPEC5 y PhAPEC7 indicaron que pertenecían a la familia Podoviridae 57. Otros dos contigs fueron similares a dos fagos Escherichia estrechamente relacionados, St11Ph5 y G7C, encontrados en las heces de aguas residuales y caballos, respectivamente 58. Finalmente, uno de los contig mostró similitud limitada a un Enterococcus fage, aislado de las aguas residuales del hospital en China, mientras que un último contig mostró similitudes moderadas con el genoma bacteriano Enterococcus hirae. Esta región puede ser un profago, insertado en el genoma bacteriano. Los fagos encontrados en este lechoncillo pueden haber remodelado la microbiota intestinal, permitiendo que bacterias oportunistas como Enterococcus hirae proliferen y comiencen a secretar toxinas. También es posible que una infección fagosa de bacterias en el intestino del cerdo llevó a un estado de estrés para estas bacterias, provocando la secreción de toxinas. El nuevo síndrome de diarrea neonatal descrito anteriormente muestra altas similitudes con la enfermedad descrita en el caso 17V079 y puede ser que los bacteriófagos están involucrados en la patogénesis de este síndrome. Hasta ahora, el papel de los fagos no se ha considerado en la patogénesis de varios trastornos entéricos, pero dada la gran abundancia aquí, debe ser en estudios futuros. Está claro que las nuevas tecnologías cambiarán la forma en que se realizan los diagnósticos en el futuro próximo. La fijación de precios podría ser actualmente un aspecto que obstaculiza el análisis de muestras de alta resistencia en la medicina veterinaria porcina, pero a medida que la tecnología evoluciona rápidamente, esto podría ser muy menos relevante. En una única lectura, en lugar de requerir diferentes ensayos diagnósticos, se dará una visión general completa de todos los virus y otros patógenos de una muestra. Sin embargo, se debe tener cuidado con la interpretación de tales resultados, ya que sólo deben ser analizados por veterinarios entrenados. Virus. Rotavirus porcino A (RVA) cepa RVA/Pig-tc/BEL/12R046/2012/G9P [23] se aisló de un cerdito diarreico y creció durante tres pasajes sucesivos en células MA104 a un título de virus infeccioso de 10 7,8 CCID 50 / ml. Las secuencias de nucleótidos de los 11 segmentos genéticos de esta cepa se resolvieron antes utilizando la secuenciación de Sanger (números de adhesión de GenBank: KM82070 (VP1), KM820707 (VP2), KM827014 (VP3), KM820720 (VP4), KM820728 (VP6), KM820735 (VP7), KM820742 (NSP1), KM820672 (NSP2), KM820679 (NSP3), KM820686 (NSP4) y KM820693 (NSP5) 59. Una cepa del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV, CV777) aislada en Bélgica en la década de 1970 se adaptó para el crecimiento en células Vero en la década de 1980 60. En nuestro Laboratorio, el virus fue cultivado a un título de virus infeccioso de 10 6,0 CCID 50/ml (número de adhesión de GenBank: AF353511). Origen de una muestra fecal de lechones lactantes diarreicos. Se recogió una muestra fecal diarreica de un cerdo belga en una granja con un total de 620 cerdas y utilizando un sistema de producción por lotes de 2 semanas, con una edad de destete de 23 días. Se cruzaron cerdas Topigs Norsvin con jabalíes Piétrain, produciendo 32 toxinas (Suiseng, Hipra). Se realizó una vacunación rotavirus sin etiqueta con una vacuna rotavirus A bovina inactivada (Lactovac, Zoetis). Hasta hace poco, los problemas diarreicos eran raramente presentes en los lechones lactantes y también se observaron porcentajes de mortalidad muy bajos (6,2-7,1%). Desde la primavera de 2017, la enfermedad entérica comenzó a causar problemas más graves acompañados de mortalidad en esta finca, principalmente en lechones lactantes de 7 días de edad. Se investigó una muestra fecal diarreica de este tipo de lechones en un laboratorio de diagnóstico privado (Dialab, Belsele, Bélgica) y etiquetada 17V079. No se encontró ninguna causa virológica que explicara los problemas diarreicos en la granja. La única bacteria aislada fue Enterococcus hirae. Esta bacteria fue añadida al programa de vacunación de cerdas (autovacuna inactivada). No se encontraron otros patógenos en esta muestra. Como el cuadro clínico insinuó una causa viral de la enfermedad, la muestra fue enviada al Laboratorio de Virología de la Facultad de Medicina Veterinaria (Universidad de Ghent) para su posterior análisis. La muestra probó negativo para RVA, RVC, PEDV y TGEV utilizando los ensayos internos RT-qPCR 25, 61, 62. Por lo tanto, se decidió realizar un análisis de metagenomía con Minion descrito en este estudio. Purificación de ácidos nucleicos virales. En primer lugar, el enriquecimiento viral se realizó con base en el protocolo NetoVIR para obtener ácidos nucleicos virales puros para la preparación de la biblioteca de secuenciación 13. En el Laboratorio de Virología Clínica (Instituto Rega, KU Leuven) se realizaron análisis Minion de virus cultivados en cultivos celulares RVA y PEDV, mientras que la muestra fecal diarreica fue analizada en el Laboratorio de Virología (Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Gante). Las existencias de RVA y PEDV fueron centrifugadas a 1 El sobrenadante de ambas suspensiones se diluyó a 6 log 10 CCID 50/ml y 500 μl de cada suspensión se mezcló para alcanzar una concentración igual de ambos virus. Esta mezcla se filtró utilizando un filtro de poliéterulfono de 0,8 μm durante 1 min a 17.000 × g, seguido de un tratamiento de nucleasa durante 2 horas a 37 °C para digerir ácidos nucleicos libres en la suspensión: 250 μl de la muestra se añadió a 14 μl de tampón casero (1 M Tris, 100 mM CaCl 2 y 30 mMgCl 2, pH 8), 4 μl de Benzonase Nuclease (Millipore) y 2 μl de Micrococcal Nuclease (NEB) como se describió anteriormente 13. Se agregaron 14 microlitros de EDTA para detener la reacción, seguidos de la extracción de ácidos nucleicos de las partículas virales mediante el kit QIAamp Viral ARN Mini Kit (Qiagen). Se siguieron las instrucciones del fabricante, pero no se añadió ARN portador y se realizó la elución en 30 μl de AVE para concentrar el extracto de ácido nucleico viral. La muestra fecal diarreica 17V079 fue procesada de manera similar como el cultivo celular de virus crecidos, con algunas modificaciones menores. Se realizó una suspensión del 10% w/v de la diarrea en Medio Esencial Mínimo y centrífuga. El sobrenadante fue filtrado a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm (Sarstedt) y tratado con Benzonase Nuclease durante 1 hora para acelerar la tubería diagnóstica. Los ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos fueron calentados a 95 °C durante 2 minutos y refrigerados sobre hielo para resolver las estructuras secundarias de ARN y para desnaturalizar el ARN de doble cadena. Se utilizó Superscript IV Transcriptasa Inversa (ThermoScientific) para generar ADNc. Se mezclaron diez microlitros de ácidos nucleicos plantilla con imprimaciones aleatorias de 0,5 μl (Random Primer 6, New England Biolabs), 1 μl dNTP mix (NEB) y 2,5 μl de agua libre de nucleasa. El primer recocido se realizó a 65 °C durante 5 min, después de lo cual se añadieron 4 μl Superscript IV Reaction Buffer (ThermoScientific), 1 μl ditiothreitol (ThermoScientific) y 1 μl Superscript IV Reverse Transcriptase (ThermoScientific) en un volumen de reacción total de 20 μl. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 23 °C durante 10 min, 50 °C durante 10 min, 80 °C durante 10 min y un paso de retención infinito a 10 °C. Se generó un segundo hilo de ADN a partir de moléculas de ADN de una sola cadena (c) utilizando el kit de síntesis NEBNext Second Strand (NEB). Veinte microlitros mezcla de reacción a la ADNc fueron añadidos a 10 μl NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer, 5 μl NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix y 45 μl de agua libre de nucleasa (80 μl de volumen de reacción total). La amplificación isotérmica se realizó a 16 °C durante 1 h y los ácidos nucleicos de doble cadena fueron purificados utilizando 144 μl de AMPure XP magnética (Beckman Coulter). Se realizaron dos pasos de lavado con etanol recién preparado 70% antes de elutar en 52 μl de agua libre de nucleasa. Cincuenta microlitros de ADN amplificado (no) se mezclaron con 7 μl de buffer Ultra II de reacción de preparación final (New England Biolabs) y 3 μl de mezcla de enzima Ultra II de preparación final (New England Biolabs), y se incubaron a 20 °C durante 5 minutos y 65 °C durante 5 minutos. A continuación, los ácidos nucleicos se purificaron utilizando 60 μl AMPure XP Beads y se eludieron en 31 μl de agua libre de nucleasa. Los adaptadores de secuenciación, provistos con el Kit de secuenciación de ligadura 1D (R9.4) (SQK-LSK108, ONT), se ligaron a los ácidos nucleicos colados dA. El ADN preparado en el extremo (30 μl) se mezcló con una mezcla de adaptadores de 20 μl (AMX, ONT) y 50 μl Blunt/TA Ligation Master Mix (New England Biolabs) en un volumen de reacción total de 100 μl e incubado a temperatura ambiente durante 10 minutos. La biblioteca de secuenciación, que contiene ADN de doble cadena con adaptadores ligados a los extremos 3′, se purificó a continuación utilizando perlas de 40 μl AMPure XP. Se realizaron dos pasos de lavado utilizando un tampón de fijación de cuentas de 140 μl Adaptador (ABB, ONT) antes de salir en 15 μl de tampón de elución (ELB, ONT). (EXP-LLB001, ONT), biblioteca adaptada y atada de 12 μl y agua libre de La secuenciación se realizó utilizando el programa de software MinKNOW software (ONT). Análisis bioinformáticos. Las lecturas en bruto fueron producidas por MinKNOW. Se activaron las llamadas de base en vivo para el primer experimento utilizando MinKNOW versión 1.5.5. En el segundo experimento, se omitió la llamada de base después de la secuenciación usando Albacore (versión 1.2.5., ONT). Se visualizaron puntuaciones de calidad y longitudes de lectura utilizando NanoPlot, seguidas de filtrado de calidad con NanoFilt 63. Se omitieron lecturas con una puntuación q inferior a 7. Se analizaron secuencias utilizando diferentes métodos BLAST, incluyendo BLAST y tBLASTx (BLAST versión 2.6.0; corte de valor electrónico 1e −3 -1e −10 ) para comparar sensibilidad y tiempos de ejecución para detectar secuencias virales entre las lecturas. Una base de datos viral completa se compuso de todas las secuencias de virus en GenBank (taxonomía ID 10239, que contiene secuencias hasta el 17 de septiembre de 2017). El mejor resultado (valor electrónico más bajo) se visualizó utilizando KronaTools 64. Se extrajeron los virus correspondientes utilizando Seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) y se utilizaron en los análisis posteriores. GraphMap (versión 0.5.2) y Samtools (versión 1.6) se utilizaron para cartografiar lecturas contra secuencias de referencia, mientras que Canu 1.6 se utilizó para el ensamblaje de novo de genomas virales [65] [66] [68]. VirSorter se ejecutó utilizando la base de datos 'Viromes' para buscar fagos, con el Modo de Descontaminación Viromérico para identificar Los análisis bioinformáticos se realizaron en un clúster local de computadoras y en las instalaciones informáticas de alto rendimiento de la Universidad de Gante. Los conjuntos de datos generados durante y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente a petición razonable. Secuenciación Sanger del gen polimerasa kobuvirus porcino. Se descubrió un kobuvirus porcino en la muestra 17V079 utilizando el Minion. La secuencia del gen 3D del kobuvirus porcino codifica la polimerasa y se considera que se conserva más entre diferentes cepas. La secuencia exacta de nucleótidos de este virus se verificó utilizando la reacción inversa de la cadena de la polimerasa transcription seguida de la secuencia de Sanger, ya que se obtuvo una baja cobertura con Minion. RT-PCR se ejecutó utilizando el OneStep RT-PCR Kit (Qiagen) con los nuevos imprimadores Kobu_6049Fw y Kobu_7524Rv (IDT DNA Technologies) (Tabla 2). La reacción RT-PCR contenía 5 μl 5 × Qiagen OneStep RT-PCR Buffer, 1 μl dNTPs, 3 μl de cada imprimador (10 μm), 7 μl de agua libre de nucleasa, 1 μl de mezcla enzimática OneStep RT-PCR y 5 μl de ARN plantilla o agua (volumen total de reacción de 25 μl). Las condiciones de RT-PCR fueron las siguientes: 50 °C durante 30 min, 95 °C durante 15 min, seguidas de 30 ciclos de amplificación (94 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 90 s) y un paso de extensión final a 72 °C durante 1 min. Las reacciones se mantuvieron a 10 °C antes de cargar el producto PCR de 5 μl con 1 μl de tinte de carga en un gel de agarosa del 1,5%. La electroforesis se realizó durante 30 min a 100 V y el producto PCR se visualizó mediante tinción de bromuro de etidium y luz UV. El control de calidad de los cromatogramas en bruto se realizó utilizando 4Peaks (Nucleobytes BV, Países Bajos) y BLASTn (NCBI, Estados Unidos).Primeros específicos de RT-qPCR (Tabla 2) para el gen codificador de polimerasa del kobuvirus porcino se diseñaron utilizando Primerquest y Oligoanalyzer (IDT DNA Technologies) para permitir la cuantificación exacta en heces de lechones. Cada reacción RT-qPCR consistió en 10 μl PrecisionPlus OneStep qRT-PCR Mastermix que contenía SYBR Green, ROX y un tinte pipeteado azul inerte (Primerdesign, Southampton, Reino Unido), 0,4 μl de cada imprimador (200 nM) y 6,2 μl de agua libre de nucleasa. Se Un control positivo de ARN sintético (175nt) fue generado por RT-PCR utilizando los imprimadores Kobu3D_qPCR +T7_Fw y Kobu3D_qPCR_Rv, seguido por la transcripción in vitro de este producto PCR utilizando una polimerasa de ARN T7. El control positivo fue medido utilizando Nanodrop y utilizado para establecer una curva estándar sobre un rango dinámico lineal (LDR) de seis a un log 10 copias/reacción. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 55 °C durante 10 min y 95 °C durante 2 min, seguido por 40 ciclos de desnaturalización (95 °C durante 10 s) y recocido (58 °C durante 60 s). La detección de fluorescencia verde SYBR se realizó al final de cada fase de recocido. Se realizó un análisis de curva de fusión para evaluar la Cada punto de dilución en la curva estándar y cada muestra se probó en duplicados. Se analizaron los amplicones una vez en un gel de agarosa para evaluar la longitud correcta del amplicón y se realizó la secuenciación de Sanger para confirmar la amplificación del gen de la polimerasa parcial del kobuvirus porcino. Los ensayos fueron válidos si la eficiencia sobre el LDR estaba entre el 90 y el 110%, y R 2 de la curva estándar replicada fue >0,99. La cuantificación de las cargas virales fue posible si los valores Cq de dos réplicas de qPCR cayeron dentro del LDR del ensayo. Ambas réplicas tuvieron que ser positivas para que una muestra se considerara positiva. Si los valores Cq de los amplicones específicos han caído detrás del punto más bajo de la curva estándar, la muestra fue considerada positiva pero no cuantificable. Tras la caracterización del viroma con el Minion, se realizó un estudio longitudinal de seguimiento entre agosto y septiembre de 2017. Para garantizar el estado de salud del ganado porcino, la entrada a la finca fue estrictamente regulada. El agricultor realizó la toma de muestras. Se proporcionaron instrucciones detalladas y materiales de muestreo al agricultor. La recolección de muestras en el estudio longitudinal de campo se realizó de acuerdo con la legislación europea sobre experimentos con animales. La recogida de muestras fue aprobada y realizada de acuerdo con los requisitos del Comité Ético Local de la Facultad de Medicina Veterinaria e Ingeniería Bioscience de la Universidad de Gante. Un día después del parto de las cerdas, se seleccionaron cinco camadas al azar. Dentro de cada camada, se identificó un lechoncito para el seguimiento longitudinal durante todo el período de lactancia. El hisopo se colocó inmediatamente en 2 ml de medio de transporte viral (salina fosfatada tamponada que contiene 1000 U/ml de penicilina (Continental Pharma, Puurs, Bélgica), 1 mg/ml de estreptomicina (Certa, Braine l′Alleud, Bélgica), 1 mg/ml de gentamicina (Life Technologies) y 0,01% v/v de Fungizona (Bristol-Myers Squibb, Braine l′Alleud, Bélgica)) en un tubo estéril de halcón de 15 ml (Sarstedt) y almacenado a −20 °C. Cada semana se recogieron muestras de la granja y se transportaron al Laboratorio de Virología. Se pidió al agricultor que marcara el tubo de cada muestra para detectar presencia o ausencia de signos diarreicos. A su llegada al Laboratorio de Virología, las muestras fueron descongeladas y colocadas en un agitador durante 30 minutos a 4 °C para liberar partículas virales en el medio de transporte. Las muestras fueron extraídas utilizando el Kit Mini Patógeno QIAamp Cador de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los ácidos nucleicos purificados se eludieron en 100 μl de AVE y se almacenaron a −70 °C hasta el análisis RT-qPCR. El análisis RT-qPCR se realizó, como se describe anteriormente, para cuantificar copias del genoma del kobuvirus porcino por hisopo. Además, se evaluó la eliminación de RVA y RVC utilizando los ensayos RT-qPCR descritos anteriormente en la casa 25, 61. Las muestras fecales (n = 44) de lechones lacrimógenos diarreicos de menos de 2 semanas de edad fueron enviadas a un laboratorio privado por veterinarios (Dialab, Belsele, Bélgica) para diagnóstico etiológico, como se describió anteriormente. Estas muestras fueron recolectadas en 2014 y almacenadas a −70 °C en el laboratorio. Anteriormente habían sido evaluadas para la presencia de rotavirus utilizando RT-qPCR 25. La extracción de ARN se llevó a cabo utilizando el QIAamp Cador Pathogen Mini Kit (Qiagen) como se describió anteriormente y RT-qPCR se realizó para cuantificar la carga de copias de ARN de kobuvirus. Las muestras con carga viral cuantificable fueron sometidas a RT-PCR para amplificar el gen polimerasa 3D, después de lo cual se realizó la secuenciación de Sanger. Las secuencias que codifican la polimerasa de 11 aislados de kobuvirus porcinos belgas fueron depositadas en GenBank con los números de adhesión MH184664-MH184674. Las secuencias fueron utilizadas para realizar una alineación de secuencias múltiples junto con otras cepas de kobuvirus porcino en MEGA 7 usando el plug-in ClustalW 69. Se construyó un árbol filogenético de tipo máximo con RAxML utilizando un modelo reversible de tiempo general con distribución gamma (20 gatos, alfa: 0,121, LogLK = 14938.461) y intercambio de rama heurística 70. La edición de árboles se realizó con Affinity Designer (Serif). Las distancias de pares se calcularon utilizando el modelo de distancia p en Mega con valores de bootstrap establecidos en 500 réplicas.

¿Qué se investigó en este estudio?

La secuenciación de nanoporos como herramienta de diagnóstico revolucionaria para complejos de enfermedades entéricas virales porcinas identifica el kobuvirus porcino como un virus entérico importantehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6026206/SHA: eff8bed68ef6109e8f0c51a8b1ec4b6ca5b6329eAutores: Theuns, Sebastiana; Vanmechelen, Bert; Bernaert, Quinten; Deboutte, Ward; Vandenhole, Marilou; Beller, Leen; Matthijnssens, Jelle; Maes, Piet; Nauwynck, Hans J. Fecha: 2018-06-29DOI: 10.1038/s41598-018-28180-9Licencia: cc-byAbstract: Las enfermedades entéricas en los cerdos a menudo son causadas por diferentes patógenos y por lo tanto la metagenómica son una herramienta útil para el diagnóstico. Las capacidades de secuenciación de nanoporos para diagnósticos virales fueron investigadas aquí. Primero, el virus de la diarrea epidémica porcina de cultivo celular y el rotavirus A fueron agrupados y secuenciados en un Minion. Las lecturas ya fueron detectadas a los 7 segundos del inicio de la secuenciación, resultando en profundidades de alta secuenciación (19.2 a 103.5X) después de 3 h. A continuación, se analizaron las heces diarreicas de un cerdito de una semana de edad. Casi todas las lecturas (99%) pertenecían a bacteriófagos, que pueden haber modificado el microbioma del cer Por otra parte, el kobuvirus porcino se descubrió en las heces por primera vez en Bélgica. Los lechones chupadores eliminan el kobuvirus a partir de una semana de edad, pero durante un estudio de seguimiento no se observaron signos diarreicos y una asociación entre el pico de eliminación viral (10(6.42)–10(7.01) copias/swab) y signos diarreicos. El análisis retrospectivo mostró la difusión (n = 25.56.8% positivo) de kobuvirus genéticamente moderadamente relacionados entre los lechones diarreicos belgas. Minion permite la detección rápida de virus entéricos. Estas nuevas metodologías cambiarán los diagnósticos, pero se deben realizar validaciones más extensas. Debe cuestionarse la verdadera patogenicidad entérica del kobuvirus porcino, mientras que su importancia subclínica no puede excluirse. Texto: la metagenómica es un activo valioso para el diagnóstico en cerdos, lo que lleva al descubrimiento de nuevos virus e identificación de complejos de enfermedades entéricas virales porcinas. Aunque se han desarrollado procedimientos estandarizados para estudiar los metagenomas virales en muestras fecales, todavía requieren una extensa preparación de muestras, incluyendo preamplificación aleatoria o dirigida de genomas virales presentes en la muestra 13. La mayoría de las plataformas de secuenciación todavía requieren inversiones de capital y altas tasas de rotación de muestras para ser rentables. Realizar los análisis necesarios a menudo resulta en largos períodos de tiempo entre la llegada de la muestra y la notificación diagnóstica, ya que los resultados sólo pueden procesarse después de terminar la secuenciación. La secuenciación de tercera generación utilizando Minion (Oxford Nanopore Technologies, ONT) podría ser una herramienta de diagnóstico útil y asequible para la medicina veterinaria porcina, ya que Las células de flujo utilizadas para la secuenciación consisten en una membrana que contiene múltiples proteínas CsgG nanoporas de Escherichia coli 14. Se establece una corriente de iones a través de este poro que resulta en cambios típicos de la corriente tras el paso de nucleótidos específicos. Esta señal se convierte en una secuencia de nucleótidos mediante algoritmos computacionales (basecalling). Desde la liberación de la tecnología Minion, se han hecho grandes avances en cuanto al número y la calidad de las lecturas generadas 15. En el campo de la virología, la tecnología se ha aplicado principalmente en la medicina humana. Utilizando la secuenciación nanopora, fue posible distinguir tres poxvirus con similitud de nucleótidos del 98% a nivel de cepa 16. Minion también se ha utilizado como herramienta diagnóstica durante los recientes brotes de Ébolavirus Junto a un flujo de trabajo de bioinformática basado en ordenador portátil, Minion pudo detectar el virus de Chikungunya, el virus del Ébola y el virus de la hepatitis C en menos de 6 horas utilizando versiones anteriores de la tecnología 19. Un método multiplex PCR para la secuenciación completa del genoma del Zikavirus in situ en muestras con bajas cargas virales ha sido desarrollado recientemente por Quick y compañeros de trabajo 20. Los genomas parciales del virus del dengue fueron amplificados isotérmicamente seguidos de secuenciación, permitiendo la clasificación de cepas en serotipos 21. En la virología veterinaria, el uso de secuenciación del nanoporo está creciendo. Se identificó una nueva especie de papilomavirus en verrugas de jirafas, utilizando amplificación del círculo rodante y secuenciación del nanoporo 22. El genoma completo de un parapoxvirus aislado Un estudio ha reportado la detección del virus de la encefalitis equina venezolana a partir de ARNc no amplificado creado a partir de ARNc poli-A mediante virus cultivados en cultivos celulares 24. Según el conocimiento del autor, el presente estudio es el primero que utiliza Minion como ayuda en el manejo de la salud porcina, con el objetivo de explorar las posibilidades de Minion como herramienta de diagnóstico rápida y fácil de usar en el manejo de la salud porcina para el diagnóstico de complejos de enfermedades entéricas virales. Se evaluó la capacidad de detectar altas cargas de rotavirus y coronavirus cultivados en cultivos celulares, imitando cantidades de derrame observadas en lechones diarreicos. En un segundo caso, se investigó la capacidad de detectar virus (novela) en heces diarreicas de un cerdito de una semana de edad con diarrea. No se realizó preamplificación génica o aleatoria de ácidos nucleicos En este último caso se descubrió un kobuvirus porcino y en adelante se realizó un estudio longitudinal de campo para dilucidar los patrones de eliminación de este virus. Además, se investigaron muestras fecales de archivos (2014) de lechones lacrimógenos diarreicos de menos de dos semanas de edad para la presencia de kobuvirus, para estudiar su epidemiología en Bélgica. se realizaron 243.313 lecturas con una longitud media de 740 nucleótidos. Se filtraron lecturas con una puntuación q inferior a 7, resultando en 177.015 secuencias restantes (longitud media 816 nt) para su uso en análisis aguas abajo. Resultados de la secuenciación, incluyendo clasificación taxonómica y mapeo de lecturas contra genomas de referencia PEDV y rotavirus A (RVA) se muestran en la Fig. 1A. Después de 24 horas de secuenciación, un total de 15.232 lecturas fueron clasificadas como virales por comparación tBLASTx sensible frente a una base de datos viral completa. De éstas, el 39,3% (n = 5.985) y el 10,3% (n = 1.564) fueron asignadas a familias virales que incluían el virus de la diarrea epidémica porcina (familia Coronaviridae) y Rotavirus (familia Reoviridae, subfamilia Sedoreovirinae), respectivamente. Una fracción de las lecturas (29,3%, n = 4.468) fueron asignadas al orden Caudovirales. Estas lecturas se originaron en el ADN del fago lambda utilizado en un control previo en la misma célula de flujo. A los 7,5 y 24,2 segundos después del inicio de la secuenciación, respectivamente, las primeras lecturas coinciden con PEDV y RVA fueron translocadas a través de un 1B). Las secuencias PEDV y RVA fueron extraídas del conjunto de datos y cartografiadas con genes de referencia viral para calcular las profundidades de secuenciación en el tiempo (Fig. 1C). Después de una hora, las profundidades de secuenciación fueron mayores para PEDV (43.0X) que para RVA (4.9 a 22.1X). Se adquirieron profundidades de alta secuenciación después de tres horas de secuenciación para PEDV (103.5X) y para la mayoría de segmentos de genes RVA (19.2 a 48.2X). El ensamblaje de novo se ejecutó en las lecturas filtradas de calidad antes de la identificación (tBLASTx) para recuperar genomas virales, lo que resultó en la recuperación de los segmentos de genoma y gen PEDV casi completos con identidades que variaban entre 95 y 99% en comparación con los genes de referencia (Tabla 1). Sin embargo, la ejecución de ensamblaje de novo antes de la clasificación taxonómica (tBLASTx) redujo el tiempo para identificar genomas virales enteros en el conjunto de datos. La composición del viroma de un cerdito diarreico joven utilizando secuenciación nanopora. Se generaron un total de 30.088 lecturas mediante secuenciación de la muestra fecal diarreica durante tres horas. De éstas, 25.466 lecturas (q-score > 7, longitud media de lectura 653 nt) se utilizaron para análisis adicionales. Se utilizaron diferentes métodos para comparar las lecturas con una base de datos virales utilizando el grupo HPC de la Universidad de Gante y los resultados se muestran en la Fig. 2. La comparación con una base de datos viral completa resultó en la detección de 6.781 a 8.677 lecturas virales potenciales, dependiendo de la configuración BLAST. BLASTn resultó en una rápida Sin embargo, hubo una diferencia muy alta entre los tiempos de pared en el grupo HPC, con sólo 26 segundos de tiempo de análisis para BLASTn, frente a casi 24 horas para tBLASTx. La mayoría de las secuencias fueron asignadas a bacteriófagos dentro del orden Caudovirales y familias Siphoviridae (n = 3.213 a 4.163 lecturas), Podoviridae (n = 2.506 a 3.002 lecturas) y Myoviridae (n = 912 a 1.202 lecturas). Un conjunto de novo fue ejecutado en la base llamada, lecturas filtradas de calidad y los contigs resultantes fueron utilizados como material de entrada para el análisis VirSorter. Diecinueve contigs fueron clasificados como seguros (n = 4; categoría 1), algo seguro (=14; categoría 2) y no tan seguro (=1; categoría 3) ser contigs tipo fago (Fig La comparación de estos contigs con la base de datos de GenBank mediante BLAST permitió su clasificación en cuatro grupos diferentes. Diez contigs mostraron similitudes entre moderado y alto nucleótidos con el fago B124-14 de Bacteroides, lo que sugiere que todos ellos pertenecían a un genoma de fagotos, lo que también fue apoyado por el hecho de que todos estos contigs mapeados bien distribuidos a través del genoma de referencia de Bacteroides fago B124-14 (datos no mostrados). El contig más largo con un tamaño de 39,069 nucleótidos, junto con otros cuatro contigs mostraron similitudes (95% nt identidad) con diferentes fagotos de Escherichia. Dos contigs mostraron poca similitud tanto con el Enterococcus fage vB_EfaS_IME_196, aislado de las aguas residuales hospitalarias en China de una cepa de Enterococcus faecalis, como con el genoma bacteriano Enterococcus hirae. Este último podría ser un profago insertado en el genoma bacteriano. Curiosamente, se identificaron tres contigs para los cuales no se encontraron similitudes con virus existentes en GenBank, pero contig 0105 cartografiado al genoma de referencia del Enterococcus fage vB_EfaS_IME196 (datos no mostrados). Estos podrían ser fagos novedosos o variantes divergentes de los fagos existentes presentes en GenBank. Tres virus porcinos eucariotas, kobuvirus porcino (n = 18 a 22 lecturas), enterovirus G Los géneros Kobuvirus y Enterovirus pertenecen a la familia Picornaviridae, mientras que el género Mamastrovirus pertenece a la familia Astroviridae. Kobuvirus lee que fueron cartografiados contra una cepa europea de referencia S-1/HUN/2007/Hungría, como se muestra en la Fig. 2C. Sin embargo, no se obtuvo cobertura completa del genoma a alta profundidad de secuenciación. Cosechado de kobuvirus porcino y rotavirus en lechones lactantes. La eliminación de kobuvirus porcino, RVA y rotavirus C (RVC) se investigó cuantitativamente en 5 cerdos lactantes de la misma granja de la que se originaron las heces diarreicas. Los patrones de derrame fecal de los diferentes virus y la presencia de signos diarreicos se muestran en la Fig. 3A. Todos los lechones comenzaron a derramar kobuvirus porcino al final de En dos lechones (A y D) el desprendimiento se mantuvo y duró por lo menos 2 semanas (por encima del límite de cuantificación). Los títulos de desprendimiento máximo del kobuvirus porcino variaron entre 6,42 y 7,01 log 10 copias/swab, que es generalmente menor que el desprendimiento máximo observado para virus entéricos típicos como el rotavirus y el PEDV. Además, el pico de desprendimiento no se relacionó con episodios diarreicos, cuestionando el papel de este virus en la patogénesis de la diarrea en la granja. Los signos diarreicos sólo se observaron en dos lechones (A y B). En el lecho B, se observó una asociación entre el desprendimiento alto de VCR y episodios diarreicos. En contraste, no hubo asociación directa entre el desprendimiento máximo de kobuvirus y episodios Curiosamente, se observó un pico en el derrame de kobuvirus en el lechoncito C en el día 11 post-estrechamiento. Este animal murió en breve, pero no estaba claro si esto puede ser atribuible a la infección por kobuvirus. El derrame agudo de RVA se observó al final del período de lactancia en tres de cinco lechones, aunque todas las cerdas fueron vacunadas antes del parto utilizando una vacuna contra el rotavirus inactivada bovina. Análisis retrospectivo de los kobuvirus porcinos que se derramaron en cerdos lactantes diarreicos belgas y análisis filogenético. Un total de 44 muestras fecales diarreicas recogidas en 2014 fueron examinadas para detectar la presencia de kobuvirus utilizando el nuevo RT-qPCR. De estas, 25 muestras (56,8%) probaron positivas y 18 muestras mostraron cargas virales cuantificables (4,31 a 6,83 log 10 copias Siete muestras fueron positivas, pero las cargas virales fueron demasiado bajas para permitir una cuantificación precisa. La presencia de RVA y RVC había sido evaluada cuantitativamente en estas muestras en un estudio previo y la ocurrencia de coinfecciones entre rotavirus y kobuvirus se muestra en la Fig. 3B 25. Kobuvirus se encontró en proporciones iguales en muestras rotavirus negativos y positivos. Doce muestras contenían una única infección por rotavirus con una alta carga de RVA y en cuatro de ellas se observó una alta carga de kobuvirus (5.16 a 5.42 log 10 copias/g). Se encontró una única infección por RVC en siete muestras y en cuatro de ellas se demostró positiva para kobuvirus a altas cargas (4.31 a 5.59 log 10 copias/g). Se observó una infección por RVC/RVC doble en dos muestras, pero no contenía cargas cuantificables por kobuvirus. Muchas (n = 10) de las muestras negativas de rotavirus contenían altas cargas de kobuvirus. La cepa 17V079 mostró una gran similitud con otros aislados belgas de kobuvirus porcino desde 2014 (92,1 a 94,0% de identidad de secuencia de nucleótidos) y con la cepa de referencia húngara S-1/Hun/2017 (93,4%). Además, hubo un alto nivel de variabilidad genética entre los aislados belgas de kobuvirus porcino de 2014, con identidades de secuencia de nucleótidos que oscilaban entre 90,1 y 97,2%. Un análisis filogenético, utilizando el gen 3D de 17V079 y doce aislados belgas de 2014 (fig. 3C), muestra las cepas belgas que se agrupan entre cepas de diferentes lugares geográficos. La prevención y el tratamiento de problemas de enfermedades entéricas en lechones jóvenes se ve frecuentemente obstaculizado Los veterinarios están restringidos a una lista corta de virus conocidos, bacterias, parásitos y factores de manejo para definir un diagnóstico diferencial. Sólo las causas más probables de la enfermedad serán investigadas diagnósticamente, lo que a menudo conduce a resultados negativos, no concluyentes o incompletos. Sin embargo, los estudios de metagenomía han indicado la existencia de complejos de enfermedades entéricas virales, potencialmente involucrando múltiples virus conocidos y novedosos 3, 4, 6, 7, 9, 10. La detección de ácidos nucleicos a partir de patógenos utilizando enfoques metagenómicos basados en NGS es una solución parcial a problemas de pruebas diagnósticas y puede proporcionar una lectura completa de virus y otros patógenos presentes en una muestra. Sin embargo, la mayoría de las plataformas NGS requieren grandes inversiones y el procesamiento de las lecturas sólo puede comenzar al final de la secuenciación. La metagenómica viral también requiere extensas preparaciones de laboratorio, incluyendo centrifugación, filtración y tratamiento de nucleasas para descartar los ácidos nucleicos bacterianos y hospedantes que constituyen la mayor parte de los ácidos nucleicos presentes 13. Además, la cantidad de ácidos nucleicos virales en una muestra es muy baja, requiriendo amplificación específica o aleatoria de estos genomas antes del análisis de NGS. La amplificación puede inducir sesgo y dificulta el desarrollo de tuberías de diagnóstico rápido debido a una pérdida de tiempo considerable. Todos estos factores conducen a un largo tiempo de rotación entre la recolección de muestras y la notificación diagnóstica. El dispositivo de secuenciación de tercera generación Minion (ONT), mantiene la promesa como plataforma diagnóstica, ya que permite secuenciar y análisis en tiempo real de todo el ADN/RN en una muestra, teóricamente sin necesidad de preampl Fue el objetivo del presente estudio evaluar esta tecnología para su uso como herramienta rápida para la identificación del complejo de la enfermedad entérica viral porcina, sin la conducción de amplificación del ácido nucleico viral. En un primer experimento, el cultivo celular de PEDV y RVA, conocidos por inducir diarrea en cerdos jóvenes, fueron agrupados a altas cargas imitando cantidades de derrame en lechones diarreicos. La secuenciación de esta muestra agrupada con el Minion resultó en una rápida identificación de ambos virus. El análisis en tiempo real de las lecturas de secuencia no fue realizado, pero es alcanzable como lo demostraron previamente Greninger y colegas utilizando la tubería de análisis SURPI para la rápida identificación de virus humanos de diferentes matrices clínicas 19. Interesantemente, la primera lectura coincide con PEDV y RVA fueron generadas respectivamente después de 7 y 24 segundos de secuenciación. Se adquirieron profundidades de alta secuenciación (43,0X) dentro de una hora de secuenciación para el PEDV y dentro de tres horas para la mayoría de los once segmentos genéticos del RVA (19,2-48,2X). En general, se generaron profundidades de secuenciación más altas para el PEDV que podrían indicar que la secuenciación de genomas virales más largos está favorecida sobre segmentos genéticos más pequeños, ya que el PEDV tiene un tamaño del genoma de aproximadamente 28 kb, y los segmentos genéticos del RVA son más cortos (0,6 a 3,3 kb). Este sesgo podría haberse introducido durante la ligadura de los adaptadores de secuenciación a los ácidos nucleicos virales. Se puede suponer que los adaptadores están más fácilmente unidos a fragmentos de ADN más largos, y se debe evitar el sesgo mediante la estandarización de la longitud de entrada de ácido nucleico viral. Mientras que la tecnología puede ser útil para dar lecturas rápidas de virus (<3 horas) presentes en una muestra, validación completa, utilizando existencias de virus bien definidas, experimentos de spiking en matrices (por ejemplo, heces) y muestras clínicas reales es necesario para asegurarse de que todos los miembros del complejo de la enfermedad entérica viral porcina están siendo diagnosticados con precisión. Además, la precisión de la tecnología necesita mayor mejora, ya que las tasas de error de los contigs de los conjuntos de novo todavía oscilaban entre 1 y 5%, obstaculizando el análisis preciso de mutaciones sutiles pero importantes en el genoma viral. Después de la identificación exitosa de los virus cultivados por células, el rendimiento de la Minion fue explorado más a fondo mediante el análisis de una muestra fecal diarreica de un lecho de leche de una semana de edad. Se realizaron análisis de PCR en tiempo real para RVA, RVC, PEDV Enterococcus hirae se aisló en un laboratorio de diagnóstico privado, pero esta especie bacteriana no se considera una causa típica de enfermedad diarreica en cerdos 26. La metagenómica viral se realizó en esta muestra utilizando el Minion y se utilizaron dos algoritmos de búsqueda BLAST diferentes para identificar taxonómicamente las lecturas comparándolas con una base de datos viral completa. En general, tBLASTx con un valor e de 10 −3 fue capaz de identificar las lecturas más virales en comparación con otras opciones de búsqueda realizadas. Sin embargo, las opciones de búsqueda de BLASTn también alcanzaron una alta sensibilidad, pero con un costo de tiempo mucho menor: 26 segundos en lugar de casi 24 horas. Para el análisis de lectura rápida y la búsqueda de secuencias virales no divergentes estrechamente relacionadas, BLASTn u otra metodología rápida debería utilizarse de manera preferente. Sin embargo, tBLASTx En la muestra 17V079 se identificaron tres virus porcinos, incluyendo el kobuvirus porcino, el mamastrovirus porcino y el enterovirus G. En un estudio reciente realizado en Tailandia, la diferencia en la prevalencia del astrovirus en las heces diarreicas y no diarreicas de cerdos belgas y en las heces de cerdos de todo el mundo 9,10,27. En un estudio reciente realizado en Tailandia, la diferencia en la prevalencia del astrovirus en las heces diarreicas (8,4%) frente a las no diarreicas (4,6%), los lechones de menos de 4 semanas de edad no fueron estadísticamente significativos. Asimismo, otros estudios han demostrado que el papel del astrovirus porcino en la patogénesis de la diarrea porcina no es completamente claro 28. En contraste, se han establecido asociaciones entre la diarrea y las infecciones por astrovirus humanos 29. Un estudio reciente realizado en 5 países europeos (Hungría, España, Alemania, Austria y Suecia) ha indicado la propagación de los astrovirus porcinos en la población porcina. Se ha encontrado una prevalencia de astrovirus cien veces mayor en cerdos diarreicos y no diarreicos de Austria y España. Los astrovirus porcinos también se han relacionado recientemente con brotes de trastornos neurológicos en lechones destetados de Hungría, y en cerdos y cerdas de 5 semanas de edad en los Estados Unidos 30, 31. El intestino podría ser un puerto hipotético de entrada para tales infecciones neurológicas por astrovirus. Los enterovirus se han relacionado más generalmente con trastornos neurológicos en cerdos, aunque se encuentran comúnmente en heces también 11, 12, [33]. En un estudio de Vietnam, no se encontró ninguna correlación significativa entre el estado de diarrea y la presencia de enterovirus G en heces 35. La participación de los astrovirus y enterovirus en la patogénesis de los trastornos entéricos puede ser cuestionada aquí, pero no se puede descartar completamente. Además, aunque se utilizaron aquí búsquedas sensibles tBLASTx, todavía existe la posibilidad de que un virus completamente nuevo esté presente en la materia oscura de la secuencia lee. Sin embargo, el reporte de un kobuvirus porcino en lechones belgas con Minion es único. En Bélgica, los kobuvirus sólo se habían encontrado anteriormente en muestras diarreicas de terneros y ganado joven en Bélgica 36. En el presente estudio, un nuevo ensayo RT-qPCR, dirigido al gen 3D conservado que codifica la ARN-ARN-polimerasa, fue desarrollado y utilizado para evaluar, por primera vez, la cinética cuantitativa longitudinal de derrame de kobuvirus porcino en cerdos en condiciones de campo. También se analizaron cinéticas similares para el rotavirus porcino A y C. Mientras los lechones lactantes comenzaron a despojarse del kobuvirus porcino a partir de una semana de edad, asociación entre el pico de despojamiento viral (6,42 a 7,01 log 10 copias/swab) y signos diarreicos. En un cerdo, se realizó una asociación entre episodios diarreicos y el pico de despojamiento del rotavirus C, un patógeno entérico bien conocido 37, 38. Muy interesantemente, las cargas fecales del kobuvirus fueron típicamente inferiores a las reportadas de virus entéricos bien descritos de los cuales la patogenicidad ha sido probada utilizando modelos de infección por cerdas, como PEDV y rotavirus [39] [40] [41]. También se encontraron cargas virales similares para el kobuvirus porcino (4,60 ± 1,76 copias/reacción de qPCR) y para el control de cerdos (4,79 ± 1,72 copias/reacción de qPCR) durante un reciente estudio danés para evaluar el papel de los virus en la patogénesis del nuevo síndrome de diarrea porcina neonatal. El estudio demostró que el kobuvirus, el astrovirus, el rotavirus A, el teschovirus porcino, el norovirus porcino y los coronavirus porcinos no estaban involucrados en la patogénesis del síndrome 42. El hallazgo de bajas cargas de kobuvirus en las heces arroja dudas sobre el verdadero tropismo patógeno entérico del virus. Hipotéticamente, es probable que su replicación no se distribuya a través de toda la vellosidad, sino que se limita a enterocitos en las extremidades de la vellosis La presencia de ARN del kobuvirus en el suero también se ha demostrado en cerdos húngaros, pero no se sabía si el virus también se está replicando en otros órganos 43. Tanto la vía orofecal como la alimentación de leche para lactantes cerdos podrían estar involucrados en la transmisión del virus. Las tasas más altas de infección se observaron en lechones lactantes, en comparación con cerdos mayores, en otros países [44] [45] [46]. En nuestro estudio, se observó un derrame relativamente largo de kobuvirus porcino en tres de cada cinco animales, lo que puede indicar que este virus puede inducir infecciones persistentes. Un estudio brasileño de 2011 demostró la presencia de ARN del kobuvirus en el suero de lechones de 3 días, que habían desaparecido para el día 21, indicando el aclaramiento viral de la sangre y excluyendo la persistencia sistémica 45. No se puede excluir una falta total de patogenicidad, ya que los kobuvirus porcinos pueden jugar un papel como virus subclínicamente importante. Estas propiedades subclínicas, aunque inmunosupresoras, se han atribuido al circovirus porcino porcino de importancia económica 47. De interés, uno de los lechones murió en el pico del derrame de kobuvirus, aunque no estaba claro si había causalidad entre la replicación del virus y la muerte del cerdito. Los experimentos in vivo con animales en un modelo de lechones neonatales, convencionales kobuvirus negativos se deben llevar a cabo para elucidar la patogénesis de los kobuvirus porcinos. Se intentó aislar el virus en diferentes líneas celulares (MA104, ST y SK), y células mononucleares de la sangre periférica. No hubo evidencia de efecto citopatógeno después de varios días de incubación. No se disponía de anticuerpos para visualizar la expresión de antígenos y, por lo tanto, no se puede descartar la posibilidad de replicación sin los informes científicos (2018) 8:9830 DOI:10.1038/s41598-018-28180-9 efecto citopatógeno evidente. Se intentará aislar el virus en cultivos enterocíticos primarios porcinos, una vez disponible. Para evaluar más ampliamente la prevalencia del kobuvirus en la industria porcina belga, se realizó un análisis retrospectivo de muestras diarreicas de lechones lactantes de menos de dos semanas de edad. Una proporción elevada (40,9%) de las muestras (n = 44) contenía cargas virales cuantificables que oscilaban entre 4,31 y 6,83 log 10 copias/g de heces. Las cargas virales encontradas fueron comparables a las cargas excretadas por lechones en el análisis longitudinal y el estudio mencionado de Dinamarca, demostrando la presencia endémica del virus en En el presente estudio, no se incluyeron lechones no diarreicos y, por lo tanto, no se puede establecer ninguna asociación entre la prevalencia del kobuvirus y la enfermedad. Sin embargo, la prevalencia del kobuvirus ha sido ampliamente descrita en cerdos de varios países europeos (Países Bajos (16,7%), Eslovaquia (63,4%), Hungría (81,0%), República Checa (87,3%), Austria (46,2%), Italia (52,4%), Alemania (54,5%) y Suecia (45,0%)), países americanos (Estados Unidos (21,9%) y Brasil (53,0%)), países africanos (Kenya (14,9%) y Uganda (15,5%) y países asiáticos (Tailandia (99%), Corea del Sur (52,1%) y Vietnam (29,3%) [44] [45] [46] [48] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [53]. En una pequeña proporción de estos estudios, se demostraron asociaciones estadísticamente significativas entre la prevalencia de kobuvirus y la diarrea en cerdos, como en Hungría (prevalencia de 54,5% en cerdos sanos frente a 92,3% en cerdos diarreicos), España (47,5% en sanos frente a 74,4% en diarreicos), Brasil (41% frente a 78,4%), Tailandia (19,3% frente a 84,5%) y Vietnam (27,6% frente a 40,9%) 35, 45, 46, 52. De hecho, es difícil establecer correlaciones entre la prevalencia del virus y la diarrea, ya que la patogenicidad del virus podría estar influenciada en gran medida por otros factores como las coinfecciones con otros virus entéricos, la microbiota y los factores de manejo. Los aislados belgas mostraron una variabilidad genética moderada a alta, con identidades nucleótidas entre 90,1 y 97,2%. Además, se agruparon difusamente entre cepas de diferentes países del mundo, lo que indica que las cepas no se distinguen por su origen geográfico. Debido a que la mayor parte (99%) de las lecturas generadas durante la secuenciación de la muestra fecal 17V079 emparejaron bacteriófagos tras el análisis con BLAST, los bacteriófagos pueden haber jugado un papel importante en la patogénesis de la enfermedad diarreica. De novo se analizaron contigs ensamblados utilizando VirSorter, un paquete de software para extraer señales virales de datos genómicos microbianos. Tales herramientas permiten maximizar la posibilidad de detectar frágidos dsDNA 54. Varios contigs mostraron similitudes altas con el phage B124-14 de Bacteroides, encontrado en las aguas residuales municipales y muestras fecales humanas. Se demostró que estaba ausente en 30 muestras recogidas de El hallazgo de varios contigs, genéticamente similares a los fagos B124 y probablemente pertenecientes a un genoma de fagos, indica que este fago encontrado en la muestra fecal de cerdo también puede replicarse en el microbioma del intestino del cerdo joven y no sólo en humanos. Sin embargo, es posible que la capacidad de replicación del fago en el intestino del cerdo sea dependiente de la edad y que los grupos de edad muy jóvenes no fueron muestreados en estudios previos. Curiosamente, varios de los contigs encontrados también mostraron similitudes con los fagos de Escherichia. Dos de los contigs fueron similares a los fagos de Escherichia PhAPEC5 y PhAPEC7, aislados de ríos belgas en el barrio de avellanas y conocidos por causar infecciones líticas en Escherichia coli aviar. Las imágenes microscópicas de los fagos PhAPEC5 y PhAPEC7 indicaron que pertenecían a la familia Podoviridae 57. Otros dos contigs fueron similares a dos fagos Escherichia estrechamente relacionados, St11Ph5 y G7C, encontrados en las heces de aguas residuales y caballos, respectivamente 58. Finalmente, uno de los contig mostró similitud limitada a un Enterococcus fage, aislado de las aguas residuales del hospital en China, mientras que un último contig mostró similitudes moderadas con el genoma bacteriano Enterococcus hirae. Esta región puede ser un profago, insertado en el genoma bacteriano. Los fagos encontrados en este lechoncillo pueden haber remodelado la microbiota intestinal, permitiendo que bacterias oportunistas como Enterococcus hirae proliferen y comiencen a secretar toxinas. También es posible que una infección fagosa de bacterias en el intestino del cerdo llevó a un estado de estrés para estas bacterias, provocando la secreción de toxinas. El nuevo síndrome de diarrea neonatal descrito anteriormente muestra altas similitudes con la enfermedad descrita en el caso 17V079 y puede ser que los bacteriófagos están involucrados en la patogénesis de este síndrome. Hasta ahora, el papel de los fagos no se ha considerado en la patogénesis de varios trastornos entéricos, pero dada la gran abundancia aquí, debe ser en estudios futuros. Está claro que las nuevas tecnologías cambiarán la forma en que se realizan los diagnósticos en el futuro próximo. La fijación de precios podría ser actualmente un aspecto que obstaculiza el análisis de muestras de alta resistencia en la medicina veterinaria porcina, pero a medida que la tecnología evoluciona rápidamente, esto podría ser muy menos relevante. En una única lectura, en lugar de requerir diferentes ensayos diagnósticos, se dará una visión general completa de todos los virus y otros patógenos de una muestra. Sin embargo, se debe tener cuidado con la interpretación de tales resultados, ya que sólo deben ser analizados por veterinarios entrenados. Virus. Rotavirus porcino A (RVA) cepa RVA/Pig-tc/BEL/12R046/2012/G9P [23] se aisló de un cerdito diarreico y creció durante tres pasajes sucesivos en células MA104 a un título de virus infeccioso de 10 7,8 CCID 50 / ml. Las secuencias de nucleótidos de los 11 segmentos genéticos de esta cepa se resolvieron antes utilizando la secuenciación de Sanger (números de adhesión de GenBank: KM82070 (VP1), KM820707 (VP2), KM827014 (VP3), KM820720 (VP4), KM820728 (VP6), KM820735 (VP7), KM820742 (NSP1), KM820672 (NSP2), KM820679 (NSP3), KM820686 (NSP4) y KM820693 (NSP5) 59. Una cepa del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV, CV777) aislada en Bélgica en la década de 1970 se adaptó para el crecimiento en células Vero en la década de 1980 60. En nuestro Laboratorio, el virus fue cultivado a un título de virus infeccioso de 10 6,0 CCID 50/ml (número de adhesión de GenBank: AF353511). Origen de una muestra fecal de lechones lactantes diarreicos. Se recogió una muestra fecal diarreica de un cerdo belga en una granja con un total de 620 cerdas y utilizando un sistema de producción por lotes de 2 semanas, con una edad de destete de 23 días. Se cruzaron cerdas Topigs Norsvin con jabalíes Piétrain, produciendo 32 toxinas (Suiseng, Hipra). Se realizó una vacunación rotavirus sin etiqueta con una vacuna rotavirus A bovina inactivada (Lactovac, Zoetis). Hasta hace poco, los problemas diarreicos eran raramente presentes en los lechones lactantes y también se observaron porcentajes de mortalidad muy bajos (6,2-7,1%). Desde la primavera de 2017, la enfermedad entérica comenzó a causar problemas más graves acompañados de mortalidad en esta finca, principalmente en lechones lactantes de 7 días de edad. Se investigó una muestra fecal diarreica de este tipo de lechones en un laboratorio de diagnóstico privado (Dialab, Belsele, Bélgica) y etiquetada 17V079. No se encontró ninguna causa virológica que explicara los problemas diarreicos en la granja. La única bacteria aislada fue Enterococcus hirae. Esta bacteria fue añadida al programa de vacunación de cerdas (autovacuna inactivada). No se encontraron otros patógenos en esta muestra. Como el cuadro clínico insinuó una causa viral de la enfermedad, la muestra fue enviada al Laboratorio de Virología de la Facultad de Medicina Veterinaria (Universidad de Ghent) para su posterior análisis. La muestra probó negativo para RVA, RVC, PEDV y TGEV utilizando los ensayos internos RT-qPCR 25, 61, 62. Por lo tanto, se decidió realizar un análisis de metagenomía con Minion descrito en este estudio. Purificación de ácidos nucleicos virales. En primer lugar, el enriquecimiento viral se realizó con base en el protocolo NetoVIR para obtener ácidos nucleicos virales puros para la preparación de la biblioteca de secuenciación 13. En el Laboratorio de Virología Clínica (Instituto Rega, KU Leuven) se realizaron análisis Minion de virus cultivados en cultivos celulares RVA y PEDV, mientras que la muestra fecal diarreica fue analizada en el Laboratorio de Virología (Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Gante). Las existencias de RVA y PEDV fueron centrifugadas a 1 El sobrenadante de ambas suspensiones se diluyó a 6 log 10 CCID 50/ml y 500 μl de cada suspensión se mezcló para alcanzar una concentración igual de ambos virus. Esta mezcla se filtró utilizando un filtro de poliéterulfono de 0,8 μm durante 1 min a 17.000 × g, seguido de un tratamiento de nucleasa durante 2 horas a 37 °C para digerir ácidos nucleicos libres en la suspensión: 250 μl de la muestra se añadió a 14 μl de tampón casero (1 M Tris, 100 mM CaCl 2 y 30 mMgCl 2, pH 8), 4 μl de Benzonase Nuclease (Millipore) y 2 μl de Micrococcal Nuclease (NEB) como se describió anteriormente 13. Se agregaron 14 microlitros de EDTA para detener la reacción, seguidos de la extracción de ácidos nucleicos de las partículas virales mediante el kit QIAamp Viral ARN Mini Kit (Qiagen). Se siguieron las instrucciones del fabricante, pero no se añadió ARN portador y se realizó la elución en 30 μl de AVE para concentrar el extracto de ácido nucleico viral. La muestra fecal diarreica 17V079 fue procesada de manera similar como el cultivo celular de virus crecidos, con algunas modificaciones menores. Se realizó una suspensión del 10% w/v de la diarrea en Medio Esencial Mínimo y centrífuga. El sobrenadante fue filtrado a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm (Sarstedt) y tratado con Benzonase Nuclease durante 1 hora para acelerar la tubería diagnóstica. Los ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos fueron calentados a 95 °C durante 2 minutos y refrigerados sobre hielo para resolver las estructuras secundarias de ARN y para desnaturalizar el ARN de doble cadena. Se utilizó Superscript IV Transcriptasa Inversa (ThermoScientific) para generar ADNc. Se mezclaron diez microlitros de ácidos nucleicos plantilla con imprimaciones aleatorias de 0,5 μl (Random Primer 6, New England Biolabs), 1 μl dNTP mix (NEB) y 2,5 μl de agua libre de nucleasa. El primer recocido se realizó a 65 °C durante 5 min, después de lo cual se añadieron 4 μl Superscript IV Reaction Buffer (ThermoScientific), 1 μl ditiothreitol (ThermoScientific) y 1 μl Superscript IV Reverse Transcriptase (ThermoScientific) en un volumen de reacción total de 20 μl. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 23 °C durante 10 min, 50 °C durante 10 min, 80 °C durante 10 min y un paso de retención infinito a 10 °C. Se generó un segundo hilo de ADN a partir de moléculas de ADN de una sola cadena (c) utilizando el kit de síntesis NEBNext Second Strand (NEB). Veinte microlitros mezcla de reacción a la ADNc fueron añadidos a 10 μl NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer, 5 μl NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix y 45 μl de agua libre de nucleasa (80 μl de volumen de reacción total). La amplificación isotérmica se realizó a 16 °C durante 1 h y los ácidos nucleicos de doble cadena fueron purificados utilizando 144 μl de AMPure XP magnética (Beckman Coulter). Se realizaron dos pasos de lavado con etanol recién preparado 70% antes de elutar en 52 μl de agua libre de nucleasa. Cincuenta microlitros de ADN amplificado (no) se mezclaron con 7 μl de buffer Ultra II de reacción de preparación final (New England Biolabs) y 3 μl de mezcla de enzima Ultra II de preparación final (New England Biolabs), y se incubaron a 20 °C durante 5 minutos y 65 °C durante 5 minutos. A continuación, los ácidos nucleicos se purificaron utilizando 60 μl AMPure XP Beads y se eludieron en 31 μl de agua libre de nucleasa. Los adaptadores de secuenciación, provistos con el Kit de secuenciación de ligadura 1D (R9.4) (SQK-LSK108, ONT), se ligaron a los ácidos nucleicos colados dA. El ADN preparado en el extremo (30 μl) se mezcló con una mezcla de adaptadores de 20 μl (AMX, ONT) y 50 μl Blunt/TA Ligation Master Mix (New England Biolabs) en un volumen de reacción total de 100 μl e incubado a temperatura ambiente durante 10 minutos. La biblioteca de secuenciación, que contiene ADN de doble cadena con adaptadores ligados a los extremos 3′, se purificó a continuación utilizando perlas de 40 μl AMPure XP. Se realizaron dos pasos de lavado utilizando un tampón de fijación de cuentas de 140 μl Adaptador (ABB, ONT) antes de salir en 15 μl de tampón de elución (ELB, ONT). (EXP-LLB001, ONT), biblioteca adaptada y atada de 12 μl y agua libre de La secuenciación se realizó utilizando el programa de software MinKNOW software (ONT). Análisis bioinformáticos. Las lecturas en bruto fueron producidas por MinKNOW. Se activaron las llamadas de base en vivo para el primer experimento utilizando MinKNOW versión 1.5.5. En el segundo experimento, se omitió la llamada de base después de la secuenciación usando Albacore (versión 1.2.5., ONT). Se visualizaron puntuaciones de calidad y longitudes de lectura utilizando NanoPlot, seguidas de filtrado de calidad con NanoFilt 63. Se omitieron lecturas con una puntuación q inferior a 7. Se analizaron secuencias utilizando diferentes métodos BLAST, incluyendo BLAST y tBLASTx (BLAST versión 2.6.0; corte de valor electrónico 1e −3 -1e −10 ) para comparar sensibilidad y tiempos de ejecución para detectar secuencias virales entre las lecturas. Una base de datos viral completa se compuso de todas las secuencias de virus en GenBank (taxonomía ID 10239, que contiene secuencias hasta el 17 de septiembre de 2017). El mejor resultado (valor electrónico más bajo) se visualizó utilizando KronaTools 64. Se extrajeron los virus correspondientes utilizando Seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) y se utilizaron en los análisis posteriores. GraphMap (versión 0.5.2) y Samtools (versión 1.6) se utilizaron para cartografiar lecturas contra secuencias de referencia, mientras que Canu 1.6 se utilizó para el ensamblaje de novo de genomas virales [65] [66] [68]. VirSorter se ejecutó utilizando la base de datos 'Viromes' para buscar fagos, con el Modo de Descontaminación Viromérico para identificar Los análisis bioinformáticos se realizaron en un clúster local de computadoras y en las instalaciones informáticas de alto rendimiento de la Universidad de Gante. Los conjuntos de datos generados durante y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente a petición razonable. Secuenciación Sanger del gen polimerasa kobuvirus porcino. Se descubrió un kobuvirus porcino en la muestra 17V079 utilizando el Minion. La secuencia del gen 3D del kobuvirus porcino codifica la polimerasa y se considera que se conserva más entre diferentes cepas. La secuencia exacta de nucleótidos de este virus se verificó utilizando la reacción inversa de la cadena de la polimerasa transcription seguida de la secuencia de Sanger, ya que se obtuvo una baja cobertura con Minion. RT-PCR se ejecutó utilizando el OneStep RT-PCR Kit (Qiagen) con los nuevos imprimadores Kobu_6049Fw y Kobu_7524Rv (IDT DNA Technologies) (Tabla 2). La reacción RT-PCR contenía 5 μl 5 × Qiagen OneStep RT-PCR Buffer, 1 μl dNTPs, 3 μl de cada imprimador (10 μm), 7 μl de agua libre de nucleasa, 1 μl de mezcla enzimática OneStep RT-PCR y 5 μl de ARN plantilla o agua (volumen total de reacción de 25 μl). Las condiciones de RT-PCR fueron las siguientes: 50 °C durante 30 min, 95 °C durante 15 min, seguidas de 30 ciclos de amplificación (94 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 90 s) y un paso de extensión final a 72 °C durante 1 min. Las reacciones se mantuvieron a 10 °C antes de cargar el producto PCR de 5 μl con 1 μl de tinte de carga en un gel de agarosa del 1,5%. La electroforesis se realizó durante 30 min a 100 V y el producto PCR se visualizó mediante tinción de bromuro de etidium y luz UV. El control de calidad de los cromatogramas en bruto se realizó utilizando 4Peaks (Nucleobytes BV, Países Bajos) y BLASTn (NCBI, Estados Unidos).Primeros específicos de RT-qPCR (Tabla 2) para el gen codificador de polimerasa del kobuvirus porcino se diseñaron utilizando Primerquest y Oligoanalyzer (IDT DNA Technologies) para permitir la cuantificación exacta en heces de lechones. Cada reacción RT-qPCR consistió en 10 μl PrecisionPlus OneStep qRT-PCR Mastermix que contenía SYBR Green, ROX y un tinte pipeteado azul inerte (Primerdesign, Southampton, Reino Unido), 0,4 μl de cada imprimador (200 nM) y 6,2 μl de agua libre de nucleasa. Se Un control positivo de ARN sintético (175nt) fue generado por RT-PCR utilizando los imprimadores Kobu3D_qPCR +T7_Fw y Kobu3D_qPCR_Rv, seguido por la transcripción in vitro de este producto PCR utilizando una polimerasa de ARN T7. El control positivo fue medido utilizando Nanodrop y utilizado para establecer una curva estándar sobre un rango dinámico lineal (LDR) de seis a un log 10 copias/reacción. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 55 °C durante 10 min y 95 °C durante 2 min, seguido por 40 ciclos de desnaturalización (95 °C durante 10 s) y recocido (58 °C durante 60 s). La detección de fluorescencia verde SYBR se realizó al final de cada fase de recocido. Se realizó un análisis de curva de fusión para evaluar la Cada punto de dilución en la curva estándar y cada muestra se probó en duplicados. Se analizaron los amplicones una vez en un gel de agarosa para evaluar la longitud correcta del amplicón y se realizó la secuenciación de Sanger para confirmar la amplificación del gen de la polimerasa parcial del kobuvirus porcino. Los ensayos fueron válidos si la eficiencia sobre el LDR estaba entre el 90 y el 110%, y R 2 de la curva estándar replicada fue >0,99. La cuantificación de las cargas virales fue posible si los valores Cq de dos réplicas de qPCR cayeron dentro del LDR del ensayo. Ambas réplicas tuvieron que ser positivas para que una muestra se considerara positiva. Si los valores Cq de los amplicones específicos han caído detrás del punto más bajo de la curva estándar, la muestra fue considerada positiva pero no cuantificable. Tras la caracterización del viroma con el Minion, se realizó un estudio longitudinal de seguimiento entre agosto y septiembre de 2017. Para garantizar el estado de salud del ganado porcino, la entrada a la finca fue estrictamente regulada. El agricultor realizó la toma de muestras. Se proporcionaron instrucciones detalladas y materiales de muestreo al agricultor. La recolección de muestras en el estudio longitudinal de campo se realizó de acuerdo con la legislación europea sobre experimentos con animales. La recogida de muestras fue aprobada y realizada de acuerdo con los requisitos del Comité Ético Local de la Facultad de Medicina Veterinaria e Ingeniería Bioscience de la Universidad de Gante. Un día después del parto de las cerdas, se seleccionaron cinco camadas al azar. Dentro de cada camada, se identificó un lechoncito para el seguimiento longitudinal durante todo el período de lactancia. El hisopo se colocó inmediatamente en 2 ml de medio de transporte viral (salina fosfatada tamponada que contiene 1000 U/ml de penicilina (Continental Pharma, Puurs, Bélgica), 1 mg/ml de estreptomicina (Certa, Braine l′Alleud, Bélgica), 1 mg/ml de gentamicina (Life Technologies) y 0,01% v/v de Fungizona (Bristol-Myers Squibb, Braine l′Alleud, Bélgica)) en un tubo estéril de halcón de 15 ml (Sarstedt) y almacenado a −20 °C. Cada semana se recogieron muestras de la granja y se transportaron al Laboratorio de Virología. Se pidió al agricultor que marcara el tubo de cada muestra para detectar presencia o ausencia de signos diarreicos. A su llegada al Laboratorio de Virología, las muestras fueron descongeladas y colocadas en un agitador durante 30 minutos a 4 °C para liberar partículas virales en el medio de transporte. Las muestras fueron extraídas utilizando el Kit Mini Patógeno QIAamp Cador de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los ácidos nucleicos purificados se eludieron en 100 μl de AVE y se almacenaron a −70 °C hasta el análisis RT-qPCR. El análisis RT-qPCR se realizó, como se describe anteriormente, para cuantificar copias del genoma del kobuvirus porcino por hisopo. Además, se evaluó la eliminación de RVA y RVC utilizando los ensayos RT-qPCR descritos anteriormente en la casa 25, 61. Las muestras fecales (n = 44) de lechones lacrimógenos diarreicos de menos de 2 semanas de edad fueron enviadas a un laboratorio privado por veterinarios (Dialab, Belsele, Bélgica) para diagnóstico etiológico, como se describió anteriormente. Estas muestras fueron recolectadas en 2014 y almacenadas a −70 °C en el laboratorio. Anteriormente habían sido evaluadas para la presencia de rotavirus utilizando RT-qPCR 25. La extracción de ARN se llevó a cabo utilizando el QIAamp Cador Pathogen Mini Kit (Qiagen) como se describió anteriormente y RT-qPCR se realizó para cuantificar la carga de copias de ARN de kobuvirus. Las muestras con carga viral cuantificable fueron sometidas a RT-PCR para amplificar el gen polimerasa 3D, después de lo cual se realizó la secuenciación de Sanger. Las secuencias que codifican la polimerasa de 11 aislados de kobuvirus porcinos belgas fueron depositadas en GenBank con los números de adhesión MH184664-MH184674. Las secuencias fueron utilizadas para realizar una alineación de secuencias múltiples junto con otras cepas de kobuvirus porcino en MEGA 7 usando el plug-in ClustalW 69. Se construyó un árbol filogenético de tipo máximo con RAxML utilizando un modelo reversible de tiempo general con distribución gamma (20 gatos, alfa: 0,121, LogLK = 14938.461) y intercambio de rama heurística 70. La edición de árboles se realizó con Affinity Designer (Serif). Las distancias de pares se calcularon utilizando el modelo de distancia p en Mega con valores de bootstrap establecidos en 500 réplicas.

¿Qué lecturas q-score fueron eliminadas del análisis?

La secuenciación de nanoporos como herramienta de diagnóstico revolucionaria para complejos de enfermedades entéricas virales porcinas identifica el kobuvirus porcino como un virus entérico importantehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6026206/SHA: eff8bed68ef6109e8f0c51a8b1ec4b6ca5b6329eAutores: Theuns, Sebastiana; Vanmechelen, Bert; Bernaert, Quinten; Deboutte, Ward; Vandenhole, Marilou; Beller, Leen; Matthijnssens, Jelle; Maes, Piet; Nauwynck, Hans J. Fecha: 2018-06-29DOI: 10.1038/s41598-018-28180-9Licencia: cc-byAbstract: Las enfermedades entéricas en los cerdos a menudo son causadas por diferentes patógenos y por lo tanto la metagenómica son una herramienta útil para el diagnóstico. Las capacidades de secuenciación de nanoporos para diagnósticos virales fueron investigadas aquí. Primero, el virus de la diarrea epidémica porcina de cultivo celular y el rotavirus A fueron agrupados y secuenciados en un Minion. Las lecturas ya fueron detectadas a los 7 segundos del inicio de la secuenciación, resultando en profundidades de alta secuenciación (19.2 a 103.5X) después de 3 h. A continuación, se analizaron las heces diarreicas de un cerdito de una semana de edad. Casi todas las lecturas (99%) pertenecían a bacteriófagos, que pueden haber modificado el microbioma del cer Por otra parte, el kobuvirus porcino se descubrió en las heces por primera vez en Bélgica. Los lechones chupadores eliminan el kobuvirus a partir de una semana de edad, pero durante un estudio de seguimiento no se observaron signos diarreicos y una asociación entre el pico de eliminación viral (10(6.42)–10(7.01) copias/swab) y signos diarreicos. El análisis retrospectivo mostró la difusión (n = 25.56.8% positivo) de kobuvirus genéticamente moderadamente relacionados entre los lechones diarreicos belgas. Minion permite la detección rápida de virus entéricos. Estas nuevas metodologías cambiarán los diagnósticos, pero se deben realizar validaciones más extensas. Debe cuestionarse la verdadera patogenicidad entérica del kobuvirus porcino, mientras que su importancia subclínica no puede excluirse. Texto: la metagenómica es un activo valioso para el diagnóstico en cerdos, lo que lleva al descubrimiento de nuevos virus e identificación de complejos de enfermedades entéricas virales porcinas. Aunque se han desarrollado procedimientos estandarizados para estudiar los metagenomas virales en muestras fecales, todavía requieren una extensa preparación de muestras, incluyendo preamplificación aleatoria o dirigida de genomas virales presentes en la muestra 13. La mayoría de las plataformas de secuenciación todavía requieren inversiones de capital y altas tasas de rotación de muestras para ser rentables. Realizar los análisis necesarios a menudo resulta en largos períodos de tiempo entre la llegada de la muestra y la notificación diagnóstica, ya que los resultados sólo pueden procesarse después de terminar la secuenciación. La secuenciación de tercera generación utilizando Minion (Oxford Nanopore Technologies, ONT) podría ser una herramienta de diagnóstico útil y asequible para la medicina veterinaria porcina, ya que Las células de flujo utilizadas para la secuenciación consisten en una membrana que contiene múltiples proteínas CsgG nanoporas de Escherichia coli 14. Se establece una corriente de iones a través de este poro que resulta en cambios típicos de la corriente tras el paso de nucleótidos específicos. Esta señal se convierte en una secuencia de nucleótidos mediante algoritmos computacionales (basecalling). Desde la liberación de la tecnología Minion, se han hecho grandes avances en cuanto al número y la calidad de las lecturas generadas 15. En el campo de la virología, la tecnología se ha aplicado principalmente en la medicina humana. Utilizando la secuenciación nanopora, fue posible distinguir tres poxvirus con similitud de nucleótidos del 98% a nivel de cepa 16. Minion también se ha utilizado como herramienta diagnóstica durante los recientes brotes de Ébolavirus Junto a un flujo de trabajo de bioinformática basado en ordenador portátil, Minion pudo detectar el virus de Chikungunya, el virus del Ébola y el virus de la hepatitis C en menos de 6 horas utilizando versiones anteriores de la tecnología 19. Un método multiplex PCR para la secuenciación completa del genoma del Zikavirus in situ en muestras con bajas cargas virales ha sido desarrollado recientemente por Quick y compañeros de trabajo 20. Los genomas parciales del virus del dengue fueron amplificados isotérmicamente seguidos de secuenciación, permitiendo la clasificación de cepas en serotipos 21. En la virología veterinaria, el uso de secuenciación del nanoporo está creciendo. Se identificó una nueva especie de papilomavirus en verrugas de jirafas, utilizando amplificación del círculo rodante y secuenciación del nanoporo 22. El genoma completo de un parapoxvirus aislado Un estudio ha reportado la detección del virus de la encefalitis equina venezolana a partir de ARNc no amplificado creado a partir de ARNc poli-A mediante virus cultivados en cultivos celulares 24. Según el conocimiento del autor, el presente estudio es el primero que utiliza Minion como ayuda en el manejo de la salud porcina, con el objetivo de explorar las posibilidades de Minion como herramienta de diagnóstico rápida y fácil de usar en el manejo de la salud porcina para el diagnóstico de complejos de enfermedades entéricas virales. Se evaluó la capacidad de detectar altas cargas de rotavirus y coronavirus cultivados en cultivos celulares, imitando cantidades de derrame observadas en lechones diarreicos. En un segundo caso, se investigó la capacidad de detectar virus (novela) en heces diarreicas de un cerdito de una semana de edad con diarrea. No se realizó preamplificación génica o aleatoria de ácidos nucleicos En este último caso se descubrió un kobuvirus porcino y en adelante se realizó un estudio longitudinal de campo para dilucidar los patrones de eliminación de este virus. Además, se investigaron muestras fecales de archivos (2014) de lechones lacrimógenos diarreicos de menos de dos semanas de edad para la presencia de kobuvirus, para estudiar su epidemiología en Bélgica. se realizaron 243.313 lecturas con una longitud media de 740 nucleótidos. Se filtraron lecturas con una puntuación q inferior a 7, resultando en 177.015 secuencias restantes (longitud media 816 nt) para su uso en análisis aguas abajo. Resultados de la secuenciación, incluyendo clasificación taxonómica y mapeo de lecturas contra genomas de referencia PEDV y rotavirus A (RVA) se muestran en la Fig. 1A. Después de 24 horas de secuenciación, un total de 15.232 lecturas fueron clasificadas como virales por comparación tBLASTx sensible frente a una base de datos viral completa. De éstas, el 39,3% (n = 5.985) y el 10,3% (n = 1.564) fueron asignadas a familias virales que incluían el virus de la diarrea epidémica porcina (familia Coronaviridae) y Rotavirus (familia Reoviridae, subfamilia Sedoreovirinae), respectivamente. Una fracción de las lecturas (29,3%, n = 4.468) fueron asignadas al orden Caudovirales. Estas lecturas se originaron en el ADN del fago lambda utilizado en un control previo en la misma célula de flujo. A los 7,5 y 24,2 segundos después del inicio de la secuenciación, respectivamente, las primeras lecturas coinciden con PEDV y RVA fueron translocadas a través de un 1B). Las secuencias PEDV y RVA fueron extraídas del conjunto de datos y cartografiadas con genes de referencia viral para calcular las profundidades de secuenciación en el tiempo (Fig. 1C). Después de una hora, las profundidades de secuenciación fueron mayores para PEDV (43.0X) que para RVA (4.9 a 22.1X). Se adquirieron profundidades de alta secuenciación después de tres horas de secuenciación para PEDV (103.5X) y para la mayoría de segmentos de genes RVA (19.2 a 48.2X). El ensamblaje de novo se ejecutó en las lecturas filtradas de calidad antes de la identificación (tBLASTx) para recuperar genomas virales, lo que resultó en la recuperación de los segmentos de genoma y gen PEDV casi completos con identidades que variaban entre 95 y 99% en comparación con los genes de referencia (Tabla 1). Sin embargo, la ejecución de ensamblaje de novo antes de la clasificación taxonómica (tBLASTx) redujo el tiempo para identificar genomas virales enteros en el conjunto de datos. La composición del viroma de un cerdito diarreico joven utilizando secuenciación nanopora. Se generaron un total de 30.088 lecturas mediante secuenciación de la muestra fecal diarreica durante tres horas. De éstas, 25.466 lecturas (q-score > 7, longitud media de lectura 653 nt) se utilizaron para análisis adicionales. Se utilizaron diferentes métodos para comparar las lecturas con una base de datos virales utilizando el grupo HPC de la Universidad de Gante y los resultados se muestran en la Fig. 2. La comparación con una base de datos viral completa resultó en la detección de 6.781 a 8.677 lecturas virales potenciales, dependiendo de la configuración BLAST. BLASTn resultó en una rápida Sin embargo, hubo una diferencia muy alta entre los tiempos de pared en el grupo HPC, con sólo 26 segundos de tiempo de análisis para BLASTn, frente a casi 24 horas para tBLASTx. La mayoría de las secuencias fueron asignadas a bacteriófagos dentro del orden Caudovirales y familias Siphoviridae (n = 3.213 a 4.163 lecturas), Podoviridae (n = 2.506 a 3.002 lecturas) y Myoviridae (n = 912 a 1.202 lecturas). Un conjunto de novo fue ejecutado en la base llamada, lecturas filtradas de calidad y los contigs resultantes fueron utilizados como material de entrada para el análisis VirSorter. Diecinueve contigs fueron clasificados como seguros (n = 4; categoría 1), algo seguro (=14; categoría 2) y no tan seguro (=1; categoría 3) ser contigs tipo fago (Fig La comparación de estos contigs con la base de datos de GenBank mediante BLAST permitió su clasificación en cuatro grupos diferentes. Diez contigs mostraron similitudes entre moderado y alto nucleótidos con el fago B124-14 de Bacteroides, lo que sugiere que todos ellos pertenecían a un genoma de fagotos, lo que también fue apoyado por el hecho de que todos estos contigs mapeados bien distribuidos a través del genoma de referencia de Bacteroides fago B124-14 (datos no mostrados). El contig más largo con un tamaño de 39,069 nucleótidos, junto con otros cuatro contigs mostraron similitudes (95% nt identidad) con diferentes fagotos de Escherichia. Dos contigs mostraron poca similitud tanto con el Enterococcus fage vB_EfaS_IME_196, aislado de las aguas residuales hospitalarias en China de una cepa de Enterococcus faecalis, como con el genoma bacteriano Enterococcus hirae. Este último podría ser un profago insertado en el genoma bacteriano. Curiosamente, se identificaron tres contigs para los cuales no se encontraron similitudes con virus existentes en GenBank, pero contig 0105 cartografiado al genoma de referencia del Enterococcus fage vB_EfaS_IME196 (datos no mostrados). Estos podrían ser fagos novedosos o variantes divergentes de los fagos existentes presentes en GenBank. Tres virus porcinos eucariotas, kobuvirus porcino (n = 18 a 22 lecturas), enterovirus G Los géneros Kobuvirus y Enterovirus pertenecen a la familia Picornaviridae, mientras que el género Mamastrovirus pertenece a la familia Astroviridae. Kobuvirus lee que fueron cartografiados contra una cepa europea de referencia S-1/HUN/2007/Hungría, como se muestra en la Fig. 2C. Sin embargo, no se obtuvo cobertura completa del genoma a alta profundidad de secuenciación. Cosechado de kobuvirus porcino y rotavirus en lechones lactantes. La eliminación de kobuvirus porcino, RVA y rotavirus C (RVC) se investigó cuantitativamente en 5 cerdos lactantes de la misma granja de la que se originaron las heces diarreicas. Los patrones de derrame fecal de los diferentes virus y la presencia de signos diarreicos se muestran en la Fig. 3A. Todos los lechones comenzaron a derramar kobuvirus porcino al final de En dos lechones (A y D) el desprendimiento se mantuvo y duró por lo menos 2 semanas (por encima del límite de cuantificación). Los títulos de desprendimiento máximo del kobuvirus porcino variaron entre 6,42 y 7,01 log 10 copias/swab, que es generalmente menor que el desprendimiento máximo observado para virus entéricos típicos como el rotavirus y el PEDV. Además, el pico de desprendimiento no se relacionó con episodios diarreicos, cuestionando el papel de este virus en la patogénesis de la diarrea en la granja. Los signos diarreicos sólo se observaron en dos lechones (A y B). En el lecho B, se observó una asociación entre el desprendimiento alto de VCR y episodios diarreicos. En contraste, no hubo asociación directa entre el desprendimiento máximo de kobuvirus y episodios Curiosamente, se observó un pico en el derrame de kobuvirus en el lechoncito C en el día 11 post-estrechamiento. Este animal murió en breve, pero no estaba claro si esto puede ser atribuible a la infección por kobuvirus. El derrame agudo de RVA se observó al final del período de lactancia en tres de cinco lechones, aunque todas las cerdas fueron vacunadas antes del parto utilizando una vacuna contra el rotavirus inactivada bovina. Análisis retrospectivo de los kobuvirus porcinos que se derramaron en cerdos lactantes diarreicos belgas y análisis filogenético. Un total de 44 muestras fecales diarreicas recogidas en 2014 fueron examinadas para detectar la presencia de kobuvirus utilizando el nuevo RT-qPCR. De estas, 25 muestras (56,8%) probaron positivas y 18 muestras mostraron cargas virales cuantificables (4,31 a 6,83 log 10 copias Siete muestras fueron positivas, pero las cargas virales fueron demasiado bajas para permitir una cuantificación precisa. La presencia de RVA y RVC había sido evaluada cuantitativamente en estas muestras en un estudio previo y la ocurrencia de coinfecciones entre rotavirus y kobuvirus se muestra en la Fig. 3B 25. Kobuvirus se encontró en proporciones iguales en muestras rotavirus negativos y positivos. Doce muestras contenían una única infección por rotavirus con una alta carga de RVA y en cuatro de ellas se observó una alta carga de kobuvirus (5.16 a 5.42 log 10 copias/g). Se encontró una única infección por RVC en siete muestras y en cuatro de ellas se demostró positiva para kobuvirus a altas cargas (4.31 a 5.59 log 10 copias/g). Se observó una infección por RVC/RVC doble en dos muestras, pero no contenía cargas cuantificables por kobuvirus. Muchas (n = 10) de las muestras negativas de rotavirus contenían altas cargas de kobuvirus. La cepa 17V079 mostró una gran similitud con otros aislados belgas de kobuvirus porcino desde 2014 (92,1 a 94,0% de identidad de secuencia de nucleótidos) y con la cepa de referencia húngara S-1/Hun/2017 (93,4%). Además, hubo un alto nivel de variabilidad genética entre los aislados belgas de kobuvirus porcino de 2014, con identidades de secuencia de nucleótidos que oscilaban entre 90,1 y 97,2%. Un análisis filogenético, utilizando el gen 3D de 17V079 y doce aislados belgas de 2014 (fig. 3C), muestra las cepas belgas que se agrupan entre cepas de diferentes lugares geográficos. La prevención y el tratamiento de problemas de enfermedades entéricas en lechones jóvenes se ve frecuentemente obstaculizado Los veterinarios están restringidos a una lista corta de virus conocidos, bacterias, parásitos y factores de manejo para definir un diagnóstico diferencial. Sólo las causas más probables de la enfermedad serán investigadas diagnósticamente, lo que a menudo conduce a resultados negativos, no concluyentes o incompletos. Sin embargo, los estudios de metagenomía han indicado la existencia de complejos de enfermedades entéricas virales, potencialmente involucrando múltiples virus conocidos y novedosos 3, 4, 6, 7, 9, 10. La detección de ácidos nucleicos a partir de patógenos utilizando enfoques metagenómicos basados en NGS es una solución parcial a problemas de pruebas diagnósticas y puede proporcionar una lectura completa de virus y otros patógenos presentes en una muestra. Sin embargo, la mayoría de las plataformas NGS requieren grandes inversiones y el procesamiento de las lecturas sólo puede comenzar al final de la secuenciación. La metagenómica viral también requiere extensas preparaciones de laboratorio, incluyendo centrifugación, filtración y tratamiento de nucleasas para descartar los ácidos nucleicos bacterianos y hospedantes que constituyen la mayor parte de los ácidos nucleicos presentes 13. Además, la cantidad de ácidos nucleicos virales en una muestra es muy baja, requiriendo amplificación específica o aleatoria de estos genomas antes del análisis de NGS. La amplificación puede inducir sesgo y dificulta el desarrollo de tuberías de diagnóstico rápido debido a una pérdida de tiempo considerable. Todos estos factores conducen a un largo tiempo de rotación entre la recolección de muestras y la notificación diagnóstica. El dispositivo de secuenciación de tercera generación Minion (ONT), mantiene la promesa como plataforma diagnóstica, ya que permite secuenciar y análisis en tiempo real de todo el ADN/RN en una muestra, teóricamente sin necesidad de preampl Fue el objetivo del presente estudio evaluar esta tecnología para su uso como herramienta rápida para la identificación del complejo de la enfermedad entérica viral porcina, sin la conducción de amplificación del ácido nucleico viral. En un primer experimento, el cultivo celular de PEDV y RVA, conocidos por inducir diarrea en cerdos jóvenes, fueron agrupados a altas cargas imitando cantidades de derrame en lechones diarreicos. La secuenciación de esta muestra agrupada con el Minion resultó en una rápida identificación de ambos virus. El análisis en tiempo real de las lecturas de secuencia no fue realizado, pero es alcanzable como lo demostraron previamente Greninger y colegas utilizando la tubería de análisis SURPI para la rápida identificación de virus humanos de diferentes matrices clínicas 19. Interesantemente, la primera lectura coincide con PEDV y RVA fueron generadas respectivamente después de 7 y 24 segundos de secuenciación. Se adquirieron profundidades de alta secuenciación (43,0X) dentro de una hora de secuenciación para el PEDV y dentro de tres horas para la mayoría de los once segmentos genéticos del RVA (19,2-48,2X). En general, se generaron profundidades de secuenciación más altas para el PEDV que podrían indicar que la secuenciación de genomas virales más largos está favorecida sobre segmentos genéticos más pequeños, ya que el PEDV tiene un tamaño del genoma de aproximadamente 28 kb, y los segmentos genéticos del RVA son más cortos (0,6 a 3,3 kb). Este sesgo podría haberse introducido durante la ligadura de los adaptadores de secuenciación a los ácidos nucleicos virales. Se puede suponer que los adaptadores están más fácilmente unidos a fragmentos de ADN más largos, y se debe evitar el sesgo mediante la estandarización de la longitud de entrada de ácido nucleico viral. Mientras que la tecnología puede ser útil para dar lecturas rápidas de virus (<3 horas) presentes en una muestra, validación completa, utilizando existencias de virus bien definidas, experimentos de spiking en matrices (por ejemplo, heces) y muestras clínicas reales es necesario para asegurarse de que todos los miembros del complejo de la enfermedad entérica viral porcina están siendo diagnosticados con precisión. Además, la precisión de la tecnología necesita mayor mejora, ya que las tasas de error de los contigs de los conjuntos de novo todavía oscilaban entre 1 y 5%, obstaculizando el análisis preciso de mutaciones sutiles pero importantes en el genoma viral. Después de la identificación exitosa de los virus cultivados por células, el rendimiento de la Minion fue explorado más a fondo mediante el análisis de una muestra fecal diarreica de un lecho de leche de una semana de edad. Se realizaron análisis de PCR en tiempo real para RVA, RVC, PEDV Enterococcus hirae se aisló en un laboratorio de diagnóstico privado, pero esta especie bacteriana no se considera una causa típica de enfermedad diarreica en cerdos 26. La metagenómica viral se realizó en esta muestra utilizando el Minion y se utilizaron dos algoritmos de búsqueda BLAST diferentes para identificar taxonómicamente las lecturas comparándolas con una base de datos viral completa. En general, tBLASTx con un valor e de 10 −3 fue capaz de identificar las lecturas más virales en comparación con otras opciones de búsqueda realizadas. Sin embargo, las opciones de búsqueda de BLASTn también alcanzaron una alta sensibilidad, pero con un costo de tiempo mucho menor: 26 segundos en lugar de casi 24 horas. Para el análisis de lectura rápida y la búsqueda de secuencias virales no divergentes estrechamente relacionadas, BLASTn u otra metodología rápida debería utilizarse de manera preferente. Sin embargo, tBLASTx En la muestra 17V079 se identificaron tres virus porcinos, incluyendo el kobuvirus porcino, el mamastrovirus porcino y el enterovirus G. En un estudio reciente realizado en Tailandia, la diferencia en la prevalencia del astrovirus en las heces diarreicas y no diarreicas de cerdos belgas y en las heces de cerdos de todo el mundo 9,10,27. En un estudio reciente realizado en Tailandia, la diferencia en la prevalencia del astrovirus en las heces diarreicas (8,4%) frente a las no diarreicas (4,6%), los lechones de menos de 4 semanas de edad no fueron estadísticamente significativos. Asimismo, otros estudios han demostrado que el papel del astrovirus porcino en la patogénesis de la diarrea porcina no es completamente claro 28. En contraste, se han establecido asociaciones entre la diarrea y las infecciones por astrovirus humanos 29. Un estudio reciente realizado en 5 países europeos (Hungría, España, Alemania, Austria y Suecia) ha indicado la propagación de los astrovirus porcinos en la población porcina. Se ha encontrado una prevalencia de astrovirus cien veces mayor en cerdos diarreicos y no diarreicos de Austria y España. Los astrovirus porcinos también se han relacionado recientemente con brotes de trastornos neurológicos en lechones destetados de Hungría, y en cerdos y cerdas de 5 semanas de edad en los Estados Unidos 30, 31. El intestino podría ser un puerto hipotético de entrada para tales infecciones neurológicas por astrovirus. Los enterovirus se han relacionado más generalmente con trastornos neurológicos en cerdos, aunque se encuentran comúnmente en heces también 11, 12, [33]. En un estudio de Vietnam, no se encontró ninguna correlación significativa entre el estado de diarrea y la presencia de enterovirus G en heces 35. La participación de los astrovirus y enterovirus en la patogénesis de los trastornos entéricos puede ser cuestionada aquí, pero no se puede descartar completamente. Además, aunque se utilizaron aquí búsquedas sensibles tBLASTx, todavía existe la posibilidad de que un virus completamente nuevo esté presente en la materia oscura de la secuencia lee. Sin embargo, el reporte de un kobuvirus porcino en lechones belgas con Minion es único. En Bélgica, los kobuvirus sólo se habían encontrado anteriormente en muestras diarreicas de terneros y ganado joven en Bélgica 36. En el presente estudio, un nuevo ensayo RT-qPCR, dirigido al gen 3D conservado que codifica la ARN-ARN-polimerasa, fue desarrollado y utilizado para evaluar, por primera vez, la cinética cuantitativa longitudinal de derrame de kobuvirus porcino en cerdos en condiciones de campo. También se analizaron cinéticas similares para el rotavirus porcino A y C. Mientras los lechones lactantes comenzaron a despojarse del kobuvirus porcino a partir de una semana de edad, asociación entre el pico de despojamiento viral (6,42 a 7,01 log 10 copias/swab) y signos diarreicos. En un cerdo, se realizó una asociación entre episodios diarreicos y el pico de despojamiento del rotavirus C, un patógeno entérico bien conocido 37, 38. Muy interesantemente, las cargas fecales del kobuvirus fueron típicamente inferiores a las reportadas de virus entéricos bien descritos de los cuales la patogenicidad ha sido probada utilizando modelos de infección por cerdas, como PEDV y rotavirus [39] [40] [41]. También se encontraron cargas virales similares para el kobuvirus porcino (4,60 ± 1,76 copias/reacción de qPCR) y para el control de cerdos (4,79 ± 1,72 copias/reacción de qPCR) durante un reciente estudio danés para evaluar el papel de los virus en la patogénesis del nuevo síndrome de diarrea porcina neonatal. El estudio demostró que el kobuvirus, el astrovirus, el rotavirus A, el teschovirus porcino, el norovirus porcino y los coronavirus porcinos no estaban involucrados en la patogénesis del síndrome 42. El hallazgo de bajas cargas de kobuvirus en las heces arroja dudas sobre el verdadero tropismo patógeno entérico del virus. Hipotéticamente, es probable que su replicación no se distribuya a través de toda la vellosidad, sino que se limita a enterocitos en las extremidades de la vellosis La presencia de ARN del kobuvirus en el suero también se ha demostrado en cerdos húngaros, pero no se sabía si el virus también se está replicando en otros órganos 43. Tanto la vía orofecal como la alimentación de leche para lactantes cerdos podrían estar involucrados en la transmisión del virus. Las tasas más altas de infección se observaron en lechones lactantes, en comparación con cerdos mayores, en otros países [44] [45] [46]. En nuestro estudio, se observó un derrame relativamente largo de kobuvirus porcino en tres de cada cinco animales, lo que puede indicar que este virus puede inducir infecciones persistentes. Un estudio brasileño de 2011 demostró la presencia de ARN del kobuvirus en el suero de lechones de 3 días, que habían desaparecido para el día 21, indicando el aclaramiento viral de la sangre y excluyendo la persistencia sistémica 45. No se puede excluir una falta total de patogenicidad, ya que los kobuvirus porcinos pueden jugar un papel como virus subclínicamente importante. Estas propiedades subclínicas, aunque inmunosupresoras, se han atribuido al circovirus porcino porcino de importancia económica 47. De interés, uno de los lechones murió en el pico del derrame de kobuvirus, aunque no estaba claro si había causalidad entre la replicación del virus y la muerte del cerdito. Los experimentos in vivo con animales en un modelo de lechones neonatales, convencionales kobuvirus negativos se deben llevar a cabo para elucidar la patogénesis de los kobuvirus porcinos. Se intentó aislar el virus en diferentes líneas celulares (MA104, ST y SK), y células mononucleares de la sangre periférica. No hubo evidencia de efecto citopatógeno después de varios días de incubación. No se disponía de anticuerpos para visualizar la expresión de antígenos y, por lo tanto, no se puede descartar la posibilidad de replicación sin los informes científicos (2018) 8:9830 DOI:10.1038/s41598-018-28180-9 efecto citopatógeno evidente. Se intentará aislar el virus en cultivos enterocíticos primarios porcinos, una vez disponible. Para evaluar más ampliamente la prevalencia del kobuvirus en la industria porcina belga, se realizó un análisis retrospectivo de muestras diarreicas de lechones lactantes de menos de dos semanas de edad. Una proporción elevada (40,9%) de las muestras (n = 44) contenía cargas virales cuantificables que oscilaban entre 4,31 y 6,83 log 10 copias/g de heces. Las cargas virales encontradas fueron comparables a las cargas excretadas por lechones en el análisis longitudinal y el estudio mencionado de Dinamarca, demostrando la presencia endémica del virus en En el presente estudio, no se incluyeron lechones no diarreicos y, por lo tanto, no se puede establecer ninguna asociación entre la prevalencia del kobuvirus y la enfermedad. Sin embargo, la prevalencia del kobuvirus ha sido ampliamente descrita en cerdos de varios países europeos (Países Bajos (16,7%), Eslovaquia (63,4%), Hungría (81,0%), República Checa (87,3%), Austria (46,2%), Italia (52,4%), Alemania (54,5%) y Suecia (45,0%)), países americanos (Estados Unidos (21,9%) y Brasil (53,0%)), países africanos (Kenya (14,9%) y Uganda (15,5%) y países asiáticos (Tailandia (99%), Corea del Sur (52,1%) y Vietnam (29,3%) [44] [45] [46] [48] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [53]. En una pequeña proporción de estos estudios, se demostraron asociaciones estadísticamente significativas entre la prevalencia de kobuvirus y la diarrea en cerdos, como en Hungría (prevalencia de 54,5% en cerdos sanos frente a 92,3% en cerdos diarreicos), España (47,5% en sanos frente a 74,4% en diarreicos), Brasil (41% frente a 78,4%), Tailandia (19,3% frente a 84,5%) y Vietnam (27,6% frente a 40,9%) 35, 45, 46, 52. De hecho, es difícil establecer correlaciones entre la prevalencia del virus y la diarrea, ya que la patogenicidad del virus podría estar influenciada en gran medida por otros factores como las coinfecciones con otros virus entéricos, la microbiota y los factores de manejo. Los aislados belgas mostraron una variabilidad genética moderada a alta, con identidades nucleótidas entre 90,1 y 97,2%. Además, se agruparon difusamente entre cepas de diferentes países del mundo, lo que indica que las cepas no se distinguen por su origen geográfico. Debido a que la mayor parte (99%) de las lecturas generadas durante la secuenciación de la muestra fecal 17V079 emparejaron bacteriófagos tras el análisis con BLAST, los bacteriófagos pueden haber jugado un papel importante en la patogénesis de la enfermedad diarreica. De novo se analizaron contigs ensamblados utilizando VirSorter, un paquete de software para extraer señales virales de datos genómicos microbianos. Tales herramientas permiten maximizar la posibilidad de detectar frágidos dsDNA 54. Varios contigs mostraron similitudes altas con el phage B124-14 de Bacteroides, encontrado en las aguas residuales municipales y muestras fecales humanas. Se demostró que estaba ausente en 30 muestras recogidas de El hallazgo de varios contigs, genéticamente similares a los fagos B124 y probablemente pertenecientes a un genoma de fagos, indica que este fago encontrado en la muestra fecal de cerdo también puede replicarse en el microbioma del intestino del cerdo joven y no sólo en humanos. Sin embargo, es posible que la capacidad de replicación del fago en el intestino del cerdo sea dependiente de la edad y que los grupos de edad muy jóvenes no fueron muestreados en estudios previos. Curiosamente, varios de los contigs encontrados también mostraron similitudes con los fagos de Escherichia. Dos de los contigs fueron similares a los fagos de Escherichia PhAPEC5 y PhAPEC7, aislados de ríos belgas en el barrio de avellanas y conocidos por causar infecciones líticas en Escherichia coli aviar. Las imágenes microscópicas de los fagos PhAPEC5 y PhAPEC7 indicaron que pertenecían a la familia Podoviridae 57. Otros dos contigs fueron similares a dos fagos Escherichia estrechamente relacionados, St11Ph5 y G7C, encontrados en las heces de aguas residuales y caballos, respectivamente 58. Finalmente, uno de los contig mostró similitud limitada a un Enterococcus fage, aislado de las aguas residuales del hospital en China, mientras que un último contig mostró similitudes moderadas con el genoma bacteriano Enterococcus hirae. Esta región puede ser un profago, insertado en el genoma bacteriano. Los fagos encontrados en este lechoncillo pueden haber remodelado la microbiota intestinal, permitiendo que bacterias oportunistas como Enterococcus hirae proliferen y comiencen a secretar toxinas. También es posible que una infección fagosa de bacterias en el intestino del cerdo llevó a un estado de estrés para estas bacterias, provocando la secreción de toxinas. El nuevo síndrome de diarrea neonatal descrito anteriormente muestra altas similitudes con la enfermedad descrita en el caso 17V079 y puede ser que los bacteriófagos están involucrados en la patogénesis de este síndrome. Hasta ahora, el papel de los fagos no se ha considerado en la patogénesis de varios trastornos entéricos, pero dada la gran abundancia aquí, debe ser en estudios futuros. Está claro que las nuevas tecnologías cambiarán la forma en que se realizan los diagnósticos en el futuro próximo. La fijación de precios podría ser actualmente un aspecto que obstaculiza el análisis de muestras de alta resistencia en la medicina veterinaria porcina, pero a medida que la tecnología evoluciona rápidamente, esto podría ser muy menos relevante. En una única lectura, en lugar de requerir diferentes ensayos diagnósticos, se dará una visión general completa de todos los virus y otros patógenos de una muestra. Sin embargo, se debe tener cuidado con la interpretación de tales resultados, ya que sólo deben ser analizados por veterinarios entrenados. Virus. Rotavirus porcino A (RVA) cepa RVA/Pig-tc/BEL/12R046/2012/G9P [23] se aisló de un cerdito diarreico y creció durante tres pasajes sucesivos en células MA104 a un título de virus infeccioso de 10 7,8 CCID 50 / ml. Las secuencias de nucleótidos de los 11 segmentos genéticos de esta cepa se resolvieron antes utilizando la secuenciación de Sanger (números de adhesión de GenBank: KM82070 (VP1), KM820707 (VP2), KM827014 (VP3), KM820720 (VP4), KM820728 (VP6), KM820735 (VP7), KM820742 (NSP1), KM820672 (NSP2), KM820679 (NSP3), KM820686 (NSP4) y KM820693 (NSP5) 59. Una cepa del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV, CV777) aislada en Bélgica en la década de 1970 se adaptó para el crecimiento en células Vero en la década de 1980 60. En nuestro Laboratorio, el virus fue cultivado a un título de virus infeccioso de 10 6,0 CCID 50/ml (número de adhesión de GenBank: AF353511). Origen de una muestra fecal de lechones lactantes diarreicos. Se recogió una muestra fecal diarreica de un cerdo belga en una granja con un total de 620 cerdas y utilizando un sistema de producción por lotes de 2 semanas, con una edad de destete de 23 días. Se cruzaron cerdas Topigs Norsvin con jabalíes Piétrain, produciendo 32 toxinas (Suiseng, Hipra). Se realizó una vacunación rotavirus sin etiqueta con una vacuna rotavirus A bovina inactivada (Lactovac, Zoetis). Hasta hace poco, los problemas diarreicos eran raramente presentes en los lechones lactantes y también se observaron porcentajes de mortalidad muy bajos (6,2-7,1%). Desde la primavera de 2017, la enfermedad entérica comenzó a causar problemas más graves acompañados de mortalidad en esta finca, principalmente en lechones lactantes de 7 días de edad. Se investigó una muestra fecal diarreica de este tipo de lechones en un laboratorio de diagnóstico privado (Dialab, Belsele, Bélgica) y etiquetada 17V079. No se encontró ninguna causa virológica que explicara los problemas diarreicos en la granja. La única bacteria aislada fue Enterococcus hirae. Esta bacteria fue añadida al programa de vacunación de cerdas (autovacuna inactivada). No se encontraron otros patógenos en esta muestra. Como el cuadro clínico insinuó una causa viral de la enfermedad, la muestra fue enviada al Laboratorio de Virología de la Facultad de Medicina Veterinaria (Universidad de Ghent) para su posterior análisis. La muestra probó negativo para RVA, RVC, PEDV y TGEV utilizando los ensayos internos RT-qPCR 25, 61, 62. Por lo tanto, se decidió realizar un análisis de metagenomía con Minion descrito en este estudio. Purificación de ácidos nucleicos virales. En primer lugar, el enriquecimiento viral se realizó con base en el protocolo NetoVIR para obtener ácidos nucleicos virales puros para la preparación de la biblioteca de secuenciación 13. En el Laboratorio de Virología Clínica (Instituto Rega, KU Leuven) se realizaron análisis Minion de virus cultivados en cultivos celulares RVA y PEDV, mientras que la muestra fecal diarreica fue analizada en el Laboratorio de Virología (Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Gante). Las existencias de RVA y PEDV fueron centrifugadas a 1 El sobrenadante de ambas suspensiones se diluyó a 6 log 10 CCID 50/ml y 500 μl de cada suspensión se mezcló para alcanzar una concentración igual de ambos virus. Esta mezcla se filtró utilizando un filtro de poliéterulfono de 0,8 μm durante 1 min a 17.000 × g, seguido de un tratamiento de nucleasa durante 2 horas a 37 °C para digerir ácidos nucleicos libres en la suspensión: 250 μl de la muestra se añadió a 14 μl de tampón casero (1 M Tris, 100 mM CaCl 2 y 30 mMgCl 2, pH 8), 4 μl de Benzonase Nuclease (Millipore) y 2 μl de Micrococcal Nuclease (NEB) como se describió anteriormente 13. Se agregaron 14 microlitros de EDTA para detener la reacción, seguidos de la extracción de ácidos nucleicos de las partículas virales mediante el kit QIAamp Viral ARN Mini Kit (Qiagen). Se siguieron las instrucciones del fabricante, pero no se añadió ARN portador y se realizó la elución en 30 μl de AVE para concentrar el extracto de ácido nucleico viral. La muestra fecal diarreica 17V079 fue procesada de manera similar como el cultivo celular de virus crecidos, con algunas modificaciones menores. Se realizó una suspensión del 10% w/v de la diarrea en Medio Esencial Mínimo y centrífuga. El sobrenadante fue filtrado a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm (Sarstedt) y tratado con Benzonase Nuclease durante 1 hora para acelerar la tubería diagnóstica. Los ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos fueron calentados a 95 °C durante 2 minutos y refrigerados sobre hielo para resolver las estructuras secundarias de ARN y para desnaturalizar el ARN de doble cadena. Se utilizó Superscript IV Transcriptasa Inversa (ThermoScientific) para generar ADNc. Se mezclaron diez microlitros de ácidos nucleicos plantilla con imprimaciones aleatorias de 0,5 μl (Random Primer 6, New England Biolabs), 1 μl dNTP mix (NEB) y 2,5 μl de agua libre de nucleasa. El primer recocido se realizó a 65 °C durante 5 min, después de lo cual se añadieron 4 μl Superscript IV Reaction Buffer (ThermoScientific), 1 μl ditiothreitol (ThermoScientific) y 1 μl Superscript IV Reverse Transcriptase (ThermoScientific) en un volumen de reacción total de 20 μl. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 23 °C durante 10 min, 50 °C durante 10 min, 80 °C durante 10 min y un paso de retención infinito a 10 °C. Se generó un segundo hilo de ADN a partir de moléculas de ADN de una sola cadena (c) utilizando el kit de síntesis NEBNext Second Strand (NEB). Veinte microlitros mezcla de reacción a la ADNc fueron añadidos a 10 μl NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer, 5 μl NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix y 45 μl de agua libre de nucleasa (80 μl de volumen de reacción total). La amplificación isotérmica se realizó a 16 °C durante 1 h y los ácidos nucleicos de doble cadena fueron purificados utilizando 144 μl de AMPure XP magnética (Beckman Coulter). Se realizaron dos pasos de lavado con etanol recién preparado 70% antes de elutar en 52 μl de agua libre de nucleasa. Cincuenta microlitros de ADN amplificado (no) se mezclaron con 7 μl de buffer Ultra II de reacción de preparación final (New England Biolabs) y 3 μl de mezcla de enzima Ultra II de preparación final (New England Biolabs), y se incubaron a 20 °C durante 5 minutos y 65 °C durante 5 minutos. A continuación, los ácidos nucleicos se purificaron utilizando 60 μl AMPure XP Beads y se eludieron en 31 μl de agua libre de nucleasa. Los adaptadores de secuenciación, provistos con el Kit de secuenciación de ligadura 1D (R9.4) (SQK-LSK108, ONT), se ligaron a los ácidos nucleicos colados dA. El ADN preparado en el extremo (30 μl) se mezcló con una mezcla de adaptadores de 20 μl (AMX, ONT) y 50 μl Blunt/TA Ligation Master Mix (New England Biolabs) en un volumen de reacción total de 100 μl e incubado a temperatura ambiente durante 10 minutos. La biblioteca de secuenciación, que contiene ADN de doble cadena con adaptadores ligados a los extremos 3′, se purificó a continuación utilizando perlas de 40 μl AMPure XP. Se realizaron dos pasos de lavado utilizando un tampón de fijación de cuentas de 140 μl Adaptador (ABB, ONT) antes de salir en 15 μl de tampón de elución (ELB, ONT). (EXP-LLB001, ONT), biblioteca adaptada y atada de 12 μl y agua libre de La secuenciación se realizó utilizando el programa de software MinKNOW software (ONT). Análisis bioinformáticos. Las lecturas en bruto fueron producidas por MinKNOW. Se activaron las llamadas de base en vivo para el primer experimento utilizando MinKNOW versión 1.5.5. En el segundo experimento, se omitió la llamada de base después de la secuenciación usando Albacore (versión 1.2.5., ONT). Se visualizaron puntuaciones de calidad y longitudes de lectura utilizando NanoPlot, seguidas de filtrado de calidad con NanoFilt 63. Se omitieron lecturas con una puntuación q inferior a 7. Se analizaron secuencias utilizando diferentes métodos BLAST, incluyendo BLAST y tBLASTx (BLAST versión 2.6.0; corte de valor electrónico 1e −3 -1e −10 ) para comparar sensibilidad y tiempos de ejecución para detectar secuencias virales entre las lecturas. Una base de datos viral completa se compuso de todas las secuencias de virus en GenBank (taxonomía ID 10239, que contiene secuencias hasta el 17 de septiembre de 2017). El mejor resultado (valor electrónico más bajo) se visualizó utilizando KronaTools 64. Se extrajeron los virus correspondientes utilizando Seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) y se utilizaron en los análisis posteriores. GraphMap (versión 0.5.2) y Samtools (versión 1.6) se utilizaron para cartografiar lecturas contra secuencias de referencia, mientras que Canu 1.6 se utilizó para el ensamblaje de novo de genomas virales [65] [66] [68]. VirSorter se ejecutó utilizando la base de datos 'Viromes' para buscar fagos, con el Modo de Descontaminación Viromérico para identificar Los análisis bioinformáticos se realizaron en un clúster local de computadoras y en las instalaciones informáticas de alto rendimiento de la Universidad de Gante. Los conjuntos de datos generados durante y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente a petición razonable. Secuenciación Sanger del gen polimerasa kobuvirus porcino. Se descubrió un kobuvirus porcino en la muestra 17V079 utilizando el Minion. La secuencia del gen 3D del kobuvirus porcino codifica la polimerasa y se considera que se conserva más entre diferentes cepas. La secuencia exacta de nucleótidos de este virus se verificó utilizando la reacción inversa de la cadena de la polimerasa transcription seguida de la secuencia de Sanger, ya que se obtuvo una baja cobertura con Minion. RT-PCR se ejecutó utilizando el OneStep RT-PCR Kit (Qiagen) con los nuevos imprimadores Kobu_6049Fw y Kobu_7524Rv (IDT DNA Technologies) (Tabla 2). La reacción RT-PCR contenía 5 μl 5 × Qiagen OneStep RT-PCR Buffer, 1 μl dNTPs, 3 μl de cada imprimador (10 μm), 7 μl de agua libre de nucleasa, 1 μl de mezcla enzimática OneStep RT-PCR y 5 μl de ARN plantilla o agua (volumen total de reacción de 25 μl). Las condiciones de RT-PCR fueron las siguientes: 50 °C durante 30 min, 95 °C durante 15 min, seguidas de 30 ciclos de amplificación (94 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 90 s) y un paso de extensión final a 72 °C durante 1 min. Las reacciones se mantuvieron a 10 °C antes de cargar el producto PCR de 5 μl con 1 μl de tinte de carga en un gel de agarosa del 1,5%. La electroforesis se realizó durante 30 min a 100 V y el producto PCR se visualizó mediante tinción de bromuro de etidium y luz UV. El control de calidad de los cromatogramas en bruto se realizó utilizando 4Peaks (Nucleobytes BV, Países Bajos) y BLASTn (NCBI, Estados Unidos).Primeros específicos de RT-qPCR (Tabla 2) para el gen codificador de polimerasa del kobuvirus porcino se diseñaron utilizando Primerquest y Oligoanalyzer (IDT DNA Technologies) para permitir la cuantificación exacta en heces de lechones. Cada reacción RT-qPCR consistió en 10 μl PrecisionPlus OneStep qRT-PCR Mastermix que contenía SYBR Green, ROX y un tinte pipeteado azul inerte (Primerdesign, Southampton, Reino Unido), 0,4 μl de cada imprimador (200 nM) y 6,2 μl de agua libre de nucleasa. Se Un control positivo de ARN sintético (175nt) fue generado por RT-PCR utilizando los imprimadores Kobu3D_qPCR +T7_Fw y Kobu3D_qPCR_Rv, seguido por la transcripción in vitro de este producto PCR utilizando una polimerasa de ARN T7. El control positivo fue medido utilizando Nanodrop y utilizado para establecer una curva estándar sobre un rango dinámico lineal (LDR) de seis a un log 10 copias/reacción. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 55 °C durante 10 min y 95 °C durante 2 min, seguido por 40 ciclos de desnaturalización (95 °C durante 10 s) y recocido (58 °C durante 60 s). La detección de fluorescencia verde SYBR se realizó al final de cada fase de recocido. Se realizó un análisis de curva de fusión para evaluar la Cada punto de dilución en la curva estándar y cada muestra se probó en duplicados. Se analizaron los amplicones una vez en un gel de agarosa para evaluar la longitud correcta del amplicón y se realizó la secuenciación de Sanger para confirmar la amplificación del gen de la polimerasa parcial del kobuvirus porcino. Los ensayos fueron válidos si la eficiencia sobre el LDR estaba entre el 90 y el 110%, y R 2 de la curva estándar replicada fue >0,99. La cuantificación de las cargas virales fue posible si los valores Cq de dos réplicas de qPCR cayeron dentro del LDR del ensayo. Ambas réplicas tuvieron que ser positivas para que una muestra se considerara positiva. Si los valores Cq de los amplicones específicos han caído detrás del punto más bajo de la curva estándar, la muestra fue considerada positiva pero no cuantificable. Tras la caracterización del viroma con el Minion, se realizó un estudio longitudinal de seguimiento entre agosto y septiembre de 2017. Para garantizar el estado de salud del ganado porcino, la entrada a la finca fue estrictamente regulada. El agricultor realizó la toma de muestras. Se proporcionaron instrucciones detalladas y materiales de muestreo al agricultor. La recolección de muestras en el estudio longitudinal de campo se realizó de acuerdo con la legislación europea sobre experimentos con animales. La recogida de muestras fue aprobada y realizada de acuerdo con los requisitos del Comité Ético Local de la Facultad de Medicina Veterinaria e Ingeniería Bioscience de la Universidad de Gante. Un día después del parto de las cerdas, se seleccionaron cinco camadas al azar. Dentro de cada camada, se identificó un lechoncito para el seguimiento longitudinal durante todo el período de lactancia. El hisopo se colocó inmediatamente en 2 ml de medio de transporte viral (salina fosfatada tamponada que contiene 1000 U/ml de penicilina (Continental Pharma, Puurs, Bélgica), 1 mg/ml de estreptomicina (Certa, Braine l′Alleud, Bélgica), 1 mg/ml de gentamicina (Life Technologies) y 0,01% v/v de Fungizona (Bristol-Myers Squibb, Braine l′Alleud, Bélgica)) en un tubo estéril de halcón de 15 ml (Sarstedt) y almacenado a −20 °C. Cada semana se recogieron muestras de la granja y se transportaron al Laboratorio de Virología. Se pidió al agricultor que marcara el tubo de cada muestra para detectar presencia o ausencia de signos diarreicos. A su llegada al Laboratorio de Virología, las muestras fueron descongeladas y colocadas en un agitador durante 30 minutos a 4 °C para liberar partículas virales en el medio de transporte. Las muestras fueron extraídas utilizando el Kit Mini Patógeno QIAamp Cador de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los ácidos nucleicos purificados se eludieron en 100 μl de AVE y se almacenaron a −70 °C hasta el análisis RT-qPCR. El análisis RT-qPCR se realizó, como se describe anteriormente, para cuantificar copias del genoma del kobuvirus porcino por hisopo. Además, se evaluó la eliminación de RVA y RVC utilizando los ensayos RT-qPCR descritos anteriormente en la casa 25, 61. Las muestras fecales (n = 44) de lechones lacrimógenos diarreicos de menos de 2 semanas de edad fueron enviadas a un laboratorio privado por veterinarios (Dialab, Belsele, Bélgica) para diagnóstico etiológico, como se describió anteriormente. Estas muestras fueron recolectadas en 2014 y almacenadas a −70 °C en el laboratorio. Anteriormente habían sido evaluadas para la presencia de rotavirus utilizando RT-qPCR 25. La extracción de ARN se llevó a cabo utilizando el QIAamp Cador Pathogen Mini Kit (Qiagen) como se describió anteriormente y RT-qPCR se realizó para cuantificar la carga de copias de ARN de kobuvirus. Las muestras con carga viral cuantificable fueron sometidas a RT-PCR para amplificar el gen polimerasa 3D, después de lo cual se realizó la secuenciación de Sanger. Las secuencias que codifican la polimerasa de 11 aislados de kobuvirus porcinos belgas fueron depositadas en GenBank con los números de adhesión MH184664-MH184674. Las secuencias fueron utilizadas para realizar una alineación de secuencias múltiples junto con otras cepas de kobuvirus porcino en MEGA 7 usando el plug-in ClustalW 69. Se construyó un árbol filogenético de tipo máximo con RAxML utilizando un modelo reversible de tiempo general con distribución gamma (20 gatos, alfa: 0,121, LogLK = 14938.461) y intercambio de rama heurística 70. La edición de árboles se realizó con Affinity Designer (Serif). Las distancias de pares se calcularon utilizando el modelo de distancia p en Mega con valores de bootstrap establecidos en 500 réplicas.

¿Cuál fue la longitud media de la lectura secuenciada?

La secuenciación de nanoporos como herramienta de diagnóstico revolucionaria para complejos de enfermedades entéricas virales porcinas identifica el kobuvirus porcino como un virus entérico importantehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6026206/SHA: eff8bed68ef6109e8f0c51a8b1ec4b6ca5b6329eAutores: Theuns, Sebastiana; Vanmechelen, Bert; Bernaert, Quinten; Deboutte, Ward; Vandenhole, Marilou; Beller, Leen; Matthijnssens, Jelle; Maes, Piet; Nauwynck, Hans J. Fecha: 2018-06-29DOI: 10.1038/s41598-018-28180-9Licencia: cc-byAbstract: Las enfermedades entéricas en los cerdos a menudo son causadas por diferentes patógenos y por lo tanto la metagenómica son una herramienta útil para el diagnóstico. Las capacidades de secuenciación de nanoporos para diagnósticos virales fueron investigadas aquí. Primero, el virus de la diarrea epidémica porcina de cultivo celular y el rotavirus A fueron agrupados y secuenciados en un Minion. Las lecturas ya fueron detectadas a los 7 segundos del inicio de la secuenciación, resultando en profundidades de alta secuenciación (19.2 a 103.5X) después de 3 h. A continuación, se analizaron las heces diarreicas de un cerdito de una semana de edad. Casi todas las lecturas (99%) pertenecían a bacteriófagos, que pueden haber modificado el microbioma del cer Por otra parte, el kobuvirus porcino se descubrió en las heces por primera vez en Bélgica. Los lechones chupadores eliminan el kobuvirus a partir de una semana de edad, pero durante un estudio de seguimiento no se observaron signos diarreicos y una asociación entre el pico de eliminación viral (10(6.42)–10(7.01) copias/swab) y signos diarreicos. El análisis retrospectivo mostró la difusión (n = 25.56.8% positivo) de kobuvirus genéticamente moderadamente relacionados entre los lechones diarreicos belgas. Minion permite la detección rápida de virus entéricos. Estas nuevas metodologías cambiarán los diagnósticos, pero se deben realizar validaciones más extensas. Debe cuestionarse la verdadera patogenicidad entérica del kobuvirus porcino, mientras que su importancia subclínica no puede excluirse. Texto: la metagenómica es un activo valioso para el diagnóstico en cerdos, lo que lleva al descubrimiento de nuevos virus e identificación de complejos de enfermedades entéricas virales porcinas. Aunque se han desarrollado procedimientos estandarizados para estudiar los metagenomas virales en muestras fecales, todavía requieren una extensa preparación de muestras, incluyendo preamplificación aleatoria o dirigida de genomas virales presentes en la muestra 13. La mayoría de las plataformas de secuenciación todavía requieren inversiones de capital y altas tasas de rotación de muestras para ser rentables. Realizar los análisis necesarios a menudo resulta en largos períodos de tiempo entre la llegada de la muestra y la notificación diagnóstica, ya que los resultados sólo pueden procesarse después de terminar la secuenciación. La secuenciación de tercera generación utilizando Minion (Oxford Nanopore Technologies, ONT) podría ser una herramienta de diagnóstico útil y asequible para la medicina veterinaria porcina, ya que Las células de flujo utilizadas para la secuenciación consisten en una membrana que contiene múltiples proteínas CsgG nanoporas de Escherichia coli 14. Se establece una corriente de iones a través de este poro que resulta en cambios típicos de la corriente tras el paso de nucleótidos específicos. Esta señal se convierte en una secuencia de nucleótidos mediante algoritmos computacionales (basecalling). Desde la liberación de la tecnología Minion, se han hecho grandes avances en cuanto al número y la calidad de las lecturas generadas 15. En el campo de la virología, la tecnología se ha aplicado principalmente en la medicina humana. Utilizando la secuenciación nanopora, fue posible distinguir tres poxvirus con similitud de nucleótidos del 98% a nivel de cepa 16. Minion también se ha utilizado como herramienta diagnóstica durante los recientes brotes de Ébolavirus Junto a un flujo de trabajo de bioinformática basado en ordenador portátil, Minion pudo detectar el virus de Chikungunya, el virus del Ébola y el virus de la hepatitis C en menos de 6 horas utilizando versiones anteriores de la tecnología 19. Un método multiplex PCR para la secuenciación completa del genoma del Zikavirus in situ en muestras con bajas cargas virales ha sido desarrollado recientemente por Quick y compañeros de trabajo 20. Los genomas parciales del virus del dengue fueron amplificados isotérmicamente seguidos de secuenciación, permitiendo la clasificación de cepas en serotipos 21. En la virología veterinaria, el uso de secuenciación del nanoporo está creciendo. Se identificó una nueva especie de papilomavirus en verrugas de jirafas, utilizando amplificación del círculo rodante y secuenciación del nanoporo 22. El genoma completo de un parapoxvirus aislado Un estudio ha reportado la detección del virus de la encefalitis equina venezolana a partir de ARNc no amplificado creado a partir de ARNc poli-A mediante virus cultivados en cultivos celulares 24. Según el conocimiento del autor, el presente estudio es el primero que utiliza Minion como ayuda en el manejo de la salud porcina, con el objetivo de explorar las posibilidades de Minion como herramienta de diagnóstico rápida y fácil de usar en el manejo de la salud porcina para el diagnóstico de complejos de enfermedades entéricas virales. Se evaluó la capacidad de detectar altas cargas de rotavirus y coronavirus cultivados en cultivos celulares, imitando cantidades de derrame observadas en lechones diarreicos. En un segundo caso, se investigó la capacidad de detectar virus (novela) en heces diarreicas de un cerdito de una semana de edad con diarrea. No se realizó preamplificación génica o aleatoria de ácidos nucleicos En este último caso se descubrió un kobuvirus porcino y en adelante se realizó un estudio longitudinal de campo para dilucidar los patrones de eliminación de este virus. Además, se investigaron muestras fecales de archivos (2014) de lechones lacrimógenos diarreicos de menos de dos semanas de edad para la presencia de kobuvirus, para estudiar su epidemiología en Bélgica. se realizaron 243.313 lecturas con una longitud media de 740 nucleótidos. Se filtraron lecturas con una puntuación q inferior a 7, resultando en 177.015 secuencias restantes (longitud media 816 nt) para su uso en análisis aguas abajo. Resultados de la secuenciación, incluyendo clasificación taxonómica y mapeo de lecturas contra genomas de referencia PEDV y rotavirus A (RVA) se muestran en la Fig. 1A. Después de 24 horas de secuenciación, un total de 15.232 lecturas fueron clasificadas como virales por comparación tBLASTx sensible frente a una base de datos viral completa. De éstas, el 39,3% (n = 5.985) y el 10,3% (n = 1.564) fueron asignadas a familias virales que incluían el virus de la diarrea epidémica porcina (familia Coronaviridae) y Rotavirus (familia Reoviridae, subfamilia Sedoreovirinae), respectivamente. Una fracción de las lecturas (29,3%, n = 4.468) fueron asignadas al orden Caudovirales. Estas lecturas se originaron en el ADN del fago lambda utilizado en un control previo en la misma célula de flujo. A los 7,5 y 24,2 segundos después del inicio de la secuenciación, respectivamente, las primeras lecturas coinciden con PEDV y RVA fueron translocadas a través de un 1B). Las secuencias PEDV y RVA fueron extraídas del conjunto de datos y cartografiadas con genes de referencia viral para calcular las profundidades de secuenciación en el tiempo (Fig. 1C). Después de una hora, las profundidades de secuenciación fueron mayores para PEDV (43.0X) que para RVA (4.9 a 22.1X). Se adquirieron profundidades de alta secuenciación después de tres horas de secuenciación para PEDV (103.5X) y para la mayoría de segmentos de genes RVA (19.2 a 48.2X). El ensamblaje de novo se ejecutó en las lecturas filtradas de calidad antes de la identificación (tBLASTx) para recuperar genomas virales, lo que resultó en la recuperación de los segmentos de genoma y gen PEDV casi completos con identidades que variaban entre 95 y 99% en comparación con los genes de referencia (Tabla 1). Sin embargo, la ejecución de ensamblaje de novo antes de la clasificación taxonómica (tBLASTx) redujo el tiempo para identificar genomas virales enteros en el conjunto de datos. La composición del viroma de un cerdito diarreico joven utilizando secuenciación nanopora. Se generaron un total de 30.088 lecturas mediante secuenciación de la muestra fecal diarreica durante tres horas. De éstas, 25.466 lecturas (q-score > 7, longitud media de lectura 653 nt) se utilizaron para análisis adicionales. Se utilizaron diferentes métodos para comparar las lecturas con una base de datos virales utilizando el grupo HPC de la Universidad de Gante y los resultados se muestran en la Fig. 2. La comparación con una base de datos viral completa resultó en la detección de 6.781 a 8.677 lecturas virales potenciales, dependiendo de la configuración BLAST. BLASTn resultó en una rápida Sin embargo, hubo una diferencia muy alta entre los tiempos de pared en el grupo HPC, con sólo 26 segundos de tiempo de análisis para BLASTn, frente a casi 24 horas para tBLASTx. La mayoría de las secuencias fueron asignadas a bacteriófagos dentro del orden Caudovirales y familias Siphoviridae (n = 3.213 a 4.163 lecturas), Podoviridae (n = 2.506 a 3.002 lecturas) y Myoviridae (n = 912 a 1.202 lecturas). Un conjunto de novo fue ejecutado en la base llamada, lecturas filtradas de calidad y los contigs resultantes fueron utilizados como material de entrada para el análisis VirSorter. Diecinueve contigs fueron clasificados como seguros (n = 4; categoría 1), algo seguro (=14; categoría 2) y no tan seguro (=1; categoría 3) ser contigs tipo fago (Fig La comparación de estos contigs con la base de datos de GenBank mediante BLAST permitió su clasificación en cuatro grupos diferentes. Diez contigs mostraron similitudes entre moderado y alto nucleótidos con el fago B124-14 de Bacteroides, lo que sugiere que todos ellos pertenecían a un genoma de fagotos, lo que también fue apoyado por el hecho de que todos estos contigs mapeados bien distribuidos a través del genoma de referencia de Bacteroides fago B124-14 (datos no mostrados). El contig más largo con un tamaño de 39,069 nucleótidos, junto con otros cuatro contigs mostraron similitudes (95% nt identidad) con diferentes fagotos de Escherichia. Dos contigs mostraron poca similitud tanto con el Enterococcus fage vB_EfaS_IME_196, aislado de las aguas residuales hospitalarias en China de una cepa de Enterococcus faecalis, como con el genoma bacteriano Enterococcus hirae. Este último podría ser un profago insertado en el genoma bacteriano. Curiosamente, se identificaron tres contigs para los cuales no se encontraron similitudes con virus existentes en GenBank, pero contig 0105 cartografiado al genoma de referencia del Enterococcus fage vB_EfaS_IME196 (datos no mostrados). Estos podrían ser fagos novedosos o variantes divergentes de los fagos existentes presentes en GenBank. Tres virus porcinos eucariotas, kobuvirus porcino (n = 18 a 22 lecturas), enterovirus G Los géneros Kobuvirus y Enterovirus pertenecen a la familia Picornaviridae, mientras que el género Mamastrovirus pertenece a la familia Astroviridae. Kobuvirus lee que fueron cartografiados contra una cepa europea de referencia S-1/HUN/2007/Hungría, como se muestra en la Fig. 2C. Sin embargo, no se obtuvo cobertura completa del genoma a alta profundidad de secuenciación. Cosechado de kobuvirus porcino y rotavirus en lechones lactantes. La eliminación de kobuvirus porcino, RVA y rotavirus C (RVC) se investigó cuantitativamente en 5 cerdos lactantes de la misma granja de la que se originaron las heces diarreicas. Los patrones de derrame fecal de los diferentes virus y la presencia de signos diarreicos se muestran en la Fig. 3A. Todos los lechones comenzaron a derramar kobuvirus porcino al final de En dos lechones (A y D) el desprendimiento se mantuvo y duró por lo menos 2 semanas (por encima del límite de cuantificación). Los títulos de desprendimiento máximo del kobuvirus porcino variaron entre 6,42 y 7,01 log 10 copias/swab, que es generalmente menor que el desprendimiento máximo observado para virus entéricos típicos como el rotavirus y el PEDV. Además, el pico de desprendimiento no se relacionó con episodios diarreicos, cuestionando el papel de este virus en la patogénesis de la diarrea en la granja. Los signos diarreicos sólo se observaron en dos lechones (A y B). En el lecho B, se observó una asociación entre el desprendimiento alto de VCR y episodios diarreicos. En contraste, no hubo asociación directa entre el desprendimiento máximo de kobuvirus y episodios Curiosamente, se observó un pico en el derrame de kobuvirus en el lechoncito C en el día 11 post-estrechamiento. Este animal murió en breve, pero no estaba claro si esto puede ser atribuible a la infección por kobuvirus. El derrame agudo de RVA se observó al final del período de lactancia en tres de cinco lechones, aunque todas las cerdas fueron vacunadas antes del parto utilizando una vacuna contra el rotavirus inactivada bovina. Análisis retrospectivo de los kobuvirus porcinos que se derramaron en cerdos lactantes diarreicos belgas y análisis filogenético. Un total de 44 muestras fecales diarreicas recogidas en 2014 fueron examinadas para detectar la presencia de kobuvirus utilizando el nuevo RT-qPCR. De estas, 25 muestras (56,8%) probaron positivas y 18 muestras mostraron cargas virales cuantificables (4,31 a 6,83 log 10 copias Siete muestras fueron positivas, pero las cargas virales fueron demasiado bajas para permitir una cuantificación precisa. La presencia de RVA y RVC había sido evaluada cuantitativamente en estas muestras en un estudio previo y la ocurrencia de coinfecciones entre rotavirus y kobuvirus se muestra en la Fig. 3B 25. Kobuvirus se encontró en proporciones iguales en muestras rotavirus negativos y positivos. Doce muestras contenían una única infección por rotavirus con una alta carga de RVA y en cuatro de ellas se observó una alta carga de kobuvirus (5.16 a 5.42 log 10 copias/g). Se encontró una única infección por RVC en siete muestras y en cuatro de ellas se demostró positiva para kobuvirus a altas cargas (4.31 a 5.59 log 10 copias/g). Se observó una infección por RVC/RVC doble en dos muestras, pero no contenía cargas cuantificables por kobuvirus. Muchas (n = 10) de las muestras negativas de rotavirus contenían altas cargas de kobuvirus. La cepa 17V079 mostró una gran similitud con otros aislados belgas de kobuvirus porcino desde 2014 (92,1 a 94,0% de identidad de secuencia de nucleótidos) y con la cepa de referencia húngara S-1/Hun/2017 (93,4%). Además, hubo un alto nivel de variabilidad genética entre los aislados belgas de kobuvirus porcino de 2014, con identidades de secuencia de nucleótidos que oscilaban entre 90,1 y 97,2%. Un análisis filogenético, utilizando el gen 3D de 17V079 y doce aislados belgas de 2014 (fig. 3C), muestra las cepas belgas que se agrupan entre cepas de diferentes lugares geográficos. La prevención y el tratamiento de problemas de enfermedades entéricas en lechones jóvenes se ve frecuentemente obstaculizado Los veterinarios están restringidos a una lista corta de virus conocidos, bacterias, parásitos y factores de manejo para definir un diagnóstico diferencial. Sólo las causas más probables de la enfermedad serán investigadas diagnósticamente, lo que a menudo conduce a resultados negativos, no concluyentes o incompletos. Sin embargo, los estudios de metagenomía han indicado la existencia de complejos de enfermedades entéricas virales, potencialmente involucrando múltiples virus conocidos y novedosos 3, 4, 6, 7, 9, 10. La detección de ácidos nucleicos a partir de patógenos utilizando enfoques metagenómicos basados en NGS es una solución parcial a problemas de pruebas diagnósticas y puede proporcionar una lectura completa de virus y otros patógenos presentes en una muestra. Sin embargo, la mayoría de las plataformas NGS requieren grandes inversiones y el procesamiento de las lecturas sólo puede comenzar al final de la secuenciación. La metagenómica viral también requiere extensas preparaciones de laboratorio, incluyendo centrifugación, filtración y tratamiento de nucleasas para descartar los ácidos nucleicos bacterianos y hospedantes que constituyen la mayor parte de los ácidos nucleicos presentes 13. Además, la cantidad de ácidos nucleicos virales en una muestra es muy baja, requiriendo amplificación específica o aleatoria de estos genomas antes del análisis de NGS. La amplificación puede inducir sesgo y dificulta el desarrollo de tuberías de diagnóstico rápido debido a una pérdida de tiempo considerable. Todos estos factores conducen a un largo tiempo de rotación entre la recolección de muestras y la notificación diagnóstica. El dispositivo de secuenciación de tercera generación Minion (ONT), mantiene la promesa como plataforma diagnóstica, ya que permite secuenciar y análisis en tiempo real de todo el ADN/RN en una muestra, teóricamente sin necesidad de preampl Fue el objetivo del presente estudio evaluar esta tecnología para su uso como herramienta rápida para la identificación del complejo de la enfermedad entérica viral porcina, sin la conducción de amplificación del ácido nucleico viral. En un primer experimento, el cultivo celular de PEDV y RVA, conocidos por inducir diarrea en cerdos jóvenes, fueron agrupados a altas cargas imitando cantidades de derrame en lechones diarreicos. La secuenciación de esta muestra agrupada con el Minion resultó en una rápida identificación de ambos virus. El análisis en tiempo real de las lecturas de secuencia no fue realizado, pero es alcanzable como lo demostraron previamente Greninger y colegas utilizando la tubería de análisis SURPI para la rápida identificación de virus humanos de diferentes matrices clínicas 19. Interesantemente, la primera lectura coincide con PEDV y RVA fueron generadas respectivamente después de 7 y 24 segundos de secuenciación. Se adquirieron profundidades de alta secuenciación (43,0X) dentro de una hora de secuenciación para el PEDV y dentro de tres horas para la mayoría de los once segmentos genéticos del RVA (19,2-48,2X). En general, se generaron profundidades de secuenciación más altas para el PEDV que podrían indicar que la secuenciación de genomas virales más largos está favorecida sobre segmentos genéticos más pequeños, ya que el PEDV tiene un tamaño del genoma de aproximadamente 28 kb, y los segmentos genéticos del RVA son más cortos (0,6 a 3,3 kb). Este sesgo podría haberse introducido durante la ligadura de los adaptadores de secuenciación a los ácidos nucleicos virales. Se puede suponer que los adaptadores están más fácilmente unidos a fragmentos de ADN más largos, y se debe evitar el sesgo mediante la estandarización de la longitud de entrada de ácido nucleico viral. Mientras que la tecnología puede ser útil para dar lecturas rápidas de virus (<3 horas) presentes en una muestra, validación completa, utilizando existencias de virus bien definidas, experimentos de spiking en matrices (por ejemplo, heces) y muestras clínicas reales es necesario para asegurarse de que todos los miembros del complejo de la enfermedad entérica viral porcina están siendo diagnosticados con precisión. Además, la precisión de la tecnología necesita mayor mejora, ya que las tasas de error de los contigs de los conjuntos de novo todavía oscilaban entre 1 y 5%, obstaculizando el análisis preciso de mutaciones sutiles pero importantes en el genoma viral. Después de la identificación exitosa de los virus cultivados por células, el rendimiento de la Minion fue explorado más a fondo mediante el análisis de una muestra fecal diarreica de un lecho de leche de una semana de edad. Se realizaron análisis de PCR en tiempo real para RVA, RVC, PEDV Enterococcus hirae se aisló en un laboratorio de diagnóstico privado, pero esta especie bacteriana no se considera una causa típica de enfermedad diarreica en cerdos 26. La metagenómica viral se realizó en esta muestra utilizando el Minion y se utilizaron dos algoritmos de búsqueda BLAST diferentes para identificar taxonómicamente las lecturas comparándolas con una base de datos viral completa. En general, tBLASTx con un valor e de 10 −3 fue capaz de identificar las lecturas más virales en comparación con otras opciones de búsqueda realizadas. Sin embargo, las opciones de búsqueda de BLASTn también alcanzaron una alta sensibilidad, pero con un costo de tiempo mucho menor: 26 segundos en lugar de casi 24 horas. Para el análisis de lectura rápida y la búsqueda de secuencias virales no divergentes estrechamente relacionadas, BLASTn u otra metodología rápida debería utilizarse de manera preferente. Sin embargo, tBLASTx En la muestra 17V079 se identificaron tres virus porcinos, incluyendo el kobuvirus porcino, el mamastrovirus porcino y el enterovirus G. En un estudio reciente realizado en Tailandia, la diferencia en la prevalencia del astrovirus en las heces diarreicas y no diarreicas de cerdos belgas y en las heces de cerdos de todo el mundo 9,10,27. En un estudio reciente realizado en Tailandia, la diferencia en la prevalencia del astrovirus en las heces diarreicas (8,4%) frente a las no diarreicas (4,6%), los lechones de menos de 4 semanas de edad no fueron estadísticamente significativos. Asimismo, otros estudios han demostrado que el papel del astrovirus porcino en la patogénesis de la diarrea porcina no es completamente claro 28. En contraste, se han establecido asociaciones entre la diarrea y las infecciones por astrovirus humanos 29. Un estudio reciente realizado en 5 países europeos (Hungría, España, Alemania, Austria y Suecia) ha indicado la propagación de los astrovirus porcinos en la población porcina. Se ha encontrado una prevalencia de astrovirus cien veces mayor en cerdos diarreicos y no diarreicos de Austria y España. Los astrovirus porcinos también se han relacionado recientemente con brotes de trastornos neurológicos en lechones destetados de Hungría, y en cerdos y cerdas de 5 semanas de edad en los Estados Unidos 30, 31. El intestino podría ser un puerto hipotético de entrada para tales infecciones neurológicas por astrovirus. Los enterovirus se han relacionado más generalmente con trastornos neurológicos en cerdos, aunque se encuentran comúnmente en heces también 11, 12, [33]. En un estudio de Vietnam, no se encontró ninguna correlación significativa entre el estado de diarrea y la presencia de enterovirus G en heces 35. La participación de los astrovirus y enterovirus en la patogénesis de los trastornos entéricos puede ser cuestionada aquí, pero no se puede descartar completamente. Además, aunque se utilizaron aquí búsquedas sensibles tBLASTx, todavía existe la posibilidad de que un virus completamente nuevo esté presente en la materia oscura de la secuencia lee. Sin embargo, el reporte de un kobuvirus porcino en lechones belgas con Minion es único. En Bélgica, los kobuvirus sólo se habían encontrado anteriormente en muestras diarreicas de terneros y ganado joven en Bélgica 36. En el presente estudio, un nuevo ensayo RT-qPCR, dirigido al gen 3D conservado que codifica la ARN-ARN-polimerasa, fue desarrollado y utilizado para evaluar, por primera vez, la cinética cuantitativa longitudinal de derrame de kobuvirus porcino en cerdos en condiciones de campo. También se analizaron cinéticas similares para el rotavirus porcino A y C. Mientras los lechones lactantes comenzaron a despojarse del kobuvirus porcino a partir de una semana de edad, asociación entre el pico de despojamiento viral (6,42 a 7,01 log 10 copias/swab) y signos diarreicos. En un cerdo, se realizó una asociación entre episodios diarreicos y el pico de despojamiento del rotavirus C, un patógeno entérico bien conocido 37, 38. Muy interesantemente, las cargas fecales del kobuvirus fueron típicamente inferiores a las reportadas de virus entéricos bien descritos de los cuales la patogenicidad ha sido probada utilizando modelos de infección por cerdas, como PEDV y rotavirus [39] [40] [41]. También se encontraron cargas virales similares para el kobuvirus porcino (4,60 ± 1,76 copias/reacción de qPCR) y para el control de cerdos (4,79 ± 1,72 copias/reacción de qPCR) durante un reciente estudio danés para evaluar el papel de los virus en la patogénesis del nuevo síndrome de diarrea porcina neonatal. El estudio demostró que el kobuvirus, el astrovirus, el rotavirus A, el teschovirus porcino, el norovirus porcino y los coronavirus porcinos no estaban involucrados en la patogénesis del síndrome 42. El hallazgo de bajas cargas de kobuvirus en las heces arroja dudas sobre el verdadero tropismo patógeno entérico del virus. Hipotéticamente, es probable que su replicación no se distribuya a través de toda la vellosidad, sino que se limita a enterocitos en las extremidades de la vellosis La presencia de ARN del kobuvirus en el suero también se ha demostrado en cerdos húngaros, pero no se sabía si el virus también se está replicando en otros órganos 43. Tanto la vía orofecal como la alimentación de leche para lactantes cerdos podrían estar involucrados en la transmisión del virus. Las tasas más altas de infección se observaron en lechones lactantes, en comparación con cerdos mayores, en otros países [44] [45] [46]. En nuestro estudio, se observó un derrame relativamente largo de kobuvirus porcino en tres de cada cinco animales, lo que puede indicar que este virus puede inducir infecciones persistentes. Un estudio brasileño de 2011 demostró la presencia de ARN del kobuvirus en el suero de lechones de 3 días, que habían desaparecido para el día 21, indicando el aclaramiento viral de la sangre y excluyendo la persistencia sistémica 45. No se puede excluir una falta total de patogenicidad, ya que los kobuvirus porcinos pueden jugar un papel como virus subclínicamente importante. Estas propiedades subclínicas, aunque inmunosupresoras, se han atribuido al circovirus porcino porcino de importancia económica 47. De interés, uno de los lechones murió en el pico del derrame de kobuvirus, aunque no estaba claro si había causalidad entre la replicación del virus y la muerte del cerdito. Los experimentos in vivo con animales en un modelo de lechones neonatales, convencionales kobuvirus negativos se deben llevar a cabo para elucidar la patogénesis de los kobuvirus porcinos. Se intentó aislar el virus en diferentes líneas celulares (MA104, ST y SK), y células mononucleares de la sangre periférica. No hubo evidencia de efecto citopatógeno después de varios días de incubación. No se disponía de anticuerpos para visualizar la expresión de antígenos y, por lo tanto, no se puede descartar la posibilidad de replicación sin los informes científicos (2018) 8:9830 DOI:10.1038/s41598-018-28180-9 efecto citopatógeno evidente. Se intentará aislar el virus en cultivos enterocíticos primarios porcinos, una vez disponible. Para evaluar más ampliamente la prevalencia del kobuvirus en la industria porcina belga, se realizó un análisis retrospectivo de muestras diarreicas de lechones lactantes de menos de dos semanas de edad. Una proporción elevada (40,9%) de las muestras (n = 44) contenía cargas virales cuantificables que oscilaban entre 4,31 y 6,83 log 10 copias/g de heces. Las cargas virales encontradas fueron comparables a las cargas excretadas por lechones en el análisis longitudinal y el estudio mencionado de Dinamarca, demostrando la presencia endémica del virus en En el presente estudio, no se incluyeron lechones no diarreicos y, por lo tanto, no se puede establecer ninguna asociación entre la prevalencia del kobuvirus y la enfermedad. Sin embargo, la prevalencia del kobuvirus ha sido ampliamente descrita en cerdos de varios países europeos (Países Bajos (16,7%), Eslovaquia (63,4%), Hungría (81,0%), República Checa (87,3%), Austria (46,2%), Italia (52,4%), Alemania (54,5%) y Suecia (45,0%)), países americanos (Estados Unidos (21,9%) y Brasil (53,0%)), países africanos (Kenya (14,9%) y Uganda (15,5%) y países asiáticos (Tailandia (99%), Corea del Sur (52,1%) y Vietnam (29,3%) [44] [45] [46] [48] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [53]. En una pequeña proporción de estos estudios, se demostraron asociaciones estadísticamente significativas entre la prevalencia de kobuvirus y la diarrea en cerdos, como en Hungría (prevalencia de 54,5% en cerdos sanos frente a 92,3% en cerdos diarreicos), España (47,5% en sanos frente a 74,4% en diarreicos), Brasil (41% frente a 78,4%), Tailandia (19,3% frente a 84,5%) y Vietnam (27,6% frente a 40,9%) 35, 45, 46, 52. De hecho, es difícil establecer correlaciones entre la prevalencia del virus y la diarrea, ya que la patogenicidad del virus podría estar influenciada en gran medida por otros factores como las coinfecciones con otros virus entéricos, la microbiota y los factores de manejo. Los aislados belgas mostraron una variabilidad genética moderada a alta, con identidades nucleótidas entre 90,1 y 97,2%. Además, se agruparon difusamente entre cepas de diferentes países del mundo, lo que indica que las cepas no se distinguen por su origen geográfico. Debido a que la mayor parte (99%) de las lecturas generadas durante la secuenciación de la muestra fecal 17V079 emparejaron bacteriófagos tras el análisis con BLAST, los bacteriófagos pueden haber jugado un papel importante en la patogénesis de la enfermedad diarreica. De novo se analizaron contigs ensamblados utilizando VirSorter, un paquete de software para extraer señales virales de datos genómicos microbianos. Tales herramientas permiten maximizar la posibilidad de detectar frágidos dsDNA 54. Varios contigs mostraron similitudes altas con el phage B124-14 de Bacteroides, encontrado en las aguas residuales municipales y muestras fecales humanas. Se demostró que estaba ausente en 30 muestras recogidas de El hallazgo de varios contigs, genéticamente similares a los fagos B124 y probablemente pertenecientes a un genoma de fagos, indica que este fago encontrado en la muestra fecal de cerdo también puede replicarse en el microbioma del intestino del cerdo joven y no sólo en humanos. Sin embargo, es posible que la capacidad de replicación del fago en el intestino del cerdo sea dependiente de la edad y que los grupos de edad muy jóvenes no fueron muestreados en estudios previos. Curiosamente, varios de los contigs encontrados también mostraron similitudes con los fagos de Escherichia. Dos de los contigs fueron similares a los fagos de Escherichia PhAPEC5 y PhAPEC7, aislados de ríos belgas en el barrio de avellanas y conocidos por causar infecciones líticas en Escherichia coli aviar. Las imágenes microscópicas de los fagos PhAPEC5 y PhAPEC7 indicaron que pertenecían a la familia Podoviridae 57. Otros dos contigs fueron similares a dos fagos Escherichia estrechamente relacionados, St11Ph5 y G7C, encontrados en las heces de aguas residuales y caballos, respectivamente 58. Finalmente, uno de los contig mostró similitud limitada a un Enterococcus fage, aislado de las aguas residuales del hospital en China, mientras que un último contig mostró similitudes moderadas con el genoma bacteriano Enterococcus hirae. Esta región puede ser un profago, insertado en el genoma bacteriano. Los fagos encontrados en este lechoncillo pueden haber remodelado la microbiota intestinal, permitiendo que bacterias oportunistas como Enterococcus hirae proliferen y comiencen a secretar toxinas. También es posible que una infección fagosa de bacterias en el intestino del cerdo llevó a un estado de estrés para estas bacterias, provocando la secreción de toxinas. El nuevo síndrome de diarrea neonatal descrito anteriormente muestra altas similitudes con la enfermedad descrita en el caso 17V079 y puede ser que los bacteriófagos están involucrados en la patogénesis de este síndrome. Hasta ahora, el papel de los fagos no se ha considerado en la patogénesis de varios trastornos entéricos, pero dada la gran abundancia aquí, debe ser en estudios futuros. Está claro que las nuevas tecnologías cambiarán la forma en que se realizan los diagnósticos en el futuro próximo. La fijación de precios podría ser actualmente un aspecto que obstaculiza el análisis de muestras de alta resistencia en la medicina veterinaria porcina, pero a medida que la tecnología evoluciona rápidamente, esto podría ser muy menos relevante. En una única lectura, en lugar de requerir diferentes ensayos diagnósticos, se dará una visión general completa de todos los virus y otros patógenos de una muestra. Sin embargo, se debe tener cuidado con la interpretación de tales resultados, ya que sólo deben ser analizados por veterinarios entrenados. Virus. Rotavirus porcino A (RVA) cepa RVA/Pig-tc/BEL/12R046/2012/G9P [23] se aisló de un cerdito diarreico y creció durante tres pasajes sucesivos en células MA104 a un título de virus infeccioso de 10 7,8 CCID 50 / ml. Las secuencias de nucleótidos de los 11 segmentos genéticos de esta cepa se resolvieron antes utilizando la secuenciación de Sanger (números de adhesión de GenBank: KM82070 (VP1), KM820707 (VP2), KM827014 (VP3), KM820720 (VP4), KM820728 (VP6), KM820735 (VP7), KM820742 (NSP1), KM820672 (NSP2), KM820679 (NSP3), KM820686 (NSP4) y KM820693 (NSP5) 59. Una cepa del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV, CV777) aislada en Bélgica en la década de 1970 se adaptó para el crecimiento en células Vero en la década de 1980 60. En nuestro Laboratorio, el virus fue cultivado a un título de virus infeccioso de 10 6,0 CCID 50/ml (número de adhesión de GenBank: AF353511). Origen de una muestra fecal de lechones lactantes diarreicos. Se recogió una muestra fecal diarreica de un cerdo belga en una granja con un total de 620 cerdas y utilizando un sistema de producción por lotes de 2 semanas, con una edad de destete de 23 días. Se cruzaron cerdas Topigs Norsvin con jabalíes Piétrain, produciendo 32 toxinas (Suiseng, Hipra). Se realizó una vacunación rotavirus sin etiqueta con una vacuna rotavirus A bovina inactivada (Lactovac, Zoetis). Hasta hace poco, los problemas diarreicos eran raramente presentes en los lechones lactantes y también se observaron porcentajes de mortalidad muy bajos (6,2-7,1%). Desde la primavera de 2017, la enfermedad entérica comenzó a causar problemas más graves acompañados de mortalidad en esta finca, principalmente en lechones lactantes de 7 días de edad. Se investigó una muestra fecal diarreica de este tipo de lechones en un laboratorio de diagnóstico privado (Dialab, Belsele, Bélgica) y etiquetada 17V079. No se encontró ninguna causa virológica que explicara los problemas diarreicos en la granja. La única bacteria aislada fue Enterococcus hirae. Esta bacteria fue añadida al programa de vacunación de cerdas (autovacuna inactivada). No se encontraron otros patógenos en esta muestra. Como el cuadro clínico insinuó una causa viral de la enfermedad, la muestra fue enviada al Laboratorio de Virología de la Facultad de Medicina Veterinaria (Universidad de Ghent) para su posterior análisis. La muestra probó negativo para RVA, RVC, PEDV y TGEV utilizando los ensayos internos RT-qPCR 25, 61, 62. Por lo tanto, se decidió realizar un análisis de metagenomía con Minion descrito en este estudio. Purificación de ácidos nucleicos virales. En primer lugar, el enriquecimiento viral se realizó con base en el protocolo NetoVIR para obtener ácidos nucleicos virales puros para la preparación de la biblioteca de secuenciación 13. En el Laboratorio de Virología Clínica (Instituto Rega, KU Leuven) se realizaron análisis Minion de virus cultivados en cultivos celulares RVA y PEDV, mientras que la muestra fecal diarreica fue analizada en el Laboratorio de Virología (Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Gante). Las existencias de RVA y PEDV fueron centrifugadas a 1 El sobrenadante de ambas suspensiones se diluyó a 6 log 10 CCID 50/ml y 500 μl de cada suspensión se mezcló para alcanzar una concentración igual de ambos virus. Esta mezcla se filtró utilizando un filtro de poliéterulfono de 0,8 μm durante 1 min a 17.000 × g, seguido de un tratamiento de nucleasa durante 2 horas a 37 °C para digerir ácidos nucleicos libres en la suspensión: 250 μl de la muestra se añadió a 14 μl de tampón casero (1 M Tris, 100 mM CaCl 2 y 30 mMgCl 2, pH 8), 4 μl de Benzonase Nuclease (Millipore) y 2 μl de Micrococcal Nuclease (NEB) como se describió anteriormente 13. Se agregaron 14 microlitros de EDTA para detener la reacción, seguidos de la extracción de ácidos nucleicos de las partículas virales mediante el kit QIAamp Viral ARN Mini Kit (Qiagen). Se siguieron las instrucciones del fabricante, pero no se añadió ARN portador y se realizó la elución en 30 μl de AVE para concentrar el extracto de ácido nucleico viral. La muestra fecal diarreica 17V079 fue procesada de manera similar como el cultivo celular de virus crecidos, con algunas modificaciones menores. Se realizó una suspensión del 10% w/v de la diarrea en Medio Esencial Mínimo y centrífuga. El sobrenadante fue filtrado a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm (Sarstedt) y tratado con Benzonase Nuclease durante 1 hora para acelerar la tubería diagnóstica. Los ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos fueron calentados a 95 °C durante 2 minutos y refrigerados sobre hielo para resolver las estructuras secundarias de ARN y para desnaturalizar el ARN de doble cadena. Se utilizó Superscript IV Transcriptasa Inversa (ThermoScientific) para generar ADNc. Se mezclaron diez microlitros de ácidos nucleicos plantilla con imprimaciones aleatorias de 0,5 μl (Random Primer 6, New England Biolabs), 1 μl dNTP mix (NEB) y 2,5 μl de agua libre de nucleasa. El primer recocido se realizó a 65 °C durante 5 min, después de lo cual se añadieron 4 μl Superscript IV Reaction Buffer (ThermoScientific), 1 μl ditiothreitol (ThermoScientific) y 1 μl Superscript IV Reverse Transcriptase (ThermoScientific) en un volumen de reacción total de 20 μl. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 23 °C durante 10 min, 50 °C durante 10 min, 80 °C durante 10 min y un paso de retención infinito a 10 °C. Se generó un segundo hilo de ADN a partir de moléculas de ADN de una sola cadena (c) utilizando el kit de síntesis NEBNext Second Strand (NEB). Veinte microlitros mezcla de reacción a la ADNc fueron añadidos a 10 μl NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer, 5 μl NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix y 45 μl de agua libre de nucleasa (80 μl de volumen de reacción total). La amplificación isotérmica se realizó a 16 °C durante 1 h y los ácidos nucleicos de doble cadena fueron purificados utilizando 144 μl de AMPure XP magnética (Beckman Coulter). Se realizaron dos pasos de lavado con etanol recién preparado 70% antes de elutar en 52 μl de agua libre de nucleasa. Cincuenta microlitros de ADN amplificado (no) se mezclaron con 7 μl de buffer Ultra II de reacción de preparación final (New England Biolabs) y 3 μl de mezcla de enzima Ultra II de preparación final (New England Biolabs), y se incubaron a 20 °C durante 5 minutos y 65 °C durante 5 minutos. A continuación, los ácidos nucleicos se purificaron utilizando 60 μl AMPure XP Beads y se eludieron en 31 μl de agua libre de nucleasa. Los adaptadores de secuenciación, provistos con el Kit de secuenciación de ligadura 1D (R9.4) (SQK-LSK108, ONT), se ligaron a los ácidos nucleicos colados dA. El ADN preparado en el extremo (30 μl) se mezcló con una mezcla de adaptadores de 20 μl (AMX, ONT) y 50 μl Blunt/TA Ligation Master Mix (New England Biolabs) en un volumen de reacción total de 100 μl e incubado a temperatura ambiente durante 10 minutos. La biblioteca de secuenciación, que contiene ADN de doble cadena con adaptadores ligados a los extremos 3′, se purificó a continuación utilizando perlas de 40 μl AMPure XP. Se realizaron dos pasos de lavado utilizando un tampón de fijación de cuentas de 140 μl Adaptador (ABB, ONT) antes de salir en 15 μl de tampón de elución (ELB, ONT). (EXP-LLB001, ONT), biblioteca adaptada y atada de 12 μl y agua libre de La secuenciación se realizó utilizando el programa de software MinKNOW software (ONT). Análisis bioinformáticos. Las lecturas en bruto fueron producidas por MinKNOW. Se activaron las llamadas de base en vivo para el primer experimento utilizando MinKNOW versión 1.5.5. En el segundo experimento, se omitió la llamada de base después de la secuenciación usando Albacore (versión 1.2.5., ONT). Se visualizaron puntuaciones de calidad y longitudes de lectura utilizando NanoPlot, seguidas de filtrado de calidad con NanoFilt 63. Se omitieron lecturas con una puntuación q inferior a 7. Se analizaron secuencias utilizando diferentes métodos BLAST, incluyendo BLAST y tBLASTx (BLAST versión 2.6.0; corte de valor electrónico 1e −3 -1e −10 ) para comparar sensibilidad y tiempos de ejecución para detectar secuencias virales entre las lecturas. Una base de datos viral completa se compuso de todas las secuencias de virus en GenBank (taxonomía ID 10239, que contiene secuencias hasta el 17 de septiembre de 2017). El mejor resultado (valor electrónico más bajo) se visualizó utilizando KronaTools 64. Se extrajeron los virus correspondientes utilizando Seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) y se utilizaron en los análisis posteriores. GraphMap (versión 0.5.2) y Samtools (versión 1.6) se utilizaron para cartografiar lecturas contra secuencias de referencia, mientras que Canu 1.6 se utilizó para el ensamblaje de novo de genomas virales [65] [66] [68]. VirSorter se ejecutó utilizando la base de datos 'Viromes' para buscar fagos, con el Modo de Descontaminación Viromérico para identificar Los análisis bioinformáticos se realizaron en un clúster local de computadoras y en las instalaciones informáticas de alto rendimiento de la Universidad de Gante. Los conjuntos de datos generados durante y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente a petición razonable. Secuenciación Sanger del gen polimerasa kobuvirus porcino. Se descubrió un kobuvirus porcino en la muestra 17V079 utilizando el Minion. La secuencia del gen 3D del kobuvirus porcino codifica la polimerasa y se considera que se conserva más entre diferentes cepas. La secuencia exacta de nucleótidos de este virus se verificó utilizando la reacción inversa de la cadena de la polimerasa transcription seguida de la secuencia de Sanger, ya que se obtuvo una baja cobertura con Minion. RT-PCR se ejecutó utilizando el OneStep RT-PCR Kit (Qiagen) con los nuevos imprimadores Kobu_6049Fw y Kobu_7524Rv (IDT DNA Technologies) (Tabla 2). La reacción RT-PCR contenía 5 μl 5 × Qiagen OneStep RT-PCR Buffer, 1 μl dNTPs, 3 μl de cada imprimador (10 μm), 7 μl de agua libre de nucleasa, 1 μl de mezcla enzimática OneStep RT-PCR y 5 μl de ARN plantilla o agua (volumen total de reacción de 25 μl). Las condiciones de RT-PCR fueron las siguientes: 50 °C durante 30 min, 95 °C durante 15 min, seguidas de 30 ciclos de amplificación (94 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 90 s) y un paso de extensión final a 72 °C durante 1 min. Las reacciones se mantuvieron a 10 °C antes de cargar el producto PCR de 5 μl con 1 μl de tinte de carga en un gel de agarosa del 1,5%. La electroforesis se realizó durante 30 min a 100 V y el producto PCR se visualizó mediante tinción de bromuro de etidium y luz UV. El control de calidad de los cromatogramas en bruto se realizó utilizando 4Peaks (Nucleobytes BV, Países Bajos) y BLASTn (NCBI, Estados Unidos).Primeros específicos de RT-qPCR (Tabla 2) para el gen codificador de polimerasa del kobuvirus porcino se diseñaron utilizando Primerquest y Oligoanalyzer (IDT DNA Technologies) para permitir la cuantificación exacta en heces de lechones. Cada reacción RT-qPCR consistió en 10 μl PrecisionPlus OneStep qRT-PCR Mastermix que contenía SYBR Green, ROX y un tinte pipeteado azul inerte (Primerdesign, Southampton, Reino Unido), 0,4 μl de cada imprimador (200 nM) y 6,2 μl de agua libre de nucleasa. Se Un control positivo de ARN sintético (175nt) fue generado por RT-PCR utilizando los imprimadores Kobu3D_qPCR +T7_Fw y Kobu3D_qPCR_Rv, seguido por la transcripción in vitro de este producto PCR utilizando una polimerasa de ARN T7. El control positivo fue medido utilizando Nanodrop y utilizado para establecer una curva estándar sobre un rango dinámico lineal (LDR) de seis a un log 10 copias/reacción. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 55 °C durante 10 min y 95 °C durante 2 min, seguido por 40 ciclos de desnaturalización (95 °C durante 10 s) y recocido (58 °C durante 60 s). La detección de fluorescencia verde SYBR se realizó al final de cada fase de recocido. Se realizó un análisis de curva de fusión para evaluar la Cada punto de dilución en la curva estándar y cada muestra se probó en duplicados. Se analizaron los amplicones una vez en un gel de agarosa para evaluar la longitud correcta del amplicón y se realizó la secuenciación de Sanger para confirmar la amplificación del gen de la polimerasa parcial del kobuvirus porcino. Los ensayos fueron válidos si la eficiencia sobre el LDR estaba entre el 90 y el 110%, y R 2 de la curva estándar replicada fue >0,99. La cuantificación de las cargas virales fue posible si los valores Cq de dos réplicas de qPCR cayeron dentro del LDR del ensayo. Ambas réplicas tuvieron que ser positivas para que una muestra se considerara positiva. Si los valores Cq de los amplicones específicos han caído detrás del punto más bajo de la curva estándar, la muestra fue considerada positiva pero no cuantificable. Tras la caracterización del viroma con el Minion, se realizó un estudio longitudinal de seguimiento entre agosto y septiembre de 2017. Para garantizar el estado de salud del ganado porcino, la entrada a la finca fue estrictamente regulada. El agricultor realizó la toma de muestras. Se proporcionaron instrucciones detalladas y materiales de muestreo al agricultor. La recolección de muestras en el estudio longitudinal de campo se realizó de acuerdo con la legislación europea sobre experimentos con animales. La recogida de muestras fue aprobada y realizada de acuerdo con los requisitos del Comité Ético Local de la Facultad de Medicina Veterinaria e Ingeniería Bioscience de la Universidad de Gante. Un día después del parto de las cerdas, se seleccionaron cinco camadas al azar. Dentro de cada camada, se identificó un lechoncito para el seguimiento longitudinal durante todo el período de lactancia. El hisopo se colocó inmediatamente en 2 ml de medio de transporte viral (salina fosfatada tamponada que contiene 1000 U/ml de penicilina (Continental Pharma, Puurs, Bélgica), 1 mg/ml de estreptomicina (Certa, Braine l′Alleud, Bélgica), 1 mg/ml de gentamicina (Life Technologies) y 0,01% v/v de Fungizona (Bristol-Myers Squibb, Braine l′Alleud, Bélgica)) en un tubo estéril de halcón de 15 ml (Sarstedt) y almacenado a −20 °C. Cada semana se recogieron muestras de la granja y se transportaron al Laboratorio de Virología. Se pidió al agricultor que marcara el tubo de cada muestra para detectar presencia o ausencia de signos diarreicos. A su llegada al Laboratorio de Virología, las muestras fueron descongeladas y colocadas en un agitador durante 30 minutos a 4 °C para liberar partículas virales en el medio de transporte. Las muestras fueron extraídas utilizando el Kit Mini Patógeno QIAamp Cador de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los ácidos nucleicos purificados se eludieron en 100 μl de AVE y se almacenaron a −70 °C hasta el análisis RT-qPCR. El análisis RT-qPCR se realizó, como se describe anteriormente, para cuantificar copias del genoma del kobuvirus porcino por hisopo. Además, se evaluó la eliminación de RVA y RVC utilizando los ensayos RT-qPCR descritos anteriormente en la casa 25, 61. Las muestras fecales (n = 44) de lechones lacrimógenos diarreicos de menos de 2 semanas de edad fueron enviadas a un laboratorio privado por veterinarios (Dialab, Belsele, Bélgica) para diagnóstico etiológico, como se describió anteriormente. Estas muestras fueron recolectadas en 2014 y almacenadas a −70 °C en el laboratorio. Anteriormente habían sido evaluadas para la presencia de rotavirus utilizando RT-qPCR 25. La extracción de ARN se llevó a cabo utilizando el QIAamp Cador Pathogen Mini Kit (Qiagen) como se describió anteriormente y RT-qPCR se realizó para cuantificar la carga de copias de ARN de kobuvirus. Las muestras con carga viral cuantificable fueron sometidas a RT-PCR para amplificar el gen polimerasa 3D, después de lo cual se realizó la secuenciación de Sanger. Las secuencias que codifican la polimerasa de 11 aislados de kobuvirus porcinos belgas fueron depositadas en GenBank con los números de adhesión MH184664-MH184674. Las secuencias fueron utilizadas para realizar una alineación de secuencias múltiples junto con otras cepas de kobuvirus porcino en MEGA 7 usando el plug-in ClustalW 69. Se construyó un árbol filogenético de tipo máximo con RAxML utilizando un modelo reversible de tiempo general con distribución gamma (20 gatos, alfa: 0,121, LogLK = 14938.461) y intercambio de rama heurística 70. La edición de árboles se realizó con Affinity Designer (Serif). Las distancias de pares se calcularon utilizando el modelo de distancia p en Mega con valores de bootstrap establecidos en 500 réplicas.

¿Qué cepa fue similar a otras cepas de kobuvirus porcino belgas?

C. difficile 630Δerm Spo0A regula la esporulación, pero no contribuye a la producción de toxinas, mediante la unión directa de alta afinidad al ADNhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3485338/SHA: f0fb3bbd96dad4c907c7fd456cd5783ed8fa7bd6Autores: Rosenbusch, Katharina E.; Bakker, Dennis; Kuijper, Ed J.; Smits, Wiep KlaasFecha: 2012-10-31DOI: 10.1371/journal.pone.0048608Licencia: cc-byAbstract: Clostridium difficile es una bacteria grampositiva, anaerobia que puede formar endosporos La bacteria es el agente causal de la infección por C. difficile (CDI), para la cual los síntomas pueden variar desde una leve diarrea hasta colitis pseudomembranosa potencialmente fatal y megacolon tóxico. La formación endoespora en Firmicutes, incluyendo C. difficile, está gobernada por el regulador clave para la esporulación, Spo0A. En Bacillus subtilis, este factor de transcripción también está implicado directa o indirectamente en varios otros procesos celulares. Aquí, informamos que C. difficile Spo0A muestra un alto grado de similitud con la proteína B. subtilis bien caracterizada y reconoce una secuencia de unión similar. Encontramos que la cepa de laboratorio C. difficile 630Δerm contiene una duplicación de 18bp cerca del dominio de unión al ADN en comparación con su cepa ancestral 630. Los ensayos de unión in vitro mediante el dominio de unión al ADN C-terminal purificado de la proteína C. difficile Spo0A demuestran la unión directa al ADN aguas arriba de spo0A y sigH, genes de esporulación temprana y varios otros objetivos putativos. Los ensayos de unión in vitro sugieren que el gen que codifica la principal toxina clostridial TcdB puede ser un objetivo directo de Spo0A, pero sobrenadante derivado de una cepa negativa spo0A no fue menos tóxico para las células Vero que el obtenido de una cepa de tipo salvaje, en contraste con informes anteriores. Estos resultados identifican por primera vez los objetivos directos (putativos) de la proteína Spo0A en C. difficile y hacen un efecto positivo de Spo0A en la producción de las grandes toxinas clostridiales improbables. Texto: La esporulación es una estrategia adaptativa que permite a las bacterias sobrevivir a duras condiciones ambientales durante períodos prolongados de tiempo, y es una parte integral de la transmisión de patógenos esporulares y su tolerancia y resistencia a los compuestos antimicrobianos. Spo0A es el regulador clave para la esporulación [1, 2]. La mayor parte de nuestro conocimiento sobre la proteína se basa en el trabajo en Bacilli. Spo0A es un regulador de respuesta que demuestra la unión dependiente de la fosforilación al ADN [3] [5]. La fosforilación se produce a través de la acción concertada de varias proteínas que juntos forman una llamada fosforelay [6]. La cascada de señalización permite la integración de señales ambientales en la regulación de procesos dependientes de Spo0A, incluyendo la esporulación. Los dos dominios funcionales, el dominio de fosforilación y dimerización N-terminal (dominio receptor) y el dominio de unión al ADN C-terminal (efector) están separados por una región bisagra que está relativamente mal conservada [7]. Se cree que la fosforilación resulta en un reordenamiento estructural que facilita la dimerización [8, 9], resultando en la interrupción de los contactos de transcripción-inhibidores entre los dominios receptor y efector. El dominio aislado de unión al ADN puede unir objetivos legítimos de la proteína Spo0A debido a la ausencia de contactos inhibidores de transcripción, evitando así la necesidad de fosforilación [10]. La caracterización extensa de los objetivos Spo0A ha revelado un motivo que representa un sitio de unión Spo0A de alta afinidad, el recuadro 0A [10, 11]. La estructura cristalina del dominio de unión al ADN confirma los contactos específicos y no específicos entre la proteína y la secuencia de consenso [12, 13]. Cabe destacar que Spo0A regula muchos otros procesos además de la esporulación, como la competencia para la transformación genética, la replicación del ADN y la formación de biopelículas en B. subtilis [14] [15] [16], los factores de virulencia y las respuestas de estrés en, por ejemplo, B. anthracis y B. turingiensis [17] [18] [19] [20] [20], y la producción de disolventes en Clostridium acetobutilicum [22, 23]. C. difficile es una bacteria grampositiva y anaerobia que es el agente causal de la infección por C. difficile (CDI) Aunque muchas personas son colonizadas asintomáticamente por C. difficile, la bacteria puede causar graves problemas de salud, como la colitis pseudomembranosa y el megacolon tóxico, bajo la influencia de factores de riesgo como la edad y el uso de antibióticos. Como resultado, la CDI fue considerada durante mucho tiempo una infección nosocomial. Sin embargo, recientemente, se puede observar un aumento en los casos de CDI adquirida por la comunidad [26]. Los brotes de CDI se han relacionado con las denominadas cepas hipervirulentas, como los ribotipos PCR 027 (BI/ NAP1) y 078 [27, 28]. Sus principales factores de virulencia son las principales toxinas clostridiales A y B [29, 30]. Además, algunas cepas de C. difficile, incluyendo ribotipos 027 y 078, C. difficile se transmite a través de la vía fecal-oral. Se cree que las esporas son cruciales para infectar con éxito a nuevos huéspedes, ya que son capaces de soportar el ambiente duro del estómago, y sobrevivir a los tratamientos antibióticos que alteran la flora endógena, después de lo cual C. difficile puede sobrecrecer [24, 25]. Hay un conocimiento limitado sobre la regulación de la esporulación en C. difficile. Se ha reportado que espo0A, como se espera, es necesario para la formación de esporas [33] y el gen es necesario para la persistencia y transmisión en ratones [34]. Aunque las vías aguas abajo de Spo0A parecen en gran medida conservadas entre B. subtilis y Clostridia, esto es menos para las vías que conducen a la activación de Spo0A [2]. Se ha sugerido que la histidina cinasa huérfana CD2492 está involucrada en la activación de Spo0A [35]. De manera similar, se informó que múltiples quinasas histidina huérfanas pueden fosforilar Spo0A en C. acetobutilicum [36]. Recientemente, se informó que spo0A se puede transcribir de un promotor dependiente de SigH [37]. Se desconoce qué genes están regulados por la unión directa de Spo0A a sus regiones anteriores. Aquí, se establece un ensayo de unión in vitro para C. difficile Spo0A y demostrar por primera vez la unión directa de este factor de transcripción al ADN aguas arriba de varios genes de destino putativo. Las cepas de Escherichia coli fueron cultivadas rutinariamente en el caldo o placas Luria-Bertani, complementadas con antibióticos apropiados. El cloramfenicol se utilizó a una concentración final de 20 mg/ml para las placas de agar y 10 mg/ml para los cultivos líquidos. La ampicilina se utilizó a una concentración final de 100 mg/ml. La canamicina se utilizó a una concentración final de 20 mg/ml. La clonación se llevó a cabo utilizando E. coli DH5a, se realizó una sobreexpresión en E. coli Rosetta(DE3) pLysS (Novagen). Las cepas difficiles se cultivaron en un medio a base de tripton-levadura sin glucosa (TTY; 3% w/v bactotrypton (BD), 2% extracto de levadura (Fluka), 0,1% w/v tioglicol (Sigma) pH 7,4), complementado con 20 mg/ml de lincomycina cuando fue apropiado, o en placas CLO o TSS Todos los plásmidos están listados en la Tabla 1. Los primeros (obtenidos de Sigma Aldrich) están listados en el Texto S1 y las condiciones específicas de ciclismo están disponibles bajo petición. Salvo que se indique lo contrario, las reacciones PCR se llevaron a cabo utilizando Pfu polimerasa (Fermentas) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PWKS1251, Plasmid pWKS1251, para la sobreproducción de Spo0A-DBD con una C-terminal 66His-tag, fue construida de la siguiente manera. Una secuencia correspondiente al dominio de unión del ADN de Spo0A fue amplificada usando los primeros oWKS-1123a y oWKS-1124 usando ADN cromosómico de C. difficile cepa 630Derm como plantilla. El fragmento resultante fue clonado en pCR2.1-TOPO (In Este plásmido fue digerido con NdeI y XhoI, separado en un gel de agarosa al 1%/0,56 TAE (20 mM Tris Acetato, 0,5 mM EDTA), el fragmento correspondiente al dominio de unión al ADN fue recuperado por aislamiento del gel (utilizando un kit de extracción del gel GeneJET, Fermentas) y clonado en pMF14 similarmente digerido [10] que había sido aislado del gel de la misma manera. El constructo fue verificado por PCR, análisis de restricción y secuenciación del ADN utilizando imprimaciones oWKS-135 y oWKS-136 (ver abajo). Plasmid pWKS1245, para la producción de Spo0A de longitud completa con un C-terminal 6xHis-tag, fue construido de manera similar utilizando ADN cromosómico de C. difficile 630Derm como plantilla, pero utilizando el producto PCR de los imprimadores oWKS-1122 y oWKS-1123a. Los plásmidos utilizados como plantillas PCR para generar sondas EMSA fueron construidos clonando los productos PCR en pCR2.1-TOPO. Los insertos, y en el caso de los promotores de PabrB mutados, la presencia de las mutaciones de puntos deseadas en la caja de consenso 0A, fueron verificados mediante secuenciación de ADN usando primers oWKS-24 y oWKS-25 (ver abajo). Los plásmidos de grado secuencial se aislaron utilizando un kit de Nucleospin Plasmid QuickPure (Macherey Nagel) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que dos reacciones de lisis se combinaron en un solo filtro y se eludieron con buffer AE precalentado de 65uC. Todos los constructos se secuenciaron utilizando química BigDye Terminator (Invitrogen) en un secuenciador ABI3130 (Perkin Elmer), de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. En resumen,,200 ng de plásmido se mezclaron con 3,2 pmol de imprimación, 1 mL Terminator Ready Reaction Mix (Invitrogen) en un volumen final de 20 mL. Después del termociclado, el ADN se precipitó y lavó con un 65% de isopropanol y se disolvió en 12 mL HiDi formamid (Invitrogen) a 96uC durante 2 minutos y se almacenó en la oscuridad a 4uC hasta la secuenciación. Se realizaron análisis de secuencias en CloneManager Professional Suite 7 (SciEd) y Geneious versión 5.6.2 (Biomatters Ltd). Plasmids pWKS1245 y pWKS1251 se transformaron en E. coli Rosetta(DE3) pLysS (Novagen). Se utilizaron transformadores para inocular 25 mL de LB con antibióticos apropiados. Después de la incubación nocturna, las células fueron 1:100 diluidas en medio fresco de 500 mL que contenía antibióticos apropiados. La producción proteica se indujo con 1 mM Las células se lavaban con PBS helado y se almacenaban en 280uC para su uso posterior. La purificación de las proteínas se realizó esencialmente como se describe [10]. En resumen, las células se interrumpieron en 4 mL de tampón de lisis (2 mM PMSF, 10 mM imidazol, 5 mM beta-mercaptoetanol, 300 mM NaCl, 50 mM NaH 2 PO 4, pH 7,9). Se incubaron células limpias con 2 mL preequilibradas 50% TALON slurry (Clontech) en un volumen final de 15 mL dysis tampón para 1 hora. Se permitió que la resina se asentara en una columna de Polipreparación (BioRad) y se lavaba con 2 mL de tampón de lavado (20 mM imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM NaH La proteína se eludió por etapas en fracciones de 1 mL después de aplicar un tampón de dilución de 2 mL a la columna (idéntico al tampón de lavado pero con 50, 100, 250 o 500 mM de imidazol). Todo el procedimiento se llevó a cabo a 4uC. Se evaluaron las fracciones de pureza y rendimiento y se dializaron fracciones adecuadas contra 26 tampón de diálisis de 1L (50 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT) utilizando casetes Slide-A-Lyzer con un corte molecular de 3,5 kDa (Pierce). Las proteínas se almacenaron a 280uC en tampón de almacenamiento (idéntico al tampón de diálisis pero que contenía 20% de glicerol). Las concentraciones de proteínas se determinaron utilizando reactivo Bradford (BioRad), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de ADN para uso en el experimento EMSA fueron generados por PCR utilizando GoTaq polimerasa (Promega) y ADN cromosómico de B. subtilis JH642 (Bacillus Genetic Stock Center 1A96; http://www.bgsc.org), plásmidos listados en la Tabla 1, o ADN cromosómico de C. difficile 630Derm [38] como plantilla. Los primeros y condiciones específicas de ciclo para la generación de las sondas EMSA se enumeran en el texto S1. Los fragmentos de ADN del tamaño esperado fueron aislados de un gel nativo de poliacrilamida 16TAE/8% utilizando tampón de difusión (acetato de amonio de 0,5 M, acetato de magnesio de 10 mM, 1 mM EDTA pH 8, 0,1% SDS) y un kit QIAExII (Qia El ADN recuperado fue marcado con 32P-c-ATP utilizando tampón FR y quinasa T4 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se determinó la actividad específica en un contador de centelleo LS6000 (Beckman). Las condiciones de EMSA se basaron en estudios previos [10]. En resumen, se realizaron reacciones de unión en tampón de unión (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glicerol) en presencia de 200 mg/ml de albúmina sérica bovina (NEB) y 200 cpm/ml de fragmento de ADN radiomarcado. Las reacciones se incubaron durante 20 minutos a 30uC antes de la carga en un gel de poliacrilamida 16TAE/8% que no desnaturalizaba que fue prerun durante 20 minutos La electroforesis se realizó durante 120 min a 85 V. Después de secar al vacío los geles sobre papel filtrante, se tomaron imágenes después de la exposición nocturna en pantallas de Fosforimager sobre un instrumento tifón (GE Healthcare). Los efectos tóxicos de los sobrenadantes de cultivos difficiles de C. sobre las células de Vero (una especie de regalo de Eric Snijder [39] ) se determinaron de la siguiente manera. El sobrenadante de un cultivo bacteriano fue cosechado por células centrifugadoras durante 3 minutos a 140006g y filtrado en un filtro de acetato de celulosa de 0,45 mM utilizando una jeringa. Los sobrenadantes fueron diluidos en serie dos veces en medio de cultivo celular (medio águila modificado de Dulbecco (Lonza) complementado con 100 mg/ml de penicilina, 100 U/ml de estreptomi Como control positivo, se añadió a las células 50 mL 1:10 toxina purificada diluida (Techlab) para determinar si los efectos citotóxicos observados eran específicos para las toxinas clostridiales grandes, se añadió antitoxina comercialmente disponible frente a TcdA y TcdB (Techlab) a un sobrenadante bacteriano diluido de 10 veces durante 60 minutos antes de la incubación en las células Vero. Los títulos de punto final de toxinas se definieron como la dilución más baja en la que no se observaron efectos citopatológicos (redondeo de células) y se evaluó la significación estadística con una prueba t de muestra independiente. Inmunización de ratones con C. difficile Spo0A-6xHis fue amablemente realizada en el Instituto Welcome Trust Sanger (Hinxton, Reino Unido). Las células de 1 mL de cultivo C. difficile fueron recolectadas por centrifugación durante 1 min a 14000 rpm en una centrifugadora de mesa y resuspendidos en tampón de resuspensión de 200 mL (10 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA, 0,5 mg/mL lisozyme, 1 mM Pefabloc SC (Roche)). Después de incubar durante 30 minutos a 37uC, 50 mL de tampón de muestreo de 56 SDS (0,1 M DTT, 2% SDS, 50 mM Tris HCl pH 6,8, 10% glicerol, 0,0025% BPB) se calentaron a 96uC durante 5 minutos. Los lisatos celulares totales (cantidades corregidas para OD 600 ) se separaron en un gel SDS-PAGE del 12% antes de secarse durante 1 h a 10 V a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF ). Se bloquearon las membranas en el tampón PBST ( solución salina tamponada fosfatada con 0,1% v/v Tween-20 ) que contiene reactivo de bloqueo de membrana 5% (Amersham Biosciences ). Para visualizar el suero policlonal eliminado de la proteína Spo0A de un solo ratón en una dilución 1:3000, seguido de un anticuerpo secundario HRP conjugado por la cabra, seguido por la detección ECL+ (Amersham Bioscience ), o un anticuerpo secundario conjugado por biotina-antimouse (Dako La detección se realizó utilizando un instrumento de tifón (GE Healthcare). Los volúmenes máximos corregidos de fondo se cuantificaron utilizando ImageQuant TL (Amersham Biosciences). Las alineaciones de B. subtilis y C. difficile spo0A se realizaron utilizando ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) sobre la base de las secuencias de genoma publicadas, los números de adhesión de Genbank AL009126 y AM180355, respectivamente, y la secuencia de 630Derm spo0A según se determinó en este estudio. La secuencia para spo0A de C. difficile cepa 630Derm se depositó en Genbank (adhesión no JX050222). Las posiciones de la caja fueron enlazadas a genes ascendentes y descendentes usando la función ''Añadir gen más cercano a Lista de Motivos de ADN'' y Microsoft Excel. Los resultados fueron inspeccionados manualmente para esas cajas dentro de 500 bp aguas arriba de un gen en la misma hebra. Las figuras para publicación fueron preparadas usando ImageQuant TL (Amersham Biosciences), Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Inc) y Corel Graphics Suite X5 (Corel Corporation). Para caracterizar C. difficile Spo0A, la proteína de longitud completa y su dominio de unión al ADN (DBD) se expresaron como una proteína Cterminally 66His-tagged en el host heterologous Escherichia coli (Fig. 1A) y purificada a casi homogeneidad usando cromatografía de afinidad metálica (fig. 1A ; carril La proteína de longitud completa se utilizó para aumentar los anticuerpos para detectar Spo0A en los lisatos totales de cepas C. difficile, y el dominio de unión al ADN purificado se utilizó en ensayos de unión in vitro posteriores (ver más adelante). Se determinó la expresión de C. difficile Spo0A durante todo el crecimiento. Se encontró que la proteína está presente en los lisatos de células de fase de crecimiento exponencial a estacionaria. Se realizó inmunobloqueo utilizando anticuerpos policlonales contra C. difficile Spo0A en los lisatos totales de tipo salvaje y células mutantes spo0A cultivadas en un medio basado en triptones y levadura (TTY). Encontramos una señal clara del tamaño esperado para Spo0A de longitud completa (,31 kDa) tan pronto como 3 horas después de la inoculación (fase de crecimiento exponencial), a través de la fase de transición (8 h) así como 24 y 48 horas después de la inoculación (fase de crecimiento estacionario) (Fig. 1B; 630Derm). Las señales fueron específicas para C. difficile Spo0A ya que estaban ausentes de los lisatos del mutante C. difficile spo0A (Fig. 1B, CT::spo0A). Obtuvimos resultados similares en otros medios, como el caldo de perfusión de corazón cerebral complementado comúnmente utilizado (BHIS; datos no mostrados). Para determinar los niveles relativos de Spo0A a lo largo del crecimiento, realizamos un experimento inmunoblot utilizando anticuerpos fluorescentes Se encontró que los niveles de Spo0A aumentan aproximadamente 20 veces a partir de 6 horas después de la inoculación y permanecen en niveles similares de 8 a 48 horas después de la inoculación (Figura 1C ). Aunque se debe notar que las manchas occidentales no proporcionan información sobre el estado de fosforilación de la proteína, se concluye que la proteína en forma activa o inactiva está presente a lo largo del crecimiento y es más abundante en la fase de crecimiento estacionario. Spo0A de C. difficile Strain 630Derm Contiene un 6aminoácido Duplicación BLAST homología búsquedas identificar fácilmente un homólogo de la proteína B. subtilis Spo0A bien caracterizada en C. difficile 630 (CD1214) y trabajo anterior demostró que un mutante spo0A (una inactivación insercional de cd1214) -como se esperaba - En los análisis silicos sugieren una estructura secundaria similar para ambas proteínas (fig. 2A), con un dominio de dimerización conservada y unión al ADN, separado por una región de bisagra mal conservada [7, 12]. Comparamos la secuencia de CD1214 obtenida de nuestra cepa de laboratorio 630Derm [38] con la del genoma publicado C. difficile 630 [42]. La cepa 630Derm es una cepa sensible a la eritromicina espontánea, que se utiliza comúnmente en estudios de mutagenesis y se obtuvo mediante el paso en serie de la cepa 630 [33, 38]. La secuencia 630Derm spo0A (adhesión Genbank no JX050222) se deriva de la expresión plásmidos construidos para este estudio, y se confirma en una secuencia genómica completa de la cepa 630Derm generada en nuestro laboratorio ( Se encontró que 630Derm spo0A contiene una repetición directa de 18 pares base, resultando en una duplicación de 6 aminoácidos (NVGNIE) en comparación con la secuencia de referencia publicada. La duplicación mapea a una región de la proteína con relativamente baja conservación de secuencias (hinga), flanqueando el dominio de unión de ADN altamente conservado (fig. 2A y B). Se verificó la ausencia de esta duplicación en la cepa 630 por PCR (Fig. 2C ) así como la secuenciación del ADN cromosómico de C. difficile 630 (datos no mostrados), para descartar un error en la secuencia de genoma original y demostrar que la diferencia de tamaño del producto PCR era específica para la inserción de 18 pb. Además, comprobamos varias otras cepas de ribotipos PCR 12 (a las que pertenecen 630 y 630Derm) por PCR, pero se encontró que la duplicación es única a 630Derm entre los aislados probados (datos no mostrados). C. difficile Spo0A-DBD muestra especificidad similar a B. subtilis Spo0A-DBD A continuación, examinamos la conservación del dominio de unión al ADN de Spo0A (Spo0A-DBD) entre B. subtilis y C. difficile. En B. subtilis residuos de aminoácidos que entran en contacto con la columna vertebral del ADN e interactúan con residuos específicos de la secuencia de unión a Spo0A se han definido [13]. Encontramos que todos estos residuos se conservaron en la secuencia de proteína C. difficile (fig. 2B La unión de ADN por la longitud completa Spo0A en B. subtilis requiere dimerización dependiente de la fosforilación [8, 9]. Sin embargo, se demostró que el DBD aislado es capaz de unirse a objetivos legítimos de la proteína de longitud completa [10]. Analógicamente, purificamos el C. difficile Spo0A-DBD para su uso en ensayos de unión in vitro. Como no se han reportado objetivos directos para la proteína de C. difficile hasta ahora, utilizamos la región aguas arriba del gen AbrB (PabrB) de B. subtilis. PabrB se utiliza comúnmente como un control de alta afinidad en ensayos de unión con la proteína de B. subtilis Spo0A o Spo0A-DBDD [43, 44]. Cabe destacar que no se pudo identificar un homólogo de abrB en C. difficile usando BLAST, indicando que la regulación indirecta potencial por Spo0A no puede ocurrir a través de abrB en C. difficile como lo hace en B. subtilis. Encontramos que C. difficile Spo0A-DBD unido con alta afinidad a PabrB (Fig. 2D y E). Realizamos ensayos de desplazamiento electroforético (EMSAs) utilizando PabrB radiomarcado y aumentando las cantidades de C. difficile Spo0A-DBD que fue purificado utilizando un C-terminal 66His-tag. La adición de proteína conduce a un retardo dosis-dependiente del fragmento de ADN con una aparente K D de,50 nM. En el mismo rango de concentraciones proteicas, no se observó unión para un control negativo (un fragmento de ADN de B. subtilis citG [45] ) (Fig. 2E), sugiriendo que la unión era específica para la región promotora del abrB. B. subtilis Spo0A reconoce una secuencia distinta (0A box), que se caracteriza por un motivo del núcleo de 7 bp (TGTCGAA) [10, 11]. Estudios estructurales han revelado que la proteína hace contactos específicos con el G en la posición 2 (G2), y la C en la posición 4 (C4) y 5 (G5) de este motivo [13]. Se introdujeron mutaciones G2A, C4A, G5A, G2A/C4A y C4A/G5A en el núcleo de consenso perfecto 0A-box presente en PabrB. Encontramos que la afinidad de C. difficile Spo0A por estos fragmentos PabrB mutados fue muy reducida (Fig. 2E). Realizamos EMSAs utilizando PabrB radiomarcado que contiene la secuencia del núcleo mutado. Para las mutaciones de punto único en el ADN, la afinidad disminuyó 10 veces. No parecía haber un efecto aditivo de una mutación de segundo punto para las dos combinaciones probadas. Ninguna de las mutaciones abolió completamente la unión de C. difficile Spo0A, lo más probable como resultado de la unión de Spo0A a otras cajas (no-consenso) 0A en el promotor abrB [44]. Tomadas juntas, concluimos que los residuos de guanina y citosina en el motivo TGTCGAA del núcleo de PabrB son importantes para la unión específica de este fragmento por C. difficile Spo0A Valor para la unión por C. difficile Spo0A-DBD Arriba, hemos establecido que la Spo0A-DBD de C. difficile es altamente homóloga a la de la proteína B. subtilis Spo0A, y que las proteínas reconocen una secuencia de consenso similar (Fig. 2 ). Basado en esta información, identificamos los varios genes como objetivos directos putativos de C. difficile Spo0A. Preguntamos la secuencia del genoma C. difficile 630 para que coincida perfectamente con la caja del núcleo 0A usando Genome2D [40]. Tal análisis reveló la presencia de 102 motivos coincidentes, de los cuales 45 estaban ubicados dentro de 500 pb del ATG iniciador de un marco abierto de lectura en la misma hebra (ver Tabla S1 ). Se nos llamó la atención sobre spo0A y sigH, ya que estos dos genes fueron previamente regulados por Spo0A en B. subtilis y/o juegan papeles importantes en la esporulación [3, [46] [47]. Encontramos que C. difficile Spo0A se une a secuencias de ADN aguas arriba de spo0A y sigH. Realizamos EMSAs con ADN que abarca 220-281 bp aguas arriba del codón ATG iniciado de los marcos de lectura abiertos spo0A, sigH y spoVG. Encontramos que la adición de Spo0A-DBD a las reacciones causó retardo de los fragmentos de ADN spo0A y sigH (Fig. 3A), pero no de un fragmento spoVG que no contenía un cuadro 0A de consenso (Fig. 3 Cabe señalar que la afinidad de Spo0A-DBD por la región aguas arriba de spo0A fue la más alta que hemos observado hasta ahora para cualquier ADN C. difficile. Además, la presencia de múltiples especies desplazadas podría indicar la presencia de más de un sitio de unión fuerte. Estos resultados establecen que spo0A y sigH son probablemente objetivos legítimos de Spo0A en C. difficile, y confirman que spoVG no lo es, en línea con los resultados obtenidos en B. subtilis [10]. Nos interesó ver si Spo0A en C. difficile podría potencialmente regular genes que no tienen función documentada en la esporulación. Nuestro análisis en silico identificó varios genes sin vínculo obvio con la esporulación que tenían un consenso 0A dentro de 100 bp aguas arriba de su codón inicial. Este posicionamiento es similar al observado para spo Confirmamos la unión in vitro de la C. difficile Spo0A-DBD a las regiones promotoras de lplA y ssuA. Realizamos experimentos EMSA utilizando sondas que incluyeron el sitio de consenso perfecto y proteína purificada Spo0A-DBD. Observamos la unión de la proteína a fragmentos aguas arriba del gen lplA (CD1654; cuadro en 267) y el gen ssuA (CD1484; cuadro en 282) (Fig. 3A). El gen lplA codifica una ligasa de lipoato-proteína predicha, y ssuA está anotado como un transportador de sulfonatos alifáticos ABC; según nuestro conocimiento, ninguno de estos ha sido implicado directamente en la esporulación o ha encontrado ser blanco de Spo0A en otros organismos. Juntos nuestros resultados establecen el potencial de unión de Spo0A al ADN aguas arriba de spo0A y sigH, dos genes que son importantes para la esporulación, e indican que Spo0A puede tener funciones que van más allá de la regulación de la esporulación en C. difficile. Se ha establecido que un mutante spo0A de C. difficile no produce esporas, consistentes con un papel crucial en la vía de esporulación [33]. Sin embargo, la identificación en silico de las regiones aguas arriba con consenso Spo0A sitio de unión no señaló a ninguno de los genes de esporulación temprana (reducción de spo0A en sí mismo) como objetivos directos de Spo0A. Esto es probablemente el resultado de variaciones en la caja 0A en estos promotores que fueron ignorados en la búsqueda de cajas. En apoyo de esto, muchos objetivos directos legítimos bien caracterizados de B. subtilis Spo0A (como spoIIAA y spoIIE) no contienen una concordancia del 100% con el motivo central, sino más bien una o más cajas de consenso cercano [5, 49]. Encontramos que Spo0A- realizamos experimentos EMSA utilizando cantidades crecientes de Spo0A-DBD purificado de C. difficile 630Derm y los fragmentos de ADN indicados anteriormente (Fig. 3B ). Para spoIIAA (codificación de un factor anti-sigma) y spoIIE (codificación de una fosfatasa de serina), observamos una baja intensidad cambiada de especie a concentraciones tan bajas como 150 nM. Para spoIIGA (codificación de una proteasa específica anti-sigma) observamos la especie desplazada sólo a concentraciones más El control negativo (spoVG) no demostró la unión de Spo0A-DBD a estas concentraciones. Además, el cambio observado fue reversible utilizando ADN sin etiquetar que contenía un sitio de unión de alta afinidad, pero no utilizando ADN sin etiqueta que carecía de tal sitio (Figura S1B-D). Por lo tanto, consideramos que la unión a los genes spoIIAA, spoIIE y spoIIGA es específica, a pesar de que el aumento de la cantidad de proteína no parecía causar un aumento significativo en la cantidad de ADN en el complejo. Juntos, estos resultados sugieren que Spo0A en C. difficile podría regular la transcripción de al menos un subconjunto de genes de esporulación temprana mediante la unión directa a sus regiones promotoras. C. difficile Spo0A-DBD Encuadernaciones al ADN Corriente ascendente de tcdB Se ha informado previamente que la eliminación de Spo0A en C. difficile resulta en una producción de toxina significativamente menor y una reducción de 1000 veces en la toxicidad del sobrenadante de cultivo derivado de células negativas spo0A hacia las células Vero [35]. Considerando la ausencia de un homólogo del represor abrB, la unión directa de Spo0A y la activación concomitante de la transcripción del gen de la toxina es un mecanismo probable a través del cual esto podría ocurrir. Encontramos evidencia de unión directa de Spo0A-DBD a la región aguas arriba del TCdB, codificando uno de los principales genes de toxina clostridial, y posiblemente TCdC, pero esto no parece resultar en niveles de toxina más bajos en nuestras manos. Se realizaron EMSAs utilizando ADN aguas arriba de tcdR (codificación de un factor sigma responsable de la activación de la transcripción del gen de la toxina), tcdB (toxina B de codificación), tcdA (toxina A de codificación). Con el fin de probar las regiones aguas arriba de todos los marcos de lectura abiertos en el PaLoc, también probamos la unión de Spo0A al ADN aguas arriba de tcdE (codificación de una proteína similar a la holina [50, 51] ) y tcdC (codificación de un regulador putativo negativo de la producción de toxina [52] [53] [54] ), aunque este regulador no tiene un efecto significativo sobre los niveles de toxina bajo las condiciones que usamos [55, 56]. De las regiones analizadas, sólo se observó una especie claramente desplazada, indicativa de unión Spo0A, para tcdB (Figura 4A ); la especie desplazada en nuestro ensayo EMSA fue revertida por la adición de ADN sin etiquetar que contenía un sitio de unión de alta afinidad, pero no por ADN que carecía de dicho sitio (Figura S1E ). Para tcdC, se observó algún frotis en todas las concentraciones de proteínas analizadas (Figura 4A ), y no parecía haber un efecto claro de la adición de fragmentos de ADN sin etiqueta (Figura S1F ). Las sondas para tcdA, tcdE y tcdR eran indistinguibles de las obtenidas con nuestro control negativo, spoVG. Queríamos determinar si los niveles de toxina en los sobrenadantes de cultivo fueron afectados directa o indirectamente por Spo No encontramos toxicidad menor hacia células Vero de sobrenadantes de cultivo derivados de células mutantes spo0A en comparación con el tipo salvaje. Cultivamos tres réplicas biológicas independientes de un tipo salvaje (630Derm) o mutante spo0A generado por Clostron (CT::spo0A -una especie de regalo del laboratorio Minton) en medio TTY libre de glucosa. Cosechamos sobrenadante de cultivo en fase de exposición tardía (aproximadamente 7 horas después de la inoculación), la fase de transición entre la fase de crecimiento exponencial y estacionaria (aproximadamente 9 horas después de la inoculación), así como dos puntos de tiempo en fase estacionaria (24 y 48 horas después de la inoculación) y determinamos los títulos de valoración de la toxina (ver Materiales y Métodos). En contraste con hallazgos previos, observamos un pequeño aumento (#4 veces) en la toxicidad de los sobrenadantes derivados de células mutantes spo0A en comparación con el tipo salvaje, pero en todos los casos esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p.0.05, prueba independiente de muestra t). En otro medio (BHIS), no observamos diferencias en absoluto (datos no mostrados). Concluimos que Spo0A no afecta positivamente a la producción de toxina en C. difficile 630Derm y la relevancia in vivo de la unión a regiones aguas arriba de tcdB y/o tcdC está por lo tanto limitada bajo nuestras condiciones experimentales. La caja Spo0A de C. difficile En B. subtilis, el sitio de unión de Spo0A al ADN diana ha sido bien caracterizado, a través de una combinación de ensayos de unión in vitro, determinación de perfiles de unión in vivo y mutagenesis de secuencias de promotor reguladas. Este trabajo ha llevado a la identificación de un motivo de núcleo conservado, TGTCGAA, o caja Spo0A [5, 10, 11, 45]. Dependiendo del análisis, este motivo está flanqueado por uno o más residuos de adenina o timina [10, 11]. Curiosamente, muchos genes objetivo no contienen una perfecta coincidencia con esta secuencia de consenso, sino que contienen uno o más motivos degenerados. Las diferencias en estos motivos pueden reflejar diferentes arquitecturas promotoras (por ejemplo, contenido AT), modos de acción (por ejemplo, activación o represión) o niveles de regulación. Los genes Spo0A en B. subtilis se pueden dividir en diferentes clases que responden a diferentes niveles de Spo0A fosforilada [43, 57]. Para C. difficile, concluimos que la proteína Spo0A probablemente reconoce un motivo similar a la caja B. subtilis Spo0A sobre la base de cuatro líneas de evidencia; 1. Todos los residuos de unión de ADN/contacto se conservan (Fig. 2B), 2. C. difficile Spo0A puede unirse con alta afinidad a un objetivo de B. subtilis Spo0A (Fig. 2D), 3. Mutagenesis de residuos clave en la caja B. subtilis Spo0A reduce la afinidad de C. difficile Spo0A por ADN (Fig. 2E ) y 4. Una caja de B. subtilis Spo0A tiene valor predictivo para la unión de ADN por C. difficile Spo0A (Fig. 3A). Es concebible que nuestro sistema modelo, utilizando el dominio de unión de ADN purificado, no refleje con precisión la unión a todos los sitios objetivo, si la selectividad del sitio objetivo está determinada en parte por otras partes de la proteína de longitud completa. Es probable que existan diferencias entre los sitios de unión preferidos para ambas proteínas que serán evidentes cuando se realice un análisis exhaustivo de la unión de ADN in vivo de C. difficile Spo0A; basado en el limitado conjunto de datos de este estudio, un análisis MEME [58] ya sugiere posibles diferencias en el motivo Spo0A extendido (W.K. Smits, observaciones no publicadas). Estas diferencias pueden relacionarse con el contenido mucho más alto de AT de C. difficile en comparación con B. subtilis (71 vs. 56.5%, respectivamente), o la dimerización dependiente de la fosforilación, por ejemplo. La iniciación de la esporulación en B. subtilis está sujeta a una regulación compleja (ver ref [1, 59] ). La activación de Spo0A está controlada por un fosforelay multicomponente que puede integrar señales ambientales [60] y asegura un aumento gradual del nivel de Spo0A fosforilado en la célula [57]. Además, la transcripción del gen spo0A está controlada por múltiples bucles de retroalimentación. Por ejemplo, Spo0A regula su propia transcripción mediante la unión al promotor spo0A [46], así como estimulando indirectamente la transcripción de sigH, codificando un factor sigma que reconoce En C. difficile, existen algunas diferencias y similitudes interesantes en las vías regulatorias. Más notablemente, no parece haber fosforelay [2] y el estado de fosforilación de Spo0A está supuestamente controlado por histidina cinasas huérfanas [35]. La transcripción de spo0A en C. difficile está bajo control del factor sigma del estado de transición Sigma H [37], como lo está en B. subtilis [61]. Nuestros datos indican que tanto spo0A como sigH podrían ser objetivos de regulación directa por Spo0A en C. difficile (Fig. 3A), aumentando la posibilidad de autorregulación de spo0A. La supuesta regulación directa de sigH por Spo0A puede reflejar que el genoma de C. difficile no alberga un homólogo del regulador pleiotrópico AbrB, que es responsable de la regulación dependiente de Spo0A de sigH en B. subtilis [48]. De acuerdo con un modelo en el que spo0A es positivamente autorregulado, observamos un fuerte aumento en los niveles de Spo0A a medida que las células se acercan a la fase de crecimiento estacionario (Fig. 3B ). Downstream de Spo0A, encontramos la unión de Spo0A al ADN aguas arriba de varios genes de esporulación temprana, como spoIIAA, spoIIE y spoIIGA (Fig. 3B ). Todas estas observaciones son consistentes con la regulación directa de estos genes por Spo0A en Aunque Spo0A es el regulador clave para la esporulación en Firmicutes, regula numerosos otros procesos en diversas bacterias. En el B. subtilis no patógeno, por ejemplo, la proteína también afecta el desarrollo de la competencia, la formación de biopelículas, la producción y resistencia a compuestos antimicrobianos, la dinámica cromosómica y aspectos de la biología de los fagos [10, [14] [16]. Es importante destacar que varios de estos procesos están regulados indirectamente, a través de la represión dependiente de Spo0A de abrB. Además, la transcripción de abrB responde ya a bajos niveles de Spo0A,P [43]. Como resultado, estos efectos son detectables en fase estacionaria tardía y temprana, ya que algunas Spo0A están presentes durante todo el crecimiento en células de B. subtilis. Aunque abrB está ausente de C. difficile, esto no excluye la posibilidad de regulación de transcripción indirecta a través de Spo0Efectos dependientes sobre otros reguladores. Alternativamente, Spo0A puede ejercer un efecto directo. En Clostridium acetobutilicum y C. beijerinckii, Spo0A es un regulador directo de la formación de disolventes, así como la esporulación [22, 23]. Por lo tanto, parece concebible que Spo0A en C. difficile también afecta aspectos del metabolismo. En este sentido, es importante notar que también en C. difficile Spo0A es detectable desde la fase de crecimiento exponencial temprana en (Fig. 1B). Observamos la unión directa de C. difficile Spo0A a la región promotora de sigH (Fig. 3 Este gen codifica el factor sigma clave para la fase de transición, y regula los procesos fuera de la esporulación también [37]. Además, encontramos niveles significativos de Spo0A desde la fase estacionaria temprana en adelante (fig. 1B y observaciones no publicadas), indicando las acciones regulatorias de Spo0A no necesitan limitarse a la fase estacionaria en C. difficile. En línea con esta idea, encontramos un vínculo regulatorio potencial entre Spo0A y dos genes que según nuestros conocimientos no están relacionados con el proceso de esporulación, la ligasa lpla y el transportador de sulfonatos alifáticos ssuA (fig. 3A). La presencia de un sitio de unión Spo0A putativo aguas arriba de estos genes, así como el espaciado en comparación con el codón inicial, se conserva en la cepa problemática Stoke-Mande Esto podría indicar que estos aspectos de la regulación por Spo0A se conservan en múltiples cepas de C. difficile. Cabe señalar que nuestro trabajo hasta ahora se ha limitado a un análisis in vitro de la unión de Spo0A, y por lo tanto no indica si la activación o represión de los genes de destino putativo ocurre in vivo. Para responder a esta pregunta, hay que realizar estudios detallados del transcriptoma y/o del proteoma. Para distinguir directamente de los efectos indirectos, se deben realizar perfiles de unión in vivo de Spo0A. Los anticuerpos generados para este estudio deben resultar útiles para este tipo de experimentos. En B. anthracis una mutación spo0A resulta en niveles elevados de AbrB, y niveles concomitantemente más bajos de los genes de la toxina pagA, cia y lef que están bajo control AbrB [17]. Del mismo modo, la producción de la toxina emética cereulida en B. cereus es ampliamente reprimida en un mutante spo0A, de una manera dependiente de AbrB [63]. En contraste, Spo0A reprime directamente la expresión de los genes de la toxina del grito en B. turingiensis y un mutante spo0A es, por lo tanto, un hiperproductor de la proteína cristalina insecticida [18, 21]. En Clostridium perfringens TpeL, un miembro de las toxinas clostridiales grandes, al igual que TcdA y TcdB, depende directamente de Spo0A [64] y también la producción de enterotoxina en este organismo parece ser (indirectamente) dependiente de la esporulación [65, 66]. En C. difficile un espo0A insercional mutante generado utilizando tecnología Clostron se informó de tener niveles reducidos de 10 veces de toxina A (TcdA), tanto intracelular como extracelularmente, así como, 1000 veces menor toxicidad hacia las células Vero, que son principalmente sensibles hacia la toxina B (TcdB) [35]. Nuestros datos de unión in vitro indican un sitio de unión potencial para Spo0A antes de tcdB y posiblemente tcdC (Fig. 4A). Sin embargo, la relevancia in vivo de esta unión parece limitada ya que en nuestras manos un mutante independiente pero idéntico (una especie de donación del laboratorio de Minton; [33] ) no demostró una toxicidad reducida hacia las células Vero. En contraste, encontramos que en las TTY los niveles medios de toxina fueron ligeramente elevados en células mutantes spo0A en comparación con el tipo salvaje (#2 veces en células de fase exponencial hasta 4 veces en células de fase estacionaria tardía).Las pequeñas, y no significativas, diferencias en los niveles de toxina en nuestros experimentos podrían atribuirse a diferencias en la susceptibilidad de las células para la lisis en lugar de la producción de toxina, pero también podrían indicar un efecto regulador negativo de Spo0A en la producción de toxina. En apoyo de esta última hipótesis, se ha reportado recientemente que un mutante spo0A de C. difficile cepa R20291 (una cepa epidémica PCR ribotipos 027/BI/NAP1) demuestra niveles de toxina 10 veces más altos que su isogénico tipo salvaje 30 h después de la inoculación, y es significativamente más virulento en un modelo de enfermedad del ratón [34]. Las diferencias entre Underwood et al [35], por un lado, y nuestro estudio, así como el estudio de Deakin y compañeros de trabajo [34], por otro, pueden explicarse por diferencias en las condiciones experimentales, como el medio utilizado. Sin embargo, no observamos diferencia en la citotoxicidad entre sobrenadante derivado del tipo salvaje o células mutantes spo0A cuando se cultivaban en BHIS, un medio casi idéntico al utilizado anteriormente (datos no mostrados). Alternativamente, las diferencias podrían indicar la integración del intron del grupo II en más de un lugar del cromosoma en la cepa utilizada en Underwood et al [35]. En ausencia de un experimento de complementación y/o datos de manchas del sur, esto queda por establecer. En resumen, nuestros datos son consistentes con un modelo en el que la regulación de las principales toxinas clostridiales en C. difficile no se ve positivamente afectada por Spo0A, en contraste con los hallazgos previos y otras Clostridias patógenas. Si Spo0A es verdaderamente un regulador negativo de la producción de toxinas queda por confirmar utilizando ensayos de transcripción in vitro e in vivo. En el presente estudio hemos demostrado por primera vez la unión directa del dominio de unión del ADN de C. difficile Spo0A al ADN objetivo putativo. Este trabajo ha revelado que aspectos de la unión Spo0A se conservan entre Bacillus y C. difficile (0A caja, posible autoregulación y unión a promotores de la esporulación temprana), mientras que otros no lo son (la ausencia de abrB como objetivo directo en C. difficile, unión al ADN aguas arriba de lplA, ssuA). Los efectos de Spo0A en la producción de toxinas pueden ser similares a los observados para B. thuringiensis [18, 21]. El trabajo futuro estará dirigido a determinar el efecto de Spo0A en la transcripción de los genes de destino putativo, y llevar a cabo un análisis exhaustivo de Spo0A unión in vivo. La identificación de genes afectados por Spo0A en C. difficile puede arrojar luz sobre el papel de la proteína en la virulencia y patogénesis de este organismo Las descripciones con fragmentos de PCR de PabrB (conteniendo un sitio de unión de alta afinidad) y PtcdA (faltando tal sitio) corresponden aproximadamente a 0,1 nM/mL -0,03 nM/mL. A. La comparación de la unión de Spo0A-DBD-his6, Spo0A-his6 y CD2195-his6 a la región aguas arriba de spoIIAA. B. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba de spoIIAA se invierte con la adición de PabrB, pero no con la adición de PtcdA). C. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba de spoIIE se invierte con la adición de PabrB, pero no con la adición de PtcdA. D. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba del spoIIGA se invierte mediante la adición de PabrB, pero no mediante la adición de PtcdA. E. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba del spoIIGA se invierte mediante la adición de PabrB, pero no mediante la adición de PtcdA. F. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba del TCdC no se ve o moderadamente afectada por la adición de PabrB y/o PtcdA. (TIF) Texto S1 Oligonucleótidos utilizados en este estudio y condiciones de ciclismo PCR para las sondas EMSA. (PDF)

¿Qué es la esporulación?

C. difficile 630Δerm Spo0A regula la esporulación, pero no contribuye a la producción de toxinas, mediante la unión directa de alta afinidad al ADNhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3485338/SHA: f0fb3bbd96dad4c907c7fd456cd5783ed8fa7bd6Autores: Rosenbusch, Katharina E.; Bakker, Dennis; Kuijper, Ed J.; Smits, Wiep KlaasFecha: 2012-10-31DOI: 10.1371/journal.pone.0048608Licencia: cc-byAbstract: Clostridium difficile es una bacteria grampositiva, anaerobia que puede formar endosporos La bacteria es el agente causal de la infección por C. difficile (CDI), para la cual los síntomas pueden variar desde una leve diarrea hasta colitis pseudomembranosa potencialmente fatal y megacolon tóxico. La formación endoespora en Firmicutes, incluyendo C. difficile, está gobernada por el regulador clave para la esporulación, Spo0A. En Bacillus subtilis, este factor de transcripción también está implicado directa o indirectamente en varios otros procesos celulares. Aquí, informamos que C. difficile Spo0A muestra un alto grado de similitud con la proteína B. subtilis bien caracterizada y reconoce una secuencia de unión similar. Encontramos que la cepa de laboratorio C. difficile 630Δerm contiene una duplicación de 18bp cerca del dominio de unión al ADN en comparación con su cepa ancestral 630. Los ensayos de unión in vitro mediante el dominio de unión al ADN C-terminal purificado de la proteína C. difficile Spo0A demuestran la unión directa al ADN aguas arriba de spo0A y sigH, genes de esporulación temprana y varios otros objetivos putativos. Los ensayos de unión in vitro sugieren que el gen que codifica la principal toxina clostridial TcdB puede ser un objetivo directo de Spo0A, pero sobrenadante derivado de una cepa negativa spo0A no fue menos tóxico para las células Vero que el obtenido de una cepa de tipo salvaje, en contraste con informes anteriores. Estos resultados identifican por primera vez los objetivos directos (putativos) de la proteína Spo0A en C. difficile y hacen un efecto positivo de Spo0A en la producción de las grandes toxinas clostridiales improbables. Texto: La esporulación es una estrategia adaptativa que permite a las bacterias sobrevivir a duras condiciones ambientales durante períodos prolongados de tiempo, y es una parte integral de la transmisión de patógenos esporulares y su tolerancia y resistencia a los compuestos antimicrobianos. Spo0A es el regulador clave para la esporulación [1, 2]. La mayor parte de nuestro conocimiento sobre la proteína se basa en el trabajo en Bacilli. Spo0A es un regulador de respuesta que demuestra la unión dependiente de la fosforilación al ADN [3] [5]. La fosforilación se produce a través de la acción concertada de varias proteínas que juntos forman una llamada fosforelay [6]. La cascada de señalización permite la integración de señales ambientales en la regulación de procesos dependientes de Spo0A, incluyendo la esporulación. Los dos dominios funcionales, el dominio de fosforilación y dimerización N-terminal (dominio receptor) y el dominio de unión al ADN C-terminal (efector) están separados por una región bisagra que está relativamente mal conservada [7]. Se cree que la fosforilación resulta en un reordenamiento estructural que facilita la dimerización [8, 9], resultando en la interrupción de los contactos de transcripción-inhibidores entre los dominios receptor y efector. El dominio aislado de unión al ADN puede unir objetivos legítimos de la proteína Spo0A debido a la ausencia de contactos inhibidores de transcripción, evitando así la necesidad de fosforilación [10]. La caracterización extensa de los objetivos Spo0A ha revelado un motivo que representa un sitio de unión Spo0A de alta afinidad, el recuadro 0A [10, 11]. La estructura cristalina del dominio de unión al ADN confirma los contactos específicos y no específicos entre la proteína y la secuencia de consenso [12, 13]. Cabe destacar que Spo0A regula muchos otros procesos además de la esporulación, como la competencia para la transformación genética, la replicación del ADN y la formación de biopelículas en B. subtilis [14] [15] [16], los factores de virulencia y las respuestas de estrés en, por ejemplo, B. anthracis y B. turingiensis [17] [18] [19] [20] [20], y la producción de disolventes en Clostridium acetobutilicum [22, 23]. C. difficile es una bacteria grampositiva y anaerobia que es el agente causal de la infección por C. difficile (CDI) Aunque muchas personas son colonizadas asintomáticamente por C. difficile, la bacteria puede causar graves problemas de salud, como la colitis pseudomembranosa y el megacolon tóxico, bajo la influencia de factores de riesgo como la edad y el uso de antibióticos. Como resultado, la CDI fue considerada durante mucho tiempo una infección nosocomial. Sin embargo, recientemente, se puede observar un aumento en los casos de CDI adquirida por la comunidad [26]. Los brotes de CDI se han relacionado con las denominadas cepas hipervirulentas, como los ribotipos PCR 027 (BI/ NAP1) y 078 [27, 28]. Sus principales factores de virulencia son las principales toxinas clostridiales A y B [29, 30]. Además, algunas cepas de C. difficile, incluyendo ribotipos 027 y 078, C. difficile se transmite a través de la vía fecal-oral. Se cree que las esporas son cruciales para infectar con éxito a nuevos huéspedes, ya que son capaces de soportar el ambiente duro del estómago, y sobrevivir a los tratamientos antibióticos que alteran la flora endógena, después de lo cual C. difficile puede sobrecrecer [24, 25]. Hay un conocimiento limitado sobre la regulación de la esporulación en C. difficile. Se ha reportado que espo0A, como se espera, es necesario para la formación de esporas [33] y el gen es necesario para la persistencia y transmisión en ratones [34]. Aunque las vías aguas abajo de Spo0A parecen en gran medida conservadas entre B. subtilis y Clostridia, esto es menos para las vías que conducen a la activación de Spo0A [2]. Se ha sugerido que la histidina cinasa huérfana CD2492 está involucrada en la activación de Spo0A [35]. De manera similar, se informó que múltiples quinasas histidina huérfanas pueden fosforilar Spo0A en C. acetobutilicum [36]. Recientemente, se informó que spo0A se puede transcribir de un promotor dependiente de SigH [37]. Se desconoce qué genes están regulados por la unión directa de Spo0A a sus regiones anteriores. Aquí, se establece un ensayo de unión in vitro para C. difficile Spo0A y demostrar por primera vez la unión directa de este factor de transcripción al ADN aguas arriba de varios genes de destino putativo. Las cepas de Escherichia coli fueron cultivadas rutinariamente en el caldo o placas Luria-Bertani, complementadas con antibióticos apropiados. El cloramfenicol se utilizó a una concentración final de 20 mg/ml para las placas de agar y 10 mg/ml para los cultivos líquidos. La ampicilina se utilizó a una concentración final de 100 mg/ml. La canamicina se utilizó a una concentración final de 20 mg/ml. La clonación se llevó a cabo utilizando E. coli DH5a, se realizó una sobreexpresión en E. coli Rosetta(DE3) pLysS (Novagen). Las cepas difficiles se cultivaron en un medio a base de tripton-levadura sin glucosa (TTY; 3% w/v bactotrypton (BD), 2% extracto de levadura (Fluka), 0,1% w/v tioglicol (Sigma) pH 7,4), complementado con 20 mg/ml de lincomycina cuando fue apropiado, o en placas CLO o TSS Todos los plásmidos están listados en la Tabla 1. Los primeros (obtenidos de Sigma Aldrich) están listados en el Texto S1 y las condiciones específicas de ciclismo están disponibles bajo petición. Salvo que se indique lo contrario, las reacciones PCR se llevaron a cabo utilizando Pfu polimerasa (Fermentas) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PWKS1251, Plasmid pWKS1251, para la sobreproducción de Spo0A-DBD con una C-terminal 66His-tag, fue construida de la siguiente manera. Una secuencia correspondiente al dominio de unión del ADN de Spo0A fue amplificada usando los primeros oWKS-1123a y oWKS-1124 usando ADN cromosómico de C. difficile cepa 630Derm como plantilla. El fragmento resultante fue clonado en pCR2.1-TOPO (In Este plásmido fue digerido con NdeI y XhoI, separado en un gel de agarosa al 1%/0,56 TAE (20 mM Tris Acetato, 0,5 mM EDTA), el fragmento correspondiente al dominio de unión al ADN fue recuperado por aislamiento del gel (utilizando un kit de extracción del gel GeneJET, Fermentas) y clonado en pMF14 similarmente digerido [10] que había sido aislado del gel de la misma manera. El constructo fue verificado por PCR, análisis de restricción y secuenciación del ADN utilizando imprimaciones oWKS-135 y oWKS-136 (ver abajo). Plasmid pWKS1245, para la producción de Spo0A de longitud completa con un C-terminal 6xHis-tag, fue construido de manera similar utilizando ADN cromosómico de C. difficile 630Derm como plantilla, pero utilizando el producto PCR de los imprimadores oWKS-1122 y oWKS-1123a. Los plásmidos utilizados como plantillas PCR para generar sondas EMSA fueron construidos clonando los productos PCR en pCR2.1-TOPO. Los insertos, y en el caso de los promotores de PabrB mutados, la presencia de las mutaciones de puntos deseadas en la caja de consenso 0A, fueron verificados mediante secuenciación de ADN usando primers oWKS-24 y oWKS-25 (ver abajo). Los plásmidos de grado secuencial se aislaron utilizando un kit de Nucleospin Plasmid QuickPure (Macherey Nagel) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que dos reacciones de lisis se combinaron en un solo filtro y se eludieron con buffer AE precalentado de 65uC. Todos los constructos se secuenciaron utilizando química BigDye Terminator (Invitrogen) en un secuenciador ABI3130 (Perkin Elmer), de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. En resumen,,200 ng de plásmido se mezclaron con 3,2 pmol de imprimación, 1 mL Terminator Ready Reaction Mix (Invitrogen) en un volumen final de 20 mL. Después del termociclado, el ADN se precipitó y lavó con un 65% de isopropanol y se disolvió en 12 mL HiDi formamid (Invitrogen) a 96uC durante 2 minutos y se almacenó en la oscuridad a 4uC hasta la secuenciación. Se realizaron análisis de secuencias en CloneManager Professional Suite 7 (SciEd) y Geneious versión 5.6.2 (Biomatters Ltd). Plasmids pWKS1245 y pWKS1251 se transformaron en E. coli Rosetta(DE3) pLysS (Novagen). Se utilizaron transformadores para inocular 25 mL de LB con antibióticos apropiados. Después de la incubación nocturna, las células fueron 1:100 diluidas en medio fresco de 500 mL que contenía antibióticos apropiados. La producción proteica se indujo con 1 mM Las células se lavaban con PBS helado y se almacenaban en 280uC para su uso posterior. La purificación de las proteínas se realizó esencialmente como se describe [10]. En resumen, las células se interrumpieron en 4 mL de tampón de lisis (2 mM PMSF, 10 mM imidazol, 5 mM beta-mercaptoetanol, 300 mM NaCl, 50 mM NaH 2 PO 4, pH 7,9). Se incubaron células limpias con 2 mL preequilibradas 50% TALON slurry (Clontech) en un volumen final de 15 mL dysis tampón para 1 hora. Se permitió que la resina se asentara en una columna de Polipreparación (BioRad) y se lavaba con 2 mL de tampón de lavado (20 mM imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM NaH La proteína se eludió por etapas en fracciones de 1 mL después de aplicar un tampón de dilución de 2 mL a la columna (idéntico al tampón de lavado pero con 50, 100, 250 o 500 mM de imidazol). Todo el procedimiento se llevó a cabo a 4uC. Se evaluaron las fracciones de pureza y rendimiento y se dializaron fracciones adecuadas contra 26 tampón de diálisis de 1L (50 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT) utilizando casetes Slide-A-Lyzer con un corte molecular de 3,5 kDa (Pierce). Las proteínas se almacenaron a 280uC en tampón de almacenamiento (idéntico al tampón de diálisis pero que contenía 20% de glicerol). Las concentraciones de proteínas se determinaron utilizando reactivo Bradford (BioRad), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de ADN para uso en el experimento EMSA fueron generados por PCR utilizando GoTaq polimerasa (Promega) y ADN cromosómico de B. subtilis JH642 (Bacillus Genetic Stock Center 1A96; http://www.bgsc.org), plásmidos listados en la Tabla 1, o ADN cromosómico de C. difficile 630Derm [38] como plantilla. Los primeros y condiciones específicas de ciclo para la generación de las sondas EMSA se enumeran en el texto S1. Los fragmentos de ADN del tamaño esperado fueron aislados de un gel nativo de poliacrilamida 16TAE/8% utilizando tampón de difusión (acetato de amonio de 0,5 M, acetato de magnesio de 10 mM, 1 mM EDTA pH 8, 0,1% SDS) y un kit QIAExII (Qia El ADN recuperado fue marcado con 32P-c-ATP utilizando tampón FR y quinasa T4 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se determinó la actividad específica en un contador de centelleo LS6000 (Beckman). Las condiciones de EMSA se basaron en estudios previos [10]. En resumen, se realizaron reacciones de unión en tampón de unión (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glicerol) en presencia de 200 mg/ml de albúmina sérica bovina (NEB) y 200 cpm/ml de fragmento de ADN radiomarcado. Las reacciones se incubaron durante 20 minutos a 30uC antes de la carga en un gel de poliacrilamida 16TAE/8% que no desnaturalizaba que fue prerun durante 20 minutos La electroforesis se realizó durante 120 min a 85 V. Después de secar al vacío los geles sobre papel filtrante, se tomaron imágenes después de la exposición nocturna en pantallas de Fosforimager sobre un instrumento tifón (GE Healthcare). Los efectos tóxicos de los sobrenadantes de cultivos difficiles de C. sobre las células de Vero (una especie de regalo de Eric Snijder [39] ) se determinaron de la siguiente manera. El sobrenadante de un cultivo bacteriano fue cosechado por células centrifugadoras durante 3 minutos a 140006g y filtrado en un filtro de acetato de celulosa de 0,45 mM utilizando una jeringa. Los sobrenadantes fueron diluidos en serie dos veces en medio de cultivo celular (medio águila modificado de Dulbecco (Lonza) complementado con 100 mg/ml de penicilina, 100 U/ml de estreptomi Como control positivo, se añadió a las células 50 mL 1:10 toxina purificada diluida (Techlab) para determinar si los efectos citotóxicos observados eran específicos para las toxinas clostridiales grandes, se añadió antitoxina comercialmente disponible frente a TcdA y TcdB (Techlab) a un sobrenadante bacteriano diluido de 10 veces durante 60 minutos antes de la incubación en las células Vero. Los títulos de punto final de toxinas se definieron como la dilución más baja en la que no se observaron efectos citopatológicos (redondeo de células) y se evaluó la significación estadística con una prueba t de muestra independiente. Inmunización de ratones con C. difficile Spo0A-6xHis fue amablemente realizada en el Instituto Welcome Trust Sanger (Hinxton, Reino Unido). Las células de 1 mL de cultivo C. difficile fueron recolectadas por centrifugación durante 1 min a 14000 rpm en una centrifugadora de mesa y resuspendidos en tampón de resuspensión de 200 mL (10 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA, 0,5 mg/mL lisozyme, 1 mM Pefabloc SC (Roche)). Después de incubar durante 30 minutos a 37uC, 50 mL de tampón de muestreo de 56 SDS (0,1 M DTT, 2% SDS, 50 mM Tris HCl pH 6,8, 10% glicerol, 0,0025% BPB) se calentaron a 96uC durante 5 minutos. Los lisatos celulares totales (cantidades corregidas para OD 600 ) se separaron en un gel SDS-PAGE del 12% antes de secarse durante 1 h a 10 V a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF ). Se bloquearon las membranas en el tampón PBST ( solución salina tamponada fosfatada con 0,1% v/v Tween-20 ) que contiene reactivo de bloqueo de membrana 5% (Amersham Biosciences ). Para visualizar el suero policlonal eliminado de la proteína Spo0A de un solo ratón en una dilución 1:3000, seguido de un anticuerpo secundario HRP conjugado por la cabra, seguido por la detección ECL+ (Amersham Bioscience ), o un anticuerpo secundario conjugado por biotina-antimouse (Dako La detección se realizó utilizando un instrumento de tifón (GE Healthcare). Los volúmenes máximos corregidos de fondo se cuantificaron utilizando ImageQuant TL (Amersham Biosciences). Las alineaciones de B. subtilis y C. difficile spo0A se realizaron utilizando ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) sobre la base de las secuencias de genoma publicadas, los números de adhesión de Genbank AL009126 y AM180355, respectivamente, y la secuencia de 630Derm spo0A según se determinó en este estudio. La secuencia para spo0A de C. difficile cepa 630Derm se depositó en Genbank (adhesión no JX050222). Las posiciones de la caja fueron enlazadas a genes ascendentes y descendentes usando la función ''Añadir gen más cercano a Lista de Motivos de ADN'' y Microsoft Excel. Los resultados fueron inspeccionados manualmente para esas cajas dentro de 500 bp aguas arriba de un gen en la misma hebra. Las figuras para publicación fueron preparadas usando ImageQuant TL (Amersham Biosciences), Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Inc) y Corel Graphics Suite X5 (Corel Corporation). Para caracterizar C. difficile Spo0A, la proteína de longitud completa y su dominio de unión al ADN (DBD) se expresaron como una proteína Cterminally 66His-tagged en el host heterologous Escherichia coli (Fig. 1A) y purificada a casi homogeneidad usando cromatografía de afinidad metálica (fig. 1A ; carril La proteína de longitud completa se utilizó para aumentar los anticuerpos para detectar Spo0A en los lisatos totales de cepas C. difficile, y el dominio de unión al ADN purificado se utilizó en ensayos de unión in vitro posteriores (ver más adelante). Se determinó la expresión de C. difficile Spo0A durante todo el crecimiento. Se encontró que la proteína está presente en los lisatos de células de fase de crecimiento exponencial a estacionaria. Se realizó inmunobloqueo utilizando anticuerpos policlonales contra C. difficile Spo0A en los lisatos totales de tipo salvaje y células mutantes spo0A cultivadas en un medio basado en triptones y levadura (TTY). Encontramos una señal clara del tamaño esperado para Spo0A de longitud completa (,31 kDa) tan pronto como 3 horas después de la inoculación (fase de crecimiento exponencial), a través de la fase de transición (8 h) así como 24 y 48 horas después de la inoculación (fase de crecimiento estacionario) (Fig. 1B; 630Derm). Las señales fueron específicas para C. difficile Spo0A ya que estaban ausentes de los lisatos del mutante C. difficile spo0A (Fig. 1B, CT::spo0A). Obtuvimos resultados similares en otros medios, como el caldo de perfusión de corazón cerebral complementado comúnmente utilizado (BHIS; datos no mostrados). Para determinar los niveles relativos de Spo0A a lo largo del crecimiento, realizamos un experimento inmunoblot utilizando anticuerpos fluorescentes Se encontró que los niveles de Spo0A aumentan aproximadamente 20 veces a partir de 6 horas después de la inoculación y permanecen en niveles similares de 8 a 48 horas después de la inoculación (Figura 1C ). Aunque se debe notar que las manchas occidentales no proporcionan información sobre el estado de fosforilación de la proteína, se concluye que la proteína en forma activa o inactiva está presente a lo largo del crecimiento y es más abundante en la fase de crecimiento estacionario. Spo0A de C. difficile Strain 630Derm Contiene un 6aminoácido Duplicación BLAST homología búsquedas identificar fácilmente un homólogo de la proteína B. subtilis Spo0A bien caracterizada en C. difficile 630 (CD1214) y trabajo anterior demostró que un mutante spo0A (una inactivación insercional de cd1214) -como se esperaba - En los análisis silicos sugieren una estructura secundaria similar para ambas proteínas (fig. 2A), con un dominio de dimerización conservada y unión al ADN, separado por una región de bisagra mal conservada [7, 12]. Comparamos la secuencia de CD1214 obtenida de nuestra cepa de laboratorio 630Derm [38] con la del genoma publicado C. difficile 630 [42]. La cepa 630Derm es una cepa sensible a la eritromicina espontánea, que se utiliza comúnmente en estudios de mutagenesis y se obtuvo mediante el paso en serie de la cepa 630 [33, 38]. La secuencia 630Derm spo0A (adhesión Genbank no JX050222) se deriva de la expresión plásmidos construidos para este estudio, y se confirma en una secuencia genómica completa de la cepa 630Derm generada en nuestro laboratorio ( Se encontró que 630Derm spo0A contiene una repetición directa de 18 pares base, resultando en una duplicación de 6 aminoácidos (NVGNIE) en comparación con la secuencia de referencia publicada. La duplicación mapea a una región de la proteína con relativamente baja conservación de secuencias (hinga), flanqueando el dominio de unión de ADN altamente conservado (fig. 2A y B). Se verificó la ausencia de esta duplicación en la cepa 630 por PCR (Fig. 2C ) así como la secuenciación del ADN cromosómico de C. difficile 630 (datos no mostrados), para descartar un error en la secuencia de genoma original y demostrar que la diferencia de tamaño del producto PCR era específica para la inserción de 18 pb. Además, comprobamos varias otras cepas de ribotipos PCR 12 (a las que pertenecen 630 y 630Derm) por PCR, pero se encontró que la duplicación es única a 630Derm entre los aislados probados (datos no mostrados). C. difficile Spo0A-DBD muestra especificidad similar a B. subtilis Spo0A-DBD A continuación, examinamos la conservación del dominio de unión al ADN de Spo0A (Spo0A-DBD) entre B. subtilis y C. difficile. En B. subtilis residuos de aminoácidos que entran en contacto con la columna vertebral del ADN e interactúan con residuos específicos de la secuencia de unión a Spo0A se han definido [13]. Encontramos que todos estos residuos se conservaron en la secuencia de proteína C. difficile (fig. 2B La unión de ADN por la longitud completa Spo0A en B. subtilis requiere dimerización dependiente de la fosforilación [8, 9]. Sin embargo, se demostró que el DBD aislado es capaz de unirse a objetivos legítimos de la proteína de longitud completa [10]. Analógicamente, purificamos el C. difficile Spo0A-DBD para su uso en ensayos de unión in vitro. Como no se han reportado objetivos directos para la proteína de C. difficile hasta ahora, utilizamos la región aguas arriba del gen AbrB (PabrB) de B. subtilis. PabrB se utiliza comúnmente como un control de alta afinidad en ensayos de unión con la proteína de B. subtilis Spo0A o Spo0A-DBDD [43, 44]. Cabe destacar que no se pudo identificar un homólogo de abrB en C. difficile usando BLAST, indicando que la regulación indirecta potencial por Spo0A no puede ocurrir a través de abrB en C. difficile como lo hace en B. subtilis. Encontramos que C. difficile Spo0A-DBD unido con alta afinidad a PabrB (Fig. 2D y E). Realizamos ensayos de desplazamiento electroforético (EMSAs) utilizando PabrB radiomarcado y aumentando las cantidades de C. difficile Spo0A-DBD que fue purificado utilizando un C-terminal 66His-tag. La adición de proteína conduce a un retardo dosis-dependiente del fragmento de ADN con una aparente K D de,50 nM. En el mismo rango de concentraciones proteicas, no se observó unión para un control negativo (un fragmento de ADN de B. subtilis citG [45] ) (Fig. 2E), sugiriendo que la unión era específica para la región promotora del abrB. B. subtilis Spo0A reconoce una secuencia distinta (0A box), que se caracteriza por un motivo del núcleo de 7 bp (TGTCGAA) [10, 11]. Estudios estructurales han revelado que la proteína hace contactos específicos con el G en la posición 2 (G2), y la C en la posición 4 (C4) y 5 (G5) de este motivo [13]. Se introdujeron mutaciones G2A, C4A, G5A, G2A/C4A y C4A/G5A en el núcleo de consenso perfecto 0A-box presente en PabrB. Encontramos que la afinidad de C. difficile Spo0A por estos fragmentos PabrB mutados fue muy reducida (Fig. 2E). Realizamos EMSAs utilizando PabrB radiomarcado que contiene la secuencia del núcleo mutado. Para las mutaciones de punto único en el ADN, la afinidad disminuyó 10 veces. No parecía haber un efecto aditivo de una mutación de segundo punto para las dos combinaciones probadas. Ninguna de las mutaciones abolió completamente la unión de C. difficile Spo0A, lo más probable como resultado de la unión de Spo0A a otras cajas (no-consenso) 0A en el promotor abrB [44]. Tomadas juntas, concluimos que los residuos de guanina y citosina en el motivo TGTCGAA del núcleo de PabrB son importantes para la unión específica de este fragmento por C. difficile Spo0A Valor para la unión por C. difficile Spo0A-DBD Arriba, hemos establecido que la Spo0A-DBD de C. difficile es altamente homóloga a la de la proteína B. subtilis Spo0A, y que las proteínas reconocen una secuencia de consenso similar (Fig. 2 ). Basado en esta información, identificamos los varios genes como objetivos directos putativos de C. difficile Spo0A. Preguntamos la secuencia del genoma C. difficile 630 para que coincida perfectamente con la caja del núcleo 0A usando Genome2D [40]. Tal análisis reveló la presencia de 102 motivos coincidentes, de los cuales 45 estaban ubicados dentro de 500 pb del ATG iniciador de un marco abierto de lectura en la misma hebra (ver Tabla S1 ). Se nos llamó la atención sobre spo0A y sigH, ya que estos dos genes fueron previamente regulados por Spo0A en B. subtilis y/o juegan papeles importantes en la esporulación [3, [46] [47]. Encontramos que C. difficile Spo0A se une a secuencias de ADN aguas arriba de spo0A y sigH. Realizamos EMSAs con ADN que abarca 220-281 bp aguas arriba del codón ATG iniciado de los marcos de lectura abiertos spo0A, sigH y spoVG. Encontramos que la adición de Spo0A-DBD a las reacciones causó retardo de los fragmentos de ADN spo0A y sigH (Fig. 3A), pero no de un fragmento spoVG que no contenía un cuadro 0A de consenso (Fig. 3 Cabe señalar que la afinidad de Spo0A-DBD por la región aguas arriba de spo0A fue la más alta que hemos observado hasta ahora para cualquier ADN C. difficile. Además, la presencia de múltiples especies desplazadas podría indicar la presencia de más de un sitio de unión fuerte. Estos resultados establecen que spo0A y sigH son probablemente objetivos legítimos de Spo0A en C. difficile, y confirman que spoVG no lo es, en línea con los resultados obtenidos en B. subtilis [10]. Nos interesó ver si Spo0A en C. difficile podría potencialmente regular genes que no tienen función documentada en la esporulación. Nuestro análisis en silico identificó varios genes sin vínculo obvio con la esporulación que tenían un consenso 0A dentro de 100 bp aguas arriba de su codón inicial. Este posicionamiento es similar al observado para spo Confirmamos la unión in vitro de la C. difficile Spo0A-DBD a las regiones promotoras de lplA y ssuA. Realizamos experimentos EMSA utilizando sondas que incluyeron el sitio de consenso perfecto y proteína purificada Spo0A-DBD. Observamos la unión de la proteína a fragmentos aguas arriba del gen lplA (CD1654; cuadro en 267) y el gen ssuA (CD1484; cuadro en 282) (Fig. 3A). El gen lplA codifica una ligasa de lipoato-proteína predicha, y ssuA está anotado como un transportador de sulfonatos alifáticos ABC; según nuestro conocimiento, ninguno de estos ha sido implicado directamente en la esporulación o ha encontrado ser blanco de Spo0A en otros organismos. Juntos nuestros resultados establecen el potencial de unión de Spo0A al ADN aguas arriba de spo0A y sigH, dos genes que son importantes para la esporulación, e indican que Spo0A puede tener funciones que van más allá de la regulación de la esporulación en C. difficile. Se ha establecido que un mutante spo0A de C. difficile no produce esporas, consistentes con un papel crucial en la vía de esporulación [33]. Sin embargo, la identificación en silico de las regiones aguas arriba con consenso Spo0A sitio de unión no señaló a ninguno de los genes de esporulación temprana (reducción de spo0A en sí mismo) como objetivos directos de Spo0A. Esto es probablemente el resultado de variaciones en la caja 0A en estos promotores que fueron ignorados en la búsqueda de cajas. En apoyo de esto, muchos objetivos directos legítimos bien caracterizados de B. subtilis Spo0A (como spoIIAA y spoIIE) no contienen una concordancia del 100% con el motivo central, sino más bien una o más cajas de consenso cercano [5, 49]. Encontramos que Spo0A- realizamos experimentos EMSA utilizando cantidades crecientes de Spo0A-DBD purificado de C. difficile 630Derm y los fragmentos de ADN indicados anteriormente (Fig. 3B ). Para spoIIAA (codificación de un factor anti-sigma) y spoIIE (codificación de una fosfatasa de serina), observamos una baja intensidad cambiada de especie a concentraciones tan bajas como 150 nM. Para spoIIGA (codificación de una proteasa específica anti-sigma) observamos la especie desplazada sólo a concentraciones más El control negativo (spoVG) no demostró la unión de Spo0A-DBD a estas concentraciones. Además, el cambio observado fue reversible utilizando ADN sin etiquetar que contenía un sitio de unión de alta afinidad, pero no utilizando ADN sin etiqueta que carecía de tal sitio (Figura S1B-D). Por lo tanto, consideramos que la unión a los genes spoIIAA, spoIIE y spoIIGA es específica, a pesar de que el aumento de la cantidad de proteína no parecía causar un aumento significativo en la cantidad de ADN en el complejo. Juntos, estos resultados sugieren que Spo0A en C. difficile podría regular la transcripción de al menos un subconjunto de genes de esporulación temprana mediante la unión directa a sus regiones promotoras. C. difficile Spo0A-DBD Encuadernaciones al ADN Corriente ascendente de tcdB Se ha informado previamente que la eliminación de Spo0A en C. difficile resulta en una producción de toxina significativamente menor y una reducción de 1000 veces en la toxicidad del sobrenadante de cultivo derivado de células negativas spo0A hacia las células Vero [35]. Considerando la ausencia de un homólogo del represor abrB, la unión directa de Spo0A y la activación concomitante de la transcripción del gen de la toxina es un mecanismo probable a través del cual esto podría ocurrir. Encontramos evidencia de unión directa de Spo0A-DBD a la región aguas arriba del TCdB, codificando uno de los principales genes de toxina clostridial, y posiblemente TCdC, pero esto no parece resultar en niveles de toxina más bajos en nuestras manos. Se realizaron EMSAs utilizando ADN aguas arriba de tcdR (codificación de un factor sigma responsable de la activación de la transcripción del gen de la toxina), tcdB (toxina B de codificación), tcdA (toxina A de codificación). Con el fin de probar las regiones aguas arriba de todos los marcos de lectura abiertos en el PaLoc, también probamos la unión de Spo0A al ADN aguas arriba de tcdE (codificación de una proteína similar a la holina [50, 51] ) y tcdC (codificación de un regulador putativo negativo de la producción de toxina [52] [53] [54] ), aunque este regulador no tiene un efecto significativo sobre los niveles de toxina bajo las condiciones que usamos [55, 56]. De las regiones analizadas, sólo se observó una especie claramente desplazada, indicativa de unión Spo0A, para tcdB (Figura 4A ); la especie desplazada en nuestro ensayo EMSA fue revertida por la adición de ADN sin etiquetar que contenía un sitio de unión de alta afinidad, pero no por ADN que carecía de dicho sitio (Figura S1E ). Para tcdC, se observó algún frotis en todas las concentraciones de proteínas analizadas (Figura 4A ), y no parecía haber un efecto claro de la adición de fragmentos de ADN sin etiqueta (Figura S1F ). Las sondas para tcdA, tcdE y tcdR eran indistinguibles de las obtenidas con nuestro control negativo, spoVG. Queríamos determinar si los niveles de toxina en los sobrenadantes de cultivo fueron afectados directa o indirectamente por Spo No encontramos toxicidad menor hacia células Vero de sobrenadantes de cultivo derivados de células mutantes spo0A en comparación con el tipo salvaje. Cultivamos tres réplicas biológicas independientes de un tipo salvaje (630Derm) o mutante spo0A generado por Clostron (CT::spo0A -una especie de regalo del laboratorio Minton) en medio TTY libre de glucosa. Cosechamos sobrenadante de cultivo en fase de exposición tardía (aproximadamente 7 horas después de la inoculación), la fase de transición entre la fase de crecimiento exponencial y estacionaria (aproximadamente 9 horas después de la inoculación), así como dos puntos de tiempo en fase estacionaria (24 y 48 horas después de la inoculación) y determinamos los títulos de valoración de la toxina (ver Materiales y Métodos). En contraste con hallazgos previos, observamos un pequeño aumento (#4 veces) en la toxicidad de los sobrenadantes derivados de células mutantes spo0A en comparación con el tipo salvaje, pero en todos los casos esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p.0.05, prueba independiente de muestra t). En otro medio (BHIS), no observamos diferencias en absoluto (datos no mostrados). Concluimos que Spo0A no afecta positivamente a la producción de toxina en C. difficile 630Derm y la relevancia in vivo de la unión a regiones aguas arriba de tcdB y/o tcdC está por lo tanto limitada bajo nuestras condiciones experimentales. La caja Spo0A de C. difficile En B. subtilis, el sitio de unión de Spo0A al ADN diana ha sido bien caracterizado, a través de una combinación de ensayos de unión in vitro, determinación de perfiles de unión in vivo y mutagenesis de secuencias de promotor reguladas. Este trabajo ha llevado a la identificación de un motivo de núcleo conservado, TGTCGAA, o caja Spo0A [5, 10, 11, 45]. Dependiendo del análisis, este motivo está flanqueado por uno o más residuos de adenina o timina [10, 11]. Curiosamente, muchos genes objetivo no contienen una perfecta coincidencia con esta secuencia de consenso, sino que contienen uno o más motivos degenerados. Las diferencias en estos motivos pueden reflejar diferentes arquitecturas promotoras (por ejemplo, contenido AT), modos de acción (por ejemplo, activación o represión) o niveles de regulación. Los genes Spo0A en B. subtilis se pueden dividir en diferentes clases que responden a diferentes niveles de Spo0A fosforilada [43, 57]. Para C. difficile, concluimos que la proteína Spo0A probablemente reconoce un motivo similar a la caja B. subtilis Spo0A sobre la base de cuatro líneas de evidencia; 1. Todos los residuos de unión de ADN/contacto se conservan (Fig. 2B), 2. C. difficile Spo0A puede unirse con alta afinidad a un objetivo de B. subtilis Spo0A (Fig. 2D), 3. Mutagenesis de residuos clave en la caja B. subtilis Spo0A reduce la afinidad de C. difficile Spo0A por ADN (Fig. 2E ) y 4. Una caja de B. subtilis Spo0A tiene valor predictivo para la unión de ADN por C. difficile Spo0A (Fig. 3A). Es concebible que nuestro sistema modelo, utilizando el dominio de unión de ADN purificado, no refleje con precisión la unión a todos los sitios objetivo, si la selectividad del sitio objetivo está determinada en parte por otras partes de la proteína de longitud completa. Es probable que existan diferencias entre los sitios de unión preferidos para ambas proteínas que serán evidentes cuando se realice un análisis exhaustivo de la unión de ADN in vivo de C. difficile Spo0A; basado en el limitado conjunto de datos de este estudio, un análisis MEME [58] ya sugiere posibles diferencias en el motivo Spo0A extendido (W.K. Smits, observaciones no publicadas). Estas diferencias pueden relacionarse con el contenido mucho más alto de AT de C. difficile en comparación con B. subtilis (71 vs. 56.5%, respectivamente), o la dimerización dependiente de la fosforilación, por ejemplo. La iniciación de la esporulación en B. subtilis está sujeta a una regulación compleja (ver ref [1, 59] ). La activación de Spo0A está controlada por un fosforelay multicomponente que puede integrar señales ambientales [60] y asegura un aumento gradual del nivel de Spo0A fosforilado en la célula [57]. Además, la transcripción del gen spo0A está controlada por múltiples bucles de retroalimentación. Por ejemplo, Spo0A regula su propia transcripción mediante la unión al promotor spo0A [46], así como estimulando indirectamente la transcripción de sigH, codificando un factor sigma que reconoce En C. difficile, existen algunas diferencias y similitudes interesantes en las vías regulatorias. Más notablemente, no parece haber fosforelay [2] y el estado de fosforilación de Spo0A está supuestamente controlado por histidina cinasas huérfanas [35]. La transcripción de spo0A en C. difficile está bajo control del factor sigma del estado de transición Sigma H [37], como lo está en B. subtilis [61]. Nuestros datos indican que tanto spo0A como sigH podrían ser objetivos de regulación directa por Spo0A en C. difficile (Fig. 3A), aumentando la posibilidad de autorregulación de spo0A. La supuesta regulación directa de sigH por Spo0A puede reflejar que el genoma de C. difficile no alberga un homólogo del regulador pleiotrópico AbrB, que es responsable de la regulación dependiente de Spo0A de sigH en B. subtilis [48]. De acuerdo con un modelo en el que spo0A es positivamente autorregulado, observamos un fuerte aumento en los niveles de Spo0A a medida que las células se acercan a la fase de crecimiento estacionario (Fig. 3B ). Downstream de Spo0A, encontramos la unión de Spo0A al ADN aguas arriba de varios genes de esporulación temprana, como spoIIAA, spoIIE y spoIIGA (Fig. 3B ). Todas estas observaciones son consistentes con la regulación directa de estos genes por Spo0A en Aunque Spo0A es el regulador clave para la esporulación en Firmicutes, regula numerosos otros procesos en diversas bacterias. En el B. subtilis no patógeno, por ejemplo, la proteína también afecta el desarrollo de la competencia, la formación de biopelículas, la producción y resistencia a compuestos antimicrobianos, la dinámica cromosómica y aspectos de la biología de los fagos [10, [14] [16]. Es importante destacar que varios de estos procesos están regulados indirectamente, a través de la represión dependiente de Spo0A de abrB. Además, la transcripción de abrB responde ya a bajos niveles de Spo0A,P [43]. Como resultado, estos efectos son detectables en fase estacionaria tardía y temprana, ya que algunas Spo0A están presentes durante todo el crecimiento en células de B. subtilis. Aunque abrB está ausente de C. difficile, esto no excluye la posibilidad de regulación de transcripción indirecta a través de Spo0Efectos dependientes sobre otros reguladores. Alternativamente, Spo0A puede ejercer un efecto directo. En Clostridium acetobutilicum y C. beijerinckii, Spo0A es un regulador directo de la formación de disolventes, así como la esporulación [22, 23]. Por lo tanto, parece concebible que Spo0A en C. difficile también afecta aspectos del metabolismo. En este sentido, es importante notar que también en C. difficile Spo0A es detectable desde la fase de crecimiento exponencial temprana en (Fig. 1B). Observamos la unión directa de C. difficile Spo0A a la región promotora de sigH (Fig. 3 Este gen codifica el factor sigma clave para la fase de transición, y regula los procesos fuera de la esporulación también [37]. Además, encontramos niveles significativos de Spo0A desde la fase estacionaria temprana en adelante (fig. 1B y observaciones no publicadas), indicando las acciones regulatorias de Spo0A no necesitan limitarse a la fase estacionaria en C. difficile. En línea con esta idea, encontramos un vínculo regulatorio potencial entre Spo0A y dos genes que según nuestros conocimientos no están relacionados con el proceso de esporulación, la ligasa lpla y el transportador de sulfonatos alifáticos ssuA (fig. 3A). La presencia de un sitio de unión Spo0A putativo aguas arriba de estos genes, así como el espaciado en comparación con el codón inicial, se conserva en la cepa problemática Stoke-Mande Esto podría indicar que estos aspectos de la regulación por Spo0A se conservan en múltiples cepas de C. difficile. Cabe señalar que nuestro trabajo hasta ahora se ha limitado a un análisis in vitro de la unión de Spo0A, y por lo tanto no indica si la activación o represión de los genes de destino putativo ocurre in vivo. Para responder a esta pregunta, hay que realizar estudios detallados del transcriptoma y/o del proteoma. Para distinguir directamente de los efectos indirectos, se deben realizar perfiles de unión in vivo de Spo0A. Los anticuerpos generados para este estudio deben resultar útiles para este tipo de experimentos. En B. anthracis una mutación spo0A resulta en niveles elevados de AbrB, y niveles concomitantemente más bajos de los genes de la toxina pagA, cia y lef que están bajo control AbrB [17]. Del mismo modo, la producción de la toxina emética cereulida en B. cereus es ampliamente reprimida en un mutante spo0A, de una manera dependiente de AbrB [63]. En contraste, Spo0A reprime directamente la expresión de los genes de la toxina del grito en B. turingiensis y un mutante spo0A es, por lo tanto, un hiperproductor de la proteína cristalina insecticida [18, 21]. En Clostridium perfringens TpeL, un miembro de las toxinas clostridiales grandes, al igual que TcdA y TcdB, depende directamente de Spo0A [64] y también la producción de enterotoxina en este organismo parece ser (indirectamente) dependiente de la esporulación [65, 66]. En C. difficile un espo0A insercional mutante generado utilizando tecnología Clostron se informó de tener niveles reducidos de 10 veces de toxina A (TcdA), tanto intracelular como extracelularmente, así como, 1000 veces menor toxicidad hacia las células Vero, que son principalmente sensibles hacia la toxina B (TcdB) [35]. Nuestros datos de unión in vitro indican un sitio de unión potencial para Spo0A antes de tcdB y posiblemente tcdC (Fig. 4A). Sin embargo, la relevancia in vivo de esta unión parece limitada ya que en nuestras manos un mutante independiente pero idéntico (una especie de donación del laboratorio de Minton; [33] ) no demostró una toxicidad reducida hacia las células Vero. En contraste, encontramos que en las TTY los niveles medios de toxina fueron ligeramente elevados en células mutantes spo0A en comparación con el tipo salvaje (#2 veces en células de fase exponencial hasta 4 veces en células de fase estacionaria tardía).Las pequeñas, y no significativas, diferencias en los niveles de toxina en nuestros experimentos podrían atribuirse a diferencias en la susceptibilidad de las células para la lisis en lugar de la producción de toxina, pero también podrían indicar un efecto regulador negativo de Spo0A en la producción de toxina. En apoyo de esta última hipótesis, se ha reportado recientemente que un mutante spo0A de C. difficile cepa R20291 (una cepa epidémica PCR ribotipos 027/BI/NAP1) demuestra niveles de toxina 10 veces más altos que su isogénico tipo salvaje 30 h después de la inoculación, y es significativamente más virulento en un modelo de enfermedad del ratón [34]. Las diferencias entre Underwood et al [35], por un lado, y nuestro estudio, así como el estudio de Deakin y compañeros de trabajo [34], por otro, pueden explicarse por diferencias en las condiciones experimentales, como el medio utilizado. Sin embargo, no observamos diferencia en la citotoxicidad entre sobrenadante derivado del tipo salvaje o células mutantes spo0A cuando se cultivaban en BHIS, un medio casi idéntico al utilizado anteriormente (datos no mostrados). Alternativamente, las diferencias podrían indicar la integración del intron del grupo II en más de un lugar del cromosoma en la cepa utilizada en Underwood et al [35]. En ausencia de un experimento de complementación y/o datos de manchas del sur, esto queda por establecer. En resumen, nuestros datos son consistentes con un modelo en el que la regulación de las principales toxinas clostridiales en C. difficile no se ve positivamente afectada por Spo0A, en contraste con los hallazgos previos y otras Clostridias patógenas. Si Spo0A es verdaderamente un regulador negativo de la producción de toxinas queda por confirmar utilizando ensayos de transcripción in vitro e in vivo. En el presente estudio hemos demostrado por primera vez la unión directa del dominio de unión del ADN de C. difficile Spo0A al ADN objetivo putativo. Este trabajo ha revelado que aspectos de la unión Spo0A se conservan entre Bacillus y C. difficile (0A caja, posible autoregulación y unión a promotores de la esporulación temprana), mientras que otros no lo son (la ausencia de abrB como objetivo directo en C. difficile, unión al ADN aguas arriba de lplA, ssuA). Los efectos de Spo0A en la producción de toxinas pueden ser similares a los observados para B. thuringiensis [18, 21]. El trabajo futuro estará dirigido a determinar el efecto de Spo0A en la transcripción de los genes de destino putativo, y llevar a cabo un análisis exhaustivo de Spo0A unión in vivo. La identificación de genes afectados por Spo0A en C. difficile puede arrojar luz sobre el papel de la proteína en la virulencia y patogénesis de este organismo Las descripciones con fragmentos de PCR de PabrB (conteniendo un sitio de unión de alta afinidad) y PtcdA (faltando tal sitio) corresponden aproximadamente a 0,1 nM/mL -0,03 nM/mL. A. La comparación de la unión de Spo0A-DBD-his6, Spo0A-his6 y CD2195-his6 a la región aguas arriba de spoIIAA. B. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba de spoIIAA se invierte con la adición de PabrB, pero no con la adición de PtcdA). C. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba de spoIIE se invierte con la adición de PabrB, pero no con la adición de PtcdA. D. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba del spoIIGA se invierte mediante la adición de PabrB, pero no mediante la adición de PtcdA. E. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba del spoIIGA se invierte mediante la adición de PabrB, pero no mediante la adición de PtcdA. F. La unión de Spo0A-DBD-his6 a la región aguas arriba del TCdC no se ve o moderadamente afectada por la adición de PabrB y/o PtcdA. (TIF) Texto S1 Oligonucleótidos utilizados en este estudio y condiciones de ciclismo PCR para las sondas EMSA. (PDF)

¿Cuál es el regulador clave de la esporulación?

El virus venezolano de la encefalitis equina induce la apotosis a través de la activación de la respuesta de proteínas no plegadas de EGR1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4794670/SHA: f4aa788ab898b28b00ee103e4d4ab24a2c684cafAutores: Baer, Alan; Lundberg, Lindsay; Swales, Danielle; Waybright, Nicole; Pinkham, Chelsea; Dinman, Jonathan D.; Jacobs, Jonathan L.; Kehn-Hall, KyleneFecha: 2016-03-11DOI: 10.1128/jvi.0282-15Licencia: cc-byAbstract: El virus venezolano de la encefalitis equina (VEEV) es El aumento de la circulación y diseminación en las Américas de VVEV y otros arbovirus encefalíticos, como el virus de la encefalitis equina oriental y el virus del Nilo Occidental, subrayan la necesidad de investigar la patogénesis de la encefalomielitis viral para el desarrollo de nuevas contramedidas médicas. La dinámica hospedante-patógena de las células de astrocitoma humano U87MG infectadas con asnos VVEV Trinidad se determinó mediante la secuenciación de ARN (ARN-Seq) de poli(A) y mRNAs. Para identificar las alteraciones críticas que tienen lugar en el transcriptoma del huésped tras la infección por VVEV, se recolectaron muestras a 4, 8 y 16 h de postinfección y se adquirieron datos de ARN-Seq utilizando una plataforma PGM Ion Torrent. Se observó una expresión diferencial de respuesta al interferón, factores de respuesta al estrés La proteína cinasa ARN similar a la proteína endoplasmática retículo cinasa (PERK) brazo de la UPR fue activado, ya que la expresión de activando el factor de transcripción 4 (ATF4) y CHOP (DDIT3), reguladores críticos de la vía, fue alterada después de la infección. La expresión del factor de transcripción respuesta temprana al crecimiento 1 (EGR1) fue inducida de una manera dependiente de PERK. EGR1(−/−) fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) demostró menor susceptibilidad a la muerte celular inducida por VEEV que los MEFs de tipo salvaje isogénico, lo que indica que EGR1 modula las vías proapoptóticas después de la infección VEEV. La influencia de EGR1 es de gran importancia, ya que el daño neuronal puede conducir a secuelas a largo plazo en En casos graves, la propagación viral se dirige al tejido neuronal, resultando en una inflamación significativa y potencialmente mortal dependiente de una combinación de interacciones virus-anfitriona. Actualmente no hay terapias para infecciones causadas por alfavirus encefalíticos debido a una comprensión incompleta de su patogénesis molecular. El virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) es un alfavirus que es prevalente en las Américas y que es capaz de infectar caballos y humanos. Aquí utilizamos la secuenciación de ARN de próxima generación para identificar alteraciones diferenciales en los astrocitos infectados con VEEV. Nuestros resultados indicaron que la abundancia de transcripciones asociadas con el interferón y las vías de respuesta proteica desplegadas se alteraron después de la infección y demostraron que la respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1) contribuyó a la muerte celular inducida por VEEV. Texto: Venezuelan equina encefalitis virus (VE El VEEV es un virus de ARN de cadena positiva que es transmitido por mosquitos y que está naturalmente presente en depósitos de roedores (1). Hay seis subtipos que se clasifican por su rango geográfico y patología en equinos y humanos. Las dos cepas epizoóticas, IA/B y IC, surgieron de mutaciones entre las cepas enzoóticas (2). Las cepas IA/B y IC son de especial preocupación debido al aumento de las tasas de morbilidad y mortalidad y los riesgos asociados con la amplificación viral y el posible derrame de especies (2). En los seres humanos, el VEEV causa una enfermedad febril tipificada por fiebre, malestar y vómitos. En algunos casos, la infección progresa hacia el sistema nervioso central (SNC) y síntomas neurológicos, como confusión, ataxia y convulsiones, se manifiestan. La tasa de mortalidad entre los casos con síntomas neurológicos puede ser de hasta 35% en niños y 10% en adultos, con déficits neurológicos a largo plazo a menudo vistos en sobrevivientes (2). En 1995, un brote de VEEV en Colombia y Venezuela dio lugar a más de 100.000 casos humanos (3). Además de brotes naturales, el VEEV también es una preocupación desde una perspectiva bioterrorista, ya que puede crecer a altos títulos, requiere una dosis infecciosa baja, y contiene múltiples serotipos. Tanto la ex Unión Soviética como los Estados Unidos anteriormente armaron el virus, produciendo grandes cantidades para sus programas de armas biológicas ofensivas ya desactivadas (4). Actualmente, la cepa vacuna TC83 se utiliza en caballos y para personal de alto riesgo; sin embargo, debido a la baja tasa de seroconversión lograda con esta vacuna (5) y su dependencia de dos mutaciones atenuantes únicas (6), se considera no a Hasta la fecha no existen tratamientos aprobados por la FDA para la infección por VEEV, y se requieren estudios adicionales para aclarar los mecanismos asociados con la patogénesis subyacente del VEEV. Los estudios transcriptómicos virales y de huésped pueden proporcionar una gran cantidad de información sobre los mecanismos patógenos subyacentes y las interacciones posteriores al curso de una infección. El uso de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de virus previamente no característicos y el establecimiento de numerosos sistemas experimentales nuevos que redefinieron las interacciones virus-anfitriones. Hasta la fecha, varios estudios han examinado las alteraciones en el transcriptoma del huésped después de la infección por VEEV. Un análisis comparativo de microarray entre células infectadas persistentemente con VEEV y células capaces de limpiar VEEV resultó en la identificación de PARP12L como factor antiviral (8). Una comparación molecular utilizando microarrays de respuestas basadas en el huésped a la cepa TC83 fue capaz de identificar biomarcadores diferenciando entre los grupos que responden a la vacuna y los que no responden a la vacuna, así como la implicación de interferón (IFN), vías inducidas por interferón, receptores similares a los de Toll (TLR) y vías relacionadas con la interleucina 12 (IL-12) (9). Un estudio que examinó el papel de la adhesión y los factores inflamatorios en ratones CD-1 infectados por VEEV encontró modulación viral de la expresión de la matriz extracelular y genes de adhesión, como las integrinas (Itgáxis, Itg2, 3 y 7), las cadherinas 1 y 2, la molécula de adhesión de células vasculares 1, y la molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1), en los cerebros de ratones infectados por VEEV (10). Un estudio de Sharma et al. utilizaron microarrays para analizar los cambios en la expresión génica en el tejido cerebral de ratones infectados por VVEV durante el curso de una infección, descubriendo numerosas vías inmunes involucradas en la presentación de antígenos, inflamación, apoptosis y la respuesta antiviral tradicional (Cxcl10, CxCl11, Ccl5, Ifr7, Ifi27, Oas1b, Fcerg1, Mif, clusterin, e importante complejo de histocompatibilidad [MHC] clase II) (11). Un segundo estudio del mismo grupo identificó la regulación de los microRNAs (miRNAs) en los cerebros de ratones infectados por VVEV, lo que permitió la correlación de los cambios de miRNA con los datos de expresión de mRNA anteriores (11, 12). Estos análisis sugieren que el VEEV puede estar utilizando miRNAs celulares para regular el ARNm aguas abajo, lo que puede corresponder con los cambios histológicos inducidos por el VEEV en el sistema nervioso (11, 12). En el estudio actual, la secuenciación del ARNm de la próxima generación (ARN-Seq) se utilizó para identificar alteraciones clínicamente relevantes en el transcriptoma del ARNm de los astrocitos humanos infectados con la cepa de tipo salvaje (WT) VEEV Trinidad burro (TrD). El análisis de mRNAs huésped por ARN-Seq proporciona una visión novedosa de cómo un huésped responde a una infección viral a través de la identificación de un amplio y dinámico rango de transcripciones de una manera imparcial. Secuencia selectiva de mRNAs, específicamente, poliadenylated [poli(A)] transcripciones, que representan el 1% de Como el VEEV ha demostrado infectar productivamente a los astrocitos tanto in vitro como in vivo (14, 15), elegimos los astrocitos como nuestro modelo de interés. Los astrocitos son las células más abundantes del cerebro, superando a las neuronas por al menos 5 veces (16), proporcionando un recurso abundante para la replicación viral dentro del cerebro. Además de su bien descrito papel estructural en el tejido neuronal, los trocitos desempeñan papeles críticos en otros procesos, incluyendo la regulación del flujo sanguíneo y de la barrera hematoencefálica, la transmisión sinapsis y la respuesta a la infección (16). Se ha demostrado que los astrocitos infectados por el VEEV producen citocinas múltiples, incluyendo IL-8, IL-17, interferón gamma (IFN- +), y proteína 10 inducida por interferón gamma, todas las cuales se encontraron asociadas con atenuación viral (14). Con el fin de obtener una visión dinámica del interactoma virus-anfitrión, se utilizó el ARN-Seq para monitorear los cambios en la expresión génica en los astrocitos infectados por VEEV TrD a las 4, 8 y 16 h de postinfección (hpi). Al observar las alteraciones en múltiples momentos tempranos utilizando réplicas biológicas triplicadas, se genera un rango robusto y dinámico de información, y esta información proporciona un aumento tanto en la potencia como en la exactitud de la detección de transcripciones expresadas diferencialmente en un modelo clínico altamente relevante (17). Entre las células infectadas por VEEV, se observó un aumento en los genes regulados por interferón, incluyendo IFIT1, IFIT2, IFIT3 y OASL. También se observó el aumento en la expresión de genes involucrados en la vía de respuesta proteica inducida por estrés (UPR). Curiosamente, la infección por VEEV resultó en un La identificación de ARNm del huésped cuya expresión se altera después de la replicación del VEEV, específicamente, EGR1 y sus interactores arriba y abajo, puede proporcionar nuevos objetivos terapéuticos basados en el huésped críticos para la replicación del VEEV y una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes que sustentan la replicación del alfavirus. Infecciones virales y ensayos de placa. Se obtuvo TrD del VEEV de Recursos del BEI. Todos los experimentos con VEEV TrD se realizaron bajo condiciones de bioseguridad nivel 3 (BSL-3). Todo trabajo que involucra a agentes selectos está registrado en los Centros de Control y Prevención de Enfermedades y se llevó a cabo en el Laboratorio de Investigación Biomédica de la Universidad George Mason, que está registrado de acuerdo con las regulaciones federales de agentes selectos. Las células fueron infectadas durante 1 h a 37 °C y rotaron cada 15 minutos para asegurar una cobertura adecuada. Las células fueron lavadas con solución salina fosfatada (PBS), y se añadió un medio de crecimiento completo a las células. Se recolectaron sobrenadantes virales y células en varias ocasiones para su posterior análisis. Los ensayos de placa se realizaron como se describió anteriormente (18). Aislamiento de mRNA y preparación de biblioteca poli(A). El ARN de células U87MG fue purificado tanto de TrD VEEV infectado (nivel de bioseguridad 3) como de células U87MG simuladas a 4, 8 y 16 hpi utilizando un kit de aislamiento de mirVana (Tecnologías de Vida). El control de calidad del ARN purificado se realizó a partir de un bioanalizador Agilent 2100, y se utilizó un corte de integridad de ARN número de 8 A continuación, se añadió una mezcla de control de pico de ARN ARN ARN External Controls Consortium (ERCC) a las entradas totales de ARN (10 g de ARN) antes de la selección de poli(A) utilizando un kit de Dynabeads de Life Technologies mRNA Direct. La preparación de una biblioteca de ARN de transcriptoma completo de ARNm purificado se llevó a cabo utilizando un kit de Ion Total ARN-Seq (v2; Life Technologies). El control de calidad de las bibliotecas de cDNA se llevó a cabo utilizando el bioanalizador Agilent 2100 junto con pruebas de esterilidad para la eliminación de bibliotecas para la secuenciación de un laboratorio BSL-3 a BSL-2. Secuenciación de ARN. La preparación de plantillas de biblioteca se realizó en una plataforma One Touch 2 (Life Technologies). La secuenciación de A Un total de 119 millones de lecturas de secuenciación y un promedio de 6,6 millones de lecturas por muestra fueron utilizados como entrada en nuestra tubería de análisis. A menos que se indique lo contrario, el análisis de ARN-Seq aguas abajo se llevó a cabo utilizando la biogenómica CLC Workbench (v7). Las lecturas de ARN-Seq en bruto fueron recortadas para eliminar cualquier fragmento de adaptador de secuenciación residual que permaneciera en los 5= o 3= extremos después de la secuenciación. Además, el recorte final de las lecturas se realizó utilizando el algoritmo Mott modificado con una puntuación de calidad Q20, y cualquier lectura de menos de 15 pb fue descartada. Tras el recorte de lectura, las lecturas fueron cartografiadas al genoma humano hg19 con los siguientes parámetros ARN-Seq: un límite de 10 hits para múltiples posiciones cartográficas, una fracción de similitud de 0,8, una fracción El nivel de expresión de genes y transcripciones individuales se calculó utilizando el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas cartográficas (RPKM) del método Mortazavi et al. (19). Además, las lecturas no cartográficas también fueron cartografiadas al conjunto de secuencias de ARN sintética ERCC92 (20), así como al genoma de referencia VEEV (número de adhesión GenBank L01442). En todas las muestras, el coeficiente de correlación (R 2) entre el número de lecturas esperadas y el número de lecturas cartográficas para los controles de pico en ERCC92 fue superior a 0.90. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los resultados de secuenciación general. El filtrado postmapping de todos los datos de ARN-Seq se llevó a cabo junto a incluir sólo genes con al menos un mapa único leído (26.230 genes permanecieron El análisis de componentes principales del conjunto de datos filtrados resultante (13.906 genes en total) se realizó utilizando recuentos brutos de lecturas exclusivamente cartografiadas (ver Fig. 2A ). Los valores de expresión RPKM restantes para cada gen incluido en el conjunto de datos filtrados se sometieron a normalización cuantitativa con un corte del 5%. En la Fig. 2B se muestra un gráfico de caja de valores RPKM transformados para cada muestra antes de la normalización. El valor R 2 para la variación de muestra a muestra en pares dentro de cada conjunto de réplica biológica se observó un rango de 0,89 a 0,99, lo que indica que nuestras réplicas biológicas fueron consistentes y no mostraron un sesgo fuerte (datos no mostrados). En primer lugar, el análisis empírico del algoritmo de expresión génica diferencial, parte del paquete edgeR Bioconductor (21), se aplicó al conjunto integrado de datos de los 18 experimentos utilizando los parámetros por defecto y un falso valor P corregido por la tasa de descubrimiento. En cada momento se compararon muestras infectadas y simuladas, y los genes cuya expresión difería en más de 2 veces con una significación con un valor P de 0,05 se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial. Además del método descrito anteriormente, se aplicó una prueba estadística ortogonal de expresión diferencial a los datos utilizando una prueba estadística desarrollada por Baggerly et al. (22) para contar el número de etiquetas de secuencia expresadas asociadas con genes individuales, una característica común de ambos análisis en serie de datos de expresión génica (SAGE) y datos ARN-Seq. Cuando se compararon muestras infectadas y simuladas, los genes individuales se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial cuando su expresión difería por más de 2 veces con una significación con un valor de P de 0.05. Los genes expresados diferencialmente que se encontraban en la intersección de los conjuntos de genes identificados por ambos métodos descritos anteriormente se consideraron candidatos de alta calidad y se utilizaron como punto de partida para la investigación ulterior. La agrupación y la GSEA. Los datos de expresión normalizados y filtrados se sometieron a la agrupación de k-medias utilizando una métrica de distancia euclidiana donde los genes se agruparon por medio de valores de expresión génica normalizada (RPKM) para cada condición experimental. La agrupación se ajustó a 20 grupos de agrupamiento distintos, y los perfiles de expresión génica individuales agrupados se probaron para el enriquecimiento de términos de ontología génica (GO) asociados con genes individuales. En primer lugar, se realizó una prueba hipergeométrica de las anotaciones de GO mediante la implementación del paquete GOStats en cada uno de los conglomerados individuales obtenidos a partir de la agrupación k-media (24). Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en todo el conjunto de datos filtrados utilizando 100.000 permutaciones, mientras que se eliminaron duplicados y se aplicó un análisis de varianza. Un total de 1.419 categorías superaron un tamaño mínimo de característica de 10 y se utilizaron para la investigación ulterior. Las cohortes de genes con patrones de expresión compartidos a lo largo del tiempo se identificaron mediante la agrupación de k-medias; las que se encontraron enriquecidas para los DEG fueron posteriormente sometidas al análisis de vía mediante el sistema GeneMania (25). Utilizando un enfoque manual ad hoc, se identificaron vías relevantes y las conexiones entre ellas sobre la base de los datos existentes en Análisis de qRT-PCR. El ARNm purificado se convirtió en ADNc utilizando un kit de ARN-a-cDNA de alta capacidad (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de los números de copia viral se realizó mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR) como se describió previamente (26). La expresión anfitriona de los siguientes genes fue analizada con los ensayos de TaqMan (indicados entre paréntesis): activando el factor de transcripción 3 (ATF3; Hs00231069_m1), ATF4 (Hs00909569_g1), CEBPB (Hs00270923_s1), CEBPD (Hs00270931_s1), DDIT3 (Hs00358796_g1), FOS (Hs04194186_s1), JUN (Hs01103582_s1), EGR1 (Hs00152928_m1), IFI6 (Hs00242571_m1), IFIT1 (Hs01911452_s1), IFIT2 (Hs01922738_s1), IFIT3 (Hs01922738_s1) Los ensayos para el ARNr 18S (Hs99999901_s1 o Mm04277571_s1) se utilizaron para la normalización. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un instrumento ABI StepOne Plus. Tratamiento con PERKi y recolección para el análisis de Western blot. Las células U87MG fueron pretratadas durante 2 h con 10 M la proteína quinasa ARN similar al retículo endoplasmático (ER) cinasa (PERK) inhibidor (PERKi) GSK2606414 (número catalógico 516535; EMD Millipore) o dimetil sulfóxido (DMSO) en DMEM antes de la infección por VEEV TrD (MOI, 5). Después de 1 h, el inóculo viral fue eliminado y las células fueron lavadas con PBS estéril (1). El medio fue reemplazado A 16 hpi, el medio fue removido, y las células fueron lavadas con PBS y luego recolectadas para el análisis de Western blot. Derribado de EGR1 con siRNA. Células U87MG sembradas a 6,7 10 4 células por pozo en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 50 nM de preparación de lisato de proteína de siGenome y análisis de Western blot. Preparación de lisato de proteína y análisis de Western blot se realizaron como se describió previamente (27). Se utilizaron anticuerpos primarios frente a los siguientes anticuerpos: EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular), virus de la encefalitis equina policlonal TC83 (subtipo IA/B) proteína capsid (Recursos BEI), CHOP (anticuerpo L63F7; número de catálogo 2895; señalización celular), subunidad fosforilada de factor de iniciación eucariótica 2 (p-eIF2+; Ser51; anticuerpo D9G8; número de catálogo 3398; señalización celular), ATF4 (anticuerpo D4B8; número de catálogo 11815; señalización celular), caspasa activada 3 (antícuerpo Asp175; número de catálogo 9661; señalización celular), y peroxidasa-conjugada por caballos -actina (número de catálogo ab49900-100; Abcam). Análisis de inmunofluorescencia. Las células U87MG fueron cultivadas en tapas en una placa de 6 pozos, infectadas con VEEV TrD como se describe anteriormente, lavadas con PBS (sin Ca y Mg), y luego fijadas con formaldehído al 4%. Las células fueron permeabilizadas con Triton X-100 en PBS durante 20 min y luego lavadas dos veces con PBS. Las células fueron bloqueadas durante 10 min a temperatura ambiente en albúmina sérica bovina al 3% en PBS. Anticuerpos primarios consistentes en una proteína capsid VEEV (número catalógico NR-9403; Recursos BEI) diluido 1:600 y un anticuerpo EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular) diluido 1:400 fueron incubados en tampón fresco de bloqueo a 37°C durante 1 h y lavado A continuación se muestra una imagen representativa de cada muestra. Anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 568 (número catalógico A11057; Invitrogen) y anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 488 (número catalógico A21202; Invitrogen) diluidos 1:400 como anticuerpos secundarios y tratados de la misma manera que los anticuerpos primarios. DAPI (4=,6-di-amidino-2-fenilindol) diluido 1:1.000 para visualizar los núcleos. Se montaron las tapas sobre diapositivas de vidrio utilizando 10 l de medio de montaje Fluoromount G (número catalógico 0100-01; Southern Biotech). Se utilizó un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE2000-U para microscopía de fluorescencia. Las imágenes se vieron utilizando una lente de inmersión de aceite objetivo de 60. Todas las imágenes fueron sometidas a un promedio de cuatro líneas. Las imágenes fueron procesadas a través del software Nikon NIS-Elements AR Analysis (v3.2). CellTiter Glo y Caspasa 3/7 Glo ensayos. Los fibroblastos embrionarios del tipo salvaje y EGR1 / mouse (MEFs) fueron infectados con TrD en varios MOIs durante una hora y luego lavados con PBS, y el medio fue reemplazado. La viabilidad celular fue medida a las 24 h postinfección utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente Promega CellTiter (número catalógico G7571) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia fue leída mediante un detector de múltiples modos Beckman Coulter DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. De manera similar, la activación de caspasa en el tipo salvaje infectado y EGR1 / MEFs se midió a las 24 h postinfección utilizando un ensayo Promega Caspasa 3/7 Glo (catalog número G8090) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia se leyó utilizando el detector multimodo DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. Números de adhesión de secuencia de nucleótidos. Los datos de secuenciación en bruto para todas las carreras de ARN-Seq incluidas en este trabajo están disponibles públicamente en la base de datos NCBI BioProject bajo el número de adhesión PRJNA300864 (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA300864). Las líneas celulares comunes utilizadas para el estudio de la infección por VEEV incluyen células Vero y BHK; en este estudio, los astrocitos U87MG fueron elegidos como modelo in vitro debido a su relevancia fisiológica y mayor significación clínica; se realizaron experimentos iniciales para caracterizar la replicación viral en células U87MG; se midió la cinética de replicación de VEEV en células U87MG mediante ensayos en placa y mediante el monitoreo de los niveles de expresión de proteínas virales y ARN y el efecto citopático (ECP) en las células infectadas (Fig. 1); se observó una liberación viral tan temprana como 4 hpi, observándose 4 unidades log de virus, seguido de un aumento consistente de la replicación a 8 y 16 hpi (Fig. 1A). La replicación viral alcanzó su punto máximo a 16 hpi, y no se observó un aumento adicional de los La expresión vírica capsid siguió un patrón similar, siendo detectada proteína a 8 hpi y plastificación de expresión a 16 hpi (Fig. 1B). Entre las células U87MG infectadas, se observó una EPC significativa por microscopía a 24 hpi, con poca o ninguna EPC detectada a 16 hpi (datos no mostrados). De acuerdo con estas observaciones, se observó un aumento de la actividad de la caspasa 3/7 sólo a 24 hpi (Fig. 1C). Sobre la base de estos datos, los tiempos de 4, 8 y 16 hpi, reflejando las etapas tempranas, medias y tardías del ciclo de vida viral, respectivamente, fueron seleccionados para el análisis de ARN-Seq para proporcionar una visión dinámica del perfil del transcriptoma host-patógeno. Análisis de secuenciación de ARN de los astrocitos infectados por VEEV. Se aisló el ARNm de conjuntos triplicados de cultivos de células U87MG infectados con simulacros y VEEV, se purificó a 4, 8 y 16 hpi, y se utilizó para preparar bibliotecas de ARNc para ARN-Seq aguas abajo (ver Materiales y Métodos). En la Tabla 1 se muestra un resumen de alto nivel de los resultados de ARN-Seq. Las muestras de ARN VEEV fueron analizadas por RT-PCR cuantitativo en cada momento como un control para demostrar el aumento de la carga de ARN viral a lo largo del tiempo (Fig. 1D), consistente con el aumento del número de lecturas de ARN-Seq cartografiadas al genoma VEEV en puntos posteriores (Tabla 1). Para el análisis de ARN-Seq, los genes individuales se expresaron como el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón En la figura 2A se muestran los valores de expresión RPKM normalizados para cada muestra experimental y se pueden encontrar en el conjunto de datos S1 del material suplementario. La variación mínima de la muestra a la muestra en los valores de expresión dentro de las réplicas biológicas fue detectada constantemente (R 2 0,89 para todas las réplicas; datos no mostrados). Además, también se encontró que la variación de la intersample era mínima cuando se probó por pares a lo largo de todo el experimento utilizando los valores RPKM para los ARN de control de pico sintético ERCC97 (R 2 0,90 para todas las comparaciones; datos no mostrados). Como era de esperar, el análisis de dos componentes principales de los datos ARN-Seq para las células infectadas por simulacro de células frente a las infectadas por VEEV mostró una separación clara de las muestras a 16 hpi de las muestras en puntos Sin embargo, el agrupamiento de muestras infectadas por VVEV con muestras simuladas infectadas en puntos de tiempo anteriores sugiere que la respuesta a la infección viral se limitó a un estrecho subconjunto de genes de respuesta temprana, lo que supone una mayor carga de prueba en la identificación de genes expresados diferencialmente (DEGs) durante las primeras horas de infección. En este sentido, se utilizaron dos métodos ortogonales para identificar DEGs adecuados para una caracterización adicional: el método edgeR (21) y el método desarrollado por Baggerly et al. (22). Los genes identificados por un método se consideraron provisionalmente DEGs, y los identificados por ambos métodos eran DEGs candidatos a ser confirmados por qRT-PCR. Además de comparar los valores individuales de expresión génica para las células infectadas simuladamente y las células infectadas por VEEV en cada momento, también se compararon los valores de expresión génica en serie dentro de cada serie temporal de células infectadas por VEEV para los genes que no mostraron cambios estadísticamente significativos en la expresión en células infectadas simuladamente. Un esquema del análisis comparativo se muestra en la figura 2C. El número de DEGs estadísticamente significativos identificados por cada una de estas comparaciones se muestra en la figura 2D. Además, se utilizó el agrupamiento de k-medias (contra los valores normalizados de RPKM) para identificar cambios brutos en la expresión génica a lo largo del tiempo para cohortes de genes que potencialmente comparten la misma vía o desencadenantes reguladores (fig. 3 ; véase también Conjunto de datos S2 en el material suplementario). Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA; véase Material y Métodos En particular, el clúster 20 (tabla 2) se enriqueció significativamente para los genes involucrados en el control traslacional, la vía de señalización mediada por interferón tipo I y la vía de respuesta a proteínas desplegadas (valor P de GSEA 0,01). Aunque existe una conexión bien establecida entre el control traslacional y la EPU, una nueva conexión entre la EPU y la respuesta mediada por interferón tipo I en respuesta a la replicación viral fue sugerida por el análisis de la vía (ver Materiales y Métodos), implicando la respuesta al crecimiento temprano 1 (EGR1) como un puente potencial entre estas dos vías (Fig. 4). La EGR1 pertenece al clúster 20 y es fuertemente inducida durante la infección por VEEV, y varios otros genes asociados con la respuesta al interferón pertenecen al mismo clúster: IRF1, IFIT1, IFIT2, ISG15 e ILF3. EGR1 se ha asociado con aumentos en la expresión de activar el factor de transcripción 3 (ATF3) (28), que es un componente clave de la UPR y que también pertenece al clúster 20. Esta conexión representó un potencial a Anotaciones del proceso biológico obtenidas de Reactome para el clúster 20. Los identificadores de anotación del reactoma están indicados para cada anotación. Sólo se consideran anotaciones clasificadas por autor rastreable (TAS). TAP, transportador asociado con el procesamiento de antígenos; SRP, partícula de reconocimiento de señales. b Conjunto completo, el número total de genes en el genoma con un proceso biológico anotado; subconjunto, número total de genes expresados diferencialmente con un proceso biológico anotado. Red de genes relacionados con la respuesta del interferón tipo I y UPR. Círculos grandes, genes diferencialmente expresados; círculos pequeños, genes sin cambio significativo de expresión; círculos rojos, factores de respuesta tipo I al interferón; círculos amarillos, genes que regulan la transcripción del ADN; círculos azules, genes de respuesta a proteínas desplegadas; líneas rojas, genes involucrados en interacciones físicas proteína-proteína; líneas azules, genes involucrados en una vía común. Esta red fue sembrada con grupos k-medias 18 y 20, y muchos genes de proteína ribosómica fueron removidos. puente entre la vía UPR y la vía de respuesta al interferón, siendo EGR1 uno de los factores clave potenciales de transcripción que impulsan esta conexión. En consecuencia, se seleccionaron 15 genes de este análisis para su posterior caracterización por qRT-PCR (ver abajo): ATF3, activando el factor de transcripción 4 (ATF4), CEBPB, CEBPD, DDIT3/CHOP, EGR1, FOS, IFI6, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG15, ISG20, JUN y OASL. Los valores de expresión de estos genes, medidos por ARN-Seq, se muestran en la Fig. 5A y B. El análisis confirmatorio qRT-PCR indicó expresión génica concordante (fig. 5C y D). Los genes de respuesta al interferón inducidos están de acuerdo con los detectados en estudios previamente publicados (11, 29, 30) y estos genes sirvieron como control positivo interno. Además, se ha demostrado el vínculo entre la EGR1 y la vía del interferón; la EGR1 es inducida por IFN-® en fibroblastos de ratón y por IFN-®, -, y -® en fibroblastos humanos (31, 32). La EGR1 y la vía UPR fueron seleccionadas para su posterior análisis, ya que su papel en la infección por VEEV no ha sido elucidado. Los datos de análisis del ARN-Seq y la vía indicaron que los genes de respuesta al estrés y la UPR fueron inducidos después de la infección por VEEV. Durante una infección, las células anfitrionas responden al estrés celular resultante de una mayor traducción de proteínas virales y secreción al desencadenar el inicio de la vía de la UPR. La vía de la UPR es una respuesta celular adaptativa activada por el estrés del retículo endoplasmático (ER Con el fin de regular la homeostasis celular durante el plegado y la secreción de proteínas, la vía UPR ha desarrollado tres clases de sensores para asegurar la correcta regulación celular: la enzima inositolrequiriendo 1 (IRE1), la proteína cinasa ARN-como la ER cinasa (PERK), y activar el factor de transcripción 6 (ATF6) (33, 34). Durante la infección por VEEV, el brazo PERK de la UPR pareció estar alterado, ya que dos reguladores críticos de esta vía se expresaron diferencialmente: ATF4 y CHOP (DDIT3) (35). Para determinar si los DEGs alteraron la expresión proteica posterior, se realizó un análisis de manchas occidentales para CHOP, ATF4 y eIF2 fosforilado (p-eIF2). Tunicamicina, un inhibidor de la glucosilación Un análisis del curso del tiempo de las células U87MG tratadas con 1 M de tunicamicina indicó que 8 h de tratamiento proporcionaban la inducción más robusta de proteínas UPR (datos no mostrados). Las células VVEV infectadas pero no infectadas simuladamente o inactivadas por UV VVEV (UV-VEEV) mostraron un aumento espectacular en la expresión p-eIF2 + y un aumento modesto pero consistente en la expresión CHOP y ATF4 a 16 hpi (Fig. 6A). No se observó ningún cambio en la expresión proteica a 4 hpi (datos no mostrados). La microscopía confocal confirmó la regulación de CHOP y ATF4, demostrando un patrón de tinción más robusto y nuclear en las células infectadas por VVEV que en las células infectadas simuladas (Fig. 6C a E). Mientras que los niveles de expresión proteica Estos resultados son consistentes con la observación de que la expresión ATF4 está regulada a nivel traslacional en la inducción EPU (37). Como eIF2® puede ser fosforilada por múltiples cinasas (PERK, proteína cinasa ARN dependiente de doble cadena [PKR], control general no derrepresivo-2 [GCN2] e inhibidor hemeregulado [HRI]) (38), el inhibidor de PERK (PERKi) GSK2606414 fue utilizado para determinar si la fosforilación observada era dependiente de PERK. El tratamiento de las células infectadas por VEEV con PERKi dio lugar a una marcada disminución de la fosforilación eIF2® (Fig. 6B). Estos resultados indican que PERK contribuye a la fosforilación eIF2® pero que es probable que haya una quinasa adicional que contribuya al evento de fosforilación En conjunto, estos hallazgos indican que el brazo de PERK de la vía UPR se induce en puntos de tiempo posteriores a la infección por VVEV. EGR1 se regula en células infectadas y se localiza en el núcleo. EGR1 es un factor de transcripción que puede ser inducido por numerosas señales, incluyendo estrés oxidativo, hipoxemia y factores de crecimiento (39, 40). También se puede activar sobre la infección por virus de ADN y ARN, incluyendo virus Epstein-Barr, virus de hepatitis ratón, coronavirus murino y virus de encefalitis japonesa (41) (42) (43). El tratamiento de MEFs con el activador UPR thapsigargin se ha demostrado que induce la expresión EGR1 de una manera dependiente de PERK (44). Dado el vínculo entre EGR1 y UPR y la inducción robusta de EGR1 expresión mRNA después de la infección por VVE 4 y 5), se eligió EGR1 para un estudio posterior. La expresión proteica EGR1 después de la infección por VEEV fue analizada por el análisis de Western blot. Como estudios previos han indicado que EGR1 puede ser activado por el virus de la hepatitis del ratón independientemente de la replicación del virus (probablemente debido a la interrupción de la membrana celular después de la entrada) (41), se incluyó un control del virus inactivado por UV (VVVEV). Los niveles de proteína EGR1 se incrementaron después de la infección por VEEV en comparación con los niveles de células infecciosas simuladas y células infectadas por UV-VEEV (fig. 7A; compare los carriles 3, 6 y 9 ). La regulación más dramática de EGR1 se produjo a 16 hpi; esto se correlaciona con los niveles más altos de producción de VEEV capsid (fig. 1B Tras la inducción, se ha demostrado que la EGR1 se transloca al núcleo para inducir la expresión génica a través de la unión a la secuencia de unión de Egr (EBS) [GCG(G/T)GGCG] (40, 45). La microcopia confocal reveló altos niveles de EGR1 en los núcleos de células infectadas, mientras que sólo se detectaron bajos niveles de EGR1 tanto nucleares como citoplasmáticos en células simuladas (Fig. 7B). El tratamiento PERKi de células infectadas con VEEV resultó en una pérdida completa de inducción EGR1 (Fig. 7C), indicando que la EGR1 fue inducida de manera dependiente de PERK. Estos resultados demuestran que los niveles de proteína EGR1 y la localización nuclear se incrementan después de la infección por VEEV y que la inducción de EGR1 es dependiente La pérdida de EGR1 inhibe la apoptosis inducida por el VEEV pero no altera la cinética de la replicación del VEEV. Como EGR1 influye en la supervivencia celular y la apoptosis (46), se evaluó el impacto del EGR1 en la muerte celular inducida por el VEEV. Se observó escisión de Caspasa 3 en MEFs WT a 24 hpi cuando se infectaron con un MOI de 0,5 y comenzaron tan pronto como 16 hpi cuando se infectaron con un MOI de 5 (Fig. 8A ). En contraste, las células EGR1 / mostraron poco o ningún escisión de caspasa detectable tras la infección con el VEEV. Se realizaron dos conjuntos de experimentos para confirmar cuantitativamente estos resultados: ensayos de CellTiter Glo para medir la viabilidad celular total (producción de ATP) y Caspasa 3/7 Tanto WT como EGR1 / MEF mostraron disminuciones dosis-dependientes en la viabilidad celular después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que tenían células significativamente más viables en cada MOI examinadas (Fig. 8B). Concordantemente, se observó un aumento dosis-dependiente en la actividad de caspasa 3/7 después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que demostraban una actividad reducida de caspasa 3 en los MOIs de 0,5 y 5 (Fig. 8C). Estos resultados se replicaron en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1 (Fig. 8D). EGR1 ha demostrado regular negativamente la transcripción de BIRC5 (Survivina), un inhibidor de la apoptosis (IAP) miembro de la familia (47). Los datos de ARN-Seq indicaron que la expresión del gen BIRC5 disminuyó después de la infección por VVEV: log 2 -transformado de los valores de cambio del pliegue de la expresión génica normalizada fueron 1,16, 1,18, y 1,50 a 4, 8, y 16 hpi, respectivamente (ver Tabla S1 en el material suplementario y NBI BioProject número de adhesión PRJNA300864). Se utilizaron WT y EGR1 / MEFs para determinar si EGR1 influyó en la expresión del gen BIRC5 después de la infección por VVEV. La expresión BIRC5 disminuyó significativamente a 16 hpi en los MEFs infectados por VVEV, pero esta reducción no se observó en los MEFs infectados por VVEV1 / (Fig. 8E). La expresión del gen para el inhibidor de la apoptosis (XIAP), otro miembro de la familia IAP, no fue significativamente alterada después de la infección (datos no mostrados). Colectivamente, estos resultados demuestran que EGR1 contribuye a la apoptosis inducida por VEEV. Se determinó la cinética de replicación VEEV tanto para EGR1 / como para WT MEFs para determinar la relevancia de EGR1 en la replicación viral.Las células fueron infectadas en dos MOIs diferentes (0,5 y 5), y los sobrenadantes virales fueron recolectados en 4, 8, 16 y 24 hpi y analizados mediante análisis de placa.La cinética de replicación fue similar entre EGR1 / y WT MEFs en ambos MOIs, con títulos que alcanzaron un máximo de 16 hpi (fig. 9A). 9B). Estos resultados fueron replicados en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1. La transfección de siRNA dirigida a EGR1 resultó en una disminución del 90% en la expresión proteica EGR1 (Fig. 9D ) sin ningún efecto significativo en la replicación viral (Fig. 9C). Estos resultados sugieren que la disminución de la apoptosis observada en EGR1 / MEFs no se debió a la cinética de replicación VEEV alterada. A pesar de ser reconocida como una amenaza emergente, se sabe relativamente poco acerca de los mecanismos de virulencia de los alfavirus, en gran parte debido a una brecha de conocimiento en el interactoroma host-patógeno. La infección por VEEV a menudo resulta en encefalitis fatal y se sabe que inhibe tanto la transcripción celular como la traducción para En contraste, en el VVEE del SNC se ha demostrado que upregula numerosos genes tanto en la respuesta inflamatoria como en las vías apoptóticas (1, 48). Específicamente, numerosas citocinas proinflamatorias, incluyendo interleu-kin-1 (IL-1), IL-6, IL-12, glucógeno sintasa cinasa 3, oxido nítrico inducible sintasa, y factor de necrosis tumoral alfa (TNF- Con este fin, la identificación de transcripciones críticas expresadas de forma diferencial entre células infectadas clínicamente relevantes ayudará a una mayor comprensión de la patogénesis viral y puede resultar beneficiosa para la identificación de objetivos terapéuticos. En este estudio, los datos de análisis de red/ARN-Seq y los resultados de estudios de expresión proteica revelaron que la infección por VEEV resultó en la activación del brazo PERK de la vía EPU, incluyendo la activación de ATF4, CHOP y eIF2-fosforilación. Varios alfavirus han sido reportados previamente para secuestrar componentes clave de la vía EPU con el fin de promover la replicación viral, ya que la dependencia de virus envueltos en la ER para la síntesis de glucoproteínas virales asociadas a la envoltura y su transporte a la membrana plasmática a menudo enfatiza la ER debido a la rápida producción de proteínas virales (54, 55). La modulación de la UPR no es exclusiva de los alfavirus; más bien, es un rasgo compartido de muchos virus de ARN de sentido positivo. El virus del dengue ha demostrado suprimir PERK al inhibir la fosforilación continua de eIF2 para inhibir la apoptosis inmediata, aumentando la traducción de proteínas virales y ampliando la duración de la replicación viral productiva (34). Estudios con el virus de la hepatitis E (HEV) han demostrado que la expresión de la proteína capsid del HEV marco abierto de lectura 2 (ORF2) activa la expresión de CHOP y ATF4 (56). En el HEV, ORF2 se demostró estimular CHOP a través de estresadores de ER y elementos de respuesta aminoácidos (AARE) a través de la interacción con ATF4 (56). Los resultados mostrados aquí indican que durante la Durante la detección inicial del estrés ER, PERK es capaz de identificar proteínas mal plegadas en el lumen de la ER y fosforilatos eIF2® con el fin de iniciar las vías de prosurvival en la UPR a través de la actividad general En 24 hpi caspasa 3/7 se analizó la actividad utilizando el ensayo Caspasa 3/7 Glo. Los valores de cambio de pliegue para células simuladas se fijaron en un valor de 1. **, P 0.001. (E) EGR1 / y WT MEFs fueron simulados o VEEV infectados (MOI, 5). El ARN fue preparado, y la expresión genética fue determinada por qRT-PCR utilizando un ensayo TaqMan para BIRC5 (Survivin). Los datos mostrados son los valores del cambio de pliegue de la expresión génica normalizada determinado por el ciclo del umbral T *, P 0,005 (comparación de las células WT infectadas por VEEV y EGR1 /). Inhibición de la síntesis proteica (33, 34). VEEV parece inducir la UPR y promover el aumento de la fosforilación eIF2, que resulta en la inhibición traslacional de la mayoría de los ARNm, mientras que UPR aumenta selectivamente la traducción de ATF4. ATF4 es responsable de la expresión de genes que codifican proteínas involucradas en apoptosis, procesos redox, metabolismo de aminoácidos y reclutamiento de chaperona ER y es un conocido mediador de la vía PERK y CHOP (33, 34). La activación CHOP facilita la expresión aumentada de chaperonas celulares para contrarrestar la acumulación de proteínas mal dobladas (57). La falta de supresión del plegado de proteínas en células persistentemente estresadas, como durante una infección viral, puede resultar en la activación del factor de transcripción proapoptótico CHOP, lo que conduce a la supresión del linfoma de células antiapoptóticas de proteína B-2 (Bcl-2). CHOP también puede funcionar como factor de transcripción prosurvival al desfosforilar eIF2® a través de la activación de la proteína DNA dañado-inducible (GADD34) en un aspecto de retroalimentación autorreguladora (33, 34). Sin embargo, los datos presentados aquí apoyan un modelo por el cual la infección VEEV lleva a CHOP a funcionar en su papel proapoptótico, ya que no se detectó ningún cambio en la expresión génica de GADD34 por el análisis de ARN-Seq. Si bien la UPR fue inducida después de la infección VEEV, Esto es algo sorprendente, ya que se espera que la infección por VVEV induzca un estrés ER significativo debido a la producción masiva de proteínas virales durante el curso de una infección aguda robusta. Las proteínas estructurales del VVEV se traducen del ARN subgenómico viral en poliproteínas en la ER áspera. Las glucoproteínas precur-sor E1 y pE2 se ensamblan como heterodímeros en la ER, experimentando cambios conformacionales que requieren numerosas chaperonas (1, 58). Es posible que el VVEV haya desarrollado mecanismos para subvertir la inducción de la UPR. Para contrarrestar la UPR, las proteínas no estructurales (nsPs) del virus Chikungunya (CHIKV) han demostrado inhibir la expresión de ATF4 y otros genes objetivo conocidos de la UPR, incluyendo GRP78/BiP, GRP94 A través de la actividad nsP, CHIKV ha desarrollado un medio de suprimir la actividad UPR resultante del estrés ER inducido por la glucoproteína viral, evitando así la autofagia inmediata y la activación apoptótica. El capsid VEEV es responsable de interferir con el tráfico nucleocitoplasmático e inhibir la transcripción del ARNr y del ARNm y ha sido implicado en la regulación de la señal de tipo I IFN y la respuesta antiviral mediante la regulación de la producción de ARN viral y proteínas (1, 48, 60). Por lo tanto, hipotetizamos que la capacidad del capsid VEEV para inhibir la transcripción celular y el tráfico de bloqueo nucleocitoplasmático resulta en la inducción retarda de la UPR. Los resultados de un análisis detallado de la red basado en los datos existentes en la literatura, junto con los perfiles de expresión génica temporal obtenidos de este estudio, apuntan a que el EGR1 es un nodo importante en el nuevo vínculo entre la activación del VEEV de la respuesta de interferón tipo I y la UPR. Se sabe que el EGR1 forma un complejo de unión al ADN con C/EBPB, socio crítico de la dimerización de CHOP (61). Estudios anteriores han demostrado que la localización nuclear del CHOP puede actuar como inductor del EGR1 y que el CHOP puede actuar como cofactor transcripcional para la regulación de los genes objetivo del C/EBPB-EGR1 (61). Los resultados del análisis de la mancha occidental y la microscopía presentados en este estudio apoyan este modelo, ya que se encontró que la infección por VEV aumenta tanto los niveles generales como la distribución nuclear Los estudios anteriores demostraron la inducción de ARNm EGR1 por IFN-â en fibroblastos de ratón y por TNF-â, TNF-, IL-1, IFN-â, IFN-â e IFN-â en fibroblastos humanos (31, 32). EGR1, también conocido como Zif268 y NGF1-A, es una proteína de dedo de zinc y factor de transcripción mamífero. Ha sido implicada en la proliferación y diferenciación celular, pero también puede tener funciones proapoptóticas, dependiendo del tipo celular y estímulo (62). De particular interés, EGR1 controla directamente la proliferación cuando se activa por la proteína activada por mitogen quinasa/vía cinasa regulada por señal extracelular en astrocitos estimulados por mitogen (63). Se han observado cambios inducidos por virus en la expresión EGR1 en En los astrocitos infectados por VIH-1, se encontró que la regulación de la EGR1 fue inducida por Tat a través de la transactivación del promotor de la EGR1, lo que llevó a la disfunción celular y a la neurotoxicidad inducida por Tat (64). También se ha demostrado que el aumento de las cantidades de ARNm EGR1 actúa de una manera específica de la región, correspondiendo temporalmente con la producción de ARN viral en los tejidos cerebrales de ratas infectadas por el virus de la rabia o el virus de la enfermedad de Borna (65). En resumen, el estudio actual demuestra un vínculo potencial entre la activación de la EPU y la EGR1. Hasta la fecha, los mecanismos subyacentes a la patogénesis del VEEV y la degeneración neuronal subsiguiente han sido sólo parcialmente elucidados, por lo que determinar el papel de la EGR1 y la UPR puede jugar un papel significativo en el desarrollo de una nueva diana terapéutica que resulte en una disminución de la muerte neuronal y las secuelas neuronales posteriores que resultan de la infección.

¿Qué prueba de laboratorio se puede utilizar para monitorear la expresión de proteínas?

El virus venezolano de la encefalitis equina induce la apotosis a través de la activación de la respuesta de proteínas no plegadas de EGR1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4794670/SHA: f4aa788ab898b28b00ee103e4d4ab24a2c684cafAutores: Baer, Alan; Lundberg, Lindsay; Swales, Danielle; Waybright, Nicole; Pinkham, Chelsea; Dinman, Jonathan D.; Jacobs, Jonathan L.; Kehn-Hall, KyleneFecha: 2016-03-11DOI: 10.1128/jvi.0282-15Licencia: cc-byAbstract: El virus venezolano de la encefalitis equina (VEEV) es El aumento de la circulación y diseminación en las Américas de VVEV y otros arbovirus encefalíticos, como el virus de la encefalitis equina oriental y el virus del Nilo Occidental, subrayan la necesidad de investigar la patogénesis de la encefalomielitis viral para el desarrollo de nuevas contramedidas médicas. La dinámica hospedante-patógena de las células de astrocitoma humano U87MG infectadas con asnos VVEV Trinidad se determinó mediante la secuenciación de ARN (ARN-Seq) de poli(A) y mRNAs. Para identificar las alteraciones críticas que tienen lugar en el transcriptoma del huésped tras la infección por VVEV, se recolectaron muestras a 4, 8 y 16 h de postinfección y se adquirieron datos de ARN-Seq utilizando una plataforma PGM Ion Torrent. Se observó una expresión diferencial de respuesta al interferón, factores de respuesta al estrés La proteína cinasa ARN similar a la proteína endoplasmática retículo cinasa (PERK) brazo de la UPR fue activado, ya que la expresión de activando el factor de transcripción 4 (ATF4) y CHOP (DDIT3), reguladores críticos de la vía, fue alterada después de la infección. La expresión del factor de transcripción respuesta temprana al crecimiento 1 (EGR1) fue inducida de una manera dependiente de PERK. EGR1(−/−) fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) demostró menor susceptibilidad a la muerte celular inducida por VEEV que los MEFs de tipo salvaje isogénico, lo que indica que EGR1 modula las vías proapoptóticas después de la infección VEEV. La influencia de EGR1 es de gran importancia, ya que el daño neuronal puede conducir a secuelas a largo plazo en En casos graves, la propagación viral se dirige al tejido neuronal, resultando en una inflamación significativa y potencialmente mortal dependiente de una combinación de interacciones virus-anfitriona. Actualmente no hay terapias para infecciones causadas por alfavirus encefalíticos debido a una comprensión incompleta de su patogénesis molecular. El virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) es un alfavirus que es prevalente en las Américas y que es capaz de infectar caballos y humanos. Aquí utilizamos la secuenciación de ARN de próxima generación para identificar alteraciones diferenciales en los astrocitos infectados con VEEV. Nuestros resultados indicaron que la abundancia de transcripciones asociadas con el interferón y las vías de respuesta proteica desplegadas se alteraron después de la infección y demostraron que la respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1) contribuyó a la muerte celular inducida por VEEV. Texto: Venezuelan equina encefalitis virus (VE El VEEV es un virus de ARN de cadena positiva que es transmitido por mosquitos y que está naturalmente presente en depósitos de roedores (1). Hay seis subtipos que se clasifican por su rango geográfico y patología en equinos y humanos. Las dos cepas epizoóticas, IA/B y IC, surgieron de mutaciones entre las cepas enzoóticas (2). Las cepas IA/B y IC son de especial preocupación debido al aumento de las tasas de morbilidad y mortalidad y los riesgos asociados con la amplificación viral y el posible derrame de especies (2). En los seres humanos, el VEEV causa una enfermedad febril tipificada por fiebre, malestar y vómitos. En algunos casos, la infección progresa hacia el sistema nervioso central (SNC) y síntomas neurológicos, como confusión, ataxia y convulsiones, se manifiestan. La tasa de mortalidad entre los casos con síntomas neurológicos puede ser de hasta 35% en niños y 10% en adultos, con déficits neurológicos a largo plazo a menudo vistos en sobrevivientes (2). En 1995, un brote de VEEV en Colombia y Venezuela dio lugar a más de 100.000 casos humanos (3). Además de brotes naturales, el VEEV también es una preocupación desde una perspectiva bioterrorista, ya que puede crecer a altos títulos, requiere una dosis infecciosa baja, y contiene múltiples serotipos. Tanto la ex Unión Soviética como los Estados Unidos anteriormente armaron el virus, produciendo grandes cantidades para sus programas de armas biológicas ofensivas ya desactivadas (4). Actualmente, la cepa vacuna TC83 se utiliza en caballos y para personal de alto riesgo; sin embargo, debido a la baja tasa de seroconversión lograda con esta vacuna (5) y su dependencia de dos mutaciones atenuantes únicas (6), se considera no a Hasta la fecha no existen tratamientos aprobados por la FDA para la infección por VEEV, y se requieren estudios adicionales para aclarar los mecanismos asociados con la patogénesis subyacente del VEEV. Los estudios transcriptómicos virales y de huésped pueden proporcionar una gran cantidad de información sobre los mecanismos patógenos subyacentes y las interacciones posteriores al curso de una infección. El uso de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de virus previamente no característicos y el establecimiento de numerosos sistemas experimentales nuevos que redefinieron las interacciones virus-anfitriones. Hasta la fecha, varios estudios han examinado las alteraciones en el transcriptoma del huésped después de la infección por VEEV. Un análisis comparativo de microarray entre células infectadas persistentemente con VEEV y células capaces de limpiar VEEV resultó en la identificación de PARP12L como factor antiviral (8). Una comparación molecular utilizando microarrays de respuestas basadas en el huésped a la cepa TC83 fue capaz de identificar biomarcadores diferenciando entre los grupos que responden a la vacuna y los que no responden a la vacuna, así como la implicación de interferón (IFN), vías inducidas por interferón, receptores similares a los de Toll (TLR) y vías relacionadas con la interleucina 12 (IL-12) (9). Un estudio que examinó el papel de la adhesión y los factores inflamatorios en ratones CD-1 infectados por VEEV encontró modulación viral de la expresión de la matriz extracelular y genes de adhesión, como las integrinas (Itgáxis, Itg2, 3 y 7), las cadherinas 1 y 2, la molécula de adhesión de células vasculares 1, y la molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1), en los cerebros de ratones infectados por VEEV (10). Un estudio de Sharma et al. utilizaron microarrays para analizar los cambios en la expresión génica en el tejido cerebral de ratones infectados por VVEV durante el curso de una infección, descubriendo numerosas vías inmunes involucradas en la presentación de antígenos, inflamación, apoptosis y la respuesta antiviral tradicional (Cxcl10, CxCl11, Ccl5, Ifr7, Ifi27, Oas1b, Fcerg1, Mif, clusterin, e importante complejo de histocompatibilidad [MHC] clase II) (11). Un segundo estudio del mismo grupo identificó la regulación de los microRNAs (miRNAs) en los cerebros de ratones infectados por VVEV, lo que permitió la correlación de los cambios de miRNA con los datos de expresión de mRNA anteriores (11, 12). Estos análisis sugieren que el VEEV puede estar utilizando miRNAs celulares para regular el ARNm aguas abajo, lo que puede corresponder con los cambios histológicos inducidos por el VEEV en el sistema nervioso (11, 12). En el estudio actual, la secuenciación del ARNm de la próxima generación (ARN-Seq) se utilizó para identificar alteraciones clínicamente relevantes en el transcriptoma del ARNm de los astrocitos humanos infectados con la cepa de tipo salvaje (WT) VEEV Trinidad burro (TrD). El análisis de mRNAs huésped por ARN-Seq proporciona una visión novedosa de cómo un huésped responde a una infección viral a través de la identificación de un amplio y dinámico rango de transcripciones de una manera imparcial. Secuencia selectiva de mRNAs, específicamente, poliadenylated [poli(A)] transcripciones, que representan el 1% de Como el VEEV ha demostrado infectar productivamente a los astrocitos tanto in vitro como in vivo (14, 15), elegimos los astrocitos como nuestro modelo de interés. Los astrocitos son las células más abundantes del cerebro, superando a las neuronas por al menos 5 veces (16), proporcionando un recurso abundante para la replicación viral dentro del cerebro. Además de su bien descrito papel estructural en el tejido neuronal, los trocitos desempeñan papeles críticos en otros procesos, incluyendo la regulación del flujo sanguíneo y de la barrera hematoencefálica, la transmisión sinapsis y la respuesta a la infección (16). Se ha demostrado que los astrocitos infectados por el VEEV producen citocinas múltiples, incluyendo IL-8, IL-17, interferón gamma (IFN- +), y proteína 10 inducida por interferón gamma, todas las cuales se encontraron asociadas con atenuación viral (14). Con el fin de obtener una visión dinámica del interactoma virus-anfitrión, se utilizó el ARN-Seq para monitorear los cambios en la expresión génica en los astrocitos infectados por VEEV TrD a las 4, 8 y 16 h de postinfección (hpi). Al observar las alteraciones en múltiples momentos tempranos utilizando réplicas biológicas triplicadas, se genera un rango robusto y dinámico de información, y esta información proporciona un aumento tanto en la potencia como en la exactitud de la detección de transcripciones expresadas diferencialmente en un modelo clínico altamente relevante (17). Entre las células infectadas por VEEV, se observó un aumento en los genes regulados por interferón, incluyendo IFIT1, IFIT2, IFIT3 y OASL. También se observó el aumento en la expresión de genes involucrados en la vía de respuesta proteica inducida por estrés (UPR). Curiosamente, la infección por VEEV resultó en un La identificación de ARNm del huésped cuya expresión se altera después de la replicación del VEEV, específicamente, EGR1 y sus interactores arriba y abajo, puede proporcionar nuevos objetivos terapéuticos basados en el huésped críticos para la replicación del VEEV y una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes que sustentan la replicación del alfavirus. Infecciones virales y ensayos de placa. Se obtuvo TrD del VEEV de Recursos del BEI. Todos los experimentos con VEEV TrD se realizaron bajo condiciones de bioseguridad nivel 3 (BSL-3). Todo trabajo que involucra a agentes selectos está registrado en los Centros de Control y Prevención de Enfermedades y se llevó a cabo en el Laboratorio de Investigación Biomédica de la Universidad George Mason, que está registrado de acuerdo con las regulaciones federales de agentes selectos. Las células fueron infectadas durante 1 h a 37 °C y rotaron cada 15 minutos para asegurar una cobertura adecuada. Las células fueron lavadas con solución salina fosfatada (PBS), y se añadió un medio de crecimiento completo a las células. Se recolectaron sobrenadantes virales y células en varias ocasiones para su posterior análisis. Los ensayos de placa se realizaron como se describió anteriormente (18). Aislamiento de mRNA y preparación de biblioteca poli(A). El ARN de células U87MG fue purificado tanto de TrD VEEV infectado (nivel de bioseguridad 3) como de células U87MG simuladas a 4, 8 y 16 hpi utilizando un kit de aislamiento de mirVana (Tecnologías de Vida). El control de calidad del ARN purificado se realizó a partir de un bioanalizador Agilent 2100, y se utilizó un corte de integridad de ARN número de 8 A continuación, se añadió una mezcla de control de pico de ARN ARN ARN External Controls Consortium (ERCC) a las entradas totales de ARN (10 g de ARN) antes de la selección de poli(A) utilizando un kit de Dynabeads de Life Technologies mRNA Direct. La preparación de una biblioteca de ARN de transcriptoma completo de ARNm purificado se llevó a cabo utilizando un kit de Ion Total ARN-Seq (v2; Life Technologies). El control de calidad de las bibliotecas de cDNA se llevó a cabo utilizando el bioanalizador Agilent 2100 junto con pruebas de esterilidad para la eliminación de bibliotecas para la secuenciación de un laboratorio BSL-3 a BSL-2. Secuenciación de ARN. La preparación de plantillas de biblioteca se realizó en una plataforma One Touch 2 (Life Technologies). La secuenciación de A Un total de 119 millones de lecturas de secuenciación y un promedio de 6,6 millones de lecturas por muestra fueron utilizados como entrada en nuestra tubería de análisis. A menos que se indique lo contrario, el análisis de ARN-Seq aguas abajo se llevó a cabo utilizando la biogenómica CLC Workbench (v7). Las lecturas de ARN-Seq en bruto fueron recortadas para eliminar cualquier fragmento de adaptador de secuenciación residual que permaneciera en los 5= o 3= extremos después de la secuenciación. Además, el recorte final de las lecturas se realizó utilizando el algoritmo Mott modificado con una puntuación de calidad Q20, y cualquier lectura de menos de 15 pb fue descartada. Tras el recorte de lectura, las lecturas fueron cartografiadas al genoma humano hg19 con los siguientes parámetros ARN-Seq: un límite de 10 hits para múltiples posiciones cartográficas, una fracción de similitud de 0,8, una fracción El nivel de expresión de genes y transcripciones individuales se calculó utilizando el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas cartográficas (RPKM) del método Mortazavi et al. (19). Además, las lecturas no cartográficas también fueron cartografiadas al conjunto de secuencias de ARN sintética ERCC92 (20), así como al genoma de referencia VEEV (número de adhesión GenBank L01442). En todas las muestras, el coeficiente de correlación (R 2) entre el número de lecturas esperadas y el número de lecturas cartográficas para los controles de pico en ERCC92 fue superior a 0.90. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los resultados de secuenciación general. El filtrado postmapping de todos los datos de ARN-Seq se llevó a cabo junto a incluir sólo genes con al menos un mapa único leído (26.230 genes permanecieron El análisis de componentes principales del conjunto de datos filtrados resultante (13.906 genes en total) se realizó utilizando recuentos brutos de lecturas exclusivamente cartografiadas (ver Fig. 2A ). Los valores de expresión RPKM restantes para cada gen incluido en el conjunto de datos filtrados se sometieron a normalización cuantitativa con un corte del 5%. En la Fig. 2B se muestra un gráfico de caja de valores RPKM transformados para cada muestra antes de la normalización. El valor R 2 para la variación de muestra a muestra en pares dentro de cada conjunto de réplica biológica se observó un rango de 0,89 a 0,99, lo que indica que nuestras réplicas biológicas fueron consistentes y no mostraron un sesgo fuerte (datos no mostrados). En primer lugar, el análisis empírico del algoritmo de expresión génica diferencial, parte del paquete edgeR Bioconductor (21), se aplicó al conjunto integrado de datos de los 18 experimentos utilizando los parámetros por defecto y un falso valor P corregido por la tasa de descubrimiento. En cada momento se compararon muestras infectadas y simuladas, y los genes cuya expresión difería en más de 2 veces con una significación con un valor P de 0,05 se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial. Además del método descrito anteriormente, se aplicó una prueba estadística ortogonal de expresión diferencial a los datos utilizando una prueba estadística desarrollada por Baggerly et al. (22) para contar el número de etiquetas de secuencia expresadas asociadas con genes individuales, una característica común de ambos análisis en serie de datos de expresión génica (SAGE) y datos ARN-Seq. Cuando se compararon muestras infectadas y simuladas, los genes individuales se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial cuando su expresión difería por más de 2 veces con una significación con un valor de P de 0.05. Los genes expresados diferencialmente que se encontraban en la intersección de los conjuntos de genes identificados por ambos métodos descritos anteriormente se consideraron candidatos de alta calidad y se utilizaron como punto de partida para la investigación ulterior. La agrupación y la GSEA. Los datos de expresión normalizados y filtrados se sometieron a la agrupación de k-medias utilizando una métrica de distancia euclidiana donde los genes se agruparon por medio de valores de expresión génica normalizada (RPKM) para cada condición experimental. La agrupación se ajustó a 20 grupos de agrupamiento distintos, y los perfiles de expresión génica individuales agrupados se probaron para el enriquecimiento de términos de ontología génica (GO) asociados con genes individuales. En primer lugar, se realizó una prueba hipergeométrica de las anotaciones de GO mediante la implementación del paquete GOStats en cada uno de los conglomerados individuales obtenidos a partir de la agrupación k-media (24). Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en todo el conjunto de datos filtrados utilizando 100.000 permutaciones, mientras que se eliminaron duplicados y se aplicó un análisis de varianza. Un total de 1.419 categorías superaron un tamaño mínimo de característica de 10 y se utilizaron para la investigación ulterior. Las cohortes de genes con patrones de expresión compartidos a lo largo del tiempo se identificaron mediante la agrupación de k-medias; las que se encontraron enriquecidas para los DEG fueron posteriormente sometidas al análisis de vía mediante el sistema GeneMania (25). Utilizando un enfoque manual ad hoc, se identificaron vías relevantes y las conexiones entre ellas sobre la base de los datos existentes en Análisis de qRT-PCR. El ARNm purificado se convirtió en ADNc utilizando un kit de ARN-a-cDNA de alta capacidad (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de los números de copia viral se realizó mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR) como se describió previamente (26). La expresión anfitriona de los siguientes genes fue analizada con los ensayos de TaqMan (indicados entre paréntesis): activando el factor de transcripción 3 (ATF3; Hs00231069_m1), ATF4 (Hs00909569_g1), CEBPB (Hs00270923_s1), CEBPD (Hs00270931_s1), DDIT3 (Hs00358796_g1), FOS (Hs04194186_s1), JUN (Hs01103582_s1), EGR1 (Hs00152928_m1), IFI6 (Hs00242571_m1), IFIT1 (Hs01911452_s1), IFIT2 (Hs01922738_s1), IFIT3 (Hs01922738_s1) Los ensayos para el ARNr 18S (Hs99999901_s1 o Mm04277571_s1) se utilizaron para la normalización. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un instrumento ABI StepOne Plus. Tratamiento con PERKi y recolección para el análisis de Western blot. Las células U87MG fueron pretratadas durante 2 h con 10 M la proteína quinasa ARN similar al retículo endoplasmático (ER) cinasa (PERK) inhibidor (PERKi) GSK2606414 (número catalógico 516535; EMD Millipore) o dimetil sulfóxido (DMSO) en DMEM antes de la infección por VEEV TrD (MOI, 5). Después de 1 h, el inóculo viral fue eliminado y las células fueron lavadas con PBS estéril (1). El medio fue reemplazado A 16 hpi, el medio fue removido, y las células fueron lavadas con PBS y luego recolectadas para el análisis de Western blot. Derribado de EGR1 con siRNA. Células U87MG sembradas a 6,7 10 4 células por pozo en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 50 nM de preparación de lisato de proteína de siGenome y análisis de Western blot. Preparación de lisato de proteína y análisis de Western blot se realizaron como se describió previamente (27). Se utilizaron anticuerpos primarios frente a los siguientes anticuerpos: EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular), virus de la encefalitis equina policlonal TC83 (subtipo IA/B) proteína capsid (Recursos BEI), CHOP (anticuerpo L63F7; número de catálogo 2895; señalización celular), subunidad fosforilada de factor de iniciación eucariótica 2 (p-eIF2+; Ser51; anticuerpo D9G8; número de catálogo 3398; señalización celular), ATF4 (anticuerpo D4B8; número de catálogo 11815; señalización celular), caspasa activada 3 (antícuerpo Asp175; número de catálogo 9661; señalización celular), y peroxidasa-conjugada por caballos -actina (número de catálogo ab49900-100; Abcam). Análisis de inmunofluorescencia. Las células U87MG fueron cultivadas en tapas en una placa de 6 pozos, infectadas con VEEV TrD como se describe anteriormente, lavadas con PBS (sin Ca y Mg), y luego fijadas con formaldehído al 4%. Las células fueron permeabilizadas con Triton X-100 en PBS durante 20 min y luego lavadas dos veces con PBS. Las células fueron bloqueadas durante 10 min a temperatura ambiente en albúmina sérica bovina al 3% en PBS. Anticuerpos primarios consistentes en una proteína capsid VEEV (número catalógico NR-9403; Recursos BEI) diluido 1:600 y un anticuerpo EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular) diluido 1:400 fueron incubados en tampón fresco de bloqueo a 37°C durante 1 h y lavado A continuación se muestra una imagen representativa de cada muestra. Anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 568 (número catalógico A11057; Invitrogen) y anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 488 (número catalógico A21202; Invitrogen) diluidos 1:400 como anticuerpos secundarios y tratados de la misma manera que los anticuerpos primarios. DAPI (4=,6-di-amidino-2-fenilindol) diluido 1:1.000 para visualizar los núcleos. Se montaron las tapas sobre diapositivas de vidrio utilizando 10 l de medio de montaje Fluoromount G (número catalógico 0100-01; Southern Biotech). Se utilizó un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE2000-U para microscopía de fluorescencia. Las imágenes se vieron utilizando una lente de inmersión de aceite objetivo de 60. Todas las imágenes fueron sometidas a un promedio de cuatro líneas. Las imágenes fueron procesadas a través del software Nikon NIS-Elements AR Analysis (v3.2). CellTiter Glo y Caspasa 3/7 Glo ensayos. Los fibroblastos embrionarios del tipo salvaje y EGR1 / mouse (MEFs) fueron infectados con TrD en varios MOIs durante una hora y luego lavados con PBS, y el medio fue reemplazado. La viabilidad celular fue medida a las 24 h postinfección utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente Promega CellTiter (número catalógico G7571) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia fue leída mediante un detector de múltiples modos Beckman Coulter DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. De manera similar, la activación de caspasa en el tipo salvaje infectado y EGR1 / MEFs se midió a las 24 h postinfección utilizando un ensayo Promega Caspasa 3/7 Glo (catalog número G8090) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia se leyó utilizando el detector multimodo DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. Números de adhesión de secuencia de nucleótidos. Los datos de secuenciación en bruto para todas las carreras de ARN-Seq incluidas en este trabajo están disponibles públicamente en la base de datos NCBI BioProject bajo el número de adhesión PRJNA300864 (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA300864). Las líneas celulares comunes utilizadas para el estudio de la infección por VEEV incluyen células Vero y BHK; en este estudio, los astrocitos U87MG fueron elegidos como modelo in vitro debido a su relevancia fisiológica y mayor significación clínica; se realizaron experimentos iniciales para caracterizar la replicación viral en células U87MG; se midió la cinética de replicación de VEEV en células U87MG mediante ensayos en placa y mediante el monitoreo de los niveles de expresión de proteínas virales y ARN y el efecto citopático (ECP) en las células infectadas (Fig. 1); se observó una liberación viral tan temprana como 4 hpi, observándose 4 unidades log de virus, seguido de un aumento consistente de la replicación a 8 y 16 hpi (Fig. 1A). La replicación viral alcanzó su punto máximo a 16 hpi, y no se observó un aumento adicional de los La expresión vírica capsid siguió un patrón similar, siendo detectada proteína a 8 hpi y plastificación de expresión a 16 hpi (Fig. 1B). Entre las células U87MG infectadas, se observó una EPC significativa por microscopía a 24 hpi, con poca o ninguna EPC detectada a 16 hpi (datos no mostrados). De acuerdo con estas observaciones, se observó un aumento de la actividad de la caspasa 3/7 sólo a 24 hpi (Fig. 1C). Sobre la base de estos datos, los tiempos de 4, 8 y 16 hpi, reflejando las etapas tempranas, medias y tardías del ciclo de vida viral, respectivamente, fueron seleccionados para el análisis de ARN-Seq para proporcionar una visión dinámica del perfil del transcriptoma host-patógeno. Análisis de secuenciación de ARN de los astrocitos infectados por VEEV. Se aisló el ARNm de conjuntos triplicados de cultivos de células U87MG infectados con simulacros y VEEV, se purificó a 4, 8 y 16 hpi, y se utilizó para preparar bibliotecas de ARNc para ARN-Seq aguas abajo (ver Materiales y Métodos). En la Tabla 1 se muestra un resumen de alto nivel de los resultados de ARN-Seq. Las muestras de ARN VEEV fueron analizadas por RT-PCR cuantitativo en cada momento como un control para demostrar el aumento de la carga de ARN viral a lo largo del tiempo (Fig. 1D), consistente con el aumento del número de lecturas de ARN-Seq cartografiadas al genoma VEEV en puntos posteriores (Tabla 1). Para el análisis de ARN-Seq, los genes individuales se expresaron como el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón En la figura 2A se muestran los valores de expresión RPKM normalizados para cada muestra experimental y se pueden encontrar en el conjunto de datos S1 del material suplementario. La variación mínima de la muestra a la muestra en los valores de expresión dentro de las réplicas biológicas fue detectada constantemente (R 2 0,89 para todas las réplicas; datos no mostrados). Además, también se encontró que la variación de la intersample era mínima cuando se probó por pares a lo largo de todo el experimento utilizando los valores RPKM para los ARN de control de pico sintético ERCC97 (R 2 0,90 para todas las comparaciones; datos no mostrados). Como era de esperar, el análisis de dos componentes principales de los datos ARN-Seq para las células infectadas por simulacro de células frente a las infectadas por VEEV mostró una separación clara de las muestras a 16 hpi de las muestras en puntos Sin embargo, el agrupamiento de muestras infectadas por VVEV con muestras simuladas infectadas en puntos de tiempo anteriores sugiere que la respuesta a la infección viral se limitó a un estrecho subconjunto de genes de respuesta temprana, lo que supone una mayor carga de prueba en la identificación de genes expresados diferencialmente (DEGs) durante las primeras horas de infección. En este sentido, se utilizaron dos métodos ortogonales para identificar DEGs adecuados para una caracterización adicional: el método edgeR (21) y el método desarrollado por Baggerly et al. (22). Los genes identificados por un método se consideraron provisionalmente DEGs, y los identificados por ambos métodos eran DEGs candidatos a ser confirmados por qRT-PCR. Además de comparar los valores individuales de expresión génica para las células infectadas simuladamente y las células infectadas por VEEV en cada momento, también se compararon los valores de expresión génica en serie dentro de cada serie temporal de células infectadas por VEEV para los genes que no mostraron cambios estadísticamente significativos en la expresión en células infectadas simuladamente. Un esquema del análisis comparativo se muestra en la figura 2C. El número de DEGs estadísticamente significativos identificados por cada una de estas comparaciones se muestra en la figura 2D. Además, se utilizó el agrupamiento de k-medias (contra los valores normalizados de RPKM) para identificar cambios brutos en la expresión génica a lo largo del tiempo para cohortes de genes que potencialmente comparten la misma vía o desencadenantes reguladores (fig. 3 ; véase también Conjunto de datos S2 en el material suplementario). Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA; véase Material y Métodos En particular, el clúster 20 (tabla 2) se enriqueció significativamente para los genes involucrados en el control traslacional, la vía de señalización mediada por interferón tipo I y la vía de respuesta a proteínas desplegadas (valor P de GSEA 0,01). Aunque existe una conexión bien establecida entre el control traslacional y la EPU, una nueva conexión entre la EPU y la respuesta mediada por interferón tipo I en respuesta a la replicación viral fue sugerida por el análisis de la vía (ver Materiales y Métodos), implicando la respuesta al crecimiento temprano 1 (EGR1) como un puente potencial entre estas dos vías (Fig. 4). La EGR1 pertenece al clúster 20 y es fuertemente inducida durante la infección por VEEV, y varios otros genes asociados con la respuesta al interferón pertenecen al mismo clúster: IRF1, IFIT1, IFIT2, ISG15 e ILF3. EGR1 se ha asociado con aumentos en la expresión de activar el factor de transcripción 3 (ATF3) (28), que es un componente clave de la UPR y que también pertenece al clúster 20. Esta conexión representó un potencial a Anotaciones del proceso biológico obtenidas de Reactome para el clúster 20. Los identificadores de anotación del reactoma están indicados para cada anotación. Sólo se consideran anotaciones clasificadas por autor rastreable (TAS). TAP, transportador asociado con el procesamiento de antígenos; SRP, partícula de reconocimiento de señales. b Conjunto completo, el número total de genes en el genoma con un proceso biológico anotado; subconjunto, número total de genes expresados diferencialmente con un proceso biológico anotado. Red de genes relacionados con la respuesta del interferón tipo I y UPR. Círculos grandes, genes diferencialmente expresados; círculos pequeños, genes sin cambio significativo de expresión; círculos rojos, factores de respuesta tipo I al interferón; círculos amarillos, genes que regulan la transcripción del ADN; círculos azules, genes de respuesta a proteínas desplegadas; líneas rojas, genes involucrados en interacciones físicas proteína-proteína; líneas azules, genes involucrados en una vía común. Esta red fue sembrada con grupos k-medias 18 y 20, y muchos genes de proteína ribosómica fueron removidos. puente entre la vía UPR y la vía de respuesta al interferón, siendo EGR1 uno de los factores clave potenciales de transcripción que impulsan esta conexión. En consecuencia, se seleccionaron 15 genes de este análisis para su posterior caracterización por qRT-PCR (ver abajo): ATF3, activando el factor de transcripción 4 (ATF4), CEBPB, CEBPD, DDIT3/CHOP, EGR1, FOS, IFI6, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG15, ISG20, JUN y OASL. Los valores de expresión de estos genes, medidos por ARN-Seq, se muestran en la Fig. 5A y B. El análisis confirmatorio qRT-PCR indicó expresión génica concordante (fig. 5C y D). Los genes de respuesta al interferón inducidos están de acuerdo con los detectados en estudios previamente publicados (11, 29, 30) y estos genes sirvieron como control positivo interno. Además, se ha demostrado el vínculo entre la EGR1 y la vía del interferón; la EGR1 es inducida por IFN-® en fibroblastos de ratón y por IFN-®, -, y -® en fibroblastos humanos (31, 32). La EGR1 y la vía UPR fueron seleccionadas para su posterior análisis, ya que su papel en la infección por VEEV no ha sido elucidado. Los datos de análisis del ARN-Seq y la vía indicaron que los genes de respuesta al estrés y la UPR fueron inducidos después de la infección por VEEV. Durante una infección, las células anfitrionas responden al estrés celular resultante de una mayor traducción de proteínas virales y secreción al desencadenar el inicio de la vía de la UPR. La vía de la UPR es una respuesta celular adaptativa activada por el estrés del retículo endoplasmático (ER Con el fin de regular la homeostasis celular durante el plegado y la secreción de proteínas, la vía UPR ha desarrollado tres clases de sensores para asegurar la correcta regulación celular: la enzima inositolrequiriendo 1 (IRE1), la proteína cinasa ARN-como la ER cinasa (PERK), y activar el factor de transcripción 6 (ATF6) (33, 34). Durante la infección por VEEV, el brazo PERK de la UPR pareció estar alterado, ya que dos reguladores críticos de esta vía se expresaron diferencialmente: ATF4 y CHOP (DDIT3) (35). Para determinar si los DEGs alteraron la expresión proteica posterior, se realizó un análisis de manchas occidentales para CHOP, ATF4 y eIF2 fosforilado (p-eIF2). Tunicamicina, un inhibidor de la glucosilación Un análisis del curso del tiempo de las células U87MG tratadas con 1 M de tunicamicina indicó que 8 h de tratamiento proporcionaban la inducción más robusta de proteínas UPR (datos no mostrados). Las células VVEV infectadas pero no infectadas simuladamente o inactivadas por UV VVEV (UV-VEEV) mostraron un aumento espectacular en la expresión p-eIF2 + y un aumento modesto pero consistente en la expresión CHOP y ATF4 a 16 hpi (Fig. 6A). No se observó ningún cambio en la expresión proteica a 4 hpi (datos no mostrados). La microscopía confocal confirmó la regulación de CHOP y ATF4, demostrando un patrón de tinción más robusto y nuclear en las células infectadas por VVEV que en las células infectadas simuladas (Fig. 6C a E). Mientras que los niveles de expresión proteica Estos resultados son consistentes con la observación de que la expresión ATF4 está regulada a nivel traslacional en la inducción EPU (37). Como eIF2® puede ser fosforilada por múltiples cinasas (PERK, proteína cinasa ARN dependiente de doble cadena [PKR], control general no derrepresivo-2 [GCN2] e inhibidor hemeregulado [HRI]) (38), el inhibidor de PERK (PERKi) GSK2606414 fue utilizado para determinar si la fosforilación observada era dependiente de PERK. El tratamiento de las células infectadas por VEEV con PERKi dio lugar a una marcada disminución de la fosforilación eIF2® (Fig. 6B). Estos resultados indican que PERK contribuye a la fosforilación eIF2® pero que es probable que haya una quinasa adicional que contribuya al evento de fosforilación En conjunto, estos hallazgos indican que el brazo de PERK de la vía UPR se induce en puntos de tiempo posteriores a la infección por VVEV. EGR1 se regula en células infectadas y se localiza en el núcleo. EGR1 es un factor de transcripción que puede ser inducido por numerosas señales, incluyendo estrés oxidativo, hipoxemia y factores de crecimiento (39, 40). También se puede activar sobre la infección por virus de ADN y ARN, incluyendo virus Epstein-Barr, virus de hepatitis ratón, coronavirus murino y virus de encefalitis japonesa (41) (42) (43). El tratamiento de MEFs con el activador UPR thapsigargin se ha demostrado que induce la expresión EGR1 de una manera dependiente de PERK (44). Dado el vínculo entre EGR1 y UPR y la inducción robusta de EGR1 expresión mRNA después de la infección por VVE 4 y 5), se eligió EGR1 para un estudio posterior. La expresión proteica EGR1 después de la infección por VEEV fue analizada por el análisis de Western blot. Como estudios previos han indicado que EGR1 puede ser activado por el virus de la hepatitis del ratón independientemente de la replicación del virus (probablemente debido a la interrupción de la membrana celular después de la entrada) (41), se incluyó un control del virus inactivado por UV (VVVEV). Los niveles de proteína EGR1 se incrementaron después de la infección por VEEV en comparación con los niveles de células infecciosas simuladas y células infectadas por UV-VEEV (fig. 7A; compare los carriles 3, 6 y 9 ). La regulación más dramática de EGR1 se produjo a 16 hpi; esto se correlaciona con los niveles más altos de producción de VEEV capsid (fig. 1B Tras la inducción, se ha demostrado que la EGR1 se transloca al núcleo para inducir la expresión génica a través de la unión a la secuencia de unión de Egr (EBS) [GCG(G/T)GGCG] (40, 45). La microcopia confocal reveló altos niveles de EGR1 en los núcleos de células infectadas, mientras que sólo se detectaron bajos niveles de EGR1 tanto nucleares como citoplasmáticos en células simuladas (Fig. 7B). El tratamiento PERKi de células infectadas con VEEV resultó en una pérdida completa de inducción EGR1 (Fig. 7C), indicando que la EGR1 fue inducida de manera dependiente de PERK. Estos resultados demuestran que los niveles de proteína EGR1 y la localización nuclear se incrementan después de la infección por VEEV y que la inducción de EGR1 es dependiente La pérdida de EGR1 inhibe la apoptosis inducida por el VEEV pero no altera la cinética de la replicación del VEEV. Como EGR1 influye en la supervivencia celular y la apoptosis (46), se evaluó el impacto del EGR1 en la muerte celular inducida por el VEEV. Se observó escisión de Caspasa 3 en MEFs WT a 24 hpi cuando se infectaron con un MOI de 0,5 y comenzaron tan pronto como 16 hpi cuando se infectaron con un MOI de 5 (Fig. 8A ). En contraste, las células EGR1 / mostraron poco o ningún escisión de caspasa detectable tras la infección con el VEEV. Se realizaron dos conjuntos de experimentos para confirmar cuantitativamente estos resultados: ensayos de CellTiter Glo para medir la viabilidad celular total (producción de ATP) y Caspasa 3/7 Tanto WT como EGR1 / MEF mostraron disminuciones dosis-dependientes en la viabilidad celular después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que tenían células significativamente más viables en cada MOI examinadas (Fig. 8B). Concordantemente, se observó un aumento dosis-dependiente en la actividad de caspasa 3/7 después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que demostraban una actividad reducida de caspasa 3 en los MOIs de 0,5 y 5 (Fig. 8C). Estos resultados se replicaron en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1 (Fig. 8D). EGR1 ha demostrado regular negativamente la transcripción de BIRC5 (Survivina), un inhibidor de la apoptosis (IAP) miembro de la familia (47). Los datos de ARN-Seq indicaron que la expresión del gen BIRC5 disminuyó después de la infección por VVEV: log 2 -transformado de los valores de cambio del pliegue de la expresión génica normalizada fueron 1,16, 1,18, y 1,50 a 4, 8, y 16 hpi, respectivamente (ver Tabla S1 en el material suplementario y NBI BioProject número de adhesión PRJNA300864). Se utilizaron WT y EGR1 / MEFs para determinar si EGR1 influyó en la expresión del gen BIRC5 después de la infección por VVEV. La expresión BIRC5 disminuyó significativamente a 16 hpi en los MEFs infectados por VVEV, pero esta reducción no se observó en los MEFs infectados por VVEV1 / (Fig. 8E). La expresión del gen para el inhibidor de la apoptosis (XIAP), otro miembro de la familia IAP, no fue significativamente alterada después de la infección (datos no mostrados). Colectivamente, estos resultados demuestran que EGR1 contribuye a la apoptosis inducida por VEEV. Se determinó la cinética de replicación VEEV tanto para EGR1 / como para WT MEFs para determinar la relevancia de EGR1 en la replicación viral.Las células fueron infectadas en dos MOIs diferentes (0,5 y 5), y los sobrenadantes virales fueron recolectados en 4, 8, 16 y 24 hpi y analizados mediante análisis de placa.La cinética de replicación fue similar entre EGR1 / y WT MEFs en ambos MOIs, con títulos que alcanzaron un máximo de 16 hpi (fig. 9A). 9B). Estos resultados fueron replicados en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1. La transfección de siRNA dirigida a EGR1 resultó en una disminución del 90% en la expresión proteica EGR1 (Fig. 9D ) sin ningún efecto significativo en la replicación viral (Fig. 9C). Estos resultados sugieren que la disminución de la apoptosis observada en EGR1 / MEFs no se debió a la cinética de replicación VEEV alterada. A pesar de ser reconocida como una amenaza emergente, se sabe relativamente poco acerca de los mecanismos de virulencia de los alfavirus, en gran parte debido a una brecha de conocimiento en el interactoroma host-patógeno. La infección por VEEV a menudo resulta en encefalitis fatal y se sabe que inhibe tanto la transcripción celular como la traducción para En contraste, en el VVEE del SNC se ha demostrado que upregula numerosos genes tanto en la respuesta inflamatoria como en las vías apoptóticas (1, 48). Específicamente, numerosas citocinas proinflamatorias, incluyendo interleu-kin-1 (IL-1), IL-6, IL-12, glucógeno sintasa cinasa 3, oxido nítrico inducible sintasa, y factor de necrosis tumoral alfa (TNF- Con este fin, la identificación de transcripciones críticas expresadas de forma diferencial entre células infectadas clínicamente relevantes ayudará a una mayor comprensión de la patogénesis viral y puede resultar beneficiosa para la identificación de objetivos terapéuticos. En este estudio, los datos de análisis de red/ARN-Seq y los resultados de estudios de expresión proteica revelaron que la infección por VEEV resultó en la activación del brazo PERK de la vía EPU, incluyendo la activación de ATF4, CHOP y eIF2-fosforilación. Varios alfavirus han sido reportados previamente para secuestrar componentes clave de la vía EPU con el fin de promover la replicación viral, ya que la dependencia de virus envueltos en la ER para la síntesis de glucoproteínas virales asociadas a la envoltura y su transporte a la membrana plasmática a menudo enfatiza la ER debido a la rápida producción de proteínas virales (54, 55). La modulación de la UPR no es exclusiva de los alfavirus; más bien, es un rasgo compartido de muchos virus de ARN de sentido positivo. El virus del dengue ha demostrado suprimir PERK al inhibir la fosforilación continua de eIF2 para inhibir la apoptosis inmediata, aumentando la traducción de proteínas virales y ampliando la duración de la replicación viral productiva (34). Estudios con el virus de la hepatitis E (HEV) han demostrado que la expresión de la proteína capsid del HEV marco abierto de lectura 2 (ORF2) activa la expresión de CHOP y ATF4 (56). En el HEV, ORF2 se demostró estimular CHOP a través de estresadores de ER y elementos de respuesta aminoácidos (AARE) a través de la interacción con ATF4 (56). Los resultados mostrados aquí indican que durante la Durante la detección inicial del estrés ER, PERK es capaz de identificar proteínas mal plegadas en el lumen de la ER y fosforilatos eIF2® con el fin de iniciar las vías de prosurvival en la UPR a través de la actividad general En 24 hpi caspasa 3/7 se analizó la actividad utilizando el ensayo Caspasa 3/7 Glo. Los valores de cambio de pliegue para células simuladas se fijaron en un valor de 1. **, P 0.001. (E) EGR1 / y WT MEFs fueron simulados o VEEV infectados (MOI, 5). El ARN fue preparado, y la expresión genética fue determinada por qRT-PCR utilizando un ensayo TaqMan para BIRC5 (Survivin). Los datos mostrados son los valores del cambio de pliegue de la expresión génica normalizada determinado por el ciclo del umbral T *, P 0,005 (comparación de las células WT infectadas por VEEV y EGR1 /). Inhibición de la síntesis proteica (33, 34). VEEV parece inducir la UPR y promover el aumento de la fosforilación eIF2, que resulta en la inhibición traslacional de la mayoría de los ARNm, mientras que UPR aumenta selectivamente la traducción de ATF4. ATF4 es responsable de la expresión de genes que codifican proteínas involucradas en apoptosis, procesos redox, metabolismo de aminoácidos y reclutamiento de chaperona ER y es un conocido mediador de la vía PERK y CHOP (33, 34). La activación CHOP facilita la expresión aumentada de chaperonas celulares para contrarrestar la acumulación de proteínas mal dobladas (57). La falta de supresión del plegado de proteínas en células persistentemente estresadas, como durante una infección viral, puede resultar en la activación del factor de transcripción proapoptótico CHOP, lo que conduce a la supresión del linfoma de células antiapoptóticas de proteína B-2 (Bcl-2). CHOP también puede funcionar como factor de transcripción prosurvival al desfosforilar eIF2® a través de la activación de la proteína DNA dañado-inducible (GADD34) en un aspecto de retroalimentación autorreguladora (33, 34). Sin embargo, los datos presentados aquí apoyan un modelo por el cual la infección VEEV lleva a CHOP a funcionar en su papel proapoptótico, ya que no se detectó ningún cambio en la expresión génica de GADD34 por el análisis de ARN-Seq. Si bien la UPR fue inducida después de la infección VEEV, Esto es algo sorprendente, ya que se espera que la infección por VVEV induzca un estrés ER significativo debido a la producción masiva de proteínas virales durante el curso de una infección aguda robusta. Las proteínas estructurales del VVEV se traducen del ARN subgenómico viral en poliproteínas en la ER áspera. Las glucoproteínas precur-sor E1 y pE2 se ensamblan como heterodímeros en la ER, experimentando cambios conformacionales que requieren numerosas chaperonas (1, 58). Es posible que el VVEV haya desarrollado mecanismos para subvertir la inducción de la UPR. Para contrarrestar la UPR, las proteínas no estructurales (nsPs) del virus Chikungunya (CHIKV) han demostrado inhibir la expresión de ATF4 y otros genes objetivo conocidos de la UPR, incluyendo GRP78/BiP, GRP94 A través de la actividad nsP, CHIKV ha desarrollado un medio de suprimir la actividad UPR resultante del estrés ER inducido por la glucoproteína viral, evitando así la autofagia inmediata y la activación apoptótica. El capsid VEEV es responsable de interferir con el tráfico nucleocitoplasmático e inhibir la transcripción del ARNr y del ARNm y ha sido implicado en la regulación de la señal de tipo I IFN y la respuesta antiviral mediante la regulación de la producción de ARN viral y proteínas (1, 48, 60). Por lo tanto, hipotetizamos que la capacidad del capsid VEEV para inhibir la transcripción celular y el tráfico de bloqueo nucleocitoplasmático resulta en la inducción retarda de la UPR. Los resultados de un análisis detallado de la red basado en los datos existentes en la literatura, junto con los perfiles de expresión génica temporal obtenidos de este estudio, apuntan a que el EGR1 es un nodo importante en el nuevo vínculo entre la activación del VEEV de la respuesta de interferón tipo I y la UPR. Se sabe que el EGR1 forma un complejo de unión al ADN con C/EBPB, socio crítico de la dimerización de CHOP (61). Estudios anteriores han demostrado que la localización nuclear del CHOP puede actuar como inductor del EGR1 y que el CHOP puede actuar como cofactor transcripcional para la regulación de los genes objetivo del C/EBPB-EGR1 (61). Los resultados del análisis de la mancha occidental y la microscopía presentados en este estudio apoyan este modelo, ya que se encontró que la infección por VEV aumenta tanto los niveles generales como la distribución nuclear Los estudios anteriores demostraron la inducción de ARNm EGR1 por IFN-â en fibroblastos de ratón y por TNF-â, TNF-, IL-1, IFN-â, IFN-â e IFN-â en fibroblastos humanos (31, 32). EGR1, también conocido como Zif268 y NGF1-A, es una proteína de dedo de zinc y factor de transcripción mamífero. Ha sido implicada en la proliferación y diferenciación celular, pero también puede tener funciones proapoptóticas, dependiendo del tipo celular y estímulo (62). De particular interés, EGR1 controla directamente la proliferación cuando se activa por la proteína activada por mitogen quinasa/vía cinasa regulada por señal extracelular en astrocitos estimulados por mitogen (63). Se han observado cambios inducidos por virus en la expresión EGR1 en En los astrocitos infectados por VIH-1, se encontró que la regulación de la EGR1 fue inducida por Tat a través de la transactivación del promotor de la EGR1, lo que llevó a la disfunción celular y a la neurotoxicidad inducida por Tat (64). También se ha demostrado que el aumento de las cantidades de ARNm EGR1 actúa de una manera específica de la región, correspondiendo temporalmente con la producción de ARN viral en los tejidos cerebrales de ratas infectadas por el virus de la rabia o el virus de la enfermedad de Borna (65). En resumen, el estudio actual demuestra un vínculo potencial entre la activación de la EPU y la EGR1. Hasta la fecha, los mecanismos subyacentes a la patogénesis del VEEV y la degeneración neuronal subsiguiente han sido sólo parcialmente elucidados, por lo que determinar el papel de la EGR1 y la UPR puede jugar un papel significativo en el desarrollo de una nueva diana terapéutica que resulte en una disminución de la muerte neuronal y las secuelas neuronales posteriores que resultan de la infección.

¿Cómo se transmite el virus venezolano de la encefalitis equina?

El virus venezolano de la encefalitis equina induce la apotosis a través de la activación de la respuesta de proteínas no plegadas de EGR1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4794670/SHA: f4aa788ab898b28b00ee103e4d4ab24a2c684cafAutores: Baer, Alan; Lundberg, Lindsay; Swales, Danielle; Waybright, Nicole; Pinkham, Chelsea; Dinman, Jonathan D.; Jacobs, Jonathan L.; Kehn-Hall, KyleneFecha: 2016-03-11DOI: 10.1128/jvi.0282-15Licencia: cc-byAbstract: El virus venezolano de la encefalitis equina (VEEV) es El aumento de la circulación y diseminación en las Américas de VVEV y otros arbovirus encefalíticos, como el virus de la encefalitis equina oriental y el virus del Nilo Occidental, subrayan la necesidad de investigar la patogénesis de la encefalomielitis viral para el desarrollo de nuevas contramedidas médicas. La dinámica hospedante-patógena de las células de astrocitoma humano U87MG infectadas con asnos VVEV Trinidad se determinó mediante la secuenciación de ARN (ARN-Seq) de poli(A) y mRNAs. Para identificar las alteraciones críticas que tienen lugar en el transcriptoma del huésped tras la infección por VVEV, se recolectaron muestras a 4, 8 y 16 h de postinfección y se adquirieron datos de ARN-Seq utilizando una plataforma PGM Ion Torrent. Se observó una expresión diferencial de respuesta al interferón, factores de respuesta al estrés La proteína cinasa ARN similar a la proteína endoplasmática retículo cinasa (PERK) brazo de la UPR fue activado, ya que la expresión de activando el factor de transcripción 4 (ATF4) y CHOP (DDIT3), reguladores críticos de la vía, fue alterada después de la infección. La expresión del factor de transcripción respuesta temprana al crecimiento 1 (EGR1) fue inducida de una manera dependiente de PERK. EGR1(−/−) fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) demostró menor susceptibilidad a la muerte celular inducida por VEEV que los MEFs de tipo salvaje isogénico, lo que indica que EGR1 modula las vías proapoptóticas después de la infección VEEV. La influencia de EGR1 es de gran importancia, ya que el daño neuronal puede conducir a secuelas a largo plazo en En casos graves, la propagación viral se dirige al tejido neuronal, resultando en una inflamación significativa y potencialmente mortal dependiente de una combinación de interacciones virus-anfitriona. Actualmente no hay terapias para infecciones causadas por alfavirus encefalíticos debido a una comprensión incompleta de su patogénesis molecular. El virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) es un alfavirus que es prevalente en las Américas y que es capaz de infectar caballos y humanos. Aquí utilizamos la secuenciación de ARN de próxima generación para identificar alteraciones diferenciales en los astrocitos infectados con VEEV. Nuestros resultados indicaron que la abundancia de transcripciones asociadas con el interferón y las vías de respuesta proteica desplegadas se alteraron después de la infección y demostraron que la respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1) contribuyó a la muerte celular inducida por VEEV. Texto: Venezuelan equina encefalitis virus (VE El VEEV es un virus de ARN de cadena positiva que es transmitido por mosquitos y que está naturalmente presente en depósitos de roedores (1). Hay seis subtipos que se clasifican por su rango geográfico y patología en equinos y humanos. Las dos cepas epizoóticas, IA/B y IC, surgieron de mutaciones entre las cepas enzoóticas (2). Las cepas IA/B y IC son de especial preocupación debido al aumento de las tasas de morbilidad y mortalidad y los riesgos asociados con la amplificación viral y el posible derrame de especies (2). En los seres humanos, el VEEV causa una enfermedad febril tipificada por fiebre, malestar y vómitos. En algunos casos, la infección progresa hacia el sistema nervioso central (SNC) y síntomas neurológicos, como confusión, ataxia y convulsiones, se manifiestan. La tasa de mortalidad entre los casos con síntomas neurológicos puede ser de hasta 35% en niños y 10% en adultos, con déficits neurológicos a largo plazo a menudo vistos en sobrevivientes (2). En 1995, un brote de VEEV en Colombia y Venezuela dio lugar a más de 100.000 casos humanos (3). Además de brotes naturales, el VEEV también es una preocupación desde una perspectiva bioterrorista, ya que puede crecer a altos títulos, requiere una dosis infecciosa baja, y contiene múltiples serotipos. Tanto la ex Unión Soviética como los Estados Unidos anteriormente armaron el virus, produciendo grandes cantidades para sus programas de armas biológicas ofensivas ya desactivadas (4). Actualmente, la cepa vacuna TC83 se utiliza en caballos y para personal de alto riesgo; sin embargo, debido a la baja tasa de seroconversión lograda con esta vacuna (5) y su dependencia de dos mutaciones atenuantes únicas (6), se considera no a Hasta la fecha no existen tratamientos aprobados por la FDA para la infección por VEEV, y se requieren estudios adicionales para aclarar los mecanismos asociados con la patogénesis subyacente del VEEV. Los estudios transcriptómicos virales y de huésped pueden proporcionar una gran cantidad de información sobre los mecanismos patógenos subyacentes y las interacciones posteriores al curso de una infección. El uso de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de virus previamente no característicos y el establecimiento de numerosos sistemas experimentales nuevos que redefinieron las interacciones virus-anfitriones. Hasta la fecha, varios estudios han examinado las alteraciones en el transcriptoma del huésped después de la infección por VEEV. Un análisis comparativo de microarray entre células infectadas persistentemente con VEEV y células capaces de limpiar VEEV resultó en la identificación de PARP12L como factor antiviral (8). Una comparación molecular utilizando microarrays de respuestas basadas en el huésped a la cepa TC83 fue capaz de identificar biomarcadores diferenciando entre los grupos que responden a la vacuna y los que no responden a la vacuna, así como la implicación de interferón (IFN), vías inducidas por interferón, receptores similares a los de Toll (TLR) y vías relacionadas con la interleucina 12 (IL-12) (9). Un estudio que examinó el papel de la adhesión y los factores inflamatorios en ratones CD-1 infectados por VEEV encontró modulación viral de la expresión de la matriz extracelular y genes de adhesión, como las integrinas (Itgáxis, Itg2, 3 y 7), las cadherinas 1 y 2, la molécula de adhesión de células vasculares 1, y la molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1), en los cerebros de ratones infectados por VEEV (10). Un estudio de Sharma et al. utilizaron microarrays para analizar los cambios en la expresión génica en el tejido cerebral de ratones infectados por VVEV durante el curso de una infección, descubriendo numerosas vías inmunes involucradas en la presentación de antígenos, inflamación, apoptosis y la respuesta antiviral tradicional (Cxcl10, CxCl11, Ccl5, Ifr7, Ifi27, Oas1b, Fcerg1, Mif, clusterin, e importante complejo de histocompatibilidad [MHC] clase II) (11). Un segundo estudio del mismo grupo identificó la regulación de los microRNAs (miRNAs) en los cerebros de ratones infectados por VVEV, lo que permitió la correlación de los cambios de miRNA con los datos de expresión de mRNA anteriores (11, 12). Estos análisis sugieren que el VEEV puede estar utilizando miRNAs celulares para regular el ARNm aguas abajo, lo que puede corresponder con los cambios histológicos inducidos por el VEEV en el sistema nervioso (11, 12). En el estudio actual, la secuenciación del ARNm de la próxima generación (ARN-Seq) se utilizó para identificar alteraciones clínicamente relevantes en el transcriptoma del ARNm de los astrocitos humanos infectados con la cepa de tipo salvaje (WT) VEEV Trinidad burro (TrD). El análisis de mRNAs huésped por ARN-Seq proporciona una visión novedosa de cómo un huésped responde a una infección viral a través de la identificación de un amplio y dinámico rango de transcripciones de una manera imparcial. Secuencia selectiva de mRNAs, específicamente, poliadenylated [poli(A)] transcripciones, que representan el 1% de Como el VEEV ha demostrado infectar productivamente a los astrocitos tanto in vitro como in vivo (14, 15), elegimos los astrocitos como nuestro modelo de interés. Los astrocitos son las células más abundantes del cerebro, superando a las neuronas por al menos 5 veces (16), proporcionando un recurso abundante para la replicación viral dentro del cerebro. Además de su bien descrito papel estructural en el tejido neuronal, los trocitos desempeñan papeles críticos en otros procesos, incluyendo la regulación del flujo sanguíneo y de la barrera hematoencefálica, la transmisión sinapsis y la respuesta a la infección (16). Se ha demostrado que los astrocitos infectados por el VEEV producen citocinas múltiples, incluyendo IL-8, IL-17, interferón gamma (IFN- +), y proteína 10 inducida por interferón gamma, todas las cuales se encontraron asociadas con atenuación viral (14). Con el fin de obtener una visión dinámica del interactoma virus-anfitrión, se utilizó el ARN-Seq para monitorear los cambios en la expresión génica en los astrocitos infectados por VEEV TrD a las 4, 8 y 16 h de postinfección (hpi). Al observar las alteraciones en múltiples momentos tempranos utilizando réplicas biológicas triplicadas, se genera un rango robusto y dinámico de información, y esta información proporciona un aumento tanto en la potencia como en la exactitud de la detección de transcripciones expresadas diferencialmente en un modelo clínico altamente relevante (17). Entre las células infectadas por VEEV, se observó un aumento en los genes regulados por interferón, incluyendo IFIT1, IFIT2, IFIT3 y OASL. También se observó el aumento en la expresión de genes involucrados en la vía de respuesta proteica inducida por estrés (UPR). Curiosamente, la infección por VEEV resultó en un La identificación de ARNm del huésped cuya expresión se altera después de la replicación del VEEV, específicamente, EGR1 y sus interactores arriba y abajo, puede proporcionar nuevos objetivos terapéuticos basados en el huésped críticos para la replicación del VEEV y una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes que sustentan la replicación del alfavirus. Infecciones virales y ensayos de placa. Se obtuvo TrD del VEEV de Recursos del BEI. Todos los experimentos con VEEV TrD se realizaron bajo condiciones de bioseguridad nivel 3 (BSL-3). Todo trabajo que involucra a agentes selectos está registrado en los Centros de Control y Prevención de Enfermedades y se llevó a cabo en el Laboratorio de Investigación Biomédica de la Universidad George Mason, que está registrado de acuerdo con las regulaciones federales de agentes selectos. Las células fueron infectadas durante 1 h a 37 °C y rotaron cada 15 minutos para asegurar una cobertura adecuada. Las células fueron lavadas con solución salina fosfatada (PBS), y se añadió un medio de crecimiento completo a las células. Se recolectaron sobrenadantes virales y células en varias ocasiones para su posterior análisis. Los ensayos de placa se realizaron como se describió anteriormente (18). Aislamiento de mRNA y preparación de biblioteca poli(A). El ARN de células U87MG fue purificado tanto de TrD VEEV infectado (nivel de bioseguridad 3) como de células U87MG simuladas a 4, 8 y 16 hpi utilizando un kit de aislamiento de mirVana (Tecnologías de Vida). El control de calidad del ARN purificado se realizó a partir de un bioanalizador Agilent 2100, y se utilizó un corte de integridad de ARN número de 8 A continuación, se añadió una mezcla de control de pico de ARN ARN ARN External Controls Consortium (ERCC) a las entradas totales de ARN (10 g de ARN) antes de la selección de poli(A) utilizando un kit de Dynabeads de Life Technologies mRNA Direct. La preparación de una biblioteca de ARN de transcriptoma completo de ARNm purificado se llevó a cabo utilizando un kit de Ion Total ARN-Seq (v2; Life Technologies). El control de calidad de las bibliotecas de cDNA se llevó a cabo utilizando el bioanalizador Agilent 2100 junto con pruebas de esterilidad para la eliminación de bibliotecas para la secuenciación de un laboratorio BSL-3 a BSL-2. Secuenciación de ARN. La preparación de plantillas de biblioteca se realizó en una plataforma One Touch 2 (Life Technologies). La secuenciación de A Un total de 119 millones de lecturas de secuenciación y un promedio de 6,6 millones de lecturas por muestra fueron utilizados como entrada en nuestra tubería de análisis. A menos que se indique lo contrario, el análisis de ARN-Seq aguas abajo se llevó a cabo utilizando la biogenómica CLC Workbench (v7). Las lecturas de ARN-Seq en bruto fueron recortadas para eliminar cualquier fragmento de adaptador de secuenciación residual que permaneciera en los 5= o 3= extremos después de la secuenciación. Además, el recorte final de las lecturas se realizó utilizando el algoritmo Mott modificado con una puntuación de calidad Q20, y cualquier lectura de menos de 15 pb fue descartada. Tras el recorte de lectura, las lecturas fueron cartografiadas al genoma humano hg19 con los siguientes parámetros ARN-Seq: un límite de 10 hits para múltiples posiciones cartográficas, una fracción de similitud de 0,8, una fracción El nivel de expresión de genes y transcripciones individuales se calculó utilizando el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas cartográficas (RPKM) del método Mortazavi et al. (19). Además, las lecturas no cartográficas también fueron cartografiadas al conjunto de secuencias de ARN sintética ERCC92 (20), así como al genoma de referencia VEEV (número de adhesión GenBank L01442). En todas las muestras, el coeficiente de correlación (R 2) entre el número de lecturas esperadas y el número de lecturas cartográficas para los controles de pico en ERCC92 fue superior a 0.90. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los resultados de secuenciación general. El filtrado postmapping de todos los datos de ARN-Seq se llevó a cabo junto a incluir sólo genes con al menos un mapa único leído (26.230 genes permanecieron El análisis de componentes principales del conjunto de datos filtrados resultante (13.906 genes en total) se realizó utilizando recuentos brutos de lecturas exclusivamente cartografiadas (ver Fig. 2A ). Los valores de expresión RPKM restantes para cada gen incluido en el conjunto de datos filtrados se sometieron a normalización cuantitativa con un corte del 5%. En la Fig. 2B se muestra un gráfico de caja de valores RPKM transformados para cada muestra antes de la normalización. El valor R 2 para la variación de muestra a muestra en pares dentro de cada conjunto de réplica biológica se observó un rango de 0,89 a 0,99, lo que indica que nuestras réplicas biológicas fueron consistentes y no mostraron un sesgo fuerte (datos no mostrados). En primer lugar, el análisis empírico del algoritmo de expresión génica diferencial, parte del paquete edgeR Bioconductor (21), se aplicó al conjunto integrado de datos de los 18 experimentos utilizando los parámetros por defecto y un falso valor P corregido por la tasa de descubrimiento. En cada momento se compararon muestras infectadas y simuladas, y los genes cuya expresión difería en más de 2 veces con una significación con un valor P de 0,05 se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial. Además del método descrito anteriormente, se aplicó una prueba estadística ortogonal de expresión diferencial a los datos utilizando una prueba estadística desarrollada por Baggerly et al. (22) para contar el número de etiquetas de secuencia expresadas asociadas con genes individuales, una característica común de ambos análisis en serie de datos de expresión génica (SAGE) y datos ARN-Seq. Cuando se compararon muestras infectadas y simuladas, los genes individuales se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial cuando su expresión difería por más de 2 veces con una significación con un valor de P de 0.05. Los genes expresados diferencialmente que se encontraban en la intersección de los conjuntos de genes identificados por ambos métodos descritos anteriormente se consideraron candidatos de alta calidad y se utilizaron como punto de partida para la investigación ulterior. La agrupación y la GSEA. Los datos de expresión normalizados y filtrados se sometieron a la agrupación de k-medias utilizando una métrica de distancia euclidiana donde los genes se agruparon por medio de valores de expresión génica normalizada (RPKM) para cada condición experimental. La agrupación se ajustó a 20 grupos de agrupamiento distintos, y los perfiles de expresión génica individuales agrupados se probaron para el enriquecimiento de términos de ontología génica (GO) asociados con genes individuales. En primer lugar, se realizó una prueba hipergeométrica de las anotaciones de GO mediante la implementación del paquete GOStats en cada uno de los conglomerados individuales obtenidos a partir de la agrupación k-media (24). Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en todo el conjunto de datos filtrados utilizando 100.000 permutaciones, mientras que se eliminaron duplicados y se aplicó un análisis de varianza. Un total de 1.419 categorías superaron un tamaño mínimo de característica de 10 y se utilizaron para la investigación ulterior. Las cohortes de genes con patrones de expresión compartidos a lo largo del tiempo se identificaron mediante la agrupación de k-medias; las que se encontraron enriquecidas para los DEG fueron posteriormente sometidas al análisis de vía mediante el sistema GeneMania (25). Utilizando un enfoque manual ad hoc, se identificaron vías relevantes y las conexiones entre ellas sobre la base de los datos existentes en Análisis de qRT-PCR. El ARNm purificado se convirtió en ADNc utilizando un kit de ARN-a-cDNA de alta capacidad (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de los números de copia viral se realizó mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR) como se describió previamente (26). La expresión anfitriona de los siguientes genes fue analizada con los ensayos de TaqMan (indicados entre paréntesis): activando el factor de transcripción 3 (ATF3; Hs00231069_m1), ATF4 (Hs00909569_g1), CEBPB (Hs00270923_s1), CEBPD (Hs00270931_s1), DDIT3 (Hs00358796_g1), FOS (Hs04194186_s1), JUN (Hs01103582_s1), EGR1 (Hs00152928_m1), IFI6 (Hs00242571_m1), IFIT1 (Hs01911452_s1), IFIT2 (Hs01922738_s1), IFIT3 (Hs01922738_s1) Los ensayos para el ARNr 18S (Hs99999901_s1 o Mm04277571_s1) se utilizaron para la normalización. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un instrumento ABI StepOne Plus. Tratamiento con PERKi y recolección para el análisis de Western blot. Las células U87MG fueron pretratadas durante 2 h con 10 M la proteína quinasa ARN similar al retículo endoplasmático (ER) cinasa (PERK) inhibidor (PERKi) GSK2606414 (número catalógico 516535; EMD Millipore) o dimetil sulfóxido (DMSO) en DMEM antes de la infección por VEEV TrD (MOI, 5). Después de 1 h, el inóculo viral fue eliminado y las células fueron lavadas con PBS estéril (1). El medio fue reemplazado A 16 hpi, el medio fue removido, y las células fueron lavadas con PBS y luego recolectadas para el análisis de Western blot. Derribado de EGR1 con siRNA. Células U87MG sembradas a 6,7 10 4 células por pozo en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 50 nM de preparación de lisato de proteína de siGenome y análisis de Western blot. Preparación de lisato de proteína y análisis de Western blot se realizaron como se describió previamente (27). Se utilizaron anticuerpos primarios frente a los siguientes anticuerpos: EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular), virus de la encefalitis equina policlonal TC83 (subtipo IA/B) proteína capsid (Recursos BEI), CHOP (anticuerpo L63F7; número de catálogo 2895; señalización celular), subunidad fosforilada de factor de iniciación eucariótica 2 (p-eIF2+; Ser51; anticuerpo D9G8; número de catálogo 3398; señalización celular), ATF4 (anticuerpo D4B8; número de catálogo 11815; señalización celular), caspasa activada 3 (antícuerpo Asp175; número de catálogo 9661; señalización celular), y peroxidasa-conjugada por caballos -actina (número de catálogo ab49900-100; Abcam). Análisis de inmunofluorescencia. Las células U87MG fueron cultivadas en tapas en una placa de 6 pozos, infectadas con VEEV TrD como se describe anteriormente, lavadas con PBS (sin Ca y Mg), y luego fijadas con formaldehído al 4%. Las células fueron permeabilizadas con Triton X-100 en PBS durante 20 min y luego lavadas dos veces con PBS. Las células fueron bloqueadas durante 10 min a temperatura ambiente en albúmina sérica bovina al 3% en PBS. Anticuerpos primarios consistentes en una proteína capsid VEEV (número catalógico NR-9403; Recursos BEI) diluido 1:600 y un anticuerpo EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular) diluido 1:400 fueron incubados en tampón fresco de bloqueo a 37°C durante 1 h y lavado A continuación se muestra una imagen representativa de cada muestra. Anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 568 (número catalógico A11057; Invitrogen) y anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 488 (número catalógico A21202; Invitrogen) diluidos 1:400 como anticuerpos secundarios y tratados de la misma manera que los anticuerpos primarios. DAPI (4=,6-di-amidino-2-fenilindol) diluido 1:1.000 para visualizar los núcleos. Se montaron las tapas sobre diapositivas de vidrio utilizando 10 l de medio de montaje Fluoromount G (número catalógico 0100-01; Southern Biotech). Se utilizó un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE2000-U para microscopía de fluorescencia. Las imágenes se vieron utilizando una lente de inmersión de aceite objetivo de 60. Todas las imágenes fueron sometidas a un promedio de cuatro líneas. Las imágenes fueron procesadas a través del software Nikon NIS-Elements AR Analysis (v3.2). CellTiter Glo y Caspasa 3/7 Glo ensayos. Los fibroblastos embrionarios del tipo salvaje y EGR1 / mouse (MEFs) fueron infectados con TrD en varios MOIs durante una hora y luego lavados con PBS, y el medio fue reemplazado. La viabilidad celular fue medida a las 24 h postinfección utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente Promega CellTiter (número catalógico G7571) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia fue leída mediante un detector de múltiples modos Beckman Coulter DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. De manera similar, la activación de caspasa en el tipo salvaje infectado y EGR1 / MEFs se midió a las 24 h postinfección utilizando un ensayo Promega Caspasa 3/7 Glo (catalog número G8090) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia se leyó utilizando el detector multimodo DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. Números de adhesión de secuencia de nucleótidos. Los datos de secuenciación en bruto para todas las carreras de ARN-Seq incluidas en este trabajo están disponibles públicamente en la base de datos NCBI BioProject bajo el número de adhesión PRJNA300864 (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA300864). Las líneas celulares comunes utilizadas para el estudio de la infección por VEEV incluyen células Vero y BHK; en este estudio, los astrocitos U87MG fueron elegidos como modelo in vitro debido a su relevancia fisiológica y mayor significación clínica; se realizaron experimentos iniciales para caracterizar la replicación viral en células U87MG; se midió la cinética de replicación de VEEV en células U87MG mediante ensayos en placa y mediante el monitoreo de los niveles de expresión de proteínas virales y ARN y el efecto citopático (ECP) en las células infectadas (Fig. 1); se observó una liberación viral tan temprana como 4 hpi, observándose 4 unidades log de virus, seguido de un aumento consistente de la replicación a 8 y 16 hpi (Fig. 1A). La replicación viral alcanzó su punto máximo a 16 hpi, y no se observó un aumento adicional de los La expresión vírica capsid siguió un patrón similar, siendo detectada proteína a 8 hpi y plastificación de expresión a 16 hpi (Fig. 1B). Entre las células U87MG infectadas, se observó una EPC significativa por microscopía a 24 hpi, con poca o ninguna EPC detectada a 16 hpi (datos no mostrados). De acuerdo con estas observaciones, se observó un aumento de la actividad de la caspasa 3/7 sólo a 24 hpi (Fig. 1C). Sobre la base de estos datos, los tiempos de 4, 8 y 16 hpi, reflejando las etapas tempranas, medias y tardías del ciclo de vida viral, respectivamente, fueron seleccionados para el análisis de ARN-Seq para proporcionar una visión dinámica del perfil del transcriptoma host-patógeno. Análisis de secuenciación de ARN de los astrocitos infectados por VEEV. Se aisló el ARNm de conjuntos triplicados de cultivos de células U87MG infectados con simulacros y VEEV, se purificó a 4, 8 y 16 hpi, y se utilizó para preparar bibliotecas de ARNc para ARN-Seq aguas abajo (ver Materiales y Métodos). En la Tabla 1 se muestra un resumen de alto nivel de los resultados de ARN-Seq. Las muestras de ARN VEEV fueron analizadas por RT-PCR cuantitativo en cada momento como un control para demostrar el aumento de la carga de ARN viral a lo largo del tiempo (Fig. 1D), consistente con el aumento del número de lecturas de ARN-Seq cartografiadas al genoma VEEV en puntos posteriores (Tabla 1). Para el análisis de ARN-Seq, los genes individuales se expresaron como el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón En la figura 2A se muestran los valores de expresión RPKM normalizados para cada muestra experimental y se pueden encontrar en el conjunto de datos S1 del material suplementario. La variación mínima de la muestra a la muestra en los valores de expresión dentro de las réplicas biológicas fue detectada constantemente (R 2 0,89 para todas las réplicas; datos no mostrados). Además, también se encontró que la variación de la intersample era mínima cuando se probó por pares a lo largo de todo el experimento utilizando los valores RPKM para los ARN de control de pico sintético ERCC97 (R 2 0,90 para todas las comparaciones; datos no mostrados). Como era de esperar, el análisis de dos componentes principales de los datos ARN-Seq para las células infectadas por simulacro de células frente a las infectadas por VEEV mostró una separación clara de las muestras a 16 hpi de las muestras en puntos Sin embargo, el agrupamiento de muestras infectadas por VVEV con muestras simuladas infectadas en puntos de tiempo anteriores sugiere que la respuesta a la infección viral se limitó a un estrecho subconjunto de genes de respuesta temprana, lo que supone una mayor carga de prueba en la identificación de genes expresados diferencialmente (DEGs) durante las primeras horas de infección. En este sentido, se utilizaron dos métodos ortogonales para identificar DEGs adecuados para una caracterización adicional: el método edgeR (21) y el método desarrollado por Baggerly et al. (22). Los genes identificados por un método se consideraron provisionalmente DEGs, y los identificados por ambos métodos eran DEGs candidatos a ser confirmados por qRT-PCR. Además de comparar los valores individuales de expresión génica para las células infectadas simuladamente y las células infectadas por VEEV en cada momento, también se compararon los valores de expresión génica en serie dentro de cada serie temporal de células infectadas por VEEV para los genes que no mostraron cambios estadísticamente significativos en la expresión en células infectadas simuladamente. Un esquema del análisis comparativo se muestra en la figura 2C. El número de DEGs estadísticamente significativos identificados por cada una de estas comparaciones se muestra en la figura 2D. Además, se utilizó el agrupamiento de k-medias (contra los valores normalizados de RPKM) para identificar cambios brutos en la expresión génica a lo largo del tiempo para cohortes de genes que potencialmente comparten la misma vía o desencadenantes reguladores (fig. 3 ; véase también Conjunto de datos S2 en el material suplementario). Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA; véase Material y Métodos En particular, el clúster 20 (tabla 2) se enriqueció significativamente para los genes involucrados en el control traslacional, la vía de señalización mediada por interferón tipo I y la vía de respuesta a proteínas desplegadas (valor P de GSEA 0,01). Aunque existe una conexión bien establecida entre el control traslacional y la EPU, una nueva conexión entre la EPU y la respuesta mediada por interferón tipo I en respuesta a la replicación viral fue sugerida por el análisis de la vía (ver Materiales y Métodos), implicando la respuesta al crecimiento temprano 1 (EGR1) como un puente potencial entre estas dos vías (Fig. 4). La EGR1 pertenece al clúster 20 y es fuertemente inducida durante la infección por VEEV, y varios otros genes asociados con la respuesta al interferón pertenecen al mismo clúster: IRF1, IFIT1, IFIT2, ISG15 e ILF3. EGR1 se ha asociado con aumentos en la expresión de activar el factor de transcripción 3 (ATF3) (28), que es un componente clave de la UPR y que también pertenece al clúster 20. Esta conexión representó un potencial a Anotaciones del proceso biológico obtenidas de Reactome para el clúster 20. Los identificadores de anotación del reactoma están indicados para cada anotación. Sólo se consideran anotaciones clasificadas por autor rastreable (TAS). TAP, transportador asociado con el procesamiento de antígenos; SRP, partícula de reconocimiento de señales. b Conjunto completo, el número total de genes en el genoma con un proceso biológico anotado; subconjunto, número total de genes expresados diferencialmente con un proceso biológico anotado. Red de genes relacionados con la respuesta del interferón tipo I y UPR. Círculos grandes, genes diferencialmente expresados; círculos pequeños, genes sin cambio significativo de expresión; círculos rojos, factores de respuesta tipo I al interferón; círculos amarillos, genes que regulan la transcripción del ADN; círculos azules, genes de respuesta a proteínas desplegadas; líneas rojas, genes involucrados en interacciones físicas proteína-proteína; líneas azules, genes involucrados en una vía común. Esta red fue sembrada con grupos k-medias 18 y 20, y muchos genes de proteína ribosómica fueron removidos. puente entre la vía UPR y la vía de respuesta al interferón, siendo EGR1 uno de los factores clave potenciales de transcripción que impulsan esta conexión. En consecuencia, se seleccionaron 15 genes de este análisis para su posterior caracterización por qRT-PCR (ver abajo): ATF3, activando el factor de transcripción 4 (ATF4), CEBPB, CEBPD, DDIT3/CHOP, EGR1, FOS, IFI6, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG15, ISG20, JUN y OASL. Los valores de expresión de estos genes, medidos por ARN-Seq, se muestran en la Fig. 5A y B. El análisis confirmatorio qRT-PCR indicó expresión génica concordante (fig. 5C y D). Los genes de respuesta al interferón inducidos están de acuerdo con los detectados en estudios previamente publicados (11, 29, 30) y estos genes sirvieron como control positivo interno. Además, se ha demostrado el vínculo entre la EGR1 y la vía del interferón; la EGR1 es inducida por IFN-® en fibroblastos de ratón y por IFN-®, -, y -® en fibroblastos humanos (31, 32). La EGR1 y la vía UPR fueron seleccionadas para su posterior análisis, ya que su papel en la infección por VEEV no ha sido elucidado. Los datos de análisis del ARN-Seq y la vía indicaron que los genes de respuesta al estrés y la UPR fueron inducidos después de la infección por VEEV. Durante una infección, las células anfitrionas responden al estrés celular resultante de una mayor traducción de proteínas virales y secreción al desencadenar el inicio de la vía de la UPR. La vía de la UPR es una respuesta celular adaptativa activada por el estrés del retículo endoplasmático (ER Con el fin de regular la homeostasis celular durante el plegado y la secreción de proteínas, la vía UPR ha desarrollado tres clases de sensores para asegurar la correcta regulación celular: la enzima inositolrequiriendo 1 (IRE1), la proteína cinasa ARN-como la ER cinasa (PERK), y activar el factor de transcripción 6 (ATF6) (33, 34). Durante la infección por VEEV, el brazo PERK de la UPR pareció estar alterado, ya que dos reguladores críticos de esta vía se expresaron diferencialmente: ATF4 y CHOP (DDIT3) (35). Para determinar si los DEGs alteraron la expresión proteica posterior, se realizó un análisis de manchas occidentales para CHOP, ATF4 y eIF2 fosforilado (p-eIF2). Tunicamicina, un inhibidor de la glucosilación Un análisis del curso del tiempo de las células U87MG tratadas con 1 M de tunicamicina indicó que 8 h de tratamiento proporcionaban la inducción más robusta de proteínas UPR (datos no mostrados). Las células VVEV infectadas pero no infectadas simuladamente o inactivadas por UV VVEV (UV-VEEV) mostraron un aumento espectacular en la expresión p-eIF2 + y un aumento modesto pero consistente en la expresión CHOP y ATF4 a 16 hpi (Fig. 6A). No se observó ningún cambio en la expresión proteica a 4 hpi (datos no mostrados). La microscopía confocal confirmó la regulación de CHOP y ATF4, demostrando un patrón de tinción más robusto y nuclear en las células infectadas por VVEV que en las células infectadas simuladas (Fig. 6C a E). Mientras que los niveles de expresión proteica Estos resultados son consistentes con la observación de que la expresión ATF4 está regulada a nivel traslacional en la inducción EPU (37). Como eIF2® puede ser fosforilada por múltiples cinasas (PERK, proteína cinasa ARN dependiente de doble cadena [PKR], control general no derrepresivo-2 [GCN2] e inhibidor hemeregulado [HRI]) (38), el inhibidor de PERK (PERKi) GSK2606414 fue utilizado para determinar si la fosforilación observada era dependiente de PERK. El tratamiento de las células infectadas por VEEV con PERKi dio lugar a una marcada disminución de la fosforilación eIF2® (Fig. 6B). Estos resultados indican que PERK contribuye a la fosforilación eIF2® pero que es probable que haya una quinasa adicional que contribuya al evento de fosforilación En conjunto, estos hallazgos indican que el brazo de PERK de la vía UPR se induce en puntos de tiempo posteriores a la infección por VVEV. EGR1 se regula en células infectadas y se localiza en el núcleo. EGR1 es un factor de transcripción que puede ser inducido por numerosas señales, incluyendo estrés oxidativo, hipoxemia y factores de crecimiento (39, 40). También se puede activar sobre la infección por virus de ADN y ARN, incluyendo virus Epstein-Barr, virus de hepatitis ratón, coronavirus murino y virus de encefalitis japonesa (41) (42) (43). El tratamiento de MEFs con el activador UPR thapsigargin se ha demostrado que induce la expresión EGR1 de una manera dependiente de PERK (44). Dado el vínculo entre EGR1 y UPR y la inducción robusta de EGR1 expresión mRNA después de la infección por VVE 4 y 5), se eligió EGR1 para un estudio posterior. La expresión proteica EGR1 después de la infección por VEEV fue analizada por el análisis de Western blot. Como estudios previos han indicado que EGR1 puede ser activado por el virus de la hepatitis del ratón independientemente de la replicación del virus (probablemente debido a la interrupción de la membrana celular después de la entrada) (41), se incluyó un control del virus inactivado por UV (VVVEV). Los niveles de proteína EGR1 se incrementaron después de la infección por VEEV en comparación con los niveles de células infecciosas simuladas y células infectadas por UV-VEEV (fig. 7A; compare los carriles 3, 6 y 9 ). La regulación más dramática de EGR1 se produjo a 16 hpi; esto se correlaciona con los niveles más altos de producción de VEEV capsid (fig. 1B Tras la inducción, se ha demostrado que la EGR1 se transloca al núcleo para inducir la expresión génica a través de la unión a la secuencia de unión de Egr (EBS) [GCG(G/T)GGCG] (40, 45). La microcopia confocal reveló altos niveles de EGR1 en los núcleos de células infectadas, mientras que sólo se detectaron bajos niveles de EGR1 tanto nucleares como citoplasmáticos en células simuladas (Fig. 7B). El tratamiento PERKi de células infectadas con VEEV resultó en una pérdida completa de inducción EGR1 (Fig. 7C), indicando que la EGR1 fue inducida de manera dependiente de PERK. Estos resultados demuestran que los niveles de proteína EGR1 y la localización nuclear se incrementan después de la infección por VEEV y que la inducción de EGR1 es dependiente La pérdida de EGR1 inhibe la apoptosis inducida por el VEEV pero no altera la cinética de la replicación del VEEV. Como EGR1 influye en la supervivencia celular y la apoptosis (46), se evaluó el impacto del EGR1 en la muerte celular inducida por el VEEV. Se observó escisión de Caspasa 3 en MEFs WT a 24 hpi cuando se infectaron con un MOI de 0,5 y comenzaron tan pronto como 16 hpi cuando se infectaron con un MOI de 5 (Fig. 8A ). En contraste, las células EGR1 / mostraron poco o ningún escisión de caspasa detectable tras la infección con el VEEV. Se realizaron dos conjuntos de experimentos para confirmar cuantitativamente estos resultados: ensayos de CellTiter Glo para medir la viabilidad celular total (producción de ATP) y Caspasa 3/7 Tanto WT como EGR1 / MEF mostraron disminuciones dosis-dependientes en la viabilidad celular después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que tenían células significativamente más viables en cada MOI examinadas (Fig. 8B). Concordantemente, se observó un aumento dosis-dependiente en la actividad de caspasa 3/7 después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que demostraban una actividad reducida de caspasa 3 en los MOIs de 0,5 y 5 (Fig. 8C). Estos resultados se replicaron en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1 (Fig. 8D). EGR1 ha demostrado regular negativamente la transcripción de BIRC5 (Survivina), un inhibidor de la apoptosis (IAP) miembro de la familia (47). Los datos de ARN-Seq indicaron que la expresión del gen BIRC5 disminuyó después de la infección por VVEV: log 2 -transformado de los valores de cambio del pliegue de la expresión génica normalizada fueron 1,16, 1,18, y 1,50 a 4, 8, y 16 hpi, respectivamente (ver Tabla S1 en el material suplementario y NBI BioProject número de adhesión PRJNA300864). Se utilizaron WT y EGR1 / MEFs para determinar si EGR1 influyó en la expresión del gen BIRC5 después de la infección por VVEV. La expresión BIRC5 disminuyó significativamente a 16 hpi en los MEFs infectados por VVEV, pero esta reducción no se observó en los MEFs infectados por VVEV1 / (Fig. 8E). La expresión del gen para el inhibidor de la apoptosis (XIAP), otro miembro de la familia IAP, no fue significativamente alterada después de la infección (datos no mostrados). Colectivamente, estos resultados demuestran que EGR1 contribuye a la apoptosis inducida por VEEV. Se determinó la cinética de replicación VEEV tanto para EGR1 / como para WT MEFs para determinar la relevancia de EGR1 en la replicación viral.Las células fueron infectadas en dos MOIs diferentes (0,5 y 5), y los sobrenadantes virales fueron recolectados en 4, 8, 16 y 24 hpi y analizados mediante análisis de placa.La cinética de replicación fue similar entre EGR1 / y WT MEFs en ambos MOIs, con títulos que alcanzaron un máximo de 16 hpi (fig. 9A). 9B). Estos resultados fueron replicados en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1. La transfección de siRNA dirigida a EGR1 resultó en una disminución del 90% en la expresión proteica EGR1 (Fig. 9D ) sin ningún efecto significativo en la replicación viral (Fig. 9C). Estos resultados sugieren que la disminución de la apoptosis observada en EGR1 / MEFs no se debió a la cinética de replicación VEEV alterada. A pesar de ser reconocida como una amenaza emergente, se sabe relativamente poco acerca de los mecanismos de virulencia de los alfavirus, en gran parte debido a una brecha de conocimiento en el interactoroma host-patógeno. La infección por VEEV a menudo resulta en encefalitis fatal y se sabe que inhibe tanto la transcripción celular como la traducción para En contraste, en el VVEE del SNC se ha demostrado que upregula numerosos genes tanto en la respuesta inflamatoria como en las vías apoptóticas (1, 48). Específicamente, numerosas citocinas proinflamatorias, incluyendo interleu-kin-1 (IL-1), IL-6, IL-12, glucógeno sintasa cinasa 3, oxido nítrico inducible sintasa, y factor de necrosis tumoral alfa (TNF- Con este fin, la identificación de transcripciones críticas expresadas de forma diferencial entre células infectadas clínicamente relevantes ayudará a una mayor comprensión de la patogénesis viral y puede resultar beneficiosa para la identificación de objetivos terapéuticos. En este estudio, los datos de análisis de red/ARN-Seq y los resultados de estudios de expresión proteica revelaron que la infección por VEEV resultó en la activación del brazo PERK de la vía EPU, incluyendo la activación de ATF4, CHOP y eIF2-fosforilación. Varios alfavirus han sido reportados previamente para secuestrar componentes clave de la vía EPU con el fin de promover la replicación viral, ya que la dependencia de virus envueltos en la ER para la síntesis de glucoproteínas virales asociadas a la envoltura y su transporte a la membrana plasmática a menudo enfatiza la ER debido a la rápida producción de proteínas virales (54, 55). La modulación de la UPR no es exclusiva de los alfavirus; más bien, es un rasgo compartido de muchos virus de ARN de sentido positivo. El virus del dengue ha demostrado suprimir PERK al inhibir la fosforilación continua de eIF2 para inhibir la apoptosis inmediata, aumentando la traducción de proteínas virales y ampliando la duración de la replicación viral productiva (34). Estudios con el virus de la hepatitis E (HEV) han demostrado que la expresión de la proteína capsid del HEV marco abierto de lectura 2 (ORF2) activa la expresión de CHOP y ATF4 (56). En el HEV, ORF2 se demostró estimular CHOP a través de estresadores de ER y elementos de respuesta aminoácidos (AARE) a través de la interacción con ATF4 (56). Los resultados mostrados aquí indican que durante la Durante la detección inicial del estrés ER, PERK es capaz de identificar proteínas mal plegadas en el lumen de la ER y fosforilatos eIF2® con el fin de iniciar las vías de prosurvival en la UPR a través de la actividad general En 24 hpi caspasa 3/7 se analizó la actividad utilizando el ensayo Caspasa 3/7 Glo. Los valores de cambio de pliegue para células simuladas se fijaron en un valor de 1. **, P 0.001. (E) EGR1 / y WT MEFs fueron simulados o VEEV infectados (MOI, 5). El ARN fue preparado, y la expresión genética fue determinada por qRT-PCR utilizando un ensayo TaqMan para BIRC5 (Survivin). Los datos mostrados son los valores del cambio de pliegue de la expresión génica normalizada determinado por el ciclo del umbral T *, P 0,005 (comparación de las células WT infectadas por VEEV y EGR1 /). Inhibición de la síntesis proteica (33, 34). VEEV parece inducir la UPR y promover el aumento de la fosforilación eIF2, que resulta en la inhibición traslacional de la mayoría de los ARNm, mientras que UPR aumenta selectivamente la traducción de ATF4. ATF4 es responsable de la expresión de genes que codifican proteínas involucradas en apoptosis, procesos redox, metabolismo de aminoácidos y reclutamiento de chaperona ER y es un conocido mediador de la vía PERK y CHOP (33, 34). La activación CHOP facilita la expresión aumentada de chaperonas celulares para contrarrestar la acumulación de proteínas mal dobladas (57). La falta de supresión del plegado de proteínas en células persistentemente estresadas, como durante una infección viral, puede resultar en la activación del factor de transcripción proapoptótico CHOP, lo que conduce a la supresión del linfoma de células antiapoptóticas de proteína B-2 (Bcl-2). CHOP también puede funcionar como factor de transcripción prosurvival al desfosforilar eIF2® a través de la activación de la proteína DNA dañado-inducible (GADD34) en un aspecto de retroalimentación autorreguladora (33, 34). Sin embargo, los datos presentados aquí apoyan un modelo por el cual la infección VEEV lleva a CHOP a funcionar en su papel proapoptótico, ya que no se detectó ningún cambio en la expresión génica de GADD34 por el análisis de ARN-Seq. Si bien la UPR fue inducida después de la infección VEEV, Esto es algo sorprendente, ya que se espera que la infección por VVEV induzca un estrés ER significativo debido a la producción masiva de proteínas virales durante el curso de una infección aguda robusta. Las proteínas estructurales del VVEV se traducen del ARN subgenómico viral en poliproteínas en la ER áspera. Las glucoproteínas precur-sor E1 y pE2 se ensamblan como heterodímeros en la ER, experimentando cambios conformacionales que requieren numerosas chaperonas (1, 58). Es posible que el VVEV haya desarrollado mecanismos para subvertir la inducción de la UPR. Para contrarrestar la UPR, las proteínas no estructurales (nsPs) del virus Chikungunya (CHIKV) han demostrado inhibir la expresión de ATF4 y otros genes objetivo conocidos de la UPR, incluyendo GRP78/BiP, GRP94 A través de la actividad nsP, CHIKV ha desarrollado un medio de suprimir la actividad UPR resultante del estrés ER inducido por la glucoproteína viral, evitando así la autofagia inmediata y la activación apoptótica. El capsid VEEV es responsable de interferir con el tráfico nucleocitoplasmático e inhibir la transcripción del ARNr y del ARNm y ha sido implicado en la regulación de la señal de tipo I IFN y la respuesta antiviral mediante la regulación de la producción de ARN viral y proteínas (1, 48, 60). Por lo tanto, hipotetizamos que la capacidad del capsid VEEV para inhibir la transcripción celular y el tráfico de bloqueo nucleocitoplasmático resulta en la inducción retarda de la UPR. Los resultados de un análisis detallado de la red basado en los datos existentes en la literatura, junto con los perfiles de expresión génica temporal obtenidos de este estudio, apuntan a que el EGR1 es un nodo importante en el nuevo vínculo entre la activación del VEEV de la respuesta de interferón tipo I y la UPR. Se sabe que el EGR1 forma un complejo de unión al ADN con C/EBPB, socio crítico de la dimerización de CHOP (61). Estudios anteriores han demostrado que la localización nuclear del CHOP puede actuar como inductor del EGR1 y que el CHOP puede actuar como cofactor transcripcional para la regulación de los genes objetivo del C/EBPB-EGR1 (61). Los resultados del análisis de la mancha occidental y la microscopía presentados en este estudio apoyan este modelo, ya que se encontró que la infección por VEV aumenta tanto los niveles generales como la distribución nuclear Los estudios anteriores demostraron la inducción de ARNm EGR1 por IFN-â en fibroblastos de ratón y por TNF-â, TNF-, IL-1, IFN-â, IFN-â e IFN-â en fibroblastos humanos (31, 32). EGR1, también conocido como Zif268 y NGF1-A, es una proteína de dedo de zinc y factor de transcripción mamífero. Ha sido implicada en la proliferación y diferenciación celular, pero también puede tener funciones proapoptóticas, dependiendo del tipo celular y estímulo (62). De particular interés, EGR1 controla directamente la proliferación cuando se activa por la proteína activada por mitogen quinasa/vía cinasa regulada por señal extracelular en astrocitos estimulados por mitogen (63). Se han observado cambios inducidos por virus en la expresión EGR1 en En los astrocitos infectados por VIH-1, se encontró que la regulación de la EGR1 fue inducida por Tat a través de la transactivación del promotor de la EGR1, lo que llevó a la disfunción celular y a la neurotoxicidad inducida por Tat (64). También se ha demostrado que el aumento de las cantidades de ARNm EGR1 actúa de una manera específica de la región, correspondiendo temporalmente con la producción de ARN viral en los tejidos cerebrales de ratas infectadas por el virus de la rabia o el virus de la enfermedad de Borna (65). En resumen, el estudio actual demuestra un vínculo potencial entre la activación de la EPU y la EGR1. Hasta la fecha, los mecanismos subyacentes a la patogénesis del VEEV y la degeneración neuronal subsiguiente han sido sólo parcialmente elucidados, por lo que determinar el papel de la EGR1 y la UPR puede jugar un papel significativo en el desarrollo de una nueva diana terapéutica que resulte en una disminución de la muerte neuronal y las secuelas neuronales posteriores que resultan de la infección.

¿Cuáles son los síntomas del virus venezolano de la encefalitis equina?

El virus venezolano de la encefalitis equina induce la apotosis a través de la activación de la respuesta de proteínas no plegadas de EGR1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4794670/SHA: f4aa788ab898b28b00ee103e4d4ab24a2c684cafAutores: Baer, Alan; Lundberg, Lindsay; Swales, Danielle; Waybright, Nicole; Pinkham, Chelsea; Dinman, Jonathan D.; Jacobs, Jonathan L.; Kehn-Hall, KyleneFecha: 2016-03-11DOI: 10.1128/jvi.0282-15Licencia: cc-byAbstract: El virus venezolano de la encefalitis equina (VEEV) es El aumento de la circulación y diseminación en las Américas de VVEV y otros arbovirus encefalíticos, como el virus de la encefalitis equina oriental y el virus del Nilo Occidental, subrayan la necesidad de investigar la patogénesis de la encefalomielitis viral para el desarrollo de nuevas contramedidas médicas. La dinámica hospedante-patógena de las células de astrocitoma humano U87MG infectadas con asnos VVEV Trinidad se determinó mediante la secuenciación de ARN (ARN-Seq) de poli(A) y mRNAs. Para identificar las alteraciones críticas que tienen lugar en el transcriptoma del huésped tras la infección por VVEV, se recolectaron muestras a 4, 8 y 16 h de postinfección y se adquirieron datos de ARN-Seq utilizando una plataforma PGM Ion Torrent. Se observó una expresión diferencial de respuesta al interferón, factores de respuesta al estrés La proteína cinasa ARN similar a la proteína endoplasmática retículo cinasa (PERK) brazo de la UPR fue activado, ya que la expresión de activando el factor de transcripción 4 (ATF4) y CHOP (DDIT3), reguladores críticos de la vía, fue alterada después de la infección. La expresión del factor de transcripción respuesta temprana al crecimiento 1 (EGR1) fue inducida de una manera dependiente de PERK. EGR1(−/−) fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) demostró menor susceptibilidad a la muerte celular inducida por VEEV que los MEFs de tipo salvaje isogénico, lo que indica que EGR1 modula las vías proapoptóticas después de la infección VEEV. La influencia de EGR1 es de gran importancia, ya que el daño neuronal puede conducir a secuelas a largo plazo en En casos graves, la propagación viral se dirige al tejido neuronal, resultando en una inflamación significativa y potencialmente mortal dependiente de una combinación de interacciones virus-anfitriona. Actualmente no hay terapias para infecciones causadas por alfavirus encefalíticos debido a una comprensión incompleta de su patogénesis molecular. El virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) es un alfavirus que es prevalente en las Américas y que es capaz de infectar caballos y humanos. Aquí utilizamos la secuenciación de ARN de próxima generación para identificar alteraciones diferenciales en los astrocitos infectados con VEEV. Nuestros resultados indicaron que la abundancia de transcripciones asociadas con el interferón y las vías de respuesta proteica desplegadas se alteraron después de la infección y demostraron que la respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1) contribuyó a la muerte celular inducida por VEEV. Texto: Venezuelan equina encefalitis virus (VE El VEEV es un virus de ARN de cadena positiva que es transmitido por mosquitos y que está naturalmente presente en depósitos de roedores (1). Hay seis subtipos que se clasifican por su rango geográfico y patología en equinos y humanos. Las dos cepas epizoóticas, IA/B y IC, surgieron de mutaciones entre las cepas enzoóticas (2). Las cepas IA/B y IC son de especial preocupación debido al aumento de las tasas de morbilidad y mortalidad y los riesgos asociados con la amplificación viral y el posible derrame de especies (2). En los seres humanos, el VEEV causa una enfermedad febril tipificada por fiebre, malestar y vómitos. En algunos casos, la infección progresa hacia el sistema nervioso central (SNC) y síntomas neurológicos, como confusión, ataxia y convulsiones, se manifiestan. La tasa de mortalidad entre los casos con síntomas neurológicos puede ser de hasta 35% en niños y 10% en adultos, con déficits neurológicos a largo plazo a menudo vistos en sobrevivientes (2). En 1995, un brote de VEEV en Colombia y Venezuela dio lugar a más de 100.000 casos humanos (3). Además de brotes naturales, el VEEV también es una preocupación desde una perspectiva bioterrorista, ya que puede crecer a altos títulos, requiere una dosis infecciosa baja, y contiene múltiples serotipos. Tanto la ex Unión Soviética como los Estados Unidos anteriormente armaron el virus, produciendo grandes cantidades para sus programas de armas biológicas ofensivas ya desactivadas (4). Actualmente, la cepa vacuna TC83 se utiliza en caballos y para personal de alto riesgo; sin embargo, debido a la baja tasa de seroconversión lograda con esta vacuna (5) y su dependencia de dos mutaciones atenuantes únicas (6), se considera no a Hasta la fecha no existen tratamientos aprobados por la FDA para la infección por VEEV, y se requieren estudios adicionales para aclarar los mecanismos asociados con la patogénesis subyacente del VEEV. Los estudios transcriptómicos virales y de huésped pueden proporcionar una gran cantidad de información sobre los mecanismos patógenos subyacentes y las interacciones posteriores al curso de una infección. El uso de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de virus previamente no característicos y el establecimiento de numerosos sistemas experimentales nuevos que redefinieron las interacciones virus-anfitriones. Hasta la fecha, varios estudios han examinado las alteraciones en el transcriptoma del huésped después de la infección por VEEV. Un análisis comparativo de microarray entre células infectadas persistentemente con VEEV y células capaces de limpiar VEEV resultó en la identificación de PARP12L como factor antiviral (8). Una comparación molecular utilizando microarrays de respuestas basadas en el huésped a la cepa TC83 fue capaz de identificar biomarcadores diferenciando entre los grupos que responden a la vacuna y los que no responden a la vacuna, así como la implicación de interferón (IFN), vías inducidas por interferón, receptores similares a los de Toll (TLR) y vías relacionadas con la interleucina 12 (IL-12) (9). Un estudio que examinó el papel de la adhesión y los factores inflamatorios en ratones CD-1 infectados por VEEV encontró modulación viral de la expresión de la matriz extracelular y genes de adhesión, como las integrinas (Itgáxis, Itg2, 3 y 7), las cadherinas 1 y 2, la molécula de adhesión de células vasculares 1, y la molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1), en los cerebros de ratones infectados por VEEV (10). Un estudio de Sharma et al. utilizaron microarrays para analizar los cambios en la expresión génica en el tejido cerebral de ratones infectados por VVEV durante el curso de una infección, descubriendo numerosas vías inmunes involucradas en la presentación de antígenos, inflamación, apoptosis y la respuesta antiviral tradicional (Cxcl10, CxCl11, Ccl5, Ifr7, Ifi27, Oas1b, Fcerg1, Mif, clusterin, e importante complejo de histocompatibilidad [MHC] clase II) (11). Un segundo estudio del mismo grupo identificó la regulación de los microRNAs (miRNAs) en los cerebros de ratones infectados por VVEV, lo que permitió la correlación de los cambios de miRNA con los datos de expresión de mRNA anteriores (11, 12). Estos análisis sugieren que el VEEV puede estar utilizando miRNAs celulares para regular el ARNm aguas abajo, lo que puede corresponder con los cambios histológicos inducidos por el VEEV en el sistema nervioso (11, 12). En el estudio actual, la secuenciación del ARNm de la próxima generación (ARN-Seq) se utilizó para identificar alteraciones clínicamente relevantes en el transcriptoma del ARNm de los astrocitos humanos infectados con la cepa de tipo salvaje (WT) VEEV Trinidad burro (TrD). El análisis de mRNAs huésped por ARN-Seq proporciona una visión novedosa de cómo un huésped responde a una infección viral a través de la identificación de un amplio y dinámico rango de transcripciones de una manera imparcial. Secuencia selectiva de mRNAs, específicamente, poliadenylated [poli(A)] transcripciones, que representan el 1% de Como el VEEV ha demostrado infectar productivamente a los astrocitos tanto in vitro como in vivo (14, 15), elegimos los astrocitos como nuestro modelo de interés. Los astrocitos son las células más abundantes del cerebro, superando a las neuronas por al menos 5 veces (16), proporcionando un recurso abundante para la replicación viral dentro del cerebro. Además de su bien descrito papel estructural en el tejido neuronal, los trocitos desempeñan papeles críticos en otros procesos, incluyendo la regulación del flujo sanguíneo y de la barrera hematoencefálica, la transmisión sinapsis y la respuesta a la infección (16). Se ha demostrado que los astrocitos infectados por el VEEV producen citocinas múltiples, incluyendo IL-8, IL-17, interferón gamma (IFN- +), y proteína 10 inducida por interferón gamma, todas las cuales se encontraron asociadas con atenuación viral (14). Con el fin de obtener una visión dinámica del interactoma virus-anfitrión, se utilizó el ARN-Seq para monitorear los cambios en la expresión génica en los astrocitos infectados por VEEV TrD a las 4, 8 y 16 h de postinfección (hpi). Al observar las alteraciones en múltiples momentos tempranos utilizando réplicas biológicas triplicadas, se genera un rango robusto y dinámico de información, y esta información proporciona un aumento tanto en la potencia como en la exactitud de la detección de transcripciones expresadas diferencialmente en un modelo clínico altamente relevante (17). Entre las células infectadas por VEEV, se observó un aumento en los genes regulados por interferón, incluyendo IFIT1, IFIT2, IFIT3 y OASL. También se observó el aumento en la expresión de genes involucrados en la vía de respuesta proteica inducida por estrés (UPR). Curiosamente, la infección por VEEV resultó en un La identificación de ARNm del huésped cuya expresión se altera después de la replicación del VEEV, específicamente, EGR1 y sus interactores arriba y abajo, puede proporcionar nuevos objetivos terapéuticos basados en el huésped críticos para la replicación del VEEV y una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes que sustentan la replicación del alfavirus. Infecciones virales y ensayos de placa. Se obtuvo TrD del VEEV de Recursos del BEI. Todos los experimentos con VEEV TrD se realizaron bajo condiciones de bioseguridad nivel 3 (BSL-3). Todo trabajo que involucra a agentes selectos está registrado en los Centros de Control y Prevención de Enfermedades y se llevó a cabo en el Laboratorio de Investigación Biomédica de la Universidad George Mason, que está registrado de acuerdo con las regulaciones federales de agentes selectos. Las células fueron infectadas durante 1 h a 37 °C y rotaron cada 15 minutos para asegurar una cobertura adecuada. Las células fueron lavadas con solución salina fosfatada (PBS), y se añadió un medio de crecimiento completo a las células. Se recolectaron sobrenadantes virales y células en varias ocasiones para su posterior análisis. Los ensayos de placa se realizaron como se describió anteriormente (18). Aislamiento de mRNA y preparación de biblioteca poli(A). El ARN de células U87MG fue purificado tanto de TrD VEEV infectado (nivel de bioseguridad 3) como de células U87MG simuladas a 4, 8 y 16 hpi utilizando un kit de aislamiento de mirVana (Tecnologías de Vida). El control de calidad del ARN purificado se realizó a partir de un bioanalizador Agilent 2100, y se utilizó un corte de integridad de ARN número de 8 A continuación, se añadió una mezcla de control de pico de ARN ARN ARN External Controls Consortium (ERCC) a las entradas totales de ARN (10 g de ARN) antes de la selección de poli(A) utilizando un kit de Dynabeads de Life Technologies mRNA Direct. La preparación de una biblioteca de ARN de transcriptoma completo de ARNm purificado se llevó a cabo utilizando un kit de Ion Total ARN-Seq (v2; Life Technologies). El control de calidad de las bibliotecas de cDNA se llevó a cabo utilizando el bioanalizador Agilent 2100 junto con pruebas de esterilidad para la eliminación de bibliotecas para la secuenciación de un laboratorio BSL-3 a BSL-2. Secuenciación de ARN. La preparación de plantillas de biblioteca se realizó en una plataforma One Touch 2 (Life Technologies). La secuenciación de A Un total de 119 millones de lecturas de secuenciación y un promedio de 6,6 millones de lecturas por muestra fueron utilizados como entrada en nuestra tubería de análisis. A menos que se indique lo contrario, el análisis de ARN-Seq aguas abajo se llevó a cabo utilizando la biogenómica CLC Workbench (v7). Las lecturas de ARN-Seq en bruto fueron recortadas para eliminar cualquier fragmento de adaptador de secuenciación residual que permaneciera en los 5= o 3= extremos después de la secuenciación. Además, el recorte final de las lecturas se realizó utilizando el algoritmo Mott modificado con una puntuación de calidad Q20, y cualquier lectura de menos de 15 pb fue descartada. Tras el recorte de lectura, las lecturas fueron cartografiadas al genoma humano hg19 con los siguientes parámetros ARN-Seq: un límite de 10 hits para múltiples posiciones cartográficas, una fracción de similitud de 0,8, una fracción El nivel de expresión de genes y transcripciones individuales se calculó utilizando el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas cartográficas (RPKM) del método Mortazavi et al. (19). Además, las lecturas no cartográficas también fueron cartografiadas al conjunto de secuencias de ARN sintética ERCC92 (20), así como al genoma de referencia VEEV (número de adhesión GenBank L01442). En todas las muestras, el coeficiente de correlación (R 2) entre el número de lecturas esperadas y el número de lecturas cartográficas para los controles de pico en ERCC92 fue superior a 0.90. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los resultados de secuenciación general. El filtrado postmapping de todos los datos de ARN-Seq se llevó a cabo junto a incluir sólo genes con al menos un mapa único leído (26.230 genes permanecieron El análisis de componentes principales del conjunto de datos filtrados resultante (13.906 genes en total) se realizó utilizando recuentos brutos de lecturas exclusivamente cartografiadas (ver Fig. 2A ). Los valores de expresión RPKM restantes para cada gen incluido en el conjunto de datos filtrados se sometieron a normalización cuantitativa con un corte del 5%. En la Fig. 2B se muestra un gráfico de caja de valores RPKM transformados para cada muestra antes de la normalización. El valor R 2 para la variación de muestra a muestra en pares dentro de cada conjunto de réplica biológica se observó un rango de 0,89 a 0,99, lo que indica que nuestras réplicas biológicas fueron consistentes y no mostraron un sesgo fuerte (datos no mostrados). En primer lugar, el análisis empírico del algoritmo de expresión génica diferencial, parte del paquete edgeR Bioconductor (21), se aplicó al conjunto integrado de datos de los 18 experimentos utilizando los parámetros por defecto y un falso valor P corregido por la tasa de descubrimiento. En cada momento se compararon muestras infectadas y simuladas, y los genes cuya expresión difería en más de 2 veces con una significación con un valor P de 0,05 se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial. Además del método descrito anteriormente, se aplicó una prueba estadística ortogonal de expresión diferencial a los datos utilizando una prueba estadística desarrollada por Baggerly et al. (22) para contar el número de etiquetas de secuencia expresadas asociadas con genes individuales, una característica común de ambos análisis en serie de datos de expresión génica (SAGE) y datos ARN-Seq. Cuando se compararon muestras infectadas y simuladas, los genes individuales se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial cuando su expresión difería por más de 2 veces con una significación con un valor de P de 0.05. Los genes expresados diferencialmente que se encontraban en la intersección de los conjuntos de genes identificados por ambos métodos descritos anteriormente se consideraron candidatos de alta calidad y se utilizaron como punto de partida para la investigación ulterior. La agrupación y la GSEA. Los datos de expresión normalizados y filtrados se sometieron a la agrupación de k-medias utilizando una métrica de distancia euclidiana donde los genes se agruparon por medio de valores de expresión génica normalizada (RPKM) para cada condición experimental. La agrupación se ajustó a 20 grupos de agrupamiento distintos, y los perfiles de expresión génica individuales agrupados se probaron para el enriquecimiento de términos de ontología génica (GO) asociados con genes individuales. En primer lugar, se realizó una prueba hipergeométrica de las anotaciones de GO mediante la implementación del paquete GOStats en cada uno de los conglomerados individuales obtenidos a partir de la agrupación k-media (24). Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en todo el conjunto de datos filtrados utilizando 100.000 permutaciones, mientras que se eliminaron duplicados y se aplicó un análisis de varianza. Un total de 1.419 categorías superaron un tamaño mínimo de característica de 10 y se utilizaron para la investigación ulterior. Las cohortes de genes con patrones de expresión compartidos a lo largo del tiempo se identificaron mediante la agrupación de k-medias; las que se encontraron enriquecidas para los DEG fueron posteriormente sometidas al análisis de vía mediante el sistema GeneMania (25). Utilizando un enfoque manual ad hoc, se identificaron vías relevantes y las conexiones entre ellas sobre la base de los datos existentes en Análisis de qRT-PCR. El ARNm purificado se convirtió en ADNc utilizando un kit de ARN-a-cDNA de alta capacidad (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de los números de copia viral se realizó mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR) como se describió previamente (26). La expresión anfitriona de los siguientes genes fue analizada con los ensayos de TaqMan (indicados entre paréntesis): activando el factor de transcripción 3 (ATF3; Hs00231069_m1), ATF4 (Hs00909569_g1), CEBPB (Hs00270923_s1), CEBPD (Hs00270931_s1), DDIT3 (Hs00358796_g1), FOS (Hs04194186_s1), JUN (Hs01103582_s1), EGR1 (Hs00152928_m1), IFI6 (Hs00242571_m1), IFIT1 (Hs01911452_s1), IFIT2 (Hs01922738_s1), IFIT3 (Hs01922738_s1) Los ensayos para el ARNr 18S (Hs99999901_s1 o Mm04277571_s1) se utilizaron para la normalización. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un instrumento ABI StepOne Plus. Tratamiento con PERKi y recolección para el análisis de Western blot. Las células U87MG fueron pretratadas durante 2 h con 10 M la proteína quinasa ARN similar al retículo endoplasmático (ER) cinasa (PERK) inhibidor (PERKi) GSK2606414 (número catalógico 516535; EMD Millipore) o dimetil sulfóxido (DMSO) en DMEM antes de la infección por VEEV TrD (MOI, 5). Después de 1 h, el inóculo viral fue eliminado y las células fueron lavadas con PBS estéril (1). El medio fue reemplazado A 16 hpi, el medio fue removido, y las células fueron lavadas con PBS y luego recolectadas para el análisis de Western blot. Derribado de EGR1 con siRNA. Células U87MG sembradas a 6,7 10 4 células por pozo en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 50 nM de preparación de lisato de proteína de siGenome y análisis de Western blot. Preparación de lisato de proteína y análisis de Western blot se realizaron como se describió previamente (27). Se utilizaron anticuerpos primarios frente a los siguientes anticuerpos: EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular), virus de la encefalitis equina policlonal TC83 (subtipo IA/B) proteína capsid (Recursos BEI), CHOP (anticuerpo L63F7; número de catálogo 2895; señalización celular), subunidad fosforilada de factor de iniciación eucariótica 2 (p-eIF2+; Ser51; anticuerpo D9G8; número de catálogo 3398; señalización celular), ATF4 (anticuerpo D4B8; número de catálogo 11815; señalización celular), caspasa activada 3 (antícuerpo Asp175; número de catálogo 9661; señalización celular), y peroxidasa-conjugada por caballos -actina (número de catálogo ab49900-100; Abcam). Análisis de inmunofluorescencia. Las células U87MG fueron cultivadas en tapas en una placa de 6 pozos, infectadas con VEEV TrD como se describe anteriormente, lavadas con PBS (sin Ca y Mg), y luego fijadas con formaldehído al 4%. Las células fueron permeabilizadas con Triton X-100 en PBS durante 20 min y luego lavadas dos veces con PBS. Las células fueron bloqueadas durante 10 min a temperatura ambiente en albúmina sérica bovina al 3% en PBS. Anticuerpos primarios consistentes en una proteína capsid VEEV (número catalógico NR-9403; Recursos BEI) diluido 1:600 y un anticuerpo EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular) diluido 1:400 fueron incubados en tampón fresco de bloqueo a 37°C durante 1 h y lavado A continuación se muestra una imagen representativa de cada muestra. Anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 568 (número catalógico A11057; Invitrogen) y anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 488 (número catalógico A21202; Invitrogen) diluidos 1:400 como anticuerpos secundarios y tratados de la misma manera que los anticuerpos primarios. DAPI (4=,6-di-amidino-2-fenilindol) diluido 1:1.000 para visualizar los núcleos. Se montaron las tapas sobre diapositivas de vidrio utilizando 10 l de medio de montaje Fluoromount G (número catalógico 0100-01; Southern Biotech). Se utilizó un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE2000-U para microscopía de fluorescencia. Las imágenes se vieron utilizando una lente de inmersión de aceite objetivo de 60. Todas las imágenes fueron sometidas a un promedio de cuatro líneas. Las imágenes fueron procesadas a través del software Nikon NIS-Elements AR Analysis (v3.2). CellTiter Glo y Caspasa 3/7 Glo ensayos. Los fibroblastos embrionarios del tipo salvaje y EGR1 / mouse (MEFs) fueron infectados con TrD en varios MOIs durante una hora y luego lavados con PBS, y el medio fue reemplazado. La viabilidad celular fue medida a las 24 h postinfección utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente Promega CellTiter (número catalógico G7571) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia fue leída mediante un detector de múltiples modos Beckman Coulter DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. De manera similar, la activación de caspasa en el tipo salvaje infectado y EGR1 / MEFs se midió a las 24 h postinfección utilizando un ensayo Promega Caspasa 3/7 Glo (catalog número G8090) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia se leyó utilizando el detector multimodo DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. Números de adhesión de secuencia de nucleótidos. Los datos de secuenciación en bruto para todas las carreras de ARN-Seq incluidas en este trabajo están disponibles públicamente en la base de datos NCBI BioProject bajo el número de adhesión PRJNA300864 (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA300864). Las líneas celulares comunes utilizadas para el estudio de la infección por VEEV incluyen células Vero y BHK; en este estudio, los astrocitos U87MG fueron elegidos como modelo in vitro debido a su relevancia fisiológica y mayor significación clínica; se realizaron experimentos iniciales para caracterizar la replicación viral en células U87MG; se midió la cinética de replicación de VEEV en células U87MG mediante ensayos en placa y mediante el monitoreo de los niveles de expresión de proteínas virales y ARN y el efecto citopático (ECP) en las células infectadas (Fig. 1); se observó una liberación viral tan temprana como 4 hpi, observándose 4 unidades log de virus, seguido de un aumento consistente de la replicación a 8 y 16 hpi (Fig. 1A). La replicación viral alcanzó su punto máximo a 16 hpi, y no se observó un aumento adicional de los La expresión vírica capsid siguió un patrón similar, siendo detectada proteína a 8 hpi y plastificación de expresión a 16 hpi (Fig. 1B). Entre las células U87MG infectadas, se observó una EPC significativa por microscopía a 24 hpi, con poca o ninguna EPC detectada a 16 hpi (datos no mostrados). De acuerdo con estas observaciones, se observó un aumento de la actividad de la caspasa 3/7 sólo a 24 hpi (Fig. 1C). Sobre la base de estos datos, los tiempos de 4, 8 y 16 hpi, reflejando las etapas tempranas, medias y tardías del ciclo de vida viral, respectivamente, fueron seleccionados para el análisis de ARN-Seq para proporcionar una visión dinámica del perfil del transcriptoma host-patógeno. Análisis de secuenciación de ARN de los astrocitos infectados por VEEV. Se aisló el ARNm de conjuntos triplicados de cultivos de células U87MG infectados con simulacros y VEEV, se purificó a 4, 8 y 16 hpi, y se utilizó para preparar bibliotecas de ARNc para ARN-Seq aguas abajo (ver Materiales y Métodos). En la Tabla 1 se muestra un resumen de alto nivel de los resultados de ARN-Seq. Las muestras de ARN VEEV fueron analizadas por RT-PCR cuantitativo en cada momento como un control para demostrar el aumento de la carga de ARN viral a lo largo del tiempo (Fig. 1D), consistente con el aumento del número de lecturas de ARN-Seq cartografiadas al genoma VEEV en puntos posteriores (Tabla 1). Para el análisis de ARN-Seq, los genes individuales se expresaron como el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón En la figura 2A se muestran los valores de expresión RPKM normalizados para cada muestra experimental y se pueden encontrar en el conjunto de datos S1 del material suplementario. La variación mínima de la muestra a la muestra en los valores de expresión dentro de las réplicas biológicas fue detectada constantemente (R 2 0,89 para todas las réplicas; datos no mostrados). Además, también se encontró que la variación de la intersample era mínima cuando se probó por pares a lo largo de todo el experimento utilizando los valores RPKM para los ARN de control de pico sintético ERCC97 (R 2 0,90 para todas las comparaciones; datos no mostrados). Como era de esperar, el análisis de dos componentes principales de los datos ARN-Seq para las células infectadas por simulacro de células frente a las infectadas por VEEV mostró una separación clara de las muestras a 16 hpi de las muestras en puntos Sin embargo, el agrupamiento de muestras infectadas por VVEV con muestras simuladas infectadas en puntos de tiempo anteriores sugiere que la respuesta a la infección viral se limitó a un estrecho subconjunto de genes de respuesta temprana, lo que supone una mayor carga de prueba en la identificación de genes expresados diferencialmente (DEGs) durante las primeras horas de infección. En este sentido, se utilizaron dos métodos ortogonales para identificar DEGs adecuados para una caracterización adicional: el método edgeR (21) y el método desarrollado por Baggerly et al. (22). Los genes identificados por un método se consideraron provisionalmente DEGs, y los identificados por ambos métodos eran DEGs candidatos a ser confirmados por qRT-PCR. Además de comparar los valores individuales de expresión génica para las células infectadas simuladamente y las células infectadas por VEEV en cada momento, también se compararon los valores de expresión génica en serie dentro de cada serie temporal de células infectadas por VEEV para los genes que no mostraron cambios estadísticamente significativos en la expresión en células infectadas simuladamente. Un esquema del análisis comparativo se muestra en la figura 2C. El número de DEGs estadísticamente significativos identificados por cada una de estas comparaciones se muestra en la figura 2D. Además, se utilizó el agrupamiento de k-medias (contra los valores normalizados de RPKM) para identificar cambios brutos en la expresión génica a lo largo del tiempo para cohortes de genes que potencialmente comparten la misma vía o desencadenantes reguladores (fig. 3 ; véase también Conjunto de datos S2 en el material suplementario). Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA; véase Material y Métodos En particular, el clúster 20 (tabla 2) se enriqueció significativamente para los genes involucrados en el control traslacional, la vía de señalización mediada por interferón tipo I y la vía de respuesta a proteínas desplegadas (valor P de GSEA 0,01). Aunque existe una conexión bien establecida entre el control traslacional y la EPU, una nueva conexión entre la EPU y la respuesta mediada por interferón tipo I en respuesta a la replicación viral fue sugerida por el análisis de la vía (ver Materiales y Métodos), implicando la respuesta al crecimiento temprano 1 (EGR1) como un puente potencial entre estas dos vías (Fig. 4). La EGR1 pertenece al clúster 20 y es fuertemente inducida durante la infección por VEEV, y varios otros genes asociados con la respuesta al interferón pertenecen al mismo clúster: IRF1, IFIT1, IFIT2, ISG15 e ILF3. EGR1 se ha asociado con aumentos en la expresión de activar el factor de transcripción 3 (ATF3) (28), que es un componente clave de la UPR y que también pertenece al clúster 20. Esta conexión representó un potencial a Anotaciones del proceso biológico obtenidas de Reactome para el clúster 20. Los identificadores de anotación del reactoma están indicados para cada anotación. Sólo se consideran anotaciones clasificadas por autor rastreable (TAS). TAP, transportador asociado con el procesamiento de antígenos; SRP, partícula de reconocimiento de señales. b Conjunto completo, el número total de genes en el genoma con un proceso biológico anotado; subconjunto, número total de genes expresados diferencialmente con un proceso biológico anotado. Red de genes relacionados con la respuesta del interferón tipo I y UPR. Círculos grandes, genes diferencialmente expresados; círculos pequeños, genes sin cambio significativo de expresión; círculos rojos, factores de respuesta tipo I al interferón; círculos amarillos, genes que regulan la transcripción del ADN; círculos azules, genes de respuesta a proteínas desplegadas; líneas rojas, genes involucrados en interacciones físicas proteína-proteína; líneas azules, genes involucrados en una vía común. Esta red fue sembrada con grupos k-medias 18 y 20, y muchos genes de proteína ribosómica fueron removidos. puente entre la vía UPR y la vía de respuesta al interferón, siendo EGR1 uno de los factores clave potenciales de transcripción que impulsan esta conexión. En consecuencia, se seleccionaron 15 genes de este análisis para su posterior caracterización por qRT-PCR (ver abajo): ATF3, activando el factor de transcripción 4 (ATF4), CEBPB, CEBPD, DDIT3/CHOP, EGR1, FOS, IFI6, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG15, ISG20, JUN y OASL. Los valores de expresión de estos genes, medidos por ARN-Seq, se muestran en la Fig. 5A y B. El análisis confirmatorio qRT-PCR indicó expresión génica concordante (fig. 5C y D). Los genes de respuesta al interferón inducidos están de acuerdo con los detectados en estudios previamente publicados (11, 29, 30) y estos genes sirvieron como control positivo interno. Además, se ha demostrado el vínculo entre la EGR1 y la vía del interferón; la EGR1 es inducida por IFN-® en fibroblastos de ratón y por IFN-®, -, y -® en fibroblastos humanos (31, 32). La EGR1 y la vía UPR fueron seleccionadas para su posterior análisis, ya que su papel en la infección por VEEV no ha sido elucidado. Los datos de análisis del ARN-Seq y la vía indicaron que los genes de respuesta al estrés y la UPR fueron inducidos después de la infección por VEEV. Durante una infección, las células anfitrionas responden al estrés celular resultante de una mayor traducción de proteínas virales y secreción al desencadenar el inicio de la vía de la UPR. La vía de la UPR es una respuesta celular adaptativa activada por el estrés del retículo endoplasmático (ER Con el fin de regular la homeostasis celular durante el plegado y la secreción de proteínas, la vía UPR ha desarrollado tres clases de sensores para asegurar la correcta regulación celular: la enzima inositolrequiriendo 1 (IRE1), la proteína cinasa ARN-como la ER cinasa (PERK), y activar el factor de transcripción 6 (ATF6) (33, 34). Durante la infección por VEEV, el brazo PERK de la UPR pareció estar alterado, ya que dos reguladores críticos de esta vía se expresaron diferencialmente: ATF4 y CHOP (DDIT3) (35). Para determinar si los DEGs alteraron la expresión proteica posterior, se realizó un análisis de manchas occidentales para CHOP, ATF4 y eIF2 fosforilado (p-eIF2). Tunicamicina, un inhibidor de la glucosilación Un análisis del curso del tiempo de las células U87MG tratadas con 1 M de tunicamicina indicó que 8 h de tratamiento proporcionaban la inducción más robusta de proteínas UPR (datos no mostrados). Las células VVEV infectadas pero no infectadas simuladamente o inactivadas por UV VVEV (UV-VEEV) mostraron un aumento espectacular en la expresión p-eIF2 + y un aumento modesto pero consistente en la expresión CHOP y ATF4 a 16 hpi (Fig. 6A). No se observó ningún cambio en la expresión proteica a 4 hpi (datos no mostrados). La microscopía confocal confirmó la regulación de CHOP y ATF4, demostrando un patrón de tinción más robusto y nuclear en las células infectadas por VVEV que en las células infectadas simuladas (Fig. 6C a E). Mientras que los niveles de expresión proteica Estos resultados son consistentes con la observación de que la expresión ATF4 está regulada a nivel traslacional en la inducción EPU (37). Como eIF2® puede ser fosforilada por múltiples cinasas (PERK, proteína cinasa ARN dependiente de doble cadena [PKR], control general no derrepresivo-2 [GCN2] e inhibidor hemeregulado [HRI]) (38), el inhibidor de PERK (PERKi) GSK2606414 fue utilizado para determinar si la fosforilación observada era dependiente de PERK. El tratamiento de las células infectadas por VEEV con PERKi dio lugar a una marcada disminución de la fosforilación eIF2® (Fig. 6B). Estos resultados indican que PERK contribuye a la fosforilación eIF2® pero que es probable que haya una quinasa adicional que contribuya al evento de fosforilación En conjunto, estos hallazgos indican que el brazo de PERK de la vía UPR se induce en puntos de tiempo posteriores a la infección por VVEV. EGR1 se regula en células infectadas y se localiza en el núcleo. EGR1 es un factor de transcripción que puede ser inducido por numerosas señales, incluyendo estrés oxidativo, hipoxemia y factores de crecimiento (39, 40). También se puede activar sobre la infección por virus de ADN y ARN, incluyendo virus Epstein-Barr, virus de hepatitis ratón, coronavirus murino y virus de encefalitis japonesa (41) (42) (43). El tratamiento de MEFs con el activador UPR thapsigargin se ha demostrado que induce la expresión EGR1 de una manera dependiente de PERK (44). Dado el vínculo entre EGR1 y UPR y la inducción robusta de EGR1 expresión mRNA después de la infección por VVE 4 y 5), se eligió EGR1 para un estudio posterior. La expresión proteica EGR1 después de la infección por VEEV fue analizada por el análisis de Western blot. Como estudios previos han indicado que EGR1 puede ser activado por el virus de la hepatitis del ratón independientemente de la replicación del virus (probablemente debido a la interrupción de la membrana celular después de la entrada) (41), se incluyó un control del virus inactivado por UV (VVVEV). Los niveles de proteína EGR1 se incrementaron después de la infección por VEEV en comparación con los niveles de células infecciosas simuladas y células infectadas por UV-VEEV (fig. 7A; compare los carriles 3, 6 y 9 ). La regulación más dramática de EGR1 se produjo a 16 hpi; esto se correlaciona con los niveles más altos de producción de VEEV capsid (fig. 1B Tras la inducción, se ha demostrado que la EGR1 se transloca al núcleo para inducir la expresión génica a través de la unión a la secuencia de unión de Egr (EBS) [GCG(G/T)GGCG] (40, 45). La microcopia confocal reveló altos niveles de EGR1 en los núcleos de células infectadas, mientras que sólo se detectaron bajos niveles de EGR1 tanto nucleares como citoplasmáticos en células simuladas (Fig. 7B). El tratamiento PERKi de células infectadas con VEEV resultó en una pérdida completa de inducción EGR1 (Fig. 7C), indicando que la EGR1 fue inducida de manera dependiente de PERK. Estos resultados demuestran que los niveles de proteína EGR1 y la localización nuclear se incrementan después de la infección por VEEV y que la inducción de EGR1 es dependiente La pérdida de EGR1 inhibe la apoptosis inducida por el VEEV pero no altera la cinética de la replicación del VEEV. Como EGR1 influye en la supervivencia celular y la apoptosis (46), se evaluó el impacto del EGR1 en la muerte celular inducida por el VEEV. Se observó escisión de Caspasa 3 en MEFs WT a 24 hpi cuando se infectaron con un MOI de 0,5 y comenzaron tan pronto como 16 hpi cuando se infectaron con un MOI de 5 (Fig. 8A ). En contraste, las células EGR1 / mostraron poco o ningún escisión de caspasa detectable tras la infección con el VEEV. Se realizaron dos conjuntos de experimentos para confirmar cuantitativamente estos resultados: ensayos de CellTiter Glo para medir la viabilidad celular total (producción de ATP) y Caspasa 3/7 Tanto WT como EGR1 / MEF mostraron disminuciones dosis-dependientes en la viabilidad celular después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que tenían células significativamente más viables en cada MOI examinadas (Fig. 8B). Concordantemente, se observó un aumento dosis-dependiente en la actividad de caspasa 3/7 después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que demostraban una actividad reducida de caspasa 3 en los MOIs de 0,5 y 5 (Fig. 8C). Estos resultados se replicaron en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1 (Fig. 8D). EGR1 ha demostrado regular negativamente la transcripción de BIRC5 (Survivina), un inhibidor de la apoptosis (IAP) miembro de la familia (47). Los datos de ARN-Seq indicaron que la expresión del gen BIRC5 disminuyó después de la infección por VVEV: log 2 -transformado de los valores de cambio del pliegue de la expresión génica normalizada fueron 1,16, 1,18, y 1,50 a 4, 8, y 16 hpi, respectivamente (ver Tabla S1 en el material suplementario y NBI BioProject número de adhesión PRJNA300864). Se utilizaron WT y EGR1 / MEFs para determinar si EGR1 influyó en la expresión del gen BIRC5 después de la infección por VVEV. La expresión BIRC5 disminuyó significativamente a 16 hpi en los MEFs infectados por VVEV, pero esta reducción no se observó en los MEFs infectados por VVEV1 / (Fig. 8E). La expresión del gen para el inhibidor de la apoptosis (XIAP), otro miembro de la familia IAP, no fue significativamente alterada después de la infección (datos no mostrados). Colectivamente, estos resultados demuestran que EGR1 contribuye a la apoptosis inducida por VEEV. Se determinó la cinética de replicación VEEV tanto para EGR1 / como para WT MEFs para determinar la relevancia de EGR1 en la replicación viral.Las células fueron infectadas en dos MOIs diferentes (0,5 y 5), y los sobrenadantes virales fueron recolectados en 4, 8, 16 y 24 hpi y analizados mediante análisis de placa.La cinética de replicación fue similar entre EGR1 / y WT MEFs en ambos MOIs, con títulos que alcanzaron un máximo de 16 hpi (fig. 9A). 9B). Estos resultados fueron replicados en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1. La transfección de siRNA dirigida a EGR1 resultó en una disminución del 90% en la expresión proteica EGR1 (Fig. 9D ) sin ningún efecto significativo en la replicación viral (Fig. 9C). Estos resultados sugieren que la disminución de la apoptosis observada en EGR1 / MEFs no se debió a la cinética de replicación VEEV alterada. A pesar de ser reconocida como una amenaza emergente, se sabe relativamente poco acerca de los mecanismos de virulencia de los alfavirus, en gran parte debido a una brecha de conocimiento en el interactoroma host-patógeno. La infección por VEEV a menudo resulta en encefalitis fatal y se sabe que inhibe tanto la transcripción celular como la traducción para En contraste, en el VVEE del SNC se ha demostrado que upregula numerosos genes tanto en la respuesta inflamatoria como en las vías apoptóticas (1, 48). Específicamente, numerosas citocinas proinflamatorias, incluyendo interleu-kin-1 (IL-1), IL-6, IL-12, glucógeno sintasa cinasa 3, oxido nítrico inducible sintasa, y factor de necrosis tumoral alfa (TNF- Con este fin, la identificación de transcripciones críticas expresadas de forma diferencial entre células infectadas clínicamente relevantes ayudará a una mayor comprensión de la patogénesis viral y puede resultar beneficiosa para la identificación de objetivos terapéuticos. En este estudio, los datos de análisis de red/ARN-Seq y los resultados de estudios de expresión proteica revelaron que la infección por VEEV resultó en la activación del brazo PERK de la vía EPU, incluyendo la activación de ATF4, CHOP y eIF2-fosforilación. Varios alfavirus han sido reportados previamente para secuestrar componentes clave de la vía EPU con el fin de promover la replicación viral, ya que la dependencia de virus envueltos en la ER para la síntesis de glucoproteínas virales asociadas a la envoltura y su transporte a la membrana plasmática a menudo enfatiza la ER debido a la rápida producción de proteínas virales (54, 55). La modulación de la UPR no es exclusiva de los alfavirus; más bien, es un rasgo compartido de muchos virus de ARN de sentido positivo. El virus del dengue ha demostrado suprimir PERK al inhibir la fosforilación continua de eIF2 para inhibir la apoptosis inmediata, aumentando la traducción de proteínas virales y ampliando la duración de la replicación viral productiva (34). Estudios con el virus de la hepatitis E (HEV) han demostrado que la expresión de la proteína capsid del HEV marco abierto de lectura 2 (ORF2) activa la expresión de CHOP y ATF4 (56). En el HEV, ORF2 se demostró estimular CHOP a través de estresadores de ER y elementos de respuesta aminoácidos (AARE) a través de la interacción con ATF4 (56). Los resultados mostrados aquí indican que durante la Durante la detección inicial del estrés ER, PERK es capaz de identificar proteínas mal plegadas en el lumen de la ER y fosforilatos eIF2® con el fin de iniciar las vías de prosurvival en la UPR a través de la actividad general En 24 hpi caspasa 3/7 se analizó la actividad utilizando el ensayo Caspasa 3/7 Glo. Los valores de cambio de pliegue para células simuladas se fijaron en un valor de 1. **, P 0.001. (E) EGR1 / y WT MEFs fueron simulados o VEEV infectados (MOI, 5). El ARN fue preparado, y la expresión genética fue determinada por qRT-PCR utilizando un ensayo TaqMan para BIRC5 (Survivin). Los datos mostrados son los valores del cambio de pliegue de la expresión génica normalizada determinado por el ciclo del umbral T *, P 0,005 (comparación de las células WT infectadas por VEEV y EGR1 /). Inhibición de la síntesis proteica (33, 34). VEEV parece inducir la UPR y promover el aumento de la fosforilación eIF2, que resulta en la inhibición traslacional de la mayoría de los ARNm, mientras que UPR aumenta selectivamente la traducción de ATF4. ATF4 es responsable de la expresión de genes que codifican proteínas involucradas en apoptosis, procesos redox, metabolismo de aminoácidos y reclutamiento de chaperona ER y es un conocido mediador de la vía PERK y CHOP (33, 34). La activación CHOP facilita la expresión aumentada de chaperonas celulares para contrarrestar la acumulación de proteínas mal dobladas (57). La falta de supresión del plegado de proteínas en células persistentemente estresadas, como durante una infección viral, puede resultar en la activación del factor de transcripción proapoptótico CHOP, lo que conduce a la supresión del linfoma de células antiapoptóticas de proteína B-2 (Bcl-2). CHOP también puede funcionar como factor de transcripción prosurvival al desfosforilar eIF2® a través de la activación de la proteína DNA dañado-inducible (GADD34) en un aspecto de retroalimentación autorreguladora (33, 34). Sin embargo, los datos presentados aquí apoyan un modelo por el cual la infección VEEV lleva a CHOP a funcionar en su papel proapoptótico, ya que no se detectó ningún cambio en la expresión génica de GADD34 por el análisis de ARN-Seq. Si bien la UPR fue inducida después de la infección VEEV, Esto es algo sorprendente, ya que se espera que la infección por VVEV induzca un estrés ER significativo debido a la producción masiva de proteínas virales durante el curso de una infección aguda robusta. Las proteínas estructurales del VVEV se traducen del ARN subgenómico viral en poliproteínas en la ER áspera. Las glucoproteínas precur-sor E1 y pE2 se ensamblan como heterodímeros en la ER, experimentando cambios conformacionales que requieren numerosas chaperonas (1, 58). Es posible que el VVEV haya desarrollado mecanismos para subvertir la inducción de la UPR. Para contrarrestar la UPR, las proteínas no estructurales (nsPs) del virus Chikungunya (CHIKV) han demostrado inhibir la expresión de ATF4 y otros genes objetivo conocidos de la UPR, incluyendo GRP78/BiP, GRP94 A través de la actividad nsP, CHIKV ha desarrollado un medio de suprimir la actividad UPR resultante del estrés ER inducido por la glucoproteína viral, evitando así la autofagia inmediata y la activación apoptótica. El capsid VEEV es responsable de interferir con el tráfico nucleocitoplasmático e inhibir la transcripción del ARNr y del ARNm y ha sido implicado en la regulación de la señal de tipo I IFN y la respuesta antiviral mediante la regulación de la producción de ARN viral y proteínas (1, 48, 60). Por lo tanto, hipotetizamos que la capacidad del capsid VEEV para inhibir la transcripción celular y el tráfico de bloqueo nucleocitoplasmático resulta en la inducción retarda de la UPR. Los resultados de un análisis detallado de la red basado en los datos existentes en la literatura, junto con los perfiles de expresión génica temporal obtenidos de este estudio, apuntan a que el EGR1 es un nodo importante en el nuevo vínculo entre la activación del VEEV de la respuesta de interferón tipo I y la UPR. Se sabe que el EGR1 forma un complejo de unión al ADN con C/EBPB, socio crítico de la dimerización de CHOP (61). Estudios anteriores han demostrado que la localización nuclear del CHOP puede actuar como inductor del EGR1 y que el CHOP puede actuar como cofactor transcripcional para la regulación de los genes objetivo del C/EBPB-EGR1 (61). Los resultados del análisis de la mancha occidental y la microscopía presentados en este estudio apoyan este modelo, ya que se encontró que la infección por VEV aumenta tanto los niveles generales como la distribución nuclear Los estudios anteriores demostraron la inducción de ARNm EGR1 por IFN-â en fibroblastos de ratón y por TNF-â, TNF-, IL-1, IFN-â, IFN-â e IFN-â en fibroblastos humanos (31, 32). EGR1, también conocido como Zif268 y NGF1-A, es una proteína de dedo de zinc y factor de transcripción mamífero. Ha sido implicada en la proliferación y diferenciación celular, pero también puede tener funciones proapoptóticas, dependiendo del tipo celular y estímulo (62). De particular interés, EGR1 controla directamente la proliferación cuando se activa por la proteína activada por mitogen quinasa/vía cinasa regulada por señal extracelular en astrocitos estimulados por mitogen (63). Se han observado cambios inducidos por virus en la expresión EGR1 en En los astrocitos infectados por VIH-1, se encontró que la regulación de la EGR1 fue inducida por Tat a través de la transactivación del promotor de la EGR1, lo que llevó a la disfunción celular y a la neurotoxicidad inducida por Tat (64). También se ha demostrado que el aumento de las cantidades de ARNm EGR1 actúa de una manera específica de la región, correspondiendo temporalmente con la producción de ARN viral en los tejidos cerebrales de ratas infectadas por el virus de la rabia o el virus de la enfermedad de Borna (65). En resumen, el estudio actual demuestra un vínculo potencial entre la activación de la EPU y la EGR1. Hasta la fecha, los mecanismos subyacentes a la patogénesis del VEEV y la degeneración neuronal subsiguiente han sido sólo parcialmente elucidados, por lo que determinar el papel de la EGR1 y la UPR puede jugar un papel significativo en el desarrollo de una nueva diana terapéutica que resulte en una disminución de la muerte neuronal y las secuelas neuronales posteriores que resultan de la infección.

¿Cuál es la tasa de mortalidad del virus venezolano de la encefalitis equina en niños?

El virus venezolano de la encefalitis equina induce la apotosis a través de la activación de la respuesta de proteínas no plegadas de EGR1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4794670/SHA: f4aa788ab898b28b00ee103e4d4ab24a2c684cafAutores: Baer, Alan; Lundberg, Lindsay; Swales, Danielle; Waybright, Nicole; Pinkham, Chelsea; Dinman, Jonathan D.; Jacobs, Jonathan L.; Kehn-Hall, KyleneFecha: 2016-03-11DOI: 10.1128/jvi.0282-15Licencia: cc-byAbstract: El virus venezolano de la encefalitis equina (VEEV) es El aumento de la circulación y diseminación en las Américas de VVEV y otros arbovirus encefalíticos, como el virus de la encefalitis equina oriental y el virus del Nilo Occidental, subrayan la necesidad de investigar la patogénesis de la encefalomielitis viral para el desarrollo de nuevas contramedidas médicas. La dinámica hospedante-patógena de las células de astrocitoma humano U87MG infectadas con asnos VVEV Trinidad se determinó mediante la secuenciación de ARN (ARN-Seq) de poli(A) y mRNAs. Para identificar las alteraciones críticas que tienen lugar en el transcriptoma del huésped tras la infección por VVEV, se recolectaron muestras a 4, 8 y 16 h de postinfección y se adquirieron datos de ARN-Seq utilizando una plataforma PGM Ion Torrent. Se observó una expresión diferencial de respuesta al interferón, factores de respuesta al estrés La proteína cinasa ARN similar a la proteína endoplasmática retículo cinasa (PERK) brazo de la UPR fue activado, ya que la expresión de activando el factor de transcripción 4 (ATF4) y CHOP (DDIT3), reguladores críticos de la vía, fue alterada después de la infección. La expresión del factor de transcripción respuesta temprana al crecimiento 1 (EGR1) fue inducida de una manera dependiente de PERK. EGR1(−/−) fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) demostró menor susceptibilidad a la muerte celular inducida por VEEV que los MEFs de tipo salvaje isogénico, lo que indica que EGR1 modula las vías proapoptóticas después de la infección VEEV. La influencia de EGR1 es de gran importancia, ya que el daño neuronal puede conducir a secuelas a largo plazo en En casos graves, la propagación viral se dirige al tejido neuronal, resultando en una inflamación significativa y potencialmente mortal dependiente de una combinación de interacciones virus-anfitriona. Actualmente no hay terapias para infecciones causadas por alfavirus encefalíticos debido a una comprensión incompleta de su patogénesis molecular. El virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) es un alfavirus que es prevalente en las Américas y que es capaz de infectar caballos y humanos. Aquí utilizamos la secuenciación de ARN de próxima generación para identificar alteraciones diferenciales en los astrocitos infectados con VEEV. Nuestros resultados indicaron que la abundancia de transcripciones asociadas con el interferón y las vías de respuesta proteica desplegadas se alteraron después de la infección y demostraron que la respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1) contribuyó a la muerte celular inducida por VEEV. Texto: Venezuelan equina encefalitis virus (VE El VEEV es un virus de ARN de cadena positiva que es transmitido por mosquitos y que está naturalmente presente en depósitos de roedores (1). Hay seis subtipos que se clasifican por su rango geográfico y patología en equinos y humanos. Las dos cepas epizoóticas, IA/B y IC, surgieron de mutaciones entre las cepas enzoóticas (2). Las cepas IA/B y IC son de especial preocupación debido al aumento de las tasas de morbilidad y mortalidad y los riesgos asociados con la amplificación viral y el posible derrame de especies (2). En los seres humanos, el VEEV causa una enfermedad febril tipificada por fiebre, malestar y vómitos. En algunos casos, la infección progresa hacia el sistema nervioso central (SNC) y síntomas neurológicos, como confusión, ataxia y convulsiones, se manifiestan. La tasa de mortalidad entre los casos con síntomas neurológicos puede ser de hasta 35% en niños y 10% en adultos, con déficits neurológicos a largo plazo a menudo vistos en sobrevivientes (2). En 1995, un brote de VEEV en Colombia y Venezuela dio lugar a más de 100.000 casos humanos (3). Además de brotes naturales, el VEEV también es una preocupación desde una perspectiva bioterrorista, ya que puede crecer a altos títulos, requiere una dosis infecciosa baja, y contiene múltiples serotipos. Tanto la ex Unión Soviética como los Estados Unidos anteriormente armaron el virus, produciendo grandes cantidades para sus programas de armas biológicas ofensivas ya desactivadas (4). Actualmente, la cepa vacuna TC83 se utiliza en caballos y para personal de alto riesgo; sin embargo, debido a la baja tasa de seroconversión lograda con esta vacuna (5) y su dependencia de dos mutaciones atenuantes únicas (6), se considera no a Hasta la fecha no existen tratamientos aprobados por la FDA para la infección por VEEV, y se requieren estudios adicionales para aclarar los mecanismos asociados con la patogénesis subyacente del VEEV. Los estudios transcriptómicos virales y de huésped pueden proporcionar una gran cantidad de información sobre los mecanismos patógenos subyacentes y las interacciones posteriores al curso de una infección. El uso de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de virus previamente no característicos y el establecimiento de numerosos sistemas experimentales nuevos que redefinieron las interacciones virus-anfitriones. Hasta la fecha, varios estudios han examinado las alteraciones en el transcriptoma del huésped después de la infección por VEEV. Un análisis comparativo de microarray entre células infectadas persistentemente con VEEV y células capaces de limpiar VEEV resultó en la identificación de PARP12L como factor antiviral (8). Una comparación molecular utilizando microarrays de respuestas basadas en el huésped a la cepa TC83 fue capaz de identificar biomarcadores diferenciando entre los grupos que responden a la vacuna y los que no responden a la vacuna, así como la implicación de interferón (IFN), vías inducidas por interferón, receptores similares a los de Toll (TLR) y vías relacionadas con la interleucina 12 (IL-12) (9). Un estudio que examinó el papel de la adhesión y los factores inflamatorios en ratones CD-1 infectados por VEEV encontró modulación viral de la expresión de la matriz extracelular y genes de adhesión, como las integrinas (Itgáxis, Itg2, 3 y 7), las cadherinas 1 y 2, la molécula de adhesión de células vasculares 1, y la molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1), en los cerebros de ratones infectados por VEEV (10). Un estudio de Sharma et al. utilizaron microarrays para analizar los cambios en la expresión génica en el tejido cerebral de ratones infectados por VVEV durante el curso de una infección, descubriendo numerosas vías inmunes involucradas en la presentación de antígenos, inflamación, apoptosis y la respuesta antiviral tradicional (Cxcl10, CxCl11, Ccl5, Ifr7, Ifi27, Oas1b, Fcerg1, Mif, clusterin, e importante complejo de histocompatibilidad [MHC] clase II) (11). Un segundo estudio del mismo grupo identificó la regulación de los microRNAs (miRNAs) en los cerebros de ratones infectados por VVEV, lo que permitió la correlación de los cambios de miRNA con los datos de expresión de mRNA anteriores (11, 12). Estos análisis sugieren que el VEEV puede estar utilizando miRNAs celulares para regular el ARNm aguas abajo, lo que puede corresponder con los cambios histológicos inducidos por el VEEV en el sistema nervioso (11, 12). En el estudio actual, la secuenciación del ARNm de la próxima generación (ARN-Seq) se utilizó para identificar alteraciones clínicamente relevantes en el transcriptoma del ARNm de los astrocitos humanos infectados con la cepa de tipo salvaje (WT) VEEV Trinidad burro (TrD). El análisis de mRNAs huésped por ARN-Seq proporciona una visión novedosa de cómo un huésped responde a una infección viral a través de la identificación de un amplio y dinámico rango de transcripciones de una manera imparcial. Secuencia selectiva de mRNAs, específicamente, poliadenylated [poli(A)] transcripciones, que representan el 1% de Como el VEEV ha demostrado infectar productivamente a los astrocitos tanto in vitro como in vivo (14, 15), elegimos los astrocitos como nuestro modelo de interés. Los astrocitos son las células más abundantes del cerebro, superando a las neuronas por al menos 5 veces (16), proporcionando un recurso abundante para la replicación viral dentro del cerebro. Además de su bien descrito papel estructural en el tejido neuronal, los trocitos desempeñan papeles críticos en otros procesos, incluyendo la regulación del flujo sanguíneo y de la barrera hematoencefálica, la transmisión sinapsis y la respuesta a la infección (16). Se ha demostrado que los astrocitos infectados por el VEEV producen citocinas múltiples, incluyendo IL-8, IL-17, interferón gamma (IFN- +), y proteína 10 inducida por interferón gamma, todas las cuales se encontraron asociadas con atenuación viral (14). Con el fin de obtener una visión dinámica del interactoma virus-anfitrión, se utilizó el ARN-Seq para monitorear los cambios en la expresión génica en los astrocitos infectados por VEEV TrD a las 4, 8 y 16 h de postinfección (hpi). Al observar las alteraciones en múltiples momentos tempranos utilizando réplicas biológicas triplicadas, se genera un rango robusto y dinámico de información, y esta información proporciona un aumento tanto en la potencia como en la exactitud de la detección de transcripciones expresadas diferencialmente en un modelo clínico altamente relevante (17). Entre las células infectadas por VEEV, se observó un aumento en los genes regulados por interferón, incluyendo IFIT1, IFIT2, IFIT3 y OASL. También se observó el aumento en la expresión de genes involucrados en la vía de respuesta proteica inducida por estrés (UPR). Curiosamente, la infección por VEEV resultó en un La identificación de ARNm del huésped cuya expresión se altera después de la replicación del VEEV, específicamente, EGR1 y sus interactores arriba y abajo, puede proporcionar nuevos objetivos terapéuticos basados en el huésped críticos para la replicación del VEEV y una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes que sustentan la replicación del alfavirus. Infecciones virales y ensayos de placa. Se obtuvo TrD del VEEV de Recursos del BEI. Todos los experimentos con VEEV TrD se realizaron bajo condiciones de bioseguridad nivel 3 (BSL-3). Todo trabajo que involucra a agentes selectos está registrado en los Centros de Control y Prevención de Enfermedades y se llevó a cabo en el Laboratorio de Investigación Biomédica de la Universidad George Mason, que está registrado de acuerdo con las regulaciones federales de agentes selectos. Las células fueron infectadas durante 1 h a 37 °C y rotaron cada 15 minutos para asegurar una cobertura adecuada. Las células fueron lavadas con solución salina fosfatada (PBS), y se añadió un medio de crecimiento completo a las células. Se recolectaron sobrenadantes virales y células en varias ocasiones para su posterior análisis. Los ensayos de placa se realizaron como se describió anteriormente (18). Aislamiento de mRNA y preparación de biblioteca poli(A). El ARN de células U87MG fue purificado tanto de TrD VEEV infectado (nivel de bioseguridad 3) como de células U87MG simuladas a 4, 8 y 16 hpi utilizando un kit de aislamiento de mirVana (Tecnologías de Vida). El control de calidad del ARN purificado se realizó a partir de un bioanalizador Agilent 2100, y se utilizó un corte de integridad de ARN número de 8 A continuación, se añadió una mezcla de control de pico de ARN ARN ARN External Controls Consortium (ERCC) a las entradas totales de ARN (10 g de ARN) antes de la selección de poli(A) utilizando un kit de Dynabeads de Life Technologies mRNA Direct. La preparación de una biblioteca de ARN de transcriptoma completo de ARNm purificado se llevó a cabo utilizando un kit de Ion Total ARN-Seq (v2; Life Technologies). El control de calidad de las bibliotecas de cDNA se llevó a cabo utilizando el bioanalizador Agilent 2100 junto con pruebas de esterilidad para la eliminación de bibliotecas para la secuenciación de un laboratorio BSL-3 a BSL-2. Secuenciación de ARN. La preparación de plantillas de biblioteca se realizó en una plataforma One Touch 2 (Life Technologies). La secuenciación de A Un total de 119 millones de lecturas de secuenciación y un promedio de 6,6 millones de lecturas por muestra fueron utilizados como entrada en nuestra tubería de análisis. A menos que se indique lo contrario, el análisis de ARN-Seq aguas abajo se llevó a cabo utilizando la biogenómica CLC Workbench (v7). Las lecturas de ARN-Seq en bruto fueron recortadas para eliminar cualquier fragmento de adaptador de secuenciación residual que permaneciera en los 5= o 3= extremos después de la secuenciación. Además, el recorte final de las lecturas se realizó utilizando el algoritmo Mott modificado con una puntuación de calidad Q20, y cualquier lectura de menos de 15 pb fue descartada. Tras el recorte de lectura, las lecturas fueron cartografiadas al genoma humano hg19 con los siguientes parámetros ARN-Seq: un límite de 10 hits para múltiples posiciones cartográficas, una fracción de similitud de 0,8, una fracción El nivel de expresión de genes y transcripciones individuales se calculó utilizando el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas cartográficas (RPKM) del método Mortazavi et al. (19). Además, las lecturas no cartográficas también fueron cartografiadas al conjunto de secuencias de ARN sintética ERCC92 (20), así como al genoma de referencia VEEV (número de adhesión GenBank L01442). En todas las muestras, el coeficiente de correlación (R 2) entre el número de lecturas esperadas y el número de lecturas cartográficas para los controles de pico en ERCC92 fue superior a 0.90. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los resultados de secuenciación general. El filtrado postmapping de todos los datos de ARN-Seq se llevó a cabo junto a incluir sólo genes con al menos un mapa único leído (26.230 genes permanecieron El análisis de componentes principales del conjunto de datos filtrados resultante (13.906 genes en total) se realizó utilizando recuentos brutos de lecturas exclusivamente cartografiadas (ver Fig. 2A ). Los valores de expresión RPKM restantes para cada gen incluido en el conjunto de datos filtrados se sometieron a normalización cuantitativa con un corte del 5%. En la Fig. 2B se muestra un gráfico de caja de valores RPKM transformados para cada muestra antes de la normalización. El valor R 2 para la variación de muestra a muestra en pares dentro de cada conjunto de réplica biológica se observó un rango de 0,89 a 0,99, lo que indica que nuestras réplicas biológicas fueron consistentes y no mostraron un sesgo fuerte (datos no mostrados). En primer lugar, el análisis empírico del algoritmo de expresión génica diferencial, parte del paquete edgeR Bioconductor (21), se aplicó al conjunto integrado de datos de los 18 experimentos utilizando los parámetros por defecto y un falso valor P corregido por la tasa de descubrimiento. En cada momento se compararon muestras infectadas y simuladas, y los genes cuya expresión difería en más de 2 veces con una significación con un valor P de 0,05 se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial. Además del método descrito anteriormente, se aplicó una prueba estadística ortogonal de expresión diferencial a los datos utilizando una prueba estadística desarrollada por Baggerly et al. (22) para contar el número de etiquetas de secuencia expresadas asociadas con genes individuales, una característica común de ambos análisis en serie de datos de expresión génica (SAGE) y datos ARN-Seq. Cuando se compararon muestras infectadas y simuladas, los genes individuales se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial cuando su expresión difería por más de 2 veces con una significación con un valor de P de 0.05. Los genes expresados diferencialmente que se encontraban en la intersección de los conjuntos de genes identificados por ambos métodos descritos anteriormente se consideraron candidatos de alta calidad y se utilizaron como punto de partida para la investigación ulterior. La agrupación y la GSEA. Los datos de expresión normalizados y filtrados se sometieron a la agrupación de k-medias utilizando una métrica de distancia euclidiana donde los genes se agruparon por medio de valores de expresión génica normalizada (RPKM) para cada condición experimental. La agrupación se ajustó a 20 grupos de agrupamiento distintos, y los perfiles de expresión génica individuales agrupados se probaron para el enriquecimiento de términos de ontología génica (GO) asociados con genes individuales. En primer lugar, se realizó una prueba hipergeométrica de las anotaciones de GO mediante la implementación del paquete GOStats en cada uno de los conglomerados individuales obtenidos a partir de la agrupación k-media (24). Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en todo el conjunto de datos filtrados utilizando 100.000 permutaciones, mientras que se eliminaron duplicados y se aplicó un análisis de varianza. Un total de 1.419 categorías superaron un tamaño mínimo de característica de 10 y se utilizaron para la investigación ulterior. Las cohortes de genes con patrones de expresión compartidos a lo largo del tiempo se identificaron mediante la agrupación de k-medias; las que se encontraron enriquecidas para los DEG fueron posteriormente sometidas al análisis de vía mediante el sistema GeneMania (25). Utilizando un enfoque manual ad hoc, se identificaron vías relevantes y las conexiones entre ellas sobre la base de los datos existentes en Análisis de qRT-PCR. El ARNm purificado se convirtió en ADNc utilizando un kit de ARN-a-cDNA de alta capacidad (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de los números de copia viral se realizó mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR) como se describió previamente (26). La expresión anfitriona de los siguientes genes fue analizada con los ensayos de TaqMan (indicados entre paréntesis): activando el factor de transcripción 3 (ATF3; Hs00231069_m1), ATF4 (Hs00909569_g1), CEBPB (Hs00270923_s1), CEBPD (Hs00270931_s1), DDIT3 (Hs00358796_g1), FOS (Hs04194186_s1), JUN (Hs01103582_s1), EGR1 (Hs00152928_m1), IFI6 (Hs00242571_m1), IFIT1 (Hs01911452_s1), IFIT2 (Hs01922738_s1), IFIT3 (Hs01922738_s1) Los ensayos para el ARNr 18S (Hs99999901_s1 o Mm04277571_s1) se utilizaron para la normalización. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un instrumento ABI StepOne Plus. Tratamiento con PERKi y recolección para el análisis de Western blot. Las células U87MG fueron pretratadas durante 2 h con 10 M la proteína quinasa ARN similar al retículo endoplasmático (ER) cinasa (PERK) inhibidor (PERKi) GSK2606414 (número catalógico 516535; EMD Millipore) o dimetil sulfóxido (DMSO) en DMEM antes de la infección por VEEV TrD (MOI, 5). Después de 1 h, el inóculo viral fue eliminado y las células fueron lavadas con PBS estéril (1). El medio fue reemplazado A 16 hpi, el medio fue removido, y las células fueron lavadas con PBS y luego recolectadas para el análisis de Western blot. Derribado de EGR1 con siRNA. Células U87MG sembradas a 6,7 10 4 células por pozo en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 50 nM de preparación de lisato de proteína de siGenome y análisis de Western blot. Preparación de lisato de proteína y análisis de Western blot se realizaron como se describió previamente (27). Se utilizaron anticuerpos primarios frente a los siguientes anticuerpos: EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular), virus de la encefalitis equina policlonal TC83 (subtipo IA/B) proteína capsid (Recursos BEI), CHOP (anticuerpo L63F7; número de catálogo 2895; señalización celular), subunidad fosforilada de factor de iniciación eucariótica 2 (p-eIF2+; Ser51; anticuerpo D9G8; número de catálogo 3398; señalización celular), ATF4 (anticuerpo D4B8; número de catálogo 11815; señalización celular), caspasa activada 3 (antícuerpo Asp175; número de catálogo 9661; señalización celular), y peroxidasa-conjugada por caballos -actina (número de catálogo ab49900-100; Abcam). Análisis de inmunofluorescencia. Las células U87MG fueron cultivadas en tapas en una placa de 6 pozos, infectadas con VEEV TrD como se describe anteriormente, lavadas con PBS (sin Ca y Mg), y luego fijadas con formaldehído al 4%. Las células fueron permeabilizadas con Triton X-100 en PBS durante 20 min y luego lavadas dos veces con PBS. Las células fueron bloqueadas durante 10 min a temperatura ambiente en albúmina sérica bovina al 3% en PBS. Anticuerpos primarios consistentes en una proteína capsid VEEV (número catalógico NR-9403; Recursos BEI) diluido 1:600 y un anticuerpo EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular) diluido 1:400 fueron incubados en tampón fresco de bloqueo a 37°C durante 1 h y lavado A continuación se muestra una imagen representativa de cada muestra. Anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 568 (número catalógico A11057; Invitrogen) y anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 488 (número catalógico A21202; Invitrogen) diluidos 1:400 como anticuerpos secundarios y tratados de la misma manera que los anticuerpos primarios. DAPI (4=,6-di-amidino-2-fenilindol) diluido 1:1.000 para visualizar los núcleos. Se montaron las tapas sobre diapositivas de vidrio utilizando 10 l de medio de montaje Fluoromount G (número catalógico 0100-01; Southern Biotech). Se utilizó un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE2000-U para microscopía de fluorescencia. Las imágenes se vieron utilizando una lente de inmersión de aceite objetivo de 60. Todas las imágenes fueron sometidas a un promedio de cuatro líneas. Las imágenes fueron procesadas a través del software Nikon NIS-Elements AR Analysis (v3.2). CellTiter Glo y Caspasa 3/7 Glo ensayos. Los fibroblastos embrionarios del tipo salvaje y EGR1 / mouse (MEFs) fueron infectados con TrD en varios MOIs durante una hora y luego lavados con PBS, y el medio fue reemplazado. La viabilidad celular fue medida a las 24 h postinfección utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente Promega CellTiter (número catalógico G7571) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia fue leída mediante un detector de múltiples modos Beckman Coulter DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. De manera similar, la activación de caspasa en el tipo salvaje infectado y EGR1 / MEFs se midió a las 24 h postinfección utilizando un ensayo Promega Caspasa 3/7 Glo (catalog número G8090) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia se leyó utilizando el detector multimodo DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. Números de adhesión de secuencia de nucleótidos. Los datos de secuenciación en bruto para todas las carreras de ARN-Seq incluidas en este trabajo están disponibles públicamente en la base de datos NCBI BioProject bajo el número de adhesión PRJNA300864 (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA300864). Las líneas celulares comunes utilizadas para el estudio de la infección por VEEV incluyen células Vero y BHK; en este estudio, los astrocitos U87MG fueron elegidos como modelo in vitro debido a su relevancia fisiológica y mayor significación clínica; se realizaron experimentos iniciales para caracterizar la replicación viral en células U87MG; se midió la cinética de replicación de VEEV en células U87MG mediante ensayos en placa y mediante el monitoreo de los niveles de expresión de proteínas virales y ARN y el efecto citopático (ECP) en las células infectadas (Fig. 1); se observó una liberación viral tan temprana como 4 hpi, observándose 4 unidades log de virus, seguido de un aumento consistente de la replicación a 8 y 16 hpi (Fig. 1A). La replicación viral alcanzó su punto máximo a 16 hpi, y no se observó un aumento adicional de los La expresión vírica capsid siguió un patrón similar, siendo detectada proteína a 8 hpi y plastificación de expresión a 16 hpi (Fig. 1B). Entre las células U87MG infectadas, se observó una EPC significativa por microscopía a 24 hpi, con poca o ninguna EPC detectada a 16 hpi (datos no mostrados). De acuerdo con estas observaciones, se observó un aumento de la actividad de la caspasa 3/7 sólo a 24 hpi (Fig. 1C). Sobre la base de estos datos, los tiempos de 4, 8 y 16 hpi, reflejando las etapas tempranas, medias y tardías del ciclo de vida viral, respectivamente, fueron seleccionados para el análisis de ARN-Seq para proporcionar una visión dinámica del perfil del transcriptoma host-patógeno. Análisis de secuenciación de ARN de los astrocitos infectados por VEEV. Se aisló el ARNm de conjuntos triplicados de cultivos de células U87MG infectados con simulacros y VEEV, se purificó a 4, 8 y 16 hpi, y se utilizó para preparar bibliotecas de ARNc para ARN-Seq aguas abajo (ver Materiales y Métodos). En la Tabla 1 se muestra un resumen de alto nivel de los resultados de ARN-Seq. Las muestras de ARN VEEV fueron analizadas por RT-PCR cuantitativo en cada momento como un control para demostrar el aumento de la carga de ARN viral a lo largo del tiempo (Fig. 1D), consistente con el aumento del número de lecturas de ARN-Seq cartografiadas al genoma VEEV en puntos posteriores (Tabla 1). Para el análisis de ARN-Seq, los genes individuales se expresaron como el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón En la figura 2A se muestran los valores de expresión RPKM normalizados para cada muestra experimental y se pueden encontrar en el conjunto de datos S1 del material suplementario. La variación mínima de la muestra a la muestra en los valores de expresión dentro de las réplicas biológicas fue detectada constantemente (R 2 0,89 para todas las réplicas; datos no mostrados). Además, también se encontró que la variación de la intersample era mínima cuando se probó por pares a lo largo de todo el experimento utilizando los valores RPKM para los ARN de control de pico sintético ERCC97 (R 2 0,90 para todas las comparaciones; datos no mostrados). Como era de esperar, el análisis de dos componentes principales de los datos ARN-Seq para las células infectadas por simulacro de células frente a las infectadas por VEEV mostró una separación clara de las muestras a 16 hpi de las muestras en puntos Sin embargo, el agrupamiento de muestras infectadas por VVEV con muestras simuladas infectadas en puntos de tiempo anteriores sugiere que la respuesta a la infección viral se limitó a un estrecho subconjunto de genes de respuesta temprana, lo que supone una mayor carga de prueba en la identificación de genes expresados diferencialmente (DEGs) durante las primeras horas de infección. En este sentido, se utilizaron dos métodos ortogonales para identificar DEGs adecuados para una caracterización adicional: el método edgeR (21) y el método desarrollado por Baggerly et al. (22). Los genes identificados por un método se consideraron provisionalmente DEGs, y los identificados por ambos métodos eran DEGs candidatos a ser confirmados por qRT-PCR. Además de comparar los valores individuales de expresión génica para las células infectadas simuladamente y las células infectadas por VEEV en cada momento, también se compararon los valores de expresión génica en serie dentro de cada serie temporal de células infectadas por VEEV para los genes que no mostraron cambios estadísticamente significativos en la expresión en células infectadas simuladamente. Un esquema del análisis comparativo se muestra en la figura 2C. El número de DEGs estadísticamente significativos identificados por cada una de estas comparaciones se muestra en la figura 2D. Además, se utilizó el agrupamiento de k-medias (contra los valores normalizados de RPKM) para identificar cambios brutos en la expresión génica a lo largo del tiempo para cohortes de genes que potencialmente comparten la misma vía o desencadenantes reguladores (fig. 3 ; véase también Conjunto de datos S2 en el material suplementario). Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA; véase Material y Métodos En particular, el clúster 20 (tabla 2) se enriqueció significativamente para los genes involucrados en el control traslacional, la vía de señalización mediada por interferón tipo I y la vía de respuesta a proteínas desplegadas (valor P de GSEA 0,01). Aunque existe una conexión bien establecida entre el control traslacional y la EPU, una nueva conexión entre la EPU y la respuesta mediada por interferón tipo I en respuesta a la replicación viral fue sugerida por el análisis de la vía (ver Materiales y Métodos), implicando la respuesta al crecimiento temprano 1 (EGR1) como un puente potencial entre estas dos vías (Fig. 4). La EGR1 pertenece al clúster 20 y es fuertemente inducida durante la infección por VEEV, y varios otros genes asociados con la respuesta al interferón pertenecen al mismo clúster: IRF1, IFIT1, IFIT2, ISG15 e ILF3. EGR1 se ha asociado con aumentos en la expresión de activar el factor de transcripción 3 (ATF3) (28), que es un componente clave de la UPR y que también pertenece al clúster 20. Esta conexión representó un potencial a Anotaciones del proceso biológico obtenidas de Reactome para el clúster 20. Los identificadores de anotación del reactoma están indicados para cada anotación. Sólo se consideran anotaciones clasificadas por autor rastreable (TAS). TAP, transportador asociado con el procesamiento de antígenos; SRP, partícula de reconocimiento de señales. b Conjunto completo, el número total de genes en el genoma con un proceso biológico anotado; subconjunto, número total de genes expresados diferencialmente con un proceso biológico anotado. Red de genes relacionados con la respuesta del interferón tipo I y UPR. Círculos grandes, genes diferencialmente expresados; círculos pequeños, genes sin cambio significativo de expresión; círculos rojos, factores de respuesta tipo I al interferón; círculos amarillos, genes que regulan la transcripción del ADN; círculos azules, genes de respuesta a proteínas desplegadas; líneas rojas, genes involucrados en interacciones físicas proteína-proteína; líneas azules, genes involucrados en una vía común. Esta red fue sembrada con grupos k-medias 18 y 20, y muchos genes de proteína ribosómica fueron removidos. puente entre la vía UPR y la vía de respuesta al interferón, siendo EGR1 uno de los factores clave potenciales de transcripción que impulsan esta conexión. En consecuencia, se seleccionaron 15 genes de este análisis para su posterior caracterización por qRT-PCR (ver abajo): ATF3, activando el factor de transcripción 4 (ATF4), CEBPB, CEBPD, DDIT3/CHOP, EGR1, FOS, IFI6, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG15, ISG20, JUN y OASL. Los valores de expresión de estos genes, medidos por ARN-Seq, se muestran en la Fig. 5A y B. El análisis confirmatorio qRT-PCR indicó expresión génica concordante (fig. 5C y D). Los genes de respuesta al interferón inducidos están de acuerdo con los detectados en estudios previamente publicados (11, 29, 30) y estos genes sirvieron como control positivo interno. Además, se ha demostrado el vínculo entre la EGR1 y la vía del interferón; la EGR1 es inducida por IFN-® en fibroblastos de ratón y por IFN-®, -, y -® en fibroblastos humanos (31, 32). La EGR1 y la vía UPR fueron seleccionadas para su posterior análisis, ya que su papel en la infección por VEEV no ha sido elucidado. Los datos de análisis del ARN-Seq y la vía indicaron que los genes de respuesta al estrés y la UPR fueron inducidos después de la infección por VEEV. Durante una infección, las células anfitrionas responden al estrés celular resultante de una mayor traducción de proteínas virales y secreción al desencadenar el inicio de la vía de la UPR. La vía de la UPR es una respuesta celular adaptativa activada por el estrés del retículo endoplasmático (ER Con el fin de regular la homeostasis celular durante el plegado y la secreción de proteínas, la vía UPR ha desarrollado tres clases de sensores para asegurar la correcta regulación celular: la enzima inositolrequiriendo 1 (IRE1), la proteína cinasa ARN-como la ER cinasa (PERK), y activar el factor de transcripción 6 (ATF6) (33, 34). Durante la infección por VEEV, el brazo PERK de la UPR pareció estar alterado, ya que dos reguladores críticos de esta vía se expresaron diferencialmente: ATF4 y CHOP (DDIT3) (35). Para determinar si los DEGs alteraron la expresión proteica posterior, se realizó un análisis de manchas occidentales para CHOP, ATF4 y eIF2 fosforilado (p-eIF2). Tunicamicina, un inhibidor de la glucosilación Un análisis del curso del tiempo de las células U87MG tratadas con 1 M de tunicamicina indicó que 8 h de tratamiento proporcionaban la inducción más robusta de proteínas UPR (datos no mostrados). Las células VVEV infectadas pero no infectadas simuladamente o inactivadas por UV VVEV (UV-VEEV) mostraron un aumento espectacular en la expresión p-eIF2 + y un aumento modesto pero consistente en la expresión CHOP y ATF4 a 16 hpi (Fig. 6A). No se observó ningún cambio en la expresión proteica a 4 hpi (datos no mostrados). La microscopía confocal confirmó la regulación de CHOP y ATF4, demostrando un patrón de tinción más robusto y nuclear en las células infectadas por VVEV que en las células infectadas simuladas (Fig. 6C a E). Mientras que los niveles de expresión proteica Estos resultados son consistentes con la observación de que la expresión ATF4 está regulada a nivel traslacional en la inducción EPU (37). Como eIF2® puede ser fosforilada por múltiples cinasas (PERK, proteína cinasa ARN dependiente de doble cadena [PKR], control general no derrepresivo-2 [GCN2] e inhibidor hemeregulado [HRI]) (38), el inhibidor de PERK (PERKi) GSK2606414 fue utilizado para determinar si la fosforilación observada era dependiente de PERK. El tratamiento de las células infectadas por VEEV con PERKi dio lugar a una marcada disminución de la fosforilación eIF2® (Fig. 6B). Estos resultados indican que PERK contribuye a la fosforilación eIF2® pero que es probable que haya una quinasa adicional que contribuya al evento de fosforilación En conjunto, estos hallazgos indican que el brazo de PERK de la vía UPR se induce en puntos de tiempo posteriores a la infección por VVEV. EGR1 se regula en células infectadas y se localiza en el núcleo. EGR1 es un factor de transcripción que puede ser inducido por numerosas señales, incluyendo estrés oxidativo, hipoxemia y factores de crecimiento (39, 40). También se puede activar sobre la infección por virus de ADN y ARN, incluyendo virus Epstein-Barr, virus de hepatitis ratón, coronavirus murino y virus de encefalitis japonesa (41) (42) (43). El tratamiento de MEFs con el activador UPR thapsigargin se ha demostrado que induce la expresión EGR1 de una manera dependiente de PERK (44). Dado el vínculo entre EGR1 y UPR y la inducción robusta de EGR1 expresión mRNA después de la infección por VVE 4 y 5), se eligió EGR1 para un estudio posterior. La expresión proteica EGR1 después de la infección por VEEV fue analizada por el análisis de Western blot. Como estudios previos han indicado que EGR1 puede ser activado por el virus de la hepatitis del ratón independientemente de la replicación del virus (probablemente debido a la interrupción de la membrana celular después de la entrada) (41), se incluyó un control del virus inactivado por UV (VVVEV). Los niveles de proteína EGR1 se incrementaron después de la infección por VEEV en comparación con los niveles de células infecciosas simuladas y células infectadas por UV-VEEV (fig. 7A; compare los carriles 3, 6 y 9 ). La regulación más dramática de EGR1 se produjo a 16 hpi; esto se correlaciona con los niveles más altos de producción de VEEV capsid (fig. 1B Tras la inducción, se ha demostrado que la EGR1 se transloca al núcleo para inducir la expresión génica a través de la unión a la secuencia de unión de Egr (EBS) [GCG(G/T)GGCG] (40, 45). La microcopia confocal reveló altos niveles de EGR1 en los núcleos de células infectadas, mientras que sólo se detectaron bajos niveles de EGR1 tanto nucleares como citoplasmáticos en células simuladas (Fig. 7B). El tratamiento PERKi de células infectadas con VEEV resultó en una pérdida completa de inducción EGR1 (Fig. 7C), indicando que la EGR1 fue inducida de manera dependiente de PERK. Estos resultados demuestran que los niveles de proteína EGR1 y la localización nuclear se incrementan después de la infección por VEEV y que la inducción de EGR1 es dependiente La pérdida de EGR1 inhibe la apoptosis inducida por el VEEV pero no altera la cinética de la replicación del VEEV. Como EGR1 influye en la supervivencia celular y la apoptosis (46), se evaluó el impacto del EGR1 en la muerte celular inducida por el VEEV. Se observó escisión de Caspasa 3 en MEFs WT a 24 hpi cuando se infectaron con un MOI de 0,5 y comenzaron tan pronto como 16 hpi cuando se infectaron con un MOI de 5 (Fig. 8A ). En contraste, las células EGR1 / mostraron poco o ningún escisión de caspasa detectable tras la infección con el VEEV. Se realizaron dos conjuntos de experimentos para confirmar cuantitativamente estos resultados: ensayos de CellTiter Glo para medir la viabilidad celular total (producción de ATP) y Caspasa 3/7 Tanto WT como EGR1 / MEF mostraron disminuciones dosis-dependientes en la viabilidad celular después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que tenían células significativamente más viables en cada MOI examinadas (Fig. 8B). Concordantemente, se observó un aumento dosis-dependiente en la actividad de caspasa 3/7 después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que demostraban una actividad reducida de caspasa 3 en los MOIs de 0,5 y 5 (Fig. 8C). Estos resultados se replicaron en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1 (Fig. 8D). EGR1 ha demostrado regular negativamente la transcripción de BIRC5 (Survivina), un inhibidor de la apoptosis (IAP) miembro de la familia (47). Los datos de ARN-Seq indicaron que la expresión del gen BIRC5 disminuyó después de la infección por VVEV: log 2 -transformado de los valores de cambio del pliegue de la expresión génica normalizada fueron 1,16, 1,18, y 1,50 a 4, 8, y 16 hpi, respectivamente (ver Tabla S1 en el material suplementario y NBI BioProject número de adhesión PRJNA300864). Se utilizaron WT y EGR1 / MEFs para determinar si EGR1 influyó en la expresión del gen BIRC5 después de la infección por VVEV. La expresión BIRC5 disminuyó significativamente a 16 hpi en los MEFs infectados por VVEV, pero esta reducción no se observó en los MEFs infectados por VVEV1 / (Fig. 8E). La expresión del gen para el inhibidor de la apoptosis (XIAP), otro miembro de la familia IAP, no fue significativamente alterada después de la infección (datos no mostrados). Colectivamente, estos resultados demuestran que EGR1 contribuye a la apoptosis inducida por VEEV. Se determinó la cinética de replicación VEEV tanto para EGR1 / como para WT MEFs para determinar la relevancia de EGR1 en la replicación viral.Las células fueron infectadas en dos MOIs diferentes (0,5 y 5), y los sobrenadantes virales fueron recolectados en 4, 8, 16 y 24 hpi y analizados mediante análisis de placa.La cinética de replicación fue similar entre EGR1 / y WT MEFs en ambos MOIs, con títulos que alcanzaron un máximo de 16 hpi (fig. 9A). 9B). Estos resultados fueron replicados en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1. La transfección de siRNA dirigida a EGR1 resultó en una disminución del 90% en la expresión proteica EGR1 (Fig. 9D ) sin ningún efecto significativo en la replicación viral (Fig. 9C). Estos resultados sugieren que la disminución de la apoptosis observada en EGR1 / MEFs no se debió a la cinética de replicación VEEV alterada. A pesar de ser reconocida como una amenaza emergente, se sabe relativamente poco acerca de los mecanismos de virulencia de los alfavirus, en gran parte debido a una brecha de conocimiento en el interactoroma host-patógeno. La infección por VEEV a menudo resulta en encefalitis fatal y se sabe que inhibe tanto la transcripción celular como la traducción para En contraste, en el VVEE del SNC se ha demostrado que upregula numerosos genes tanto en la respuesta inflamatoria como en las vías apoptóticas (1, 48). Específicamente, numerosas citocinas proinflamatorias, incluyendo interleu-kin-1 (IL-1), IL-6, IL-12, glucógeno sintasa cinasa 3, oxido nítrico inducible sintasa, y factor de necrosis tumoral alfa (TNF- Con este fin, la identificación de transcripciones críticas expresadas de forma diferencial entre células infectadas clínicamente relevantes ayudará a una mayor comprensión de la patogénesis viral y puede resultar beneficiosa para la identificación de objetivos terapéuticos. En este estudio, los datos de análisis de red/ARN-Seq y los resultados de estudios de expresión proteica revelaron que la infección por VEEV resultó en la activación del brazo PERK de la vía EPU, incluyendo la activación de ATF4, CHOP y eIF2-fosforilación. Varios alfavirus han sido reportados previamente para secuestrar componentes clave de la vía EPU con el fin de promover la replicación viral, ya que la dependencia de virus envueltos en la ER para la síntesis de glucoproteínas virales asociadas a la envoltura y su transporte a la membrana plasmática a menudo enfatiza la ER debido a la rápida producción de proteínas virales (54, 55). La modulación de la UPR no es exclusiva de los alfavirus; más bien, es un rasgo compartido de muchos virus de ARN de sentido positivo. El virus del dengue ha demostrado suprimir PERK al inhibir la fosforilación continua de eIF2 para inhibir la apoptosis inmediata, aumentando la traducción de proteínas virales y ampliando la duración de la replicación viral productiva (34). Estudios con el virus de la hepatitis E (HEV) han demostrado que la expresión de la proteína capsid del HEV marco abierto de lectura 2 (ORF2) activa la expresión de CHOP y ATF4 (56). En el HEV, ORF2 se demostró estimular CHOP a través de estresadores de ER y elementos de respuesta aminoácidos (AARE) a través de la interacción con ATF4 (56). Los resultados mostrados aquí indican que durante la Durante la detección inicial del estrés ER, PERK es capaz de identificar proteínas mal plegadas en el lumen de la ER y fosforilatos eIF2® con el fin de iniciar las vías de prosurvival en la UPR a través de la actividad general En 24 hpi caspasa 3/7 se analizó la actividad utilizando el ensayo Caspasa 3/7 Glo. Los valores de cambio de pliegue para células simuladas se fijaron en un valor de 1. **, P 0.001. (E) EGR1 / y WT MEFs fueron simulados o VEEV infectados (MOI, 5). El ARN fue preparado, y la expresión genética fue determinada por qRT-PCR utilizando un ensayo TaqMan para BIRC5 (Survivin). Los datos mostrados son los valores del cambio de pliegue de la expresión génica normalizada determinado por el ciclo del umbral T *, P 0,005 (comparación de las células WT infectadas por VEEV y EGR1 /). Inhibición de la síntesis proteica (33, 34). VEEV parece inducir la UPR y promover el aumento de la fosforilación eIF2, que resulta en la inhibición traslacional de la mayoría de los ARNm, mientras que UPR aumenta selectivamente la traducción de ATF4. ATF4 es responsable de la expresión de genes que codifican proteínas involucradas en apoptosis, procesos redox, metabolismo de aminoácidos y reclutamiento de chaperona ER y es un conocido mediador de la vía PERK y CHOP (33, 34). La activación CHOP facilita la expresión aumentada de chaperonas celulares para contrarrestar la acumulación de proteínas mal dobladas (57). La falta de supresión del plegado de proteínas en células persistentemente estresadas, como durante una infección viral, puede resultar en la activación del factor de transcripción proapoptótico CHOP, lo que conduce a la supresión del linfoma de células antiapoptóticas de proteína B-2 (Bcl-2). CHOP también puede funcionar como factor de transcripción prosurvival al desfosforilar eIF2® a través de la activación de la proteína DNA dañado-inducible (GADD34) en un aspecto de retroalimentación autorreguladora (33, 34). Sin embargo, los datos presentados aquí apoyan un modelo por el cual la infección VEEV lleva a CHOP a funcionar en su papel proapoptótico, ya que no se detectó ningún cambio en la expresión génica de GADD34 por el análisis de ARN-Seq. Si bien la UPR fue inducida después de la infección VEEV, Esto es algo sorprendente, ya que se espera que la infección por VVEV induzca un estrés ER significativo debido a la producción masiva de proteínas virales durante el curso de una infección aguda robusta. Las proteínas estructurales del VVEV se traducen del ARN subgenómico viral en poliproteínas en la ER áspera. Las glucoproteínas precur-sor E1 y pE2 se ensamblan como heterodímeros en la ER, experimentando cambios conformacionales que requieren numerosas chaperonas (1, 58). Es posible que el VVEV haya desarrollado mecanismos para subvertir la inducción de la UPR. Para contrarrestar la UPR, las proteínas no estructurales (nsPs) del virus Chikungunya (CHIKV) han demostrado inhibir la expresión de ATF4 y otros genes objetivo conocidos de la UPR, incluyendo GRP78/BiP, GRP94 A través de la actividad nsP, CHIKV ha desarrollado un medio de suprimir la actividad UPR resultante del estrés ER inducido por la glucoproteína viral, evitando así la autofagia inmediata y la activación apoptótica. El capsid VEEV es responsable de interferir con el tráfico nucleocitoplasmático e inhibir la transcripción del ARNr y del ARNm y ha sido implicado en la regulación de la señal de tipo I IFN y la respuesta antiviral mediante la regulación de la producción de ARN viral y proteínas (1, 48, 60). Por lo tanto, hipotetizamos que la capacidad del capsid VEEV para inhibir la transcripción celular y el tráfico de bloqueo nucleocitoplasmático resulta en la inducción retarda de la UPR. Los resultados de un análisis detallado de la red basado en los datos existentes en la literatura, junto con los perfiles de expresión génica temporal obtenidos de este estudio, apuntan a que el EGR1 es un nodo importante en el nuevo vínculo entre la activación del VEEV de la respuesta de interferón tipo I y la UPR. Se sabe que el EGR1 forma un complejo de unión al ADN con C/EBPB, socio crítico de la dimerización de CHOP (61). Estudios anteriores han demostrado que la localización nuclear del CHOP puede actuar como inductor del EGR1 y que el CHOP puede actuar como cofactor transcripcional para la regulación de los genes objetivo del C/EBPB-EGR1 (61). Los resultados del análisis de la mancha occidental y la microscopía presentados en este estudio apoyan este modelo, ya que se encontró que la infección por VEV aumenta tanto los niveles generales como la distribución nuclear Los estudios anteriores demostraron la inducción de ARNm EGR1 por IFN-â en fibroblastos de ratón y por TNF-â, TNF-, IL-1, IFN-â, IFN-â e IFN-â en fibroblastos humanos (31, 32). EGR1, también conocido como Zif268 y NGF1-A, es una proteína de dedo de zinc y factor de transcripción mamífero. Ha sido implicada en la proliferación y diferenciación celular, pero también puede tener funciones proapoptóticas, dependiendo del tipo celular y estímulo (62). De particular interés, EGR1 controla directamente la proliferación cuando se activa por la proteína activada por mitogen quinasa/vía cinasa regulada por señal extracelular en astrocitos estimulados por mitogen (63). Se han observado cambios inducidos por virus en la expresión EGR1 en En los astrocitos infectados por VIH-1, se encontró que la regulación de la EGR1 fue inducida por Tat a través de la transactivación del promotor de la EGR1, lo que llevó a la disfunción celular y a la neurotoxicidad inducida por Tat (64). También se ha demostrado que el aumento de las cantidades de ARNm EGR1 actúa de una manera específica de la región, correspondiendo temporalmente con la producción de ARN viral en los tejidos cerebrales de ratas infectadas por el virus de la rabia o el virus de la enfermedad de Borna (65). En resumen, el estudio actual demuestra un vínculo potencial entre la activación de la EPU y la EGR1. Hasta la fecha, los mecanismos subyacentes a la patogénesis del VEEV y la degeneración neuronal subsiguiente han sido sólo parcialmente elucidados, por lo que determinar el papel de la EGR1 y la UPR puede jugar un papel significativo en el desarrollo de una nueva diana terapéutica que resulte en una disminución de la muerte neuronal y las secuelas neuronales posteriores que resultan de la infección.

¿Cuál es la tasa de mortalidad del virus de la encefalitis equina venezolana en adultos?

El virus venezolano de la encefalitis equina induce la apotosis a través de la activación de la respuesta de proteínas no plegadas de EGR1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4794670/SHA: f4aa788ab898b28b00ee103e4d4ab24a2c684cafAutores: Baer, Alan; Lundberg, Lindsay; Swales, Danielle; Waybright, Nicole; Pinkham, Chelsea; Dinman, Jonathan D.; Jacobs, Jonathan L.; Kehn-Hall, KyleneFecha: 2016-03-11DOI: 10.1128/jvi.0282-15Licencia: cc-byAbstract: El virus venezolano de la encefalitis equina (VEEV) es El aumento de la circulación y diseminación en las Américas de VVEV y otros arbovirus encefalíticos, como el virus de la encefalitis equina oriental y el virus del Nilo Occidental, subrayan la necesidad de investigar la patogénesis de la encefalomielitis viral para el desarrollo de nuevas contramedidas médicas. La dinámica hospedante-patógena de las células de astrocitoma humano U87MG infectadas con asnos VVEV Trinidad se determinó mediante la secuenciación de ARN (ARN-Seq) de poli(A) y mRNAs. Para identificar las alteraciones críticas que tienen lugar en el transcriptoma del huésped tras la infección por VVEV, se recolectaron muestras a 4, 8 y 16 h de postinfección y se adquirieron datos de ARN-Seq utilizando una plataforma PGM Ion Torrent. Se observó una expresión diferencial de respuesta al interferón, factores de respuesta al estrés La proteína cinasa ARN similar a la proteína endoplasmática retículo cinasa (PERK) brazo de la UPR fue activado, ya que la expresión de activando el factor de transcripción 4 (ATF4) y CHOP (DDIT3), reguladores críticos de la vía, fue alterada después de la infección. La expresión del factor de transcripción respuesta temprana al crecimiento 1 (EGR1) fue inducida de una manera dependiente de PERK. EGR1(−/−) fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) demostró menor susceptibilidad a la muerte celular inducida por VEEV que los MEFs de tipo salvaje isogénico, lo que indica que EGR1 modula las vías proapoptóticas después de la infección VEEV. La influencia de EGR1 es de gran importancia, ya que el daño neuronal puede conducir a secuelas a largo plazo en En casos graves, la propagación viral se dirige al tejido neuronal, resultando en una inflamación significativa y potencialmente mortal dependiente de una combinación de interacciones virus-anfitriona. Actualmente no hay terapias para infecciones causadas por alfavirus encefalíticos debido a una comprensión incompleta de su patogénesis molecular. El virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) es un alfavirus que es prevalente en las Américas y que es capaz de infectar caballos y humanos. Aquí utilizamos la secuenciación de ARN de próxima generación para identificar alteraciones diferenciales en los astrocitos infectados con VEEV. Nuestros resultados indicaron que la abundancia de transcripciones asociadas con el interferón y las vías de respuesta proteica desplegadas se alteraron después de la infección y demostraron que la respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1) contribuyó a la muerte celular inducida por VEEV. Texto: Venezuelan equina encefalitis virus (VE El VEEV es un virus de ARN de cadena positiva que es transmitido por mosquitos y que está naturalmente presente en depósitos de roedores (1). Hay seis subtipos que se clasifican por su rango geográfico y patología en equinos y humanos. Las dos cepas epizoóticas, IA/B y IC, surgieron de mutaciones entre las cepas enzoóticas (2). Las cepas IA/B y IC son de especial preocupación debido al aumento de las tasas de morbilidad y mortalidad y los riesgos asociados con la amplificación viral y el posible derrame de especies (2). En los seres humanos, el VEEV causa una enfermedad febril tipificada por fiebre, malestar y vómitos. En algunos casos, la infección progresa hacia el sistema nervioso central (SNC) y síntomas neurológicos, como confusión, ataxia y convulsiones, se manifiestan. La tasa de mortalidad entre los casos con síntomas neurológicos puede ser de hasta 35% en niños y 10% en adultos, con déficits neurológicos a largo plazo a menudo vistos en sobrevivientes (2). En 1995, un brote de VEEV en Colombia y Venezuela dio lugar a más de 100.000 casos humanos (3). Además de brotes naturales, el VEEV también es una preocupación desde una perspectiva bioterrorista, ya que puede crecer a altos títulos, requiere una dosis infecciosa baja, y contiene múltiples serotipos. Tanto la ex Unión Soviética como los Estados Unidos anteriormente armaron el virus, produciendo grandes cantidades para sus programas de armas biológicas ofensivas ya desactivadas (4). Actualmente, la cepa vacuna TC83 se utiliza en caballos y para personal de alto riesgo; sin embargo, debido a la baja tasa de seroconversión lograda con esta vacuna (5) y su dependencia de dos mutaciones atenuantes únicas (6), se considera no a Hasta la fecha no existen tratamientos aprobados por la FDA para la infección por VEEV, y se requieren estudios adicionales para aclarar los mecanismos asociados con la patogénesis subyacente del VEEV. Los estudios transcriptómicos virales y de huésped pueden proporcionar una gran cantidad de información sobre los mecanismos patógenos subyacentes y las interacciones posteriores al curso de una infección. El uso de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de virus previamente no característicos y el establecimiento de numerosos sistemas experimentales nuevos que redefinieron las interacciones virus-anfitriones. Hasta la fecha, varios estudios han examinado las alteraciones en el transcriptoma del huésped después de la infección por VEEV. Un análisis comparativo de microarray entre células infectadas persistentemente con VEEV y células capaces de limpiar VEEV resultó en la identificación de PARP12L como factor antiviral (8). Una comparación molecular utilizando microarrays de respuestas basadas en el huésped a la cepa TC83 fue capaz de identificar biomarcadores diferenciando entre los grupos que responden a la vacuna y los que no responden a la vacuna, así como la implicación de interferón (IFN), vías inducidas por interferón, receptores similares a los de Toll (TLR) y vías relacionadas con la interleucina 12 (IL-12) (9). Un estudio que examinó el papel de la adhesión y los factores inflamatorios en ratones CD-1 infectados por VEEV encontró modulación viral de la expresión de la matriz extracelular y genes de adhesión, como las integrinas (Itgáxis, Itg2, 3 y 7), las cadherinas 1 y 2, la molécula de adhesión de células vasculares 1, y la molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1), en los cerebros de ratones infectados por VEEV (10). Un estudio de Sharma et al. utilizaron microarrays para analizar los cambios en la expresión génica en el tejido cerebral de ratones infectados por VVEV durante el curso de una infección, descubriendo numerosas vías inmunes involucradas en la presentación de antígenos, inflamación, apoptosis y la respuesta antiviral tradicional (Cxcl10, CxCl11, Ccl5, Ifr7, Ifi27, Oas1b, Fcerg1, Mif, clusterin, e importante complejo de histocompatibilidad [MHC] clase II) (11). Un segundo estudio del mismo grupo identificó la regulación de los microRNAs (miRNAs) en los cerebros de ratones infectados por VVEV, lo que permitió la correlación de los cambios de miRNA con los datos de expresión de mRNA anteriores (11, 12). Estos análisis sugieren que el VEEV puede estar utilizando miRNAs celulares para regular el ARNm aguas abajo, lo que puede corresponder con los cambios histológicos inducidos por el VEEV en el sistema nervioso (11, 12). En el estudio actual, la secuenciación del ARNm de la próxima generación (ARN-Seq) se utilizó para identificar alteraciones clínicamente relevantes en el transcriptoma del ARNm de los astrocitos humanos infectados con la cepa de tipo salvaje (WT) VEEV Trinidad burro (TrD). El análisis de mRNAs huésped por ARN-Seq proporciona una visión novedosa de cómo un huésped responde a una infección viral a través de la identificación de un amplio y dinámico rango de transcripciones de una manera imparcial. Secuencia selectiva de mRNAs, específicamente, poliadenylated [poli(A)] transcripciones, que representan el 1% de Como el VEEV ha demostrado infectar productivamente a los astrocitos tanto in vitro como in vivo (14, 15), elegimos los astrocitos como nuestro modelo de interés. Los astrocitos son las células más abundantes del cerebro, superando a las neuronas por al menos 5 veces (16), proporcionando un recurso abundante para la replicación viral dentro del cerebro. Además de su bien descrito papel estructural en el tejido neuronal, los trocitos desempeñan papeles críticos en otros procesos, incluyendo la regulación del flujo sanguíneo y de la barrera hematoencefálica, la transmisión sinapsis y la respuesta a la infección (16). Se ha demostrado que los astrocitos infectados por el VEEV producen citocinas múltiples, incluyendo IL-8, IL-17, interferón gamma (IFN- +), y proteína 10 inducida por interferón gamma, todas las cuales se encontraron asociadas con atenuación viral (14). Con el fin de obtener una visión dinámica del interactoma virus-anfitrión, se utilizó el ARN-Seq para monitorear los cambios en la expresión génica en los astrocitos infectados por VEEV TrD a las 4, 8 y 16 h de postinfección (hpi). Al observar las alteraciones en múltiples momentos tempranos utilizando réplicas biológicas triplicadas, se genera un rango robusto y dinámico de información, y esta información proporciona un aumento tanto en la potencia como en la exactitud de la detección de transcripciones expresadas diferencialmente en un modelo clínico altamente relevante (17). Entre las células infectadas por VEEV, se observó un aumento en los genes regulados por interferón, incluyendo IFIT1, IFIT2, IFIT3 y OASL. También se observó el aumento en la expresión de genes involucrados en la vía de respuesta proteica inducida por estrés (UPR). Curiosamente, la infección por VEEV resultó en un La identificación de ARNm del huésped cuya expresión se altera después de la replicación del VEEV, específicamente, EGR1 y sus interactores arriba y abajo, puede proporcionar nuevos objetivos terapéuticos basados en el huésped críticos para la replicación del VEEV y una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes que sustentan la replicación del alfavirus. Infecciones virales y ensayos de placa. Se obtuvo TrD del VEEV de Recursos del BEI. Todos los experimentos con VEEV TrD se realizaron bajo condiciones de bioseguridad nivel 3 (BSL-3). Todo trabajo que involucra a agentes selectos está registrado en los Centros de Control y Prevención de Enfermedades y se llevó a cabo en el Laboratorio de Investigación Biomédica de la Universidad George Mason, que está registrado de acuerdo con las regulaciones federales de agentes selectos. Las células fueron infectadas durante 1 h a 37 °C y rotaron cada 15 minutos para asegurar una cobertura adecuada. Las células fueron lavadas con solución salina fosfatada (PBS), y se añadió un medio de crecimiento completo a las células. Se recolectaron sobrenadantes virales y células en varias ocasiones para su posterior análisis. Los ensayos de placa se realizaron como se describió anteriormente (18). Aislamiento de mRNA y preparación de biblioteca poli(A). El ARN de células U87MG fue purificado tanto de TrD VEEV infectado (nivel de bioseguridad 3) como de células U87MG simuladas a 4, 8 y 16 hpi utilizando un kit de aislamiento de mirVana (Tecnologías de Vida). El control de calidad del ARN purificado se realizó a partir de un bioanalizador Agilent 2100, y se utilizó un corte de integridad de ARN número de 8 A continuación, se añadió una mezcla de control de pico de ARN ARN ARN External Controls Consortium (ERCC) a las entradas totales de ARN (10 g de ARN) antes de la selección de poli(A) utilizando un kit de Dynabeads de Life Technologies mRNA Direct. La preparación de una biblioteca de ARN de transcriptoma completo de ARNm purificado se llevó a cabo utilizando un kit de Ion Total ARN-Seq (v2; Life Technologies). El control de calidad de las bibliotecas de cDNA se llevó a cabo utilizando el bioanalizador Agilent 2100 junto con pruebas de esterilidad para la eliminación de bibliotecas para la secuenciación de un laboratorio BSL-3 a BSL-2. Secuenciación de ARN. La preparación de plantillas de biblioteca se realizó en una plataforma One Touch 2 (Life Technologies). La secuenciación de A Un total de 119 millones de lecturas de secuenciación y un promedio de 6,6 millones de lecturas por muestra fueron utilizados como entrada en nuestra tubería de análisis. A menos que se indique lo contrario, el análisis de ARN-Seq aguas abajo se llevó a cabo utilizando la biogenómica CLC Workbench (v7). Las lecturas de ARN-Seq en bruto fueron recortadas para eliminar cualquier fragmento de adaptador de secuenciación residual que permaneciera en los 5= o 3= extremos después de la secuenciación. Además, el recorte final de las lecturas se realizó utilizando el algoritmo Mott modificado con una puntuación de calidad Q20, y cualquier lectura de menos de 15 pb fue descartada. Tras el recorte de lectura, las lecturas fueron cartografiadas al genoma humano hg19 con los siguientes parámetros ARN-Seq: un límite de 10 hits para múltiples posiciones cartográficas, una fracción de similitud de 0,8, una fracción El nivel de expresión de genes y transcripciones individuales se calculó utilizando el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas cartográficas (RPKM) del método Mortazavi et al. (19). Además, las lecturas no cartográficas también fueron cartografiadas al conjunto de secuencias de ARN sintética ERCC92 (20), así como al genoma de referencia VEEV (número de adhesión GenBank L01442). En todas las muestras, el coeficiente de correlación (R 2) entre el número de lecturas esperadas y el número de lecturas cartográficas para los controles de pico en ERCC92 fue superior a 0.90. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los resultados de secuenciación general. El filtrado postmapping de todos los datos de ARN-Seq se llevó a cabo junto a incluir sólo genes con al menos un mapa único leído (26.230 genes permanecieron El análisis de componentes principales del conjunto de datos filtrados resultante (13.906 genes en total) se realizó utilizando recuentos brutos de lecturas exclusivamente cartografiadas (ver Fig. 2A ). Los valores de expresión RPKM restantes para cada gen incluido en el conjunto de datos filtrados se sometieron a normalización cuantitativa con un corte del 5%. En la Fig. 2B se muestra un gráfico de caja de valores RPKM transformados para cada muestra antes de la normalización. El valor R 2 para la variación de muestra a muestra en pares dentro de cada conjunto de réplica biológica se observó un rango de 0,89 a 0,99, lo que indica que nuestras réplicas biológicas fueron consistentes y no mostraron un sesgo fuerte (datos no mostrados). En primer lugar, el análisis empírico del algoritmo de expresión génica diferencial, parte del paquete edgeR Bioconductor (21), se aplicó al conjunto integrado de datos de los 18 experimentos utilizando los parámetros por defecto y un falso valor P corregido por la tasa de descubrimiento. En cada momento se compararon muestras infectadas y simuladas, y los genes cuya expresión difería en más de 2 veces con una significación con un valor P de 0,05 se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial. Además del método descrito anteriormente, se aplicó una prueba estadística ortogonal de expresión diferencial a los datos utilizando una prueba estadística desarrollada por Baggerly et al. (22) para contar el número de etiquetas de secuencia expresadas asociadas con genes individuales, una característica común de ambos análisis en serie de datos de expresión génica (SAGE) y datos ARN-Seq. Cuando se compararon muestras infectadas y simuladas, los genes individuales se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial cuando su expresión difería por más de 2 veces con una significación con un valor de P de 0.05. Los genes expresados diferencialmente que se encontraban en la intersección de los conjuntos de genes identificados por ambos métodos descritos anteriormente se consideraron candidatos de alta calidad y se utilizaron como punto de partida para la investigación ulterior. La agrupación y la GSEA. Los datos de expresión normalizados y filtrados se sometieron a la agrupación de k-medias utilizando una métrica de distancia euclidiana donde los genes se agruparon por medio de valores de expresión génica normalizada (RPKM) para cada condición experimental. La agrupación se ajustó a 20 grupos de agrupamiento distintos, y los perfiles de expresión génica individuales agrupados se probaron para el enriquecimiento de términos de ontología génica (GO) asociados con genes individuales. En primer lugar, se realizó una prueba hipergeométrica de las anotaciones de GO mediante la implementación del paquete GOStats en cada uno de los conglomerados individuales obtenidos a partir de la agrupación k-media (24). Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en todo el conjunto de datos filtrados utilizando 100.000 permutaciones, mientras que se eliminaron duplicados y se aplicó un análisis de varianza. Un total de 1.419 categorías superaron un tamaño mínimo de característica de 10 y se utilizaron para la investigación ulterior. Las cohortes de genes con patrones de expresión compartidos a lo largo del tiempo se identificaron mediante la agrupación de k-medias; las que se encontraron enriquecidas para los DEG fueron posteriormente sometidas al análisis de vía mediante el sistema GeneMania (25). Utilizando un enfoque manual ad hoc, se identificaron vías relevantes y las conexiones entre ellas sobre la base de los datos existentes en Análisis de qRT-PCR. El ARNm purificado se convirtió en ADNc utilizando un kit de ARN-a-cDNA de alta capacidad (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de los números de copia viral se realizó mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR) como se describió previamente (26). La expresión anfitriona de los siguientes genes fue analizada con los ensayos de TaqMan (indicados entre paréntesis): activando el factor de transcripción 3 (ATF3; Hs00231069_m1), ATF4 (Hs00909569_g1), CEBPB (Hs00270923_s1), CEBPD (Hs00270931_s1), DDIT3 (Hs00358796_g1), FOS (Hs04194186_s1), JUN (Hs01103582_s1), EGR1 (Hs00152928_m1), IFI6 (Hs00242571_m1), IFIT1 (Hs01911452_s1), IFIT2 (Hs01922738_s1), IFIT3 (Hs01922738_s1) Los ensayos para el ARNr 18S (Hs99999901_s1 o Mm04277571_s1) se utilizaron para la normalización. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un instrumento ABI StepOne Plus. Tratamiento con PERKi y recolección para el análisis de Western blot. Las células U87MG fueron pretratadas durante 2 h con 10 M la proteína quinasa ARN similar al retículo endoplasmático (ER) cinasa (PERK) inhibidor (PERKi) GSK2606414 (número catalógico 516535; EMD Millipore) o dimetil sulfóxido (DMSO) en DMEM antes de la infección por VEEV TrD (MOI, 5). Después de 1 h, el inóculo viral fue eliminado y las células fueron lavadas con PBS estéril (1). El medio fue reemplazado A 16 hpi, el medio fue removido, y las células fueron lavadas con PBS y luego recolectadas para el análisis de Western blot. Derribado de EGR1 con siRNA. Células U87MG sembradas a 6,7 10 4 células por pozo en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 50 nM de preparación de lisato de proteína de siGenome y análisis de Western blot. Preparación de lisato de proteína y análisis de Western blot se realizaron como se describió previamente (27). Se utilizaron anticuerpos primarios frente a los siguientes anticuerpos: EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular), virus de la encefalitis equina policlonal TC83 (subtipo IA/B) proteína capsid (Recursos BEI), CHOP (anticuerpo L63F7; número de catálogo 2895; señalización celular), subunidad fosforilada de factor de iniciación eucariótica 2 (p-eIF2+; Ser51; anticuerpo D9G8; número de catálogo 3398; señalización celular), ATF4 (anticuerpo D4B8; número de catálogo 11815; señalización celular), caspasa activada 3 (antícuerpo Asp175; número de catálogo 9661; señalización celular), y peroxidasa-conjugada por caballos -actina (número de catálogo ab49900-100; Abcam). Análisis de inmunofluorescencia. Las células U87MG fueron cultivadas en tapas en una placa de 6 pozos, infectadas con VEEV TrD como se describe anteriormente, lavadas con PBS (sin Ca y Mg), y luego fijadas con formaldehído al 4%. Las células fueron permeabilizadas con Triton X-100 en PBS durante 20 min y luego lavadas dos veces con PBS. Las células fueron bloqueadas durante 10 min a temperatura ambiente en albúmina sérica bovina al 3% en PBS. Anticuerpos primarios consistentes en una proteína capsid VEEV (número catalógico NR-9403; Recursos BEI) diluido 1:600 y un anticuerpo EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular) diluido 1:400 fueron incubados en tampón fresco de bloqueo a 37°C durante 1 h y lavado A continuación se muestra una imagen representativa de cada muestra. Anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 568 (número catalógico A11057; Invitrogen) y anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 488 (número catalógico A21202; Invitrogen) diluidos 1:400 como anticuerpos secundarios y tratados de la misma manera que los anticuerpos primarios. DAPI (4=,6-di-amidino-2-fenilindol) diluido 1:1.000 para visualizar los núcleos. Se montaron las tapas sobre diapositivas de vidrio utilizando 10 l de medio de montaje Fluoromount G (número catalógico 0100-01; Southern Biotech). Se utilizó un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE2000-U para microscopía de fluorescencia. Las imágenes se vieron utilizando una lente de inmersión de aceite objetivo de 60. Todas las imágenes fueron sometidas a un promedio de cuatro líneas. Las imágenes fueron procesadas a través del software Nikon NIS-Elements AR Analysis (v3.2). CellTiter Glo y Caspasa 3/7 Glo ensayos. Los fibroblastos embrionarios del tipo salvaje y EGR1 / mouse (MEFs) fueron infectados con TrD en varios MOIs durante una hora y luego lavados con PBS, y el medio fue reemplazado. La viabilidad celular fue medida a las 24 h postinfección utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente Promega CellTiter (número catalógico G7571) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia fue leída mediante un detector de múltiples modos Beckman Coulter DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. De manera similar, la activación de caspasa en el tipo salvaje infectado y EGR1 / MEFs se midió a las 24 h postinfección utilizando un ensayo Promega Caspasa 3/7 Glo (catalog número G8090) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia se leyó utilizando el detector multimodo DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. Números de adhesión de secuencia de nucleótidos. Los datos de secuenciación en bruto para todas las carreras de ARN-Seq incluidas en este trabajo están disponibles públicamente en la base de datos NCBI BioProject bajo el número de adhesión PRJNA300864 (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA300864). Las líneas celulares comunes utilizadas para el estudio de la infección por VEEV incluyen células Vero y BHK; en este estudio, los astrocitos U87MG fueron elegidos como modelo in vitro debido a su relevancia fisiológica y mayor significación clínica; se realizaron experimentos iniciales para caracterizar la replicación viral en células U87MG; se midió la cinética de replicación de VEEV en células U87MG mediante ensayos en placa y mediante el monitoreo de los niveles de expresión de proteínas virales y ARN y el efecto citopático (ECP) en las células infectadas (Fig. 1); se observó una liberación viral tan temprana como 4 hpi, observándose 4 unidades log de virus, seguido de un aumento consistente de la replicación a 8 y 16 hpi (Fig. 1A). La replicación viral alcanzó su punto máximo a 16 hpi, y no se observó un aumento adicional de los La expresión vírica capsid siguió un patrón similar, siendo detectada proteína a 8 hpi y plastificación de expresión a 16 hpi (Fig. 1B). Entre las células U87MG infectadas, se observó una EPC significativa por microscopía a 24 hpi, con poca o ninguna EPC detectada a 16 hpi (datos no mostrados). De acuerdo con estas observaciones, se observó un aumento de la actividad de la caspasa 3/7 sólo a 24 hpi (Fig. 1C). Sobre la base de estos datos, los tiempos de 4, 8 y 16 hpi, reflejando las etapas tempranas, medias y tardías del ciclo de vida viral, respectivamente, fueron seleccionados para el análisis de ARN-Seq para proporcionar una visión dinámica del perfil del transcriptoma host-patógeno. Análisis de secuenciación de ARN de los astrocitos infectados por VEEV. Se aisló el ARNm de conjuntos triplicados de cultivos de células U87MG infectados con simulacros y VEEV, se purificó a 4, 8 y 16 hpi, y se utilizó para preparar bibliotecas de ARNc para ARN-Seq aguas abajo (ver Materiales y Métodos). En la Tabla 1 se muestra un resumen de alto nivel de los resultados de ARN-Seq. Las muestras de ARN VEEV fueron analizadas por RT-PCR cuantitativo en cada momento como un control para demostrar el aumento de la carga de ARN viral a lo largo del tiempo (Fig. 1D), consistente con el aumento del número de lecturas de ARN-Seq cartografiadas al genoma VEEV en puntos posteriores (Tabla 1). Para el análisis de ARN-Seq, los genes individuales se expresaron como el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón En la figura 2A se muestran los valores de expresión RPKM normalizados para cada muestra experimental y se pueden encontrar en el conjunto de datos S1 del material suplementario. La variación mínima de la muestra a la muestra en los valores de expresión dentro de las réplicas biológicas fue detectada constantemente (R 2 0,89 para todas las réplicas; datos no mostrados). Además, también se encontró que la variación de la intersample era mínima cuando se probó por pares a lo largo de todo el experimento utilizando los valores RPKM para los ARN de control de pico sintético ERCC97 (R 2 0,90 para todas las comparaciones; datos no mostrados). Como era de esperar, el análisis de dos componentes principales de los datos ARN-Seq para las células infectadas por simulacro de células frente a las infectadas por VEEV mostró una separación clara de las muestras a 16 hpi de las muestras en puntos Sin embargo, el agrupamiento de muestras infectadas por VVEV con muestras simuladas infectadas en puntos de tiempo anteriores sugiere que la respuesta a la infección viral se limitó a un estrecho subconjunto de genes de respuesta temprana, lo que supone una mayor carga de prueba en la identificación de genes expresados diferencialmente (DEGs) durante las primeras horas de infección. En este sentido, se utilizaron dos métodos ortogonales para identificar DEGs adecuados para una caracterización adicional: el método edgeR (21) y el método desarrollado por Baggerly et al. (22). Los genes identificados por un método se consideraron provisionalmente DEGs, y los identificados por ambos métodos eran DEGs candidatos a ser confirmados por qRT-PCR. Además de comparar los valores individuales de expresión génica para las células infectadas simuladamente y las células infectadas por VEEV en cada momento, también se compararon los valores de expresión génica en serie dentro de cada serie temporal de células infectadas por VEEV para los genes que no mostraron cambios estadísticamente significativos en la expresión en células infectadas simuladamente. Un esquema del análisis comparativo se muestra en la figura 2C. El número de DEGs estadísticamente significativos identificados por cada una de estas comparaciones se muestra en la figura 2D. Además, se utilizó el agrupamiento de k-medias (contra los valores normalizados de RPKM) para identificar cambios brutos en la expresión génica a lo largo del tiempo para cohortes de genes que potencialmente comparten la misma vía o desencadenantes reguladores (fig. 3 ; véase también Conjunto de datos S2 en el material suplementario). Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA; véase Material y Métodos En particular, el clúster 20 (tabla 2) se enriqueció significativamente para los genes involucrados en el control traslacional, la vía de señalización mediada por interferón tipo I y la vía de respuesta a proteínas desplegadas (valor P de GSEA 0,01). Aunque existe una conexión bien establecida entre el control traslacional y la EPU, una nueva conexión entre la EPU y la respuesta mediada por interferón tipo I en respuesta a la replicación viral fue sugerida por el análisis de la vía (ver Materiales y Métodos), implicando la respuesta al crecimiento temprano 1 (EGR1) como un puente potencial entre estas dos vías (Fig. 4). La EGR1 pertenece al clúster 20 y es fuertemente inducida durante la infección por VEEV, y varios otros genes asociados con la respuesta al interferón pertenecen al mismo clúster: IRF1, IFIT1, IFIT2, ISG15 e ILF3. EGR1 se ha asociado con aumentos en la expresión de activar el factor de transcripción 3 (ATF3) (28), que es un componente clave de la UPR y que también pertenece al clúster 20. Esta conexión representó un potencial a Anotaciones del proceso biológico obtenidas de Reactome para el clúster 20. Los identificadores de anotación del reactoma están indicados para cada anotación. Sólo se consideran anotaciones clasificadas por autor rastreable (TAS). TAP, transportador asociado con el procesamiento de antígenos; SRP, partícula de reconocimiento de señales. b Conjunto completo, el número total de genes en el genoma con un proceso biológico anotado; subconjunto, número total de genes expresados diferencialmente con un proceso biológico anotado. Red de genes relacionados con la respuesta del interferón tipo I y UPR. Círculos grandes, genes diferencialmente expresados; círculos pequeños, genes sin cambio significativo de expresión; círculos rojos, factores de respuesta tipo I al interferón; círculos amarillos, genes que regulan la transcripción del ADN; círculos azules, genes de respuesta a proteínas desplegadas; líneas rojas, genes involucrados en interacciones físicas proteína-proteína; líneas azules, genes involucrados en una vía común. Esta red fue sembrada con grupos k-medias 18 y 20, y muchos genes de proteína ribosómica fueron removidos. puente entre la vía UPR y la vía de respuesta al interferón, siendo EGR1 uno de los factores clave potenciales de transcripción que impulsan esta conexión. En consecuencia, se seleccionaron 15 genes de este análisis para su posterior caracterización por qRT-PCR (ver abajo): ATF3, activando el factor de transcripción 4 (ATF4), CEBPB, CEBPD, DDIT3/CHOP, EGR1, FOS, IFI6, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG15, ISG20, JUN y OASL. Los valores de expresión de estos genes, medidos por ARN-Seq, se muestran en la Fig. 5A y B. El análisis confirmatorio qRT-PCR indicó expresión génica concordante (fig. 5C y D). Los genes de respuesta al interferón inducidos están de acuerdo con los detectados en estudios previamente publicados (11, 29, 30) y estos genes sirvieron como control positivo interno. Además, se ha demostrado el vínculo entre la EGR1 y la vía del interferón; la EGR1 es inducida por IFN-® en fibroblastos de ratón y por IFN-®, -, y -® en fibroblastos humanos (31, 32). La EGR1 y la vía UPR fueron seleccionadas para su posterior análisis, ya que su papel en la infección por VEEV no ha sido elucidado. Los datos de análisis del ARN-Seq y la vía indicaron que los genes de respuesta al estrés y la UPR fueron inducidos después de la infección por VEEV. Durante una infección, las células anfitrionas responden al estrés celular resultante de una mayor traducción de proteínas virales y secreción al desencadenar el inicio de la vía de la UPR. La vía de la UPR es una respuesta celular adaptativa activada por el estrés del retículo endoplasmático (ER Con el fin de regular la homeostasis celular durante el plegado y la secreción de proteínas, la vía UPR ha desarrollado tres clases de sensores para asegurar la correcta regulación celular: la enzima inositolrequiriendo 1 (IRE1), la proteína cinasa ARN-como la ER cinasa (PERK), y activar el factor de transcripción 6 (ATF6) (33, 34). Durante la infección por VEEV, el brazo PERK de la UPR pareció estar alterado, ya que dos reguladores críticos de esta vía se expresaron diferencialmente: ATF4 y CHOP (DDIT3) (35). Para determinar si los DEGs alteraron la expresión proteica posterior, se realizó un análisis de manchas occidentales para CHOP, ATF4 y eIF2 fosforilado (p-eIF2). Tunicamicina, un inhibidor de la glucosilación Un análisis del curso del tiempo de las células U87MG tratadas con 1 M de tunicamicina indicó que 8 h de tratamiento proporcionaban la inducción más robusta de proteínas UPR (datos no mostrados). Las células VVEV infectadas pero no infectadas simuladamente o inactivadas por UV VVEV (UV-VEEV) mostraron un aumento espectacular en la expresión p-eIF2 + y un aumento modesto pero consistente en la expresión CHOP y ATF4 a 16 hpi (Fig. 6A). No se observó ningún cambio en la expresión proteica a 4 hpi (datos no mostrados). La microscopía confocal confirmó la regulación de CHOP y ATF4, demostrando un patrón de tinción más robusto y nuclear en las células infectadas por VVEV que en las células infectadas simuladas (Fig. 6C a E). Mientras que los niveles de expresión proteica Estos resultados son consistentes con la observación de que la expresión ATF4 está regulada a nivel traslacional en la inducción EPU (37). Como eIF2® puede ser fosforilada por múltiples cinasas (PERK, proteína cinasa ARN dependiente de doble cadena [PKR], control general no derrepresivo-2 [GCN2] e inhibidor hemeregulado [HRI]) (38), el inhibidor de PERK (PERKi) GSK2606414 fue utilizado para determinar si la fosforilación observada era dependiente de PERK. El tratamiento de las células infectadas por VEEV con PERKi dio lugar a una marcada disminución de la fosforilación eIF2® (Fig. 6B). Estos resultados indican que PERK contribuye a la fosforilación eIF2® pero que es probable que haya una quinasa adicional que contribuya al evento de fosforilación En conjunto, estos hallazgos indican que el brazo de PERK de la vía UPR se induce en puntos de tiempo posteriores a la infección por VVEV. EGR1 se regula en células infectadas y se localiza en el núcleo. EGR1 es un factor de transcripción que puede ser inducido por numerosas señales, incluyendo estrés oxidativo, hipoxemia y factores de crecimiento (39, 40). También se puede activar sobre la infección por virus de ADN y ARN, incluyendo virus Epstein-Barr, virus de hepatitis ratón, coronavirus murino y virus de encefalitis japonesa (41) (42) (43). El tratamiento de MEFs con el activador UPR thapsigargin se ha demostrado que induce la expresión EGR1 de una manera dependiente de PERK (44). Dado el vínculo entre EGR1 y UPR y la inducción robusta de EGR1 expresión mRNA después de la infección por VVE 4 y 5), se eligió EGR1 para un estudio posterior. La expresión proteica EGR1 después de la infección por VEEV fue analizada por el análisis de Western blot. Como estudios previos han indicado que EGR1 puede ser activado por el virus de la hepatitis del ratón independientemente de la replicación del virus (probablemente debido a la interrupción de la membrana celular después de la entrada) (41), se incluyó un control del virus inactivado por UV (VVVEV). Los niveles de proteína EGR1 se incrementaron después de la infección por VEEV en comparación con los niveles de células infecciosas simuladas y células infectadas por UV-VEEV (fig. 7A; compare los carriles 3, 6 y 9 ). La regulación más dramática de EGR1 se produjo a 16 hpi; esto se correlaciona con los niveles más altos de producción de VEEV capsid (fig. 1B Tras la inducción, se ha demostrado que la EGR1 se transloca al núcleo para inducir la expresión génica a través de la unión a la secuencia de unión de Egr (EBS) [GCG(G/T)GGCG] (40, 45). La microcopia confocal reveló altos niveles de EGR1 en los núcleos de células infectadas, mientras que sólo se detectaron bajos niveles de EGR1 tanto nucleares como citoplasmáticos en células simuladas (Fig. 7B). El tratamiento PERKi de células infectadas con VEEV resultó en una pérdida completa de inducción EGR1 (Fig. 7C), indicando que la EGR1 fue inducida de manera dependiente de PERK. Estos resultados demuestran que los niveles de proteína EGR1 y la localización nuclear se incrementan después de la infección por VEEV y que la inducción de EGR1 es dependiente La pérdida de EGR1 inhibe la apoptosis inducida por el VEEV pero no altera la cinética de la replicación del VEEV. Como EGR1 influye en la supervivencia celular y la apoptosis (46), se evaluó el impacto del EGR1 en la muerte celular inducida por el VEEV. Se observó escisión de Caspasa 3 en MEFs WT a 24 hpi cuando se infectaron con un MOI de 0,5 y comenzaron tan pronto como 16 hpi cuando se infectaron con un MOI de 5 (Fig. 8A ). En contraste, las células EGR1 / mostraron poco o ningún escisión de caspasa detectable tras la infección con el VEEV. Se realizaron dos conjuntos de experimentos para confirmar cuantitativamente estos resultados: ensayos de CellTiter Glo para medir la viabilidad celular total (producción de ATP) y Caspasa 3/7 Tanto WT como EGR1 / MEF mostraron disminuciones dosis-dependientes en la viabilidad celular después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que tenían células significativamente más viables en cada MOI examinadas (Fig. 8B). Concordantemente, se observó un aumento dosis-dependiente en la actividad de caspasa 3/7 después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que demostraban una actividad reducida de caspasa 3 en los MOIs de 0,5 y 5 (Fig. 8C). Estos resultados se replicaron en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1 (Fig. 8D). EGR1 ha demostrado regular negativamente la transcripción de BIRC5 (Survivina), un inhibidor de la apoptosis (IAP) miembro de la familia (47). Los datos de ARN-Seq indicaron que la expresión del gen BIRC5 disminuyó después de la infección por VVEV: log 2 -transformado de los valores de cambio del pliegue de la expresión génica normalizada fueron 1,16, 1,18, y 1,50 a 4, 8, y 16 hpi, respectivamente (ver Tabla S1 en el material suplementario y NBI BioProject número de adhesión PRJNA300864). Se utilizaron WT y EGR1 / MEFs para determinar si EGR1 influyó en la expresión del gen BIRC5 después de la infección por VVEV. La expresión BIRC5 disminuyó significativamente a 16 hpi en los MEFs infectados por VVEV, pero esta reducción no se observó en los MEFs infectados por VVEV1 / (Fig. 8E). La expresión del gen para el inhibidor de la apoptosis (XIAP), otro miembro de la familia IAP, no fue significativamente alterada después de la infección (datos no mostrados). Colectivamente, estos resultados demuestran que EGR1 contribuye a la apoptosis inducida por VEEV. Se determinó la cinética de replicación VEEV tanto para EGR1 / como para WT MEFs para determinar la relevancia de EGR1 en la replicación viral.Las células fueron infectadas en dos MOIs diferentes (0,5 y 5), y los sobrenadantes virales fueron recolectados en 4, 8, 16 y 24 hpi y analizados mediante análisis de placa.La cinética de replicación fue similar entre EGR1 / y WT MEFs en ambos MOIs, con títulos que alcanzaron un máximo de 16 hpi (fig. 9A). 9B). Estos resultados fueron replicados en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1. La transfección de siRNA dirigida a EGR1 resultó en una disminución del 90% en la expresión proteica EGR1 (Fig. 9D ) sin ningún efecto significativo en la replicación viral (Fig. 9C). Estos resultados sugieren que la disminución de la apoptosis observada en EGR1 / MEFs no se debió a la cinética de replicación VEEV alterada. A pesar de ser reconocida como una amenaza emergente, se sabe relativamente poco acerca de los mecanismos de virulencia de los alfavirus, en gran parte debido a una brecha de conocimiento en el interactoroma host-patógeno. La infección por VEEV a menudo resulta en encefalitis fatal y se sabe que inhibe tanto la transcripción celular como la traducción para En contraste, en el VVEE del SNC se ha demostrado que upregula numerosos genes tanto en la respuesta inflamatoria como en las vías apoptóticas (1, 48). Específicamente, numerosas citocinas proinflamatorias, incluyendo interleu-kin-1 (IL-1), IL-6, IL-12, glucógeno sintasa cinasa 3, oxido nítrico inducible sintasa, y factor de necrosis tumoral alfa (TNF- Con este fin, la identificación de transcripciones críticas expresadas de forma diferencial entre células infectadas clínicamente relevantes ayudará a una mayor comprensión de la patogénesis viral y puede resultar beneficiosa para la identificación de objetivos terapéuticos. En este estudio, los datos de análisis de red/ARN-Seq y los resultados de estudios de expresión proteica revelaron que la infección por VEEV resultó en la activación del brazo PERK de la vía EPU, incluyendo la activación de ATF4, CHOP y eIF2-fosforilación. Varios alfavirus han sido reportados previamente para secuestrar componentes clave de la vía EPU con el fin de promover la replicación viral, ya que la dependencia de virus envueltos en la ER para la síntesis de glucoproteínas virales asociadas a la envoltura y su transporte a la membrana plasmática a menudo enfatiza la ER debido a la rápida producción de proteínas virales (54, 55). La modulación de la UPR no es exclusiva de los alfavirus; más bien, es un rasgo compartido de muchos virus de ARN de sentido positivo. El virus del dengue ha demostrado suprimir PERK al inhibir la fosforilación continua de eIF2 para inhibir la apoptosis inmediata, aumentando la traducción de proteínas virales y ampliando la duración de la replicación viral productiva (34). Estudios con el virus de la hepatitis E (HEV) han demostrado que la expresión de la proteína capsid del HEV marco abierto de lectura 2 (ORF2) activa la expresión de CHOP y ATF4 (56). En el HEV, ORF2 se demostró estimular CHOP a través de estresadores de ER y elementos de respuesta aminoácidos (AARE) a través de la interacción con ATF4 (56). Los resultados mostrados aquí indican que durante la Durante la detección inicial del estrés ER, PERK es capaz de identificar proteínas mal plegadas en el lumen de la ER y fosforilatos eIF2® con el fin de iniciar las vías de prosurvival en la UPR a través de la actividad general En 24 hpi caspasa 3/7 se analizó la actividad utilizando el ensayo Caspasa 3/7 Glo. Los valores de cambio de pliegue para células simuladas se fijaron en un valor de 1. **, P 0.001. (E) EGR1 / y WT MEFs fueron simulados o VEEV infectados (MOI, 5). El ARN fue preparado, y la expresión genética fue determinada por qRT-PCR utilizando un ensayo TaqMan para BIRC5 (Survivin). Los datos mostrados son los valores del cambio de pliegue de la expresión génica normalizada determinado por el ciclo del umbral T *, P 0,005 (comparación de las células WT infectadas por VEEV y EGR1 /). Inhibición de la síntesis proteica (33, 34). VEEV parece inducir la UPR y promover el aumento de la fosforilación eIF2, que resulta en la inhibición traslacional de la mayoría de los ARNm, mientras que UPR aumenta selectivamente la traducción de ATF4. ATF4 es responsable de la expresión de genes que codifican proteínas involucradas en apoptosis, procesos redox, metabolismo de aminoácidos y reclutamiento de chaperona ER y es un conocido mediador de la vía PERK y CHOP (33, 34). La activación CHOP facilita la expresión aumentada de chaperonas celulares para contrarrestar la acumulación de proteínas mal dobladas (57). La falta de supresión del plegado de proteínas en células persistentemente estresadas, como durante una infección viral, puede resultar en la activación del factor de transcripción proapoptótico CHOP, lo que conduce a la supresión del linfoma de células antiapoptóticas de proteína B-2 (Bcl-2). CHOP también puede funcionar como factor de transcripción prosurvival al desfosforilar eIF2® a través de la activación de la proteína DNA dañado-inducible (GADD34) en un aspecto de retroalimentación autorreguladora (33, 34). Sin embargo, los datos presentados aquí apoyan un modelo por el cual la infección VEEV lleva a CHOP a funcionar en su papel proapoptótico, ya que no se detectó ningún cambio en la expresión génica de GADD34 por el análisis de ARN-Seq. Si bien la UPR fue inducida después de la infección VEEV, Esto es algo sorprendente, ya que se espera que la infección por VVEV induzca un estrés ER significativo debido a la producción masiva de proteínas virales durante el curso de una infección aguda robusta. Las proteínas estructurales del VVEV se traducen del ARN subgenómico viral en poliproteínas en la ER áspera. Las glucoproteínas precur-sor E1 y pE2 se ensamblan como heterodímeros en la ER, experimentando cambios conformacionales que requieren numerosas chaperonas (1, 58). Es posible que el VVEV haya desarrollado mecanismos para subvertir la inducción de la UPR. Para contrarrestar la UPR, las proteínas no estructurales (nsPs) del virus Chikungunya (CHIKV) han demostrado inhibir la expresión de ATF4 y otros genes objetivo conocidos de la UPR, incluyendo GRP78/BiP, GRP94 A través de la actividad nsP, CHIKV ha desarrollado un medio de suprimir la actividad UPR resultante del estrés ER inducido por la glucoproteína viral, evitando así la autofagia inmediata y la activación apoptótica. El capsid VEEV es responsable de interferir con el tráfico nucleocitoplasmático e inhibir la transcripción del ARNr y del ARNm y ha sido implicado en la regulación de la señal de tipo I IFN y la respuesta antiviral mediante la regulación de la producción de ARN viral y proteínas (1, 48, 60). Por lo tanto, hipotetizamos que la capacidad del capsid VEEV para inhibir la transcripción celular y el tráfico de bloqueo nucleocitoplasmático resulta en la inducción retarda de la UPR. Los resultados de un análisis detallado de la red basado en los datos existentes en la literatura, junto con los perfiles de expresión génica temporal obtenidos de este estudio, apuntan a que el EGR1 es un nodo importante en el nuevo vínculo entre la activación del VEEV de la respuesta de interferón tipo I y la UPR. Se sabe que el EGR1 forma un complejo de unión al ADN con C/EBPB, socio crítico de la dimerización de CHOP (61). Estudios anteriores han demostrado que la localización nuclear del CHOP puede actuar como inductor del EGR1 y que el CHOP puede actuar como cofactor transcripcional para la regulación de los genes objetivo del C/EBPB-EGR1 (61). Los resultados del análisis de la mancha occidental y la microscopía presentados en este estudio apoyan este modelo, ya que se encontró que la infección por VEV aumenta tanto los niveles generales como la distribución nuclear Los estudios anteriores demostraron la inducción de ARNm EGR1 por IFN-â en fibroblastos de ratón y por TNF-â, TNF-, IL-1, IFN-â, IFN-â e IFN-â en fibroblastos humanos (31, 32). EGR1, también conocido como Zif268 y NGF1-A, es una proteína de dedo de zinc y factor de transcripción mamífero. Ha sido implicada en la proliferación y diferenciación celular, pero también puede tener funciones proapoptóticas, dependiendo del tipo celular y estímulo (62). De particular interés, EGR1 controla directamente la proliferación cuando se activa por la proteína activada por mitogen quinasa/vía cinasa regulada por señal extracelular en astrocitos estimulados por mitogen (63). Se han observado cambios inducidos por virus en la expresión EGR1 en En los astrocitos infectados por VIH-1, se encontró que la regulación de la EGR1 fue inducida por Tat a través de la transactivación del promotor de la EGR1, lo que llevó a la disfunción celular y a la neurotoxicidad inducida por Tat (64). También se ha demostrado que el aumento de las cantidades de ARNm EGR1 actúa de una manera específica de la región, correspondiendo temporalmente con la producción de ARN viral en los tejidos cerebrales de ratas infectadas por el virus de la rabia o el virus de la enfermedad de Borna (65). En resumen, el estudio actual demuestra un vínculo potencial entre la activación de la EPU y la EGR1. Hasta la fecha, los mecanismos subyacentes a la patogénesis del VEEV y la degeneración neuronal subsiguiente han sido sólo parcialmente elucidados, por lo que determinar el papel de la EGR1 y la UPR puede jugar un papel significativo en el desarrollo de una nueva diana terapéutica que resulte en una disminución de la muerte neuronal y las secuelas neuronales posteriores que resultan de la infección.

¿Qué vacuna se puede usar para prevenir el virus de la encefalitis equina venezolana?

El virus venezolano de la encefalitis equina induce la apotosis a través de la activación de la respuesta de proteínas no plegadas de EGR1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4794670/SHA: f4aa788ab898b28b00ee103e4d4ab24a2c684cafAutores: Baer, Alan; Lundberg, Lindsay; Swales, Danielle; Waybright, Nicole; Pinkham, Chelsea; Dinman, Jonathan D.; Jacobs, Jonathan L.; Kehn-Hall, KyleneFecha: 2016-03-11DOI: 10.1128/jvi.0282-15Licencia: cc-byAbstract: El virus venezolano de la encefalitis equina (VEEV) es El aumento de la circulación y diseminación en las Américas de VVEV y otros arbovirus encefalíticos, como el virus de la encefalitis equina oriental y el virus del Nilo Occidental, subrayan la necesidad de investigar la patogénesis de la encefalomielitis viral para el desarrollo de nuevas contramedidas médicas. La dinámica hospedante-patógena de las células de astrocitoma humano U87MG infectadas con asnos VVEV Trinidad se determinó mediante la secuenciación de ARN (ARN-Seq) de poli(A) y mRNAs. Para identificar las alteraciones críticas que tienen lugar en el transcriptoma del huésped tras la infección por VVEV, se recolectaron muestras a 4, 8 y 16 h de postinfección y se adquirieron datos de ARN-Seq utilizando una plataforma PGM Ion Torrent. Se observó una expresión diferencial de respuesta al interferón, factores de respuesta al estrés La proteína cinasa ARN similar a la proteína endoplasmática retículo cinasa (PERK) brazo de la UPR fue activado, ya que la expresión de activando el factor de transcripción 4 (ATF4) y CHOP (DDIT3), reguladores críticos de la vía, fue alterada después de la infección. La expresión del factor de transcripción respuesta temprana al crecimiento 1 (EGR1) fue inducida de una manera dependiente de PERK. EGR1(−/−) fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) demostró menor susceptibilidad a la muerte celular inducida por VEEV que los MEFs de tipo salvaje isogénico, lo que indica que EGR1 modula las vías proapoptóticas después de la infección VEEV. La influencia de EGR1 es de gran importancia, ya que el daño neuronal puede conducir a secuelas a largo plazo en En casos graves, la propagación viral se dirige al tejido neuronal, resultando en una inflamación significativa y potencialmente mortal dependiente de una combinación de interacciones virus-anfitriona. Actualmente no hay terapias para infecciones causadas por alfavirus encefalíticos debido a una comprensión incompleta de su patogénesis molecular. El virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) es un alfavirus que es prevalente en las Américas y que es capaz de infectar caballos y humanos. Aquí utilizamos la secuenciación de ARN de próxima generación para identificar alteraciones diferenciales en los astrocitos infectados con VEEV. Nuestros resultados indicaron que la abundancia de transcripciones asociadas con el interferón y las vías de respuesta proteica desplegadas se alteraron después de la infección y demostraron que la respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1) contribuyó a la muerte celular inducida por VEEV. Texto: Venezuelan equina encefalitis virus (VE El VEEV es un virus de ARN de cadena positiva que es transmitido por mosquitos y que está naturalmente presente en depósitos de roedores (1). Hay seis subtipos que se clasifican por su rango geográfico y patología en equinos y humanos. Las dos cepas epizoóticas, IA/B y IC, surgieron de mutaciones entre las cepas enzoóticas (2). Las cepas IA/B y IC son de especial preocupación debido al aumento de las tasas de morbilidad y mortalidad y los riesgos asociados con la amplificación viral y el posible derrame de especies (2). En los seres humanos, el VEEV causa una enfermedad febril tipificada por fiebre, malestar y vómitos. En algunos casos, la infección progresa hacia el sistema nervioso central (SNC) y síntomas neurológicos, como confusión, ataxia y convulsiones, se manifiestan. La tasa de mortalidad entre los casos con síntomas neurológicos puede ser de hasta 35% en niños y 10% en adultos, con déficits neurológicos a largo plazo a menudo vistos en sobrevivientes (2). En 1995, un brote de VEEV en Colombia y Venezuela dio lugar a más de 100.000 casos humanos (3). Además de brotes naturales, el VEEV también es una preocupación desde una perspectiva bioterrorista, ya que puede crecer a altos títulos, requiere una dosis infecciosa baja, y contiene múltiples serotipos. Tanto la ex Unión Soviética como los Estados Unidos anteriormente armaron el virus, produciendo grandes cantidades para sus programas de armas biológicas ofensivas ya desactivadas (4). Actualmente, la cepa vacuna TC83 se utiliza en caballos y para personal de alto riesgo; sin embargo, debido a la baja tasa de seroconversión lograda con esta vacuna (5) y su dependencia de dos mutaciones atenuantes únicas (6), se considera no a Hasta la fecha no existen tratamientos aprobados por la FDA para la infección por VEEV, y se requieren estudios adicionales para aclarar los mecanismos asociados con la patogénesis subyacente del VEEV. Los estudios transcriptómicos virales y de huésped pueden proporcionar una gran cantidad de información sobre los mecanismos patógenos subyacentes y las interacciones posteriores al curso de una infección. El uso de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de virus previamente no característicos y el establecimiento de numerosos sistemas experimentales nuevos que redefinieron las interacciones virus-anfitriones. Hasta la fecha, varios estudios han examinado las alteraciones en el transcriptoma del huésped después de la infección por VEEV. Un análisis comparativo de microarray entre células infectadas persistentemente con VEEV y células capaces de limpiar VEEV resultó en la identificación de PARP12L como factor antiviral (8). Una comparación molecular utilizando microarrays de respuestas basadas en el huésped a la cepa TC83 fue capaz de identificar biomarcadores diferenciando entre los grupos que responden a la vacuna y los que no responden a la vacuna, así como la implicación de interferón (IFN), vías inducidas por interferón, receptores similares a los de Toll (TLR) y vías relacionadas con la interleucina 12 (IL-12) (9). Un estudio que examinó el papel de la adhesión y los factores inflamatorios en ratones CD-1 infectados por VEEV encontró modulación viral de la expresión de la matriz extracelular y genes de adhesión, como las integrinas (Itgáxis, Itg2, 3 y 7), las cadherinas 1 y 2, la molécula de adhesión de células vasculares 1, y la molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1), en los cerebros de ratones infectados por VEEV (10). Un estudio de Sharma et al. utilizaron microarrays para analizar los cambios en la expresión génica en el tejido cerebral de ratones infectados por VVEV durante el curso de una infección, descubriendo numerosas vías inmunes involucradas en la presentación de antígenos, inflamación, apoptosis y la respuesta antiviral tradicional (Cxcl10, CxCl11, Ccl5, Ifr7, Ifi27, Oas1b, Fcerg1, Mif, clusterin, e importante complejo de histocompatibilidad [MHC] clase II) (11). Un segundo estudio del mismo grupo identificó la regulación de los microRNAs (miRNAs) en los cerebros de ratones infectados por VVEV, lo que permitió la correlación de los cambios de miRNA con los datos de expresión de mRNA anteriores (11, 12). Estos análisis sugieren que el VEEV puede estar utilizando miRNAs celulares para regular el ARNm aguas abajo, lo que puede corresponder con los cambios histológicos inducidos por el VEEV en el sistema nervioso (11, 12). En el estudio actual, la secuenciación del ARNm de la próxima generación (ARN-Seq) se utilizó para identificar alteraciones clínicamente relevantes en el transcriptoma del ARNm de los astrocitos humanos infectados con la cepa de tipo salvaje (WT) VEEV Trinidad burro (TrD). El análisis de mRNAs huésped por ARN-Seq proporciona una visión novedosa de cómo un huésped responde a una infección viral a través de la identificación de un amplio y dinámico rango de transcripciones de una manera imparcial. Secuencia selectiva de mRNAs, específicamente, poliadenylated [poli(A)] transcripciones, que representan el 1% de Como el VEEV ha demostrado infectar productivamente a los astrocitos tanto in vitro como in vivo (14, 15), elegimos los astrocitos como nuestro modelo de interés. Los astrocitos son las células más abundantes del cerebro, superando a las neuronas por al menos 5 veces (16), proporcionando un recurso abundante para la replicación viral dentro del cerebro. Además de su bien descrito papel estructural en el tejido neuronal, los trocitos desempeñan papeles críticos en otros procesos, incluyendo la regulación del flujo sanguíneo y de la barrera hematoencefálica, la transmisión sinapsis y la respuesta a la infección (16). Se ha demostrado que los astrocitos infectados por el VEEV producen citocinas múltiples, incluyendo IL-8, IL-17, interferón gamma (IFN- +), y proteína 10 inducida por interferón gamma, todas las cuales se encontraron asociadas con atenuación viral (14). Con el fin de obtener una visión dinámica del interactoma virus-anfitrión, se utilizó el ARN-Seq para monitorear los cambios en la expresión génica en los astrocitos infectados por VEEV TrD a las 4, 8 y 16 h de postinfección (hpi). Al observar las alteraciones en múltiples momentos tempranos utilizando réplicas biológicas triplicadas, se genera un rango robusto y dinámico de información, y esta información proporciona un aumento tanto en la potencia como en la exactitud de la detección de transcripciones expresadas diferencialmente en un modelo clínico altamente relevante (17). Entre las células infectadas por VEEV, se observó un aumento en los genes regulados por interferón, incluyendo IFIT1, IFIT2, IFIT3 y OASL. También se observó el aumento en la expresión de genes involucrados en la vía de respuesta proteica inducida por estrés (UPR). Curiosamente, la infección por VEEV resultó en un La identificación de ARNm del huésped cuya expresión se altera después de la replicación del VEEV, específicamente, EGR1 y sus interactores arriba y abajo, puede proporcionar nuevos objetivos terapéuticos basados en el huésped críticos para la replicación del VEEV y una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes que sustentan la replicación del alfavirus. Infecciones virales y ensayos de placa. Se obtuvo TrD del VEEV de Recursos del BEI. Todos los experimentos con VEEV TrD se realizaron bajo condiciones de bioseguridad nivel 3 (BSL-3). Todo trabajo que involucra a agentes selectos está registrado en los Centros de Control y Prevención de Enfermedades y se llevó a cabo en el Laboratorio de Investigación Biomédica de la Universidad George Mason, que está registrado de acuerdo con las regulaciones federales de agentes selectos. Las células fueron infectadas durante 1 h a 37 °C y rotaron cada 15 minutos para asegurar una cobertura adecuada. Las células fueron lavadas con solución salina fosfatada (PBS), y se añadió un medio de crecimiento completo a las células. Se recolectaron sobrenadantes virales y células en varias ocasiones para su posterior análisis. Los ensayos de placa se realizaron como se describió anteriormente (18). Aislamiento de mRNA y preparación de biblioteca poli(A). El ARN de células U87MG fue purificado tanto de TrD VEEV infectado (nivel de bioseguridad 3) como de células U87MG simuladas a 4, 8 y 16 hpi utilizando un kit de aislamiento de mirVana (Tecnologías de Vida). El control de calidad del ARN purificado se realizó a partir de un bioanalizador Agilent 2100, y se utilizó un corte de integridad de ARN número de 8 A continuación, se añadió una mezcla de control de pico de ARN ARN ARN External Controls Consortium (ERCC) a las entradas totales de ARN (10 g de ARN) antes de la selección de poli(A) utilizando un kit de Dynabeads de Life Technologies mRNA Direct. La preparación de una biblioteca de ARN de transcriptoma completo de ARNm purificado se llevó a cabo utilizando un kit de Ion Total ARN-Seq (v2; Life Technologies). El control de calidad de las bibliotecas de cDNA se llevó a cabo utilizando el bioanalizador Agilent 2100 junto con pruebas de esterilidad para la eliminación de bibliotecas para la secuenciación de un laboratorio BSL-3 a BSL-2. Secuenciación de ARN. La preparación de plantillas de biblioteca se realizó en una plataforma One Touch 2 (Life Technologies). La secuenciación de A Un total de 119 millones de lecturas de secuenciación y un promedio de 6,6 millones de lecturas por muestra fueron utilizados como entrada en nuestra tubería de análisis. A menos que se indique lo contrario, el análisis de ARN-Seq aguas abajo se llevó a cabo utilizando la biogenómica CLC Workbench (v7). Las lecturas de ARN-Seq en bruto fueron recortadas para eliminar cualquier fragmento de adaptador de secuenciación residual que permaneciera en los 5= o 3= extremos después de la secuenciación. Además, el recorte final de las lecturas se realizó utilizando el algoritmo Mott modificado con una puntuación de calidad Q20, y cualquier lectura de menos de 15 pb fue descartada. Tras el recorte de lectura, las lecturas fueron cartografiadas al genoma humano hg19 con los siguientes parámetros ARN-Seq: un límite de 10 hits para múltiples posiciones cartográficas, una fracción de similitud de 0,8, una fracción El nivel de expresión de genes y transcripciones individuales se calculó utilizando el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas cartográficas (RPKM) del método Mortazavi et al. (19). Además, las lecturas no cartográficas también fueron cartografiadas al conjunto de secuencias de ARN sintética ERCC92 (20), así como al genoma de referencia VEEV (número de adhesión GenBank L01442). En todas las muestras, el coeficiente de correlación (R 2) entre el número de lecturas esperadas y el número de lecturas cartográficas para los controles de pico en ERCC92 fue superior a 0.90. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los resultados de secuenciación general. El filtrado postmapping de todos los datos de ARN-Seq se llevó a cabo junto a incluir sólo genes con al menos un mapa único leído (26.230 genes permanecieron El análisis de componentes principales del conjunto de datos filtrados resultante (13.906 genes en total) se realizó utilizando recuentos brutos de lecturas exclusivamente cartografiadas (ver Fig. 2A ). Los valores de expresión RPKM restantes para cada gen incluido en el conjunto de datos filtrados se sometieron a normalización cuantitativa con un corte del 5%. En la Fig. 2B se muestra un gráfico de caja de valores RPKM transformados para cada muestra antes de la normalización. El valor R 2 para la variación de muestra a muestra en pares dentro de cada conjunto de réplica biológica se observó un rango de 0,89 a 0,99, lo que indica que nuestras réplicas biológicas fueron consistentes y no mostraron un sesgo fuerte (datos no mostrados). En primer lugar, el análisis empírico del algoritmo de expresión génica diferencial, parte del paquete edgeR Bioconductor (21), se aplicó al conjunto integrado de datos de los 18 experimentos utilizando los parámetros por defecto y un falso valor P corregido por la tasa de descubrimiento. En cada momento se compararon muestras infectadas y simuladas, y los genes cuya expresión difería en más de 2 veces con una significación con un valor P de 0,05 se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial. Además del método descrito anteriormente, se aplicó una prueba estadística ortogonal de expresión diferencial a los datos utilizando una prueba estadística desarrollada por Baggerly et al. (22) para contar el número de etiquetas de secuencia expresadas asociadas con genes individuales, una característica común de ambos análisis en serie de datos de expresión génica (SAGE) y datos ARN-Seq. Cuando se compararon muestras infectadas y simuladas, los genes individuales se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial cuando su expresión difería por más de 2 veces con una significación con un valor de P de 0.05. Los genes expresados diferencialmente que se encontraban en la intersección de los conjuntos de genes identificados por ambos métodos descritos anteriormente se consideraron candidatos de alta calidad y se utilizaron como punto de partida para la investigación ulterior. La agrupación y la GSEA. Los datos de expresión normalizados y filtrados se sometieron a la agrupación de k-medias utilizando una métrica de distancia euclidiana donde los genes se agruparon por medio de valores de expresión génica normalizada (RPKM) para cada condición experimental. La agrupación se ajustó a 20 grupos de agrupamiento distintos, y los perfiles de expresión génica individuales agrupados se probaron para el enriquecimiento de términos de ontología génica (GO) asociados con genes individuales. En primer lugar, se realizó una prueba hipergeométrica de las anotaciones de GO mediante la implementación del paquete GOStats en cada uno de los conglomerados individuales obtenidos a partir de la agrupación k-media (24). Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en todo el conjunto de datos filtrados utilizando 100.000 permutaciones, mientras que se eliminaron duplicados y se aplicó un análisis de varianza. Un total de 1.419 categorías superaron un tamaño mínimo de característica de 10 y se utilizaron para la investigación ulterior. Las cohortes de genes con patrones de expresión compartidos a lo largo del tiempo se identificaron mediante la agrupación de k-medias; las que se encontraron enriquecidas para los DEG fueron posteriormente sometidas al análisis de vía mediante el sistema GeneMania (25). Utilizando un enfoque manual ad hoc, se identificaron vías relevantes y las conexiones entre ellas sobre la base de los datos existentes en Análisis de qRT-PCR. El ARNm purificado se convirtió en ADNc utilizando un kit de ARN-a-cDNA de alta capacidad (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de los números de copia viral se realizó mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR) como se describió previamente (26). La expresión anfitriona de los siguientes genes fue analizada con los ensayos de TaqMan (indicados entre paréntesis): activando el factor de transcripción 3 (ATF3; Hs00231069_m1), ATF4 (Hs00909569_g1), CEBPB (Hs00270923_s1), CEBPD (Hs00270931_s1), DDIT3 (Hs00358796_g1), FOS (Hs04194186_s1), JUN (Hs01103582_s1), EGR1 (Hs00152928_m1), IFI6 (Hs00242571_m1), IFIT1 (Hs01911452_s1), IFIT2 (Hs01922738_s1), IFIT3 (Hs01922738_s1) Los ensayos para el ARNr 18S (Hs99999901_s1 o Mm04277571_s1) se utilizaron para la normalización. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un instrumento ABI StepOne Plus. Tratamiento con PERKi y recolección para el análisis de Western blot. Las células U87MG fueron pretratadas durante 2 h con 10 M la proteína quinasa ARN similar al retículo endoplasmático (ER) cinasa (PERK) inhibidor (PERKi) GSK2606414 (número catalógico 516535; EMD Millipore) o dimetil sulfóxido (DMSO) en DMEM antes de la infección por VEEV TrD (MOI, 5). Después de 1 h, el inóculo viral fue eliminado y las células fueron lavadas con PBS estéril (1). El medio fue reemplazado A 16 hpi, el medio fue removido, y las células fueron lavadas con PBS y luego recolectadas para el análisis de Western blot. Derribado de EGR1 con siRNA. Células U87MG sembradas a 6,7 10 4 células por pozo en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 50 nM de preparación de lisato de proteína de siGenome y análisis de Western blot. Preparación de lisato de proteína y análisis de Western blot se realizaron como se describió previamente (27). Se utilizaron anticuerpos primarios frente a los siguientes anticuerpos: EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular), virus de la encefalitis equina policlonal TC83 (subtipo IA/B) proteína capsid (Recursos BEI), CHOP (anticuerpo L63F7; número de catálogo 2895; señalización celular), subunidad fosforilada de factor de iniciación eucariótica 2 (p-eIF2+; Ser51; anticuerpo D9G8; número de catálogo 3398; señalización celular), ATF4 (anticuerpo D4B8; número de catálogo 11815; señalización celular), caspasa activada 3 (antícuerpo Asp175; número de catálogo 9661; señalización celular), y peroxidasa-conjugada por caballos -actina (número de catálogo ab49900-100; Abcam). Análisis de inmunofluorescencia. Las células U87MG fueron cultivadas en tapas en una placa de 6 pozos, infectadas con VEEV TrD como se describe anteriormente, lavadas con PBS (sin Ca y Mg), y luego fijadas con formaldehído al 4%. Las células fueron permeabilizadas con Triton X-100 en PBS durante 20 min y luego lavadas dos veces con PBS. Las células fueron bloqueadas durante 10 min a temperatura ambiente en albúmina sérica bovina al 3% en PBS. Anticuerpos primarios consistentes en una proteína capsid VEEV (número catalógico NR-9403; Recursos BEI) diluido 1:600 y un anticuerpo EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular) diluido 1:400 fueron incubados en tampón fresco de bloqueo a 37°C durante 1 h y lavado A continuación se muestra una imagen representativa de cada muestra. Anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 568 (número catalógico A11057; Invitrogen) y anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 488 (número catalógico A21202; Invitrogen) diluidos 1:400 como anticuerpos secundarios y tratados de la misma manera que los anticuerpos primarios. DAPI (4=,6-di-amidino-2-fenilindol) diluido 1:1.000 para visualizar los núcleos. Se montaron las tapas sobre diapositivas de vidrio utilizando 10 l de medio de montaje Fluoromount G (número catalógico 0100-01; Southern Biotech). Se utilizó un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE2000-U para microscopía de fluorescencia. Las imágenes se vieron utilizando una lente de inmersión de aceite objetivo de 60. Todas las imágenes fueron sometidas a un promedio de cuatro líneas. Las imágenes fueron procesadas a través del software Nikon NIS-Elements AR Analysis (v3.2). CellTiter Glo y Caspasa 3/7 Glo ensayos. Los fibroblastos embrionarios del tipo salvaje y EGR1 / mouse (MEFs) fueron infectados con TrD en varios MOIs durante una hora y luego lavados con PBS, y el medio fue reemplazado. La viabilidad celular fue medida a las 24 h postinfección utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente Promega CellTiter (número catalógico G7571) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia fue leída mediante un detector de múltiples modos Beckman Coulter DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. De manera similar, la activación de caspasa en el tipo salvaje infectado y EGR1 / MEFs se midió a las 24 h postinfección utilizando un ensayo Promega Caspasa 3/7 Glo (catalog número G8090) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia se leyó utilizando el detector multimodo DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. Números de adhesión de secuencia de nucleótidos. Los datos de secuenciación en bruto para todas las carreras de ARN-Seq incluidas en este trabajo están disponibles públicamente en la base de datos NCBI BioProject bajo el número de adhesión PRJNA300864 (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA300864). Las líneas celulares comunes utilizadas para el estudio de la infección por VEEV incluyen células Vero y BHK; en este estudio, los astrocitos U87MG fueron elegidos como modelo in vitro debido a su relevancia fisiológica y mayor significación clínica; se realizaron experimentos iniciales para caracterizar la replicación viral en células U87MG; se midió la cinética de replicación de VEEV en células U87MG mediante ensayos en placa y mediante el monitoreo de los niveles de expresión de proteínas virales y ARN y el efecto citopático (ECP) en las células infectadas (Fig. 1); se observó una liberación viral tan temprana como 4 hpi, observándose 4 unidades log de virus, seguido de un aumento consistente de la replicación a 8 y 16 hpi (Fig. 1A). La replicación viral alcanzó su punto máximo a 16 hpi, y no se observó un aumento adicional de los La expresión vírica capsid siguió un patrón similar, siendo detectada proteína a 8 hpi y plastificación de expresión a 16 hpi (Fig. 1B). Entre las células U87MG infectadas, se observó una EPC significativa por microscopía a 24 hpi, con poca o ninguna EPC detectada a 16 hpi (datos no mostrados). De acuerdo con estas observaciones, se observó un aumento de la actividad de la caspasa 3/7 sólo a 24 hpi (Fig. 1C). Sobre la base de estos datos, los tiempos de 4, 8 y 16 hpi, reflejando las etapas tempranas, medias y tardías del ciclo de vida viral, respectivamente, fueron seleccionados para el análisis de ARN-Seq para proporcionar una visión dinámica del perfil del transcriptoma host-patógeno. Análisis de secuenciación de ARN de los astrocitos infectados por VEEV. Se aisló el ARNm de conjuntos triplicados de cultivos de células U87MG infectados con simulacros y VEEV, se purificó a 4, 8 y 16 hpi, y se utilizó para preparar bibliotecas de ARNc para ARN-Seq aguas abajo (ver Materiales y Métodos). En la Tabla 1 se muestra un resumen de alto nivel de los resultados de ARN-Seq. Las muestras de ARN VEEV fueron analizadas por RT-PCR cuantitativo en cada momento como un control para demostrar el aumento de la carga de ARN viral a lo largo del tiempo (Fig. 1D), consistente con el aumento del número de lecturas de ARN-Seq cartografiadas al genoma VEEV en puntos posteriores (Tabla 1). Para el análisis de ARN-Seq, los genes individuales se expresaron como el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón En la figura 2A se muestran los valores de expresión RPKM normalizados para cada muestra experimental y se pueden encontrar en el conjunto de datos S1 del material suplementario. La variación mínima de la muestra a la muestra en los valores de expresión dentro de las réplicas biológicas fue detectada constantemente (R 2 0,89 para todas las réplicas; datos no mostrados). Además, también se encontró que la variación de la intersample era mínima cuando se probó por pares a lo largo de todo el experimento utilizando los valores RPKM para los ARN de control de pico sintético ERCC97 (R 2 0,90 para todas las comparaciones; datos no mostrados). Como era de esperar, el análisis de dos componentes principales de los datos ARN-Seq para las células infectadas por simulacro de células frente a las infectadas por VEEV mostró una separación clara de las muestras a 16 hpi de las muestras en puntos Sin embargo, el agrupamiento de muestras infectadas por VVEV con muestras simuladas infectadas en puntos de tiempo anteriores sugiere que la respuesta a la infección viral se limitó a un estrecho subconjunto de genes de respuesta temprana, lo que supone una mayor carga de prueba en la identificación de genes expresados diferencialmente (DEGs) durante las primeras horas de infección. En este sentido, se utilizaron dos métodos ortogonales para identificar DEGs adecuados para una caracterización adicional: el método edgeR (21) y el método desarrollado por Baggerly et al. (22). Los genes identificados por un método se consideraron provisionalmente DEGs, y los identificados por ambos métodos eran DEGs candidatos a ser confirmados por qRT-PCR. Además de comparar los valores individuales de expresión génica para las células infectadas simuladamente y las células infectadas por VEEV en cada momento, también se compararon los valores de expresión génica en serie dentro de cada serie temporal de células infectadas por VEEV para los genes que no mostraron cambios estadísticamente significativos en la expresión en células infectadas simuladamente. Un esquema del análisis comparativo se muestra en la figura 2C. El número de DEGs estadísticamente significativos identificados por cada una de estas comparaciones se muestra en la figura 2D. Además, se utilizó el agrupamiento de k-medias (contra los valores normalizados de RPKM) para identificar cambios brutos en la expresión génica a lo largo del tiempo para cohortes de genes que potencialmente comparten la misma vía o desencadenantes reguladores (fig. 3 ; véase también Conjunto de datos S2 en el material suplementario). Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA; véase Material y Métodos En particular, el clúster 20 (tabla 2) se enriqueció significativamente para los genes involucrados en el control traslacional, la vía de señalización mediada por interferón tipo I y la vía de respuesta a proteínas desplegadas (valor P de GSEA 0,01). Aunque existe una conexión bien establecida entre el control traslacional y la EPU, una nueva conexión entre la EPU y la respuesta mediada por interferón tipo I en respuesta a la replicación viral fue sugerida por el análisis de la vía (ver Materiales y Métodos), implicando la respuesta al crecimiento temprano 1 (EGR1) como un puente potencial entre estas dos vías (Fig. 4). La EGR1 pertenece al clúster 20 y es fuertemente inducida durante la infección por VEEV, y varios otros genes asociados con la respuesta al interferón pertenecen al mismo clúster: IRF1, IFIT1, IFIT2, ISG15 e ILF3. EGR1 se ha asociado con aumentos en la expresión de activar el factor de transcripción 3 (ATF3) (28), que es un componente clave de la UPR y que también pertenece al clúster 20. Esta conexión representó un potencial a Anotaciones del proceso biológico obtenidas de Reactome para el clúster 20. Los identificadores de anotación del reactoma están indicados para cada anotación. Sólo se consideran anotaciones clasificadas por autor rastreable (TAS). TAP, transportador asociado con el procesamiento de antígenos; SRP, partícula de reconocimiento de señales. b Conjunto completo, el número total de genes en el genoma con un proceso biológico anotado; subconjunto, número total de genes expresados diferencialmente con un proceso biológico anotado. Red de genes relacionados con la respuesta del interferón tipo I y UPR. Círculos grandes, genes diferencialmente expresados; círculos pequeños, genes sin cambio significativo de expresión; círculos rojos, factores de respuesta tipo I al interferón; círculos amarillos, genes que regulan la transcripción del ADN; círculos azules, genes de respuesta a proteínas desplegadas; líneas rojas, genes involucrados en interacciones físicas proteína-proteína; líneas azules, genes involucrados en una vía común. Esta red fue sembrada con grupos k-medias 18 y 20, y muchos genes de proteína ribosómica fueron removidos. puente entre la vía UPR y la vía de respuesta al interferón, siendo EGR1 uno de los factores clave potenciales de transcripción que impulsan esta conexión. En consecuencia, se seleccionaron 15 genes de este análisis para su posterior caracterización por qRT-PCR (ver abajo): ATF3, activando el factor de transcripción 4 (ATF4), CEBPB, CEBPD, DDIT3/CHOP, EGR1, FOS, IFI6, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG15, ISG20, JUN y OASL. Los valores de expresión de estos genes, medidos por ARN-Seq, se muestran en la Fig. 5A y B. El análisis confirmatorio qRT-PCR indicó expresión génica concordante (fig. 5C y D). Los genes de respuesta al interferón inducidos están de acuerdo con los detectados en estudios previamente publicados (11, 29, 30) y estos genes sirvieron como control positivo interno. Además, se ha demostrado el vínculo entre la EGR1 y la vía del interferón; la EGR1 es inducida por IFN-® en fibroblastos de ratón y por IFN-®, -, y -® en fibroblastos humanos (31, 32). La EGR1 y la vía UPR fueron seleccionadas para su posterior análisis, ya que su papel en la infección por VEEV no ha sido elucidado. Los datos de análisis del ARN-Seq y la vía indicaron que los genes de respuesta al estrés y la UPR fueron inducidos después de la infección por VEEV. Durante una infección, las células anfitrionas responden al estrés celular resultante de una mayor traducción de proteínas virales y secreción al desencadenar el inicio de la vía de la UPR. La vía de la UPR es una respuesta celular adaptativa activada por el estrés del retículo endoplasmático (ER Con el fin de regular la homeostasis celular durante el plegado y la secreción de proteínas, la vía UPR ha desarrollado tres clases de sensores para asegurar la correcta regulación celular: la enzima inositolrequiriendo 1 (IRE1), la proteína cinasa ARN-como la ER cinasa (PERK), y activar el factor de transcripción 6 (ATF6) (33, 34). Durante la infección por VEEV, el brazo PERK de la UPR pareció estar alterado, ya que dos reguladores críticos de esta vía se expresaron diferencialmente: ATF4 y CHOP (DDIT3) (35). Para determinar si los DEGs alteraron la expresión proteica posterior, se realizó un análisis de manchas occidentales para CHOP, ATF4 y eIF2 fosforilado (p-eIF2). Tunicamicina, un inhibidor de la glucosilación Un análisis del curso del tiempo de las células U87MG tratadas con 1 M de tunicamicina indicó que 8 h de tratamiento proporcionaban la inducción más robusta de proteínas UPR (datos no mostrados). Las células VVEV infectadas pero no infectadas simuladamente o inactivadas por UV VVEV (UV-VEEV) mostraron un aumento espectacular en la expresión p-eIF2 + y un aumento modesto pero consistente en la expresión CHOP y ATF4 a 16 hpi (Fig. 6A). No se observó ningún cambio en la expresión proteica a 4 hpi (datos no mostrados). La microscopía confocal confirmó la regulación de CHOP y ATF4, demostrando un patrón de tinción más robusto y nuclear en las células infectadas por VVEV que en las células infectadas simuladas (Fig. 6C a E). Mientras que los niveles de expresión proteica Estos resultados son consistentes con la observación de que la expresión ATF4 está regulada a nivel traslacional en la inducción EPU (37). Como eIF2® puede ser fosforilada por múltiples cinasas (PERK, proteína cinasa ARN dependiente de doble cadena [PKR], control general no derrepresivo-2 [GCN2] e inhibidor hemeregulado [HRI]) (38), el inhibidor de PERK (PERKi) GSK2606414 fue utilizado para determinar si la fosforilación observada era dependiente de PERK. El tratamiento de las células infectadas por VEEV con PERKi dio lugar a una marcada disminución de la fosforilación eIF2® (Fig. 6B). Estos resultados indican que PERK contribuye a la fosforilación eIF2® pero que es probable que haya una quinasa adicional que contribuya al evento de fosforilación En conjunto, estos hallazgos indican que el brazo de PERK de la vía UPR se induce en puntos de tiempo posteriores a la infección por VVEV. EGR1 se regula en células infectadas y se localiza en el núcleo. EGR1 es un factor de transcripción que puede ser inducido por numerosas señales, incluyendo estrés oxidativo, hipoxemia y factores de crecimiento (39, 40). También se puede activar sobre la infección por virus de ADN y ARN, incluyendo virus Epstein-Barr, virus de hepatitis ratón, coronavirus murino y virus de encefalitis japonesa (41) (42) (43). El tratamiento de MEFs con el activador UPR thapsigargin se ha demostrado que induce la expresión EGR1 de una manera dependiente de PERK (44). Dado el vínculo entre EGR1 y UPR y la inducción robusta de EGR1 expresión mRNA después de la infección por VVE 4 y 5), se eligió EGR1 para un estudio posterior. La expresión proteica EGR1 después de la infección por VEEV fue analizada por el análisis de Western blot. Como estudios previos han indicado que EGR1 puede ser activado por el virus de la hepatitis del ratón independientemente de la replicación del virus (probablemente debido a la interrupción de la membrana celular después de la entrada) (41), se incluyó un control del virus inactivado por UV (VVVEV). Los niveles de proteína EGR1 se incrementaron después de la infección por VEEV en comparación con los niveles de células infecciosas simuladas y células infectadas por UV-VEEV (fig. 7A; compare los carriles 3, 6 y 9 ). La regulación más dramática de EGR1 se produjo a 16 hpi; esto se correlaciona con los niveles más altos de producción de VEEV capsid (fig. 1B Tras la inducción, se ha demostrado que la EGR1 se transloca al núcleo para inducir la expresión génica a través de la unión a la secuencia de unión de Egr (EBS) [GCG(G/T)GGCG] (40, 45). La microcopia confocal reveló altos niveles de EGR1 en los núcleos de células infectadas, mientras que sólo se detectaron bajos niveles de EGR1 tanto nucleares como citoplasmáticos en células simuladas (Fig. 7B). El tratamiento PERKi de células infectadas con VEEV resultó en una pérdida completa de inducción EGR1 (Fig. 7C), indicando que la EGR1 fue inducida de manera dependiente de PERK. Estos resultados demuestran que los niveles de proteína EGR1 y la localización nuclear se incrementan después de la infección por VEEV y que la inducción de EGR1 es dependiente La pérdida de EGR1 inhibe la apoptosis inducida por el VEEV pero no altera la cinética de la replicación del VEEV. Como EGR1 influye en la supervivencia celular y la apoptosis (46), se evaluó el impacto del EGR1 en la muerte celular inducida por el VEEV. Se observó escisión de Caspasa 3 en MEFs WT a 24 hpi cuando se infectaron con un MOI de 0,5 y comenzaron tan pronto como 16 hpi cuando se infectaron con un MOI de 5 (Fig. 8A ). En contraste, las células EGR1 / mostraron poco o ningún escisión de caspasa detectable tras la infección con el VEEV. Se realizaron dos conjuntos de experimentos para confirmar cuantitativamente estos resultados: ensayos de CellTiter Glo para medir la viabilidad celular total (producción de ATP) y Caspasa 3/7 Tanto WT como EGR1 / MEF mostraron disminuciones dosis-dependientes en la viabilidad celular después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que tenían células significativamente más viables en cada MOI examinadas (Fig. 8B). Concordantemente, se observó un aumento dosis-dependiente en la actividad de caspasa 3/7 después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que demostraban una actividad reducida de caspasa 3 en los MOIs de 0,5 y 5 (Fig. 8C). Estos resultados se replicaron en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1 (Fig. 8D). EGR1 ha demostrado regular negativamente la transcripción de BIRC5 (Survivina), un inhibidor de la apoptosis (IAP) miembro de la familia (47). Los datos de ARN-Seq indicaron que la expresión del gen BIRC5 disminuyó después de la infección por VVEV: log 2 -transformado de los valores de cambio del pliegue de la expresión génica normalizada fueron 1,16, 1,18, y 1,50 a 4, 8, y 16 hpi, respectivamente (ver Tabla S1 en el material suplementario y NBI BioProject número de adhesión PRJNA300864). Se utilizaron WT y EGR1 / MEFs para determinar si EGR1 influyó en la expresión del gen BIRC5 después de la infección por VVEV. La expresión BIRC5 disminuyó significativamente a 16 hpi en los MEFs infectados por VVEV, pero esta reducción no se observó en los MEFs infectados por VVEV1 / (Fig. 8E). La expresión del gen para el inhibidor de la apoptosis (XIAP), otro miembro de la familia IAP, no fue significativamente alterada después de la infección (datos no mostrados). Colectivamente, estos resultados demuestran que EGR1 contribuye a la apoptosis inducida por VEEV. Se determinó la cinética de replicación VEEV tanto para EGR1 / como para WT MEFs para determinar la relevancia de EGR1 en la replicación viral.Las células fueron infectadas en dos MOIs diferentes (0,5 y 5), y los sobrenadantes virales fueron recolectados en 4, 8, 16 y 24 hpi y analizados mediante análisis de placa.La cinética de replicación fue similar entre EGR1 / y WT MEFs en ambos MOIs, con títulos que alcanzaron un máximo de 16 hpi (fig. 9A). 9B). Estos resultados fueron replicados en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1. La transfección de siRNA dirigida a EGR1 resultó en una disminución del 90% en la expresión proteica EGR1 (Fig. 9D ) sin ningún efecto significativo en la replicación viral (Fig. 9C). Estos resultados sugieren que la disminución de la apoptosis observada en EGR1 / MEFs no se debió a la cinética de replicación VEEV alterada. A pesar de ser reconocida como una amenaza emergente, se sabe relativamente poco acerca de los mecanismos de virulencia de los alfavirus, en gran parte debido a una brecha de conocimiento en el interactoroma host-patógeno. La infección por VEEV a menudo resulta en encefalitis fatal y se sabe que inhibe tanto la transcripción celular como la traducción para En contraste, en el VVEE del SNC se ha demostrado que upregula numerosos genes tanto en la respuesta inflamatoria como en las vías apoptóticas (1, 48). Específicamente, numerosas citocinas proinflamatorias, incluyendo interleu-kin-1 (IL-1), IL-6, IL-12, glucógeno sintasa cinasa 3, oxido nítrico inducible sintasa, y factor de necrosis tumoral alfa (TNF- Con este fin, la identificación de transcripciones críticas expresadas de forma diferencial entre células infectadas clínicamente relevantes ayudará a una mayor comprensión de la patogénesis viral y puede resultar beneficiosa para la identificación de objetivos terapéuticos. En este estudio, los datos de análisis de red/ARN-Seq y los resultados de estudios de expresión proteica revelaron que la infección por VEEV resultó en la activación del brazo PERK de la vía EPU, incluyendo la activación de ATF4, CHOP y eIF2-fosforilación. Varios alfavirus han sido reportados previamente para secuestrar componentes clave de la vía EPU con el fin de promover la replicación viral, ya que la dependencia de virus envueltos en la ER para la síntesis de glucoproteínas virales asociadas a la envoltura y su transporte a la membrana plasmática a menudo enfatiza la ER debido a la rápida producción de proteínas virales (54, 55). La modulación de la UPR no es exclusiva de los alfavirus; más bien, es un rasgo compartido de muchos virus de ARN de sentido positivo. El virus del dengue ha demostrado suprimir PERK al inhibir la fosforilación continua de eIF2 para inhibir la apoptosis inmediata, aumentando la traducción de proteínas virales y ampliando la duración de la replicación viral productiva (34). Estudios con el virus de la hepatitis E (HEV) han demostrado que la expresión de la proteína capsid del HEV marco abierto de lectura 2 (ORF2) activa la expresión de CHOP y ATF4 (56). En el HEV, ORF2 se demostró estimular CHOP a través de estresadores de ER y elementos de respuesta aminoácidos (AARE) a través de la interacción con ATF4 (56). Los resultados mostrados aquí indican que durante la Durante la detección inicial del estrés ER, PERK es capaz de identificar proteínas mal plegadas en el lumen de la ER y fosforilatos eIF2® con el fin de iniciar las vías de prosurvival en la UPR a través de la actividad general En 24 hpi caspasa 3/7 se analizó la actividad utilizando el ensayo Caspasa 3/7 Glo. Los valores de cambio de pliegue para células simuladas se fijaron en un valor de 1. **, P 0.001. (E) EGR1 / y WT MEFs fueron simulados o VEEV infectados (MOI, 5). El ARN fue preparado, y la expresión genética fue determinada por qRT-PCR utilizando un ensayo TaqMan para BIRC5 (Survivin). Los datos mostrados son los valores del cambio de pliegue de la expresión génica normalizada determinado por el ciclo del umbral T *, P 0,005 (comparación de las células WT infectadas por VEEV y EGR1 /). Inhibición de la síntesis proteica (33, 34). VEEV parece inducir la UPR y promover el aumento de la fosforilación eIF2, que resulta en la inhibición traslacional de la mayoría de los ARNm, mientras que UPR aumenta selectivamente la traducción de ATF4. ATF4 es responsable de la expresión de genes que codifican proteínas involucradas en apoptosis, procesos redox, metabolismo de aminoácidos y reclutamiento de chaperona ER y es un conocido mediador de la vía PERK y CHOP (33, 34). La activación CHOP facilita la expresión aumentada de chaperonas celulares para contrarrestar la acumulación de proteínas mal dobladas (57). La falta de supresión del plegado de proteínas en células persistentemente estresadas, como durante una infección viral, puede resultar en la activación del factor de transcripción proapoptótico CHOP, lo que conduce a la supresión del linfoma de células antiapoptóticas de proteína B-2 (Bcl-2). CHOP también puede funcionar como factor de transcripción prosurvival al desfosforilar eIF2® a través de la activación de la proteína DNA dañado-inducible (GADD34) en un aspecto de retroalimentación autorreguladora (33, 34). Sin embargo, los datos presentados aquí apoyan un modelo por el cual la infección VEEV lleva a CHOP a funcionar en su papel proapoptótico, ya que no se detectó ningún cambio en la expresión génica de GADD34 por el análisis de ARN-Seq. Si bien la UPR fue inducida después de la infección VEEV, Esto es algo sorprendente, ya que se espera que la infección por VVEV induzca un estrés ER significativo debido a la producción masiva de proteínas virales durante el curso de una infección aguda robusta. Las proteínas estructurales del VVEV se traducen del ARN subgenómico viral en poliproteínas en la ER áspera. Las glucoproteínas precur-sor E1 y pE2 se ensamblan como heterodímeros en la ER, experimentando cambios conformacionales que requieren numerosas chaperonas (1, 58). Es posible que el VVEV haya desarrollado mecanismos para subvertir la inducción de la UPR. Para contrarrestar la UPR, las proteínas no estructurales (nsPs) del virus Chikungunya (CHIKV) han demostrado inhibir la expresión de ATF4 y otros genes objetivo conocidos de la UPR, incluyendo GRP78/BiP, GRP94 A través de la actividad nsP, CHIKV ha desarrollado un medio de suprimir la actividad UPR resultante del estrés ER inducido por la glucoproteína viral, evitando así la autofagia inmediata y la activación apoptótica. El capsid VEEV es responsable de interferir con el tráfico nucleocitoplasmático e inhibir la transcripción del ARNr y del ARNm y ha sido implicado en la regulación de la señal de tipo I IFN y la respuesta antiviral mediante la regulación de la producción de ARN viral y proteínas (1, 48, 60). Por lo tanto, hipotetizamos que la capacidad del capsid VEEV para inhibir la transcripción celular y el tráfico de bloqueo nucleocitoplasmático resulta en la inducción retarda de la UPR. Los resultados de un análisis detallado de la red basado en los datos existentes en la literatura, junto con los perfiles de expresión génica temporal obtenidos de este estudio, apuntan a que el EGR1 es un nodo importante en el nuevo vínculo entre la activación del VEEV de la respuesta de interferón tipo I y la UPR. Se sabe que el EGR1 forma un complejo de unión al ADN con C/EBPB, socio crítico de la dimerización de CHOP (61). Estudios anteriores han demostrado que la localización nuclear del CHOP puede actuar como inductor del EGR1 y que el CHOP puede actuar como cofactor transcripcional para la regulación de los genes objetivo del C/EBPB-EGR1 (61). Los resultados del análisis de la mancha occidental y la microscopía presentados en este estudio apoyan este modelo, ya que se encontró que la infección por VEV aumenta tanto los niveles generales como la distribución nuclear Los estudios anteriores demostraron la inducción de ARNm EGR1 por IFN-â en fibroblastos de ratón y por TNF-â, TNF-, IL-1, IFN-â, IFN-â e IFN-â en fibroblastos humanos (31, 32). EGR1, también conocido como Zif268 y NGF1-A, es una proteína de dedo de zinc y factor de transcripción mamífero. Ha sido implicada en la proliferación y diferenciación celular, pero también puede tener funciones proapoptóticas, dependiendo del tipo celular y estímulo (62). De particular interés, EGR1 controla directamente la proliferación cuando se activa por la proteína activada por mitogen quinasa/vía cinasa regulada por señal extracelular en astrocitos estimulados por mitogen (63). Se han observado cambios inducidos por virus en la expresión EGR1 en En los astrocitos infectados por VIH-1, se encontró que la regulación de la EGR1 fue inducida por Tat a través de la transactivación del promotor de la EGR1, lo que llevó a la disfunción celular y a la neurotoxicidad inducida por Tat (64). También se ha demostrado que el aumento de las cantidades de ARNm EGR1 actúa de una manera específica de la región, correspondiendo temporalmente con la producción de ARN viral en los tejidos cerebrales de ratas infectadas por el virus de la rabia o el virus de la enfermedad de Borna (65). En resumen, el estudio actual demuestra un vínculo potencial entre la activación de la EPU y la EGR1. Hasta la fecha, los mecanismos subyacentes a la patogénesis del VEEV y la degeneración neuronal subsiguiente han sido sólo parcialmente elucidados, por lo que determinar el papel de la EGR1 y la UPR puede jugar un papel significativo en el desarrollo de una nueva diana terapéutica que resulte en una disminución de la muerte neuronal y las secuelas neuronales posteriores que resultan de la infección.

¿Qué se puede utilizar para monitorear la secuenciación de ARN?

El virus venezolano de la encefalitis equina induce la apotosis a través de la activación de la respuesta de proteínas no plegadas de EGR1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4794670/SHA: f4aa788ab898b28b00ee103e4d4ab24a2c684cafAutores: Baer, Alan; Lundberg, Lindsay; Swales, Danielle; Waybright, Nicole; Pinkham, Chelsea; Dinman, Jonathan D.; Jacobs, Jonathan L.; Kehn-Hall, KyleneFecha: 2016-03-11DOI: 10.1128/jvi.0282-15Licencia: cc-byAbstract: El virus venezolano de la encefalitis equina (VEEV) es El aumento de la circulación y diseminación en las Américas de VVEV y otros arbovirus encefalíticos, como el virus de la encefalitis equina oriental y el virus del Nilo Occidental, subrayan la necesidad de investigar la patogénesis de la encefalomielitis viral para el desarrollo de nuevas contramedidas médicas. La dinámica hospedante-patógena de las células de astrocitoma humano U87MG infectadas con asnos VVEV Trinidad se determinó mediante la secuenciación de ARN (ARN-Seq) de poli(A) y mRNAs. Para identificar las alteraciones críticas que tienen lugar en el transcriptoma del huésped tras la infección por VVEV, se recolectaron muestras a 4, 8 y 16 h de postinfección y se adquirieron datos de ARN-Seq utilizando una plataforma PGM Ion Torrent. Se observó una expresión diferencial de respuesta al interferón, factores de respuesta al estrés La proteína cinasa ARN similar a la proteína endoplasmática retículo cinasa (PERK) brazo de la UPR fue activado, ya que la expresión de activando el factor de transcripción 4 (ATF4) y CHOP (DDIT3), reguladores críticos de la vía, fue alterada después de la infección. La expresión del factor de transcripción respuesta temprana al crecimiento 1 (EGR1) fue inducida de una manera dependiente de PERK. EGR1(−/−) fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) demostró menor susceptibilidad a la muerte celular inducida por VEEV que los MEFs de tipo salvaje isogénico, lo que indica que EGR1 modula las vías proapoptóticas después de la infección VEEV. La influencia de EGR1 es de gran importancia, ya que el daño neuronal puede conducir a secuelas a largo plazo en En casos graves, la propagación viral se dirige al tejido neuronal, resultando en una inflamación significativa y potencialmente mortal dependiente de una combinación de interacciones virus-anfitriona. Actualmente no hay terapias para infecciones causadas por alfavirus encefalíticos debido a una comprensión incompleta de su patogénesis molecular. El virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) es un alfavirus que es prevalente en las Américas y que es capaz de infectar caballos y humanos. Aquí utilizamos la secuenciación de ARN de próxima generación para identificar alteraciones diferenciales en los astrocitos infectados con VEEV. Nuestros resultados indicaron que la abundancia de transcripciones asociadas con el interferón y las vías de respuesta proteica desplegadas se alteraron después de la infección y demostraron que la respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1) contribuyó a la muerte celular inducida por VEEV. Texto: Venezuelan equina encefalitis virus (VE El VEEV es un virus de ARN de cadena positiva que es transmitido por mosquitos y que está naturalmente presente en depósitos de roedores (1). Hay seis subtipos que se clasifican por su rango geográfico y patología en equinos y humanos. Las dos cepas epizoóticas, IA/B y IC, surgieron de mutaciones entre las cepas enzoóticas (2). Las cepas IA/B y IC son de especial preocupación debido al aumento de las tasas de morbilidad y mortalidad y los riesgos asociados con la amplificación viral y el posible derrame de especies (2). En los seres humanos, el VEEV causa una enfermedad febril tipificada por fiebre, malestar y vómitos. En algunos casos, la infección progresa hacia el sistema nervioso central (SNC) y síntomas neurológicos, como confusión, ataxia y convulsiones, se manifiestan. La tasa de mortalidad entre los casos con síntomas neurológicos puede ser de hasta 35% en niños y 10% en adultos, con déficits neurológicos a largo plazo a menudo vistos en sobrevivientes (2). En 1995, un brote de VEEV en Colombia y Venezuela dio lugar a más de 100.000 casos humanos (3). Además de brotes naturales, el VEEV también es una preocupación desde una perspectiva bioterrorista, ya que puede crecer a altos títulos, requiere una dosis infecciosa baja, y contiene múltiples serotipos. Tanto la ex Unión Soviética como los Estados Unidos anteriormente armaron el virus, produciendo grandes cantidades para sus programas de armas biológicas ofensivas ya desactivadas (4). Actualmente, la cepa vacuna TC83 se utiliza en caballos y para personal de alto riesgo; sin embargo, debido a la baja tasa de seroconversión lograda con esta vacuna (5) y su dependencia de dos mutaciones atenuantes únicas (6), se considera no a Hasta la fecha no existen tratamientos aprobados por la FDA para la infección por VEEV, y se requieren estudios adicionales para aclarar los mecanismos asociados con la patogénesis subyacente del VEEV. Los estudios transcriptómicos virales y de huésped pueden proporcionar una gran cantidad de información sobre los mecanismos patógenos subyacentes y las interacciones posteriores al curso de una infección. El uso de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de virus previamente no característicos y el establecimiento de numerosos sistemas experimentales nuevos que redefinieron las interacciones virus-anfitriones. Hasta la fecha, varios estudios han examinado las alteraciones en el transcriptoma del huésped después de la infección por VEEV. Un análisis comparativo de microarray entre células infectadas persistentemente con VEEV y células capaces de limpiar VEEV resultó en la identificación de PARP12L como factor antiviral (8). Una comparación molecular utilizando microarrays de respuestas basadas en el huésped a la cepa TC83 fue capaz de identificar biomarcadores diferenciando entre los grupos que responden a la vacuna y los que no responden a la vacuna, así como la implicación de interferón (IFN), vías inducidas por interferón, receptores similares a los de Toll (TLR) y vías relacionadas con la interleucina 12 (IL-12) (9). Un estudio que examinó el papel de la adhesión y los factores inflamatorios en ratones CD-1 infectados por VEEV encontró modulación viral de la expresión de la matriz extracelular y genes de adhesión, como las integrinas (Itgáxis, Itg2, 3 y 7), las cadherinas 1 y 2, la molécula de adhesión de células vasculares 1, y la molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1), en los cerebros de ratones infectados por VEEV (10). Un estudio de Sharma et al. utilizaron microarrays para analizar los cambios en la expresión génica en el tejido cerebral de ratones infectados por VVEV durante el curso de una infección, descubriendo numerosas vías inmunes involucradas en la presentación de antígenos, inflamación, apoptosis y la respuesta antiviral tradicional (Cxcl10, CxCl11, Ccl5, Ifr7, Ifi27, Oas1b, Fcerg1, Mif, clusterin, e importante complejo de histocompatibilidad [MHC] clase II) (11). Un segundo estudio del mismo grupo identificó la regulación de los microRNAs (miRNAs) en los cerebros de ratones infectados por VVEV, lo que permitió la correlación de los cambios de miRNA con los datos de expresión de mRNA anteriores (11, 12). Estos análisis sugieren que el VEEV puede estar utilizando miRNAs celulares para regular el ARNm aguas abajo, lo que puede corresponder con los cambios histológicos inducidos por el VEEV en el sistema nervioso (11, 12). En el estudio actual, la secuenciación del ARNm de la próxima generación (ARN-Seq) se utilizó para identificar alteraciones clínicamente relevantes en el transcriptoma del ARNm de los astrocitos humanos infectados con la cepa de tipo salvaje (WT) VEEV Trinidad burro (TrD). El análisis de mRNAs huésped por ARN-Seq proporciona una visión novedosa de cómo un huésped responde a una infección viral a través de la identificación de un amplio y dinámico rango de transcripciones de una manera imparcial. Secuencia selectiva de mRNAs, específicamente, poliadenylated [poli(A)] transcripciones, que representan el 1% de Como el VEEV ha demostrado infectar productivamente a los astrocitos tanto in vitro como in vivo (14, 15), elegimos los astrocitos como nuestro modelo de interés. Los astrocitos son las células más abundantes del cerebro, superando a las neuronas por al menos 5 veces (16), proporcionando un recurso abundante para la replicación viral dentro del cerebro. Además de su bien descrito papel estructural en el tejido neuronal, los trocitos desempeñan papeles críticos en otros procesos, incluyendo la regulación del flujo sanguíneo y de la barrera hematoencefálica, la transmisión sinapsis y la respuesta a la infección (16). Se ha demostrado que los astrocitos infectados por el VEEV producen citocinas múltiples, incluyendo IL-8, IL-17, interferón gamma (IFN- +), y proteína 10 inducida por interferón gamma, todas las cuales se encontraron asociadas con atenuación viral (14). Con el fin de obtener una visión dinámica del interactoma virus-anfitrión, se utilizó el ARN-Seq para monitorear los cambios en la expresión génica en los astrocitos infectados por VEEV TrD a las 4, 8 y 16 h de postinfección (hpi). Al observar las alteraciones en múltiples momentos tempranos utilizando réplicas biológicas triplicadas, se genera un rango robusto y dinámico de información, y esta información proporciona un aumento tanto en la potencia como en la exactitud de la detección de transcripciones expresadas diferencialmente en un modelo clínico altamente relevante (17). Entre las células infectadas por VEEV, se observó un aumento en los genes regulados por interferón, incluyendo IFIT1, IFIT2, IFIT3 y OASL. También se observó el aumento en la expresión de genes involucrados en la vía de respuesta proteica inducida por estrés (UPR). Curiosamente, la infección por VEEV resultó en un La identificación de ARNm del huésped cuya expresión se altera después de la replicación del VEEV, específicamente, EGR1 y sus interactores arriba y abajo, puede proporcionar nuevos objetivos terapéuticos basados en el huésped críticos para la replicación del VEEV y una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes que sustentan la replicación del alfavirus. Infecciones virales y ensayos de placa. Se obtuvo TrD del VEEV de Recursos del BEI. Todos los experimentos con VEEV TrD se realizaron bajo condiciones de bioseguridad nivel 3 (BSL-3). Todo trabajo que involucra a agentes selectos está registrado en los Centros de Control y Prevención de Enfermedades y se llevó a cabo en el Laboratorio de Investigación Biomédica de la Universidad George Mason, que está registrado de acuerdo con las regulaciones federales de agentes selectos. Las células fueron infectadas durante 1 h a 37 °C y rotaron cada 15 minutos para asegurar una cobertura adecuada. Las células fueron lavadas con solución salina fosfatada (PBS), y se añadió un medio de crecimiento completo a las células. Se recolectaron sobrenadantes virales y células en varias ocasiones para su posterior análisis. Los ensayos de placa se realizaron como se describió anteriormente (18). Aislamiento de mRNA y preparación de biblioteca poli(A). El ARN de células U87MG fue purificado tanto de TrD VEEV infectado (nivel de bioseguridad 3) como de células U87MG simuladas a 4, 8 y 16 hpi utilizando un kit de aislamiento de mirVana (Tecnologías de Vida). El control de calidad del ARN purificado se realizó a partir de un bioanalizador Agilent 2100, y se utilizó un corte de integridad de ARN número de 8 A continuación, se añadió una mezcla de control de pico de ARN ARN ARN External Controls Consortium (ERCC) a las entradas totales de ARN (10 g de ARN) antes de la selección de poli(A) utilizando un kit de Dynabeads de Life Technologies mRNA Direct. La preparación de una biblioteca de ARN de transcriptoma completo de ARNm purificado se llevó a cabo utilizando un kit de Ion Total ARN-Seq (v2; Life Technologies). El control de calidad de las bibliotecas de cDNA se llevó a cabo utilizando el bioanalizador Agilent 2100 junto con pruebas de esterilidad para la eliminación de bibliotecas para la secuenciación de un laboratorio BSL-3 a BSL-2. Secuenciación de ARN. La preparación de plantillas de biblioteca se realizó en una plataforma One Touch 2 (Life Technologies). La secuenciación de A Un total de 119 millones de lecturas de secuenciación y un promedio de 6,6 millones de lecturas por muestra fueron utilizados como entrada en nuestra tubería de análisis. A menos que se indique lo contrario, el análisis de ARN-Seq aguas abajo se llevó a cabo utilizando la biogenómica CLC Workbench (v7). Las lecturas de ARN-Seq en bruto fueron recortadas para eliminar cualquier fragmento de adaptador de secuenciación residual que permaneciera en los 5= o 3= extremos después de la secuenciación. Además, el recorte final de las lecturas se realizó utilizando el algoritmo Mott modificado con una puntuación de calidad Q20, y cualquier lectura de menos de 15 pb fue descartada. Tras el recorte de lectura, las lecturas fueron cartografiadas al genoma humano hg19 con los siguientes parámetros ARN-Seq: un límite de 10 hits para múltiples posiciones cartográficas, una fracción de similitud de 0,8, una fracción El nivel de expresión de genes y transcripciones individuales se calculó utilizando el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas cartográficas (RPKM) del método Mortazavi et al. (19). Además, las lecturas no cartográficas también fueron cartografiadas al conjunto de secuencias de ARN sintética ERCC92 (20), así como al genoma de referencia VEEV (número de adhesión GenBank L01442). En todas las muestras, el coeficiente de correlación (R 2) entre el número de lecturas esperadas y el número de lecturas cartográficas para los controles de pico en ERCC92 fue superior a 0.90. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los resultados de secuenciación general. El filtrado postmapping de todos los datos de ARN-Seq se llevó a cabo junto a incluir sólo genes con al menos un mapa único leído (26.230 genes permanecieron El análisis de componentes principales del conjunto de datos filtrados resultante (13.906 genes en total) se realizó utilizando recuentos brutos de lecturas exclusivamente cartografiadas (ver Fig. 2A ). Los valores de expresión RPKM restantes para cada gen incluido en el conjunto de datos filtrados se sometieron a normalización cuantitativa con un corte del 5%. En la Fig. 2B se muestra un gráfico de caja de valores RPKM transformados para cada muestra antes de la normalización. El valor R 2 para la variación de muestra a muestra en pares dentro de cada conjunto de réplica biológica se observó un rango de 0,89 a 0,99, lo que indica que nuestras réplicas biológicas fueron consistentes y no mostraron un sesgo fuerte (datos no mostrados). En primer lugar, el análisis empírico del algoritmo de expresión génica diferencial, parte del paquete edgeR Bioconductor (21), se aplicó al conjunto integrado de datos de los 18 experimentos utilizando los parámetros por defecto y un falso valor P corregido por la tasa de descubrimiento. En cada momento se compararon muestras infectadas y simuladas, y los genes cuya expresión difería en más de 2 veces con una significación con un valor P de 0,05 se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial. Además del método descrito anteriormente, se aplicó una prueba estadística ortogonal de expresión diferencial a los datos utilizando una prueba estadística desarrollada por Baggerly et al. (22) para contar el número de etiquetas de secuencia expresadas asociadas con genes individuales, una característica común de ambos análisis en serie de datos de expresión génica (SAGE) y datos ARN-Seq. Cuando se compararon muestras infectadas y simuladas, los genes individuales se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial cuando su expresión difería por más de 2 veces con una significación con un valor de P de 0.05. Los genes expresados diferencialmente que se encontraban en la intersección de los conjuntos de genes identificados por ambos métodos descritos anteriormente se consideraron candidatos de alta calidad y se utilizaron como punto de partida para la investigación ulterior. La agrupación y la GSEA. Los datos de expresión normalizados y filtrados se sometieron a la agrupación de k-medias utilizando una métrica de distancia euclidiana donde los genes se agruparon por medio de valores de expresión génica normalizada (RPKM) para cada condición experimental. La agrupación se ajustó a 20 grupos de agrupamiento distintos, y los perfiles de expresión génica individuales agrupados se probaron para el enriquecimiento de términos de ontología génica (GO) asociados con genes individuales. En primer lugar, se realizó una prueba hipergeométrica de las anotaciones de GO mediante la implementación del paquete GOStats en cada uno de los conglomerados individuales obtenidos a partir de la agrupación k-media (24). Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en todo el conjunto de datos filtrados utilizando 100.000 permutaciones, mientras que se eliminaron duplicados y se aplicó un análisis de varianza. Un total de 1.419 categorías superaron un tamaño mínimo de característica de 10 y se utilizaron para la investigación ulterior. Las cohortes de genes con patrones de expresión compartidos a lo largo del tiempo se identificaron mediante la agrupación de k-medias; las que se encontraron enriquecidas para los DEG fueron posteriormente sometidas al análisis de vía mediante el sistema GeneMania (25). Utilizando un enfoque manual ad hoc, se identificaron vías relevantes y las conexiones entre ellas sobre la base de los datos existentes en Análisis de qRT-PCR. El ARNm purificado se convirtió en ADNc utilizando un kit de ARN-a-cDNA de alta capacidad (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de los números de copia viral se realizó mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR) como se describió previamente (26). La expresión anfitriona de los siguientes genes fue analizada con los ensayos de TaqMan (indicados entre paréntesis): activando el factor de transcripción 3 (ATF3; Hs00231069_m1), ATF4 (Hs00909569_g1), CEBPB (Hs00270923_s1), CEBPD (Hs00270931_s1), DDIT3 (Hs00358796_g1), FOS (Hs04194186_s1), JUN (Hs01103582_s1), EGR1 (Hs00152928_m1), IFI6 (Hs00242571_m1), IFIT1 (Hs01911452_s1), IFIT2 (Hs01922738_s1), IFIT3 (Hs01922738_s1) Los ensayos para el ARNr 18S (Hs99999901_s1 o Mm04277571_s1) se utilizaron para la normalización. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un instrumento ABI StepOne Plus. Tratamiento con PERKi y recolección para el análisis de Western blot. Las células U87MG fueron pretratadas durante 2 h con 10 M la proteína quinasa ARN similar al retículo endoplasmático (ER) cinasa (PERK) inhibidor (PERKi) GSK2606414 (número catalógico 516535; EMD Millipore) o dimetil sulfóxido (DMSO) en DMEM antes de la infección por VEEV TrD (MOI, 5). Después de 1 h, el inóculo viral fue eliminado y las células fueron lavadas con PBS estéril (1). El medio fue reemplazado A 16 hpi, el medio fue removido, y las células fueron lavadas con PBS y luego recolectadas para el análisis de Western blot. Derribado de EGR1 con siRNA. Células U87MG sembradas a 6,7 10 4 células por pozo en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 50 nM de preparación de lisato de proteína de siGenome y análisis de Western blot. Preparación de lisato de proteína y análisis de Western blot se realizaron como se describió previamente (27). Se utilizaron anticuerpos primarios frente a los siguientes anticuerpos: EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular), virus de la encefalitis equina policlonal TC83 (subtipo IA/B) proteína capsid (Recursos BEI), CHOP (anticuerpo L63F7; número de catálogo 2895; señalización celular), subunidad fosforilada de factor de iniciación eucariótica 2 (p-eIF2+; Ser51; anticuerpo D9G8; número de catálogo 3398; señalización celular), ATF4 (anticuerpo D4B8; número de catálogo 11815; señalización celular), caspasa activada 3 (antícuerpo Asp175; número de catálogo 9661; señalización celular), y peroxidasa-conjugada por caballos -actina (número de catálogo ab49900-100; Abcam). Análisis de inmunofluorescencia. Las células U87MG fueron cultivadas en tapas en una placa de 6 pozos, infectadas con VEEV TrD como se describe anteriormente, lavadas con PBS (sin Ca y Mg), y luego fijadas con formaldehído al 4%. Las células fueron permeabilizadas con Triton X-100 en PBS durante 20 min y luego lavadas dos veces con PBS. Las células fueron bloqueadas durante 10 min a temperatura ambiente en albúmina sérica bovina al 3% en PBS. Anticuerpos primarios consistentes en una proteína capsid VEEV (número catalógico NR-9403; Recursos BEI) diluido 1:600 y un anticuerpo EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular) diluido 1:400 fueron incubados en tampón fresco de bloqueo a 37°C durante 1 h y lavado A continuación se muestra una imagen representativa de cada muestra. Anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 568 (número catalógico A11057; Invitrogen) y anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 488 (número catalógico A21202; Invitrogen) diluidos 1:400 como anticuerpos secundarios y tratados de la misma manera que los anticuerpos primarios. DAPI (4=,6-di-amidino-2-fenilindol) diluido 1:1.000 para visualizar los núcleos. Se montaron las tapas sobre diapositivas de vidrio utilizando 10 l de medio de montaje Fluoromount G (número catalógico 0100-01; Southern Biotech). Se utilizó un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE2000-U para microscopía de fluorescencia. Las imágenes se vieron utilizando una lente de inmersión de aceite objetivo de 60. Todas las imágenes fueron sometidas a un promedio de cuatro líneas. Las imágenes fueron procesadas a través del software Nikon NIS-Elements AR Analysis (v3.2). CellTiter Glo y Caspasa 3/7 Glo ensayos. Los fibroblastos embrionarios del tipo salvaje y EGR1 / mouse (MEFs) fueron infectados con TrD en varios MOIs durante una hora y luego lavados con PBS, y el medio fue reemplazado. La viabilidad celular fue medida a las 24 h postinfección utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente Promega CellTiter (número catalógico G7571) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia fue leída mediante un detector de múltiples modos Beckman Coulter DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. De manera similar, la activación de caspasa en el tipo salvaje infectado y EGR1 / MEFs se midió a las 24 h postinfección utilizando un ensayo Promega Caspasa 3/7 Glo (catalog número G8090) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia se leyó utilizando el detector multimodo DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. Números de adhesión de secuencia de nucleótidos. Los datos de secuenciación en bruto para todas las carreras de ARN-Seq incluidas en este trabajo están disponibles públicamente en la base de datos NCBI BioProject bajo el número de adhesión PRJNA300864 (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA300864). Las líneas celulares comunes utilizadas para el estudio de la infección por VEEV incluyen células Vero y BHK; en este estudio, los astrocitos U87MG fueron elegidos como modelo in vitro debido a su relevancia fisiológica y mayor significación clínica; se realizaron experimentos iniciales para caracterizar la replicación viral en células U87MG; se midió la cinética de replicación de VEEV en células U87MG mediante ensayos en placa y mediante el monitoreo de los niveles de expresión de proteínas virales y ARN y el efecto citopático (ECP) en las células infectadas (Fig. 1); se observó una liberación viral tan temprana como 4 hpi, observándose 4 unidades log de virus, seguido de un aumento consistente de la replicación a 8 y 16 hpi (Fig. 1A). La replicación viral alcanzó su punto máximo a 16 hpi, y no se observó un aumento adicional de los La expresión vírica capsid siguió un patrón similar, siendo detectada proteína a 8 hpi y plastificación de expresión a 16 hpi (Fig. 1B). Entre las células U87MG infectadas, se observó una EPC significativa por microscopía a 24 hpi, con poca o ninguna EPC detectada a 16 hpi (datos no mostrados). De acuerdo con estas observaciones, se observó un aumento de la actividad de la caspasa 3/7 sólo a 24 hpi (Fig. 1C). Sobre la base de estos datos, los tiempos de 4, 8 y 16 hpi, reflejando las etapas tempranas, medias y tardías del ciclo de vida viral, respectivamente, fueron seleccionados para el análisis de ARN-Seq para proporcionar una visión dinámica del perfil del transcriptoma host-patógeno. Análisis de secuenciación de ARN de los astrocitos infectados por VEEV. Se aisló el ARNm de conjuntos triplicados de cultivos de células U87MG infectados con simulacros y VEEV, se purificó a 4, 8 y 16 hpi, y se utilizó para preparar bibliotecas de ARNc para ARN-Seq aguas abajo (ver Materiales y Métodos). En la Tabla 1 se muestra un resumen de alto nivel de los resultados de ARN-Seq. Las muestras de ARN VEEV fueron analizadas por RT-PCR cuantitativo en cada momento como un control para demostrar el aumento de la carga de ARN viral a lo largo del tiempo (Fig. 1D), consistente con el aumento del número de lecturas de ARN-Seq cartografiadas al genoma VEEV en puntos posteriores (Tabla 1). Para el análisis de ARN-Seq, los genes individuales se expresaron como el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón En la figura 2A se muestran los valores de expresión RPKM normalizados para cada muestra experimental y se pueden encontrar en el conjunto de datos S1 del material suplementario. La variación mínima de la muestra a la muestra en los valores de expresión dentro de las réplicas biológicas fue detectada constantemente (R 2 0,89 para todas las réplicas; datos no mostrados). Además, también se encontró que la variación de la intersample era mínima cuando se probó por pares a lo largo de todo el experimento utilizando los valores RPKM para los ARN de control de pico sintético ERCC97 (R 2 0,90 para todas las comparaciones; datos no mostrados). Como era de esperar, el análisis de dos componentes principales de los datos ARN-Seq para las células infectadas por simulacro de células frente a las infectadas por VEEV mostró una separación clara de las muestras a 16 hpi de las muestras en puntos Sin embargo, el agrupamiento de muestras infectadas por VVEV con muestras simuladas infectadas en puntos de tiempo anteriores sugiere que la respuesta a la infección viral se limitó a un estrecho subconjunto de genes de respuesta temprana, lo que supone una mayor carga de prueba en la identificación de genes expresados diferencialmente (DEGs) durante las primeras horas de infección. En este sentido, se utilizaron dos métodos ortogonales para identificar DEGs adecuados para una caracterización adicional: el método edgeR (21) y el método desarrollado por Baggerly et al. (22). Los genes identificados por un método se consideraron provisionalmente DEGs, y los identificados por ambos métodos eran DEGs candidatos a ser confirmados por qRT-PCR. Además de comparar los valores individuales de expresión génica para las células infectadas simuladamente y las células infectadas por VEEV en cada momento, también se compararon los valores de expresión génica en serie dentro de cada serie temporal de células infectadas por VEEV para los genes que no mostraron cambios estadísticamente significativos en la expresión en células infectadas simuladamente. Un esquema del análisis comparativo se muestra en la figura 2C. El número de DEGs estadísticamente significativos identificados por cada una de estas comparaciones se muestra en la figura 2D. Además, se utilizó el agrupamiento de k-medias (contra los valores normalizados de RPKM) para identificar cambios brutos en la expresión génica a lo largo del tiempo para cohortes de genes que potencialmente comparten la misma vía o desencadenantes reguladores (fig. 3 ; véase también Conjunto de datos S2 en el material suplementario). Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA; véase Material y Métodos En particular, el clúster 20 (tabla 2) se enriqueció significativamente para los genes involucrados en el control traslacional, la vía de señalización mediada por interferón tipo I y la vía de respuesta a proteínas desplegadas (valor P de GSEA 0,01). Aunque existe una conexión bien establecida entre el control traslacional y la EPU, una nueva conexión entre la EPU y la respuesta mediada por interferón tipo I en respuesta a la replicación viral fue sugerida por el análisis de la vía (ver Materiales y Métodos), implicando la respuesta al crecimiento temprano 1 (EGR1) como un puente potencial entre estas dos vías (Fig. 4). La EGR1 pertenece al clúster 20 y es fuertemente inducida durante la infección por VEEV, y varios otros genes asociados con la respuesta al interferón pertenecen al mismo clúster: IRF1, IFIT1, IFIT2, ISG15 e ILF3. EGR1 se ha asociado con aumentos en la expresión de activar el factor de transcripción 3 (ATF3) (28), que es un componente clave de la UPR y que también pertenece al clúster 20. Esta conexión representó un potencial a Anotaciones del proceso biológico obtenidas de Reactome para el clúster 20. Los identificadores de anotación del reactoma están indicados para cada anotación. Sólo se consideran anotaciones clasificadas por autor rastreable (TAS). TAP, transportador asociado con el procesamiento de antígenos; SRP, partícula de reconocimiento de señales. b Conjunto completo, el número total de genes en el genoma con un proceso biológico anotado; subconjunto, número total de genes expresados diferencialmente con un proceso biológico anotado. Red de genes relacionados con la respuesta del interferón tipo I y UPR. Círculos grandes, genes diferencialmente expresados; círculos pequeños, genes sin cambio significativo de expresión; círculos rojos, factores de respuesta tipo I al interferón; círculos amarillos, genes que regulan la transcripción del ADN; círculos azules, genes de respuesta a proteínas desplegadas; líneas rojas, genes involucrados en interacciones físicas proteína-proteína; líneas azules, genes involucrados en una vía común. Esta red fue sembrada con grupos k-medias 18 y 20, y muchos genes de proteína ribosómica fueron removidos. puente entre la vía UPR y la vía de respuesta al interferón, siendo EGR1 uno de los factores clave potenciales de transcripción que impulsan esta conexión. En consecuencia, se seleccionaron 15 genes de este análisis para su posterior caracterización por qRT-PCR (ver abajo): ATF3, activando el factor de transcripción 4 (ATF4), CEBPB, CEBPD, DDIT3/CHOP, EGR1, FOS, IFI6, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG15, ISG20, JUN y OASL. Los valores de expresión de estos genes, medidos por ARN-Seq, se muestran en la Fig. 5A y B. El análisis confirmatorio qRT-PCR indicó expresión génica concordante (fig. 5C y D). Los genes de respuesta al interferón inducidos están de acuerdo con los detectados en estudios previamente publicados (11, 29, 30) y estos genes sirvieron como control positivo interno. Además, se ha demostrado el vínculo entre la EGR1 y la vía del interferón; la EGR1 es inducida por IFN-® en fibroblastos de ratón y por IFN-®, -, y -® en fibroblastos humanos (31, 32). La EGR1 y la vía UPR fueron seleccionadas para su posterior análisis, ya que su papel en la infección por VEEV no ha sido elucidado. Los datos de análisis del ARN-Seq y la vía indicaron que los genes de respuesta al estrés y la UPR fueron inducidos después de la infección por VEEV. Durante una infección, las células anfitrionas responden al estrés celular resultante de una mayor traducción de proteínas virales y secreción al desencadenar el inicio de la vía de la UPR. La vía de la UPR es una respuesta celular adaptativa activada por el estrés del retículo endoplasmático (ER Con el fin de regular la homeostasis celular durante el plegado y la secreción de proteínas, la vía UPR ha desarrollado tres clases de sensores para asegurar la correcta regulación celular: la enzima inositolrequiriendo 1 (IRE1), la proteína cinasa ARN-como la ER cinasa (PERK), y activar el factor de transcripción 6 (ATF6) (33, 34). Durante la infección por VEEV, el brazo PERK de la UPR pareció estar alterado, ya que dos reguladores críticos de esta vía se expresaron diferencialmente: ATF4 y CHOP (DDIT3) (35). Para determinar si los DEGs alteraron la expresión proteica posterior, se realizó un análisis de manchas occidentales para CHOP, ATF4 y eIF2 fosforilado (p-eIF2). Tunicamicina, un inhibidor de la glucosilación Un análisis del curso del tiempo de las células U87MG tratadas con 1 M de tunicamicina indicó que 8 h de tratamiento proporcionaban la inducción más robusta de proteínas UPR (datos no mostrados). Las células VVEV infectadas pero no infectadas simuladamente o inactivadas por UV VVEV (UV-VEEV) mostraron un aumento espectacular en la expresión p-eIF2 + y un aumento modesto pero consistente en la expresión CHOP y ATF4 a 16 hpi (Fig. 6A). No se observó ningún cambio en la expresión proteica a 4 hpi (datos no mostrados). La microscopía confocal confirmó la regulación de CHOP y ATF4, demostrando un patrón de tinción más robusto y nuclear en las células infectadas por VVEV que en las células infectadas simuladas (Fig. 6C a E). Mientras que los niveles de expresión proteica Estos resultados son consistentes con la observación de que la expresión ATF4 está regulada a nivel traslacional en la inducción EPU (37). Como eIF2® puede ser fosforilada por múltiples cinasas (PERK, proteína cinasa ARN dependiente de doble cadena [PKR], control general no derrepresivo-2 [GCN2] e inhibidor hemeregulado [HRI]) (38), el inhibidor de PERK (PERKi) GSK2606414 fue utilizado para determinar si la fosforilación observada era dependiente de PERK. El tratamiento de las células infectadas por VEEV con PERKi dio lugar a una marcada disminución de la fosforilación eIF2® (Fig. 6B). Estos resultados indican que PERK contribuye a la fosforilación eIF2® pero que es probable que haya una quinasa adicional que contribuya al evento de fosforilación En conjunto, estos hallazgos indican que el brazo de PERK de la vía UPR se induce en puntos de tiempo posteriores a la infección por VVEV. EGR1 se regula en células infectadas y se localiza en el núcleo. EGR1 es un factor de transcripción que puede ser inducido por numerosas señales, incluyendo estrés oxidativo, hipoxemia y factores de crecimiento (39, 40). También se puede activar sobre la infección por virus de ADN y ARN, incluyendo virus Epstein-Barr, virus de hepatitis ratón, coronavirus murino y virus de encefalitis japonesa (41) (42) (43). El tratamiento de MEFs con el activador UPR thapsigargin se ha demostrado que induce la expresión EGR1 de una manera dependiente de PERK (44). Dado el vínculo entre EGR1 y UPR y la inducción robusta de EGR1 expresión mRNA después de la infección por VVE 4 y 5), se eligió EGR1 para un estudio posterior. La expresión proteica EGR1 después de la infección por VEEV fue analizada por el análisis de Western blot. Como estudios previos han indicado que EGR1 puede ser activado por el virus de la hepatitis del ratón independientemente de la replicación del virus (probablemente debido a la interrupción de la membrana celular después de la entrada) (41), se incluyó un control del virus inactivado por UV (VVVEV). Los niveles de proteína EGR1 se incrementaron después de la infección por VEEV en comparación con los niveles de células infecciosas simuladas y células infectadas por UV-VEEV (fig. 7A; compare los carriles 3, 6 y 9 ). La regulación más dramática de EGR1 se produjo a 16 hpi; esto se correlaciona con los niveles más altos de producción de VEEV capsid (fig. 1B Tras la inducción, se ha demostrado que la EGR1 se transloca al núcleo para inducir la expresión génica a través de la unión a la secuencia de unión de Egr (EBS) [GCG(G/T)GGCG] (40, 45). La microcopia confocal reveló altos niveles de EGR1 en los núcleos de células infectadas, mientras que sólo se detectaron bajos niveles de EGR1 tanto nucleares como citoplasmáticos en células simuladas (Fig. 7B). El tratamiento PERKi de células infectadas con VEEV resultó en una pérdida completa de inducción EGR1 (Fig. 7C), indicando que la EGR1 fue inducida de manera dependiente de PERK. Estos resultados demuestran que los niveles de proteína EGR1 y la localización nuclear se incrementan después de la infección por VEEV y que la inducción de EGR1 es dependiente La pérdida de EGR1 inhibe la apoptosis inducida por el VEEV pero no altera la cinética de la replicación del VEEV. Como EGR1 influye en la supervivencia celular y la apoptosis (46), se evaluó el impacto del EGR1 en la muerte celular inducida por el VEEV. Se observó escisión de Caspasa 3 en MEFs WT a 24 hpi cuando se infectaron con un MOI de 0,5 y comenzaron tan pronto como 16 hpi cuando se infectaron con un MOI de 5 (Fig. 8A ). En contraste, las células EGR1 / mostraron poco o ningún escisión de caspasa detectable tras la infección con el VEEV. Se realizaron dos conjuntos de experimentos para confirmar cuantitativamente estos resultados: ensayos de CellTiter Glo para medir la viabilidad celular total (producción de ATP) y Caspasa 3/7 Tanto WT como EGR1 / MEF mostraron disminuciones dosis-dependientes en la viabilidad celular después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que tenían células significativamente más viables en cada MOI examinadas (Fig. 8B). Concordantemente, se observó un aumento dosis-dependiente en la actividad de caspasa 3/7 después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que demostraban una actividad reducida de caspasa 3 en los MOIs de 0,5 y 5 (Fig. 8C). Estos resultados se replicaron en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1 (Fig. 8D). EGR1 ha demostrado regular negativamente la transcripción de BIRC5 (Survivina), un inhibidor de la apoptosis (IAP) miembro de la familia (47). Los datos de ARN-Seq indicaron que la expresión del gen BIRC5 disminuyó después de la infección por VVEV: log 2 -transformado de los valores de cambio del pliegue de la expresión génica normalizada fueron 1,16, 1,18, y 1,50 a 4, 8, y 16 hpi, respectivamente (ver Tabla S1 en el material suplementario y NBI BioProject número de adhesión PRJNA300864). Se utilizaron WT y EGR1 / MEFs para determinar si EGR1 influyó en la expresión del gen BIRC5 después de la infección por VVEV. La expresión BIRC5 disminuyó significativamente a 16 hpi en los MEFs infectados por VVEV, pero esta reducción no se observó en los MEFs infectados por VVEV1 / (Fig. 8E). La expresión del gen para el inhibidor de la apoptosis (XIAP), otro miembro de la familia IAP, no fue significativamente alterada después de la infección (datos no mostrados). Colectivamente, estos resultados demuestran que EGR1 contribuye a la apoptosis inducida por VEEV. Se determinó la cinética de replicación VEEV tanto para EGR1 / como para WT MEFs para determinar la relevancia de EGR1 en la replicación viral.Las células fueron infectadas en dos MOIs diferentes (0,5 y 5), y los sobrenadantes virales fueron recolectados en 4, 8, 16 y 24 hpi y analizados mediante análisis de placa.La cinética de replicación fue similar entre EGR1 / y WT MEFs en ambos MOIs, con títulos que alcanzaron un máximo de 16 hpi (fig. 9A). 9B). Estos resultados fueron replicados en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1. La transfección de siRNA dirigida a EGR1 resultó en una disminución del 90% en la expresión proteica EGR1 (Fig. 9D ) sin ningún efecto significativo en la replicación viral (Fig. 9C). Estos resultados sugieren que la disminución de la apoptosis observada en EGR1 / MEFs no se debió a la cinética de replicación VEEV alterada. A pesar de ser reconocida como una amenaza emergente, se sabe relativamente poco acerca de los mecanismos de virulencia de los alfavirus, en gran parte debido a una brecha de conocimiento en el interactoroma host-patógeno. La infección por VEEV a menudo resulta en encefalitis fatal y se sabe que inhibe tanto la transcripción celular como la traducción para En contraste, en el VVEE del SNC se ha demostrado que upregula numerosos genes tanto en la respuesta inflamatoria como en las vías apoptóticas (1, 48). Específicamente, numerosas citocinas proinflamatorias, incluyendo interleu-kin-1 (IL-1), IL-6, IL-12, glucógeno sintasa cinasa 3, oxido nítrico inducible sintasa, y factor de necrosis tumoral alfa (TNF- Con este fin, la identificación de transcripciones críticas expresadas de forma diferencial entre células infectadas clínicamente relevantes ayudará a una mayor comprensión de la patogénesis viral y puede resultar beneficiosa para la identificación de objetivos terapéuticos. En este estudio, los datos de análisis de red/ARN-Seq y los resultados de estudios de expresión proteica revelaron que la infección por VEEV resultó en la activación del brazo PERK de la vía EPU, incluyendo la activación de ATF4, CHOP y eIF2-fosforilación. Varios alfavirus han sido reportados previamente para secuestrar componentes clave de la vía EPU con el fin de promover la replicación viral, ya que la dependencia de virus envueltos en la ER para la síntesis de glucoproteínas virales asociadas a la envoltura y su transporte a la membrana plasmática a menudo enfatiza la ER debido a la rápida producción de proteínas virales (54, 55). La modulación de la UPR no es exclusiva de los alfavirus; más bien, es un rasgo compartido de muchos virus de ARN de sentido positivo. El virus del dengue ha demostrado suprimir PERK al inhibir la fosforilación continua de eIF2 para inhibir la apoptosis inmediata, aumentando la traducción de proteínas virales y ampliando la duración de la replicación viral productiva (34). Estudios con el virus de la hepatitis E (HEV) han demostrado que la expresión de la proteína capsid del HEV marco abierto de lectura 2 (ORF2) activa la expresión de CHOP y ATF4 (56). En el HEV, ORF2 se demostró estimular CHOP a través de estresadores de ER y elementos de respuesta aminoácidos (AARE) a través de la interacción con ATF4 (56). Los resultados mostrados aquí indican que durante la Durante la detección inicial del estrés ER, PERK es capaz de identificar proteínas mal plegadas en el lumen de la ER y fosforilatos eIF2® con el fin de iniciar las vías de prosurvival en la UPR a través de la actividad general En 24 hpi caspasa 3/7 se analizó la actividad utilizando el ensayo Caspasa 3/7 Glo. Los valores de cambio de pliegue para células simuladas se fijaron en un valor de 1. **, P 0.001. (E) EGR1 / y WT MEFs fueron simulados o VEEV infectados (MOI, 5). El ARN fue preparado, y la expresión genética fue determinada por qRT-PCR utilizando un ensayo TaqMan para BIRC5 (Survivin). Los datos mostrados son los valores del cambio de pliegue de la expresión génica normalizada determinado por el ciclo del umbral T *, P 0,005 (comparación de las células WT infectadas por VEEV y EGR1 /). Inhibición de la síntesis proteica (33, 34). VEEV parece inducir la UPR y promover el aumento de la fosforilación eIF2, que resulta en la inhibición traslacional de la mayoría de los ARNm, mientras que UPR aumenta selectivamente la traducción de ATF4. ATF4 es responsable de la expresión de genes que codifican proteínas involucradas en apoptosis, procesos redox, metabolismo de aminoácidos y reclutamiento de chaperona ER y es un conocido mediador de la vía PERK y CHOP (33, 34). La activación CHOP facilita la expresión aumentada de chaperonas celulares para contrarrestar la acumulación de proteínas mal dobladas (57). La falta de supresión del plegado de proteínas en células persistentemente estresadas, como durante una infección viral, puede resultar en la activación del factor de transcripción proapoptótico CHOP, lo que conduce a la supresión del linfoma de células antiapoptóticas de proteína B-2 (Bcl-2). CHOP también puede funcionar como factor de transcripción prosurvival al desfosforilar eIF2® a través de la activación de la proteína DNA dañado-inducible (GADD34) en un aspecto de retroalimentación autorreguladora (33, 34). Sin embargo, los datos presentados aquí apoyan un modelo por el cual la infección VEEV lleva a CHOP a funcionar en su papel proapoptótico, ya que no se detectó ningún cambio en la expresión génica de GADD34 por el análisis de ARN-Seq. Si bien la UPR fue inducida después de la infección VEEV, Esto es algo sorprendente, ya que se espera que la infección por VVEV induzca un estrés ER significativo debido a la producción masiva de proteínas virales durante el curso de una infección aguda robusta. Las proteínas estructurales del VVEV se traducen del ARN subgenómico viral en poliproteínas en la ER áspera. Las glucoproteínas precur-sor E1 y pE2 se ensamblan como heterodímeros en la ER, experimentando cambios conformacionales que requieren numerosas chaperonas (1, 58). Es posible que el VVEV haya desarrollado mecanismos para subvertir la inducción de la UPR. Para contrarrestar la UPR, las proteínas no estructurales (nsPs) del virus Chikungunya (CHIKV) han demostrado inhibir la expresión de ATF4 y otros genes objetivo conocidos de la UPR, incluyendo GRP78/BiP, GRP94 A través de la actividad nsP, CHIKV ha desarrollado un medio de suprimir la actividad UPR resultante del estrés ER inducido por la glucoproteína viral, evitando así la autofagia inmediata y la activación apoptótica. El capsid VEEV es responsable de interferir con el tráfico nucleocitoplasmático e inhibir la transcripción del ARNr y del ARNm y ha sido implicado en la regulación de la señal de tipo I IFN y la respuesta antiviral mediante la regulación de la producción de ARN viral y proteínas (1, 48, 60). Por lo tanto, hipotetizamos que la capacidad del capsid VEEV para inhibir la transcripción celular y el tráfico de bloqueo nucleocitoplasmático resulta en la inducción retarda de la UPR. Los resultados de un análisis detallado de la red basado en los datos existentes en la literatura, junto con los perfiles de expresión génica temporal obtenidos de este estudio, apuntan a que el EGR1 es un nodo importante en el nuevo vínculo entre la activación del VEEV de la respuesta de interferón tipo I y la UPR. Se sabe que el EGR1 forma un complejo de unión al ADN con C/EBPB, socio crítico de la dimerización de CHOP (61). Estudios anteriores han demostrado que la localización nuclear del CHOP puede actuar como inductor del EGR1 y que el CHOP puede actuar como cofactor transcripcional para la regulación de los genes objetivo del C/EBPB-EGR1 (61). Los resultados del análisis de la mancha occidental y la microscopía presentados en este estudio apoyan este modelo, ya que se encontró que la infección por VEV aumenta tanto los niveles generales como la distribución nuclear Los estudios anteriores demostraron la inducción de ARNm EGR1 por IFN-â en fibroblastos de ratón y por TNF-â, TNF-, IL-1, IFN-â, IFN-â e IFN-â en fibroblastos humanos (31, 32). EGR1, también conocido como Zif268 y NGF1-A, es una proteína de dedo de zinc y factor de transcripción mamífero. Ha sido implicada en la proliferación y diferenciación celular, pero también puede tener funciones proapoptóticas, dependiendo del tipo celular y estímulo (62). De particular interés, EGR1 controla directamente la proliferación cuando se activa por la proteína activada por mitogen quinasa/vía cinasa regulada por señal extracelular en astrocitos estimulados por mitogen (63). Se han observado cambios inducidos por virus en la expresión EGR1 en En los astrocitos infectados por VIH-1, se encontró que la regulación de la EGR1 fue inducida por Tat a través de la transactivación del promotor de la EGR1, lo que llevó a la disfunción celular y a la neurotoxicidad inducida por Tat (64). También se ha demostrado que el aumento de las cantidades de ARNm EGR1 actúa de una manera específica de la región, correspondiendo temporalmente con la producción de ARN viral en los tejidos cerebrales de ratas infectadas por el virus de la rabia o el virus de la enfermedad de Borna (65). En resumen, el estudio actual demuestra un vínculo potencial entre la activación de la EPU y la EGR1. Hasta la fecha, los mecanismos subyacentes a la patogénesis del VEEV y la degeneración neuronal subsiguiente han sido sólo parcialmente elucidados, por lo que determinar el papel de la EGR1 y la UPR puede jugar un papel significativo en el desarrollo de una nueva diana terapéutica que resulte en una disminución de la muerte neuronal y las secuelas neuronales posteriores que resultan de la infección.

¿Dónde se acumula EGR1 en la célula?

El virus venezolano de la encefalitis equina induce la apotosis a través de la activación de la respuesta de proteínas no plegadas de EGR1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4794670/SHA: f4aa788ab898b28b00ee103e4d4ab24a2c684cafAutores: Baer, Alan; Lundberg, Lindsay; Swales, Danielle; Waybright, Nicole; Pinkham, Chelsea; Dinman, Jonathan D.; Jacobs, Jonathan L.; Kehn-Hall, KyleneFecha: 2016-03-11DOI: 10.1128/jvi.0282-15Licencia: cc-byAbstract: El virus venezolano de la encefalitis equina (VEEV) es El aumento de la circulación y diseminación en las Américas de VVEV y otros arbovirus encefalíticos, como el virus de la encefalitis equina oriental y el virus del Nilo Occidental, subrayan la necesidad de investigar la patogénesis de la encefalomielitis viral para el desarrollo de nuevas contramedidas médicas. La dinámica hospedante-patógena de las células de astrocitoma humano U87MG infectadas con asnos VVEV Trinidad se determinó mediante la secuenciación de ARN (ARN-Seq) de poli(A) y mRNAs. Para identificar las alteraciones críticas que tienen lugar en el transcriptoma del huésped tras la infección por VVEV, se recolectaron muestras a 4, 8 y 16 h de postinfección y se adquirieron datos de ARN-Seq utilizando una plataforma PGM Ion Torrent. Se observó una expresión diferencial de respuesta al interferón, factores de respuesta al estrés La proteína cinasa ARN similar a la proteína endoplasmática retículo cinasa (PERK) brazo de la UPR fue activado, ya que la expresión de activando el factor de transcripción 4 (ATF4) y CHOP (DDIT3), reguladores críticos de la vía, fue alterada después de la infección. La expresión del factor de transcripción respuesta temprana al crecimiento 1 (EGR1) fue inducida de una manera dependiente de PERK. EGR1(−/−) fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) demostró menor susceptibilidad a la muerte celular inducida por VEEV que los MEFs de tipo salvaje isogénico, lo que indica que EGR1 modula las vías proapoptóticas después de la infección VEEV. La influencia de EGR1 es de gran importancia, ya que el daño neuronal puede conducir a secuelas a largo plazo en En casos graves, la propagación viral se dirige al tejido neuronal, resultando en una inflamación significativa y potencialmente mortal dependiente de una combinación de interacciones virus-anfitriona. Actualmente no hay terapias para infecciones causadas por alfavirus encefalíticos debido a una comprensión incompleta de su patogénesis molecular. El virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) es un alfavirus que es prevalente en las Américas y que es capaz de infectar caballos y humanos. Aquí utilizamos la secuenciación de ARN de próxima generación para identificar alteraciones diferenciales en los astrocitos infectados con VEEV. Nuestros resultados indicaron que la abundancia de transcripciones asociadas con el interferón y las vías de respuesta proteica desplegadas se alteraron después de la infección y demostraron que la respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1) contribuyó a la muerte celular inducida por VEEV. Texto: Venezuelan equina encefalitis virus (VE El VEEV es un virus de ARN de cadena positiva que es transmitido por mosquitos y que está naturalmente presente en depósitos de roedores (1). Hay seis subtipos que se clasifican por su rango geográfico y patología en equinos y humanos. Las dos cepas epizoóticas, IA/B y IC, surgieron de mutaciones entre las cepas enzoóticas (2). Las cepas IA/B y IC son de especial preocupación debido al aumento de las tasas de morbilidad y mortalidad y los riesgos asociados con la amplificación viral y el posible derrame de especies (2). En los seres humanos, el VEEV causa una enfermedad febril tipificada por fiebre, malestar y vómitos. En algunos casos, la infección progresa hacia el sistema nervioso central (SNC) y síntomas neurológicos, como confusión, ataxia y convulsiones, se manifiestan. La tasa de mortalidad entre los casos con síntomas neurológicos puede ser de hasta 35% en niños y 10% en adultos, con déficits neurológicos a largo plazo a menudo vistos en sobrevivientes (2). En 1995, un brote de VEEV en Colombia y Venezuela dio lugar a más de 100.000 casos humanos (3). Además de brotes naturales, el VEEV también es una preocupación desde una perspectiva bioterrorista, ya que puede crecer a altos títulos, requiere una dosis infecciosa baja, y contiene múltiples serotipos. Tanto la ex Unión Soviética como los Estados Unidos anteriormente armaron el virus, produciendo grandes cantidades para sus programas de armas biológicas ofensivas ya desactivadas (4). Actualmente, la cepa vacuna TC83 se utiliza en caballos y para personal de alto riesgo; sin embargo, debido a la baja tasa de seroconversión lograda con esta vacuna (5) y su dependencia de dos mutaciones atenuantes únicas (6), se considera no a Hasta la fecha no existen tratamientos aprobados por la FDA para la infección por VEEV, y se requieren estudios adicionales para aclarar los mecanismos asociados con la patogénesis subyacente del VEEV. Los estudios transcriptómicos virales y de huésped pueden proporcionar una gran cantidad de información sobre los mecanismos patógenos subyacentes y las interacciones posteriores al curso de una infección. El uso de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de virus previamente no característicos y el establecimiento de numerosos sistemas experimentales nuevos que redefinieron las interacciones virus-anfitriones. Hasta la fecha, varios estudios han examinado las alteraciones en el transcriptoma del huésped después de la infección por VEEV. Un análisis comparativo de microarray entre células infectadas persistentemente con VEEV y células capaces de limpiar VEEV resultó en la identificación de PARP12L como factor antiviral (8). Una comparación molecular utilizando microarrays de respuestas basadas en el huésped a la cepa TC83 fue capaz de identificar biomarcadores diferenciando entre los grupos que responden a la vacuna y los que no responden a la vacuna, así como la implicación de interferón (IFN), vías inducidas por interferón, receptores similares a los de Toll (TLR) y vías relacionadas con la interleucina 12 (IL-12) (9). Un estudio que examinó el papel de la adhesión y los factores inflamatorios en ratones CD-1 infectados por VEEV encontró modulación viral de la expresión de la matriz extracelular y genes de adhesión, como las integrinas (Itgáxis, Itg2, 3 y 7), las cadherinas 1 y 2, la molécula de adhesión de células vasculares 1, y la molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1), en los cerebros de ratones infectados por VEEV (10). Un estudio de Sharma et al. utilizaron microarrays para analizar los cambios en la expresión génica en el tejido cerebral de ratones infectados por VVEV durante el curso de una infección, descubriendo numerosas vías inmunes involucradas en la presentación de antígenos, inflamación, apoptosis y la respuesta antiviral tradicional (Cxcl10, CxCl11, Ccl5, Ifr7, Ifi27, Oas1b, Fcerg1, Mif, clusterin, e importante complejo de histocompatibilidad [MHC] clase II) (11). Un segundo estudio del mismo grupo identificó la regulación de los microRNAs (miRNAs) en los cerebros de ratones infectados por VVEV, lo que permitió la correlación de los cambios de miRNA con los datos de expresión de mRNA anteriores (11, 12). Estos análisis sugieren que el VEEV puede estar utilizando miRNAs celulares para regular el ARNm aguas abajo, lo que puede corresponder con los cambios histológicos inducidos por el VEEV en el sistema nervioso (11, 12). En el estudio actual, la secuenciación del ARNm de la próxima generación (ARN-Seq) se utilizó para identificar alteraciones clínicamente relevantes en el transcriptoma del ARNm de los astrocitos humanos infectados con la cepa de tipo salvaje (WT) VEEV Trinidad burro (TrD). El análisis de mRNAs huésped por ARN-Seq proporciona una visión novedosa de cómo un huésped responde a una infección viral a través de la identificación de un amplio y dinámico rango de transcripciones de una manera imparcial. Secuencia selectiva de mRNAs, específicamente, poliadenylated [poli(A)] transcripciones, que representan el 1% de Como el VEEV ha demostrado infectar productivamente a los astrocitos tanto in vitro como in vivo (14, 15), elegimos los astrocitos como nuestro modelo de interés. Los astrocitos son las células más abundantes del cerebro, superando a las neuronas por al menos 5 veces (16), proporcionando un recurso abundante para la replicación viral dentro del cerebro. Además de su bien descrito papel estructural en el tejido neuronal, los trocitos desempeñan papeles críticos en otros procesos, incluyendo la regulación del flujo sanguíneo y de la barrera hematoencefálica, la transmisión sinapsis y la respuesta a la infección (16). Se ha demostrado que los astrocitos infectados por el VEEV producen citocinas múltiples, incluyendo IL-8, IL-17, interferón gamma (IFN- +), y proteína 10 inducida por interferón gamma, todas las cuales se encontraron asociadas con atenuación viral (14). Con el fin de obtener una visión dinámica del interactoma virus-anfitrión, se utilizó el ARN-Seq para monitorear los cambios en la expresión génica en los astrocitos infectados por VEEV TrD a las 4, 8 y 16 h de postinfección (hpi). Al observar las alteraciones en múltiples momentos tempranos utilizando réplicas biológicas triplicadas, se genera un rango robusto y dinámico de información, y esta información proporciona un aumento tanto en la potencia como en la exactitud de la detección de transcripciones expresadas diferencialmente en un modelo clínico altamente relevante (17). Entre las células infectadas por VEEV, se observó un aumento en los genes regulados por interferón, incluyendo IFIT1, IFIT2, IFIT3 y OASL. También se observó el aumento en la expresión de genes involucrados en la vía de respuesta proteica inducida por estrés (UPR). Curiosamente, la infección por VEEV resultó en un La identificación de ARNm del huésped cuya expresión se altera después de la replicación del VEEV, específicamente, EGR1 y sus interactores arriba y abajo, puede proporcionar nuevos objetivos terapéuticos basados en el huésped críticos para la replicación del VEEV y una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes que sustentan la replicación del alfavirus. Infecciones virales y ensayos de placa. Se obtuvo TrD del VEEV de Recursos del BEI. Todos los experimentos con VEEV TrD se realizaron bajo condiciones de bioseguridad nivel 3 (BSL-3). Todo trabajo que involucra a agentes selectos está registrado en los Centros de Control y Prevención de Enfermedades y se llevó a cabo en el Laboratorio de Investigación Biomédica de la Universidad George Mason, que está registrado de acuerdo con las regulaciones federales de agentes selectos. Las células fueron infectadas durante 1 h a 37 °C y rotaron cada 15 minutos para asegurar una cobertura adecuada. Las células fueron lavadas con solución salina fosfatada (PBS), y se añadió un medio de crecimiento completo a las células. Se recolectaron sobrenadantes virales y células en varias ocasiones para su posterior análisis. Los ensayos de placa se realizaron como se describió anteriormente (18). Aislamiento de mRNA y preparación de biblioteca poli(A). El ARN de células U87MG fue purificado tanto de TrD VEEV infectado (nivel de bioseguridad 3) como de células U87MG simuladas a 4, 8 y 16 hpi utilizando un kit de aislamiento de mirVana (Tecnologías de Vida). El control de calidad del ARN purificado se realizó a partir de un bioanalizador Agilent 2100, y se utilizó un corte de integridad de ARN número de 8 A continuación, se añadió una mezcla de control de pico de ARN ARN ARN External Controls Consortium (ERCC) a las entradas totales de ARN (10 g de ARN) antes de la selección de poli(A) utilizando un kit de Dynabeads de Life Technologies mRNA Direct. La preparación de una biblioteca de ARN de transcriptoma completo de ARNm purificado se llevó a cabo utilizando un kit de Ion Total ARN-Seq (v2; Life Technologies). El control de calidad de las bibliotecas de cDNA se llevó a cabo utilizando el bioanalizador Agilent 2100 junto con pruebas de esterilidad para la eliminación de bibliotecas para la secuenciación de un laboratorio BSL-3 a BSL-2. Secuenciación de ARN. La preparación de plantillas de biblioteca se realizó en una plataforma One Touch 2 (Life Technologies). La secuenciación de A Un total de 119 millones de lecturas de secuenciación y un promedio de 6,6 millones de lecturas por muestra fueron utilizados como entrada en nuestra tubería de análisis. A menos que se indique lo contrario, el análisis de ARN-Seq aguas abajo se llevó a cabo utilizando la biogenómica CLC Workbench (v7). Las lecturas de ARN-Seq en bruto fueron recortadas para eliminar cualquier fragmento de adaptador de secuenciación residual que permaneciera en los 5= o 3= extremos después de la secuenciación. Además, el recorte final de las lecturas se realizó utilizando el algoritmo Mott modificado con una puntuación de calidad Q20, y cualquier lectura de menos de 15 pb fue descartada. Tras el recorte de lectura, las lecturas fueron cartografiadas al genoma humano hg19 con los siguientes parámetros ARN-Seq: un límite de 10 hits para múltiples posiciones cartográficas, una fracción de similitud de 0,8, una fracción El nivel de expresión de genes y transcripciones individuales se calculó utilizando el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas cartográficas (RPKM) del método Mortazavi et al. (19). Además, las lecturas no cartográficas también fueron cartografiadas al conjunto de secuencias de ARN sintética ERCC92 (20), así como al genoma de referencia VEEV (número de adhesión GenBank L01442). En todas las muestras, el coeficiente de correlación (R 2) entre el número de lecturas esperadas y el número de lecturas cartográficas para los controles de pico en ERCC92 fue superior a 0.90. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los resultados de secuenciación general. El filtrado postmapping de todos los datos de ARN-Seq se llevó a cabo junto a incluir sólo genes con al menos un mapa único leído (26.230 genes permanecieron El análisis de componentes principales del conjunto de datos filtrados resultante (13.906 genes en total) se realizó utilizando recuentos brutos de lecturas exclusivamente cartografiadas (ver Fig. 2A ). Los valores de expresión RPKM restantes para cada gen incluido en el conjunto de datos filtrados se sometieron a normalización cuantitativa con un corte del 5%. En la Fig. 2B se muestra un gráfico de caja de valores RPKM transformados para cada muestra antes de la normalización. El valor R 2 para la variación de muestra a muestra en pares dentro de cada conjunto de réplica biológica se observó un rango de 0,89 a 0,99, lo que indica que nuestras réplicas biológicas fueron consistentes y no mostraron un sesgo fuerte (datos no mostrados). En primer lugar, el análisis empírico del algoritmo de expresión génica diferencial, parte del paquete edgeR Bioconductor (21), se aplicó al conjunto integrado de datos de los 18 experimentos utilizando los parámetros por defecto y un falso valor P corregido por la tasa de descubrimiento. En cada momento se compararon muestras infectadas y simuladas, y los genes cuya expresión difería en más de 2 veces con una significación con un valor P de 0,05 se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial. Además del método descrito anteriormente, se aplicó una prueba estadística ortogonal de expresión diferencial a los datos utilizando una prueba estadística desarrollada por Baggerly et al. (22) para contar el número de etiquetas de secuencia expresadas asociadas con genes individuales, una característica común de ambos análisis en serie de datos de expresión génica (SAGE) y datos ARN-Seq. Cuando se compararon muestras infectadas y simuladas, los genes individuales se consideraron provisionalmente expresados de manera diferencial cuando su expresión difería por más de 2 veces con una significación con un valor de P de 0.05. Los genes expresados diferencialmente que se encontraban en la intersección de los conjuntos de genes identificados por ambos métodos descritos anteriormente se consideraron candidatos de alta calidad y se utilizaron como punto de partida para la investigación ulterior. La agrupación y la GSEA. Los datos de expresión normalizados y filtrados se sometieron a la agrupación de k-medias utilizando una métrica de distancia euclidiana donde los genes se agruparon por medio de valores de expresión génica normalizada (RPKM) para cada condición experimental. La agrupación se ajustó a 20 grupos de agrupamiento distintos, y los perfiles de expresión génica individuales agrupados se probaron para el enriquecimiento de términos de ontología génica (GO) asociados con genes individuales. En primer lugar, se realizó una prueba hipergeométrica de las anotaciones de GO mediante la implementación del paquete GOStats en cada uno de los conglomerados individuales obtenidos a partir de la agrupación k-media (24). Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en todo el conjunto de datos filtrados utilizando 100.000 permutaciones, mientras que se eliminaron duplicados y se aplicó un análisis de varianza. Un total de 1.419 categorías superaron un tamaño mínimo de característica de 10 y se utilizaron para la investigación ulterior. Las cohortes de genes con patrones de expresión compartidos a lo largo del tiempo se identificaron mediante la agrupación de k-medias; las que se encontraron enriquecidas para los DEG fueron posteriormente sometidas al análisis de vía mediante el sistema GeneMania (25). Utilizando un enfoque manual ad hoc, se identificaron vías relevantes y las conexiones entre ellas sobre la base de los datos existentes en Análisis de qRT-PCR. El ARNm purificado se convirtió en ADNc utilizando un kit de ARN-a-cDNA de alta capacidad (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de los números de copia viral se realizó mediante transcripción cuantitativa inversa-PCR (qRT-PCR) como se describió previamente (26). La expresión anfitriona de los siguientes genes fue analizada con los ensayos de TaqMan (indicados entre paréntesis): activando el factor de transcripción 3 (ATF3; Hs00231069_m1), ATF4 (Hs00909569_g1), CEBPB (Hs00270923_s1), CEBPD (Hs00270931_s1), DDIT3 (Hs00358796_g1), FOS (Hs04194186_s1), JUN (Hs01103582_s1), EGR1 (Hs00152928_m1), IFI6 (Hs00242571_m1), IFIT1 (Hs01911452_s1), IFIT2 (Hs01922738_s1), IFIT3 (Hs01922738_s1) Los ensayos para el ARNr 18S (Hs99999901_s1 o Mm04277571_s1) se utilizaron para la normalización. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un instrumento ABI StepOne Plus. Tratamiento con PERKi y recolección para el análisis de Western blot. Las células U87MG fueron pretratadas durante 2 h con 10 M la proteína quinasa ARN similar al retículo endoplasmático (ER) cinasa (PERK) inhibidor (PERKi) GSK2606414 (número catalógico 516535; EMD Millipore) o dimetil sulfóxido (DMSO) en DMEM antes de la infección por VEEV TrD (MOI, 5). Después de 1 h, el inóculo viral fue eliminado y las células fueron lavadas con PBS estéril (1). El medio fue reemplazado A 16 hpi, el medio fue removido, y las células fueron lavadas con PBS y luego recolectadas para el análisis de Western blot. Derribado de EGR1 con siRNA. Células U87MG sembradas a 6,7 10 4 células por pozo en una placa de 12 pocillos fueron transfectadas con 50 nM de preparación de lisato de proteína de siGenome y análisis de Western blot. Preparación de lisato de proteína y análisis de Western blot se realizaron como se describió previamente (27). Se utilizaron anticuerpos primarios frente a los siguientes anticuerpos: EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular), virus de la encefalitis equina policlonal TC83 (subtipo IA/B) proteína capsid (Recursos BEI), CHOP (anticuerpo L63F7; número de catálogo 2895; señalización celular), subunidad fosforilada de factor de iniciación eucariótica 2 (p-eIF2+; Ser51; anticuerpo D9G8; número de catálogo 3398; señalización celular), ATF4 (anticuerpo D4B8; número de catálogo 11815; señalización celular), caspasa activada 3 (antícuerpo Asp175; número de catálogo 9661; señalización celular), y peroxidasa-conjugada por caballos -actina (número de catálogo ab49900-100; Abcam). Análisis de inmunofluorescencia. Las células U87MG fueron cultivadas en tapas en una placa de 6 pozos, infectadas con VEEV TrD como se describe anteriormente, lavadas con PBS (sin Ca y Mg), y luego fijadas con formaldehído al 4%. Las células fueron permeabilizadas con Triton X-100 en PBS durante 20 min y luego lavadas dos veces con PBS. Las células fueron bloqueadas durante 10 min a temperatura ambiente en albúmina sérica bovina al 3% en PBS. Anticuerpos primarios consistentes en una proteína capsid VEEV (número catalógico NR-9403; Recursos BEI) diluido 1:600 y un anticuerpo EGR1 (anticuerpo 44D5; número de catálogo 4154; señalización celular) diluido 1:400 fueron incubados en tampón fresco de bloqueo a 37°C durante 1 h y lavado A continuación se muestra una imagen representativa de cada muestra. Anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 568 (número catalógico A11057; Invitrogen) y anticuerpo secundario anticabra de burro Alexa Fluor 488 (número catalógico A21202; Invitrogen) diluidos 1:400 como anticuerpos secundarios y tratados de la misma manera que los anticuerpos primarios. DAPI (4=,6-di-amidino-2-fenilindol) diluido 1:1.000 para visualizar los núcleos. Se montaron las tapas sobre diapositivas de vidrio utilizando 10 l de medio de montaje Fluoromount G (número catalógico 0100-01; Southern Biotech). Se utilizó un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE2000-U para microscopía de fluorescencia. Las imágenes se vieron utilizando una lente de inmersión de aceite objetivo de 60. Todas las imágenes fueron sometidas a un promedio de cuatro líneas. Las imágenes fueron procesadas a través del software Nikon NIS-Elements AR Analysis (v3.2). CellTiter Glo y Caspasa 3/7 Glo ensayos. Los fibroblastos embrionarios del tipo salvaje y EGR1 / mouse (MEFs) fueron infectados con TrD en varios MOIs durante una hora y luego lavados con PBS, y el medio fue reemplazado. La viabilidad celular fue medida a las 24 h postinfección utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente Promega CellTiter (número catalógico G7571) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia fue leída mediante un detector de múltiples modos Beckman Coulter DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. De manera similar, la activación de caspasa en el tipo salvaje infectado y EGR1 / MEFs se midió a las 24 h postinfección utilizando un ensayo Promega Caspasa 3/7 Glo (catalog número G8090) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La luminiscencia se leyó utilizando el detector multimodo DTX 880 con un tiempo de integración de 100 ms por pozo. Números de adhesión de secuencia de nucleótidos. Los datos de secuenciación en bruto para todas las carreras de ARN-Seq incluidas en este trabajo están disponibles públicamente en la base de datos NCBI BioProject bajo el número de adhesión PRJNA300864 (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA300864). Las líneas celulares comunes utilizadas para el estudio de la infección por VEEV incluyen células Vero y BHK; en este estudio, los astrocitos U87MG fueron elegidos como modelo in vitro debido a su relevancia fisiológica y mayor significación clínica; se realizaron experimentos iniciales para caracterizar la replicación viral en células U87MG; se midió la cinética de replicación de VEEV en células U87MG mediante ensayos en placa y mediante el monitoreo de los niveles de expresión de proteínas virales y ARN y el efecto citopático (ECP) en las células infectadas (Fig. 1); se observó una liberación viral tan temprana como 4 hpi, observándose 4 unidades log de virus, seguido de un aumento consistente de la replicación a 8 y 16 hpi (Fig. 1A). La replicación viral alcanzó su punto máximo a 16 hpi, y no se observó un aumento adicional de los La expresión vírica capsid siguió un patrón similar, siendo detectada proteína a 8 hpi y plastificación de expresión a 16 hpi (Fig. 1B). Entre las células U87MG infectadas, se observó una EPC significativa por microscopía a 24 hpi, con poca o ninguna EPC detectada a 16 hpi (datos no mostrados). De acuerdo con estas observaciones, se observó un aumento de la actividad de la caspasa 3/7 sólo a 24 hpi (Fig. 1C). Sobre la base de estos datos, los tiempos de 4, 8 y 16 hpi, reflejando las etapas tempranas, medias y tardías del ciclo de vida viral, respectivamente, fueron seleccionados para el análisis de ARN-Seq para proporcionar una visión dinámica del perfil del transcriptoma host-patógeno. Análisis de secuenciación de ARN de los astrocitos infectados por VEEV. Se aisló el ARNm de conjuntos triplicados de cultivos de células U87MG infectados con simulacros y VEEV, se purificó a 4, 8 y 16 hpi, y se utilizó para preparar bibliotecas de ARNc para ARN-Seq aguas abajo (ver Materiales y Métodos). En la Tabla 1 se muestra un resumen de alto nivel de los resultados de ARN-Seq. Las muestras de ARN VEEV fueron analizadas por RT-PCR cuantitativo en cada momento como un control para demostrar el aumento de la carga de ARN viral a lo largo del tiempo (Fig. 1D), consistente con el aumento del número de lecturas de ARN-Seq cartografiadas al genoma VEEV en puntos posteriores (Tabla 1). Para el análisis de ARN-Seq, los genes individuales se expresaron como el número de lecturas por kilobase del modelo de exón por millón En la figura 2A se muestran los valores de expresión RPKM normalizados para cada muestra experimental y se pueden encontrar en el conjunto de datos S1 del material suplementario. La variación mínima de la muestra a la muestra en los valores de expresión dentro de las réplicas biológicas fue detectada constantemente (R 2 0,89 para todas las réplicas; datos no mostrados). Además, también se encontró que la variación de la intersample era mínima cuando se probó por pares a lo largo de todo el experimento utilizando los valores RPKM para los ARN de control de pico sintético ERCC97 (R 2 0,90 para todas las comparaciones; datos no mostrados). Como era de esperar, el análisis de dos componentes principales de los datos ARN-Seq para las células infectadas por simulacro de células frente a las infectadas por VEEV mostró una separación clara de las muestras a 16 hpi de las muestras en puntos Sin embargo, el agrupamiento de muestras infectadas por VVEV con muestras simuladas infectadas en puntos de tiempo anteriores sugiere que la respuesta a la infección viral se limitó a un estrecho subconjunto de genes de respuesta temprana, lo que supone una mayor carga de prueba en la identificación de genes expresados diferencialmente (DEGs) durante las primeras horas de infección. En este sentido, se utilizaron dos métodos ortogonales para identificar DEGs adecuados para una caracterización adicional: el método edgeR (21) y el método desarrollado por Baggerly et al. (22). Los genes identificados por un método se consideraron provisionalmente DEGs, y los identificados por ambos métodos eran DEGs candidatos a ser confirmados por qRT-PCR. Además de comparar los valores individuales de expresión génica para las células infectadas simuladamente y las células infectadas por VEEV en cada momento, también se compararon los valores de expresión génica en serie dentro de cada serie temporal de células infectadas por VEEV para los genes que no mostraron cambios estadísticamente significativos en la expresión en células infectadas simuladamente. Un esquema del análisis comparativo se muestra en la figura 2C. El número de DEGs estadísticamente significativos identificados por cada una de estas comparaciones se muestra en la figura 2D. Además, se utilizó el agrupamiento de k-medias (contra los valores normalizados de RPKM) para identificar cambios brutos en la expresión génica a lo largo del tiempo para cohortes de genes que potencialmente comparten la misma vía o desencadenantes reguladores (fig. 3 ; véase también Conjunto de datos S2 en el material suplementario). Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA; véase Material y Métodos En particular, el clúster 20 (tabla 2) se enriqueció significativamente para los genes involucrados en el control traslacional, la vía de señalización mediada por interferón tipo I y la vía de respuesta a proteínas desplegadas (valor P de GSEA 0,01). Aunque existe una conexión bien establecida entre el control traslacional y la EPU, una nueva conexión entre la EPU y la respuesta mediada por interferón tipo I en respuesta a la replicación viral fue sugerida por el análisis de la vía (ver Materiales y Métodos), implicando la respuesta al crecimiento temprano 1 (EGR1) como un puente potencial entre estas dos vías (Fig. 4). La EGR1 pertenece al clúster 20 y es fuertemente inducida durante la infección por VEEV, y varios otros genes asociados con la respuesta al interferón pertenecen al mismo clúster: IRF1, IFIT1, IFIT2, ISG15 e ILF3. EGR1 se ha asociado con aumentos en la expresión de activar el factor de transcripción 3 (ATF3) (28), que es un componente clave de la UPR y que también pertenece al clúster 20. Esta conexión representó un potencial a Anotaciones del proceso biológico obtenidas de Reactome para el clúster 20. Los identificadores de anotación del reactoma están indicados para cada anotación. Sólo se consideran anotaciones clasificadas por autor rastreable (TAS). TAP, transportador asociado con el procesamiento de antígenos; SRP, partícula de reconocimiento de señales. b Conjunto completo, el número total de genes en el genoma con un proceso biológico anotado; subconjunto, número total de genes expresados diferencialmente con un proceso biológico anotado. Red de genes relacionados con la respuesta del interferón tipo I y UPR. Círculos grandes, genes diferencialmente expresados; círculos pequeños, genes sin cambio significativo de expresión; círculos rojos, factores de respuesta tipo I al interferón; círculos amarillos, genes que regulan la transcripción del ADN; círculos azules, genes de respuesta a proteínas desplegadas; líneas rojas, genes involucrados en interacciones físicas proteína-proteína; líneas azules, genes involucrados en una vía común. Esta red fue sembrada con grupos k-medias 18 y 20, y muchos genes de proteína ribosómica fueron removidos. puente entre la vía UPR y la vía de respuesta al interferón, siendo EGR1 uno de los factores clave potenciales de transcripción que impulsan esta conexión. En consecuencia, se seleccionaron 15 genes de este análisis para su posterior caracterización por qRT-PCR (ver abajo): ATF3, activando el factor de transcripción 4 (ATF4), CEBPB, CEBPD, DDIT3/CHOP, EGR1, FOS, IFI6, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG15, ISG20, JUN y OASL. Los valores de expresión de estos genes, medidos por ARN-Seq, se muestran en la Fig. 5A y B. El análisis confirmatorio qRT-PCR indicó expresión génica concordante (fig. 5C y D). Los genes de respuesta al interferón inducidos están de acuerdo con los detectados en estudios previamente publicados (11, 29, 30) y estos genes sirvieron como control positivo interno. Además, se ha demostrado el vínculo entre la EGR1 y la vía del interferón; la EGR1 es inducida por IFN-® en fibroblastos de ratón y por IFN-®, -, y -® en fibroblastos humanos (31, 32). La EGR1 y la vía UPR fueron seleccionadas para su posterior análisis, ya que su papel en la infección por VEEV no ha sido elucidado. Los datos de análisis del ARN-Seq y la vía indicaron que los genes de respuesta al estrés y la UPR fueron inducidos después de la infección por VEEV. Durante una infección, las células anfitrionas responden al estrés celular resultante de una mayor traducción de proteínas virales y secreción al desencadenar el inicio de la vía de la UPR. La vía de la UPR es una respuesta celular adaptativa activada por el estrés del retículo endoplasmático (ER Con el fin de regular la homeostasis celular durante el plegado y la secreción de proteínas, la vía UPR ha desarrollado tres clases de sensores para asegurar la correcta regulación celular: la enzima inositolrequiriendo 1 (IRE1), la proteína cinasa ARN-como la ER cinasa (PERK), y activar el factor de transcripción 6 (ATF6) (33, 34). Durante la infección por VEEV, el brazo PERK de la UPR pareció estar alterado, ya que dos reguladores críticos de esta vía se expresaron diferencialmente: ATF4 y CHOP (DDIT3) (35). Para determinar si los DEGs alteraron la expresión proteica posterior, se realizó un análisis de manchas occidentales para CHOP, ATF4 y eIF2 fosforilado (p-eIF2). Tunicamicina, un inhibidor de la glucosilación Un análisis del curso del tiempo de las células U87MG tratadas con 1 M de tunicamicina indicó que 8 h de tratamiento proporcionaban la inducción más robusta de proteínas UPR (datos no mostrados). Las células VVEV infectadas pero no infectadas simuladamente o inactivadas por UV VVEV (UV-VEEV) mostraron un aumento espectacular en la expresión p-eIF2 + y un aumento modesto pero consistente en la expresión CHOP y ATF4 a 16 hpi (Fig. 6A). No se observó ningún cambio en la expresión proteica a 4 hpi (datos no mostrados). La microscopía confocal confirmó la regulación de CHOP y ATF4, demostrando un patrón de tinción más robusto y nuclear en las células infectadas por VVEV que en las células infectadas simuladas (Fig. 6C a E). Mientras que los niveles de expresión proteica Estos resultados son consistentes con la observación de que la expresión ATF4 está regulada a nivel traslacional en la inducción EPU (37). Como eIF2® puede ser fosforilada por múltiples cinasas (PERK, proteína cinasa ARN dependiente de doble cadena [PKR], control general no derrepresivo-2 [GCN2] e inhibidor hemeregulado [HRI]) (38), el inhibidor de PERK (PERKi) GSK2606414 fue utilizado para determinar si la fosforilación observada era dependiente de PERK. El tratamiento de las células infectadas por VEEV con PERKi dio lugar a una marcada disminución de la fosforilación eIF2® (Fig. 6B). Estos resultados indican que PERK contribuye a la fosforilación eIF2® pero que es probable que haya una quinasa adicional que contribuya al evento de fosforilación En conjunto, estos hallazgos indican que el brazo de PERK de la vía UPR se induce en puntos de tiempo posteriores a la infección por VVEV. EGR1 se regula en células infectadas y se localiza en el núcleo. EGR1 es un factor de transcripción que puede ser inducido por numerosas señales, incluyendo estrés oxidativo, hipoxemia y factores de crecimiento (39, 40). También se puede activar sobre la infección por virus de ADN y ARN, incluyendo virus Epstein-Barr, virus de hepatitis ratón, coronavirus murino y virus de encefalitis japonesa (41) (42) (43). El tratamiento de MEFs con el activador UPR thapsigargin se ha demostrado que induce la expresión EGR1 de una manera dependiente de PERK (44). Dado el vínculo entre EGR1 y UPR y la inducción robusta de EGR1 expresión mRNA después de la infección por VVE 4 y 5), se eligió EGR1 para un estudio posterior. La expresión proteica EGR1 después de la infección por VEEV fue analizada por el análisis de Western blot. Como estudios previos han indicado que EGR1 puede ser activado por el virus de la hepatitis del ratón independientemente de la replicación del virus (probablemente debido a la interrupción de la membrana celular después de la entrada) (41), se incluyó un control del virus inactivado por UV (VVVEV). Los niveles de proteína EGR1 se incrementaron después de la infección por VEEV en comparación con los niveles de células infecciosas simuladas y células infectadas por UV-VEEV (fig. 7A; compare los carriles 3, 6 y 9 ). La regulación más dramática de EGR1 se produjo a 16 hpi; esto se correlaciona con los niveles más altos de producción de VEEV capsid (fig. 1B Tras la inducción, se ha demostrado que la EGR1 se transloca al núcleo para inducir la expresión génica a través de la unión a la secuencia de unión de Egr (EBS) [GCG(G/T)GGCG] (40, 45). La microcopia confocal reveló altos niveles de EGR1 en los núcleos de células infectadas, mientras que sólo se detectaron bajos niveles de EGR1 tanto nucleares como citoplasmáticos en células simuladas (Fig. 7B). El tratamiento PERKi de células infectadas con VEEV resultó en una pérdida completa de inducción EGR1 (Fig. 7C), indicando que la EGR1 fue inducida de manera dependiente de PERK. Estos resultados demuestran que los niveles de proteína EGR1 y la localización nuclear se incrementan después de la infección por VEEV y que la inducción de EGR1 es dependiente La pérdida de EGR1 inhibe la apoptosis inducida por el VEEV pero no altera la cinética de la replicación del VEEV. Como EGR1 influye en la supervivencia celular y la apoptosis (46), se evaluó el impacto del EGR1 en la muerte celular inducida por el VEEV. Se observó escisión de Caspasa 3 en MEFs WT a 24 hpi cuando se infectaron con un MOI de 0,5 y comenzaron tan pronto como 16 hpi cuando se infectaron con un MOI de 5 (Fig. 8A ). En contraste, las células EGR1 / mostraron poco o ningún escisión de caspasa detectable tras la infección con el VEEV. Se realizaron dos conjuntos de experimentos para confirmar cuantitativamente estos resultados: ensayos de CellTiter Glo para medir la viabilidad celular total (producción de ATP) y Caspasa 3/7 Tanto WT como EGR1 / MEF mostraron disminuciones dosis-dependientes en la viabilidad celular después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que tenían células significativamente más viables en cada MOI examinadas (Fig. 8B). Concordantemente, se observó un aumento dosis-dependiente en la actividad de caspasa 3/7 después de la infección por VEEV, con células EGR1 / que demostraban una actividad reducida de caspasa 3 en los MOIs de 0,5 y 5 (Fig. 8C). Estos resultados se replicaron en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1 (Fig. 8D). EGR1 ha demostrado regular negativamente la transcripción de BIRC5 (Survivina), un inhibidor de la apoptosis (IAP) miembro de la familia (47). Los datos de ARN-Seq indicaron que la expresión del gen BIRC5 disminuyó después de la infección por VVEV: log 2 -transformado de los valores de cambio del pliegue de la expresión génica normalizada fueron 1,16, 1,18, y 1,50 a 4, 8, y 16 hpi, respectivamente (ver Tabla S1 en el material suplementario y NBI BioProject número de adhesión PRJNA300864). Se utilizaron WT y EGR1 / MEFs para determinar si EGR1 influyó en la expresión del gen BIRC5 después de la infección por VVEV. La expresión BIRC5 disminuyó significativamente a 16 hpi en los MEFs infectados por VVEV, pero esta reducción no se observó en los MEFs infectados por VVEV1 / (Fig. 8E). La expresión del gen para el inhibidor de la apoptosis (XIAP), otro miembro de la familia IAP, no fue significativamente alterada después de la infección (datos no mostrados). Colectivamente, estos resultados demuestran que EGR1 contribuye a la apoptosis inducida por VEEV. Se determinó la cinética de replicación VEEV tanto para EGR1 / como para WT MEFs para determinar la relevancia de EGR1 en la replicación viral.Las células fueron infectadas en dos MOIs diferentes (0,5 y 5), y los sobrenadantes virales fueron recolectados en 4, 8, 16 y 24 hpi y analizados mediante análisis de placa.La cinética de replicación fue similar entre EGR1 / y WT MEFs en ambos MOIs, con títulos que alcanzaron un máximo de 16 hpi (fig. 9A). 9B). Estos resultados fueron replicados en células U87MG transfectadas con siRNA dirigida a EGR1. La transfección de siRNA dirigida a EGR1 resultó en una disminución del 90% en la expresión proteica EGR1 (Fig. 9D ) sin ningún efecto significativo en la replicación viral (Fig. 9C). Estos resultados sugieren que la disminución de la apoptosis observada en EGR1 / MEFs no se debió a la cinética de replicación VEEV alterada. A pesar de ser reconocida como una amenaza emergente, relativamente poco se sabe sobre los mecanismos de virulencia de los alfavirus, en gran parte debido a una brecha de conocimiento en el interactoroma host-patógeno. La infección por VEV a menudo resulta en encefalitis fatal y se sabe que inhibe tanto la transcripción celular como la traducción para reducir la En contraste, en el VVEE del SNC se ha demostrado que upregula numerosos genes tanto en la respuesta inflamatoria como en las vías apoptóticas (1, 48). Específicamente, numerosas citocinas proinflamatorias, incluyendo interleu-kin-1 (IL-1), IL-6, IL-12, glucógeno sintasa cinasa 3, oxido nítrico inducible sintasa, y factor de necrosis tumoral alfa (TNF- Con este fin, la identificación de transcripciones críticas expresadas de forma diferencial entre células infectadas clínicamente relevantes ayudará a una mayor comprensión de la patogénesis viral y puede resultar beneficiosa para la identificación de objetivos terapéuticos. En este estudio, los datos de análisis de red/ARN-Seq y los resultados de estudios de expresión proteica revelaron que la infección por VEEV resultó en la activación del brazo PERK de la vía EPU, incluyendo la activación de ATF4, CHOP y eIF2-fosforilación. Varios alfavirus han sido reportados previamente para secuestrar componentes clave de la vía EPU con el fin de promover la replicación viral, ya que la dependencia de virus envueltos en la ER para la síntesis de glucoproteínas virales asociadas a la envoltura y su transporte a la membrana plasmática a menudo enfatiza la ER debido a la rápida producción de proteínas virales (54, 55). La modulación de la UPR no es exclusiva de los alfavirus; más bien, es un rasgo compartido de muchos virus de ARN de sentido positivo. El virus del dengue ha demostrado suprimir PERK al inhibir la fosforilación continua de eIF2 para inhibir la apoptosis inmediata, aumentando la traducción de proteínas virales y ampliando la duración de la replicación viral productiva (34). Estudios con el virus de la hepatitis E (HEV) han demostrado que la expresión de la proteína capsid del HEV marco abierto de lectura 2 (ORF2) activa la expresión de CHOP y ATF4 (56). En el HEV, ORF2 se demostró estimular CHOP a través de estresadores de ER y elementos de respuesta aminoácidos (AARE) a través de la interacción con ATF4 (56). Los resultados mostrados aquí indican que durante la Durante la detección inicial del estrés ER, PERK es capaz de identificar proteínas mal plegadas en el lumen de la ER y fosforilatos eIF2® con el fin de iniciar las vías de prosurvival en la UPR a través de la actividad general En 24 hpi caspasa 3/7 se analizó la actividad utilizando el ensayo Caspasa 3/7 Glo. Los valores de cambio de pliegue para células simuladas se fijaron en un valor de 1. **, P 0.001. (E) EGR1 / y WT MEFs fueron simulados o VEEV infectados (MOI, 5). El ARN fue preparado, y la expresión genética fue determinada por qRT-PCR utilizando un ensayo TaqMan para BIRC5 (Survivin). Los datos mostrados son los valores del cambio de pliegue de la expresión génica normalizada determinado por el ciclo del umbral T *, P 0,005 (comparación de las células WT infectadas por VEEV y EGR1 /). Inhibición de la síntesis proteica (33, 34). VEEV parece inducir la UPR y promover el aumento de la fosforilación eIF2, que resulta en la inhibición traslacional de la mayoría de los ARNm, mientras que UPR aumenta selectivamente la traducción de ATF4. ATF4 es responsable de la expresión de genes que codifican proteínas involucradas en apoptosis, procesos redox, metabolismo de aminoácidos y reclutamiento de chaperona ER y es un conocido mediador de la vía PERK y CHOP (33, 34). La activación CHOP facilita la expresión aumentada de chaperonas celulares para contrarrestar la acumulación de proteínas mal dobladas (57). La falta de supresión del plegado de proteínas en células persistentemente estresadas, como durante una infección viral, puede resultar en la activación del factor de transcripción proapoptótico CHOP, lo que conduce a la supresión del linfoma de células antiapoptóticas de proteína B-2 (Bcl-2). CHOP también puede funcionar como factor de transcripción prosurvival al desfosforilar eIF2® a través de la activación de la proteína DNA dañado-inducible (GADD34) en un aspecto de retroalimentación autorreguladora (33, 34). Sin embargo, los datos presentados aquí apoyan un modelo por el cual la infección VEEV lleva a CHOP a funcionar en su papel proapoptótico, ya que no se detectó ningún cambio en la expresión génica de GADD34 por el análisis de ARN-Seq. Si bien la UPR fue inducida después de la infección VEEV, Esto es algo sorprendente, ya que se espera que la infección por VVEV induzca un estrés ER significativo debido a la producción masiva de proteínas virales durante el curso de una infección aguda robusta. Las proteínas estructurales del VVEV se traducen del ARN subgenómico viral en poliproteínas en la ER áspera. Las glucoproteínas precur-sor E1 y pE2 se ensamblan como heterodímeros en la ER, experimentando cambios conformacionales que requieren numerosas chaperonas (1, 58). Es posible que el VVEV haya desarrollado mecanismos para subvertir la inducción de la UPR. Para contrarrestar la UPR, las proteínas no estructurales (nsPs) del virus Chikungunya (CHIKV) han demostrado inhibir la expresión de ATF4 y otros genes objetivo conocidos de la UPR, incluyendo GRP78/BiP, GRP94 A través de la actividad nsP, CHIKV ha desarrollado un medio de suprimir la actividad UPR resultante del estrés ER inducido por la glucoproteína viral, evitando así la autofagia inmediata y la activación apoptótica. El capsid VEEV es responsable de interferir con el tráfico nucleocitoplasmático e inhibir la transcripción del ARNr y del ARNm y ha sido implicado en la regulación de la señal de tipo I IFN y la respuesta antiviral mediante la regulación de la producción de ARN viral y proteínas (1, 48, 60). Por lo tanto, hipotetizamos que la capacidad del capsid VEEV para inhibir la transcripción celular y el tráfico de bloqueo nucleocitoplasmático resulta en la inducción retarda de la UPR. Los resultados de un análisis detallado de la red basado en los datos existentes en la literatura, junto con los perfiles de expresión génica temporal obtenidos de este estudio, apuntan a que el EGR1 es un nodo importante en el nuevo vínculo entre la activación del VEEV de la respuesta de interferón tipo I y la UPR. Se sabe que el EGR1 forma un complejo de unión al ADN con C/EBPB, socio crítico de la dimerización de CHOP (61). Estudios anteriores han demostrado que la localización nuclear del CHOP puede actuar como inductor del EGR1 y que el CHOP puede actuar como cofactor transcripcional para la regulación de los genes objetivo del C/EBPB-EGR1 (61). Los resultados del análisis de la mancha occidental y la microscopía presentados en este estudio apoyan este modelo, ya que se encontró que la infección por VEV aumenta tanto los niveles generales como la distribución nuclear Los estudios anteriores demostraron la inducción de ARNm EGR1 por IFN-â en fibroblastos de ratón y por TNF-â, TNF-â, IL-1, IFN-â, IFN-â e IFN-â en fibroblastos humanos (31, 32). EGR1, también conocido como Zif268 y NGF1-A, es una proteína de dedo de zinc y factor de transcripción mamífero. Se ha implicado en la proliferación y diferenciación celular, pero también puede tener funciones proapoptóticas, dependiendo del tipo celular y el estímulo (62). De particular interés, EGR1 controla directamente la proliferación cuando se activa por la proteína quinasa activada por mitogen/vía cinasa regulada por señales extracelulares en astrocitos estimulados por mitogen (63). Se han observado cambios inducidos por virus en la expresión EGR1 En los astrocitos infectados por VIH-1, se encontró que la regulación de la EGR1 fue inducida por Tat a través de la transactivación del promotor de la EGR1, lo que llevó a la disfunción celular y a la neurotoxicidad inducida por Tat (64). También se ha demostrado que el aumento de las cantidades de ARNm EGR1 actúa de una manera específica de la región, correspondiendo temporalmente con la producción de ARN viral en los tejidos cerebrales de ratas infectadas por el virus de la rabia o el virus de la enfermedad de Borna (65). En resumen, el estudio actual demuestra un vínculo potencial entre la activación de la EPU y la EGR1. Hasta la fecha, los mecanismos subyacentes a la patogénesis del VEEV y la degeneración neuronal subsiguiente han sido sólo parcialmente elucidados, por lo que determinar el papel de la EGR1 y la UPR puede jugar un papel significativo en el desarrollo de una nueva diana terapéutica que resulte en una disminución de la muerte neuronal y las secuelas neuronales posteriores que resultan de la infección.

¿Qué es EGR1?

La resiliencia de los huéspedes a los coronavirus emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7079962/SHA: f7cfc37ea164f16393d7f4f3f2b32214dea1ded4Autores: Jamieson, Amanda MDate: 2016-07-01DOI: 10.2217/fvl-2016-0060Licencia: cc-byAbstract: Recientemente, dos coronavirus, el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio, han surgido para causar enfermedades respiratorias inusualmente graves en los seres humanos. Actualmente, hay una falta de opciones eficaces de tratamiento antiviral o vacunas disponibles. Dada la gravedad de estos brotes, y la posibilidad de que surjan coronavirus zoonóticos adicionales en el futuro cercano, es necesario explorar La resiliencia de la enfermedad es la capacidad de un huésped determinado para tolerar una infección y volver a un estado de salud. Esta revisión se centra en explorar varios mecanismos de resiliencia del huésped que podrían ser explotados para el tratamiento del coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave, el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio y otros virus respiratorios que causan lesiones pulmonares agudas y síndrome de dificultad respiratoria aguda. Texto: El siglo XXI fue anunciado con la aparición de dos nuevos coronavirus (CoV) que tienen una patogenicidad y mortalidad inusualmente altas [1] [2] [3] [5] [5]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-Cov) fue identificado por primera vez en 2003 [6] [7] [8] [9]. Aunque inicialmente hubo gran preocupación por el SARS-CoV, una vez que no surgieron nuevos casos, la financiación y la investigación disminuyeron. Sin embargo, una década más tarde el síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV), también conocido Si bien el SARS-CoV no está tan extendido como el SARS-CoV, parece tener una tasa de mortalidad aún más alta, con un 35-50% de las infecciones diagnosticadas resultando en la muerte [3, [12] [13]. Estos virus letales del betacoravirus existían en depósitos de animales [4] [5] 9, [14] [15]. Recientemente, se han detectado otros virus de la CoV en poblaciones animales, lo que aumenta la posibilidad de que veamos una repetición de estos tipos de brotes en un futuro próximo [11, [16] [17] [18] [20]. Ambos virus zoonóticos causan una enfermedad mucho más grave que la que se ve típicamente para los CoVs, convirtiéndolas en un problema de salud mundial. Muchos pacientes infectados presentan lesión pulmonar aguda (AI), condición que se diagnostica en base a la presencia de edema pulmonar e insuficiencia respiratoria sin causa cardiaca. En algunos pacientes hay una progresión a la forma más grave de ALI, síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) [21] [22] [23]. Para sobrevivir a una infección dada, un huésped exitoso no sólo debe ser capaz de limpiar el patógeno, sino tolerar el daño causado por el propio patógeno y también por la respuesta inmune del huésped [24] [26]. Nos referimos a la resiliencia como la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de los patógenos y la respuesta inmune a los patógenos. Un huésped resistente es capaz de volver a un estado de salud después de responder a una infección [24, [27] [28]. La mayoría de las opciones de tratamiento disponibles actualmente para las enfermedades infecciosas son los antimicrobianos, Para pedidos de reimpresión, por favor contacte: reprints@futuremedicine.com REVIEW Jamieson futuro grupo científico y así dirigir el patógeno mismo. Dado el daño que los patógenos pueden causar este enfoque en el aclaramiento rápido de patógenos es comprensible. Sin embargo, una intervención médica igualmente importante es aumentar la capacidad del huésped para tolerar los efectos directos e indirectos del patógeno, y este es un área que está empezando a explorarse [29]. Daño al epitelio pulmonar por patógenos respiratorios es una causa común de disminución de la resiliencia [30] [31] [32]. Esta revisión explora algunas de las probables vías de resiliencia del huésped a las infecciones virales, con un enfoque especial en los coronavirus emergentes. También examinaremos los factores que hacen que algunos pacientes tolerantes a la enfermedad y otros pacientes menos tolerantes Estos factores pueden servir de guía para nuevas terapias potenciales para mejorar el cuidado del paciente. Tanto el SARS-CoV como el MERS-CoV se caracterizan por una rápida progresión a la SDRA, sin embargo, hay algunas diferencias diferenciadas en la infectividad y patogenicidad. Los dos virus tienen diferentes receptores que conducen a diferentes tropismo celular, y el SARS-CoV es más ubicuo en el tipo de célula y especie que puede infectar. El SARS-CoV utiliza el receptor ACE2 para obtener entrada a las células, mientras que el MERS-CoV utiliza la ectopeptidasa DPP4 [33] [34] [35]. A diferencia de la infección por SARS-CoV, que causa principalmente un síndrome respiratorio grave, la infección por MERS-CoV también puede conducir a insuficiencia renal [37, 38]. El SARS-CoV también se disemina más rápidamente entre los huéspedes, mientras que el MERS-CoV se ha contenido más fácilmente, pero no está claro si esto se debe a las poblaciones y regiones de pacientes afectados [3] [4] 39 ]. Dado que el MERS-CoV es un virus descubierto muy recientemente, [40, 41] se ha realizado más investigación sobre el SARS-CoV. Sin embargo, dadas las similitudes se espera que algunos de estos hallazgos también puedan aplicarse a los CORRS-CoV, y otros potenciales coronavirus zoonóticos emergentes. Ambas infecciones virales provocan una respuesta inflamatoria muy fuerte, y también son capaces de eludir la respuesta inmunitaria. Parece haber varias maneras en que estos virus evaden y redirijan de otro modo la respuesta inmune [1, [42] [43] [44] [45]. Las vías que conducen a la inducción de la respuesta al interferón antiviral tipo I (IFN) son El SARS-CoV y el MERS-CoV están contenidos en vesículas de doble membrana (VMD), que impiden la detección de su genoma [1, 46]. Al igual que la mayoría de los coronavirus, varias proteínas virales suprimen la respuesta IFN de tipo I, y otros aspectos de la inmunidad antiviral innata [47]. Estas alteraciones de la respuesta IFN de tipo I parecen desempeñar un papel en la inmunopatología de más de una manera. En pacientes con títulos virales iniciales altos hay un pronóstico pobre [39, 48]. Esto indica que la reducción de la respuesta antiviral puede conducir a una patología inducida directa por virus. También hay evidencia de que la respuesta IFN de tipo I retardadada puede conducir a una mala regulación de la respuesta inmune que puede causar inmunopatología. El retraso de esta potente respuesta antiviral conduce a una disminución del aclaramiento viral, al mismo tiempo que se produce un aumento de las células inflamatorias del sistema inmunitario que causan una inmunopatología excesiva [49]. En este caso, la respuesta antiviral retardada no sólo causa inmunopatología, sino que también no controla adecuadamente la replicación viral. Si bien se necesita más investigación, parece que el MERS tiene un efecto similar en la respuesta inmune innata [5, 50]. Las opciones actuales de tratamiento y prevención para el SARS-CoV y el MERS-CoV son limitadas. Hasta ahora no hay vacunas autorizadas para el SAR-CoV o el MERS-CoV, aunque se han probado varias estrategias en modelos animales [51, 52]. Tampoco existen estrategias antivirales que sean claramente eficaces en ensayos controlados. Durante los brotes se han probado empíricamente varias estrategias antivirales, pero estos estudios no Los principales antivirales utilizados fueron ribavirina, lopinavir y ritonavir [38, 53], que a menudo se utilizaron en combinación con el tratamiento con IFN [54]. Sin embargo, el análisis retrospectivo de estos datos no ha llevado a conclusiones claras de la eficacia de estas opciones de tratamiento. La investigación en esta área todavía está en curso y se espera que pronto tengamos estrategias eficaces para tratar la nueva CoV [3,36,38,40, [55] [57] [58] [60] [61] [62] [63] [64]. La falta de antivirales eficaces hace necesario examinar otros tratamientos potenciales para el SARS-CoV y el MERS-CoV. Incluso si hubiera estrategias eficaces para disminuir la carga viral, para estos virus, el potencial de nuevas COV zoonóticas emergentes presenta complicaciones adicionales. Las vacunas no pueden producirse a tiempo para detener la propagación de un virus emergente. Además, como se demostró durante los brotes de SARS-CoV y MERS-CoV, siempre hay un desafío durante una situación de crisis para saber qué resistencia del huésped a los coronavirus emergentes REVIEW futuro grupo científico www.futuremedicine.com antiviral trabajará en un virus determinado. Un método para abordar esto es desarrollar antivirales de amplio espectro que se dirigen a características conservadas de una clase determinada de virus [65]. Sin embargo, dadas las rápidas tasas de mutación de virus hay varios desafíos a esta estrategia. Otro método es aumentar la capacidad de un paciente determinado para tolerar la enfermedad, es decir, los mecanismos de resistencia del huésped objetivo. Hasta ahora esto ha sido en gran medida en forma de atención de apoyo, que se basa en la ventilación mecánica y la oxigenación [29, 39, 66]. Sin embargo, muchos otros virus causan ALI y ARDS, incluyendo el virus influenza A (IAV). Al observar los datos de otros virus de alta patología, podemos extrapolar varias vías que podrían ser dirigidas durante la infección con estas COV emergentes. Esto puede aumentar nuestra comprensión de los mecanismos de resiliencia a las enfermedades que hemos aprendido de estudios directos de SARS-CoV y MERS-CoV. Una mayor comprensión de los mecanismos de resiliencia del huésped puede conducir a futuras terapias basadas en el huésped que podrían aumentar la supervivencia del paciente [29]. Un tema común que surge en muchos virus respiratorios, incluyendo SARS-CoV y MERS-CoV es que gran parte de la patología se debe a una respuesta inflamatoria excesiva. Un estudio de Josset et al. examina la respuesta del huésped celular a MERS-CoV y SARS-CoV, y descubrió que MERS-CoV disregula el transcriptoma del huésped en Se demuestra que los glucocorticoides pueden ser una forma potencial de alterar los cambios en el transcriptoma del huésped en momentos tardíos después de la infección. Si se mantienen las respuestas génicas del huésped esto puede aumentar la resiliencia de la enfermedad. Dada la enfermedad severa que se manifestó durante el brote del SARS-CoV, se probaron empíricamente muchas opciones de tratamiento diferentes en pacientes humanos. Un tratamiento inmunomodulador que se probó durante el brote del SARS-CoV fue corticosteroides sistémicos. Esto se probó con y sin el uso de IFN de tipo I y otras terapias que podrían dirigirse directamente al virus [68]. El análisis retrospectivo reveló que, cuando se administró en el momento correcto y a los pacientes apropiados, el uso de corticosteroides podría disminuir la mortalidad y también la duración de las estancias hospitalarias [68]. Aunque estos tratamientos no están sin complicaciones, y ha habido una falta de un ensayo controlado aleatorizado [5, 39]. Los corticosteroides son ampliamente inmunosupresores y tienen muchos efectos fisiológicos [5, 39]. Varios estudios recientes han sugerido que otros compuestos podrían ser útiles para aumentar la resistencia del huésped a las infecciones pulmonares virales. Un artículo reciente demuestra que la topoisomerasa I puede proteger contra la muerte inducida por la inflamación de una variedad de infecciones virales incluyendo IAV [70]. Bloqueo de C5a señalización complementaria también se ha sugerido como una posible opción para disminuir la inflamación durante la infección por VAI [71]. Otros inmunomoduladores incluyen celecoxib, mesalazina y eritorán [72, 73]. Otra clase de medicamentos que se han sugerido son las estatinas. Actúan para estabilizar la activación de aspectos de la respuesta inmune innata y prevenir la inflamación excesiva Sin embargo, la disminución de la inmunopatología por inmunomodulación es problemática porque puede conducir a un aumento de la carga de patógenos, aumentando así la patología inducida por virus [75, 76]. Otra opción potencial de tratamiento es el aumento de las vías de reparación tisular para aumentar la resiliencia del huésped a la enfermedad. Esto ha sido demostrado por la bioinformática [77], así como en varios modelos animales [30-31,78-79]. Estas terapias se han demostrado en sistemas de modelos de cultivo celular o modelos animales para ser eficaces, pero no se han demostrado en pacientes humanos. El momento correcto de los tratamientos es esencial. Se ha demostrado que la intervención temprana es la más eficaz en algunos casos, pero otras terapias funcionan mejor cuando se administran un poco más tarde durante el curso de la infección. Además de los efectos virales, y la patología causada por la respuesta inmunitaria, hay varias comorbilidades asociadas con el SARS-CoV y el MERS-CoV que conducen a resultados adversos. Curiosamente, estos factores de riesgo adicionales que conducen a una enfermedad más grave son diferentes entre los dos virus. No está claro si estas diferencias se deben a poblaciones distintas afectadas por los virus, debido a las propiedades del virus en sí, o ambos. Entender estos factores podría ser una clave para aumentar la resiliencia del huésped a las infecciones. Los pacientes con MERS-CoV tuvieron un aumento de morbilidad y mortalidad si eran obesos, inmunocomprometidos, diabéticos o tenían enfermedad cardíaca [4, 12]. REVIEW Jamieson futuro grupo científico Los factores de riesgo para los pacientes con SARS-CoV incluyeron una edad mayor y varones [39]. Los factores inmunológicos que aumentaron la mortalidad por SRAS-CoV fueron un recuento de neutrófilos más alto y un recuento de células T bajo [5, 39, 77]. Un factor que aumentó la enfermedad para los pacientes infectados con SRAS-CoV y MERS-CoV fue la infección por otros virus o bacterias [5, 39]. Esto es similar a lo que se ve con muchas otras infecciones respiratorias. Un estudio reciente que examinó las infecciones por malaria en modelos animales y pacientes humanos demostró que los huéspedes resistentes pueden predecirse [28]. Estudios clínicos han comenzado a correlacionar biomarcadores específicos con los resultados de enfermedades en pacientes con SDAA [80]. Al comprender los factores de riesgo de gravedad de la enfermedad, tal vez podamos predecir si un huésped puede ser no resistente y adaptar las opciones de tratamiento adecuadamente. Una ventaja clara de dirigir las vías de resiliencia del huésped es que estas terapias pueden utilizarse para tratar una variedad Además, no hay necesidad de desarrollar una vacuna o entender la susceptibilidad antiviral de un nuevo virus. Con este fin, es esencial entender por qué algunos pacientes o poblaciones de pacientes tienen una mayor susceptibilidad. Además, es esencial la necesidad de contar con buenos sistemas modelo para estudiar las respuestas a estos nuevos coronavirus emergentes. La investigación en ambos temas nos llevará a mejorar el tratamiento de los virus emergentes que causan ALI, como el SRAS-CoV y el MERS-CoV. El autor no tiene ninguna afiliación relevante ni participación financiera con ninguna organización o entidad con intereses financieros o conflicto financiero con el tema o materiales discutidos en el manuscrito. Esto incluye empleo, consultorías, honorarios, propiedad o opciones, testimonio de expertos, subvenciones o patentes recibidas o pendientes, o regalías. No se utilizó asistencia por escrito en la producción de este manuscrito. • El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio son coronavirus zoonóticos que causan lesión pulmonar aguda y síndrome de dificultad respiratoria aguda. • Los antivirales tienen efectos limitados en el curso de la infección con estos coronavirus. • Actualmente no existe ninguna vacuna para el coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave ni para el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio. • La resiliencia del huésped es la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de una infección y volver a un estado de salud. • Varias vías, incluido el control de la inflamación, el metabolismo y la reparación de tejidos, pueden estar dirigidas a aumentar la resiliencia del huésped. • El desafío futuro es dirigirse a las vías de resiliencia del huésped de tal manera que haya efectos limitados en las vías de aclaramiento de patógenos.

¿En qué familia de virus reside el SARS?

La resiliencia de los huéspedes a los coronavirus emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7079962/SHA: f7cfc37ea164f16393d7f4f3f2b32214dea1ded4Autores: Jamieson, Amanda MDate: 2016-07-01DOI: 10.2217/fvl-2016-0060Licencia: cc-byAbstract: Recientemente, dos coronavirus, el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio, han surgido para causar enfermedades respiratorias inusualmente graves en los seres humanos. Actualmente, hay una falta de opciones eficaces de tratamiento antiviral o vacunas disponibles. Dada la gravedad de estos brotes, y la posibilidad de que surjan coronavirus zoonóticos adicionales en el futuro cercano, es necesario explorar La resiliencia de la enfermedad es la capacidad de un huésped determinado para tolerar una infección y volver a un estado de salud. Esta revisión se centra en explorar varios mecanismos de resiliencia del huésped que podrían ser explotados para el tratamiento del coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave, el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio y otros virus respiratorios que causan lesiones pulmonares agudas y síndrome de dificultad respiratoria aguda. Texto: El siglo XXI fue anunciado con la aparición de dos nuevos coronavirus (CoV) que tienen una patogenicidad y mortalidad inusualmente altas [1] [2] [3] [5] [5]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-Cov) fue identificado por primera vez en 2003 [6] [7] [8] [9]. Aunque inicialmente hubo gran preocupación por el SARS-CoV, una vez que no surgieron nuevos casos, la financiación y la investigación disminuyeron. Sin embargo, una década más tarde el síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV), también conocido Si bien el SARS-CoV no está tan extendido como el SARS-CoV, parece tener una tasa de mortalidad aún más alta, con un 35-50% de las infecciones diagnosticadas resultando en la muerte [3, [12] [13]. Estos virus letales del betacoravirus existían en depósitos de animales [4] [5] 9, [14] [15]. Recientemente, se han detectado otros virus de la CoV en poblaciones animales, lo que aumenta la posibilidad de que veamos una repetición de estos tipos de brotes en un futuro próximo [11, [16] [17] [18] [20]. Ambos virus zoonóticos causan una enfermedad mucho más grave que la que se ve típicamente para los CoVs, convirtiéndolas en un problema de salud mundial. Muchos pacientes infectados presentan lesión pulmonar aguda (AI), condición que se diagnostica en base a la presencia de edema pulmonar e insuficiencia respiratoria sin causa cardiaca. En algunos pacientes hay una progresión a la forma más grave de ALI, síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) [21] [22] [23]. Para sobrevivir a una infección dada, un huésped exitoso no sólo debe ser capaz de limpiar el patógeno, sino tolerar el daño causado por el propio patógeno y también por la respuesta inmune del huésped [24] [26]. Nos referimos a la resiliencia como la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de los patógenos y la respuesta inmune a los patógenos. Un huésped resistente es capaz de volver a un estado de salud después de responder a una infección [24, [27] [28]. La mayoría de las opciones de tratamiento disponibles actualmente para las enfermedades infecciosas son los antimicrobianos, Para pedidos de reimpresión, por favor contacte: reprints@futuremedicine.com REVIEW Jamieson futuro grupo científico y así dirigir el patógeno mismo. Dado el daño que los patógenos pueden causar este enfoque en el aclaramiento rápido de patógenos es comprensible. Sin embargo, una intervención médica igualmente importante es aumentar la capacidad del huésped para tolerar los efectos directos e indirectos del patógeno, y este es un área que está empezando a explorarse [29]. Daño al epitelio pulmonar por patógenos respiratorios es una causa común de disminución de la resiliencia [30] [31] [32]. Esta revisión explora algunas de las probables vías de resiliencia del huésped a las infecciones virales, con un enfoque especial en los coronavirus emergentes. También examinaremos los factores que hacen que algunos pacientes tolerantes a la enfermedad y otros pacientes menos tolerantes Estos factores pueden servir de guía para nuevas terapias potenciales para mejorar el cuidado del paciente. Tanto el SARS-CoV como el MERS-CoV se caracterizan por una rápida progresión a la SDRA, sin embargo, hay algunas diferencias diferenciadas en la infectividad y patogenicidad. Los dos virus tienen diferentes receptores que conducen a diferentes tropismo celular, y el SARS-CoV es más ubicuo en el tipo de célula y especie que puede infectar. El SARS-CoV utiliza el receptor ACE2 para obtener entrada a las células, mientras que el MERS-CoV utiliza la ectopeptidasa DPP4 [33] [34] [35]. A diferencia de la infección por SARS-CoV, que causa principalmente un síndrome respiratorio grave, la infección por MERS-CoV también puede conducir a insuficiencia renal [37, 38]. El SARS-CoV también se disemina más rápidamente entre los huéspedes, mientras que el MERS-CoV se ha contenido más fácilmente, pero no está claro si esto se debe a las poblaciones y regiones de pacientes afectados [3] [4] 39 ]. Dado que el MERS-CoV es un virus descubierto muy recientemente, [40, 41] se ha realizado más investigación sobre el SARS-CoV. Sin embargo, dadas las similitudes se espera que algunos de estos hallazgos también puedan aplicarse a los CORRS-CoV, y otros potenciales coronavirus zoonóticos emergentes. Ambas infecciones virales provocan una respuesta inflamatoria muy fuerte, y también son capaces de eludir la respuesta inmunitaria. Parece haber varias maneras en que estos virus evaden y redirijan de otro modo la respuesta inmune [1, [42] [43] [44] [45]. Las vías que conducen a la inducción de la respuesta al interferón antiviral tipo I (IFN) son El SARS-CoV y el MERS-CoV están contenidos en vesículas de doble membrana (VMD), que impiden la detección de su genoma [1, 46]. Al igual que la mayoría de los coronavirus, varias proteínas virales suprimen la respuesta IFN de tipo I, y otros aspectos de la inmunidad antiviral innata [47]. Estas alteraciones de la respuesta IFN de tipo I parecen desempeñar un papel en la inmunopatología de más de una manera. En pacientes con títulos virales iniciales altos hay un pronóstico pobre [39, 48]. Esto indica que la reducción de la respuesta antiviral puede conducir a una patología inducida directa por virus. También hay evidencia de que la respuesta IFN de tipo I retardadada puede conducir a una mala regulación de la respuesta inmune que puede causar inmunopatología. El retraso de esta potente respuesta antiviral conduce a una disminución del aclaramiento viral, al mismo tiempo que se produce un aumento de las células inflamatorias del sistema inmunitario que causan una inmunopatología excesiva [49]. En este caso, la respuesta antiviral retardada no sólo causa inmunopatología, sino que también no controla adecuadamente la replicación viral. Si bien se necesita más investigación, parece que el MERS tiene un efecto similar en la respuesta inmune innata [5, 50]. Las opciones actuales de tratamiento y prevención para el SARS-CoV y el MERS-CoV son limitadas. Hasta ahora no hay vacunas autorizadas para el SAR-CoV o el MERS-CoV, aunque se han probado varias estrategias en modelos animales [51, 52]. Tampoco existen estrategias antivirales que sean claramente eficaces en ensayos controlados. Durante los brotes se han probado empíricamente varias estrategias antivirales, pero estos estudios no Los principales antivirales utilizados fueron ribavirina, lopinavir y ritonavir [38, 53], que a menudo se utilizaron en combinación con el tratamiento con IFN [54]. Sin embargo, el análisis retrospectivo de estos datos no ha llevado a conclusiones claras de la eficacia de estas opciones de tratamiento. La investigación en esta área todavía está en curso y se espera que pronto tengamos estrategias eficaces para tratar la nueva CoV [3,36,38,40, [55] [57] [58] [60] [61] [62] [63] [64]. La falta de antivirales eficaces hace necesario examinar otros tratamientos potenciales para el SARS-CoV y el MERS-CoV. Incluso si hubiera estrategias eficaces para disminuir la carga viral, para estos virus, el potencial de nuevas COV zoonóticas emergentes presenta complicaciones adicionales. Las vacunas no pueden producirse a tiempo para detener la propagación de un virus emergente. Además, como se demostró durante los brotes de SARS-CoV y MERS-CoV, siempre hay un desafío durante una situación de crisis para saber qué resistencia del huésped a los coronavirus emergentes REVIEW futuro grupo científico www.futuremedicine.com antiviral trabajará en un virus determinado. Un método para abordar esto es desarrollar antivirales de amplio espectro que se dirigen a características conservadas de una clase determinada de virus [65]. Sin embargo, dadas las rápidas tasas de mutación de virus hay varios desafíos a esta estrategia. Otro método es aumentar la capacidad de un paciente determinado para tolerar la enfermedad, es decir, los mecanismos de resistencia del huésped objetivo. Hasta ahora esto ha sido en gran medida en forma de atención de apoyo, que se basa en la ventilación mecánica y la oxigenación [29, 39, 66]. Sin embargo, muchos otros virus causan ALI y ARDS, incluyendo el virus influenza A (IAV). Al observar los datos de otros virus de alta patología, podemos extrapolar varias vías que podrían ser dirigidas durante la infección con estas COV emergentes. Esto puede aumentar nuestra comprensión de los mecanismos de resiliencia a las enfermedades que hemos aprendido de estudios directos de SARS-CoV y MERS-CoV. Una mayor comprensión de los mecanismos de resiliencia del huésped puede conducir a futuras terapias basadas en el huésped que podrían aumentar la supervivencia del paciente [29]. Un tema común que surge en muchos virus respiratorios, incluyendo SARS-CoV y MERS-CoV es que gran parte de la patología se debe a una respuesta inflamatoria excesiva. Un estudio de Josset et al. examina la respuesta del huésped celular a MERS-CoV y SARS-CoV, y descubrió que MERS-CoV disregula el transcriptoma del huésped en Se demuestra que los glucocorticoides pueden ser una forma potencial de alterar los cambios en el transcriptoma del huésped en momentos tardíos después de la infección. Si se mantienen las respuestas génicas del huésped esto puede aumentar la resiliencia de la enfermedad. Dada la enfermedad severa que se manifestó durante el brote del SARS-CoV, se probaron empíricamente muchas opciones de tratamiento diferentes en pacientes humanos. Un tratamiento inmunomodulador que se probó durante el brote del SARS-CoV fue corticosteroides sistémicos. Esto se probó con y sin el uso de IFN de tipo I y otras terapias que podrían dirigirse directamente al virus [68]. El análisis retrospectivo reveló que, cuando se administró en el momento correcto y a los pacientes apropiados, el uso de corticosteroides podría disminuir la mortalidad y también la duración de las estancias hospitalarias [68]. Aunque estos tratamientos no están sin complicaciones, y ha habido una falta de un ensayo controlado aleatorizado [5, 39]. Los corticosteroides son ampliamente inmunosupresores y tienen muchos efectos fisiológicos [5, 39]. Varios estudios recientes han sugerido que otros compuestos podrían ser útiles para aumentar la resistencia del huésped a las infecciones pulmonares virales. Un artículo reciente demuestra que la topoisomerasa I puede proteger contra la muerte inducida por la inflamación de una variedad de infecciones virales incluyendo IAV [70]. Bloqueo de C5a señalización complementaria también se ha sugerido como una posible opción para disminuir la inflamación durante la infección por VAI [71]. Otros inmunomoduladores incluyen celecoxib, mesalazina y eritorán [72, 73]. Otra clase de medicamentos que se han sugerido son las estatinas. Actúan para estabilizar la activación de aspectos de la respuesta inmune innata y prevenir la inflamación excesiva Sin embargo, la disminución de la inmunopatología por inmunomodulación es problemática porque puede conducir a un aumento de la carga de patógenos, aumentando así la patología inducida por virus [75, 76]. Otra opción potencial de tratamiento es el aumento de las vías de reparación tisular para aumentar la resiliencia del huésped a la enfermedad. Esto ha sido demostrado por la bioinformática [77], así como en varios modelos animales [30-31,78-79]. Estas terapias se han demostrado en sistemas de modelos de cultivo celular o modelos animales para ser eficaces, pero no se han demostrado en pacientes humanos. El momento correcto de los tratamientos es esencial. Se ha demostrado que la intervención temprana es la más eficaz en algunos casos, pero otras terapias funcionan mejor cuando se administran un poco más tarde durante el curso de la infección. Además de los efectos virales, y la patología causada por la respuesta inmunitaria, hay varias comorbilidades asociadas con el SARS-CoV y el MERS-CoV que conducen a resultados adversos. Curiosamente, estos factores de riesgo adicionales que conducen a una enfermedad más grave son diferentes entre los dos virus. No está claro si estas diferencias se deben a poblaciones distintas afectadas por los virus, debido a las propiedades del virus en sí, o ambos. Entender estos factores podría ser una clave para aumentar la resiliencia del huésped a las infecciones. Los pacientes con MERS-CoV tuvieron un aumento de morbilidad y mortalidad si eran obesos, inmunocomprometidos, diabéticos o tenían enfermedad cardíaca [4, 12]. REVIEW Jamieson futuro grupo científico Los factores de riesgo para los pacientes con SARS-CoV incluyeron una edad mayor y varones [39]. Los factores inmunológicos que aumentaron la mortalidad por SRAS-CoV fueron un recuento de neutrófilos más alto y un recuento de células T bajo [5, 39, 77]. Un factor que aumentó la enfermedad para los pacientes infectados con SRAS-CoV y MERS-CoV fue la infección por otros virus o bacterias [5, 39]. Esto es similar a lo que se ve con muchas otras infecciones respiratorias. Un estudio reciente que examinó las infecciones por malaria en modelos animales y pacientes humanos demostró que los huéspedes resistentes pueden predecirse [28]. Estudios clínicos han comenzado a correlacionar biomarcadores específicos con los resultados de enfermedades en pacientes con SDAA [80]. Al comprender los factores de riesgo de gravedad de la enfermedad, tal vez podamos predecir si un huésped puede ser no resistente y adaptar las opciones de tratamiento adecuadamente. Una ventaja clara de dirigir las vías de resiliencia del huésped es que estas terapias pueden utilizarse para tratar una variedad Además, no hay necesidad de desarrollar una vacuna o entender la susceptibilidad antiviral de un nuevo virus. Con este fin, es esencial entender por qué algunos pacientes o poblaciones de pacientes tienen una mayor susceptibilidad. Además, es esencial la necesidad de contar con buenos sistemas modelo para estudiar las respuestas a estos nuevos coronavirus emergentes. La investigación en ambos temas nos llevará a mejorar el tratamiento de los virus emergentes que causan ALI, como el SRAS-CoV y el MERS-CoV. El autor no tiene ninguna afiliación relevante ni participación financiera con ninguna organización o entidad con intereses financieros o conflicto financiero con el tema o materiales discutidos en el manuscrito. Esto incluye empleo, consultorías, honorarios, propiedad o opciones, testimonio de expertos, subvenciones o patentes recibidas o pendientes, o regalías. No se utilizó asistencia por escrito en la producción de este manuscrito. • El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio son coronavirus zoonóticos que causan lesión pulmonar aguda y síndrome de dificultad respiratoria aguda. • Los antivirales tienen efectos limitados en el curso de la infección con estos coronavirus. • Actualmente no existe ninguna vacuna para el coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave ni para el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio. • La resiliencia del huésped es la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de una infección y volver a un estado de salud. • Varias vías, incluido el control de la inflamación, el metabolismo y la reparación de tejidos, pueden estar dirigidas a aumentar la resiliencia del huésped. • El desafío futuro es dirigirse a las vías de resiliencia del huésped de tal manera que haya efectos limitados en las vías de aclaramiento de patógenos.

¿En qué familia de virus reside MERS?

La resiliencia de los huéspedes a los coronavirus emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7079962/SHA: f7cfc37ea164f16393d7f4f3f2b32214dea1ded4Autores: Jamieson, Amanda MDate: 2016-07-01DOI: 10.2217/fvl-2016-0060Licencia: cc-byAbstract: Recientemente, dos coronavirus, el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio, han surgido para causar enfermedades respiratorias inusualmente graves en los seres humanos. Actualmente, hay una falta de opciones eficaces de tratamiento antiviral o vacunas disponibles. Dada la gravedad de estos brotes, y la posibilidad de que surjan coronavirus zoonóticos adicionales en el futuro cercano, es necesario explorar La resiliencia de la enfermedad es la capacidad de un huésped determinado para tolerar una infección y volver a un estado de salud. Esta revisión se centra en explorar varios mecanismos de resiliencia del huésped que podrían ser explotados para el tratamiento del coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave, el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio y otros virus respiratorios que causan lesiones pulmonares agudas y síndrome de dificultad respiratoria aguda. Texto: El siglo XXI fue anunciado con la aparición de dos nuevos coronavirus (CoV) que tienen una patogenicidad y mortalidad inusualmente altas [1] [2] [3] [5] [5]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-Cov) fue identificado por primera vez en 2003 [6] [7] [8] [9]. Aunque inicialmente hubo gran preocupación por el SARS-CoV, una vez que no surgieron nuevos casos, la financiación y la investigación disminuyeron. Sin embargo, una década más tarde el síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV), también conocido Si bien el SARS-CoV no está tan extendido como el SARS-CoV, parece tener una tasa de mortalidad aún más alta, con un 35-50% de las infecciones diagnosticadas resultando en la muerte [3, [12] [13]. Estos virus letales del betacoravirus existían en depósitos de animales [4] [5] 9, [14] [15]. Recientemente, se han detectado otros virus de la CoV en poblaciones animales, lo que aumenta la posibilidad de que veamos una repetición de estos tipos de brotes en un futuro próximo [11, [16] [17] [18] [20]. Ambos virus zoonóticos causan una enfermedad mucho más grave que la que se ve típicamente para los CoVs, convirtiéndolas en un problema de salud mundial. Muchos pacientes infectados presentan lesión pulmonar aguda (AI), condición que se diagnostica en base a la presencia de edema pulmonar e insuficiencia respiratoria sin causa cardiaca. En algunos pacientes hay una progresión a la forma más grave de ALI, síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) [21] [22] [23]. Para sobrevivir a una infección dada, un huésped exitoso no sólo debe ser capaz de limpiar el patógeno, sino tolerar el daño causado por el propio patógeno y también por la respuesta inmune del huésped [24] [26]. Nos referimos a la resiliencia como la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de los patógenos y la respuesta inmune a los patógenos. Un huésped resistente es capaz de volver a un estado de salud después de responder a una infección [24, [27] [28]. La mayoría de las opciones de tratamiento disponibles actualmente para las enfermedades infecciosas son los antimicrobianos, Para pedidos de reimpresión, por favor contacte: reprints@futuremedicine.com REVIEW Jamieson futuro grupo científico y así dirigir el patógeno mismo. Dado el daño que los patógenos pueden causar este enfoque en el aclaramiento rápido de patógenos es comprensible. Sin embargo, una intervención médica igualmente importante es aumentar la capacidad del huésped para tolerar los efectos directos e indirectos del patógeno, y este es un área que está empezando a explorarse [29]. Daño al epitelio pulmonar por patógenos respiratorios es una causa común de disminución de la resiliencia [30] [31] [32]. Esta revisión explora algunas de las probables vías de resiliencia del huésped a las infecciones virales, con un enfoque especial en los coronavirus emergentes. También examinaremos los factores que hacen que algunos pacientes tolerantes a la enfermedad y otros pacientes menos tolerantes Estos factores pueden servir de guía para nuevas terapias potenciales para mejorar el cuidado del paciente. Tanto el SARS-CoV como el MERS-CoV se caracterizan por una rápida progresión a la SDRA, sin embargo, hay algunas diferencias diferenciadas en la infectividad y patogenicidad. Los dos virus tienen diferentes receptores que conducen a diferentes tropismo celular, y el SARS-CoV es más ubicuo en el tipo de célula y especie que puede infectar. El SARS-CoV utiliza el receptor ACE2 para obtener entrada a las células, mientras que el MERS-CoV utiliza la ectopeptidasa DPP4 [33] [34] [35]. A diferencia de la infección por SARS-CoV, que causa principalmente un síndrome respiratorio grave, la infección por MERS-CoV también puede conducir a insuficiencia renal [37, 38]. El SARS-CoV también se disemina más rápidamente entre los huéspedes, mientras que el MERS-CoV se ha contenido más fácilmente, pero no está claro si esto se debe a las poblaciones y regiones de pacientes afectados [3] [4] 39 ]. Dado que el MERS-CoV es un virus descubierto muy recientemente, [40, 41] se ha realizado más investigación sobre el SARS-CoV. Sin embargo, dadas las similitudes se espera que algunos de estos hallazgos también puedan aplicarse a los CORRS-CoV, y otros potenciales coronavirus zoonóticos emergentes. Ambas infecciones virales provocan una respuesta inflamatoria muy fuerte, y también son capaces de eludir la respuesta inmunitaria. Parece haber varias maneras en que estos virus evaden y redirijan de otro modo la respuesta inmune [1, [42] [43] [44] [45]. Las vías que conducen a la inducción de la respuesta al interferón antiviral tipo I (IFN) son El SARS-CoV y el MERS-CoV están contenidos en vesículas de doble membrana (VMD), que impiden la detección de su genoma [1, 46]. Al igual que la mayoría de los coronavirus, varias proteínas virales suprimen la respuesta IFN de tipo I, y otros aspectos de la inmunidad antiviral innata [47]. Estas alteraciones de la respuesta IFN de tipo I parecen desempeñar un papel en la inmunopatología de más de una manera. En pacientes con títulos virales iniciales altos hay un pronóstico pobre [39, 48]. Esto indica que la reducción de la respuesta antiviral puede conducir a una patología inducida directa por virus. También hay evidencia de que la respuesta IFN de tipo I retardadada puede conducir a una mala regulación de la respuesta inmune que puede causar inmunopatología. El retraso de esta potente respuesta antiviral conduce a una disminución del aclaramiento viral, al mismo tiempo que se produce un aumento de las células inflamatorias del sistema inmunitario que causan una inmunopatología excesiva [49]. En este caso, la respuesta antiviral retardada no sólo causa inmunopatología, sino que también no controla adecuadamente la replicación viral. Si bien se necesita más investigación, parece que el MERS tiene un efecto similar en la respuesta inmune innata [5, 50]. Las opciones actuales de tratamiento y prevención para el SARS-CoV y el MERS-CoV son limitadas. Hasta ahora no hay vacunas autorizadas para el SAR-CoV o el MERS-CoV, aunque se han probado varias estrategias en modelos animales [51, 52]. Tampoco existen estrategias antivirales que sean claramente eficaces en ensayos controlados. Durante los brotes se han probado empíricamente varias estrategias antivirales, pero estos estudios no Los principales antivirales utilizados fueron ribavirina, lopinavir y ritonavir [38, 53], que a menudo se utilizaron en combinación con el tratamiento con IFN [54]. Sin embargo, el análisis retrospectivo de estos datos no ha llevado a conclusiones claras de la eficacia de estas opciones de tratamiento. La investigación en esta área todavía está en curso y se espera que pronto tengamos estrategias eficaces para tratar la nueva CoV [3,36,38,40, [55] [57] [58] [60] [61] [62] [63] [64]. La falta de antivirales eficaces hace necesario examinar otros tratamientos potenciales para el SARS-CoV y el MERS-CoV. Incluso si hubiera estrategias eficaces para disminuir la carga viral, para estos virus, el potencial de nuevas COV zoonóticas emergentes presenta complicaciones adicionales. Las vacunas no pueden producirse a tiempo para detener la propagación de un virus emergente. Además, como se demostró durante los brotes de SARS-CoV y MERS-CoV, siempre hay un desafío durante una situación de crisis para saber qué resistencia del huésped a los coronavirus emergentes REVIEW futuro grupo científico www.futuremedicine.com antiviral trabajará en un virus determinado. Un método para abordar esto es desarrollar antivirales de amplio espectro que se dirigen a características conservadas de una clase determinada de virus [65]. Sin embargo, dadas las rápidas tasas de mutación de virus hay varios desafíos a esta estrategia. Otro método es aumentar la capacidad de un paciente determinado para tolerar la enfermedad, es decir, los mecanismos de resistencia del huésped objetivo. Hasta ahora esto ha sido en gran medida en forma de atención de apoyo, que se basa en la ventilación mecánica y la oxigenación [29, 39, 66]. Sin embargo, muchos otros virus causan ALI y ARDS, incluyendo el virus influenza A (IAV). Al observar los datos de otros virus de alta patología, podemos extrapolar varias vías que podrían ser dirigidas durante la infección con estas COV emergentes. Esto puede aumentar nuestra comprensión de los mecanismos de resiliencia a las enfermedades que hemos aprendido de estudios directos de SARS-CoV y MERS-CoV. Una mayor comprensión de los mecanismos de resiliencia del huésped puede conducir a futuras terapias basadas en el huésped que podrían aumentar la supervivencia del paciente [29]. Un tema común que surge en muchos virus respiratorios, incluyendo SARS-CoV y MERS-CoV es que gran parte de la patología se debe a una respuesta inflamatoria excesiva. Un estudio de Josset et al. examina la respuesta del huésped celular a MERS-CoV y SARS-CoV, y descubrió que MERS-CoV disregula el transcriptoma del huésped en Se demuestra que los glucocorticoides pueden ser una forma potencial de alterar los cambios en el transcriptoma del huésped en momentos tardíos después de la infección. Si se mantienen las respuestas génicas del huésped esto puede aumentar la resiliencia de la enfermedad. Dada la enfermedad severa que se manifestó durante el brote del SARS-CoV, se probaron empíricamente muchas opciones de tratamiento diferentes en pacientes humanos. Un tratamiento inmunomodulador que se probó durante el brote del SARS-CoV fue corticosteroides sistémicos. Esto se probó con y sin el uso de IFN de tipo I y otras terapias que podrían dirigirse directamente al virus [68]. El análisis retrospectivo reveló que, cuando se administró en el momento correcto y a los pacientes apropiados, el uso de corticosteroides podría disminuir la mortalidad y también la duración de las estancias hospitalarias [68]. Aunque estos tratamientos no están sin complicaciones, y ha habido una falta de un ensayo controlado aleatorizado [5, 39]. Los corticosteroides son ampliamente inmunosupresores y tienen muchos efectos fisiológicos [5, 39]. Varios estudios recientes han sugerido que otros compuestos podrían ser útiles para aumentar la resistencia del huésped a las infecciones pulmonares virales. Un artículo reciente demuestra que la topoisomerasa I puede proteger contra la muerte inducida por la inflamación de una variedad de infecciones virales incluyendo IAV [70]. Bloqueo de C5a señalización complementaria también se ha sugerido como una posible opción para disminuir la inflamación durante la infección por VAI [71]. Otros inmunomoduladores incluyen celecoxib, mesalazina y eritorán [72, 73]. Otra clase de medicamentos que se han sugerido son las estatinas. Actúan para estabilizar la activación de aspectos de la respuesta inmune innata y prevenir la inflamación excesiva Sin embargo, la disminución de la inmunopatología por inmunomodulación es problemática porque puede conducir a un aumento de la carga de patógenos, aumentando así la patología inducida por virus [75, 76]. Otra opción potencial de tratamiento es el aumento de las vías de reparación tisular para aumentar la resiliencia del huésped a la enfermedad. Esto ha sido demostrado por la bioinformática [77], así como en varios modelos animales [30-31,78-79]. Estas terapias se han demostrado en sistemas de modelos de cultivo celular o modelos animales para ser eficaces, pero no se han demostrado en pacientes humanos. El momento correcto de los tratamientos es esencial. Se ha demostrado que la intervención temprana es la más eficaz en algunos casos, pero otras terapias funcionan mejor cuando se administran un poco más tarde durante el curso de la infección. Además de los efectos virales, y la patología causada por la respuesta inmunitaria, hay varias comorbilidades asociadas con el SARS-CoV y el MERS-CoV que conducen a resultados adversos. Curiosamente, estos factores de riesgo adicionales que conducen a una enfermedad más grave son diferentes entre los dos virus. No está claro si estas diferencias se deben a poblaciones distintas afectadas por los virus, debido a las propiedades del virus en sí, o ambos. Entender estos factores podría ser una clave para aumentar la resiliencia del huésped a las infecciones. Los pacientes con MERS-CoV tuvieron un aumento de morbilidad y mortalidad si eran obesos, inmunocomprometidos, diabéticos o tenían enfermedad cardíaca [4, 12]. REVIEW Jamieson futuro grupo científico Los factores de riesgo para los pacientes con SARS-CoV incluyeron una edad mayor y varones [39]. Los factores inmunológicos que aumentaron la mortalidad por SRAS-CoV fueron un recuento de neutrófilos más alto y un recuento de células T bajo [5, 39, 77]. Un factor que aumentó la enfermedad para los pacientes infectados con SRAS-CoV y MERS-CoV fue la infección por otros virus o bacterias [5, 39]. Esto es similar a lo que se ve con muchas otras infecciones respiratorias. Un estudio reciente que examinó las infecciones por malaria en modelos animales y pacientes humanos demostró que los huéspedes resistentes pueden predecirse [28]. Estudios clínicos han comenzado a correlacionar biomarcadores específicos con los resultados de enfermedades en pacientes con SDAA [80]. Al comprender los factores de riesgo de gravedad de la enfermedad, tal vez podamos predecir si un huésped puede ser no resistente y adaptar las opciones de tratamiento adecuadamente. Una ventaja clara de dirigir las vías de resiliencia del huésped es que estas terapias pueden utilizarse para tratar una variedad Además, no hay necesidad de desarrollar una vacuna o entender la susceptibilidad antiviral de un nuevo virus. Con este fin, es esencial entender por qué algunos pacientes o poblaciones de pacientes tienen una mayor susceptibilidad. Además, es esencial la necesidad de contar con buenos sistemas modelo para estudiar las respuestas a estos nuevos coronavirus emergentes. La investigación en ambos temas nos llevará a mejorar el tratamiento de los virus emergentes que causan ALI, como el SRAS-CoV y el MERS-CoV. El autor no tiene ninguna afiliación relevante ni participación financiera con ninguna organización o entidad con intereses financieros o conflicto financiero con el tema o materiales discutidos en el manuscrito. Esto incluye empleo, consultorías, honorarios, propiedad o opciones, testimonio de expertos, subvenciones o patentes recibidas o pendientes, o regalías. No se utilizó asistencia por escrito en la producción de este manuscrito. • El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio son coronavirus zoonóticos que causan lesión pulmonar aguda y síndrome de dificultad respiratoria aguda. • Los antivirales tienen efectos limitados en el curso de la infección con estos coronavirus. • Actualmente no existe ninguna vacuna para el coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave ni para el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio. • La resiliencia del huésped es la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de una infección y volver a un estado de salud. • Varias vías, incluido el control de la inflamación, el metabolismo y la reparación de tejidos, pueden estar dirigidas a aumentar la resiliencia del huésped. • El desafío futuro es dirigirse a las vías de resiliencia del huésped de tal manera que haya efectos limitados en las vías de aclaramiento de patógenos.

¿Cuándo se identificó por primera vez el SARS-CoV?

La resiliencia de los huéspedes a los coronavirus emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7079962/SHA: f7cfc37ea164f16393d7f4f3f2b32214dea1ded4Autores: Jamieson, Amanda MDate: 2016-07-01DOI: 10.2217/fvl-2016-0060Licencia: cc-byAbstract: Recientemente, dos coronavirus, el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio, han surgido para causar enfermedades respiratorias inusualmente graves en los seres humanos. Actualmente, hay una falta de opciones eficaces de tratamiento antiviral o vacunas disponibles. Dada la gravedad de estos brotes, y la posibilidad de que surjan coronavirus zoonóticos adicionales en el futuro cercano, es necesario explorar La resiliencia de la enfermedad es la capacidad de un huésped determinado para tolerar una infección y volver a un estado de salud. Esta revisión se centra en explorar varios mecanismos de resiliencia del huésped que podrían ser explotados para el tratamiento del coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave, el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio y otros virus respiratorios que causan lesiones pulmonares agudas y síndrome de dificultad respiratoria aguda. Texto: El siglo XXI fue anunciado con la aparición de dos nuevos coronavirus (CoV) que tienen una patogenicidad y mortalidad inusualmente altas [1] [2] [3] [5] [5]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-Cov) fue identificado por primera vez en 2003 [6] [7] [8] [9]. Aunque inicialmente hubo gran preocupación por el SARS-CoV, una vez que no surgieron nuevos casos, la financiación y la investigación disminuyeron. Sin embargo, una década más tarde el síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV), también conocido Si bien el SARS-CoV no está tan extendido como el SARS-CoV, parece tener una tasa de mortalidad aún más alta, con un 35-50% de las infecciones diagnosticadas resultando en la muerte [3, [12] [13]. Estos virus letales del betacoravirus existían en depósitos de animales [4] [5] 9, [14] [15]. Recientemente, se han detectado otros virus de la CoV en poblaciones animales, lo que aumenta la posibilidad de que veamos una repetición de estos tipos de brotes en un futuro próximo [11, [16] [17] [18] [20]. Ambos virus zoonóticos causan una enfermedad mucho más grave que la que se ve típicamente para los CoVs, convirtiéndolas en un problema de salud mundial. Muchos pacientes infectados presentan lesión pulmonar aguda (AI), condición que se diagnostica en base a la presencia de edema pulmonar e insuficiencia respiratoria sin causa cardiaca. En algunos pacientes hay una progresión a la forma más grave de ALI, síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) [21] [22] [23]. Para sobrevivir a una infección dada, un huésped exitoso no sólo debe ser capaz de limpiar el patógeno, sino tolerar el daño causado por el propio patógeno y también por la respuesta inmune del huésped [24] [26]. Nos referimos a la resiliencia como la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de los patógenos y la respuesta inmune a los patógenos. Un huésped resistente es capaz de volver a un estado de salud después de responder a una infección [24, [27] [28]. La mayoría de las opciones de tratamiento disponibles actualmente para las enfermedades infecciosas son los antimicrobianos, Para pedidos de reimpresión, por favor contacte: reprints@futuremedicine.com REVIEW Jamieson futuro grupo científico y así dirigir el patógeno mismo. Dado el daño que los patógenos pueden causar este enfoque en el aclaramiento rápido de patógenos es comprensible. Sin embargo, una intervención médica igualmente importante es aumentar la capacidad del huésped para tolerar los efectos directos e indirectos del patógeno, y este es un área que está empezando a explorarse [29]. Daño al epitelio pulmonar por patógenos respiratorios es una causa común de disminución de la resiliencia [30] [31] [32]. Esta revisión explora algunas de las probables vías de resiliencia del huésped a las infecciones virales, con un enfoque especial en los coronavirus emergentes. También examinaremos los factores que hacen que algunos pacientes tolerantes a la enfermedad y otros pacientes menos tolerantes Estos factores pueden servir de guía para nuevas terapias potenciales para mejorar el cuidado del paciente. Tanto el SARS-CoV como el MERS-CoV se caracterizan por una rápida progresión a la SDRA, sin embargo, hay algunas diferencias diferenciadas en la infectividad y patogenicidad. Los dos virus tienen diferentes receptores que conducen a diferentes tropismo celular, y el SARS-CoV es más ubicuo en el tipo de célula y especie que puede infectar. El SARS-CoV utiliza el receptor ACE2 para obtener entrada a las células, mientras que el MERS-CoV utiliza la ectopeptidasa DPP4 [33] [34] [35]. A diferencia de la infección por SARS-CoV, que causa principalmente un síndrome respiratorio grave, la infección por MERS-CoV también puede conducir a insuficiencia renal [37, 38]. El SARS-CoV también se disemina más rápidamente entre los huéspedes, mientras que el MERS-CoV se ha contenido más fácilmente, pero no está claro si esto se debe a las poblaciones y regiones de pacientes afectados [3] [4] 39 ]. Dado que el MERS-CoV es un virus descubierto muy recientemente, [40, 41] se ha realizado más investigación sobre el SARS-CoV. Sin embargo, dadas las similitudes se espera que algunos de estos hallazgos también puedan aplicarse a los CORRS-CoV, y otros potenciales coronavirus zoonóticos emergentes. Ambas infecciones virales provocan una respuesta inflamatoria muy fuerte, y también son capaces de eludir la respuesta inmunitaria. Parece haber varias maneras en que estos virus evaden y redirijan de otro modo la respuesta inmune [1, [42] [43] [44] [45]. Las vías que conducen a la inducción de la respuesta al interferón antiviral tipo I (IFN) son El SARS-CoV y el MERS-CoV están contenidos en vesículas de doble membrana (VMD), que impiden la detección de su genoma [1, 46]. Al igual que la mayoría de los coronavirus, varias proteínas virales suprimen la respuesta IFN de tipo I, y otros aspectos de la inmunidad antiviral innata [47]. Estas alteraciones de la respuesta IFN de tipo I parecen desempeñar un papel en la inmunopatología de más de una manera. En pacientes con títulos virales iniciales altos hay un pronóstico pobre [39, 48]. Esto indica que la reducción de la respuesta antiviral puede conducir a una patología inducida directa por virus. También hay evidencia de que la respuesta IFN de tipo I retardadada puede conducir a una mala regulación de la respuesta inmune que puede causar inmunopatología. El retraso de esta potente respuesta antiviral conduce a una disminución del aclaramiento viral, al mismo tiempo que se produce un aumento de las células inflamatorias del sistema inmunitario que causan una inmunopatología excesiva [49]. En este caso, la respuesta antiviral retardada no sólo causa inmunopatología, sino que también no controla adecuadamente la replicación viral. Si bien se necesita más investigación, parece que el MERS tiene un efecto similar en la respuesta inmune innata [5, 50]. Las opciones actuales de tratamiento y prevención para el SARS-CoV y el MERS-CoV son limitadas. Hasta ahora no hay vacunas autorizadas para el SAR-CoV o el MERS-CoV, aunque se han probado varias estrategias en modelos animales [51, 52]. Tampoco existen estrategias antivirales que sean claramente eficaces en ensayos controlados. Durante los brotes se han probado empíricamente varias estrategias antivirales, pero estos estudios no Los principales antivirales utilizados fueron ribavirina, lopinavir y ritonavir [38, 53], que a menudo se utilizaron en combinación con el tratamiento con IFN [54]. Sin embargo, el análisis retrospectivo de estos datos no ha llevado a conclusiones claras de la eficacia de estas opciones de tratamiento. La investigación en esta área todavía está en curso y se espera que pronto tengamos estrategias eficaces para tratar la nueva CoV [3,36,38,40, [55] [57] [58] [60] [61] [62] [63] [64]. La falta de antivirales eficaces hace necesario examinar otros tratamientos potenciales para el SARS-CoV y el MERS-CoV. Incluso si hubiera estrategias eficaces para disminuir la carga viral, para estos virus, el potencial de nuevas COV zoonóticas emergentes presenta complicaciones adicionales. Las vacunas no pueden producirse a tiempo para detener la propagación de un virus emergente. Además, como se demostró durante los brotes de SARS-CoV y MERS-CoV, siempre hay un desafío durante una situación de crisis para saber qué resistencia del huésped a los coronavirus emergentes REVIEW futuro grupo científico www.futuremedicine.com antiviral trabajará en un virus determinado. Un método para abordar esto es desarrollar antivirales de amplio espectro que se dirigen a características conservadas de una clase determinada de virus [65]. Sin embargo, dadas las rápidas tasas de mutación de virus hay varios desafíos a esta estrategia. Otro método es aumentar la capacidad de un paciente determinado para tolerar la enfermedad, es decir, los mecanismos de resistencia del huésped objetivo. Hasta ahora esto ha sido en gran medida en forma de atención de apoyo, que se basa en la ventilación mecánica y la oxigenación [29, 39, 66]. Sin embargo, muchos otros virus causan ALI y ARDS, incluyendo el virus influenza A (IAV). Al observar los datos de otros virus de alta patología, podemos extrapolar varias vías que podrían ser dirigidas durante la infección con estas COV emergentes. Esto puede aumentar nuestra comprensión de los mecanismos de resiliencia a las enfermedades que hemos aprendido de estudios directos de SARS-CoV y MERS-CoV. Una mayor comprensión de los mecanismos de resiliencia del huésped puede conducir a futuras terapias basadas en el huésped que podrían aumentar la supervivencia del paciente [29]. Un tema común que surge en muchos virus respiratorios, incluyendo SARS-CoV y MERS-CoV es que gran parte de la patología se debe a una respuesta inflamatoria excesiva. Un estudio de Josset et al. examina la respuesta del huésped celular a MERS-CoV y SARS-CoV, y descubrió que MERS-CoV disregula el transcriptoma del huésped en Se demuestra que los glucocorticoides pueden ser una forma potencial de alterar los cambios en el transcriptoma del huésped en momentos tardíos después de la infección. Si se mantienen las respuestas génicas del huésped esto puede aumentar la resiliencia de la enfermedad. Dada la enfermedad severa que se manifestó durante el brote del SARS-CoV, se probaron empíricamente muchas opciones de tratamiento diferentes en pacientes humanos. Un tratamiento inmunomodulador que se probó durante el brote del SARS-CoV fue corticosteroides sistémicos. Esto se probó con y sin el uso de IFN de tipo I y otras terapias que podrían dirigirse directamente al virus [68]. El análisis retrospectivo reveló que, cuando se administró en el momento correcto y a los pacientes apropiados, el uso de corticosteroides podría disminuir la mortalidad y también la duración de las estancias hospitalarias [68]. Aunque estos tratamientos no están sin complicaciones, y ha habido una falta de un ensayo controlado aleatorizado [5, 39]. Los corticosteroides son ampliamente inmunosupresores y tienen muchos efectos fisiológicos [5, 39]. Varios estudios recientes han sugerido que otros compuestos podrían ser útiles para aumentar la resistencia del huésped a las infecciones pulmonares virales. Un artículo reciente demuestra que la topoisomerasa I puede proteger contra la muerte inducida por la inflamación de una variedad de infecciones virales incluyendo IAV [70]. Bloqueo de C5a señalización complementaria también se ha sugerido como una posible opción para disminuir la inflamación durante la infección por VAI [71]. Otros inmunomoduladores incluyen celecoxib, mesalazina y eritorán [72, 73]. Otra clase de medicamentos que se han sugerido son las estatinas. Actúan para estabilizar la activación de aspectos de la respuesta inmune innata y prevenir la inflamación excesiva Sin embargo, la disminución de la inmunopatología por inmunomodulación es problemática porque puede conducir a un aumento de la carga de patógenos, aumentando así la patología inducida por virus [75, 76]. Otra opción potencial de tratamiento es el aumento de las vías de reparación tisular para aumentar la resiliencia del huésped a la enfermedad. Esto ha sido demostrado por la bioinformática [77], así como en varios modelos animales [30-31,78-79]. Estas terapias se han demostrado en sistemas de modelos de cultivo celular o modelos animales para ser eficaces, pero no se han demostrado en pacientes humanos. El momento correcto de los tratamientos es esencial. Se ha demostrado que la intervención temprana es la más eficaz en algunos casos, pero otras terapias funcionan mejor cuando se administran un poco más tarde durante el curso de la infección. Además de los efectos virales, y la patología causada por la respuesta inmunitaria, hay varias comorbilidades asociadas con el SARS-CoV y el MERS-CoV que conducen a resultados adversos. Curiosamente, estos factores de riesgo adicionales que conducen a una enfermedad más grave son diferentes entre los dos virus. No está claro si estas diferencias se deben a poblaciones distintas afectadas por los virus, debido a las propiedades del virus en sí, o ambos. Entender estos factores podría ser una clave para aumentar la resiliencia del huésped a las infecciones. Los pacientes con MERS-CoV tuvieron un aumento de morbilidad y mortalidad si eran obesos, inmunocomprometidos, diabéticos o tenían enfermedad cardíaca [4, 12]. REVIEW Jamieson futuro grupo científico Los factores de riesgo para los pacientes con SARS-CoV incluyeron una edad mayor y varones [39]. Los factores inmunológicos que aumentaron la mortalidad por SRAS-CoV fueron un recuento de neutrófilos más alto y un recuento de células T bajo [5, 39, 77]. Un factor que aumentó la enfermedad para los pacientes infectados con SRAS-CoV y MERS-CoV fue la infección por otros virus o bacterias [5, 39]. Esto es similar a lo que se ve con muchas otras infecciones respiratorias. Un estudio reciente que examinó las infecciones por malaria en modelos animales y pacientes humanos demostró que los huéspedes resistentes pueden predecirse [28]. Estudios clínicos han comenzado a correlacionar biomarcadores específicos con los resultados de enfermedades en pacientes con SDAA [80]. Al comprender los factores de riesgo de gravedad de la enfermedad, tal vez podamos predecir si un huésped puede ser no resistente y adaptar las opciones de tratamiento adecuadamente. Una ventaja clara de dirigir las vías de resiliencia del huésped es que estas terapias pueden utilizarse para tratar una variedad Además, no hay necesidad de desarrollar una vacuna o entender la susceptibilidad antiviral de un nuevo virus. Con este fin, es esencial entender por qué algunos pacientes o poblaciones de pacientes tienen una mayor susceptibilidad. Además, es esencial la necesidad de contar con buenos sistemas modelo para estudiar las respuestas a estos nuevos coronavirus emergentes. La investigación en ambos temas nos llevará a mejorar el tratamiento de los virus emergentes que causan ALI, como el SRAS-CoV y el MERS-CoV. El autor no tiene ninguna afiliación relevante ni participación financiera con ninguna organización o entidad con intereses financieros o conflicto financiero con el tema o materiales discutidos en el manuscrito. Esto incluye empleo, consultorías, honorarios, propiedad o opciones, testimonio de expertos, subvenciones o patentes recibidas o pendientes, o regalías. No se utilizó asistencia por escrito en la producción de este manuscrito. • El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio son coronavirus zoonóticos que causan lesión pulmonar aguda y síndrome de dificultad respiratoria aguda. • Los antivirales tienen efectos limitados en el curso de la infección con estos coronavirus. • Actualmente no existe ninguna vacuna para el coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave ni para el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio. • La resiliencia del huésped es la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de una infección y volver a un estado de salud. • Varias vías, incluido el control de la inflamación, el metabolismo y la reparación de tejidos, pueden estar dirigidas a aumentar la resiliencia del huésped. • El desafío futuro es dirigirse a las vías de resiliencia del huésped de tal manera que haya efectos limitados en las vías de aclaramiento de patógenos.

¿Qué porcentaje de personas infectadas con MERS-CoV murieron?

La resiliencia de los huéspedes a los coronavirus emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7079962/SHA: f7cfc37ea164f16393d7f4f3f2b32214dea1ded4Autores: Jamieson, Amanda MDate: 2016-07-01DOI: 10.2217/fvl-2016-0060Licencia: cc-byAbstract: Recientemente, dos coronavirus, el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio, han surgido para causar enfermedades respiratorias inusualmente graves en los seres humanos. Actualmente, hay una falta de opciones eficaces de tratamiento antiviral o vacunas disponibles. Dada la gravedad de estos brotes, y la posibilidad de que surjan coronavirus zoonóticos adicionales en el futuro cercano, es necesario explorar La resiliencia de la enfermedad es la capacidad de un huésped determinado para tolerar una infección y volver a un estado de salud. Esta revisión se centra en explorar varios mecanismos de resiliencia del huésped que podrían ser explotados para el tratamiento del coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave, el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio y otros virus respiratorios que causan lesiones pulmonares agudas y síndrome de dificultad respiratoria aguda. Texto: El siglo XXI fue anunciado con la aparición de dos nuevos coronavirus (CoV) que tienen una patogenicidad y mortalidad inusualmente altas [1] [2] [3] [5] [5]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-Cov) fue identificado por primera vez en 2003 [6] [7] [8] [9]. Aunque inicialmente hubo gran preocupación por el SARS-CoV, una vez que no surgieron nuevos casos, la financiación y la investigación disminuyeron. Sin embargo, una década más tarde el síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV), también conocido Si bien el SARS-CoV no está tan extendido como el SARS-CoV, parece tener una tasa de mortalidad aún más alta, con un 35-50% de las infecciones diagnosticadas resultando en la muerte [3, [12] [13]. Estos virus letales del betacoravirus existían en depósitos de animales [4] [5] 9, [14] [15]. Recientemente, se han detectado otros virus de la CoV en poblaciones animales, lo que aumenta la posibilidad de que veamos una repetición de estos tipos de brotes en un futuro próximo [11, [16] [17] [18] [20]. Ambos virus zoonóticos causan una enfermedad mucho más grave que la que se ve típicamente para los CoVs, convirtiéndolas en un problema de salud mundial. Muchos pacientes infectados presentan lesión pulmonar aguda (AI), condición que se diagnostica en base a la presencia de edema pulmonar e insuficiencia respiratoria sin causa cardiaca. En algunos pacientes hay una progresión a la forma más grave de ALI, síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) [21] [22] [23]. Para sobrevivir a una infección dada, un huésped exitoso no sólo debe ser capaz de limpiar el patógeno, sino tolerar el daño causado por el propio patógeno y también por la respuesta inmune del huésped [24] [26]. Nos referimos a la resiliencia como la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de los patógenos y la respuesta inmune a los patógenos. Un huésped resistente es capaz de volver a un estado de salud después de responder a una infección [24, [27] [28]. La mayoría de las opciones de tratamiento disponibles actualmente para las enfermedades infecciosas son los antimicrobianos, Para pedidos de reimpresión, por favor contacte: reprints@futuremedicine.com REVIEW Jamieson futuro grupo científico y así dirigir el patógeno mismo. Dado el daño que los patógenos pueden causar este enfoque en el aclaramiento rápido de patógenos es comprensible. Sin embargo, una intervención médica igualmente importante es aumentar la capacidad del huésped para tolerar los efectos directos e indirectos del patógeno, y este es un área que está empezando a explorarse [29]. Daño al epitelio pulmonar por patógenos respiratorios es una causa común de disminución de la resiliencia [30] [31] [32]. Esta revisión explora algunas de las probables vías de resiliencia del huésped a las infecciones virales, con un enfoque especial en los coronavirus emergentes. También examinaremos los factores que hacen que algunos pacientes tolerantes a la enfermedad y otros pacientes menos tolerantes Estos factores pueden servir de guía para nuevas terapias potenciales para mejorar el cuidado del paciente. Tanto el SARS-CoV como el MERS-CoV se caracterizan por una rápida progresión a la SDRA, sin embargo, hay algunas diferencias diferenciadas en la infectividad y patogenicidad. Los dos virus tienen diferentes receptores que conducen a diferentes tropismo celular, y el SARS-CoV es más ubicuo en el tipo de célula y especie que puede infectar. El SARS-CoV utiliza el receptor ACE2 para obtener entrada a las células, mientras que el MERS-CoV utiliza la ectopeptidasa DPP4 [33] [34] [35]. A diferencia de la infección por SARS-CoV, que causa principalmente un síndrome respiratorio grave, la infección por MERS-CoV también puede conducir a insuficiencia renal [37, 38]. El SARS-CoV también se disemina más rápidamente entre los huéspedes, mientras que el MERS-CoV se ha contenido más fácilmente, pero no está claro si esto se debe a las poblaciones y regiones de pacientes afectados [3] [4] 39 ]. Dado que el MERS-CoV es un virus descubierto muy recientemente, [40, 41] se ha realizado más investigación sobre el SARS-CoV. Sin embargo, dadas las similitudes se espera que algunos de estos hallazgos también puedan aplicarse a los CORRS-CoV, y otros potenciales coronavirus zoonóticos emergentes. Ambas infecciones virales provocan una respuesta inflamatoria muy fuerte, y también son capaces de eludir la respuesta inmunitaria. Parece haber varias maneras en que estos virus evaden y redirijan de otro modo la respuesta inmune [1, [42] [43] [44] [45]. Las vías que conducen a la inducción de la respuesta al interferón antiviral tipo I (IFN) son El SARS-CoV y el MERS-CoV están contenidos en vesículas de doble membrana (VMD), que impiden la detección de su genoma [1, 46]. Al igual que la mayoría de los coronavirus, varias proteínas virales suprimen la respuesta IFN de tipo I, y otros aspectos de la inmunidad antiviral innata [47]. Estas alteraciones de la respuesta IFN de tipo I parecen desempeñar un papel en la inmunopatología de más de una manera. En pacientes con títulos virales iniciales altos hay un pronóstico pobre [39, 48]. Esto indica que la reducción de la respuesta antiviral puede conducir a una patología inducida directa por virus. También hay evidencia de que la respuesta IFN de tipo I retardadada puede conducir a una mala regulación de la respuesta inmune que puede causar inmunopatología. El retraso de esta potente respuesta antiviral conduce a una disminución del aclaramiento viral, al mismo tiempo que se produce un aumento de las células inflamatorias del sistema inmunitario que causan una inmunopatología excesiva [49]. En este caso, la respuesta antiviral retardada no sólo causa inmunopatología, sino que también no controla adecuadamente la replicación viral. Si bien se necesita más investigación, parece que el MERS tiene un efecto similar en la respuesta inmune innata [5, 50]. Las opciones actuales de tratamiento y prevención para el SARS-CoV y el MERS-CoV son limitadas. Hasta ahora no hay vacunas autorizadas para el SAR-CoV o el MERS-CoV, aunque se han probado varias estrategias en modelos animales [51, 52]. Tampoco existen estrategias antivirales que sean claramente eficaces en ensayos controlados. Durante los brotes se han probado empíricamente varias estrategias antivirales, pero estos estudios no Los principales antivirales utilizados fueron ribavirina, lopinavir y ritonavir [38, 53], que a menudo se utilizaron en combinación con el tratamiento con IFN [54]. Sin embargo, el análisis retrospectivo de estos datos no ha llevado a conclusiones claras de la eficacia de estas opciones de tratamiento. La investigación en esta área todavía está en curso y se espera que pronto tengamos estrategias eficaces para tratar la nueva CoV [3,36,38,40, [55] [57] [58] [60] [61] [62] [63] [64]. La falta de antivirales eficaces hace necesario examinar otros tratamientos potenciales para el SARS-CoV y el MERS-CoV. Incluso si hubiera estrategias eficaces para disminuir la carga viral, para estos virus, el potencial de nuevas COV zoonóticas emergentes presenta complicaciones adicionales. Las vacunas no pueden producirse a tiempo para detener la propagación de un virus emergente. Además, como se demostró durante los brotes de SARS-CoV y MERS-CoV, siempre hay un desafío durante una situación de crisis para saber qué resistencia del huésped a los coronavirus emergentes REVIEW futuro grupo científico www.futuremedicine.com antiviral trabajará en un virus determinado. Un método para abordar esto es desarrollar antivirales de amplio espectro que se dirigen a características conservadas de una clase determinada de virus [65]. Sin embargo, dadas las rápidas tasas de mutación de virus hay varios desafíos a esta estrategia. Otro método es aumentar la capacidad de un paciente determinado para tolerar la enfermedad, es decir, los mecanismos de resistencia del huésped objetivo. Hasta ahora esto ha sido en gran medida en forma de atención de apoyo, que se basa en la ventilación mecánica y la oxigenación [29, 39, 66]. Sin embargo, muchos otros virus causan ALI y ARDS, incluyendo el virus influenza A (IAV). Al observar los datos de otros virus de alta patología, podemos extrapolar varias vías que podrían ser dirigidas durante la infección con estas COV emergentes. Esto puede aumentar nuestra comprensión de los mecanismos de resiliencia a las enfermedades que hemos aprendido de estudios directos de SARS-CoV y MERS-CoV. Una mayor comprensión de los mecanismos de resiliencia del huésped puede conducir a futuras terapias basadas en el huésped que podrían aumentar la supervivencia del paciente [29]. Un tema común que surge en muchos virus respiratorios, incluyendo SARS-CoV y MERS-CoV es que gran parte de la patología se debe a una respuesta inflamatoria excesiva. Un estudio de Josset et al. examina la respuesta del huésped celular a MERS-CoV y SARS-CoV, y descubrió que MERS-CoV disregula el transcriptoma del huésped en Se demuestra que los glucocorticoides pueden ser una forma potencial de alterar los cambios en el transcriptoma del huésped en momentos tardíos después de la infección. Si se mantienen las respuestas génicas del huésped esto puede aumentar la resiliencia de la enfermedad. Dada la enfermedad severa que se manifestó durante el brote del SARS-CoV, se probaron empíricamente muchas opciones de tratamiento diferentes en pacientes humanos. Un tratamiento inmunomodulador que se probó durante el brote del SARS-CoV fue corticosteroides sistémicos. Esto se probó con y sin el uso de IFN de tipo I y otras terapias que podrían dirigirse directamente al virus [68]. El análisis retrospectivo reveló que, cuando se administró en el momento correcto y a los pacientes apropiados, el uso de corticosteroides podría disminuir la mortalidad y también la duración de las estancias hospitalarias [68]. Aunque estos tratamientos no están sin complicaciones, y ha habido una falta de un ensayo controlado aleatorizado [5, 39]. Los corticosteroides son ampliamente inmunosupresores y tienen muchos efectos fisiológicos [5, 39]. Varios estudios recientes han sugerido que otros compuestos podrían ser útiles para aumentar la resistencia del huésped a las infecciones pulmonares virales. Un artículo reciente demuestra que la topoisomerasa I puede proteger contra la muerte inducida por la inflamación de una variedad de infecciones virales incluyendo IAV [70]. Bloqueo de C5a señalización complementaria también se ha sugerido como una posible opción para disminuir la inflamación durante la infección por VAI [71]. Otros inmunomoduladores incluyen celecoxib, mesalazina y eritorán [72, 73]. Otra clase de medicamentos que se han sugerido son las estatinas. Actúan para estabilizar la activación de aspectos de la respuesta inmune innata y prevenir la inflamación excesiva Sin embargo, la disminución de la inmunopatología por inmunomodulación es problemática porque puede conducir a un aumento de la carga de patógenos, aumentando así la patología inducida por virus [75, 76]. Otra opción potencial de tratamiento es el aumento de las vías de reparación tisular para aumentar la resiliencia del huésped a la enfermedad. Esto ha sido demostrado por la bioinformática [77], así como en varios modelos animales [30-31,78-79]. Estas terapias se han demostrado en sistemas de modelos de cultivo celular o modelos animales para ser eficaces, pero no se han demostrado en pacientes humanos. El momento correcto de los tratamientos es esencial. Se ha demostrado que la intervención temprana es la más eficaz en algunos casos, pero otras terapias funcionan mejor cuando se administran un poco más tarde durante el curso de la infección. Además de los efectos virales, y la patología causada por la respuesta inmunitaria, hay varias comorbilidades asociadas con el SARS-CoV y el MERS-CoV que conducen a resultados adversos. Curiosamente, estos factores de riesgo adicionales que conducen a una enfermedad más grave son diferentes entre los dos virus. No está claro si estas diferencias se deben a poblaciones distintas afectadas por los virus, debido a las propiedades del virus en sí, o ambos. Entender estos factores podría ser una clave para aumentar la resiliencia del huésped a las infecciones. Los pacientes con MERS-CoV tuvieron un aumento de morbilidad y mortalidad si eran obesos, inmunocomprometidos, diabéticos o tenían enfermedad cardíaca [4, 12]. REVIEW Jamieson futuro grupo científico Los factores de riesgo para los pacientes con SARS-CoV incluyeron una edad mayor y varones [39]. Los factores inmunológicos que aumentaron la mortalidad por SRAS-CoV fueron un recuento de neutrófilos más alto y un recuento de células T bajo [5, 39, 77]. Un factor que aumentó la enfermedad para los pacientes infectados con SRAS-CoV y MERS-CoV fue la infección por otros virus o bacterias [5, 39]. Esto es similar a lo que se ve con muchas otras infecciones respiratorias. Un estudio reciente que examinó las infecciones por malaria en modelos animales y pacientes humanos demostró que los huéspedes resistentes pueden predecirse [28]. Estudios clínicos han comenzado a correlacionar biomarcadores específicos con los resultados de enfermedades en pacientes con SDAA [80]. Al comprender los factores de riesgo de gravedad de la enfermedad, tal vez podamos predecir si un huésped puede ser no resistente y adaptar las opciones de tratamiento adecuadamente. Una ventaja clara de dirigir las vías de resiliencia del huésped es que estas terapias pueden utilizarse para tratar una variedad Además, no hay necesidad de desarrollar una vacuna o entender la susceptibilidad antiviral de un nuevo virus. Con este fin, es esencial entender por qué algunos pacientes o poblaciones de pacientes tienen una mayor susceptibilidad. Además, es esencial la necesidad de contar con buenos sistemas modelo para estudiar las respuestas a estos nuevos coronavirus emergentes. La investigación en ambos temas nos llevará a mejorar el tratamiento de los virus emergentes que causan ALI, como el SRAS-CoV y el MERS-CoV. El autor no tiene ninguna afiliación relevante ni participación financiera con ninguna organización o entidad con intereses financieros o conflicto financiero con el tema o materiales discutidos en el manuscrito. Esto incluye empleo, consultorías, honorarios, propiedad o opciones, testimonio de expertos, subvenciones o patentes recibidas o pendientes, o regalías. No se utilizó asistencia por escrito en la producción de este manuscrito. • El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio son coronavirus zoonóticos que causan lesión pulmonar aguda y síndrome de dificultad respiratoria aguda. • Los antivirales tienen efectos limitados en el curso de la infección con estos coronavirus. • Actualmente no existe ninguna vacuna para el coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave ni para el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio. • La resiliencia del huésped es la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de una infección y volver a un estado de salud. • Varias vías, incluido el control de la inflamación, el metabolismo y la reparación de tejidos, pueden estar dirigidas a aumentar la resiliencia del huésped. • El desafío futuro es dirigirse a las vías de resiliencia del huésped de tal manera que haya efectos limitados en las vías de aclaramiento de patógenos.

¿Qué papel desempeña el título viral inicial en el pronóstico del SARS-CoV y el MERS-CoV?

La resiliencia de los huéspedes a los coronavirus emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7079962/SHA: f7cfc37ea164f16393d7f4f3f2b32214dea1ded4Autores: Jamieson, Amanda MDate: 2016-07-01DOI: 10.2217/fvl-2016-0060Licencia: cc-byAbstract: Recientemente, dos coronavirus, el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio, han surgido para causar enfermedades respiratorias inusualmente graves en los seres humanos. Actualmente, hay una falta de opciones eficaces de tratamiento antiviral o vacunas disponibles. Dada la gravedad de estos brotes, y la posibilidad de que surjan coronavirus zoonóticos adicionales en el futuro cercano, es necesario explorar La resiliencia de la enfermedad es la capacidad de un huésped determinado para tolerar una infección y volver a un estado de salud. Esta revisión se centra en explorar varios mecanismos de resiliencia del huésped que podrían ser explotados para el tratamiento del coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave, el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio y otros virus respiratorios que causan lesiones pulmonares agudas y síndrome de dificultad respiratoria aguda. Texto: El siglo XXI fue anunciado con la aparición de dos nuevos coronavirus (CoV) que tienen una patogenicidad y mortalidad inusualmente altas [1] [2] [3] [5] [5]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-Cov) fue identificado por primera vez en 2003 [6] [7] [8] [9]. Aunque inicialmente hubo gran preocupación por el SARS-CoV, una vez que no surgieron nuevos casos, la financiación y la investigación disminuyeron. Sin embargo, una década más tarde el síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV), también conocido Si bien el SARS-CoV no está tan extendido como el SARS-CoV, parece tener una tasa de mortalidad aún más alta, con un 35-50% de las infecciones diagnosticadas resultando en la muerte [3, [12] [13]. Estos virus letales del betacoravirus existían en depósitos de animales [4] [5] 9, [14] [15]. Recientemente, se han detectado otros virus de la CoV en poblaciones animales, lo que aumenta la posibilidad de que veamos una repetición de estos tipos de brotes en un futuro próximo [11, [16] [17] [18] [20]. Ambos virus zoonóticos causan una enfermedad mucho más grave que la que se ve típicamente para los CoVs, convirtiéndolas en un problema de salud mundial. Muchos pacientes infectados presentan lesión pulmonar aguda (AI), condición que se diagnostica en base a la presencia de edema pulmonar e insuficiencia respiratoria sin causa cardiaca. En algunos pacientes hay una progresión a la forma más grave de ALI, síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) [21] [22] [23]. Para sobrevivir a una infección dada, un huésped exitoso no sólo debe ser capaz de limpiar el patógeno, sino tolerar el daño causado por el propio patógeno y también por la respuesta inmune del huésped [24] [26]. Nos referimos a la resiliencia como la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de los patógenos y la respuesta inmune a los patógenos. Un huésped resistente es capaz de volver a un estado de salud después de responder a una infección [24, [27] [28]. La mayoría de las opciones de tratamiento disponibles actualmente para las enfermedades infecciosas son los antimicrobianos, Para pedidos de reimpresión, por favor contacte: reprints@futuremedicine.com REVIEW Jamieson futuro grupo científico y así dirigir el patógeno mismo. Dado el daño que los patógenos pueden causar este enfoque en el aclaramiento rápido de patógenos es comprensible. Sin embargo, una intervención médica igualmente importante es aumentar la capacidad del huésped para tolerar los efectos directos e indirectos del patógeno, y este es un área que está empezando a explorarse [29]. Daño al epitelio pulmonar por patógenos respiratorios es una causa común de disminución de la resiliencia [30] [31] [32]. Esta revisión explora algunas de las probables vías de resiliencia del huésped a las infecciones virales, con un enfoque especial en los coronavirus emergentes. También examinaremos los factores que hacen que algunos pacientes tolerantes a la enfermedad y otros pacientes menos tolerantes Estos factores pueden servir de guía para nuevas terapias potenciales para mejorar el cuidado del paciente. Tanto el SARS-CoV como el MERS-CoV se caracterizan por una rápida progresión a la SDRA, sin embargo, hay algunas diferencias diferenciadas en la infectividad y patogenicidad. Los dos virus tienen diferentes receptores que conducen a diferentes tropismo celular, y el SARS-CoV es más ubicuo en el tipo de célula y especie que puede infectar. El SARS-CoV utiliza el receptor ACE2 para obtener entrada a las células, mientras que el MERS-CoV utiliza la ectopeptidasa DPP4 [33] [34] [35]. A diferencia de la infección por SARS-CoV, que causa principalmente un síndrome respiratorio grave, la infección por MERS-CoV también puede conducir a insuficiencia renal [37, 38]. El SARS-CoV también se disemina más rápidamente entre los huéspedes, mientras que el MERS-CoV se ha contenido más fácilmente, pero no está claro si esto se debe a las poblaciones y regiones de pacientes afectados [3] [4] 39 ]. Dado que el MERS-CoV es un virus descubierto muy recientemente, [40, 41] se ha realizado más investigación sobre el SARS-CoV. Sin embargo, dadas las similitudes se espera que algunos de estos hallazgos también puedan aplicarse a los CORRS-CoV, y otros potenciales coronavirus zoonóticos emergentes. Ambas infecciones virales provocan una respuesta inflamatoria muy fuerte, y también son capaces de eludir la respuesta inmunitaria. Parece haber varias maneras en que estos virus evaden y redirijan de otro modo la respuesta inmune [1, [42] [43] [44] [45]. Las vías que conducen a la inducción de la respuesta al interferón antiviral tipo I (IFN) son El SARS-CoV y el MERS-CoV están contenidos en vesículas de doble membrana (VMD), que impiden la detección de su genoma [1, 46]. Al igual que la mayoría de los coronavirus, varias proteínas virales suprimen la respuesta IFN de tipo I, y otros aspectos de la inmunidad antiviral innata [47]. Estas alteraciones de la respuesta IFN de tipo I parecen desempeñar un papel en la inmunopatología de más de una manera. En pacientes con títulos virales iniciales altos hay un pronóstico pobre [39, 48]. Esto indica que la reducción de la respuesta antiviral puede conducir a una patología inducida directa por virus. También hay evidencia de que la respuesta IFN de tipo I retardadada puede conducir a una mala regulación de la respuesta inmune que puede causar inmunopatología. El retraso de esta potente respuesta antiviral conduce a una disminución del aclaramiento viral, al mismo tiempo que se produce un aumento de las células inflamatorias del sistema inmunitario que causan una inmunopatología excesiva [49]. En este caso, la respuesta antiviral retardada no sólo causa inmunopatología, sino que también no controla adecuadamente la replicación viral. Si bien se necesita más investigación, parece que el MERS tiene un efecto similar en la respuesta inmune innata [5, 50]. Las opciones actuales de tratamiento y prevención para el SARS-CoV y el MERS-CoV son limitadas. Hasta ahora no hay vacunas autorizadas para el SAR-CoV o el MERS-CoV, aunque se han probado varias estrategias en modelos animales [51, 52]. Tampoco existen estrategias antivirales que sean claramente eficaces en ensayos controlados. Durante los brotes se han probado empíricamente varias estrategias antivirales, pero estos estudios no Los principales antivirales utilizados fueron ribavirina, lopinavir y ritonavir [38, 53], que a menudo se utilizaron en combinación con el tratamiento con IFN [54]. Sin embargo, el análisis retrospectivo de estos datos no ha llevado a conclusiones claras de la eficacia de estas opciones de tratamiento. La investigación en esta área todavía está en curso y se espera que pronto tengamos estrategias eficaces para tratar la nueva CoV [3,36,38,40, [55] [57] [58] [60] [61] [62] [63] [64]. La falta de antivirales eficaces hace necesario examinar otros tratamientos potenciales para el SARS-CoV y el MERS-CoV. Incluso si hubiera estrategias eficaces para disminuir la carga viral, para estos virus, el potencial de nuevas COV zoonóticas emergentes presenta complicaciones adicionales. Las vacunas no pueden producirse a tiempo para detener la propagación de un virus emergente. Además, como se demostró durante los brotes de SARS-CoV y MERS-CoV, siempre hay un desafío durante una situación de crisis para saber qué resistencia del huésped a los coronavirus emergentes REVIEW futuro grupo científico www.futuremedicine.com antiviral trabajará en un virus determinado. Un método para abordar esto es desarrollar antivirales de amplio espectro que se dirigen a características conservadas de una clase determinada de virus [65]. Sin embargo, dadas las rápidas tasas de mutación de virus hay varios desafíos a esta estrategia. Otro método es aumentar la capacidad de un paciente determinado para tolerar la enfermedad, es decir, los mecanismos de resistencia del huésped objetivo. Hasta ahora esto ha sido en gran medida en forma de atención de apoyo, que se basa en la ventilación mecánica y la oxigenación [29, 39, 66]. Sin embargo, muchos otros virus causan ALI y ARDS, incluyendo el virus influenza A (IAV). Al observar los datos de otros virus de alta patología, podemos extrapolar varias vías que podrían ser dirigidas durante la infección con estas COV emergentes. Esto puede aumentar nuestra comprensión de los mecanismos de resiliencia a las enfermedades que hemos aprendido de estudios directos de SARS-CoV y MERS-CoV. Una mayor comprensión de los mecanismos de resiliencia del huésped puede conducir a futuras terapias basadas en el huésped que podrían aumentar la supervivencia del paciente [29]. Un tema común que surge en muchos virus respiratorios, incluyendo SARS-CoV y MERS-CoV es que gran parte de la patología se debe a una respuesta inflamatoria excesiva. Un estudio de Josset et al. examina la respuesta del huésped celular a MERS-CoV y SARS-CoV, y descubrió que MERS-CoV disregula el transcriptoma del huésped en Se demuestra que los glucocorticoides pueden ser una forma potencial de alterar los cambios en el transcriptoma del huésped en momentos tardíos después de la infección. Si se mantienen las respuestas génicas del huésped esto puede aumentar la resiliencia de la enfermedad. Dada la enfermedad severa que se manifestó durante el brote del SARS-CoV, se probaron empíricamente muchas opciones de tratamiento diferentes en pacientes humanos. Un tratamiento inmunomodulador que se probó durante el brote del SARS-CoV fue corticosteroides sistémicos. Esto se probó con y sin el uso de IFN de tipo I y otras terapias que podrían dirigirse directamente al virus [68]. El análisis retrospectivo reveló que, cuando se administró en el momento correcto y a los pacientes apropiados, el uso de corticosteroides podría disminuir la mortalidad y también la duración de las estancias hospitalarias [68]. Aunque estos tratamientos no están sin complicaciones, y ha habido una falta de un ensayo controlado aleatorizado [5, 39]. Los corticosteroides son ampliamente inmunosupresores y tienen muchos efectos fisiológicos [5, 39]. Varios estudios recientes han sugerido que otros compuestos podrían ser útiles para aumentar la resistencia del huésped a las infecciones pulmonares virales. Un artículo reciente demuestra que la topoisomerasa I puede proteger contra la muerte inducida por la inflamación de una variedad de infecciones virales incluyendo IAV [70]. Bloqueo de C5a señalización complementaria también se ha sugerido como una posible opción para disminuir la inflamación durante la infección por VAI [71]. Otros inmunomoduladores incluyen celecoxib, mesalazina y eritorán [72, 73]. Otra clase de medicamentos que se han sugerido son las estatinas. Actúan para estabilizar la activación de aspectos de la respuesta inmune innata y prevenir la inflamación excesiva Sin embargo, la disminución de la inmunopatología por inmunomodulación es problemática porque puede conducir a un aumento de la carga de patógenos, aumentando así la patología inducida por virus [75, 76]. Otra opción potencial de tratamiento es el aumento de las vías de reparación tisular para aumentar la resiliencia del huésped a la enfermedad. Esto ha sido demostrado por la bioinformática [77], así como en varios modelos animales [30-31,78-79]. Estas terapias se han demostrado en sistemas de modelos de cultivo celular o modelos animales para ser eficaces, pero no se han demostrado en pacientes humanos. El momento correcto de los tratamientos es esencial. Se ha demostrado que la intervención temprana es la más eficaz en algunos casos, pero otras terapias funcionan mejor cuando se administran un poco más tarde durante el curso de la infección. Además de los efectos virales, y la patología causada por la respuesta inmunitaria, hay varias comorbilidades asociadas con el SARS-CoV y el MERS-CoV que conducen a resultados adversos. Curiosamente, estos factores de riesgo adicionales que conducen a una enfermedad más grave son diferentes entre los dos virus. No está claro si estas diferencias se deben a poblaciones distintas afectadas por los virus, debido a las propiedades del virus en sí, o ambos. Entender estos factores podría ser una clave para aumentar la resiliencia del huésped a las infecciones. Los pacientes con MERS-CoV tuvieron un aumento de morbilidad y mortalidad si eran obesos, inmunocomprometidos, diabéticos o tenían enfermedad cardíaca [4, 12]. REVIEW Jamieson futuro grupo científico Los factores de riesgo para los pacientes con SARS-CoV incluyeron una edad mayor y varones [39]. Los factores inmunológicos que aumentaron la mortalidad por SRAS-CoV fueron un recuento de neutrófilos más alto y un recuento de células T bajo [5, 39, 77]. Un factor que aumentó la enfermedad para los pacientes infectados con SRAS-CoV y MERS-CoV fue la infección por otros virus o bacterias [5, 39]. Esto es similar a lo que se ve con muchas otras infecciones respiratorias. Un estudio reciente que examinó las infecciones por malaria en modelos animales y pacientes humanos demostró que los huéspedes resistentes pueden predecirse [28]. Estudios clínicos han comenzado a correlacionar biomarcadores específicos con los resultados de enfermedades en pacientes con SDAA [80]. Al comprender los factores de riesgo de gravedad de la enfermedad, tal vez podamos predecir si un huésped puede ser no resistente y adaptar las opciones de tratamiento adecuadamente. Una ventaja clara de dirigir las vías de resiliencia del huésped es que estas terapias pueden utilizarse para tratar una variedad Además, no hay necesidad de desarrollar una vacuna o entender la susceptibilidad antiviral de un nuevo virus. Con este fin, es esencial entender por qué algunos pacientes o poblaciones de pacientes tienen una mayor susceptibilidad. Además, es esencial la necesidad de contar con buenos sistemas modelo para estudiar las respuestas a estos nuevos coronavirus emergentes. La investigación en ambos temas nos llevará a mejorar el tratamiento de los virus emergentes que causan ALI, como el SRAS-CoV y el MERS-CoV. El autor no tiene ninguna afiliación relevante ni participación financiera con ninguna organización o entidad con intereses financieros o conflicto financiero con el tema o materiales discutidos en el manuscrito. Esto incluye empleo, consultorías, honorarios, propiedad o opciones, testimonio de expertos, subvenciones o patentes recibidas o pendientes, o regalías. No se utilizó asistencia por escrito en la producción de este manuscrito. • El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio son coronavirus zoonóticos que causan lesión pulmonar aguda y síndrome de dificultad respiratoria aguda. • Los antivirales tienen efectos limitados en el curso de la infección con estos coronavirus. • Actualmente no existe ninguna vacuna para el coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave ni para el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio. • La resiliencia del huésped es la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de una infección y volver a un estado de salud. • Varias vías, incluido el control de la inflamación, el metabolismo y la reparación de tejidos, pueden estar dirigidas a aumentar la resiliencia del huésped. • El desafío futuro es dirigirse a las vías de resiliencia del huésped de tal manera que haya efectos limitados en las vías de aclaramiento de patógenos.

¿Cómo interactúan las proteínas virales del SARS-CoV con la respuesta inmunitaria?

La resiliencia de los huéspedes a los coronavirus emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7079962/SHA: f7cfc37ea164f16393d7f4f3f2b32214dea1ded4Autores: Jamieson, Amanda MDate: 2016-07-01DOI: 10.2217/fvl-2016-0060Licencia: cc-byAbstract: Recientemente, dos coronavirus, el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio, han surgido para causar enfermedades respiratorias inusualmente graves en los seres humanos. Actualmente, hay una falta de opciones eficaces de tratamiento antiviral o vacunas disponibles. Dada la gravedad de estos brotes, y la posibilidad de que surjan coronavirus zoonóticos adicionales en el futuro cercano, es necesario explorar La resiliencia de la enfermedad es la capacidad de un huésped determinado para tolerar una infección y volver a un estado de salud. Esta revisión se centra en explorar varios mecanismos de resiliencia del huésped que podrían ser explotados para el tratamiento del coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave, el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio y otros virus respiratorios que causan lesiones pulmonares agudas y síndrome de dificultad respiratoria aguda. Texto: El siglo XXI fue anunciado con la aparición de dos nuevos coronavirus (CoV) que tienen una patogenicidad y mortalidad inusualmente altas [1] [2] [3] [5] [5]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-Cov) fue identificado por primera vez en 2003 [6] [7] [8] [9]. Aunque inicialmente hubo gran preocupación por el SARS-CoV, una vez que no surgieron nuevos casos, la financiación y la investigación disminuyeron. Sin embargo, una década más tarde el síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV), también conocido Si bien el SARS-CoV no está tan extendido como el SARS-CoV, parece tener una tasa de mortalidad aún más alta, con un 35-50% de las infecciones diagnosticadas resultando en la muerte [3, [12] [13]. Estos virus letales del betacoravirus existían en depósitos de animales [4] [5] 9, [14] [15]. Recientemente, se han detectado otros virus de la CoV en poblaciones animales, lo que aumenta la posibilidad de que veamos una repetición de estos tipos de brotes en un futuro próximo [11, [16] [17] [18] [20]. Ambos virus zoonóticos causan una enfermedad mucho más grave que la que se ve típicamente para los CoVs, convirtiéndolas en un problema de salud mundial. Muchos pacientes infectados presentan lesión pulmonar aguda (AI), condición que se diagnostica en base a la presencia de edema pulmonar e insuficiencia respiratoria sin causa cardiaca. En algunos pacientes hay una progresión a la forma más grave de ALI, síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) [21] [22] [23]. Para sobrevivir a una infección dada, un huésped exitoso no sólo debe ser capaz de limpiar el patógeno, sino tolerar el daño causado por el propio patógeno y también por la respuesta inmune del huésped [24] [26]. Nos referimos a la resiliencia como la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de los patógenos y la respuesta inmune a los patógenos. Un huésped resistente es capaz de volver a un estado de salud después de responder a una infección [24, [27] [28]. La mayoría de las opciones de tratamiento disponibles actualmente para las enfermedades infecciosas son los antimicrobianos, Para pedidos de reimpresión, por favor contacte: reprints@futuremedicine.com REVIEW Jamieson futuro grupo científico y así dirigir el patógeno mismo. Dado el daño que los patógenos pueden causar este enfoque en el aclaramiento rápido de patógenos es comprensible. Sin embargo, una intervención médica igualmente importante es aumentar la capacidad del huésped para tolerar los efectos directos e indirectos del patógeno, y este es un área que está empezando a explorarse [29]. Daño al epitelio pulmonar por patógenos respiratorios es una causa común de disminución de la resiliencia [30] [31] [32]. Esta revisión explora algunas de las probables vías de resiliencia del huésped a las infecciones virales, con un enfoque especial en los coronavirus emergentes. También examinaremos los factores que hacen que algunos pacientes tolerantes a la enfermedad y otros pacientes menos tolerantes Estos factores pueden servir de guía para nuevas terapias potenciales para mejorar el cuidado del paciente. Tanto el SARS-CoV como el MERS-CoV se caracterizan por una rápida progresión a la SDRA, sin embargo, hay algunas diferencias diferenciadas en la infectividad y patogenicidad. Los dos virus tienen diferentes receptores que conducen a diferentes tropismo celular, y el SARS-CoV es más ubicuo en el tipo de célula y especie que puede infectar. El SARS-CoV utiliza el receptor ACE2 para obtener entrada a las células, mientras que el MERS-CoV utiliza la ectopeptidasa DPP4 [33] [34] [35]. A diferencia de la infección por SARS-CoV, que causa principalmente un síndrome respiratorio grave, la infección por MERS-CoV también puede conducir a insuficiencia renal [37, 38]. El SARS-CoV también se disemina más rápidamente entre los huéspedes, mientras que el MERS-CoV se ha contenido más fácilmente, pero no está claro si esto se debe a las poblaciones y regiones de pacientes afectados [3] [4] 39 ]. Dado que el MERS-CoV es un virus descubierto muy recientemente, [40, 41] se ha realizado más investigación sobre el SARS-CoV. Sin embargo, dadas las similitudes se espera que algunos de estos hallazgos también puedan aplicarse a los CORRS-CoV, y otros potenciales coronavirus zoonóticos emergentes. Ambas infecciones virales provocan una respuesta inflamatoria muy fuerte, y también son capaces de eludir la respuesta inmunitaria. Parece haber varias maneras en que estos virus evaden y redirijan de otro modo la respuesta inmune [1, [42] [43] [44] [45]. Las vías que conducen a la inducción de la respuesta al interferón antiviral tipo I (IFN) son El SARS-CoV y el MERS-CoV están contenidos en vesículas de doble membrana (VMD), que impiden la detección de su genoma [1, 46]. Al igual que la mayoría de los coronavirus, varias proteínas virales suprimen la respuesta IFN de tipo I, y otros aspectos de la inmunidad antiviral innata [47]. Estas alteraciones de la respuesta IFN de tipo I parecen desempeñar un papel en la inmunopatología de más de una manera. En pacientes con títulos virales iniciales altos hay un pronóstico pobre [39, 48]. Esto indica que la reducción de la respuesta antiviral puede conducir a una patología inducida directa por virus. También hay evidencia de que la respuesta IFN de tipo I retardadada puede conducir a una mala regulación de la respuesta inmune que puede causar inmunopatología. El retraso de esta potente respuesta antiviral conduce a una disminución del aclaramiento viral, al mismo tiempo que se produce un aumento de las células inflamatorias del sistema inmunitario que causan una inmunopatología excesiva [49]. En este caso, la respuesta antiviral retardada no sólo causa inmunopatología, sino que también no controla adecuadamente la replicación viral. Si bien se necesita más investigación, parece que el MERS tiene un efecto similar en la respuesta inmune innata [5, 50]. Las opciones actuales de tratamiento y prevención para el SARS-CoV y el MERS-CoV son limitadas. Hasta ahora no hay vacunas autorizadas para el SAR-CoV o el MERS-CoV, aunque se han probado varias estrategias en modelos animales [51, 52]. Tampoco existen estrategias antivirales que sean claramente eficaces en ensayos controlados. Durante los brotes se han probado empíricamente varias estrategias antivirales, pero estos estudios no Los principales antivirales utilizados fueron ribavirina, lopinavir y ritonavir [38, 53], que a menudo se utilizaron en combinación con el tratamiento con IFN [54]. Sin embargo, el análisis retrospectivo de estos datos no ha llevado a conclusiones claras de la eficacia de estas opciones de tratamiento. La investigación en esta área todavía está en curso y se espera que pronto tengamos estrategias eficaces para tratar la nueva CoV [3,36,38,40, [55] [57] [58] [60] [61] [62] [63] [64]. La falta de antivirales eficaces hace necesario examinar otros tratamientos potenciales para el SARS-CoV y el MERS-CoV. Incluso si hubiera estrategias eficaces para disminuir la carga viral, para estos virus, el potencial de nuevas COV zoonóticas emergentes presenta complicaciones adicionales. Las vacunas no pueden producirse a tiempo para detener la propagación de un virus emergente. Además, como se demostró durante los brotes de SARS-CoV y MERS-CoV, siempre hay un desafío durante una situación de crisis para saber qué resistencia del huésped a los coronavirus emergentes REVIEW futuro grupo científico www.futuremedicine.com antiviral trabajará en un virus determinado. Un método para abordar esto es desarrollar antivirales de amplio espectro que se dirigen a características conservadas de una clase determinada de virus [65]. Sin embargo, dadas las rápidas tasas de mutación de virus hay varios desafíos a esta estrategia. Otro método es aumentar la capacidad de un paciente determinado para tolerar la enfermedad, es decir, los mecanismos de resistencia del huésped objetivo. Hasta ahora esto ha sido en gran medida en forma de atención de apoyo, que se basa en la ventilación mecánica y la oxigenación [29, 39, 66]. Sin embargo, muchos otros virus causan ALI y ARDS, incluyendo el virus influenza A (IAV). Al observar los datos de otros virus de alta patología, podemos extrapolar varias vías que podrían ser dirigidas durante la infección con estas COV emergentes. Esto puede aumentar nuestra comprensión de los mecanismos de resiliencia a las enfermedades que hemos aprendido de estudios directos de SARS-CoV y MERS-CoV. Una mayor comprensión de los mecanismos de resiliencia del huésped puede conducir a futuras terapias basadas en el huésped que podrían aumentar la supervivencia del paciente [29]. Un tema común que surge en muchos virus respiratorios, incluyendo SARS-CoV y MERS-CoV es que gran parte de la patología se debe a una respuesta inflamatoria excesiva. Un estudio de Josset et al. examina la respuesta del huésped celular a MERS-CoV y SARS-CoV, y descubrió que MERS-CoV disregula el transcriptoma del huésped en Se demuestra que los glucocorticoides pueden ser una forma potencial de alterar los cambios en el transcriptoma del huésped en momentos tardíos después de la infección. Si se mantienen las respuestas génicas del huésped esto puede aumentar la resiliencia de la enfermedad. Dada la enfermedad severa que se manifestó durante el brote del SARS-CoV, se probaron empíricamente muchas opciones de tratamiento diferentes en pacientes humanos. Un tratamiento inmunomodulador que se probó durante el brote del SARS-CoV fue corticosteroides sistémicos. Esto se probó con y sin el uso de IFN de tipo I y otras terapias que podrían dirigirse directamente al virus [68]. El análisis retrospectivo reveló que, cuando se administró en el momento correcto y a los pacientes apropiados, el uso de corticosteroides podría disminuir la mortalidad y también la duración de las estancias hospitalarias [68]. Aunque estos tratamientos no están sin complicaciones, y ha habido una falta de un ensayo controlado aleatorizado [5, 39]. Los corticosteroides son ampliamente inmunosupresores y tienen muchos efectos fisiológicos [5, 39]. Varios estudios recientes han sugerido que otros compuestos podrían ser útiles para aumentar la resistencia del huésped a las infecciones pulmonares virales. Un artículo reciente demuestra que la topoisomerasa I puede proteger contra la muerte inducida por la inflamación de una variedad de infecciones virales incluyendo IAV [70]. Bloqueo de C5a señalización complementaria también se ha sugerido como una posible opción para disminuir la inflamación durante la infección por VAI [71]. Otros inmunomoduladores incluyen celecoxib, mesalazina y eritorán [72, 73]. Otra clase de medicamentos que se han sugerido son las estatinas. Actúan para estabilizar la activación de aspectos de la respuesta inmune innata y prevenir la inflamación excesiva Sin embargo, la disminución de la inmunopatología por inmunomodulación es problemática porque puede conducir a un aumento de la carga de patógenos, aumentando así la patología inducida por virus [75, 76]. Otra opción potencial de tratamiento es el aumento de las vías de reparación tisular para aumentar la resiliencia del huésped a la enfermedad. Esto ha sido demostrado por la bioinformática [77], así como en varios modelos animales [30-31,78-79]. Estas terapias se han demostrado en sistemas de modelos de cultivo celular o modelos animales para ser eficaces, pero no se han demostrado en pacientes humanos. El momento correcto de los tratamientos es esencial. Se ha demostrado que la intervención temprana es la más eficaz en algunos casos, pero otras terapias funcionan mejor cuando se administran un poco más tarde durante el curso de la infección. Además de los efectos virales, y la patología causada por la respuesta inmunitaria, hay varias comorbilidades asociadas con el SARS-CoV y el MERS-CoV que conducen a resultados adversos. Curiosamente, estos factores de riesgo adicionales que conducen a una enfermedad más grave son diferentes entre los dos virus. No está claro si estas diferencias se deben a poblaciones distintas afectadas por los virus, debido a las propiedades del virus en sí, o ambos. Entender estos factores podría ser una clave para aumentar la resiliencia del huésped a las infecciones. Los pacientes con MERS-CoV tuvieron un aumento de morbilidad y mortalidad si eran obesos, inmunocomprometidos, diabéticos o tenían enfermedad cardíaca [4, 12]. REVIEW Jamieson futuro grupo científico Los factores de riesgo para los pacientes con SARS-CoV incluyeron una edad mayor y varones [39]. Los factores inmunológicos que aumentaron la mortalidad por SRAS-CoV fueron un recuento de neutrófilos más alto y un recuento de células T bajo [5, 39, 77]. Un factor que aumentó la enfermedad para los pacientes infectados con SRAS-CoV y MERS-CoV fue la infección por otros virus o bacterias [5, 39]. Esto es similar a lo que se ve con muchas otras infecciones respiratorias. Un estudio reciente que examinó las infecciones por malaria en modelos animales y pacientes humanos demostró que los huéspedes resistentes pueden predecirse [28]. Estudios clínicos han comenzado a correlacionar biomarcadores específicos con los resultados de enfermedades en pacientes con SDAA [80]. Al comprender los factores de riesgo de gravedad de la enfermedad, tal vez podamos predecir si un huésped puede ser no resistente y adaptar las opciones de tratamiento adecuadamente. Una ventaja clara de dirigir las vías de resiliencia del huésped es que estas terapias pueden utilizarse para tratar una variedad Además, no hay necesidad de desarrollar una vacuna o entender la susceptibilidad antiviral de un nuevo virus. Con este fin, es esencial entender por qué algunos pacientes o poblaciones de pacientes tienen una mayor susceptibilidad. Además, es esencial la necesidad de contar con buenos sistemas modelo para estudiar las respuestas a estos nuevos coronavirus emergentes. La investigación en ambos temas nos llevará a mejorar el tratamiento de los virus emergentes que causan ALI, como el SRAS-CoV y el MERS-CoV. El autor no tiene ninguna afiliación relevante ni participación financiera con ninguna organización o entidad con intereses financieros o conflicto financiero con el tema o materiales discutidos en el manuscrito. Esto incluye empleo, consultorías, honorarios, propiedad o opciones, testimonio de expertos, subvenciones o patentes recibidas o pendientes, o regalías. No se utilizó asistencia por escrito en la producción de este manuscrito. • El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio son coronavirus zoonóticos que causan lesión pulmonar aguda y síndrome de dificultad respiratoria aguda. • Los antivirales tienen efectos limitados en el curso de la infección con estos coronavirus. • Actualmente no existe ninguna vacuna para el coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave ni para el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio. • La resiliencia del huésped es la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de una infección y volver a un estado de salud. • Varias vías, incluido el control de la inflamación, el metabolismo y la reparación de tejidos, pueden estar dirigidas a aumentar la resiliencia del huésped. • El desafío futuro es dirigirse a las vías de resiliencia del huésped de tal manera que haya efectos limitados en las vías de aclaramiento de patógenos.

¿Cuál es el papel de la topoisomerasa I en la mejora de la resiliencia del huésped en las infecciones pulmonares virales?

La resiliencia de los huéspedes a los coronavirus emergenteshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7079962/SHA: f7cfc37ea164f16393d7f4f3f2b32214dea1ded4Autores: Jamieson, Amanda MDate: 2016-07-01DOI: 10.2217/fvl-2016-0060Licencia: cc-byAbstract: Recientemente, dos coronavirus, el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio, han surgido para causar enfermedades respiratorias inusualmente graves en los seres humanos. Actualmente, hay una falta de opciones eficaces de tratamiento antiviral o vacunas disponibles. Dada la gravedad de estos brotes, y la posibilidad de que surjan coronavirus zoonóticos adicionales en el futuro cercano, es necesario explorar La resiliencia de la enfermedad es la capacidad de un huésped determinado para tolerar una infección y volver a un estado de salud. Esta revisión se centra en explorar varios mecanismos de resiliencia del huésped que podrían ser explotados para el tratamiento del coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave, el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio y otros virus respiratorios que causan lesiones pulmonares agudas y síndrome de dificultad respiratoria aguda. Texto: El siglo XXI fue anunciado con la aparición de dos nuevos coronavirus (CoV) que tienen una patogenicidad y mortalidad inusualmente altas [1] [2] [3] [5] [5]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-Cov) fue identificado por primera vez en 2003 [6] [7] [8] [9]. Aunque inicialmente hubo gran preocupación por el SARS-CoV, una vez que no surgieron nuevos casos, la financiación y la investigación disminuyeron. Sin embargo, una década más tarde el síndrome respiratorio del Oriente Medio coronavirus (MERS-CoV), también conocido Si bien el SARS-CoV no está tan extendido como el SARS-CoV, parece tener una tasa de mortalidad aún más alta, con un 35-50% de las infecciones diagnosticadas resultando en la muerte [3, [12] [13]. Estos virus letales del betacoravirus existían en depósitos de animales [4] [5] 9, [14] [15]. Recientemente, se han detectado otros virus de la CoV en poblaciones animales, lo que aumenta la posibilidad de que veamos una repetición de estos tipos de brotes en un futuro próximo [11, [16] [17] [18] [20]. Ambos virus zoonóticos causan una enfermedad mucho más grave que la que se ve típicamente para los CoVs, convirtiéndolas en un problema de salud mundial. Muchos pacientes infectados presentan lesión pulmonar aguda (AI), condición que se diagnostica en base a la presencia de edema pulmonar e insuficiencia respiratoria sin causa cardiaca. En algunos pacientes hay una progresión a la forma más grave de ALI, síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) [21] [22] [23]. Para sobrevivir a una infección dada, un huésped exitoso no sólo debe ser capaz de limpiar el patógeno, sino tolerar el daño causado por el propio patógeno y también por la respuesta inmune del huésped [24] [26]. Nos referimos a la resiliencia como la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de los patógenos y la respuesta inmune a los patógenos. Un huésped resistente es capaz de volver a un estado de salud después de responder a una infección [24, [27] [28]. La mayoría de las opciones de tratamiento disponibles actualmente para las enfermedades infecciosas son los antimicrobianos, Para pedidos de reimpresión, por favor contacte: reprints@futuremedicine.com REVIEW Jamieson futuro grupo científico y así dirigir el patógeno mismo. Dado el daño que los patógenos pueden causar este enfoque en el aclaramiento rápido de patógenos es comprensible. Sin embargo, una intervención médica igualmente importante es aumentar la capacidad del huésped para tolerar los efectos directos e indirectos del patógeno, y este es un área que está empezando a explorarse [29]. Daño al epitelio pulmonar por patógenos respiratorios es una causa común de disminución de la resiliencia [30] [31] [32]. Esta revisión explora algunas de las probables vías de resiliencia del huésped a las infecciones virales, con un enfoque especial en los coronavirus emergentes. También examinaremos los factores que hacen que algunos pacientes tolerantes a la enfermedad y otros pacientes menos tolerantes Estos factores pueden servir de guía para nuevas terapias potenciales para mejorar el cuidado del paciente. Tanto el SARS-CoV como el MERS-CoV se caracterizan por una rápida progresión a la SDRA, sin embargo, hay algunas diferencias diferenciadas en la infectividad y patogenicidad. Los dos virus tienen diferentes receptores que conducen a diferentes tropismo celular, y el SARS-CoV es más ubicuo en el tipo de célula y especie que puede infectar. El SARS-CoV utiliza el receptor ACE2 para obtener entrada a las células, mientras que el MERS-CoV utiliza la ectopeptidasa DPP4 [33] [34] [35]. A diferencia de la infección por SARS-CoV, que causa principalmente un síndrome respiratorio grave, la infección por MERS-CoV también puede conducir a insuficiencia renal [37, 38]. El SARS-CoV también se disemina más rápidamente entre los huéspedes, mientras que el MERS-CoV se ha contenido más fácilmente, pero no está claro si esto se debe a las poblaciones y regiones de pacientes afectados [3] [4] 39 ]. Dado que el MERS-CoV es un virus descubierto muy recientemente, [40, 41] se ha realizado más investigación sobre el SARS-CoV. Sin embargo, dadas las similitudes se espera que algunos de estos hallazgos también puedan aplicarse a los CORRS-CoV, y otros potenciales coronavirus zoonóticos emergentes. Ambas infecciones virales provocan una respuesta inflamatoria muy fuerte, y también son capaces de eludir la respuesta inmunitaria. Parece haber varias maneras en que estos virus evaden y redirijan de otro modo la respuesta inmune [1, [42] [43] [44] [45]. Las vías que conducen a la inducción de la respuesta al interferón antiviral tipo I (IFN) son El SARS-CoV y el MERS-CoV están contenidos en vesículas de doble membrana (VMD), que impiden la detección de su genoma [1, 46]. Al igual que la mayoría de los coronavirus, varias proteínas virales suprimen la respuesta IFN de tipo I, y otros aspectos de la inmunidad antiviral innata [47]. Estas alteraciones de la respuesta IFN de tipo I parecen desempeñar un papel en la inmunopatología de más de una manera. En pacientes con títulos virales iniciales altos hay un pronóstico pobre [39, 48]. Esto indica que la reducción de la respuesta antiviral puede conducir a una patología inducida directa por virus. También hay evidencia de que la respuesta IFN de tipo I retardadada puede conducir a una mala regulación de la respuesta inmune que puede causar inmunopatología. El retraso de esta potente respuesta antiviral conduce a una disminución del aclaramiento viral, al mismo tiempo que se produce un aumento de las células inflamatorias del sistema inmunitario que causan una inmunopatología excesiva [49]. En este caso, la respuesta antiviral retardada no sólo causa inmunopatología, sino que también no controla adecuadamente la replicación viral. Si bien se necesita más investigación, parece que el MERS tiene un efecto similar en la respuesta inmune innata [5, 50]. Las opciones actuales de tratamiento y prevención para el SARS-CoV y el MERS-CoV son limitadas. Hasta ahora no hay vacunas autorizadas para el SAR-CoV o el MERS-CoV, aunque se han probado varias estrategias en modelos animales [51, 52]. Tampoco existen estrategias antivirales que sean claramente eficaces en ensayos controlados. Durante los brotes se han probado empíricamente varias estrategias antivirales, pero estos estudios no Los principales antivirales utilizados fueron ribavirina, lopinavir y ritonavir [38, 53], que a menudo se utilizaron en combinación con el tratamiento con IFN [54]. Sin embargo, el análisis retrospectivo de estos datos no ha llevado a conclusiones claras de la eficacia de estas opciones de tratamiento. La investigación en esta área todavía está en curso y se espera que pronto tengamos estrategias eficaces para tratar la nueva CoV [3,36,38,40, [55] [57] [58] [60] [61] [62] [63] [64]. La falta de antivirales eficaces hace necesario examinar otros tratamientos potenciales para el SARS-CoV y el MERS-CoV. Incluso si hubiera estrategias eficaces para disminuir la carga viral, para estos virus, el potencial de nuevas COV zoonóticas emergentes presenta complicaciones adicionales. Las vacunas no pueden producirse a tiempo para detener la propagación de un virus emergente. Además, como se demostró durante los brotes de SARS-CoV y MERS-CoV, siempre hay un desafío durante una situación de crisis para saber qué resistencia del huésped a los coronavirus emergentes REVIEW futuro grupo científico www.futuremedicine.com antiviral trabajará en un virus determinado. Un método para abordar esto es desarrollar antivirales de amplio espectro que se dirigen a características conservadas de una clase determinada de virus [65]. Sin embargo, dadas las rápidas tasas de mutación de virus hay varios desafíos a esta estrategia. Otro método es aumentar la capacidad de un paciente determinado para tolerar la enfermedad, es decir, los mecanismos de resistencia del huésped objetivo. Hasta ahora esto ha sido en gran medida en forma de atención de apoyo, que se basa en la ventilación mecánica y la oxigenación [29, 39, 66]. Sin embargo, muchos otros virus causan ALI y ARDS, incluyendo el virus influenza A (IAV). Al observar los datos de otros virus de alta patología, podemos extrapolar varias vías que podrían ser dirigidas durante la infección con estas COV emergentes. Esto puede aumentar nuestra comprensión de los mecanismos de resiliencia a las enfermedades que hemos aprendido de estudios directos de SARS-CoV y MERS-CoV. Una mayor comprensión de los mecanismos de resiliencia del huésped puede conducir a futuras terapias basadas en el huésped que podrían aumentar la supervivencia del paciente [29]. Un tema común que surge en muchos virus respiratorios, incluyendo SARS-CoV y MERS-CoV es que gran parte de la patología se debe a una respuesta inflamatoria excesiva. Un estudio de Josset et al. examina la respuesta del huésped celular a MERS-CoV y SARS-CoV, y descubrió que MERS-CoV disregula el transcriptoma del huésped en Se demuestra que los glucocorticoides pueden ser una forma potencial de alterar los cambios en el transcriptoma del huésped en momentos tardíos después de la infección. Si se mantienen las respuestas génicas del huésped esto puede aumentar la resiliencia de la enfermedad. Dada la enfermedad severa que se manifestó durante el brote del SARS-CoV, se probaron empíricamente muchas opciones de tratamiento diferentes en pacientes humanos. Un tratamiento inmunomodulador que se probó durante el brote del SARS-CoV fue corticosteroides sistémicos. Esto se probó con y sin el uso de IFN de tipo I y otras terapias que podrían dirigirse directamente al virus [68]. El análisis retrospectivo reveló que, cuando se administró en el momento correcto y a los pacientes apropiados, el uso de corticosteroides podría disminuir la mortalidad y también la duración de las estancias hospitalarias [68]. Aunque estos tratamientos no están sin complicaciones, y ha habido una falta de un ensayo controlado aleatorizado [5, 39]. Los corticosteroides son ampliamente inmunosupresores y tienen muchos efectos fisiológicos [5, 39]. Varios estudios recientes han sugerido que otros compuestos podrían ser útiles para aumentar la resistencia del huésped a las infecciones pulmonares virales. Un artículo reciente demuestra que la topoisomerasa I puede proteger contra la muerte inducida por la inflamación de una variedad de infecciones virales incluyendo IAV [70]. Bloqueo de C5a señalización complementaria también se ha sugerido como una posible opción para disminuir la inflamación durante la infección por VAI [71]. Otros inmunomoduladores incluyen celecoxib, mesalazina y eritorán [72, 73]. Otra clase de medicamentos que se han sugerido son las estatinas. Actúan para estabilizar la activación de aspectos de la respuesta inmune innata y prevenir la inflamación excesiva Sin embargo, la disminución de la inmunopatología por inmunomodulación es problemática porque puede conducir a un aumento de la carga de patógenos, aumentando así la patología inducida por virus [75, 76]. Otra opción potencial de tratamiento es el aumento de las vías de reparación tisular para aumentar la resiliencia del huésped a la enfermedad. Esto ha sido demostrado por la bioinformática [77], así como en varios modelos animales [30-31,78-79]. Estas terapias se han demostrado en sistemas de modelos de cultivo celular o modelos animales para ser eficaces, pero no se han demostrado en pacientes humanos. El momento correcto de los tratamientos es esencial. Se ha demostrado que la intervención temprana es la más eficaz en algunos casos, pero otras terapias funcionan mejor cuando se administran un poco más tarde durante el curso de la infección. Además de los efectos virales, y la patología causada por la respuesta inmunitaria, hay varias comorbilidades asociadas con el SARS-CoV y el MERS-CoV que conducen a resultados adversos. Curiosamente, estos factores de riesgo adicionales que conducen a una enfermedad más grave son diferentes entre los dos virus. No está claro si estas diferencias se deben a poblaciones distintas afectadas por los virus, debido a las propiedades del virus en sí, o ambos. Entender estos factores podría ser una clave para aumentar la resiliencia del huésped a las infecciones. Los pacientes con MERS-CoV tuvieron un aumento de morbilidad y mortalidad si eran obesos, inmunocomprometidos, diabéticos o tenían enfermedad cardíaca [4, 12]. REVIEW Jamieson futuro grupo científico Los factores de riesgo para los pacientes con SARS-CoV incluyeron una edad mayor y varones [39]. Los factores inmunológicos que aumentaron la mortalidad por SRAS-CoV fueron un recuento de neutrófilos más alto y un recuento de células T bajo [5, 39, 77]. Un factor que aumentó la enfermedad para los pacientes infectados con SRAS-CoV y MERS-CoV fue la infección por otros virus o bacterias [5, 39]. Esto es similar a lo que se ve con muchas otras infecciones respiratorias. Un estudio reciente que examinó las infecciones por malaria en modelos animales y pacientes humanos demostró que los huéspedes resistentes pueden predecirse [28]. Estudios clínicos han comenzado a correlacionar biomarcadores específicos con los resultados de enfermedades en pacientes con SDAA [80]. Al comprender los factores de riesgo de gravedad de la enfermedad, tal vez podamos predecir si un huésped puede ser no resistente y adaptar las opciones de tratamiento adecuadamente. Una ventaja clara de dirigir las vías de resiliencia del huésped es que estas terapias pueden utilizarse para tratar una variedad Además, no hay necesidad de desarrollar una vacuna o entender la susceptibilidad antiviral de un nuevo virus. Con este fin, es esencial entender por qué algunos pacientes o poblaciones de pacientes tienen una mayor susceptibilidad. Además, es esencial la necesidad de contar con buenos sistemas modelo para estudiar las respuestas a estos nuevos coronavirus emergentes. La investigación en ambos temas nos llevará a mejorar el tratamiento de los virus emergentes que causan ALI, como el SRAS-CoV y el MERS-CoV. El autor no tiene ninguna afiliación relevante ni participación financiera con ninguna organización o entidad con intereses financieros o conflicto financiero con el tema o materiales discutidos en el manuscrito. Esto incluye empleo, consultorías, honorarios, propiedad o opciones, testimonio de expertos, subvenciones o patentes recibidas o pendientes, o regalías. No se utilizó asistencia por escrito en la producción de este manuscrito. • El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio son coronavirus zoonóticos que causan lesión pulmonar aguda y síndrome de dificultad respiratoria aguda. • Los antivirales tienen efectos limitados en el curso de la infección con estos coronavirus. • Actualmente no existe ninguna vacuna para el coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave ni para el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio. • La resiliencia del huésped es la capacidad de un huésped para tolerar los efectos de una infección y volver a un estado de salud. • Varias vías, incluido el control de la inflamación, el metabolismo y la reparación de tejidos, pueden estar dirigidas a aumentar la resiliencia del huésped. • El desafío futuro es dirigirse a las vías de resiliencia del huésped de tal manera que haya efectos limitados en las vías de aclaramiento de patógenos.

¿Qué comorbilidades médicas influyeron más profundamente en los resultados del MERS-CoV?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras en la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y el desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo estimar la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígenos Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados severos. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Se observó una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia [119]. Sin embargo, los estudios tuvieron un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la asignación del Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación, ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, aunque no es viable para ninguna forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿Cuántos casos confirmados se identificaron en febrero de 2020?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras en la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo la estimación de la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígeno Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados graves. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo de Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia se observó [119]. Sin embargo, los estudios se presentaron con un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación, ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, aunque no es viable para ninguna forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿Cuál fue la tasa de mortalidad?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene una mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras a la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y el desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo estimar la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígenos Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados graves. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo de Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia se observó [119]. Sin embargo, los estudios se presentaron con un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación, ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, aunque no es viable para ninguna forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿Cuáles son los síntomas al inicio?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras en la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo la estimación de la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígeno Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados graves. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo de Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia se observó [119]. Sin embargo, los estudios se presentaron con un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación, ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, aunque no es viable para ninguna forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿Qué tipo de virus es 2019-nCOV?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene una mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras a la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y el desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo estimar la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígenos Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados graves. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo de Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia se observó [119]. Sin embargo, los estudios se presentaron con un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación, ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, aunque no es viable para ninguna forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿A qué clado pertenece?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras en la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y el desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo estimar la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígenos Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados severos. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Se observó una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia [119]. Sin embargo, los estudios tuvieron un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la asignación del Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, si bien no es viable para cualquier forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿Qué bases de datos electrónicas se utilizaron para este estudio?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene una mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras a la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y el desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo estimar la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígenos Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados graves. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo de Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia se observó [119]. Sin embargo, los estudios se presentaron con un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación, ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, aunque no es viable para ninguna forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿Cuál es el medio principal para diagnosticar la nueva cepa del virus?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras en la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y el desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo estimar la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígenos Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados severos. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Se observó una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia [119]. Sin embargo, los estudios tuvieron un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la asignación del Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación, ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, aunque no es viable para ninguna forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿Cuáles son algunos de los otros métodos de diagnóstico?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras en la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo la estimación de la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígeno Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados graves. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo de Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia se observó [119]. Sin embargo, los estudios se presentaron con un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación, ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, aunque no es viable para ninguna forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿Cómo se comparan RT-iiPCR y un rRT-PCR de un solo paso con otros métodos?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene una mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras a la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y el desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo estimar la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígenos Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados graves. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo de Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia se observó [119]. Sin embargo, los estudios se presentaron con un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación, ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, aunque no es viable para ninguna forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿Qué es la seguridad de las vacunas?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene una mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras a la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y el desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo estimar la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígenos Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados graves. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo de Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia se observó [119]. Sin embargo, los estudios se presentaron con un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación, ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, aunque no es viable para ninguna forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿Cuántos ensayos clínicos se han registrado?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene una mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras a la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y el desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo estimar la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígenos Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados graves. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo de Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia se observó [119]. Sin embargo, los estudios se presentaron con un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación, ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, aunque no es viable para ninguna forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿Cuál fue el resultado del ensayo de fase 1 de inmunoglobina IgG?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras en la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo la estimación de la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígeno Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados graves. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo de Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia se observó [119]. Sin embargo, los estudios se presentaron con un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación, ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, aunque no es viable para ninguna forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿Cuál es la limitación en las pruebas de virus?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras en la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo la estimación de la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígeno Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados graves. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo de Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia se observó [119]. Sin embargo, los estudios se presentaron con un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación, ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, aunque no es viable para ninguna forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿Por qué se prefieren generalmente las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) como en el caso del diagnóstico de MERS-CoV?

Posibles diagnósticos rápidos, vacunas y terapias para el Coronavirus Novel 2019 (2019-nCoV): Una revisión sistemáticahttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2937d7a7acb524a756b6113bAutores: Pang, Junxiong; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chor Es oportuno revisar sistemáticamente el potencial de estas intervenciones, incluidas las relacionadas con el síndrome respiratorio del Oriente Medio-Coronavirus (MERS-CoV) y el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, para orientar a los responsables de la formulación de políticas a nivel mundial sobre su priorización de los recursos para la investigación y el desarrollo. Se realizó una búsqueda sistemática en tres importantes bases de datos electrónicos (Biblioteca de PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados de conformidad con las directrices sobre los artículos de notificación preferidos para revisiones sistemáticas y metaanálisis (PRISMA). Se utilizaron estrategias complementarias mediante búsqueda en Google y comunicaciones personales. En total 27 estudios cumplieron los criterios para la revisión. Sin embargo, no se han desarrollado ensayos serológicos ni kits de pruebas de puntos de cuidado, pero es probable que en un futuro próximo. Varios candidatos a la vacuna están en proceso de preparación. Es probable que el primer ensayo de la primera fase de la vacuna sea un candidato basado en el ADN sintético. Varios compuestos nuevos, así como tratamientos con licencia para otras condiciones, parecen tener eficacia in vitro frente al 2019-nCoV. Algunos se están probando en ensayos clínicos contra el MERS-CoV y el SARS-CoV, mientras que otros se han incluido en la lista de ensayos clínicos con respecto al 2019-nCoV. Sin embargo, actualmente no hay antivirales específicos eficaces ni combinaciones de fármacos respaldados por pruebas de alto nivel. Texto: Desde mediados de diciembre de 2019 y a principios de febrero de 2020, el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) originario de Wuhan (provincia de Hubei, China) ha infectado más de 25.000 casos confirmados en laboratorios en 28 países con unas 500 muertes (una tasa de mortalidad de aproximadamente el 2%). Más del 90% de los casos y muertes se produjeron en China [1]. Basados en el aumento inicial de casos reportados en Wuhan, la mayoría eran hombres con una edad media de 55 años y vinculados al Mercado Mayorista de Alimentos Marinos de Huanan [2]. La mayoría de los casos notificados tenían síntomas similares al inicio de enfermedades como fiebre, tos y mialgia o fatiga. La mayoría de los casos desarrollaron neumonía y algunas enfermedades respiratorias graves e incluso mortales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda [3]. El nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), un betacoronavirus, forma un clado dentro del subgénero sarbecovirus de la subfamilia Ortocoronavirinae [4]. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) también son betacoronavirus de origen zoonótico y se han relacionado con una posible enfermedad mortal durante los brotes en 2003 y 2012, respectivamente [5, 6]. Basándose en la evidencia actual, la patogenicidad para 2019-nCoV es aproximadamente 3%, lo que es significativamente menor que el SARS-CoV (10%) y el MERS-CoV (40%) [7]. Sin embargo, 2019-nCoV tiene una transmisibilidad potencialmente más alta (R0: 1.4-5,5) que SRAS-CoV (R0: [2] [3] [4] y MERS-CoV (R0: <1) [7]. Con la posible expansión de 2019-nCoV a nivel mundial [8] y la declaración del brote de 2019-nCoV como una emergencia de salud pública de preocupación internacional por la Organización Mundial de la Salud, existe una necesidad urgente de diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para detectar, prevenir y contener 2019-nCoV rápidamente. Sin embargo, actualmente existe una falta de comprensión de lo que está disponible en la fase inicial del brote de 2019-nCoV. La revisión sistemática describe y evalúa los posibles diagnósticos rápidos, vacunas y tratamientos para 2019-nCoV, basados en parte en la evolución de MERS-CoV y SARS-CoV. Se realizó una búsqueda sistemática en tres bases de datos electrónicas importantes (Biblioteca PubMed, Embase y Cochrane) para identificar estudios publicados que examinan el diagnóstico, los fármacos terapéuticos y las vacunas para el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV), de acuerdo con las directrices Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA). Había dos revisores independientes cada uno centrados en el SARS, el MERS y el 2019-nCoV, respectivamente. Un tercer revisor independiente se comprometió a resolver cualquier artículo de interés en conflicto. Utilizamos las palabras clave "SARS", "coronavirus", "MERS", "2019 Novel coronavirus", "Wuhan virus" para identificar las enfermedades en la estrategia de búsqueda. Las búsquedas sistemáticas de diagnóstico, fármacos terapéuticos y vacunas se llevaron a cabo de forma independiente y las palabras clave "fármaco", "terapia", "vacuna", "diagnóstico", "pruebas de puntos de atención" y "prueba diagnóstica rápida" se utilizaron junto con las palabras clave de la enfermedad para las búsquedas respectivas. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas de búsqueda en la Tabla S1. Se buscaron ensayos aleatorizados controlados (RCT) y ensayos de validación (para pruebas de diagnóstico) publicados en inglés, que midieron: a) la sensibilidad y/o especificidad de una prueba de diagnóstico rápido o un kit de pruebas de puntos de cuidado, b) el impacto de la terapia de fármacos o c) la eficacia de la vacuna contra cualquiera de estas enfermedades sin restricción de fecha aplicada. Además, se revisaron las referencias de artículos recuperados con el fin de identificar estudios o informes adicionales no recuperados por las búsquedas iniciales. Se excluyeron los estudios que examinaron los mecanismos de pruebas diagnósticas, terapia farmacológica o eficacia vacunal contra SARS, MERS y 2019-nCoV. Una búsqueda en Google de diagnósticos 2019-nCoV (al 6 de febrero de 2020; Tabla S2 ) produjo cinco enlaces de páginas web de organismos gubernamentales e internacionales con información y directrices oficiales (OMS, Europa CDC, US CDC, US FDA), tres enlaces de páginas web sobre protocolos diagnóstico y comentarios científicos, y cinco enlaces de páginas web sobre noticias de mercado y comunicados de prensa. Se publicaron seis protocolos para diagnósticos utilizando reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) de seis países en el sitio web de la OMS [9]. Con la aparición de 2019-nCoV, RT-PCR en tiempo real sigue siendo el principal medio para diagnosticar la nueva cepa viral entre las muchas plataformas diagnósticas disponibles ( [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [19] ; Tabla S3 ). Entre los 16 estudios de diagnóstico seleccionados, un estudio discutió el uso de RT-PCR en el diagnóstico de pacientes con 2019-nCoV [11] (Tabla 1 ). El período y el tipo de espécimen recolectado para RT-PCR desempeñan un papel importante en el diagnóstico de 2019-nCoV. Se encontró que los especímenes respiratorios fueron positivos para el virus mientras que el suero fue negativo en los primeros días de la enfermedad. Aparte de la RT-PCR comúnmente utilizada en el diagnóstico de MERS-CoV, cuatro estudios identificaron varios métodos diagnósticos como la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), PCR isotérmico aislado por RT (RT-iiPCR) y un ensayo rRT-PCR de un solo paso basado en sondas TaqMan específicas. RT-LAMP tiene sensibilidad similar a RT-PCR en tiempo real. También es muy específico y se utiliza para detectar MERS-CoV. Es comparable a las pruebas de diagnóstico habituales y es rápido, sencillo y conveniente. Asimismo, RT-iiPCR y un ensayo rRT-PCR de un solo paso también han mostrado sensibilidad similar y alta especificidad para MER-CoV. Por último, un estudio centrado en la validación de los seis kits RT-PCR reales comerciales, con alta precisión. Aunque el RT-PCR en tiempo real es un método primario para diagnosticar el MERS-CoV, altos niveles de inhibición del PCR pueden dificultar la sensibilidad al PCR (Tabla 1). Hay once estudios que se centran en la prueba diagnóstica del SARS-CoV (Tabla 1). Estos trabajos describen métodos diagnósticos para detectar el virus con la mayoría de ellos utilizando pruebas moleculares para el diagnóstico. Comparación entre la prueba molecular (es decir, RT-PCR) y la prueba serológica (es decir, ELISA) mostró que la prueba molecular tiene una mejor sensibilidad y especificidad. Por lo tanto, se realizaron mejoras a la prueba molecular actual para mejorar el diagnóstico. Estudios analizaron el uso del PCR anidado para incluir un paso de preamplificación o incorporar el gen N como marcador molecular sensible adicional para mejorar la sensibilidad (Tabla 1 ). Además, hay siete kits de diagnóstico rápido potencial (al 24 de enero de 2020; Tabla 2 ) disponibles en el mercado para 2019-nCoV. Seis de ellos son sólo para fines de investigación. Sólo un kit del Beijing Genome Institute (BGI) está aprobado para su uso en el entorno clínico para el diagnóstico rápido. La mayoría de los kits son para RT-PCR. Había dos kits (BGI, China y Veredus, Singapur) con la capacidad de detectar múltiples patógenos utilizando tecnologías de secuenciación y microarray, respectivamente. El límite de detección del método PCR mejorado en tiempo real fue 10 2 veces mayor que el ensayo PCR estándar en tiempo real y 10 7 veces mayor que los métodos PCR convencionales En el aspecto clínico, el método PCR mejorado en tiempo real fue capaz de detectar 6 casos de muestras positivas de SARS-CoV que no fueron confirmadas por ningún otro ensayo [25] • La PCR en tiempo real tiene una sensibilidad umbral de 10 equivalentes genomas por reacción y tiene una buena reproducibilidad con los coeficientes de variación inter-ensayo de 1,73 a 2,72%. • 13 muestras de 6 pacientes fueron positivas con rango de carga viral de 362 a 36.240.000 equivalentes genomas/ml. La reacción RT-PCR en tiempo real fue más sensible que la reacción PCR anidada, ya que el límite de detección de la reacción PCR anidada fue de aproximadamente 10 3 equivalentes genomas en el control estándar de la [34] PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR); ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp); marco de lectura abierto 1a (ORF1a); amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP); ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA); ensayo inmunofluorescente (IFA); prueba inmunocromatográfica (TIC); aspirado nasofaríngeo (NPA). Con la aparición de 2019-nCoV, hay alrededor de 15 posibles candidatos a vacuna en el oleoducto mundial (Tabla 3 ), en el que se aplicó una amplia gama de tecnología (como ARN mensajero, nanopartículas basadas en el ADN, sintéticas y víricas modificadas) y es probable que la mayoría de los candidatos tarden aproximadamente un año en iniciar ensayos clínicos de fase 1 excepto los financiados por la Coalición para Innovaciones Epidémicas de Preparación Sin embargo, el kit desarrollado por el BGI ha pasado el procedimiento de aprobación de emergencia de la Administración Nacional de Productos Médicos, y actualmente se utilizan en centros clínicos y de vigilancia de China [40]. Del total de 570 estudios únicos sobre vacunas de 2019-nCoV, SARS CoV o MERS-CoV examinados, sólo cuatro fueron finalmente incluidos en la revisión. La mayoría de los estudios sobre vacunas de SARS y MERS fueron excluidos ya que se realizaron en modelos celulares o animales (Figura 1 ). Los cuatro estudios incluidos en esta revisión fueron ensayos clínicos de fase I sobre vacunas de SARS o MERS (Tabla 4 ) [44] [45] [46] [47]. No hubo estudios de ningún tipo de población (celular, animal, humano) en el punto de detección de 2019-nCoV. Los ensayos clínicos publicados se realizaron principalmente en Estados Unidos excepto uno sobre la vacuna de SARS realizada en China [4 Se informó de que todos los candidatos a la vacuna para el SARS y el MERS eran seguros, bien tolerados y capaces de desencadenar las respuestas inmunes pertinentes y apropiadas en los participantes. Además, destacamos seis ensayos clínicos en fase I identificados en el registro ClinicalTrials.gov ( [48, 49] ); Tabla S4 ) [50] [51] [52]. Todos estos ensayos están probando la seguridad e inmunogenicidad de sus respectivos candidatos a la vacuna MERS-CoV, pero fueron excluidos ya que aún no se han publicado resultados. Se prevé que los ensayos concluyan en diciembre de 2020 (dos estudios en Rusia [50, 51] ) y diciembre de 2021 (en Alemania [52] ). Entre los 23 ensayos encontrados en la revisión sistemática (tabla 5), hay nueve ensayos clínicos registrados en el registro de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov) para las terapias de 2019-nCoV [53] [54] [56] [57] [59] [60] [61]. De los cuales cinco estudios sobre hidroxicloroquina, lopinavir más ritonavir y arbidol, células madre mesenquimales, medicina tradicional china y uso de terapia glucocorticoide han comenzado a reclutarse. Los cuatro estudios restantes abarcan la investigación de antivirales, atomización del interferón, darunavir y cobicistat, arbidol y uso de remdesivir para pacientes de 2019-nCoV (tabla 5). La seroconversión medida por S1-ELISA se produjo en 86% y 94% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente, y se mantuvo en 79% participantes hasta el final del estudio en la semana 60. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en 50% participantes en uno o más momentos durante el estudio, pero sólo 3% mantuvieron la actividad de neutralización hasta el final del estudio. Las respuestas de células T fueron detectadas en 71% y 76% participantes después de 2 y 3 dosis, respectivamente. No hubo diferencias en las respuestas inmunitarias entre los grupos de dosis después de 6 semanas y las respuestas humorales y celulares inducidas por la vacuna fueron detectadas respectivamente en 77% y 64% participantes en la semana 60. [47] Las moléculas desarrolladas por los científicos universitarios inhiben dos enzimas del coronavirus y previenen su replicación. Los investigadores señalan que los fármacos identificados pueden no estar disponibles para abordar el brote en curso, pero esperan hacerlo accesible para futuros brotes. [85] Además de los seis ensayos controlados aleatorizados completados seleccionados de la revisión sistemática (Tabla 6), sólo hay un ensayo controlado aleatorizado en curso dirigido a terapias SRAS [92]. Los estudios encontrados en ClinicalTrials.gov no se han actualizado desde 2013. Si bien muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohortes realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con lopinavir/ritonavir o ribavirina solamente, todavía no se han realizado ensayos clínicos bien diseñados que investiguen su uso. Se realizaron tres ensayos controlados aleatorizados completados durante la epidemia SRAS-3 en China, 1 en Taiwán y 2 en Hong Kong [93] [95] [96] [97]. Los estudios investigaron, respectivamente, el uso de antibióticos en 190 participantes, la combinación de tratamiento occidental y chino frente al tratamiento chino en 123 participantes, el tratamiento integrador chino y occidental en 49 pacientes, el uso de un medicamento chino específico en cuatro participantes y el uso temprano de corticosteroides en 16 participantes. Otro estudio notable fue un estudio abierto no aleatorizado que investigó el uso de ribavirina/lopinavir/ritonavir en 152 participantes [98]. Se excluyó un ensayo aleatorizado controlado que investigó el tratamiento integrador occidental y chino durante la epidemia del SARS, ya que se trataba de un artículo chino [94]. Sólo hay un ensayo aleatorizado controlado en curso dirigido a la terapia del MERS [99]. Se investiga el uso de Lopinavir/Ritonavir e Interferón Beta 1B. Asimismo, muchos estudios prospectivos y retrospectivos de cohorte realizados durante la epidemia centrados en el uso de ribavirina con Hasta la fecha, sólo se ha completado un ensayo. Un ensayo clínico de fase 1 que investigaba la seguridad y tolerabilidad de una inmunoglobulina policlonal IgG totalmente humana (SAB-301) se encontró en la literatura disponible [46]. El ensayo realizado en los Estados Unidos en 2017 demostró que SAB-301 era seguro y bien tolerado a dosis únicas. Otro ensayo sobre terapia MERS se encontró en el ensayo ClinicalTrials.gov-a fase 2/3 en los Estados Unidos evaluando la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética (PK) e inmunogenicidad en anticuerpos MERS-CoV administrados conjuntamente REGN3048 y REGN3051 [100]. Los diagnósticos rápidos desempeñan un papel importante en el manejo de enfermedades y brotes. El diagnóstico rápido y preciso de una infección viral específica permite una vigilancia rápida y precisa de la salud pública, la prevención y las medidas de control. El diagnóstico rápido también facilita otras intervenciones específicas de salud pública, como el cierre de instalaciones de alto riesgo y zonas asociadas a los casos confirmados de control rápido de infecciones y descontaminación ambiental [11, 101]. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse mediante: a) la detección del material genético del virus, b) la detección de anticuerpos que neutralizan las partículas virales de interés, c) la detección de epitopes virales de interés con anticuerpos (pruebas serológicas), o d) el cultivo y aislamiento de partículas virales viables. Las limitaciones clave de la detección del material genético son la falta de conocimiento de la presencia de virus viables, la posible reactividad cruzada con regiones genéticas no específicas y el corto plazo para la detección precisa durante la fase de infección aguda. Las limitaciones clave de las pruebas serológicas es la necesidad de recoger muestras séricas emparejadas (en las fases aguda y convaleciente) de los casos investigados para su confirmación con el fin de eliminar la potencial reactividad cruzada de anticuerpos no específicos de la exposición pasada y/o infección por otros coronavirus. La limitación del cultivo y aislamiento del virus es la larga duración y las habilidades altamente especializadas requeridas por los técnicos para procesar las muestras. Todos los pacientes se recuperaron.Recortó significativamente el tiempo desde el inicio de la enfermedad hasta la mejoría de los síntomas en el tratamiento (5,10 ± 2,83 días) en comparación con el grupo control (7,62 ± 2,27 días) (p < 0,05) No hubo diferencia significativa en la mejora de la rutina sanguínea, la sombra torácica pulmonar en la mejora de la película torácica y las urgas corticosteroides entre los 2 grupos. Sin embargo, especialmente en lo que respecta a mejorar los síntomas clínicos, elevar la calidad de vida, promover la recuperación de la función inmunitaria, promover la absorción de la inflamación pulmonar, reducir la dosis de cortiesteroides y acortar el curso terapéutico, el tratamiento con tratamiento integrador chino y medicina occidental tuvo una superioridad evidente en comparación con el tratamiento de control solo. Las infusiones únicas de SAB-301 hasta 50 mg/kg parecen ser seguras y bien toleradas en participantes sanos. [46] Cuando las muestras biológicas se toman también desempeñan un papel en la sensibilidad de estas pruebas. Para el SARS-CoV y el MERS-CoV, las muestras recogidas de las vías respiratorias inferiores como el esputo y los aspirados traqueales tienen niveles más altos y más prolongados de ARN viral debido al tropismo del virus. Aunque pueden utilizarse muestras del tracto respiratorio superior, como hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos, tienen cargas virales potencialmente más bajas y pueden tener mayor riesgo de falsos negativos entre los casos de MERS y SARS leves [102, 103], y probablemente entre los casos de 2019-nCoV. Las prácticas existentes en la detección del material genético de los coronavirus como el SARS-CoV y el MERS-CoV incluyen: a) reacción inversa de la cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), b) RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), c) amplificación isotérmica mediada por el bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y d) RT-LAMP en tiempo real [104]. Las pruebas de amplificación nucleica (NAAT) son generalmente preferidas como en el caso del diagnóstico MERS-CoV ya que tiene la mayor sensibilidad en el momento más temprano en la fase aguda de la infección [102]. Las autoridades sanitarias chinas han publicado recientemente el genoma completo de 2019-nCoV en el GenBank y en el portal GISAID para facilitar la detección del virus [113]. Se han desarrollado varios ensayos de laboratorio para detectar el nuevo coronavirus en Wuhan, como se destaca en las directrices provisionales de la OMS sobre pruebas de laboratorio nCoV de casos sospechosos, entre ellos protocolos de otros países como Tailandia, Japón y China [105]. La primera prueba de diagnóstico validada fue diseñada en Alemania. Corman y otros habían diseñado inicialmente un ensayo RT-PCR de diagnóstico candidato basado en el SARS o el coronavirus relacionado con SARS, ya que se sugirió que el virus circulante era similar al SA Tras la liberación de la secuencia, se seleccionaron ensayos basados en la comparación con 2019-nCoV al inspeccionar la alineación de la secuencia. Se utilizaron dos ensayos para el gen ARN dependiente de ARN polimerasa (RdRP) y el gen E, donde el ensayo del gen E actúa como la herramienta de cribado de primera línea y el ensayo del gen RdRp como prueba confirmatoria. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos en el sentido de que no reaccionaron de forma cruzada con otros coronavirus y también muestras clínicas humanas que contenían virus respiratorios [11]. La Universidad de Hong Kong utilizó dos ensayos monoplex que fueron reactivos con coronavirus bajo el subgénero Sarbecovirus (consistente de COV 2019-n, SARS-CoV y coronavirus similar al SARS). El ARN viral extraído del SARS-CoV se puede utilizar como control positivo para el protocolo sugerido asumiendo que el SARS ha sido erradicado. Se propone que el gen N RT-PCR pueda ser utilizado como ensayo de cribado mientras que el ensayo Orf1b actúa como prueba confirmatoria. Sin embargo, este protocolo sólo ha sido evaluado con un panel de controles con el único control positivo SARS-CoV ARN. El control sintético de oligonucleótidos o 2019-nCoV aún no han sido probados [106]. El CDC de EE.UU. compartió el protocolo en tiempo real RT-PCR ensayo para la detección del 2019-nCoV con los imprimadores y sondas diseñados para la detección universal del coronavirus similar al SARS y la detección específica de 2019-nCoV. Sin embargo, el protocolo no ha sido validado en otras plataformas o farmacias aparte del protocolo descrito Hay algunas limitaciones para el ensayo. Los analistas involucrados tienen que ser entrenados y familiarizados con el procedimiento de prueba y la interpretación de resultados. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir debido a organismos insuficientes en la muestra resultantes de la recolección, transporte o manipulación incorrectas. Además, los virus ARN pueden mostrar variabilidad genética sustancial, lo que podría resultar en un desajuste entre el imprimador y las sondas con la secuencia diana que puede disminuir el rendimiento del ensayo o resultar en resultados falsos negativos [107]. El kit de prueba de punto de cuidado puede potencialmente minimizar estas limitaciones, que deben ser altamente priorizadas para la investigación y el desarrollo en los próximos meses. Las pruebas serológicas como ELISA, IIFT y pruebas de neutralización son eficaces para determinar el grado de infección, incluyendo estimar la tasa de ataque y asintomática. En comparación con la detección del genoma viral a través de métodos moleculares, las pruebas serológicas detectan anticuerpos y antígenos Habría un período de desfase ya que los anticuerpos dirigidos específicamente al virus aparecerían normalmente entre 14 y 28 días después de la aparición de la enfermedad [108]. Además, los estudios sugieren que los títulos de anticuerpos bajos en la segunda semana o la producción de anticuerpos retardada podrían estar asociados con la mortalidad con una alta carga viral. Por lo tanto, es probable que se utilicen diagnósticos serológicos cuando no se dispone de pruebas de amplificación nucleica (NAAT) o no se puede acceder a ellas [102]. Las vacunas pueden prevenir y proteger contra la infección y la aparición de enfermedades cuando están expuestas al patógeno específico de interés, especialmente en poblaciones vulnerables que son más propensas a resultados graves. En el contexto del brote actual de 2019-nCoV, las vacunas ayudarán a controlar y reducir la transmisión de la enfermedad creando inmunidad de rebaños además de proteger a los individuos sanos de la infección, lo que disminuye el valor R0 efectivo de Sin embargo, existen obstáculos sociales, clínicos y económicos para los programas de vacunación y vacunación, entre ellos: a) la voluntad del público de someterse a la vacunación con una nueva vacuna; b) los efectos secundarios y las reacciones adversas graves de la vacunación; c) la diferencia potencial y/o baja eficacia de la vacuna en poblaciones diferentes de las poblaciones de los ensayos clínicos; y d) la accesibilidad de las vacunas a una población determinada (incluidos el costo y la disponibilidad de la vacuna); las vacunas contra la vacuna 2019-nCoV están en desarrollo y ninguna está en pruebas (en el momento de redactarse el presente informe). El 23 de enero de 2020, la Coalición para la Innovación en la Preparación Epidémica (CEPI) anunció que financiarán programas de desarrollo de vacunas con Inovio, la Universidad de Queensland y Moderna, Inc., respectivamente, con el objetivo de probar las vacunas experimentales clínicamente en 16 semanas (para junio de 2020). Los candidatos a la vacuna serán desarrollados por las plataformas de vacunas de ADN, recombinante y mRNA de estas organizaciones [109]. Basados en el brote más reciente de MERS-CoV, ya hay un número de candidatos a la vacuna que se están desarrollando, pero la mayoría todavía se encuentran en la etapa de pruebas preclínicas.Las vacunas en desarrollo incluyen vacunas virales basadas en vectores, vacunas de ADN, vacunas de subunidades, vacunas de partículas similares a virus (VLPs), vacunas de virus enteros inactivados (VIVS) y vacunas atenuadas vivas.Los últimos hallazgos de estas vacunas se basan en la revisión realizada por Yong et al. (2019) en agosto de 2019 [119].A partir de la fecha de presentación de informes, sólo hay un estudio clínico publicado sobre la vacuna MERS-CoV por GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47]. Ambos ensayos clínicos de fase I reportaron resultados positivos, pero solo uno ha anunciado planes para proceder al ensayo de fase 2 [111]. Debido a la estrecha relación genética de SARS-CoV (79%) con 2019-nCoV [112], puede haber un posible efecto cruzadoprotector del uso de una vacuna segura SARS-CoV mientras se espera la vacuna 2019-nCoV. Sin embargo, esto requeriría la implementación fase por fase a pequeña escala y un estrecho seguimiento de las vacunas antes de cualquier implementación a gran escala. Aparte del diagnóstico oportuno de los casos, el logro de resultados clínicos favorables depende del tratamiento oportuno administrado. Se ha reportado que ACE2 es el mismo receptor de entrada celular utilizado por 2019-nCoV para infectar a los seres humanos que SARS-CoV [113]. Por lo tanto, se espera que la similitud clínica entre los dos virus, particularmente en casos graves. Además, la mayoría de las personas que han muerto de MERS-CoV, SRAS-CoV y 2019-nCoV eran de edad avanzada y tenían condiciones de salud subyacentes como hipertensión, diabetes o enfermedades cardiovasculares que comprometían su sistema inmunitario [114]. Los coronavirus tienen polimerasas ARN dependientes de ARN propensos a errores (RdRP), que resultan en mutaciones frecuentes y eventos de recombinación, lo que resulta en una diversidad de cuasiespecies que está estrechamente asociada con la evolución adaptativa y la capacidad de mejorar la entrada de células virales para causar enfermedades a lo largo del tiempo en una población específica en riesgo [115]. Dado que la ACE2 está abundantemente presente en los seres humanos en la epitelia del pulmón y el intestino delgado, los coronavirus son propensos a infectar el tracto respiratorio y gastrointestinal superior y esto puede influir en el tipo de terapias contra 2019- Sin embargo, en los años siguientes a dos grandes brotes de coronavirus SARS-CoV en 2003 y MERS-CoV en 2012, no hay consenso sobre la terapia óptima para cualquiera de las dos enfermedades [116, 117]. Los ensayos clínicos bien diseñados que proporcionan el estándar oro para evaluar las medidas terapéuticas son escasos. No hay inhibidores de la proteasa por coronavirus que hayan completado exitosamente un programa de desarrollo preclínico a pesar de grandes esfuerzos explorando inhibidores del SARS-CoV. La mayor parte de las estrategias terapéuticas potenciales permanecen en la fase experimental, con sólo un puñado cruzando el obstáculo in vitro. Se requieren mayores esfuerzos en la investigación para opciones de tratamiento de los principales coronavirus dado su potencial pandémico. Las opciones de tratamiento eficaces son esenciales para maximizar la restauración de las poblaciones afectadas a una buena salud después de las infecciones. Actualmente no hay antiviral específico eficaz con evidencia de alto nivel; cualquier terapia antiviral específica debe ser proporcionada en el contexto de un estudio clínico/trial. Pocos tratamientos han mostrado acción curativa real contra el SARS y el MERS y la literatura generalmente describe casos aislados o series de casos pequeños. Muchos interferones de las tres clases han sido probados para sus actividades antivirales contra el SARS-CoV tanto in vitro como en modelos animales. El interferón β ha demostrado ser el más activo, seguido por interferón α. El uso de corticosteroides con interferón alfacon-1 (ferroferón sintético α) parece haber mejorado la oxigenación y la resolución más rápida de las anomalías de la radiografía de tórax en estudios observacionales con controles no tratados. Interferón se ha utilizado en estudios observacionales múltiples para tratar pacientes con SARS-CoV y MERS-CoV [116, 117]. Los interferones, con o sin ribavirina, y lopinavir/ritonavir son los más propensos a ser beneficiosos y se están probando en China para 2019-nCoV. Este tratamiento farmacológico parece ser el más avanzado. Es probable que el tiempo de tratamiento sea un factor importante de eficacia. Se utilizó una combinación de ribavirina y lopinavir/ritonavir como profilaxis post-exposición en trabajadores de la salud y puede haber reducido el riesgo de infección. Es poco probable que la ribavirina sola tenga actividades antivirales sustanciales a dosis clínicamente utilizadas. Por lo tanto, ribavirina con o sin corticosteroides y con lopinavir y ritonavir se encuentran entre las combinaciones empleadas. Este fue el agente más común reportado en la literatura disponible. Su eficacia ha sido evaluada en estudios observacionales, series retrospectivas de casos, estudio retrospectivo de cohorte, estudio prospectivo observacional, estudio prospectivo de cohor Lopinavir/ritonavir (Kaletra) fue la primera combinación de inhibidores de la proteasa introducida para el tratamiento del SARS-CoV. Su eficacia fue documentada en varios estudios, causando una incidencia notablemente menor de resultados adversos que con ribavirina sola. El uso combinado con ribavirina también se asoció con una menor incidencia de síndrome de distrés respiratorio agudo, infección nosocomial y muerte, entre otros resultados favorables. Estudios in vitro recientes han mostrado que otro inhibidor de la proteasa del VIH, nelfinavir, tiene capacidad antiviral frente al SARS-CoV, aunque aún no ha mostrado resultados favorables en estudios en animales [118]. Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734), análogo a los nucleósidos in vitro e in vivo, apoya el desarrollo de datos GS-5734 como posible antiviral pan-coronavirus basado en los resultados frente a varios coronavirus (CoVs), incluyendo CoVs altamente patógenos y BatCoVs potencialmente emergentes. El uso de remdesivir puede ser un buen candidato como tratamiento investigativo. Se informó de una mejor mortalidad tras la recepción de plasma convaleciente en varias dosis en varios estudios observacionales que incluyeron casos de infecciones respiratorias agudas graves (ISRA) de etiología viral. Una reducción significativa de las probabilidades de mortalidad agrupadas tras el tratamiento de 0,25 en comparación con placebo o sin terapia se observó [119]. Sin embargo, los estudios se presentaron con un riesgo moderado a alto de sesgo dados los tamaños pequeños de las muestras, la Las asociaciones entre plasma convaleciente y duración hospitalaria, los niveles de anticuerpos virales y la carga viral respectivamente fueron igualmente inconsistentes en la literatura disponible. El plasma convaleciente, aunque prometedor, aún no es factible, dado el limitado número de donantes potenciales y los problemas de escalabilidad. El tratamiento con anticuerpos monoclonales está progresando. El SARS-CoV entra en las células huésped a través de la unión de su proteína de pico (S) a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y CD209L [118]. Los anticuerpos monoclonales humanos a la proteína S han demostrado reducir significativamente la gravedad de la patología pulmonar en primates no humanos después de la infección por MERS-CoV [120]. Estos anticuerpos neutralizantes pueden ser provocados mediante inmunización activa o pasiva utilizando vacunas o plasma convaleciente respectivamente. Aunque estos anticuerpos neutralizantes se pueden recolectar teóricamente de individuos inmunizados con vacunas, existe incertidumbre sobre el logro de niveles terapéuticos de anticuerpos. También se han reportado otros agentes terapéuticos. Un agente antipalúdico conocido, la cloroquina, produce efectos antivirales contra múltiples virus incluyendo VIH tipo 1, hepatitis B y HCoV-229E. La cloroquina también es inmunomoduladora, capaz de suprimir la producción y liberación de factores que median las complicaciones inflamatorias de las enfermedades virales (factor necrosis tumoral e interleucina 6) [121]. Se postula que la cloroquina funciona alterando la glicosilación ACE2 y el pH endosomal. Sus propiedades antiinflamatorias pueden ser beneficiosas para el tratamiento del SARS. La niclosamida como un fármaco conocido utilizado en el tratamiento antihelminótico. La eficacia de la niclosamida como inhibidor de la replica En ambos análisis de inmunoblot y ensayos de inmunofluorescencia, se observó que el tratamiento con niclosamida inhibe completamente la síntesis de antígenos virales. La reducción del rendimiento del virus en las células infectadas dependía de la dosis. Es probable que la niclosamida no interfiera en las primeras etapas de la unión y entrada del virus en las células, ni funcione como un inhibidor de la proteasa. Los mecanismos de actividad de niclosamida justifican una investigación adicional [122]. La glicirrizina también inhibe la adsorción y penetración del virus en las primeras etapas de la replicación del virus. La glicirrizina fue un inhibidor significativamente potente con un índice de selectividad bajo cuando se probó contra varios flavivirus patógenos. Mientras que los resultados preliminares sugieren la producción de óxido nitroso (que inhibe la replicación del virus) mediante la inducción de óxido nitroso sintasa, El compuesto también tiene una toxicidad relativamente menor en comparación con inhibidores de la proteasa como la ribavirina [123]. La actividad inhibitoria también se detectó en la baicalina [124], extraída de otra hierba utilizada en el tratamiento del SARS en China y Hong Kong. Los hallazgos sobre estos compuestos se limitan a estudios in vitro [121] [122] [123] [124]. Debido a la rápida evolución de la situación del 2019-nCoV, habrá limitaciones potenciales a la revisión sistemática. La revisión sistemática es probable que tenga sesgo de publicación, ya que algunos desarrollos aún no han sido reportados, mientras que para otros desarrollos no hay intención de informar públicamente (o en plataformas científicas) debido a preocupaciones de confidencialidad. Sin embargo, esto puede limitarse a unos pocos desarrollos para la revisión, ya que la publicidad ayuda en cierta medida a la marca para la empresa y/o el financiador. Además, debido a la rápida necesidad de compartir el estado de estos desarrollos, puede haber sesgo de notificación en algunos detalles proporcionados por los autores de los artículos científicos o artículos de comentarios en los medios tradicionales. Por último, aunque no es viable para ninguna forma de evaluación de la calidad y metaanálisis de los artículos seleccionados debido a los datos limitados proporcionados y el estilo heterogéneo de los informes de diferentes artículos, este trabajo ha proporcionado una visión general de los posibles desarrollos de estas intervenciones farmacéuticas durante la fase inicial del brote. Esta revisión sistemática sería útil para comprobar de forma cruzada cuando la evaluación de la calidad y el metaanálisis de estos desarrollos se realizan como un estudio de seguimiento. Sin embargo, las lecciones de MERS-CoV y SRAS-CoV han demostrado que los recorridos para estos desarrollos pueden seguir siendo difíciles. Materiales suplementarios: Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Tabla S1 : Ejemplo de estrategia de búsqueda completa en Pubmed, Tabla S2 : Google Buscar: diagnósticos 2019-nCoV, Tabla S3 : Resumen de ensayos de diagnóstico desarrollados para 2019-nCoV, Tabla S4

¿Dónde se diseñó la primera prueba de diagnóstico validada?

Port d’Entrée for Respiratory Infections – Does the Influenza A Virus Pave the Way for Bacterias? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5742597/SHA: ee0050c6fb81a4067d134010d0c80d21edb5df0bAutores: Siemens, Nikolai; Oehmcke-Hecht, Sonja; Mettenleiter, Thomas C.; Kreikemeyer, Bernd; Valentin-Weigand, Peter; Hammerschmidt, SvenFecha: 2017-12-21DOI: 10.3389/fmicb.2017.02602Licencia: cc-byAbstract: Las coinfecciones bacterianas y virales de las vías respiratorias son El Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes son colonizadores frecuentes del tracto respiratorio superior. Los desequilibrios mediante la adquisición de virus estacionales, por ejemplo, el virus Influenza A, pueden conducir a la diseminación bacteriana al tracto respiratorio inferior, lo que a su vez puede dar lugar a una neumonía grave. En esta revisión, se resume el conocimiento actual sobre las coinfecciones bacterianas y virales del tracto respiratorio y se enfoca en posibles modelos experimentales adecuados para imitar esta enfermedad. La transmisión del VAI y la neumonía se modela principalmente por infección de ratón. Pocos estudios que utilizan hurones, ratas, cobayas, conejos y primates no humanos también están disponibles. Los conocimientos adquiridos de estos estudios llevaron a importantes descubrimientos y avances en la comprensión de estas enfermedades infecciosas. Sin embargo, los modelos de ratón y otras infecciones tienen limitaciones, especialmente en En este caso, se sugiere el uso de tejidos pulmonares modificados por ingeniería humana, tejidos pulmonares ex vivo humanos y modelos porcinos para estudiar las coinfecciones respiratorias, que podrían contribuir a una mayor traducción de los resultados a los seres humanos y mejorar tanto la salud animal como humana. Texto: En los últimos años la microbiota humana es cada vez más reconocida por desempeñar un papel crucial en la patogénesis de muchas enfermedades (Weinstock, 2012). El tracto respiratorio superior es un nicho natural para bacterias potencialmente patogénicas incrustadas en comunidades comensales que forman el microbioma nasofaríngeo. En particular, las comunidades microbianas de la nasofaringe (Hilty et al., 2012) están asociadas con enfermedades respiratorias, es decir, neumonía grave, que son responsables de una mortalidad y morbilidad considerables en humanos en todo el mundo (Prina et al., 2016). La composición del microbioma nasofaríngeo es altamente dinámica (Biesbroek et al., 2014a,b,c) y muchos factores, incluyendo factores ambientales y de acogida, pueden afectar a la colonización microbiana (Koppen et al., 2015). Estudios recientes sobre neonatos han demostrado que la microbiota respiratoria se desarrolla desde la flora mixta inicialmente transmitida maternalmente con predominio de la especie Streptococcus viridans hasta perfiles bacterianos específicos de nicho que contienen principalmente Staphylococcus aureus a alrededor de 1 semana de edad (Bosch et al., 2016a). Entre 2 semanas y 6 meses después del nacimiento, el predominio estafilococo declina y colonización con Streptococcus pneumoniae (pneumococci) como un patobionet predominante emerge (Miller et al., 2011; Bosch et La composición dinámica del microbioma está garantizada a través de la interacción entre las especies bacterianas, otros microbios y las condiciones ambientales cambiantes, así como las interacciones huésped-bacteria (Blaser y Falkow, 2009 ). La mayor parte del tiempo, el microbioma y su interacción con el huésped humano se cree que son beneficiosas para ambos (Pettigrew et al., 2008; Murphy et al., 2009 ). Sin embargo, los desequilibrios en la composición microbiana pueden conducir a la adquisición de nuevas especies virales o bacterianas e invasión de patógenos potenciales, que a su vez pueden llegar a ser perjudiciales, especialmente en personas mayores y niños con un sistema inmunológico agotado o inmaduro (Pettigrew et al., 2008; Blaser y Falkow, 2009; Murphy et al., 2009. Un ejemplo particular que muestra desequilibrios introducidos por dosis únicas de antibióticos fue demostrado por Ichinohe Mientras que la microbiota respiratoria comensal facilitó el soporte inmune contra la infección por el virus de la influenza A (IAV), el tratamiento oral con antibióticos resultó no sólo en un cambio de la composición bacteriana, sino también en la inmunidad de células CD4 T-, CD8 T- y B- tras la infección por el virus de la gripe A en ratones (Ichinohe et al., 2011). Los análisis de microbiomas orofaríngeos humanos durante la pandemia de VAI H1N1 de 2009 revelaron que a nivel filo, la abundancia de Fermicutos y Proteobacterias se aumentó en pacientes con neumonía en comparación con controles saludables (Leung et al., 2013). Sin embargo, otro estudio publicado en el mismo año contradijo estos resultados (Chaban et al., 2013). Chaban y sus colegas analizaron microbiomas de 65 pacientes del brote de VAI H1N1 en 2009. Aunque la composición filogenética de los pacientes con neumonía estuvo dominada por Fermicutes, Proteobacterias y Actinobacterias, no se observaron diferencias significativas entre los pacientes y los controles sanos ni ninguna otra variable probada, incluyendo edad y género (Chaban et al., 2013). En esta revisión se discuten infecciones bacterianas secundarias del tracto respiratorio después de la infección primaria por el VAI con un enfoque en los mecanismos por los cuales estas interacciones son potencialmente mediadas, y se proporcionará una visión de la contribución del huésped y consecuencias inmunológicas. Además, nos centramos en modelos animales potenciales adecuados para imitar la colonización bacteriana asintomática y la progresión de la enfermedad y por lo tanto, permitiendo estudiar estrategias de adaptación, interacciones viral-bacterianas y respuestas inmunes en estas coinfección altamente letales. Los virus de la influenza A pertenecen a la familia de Orthomyxoviridae y se basan en la antigenicidad de su hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) que se clasifican en 16 subtipos clásicos de la HA y 9 de la NA clásica (Neumann et al., 2009). Los genomas de 8 segmentados de los virus de la gripe A se caracterizan por una plasticidad significativa. Debido a mutaciones puntuales y eventos de re-asociación surgen nuevas variantes o cepas con potencial epidémico o pandémico (Neumann et al., 2009). Además, la gripe puede transmitirse entre animales, incluyendo cerdos, aves, caballos y humanos, por lo que es una enfermedad zoonótica (van der Meer et al., 2010). La gripe estacional suele resolverse sin consecuencias en individuos sanos. Sin embargo, se estima que los efectos estacionales de la gripe entre el 5 y el 10% de la población mundial resultan en alrededor de 250.000 a 500.000 muertes anuales (Tjon-Kon-Fat et al., 2016). Con mayor riesgo de desarrollar neumonía bacteriana secundaria son individuos con comorbilidades, personas de edad avanzada (edad > 65), mujeres embarazadas y niños menores de 1 año (Rothberg et al., 2008). Durante mucho tiempo se consideró que la cepa H1N1, un virus H1N1 similar al de las aves, causó directamente la mayoría de las muertes durante la pandemia de 1918-1919 (gripe española), a menudo de una neumonitis hemorrágica que progresa rápidamente a síndrome de dificultad respiratoria aguda y muerte (Osterholm, 2005; Gerberding, 2006; Oxford et al., 2006). La pandemia mató alrededor de 50 millones de personas en todo el mundo y Sin embargo, muchos de los hallazgos han sido reinterpretados en los últimos años (Brundage y Shanks, 2007; Chien et al., 2009). Se estima que alrededor del 95% de todos los casos graves y muertes fueron atribuidas a infecciones secundarias con patógenos bacterianos, principalmente por Streptococcus pneumoniae (Morens et al., 2008). Estudios individuales limitados a ciertas regiones identificaron también otros patógenos comúnmente colonizando el tracto respiratorio, incluyendo Staphylococcus aureus, grupo A streptococcus (GAS) y Haemophilus influenzae (Brundage y Shanks, 2008). Durante las siguientes dos pandemias (H2N2 Asian Flu 1957 y H3N2 Hong Kong Flu 1968 -1969 coinfección bacteriana fueron menos probables que la causa de muerte fuera la gripe española (Giles y Shuttle Sin embargo, la neumonía representó alrededor del 44% de las muertes durante la gripe asiática (Giles and Shuttleworth, 1957). La mayoría de las muertes resultantes de la neumonía ocurrieron en individuos con enfermedades crónicas, es decir, enfermedades pulmonares crónicas, carditis reumática e hipertensión (Giles and Shuttleworth, 1957). En 1957-1958, S. aureus fue predominantemente aislado de casos de neumonía fatal (Hers et al., 1957 (Hers et al., 1958 Robertson et al., 1958; Martin et al., 1959), mientras que S. pneumoniae regresó como causa predominante de neumonía grave durante la gripe de Hong Kong (Sharrar, 1969; Bisno et al., 1971; Burk et al., 1971; Schwarzamann et al., 1971). Cuarenta años más tarde, en 2009, surgió un nuevo virus H1N1 de origen porcino que volvió a causar una pandemia (Dawood et al., 2009 (Dawood et al., 2012 ). A diferencia de la gripe asiática y de Hong Kong, las tasas de mortalidad fueron bastante bajas, pero la mayoría de las muertes ocurrieron en jóvenes sanos sin condiciones subyacentes (Reichert et al., 2010; Monsalvo et al., 2011; Dawood et al., 2012). Alrededor del 25-50% de los casos graves o mortales se relacionaron con complicaciones debidas a neumonía bacteriana (Dominguez-Cherit et al., 2009; Estenssoro et al., 2010; Mauad et al., 2010; Shieh et al., 2010 ). Aunque se produjeron variaciones regionales, los neumococos y S. aureus fueron las especies bacterianas más frecuentemente aisladas (Mauad et al., 2010; Shieh et al., 2010; Rice et al., 2012). El estreptococo del grupo A estuvo ausente en muchos brotes de neumonía local asociados con virus, pero predominó en otros (Brundage and Shanks, 2008; Ampofo et al., 2010). Cuando aparece, es típicamente tercero en incidencia (Chaussee et al., 2011). En general, los datos sobre brotes pandémicos sugieren que la gravedad y mortalidad de la enfermedad pueden estar vinculados a patógenos bacterianos secundarios con variaciones dependiendo de las regiones y el estado de inmunidad de la población (Brundage and Shanks, 2008; Shanks et al., 2010 Shanks et al., 2011 McCullers, 2013). Hay cada vez más evidencia de que la microbiota nasofaríngea desempeña un papel importante en la patogénesis de las infecciones respiratorias víricas agudas (Teo et al., 2015; de Steenhuijsen Piters et al., 2016; Rosas-Salazar et al., 2016a,b). Se ha demostrado que los virus respiratorios, incluido el VAI, alteran la adherencia bacteriana y la colonización, lo que aumenta el riesgo de infecciones bacterianas secundarias (Tregoning y Schwarze, 2010). Los neumococci, S. aureus y el GAS son importantes patógenos Gram positivos humanos. Todos ellos son colonizadores frecuentes de la nasofaringe humana y comparten muchas características, incluidos los mecanismos patógenos y los aspectos clínicos (Figura 1). El Staphylococcus aureus coloniza persistentemente alrededor del 30% de la población humana y los nichos típicos incluyen nares, axilas y piel (Peacock et al., 2001; von Eiff et al., 2001; van Belkum et al., 2009). Causan una variedad de manifestaciones clínicas que van desde infecciones leves de la piel hasta neumonía necrotizante fatal. En las últimas décadas, el patógeno se hizo resistente a un número creciente de antibióticos y S. aureus resistente a la meticilina (MRSA) es ahora una causa importante de infecciones adquiridas en hospitales (Hartman y Tomasz, 1984; Ubukata et al., 1989; Zetola et al., 2005). También el aumento de cepas de S. aureus adquiridas en la comunidad es de especial preocupación, porque ciertos clones están asociados con infecciones muy graves (Rasigade Estudios prospectivos recientes demostraron un aumento en la proporción de S. aureus sensibles a la meticilina adquirida por la comunidad en casos de neumonía grave (McCaskill et al., 2007; Sicot et al., 2013). El neumococo es un colonizador típico de la nasofaringe humana. Alrededor del 20-50% de los niños sanos y del 8-30% de los adultos sanos son colonizados asintomáticamente (McCullers, 2006). Los neumococos causan enfermedades que van desde leves, es decir, sinusitis, conjuntivitis y otitis media, hasta infecciones más graves y potencialmente mortales, incluyendo neumonía adquirida por la comunidad, bacteremia y meningitis (Bogaert et al., 2004; Valles et al., 2016). Esta bacteria se asocia con altas tasas de morbilidad y mortalidad en grupos de riesgo como individuos inmunocomprometidos, niños y ancianos (Black et al., 2010; Valles et al., 2016). Los estreptococos del grupo A colonizan la boca y el tracto respiratorio superior en alrededor del 2-5% de la población mundial (Okumura y Nizet, 2014). Las infecciones más comunes, no invasivas y leves causadas por el GAS son amigdalitis y faringitis con 600 millones de casos estimados al año (Carapetis et al., 2005). Enumerado como el número nueve en la lista de asesinos globales con alrededor de 500.000 muertes anuales (Carapetis et al., 2005), es obvio que este patógeno puede causar infecciones invasivas graves, incluyendo neumonía, sepsis, síndrome de shock tóxico estreptocócico, e infecciones cutáneas necrotizantes (Cunningham, 2000; Carapetis et al., 2005). Aunque los tres patógenos son capaces de causar enfermedades altamente letales, el más mortal sigue siendo el neumocococo, estimado para causar aproximadamente el 10% de todas las muertes en niños menores de 5 años de edad (O'Brien et al., 2009), en los ancianos (Marrie et al., 2017), y en individuos inmunocomprometidos (Baxter et al., 2016). El virus de la gripe A se une a través de la HA al ácido siálico α2,3 o α2,6 ligado a la superficie de las células epiteliales del tracto respiratorio superior e inferior (Webster et al., 1992). Las cepas estacionales muestran generalmente afinidad a los ácidos siálicos α2,6 ligados a la tráquea humana, mientras que los virus similares a los de la ave se unen preferentemente a los ácidos siálicos α2,3 ligados a las células alveolares de tipo II (Shinya et al., 2006; van Riel et al., 2007 van Riel et al.,, 2010. La liberación de ARN genómico viral en el citosol activa diferentes vías de respuesta inmune. La unión del ARN viral al gen inducible del ácido retinoico 1 induce la expresión de los interferones de tipo I y III y activa el factor de transcripción NF-B, que a su vez activa la liberación de citocinas proinflamatorias (Durbin et al., 2013; Iwasaki y Pillai, 2014). Además, la activación del inflamatorio conduce a la liberación de IL-1β e IL-18 (Pothlichet et al., 2013; Iwasaki y Pillai, 2014). Todas estas respuestas se supone que promueven el aclaramiento viral. Sin embargo, la presencia de proteínas virales durante la infección induce también la activación directa de la vía apoptótica intrínseca o indirecta mediante la producción de citocinas inflamatorias, resultando en apoptosis o incluso necrosis del epitelio (Korteweg y Gu, 2008) Además, la coagulación aberrante inducida por la infección por virus provoca una respuesta hiperinflamatoria (Yang y Tang, 2016). Todos estos eventos contribuyen a la lesión del tejido pulmonar (Imai et al., 2008; Davidson et al., 2014). El daño epitelial debido a la replicación viral proporciona un ambiente beneficioso para la unión bacteriana inicial (Plotkowski et al., 1993). Por otro lado, las bacterias ya colonizadas pueden aumentar la virulencia del virus de la gripe, ya sea secretando directamente las proteasas que se cortan y activan HA (Figura 2 ) (Bottcher-Friebertshauser et al., 2013) o, indirectamente, activando proteasasas del huésped como el plasminógeno, lo que aumenta las tasas de replicación y la infectividad del virus (Scheiblauer et Las bacterias potencialmente patógenas, incluyendo las tres especies mencionadas anteriormente, expresan un arsenal de factores de virulencia responsables de la unión a las estructuras humanas huésped. Componentes de la superficie microbiana que reconocen las moléculas de la matriz adhesiva FIGURA 1 Modelos potenciales para estudiar coinfecciones bacterianas y virales del tracto respiratorio. S. pneumoniae, S. aureus, S. pyogenes y S. suis son colonizadores frecuentes del tracto respiratorio superior. La infección estacional por VAI puede conducir a un mayor riesgo de infecciones bacterianas secundarias, es decir, neumonía. Se pueden utilizar varios modelos experimentales para estudiar estas infecciones graves. Las muestras de pacientes, incluido el tejido pulmonar ex vivo, son materiales de elección, pero son raras debido a consideraciones éticas. Las coinfecciones bacterianas y virales in vivo se realizan principalmente en ratones, lo que no se parece necesariamente a la fisiología humana y al sistema inmunitario. Por lo tanto, sugerimos utilizar el modelo porcino, que casi se asemeja a más del 80% del sistema inmunitario humano. (MSCRAMM), tales como PspC, PspA y PsaA en neumococci (Hammerschmidt, 2006), SPA, FnbA, ClfA y ClfB en S. aureus (Bartlett y Hulten, 2010; Otto, 2010), y proteína M, PrtF1 y PrtF2 en GAS (Cunningham, 2000), respectivamente, y las llamadas proteínas iluminantes de la luna expresadas por las tres especies, por ejemplo, GAPDH, enolasa o PGK (Fulde y otros, 2013), permiten a las bacterias unirse a células o moléculas dañadas de la matriz extracelular, incluyendo fibronectina, fibrin, fibrinógeno y colágenos, o proteínas fibrinolíticas como plasminógeno (McCullers y Rehg, 2002; Bergmann Una vez que se produce la unión inicial, citotoxinas bacterianas, incluyendo neumolisina de neumococos (Garcia-Suarez Mdel et al., 2007; Zahlten et al., 2015), α-hemolisina y leucocidinas de S. aureus (Mairpady Shambat et al., 2015) y Streptolysins S y O y exotoxina pirogénica pirogénica B de S. pyogenes (Tsai et al., 1998; Gurel et al., 2013; Siemens et al., 2015 Siemens et al.,, 2016, pueden sinergizar con contrapartes virales para aumentar aún más la patología del tejido pulmonar. Entre los posibles mecanismos adicionales por los que podría producirse la colonización inicial del tracto respiratorio inferior y daño del tejido pulmonar se incluyen la potenciación del desarrollo de neumonía por parte de la neuraminidasa del VAI mediante la eliminación enzimática del ácido siálico del pulmón, exponiendo así los receptores del huésped para la adhesión neumocócica (McCullers y Bartmess, 2003). El estado inflamatorio del huésped en respuesta a la infección viral puede alterar la presentación de los receptores en la superficie, permitiendo así la invasión bacteriana (Cundell y Tuomanen, 1994). A medida que el paciente comienza a recuperarse de la infección viral, pueden ocurrir infecciones bacterianas secundarias (Louria et al., 1959) debido a la curación incompleta de la herida y la exposición de los componentes de la membrana del huésped, incluyendo lamina, colágenos tipo I y IV a las MSCRAMMs bacterianas clásicas ( Las células epiteliales son las primeras en responder a las infecciones pulmonares, seguidas por los macrófagos alveolares residentes en el tejido. Promueven el aclaramiento viral a través de fagocitosis, eferocitosis y liberación de citocinas y quimioquinas para promover las respuestas inmunes (Hashimoto et al., 2007; Kumagai et al., 2007; Wang et al., 2012; Hillaire et al., 2013). Los virus respiratorios como el VAI son capaces de inducir la supresión y muerte de los macrófagos alveolares residentes (Figura 2 ) (Ghoneim et al., 2013). Estas células suelen ser reemplazadas por la diferenciación de monocitos derivados de la sangre reclutados en macrófagos de diferentes patrones de polarización, lo que a su vez crea un retraso en el aclaramiento de patógenos y Además, la inducción de interferones como respuesta a la infección viral compromete la detección inmunitaria de bacterias Gram-positivas por neutrófilos y macrófagos, lo que normalmente eliminaría las bacterias de los pulmones (Figura 2 ) (Sun y Metzger, 2008; Tian et al., 2012). El mecanismo exacto subyacente a este fenómeno todavía no se entiende. Varios estudios sugieren que el ARN viral activa los receptores de tipo peaje (TLR) 2 y TLR4 y, en consecuencia, la producción de interferones de tipo I para promover un estado antiviral (Shahangian et al., 2009). La infección posterior por bacterias Gram-positivas, p. ej., pneumococci, potencia la expresión de interferón tipo I, que a su vez suprime la producción de la quimioquina CCL2 y el reclutamiento de macrófagos (Nakamura Frontiers in Microbiology www.bordersin.org FIGURE 2 La interacción entre el VAI, las bacterias y el huésped humano. El daño epitelial debido a la replicación viral proporciona un ambiente beneficioso para la unión bacteriana (Bact.). El VAI es capaz de inducir la supresión y muerte de los macrófagos alveolares residentes (AM), que a su vez retrasa el aclaramiento viral. La liberación de ARN viral activa diferentes vías de respuesta inmune que resultan en tormenta de citoquinas. Los interferones de tipo I y III comprometen el reconocimiento inmune de bacterias Gram-positivas por neu Además, podrían suprimir la función celular asesina natural (NK), incluyendo la liberación de TNF, que activa los macrófagos alveolares. Después de la inflamación inicial, la situación podría empeorar debido a la infiltración celular de los pulmones por neutrófilos (PMN), lo que conduce a un aumento de la desgranulación y el daño tisular por moléculas efectoras, incluyendo la proteína de unión a la heparina (HBP). et al., 2011). Otro estudio de Shahangian et al. (2009) reveló que el estado antiviral conduce a la producción deteriorada de quimioattractantes neutrófilos CXCL1 y CXCL2, que a su vez promueve respuestas inmunológicas menos eficaces debido a las funciones neutrófilas atenuadas durante la fase temprana de la invasión neumocócica. Otros estudios encontraron que los pulmones expuestos habían dañado las respuestas La reducción de la producción de TNFα por las células NK se identificó como un mecanismo previo crucial de las actividades antimicrobianas deprimidas por los macrófagos alveolares (Figura 2 ) (Small et al., 2010). Parece probable que IAV NA también sea capaz de activar los receptores de células huésped de manera dependiente de TGF-β, lo que a su vez promueve la invasión de GAS y la patología pulmonar posterior (Li et al., 2015). Estudios in vitro sobre la interacción entre las células dendríticas humanas y los neumococos IAV revelaron TLR3 como un sensor crucial de ARN viral y bacteriano que conduce a una producción mejorada de IL-12p70, que a su vez podría promover un estado antiviral mediante la regulación de los interferones (Yamamoto et al., 2004; Spelmink Sin embargo, cabe señalar que dependiendo de la especie bacteriana la manifestación de la enfermedad y las respuestas inmunes innatas subyacentes pueden variar (Sharma-Chawla et al., 2016). Muchos de los estudios experimentales sobre los mecanismos de la enfermedad y las respuestas inmunitarias se basan en una infección bacteriana posterior en horas o pocos días después de la infección por VAI. Sin embargo, las infiltraciones bacterianas de los pulmones pueden ocurrir mucho más tarde, es decir, durante el inicio de la cicatrización de heridas después del aclaramiento parcial del VAI, que se ha reportado en la mayoría de los estudios realizados en los últimos años (Snelgrove et al., 2008; Hussell y Cavanagh, 2009 ). Estos procesos se caracterizan por un estado antiinflamatorio general y la supresión de mecanismos involucrados en el aclaramiento de patógenos debido al aumento de la producción de interleucina-10 (van der Sluijs et al. El estado antiinflamatorio suprime la expresión de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) en fagocitos profesionales que conducen a la fagocitosis alterada y la muerte de microbios. Estos eventos podrían permitir el sobrecrecimiento bacteriano en los pulmones y patología tisular (Sun and Metzger, 2008; Goulding et al., 2011). Al igual que otras enfermedades infecciosas graves causadas por agentes individuales, la neumonía se caracteriza por condiciones hiperinflamatorias de los pulmones al inicio de la infección, seguido de un estado hipoinflamatorio con parálisis inmune (Morton et al., 2014). En las coinfecciones, después de la inflamación inicial en respuesta a la infección viral, la situación podría empeorar debido a la invasión bacteriana y la infiltración celular mejorada de los pulmones por neutrófilos, lo que conduce a un aumento del daño tisular y la tormenta de citoquinas (Figura 2 ) (Conenello et al., 2007; McAuley et al., 2007 McAuley et al.,, 2010 Porto y Stein, 2016). Además, el sistema de coagulación se activa y contribuye a la respuesta fisiopatológica a la infección (van der Poll y Herwald, 2014). Bacterias como pneumococci, S. aureus y GAS pueden activar y modular el sistema de coagulación, lo que conduce a una amplia expresión del factor tisular e incrementar el riesgo de coagulopatía grave Shannon et al., 2013; Walters et Los patógenos bacterianos también expresan una variedad de toxinas citolíticas que pueden contribuir a la inflamación y patología tisular. La neumolisina, una toxina neumocócica formadora de poros con baja afinidad a las células epiteliales pulmonares, puede dañar los neutrófilos mediante la utilización del receptor P2X7 (Domon et al., 2016). Las citotoxinas estafilocócicas (α-toxina y leucocidinas, incluyendo Panton-Valentina leucocidina, PVL) están asociadas con patología tisular severa, fuerte regulación de quimioquinas, y el aumento de la afluencia de neutrófilos de los pulmones (Mairpady Shambat et al., 2015). Las toxinas GAS, incluyendo SLO y SpeB, son capaces de causar daño tisular directamente y promover estados proinflamatorios a través de la lisis de neutrófilos (Snall et al., 2016; Uhlmann et al., 2016). Los efectos citolíticos causados por toxinas bacterianas podrían sinergizarse con el resultado de la proteína accesoria citotóxica IAV, PB1-F2, patología tisular mediada que conduce a una mayor producción de citocinas (Ramos y Fernández-Sesma, 2012). Tomados juntos, lo más probable, efectos sinérgicos de las vías que están involucradas en la inflamación bacteriana y viral conducen a una mayor activación inmune y una mayor morbilidad y mortalidad (Joyce et al., 2009; Koppe et al., 2012; Ramos y Fernández-Sesma, 2012; Bucasas et al., 2013; La Figura 2 resume la interacción entre virus, bacterias y huésped. Los modelos animales experimentales son una herramienta útil para estudiar los efectos in vivo de diferentes agentes infecciosos y representan aproximadamente el 3% de toda la investigación sobre neumonía publicada en revistas de revisión por pares (Hraiech et al., 2015). Sin embargo, el aumento constante de estudios en animales en las últimas décadas contrasta con su reproducibilidad en humanos (Hackam y Redelmeier, 2006). Hackam y sus colegas identificaron 2.000 artículos publicados entre 1980 y 2006 en siete revistas científicas líderes que publican regularmente estudios en animales (Hackam y Redelmeier, 2006). Setenta y seis de 2.000 fueron muy citados con un recuento medio de citas de 889. De estos 76 estudios 28 fueron replicados en ensayos aleatorios humanos, 14 fueron contradichos y 34 permanecieron sin probar (Hackam y Redelmeier, 2006). Sólo un 1,4% de los estudios en animales publicados en revistas de alto impacto fueron traducidos en ensayos aleatorizados en humanos (Hackam y Redelmeier, 2006), mientras que alrededor de un 44% de la tasa de replicación fue reportada en estudios humanos altamente citados (Ioannidis, 2005). En modelos de neumonía, los mamíferos se utilizan principalmente por su proximidad anatómica y fisiológica al ser humano (Hraiech et al., 2015). Para monitorear estudios fisiológicos extensos, especies de mamíferos más grandes, incluyendo hurones, perros, conejos, cerdos y babuinos son los modelos de elección (Mizgerd y Skerrett, 2008). Sin embargo, los roedores y en particular ratones se utilizan con mayor frecuencia como organismos modelo de neumonía. La velocidad reproductiva rápida, el tamaño pequeño, el manejo menos complicado, la capacidad de reproducir y comparar los resultados con las monoinfecciones bacterianas y virales ya publicadas, el conocimiento detallado de la genética y las respuestas inmunitarias, y una plétora de reactivos disponibles para estudiar las infecciones en ratones son razones para el uso de estos animales. Para evitar variaciones en las respuestas debido a la diversidad genética, las cepas de ratones endogenados son herramientas útiles para estudios destinados a dilucidar los mecanismos moleculares de las enfermedades. Además, la ingeniería genética permitió generar una amplia variedad de variantes de ratón con genes de ganancia de función, pérdida de función o reportero (Mizgerd y Skerrett, 2008). Como se indicó anteriormente, muchos estudios in vivo sobre coinfecciones bacterianas y virales proporcionaron información útil sobre la neumonía grave, entre ellos: i) el hecho de que la infección viral prepara al huésped para la susceptibilidad bacteriana que conduce a una infección secundaria grave (Hashimoto et al., 2007; Shahangian et al., 2009; Chaussee et al., 2011; Nakamura et al., 2011); ii) sinergismo patógeno (Tsai et al., 1998; McCullers and Rehg, 2002; Garcia-Suarez Mdel et al., 2007; Gurel et al., 2013; Mairpady Shambat et al., 2015; Zahlten et al., 2015); iii) mayor respuesta inflamatoria al inicio de la infección (Korteweg y Gu, 2008; Durbin et al., 2013; Pothlichet Sin embargo, los modelos de ratón para infecciones bacterianas y/o virales tienen varias limitaciones. La mayoría de las especies bacterianas y virales bajo estudio son patógenos humanos. En los últimos años también se demostró que las variaciones genéticas del huésped y las diferencias de sexo tienen un impacto en la predisposición, severidad y resultado de la infección (Chella Krishnan et al., 2015 Mientras que los ratones C57BL/6 y BALB/c se caracterizan por una mayor resistencia, las cepas DBA/2 son más susceptibles y permisivas a las cepas bacterianas y virales (Alymova et al., 2011; Chella Krishnan et al., 2015. Además, la transmisión de VAI y bacterias es ineficiente en ratones adultos, lo que requiere modelos animales alternativos, incluyendo ratones neonatales o ferrets (Diavatopoulos et al., 2010; McCullers et al., 2010) Se demostró que el VAI era esencial para la transmisión neumocócica de ratones colonizados a sus compañeros ingenuos y la transmisión se produjo sólo cuando todos los ratones estaban infectados con el VAI (Diavatopoulos et al., 2010). et al., 2010. Los hurones son naturalmente susceptibles al VAI aislados de diferentes especies, incluyendo humanos, aves y cerdos (Thangavel y Bouvier, 2014). La infección de hurones con aislados de VAI estacionales humanos resulta en una infección del tracto respiratorio superior similar a la infección por gripe humana (Tripp y Tompkins, 2009). A diferencia de los ratones, el VAI humano no adaptado puede ser utilizado para la infección. Desafortunadamente, sólo hay pocos informes sobre coinfección bacteriana y VAI en este organismo modelo. Un informe de Sanford y Ramsay mostró una mayor colonización estafilocócica del tracto respiratorio superior en animales infectados por el VAI en comparación con los no infectados, mientras que no se observó diferencia entre ambos grupos en la infección por estreptococo del grupo B (Sanford y Ramsay, 1987). En contraste, Smith y Mc Cullers reportaron falta de establecimiento de infección por estafilococo incluso cuando los hurones estaban preinfectados con el VAI (Smith y McCullers, 2014). Las mayores ventajas de usar hurones como modelo incluyen: i) su susceptibilidad a patógenos humanos no adaptados, ii) la eficiencia en la transmisión del VAI y bacterias de un individuo a otro, y iii) la presentación de los signos clínicos de manifestación de la enfermedad similar a la infección por gripe humana. Desafortunadamente, su limitada disponibilidad, la compleja crianza y la limitada accesibilidad a reactivos específicos de hurones dificultan la realización de esta investigación (Bouvier y Lowen, 2010). En los últimos años, el cobaya (Cavia porcellus) también se utilizó en la investigación de neumonía. La fisiología y anatomía del pulmón de cobaya se asemeja en cierta medida al pulmón humano y este organismo modelo se utiliza a menudo en enfermedades pulmonares no infecciosas, incluyendo asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (Canning y Chou, 2008). Además, su disponibilidad comercial, facilidad de cría, la capacidad de trabajar con patógenos no adaptados y la eficiencia de la transmisión son razones para utilizar este modelo in vivo (Bouvier y Lowen, 2010). Aunque la replicación viral puede detectarse fácilmente tras la inoculación intranasal en el tracto respiratorio superior y los pulmones, los cobayas sólo presentan síntomas clínicos menores (Lowen et al., 2006; Gabbard et al., 2014). Sin embargo, la patología pulmonar de los cobayas infectados por el VAI se correlaciona con la gravedad clínica de la infección humana (Gabbard et al., 2014). La transmisión de neumococos en cobayas se promueve por la coinfección con el virus de Sendai (Saito et al., 1988). Los cobayas infectados por neumococos solos y enjaulados con animales de contacto no tratados transmiten la bacteria sólo en el 7% de los casos, mientras que los coconejillos infectados por el virus de Sendai adquirieron infección neumocócica en el 83% de Otro estudio evaluó la eficacia de los antibióticos en la infección pulmonar invasiva causada por neumococo resistente a la penicilina (Ponte et al., 1996). Instilación intraqueal de 3 × 10 9 UFC de S. pneumoniae indujo una neumonía fatal y bacteremia en el 85% de los animales no tratados dentro de las 46 h (Ponte et al., 1996). Al igual que con los hurones, hay una escasez de datos que describen las respuestas inmunitarias a los agentes infecciosos pulmonares, esto se debe en parte a la falta de reactivos específicos de especies, lo que es una desventaja en el uso de este organismo modelo. Recientemente, la rata de algodón (Sigmodon hispidus) fue reportada como susceptible a la VAI. Infección nasal y pulmonar en ratas adultas de algodón no requirieron adaptación viral (Otto La replicación del VAI fue más extensa en los tejidos nasales que en el pulmón y persistió durante seis días consecutivos. La patología tisular incluyó daño del epitelio bronquiolar y los animales desarrollaron neumonía que persistió durante casi 3 semanas (Ottolini et al., 2005). En los estudios bacteriológicos las ratas se utilizan con mayor frecuencia. Existen numerosos modelos de ratas que investigan el impacto de la diabetes (Oliveira et al., 2016), síndromes metabólicos (Feng et al., 2015), cirrosis, farmacocinética y dinámica (Antonopoulou et al., 2015; Hoover et al., 2015), intoxicación (Davis et al., 1991), inmunización (Iinuma y Okinaga, 1989) y factores de virulencia bacteriana general (Shanley et al., 1996) sobre el desarrollo de neumocócicos, estreptocócicos y neumonía estafilocócica y patología pulmonar. Lamentablemente, sólo hay pocos estudios sobre coinfecciones bacterianas y virales en ratas. La primera fue realizada por Harford et al., 1946 (Harford et al., 1946. Los autores concluyeron que la neumonía bacteriana secundaria no convierte la infección viral subletal en un resultado letal (Harford et al., 1946). Otro estudio sobre el virus sincitial respiratorio humano y S. pneumoniae reveló que las ratas fueron fácilmente colonizadas con neumococos, pero la replicación viral después de la infección posterior fue dependiente de la tensión. Además, ni los neumococos ni el virus se propagaron del tracto respiratorio superior al inferior, y ninguno de los patógenos se transmitió a compañeros de jaula ingenuos. Aunque las ratas comparten muchas características inmunes con los seres humanos, incluyendo la producción de óxido nítrico por macrófagos (Carsillo et al., 2009), las mayores desventajas son la baja disponibilidad animal, la agresividad de la especie y la falta de reactivos específicos. Los conejos (Oryctolagus cunilulus También se emplearon conejos para estudiar la neumonía, aunque sólo se dispone de unos pocos modelos. Los parámetros típicos de lectura incluyen supervivencia, infiltración de leucocitos en los pulmones, patología pulmonar y evaluación de la concentración de fármacos en el suero. Uno de los primeros estudios sobre neumonía neumocócica en conejos se realizó en Kline e Winternitz (1913). Este estudio reveló que los conejos poseen inmunidad activa si se han recuperado de un ataque de neumonía experimental y posteriormente pueden resistir dosis intratraqueales repetidas de neumococos (Kline e Winternitz, 1913). En 1926 se estableció una infección por inhalación de neumococos de tipo I en conejos (Stillman y Branch, 1926). Las bacterias se infiltraron fácilmente en el tracto respiratorio inferior y neumococos que llegaban a los pulmones generalmente desaparecieron en horas y aparecieron septicemia fatal en Los modelos más recientes de neumonía por neumococo y estafilococo en conejos se basan en infecciones intrabronquiales o intrapulmonares que las hacen útiles para la patogénesis (Diep et al., 2010 (Diep et al., 2017,, así como en estudios de eficacia y eficacia de fármacos (Cabellos et al., 1992; Croisier-Bertin et al., 2011). Sin embargo, esta vía de infección requiere cirugía y los reactivos específicos de especies son escasos. En la investigación de IAV los conejos se utilizan con frecuencia para la producción de anticuerpos y para estudios sobre cinética de anticuerpos después de administraciones únicas o múltiples de IAV (Loza-Tulimowska et al., 1977). Además, los conejos se utilizan para investigar la seguridad de las vacunas (por ejemplo, CoVaccine HT o Aflunov) (Heldens et al., 2010; Gasparini et al., 2012). En los últimos años se investigó el desprendimiento de IAV aviar por colas de algodón (Sylvilagus spp.) revelando que las colas de algodón inoculadas nasales y orales arrojan cantidades relativamente grandes de ARN viral (Root et al., 2014). En particular, se encontró que los títulos virales bajos eran suficientes para iniciar la replicación viral en colas de algodón (Root et al., 2017). Sin embargo, a pesar de su susceptibilidad a la infección por IAV, los conejos son raramente utilizados como modelo para la patogénesis por IAV, ya que no ofrecen mejoría sobre otros modelos de infección establecidos. Los Las especies más utilizadas son los macacos rhesus (Macaca mulatta) y los macacos cynomolgus (Macaca fasciluraris). Aunque se demostró a principios de ese año que los macacos eran susceptibles al VAI (Saslaw et al., 1946), los modelos animales de elección siguieron siendo hurones y ratones. Recientemente, los macacos se han utilizado para comparar la patogénesis de la pandemia altamente virulenta de 1918 VAI y la cepa de gripe patogénica de aves (H5N1) con una cepa convencional H1N1 (Rimmelzwaan et al., 2001). Los macacos cynomolgus infectados con H5N1 de alta patogenicidad desarrollaron síndrome de dificultad respiratoria aguda, fiebre y neumonía necrotizante (Rimmelzwaan et al., 2001). La cepa de 1918 del VAI indujo una disregulación de la respuesta antiviral que provocó una insuficiente protección del huésped, lo que a su vez resultó en malestar respiratorio agudo y desenlace fatal (Kobasa et al., 2007). El aislado pandémico H1N1 de EE.UU. de 2009 causó lesiones patológicas graves en los pulmones de los macacos (Itoh et al., 2009 ). Los tres estudios mencionados anteriormente utilizaron la administración intratraqueal combinada de altas dosis de virus. Un estudio reciente de Marriott et al. analizaron el resultado de las rutas de desafío, incluyendo la inhalación de aerosoles e instilación intranasal con dosis bajas a moderadas de H1N1 en macacos cinomolgus (Marriott et al., 2016). La replicación vírica fue detectada en todos los grupos de desafío, aunque la enfermedad permaneció subc Para el grupo A se realizaron análisis de transcriptoma longitudinal de infección estreptocócica en faringitis experimental (Virtaneva et al., 2005) e infección del tracto respiratorio inferior en macacos cinomolgus (Olsen et al., 2010a). La enfermedad del tracto respiratorio inferior observada en macacos después de la infección por GAS imitaba las características clínicas y patológicas de la bronconeumonía grave en humanos (Olsen et al., 2010a). Otro estudio realizado por Olsen y colegas analizó la contribución de PVL de una cepa USA300 S. aureus altamente virulenta en infección respiratoria (Olsen et al., 2010b). Aunque la enfermedad del tracto respiratorio inferior observada en el mono imitaba las características clínicas y patológicas de la neumonía temprana de leve a moderada en los seres humanos, no se pudo detectar ninguna afectación del PVL en la patología pulmonar o la afluencia de células inmunitarias de los pulmones (Olsen et al., 2010b). El mismo grupo de investigación ha desarrollado un modelo de coinfección no letal IAV (H3N2)-S. aureus coinfection model en cinomolgus macaques (Kobayashi et al., 2013). La progresión de la neumonía fue monitoreada por la evaluación de parámetros clínicos, química de la sangre, hisopos nasales y patología de los pulmones. Aunque los macacos se utilizan con frecuencia para evaluar la eficacia de la vacuna antineumocócica, incluyendo la prueba del impacto de la vacuna antineumocócica conjugada 13-valente y la vacuna antineumocócica polisacárida 23-valente en repertorios de células B de memoria específica de antígenos (Jia et al., 2017), en la última década sólo se realizaron dos estudios sobre transporte de neumocócicos y neumonía. En 2013, Philipp y sus colegas analizaron la tasa de transporte de neumocococo en 158 animales de la colonia. Ninguno de los rhesus macaques encuestados llevó S. pneumoniae en la nasofaringe (Philipp et al., 2012). Los autores concluyeron que el rhesus macaque probablemente no es un huésped natural de neumococos. Pero, cuando los bebés fueron colonizados con cepa 19F a través de la instilación nasofaríngea, la colonización fue inducida en ocho de ocho infantes, duró 2 semanas en todos los animales y 7 semanas en más del 60% (Philipp et al., 2012). El mismo grupo probó la neumolisina desintoxicada (dPly) y la proteína de triada de histidina neumocócica D (PhtD) como potenciales candidatos a vacuna para prevenir la neumonía (Denoel et al., 2011). Después de la inmunización los macacos rhesus fueron desafiados con una cepa neumocócica de 19F. La vacuna PhtD-dPly adyuvada con AS02 protegía a los animales contra la neumonía inducida por S. pneumoniae, que estaba relacionada con la capacidad (i) de reducir en gran medida la carga bacteriana dentro de la primera semana después del desafío y (ii) los niveles de anticuerpos específicos de PhtD-y Ply (Denoel et al., 2011). Aunque sólo existen unos pocos estudios macacos sobre neumonía, debido a la proximidad a los seres humanos en términos de fisiología e inmunidad, estos animales pueden ser un buen modelo en el contexto de estudios de traducción que evalúan la terapéutica y la profilaxis. A pesar del amplio uso de diferentes modelos animales, el modelo in vivo óptimo para la neumonía humana sigue sin identificarse. Los mamíferos pequeños, incluidos los roedores, son bien conocidos desde un punto de vista biológico, genético e inmunológico y son fáciles de mantener. La elección de estos animales Sin embargo, también están lejos de la anatomía, la fisiología, la inmunología y la susceptibilidad a los patógenos exclusivamente humanos. El modelo animal experimental debe ser elegido en base a respuestas comparables a los humanos. Los primates generalmente están legalmente reservados a temas específicos. En este caso, los cerdos podrían ser un sistema modelo apropiado para estudiar enfermedades infecciosas incluyendo neumonía (Figura 1). La composición y tamaño del genoma porcino es comparable a la de los humanos (Hart et al., 2007). Además, los órganos humanos y porcinos tienen muchas características y funciones comunes (Swindle et al., 2012). El tracto respiratorio superior de los humanos y los cerdos, incluyendo el tejido linfoide en la nasofaringe, es anatómicamente similar. Además, como los humanos, los cerdos poseen tonsils, que están ausentes en ratones (Horter et al., 2003). Una ventaja importante del estudio de enfermedades infecciosas mediante la utilización de cerdos como organismo huésped es que los cerdos tienen un conjunto completo de inmunizadores innatos y adaptativos. Según los resultados de secuenciación del genoma completo, el sistema inmunitario porcino se asemeja a más del 80% del sistema inmunitario humano, mientras que los ratones comparten menos del 10% con los humanos (Dawson et al., 2016). La mayoría de los compartimentos de células inmunes identificados en los seres humanos también están presentes en los cerdos (Piriou-Guzilack y Salmon, 2008; Fairbairn et al., 2011). A diferencia de los ratones y similares a los humanos, los cerdos tienen entre el 50 y el 70% de las células nucleares polimorfo circulantes (Fairbairn et al., 2011). Además, todas las citoquinas funcionales o ortologistas involucrados en el paradigma Th1, Th2, Th17 y Treg y las células inmunes correspondientes se han descrito en cerdos (Murtaugh et al., 2009; Kaser et al., 2011; Kiros et al., 2011). Especialmente el muy prominente quimio-atractivo proinflamatorio humano, CXCL8, está presente como un ortolog en cerdos, mientras que no hay homólogo en ratones (Fairbairn et al., 2011). A diferencia de los monocitos humanos, que pueden dividirse en tres subclases (CD14 clásico + CD16 −, CD14 no clásico + CD16 +, y CD14 intermedio ++ CD16 + ), los monocitos porcinos consisten en cuatro subclases (Chamorro et al., 2005; Fairbairn et al., 2013). Al igual que los monocitos humanos, expresan moléculas de adhesión, como VLA-4 y LFA-1 y moléculas costimuladoras, incluyendo CD80 y CD86 (Chamorro et al., 2005). El cerdo se ha utilizado previamente para imitar una serie de enfermedades infecciosas humanas. Ejemplos de infecciones por S. aureus con este organismo modelo son infecciones por heridas Svedman et al., 1989), osteomielitis (Jensen et al., 2010) y sepsis (Nielsen La inoculación intravenosa de lechones con neumococos llevó a la bacteriemia durante un período de 5 días y se asoció con fiebre y artritis séptica. La inoculación intranasal de lechones llevó a la colonización durante al menos seis días consecutivos sin causar signos clínicos (De Greeff et al., 2016). Además, la investigación sobre infecciones respiratorias de cerdos por patógenos humanos incluyendo S. aureus (Luna et al., 2009), Mycobacterium tuberculosis (Gil et al., 2010), Bordetella pertussis (Elahi et al., 2007), Pseudomonas aeruginosa (Luna et al., 2009), y IAV (Khatri et al., 2010), se realizó en los últimos años. El hecho de que los cerdos y los seres humanos estén infectados con subtipos idénticos de VAI (H1N1, H3N2), y muestren una presentación clínica y patogénesis similares, hace que los cerdos sean un organismo modelo ideal para estudios sobre coinfecciones respiratorias (Van Reeth et al., 1998). Especialmente las infecciones por VAI ya están bien establecidas en los cerdos (Van Reeth et al., 1998, 2002a Jung et al., 2007; Khatri et al., 2010; Barbe et al., 2011). Además del número limitado de publicaciones sobre cerdos y patógenos humanos, mucho se puede traducir y aprender de estudios sobre el patógeno zoonótico porcino Streptococcus suis. S. suis usualmente habita superficies mucosas de amígdalas, nares, genitales y tractos alimentarios de lechones. Una vez alterado el equilibrio microbiano, las bacterias pueden causar meningitis, septicemia, artritis y neumonía en cerdos (Staats et al., 1997). Algunas cepas de S. suis se consideran hipervirulentas y otras hipovirulentas. En general, el serotipo 2 se aísla con mayor frecuencia de cerdos enfermos (Staats et al., 1997). S. suis también puede causar enfermedades graves en los seres humanos, incluyendo septicemia, meningitis, artritis y síndrome de shock tóxico estreptocócico (Tang et al., 2006; Yu et al., 2006; Gottschalk et al., 2007). Aunque muchos estudios in vivo sobre S. suis se han realizado utilizando ratones como organismo modelo (Seitz et al., 2012; Auger et al., 2016), varios otros estudios han demostrado la ventaja de utilizar cerdos como huésped natural para S. suis (Bi et al., 2014; Ferrando et al., 2015). Una reciente publicación de Lin y colegas sobre H1N1 y S. suis co-infectados lechones demostró los efectos sinérgicos de ambos patógenos (Lin et al., 2015). Coinfectados lechones tuvieron una presentación clínica más severa y cambios patológicos en el pulmón, en comparación con los animales infectados con patógenos únicos (Lin et al., 2015). Además, los genes asociados con las respuestas inmunitarias, la producción de citocinas inflamatorias y las vías apoptóticas fueron muy sobreexpresados en el grupo coinfectado (Lin et al., 2015). Aunque el modelo porcino parece ser ideal para imitar enfermedades infecciosas humanas, también hay desventajas, incluyendo, por ejemplo, la necesidad de instalaciones animales experimentales especializadas, manejo de tiempo, altos costos de mantenimiento y disponibilidad limitada de animales transgénicos. Aunque el uso de animales contribuye en gran medida a nuestra comprensión de las enfermedades infecciosas, los modelos de tejido humano 3D-organotípico y tejidos de órganos ex vivo deben ser considerados, ya que son herramientas más valiosas para estudiar las interacciones host-patógenos en un entorno más complejo (Figura 1). Los enfoques de ingeniería de tejidos se centraron originalmente en la medicina regenerativa (Lager y Vacanti, 1993). A diferencia de los cultivos celulares monocapa estándar, los modelos de tejido se asemejan mucho más a la arquitectura 3D, la composición celular y la complejidad de la matriz del órgano respectivo. En los últimos años, la ingeniería tisular también se empleó con éxito en varios estudios sobre enfermedades infecciosas, como infecciones por virus del Zika de organoide cerebral (Lancaster et al., 2013; Dang et al., 2016), infecciones por Helicobacter pylori de organoide epitelial gástrico (McCracken et al., 2014; Schlaermann et al., 2016), infecciones por Escherichia coli y Rotavirus de enteroides gastrointestinales y pequeños intestinales (Saxena et al., 2015; VanDussen et al., 2015), infecciones por el virus Entamoeba histolytica o Hepatitis B de tejido sinusoide hepático (Petropolis et al., 2014 (Petropolis et al., 2016, Grupo A y G, infecciones por estreptococócicas Por ejemplo, el modelo de tejido pulmonar relevante para la neumonía consiste en fibroblastos pulmonares incrustados en una matriz de colágeno con una capa epitelial estratificada en la parte superior (Nguyen Hoang et al., 2012). El tejido diseñado es adecuado para implantar y estudiar células inmunitarias, incluyendo células dendríticas, monocitos, macrófagos e incluso células mononucleares de sangre periférica (Nguyen Hoang et al., 2012; Mairpady Shambat et al., 2015). Una publicación reciente demostró un evento doble de patología pulmonar en neumonía necrotizante estafilocócica (Mairpady Shambat et al., 2015). Mientras que la α-toxina tuvo un efecto perjudicial directo en el epitelio pulmonar, la PVL indujo patología pulmonar indirectamente a través de la lisis de neutrófilos (Mairpady Shambat et al., 2015). Todos los estudios mencionados anteriormente destacan un progreso significativo en el campo de las enfermedades infecciosas no sólo desde el punto de vista científico, sino también contribuyendo al principio de tres R de experimentación animal (Russell, 1995). En estos términos, el uso de biopsias de órganos humanos ex vivo cultivadas, que son raras debido a consideraciones éticas, es una opción adicional para estudiar interacciones host-patógeno. Este sistema ex vivo puede superar incluso las limitaciones del tejido diseñado. En los últimos años se han realizado infecciones del tejido pulmonar ex vivo humano con varios microorganismos, incluyendo neumococos (Szymanski et al., 2012; Fatykhova et al., 2015), Bacillus anthracis (Chakrabarty et al., 2007), Haemophilus influenzae (Zhang et al., 2016) y IAV (Nicholls et al., 2007; Chan et al., 2009). En el ámbito humano, la mayor parte del trabajo se ha centrado en el tropismo, la gravedad de las infecciones, la liberación de mediadores inflamatorios y las tasas de replicación de los microorganismos. Además, recientemente también se han realizado experimentos con el virus de la gripe porcina (SIV) y S. suis coinfecciones de las rebanadas de pulmón ex vivo porcino. Meng y sus colegas mostraron que la VIS promueve infecciones bacterianas posteriores en un proceso de dos pasos del cual el primer paso inicial fue dependiente de la expresión de la cápsula, mientras que el segundo paso de invasión bacteriana en capas más profundas fue independiente de la cápsula y requirió daño mediado por virus (Meng et al., 2015). Sin embargo, esto es sólo un comienzo y se necesitan más investigaciones para desentrañar la complejidad subyacente a estas infecciones altamente invasivas. En resumen, las coinfecciones bacterianas y virales del tracto respiratorio son altamente letales y representan una carga dramática para el sistema de salud mundial. La sinergia entre los agentes bacterianos y virales infecciosos está relacionada con una variedad de factores, incluyendo daño de barrera epitelial, respuesta inmune innata exagerada, y tormenta de citoquinas. A pesar de muchos avances en los últimos años, se necesita más conocimiento sobre mecanismos e inmunología de progresión Las caracterizaciones in vivo de estas infecciones graves se realizan principalmente en ratones que se asemejan poco a la fisiología humana y el sistema inmunológico. Se han hecho varios esfuerzos para establecer otros modelos, incluyendo hurones, cobayas, conejos, ratas y primates no humanos. Sin embargo, todos tienen limitaciones. Aquí, sugerimos utilizar el modelo porcino, que proporciona ventajas obvias en estudios de enfermedades infecciosas humanas y debe ser considerado mucho más frecuente para estudios futuros sobre enfermedades infecciosas graves, incluyendo neumonía.

¿Qué porcentaje de adultos sanos son colonizados asintóticamente por bacterias neumococcus?

Port d’Entrée for Respiratory Infections – Does the Influenza A Virus Pave the Way for Bacterias? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5742597/SHA: ee0050c6fb81a4067d134010d0c80d21edb5df0bAutores: Siemens, Nikolai; Oehmcke-Hecht, Sonja; Mettenleiter, Thomas C.; Kreikemeyer, Bernd; Valentin-Weigand, Peter; Hammerschmidt, SvenFecha: 2017-12-21DOI: 10.3389/fmicb.2017.02602Licencia: cc-byAbstract: Las coinfecciones bacterianas y virales de las vías respiratorias son El Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes son colonizadores frecuentes del tracto respiratorio superior. Los desequilibrios mediante la adquisición de virus estacionales, por ejemplo, el virus Influenza A, pueden conducir a la diseminación bacteriana al tracto respiratorio inferior, lo que a su vez puede dar lugar a una neumonía grave. En esta revisión, se resume el conocimiento actual sobre las coinfecciones bacterianas y virales del tracto respiratorio y se enfoca en posibles modelos experimentales adecuados para imitar esta enfermedad. La transmisión del VAI y la neumonía se modela principalmente por infección de ratón. Pocos estudios que utilizan hurones, ratas, cobayas, conejos y primates no humanos también están disponibles. Los conocimientos adquiridos de estos estudios llevaron a importantes descubrimientos y avances en la comprensión de estas enfermedades infecciosas. Sin embargo, los modelos de ratón y otras infecciones tienen limitaciones, especialmente en En este caso, se sugiere el uso de tejidos pulmonares modificados por ingeniería humana, tejidos pulmonares ex vivo humanos y modelos porcinos para estudiar las coinfecciones respiratorias, que podrían contribuir a una mayor traducción de los resultados a los seres humanos y mejorar tanto la salud animal como humana. Texto: En los últimos años la microbiota humana es cada vez más reconocida por desempeñar un papel crucial en la patogénesis de muchas enfermedades (Weinstock, 2012). El tracto respiratorio superior es un nicho natural para bacterias potencialmente patogénicas incrustadas en comunidades comensales que forman el microbioma nasofaríngeo. En particular, las comunidades microbianas de la nasofaringe (Hilty et al., 2012) están asociadas con enfermedades respiratorias, es decir, neumonía grave, que son responsables de una mortalidad y morbilidad considerables en humanos en todo el mundo (Prina et al., 2016). La composición del microbioma nasofaríngeo es altamente dinámica (Biesbroek et al., 2014a,b,c) y muchos factores, incluyendo factores ambientales y de acogida, pueden afectar a la colonización microbiana (Koppen et al., 2015). Estudios recientes sobre neonatos han demostrado que la microbiota respiratoria se desarrolla desde la flora mixta inicialmente transmitida maternalmente con predominio de la especie Streptococcus viridans hasta perfiles bacterianos específicos de nicho que contienen principalmente Staphylococcus aureus a alrededor de 1 semana de edad (Bosch et al., 2016a). Entre 2 semanas y 6 meses después del nacimiento, el predominio estafilococo declina y colonización con Streptococcus pneumoniae (pneumococci) como un patobionet predominante emerge (Miller et al., 2011; Bosch et La composición dinámica del microbioma está garantizada a través de la interacción entre las especies bacterianas, otros microbios y las condiciones ambientales cambiantes, así como las interacciones huésped-bacteria (Blaser y Falkow, 2009 ). La mayor parte del tiempo, el microbioma y su interacción con el huésped humano se cree que son beneficiosas para ambos (Pettigrew et al., 2008; Murphy et al., 2009 ). Sin embargo, los desequilibrios en la composición microbiana pueden conducir a la adquisición de nuevas especies virales o bacterianas e invasión de patógenos potenciales, que a su vez pueden llegar a ser perjudiciales, especialmente en personas mayores y niños con un sistema inmunológico agotado o inmaduro (Pettigrew et al., 2008; Blaser y Falkow, 2009; Murphy et al., 2009. Un ejemplo particular que muestra desequilibrios introducidos por dosis únicas de antibióticos fue demostrado por Ichinohe Mientras que la microbiota respiratoria comensal facilitó el soporte inmune contra la infección por el virus de la influenza A (IAV), el tratamiento oral con antibióticos resultó no sólo en un cambio de la composición bacteriana, sino también en la inmunidad de células CD4 T-, CD8 T- y B- tras la infección por el virus de la gripe A en ratones (Ichinohe et al., 2011). Los análisis de microbiomas orofaríngeos humanos durante la pandemia de VAI H1N1 de 2009 revelaron que a nivel filo, la abundancia de Fermicutos y Proteobacterias se aumentó en pacientes con neumonía en comparación con controles saludables (Leung et al., 2013). Sin embargo, otro estudio publicado en el mismo año contradijo estos resultados (Chaban et al., 2013). Chaban y sus colegas analizaron microbiomas de 65 pacientes del brote de VAI H1N1 en 2009. Aunque la composición filogenética de los pacientes con neumonía estuvo dominada por Fermicutes, Proteobacterias y Actinobacterias, no se observaron diferencias significativas entre los pacientes y los controles sanos ni ninguna otra variable probada, incluyendo edad y género (Chaban et al., 2013). En esta revisión se discuten infecciones bacterianas secundarias del tracto respiratorio después de la infección primaria por el VAI con un enfoque en los mecanismos por los cuales estas interacciones son potencialmente mediadas, y se proporcionará una visión de la contribución del huésped y consecuencias inmunológicas. Además, nos centramos en modelos animales potenciales adecuados para imitar la colonización bacteriana asintomática y la progresión de la enfermedad y por lo tanto, permitiendo estudiar estrategias de adaptación, interacciones viral-bacterianas y respuestas inmunes en estas coinfección altamente letales. Los virus de la influenza A pertenecen a la familia de Orthomyxoviridae y se basan en la antigenicidad de su hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) que se clasifican en 16 subtipos clásicos de la HA y 9 de la NA clásica (Neumann et al., 2009). Los genomas de 8 segmentados de los virus de la gripe A se caracterizan por una plasticidad significativa. Debido a mutaciones puntuales y eventos de re-asociación surgen nuevas variantes o cepas con potencial epidémico o pandémico (Neumann et al., 2009). Además, la gripe puede transmitirse entre animales, incluyendo cerdos, aves, caballos y humanos, por lo que es una enfermedad zoonótica (van der Meer et al., 2010). La gripe estacional suele resolverse sin consecuencias en individuos sanos. Sin embargo, se estima que los efectos estacionales de la gripe entre el 5 y el 10% de la población mundial resultan en alrededor de 250.000 a 500.000 muertes anuales (Tjon-Kon-Fat et al., 2016). Con mayor riesgo de desarrollar neumonía bacteriana secundaria son individuos con comorbilidades, personas de edad avanzada (edad > 65), mujeres embarazadas y niños menores de 1 año (Rothberg et al., 2008). Durante mucho tiempo se consideró que la cepa H1N1, un virus H1N1 similar al de las aves, causó directamente la mayoría de las muertes durante la pandemia de 1918-1919 (gripe española), a menudo de una neumonitis hemorrágica que progresa rápidamente a síndrome de dificultad respiratoria aguda y muerte (Osterholm, 2005; Gerberding, 2006; Oxford et al., 2006). La pandemia mató alrededor de 50 millones de personas en todo el mundo y Sin embargo, muchos de los hallazgos han sido reinterpretados en los últimos años (Brundage y Shanks, 2007; Chien et al., 2009). Se estima que alrededor del 95% de todos los casos graves y muertes fueron atribuidas a infecciones secundarias con patógenos bacterianos, principalmente por Streptococcus pneumoniae (Morens et al., 2008). Estudios individuales limitados a ciertas regiones identificaron también otros patógenos comúnmente colonizando el tracto respiratorio, incluyendo Staphylococcus aureus, grupo A streptococcus (GAS) y Haemophilus influenzae (Brundage y Shanks, 2008). Durante las siguientes dos pandemias (H2N2 Asian Flu 1957 y H3N2 Hong Kong Flu 1968 -1969 coinfección bacteriana fueron menos probables que la causa de muerte fuera la gripe española (Giles y Shuttle Sin embargo, la neumonía representó alrededor del 44% de las muertes durante la gripe asiática (Giles and Shuttleworth, 1957). La mayoría de las muertes resultantes de la neumonía ocurrieron en individuos con enfermedades crónicas, es decir, enfermedades pulmonares crónicas, carditis reumática e hipertensión (Giles and Shuttleworth, 1957). En 1957-1958, S. aureus fue predominantemente aislado de casos de neumonía fatal (Hers et al., 1957 (Hers et al., 1958 Robertson et al., 1958; Martin et al., 1959), mientras que S. pneumoniae regresó como causa predominante de neumonía grave durante la gripe de Hong Kong (Sharrar, 1969; Bisno et al., 1971; Burk et al., 1971; Schwarzamann et al., 1971). Cuarenta años más tarde, en 2009, surgió un nuevo virus H1N1 de origen porcino que volvió a causar una pandemia (Dawood et al., 2009 (Dawood et al., 2012 ). A diferencia de la gripe asiática y de Hong Kong, las tasas de mortalidad fueron bastante bajas, pero la mayoría de las muertes ocurrieron en jóvenes sanos sin condiciones subyacentes (Reichert et al., 2010; Monsalvo et al., 2011; Dawood et al., 2012). Alrededor del 25-50% de los casos graves o mortales se relacionaron con complicaciones debidas a neumonía bacteriana (Dominguez-Cherit et al., 2009; Estenssoro et al., 2010; Mauad et al., 2010; Shieh et al., 2010 ). Aunque se produjeron variaciones regionales, los neumococos y S. aureus fueron las especies bacterianas más frecuentemente aisladas (Mauad et al., 2010; Shieh et al., 2010; Rice et al., 2012). El estreptococo del grupo A estuvo ausente en muchos brotes de neumonía local asociados con virus, pero predominó en otros (Brundage and Shanks, 2008; Ampofo et al., 2010). Cuando aparece, es típicamente tercero en incidencia (Chaussee et al., 2011). En general, los datos sobre brotes pandémicos sugieren que la gravedad y mortalidad de la enfermedad pueden estar vinculados a patógenos bacterianos secundarios con variaciones dependiendo de las regiones y el estado de inmunidad de la población (Brundage and Shanks, 2008; Shanks et al., 2010 Shanks et al., 2011 McCullers, 2013). Hay cada vez más evidencia de que la microbiota nasofaríngea desempeña un papel importante en la patogénesis de las infecciones respiratorias víricas agudas (Teo et al., 2015; de Steenhuijsen Piters et al., 2016; Rosas-Salazar et al., 2016a,b). Se ha demostrado que los virus respiratorios, incluido el VAI, alteran la adherencia bacteriana y la colonización, lo que aumenta el riesgo de infecciones bacterianas secundarias (Tregoning y Schwarze, 2010). Los neumococci, S. aureus y el GAS son importantes patógenos Gram positivos humanos. Todos ellos son colonizadores frecuentes de la nasofaringe humana y comparten muchas características, incluidos los mecanismos patógenos y los aspectos clínicos (Figura 1). El Staphylococcus aureus coloniza persistentemente alrededor del 30% de la población humana y los nichos típicos incluyen nares, axilas y piel (Peacock et al., 2001; von Eiff et al., 2001; van Belkum et al., 2009). Causan una variedad de manifestaciones clínicas que van desde infecciones leves de la piel hasta neumonía necrotizante fatal. En las últimas décadas, el patógeno se hizo resistente a un número creciente de antibióticos y S. aureus resistente a la meticilina (MRSA) es ahora una causa importante de infecciones adquiridas en hospitales (Hartman y Tomasz, 1984; Ubukata et al., 1989; Zetola et al., 2005). También el aumento de cepas de S. aureus adquiridas en la comunidad es de especial preocupación, porque ciertos clones están asociados con infecciones muy graves (Rasigade Estudios prospectivos recientes demostraron un aumento en la proporción de S. aureus sensibles a la meticilina adquirida por la comunidad en casos de neumonía grave (McCaskill et al., 2007; Sicot et al., 2013). El neumococo es un colonizador típico de la nasofaringe humana. Alrededor del 20-50% de los niños sanos y del 8-30% de los adultos sanos son colonizados asintomáticamente (McCullers, 2006). Los neumococos causan enfermedades que van desde leves, es decir, sinusitis, conjuntivitis y otitis media, hasta infecciones más graves y potencialmente mortales, incluyendo neumonía adquirida por la comunidad, bacteremia y meningitis (Bogaert et al., 2004; Valles et al., 2016). Esta bacteria se asocia con altas tasas de morbilidad y mortalidad en grupos de riesgo como individuos inmunocomprometidos, niños y ancianos (Black et al., 2010; Valles et al., 2016). Los estreptococos del grupo A colonizan la boca y el tracto respiratorio superior en alrededor del 2-5% de la población mundial (Okumura y Nizet, 2014). Las infecciones más comunes, no invasivas y leves causadas por el GAS son amigdalitis y faringitis con 600 millones de casos estimados al año (Carapetis et al., 2005). Enumerado como el número nueve en la lista de asesinos globales con alrededor de 500.000 muertes anuales (Carapetis et al., 2005), es obvio que este patógeno puede causar infecciones invasivas graves, incluyendo neumonía, sepsis, síndrome de shock tóxico estreptocócico, e infecciones cutáneas necrotizantes (Cunningham, 2000; Carapetis et al., 2005). Aunque los tres patógenos son capaces de causar enfermedades altamente letales, el más mortal sigue siendo el neumocococo, estimado para causar aproximadamente el 10% de todas las muertes en niños menores de 5 años de edad (O'Brien et al., 2009), en los ancianos (Marrie et al., 2017), y en individuos inmunocomprometidos (Baxter et al., 2016). El virus de la gripe A se une a través de la HA al ácido siálico α2,3 o α2,6 ligado a la superficie de las células epiteliales del tracto respiratorio superior e inferior (Webster et al., 1992). Las cepas estacionales muestran generalmente afinidad a los ácidos siálicos α2,6 ligados a la tráquea humana, mientras que los virus similares a los de la ave se unen preferentemente a los ácidos siálicos α2,3 ligados a las células alveolares de tipo II (Shinya et al., 2006; van Riel et al., 2007 van Riel et al.,, 2010. La liberación de ARN genómico viral en el citosol activa diferentes vías de respuesta inmune. La unión del ARN viral al gen inducible del ácido retinoico 1 induce la expresión de los interferones de tipo I y III y activa el factor de transcripción NF-B, que a su vez activa la liberación de citocinas proinflamatorias (Durbin et al., 2013; Iwasaki y Pillai, 2014). Además, la activación del inflamatorio conduce a la liberación de IL-1β e IL-18 (Pothlichet et al., 2013; Iwasaki y Pillai, 2014). Todas estas respuestas se supone que promueven el aclaramiento viral. Sin embargo, la presencia de proteínas virales durante la infección induce también la activación directa de la vía apoptótica intrínseca o indirecta mediante la producción de citocinas inflamatorias, resultando en apoptosis o incluso necrosis del epitelio (Korteweg y Gu, 2008) Además, la coagulación aberrante inducida por la infección por virus provoca una respuesta hiperinflamatoria (Yang y Tang, 2016). Todos estos eventos contribuyen a la lesión del tejido pulmonar (Imai et al., 2008; Davidson et al., 2014). El daño epitelial debido a la replicación viral proporciona un ambiente beneficioso para la unión bacteriana inicial (Plotkowski et al., 1993). Por otro lado, las bacterias ya colonizadas pueden aumentar la virulencia del virus de la gripe, ya sea secretando directamente las proteasas que se cortan y activan HA (Figura 2 ) (Bottcher-Friebertshauser et al., 2013) o, indirectamente, activando proteasasas del huésped como el plasminógeno, lo que aumenta las tasas de replicación y la infectividad del virus (Scheiblauer et Las bacterias potencialmente patógenas, incluyendo las tres especies mencionadas anteriormente, expresan un arsenal de factores de virulencia responsables de la unión a las estructuras humanas huésped. Componentes de la superficie microbiana que reconocen las moléculas de la matriz adhesiva FIGURA 1 Modelos potenciales para estudiar coinfecciones bacterianas y virales del tracto respiratorio. S. pneumoniae, S. aureus, S. pyogenes y S. suis son colonizadores frecuentes del tracto respiratorio superior. La infección estacional por VAI puede conducir a un mayor riesgo de infecciones bacterianas secundarias, es decir, neumonía. Se pueden utilizar varios modelos experimentales para estudiar estas infecciones graves. Las muestras de pacientes, incluido el tejido pulmonar ex vivo, son materiales de elección, pero son raras debido a consideraciones éticas. Las coinfecciones bacterianas y virales in vivo se realizan principalmente en ratones, lo que no se parece necesariamente a la fisiología humana y al sistema inmunitario. Por lo tanto, sugerimos utilizar el modelo porcino, que casi se asemeja a más del 80% del sistema inmunitario humano. (MSCRAMM), tales como PspC, PspA y PsaA en neumococci (Hammerschmidt, 2006), SPA, FnbA, ClfA y ClfB en S. aureus (Bartlett y Hulten, 2010; Otto, 2010), y proteína M, PrtF1 y PrtF2 en GAS (Cunningham, 2000), respectivamente, y las llamadas proteínas iluminantes de la luna expresadas por las tres especies, por ejemplo, GAPDH, enolasa o PGK (Fulde y otros, 2013), permiten a las bacterias unirse a células o moléculas dañadas de la matriz extracelular, incluyendo fibronectina, fibrin, fibrinógeno y colágenos, o proteínas fibrinolíticas como plasminógeno (McCullers y Rehg, 2002; Bergmann Una vez que se produce la unión inicial, citotoxinas bacterianas, incluyendo neumolisina de neumococos (Garcia-Suarez Mdel et al., 2007; Zahlten et al., 2015), α-hemolisina y leucocidinas de S. aureus (Mairpady Shambat et al., 2015) y Streptolysins S y O y exotoxina pirogénica pirogénica B de S. pyogenes (Tsai et al., 1998; Gurel et al., 2013; Siemens et al., 2015 Siemens et al.,, 2016, pueden sinergizar con contrapartes virales para aumentar aún más la patología del tejido pulmonar. Entre los posibles mecanismos adicionales por los que podría producirse la colonización inicial del tracto respiratorio inferior y daño del tejido pulmonar se incluyen la potenciación del desarrollo de neumonía por parte de la neuraminidasa del VAI mediante la eliminación enzimática del ácido siálico del pulmón, exponiendo así los receptores del huésped para la adhesión neumocócica (McCullers y Bartmess, 2003). El estado inflamatorio del huésped en respuesta a la infección viral puede alterar la presentación de los receptores en la superficie, permitiendo así la invasión bacteriana (Cundell y Tuomanen, 1994). A medida que el paciente comienza a recuperarse de la infección viral, pueden ocurrir infecciones bacterianas secundarias (Louria et al., 1959) debido a la curación incompleta de la herida y la exposición de los componentes de la membrana del huésped, incluyendo lamina, colágenos tipo I y IV a las MSCRAMMs bacterianas clásicas ( Las células epiteliales son las primeras en responder a las infecciones pulmonares, seguidas por los macrófagos alveolares residentes en el tejido. Promueven el aclaramiento viral a través de fagocitosis, eferocitosis y liberación de citocinas y quimioquinas para promover las respuestas inmunes (Hashimoto et al., 2007; Kumagai et al., 2007; Wang et al., 2012; Hillaire et al., 2013). Los virus respiratorios como el VAI son capaces de inducir la supresión y muerte de los macrófagos alveolares residentes (Figura 2 ) (Ghoneim et al., 2013). Estas células suelen ser reemplazadas por la diferenciación de monocitos derivados de la sangre reclutados en macrófagos de diferentes patrones de polarización, lo que a su vez crea un retraso en el aclaramiento de patógenos y Además, la inducción de interferones como respuesta a la infección viral compromete la detección inmunitaria de bacterias Gram-positivas por neutrófilos y macrófagos, lo que normalmente eliminaría las bacterias de los pulmones (Figura 2 ) (Sun y Metzger, 2008; Tian et al., 2012). El mecanismo exacto subyacente a este fenómeno todavía no se entiende. Varios estudios sugieren que el ARN viral activa los receptores de tipo peaje (TLR) 2 y TLR4 y, en consecuencia, la producción de interferones de tipo I para promover un estado antiviral (Shahangian et al., 2009). La infección posterior por bacterias Gram-positivas, p. ej., pneumococci, potencia la expresión de interferón tipo I, que a su vez suprime la producción de la quimioquina CCL2 y el reclutamiento de macrófagos (Nakamura Frontiers in Microbiology www.bordersin.org FIGURE 2 La interacción entre el VAI, las bacterias y el huésped humano. El daño epitelial debido a la replicación viral proporciona un ambiente beneficioso para la unión bacteriana (Bact.). El VAI es capaz de inducir la supresión y muerte de los macrófagos alveolares residentes (AM), que a su vez retrasa el aclaramiento viral. La liberación de ARN viral activa diferentes vías de respuesta inmune que resultan en tormenta de citoquinas. Los interferones de tipo I y III comprometen el reconocimiento inmune de bacterias Gram-positivas por neu Además, podrían suprimir la función celular asesina natural (NK), incluyendo la liberación de TNF, que activa los macrófagos alveolares. Después de la inflamación inicial, la situación podría empeorar debido a la infiltración celular de los pulmones por neutrófilos (PMN), lo que conduce a un aumento de la desgranulación y el daño tisular por moléculas efectoras, incluyendo la proteína de unión a la heparina (HBP). et al., 2011). Otro estudio de Shahangian et al. (2009) reveló que el estado antiviral conduce a la producción deteriorada de quimioattractantes neutrófilos CXCL1 y CXCL2, que a su vez promueve respuestas inmunológicas menos eficaces debido a las funciones neutrófilas atenuadas durante la fase temprana de la invasión neumocócica. Otros estudios encontraron que los pulmones expuestos habían dañado las respuestas La reducción de la producción de TNFα por las células NK se identificó como un mecanismo previo crucial de las actividades antimicrobianas deprimidas por los macrófagos alveolares (Figura 2 ) (Small et al., 2010). Parece probable que IAV NA también sea capaz de activar los receptores de células huésped de manera dependiente de TGF-β, lo que a su vez promueve la invasión de GAS y la patología pulmonar posterior (Li et al., 2015). Estudios in vitro sobre la interacción entre las células dendríticas humanas y los neumococos IAV revelaron TLR3 como un sensor crucial de ARN viral y bacteriano que conduce a una producción mejorada de IL-12p70, que a su vez podría promover un estado antiviral mediante la regulación de los interferones (Yamamoto et al., 2004; Spelmink Sin embargo, cabe señalar que dependiendo de la especie bacteriana la manifestación de la enfermedad y las respuestas inmunes innatas subyacentes pueden variar (Sharma-Chawla et al., 2016). Muchos de los estudios experimentales sobre los mecanismos de la enfermedad y las respuestas inmunitarias se basan en una infección bacteriana posterior en horas o pocos días después de la infección por VAI. Sin embargo, las infiltraciones bacterianas de los pulmones pueden ocurrir mucho más tarde, es decir, durante el inicio de la cicatrización de heridas después del aclaramiento parcial del VAI, que se ha reportado en la mayoría de los estudios realizados en los últimos años (Snelgrove et al., 2008; Hussell y Cavanagh, 2009 ). Estos procesos se caracterizan por un estado antiinflamatorio general y la supresión de mecanismos involucrados en el aclaramiento de patógenos debido al aumento de la producción de interleucina-10 (van der Sluijs et al. El estado antiinflamatorio suprime la expresión de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) en fagocitos profesionales que conducen a la fagocitosis alterada y la muerte de microbios. Estos eventos podrían permitir el sobrecrecimiento bacteriano en los pulmones y patología tisular (Sun and Metzger, 2008; Goulding et al., 2011). Al igual que otras enfermedades infecciosas graves causadas por agentes individuales, la neumonía se caracteriza por condiciones hiperinflamatorias de los pulmones al inicio de la infección, seguido de un estado hipoinflamatorio con parálisis inmune (Morton et al., 2014). En las coinfecciones, después de la inflamación inicial en respuesta a la infección viral, la situación podría empeorar debido a la invasión bacteriana y la infiltración celular mejorada de los pulmones por neutrófilos, lo que conduce a un aumento del daño tisular y la tormenta de citoquinas (Figura 2 ) (Conenello et al., 2007; McAuley et al., 2007 McAuley et al.,, 2010 Porto y Stein, 2016). Además, el sistema de coagulación se activa y contribuye a la respuesta fisiopatológica a la infección (van der Poll y Herwald, 2014). Bacterias como pneumococci, S. aureus y GAS pueden activar y modular el sistema de coagulación, lo que conduce a una amplia expresión del factor tisular e incrementar el riesgo de coagulopatía grave Shannon et al., 2013; Walters et Los patógenos bacterianos también expresan una variedad de toxinas citolíticas que pueden contribuir a la inflamación y patología tisular. La neumolisina, una toxina neumocócica formadora de poros con baja afinidad a las células epiteliales pulmonares, puede dañar los neutrófilos mediante la utilización del receptor P2X7 (Domon et al., 2016). Las citotoxinas estafilocócicas (α-toxina y leucocidinas, incluyendo Panton-Valentina leucocidina, PVL) están asociadas con patología tisular severa, fuerte regulación de quimioquinas, y el aumento de la afluencia de neutrófilos de los pulmones (Mairpady Shambat et al., 2015). Las toxinas GAS, incluyendo SLO y SpeB, son capaces de causar daño tisular directamente y promover estados proinflamatorios a través de la lisis de neutrófilos (Snall et al., 2016; Uhlmann et al., 2016). Los efectos citolíticos causados por toxinas bacterianas podrían sinergizarse con el resultado de la proteína accesoria citotóxica IAV, PB1-F2, patología tisular mediada que conduce a una mayor producción de citocinas (Ramos y Fernández-Sesma, 2012). Tomados juntos, lo más probable, efectos sinérgicos de las vías que están involucradas en la inflamación bacteriana y viral conducen a una mayor activación inmune y una mayor morbilidad y mortalidad (Joyce et al., 2009; Koppe et al., 2012; Ramos y Fernández-Sesma, 2012; Bucasas et al., 2013; La Figura 2 resume la interacción entre virus, bacterias y huésped. Los modelos animales experimentales son una herramienta útil para estudiar los efectos in vivo de diferentes agentes infecciosos y representan aproximadamente el 3% de toda la investigación sobre neumonía publicada en revistas de revisión por pares (Hraiech et al., 2015). Sin embargo, el aumento constante de estudios en animales en las últimas décadas contrasta con su reproducibilidad en humanos (Hackam y Redelmeier, 2006). Hackam y sus colegas identificaron 2.000 artículos publicados entre 1980 y 2006 en siete revistas científicas líderes que publican regularmente estudios en animales (Hackam y Redelmeier, 2006). Setenta y seis de 2.000 fueron muy citados con un recuento medio de citas de 889. De estos 76 estudios 28 fueron replicados en ensayos aleatorios humanos, 14 fueron contradichos y 34 permanecieron sin probar (Hackam y Redelmeier, 2006). Sólo un 1,4% de los estudios en animales publicados en revistas de alto impacto fueron traducidos en ensayos aleatorizados en humanos (Hackam y Redelmeier, 2006), mientras que alrededor de un 44% de la tasa de replicación fue reportada en estudios humanos altamente citados (Ioannidis, 2005). En modelos de neumonía, los mamíferos se utilizan principalmente por su proximidad anatómica y fisiológica al ser humano (Hraiech et al., 2015). Para monitorear estudios fisiológicos extensos, especies de mamíferos más grandes, incluyendo hurones, perros, conejos, cerdos y babuinos son los modelos de elección (Mizgerd y Skerrett, 2008). Sin embargo, los roedores y en particular ratones se utilizan con mayor frecuencia como organismos modelo de neumonía. La velocidad reproductiva rápida, el tamaño pequeño, el manejo menos complicado, la capacidad de reproducir y comparar los resultados con las monoinfecciones bacterianas y virales ya publicadas, el conocimiento detallado de la genética y las respuestas inmunitarias, y una plétora de reactivos disponibles para estudiar las infecciones en ratones son razones para el uso de estos animales. Para evitar variaciones en las respuestas debido a la diversidad genética, las cepas de ratones endogenados son herramientas útiles para estudios destinados a dilucidar los mecanismos moleculares de las enfermedades. Además, la ingeniería genética permitió generar una amplia variedad de variantes de ratón con genes de ganancia de función, pérdida de función o reportero (Mizgerd y Skerrett, 2008). Como se indicó anteriormente, muchos estudios in vivo sobre coinfecciones bacterianas y virales proporcionaron información útil sobre la neumonía grave, entre ellos: i) el hecho de que la infección viral prepara al huésped para la susceptibilidad bacteriana que conduce a una infección secundaria grave (Hashimoto et al., 2007; Shahangian et al., 2009; Chaussee et al., 2011; Nakamura et al., 2011); ii) sinergismo patógeno (Tsai et al., 1998; McCullers and Rehg, 2002; Garcia-Suarez Mdel et al., 2007; Gurel et al., 2013; Mairpady Shambat et al., 2015; Zahlten et al., 2015); iii) mayor respuesta inflamatoria al inicio de la infección (Korteweg y Gu, 2008; Durbin et al., 2013; Pothlichet Sin embargo, los modelos de ratón para infecciones bacterianas y/o virales tienen varias limitaciones. La mayoría de las especies bacterianas y virales bajo estudio son patógenos humanos. En los últimos años también se demostró que las variaciones genéticas del huésped y las diferencias de sexo tienen un impacto en la predisposición, severidad y resultado de la infección (Chella Krishnan et al., 2015 Mientras que los ratones C57BL/6 y BALB/c se caracterizan por una mayor resistencia, las cepas DBA/2 son más susceptibles y permisivas a las cepas bacterianas y virales (Alymova et al., 2011; Chella Krishnan et al., 2015. Además, la transmisión de VAI y bacterias es ineficiente en ratones adultos, lo que requiere modelos animales alternativos, incluyendo ratones neonatales o ferrets (Diavatopoulos et al., 2010; McCullers et al., 2010) Se demostró que el VAI era esencial para la transmisión neumocócica de ratones colonizados a sus compañeros ingenuos y la transmisión se produjo sólo cuando todos los ratones estaban infectados con el VAI (Diavatopoulos et al., 2010). et al., 2010. Los hurones son naturalmente susceptibles al VAI aislados de diferentes especies, incluyendo humanos, aves y cerdos (Thangavel y Bouvier, 2014). La infección de hurones con aislados de VAI estacionales humanos resulta en una infección del tracto respiratorio superior similar a la infección por gripe humana (Tripp y Tompkins, 2009). A diferencia de los ratones, el VAI humano no adaptado puede ser utilizado para la infección. Desafortunadamente, sólo hay pocos informes sobre coinfección bacteriana y VAI en este organismo modelo. Un informe de Sanford y Ramsay mostró una mayor colonización estafilocócica del tracto respiratorio superior en animales infectados por el VAI en comparación con los no infectados, mientras que no se observó diferencia entre ambos grupos en la infección por estreptococo del grupo B (Sanford y Ramsay, 1987). En contraste, Smith y Mc Cullers reportaron falta de establecimiento de infección por estafilococo incluso cuando los hurones estaban preinfectados con el VAI (Smith y McCullers, 2014). Las mayores ventajas de usar hurones como modelo incluyen: i) su susceptibilidad a patógenos humanos no adaptados, ii) la eficiencia en la transmisión del VAI y bacterias de un individuo a otro, y iii) la presentación de los signos clínicos de manifestación de la enfermedad similar a la infección por gripe humana. Desafortunadamente, su limitada disponibilidad, la compleja crianza y la limitada accesibilidad a reactivos específicos de hurones dificultan la realización de esta investigación (Bouvier y Lowen, 2010). En los últimos años, el cobaya (Cavia porcellus) también se utilizó en la investigación de neumonía. La fisiología y anatomía del pulmón de cobaya se asemeja en cierta medida al pulmón humano y este organismo modelo se utiliza a menudo en enfermedades pulmonares no infecciosas, incluyendo asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (Canning y Chou, 2008). Además, su disponibilidad comercial, facilidad de cría, la capacidad de trabajar con patógenos no adaptados y la eficiencia de la transmisión son razones para utilizar este modelo in vivo (Bouvier y Lowen, 2010). Aunque la replicación viral puede detectarse fácilmente tras la inoculación intranasal en el tracto respiratorio superior y los pulmones, los cobayas sólo presentan síntomas clínicos menores (Lowen et al., 2006; Gabbard et al., 2014). Sin embargo, la patología pulmonar de los cobayas infectados por el VAI se correlaciona con la gravedad clínica de la infección humana (Gabbard et al., 2014). La transmisión de neumococos en cobayas se promueve por la coinfección con el virus de Sendai (Saito et al., 1988). Los cobayas infectados por neumococos solos y enjaulados con animales de contacto no tratados transmiten la bacteria sólo en el 7% de los casos, mientras que los coconejillos infectados por el virus de Sendai adquirieron infección neumocócica en el 83% de Otro estudio evaluó la eficacia de los antibióticos en la infección pulmonar invasiva causada por neumococo resistente a la penicilina (Ponte et al., 1996). Instilación intraqueal de 3 × 10 9 UFC de S. pneumoniae indujo una neumonía fatal y bacteremia en el 85% de los animales no tratados dentro de las 46 h (Ponte et al., 1996). Al igual que con los hurones, hay una escasez de datos que describen las respuestas inmunitarias a los agentes infecciosos pulmonares, esto se debe en parte a la falta de reactivos específicos de especies, lo que es una desventaja en el uso de este organismo modelo. Recientemente, la rata de algodón (Sigmodon hispidus) fue reportada como susceptible a la VAI. Infección nasal y pulmonar en ratas adultas de algodón no requirieron adaptación viral (Otto La replicación del VAI fue más extensa en los tejidos nasales que en el pulmón y persistió durante seis días consecutivos. La patología tisular incluyó daño del epitelio bronquiolar y los animales desarrollaron neumonía que persistió durante casi 3 semanas (Ottolini et al., 2005). En los estudios bacteriológicos las ratas se utilizan con mayor frecuencia. Existen numerosos modelos de ratas que investigan el impacto de la diabetes (Oliveira et al., 2016), síndromes metabólicos (Feng et al., 2015), cirrosis, farmacocinética y dinámica (Antonopoulou et al., 2015; Hoover et al., 2015), intoxicación (Davis et al., 1991), inmunización (Iinuma y Okinaga, 1989) y factores de virulencia bacteriana general (Shanley et al., 1996) sobre el desarrollo de neumocócicos, estreptocócicos y neumonía estafilocócica y patología pulmonar. Lamentablemente, sólo hay pocos estudios sobre coinfecciones bacterianas y virales en ratas. La primera fue realizada por Harford et al., 1946 (Harford et al., 1946. Los autores concluyeron que la neumonía bacteriana secundaria no convierte la infección viral subletal en un resultado letal (Harford et al., 1946). Otro estudio sobre el virus sincitial respiratorio humano y S. pneumoniae reveló que las ratas fueron fácilmente colonizadas con neumococos, pero la replicación viral después de la infección posterior fue dependiente de la tensión. Además, ni los neumococos ni el virus se propagaron del tracto respiratorio superior al inferior, y ninguno de los patógenos se transmitió a compañeros de jaula ingenuos. Aunque las ratas comparten muchas características inmunes con los seres humanos, incluyendo la producción de óxido nítrico por macrófagos (Carsillo et al., 2009), las mayores desventajas son la baja disponibilidad animal, la agresividad de la especie y la falta de reactivos específicos. Los conejos (Oryctolagus cunilulus También se emplearon conejos para estudiar la neumonía, aunque sólo se dispone de unos pocos modelos. Los parámetros típicos de lectura incluyen supervivencia, infiltración de leucocitos en los pulmones, patología pulmonar y evaluación de la concentración de fármacos en el suero. Uno de los primeros estudios sobre neumonía neumocócica en conejos se realizó en Kline e Winternitz (1913). Este estudio reveló que los conejos poseen inmunidad activa si se han recuperado de un ataque de neumonía experimental y posteriormente pueden resistir dosis intratraqueales repetidas de neumococos (Kline e Winternitz, 1913). En 1926 se estableció una infección por inhalación de neumococos de tipo I en conejos (Stillman y Branch, 1926). Las bacterias se infiltraron fácilmente en el tracto respiratorio inferior y neumococos que llegaban a los pulmones generalmente desaparecieron en horas y aparecieron septicemia fatal en Los modelos más recientes de neumonía por neumococo y estafilococo en conejos se basan en infecciones intrabronquiales o intrapulmonares que las hacen útiles para la patogénesis (Diep et al., 2010 (Diep et al., 2017,, así como en estudios de eficacia y eficacia de fármacos (Cabellos et al., 1992; Croisier-Bertin et al., 2011). Sin embargo, esta vía de infección requiere cirugía y los reactivos específicos de especies son escasos. En la investigación de IAV los conejos se utilizan con frecuencia para la producción de anticuerpos y para estudios sobre cinética de anticuerpos después de administraciones únicas o múltiples de IAV (Loza-Tulimowska et al., 1977). Además, los conejos se utilizan para investigar la seguridad de las vacunas (por ejemplo, CoVaccine HT o Aflunov) (Heldens et al., 2010; Gasparini et al., 2012). En los últimos años se investigó el desprendimiento de IAV aviar por colas de algodón (Sylvilagus spp.) revelando que las colas de algodón inoculadas nasales y orales arrojan cantidades relativamente grandes de ARN viral (Root et al., 2014). En particular, se encontró que los títulos virales bajos eran suficientes para iniciar la replicación viral en colas de algodón (Root et al., 2017). Sin embargo, a pesar de su susceptibilidad a la infección por IAV, los conejos son raramente utilizados como modelo para la patogénesis por IAV, ya que no ofrecen mejoría sobre otros modelos de infección establecidos. Las especies más utilizadas son los macacos rhesus (Macaca mulatta) y los macacos cynomolgus (Macaca fasciluraris). Aunque se demostró a principios de ese año que los macacos eran susceptibles al VAI (Saslaw et al., 1946), los modelos animales de elección siguieron siendo hurones y ratones. Recientemente, los macacos se han utilizado para comparar la patogénesis de la pandemia altamente virulenta de 1918 VAI y la cepa de gripe patogénica de aves (H5N1) con una cepa convencional H1N1 (Rimmelzwaan et al., 2001). Los macacos cynomolgus infectados con H5N1 de alta patogenicidad desarrollaron síndrome de dificultad respiratoria aguda, fiebre y neumonía necrotizante (Rimmelzwaan et al., 2001). La cepa de 1918 del VAI indujo una disregulación de la respuesta antiviral que provocó una insuficiente protección del huésped, lo que a su vez resultó en malestar respiratorio agudo y desenlace fatal (Kobasa et al., 2007). El aislado pandémico H1N1 de EE.UU. de 2009 causó lesiones patológicas graves en los pulmones de los macacos (Itoh et al., 2009 ). Los tres estudios mencionados anteriormente utilizaron la administración intratraqueal combinada de altas dosis de virus. Un estudio reciente de Marriott et al. analizaron el resultado de las rutas de desafío, incluyendo la inhalación de aerosoles e instilación intranasal con dosis bajas a moderadas de H1N1 en macacos cinomolgus (Marriott et al., 2016). La replicación vírica fue detectada en todos los grupos de desafío, aunque la enfermedad permaneció subc Para el grupo A se realizaron análisis de transcriptoma longitudinal de infección estreptocócica en faringitis experimental (Virtaneva et al., 2005) e infección del tracto respiratorio inferior en macacos cinomolgus (Olsen et al., 2010a). La enfermedad del tracto respiratorio inferior observada en macacos después de la infección por GAS imitaba las características clínicas y patológicas de la bronconeumonía grave en humanos (Olsen et al., 2010a). Otro estudio realizado por Olsen y colegas analizó la contribución de PVL de una cepa USA300 S. aureus altamente virulenta en infección respiratoria (Olsen et al., 2010b). Aunque la enfermedad del tracto respiratorio inferior observada en el mono imitaba las características clínicas y patológicas de la neumonía temprana de leve a moderada en los seres humanos, no se pudo detectar ninguna afectación del PVL en la patología pulmonar o la afluencia de células inmunitarias de los pulmones (Olsen et al., 2010b). El mismo grupo de investigación ha desarrollado un modelo de coinfección no letal IAV (H3N2)-S. aureus coinfection model en cinomolgus macaques (Kobayashi et al., 2013). La progresión de la neumonía fue monitoreada por la evaluación de parámetros clínicos, química de la sangre, hisopos nasales y patología de los pulmones. Aunque los macacos se utilizan con frecuencia para evaluar la eficacia de la vacuna antineumocócica, incluyendo la prueba del impacto de la vacuna antineumocócica conjugada 13-valente y la vacuna antineumocócica polisacárida 23-valente en repertorios de células B de memoria específica de antígenos (Jia et al., 2017), en la última década sólo se realizaron dos estudios sobre transporte de neumocócicos y neumonía. En 2013, Philipp y sus colegas analizaron la tasa de transporte de neumocococo en 158 animales de la colonia. Ninguno de los rhesus macaques encuestados llevó S. pneumoniae en la nasofaringe (Philipp et al., 2012). Los autores concluyeron que el rhesus macaque probablemente no es un huésped natural de neumococos. Pero, cuando los bebés fueron colonizados con cepa 19F a través de la instilación nasofaríngea, la colonización fue inducida en ocho de ocho infantes, duró 2 semanas en todos los animales y 7 semanas en más del 60% (Philipp et al., 2012). El mismo grupo probó la neumolisina desintoxicada (dPly) y la proteína de triada de histidina neumocócica D (PhtD) como potenciales candidatos a vacuna para prevenir la neumonía (Denoel et al., 2011). Después de la inmunización los macacos rhesus fueron desafiados con una cepa neumocócica de 19F. La vacuna PhtD-dPly adyuvada con AS02 protegía a los animales contra la neumonía inducida por S. pneumoniae, que estaba relacionada con la capacidad (i) de reducir en gran medida la carga bacteriana dentro de la primera semana después del desafío y (ii) los niveles de anticuerpos específicos de PhtD-y Ply (Denoel et al., 2011). Aunque sólo existen unos pocos estudios macacos sobre neumonía, debido a la proximidad a los seres humanos en términos de fisiología e inmunidad, estos animales pueden ser un buen modelo en el contexto de estudios de traducción que evalúan la terapéutica y la profilaxis. A pesar del amplio uso de diferentes modelos animales, el modelo in vivo óptimo para la neumonía humana sigue sin identificarse. Los mamíferos pequeños, incluidos los roedores, son bien conocidos desde un punto de vista biológico, genético e inmunológico y son fáciles de mantener. La elección de estos animales Sin embargo, también están lejos de la anatomía, la fisiología, la inmunología y la susceptibilidad a los patógenos exclusivamente humanos. El modelo animal experimental debe ser elegido en base a respuestas comparables a los humanos. Los primates generalmente están legalmente reservados a temas específicos. En este caso, los cerdos podrían ser un sistema modelo apropiado para estudiar enfermedades infecciosas incluyendo neumonía (Figura 1). La composición y tamaño del genoma porcino es comparable a la de los humanos (Hart et al., 2007). Además, los órganos humanos y porcinos tienen muchas características y funciones comunes (Swindle et al., 2012). El tracto respiratorio superior de los humanos y los cerdos, incluyendo el tejido linfoide en la nasofaringe, es anatómicamente similar. Además, como los humanos, los cerdos poseen tonsils, que están ausentes en ratones (Horter et al., 2003). Una ventaja importante del estudio de enfermedades infecciosas mediante la utilización de cerdos como organismo huésped es que los cerdos tienen un conjunto completo de inmunizadores innatos y adaptativos. Según los resultados de secuenciación del genoma completo, el sistema inmunitario porcino se asemeja a más del 80% del sistema inmunitario humano, mientras que los ratones comparten menos del 10% con los humanos (Dawson et al., 2016). La mayoría de los compartimentos de células inmunes identificados en los seres humanos también están presentes en los cerdos (Piriou-Guzilack y Salmon, 2008; Fairbairn et al., 2011). A diferencia de los ratones y similares a los humanos, los cerdos tienen entre el 50 y el 70% de las células nucleares polimorfo circulantes (Fairbairn et al., 2011). Además, todas las citoquinas funcionales o ortologistas involucrados en el paradigma Th1, Th2, Th17 y Treg y las células inmunes correspondientes se han descrito en cerdos (Murtaugh et al., 2009; Kaser et al., 2011; Kiros et al., 2011). Especialmente el muy prominente quimio-atractivo proinflamatorio humano, CXCL8, está presente como un ortolog en cerdos, mientras que no hay homólogo en ratones (Fairbairn et al., 2011). A diferencia de los monocitos humanos, que pueden dividirse en tres subclases (CD14 clásico + CD16 −, CD14 no clásico + CD16 +, y CD14 intermedio ++ CD16 + ), los monocitos porcinos consisten en cuatro subclases (Chamorro et al., 2005; Fairbairn et al., 2013). Al igual que los monocitos humanos, expresan moléculas de adhesión, como VLA-4 y LFA-1 y moléculas costimuladoras, incluyendo CD80 y CD86 (Chamorro et al., 2005). El cerdo se ha utilizado previamente para imitar una serie de enfermedades infecciosas humanas. Ejemplos de infecciones por S. aureus con este organismo modelo son infecciones por heridas Svedman et al., 1989), osteomielitis (Jensen et al., 2010) y sepsis (Nielsen La inoculación intravenosa de lechones con neumococos llevó a la bacteriemia durante un período de 5 días y se asoció con fiebre y artritis séptica. La inoculación intranasal de lechones llevó a la colonización durante al menos seis días consecutivos sin causar signos clínicos (De Greeff et al., 2016). Además, la investigación sobre infecciones respiratorias de cerdos por patógenos humanos incluyendo S. aureus (Luna et al., 2009), Mycobacterium tuberculosis (Gil et al., 2010), Bordetella pertussis (Elahi et al., 2007), Pseudomonas aeruginosa (Luna et al., 2009), y IAV (Khatri et al., 2010), se realizó en los últimos años. El hecho de que los cerdos y los seres humanos estén infectados con subtipos idénticos de VAI (H1N1, H3N2), y muestren una presentación clínica y patogénesis similares, hace que los cerdos sean un organismo modelo ideal para estudios sobre coinfecciones respiratorias (Van Reeth et al., 1998). Especialmente las infecciones por VAI ya están bien establecidas en los cerdos (Van Reeth et al., 1998, 2002a Jung et al., 2007; Khatri et al., 2010; Barbe et al., 2011). Además del número limitado de publicaciones sobre cerdos y patógenos humanos, mucho se puede traducir y aprender de estudios sobre el patógeno zoonótico porcino Streptococcus suis. S. suis usualmente habita superficies mucosas de amígdalas, nares, genitales y tractos alimentarios de lechones. Una vez alterado el equilibrio microbiano, las bacterias pueden causar meningitis, septicemia, artritis y neumonía en cerdos (Staats et al., 1997). Algunas cepas de S. suis se consideran hipervirulentas y otras hipovirulentas. En general, el serotipo 2 se aísla con mayor frecuencia de cerdos enfermos (Staats et al., 1997). S. suis también puede causar enfermedades graves en los seres humanos, incluyendo septicemia, meningitis, artritis y síndrome de shock tóxico estreptocócico (Tang et al., 2006; Yu et al., 2006; Gottschalk et al., 2007). Aunque muchos estudios in vivo sobre S. suis se han realizado utilizando ratones como organismo modelo (Seitz et al., 2012; Auger et al., 2016), varios otros estudios han demostrado la ventaja de utilizar cerdos como huésped natural para S. suis (Bi et al., 2014; Ferrando et al., 2015). Una reciente publicación de Lin y colegas sobre H1N1 y S. suis co-infectados lechones demostró los efectos sinérgicos de ambos patógenos (Lin et al., 2015). Coinfectados lechones tuvieron una presentación clínica más severa y cambios patológicos en el pulmón, en comparación con los animales infectados con patógenos únicos (Lin et al., 2015). Además, los genes asociados con las respuestas inmunitarias, la producción de citocinas inflamatorias y las vías apoptóticas fueron muy sobreexpresados en el grupo coinfectado (Lin et al., 2015). Aunque el modelo porcino parece ser ideal para imitar enfermedades infecciosas humanas, también hay desventajas, incluyendo, por ejemplo, la necesidad de instalaciones animales experimentales especializadas, manejo de tiempo, altos costos de mantenimiento y disponibilidad limitada de animales transgénicos. Aunque el uso de animales contribuye en gran medida a nuestra comprensión de las enfermedades infecciosas, los modelos de tejido humano 3D-organotípico y tejidos de órganos ex vivo deben ser considerados, ya que son herramientas más valiosas para estudiar las interacciones host-patógenos en un entorno más complejo (Figura 1). Los enfoques de ingeniería de tejidos se centraron originalmente en la medicina regenerativa (Lager y Vacanti, 1993). A diferencia de los cultivos celulares monocapa estándar, los modelos de tejido se asemejan mucho más a la arquitectura 3D, la composición celular y la complejidad de la matriz del órgano respectivo. En los últimos años, la ingeniería tisular también se empleó con éxito en varios estudios sobre enfermedades infecciosas, como infecciones por virus del Zika de organoide cerebral (Lancaster et al., 2013; Dang et al., 2016), infecciones por Helicobacter pylori de organoide epitelial gástrico (McCracken et al., 2014; Schlaermann et al., 2016), infecciones por Escherichia coli y Rotavirus de enteroides gastrointestinales y pequeños intestinales (Saxena et al., 2015; VanDussen et al., 2015), infecciones por el virus Entamoeba histolytica o Hepatitis B de tejido sinusoide hepático (Petropolis et al., 2014 (Petropolis et al., 2016, Grupo A y G, infecciones por estreptococócicas Por ejemplo, el modelo de tejido pulmonar relevante para la neumonía consiste en fibroblastos pulmonares incrustados en una matriz de colágeno con una capa epitelial estratificada en la parte superior (Nguyen Hoang et al., 2012). El tejido diseñado es adecuado para implantar y estudiar células inmunitarias, incluyendo células dendríticas, monocitos, macrófagos e incluso células mononucleares de sangre periférica (Nguyen Hoang et al., 2012; Mairpady Shambat et al., 2015). Una publicación reciente demostró un evento doble de patología pulmonar en neumonía necrotizante estafilocócica (Mairpady Shambat et al., 2015). Mientras que la α-toxina tuvo un efecto perjudicial directo en el epitelio pulmonar, la PVL indujo patología pulmonar indirectamente a través de la lisis de neutrófilos (Mairpady Shambat et al., 2015). Todos los estudios mencionados anteriormente destacan un progreso significativo en el campo de las enfermedades infecciosas no sólo desde el punto de vista científico, sino también contribuyendo al principio de tres R de experimentación animal (Russell, 1995). En estos términos, el uso de biopsias de órganos humanos ex vivo cultivadas, que son raras debido a consideraciones éticas, es una opción adicional para estudiar interacciones host-patógeno. Este sistema ex vivo puede superar incluso las limitaciones del tejido diseñado. En los últimos años se han realizado infecciones del tejido pulmonar ex vivo humano con varios microorganismos, incluyendo neumococos (Szymanski et al., 2012; Fatykhova et al., 2015), Bacillus anthracis (Chakrabarty et al., 2007), Haemophilus influenzae (Zhang et al., 2016) y IAV (Nicholls et al., 2007; Chan et al., 2009). En el ámbito humano, la mayor parte del trabajo se ha centrado en el tropismo, la gravedad de las infecciones, la liberación de mediadores inflamatorios y las tasas de replicación de los microorganismos. Además, recientemente también se han realizado experimentos con el virus de la gripe porcina (SIV) y S. suis coinfecciones de las rebanadas de pulmón ex vivo porcino. Meng y sus colegas mostraron que la VIS promueve infecciones bacterianas posteriores en un proceso de dos pasos del cual el primer paso inicial fue dependiente de la expresión de la cápsula, mientras que el segundo paso de invasión bacteriana en capas más profundas fue independiente de la cápsula y requirió daño mediado por virus (Meng et al., 2015). Sin embargo, esto es sólo un comienzo y se necesitan más investigaciones para desentrañar la complejidad subyacente a estas infecciones altamente invasivas. En resumen, las coinfecciones bacterianas y virales del tracto respiratorio son altamente letales y representan una carga dramática para el sistema de salud mundial. La sinergia entre los agentes bacterianos y virales infecciosos está relacionada con una variedad de factores, incluyendo daño de barrera epitelial, respuesta inmune innata exagerada, y tormenta de citoquinas. A pesar de muchos avances en los últimos años, se necesita más conocimiento sobre mecanismos e inmunología de progresión Las caracterizaciones in vivo de estas infecciones graves se realizan principalmente en ratones que se asemejan poco a la fisiología humana y el sistema inmunológico. Se han hecho varios esfuerzos para establecer otros modelos, incluyendo hurones, cobayas, conejos, ratas y primates no humanos. Sin embargo, todos tienen limitaciones. Aquí, sugerimos utilizar el modelo porcino, que proporciona ventajas obvias en estudios de enfermedades infecciosas humanas y debe ser considerado mucho más frecuente para estudios futuros sobre enfermedades infecciosas graves, incluyendo neumonía.

¿Qué tipos de células siguen las células epiteliales en la respuesta inmune a las infecciones pulmonares?

Port d’Entrée for Respiratory Infections – Does the Influenza A Virus Pave the Way for Bacterias? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5742597/SHA: ee0050c6fb81a4067d134010d0c80d21edb5df0bAutores: Siemens, Nikolai; Oehmcke-Hecht, Sonja; Mettenleiter, Thomas C.; Kreikemeyer, Bernd; Valentin-Weigand, Peter; Hammerschmidt, SvenFecha: 2017-12-21DOI: 10.3389/fmicb.2017.02602Licencia: cc-byAbstract: Las coinfecciones bacterianas y virales de las vías respiratorias son El Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes son colonizadores frecuentes del tracto respiratorio superior. Los desequilibrios mediante la adquisición de virus estacionales, por ejemplo, el virus Influenza A, pueden conducir a la diseminación bacteriana al tracto respiratorio inferior, lo que a su vez puede dar lugar a una neumonía grave. En esta revisión, se resume el conocimiento actual sobre las coinfecciones bacterianas y virales del tracto respiratorio y se enfoca en posibles modelos experimentales adecuados para imitar esta enfermedad. La transmisión del VAI y la neumonía se modela principalmente por infección de ratón. Pocos estudios que utilizan hurones, ratas, cobayas, conejos y primates no humanos también están disponibles. Los conocimientos adquiridos de estos estudios llevaron a importantes descubrimientos y avances en la comprensión de estas enfermedades infecciosas. Sin embargo, los modelos de ratón y otras infecciones tienen limitaciones, especialmente en En este caso, se sugiere el uso de tejidos pulmonares modificados por ingeniería humana, tejidos pulmonares ex vivo humanos y modelos porcinos para estudiar las coinfecciones respiratorias, que podrían contribuir a una mayor traducción de los resultados a los seres humanos y mejorar tanto la salud animal como humana. Texto: En los últimos años la microbiota humana es cada vez más reconocida por desempeñar un papel crucial en la patogénesis de muchas enfermedades (Weinstock, 2012). El tracto respiratorio superior es un nicho natural para bacterias potencialmente patogénicas incrustadas en comunidades comensales que forman el microbioma nasofaríngeo. En particular, las comunidades microbianas de la nasofaringe (Hilty et al., 2012) están asociadas con enfermedades respiratorias, es decir, neumonía grave, que son responsables de una mortalidad y morbilidad considerables en humanos en todo el mundo (Prina et al., 2016). La composición del microbioma nasofaríngeo es altamente dinámica (Biesbroek et al., 2014a,b,c) y muchos factores, incluyendo factores ambientales y de acogida, pueden afectar a la colonización microbiana (Koppen et al., 2015). Estudios recientes sobre neonatos han demostrado que la microbiota respiratoria se desarrolla desde la flora mixta inicialmente transmitida maternalmente con predominio de la especie Streptococcus viridans hasta perfiles bacterianos específicos de nicho que contienen principalmente Staphylococcus aureus a alrededor de 1 semana de edad (Bosch et al., 2016a). Entre 2 semanas y 6 meses después del nacimiento, el predominio estafilococo declina y colonización con Streptococcus pneumoniae (pneumococci) como un patobionet predominante emerge (Miller et al., 2011; Bosch et La composición dinámica del microbioma está garantizada a través de la interacción entre las especies bacterianas, otros microbios y las condiciones ambientales cambiantes, así como las interacciones huésped-bacteria (Blaser y Falkow, 2009 ). La mayor parte del tiempo, el microbioma y su interacción con el huésped humano se cree que son beneficiosas para ambos (Pettigrew et al., 2008; Murphy et al., 2009 ). Sin embargo, los desequilibrios en la composición microbiana pueden conducir a la adquisición de nuevas especies virales o bacterianas e invasión de patógenos potenciales, que a su vez pueden llegar a ser perjudiciales, especialmente en personas mayores y niños con un sistema inmunológico agotado o inmaduro (Pettigrew et al., 2008; Blaser y Falkow, 2009; Murphy et al., 2009. Un ejemplo particular que muestra desequilibrios introducidos por dosis únicas de antibióticos fue demostrado por Ichinohe Mientras que la microbiota respiratoria comensal facilitó el soporte inmune contra la infección por el virus de la influenza A (IAV), el tratamiento oral con antibióticos resultó no sólo en un cambio de la composición bacteriana, sino también en la inmunidad de células CD4 T-, CD8 T- y B- tras la infección por el virus de la gripe A en ratones (Ichinohe et al., 2011). Los análisis de microbiomas orofaríngeos humanos durante la pandemia de VAI H1N1 de 2009 revelaron que a nivel filo, la abundancia de Fermicutos y Proteobacterias se aumentó en pacientes con neumonía en comparación con controles saludables (Leung et al., 2013). Sin embargo, otro estudio publicado en el mismo año contradijo estos resultados (Chaban et al., 2013). Chaban y sus colegas analizaron microbiomas de 65 pacientes del brote de VAI H1N1 en 2009. Aunque la composición filogenética de los pacientes con neumonía estuvo dominada por Fermicutes, Proteobacterias y Actinobacterias, no se observaron diferencias significativas entre los pacientes y los controles sanos ni ninguna otra variable probada, incluyendo edad y género (Chaban et al., 2013). En esta revisión se discuten infecciones bacterianas secundarias del tracto respiratorio después de la infección primaria por el VAI con un enfoque en los mecanismos por los cuales estas interacciones son potencialmente mediadas, y se proporcionará una visión de la contribución del huésped y consecuencias inmunológicas. Además, nos centramos en modelos animales potenciales adecuados para imitar la colonización bacteriana asintomática y la progresión de la enfermedad y por lo tanto, permitiendo estudiar estrategias de adaptación, interacciones viral-bacterianas y respuestas inmunes en estas coinfección altamente letales. Los virus de la influenza A pertenecen a la familia de Orthomyxoviridae y se basan en la antigenicidad de su hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) que se clasifican en 16 subtipos clásicos de la HA y 9 de la NA clásica (Neumann et al., 2009). Los genomas de 8 segmentados de los virus de la gripe A se caracterizan por una plasticidad significativa. Debido a mutaciones puntuales y eventos de re-asociación surgen nuevas variantes o cepas con potencial epidémico o pandémico (Neumann et al., 2009). Además, la gripe puede transmitirse entre animales, incluyendo cerdos, aves, caballos y humanos, por lo que es una enfermedad zoonótica (van der Meer et al., 2010). La gripe estacional suele resolverse sin consecuencias en individuos sanos. Sin embargo, se estima que los efectos estacionales de la gripe entre el 5 y el 10% de la población mundial resultan en alrededor de 250.000 a 500.000 muertes anuales (Tjon-Kon-Fat et al., 2016). Con mayor riesgo de desarrollar neumonía bacteriana secundaria son individuos con comorbilidades, personas de edad avanzada (edad > 65), mujeres embarazadas y niños menores de 1 año (Rothberg et al., 2008). Durante mucho tiempo se consideró que la cepa H1N1, un virus H1N1 similar al de las aves, causó directamente la mayoría de las muertes durante la pandemia de 1918-1919 (gripe española), a menudo de una neumonitis hemorrágica que progresa rápidamente a síndrome de dificultad respiratoria aguda y muerte (Osterholm, 2005; Gerberding, 2006; Oxford et al., 2006). La pandemia mató alrededor de 50 millones de personas en todo el mundo y Sin embargo, muchos de los hallazgos han sido reinterpretados en los últimos años (Brundage y Shanks, 2007; Chien et al., 2009). Se estima que alrededor del 95% de todos los casos graves y muertes fueron atribuidas a infecciones secundarias con patógenos bacterianos, principalmente por Streptococcus pneumoniae (Morens et al., 2008). Estudios individuales limitados a ciertas regiones identificaron también otros patógenos comúnmente colonizando el tracto respiratorio, incluyendo Staphylococcus aureus, grupo A streptococcus (GAS) y Haemophilus influenzae (Brundage y Shanks, 2008). Durante las siguientes dos pandemias (H2N2 Asian Flu 1957 y H3N2 Hong Kong Flu 1968 -1969 coinfección bacteriana fueron menos probables que la causa de muerte fuera la gripe española (Giles y Shuttle Sin embargo, la neumonía representó alrededor del 44% de las muertes durante la gripe asiática (Giles and Shuttleworth, 1957). La mayoría de las muertes resultantes de la neumonía ocurrieron en individuos con enfermedades crónicas, es decir, enfermedades pulmonares crónicas, carditis reumática e hipertensión (Giles and Shuttleworth, 1957). En 1957-1958, S. aureus fue predominantemente aislado de casos de neumonía fatal (Hers et al., 1957 (Hers et al., 1958 Robertson et al., 1958; Martin et al., 1959), mientras que S. pneumoniae regresó como causa predominante de neumonía grave durante la gripe de Hong Kong (Sharrar, 1969; Bisno et al., 1971; Burk et al., 1971; Schwarzamann et al., 1971). Cuarenta años más tarde, en 2009, surgió un nuevo virus H1N1 de origen porcino que volvió a causar una pandemia (Dawood et al., 2009 (Dawood et al., 2012 ). A diferencia de la gripe asiática y de Hong Kong, las tasas de mortalidad fueron bastante bajas, pero la mayoría de las muertes ocurrieron en jóvenes sanos sin condiciones subyacentes (Reichert et al., 2010; Monsalvo et al., 2011; Dawood et al., 2012). Alrededor del 25-50% de los casos graves o mortales se relacionaron con complicaciones debidas a neumonía bacteriana (Dominguez-Cherit et al., 2009; Estenssoro et al., 2010; Mauad et al., 2010; Shieh et al., 2010 ). Aunque se produjeron variaciones regionales, los neumococos y S. aureus fueron las especies bacterianas más frecuentemente aisladas (Mauad et al., 2010; Shieh et al., 2010; Rice et al., 2012). El estreptococo del grupo A estuvo ausente en muchos brotes de neumonía local asociados con virus, pero predominó en otros (Brundage and Shanks, 2008; Ampofo et al., 2010). Cuando aparece, es típicamente tercero en incidencia (Chaussee et al., 2011). En general, los datos sobre brotes pandémicos sugieren que la gravedad y mortalidad de la enfermedad pueden estar vinculados a patógenos bacterianos secundarios con variaciones dependiendo de las regiones y el estado de inmunidad de la población (Brundage and Shanks, 2008; Shanks et al., 2010 Shanks et al., 2011 McCullers, 2013). Hay cada vez más evidencia de que la microbiota nasofaríngea desempeña un papel importante en la patogénesis de las infecciones respiratorias víricas agudas (Teo et al., 2015; de Steenhuijsen Piters et al., 2016; Rosas-Salazar et al., 2016a,b). Se ha demostrado que los virus respiratorios, incluido el VAI, alteran la adherencia bacteriana y la colonización, lo que aumenta el riesgo de infecciones bacterianas secundarias (Tregoning y Schwarze, 2010). Los neumococci, S. aureus y el GAS son importantes patógenos Gram positivos humanos. Todos ellos son colonizadores frecuentes de la nasofaringe humana y comparten muchas características, incluidos los mecanismos patógenos y los aspectos clínicos (Figura 1). El Staphylococcus aureus coloniza persistentemente alrededor del 30% de la población humana y los nichos típicos incluyen nares, axilas y piel (Peacock et al., 2001; von Eiff et al., 2001; van Belkum et al., 2009). Causan una variedad de manifestaciones clínicas que van desde infecciones leves de la piel hasta neumonía necrotizante fatal. En las últimas décadas, el patógeno se hizo resistente a un número creciente de antibióticos y S. aureus resistente a la meticilina (MRSA) es ahora una causa importante de infecciones adquiridas en hospitales (Hartman y Tomasz, 1984; Ubukata et al., 1989; Zetola et al., 2005). También el aumento de cepas de S. aureus adquiridas en la comunidad es de especial preocupación, porque ciertos clones están asociados con infecciones muy graves (Rasigade Estudios prospectivos recientes demostraron un aumento en la proporción de S. aureus sensibles a la meticilina adquirida por la comunidad en casos de neumonía grave (McCaskill et al., 2007; Sicot et al., 2013). El neumococo es un colonizador típico de la nasofaringe humana. Alrededor del 20-50% de los niños sanos y del 8-30% de los adultos sanos son colonizados asintomáticamente (McCullers, 2006). Los neumococos causan enfermedades que van desde leves, es decir, sinusitis, conjuntivitis y otitis media, hasta infecciones más graves y potencialmente mortales, incluyendo neumonía adquirida por la comunidad, bacteremia y meningitis (Bogaert et al., 2004; Valles et al., 2016). Esta bacteria se asocia con altas tasas de morbilidad y mortalidad en grupos de riesgo como individuos inmunocomprometidos, niños y ancianos (Black et al., 2010; Valles et al., 2016). Los estreptococos del grupo A colonizan la boca y el tracto respiratorio superior en alrededor del 2-5% de la población mundial (Okumura y Nizet, 2014). Las infecciones más comunes, no invasivas y leves causadas por el GAS son amigdalitis y faringitis con 600 millones de casos estimados al año (Carapetis et al., 2005). Enumerado como el número nueve en la lista de asesinos globales con alrededor de 500.000 muertes anuales (Carapetis et al., 2005), es obvio que este patógeno puede causar infecciones invasivas graves, incluyendo neumonía, sepsis, síndrome de shock tóxico estreptocócico, e infecciones cutáneas necrotizantes (Cunningham, 2000; Carapetis et al., 2005). Aunque los tres patógenos son capaces de causar enfermedades altamente letales, el más mortal sigue siendo el neumocococo, estimado para causar aproximadamente el 10% de todas las muertes en niños menores de 5 años de edad (O'Brien et al., 2009), en los ancianos (Marrie et al., 2017), y en individuos inmunocomprometidos (Baxter et al., 2016). El virus de la gripe A se une a través de la HA al ácido siálico α2,3 o α2,6 ligado a la superficie de las células epiteliales del tracto respiratorio superior e inferior (Webster et al., 1992). Las cepas estacionales muestran generalmente afinidad a los ácidos siálicos α2,6 ligados a la tráquea humana, mientras que los virus similares a los de la ave se unen preferentemente a los ácidos siálicos α2,3 ligados a las células alveolares de tipo II (Shinya et al., 2006; van Riel et al., 2007 van Riel et al.,, 2010. La liberación de ARN genómico viral en el citosol activa diferentes vías de respuesta inmune. La unión del ARN viral al gen inducible del ácido retinoico 1 induce la expresión de los interferones de tipo I y III y activa el factor de transcripción NF-B, que a su vez activa la liberación de citocinas proinflamatorias (Durbin et al., 2013; Iwasaki y Pillai, 2014). Además, la activación del inflamatorio conduce a la liberación de IL-1β e IL-18 (Pothlichet et al., 2013; Iwasaki y Pillai, 2014). Todas estas respuestas se supone que promueven el aclaramiento viral. Sin embargo, la presencia de proteínas virales durante la infección induce también la activación directa de la vía apoptótica intrínseca o indirecta mediante la producción de citocinas inflamatorias, resultando en apoptosis o incluso necrosis del epitelio (Korteweg y Gu, 2008) Además, la coagulación aberrante inducida por la infección por virus provoca una respuesta hiperinflamatoria (Yang y Tang, 2016). Todos estos eventos contribuyen a la lesión del tejido pulmonar (Imai et al., 2008; Davidson et al., 2014). El daño epitelial debido a la replicación viral proporciona un ambiente beneficioso para la unión bacteriana inicial (Plotkowski et al., 1993). Por otro lado, las bacterias ya colonizadas pueden aumentar la virulencia del virus de la gripe, ya sea secretando directamente las proteasas que se cortan y activan HA (Figura 2 ) (Bottcher-Friebertshauser et al., 2013) o, indirectamente, activando proteasasas del huésped como el plasminógeno, lo que aumenta las tasas de replicación y la infectividad del virus (Scheiblauer et Las bacterias potencialmente patógenas, incluyendo las tres especies mencionadas anteriormente, expresan un arsenal de factores de virulencia responsables de la unión a las estructuras humanas huésped. Componentes de la superficie microbiana que reconocen las moléculas de la matriz adhesiva FIGURA 1 Modelos potenciales para estudiar coinfecciones bacterianas y virales del tracto respiratorio. S. pneumoniae, S. aureus, S. pyogenes y S. suis son colonizadores frecuentes del tracto respiratorio superior. La infección estacional por VAI puede conducir a un mayor riesgo de infecciones bacterianas secundarias, es decir, neumonía. Se pueden utilizar varios modelos experimentales para estudiar estas infecciones graves. Las muestras de pacientes, incluido el tejido pulmonar ex vivo, son materiales de elección, pero son raras debido a consideraciones éticas. Las coinfecciones bacterianas y virales in vivo se realizan principalmente en ratones, lo que no se parece necesariamente a la fisiología humana y al sistema inmunitario. Por lo tanto, sugerimos utilizar el modelo porcino, que casi se asemeja a más del 80% del sistema inmunitario humano. (MSCRAMM), tales como PspC, PspA y PsaA en neumococci (Hammerschmidt, 2006), SPA, FnbA, ClfA y ClfB en S. aureus (Bartlett y Hulten, 2010; Otto, 2010), y proteína M, PrtF1 y PrtF2 en GAS (Cunningham, 2000), respectivamente, y las llamadas proteínas iluminantes de la luna expresadas por las tres especies, por ejemplo, GAPDH, enolasa o PGK (Fulde y otros, 2013), permiten a las bacterias unirse a células o moléculas dañadas de la matriz extracelular, incluyendo fibronectina, fibrin, fibrinógeno y colágenos, o proteínas fibrinolíticas como plasminógeno (McCullers y Rehg, 2002; Bergmann Una vez que se produce la unión inicial, citotoxinas bacterianas, incluyendo neumolisina de neumococos (Garcia-Suarez Mdel et al., 2007; Zahlten et al., 2015), α-hemolisina y leucocidinas de S. aureus (Mairpady Shambat et al., 2015) y Streptolysins S y O y exotoxina pirogénica pirogénica B de S. pyogenes (Tsai et al., 1998; Gurel et al., 2013; Siemens et al., 2015 Siemens et al.,, 2016, pueden sinergizar con contrapartes virales para aumentar aún más la patología del tejido pulmonar. Entre los posibles mecanismos adicionales por los que podría producirse la colonización inicial del tracto respiratorio inferior y daño del tejido pulmonar se incluyen la potenciación del desarrollo de neumonía por parte de la neuraminidasa del VAI mediante la eliminación enzimática del ácido siálico del pulmón, exponiendo así los receptores del huésped para la adhesión neumocócica (McCullers y Bartmess, 2003). El estado inflamatorio del huésped en respuesta a la infección viral puede alterar la presentación de los receptores en la superficie, permitiendo así la invasión bacteriana (Cundell y Tuomanen, 1994). A medida que el paciente comienza a recuperarse de la infección viral, pueden ocurrir infecciones bacterianas secundarias (Louria et al., 1959) debido a la curación incompleta de la herida y la exposición de los componentes de la membrana del huésped, incluyendo lamina, colágenos tipo I y IV a las MSCRAMMs bacterianas clásicas ( Las células epiteliales son las primeras en responder a las infecciones pulmonares, seguidas por los macrófagos alveolares residentes en el tejido. Promueven el aclaramiento viral a través de fagocitosis, eferocitosis y liberación de citocinas y quimioquinas para promover las respuestas inmunes (Hashimoto et al., 2007; Kumagai et al., 2007; Wang et al., 2012; Hillaire et al., 2013). Los virus respiratorios como el VAI son capaces de inducir la supresión y muerte de los macrófagos alveolares residentes (Figura 2 ) (Ghoneim et al., 2013). Estas células suelen ser reemplazadas por la diferenciación de monocitos derivados de la sangre reclutados en macrófagos de diferentes patrones de polarización, lo que a su vez crea un retraso en el aclaramiento de patógenos y Además, la inducción de interferones como respuesta a la infección viral compromete la detección inmunitaria de bacterias Gram-positivas por neutrófilos y macrófagos, lo que normalmente eliminaría las bacterias de los pulmones (Figura 2 ) (Sun y Metzger, 2008; Tian et al., 2012). El mecanismo exacto subyacente a este fenómeno todavía no se entiende. Varios estudios sugieren que el ARN viral activa los receptores de tipo peaje (TLR) 2 y TLR4 y, en consecuencia, la producción de interferones de tipo I para promover un estado antiviral (Shahangian et al., 2009). La infección posterior por bacterias Gram-positivas, p. ej., pneumococci, potencia la expresión de interferón tipo I, que a su vez suprime la producción de la quimioquina CCL2 y el reclutamiento de macrófagos (Nakamura Frontiers in Microbiology www.bordersin.org FIGURE 2 La interacción entre el VAI, las bacterias y el huésped humano. El daño epitelial debido a la replicación viral proporciona un ambiente beneficioso para la unión bacteriana (Bact.). El VAI es capaz de inducir la supresión y muerte de los macrófagos alveolares residentes (AM), que a su vez retrasa el aclaramiento viral. La liberación de ARN viral activa diferentes vías de respuesta inmune que resultan en tormenta de citoquinas. Los interferones de tipo I y III comprometen el reconocimiento inmune de bacterias Gram-positivas por neu Además, podrían suprimir la función celular asesina natural (NK), incluyendo la liberación de TNF, que activa los macrófagos alveolares. Después de la inflamación inicial, la situación podría empeorar debido a la infiltración celular de los pulmones por neutrófilos (PMN), lo que conduce a un aumento de la desgranulación y el daño tisular por moléculas efectoras, incluyendo la proteína de unión a la heparina (HBP). et al., 2011). Otro estudio de Shahangian et al. (2009) reveló que el estado antiviral conduce a la producción deteriorada de quimioattractantes neutrófilos CXCL1 y CXCL2, que a su vez promueve respuestas inmunológicas menos eficaces debido a las funciones neutrófilas atenuadas durante la fase temprana de la invasión neumocócica. Otros estudios encontraron que los pulmones expuestos habían dañado las respuestas La reducción de la producción de TNFα por las células NK se identificó como un mecanismo previo crucial de las actividades antimicrobianas deprimidas por los macrófagos alveolares (Figura 2 ) (Small et al., 2010). Parece probable que IAV NA también sea capaz de activar los receptores de células huésped de manera dependiente de TGF-β, lo que a su vez promueve la invasión de GAS y la patología pulmonar posterior (Li et al., 2015). Estudios in vitro sobre la interacción entre las células dendríticas humanas y los neumococos IAV revelaron TLR3 como un sensor crucial de ARN viral y bacteriano que conduce a una producción mejorada de IL-12p70, que a su vez podría promover un estado antiviral mediante la regulación de los interferones (Yamamoto et al., 2004; Spelmink Sin embargo, cabe señalar que dependiendo de la especie bacteriana la manifestación de la enfermedad y las respuestas inmunes innatas subyacentes pueden variar (Sharma-Chawla et al., 2016). Muchos de los estudios experimentales sobre los mecanismos de la enfermedad y las respuestas inmunitarias se basan en una infección bacteriana posterior en horas o pocos días después de la infección por VAI. Sin embargo, las infiltraciones bacterianas de los pulmones pueden ocurrir mucho más tarde, es decir, durante el inicio de la cicatrización de heridas después del aclaramiento parcial del VAI, que se ha reportado en la mayoría de los estudios realizados en los últimos años (Snelgrove et al., 2008; Hussell y Cavanagh, 2009 ). Estos procesos se caracterizan por un estado antiinflamatorio general y la supresión de mecanismos involucrados en el aclaramiento de patógenos debido al aumento de la producción de interleucina-10 (van der Sluijs et al. El estado antiinflamatorio suprime la expresión de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) en fagocitos profesionales que conducen a la fagocitosis alterada y la muerte de microbios. Estos eventos podrían permitir el sobrecrecimiento bacteriano en los pulmones y patología tisular (Sun and Metzger, 2008; Goulding et al., 2011). Al igual que otras enfermedades infecciosas graves causadas por agentes individuales, la neumonía se caracteriza por condiciones hiperinflamatorias de los pulmones al inicio de la infección, seguido de un estado hipoinflamatorio con parálisis inmune (Morton et al., 2014). En las coinfecciones, después de la inflamación inicial en respuesta a la infección viral, la situación podría empeorar debido a la invasión bacteriana y la infiltración celular mejorada de los pulmones por neutrófilos, lo que conduce a un aumento del daño tisular y la tormenta de citoquinas (Figura 2 ) (Conenello et al., 2007; McAuley et al., 2007 McAuley et al.,, 2010 Porto y Stein, 2016). Además, el sistema de coagulación se activa y contribuye a la respuesta fisiopatológica a la infección (van der Poll y Herwald, 2014). Bacterias como pneumococci, S. aureus y GAS pueden activar y modular el sistema de coagulación, lo que conduce a una amplia expresión del factor tisular e incrementar el riesgo de coagulopatía grave Shannon et al., 2013; Walters et Los patógenos bacterianos también expresan una variedad de toxinas citolíticas que pueden contribuir a la inflamación y patología tisular. La neumolisina, una toxina neumocócica formadora de poros con baja afinidad a las células epiteliales pulmonares, puede dañar los neutrófilos mediante la utilización del receptor P2X7 (Domon et al., 2016). Las citotoxinas estafilocócicas (α-toxina y leucocidinas, incluyendo Panton-Valentina leucocidina, PVL) están asociadas con patología tisular severa, fuerte regulación de quimioquinas, y el aumento de la afluencia de neutrófilos de los pulmones (Mairpady Shambat et al., 2015). Las toxinas GAS, incluyendo SLO y SpeB, son capaces de causar daño tisular directamente y promover estados proinflamatorios a través de la lisis de neutrófilos (Snall et al., 2016; Uhlmann et al., 2016). Los efectos citolíticos causados por toxinas bacterianas podrían sinergizarse con el resultado de la proteína accesoria citotóxica IAV, PB1-F2, patología tisular mediada que conduce a una mayor producción de citocinas (Ramos y Fernández-Sesma, 2012). Tomados juntos, lo más probable, efectos sinérgicos de las vías que están involucradas en la inflamación bacteriana y viral conducen a una mayor activación inmune y una mayor morbilidad y mortalidad (Joyce et al., 2009; Koppe et al., 2012; Ramos y Fernández-Sesma, 2012; Bucasas et al., 2013; La Figura 2 resume la interacción entre virus, bacterias y huésped. Los modelos animales experimentales son una herramienta útil para estudiar los efectos in vivo de diferentes agentes infecciosos y representan aproximadamente el 3% de toda la investigación sobre neumonía publicada en revistas de revisión por pares (Hraiech et al., 2015). Sin embargo, el aumento constante de estudios en animales en las últimas décadas contrasta con su reproducibilidad en humanos (Hackam y Redelmeier, 2006). Hackam y sus colegas identificaron 2.000 artículos publicados entre 1980 y 2006 en siete revistas científicas líderes que publican regularmente estudios en animales (Hackam y Redelmeier, 2006). Setenta y seis de 2.000 fueron muy citados con un recuento medio de citas de 889. De estos 76 estudios 28 fueron replicados en ensayos aleatorios humanos, 14 fueron contradichos y 34 permanecieron sin probar (Hackam y Redelmeier, 2006). Sólo un 1,4% de los estudios en animales publicados en revistas de alto impacto fueron traducidos en ensayos aleatorizados en humanos (Hackam y Redelmeier, 2006), mientras que alrededor de un 44% de la tasa de replicación fue reportada en estudios humanos altamente citados (Ioannidis, 2005). En modelos de neumonía, los mamíferos se utilizan principalmente por su proximidad anatómica y fisiológica al ser humano (Hraiech et al., 2015). Para monitorear estudios fisiológicos extensos, especies de mamíferos más grandes, incluyendo hurones, perros, conejos, cerdos y babuinos son los modelos de elección (Mizgerd y Skerrett, 2008). Sin embargo, los roedores y en particular ratones se utilizan con mayor frecuencia como organismos modelo de neumonía. La velocidad reproductiva rápida, el tamaño pequeño, el manejo menos complicado, la capacidad de reproducir y comparar los resultados con las monoinfecciones bacterianas y virales ya publicadas, el conocimiento detallado de la genética y las respuestas inmunitarias, y una plétora de reactivos disponibles para estudiar las infecciones en ratones son razones para el uso de estos animales. Para evitar variaciones en las respuestas debido a la diversidad genética, las cepas de ratones endogenados son herramientas útiles para estudios destinados a dilucidar los mecanismos moleculares de las enfermedades. Además, la ingeniería genética permitió generar una amplia variedad de variantes de ratón con genes de ganancia de función, pérdida de función o reportero (Mizgerd y Skerrett, 2008). Como se indicó anteriormente, muchos estudios in vivo sobre coinfecciones bacterianas y virales proporcionaron información útil sobre la neumonía grave, entre ellos: i) el hecho de que la infección viral prepara al huésped para la susceptibilidad bacteriana que conduce a una infección secundaria grave (Hashimoto et al., 2007; Shahangian et al., 2009; Chaussee et al., 2011; Nakamura et al., 2011); ii) sinergismo patógeno (Tsai et al., 1998; McCullers and Rehg, 2002; Garcia-Suarez Mdel et al., 2007; Gurel et al., 2013; Mairpady Shambat et al., 2015; Zahlten et al., 2015); iii) mayor respuesta inflamatoria al inicio de la infección (Korteweg y Gu, 2008; Durbin et al., 2013; Pothlichet Sin embargo, los modelos de ratón para infecciones bacterianas y/o virales tienen varias limitaciones. La mayoría de las especies bacterianas y virales bajo estudio son patógenos humanos. En los últimos años también se demostró que las variaciones genéticas del huésped y las diferencias de sexo tienen un impacto en la predisposición, severidad y resultado de la infección (Chella Krishnan et al., 2015 Mientras que los ratones C57BL/6 y BALB/c se caracterizan por una mayor resistencia, las cepas DBA/2 son más susceptibles y permisivas a las cepas bacterianas y virales (Alymova et al., 2011; Chella Krishnan et al., 2015. Además, la transmisión de VAI y bacterias es ineficiente en ratones adultos, lo que requiere modelos animales alternativos, incluyendo ratones neonatales o ferrets (Diavatopoulos et al., 2010; McCullers et al., 2010) Se demostró que el VAI era esencial para la transmisión neumocócica de ratones colonizados a sus compañeros ingenuos y la transmisión se produjo sólo cuando todos los ratones estaban infectados con el VAI (Diavatopoulos et al., 2010). et al., 2010. Los hurones son naturalmente susceptibles al VAI aislados de diferentes especies, incluyendo humanos, aves y cerdos (Thangavel y Bouvier, 2014). La infección de hurones con aislados de VAI estacionales humanos resulta en una infección del tracto respiratorio superior similar a la infección por gripe humana (Tripp y Tompkins, 2009). A diferencia de los ratones, el VAI humano no adaptado puede ser utilizado para la infección. Desafortunadamente, sólo hay pocos informes sobre coinfección bacteriana y VAI en este organismo modelo. Un informe de Sanford y Ramsay mostró una mayor colonización estafilocócica del tracto respiratorio superior en animales infectados por el VAI en comparación con los no infectados, mientras que no se observó diferencia entre ambos grupos en la infección por estreptococo del grupo B (Sanford y Ramsay, 1987). En contraste, Smith y Mc Cullers reportaron falta de establecimiento de infección por estafilococo incluso cuando los hurones estaban preinfectados con el VAI (Smith y McCullers, 2014). Las mayores ventajas de usar hurones como modelo incluyen: i) su susceptibilidad a patógenos humanos no adaptados, ii) la eficiencia en la transmisión del VAI y bacterias de un individuo a otro, y iii) la presentación de los signos clínicos de manifestación de la enfermedad similar a la infección por gripe humana. Desafortunadamente, su limitada disponibilidad, la compleja crianza y la limitada accesibilidad a reactivos específicos de hurones dificultan la realización de esta investigación (Bouvier y Lowen, 2010). En los últimos años, el cobaya (Cavia porcellus) también se utilizó en la investigación de neumonía. La fisiología y anatomía del pulmón de cobaya se asemeja en cierta medida al pulmón humano y este organismo modelo se utiliza a menudo en enfermedades pulmonares no infecciosas, incluyendo asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (Canning y Chou, 2008). Además, su disponibilidad comercial, facilidad de cría, la capacidad de trabajar con patógenos no adaptados y la eficiencia de la transmisión son razones para utilizar este modelo in vivo (Bouvier y Lowen, 2010). Aunque la replicación viral puede detectarse fácilmente tras la inoculación intranasal en el tracto respiratorio superior y los pulmones, los cobayas sólo presentan síntomas clínicos menores (Lowen et al., 2006; Gabbard et al., 2014). Sin embargo, la patología pulmonar de los cobayas infectados por el VAI se correlaciona con la gravedad clínica de la infección humana (Gabbard et al., 2014). La transmisión de neumococos en cobayas se promueve por la coinfección con el virus de Sendai (Saito et al., 1988). Los cobayas infectados por neumococos solos y enjaulados con animales de contacto no tratados transmiten la bacteria sólo en el 7% de los casos, mientras que los coconejillos infectados por el virus de Sendai adquirieron infección neumocócica en el 83% de Otro estudio evaluó la eficacia de los antibióticos en la infección pulmonar invasiva causada por neumococo resistente a la penicilina (Ponte et al., 1996). Instilación intraqueal de 3 × 10 9 UFC de S. pneumoniae indujo una neumonía fatal y bacteremia en el 85% de los animales no tratados dentro de las 46 h (Ponte et al., 1996). Al igual que con los hurones, hay una escasez de datos que describen las respuestas inmunitarias a los agentes infecciosos pulmonares, esto se debe en parte a la falta de reactivos específicos de especies, lo que es una desventaja en el uso de este organismo modelo. Recientemente, la rata de algodón (Sigmodon hispidus) fue reportada como susceptible a la VAI. Infección nasal y pulmonar en ratas adultas de algodón no requirieron adaptación viral (Otto La replicación del VAI fue más extensa en los tejidos nasales que en el pulmón y persistió durante seis días consecutivos. La patología tisular incluyó daño del epitelio bronquiolar y los animales desarrollaron neumonía que persistió durante casi 3 semanas (Ottolini et al., 2005). En los estudios bacteriológicos las ratas se utilizan con mayor frecuencia. Existen numerosos modelos de ratas que investigan el impacto de la diabetes (Oliveira et al., 2016), síndromes metabólicos (Feng et al., 2015), cirrosis, farmacocinética y dinámica (Antonopoulou et al., 2015; Hoover et al., 2015), intoxicación (Davis et al., 1991), inmunización (Iinuma y Okinaga, 1989) y factores de virulencia bacteriana general (Shanley et al., 1996) sobre el desarrollo de neumocócicos, estreptocócicos y neumonía estafilocócica y patología pulmonar. Lamentablemente, sólo hay pocos estudios sobre coinfecciones bacterianas y virales en ratas. La primera fue realizada por Harford et al., 1946 (Harford et al., 1946. Los autores concluyeron que la neumonía bacteriana secundaria no convierte la infección viral subletal en un resultado letal (Harford et al., 1946). Otro estudio sobre el virus sincitial respiratorio humano y S. pneumoniae reveló que las ratas fueron fácilmente colonizadas con neumococos, pero la replicación viral después de la infección posterior fue dependiente de la tensión. Además, ni los neumococos ni el virus se propagaron del tracto respiratorio superior al inferior, y ninguno de los patógenos se transmitió a compañeros de jaula ingenuos. Aunque las ratas comparten muchas características inmunes con los seres humanos, incluyendo la producción de óxido nítrico por macrófagos (Carsillo et al., 2009), las mayores desventajas son la baja disponibilidad animal, la agresividad de la especie y la falta de reactivos específicos. Los conejos (Oryctolagus cunilulus También se emplearon conejos para estudiar la neumonía, aunque sólo se dispone de unos pocos modelos. Los parámetros típicos de lectura incluyen supervivencia, infiltración de leucocitos en los pulmones, patología pulmonar y evaluación de la concentración de fármacos en el suero. Uno de los primeros estudios sobre neumonía neumocócica en conejos se realizó en Kline e Winternitz (1913). Este estudio reveló que los conejos poseen inmunidad activa si se han recuperado de un ataque de neumonía experimental y posteriormente pueden resistir dosis intratraqueales repetidas de neumococos (Kline e Winternitz, 1913). En 1926 se estableció una infección por inhalación de neumococos de tipo I en conejos (Stillman y Branch, 1926). Las bacterias se infiltraron fácilmente en el tracto respiratorio inferior y neumococos que llegaban a los pulmones generalmente desaparecieron en horas y aparecieron septicemia fatal en Los modelos más recientes de neumonía por neumococo y estafilococo en conejos se basan en infecciones intrabronquiales o intrapulmonares que las hacen útiles para la patogénesis (Diep et al., 2010 (Diep et al., 2017,, así como en estudios de eficacia y eficacia de fármacos (Cabellos et al., 1992; Croisier-Bertin et al., 2011). Sin embargo, esta vía de infección requiere cirugía y los reactivos específicos de especies son escasos. En la investigación de IAV los conejos se utilizan con frecuencia para la producción de anticuerpos y para estudios sobre cinética de anticuerpos después de administraciones únicas o múltiples de IAV (Loza-Tulimowska et al., 1977). Además, los conejos se utilizan para investigar la seguridad de las vacunas (por ejemplo, CoVaccine HT o Aflunov) (Heldens et al., 2010; Gasparini et al., 2012). En los últimos años se investigó el desprendimiento de IAV aviar por colas de algodón (Sylvilagus spp.) revelando que las colas de algodón inoculadas nasales y orales arrojan cantidades relativamente grandes de ARN viral (Root et al., 2014). En particular, se encontró que los títulos virales bajos eran suficientes para iniciar la replicación viral en colas de algodón (Root et al., 2017). Sin embargo, a pesar de su susceptibilidad a la infección por IAV, los conejos son raramente utilizados como modelo para la patogénesis por IAV, ya que no ofrecen mejoría sobre otros modelos de infección establecidos. Las especies más utilizadas son los macacos rhesus (Macaca mulatta) y los macacos cynomolgus (Macaca fasciluraris). Aunque se demostró a principios de ese año que los macacos eran susceptibles al VAI (Saslaw et al., 1946), los modelos animales de elección siguieron siendo hurones y ratones. Recientemente, los macacos se han utilizado para comparar la patogénesis de la pandemia altamente virulenta de 1918 VAI y la cepa de gripe patogénica de aves (H5N1) con una cepa convencional H1N1 (Rimmelzwaan et al., 2001). Los macacos cynomolgus infectados con H5N1 de alta patogenicidad desarrollaron síndrome de dificultad respiratoria aguda, fiebre y neumonía necrotizante (Rimmelzwaan et al., 2001). La cepa de 1918 del VAI indujo una disregulación de la respuesta antiviral que provocó una insuficiente protección del huésped, lo que a su vez resultó en malestar respiratorio agudo y desenlace fatal (Kobasa et al., 2007). El aislado pandémico H1N1 de EE.UU. de 2009 causó lesiones patológicas graves en los pulmones de los macacos (Itoh et al., 2009 ). Los tres estudios mencionados anteriormente utilizaron la administración intratraqueal combinada de altas dosis de virus. Un estudio reciente de Marriott et al. analizaron el resultado de las rutas de desafío, incluyendo la inhalación de aerosoles e instilación intranasal con dosis bajas a moderadas de H1N1 en macacos cinomolgus (Marriott et al., 2016). La replicación vírica fue detectada en todos los grupos de desafío, aunque la enfermedad permaneció subc Para el grupo A se realizaron análisis de transcriptoma longitudinal de infección estreptocócica en faringitis experimental (Virtaneva et al., 2005) e infección del tracto respiratorio inferior en macacos cinomolgus (Olsen et al., 2010a). La enfermedad del tracto respiratorio inferior observada en macacos después de la infección por GAS imitaba las características clínicas y patológicas de la bronconeumonía grave en humanos (Olsen et al., 2010a). Otro estudio realizado por Olsen y colegas analizó la contribución de PVL de una cepa USA300 S. aureus altamente virulenta en infección respiratoria (Olsen et al., 2010b). Aunque la enfermedad del tracto respiratorio inferior observada en el mono imitaba las características clínicas y patológicas de la neumonía temprana de leve a moderada en los seres humanos, no se pudo detectar ninguna afectación del PVL en la patología pulmonar o la afluencia de células inmunitarias de los pulmones (Olsen et al., 2010b). El mismo grupo de investigación ha desarrollado un modelo de coinfección no letal IAV (H3N2)-S. aureus coinfection model en cinomolgus macaques (Kobayashi et al., 2013). La progresión de la neumonía fue monitoreada por la evaluación de parámetros clínicos, química de la sangre, hisopos nasales y patología de los pulmones. Aunque los macacos se utilizan con frecuencia para evaluar la eficacia de la vacuna antineumocócica, incluyendo la prueba del impacto de la vacuna antineumocócica conjugada 13-valente y la vacuna antineumocócica polisacárida 23-valente en repertorios de células B de memoria específica de antígenos (Jia et al., 2017), en la última década sólo se realizaron dos estudios sobre transporte de neumocócicos y neumonía. En 2013, Philipp y sus colegas analizaron la tasa de transporte de neumocococo en 158 animales de la colonia. Ninguno de los rhesus macaques encuestados llevó S. pneumoniae en la nasofaringe (Philipp et al., 2012). Los autores concluyeron que el rhesus macaque probablemente no es un huésped natural de neumococos. Pero, cuando los bebés fueron colonizados con cepa 19F a través de la instilación nasofaríngea, la colonización fue inducida en ocho de ocho infantes, duró 2 semanas en todos los animales y 7 semanas en más del 60% (Philipp et al., 2012). El mismo grupo probó la neumolisina desintoxicada (dPly) y la proteína de triada de histidina neumocócica D (PhtD) como potenciales candidatos a vacuna para prevenir la neumonía (Denoel et al., 2011). Después de la inmunización los macacos rhesus fueron desafiados con una cepa neumocócica de 19F. La vacuna PhtD-dPly adyuvada con AS02 protegía a los animales contra la neumonía inducida por S. pneumoniae, que estaba relacionada con la capacidad (i) de reducir en gran medida la carga bacteriana dentro de la primera semana después del desafío y (ii) los niveles de anticuerpos específicos de PhtD-y Ply (Denoel et al., 2011). Aunque sólo existen unos pocos estudios macacos sobre neumonía, debido a la proximidad a los seres humanos en términos de fisiología e inmunidad, estos animales pueden ser un buen modelo en el contexto de estudios de traducción que evalúan la terapéutica y la profilaxis. A pesar del amplio uso de diferentes modelos animales, el modelo in vivo óptimo para la neumonía humana sigue sin identificarse. Los mamíferos pequeños, incluidos los roedores, son bien conocidos desde un punto de vista biológico, genético e inmunológico y son fáciles de mantener. La elección de estos animales Sin embargo, también están lejos de la anatomía, la fisiología, la inmunología y la susceptibilidad a los patógenos exclusivamente humanos. El modelo animal experimental debe ser elegido en base a respuestas comparables a los humanos. Los primates generalmente están legalmente reservados a temas específicos. En este caso, los cerdos podrían ser un sistema modelo apropiado para estudiar enfermedades infecciosas incluyendo neumonía (Figura 1). La composición y tamaño del genoma porcino es comparable a la de los humanos (Hart et al., 2007). Además, los órganos humanos y porcinos tienen muchas características y funciones comunes (Swindle et al., 2012). El tracto respiratorio superior de los humanos y los cerdos, incluyendo el tejido linfoide en la nasofaringe, es anatómicamente similar. Además, como los humanos, los cerdos poseen tonsils, que están ausentes en ratones (Horter et al., 2003). Una ventaja importante del estudio de enfermedades infecciosas mediante la utilización de cerdos como organismo huésped es que los cerdos tienen un conjunto completo de inmunizadores innatos y adaptativos. Según los resultados de secuenciación del genoma completo, el sistema inmunitario porcino se asemeja a más del 80% del sistema inmunitario humano, mientras que los ratones comparten menos del 10% con los humanos (Dawson et al., 2016). La mayoría de los compartimentos de células inmunes identificados en los seres humanos también están presentes en los cerdos (Piriou-Guzilack y Salmon, 2008; Fairbairn et al., 2011). A diferencia de los ratones y similares a los humanos, los cerdos tienen entre el 50 y el 70% de las células nucleares polimorfo circulantes (Fairbairn et al., 2011). Además, todas las citoquinas funcionales o ortologistas involucrados en el paradigma Th1, Th2, Th17 y Treg y las células inmunes correspondientes se han descrito en cerdos (Murtaugh et al., 2009; Kaser et al., 2011; Kiros et al., 2011). Especialmente el muy prominente quimio-atractivo proinflamatorio humano, CXCL8, está presente como un ortolog en cerdos, mientras que no hay homólogo en ratones (Fairbairn et al., 2011). A diferencia de los monocitos humanos, que pueden dividirse en tres subclases (CD14 clásico + CD16 −, CD14 no clásico + CD16 +, y CD14 intermedio ++ CD16 + ), los monocitos porcinos consisten en cuatro subclases (Chamorro et al., 2005; Fairbairn et al., 2013). Al igual que los monocitos humanos, expresan moléculas de adhesión, como VLA-4 y LFA-1 y moléculas costimuladoras, incluyendo CD80 y CD86 (Chamorro et al., 2005). El cerdo se ha utilizado previamente para imitar una serie de enfermedades infecciosas humanas. Ejemplos de infecciones por S. aureus con este organismo modelo son infecciones por heridas Svedman et al., 1989), osteomielitis (Jensen et al., 2010) y sepsis (Nielsen La inoculación intravenosa de lechones con neumococos llevó a la bacteriemia durante un período de 5 días y se asoció con fiebre y artritis séptica. La inoculación intranasal de lechones llevó a la colonización durante al menos seis días consecutivos sin causar signos clínicos (De Greeff et al., 2016). Además, la investigación sobre infecciones respiratorias de cerdos por patógenos humanos incluyendo S. aureus (Luna et al., 2009), Mycobacterium tuberculosis (Gil et al., 2010), Bordetella pertussis (Elahi et al., 2007), Pseudomonas aeruginosa (Luna et al., 2009), y IAV (Khatri et al., 2010), se realizó en los últimos años. El hecho de que los cerdos y los seres humanos estén infectados con subtipos idénticos de VAI (H1N1, H3N2), y muestren una presentación clínica y patogénesis similares, hace que los cerdos sean un organismo modelo ideal para estudios sobre coinfecciones respiratorias (Van Reeth et al., 1998). Especialmente las infecciones por VAI ya están bien establecidas en los cerdos (Van Reeth et al., 1998, 2002a Jung et al., 2007; Khatri et al., 2010; Barbe et al., 2011). Además del número limitado de publicaciones sobre cerdos y patógenos humanos, mucho se puede traducir y aprender de estudios sobre el patógeno zoonótico porcino Streptococcus suis. S. suis usualmente habita superficies mucosas de amígdalas, nares, genitales y tractos alimentarios de lechones. Una vez alterado el equilibrio microbiano, las bacterias pueden causar meningitis, septicemia, artritis y neumonía en cerdos (Staats et al., 1997). Algunas cepas de S. suis se consideran hipervirulentas y otras hipovirulentas. En general, el serotipo 2 se aísla con mayor frecuencia de cerdos enfermos (Staats et al., 1997). S. suis también puede causar enfermedades graves en los seres humanos, incluyendo septicemia, meningitis, artritis y síndrome de shock tóxico estreptocócico (Tang et al., 2006; Yu et al., 2006; Gottschalk et al., 2007). Aunque muchos estudios in vivo sobre S. suis se han realizado utilizando ratones como organismo modelo (Seitz et al., 2012; Auger et al., 2016), varios otros estudios han demostrado la ventaja de utilizar cerdos como huésped natural para S. suis (Bi et al., 2014; Ferrando et al., 2015). Una reciente publicación de Lin y colegas sobre H1N1 y S. suis co-infectados lechones demostró los efectos sinérgicos de ambos patógenos (Lin et al., 2015). Coinfectados lechones tuvieron una presentación clínica más severa y cambios patológicos en el pulmón, en comparación con los animales infectados con patógenos únicos (Lin et al., 2015). Además, los genes asociados con las respuestas inmunitarias, la producción de citocinas inflamatorias y las vías apoptóticas fueron muy sobreexpresados en el grupo coinfectado (Lin et al., 2015). Aunque el modelo porcino parece ser ideal para imitar enfermedades infecciosas humanas, también hay desventajas, incluyendo, por ejemplo, la necesidad de instalaciones animales experimentales especializadas, manejo de tiempo, altos costos de mantenimiento y disponibilidad limitada de animales transgénicos. Aunque el uso de animales contribuye en gran medida a nuestra comprensión de las enfermedades infecciosas, los modelos de tejido humano 3D-organotípico y tejidos de órganos ex vivo deben ser considerados, ya que son herramientas más valiosas para estudiar las interacciones host-patógenos en un entorno más complejo (Figura 1). Los enfoques de ingeniería de tejidos se centraron originalmente en la medicina regenerativa (Lager y Vacanti, 1993). A diferencia de los cultivos celulares monocapa estándar, los modelos de tejido se asemejan mucho más a la arquitectura 3D, la composición celular y la complejidad de la matriz del órgano respectivo. En los últimos años, la ingeniería tisular también se empleó con éxito en varios estudios sobre enfermedades infecciosas, como infecciones por virus del Zika de organoide cerebral (Lancaster et al., 2013; Dang et al., 2016), infecciones por Helicobacter pylori de organoide epitelial gástrico (McCracken et al., 2014; Schlaermann et al., 2016), infecciones por Escherichia coli y Rotavirus de enteroides gastrointestinales y pequeños intestinales (Saxena et al., 2015; VanDussen et al., 2015), infecciones por el virus Entamoeba histolytica o Hepatitis B de tejido sinusoide hepático (Petropolis et al., 2014 (Petropolis et al., 2016, Grupo A y G, infecciones por estreptococócicas Por ejemplo, el modelo de tejido pulmonar relevante para la neumonía consiste en fibroblastos pulmonares incrustados en una matriz de colágeno con una capa epitelial estratificada en la parte superior (Nguyen Hoang et al., 2012). El tejido diseñado es adecuado para implantar y estudiar células inmunitarias, incluyendo células dendríticas, monocitos, macrófagos e incluso células mononucleares de sangre periférica (Nguyen Hoang et al., 2012; Mairpady Shambat et al., 2015). Una publicación reciente demostró un evento doble de patología pulmonar en neumonía necrotizante estafilocócica (Mairpady Shambat et al., 2015). Mientras que la α-toxina tuvo un efecto perjudicial directo en el epitelio pulmonar, la PVL indujo patología pulmonar indirectamente a través de la lisis de neutrófilos (Mairpady Shambat et al., 2015). Todos los estudios mencionados anteriormente destacan un progreso significativo en el campo de las enfermedades infecciosas no sólo desde el punto de vista científico, sino también contribuyendo al principio de tres R de experimentación animal (Russell, 1995). En estos términos, el uso de biopsias de órganos humanos ex vivo cultivadas, que son raras debido a consideraciones éticas, es una opción adicional para estudiar interacciones host-patógeno. Este sistema ex vivo puede superar incluso las limitaciones del tejido diseñado. En los últimos años se han realizado infecciones del tejido pulmonar ex vivo humano con varios microorganismos, incluyendo neumococos (Szymanski et al., 2012; Fatykhova et al., 2015), Bacillus anthracis (Chakrabarty et al., 2007), Haemophilus influenzae (Zhang et al., 2016) y IAV (Nicholls et al., 2007; Chan et al., 2009). En el ámbito humano, la mayor parte del trabajo se ha centrado en el tropismo, la gravedad de las infecciones, la liberación de mediadores inflamatorios y las tasas de replicación de los microorganismos. Además, recientemente también se han realizado experimentos con el virus de la gripe porcina (SIV) y S. suis coinfecciones de las rebanadas de pulmón ex vivo porcino. Meng y sus colegas mostraron que la VIS promueve infecciones bacterianas posteriores en un proceso de dos pasos del cual el primer paso inicial fue dependiente de la expresión de la cápsula, mientras que el segundo paso de invasión bacteriana en capas más profundas fue independiente de la cápsula y requirió daño mediado por virus (Meng et al., 2015). Sin embargo, esto es sólo un comienzo y se necesitan más investigaciones para desentrañar la complejidad subyacente a estas infecciones altamente invasivas. En resumen, las coinfecciones bacterianas y virales del tracto respiratorio son altamente letales y representan una carga dramática para el sistema de salud mundial. La sinergia entre los agentes bacterianos y virales infecciosos está relacionada con una variedad de factores, incluyendo daño de barrera epitelial, respuesta inmune innata exagerada, y tormenta de citoquinas. A pesar de muchos avances en los últimos años, se necesita más conocimiento sobre mecanismos e inmunología de progresión Las caracterizaciones in vivo de estas infecciones graves se realizan principalmente en ratones que se asemejan poco a la fisiología humana y el sistema inmunológico. Se han hecho varios esfuerzos para establecer otros modelos, incluyendo hurones, cobayas, conejos, ratas y primates no humanos. Sin embargo, todos tienen limitaciones. Aquí, sugerimos utilizar el modelo porcino, que proporciona ventajas obvias en estudios de enfermedades infecciosas humanas y debe ser considerado mucho más frecuente para estudios futuros sobre enfermedades infecciosas graves, incluyendo neumonía.

¿Qué es la neumolisina?

La vacuna contra la gripe recombinante Lactobacillus casei-Displayed CTA1-Conjugated Consensus Matrix Protein-2 (sM2) induce una amplia protección contra los subtipos de gripe divergente en BALB/c Micehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3979752/SHA: efaa556b484fbcd9cc34832ffac53ef3e8334e9c0Autores: Chowdhury, Mohammed Y. E.; Li, Rui; Kim, Jae-Hoon; Park, Min-Eun; Kim, Tae-Hwan; Pathinayake, Prabuddha; Weeratunga, Prasanna; Song, Man Ki; Son, Hwa-Young; Hong, Se casei) o sin (pgsA-sM2/L. casei) subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) en la superficie. La localización superficial de la proteína de fusión fue verificada mediante análisis de fraccionamiento celular, citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia. Inoculaciones orales y nasales de L. casei recombinante en ratones dieron lugar a altos niveles de inmunoglobulina sérica G (IgG) e IgA mucosal. Sin embargo, la conjugación de la subunidad de toxina de cólera A1 indujo respuestas inmunes más potentes de mucosa, humoral y mediadas por células. En una prueba de desafío con 10 MLD(50) de A/EM/Corea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/Ave acuática /Corea/W81/2005(H5N2), A/Ave acuática/Corea/W44/2005(H7N3) y virus A/Chicken/Corea/116/2004(H9N2), los pgsA-CTA1-sM2/L. casei recombinantes proporcionaron una mejor protección contra los desafíos letales que pgsA-sM2/L. casei, pgsA/L. casei y PBS en ratones. Estos resultados indican que la inmunización mucosal con L. casei recombinante que expresa la proteína sM2 conjugada con CTA1 en su superficie es un medio eficaz para obtener respuestas inmunes protectoras contra diversos subtipos de gripe. Texto: La vacunación sigue siendo el medio más económico y eficaz contra las enfermedades respiratorias causadas por virus de la gripe [1]. Con base en los virus que circulan en la población, se han desarrollado cepas de vacunas trivalentes que se utilizan para la protección del virus de la gripe [2]. La estrategia actual más aceptable es la administración intramuscular de vacunas inactivadas producidas por sistemas de fabricación a base de huevos que, si bien son eficaces, se ven obstaculizadas por una capacidad y flexibilidad limitadas [3]. Sin embargo, las cepas vacunales deben adaptarse con frecuencia para adaptarse a los virus circulantes en todo el mundo [4]. Además, se ha observado que los niveles de anticuerpos inducidos por la vacuna in Por lo tanto, las estrategias alternativas para el desarrollo de vacunas ampliamente cruzadas, seguras y eficaces contra las infecciones virales de la gripe son de gran importancia. La proteína matriz 2 (M2) está muy conservada entre las cepas del virus influenza A, lo que indica que M2 es un objetivo atractivo para el desarrollo de una vacuna universal [6]. En estudios anteriores, se han desarrollado y probado varios constructos de la vacuna M2, incluyendo escherichia coli recombinante (E. coli) que expresa la proteína de fusión M2, vectores adenovirales que expresan la proteína M2, codificación de ADN plasmido M2 [7] [8] [9] y péptidos que codifican M2e [11], cada uno de los cuales fue capaz de generar respuestas inmunes protectoras en ratones. Sin embargo, el inconveniente de estas vacunas basadas en M2 es su baja inmunogenicidad; además, la mayoría de ellas requeriría inyecciones intramusculares. Por lo tanto, se han aplicado muchas estrategias centradas en el aumento de la inmunogenicidad de las vacunas basadas en M2, por ejemplo, la fusión de M2 con diferentes moléculas portadoras como la proteína L del virus del papiloma humano [12], la hemocianina de la cojera del ojo clave [10] y la flagellina [13]. Además, se han aplicado vacunas con diferentes adyuvantes y vías de administración para evaluar su protección contra cepas divergentes de virus de la gripe. Los ratones vacunaron mucosally con una M2 o partículas similares al virus (VLP) adyuvadas con toxina de cólera (TC) demostraron una mejor protección que los ratones sometidos a inmunización parenteral [14, 15]. Sin embargo, debido a los efectos adversos de la TC en humanos, los investigadores han intentado identificar subunidades no tóxicas con adyuvancia mediante la eliminación de la subunidad A o E. coli expresando la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) fusionada con el fragmento D de Staphylococcus aureus mostró los efectos adyuvante sin ninguna reactogenicidad de la subunidad A1 en la vacuna mucosa [6]. Aunque la conjugación química o genética de M2 puede no presentar M2 en su forma tetramérica nativa, antígenos de acceso extracelular expresados en las superficies de bacterias son mejor reconocidos por el sistema inmunitario que los que son intracelulares [17]. Por lo tanto, la elección del vehículo de distribución es también una preocupación importante para las posibles vacunas mucosas. Recientemente, se han estudiado bacterias de ácido láctico (LAB) que presentan antígenos del virus de la gripe [3, 18, 19]. Para la inmunización de la mucosa, LAB es un sistema de administración más atractivo que otros vectores de vacunas vivas, como Shigella Se considera seguro y presenta un efecto adyuvante sobre la inmunidad mucosal y sistémica [18, 22, 23]. El anclaje de la proteína diana a las superficies celulares del LAB está destinado principalmente a usarse en vacunas mucosales. La proteína transmembrana pgsA es uno de los complejos de poli-glutamato sintetasa de Bacillus subtilis [17, 24, 25], que es una proteína ancla bien estudiada es capaz de fusionar la proteína diana a su término C y estabilizar el complejo al anclarla en la membrana celular. Dado que el sM2 es un objetivo altamente conservado y prometedor para una vacuna universal y el CTA1 es fuerte adyuvante mucosa, en este estudio se desarrollaron constructos utilizando un gen sM2 de consenso reconstituido a partir del análisis de virus de la gripe H1N1, H5N1 y H9N2 (sin dominio transmembrana) con o sin fusión de CTA1. Para ello se utilizó un nuevo vector de expresión que puede expresar un producto del gen pgsA como matriz de anclaje. Nuestros antígenos objetivo, sM2 y CTA1, se mostraron en la superficie de Lactobacillus casei, y la administración oral o intranasal de respuestas inmunológicas sistémicas y mucosas inducidas por L. casei recombinantes que tienen el potencial de proteger contra los desafíos letales de subtipos de gripe divergentes. Un total de 672 ratones BALB/c hembra (5 semanas de edad) fueron comprados a Samtako (Seúl, Corea) y alojados en jaulas ventiladas. Los ratones fueron manejados con alimentación en pellets y agua del grifo ad libitum, mantenidos en un ambiente específico libre de patógenos y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento después de la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Corporación de Biolíderes, Daejeon, Corea del Sur, número de protocolo: BSL-ABLS-13-002. Las inmunizaciones de animales se realizaron en instalaciones de laboratorio de nivel de bioseguridad (BSL)-2. Los ratones se dividieron en 6 conjuntos experimentales, cada uno de los cuales constaba de 2 subconjuntos: 1 para administración oral y 1 para administración intranasal que contenía 4 grupos cada uno. De 6, 4 conjuntos tenían 14 ratones por grupo Uno de los grupos tenía 17 (3 ratones para histopatología pulmonar e inmunohistoquímica) y el último contenía 11 ratones por grupo (3 ratones para respuesta CTL). Las concentraciones de L. casei recombinante se determinaron por unidades formadoras de colonias (UFC). En cada subconjunto, 2 grupos recibieron 10 UFC de pgsA-sM2/L. casei o pgsA-CTA1-sM2/L. casei, y los otros dos grupos recibieron la misma concentración de pKV-pgsA/L. casei o PBS en 100 ml por vía oral a través de lavado intragástrico en los días 0 a 3, 7 a 9 y 21 a 23. Del mismo modo, 10 9 UFC de células recombinantes se administraron en 20 ml suspensiones en las fosas nasales de ratones ligeramente anestesiados en los días 0 a 3, 7 a 9 y 21. Se recogieron muestras de sangre del plexo retro-orbital en los días 21, 14 y 28; se separaron los sueros por centrifugación durante 5 minutos a 12.0006g y se almacenaron a 220uC hasta el análisis; al día 28, se sacrificaron al azar 3 ratones de cada grupo para recoger la muestra IgA de los pulmones y el intestino y se almacenaron a 270uC hasta el análisis; se recolectaron bazo asépticamente en el día 28 para el análisis de la respuesta CTL al azar de 3 ratones de un grupo; el resto de ratones del mismo grupo se mantuvieron durante 6 meses desde la fecha del último impulso para medir las respuestas inmunes duraderas y la eficacia de protección. Los virus de la gripe aviar A/EM/Korea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2), A/Aquatic bird/Korea/W44/2005(H7N3) y A/ Chicken/Korea/116/2004(H9N2) utilizados en este estudio fueron proporcionados amablemente por el Dr. Young-Ki Choi (College of Medicine and Medical Research Institute, Chungbuk National University, Cheongju, República de Corea). Todos los virus se propagaron en el líquido alantoico de embriones de pollo de 10 días de edad, y el 50% de dosis letales de ratón (MLD 50 ) se determinaron en ratones ingenuos BALB/ c de 8 semanas de Se infectó por vía intranasal a ratones con narcosis-anestesia de ether con 10 veces el MLD 50 de virus de desafío en 20 ml de PBS. Seis ratones en cada grupo fueron sacrificados en 3 y 5 dpi para comprobar el título del virus en los pulmones y otros 5 ratones permanecieron en cada grupo han sido utilizados para la supervivencia. Los ratones fueron monitorizados cada día alternativo en el punto de tiempo fijo para medir la pérdida de peso y supervivencia. Los ratones fueron eutanasiados si moribundos, es decir, pérdida de peso, pelaje escalonado, escalofríos, taquipnea, malestar respiratorio, hipotermia y poco sensibles a estímulos externos, quedando considerados como número de supervivencia. Después del monitoreo final, todos los ratones sobrevivientes fueron humanizados mediante inhalación de CO 2 durante 5 minutos. A los 180 días de la vacunación final, ratones de un conjunto fueron desafiados En este estudio, E. coli JM83 se utilizó para la clonación y L. casei L525 se utilizó para la expresión superficial de la proteína diana. Estas bacterias se cultivaron en los medios LB y MRS, respectivamente. El plásmido pKV-Pald-PgsA, que alberga los genes pgsA de Bacillus subtilis, se utilizó para construir el plásmido de visualización superficial, que fue un regalo amable de la Bioleaders Corporation (Daejeon, Corea del Sur). Se generó un gen que codifica la secuencia de consenso de M2 que abarca los residuos de los dominios extracelular y citoplasmático sin el dominio transmembrana del virus de la gripe. Las secuencias de consenso se crearon a partir de los aminoácidos más comunes en cada posición de la alineación de H1N1, H5N1 y H9N2; luego se sintetizaron y utilizaron como plantillas para la construcción de los plásmidos pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei por clonación, como se describió anteriormente [26, 27]. El gen sM2 fue modificado añadiendo un sitio Kpn I en el terminal 59 y Sal I en el terminal 39 para clonación. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó para amplificar el gen utilizando el par de imprimadores 59-GGGGACCTCTATTAACA-39, y 59-ACGTCGACT-CATTCAAGTTCAATAATG AC-39. Del mismo modo, un sitio BamH I en la terminal 59 y un sitio Kpn I en la terminal 39 fueron añadidos al gen CTA1 utilizando los imprimadores 59-CGGGATCCAAT-GATTATAT-39 y 59-GGGGT ACCGAT-GATCTTGAGC ATT-39. Los genes modificados se ligaron al Vector T Easy (Invitrogen, Seúl, Corea). Los genes fueron luego digeridos con Kpn I-Sal I para sM2 y BamH I-Kpn I para CTA1. El sM2 digerido fue ligado al plásmido vector pKV-pgsA para la construcción de pKV-pgsA-sM2. Del mismo modo, el CTA1 fue ligado para la construcción de pKV-pgsA-CTA1-sM2. Los productos ligados fueron transformados en células competentes E. coli JM83, como se describió anteriormente, utilizando un método de electroporación [17]. Los perfiles de los plasmidos recombinantes fueron confirmados por la digestión de restricción de endonucleasa y secuenciación de ADN (Solgent, Seúl, Corea). Después de la confirmación, los plásmidos fueron transformados en L. casei L525 por electroporación y llamados pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei Los genes de L. casei recombinantes que contienen pgsA, pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2 fueron cultivados a 30uC durante 48 horas. Las células fueron recolectadas por centrifugación a 6.0006g durante 10 minutos a 4uC, seguidas por lavado dos veces con solución salina estéril bufferada por fosfato (PBS). Los análisis bacteriales fueron realizados por sonificación y centrifugados a 12.0006g durante 20 minutos a 4uC. Las fracciones de pared celular y citoplasmáticas fueron separadas por centrifugación a 25.0006g a 4uC durante 2 horas. Los pellets (pared celular) fueron resuspendidos en 100 ml de sarcosol al 1% que contenía 1 mM de fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF, Sigma-Aldrich Para la detección inmunitaria de proteínas de fusión, las membranas fueron analizadas con toxina anticolera de conejo (1:2000, Abcam, UK), anticuerpos anti-pgsA (1:1000) y anti-M2 (1:1000). Los anticuerpos anti-pgsA y anti-M2 de conejo utilizados en este experimento fueron generados por la inoculación i.m. de pgsA KLH-conjugado o péptido M2 en conejo, respectivamente, dos veces a las 2 semanas-intervalo. Las membranas fueron reaccionadas con una dilución 1:10,000 de inmunoglobulina G anti-rabbit conjugada con peroxidasa de rábano (IgG HRP). Finalmente, las proteínas diana fueron detectadas mediante el sistema de detección WEST-ZOL plus Western Blot (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do, Corea) y visualizadas mediante la mejora de la quimioluminiscencia (ECL) [17, 26, 28]. Para investigar la expresión de sM2 o CTA1-sM2 en la superficie de L. casei, L. casei recombinante se cultivaron en 30uC durante 48 horas en el caldo MRS. Las bacterias se cosecharon mediante centrifugación a 5.0006g durante 10 minutos a 4uC, se lavaron tres veces con solución salina estéril fosfatada que contenía 0,01% Tween-20 (PBST) y se probó con anticuerpo anti-TC del conejo policlonal durante la noche. Después de otro lavado, las células fueron tratadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) anticuerpos anti-rabbit IgG (Burlingame, CA, EE.UU.) durante 2 horas. Finalmente, 10.000 células fueron analizadas por citometría de flujo (Becton Dickinson, Oxnard, CA, EE.UU.). Para la inmunofluorescencia, las células fueron preparadas bajo la misma condición descrita para la citometría de flujo. El pgsA/L. casei fue utilizado como control negativo y el análisis de inmunofluoresencia fue examinado mediante un microscopio de fluorescencia Carl Zeiss Axioskop 2. En primer lugar, las placas inmunosorbentes de 96 pocillos (Nunc) fueron incubadas con 300 ng/proteínas sM2 bien purificadas o CTA1 a 4uC durante la noche. Las proteínas sM2 y CTA1 recombinantes utilizadas en este estudio fueron purificadas a partir de E. coli. A continuación, los pozos fueron bloqueados con leche descremada al 10% durante 2 horas en RT, lavada cinco veces con PBST, tratada con muestras de suero diluido (1:200) en triplicado para detectar IgG y tejido homogeneizado sin diluir, sobrenadante para detectar IgA local e incubada durante 2 horas a 37uC. Después de lavar tres veces, se añadió IgG HRP (1:1000, sigma) o antimouse IgA a cada pozo e incubada Después de otra ronda de lavado, las placas fueron reaccionadas con la solución de sustrato que contenía tetrametilbencidina y H 2 O 2 y se les permitió preceder la reacción durante 10 minutos. Después de añadir la solución de parada 2N-H 2 SO 4, la densidad óptica (OD) se midió a 450 nm utilizando un autolector ELISA (dispositivos moleculares). El desarrollo y recuento de citoquinas fueron realizados por ELISPOTs, como se describió anteriormente [31, 32]. Brevemente, el día antes del aislamiento de los esplenocitos, las placas ELISPOT 96-well fueron recubiertas con anticuerpos antimouse monoclonal IFN-c e IL-4 de captura (5 mg/ml) en PBS e incubadas a 4uC durante la noche. Las placas fueron lavadas con PBS, y 200 ml/pozo de solución de bloqueo que contenía el medio RPMI 1640 completo y 10% de suero fetal bovino, se añadieron (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) e incubadas durante 2 horas en RT. Los bazozos de los ratones vacunados se aislaron asépticamente y se añadieron a 5610 4 células/pozo en medios que contenían proteína sM2, péptido M2 (SLLLTEVETPTRNGWECKCSD) (1 mg/pozo), solo medio (control negativo), o 5 mg/ml fitohemaglutinina (control positivo, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Después de añadir células y estimuladores, las placas fueron incubadas durante 24 horas a 37uC con 5% de CO 2. Las placas fueron tratadas secuencialmente con anticuerpos IFN-c e IL-4 biotinilados antimouse, peroxidasa de estreptavidinhorse rábano y solución de sustrato. Finalmente, los puntos fueron contados utilizando un analizador InmunoScan Entry (Tecnología Celular, Shaker Heights, EE.UU.). Los pulmones fueron recolectados asépticamente, y los títulos del virus fueron determinados por dosis infecciosas de cultivo tisular 50% (TCID 50 ), como se describió anteriormente [33]. Brevemente, los tejidos pulmonares fueron homogenizados en 500 ml de PBS que contenían antibióticos (penicilina y estreptomicina) y compuestos antimicóticos (Fungizone) (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se centrifugaron muestras pulmonares homogeneizadas mecánicamente Las células MDCK fueron inoculadas con una muestra diluida en serie de 10 veces e incubadas a 37uC en una atmósfera húmeda de 5% de CO 2 durante una hora. Después de la absorción, se extrajo el medio y se incubado durante 72 horas el medio que contenía L-1-tosilamido-2-feniletilclorometilcetona (TPCK) tripsina (Thermo Fisher Scientific, Rockford, EE.UU.) se añadió a las células infectadas y se observaron efectos citopáticos virales diarios, y los títulos fueron determinados por la prueba de HA. El título viral de cada muestra se expresó en dosis de 50% de tejido infectado mediante el método Reed-Muench [34]. Para la histopatología, los tejidos pulmonares fueron recolectados en 5 dpi de ratones con narcosis-anestesia de éter. Los tejidos se fijaron inmediatamente en formalina del 10% que contenía tampón neutro, incrustado en cera de parafina, seccionado a un espesor de 4-6 mm mediante una máquina de microtomo, montada en diapositivas y manchada con tinción de eosina. Los cambios histopatológicos se examinaron mediante microscopía ligera, como se ha descrito anteriormente [29, 30, 35]. Además, las diapositivas se mancharon utilizando un método de inmunoperoxidasa con un anticuerpo (anti-M2, 1:500) dirigido contra la proteína matriz-2 del virus influenza A. Se utilizó un IgG HRP (1:2000, Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) como anticuerpo secundario para la detección de células infectadas por el virus en los tejidos respectivos [57]. Los datos se presentan como media 6 desviaciones estándar (S.D.) y son representativos de al Las diferencias entre los grupos fueron analizadas por análisis de varianza (ANOVA), y los medios fueron comparados por la prueba t de Student. Los valores de P inferiores a 0,05 fueron considerados como significativos. Los resultados del porcentaje de peso corporal inicial también fueron comparados por la prueba t de Student. La comparación de supervivencia se realizó mediante prueba de rango logarítmico utilizando la versión 6 de GraphPad Prism. El vector de expresión pgsA se utilizó para construir plásmidos que contenían el gen sM2 de consenso altamente conservado, con (pgsA-CTA1-sM2) o sin (pgsA-sM2) la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1, Fig. 1A ). Los plásmidos se transformaron en células L. casei. Los niveles de expresión de los anticuerpos policlonales pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2 fueron monitorizados por inmunoblote mediante anticuerpos anti-pgsA, anti-M2 o anti-CT (datos no mostrados). Para determinar la localización celular de las proteínas sM2 y CTA1 expresadas en la superficie de L. casei a través de las proteínas de anclaje de pared celular pgsA, membrana y fracciones citoplásmicas fueron sometidas a análisis de blot occidental. Como era de esperar, tanto las proteínas de fusión pgsA-sM2 como las proteínas pgsA-CTA-CTA-sM2 fueron detectadas por anticuerpos anti-pgsA, anti-M2 o anti-CT policlonales en la membrana, no en fracciones citoplásmicas (fig. 1B, carril 2, 3 y Se realizaron inmunoreacciones con anti-pgsA y bandas que representaban el tamaño de las proteínas fusionadas pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2, mientras que durante las reacciones con anticuerpos anti-M2 o anti-CT, no se detectaron otras bandas (Fig. 1B, carril 3 y 4). Este hallazgo puede haber sido resultado de la degradación que se produce durante el procedimiento de fraccionamiento de membrana. Se utilizó la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) e inmunofluorescencia de las células para verificar la localización de la proteína de fusión pgsA-sM2 y pgsA-CTA-CTA2 en la superficie de L. casei. El análisis citométrico de flujo con anticuerpos anti-M2 y anti-CT reveló un aumento del nivel de intensidad de fluorescencia de pgsA-sM2/L Las células casei o pgsA-CTA1-sM2/L., en comparación con las células casei de control L. casei (Fig. 1C ). La microscopía de inmunofluorescencia también mostró bacterias recombinantes que albergaban pgsA-sM2 o pgsA-CTA1-sM2 que inmunosentaban positiva para sM2 y CTA1, pero esto no se encontró en las células de control. Estos resultados demostraron que L. casei recombinante podía mostrar eficientemente las proteínas de fusión sM2 y CTA1-sM2 en la superficie, utilizando pgsA como proteína ancla de membrana. Para caracterizar la inmunogenicidad de los sM2 de L. casei y los sM2 de CTA1conjugados, los ratones BALB/c fueron inmunizados nasalmente (10 dosis de 9 células/20 ml) o por vía oral (10 dosis de 10 células/100 ml) con pgsA-sM2/L. casei y bacterias pgsA-CTA1-sM2/L. casei recombinantes. Como control negativo, los ratones fueron inmunizados con L. casei albergando el plásmido parental pKV-pgsA (pgsA/L. casei) y PBS. Las muestras séricas fueron recogidas a los 0, 14 y 28 días y analizadas por ELISA, utilizando proteínas sM2 y CTA1 (purificadas a partir de E. coli) como antígeno de recubrimiento. Después de la primera serie de inmunización, se detectaron niveles comparativamente bajos de IgG sérico tanto en el grupo inmunizado i.n. como en el grupo inmunizado oral. Sin embargo, se detectaron altos niveles de anticuerpos poco después de la segunda serie de inmunización, y el grupo sM2 conjugado con CTA1 indujo IgG sérico a un nivel significativo, comparado con el grupo sM2 y los controles negativos (fig. 2A y B). Aunque se esperaba que la conjugación de CTA1 con sM2 tuviera una función adyuvante solamente, se detectó un nivel significativo de anticuerpos anti-CTA1 tanto en las vacunas nasales como orales (fig. 2A y B derecha). En comparación con el grupo oral, el grupo inmunizado nasalmente mostró niveles más altos de IgG sérico específicos de sM2 y CTA1. Para evaluar las respuestas Los tejidos pulmonares e intestinales fueron recolectados en el día 28 de la inmunización y examinados utilizando proteína sM2 como antígeno de recubrimiento. En ambas vías de vacunación, pgsA-CTA1-sM2/L. casei indujo niveles significativamente mayores de sM2 mucosal IgA en comparación con los grupos pgsA-sM2/L. casei y control. Sin embargo, como era de esperar, se detectaron niveles más altos de títulos de anticuerpos en el lugar de inoculación que en el sitio remoto. Se observó un patrón similar de respuestas de anticuerpos para ambas vías de inmunización, en las que predominaron los grupos pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 2C y D). Estos datos demostraron que la subunidad de toxina de cólera A1 conjugada sM2 dio lugar a aumentos significativos en los niveles específicos de IgG y IgA mucosal de sM2 comparados con la sM2 sola o con controles inmunizados con pgsA/ L. casei o PBS. Inmunización mucosa con L. casei La sM2 y la CTA1-sM2 estimuladas M2 específicas para la respuesta inmune celularPara determinar si la vacunación mucosal con L. casei en superficie displayed sM2 y CTA1 conjugadas sM2 podría inducir inmunidad celular, se realizaron IFN-c e IL-4 ELISPOT. Se esplenocitos de ratones vacunados fueron estimulados con 10 mg/ml de proteína sM2 recombinante o péptido M2 y se desarrollaron los ELISPO Los puntos fueron contados para medir las diferencias en las respuestas CTL entre los grupos. Las células de los ratones inmunizados i.n. con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron niveles significativos de IFN-c en respuesta a la estimulación con proteína sM2 y péptido M2 (Fig. 3A). De igual manera, observamos que los grupos administrados i.n. tanto para pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron niveles detectables de esplenocitos IL-4 que secretaban tras la estimulación con proteína sM2 o péptido M2 (Fig. 3B). También se observaron células secretantes IFN-c e IL-4 en ratones inmunizados oralmente con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei (Fig. 3C ) aunque sus niveles fueron inferiores al grupo i.n. y no fueron significativos. El grupo de control inmunizado con pgsA/L. casei mostró un nivel de fondo puntual para ambos grupos intranasal y oral. Estos hallazgos indican que sM2 altamente conservado puede inducir respuestas de células T secretas específicas de IFN-c e IL-4 de M2, mientras que el parto de mucosas a través de L. casei y CTA1 con sM2 realzó la inmunidad mediada por la célula, lo que puede contribuir a ampliar la inmunidad protectora. M2 es conocido como un objetivo potencial para el desarrollo de la vacuna contra la gripe de amplio espectro con variabilidad mínima [36, 37]. Para confirmar la variabilidad de las secuencias de sM2 de los virus desafiados utilizados en este estudio, se comparó el sM2 de subtipos de gripe disponibles en el Centro Nacional de Información Biotecnológica de EE.UU. (NCBI) con nuestra secuencia de consenso sM2 particularmente el entero ecto conservado y alguna porción del dominio citoplásmico (CD), aunque la CD entera fue incluida en el constructo de la vacuna (Tabla 1). Encontramos que los virus utilizados en este estudio contienen 0-8 aminoácidos desfasados entre los aminoácidos de sM2 comparados en este estudio. Para evaluar la eficacia de la vacuna sM2, semana después de la inmunización final, los ratones fueron desafiados i.n. con el 10 MLD 50 de A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2) subtipos Los ratones inmunizados oralmente con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron protección del 40 y 60% respectivamente. Asimismo, los grupos de inmunización conferían 40 y 80% contra la infección letal con el virus H5N2 altamente virulento. En contraste, ninguno de los ratones no inmunizados sobrevivió después de la infección letal (fig. 4A y B, panel derecho). La morbilidad aumentó en los ratones inmunizados por vía oral, mientras que los ratones que recibieron inmunización con pgsA-CTA1-sM2/L. perdieron el 20% de su peso corporal inicial y comenzaron a recuperarse por la infección de 9 días después (dpi) y se recuperaron completamente para el día 13 (fig. 4A y B, panel izquierdo). A continuación se evaluó la eficiencia de protección de la vacuna sM2 candidata frente a A/Puerto Rico/8/34(H1N1), que contiene 8 aminoácidos desfasados en relación con la secuencia de consenso de sM2. Se desafiaron conjuntos de ratones vacunados con 10 MLD 50 del virus H1N1. Como se muestra en la figura 4C y D, los ratones inmunizados por los ratones fueron agrupados como se menciona en materiales y métodos y recibieron administraciones orales o nasales, de acuerdo con el calendario. Las flechas indicaron las rutas de inmunización y los períodos de pgsA/L. casei, pgsA-sM2/L. casei o pgsA-CTA1-sM2/L. células casei. Se recogieron seras en los días 0, 14 y 28; se recolectaron muestras de los pulmones e intestinos en el día 28 después Una semana después de la inmunización final, se extrajeron bazos de 3 ratones en cada grupo, con un conjunto para el análisis de CTL. Dos o 24 semanas después de la última inmunización, todos los ratones fueron desafiados con una dosis letal de subtipos de gripe a través de la ruta intranasal y monitoreados durante 13 días. Los días 3 y 5 post infección, los pulmones fueron extraídos de 3 ratones en cada grupo para determinar el título del virus. doi:10.1371/journal.pone.0094051.g001 CTA1-sM2 Induce inmunidad protectora a virus patógenos de gripe A PLOS ONE www.plosone.org i.n ruta mostró un nivel de protección más alto que los grupos inmunizados por vía oral, y ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron un nivel de protección significativamente más alto que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei (fig. 4C y D, panel derecho). Los ratones inmunizados perdieron hasta el 40% de su peso corporal y murieron por 9 dpi. casei perdió el 20% de su peso corporal inicial por 9 dpi y se recuperó más lentamente que los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 4C y D, panel izquierdo). Otro grupo de ratones vacunados fueron infectados con A/Chicken/ Corea/116/2004(H9N2) para comprobar el rango de capacidad de protección de la vacuna sM2 indujo respuestas inmunitarias. La secuencia sM2 de H9N2 contiene 2 desajustes en relación con la secuencia de consenso sM2. Los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron una pérdida de peso corporal insignificante y una recuperación gradual en comparación con los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei y los ratones no vacunados tanto para la vía oral (fig. 4E Ninguno de los ratones no inmunizados sobrevivió, mientras que el 100% y el 80% de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei a través de la vía intravenosa y oral sobrevivieron, respectivamente. Las tasas de supervivencia de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei fueron del 80% y 60% para la vía intravenosa y oral, respectivamente (fig. 4E y F, panel derecho). También se evaluó la amplitud de protección de la vacuna sM2 contra subtipos de gripe divergentes. Conjunto de ratones inmunizados fueron desafiados con gripe aviar de alta patogenicidad (HPAI) A/ EM/Korea/W149/06(H5N1), que contiene 2 desajustes de aminoácidos en relación con la secuencia de consenso sM2. y las vías orales con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron mayor eficacia de protección, 80% y 60%, respectivamente, en comparación con los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, para los cuales las tasas fueron de 60% y 20%, respectivamente (fig. 4G y H, panel derecho). Respecto a la morbilidad, los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron menor morbilidad que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei (fig. 4G y H, panel izquierdo). Un grupo más de ratones vacunados fueron desafiados con el virus A/Acuático/Corea/W44/2005 (H7N3), que contiene 1 desajuste en relación con la secuencia de consenso sM2, y se observó el peso Como se muestra en la figura 4I y J, los ratones no inmunizados perdieron hasta el 30% de su peso corporal que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 4I y J, panel izquierdo). Los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei a través de la ruta de la i.n mostraron un nivel de protección significativamente más alto contra el virus de la gripe H7N3 que los demás grupos (fig. 4I y J, panel derecho). Tomados en conjunto, los resultados indican que la inmunización con pgsA-CTA1-sM2/L. Las respuestas inmunitarias inducidas por casei que conferían niveles significativos de protección frente a subtipos divergentes de virus de la gripe que contenían aminoácidos desfasados que oscilaban entre 0 y 8 del consenso sM2, independientemente de si era completa o parcial. Se midieron títulos de virus en los pulmones de ratones desafiados para estimar su replicación a 3 y 5 dpi. Los ratones fueron vacunados a través de las vías i.n y oral con subtipos de gripe pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei y desafiados con los subtipos H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 o H7N3. En 3 y 5 dpi, 3 ratones fueron sacrificados al azar de cada grupo, y sus títulos de virus pulmonar fueron medidos utilizando el método casei tenía títulos inferiores a 3 dpi y había reducido significativamente la replicación viral a 5 dpi en comparación con ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei o los grupos control al mismo tiempo (fig. 5A-J). Se observaron títulos virales reducidos en los pulmones en grupos de ratones inmunizados por vía intravenosa en relación con los ratones inmunizados por vía oral, especialmente en el día 3 post infecciones (fig. 5). Estos títulos reducidos pueden deberse a que las vías de vacunación y el desafío son los mismos, y los títulos se correlacionaron con los resultados de supervivencia para infecciones letales con H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 y H7N3. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el consenso de proteína sM2 fusionada con CTA1 proporcionó una mejor protección que sM2, y la vía i.n fue más potente que la vía oral de inmunización con respecto a la protección contra un desafío letal de subtipos de gripe divergentes. Se realizó histopatología e inmunohistoquímica para corroborar los hallazgos del título del virus pulmonar. A los 5 dpi, los pulmones fueron recogidos aleatoriamente de cada grupo de un conjunto, fijos y manchados con eosina antes de ser examinados bajo un microscopio ligero. Como se muestra en la figura 5K, se observaron signos claros de inflamación pulmonar profunda en los pulmones de ratones tratados con PBS o pgsA/L. casei para las vías de administración oral e i.n, mientras que los pulmones de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. Para la inmunohistoquímica, se utilizó el método de la inmunoperoxidasa con un anticuerpo dirigido contra la proteína matriz-2 del virus influenza A para la detección de células infectadas por virus en los tejidos respectivos. El antígeno del virus en las células epiteliales aparece como coloración marrón del núcleo y citoplasma. Como se muestra en la figura 5K, a los 5 días p.i., se detectaron numerosas células infectadas por virus en ratones vacunados con control o pgsA-sM2/L. casei, mientras que se encontró un número muy reducido de células positivas de antígeno en los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, tanto en el grupo vacunado por vía oral como en el grupo vacunado por vía oral (fig. panel derecho 5K). Estos resultados indican que los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei desarrollaron respuestas inmunitarias lo suficientemente fuertes como para inhibir la replicación viral, lo que promueve la supervivencia de los ratones tras una infección letal por influenza A. La vacuna PgsA-CTA1-sM2/L. casei indujo protección cruzada duraderaLa duración de la protección es un criterio importante para una posible vacuna. Así, la longevidad de la inmunidad inducida por sM2 y CTA1 conjugado sM2 fue investigada mediante la detección de IgG sérico e IgA mucosal por ELISA. Se observó un aumento significativo de los niveles de IgG sérico específico de sM2, así como de IgA pulmonar e intestinal 180 días después de la vacunación (fig. 6A y C) en comparación con los grupos PBS y pgs Los ratones fueron desafiados con A/ ave acuática/Corea/W81/2005(H5N2), y los cambios en el peso corporal y la supervivencia fueron monitoreados hasta 13 dpi. Los ratones no vacunados mostraron pérdida de peso corporal del 30% (Fig. 6B y D panel izquierdo) y murieron al día 9 post infección tanto en el grupo oral como en el grupo i.n. En contraste, los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron pérdida de peso corporal insignificante, que fue recuperada por 13 dpi; el 80% sobrevivió en el grupo inmunizado de i.n. (Fig. 6B panel derecho) y el 60% sobrevivió en el grupo inmunizado oral (Fig. 6D panel derecho). Este resultado indica que la vacuna CTA1conjugada sM2 mucosal confirió protección contra una infección letal 6 El sistema inmunológico mucosal es la primera barrera inmunológica contra los patógenos que invaden el cuerpo a través de la superficie mucosal. Así, la inducción de la inmunidad mucosal es necesaria para garantizar la protección contra múltiples subtipos del virus influenza A. Un virus respiratorio, la gripe A es responsable de epidemias estacionales anuales en todo el mundo y, ocasionalmente, pandemias, que son causadas por nuevos subtipos o cepas emergentes derivados del reasociamiento con virus aviares o porcinos. Las vacunas actuales contra la gripe proporcionan únicamente protección específica para las cepas. Por lo tanto, es crucial establecer una vacuna contra la gripe ampliamente cruzada. Los antígenos bien conservados entre la gripe Los virus A se consideran objetivos prometedores para la inducción de la protección cruzada contra estos diferentes subtipos. Sin embargo, el objetivo debe ser el desarrollo de una primera línea de defensa mediante la eliminación efectiva de patógenos en la superficie mucosa. La proteína 2 de la matriz de la gripe (M2) está relativamente bien conservada entre los subtipos de gripe y puede considerarse un antígeno prometedor de la vacuna contra la gripe [30]. Consta de los tres siguientes dominios estructurales: un dominio extracelular de 24-aminoácidos, un dominio transmembrana de 19-aminoácidos y un dominio de cola citoplasmática de 54-aminoácidos [39, 40]. En este estudio se utilizaron los dominios extracelulares y citoplasmáticos, bien conservados entre los virus de la gripe y que desempeñan un papel importante en el ensamblaje viral y la morfogénesis. Aquí se desarrolló el consenso sM2 derivado del análisis de secuencias de subtipos H5N1, H1N1 y H9N2 en la base de datos. Considerando los hallazgos previos de que el dominio extracelular particularmente (aa, 1-13) es altamente conservado entre los subtipos del virus de la gripe y reconocido como epítopo para la inducción de anticuerpos monoclonales, lo que podría proteger la infección por el virus de la gripe [56], se utilizó la secuencia vertebral sM2 del virus H5N1; para la posible homología entre otros subtipos cambiamos en la posición de 14 (E-G) y 18 (R-K) y mantuvimos sin cambios el epítopo conservado (aa, 1-13). Como se muestra en la alineación secuencial, la secuencia sM2 de consenso tiene desajustes de 0-8 entre los subtipos utilizados en este estudio (tabla 1). Además, la incorporación de un adyuvante se considera esencial para impulsar la interacción de la vacuna con el sistema inmunológico mucosa [41]. Varios adyuvantes, como liposomas, nanopartículas y complejos inmunoestimulantes (ISCOMs), han sido estudiados y han sido encontrados para mejorar la respuesta inmune [42], pero su eficacia no fue óptima. A pesar de su potencial como adyuvante mucosa [43], el uso de la toxina del cólera (TC) en las vacunas está limitado por su toxicidad innata, por lo que la toxicidad de la TC tendría que separarse de su adyuvante antes de poder ser utilizada como adyuvante vacunal. Estudios han demostrado que los constructos consistentes en M2e fusionados con la subunidad de toxina del cólera A1 junto con un fuerte agente ADpremilante y un dímero de la D-fragmento de la proteína Staphylococcus aureus Una vacuna provocó protección completa y morbilidad reducida [6, 44]. La CTA1 mantiene la función adyuvante de la TC sin sus efectos secundarios tóxicos, como la reactogenicidad en el lugar de su administración y la unión o acumulación en los tejidos nerviosos [45]. Basándose en hallazgos previos, se ha supuesto que el fragmento de consenso sM2, cuando se fusiona con el potente adyuvante mucosal CTA1, puede inducir una amplia inmunidad protectora contra subtipos divergentes del virus de la gripe. En este estudio se utilizó la proteína total CTA1 de 22 kDa (una ribosiltransferasa ADP), que consta de tres subdominios distintos: CTA11 (residuos 1 a 132), CTA12 (residuos 133 a 161) y CTA13 (residuos 162 a 192). Se ha informado que la CTA1 carece de CTB tiene actividades adyuvantes fuertes sin toxicidad alguna. Para el desarrollo de una vacuna universal contra la gripe mucosa con un péptido de sM2 conservado y potente adyuvante CTA1, L. casei recombinante muestra sM2 fusionado con o sin CTA1Los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron alvéolos claros sin infiltración celular inflamatoria, en contraste con los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-sM2/L. casei o ratones de control, los cuales revelaron características de neumonitis grave (panel medio e izquierdo).Se detectó un número reducido de antígenos virales en los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, en contraste con los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-sM2/L. Los microgramas son representativos para cada grupo de tratamiento a una ampliación de 200X. El antígeno del virus en las células epiteliales aparece como coloración marrón del núcleo y citoplasma. En los títulos pulmonares, las barras denotan una media de 6 S.D. El asterisco indica una diferencia significativa entre pgsA-CTA1-sM2/L. casei y otros grupos (*P,0.05). doi:10.1371/journal.pone.0094051.g005 fueron construidos para el parto de mucosas por el vehículo de vacuna viva ampliamente utilizado LAB [38]. El gen pgsA utilizado en este estudio es un ancla para la visualización en la superficie de LAB que se deriva del complejo enzimático pgsBCA de Bacillus subtilis y consiste en dominio transmembrana cerca de su N-terminal con el dominio ubicado en el exterior de la membrana celular. Así, pgsA es capaz de cruzar la pared celular y mostrar la proteína heteróloga fusionada a su C-terminal [17]. Las vacunas desarrolladas se probaron a través de dos rutas principales. Encontramos que la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei fue capaz de inducir un nivel significativamente más alto de sM2 específico IgG sérico ( Fig. 2A y B ) y mucosa IgA (Fig. 2C y D) en comparación con pgsA-sM2/L. casei, y confiriendo protección contra subtipos de gripe divergentes del grupo filogenético 1 (H1, H5, H9) y del grupo 2 (H7) [46] (Fig. 4). Este estudio también reveló que la administración de i.n. fue superior a la vía oral de vacunación, lo que es consistente con otras observaciones [48]. Puede haber dos posibles razones para explicar este fenómeno. Primero, la vía de desafío es la misma que la de la vacunación; la mucosal IgA específica puede prevenir la colonización viral en el tracto respiratorio. Segundo, el volumen de la inocula fue 5 veces menor que el de la inoculación oral, lo que puede haber permitido presentar la forma concentrada del antígeno a las células inmunes. Debido a que se detectaron mayores niveles de IgG sérico e IgA mucosal en ratones inmunizados intranasalmente que en los inmunizados oralmente (fig. 2), una explicación alternativa podría ser que los antígenos se procesan y/o se presentan de manera diferente a las células inmunitarias en los dos compartimentos de la mucosa. Es importante destacar que nuestro estudio demostró por primera vez que la inmunización de la mucosa con la vacuna basada en sM2 con TCA1 presentada en la superficie de LAB induce una amplia protección contra el desafío con subtipos de gripe divergentes. Sin embargo, el mecanismo por el cual Abs contra sM2 mediaba esta amplia protección no se entiende plenamente. Estudios anteriores han demostrado que Abs a la N-terminal de M2e, particularmente posiciones 1-10, inhibió la replicación del virus influenza A [49, 50]. Otros estudios revelaron que la citotoxicidad celular mediada por IgG anti-M2e o fagocitosis puede inducir la eliminación de células infectadas antes de que el virus de la progenie florezca y se propague [54, 55] que está apoyando nuestros hallazgos del título del virus pulmonar y los datos inmunohistoquímicos detectados a 5 dpi en nuestros experimentos de desafío. Por lo tanto, en este estudio, la combinación de esas respuestas y Abs a la secuencia N-terminal de la secuencia sM2 que se conserva entre los virus de desafío (Tabla 1 ) puede proteger los subtipos de gripe divergentes después de la inmunización mucosa con la vacuna recombinante LAB CTA1 basada en M2. Además, la respuesta inmune celular juega un papel importante en el control de la replicación viral. Examinamos las respuestas de citoquina Th1 (IFN-c) y Th2 (IL-4) por Se detectaron niveles significativamente más altos de IFN-c en respuesta a la estimulación con la proteína sM2 y el péptido M2 en ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei en comparación con los niveles en ratones en los grupos de pgsA-sM2/L. casei y control (fig. 3A y C). Asimismo, se observaron niveles sustancialmente más altos de IL-4 en ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei tras la estimulación con la proteína sM2 y el péptido M2 (fig. 3B y D). Estos resultados apoyan aún más los hallazgos de que los anticuerpos y la citotoxicidad mediada por células fueron específicos del antígeno M2 y que sus actividades antivirales fueron inducidas por M2 monomérico, tres copias de M2 fusiona En conjunto, estos resultados indican que la M2 adyuvada con CTA1 fusionada indujo respuestas inmunitarias en ratones, lo que los protegió de subtipos de gripe divergentes. En este sentido, nuestros resultados tienen significancia para el uso de CTA1, que tiene función adyuvante, en candidatos vacunales. Como la protección clínica no es el único parámetro por el cual se evalúa el desempeño de la vacuna, se evaluó la inmunogenicidad de la vacuna LAB recombinante sobre la base de otros parámetros, como la reducción de lesiones patológicas y la eliminación del virus. En este estudio, los títulos bajos del virus de desafío fueron valorados desde los pulmones después de la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, mientras que el virus de desafío podría ser detectado en títulos superiores en ratones simulados y los vacunados con pgsA-sM2/L. casei (Fig La reducción de las lesiones groseras y histopatológicas consistentes con la infección viral son los principales parámetros indicativos de la eficacia de la vacuna antigripal. Aquí, demostramos que la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei limitó notablemente la gravedad del daño al inhibir la replicación viral y la acumulación de células inflamatorias y antígenos virales en los tejidos alveolares pulmonares, en relación con la gravedad en ratones no inmunizados y ratones vacunados con pgsA-sM2/L. casei (Fig. 5K). Nuestro estudio demostró además, por primera vez, que L. casei recombinante que expresaba la inmunidad CTA1-sM2 inducida de larga duración y confería protección contra infecciones letales por gripe, incluso a los 6 meses de la vacunación final (Fig. 6), que es importante para cualquier vacuna exitosa. Se observaron resultados similares en estudios previos, en los que la M2 VLP confería inmunidad a largo plazo y protección cruzada y los anticuerpos en los sitios sueros y mucosas eran de larga vida [53, 54]. En conclusión, nuestros hallazgos revelaron que la inmunización mucosal de ratones con L. casei recombinante que expresaba CTA1conjugado sM2 puede inducir respuestas inmunes sistémicas y locales, así como celulares mediadas, contra subtipos divergentes del virus de la gripe. Así, la L. casei recombinante que expresaba CTA1conjugado consenso sM2 vacuna mucosal puede ser una vacuna prometedora candidata para la preparación para la pandemia de gripe.

¿Qué cepa Lactobacililus casei no tiene la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) en la superficie?

La vacuna contra la gripe recombinante Lactobacillus casei-Displayed CTA1-Conjugated Consensus Matrix Protein-2 (sM2) induce una amplia protección contra los subtipos de gripe divergente en BALB/c Micehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3979752/SHA: efaa556b484fbcd9cc34832ffac53ef3e8334e9c0Autores: Chowdhury, Mohammed Y. E.; Li, Rui; Kim, Jae-Hoon; Park, Min-Eun; Kim, Tae-Hwan; Pathinayake, Prabuddha; Weeratunga, Prasanna; Song, Man Ki; Son, Hwa-Young; Hong, Se casei) o sin (pgsA-sM2/L. casei) subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) en la superficie. La localización superficial de la proteína de fusión fue verificada mediante análisis de fraccionamiento celular, citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia. Inoculaciones orales y nasales de L. casei recombinante en ratones dieron lugar a altos niveles de inmunoglobulina sérica G (IgG) e IgA mucosal. Sin embargo, la conjugación de la subunidad de toxina de cólera A1 indujo respuestas inmunes más potentes de mucosa, humoral y mediadas por células. En una prueba de desafío con 10 MLD(50) de A/EM/Corea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/Ave acuática /Corea/W81/2005(H5N2), A/Ave acuática/Corea/W44/2005(H7N3) y virus A/Chicken/Corea/116/2004(H9N2), los pgsA-CTA1-sM2/L. casei recombinantes proporcionaron una mejor protección contra los desafíos letales que pgsA-sM2/L. casei, pgsA/L. casei y PBS en ratones. Estos resultados indican que la inmunización mucosal con L. casei recombinante que expresa la proteína sM2 conjugada con CTA1 en su superficie es un medio eficaz para obtener respuestas inmunes protectoras contra diversos subtipos de gripe. Texto: La vacunación sigue siendo el medio más económico y eficaz contra las enfermedades respiratorias causadas por virus de la gripe [1]. Con base en los virus que circulan en la población, se han desarrollado cepas de vacunas trivalentes que se utilizan para la protección del virus de la gripe [2]. La estrategia actual más aceptable es la administración intramuscular de vacunas inactivadas producidas por sistemas de fabricación a base de huevos que, si bien son eficaces, se ven obstaculizadas por una capacidad y flexibilidad limitadas [3]. Sin embargo, las cepas vacunales deben adaptarse con frecuencia para adaptarse a los virus circulantes en todo el mundo [4]. Además, se ha observado que los niveles de anticuerpos inducidos por la vacuna in Por lo tanto, las estrategias alternativas para el desarrollo de vacunas ampliamente cruzadas, seguras y eficaces contra las infecciones virales de la gripe son de gran importancia. La proteína matriz 2 (M2) está muy conservada entre las cepas del virus influenza A, lo que indica que M2 es un objetivo atractivo para el desarrollo de una vacuna universal [6]. En estudios anteriores, se han desarrollado y probado varios constructos de la vacuna M2, incluyendo escherichia coli recombinante (E. coli) que expresa la proteína de fusión M2, vectores adenovirales que expresan la proteína M2, codificación de ADN plasmido M2 [7] [8] [9] y péptidos que codifican M2e [11], cada uno de los cuales fue capaz de generar respuestas inmunes protectoras en ratones. Sin embargo, el inconveniente de estas vacunas basadas en M2 es su baja inmunogenicidad; además, la mayoría de ellas requeriría inyecciones intramusculares. Por lo tanto, se han aplicado muchas estrategias centradas en el aumento de la inmunogenicidad de las vacunas basadas en M2, por ejemplo, la fusión de M2 con diferentes moléculas portadoras como la proteína L del virus del papiloma humano [12], la hemocianina de la cojera del ojo clave [10] y la flagellina [13]. Además, se han aplicado vacunas con diferentes adyuvantes y vías de administración para evaluar su protección contra cepas divergentes de virus de la gripe. Los ratones inmunizaron mucosally con una M2 o partículas similares al virus (VLP) adyuvadas con toxina de cólera (TC) demostraron una mejor protección que los ratones sometidos a inmunización parenteral [14, 15]. Sin embargo, debido a los efectos adversos de la TC en humanos, los investigadores han intentado identificar subunidades no tóxicas con adyuvancia mediante la eliminación de la subunidad E. coli expresando la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) fusionada con el fragmento D de Staphylococcus aureus mostró los efectos adyuvante sin ninguna reactogenicidad de la subunidad A1 en la vacuna mucosa [6]. Aunque la conjugación química o genética de M2 puede no presentar M2 en su forma tetramérica nativa, antígenos de acceso extracelular expresados en las superficies de bacterias son mejor reconocidos por el sistema inmunitario que los que son intracelulares [17]. Por lo tanto, la elección del vehículo de distribución es también una preocupación importante para las posibles vacunas mucosas. Recientemente, se han estudiado bacterias de ácido láctico (LAB) que presentan antígenos del virus de la gripe [3, 18, 19]. Para la inmunización de la mucosa, LAB es un sistema de administración más atractivo que otros vectores de vacunas vivas, como Shigella Se considera seguro y presenta un efecto adyuvante sobre la inmunidad mucosal y sistémica [18, 22, 23]. El anclaje de la proteína diana a las superficies celulares del LAB está destinado principalmente a usarse en vacunas mucosales. La proteína transmembrana pgsA es uno de los complejos de poli-glutamato sintetasa de Bacillus subtilis [17, 24, 25], que es una proteína ancla bien estudiada es capaz de fusionar la proteína diana a su término C y estabilizar el complejo al anclarla en la membrana celular. Dado que el sM2 es un objetivo altamente conservado y prometedor para una vacuna universal y el CTA1 es fuerte adyuvante mucosa, en este estudio se desarrollaron constructos utilizando un gen sM2 de consenso reconstituido a partir del análisis de virus de la gripe H1N1, H5N1 y H9N2 (sin dominio transmembrana) con o sin fusión de CTA1. Para ello se utilizó un nuevo vector de expresión que puede expresar un producto del gen pgsA como matriz de anclaje. Nuestros antígenos objetivo, sM2 y CTA1, se mostraron en la superficie de Lactobacillus casei, y la administración oral o intranasal de respuestas inmunológicas sistémicas y mucosas inducidas por L. casei recombinantes que tienen el potencial de proteger contra los desafíos letales de subtipos de gripe divergentes. Un total de 672 ratones BALB/c hembra (5 semanas de edad) fueron comprados a Samtako (Seúl, Corea) y alojados en jaulas ventiladas. Los ratones fueron manejados con alimentación en pellets y agua del grifo ad libitum, mantenidos en un ambiente específico libre de patógenos y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento después de la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Corporación de Biolíderes, Daejeon, Corea del Sur, número de protocolo: BSL-ABLS-13-002. Las inmunizaciones de animales se realizaron en instalaciones de laboratorio de nivel de bioseguridad (BSL)-2. Los ratones se dividieron en 6 conjuntos experimentales, cada uno de los cuales constaba de 2 subconjuntos: 1 para administración oral y 1 para administración intranasal que contenía 4 grupos cada uno. De 6, 4 conjuntos tenían 14 ratones por grupo Uno de los grupos tenía 17 (3 ratones para histopatología pulmonar e inmunohistoquímica) y el último contenía 11 ratones por grupo (3 ratones para respuesta CTL). Las concentraciones de L. casei recombinante se determinaron por unidades formadoras de colonias (UFC). En cada subconjunto, 2 grupos recibieron 10 UFC de pgsA-sM2/L. casei o pgsA-CTA1-sM2/L. casei, y los otros dos grupos recibieron la misma concentración de pKV-pgsA/L. casei o PBS en 100 ml por vía oral a través de lavado intragástrico en los días 0 a 3, 7 a 9 y 21 a 23. Del mismo modo, 10 9 UFC de células recombinantes se administraron en 20 ml suspensiones en las fosas nasales de ratones ligeramente anestesiados en los días 0 a 3, 7 a 9 y 21. Se recogieron muestras de sangre del plexo retro-orbital en los días 21, 14 y 28; se separaron los sueros por centrifugación durante 5 minutos a 12.0006g y se almacenaron a 220uC hasta el análisis; al día 28, se sacrificaron al azar 3 ratones de cada grupo para recoger la muestra IgA de los pulmones y el intestino y se almacenaron a 270uC hasta el análisis; se recolectaron bazo asépticamente en el día 28 para el análisis de la respuesta CTL al azar de 3 ratones de un mismo grupo; el resto de ratones del mismo grupo se mantuvo durante 6 meses a partir de la fecha del último impulso para medir las respuestas inmunitarias duraderas y la eficacia de protección. Los virus de la gripe aviar A/EM/Korea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2), A/Aquatic bird/Korea/W44/2005(H7N3) y A/ Chicken/Korea/116/2004(H9N2) utilizados en este estudio fueron proporcionados amablemente por el Dr. Young-Ki Choi (College of Medicine and Medical Research Institute, Chungbuk National University, Cheongju, República de Corea). Todos los virus se propagaron en el líquido alantoico de embriones de pollo de 10 días de edad, y el 50% de dosis letales de ratón (MLD 50 ) se determinaron en ratones ingenuos BALB/ c de 8 semanas de Se infectó por vía intranasal a ratones con narcosis-anestesia de ether con 10 veces el MLD 50 de virus de desafío en 20 ml de PBS. Seis ratones en cada grupo fueron sacrificados en 3 y 5 dpi para comprobar el título del virus en los pulmones y otros 5 ratones permanecieron en cada grupo han sido utilizados para la supervivencia. Los ratones fueron monitorizados cada día alternativo en el punto de tiempo fijo para medir la pérdida de peso y supervivencia. Los ratones fueron eutanasiados si moribundos, es decir, pérdida de peso, pelaje escalonado, escalofríos, taquipnea, malestar respiratorio, hipotermia y poco sensibles a estímulos externos, quedando considerados como número de supervivencia. Después del monitoreo final, todos los ratones sobrevivientes fueron humanizados mediante inhalación de CO 2 durante 5 minutos. A los 180 días de la vacunación final, ratones de un conjunto fueron desafiados En este estudio, E. coli JM83 se utilizó para la clonación y L. casei L525 se utilizó para la expresión superficial de la proteína diana. Estas bacterias se cultivaron en los medios LB y MRS, respectivamente. El plásmido pKV-Pald-PgsA, que alberga los genes pgsA de Bacillus subtilis, se utilizó para construir el plásmido de visualización superficial, que fue un regalo amable de la Bioleaders Corporation (Daejeon, Corea del Sur). Se generó un gen que codifica la secuencia de consenso de M2 que abarca los residuos de los dominios extracelular y citoplasmático sin el dominio transmembrana del virus de la gripe. Las secuencias de consenso se crearon a partir de los aminoácidos más comunes en cada posición de la alineación de H1N1, H5N1 y H9N2; luego se sintetizaron y utilizaron como plantillas para la construcción de los plásmidos pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei por clonación, como se describió anteriormente [26, 27]. El gen sM2 fue modificado añadiendo un sitio Kpn I en el terminal 59 y Sal I en el terminal 39 para clonación. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó para amplificar el gen utilizando el par de imprimadores 59-GGGGACCTCTATTAACA-39, y 59-ACGTCGACT-CATTCAAGTTCAATAATG AC-39. Del mismo modo, un sitio BamH I en la terminal 59 y un sitio Kpn I en la terminal 39 fueron añadidos al gen CTA1 utilizando los imprimadores 59-CGGGATCCAAT-GATTATAT-39 y 59-GGGGT ACCGAT-GATCTTGAGC ATT-39. Los genes modificados se ligaron al Vector T Easy (Invitrogen, Seúl, Corea). Los genes fueron luego digeridos con Kpn I-Sal I para sM2 y BamH I-Kpn I para CTA1. El sM2 digerido fue ligado al plásmido vector pKV-pgsA para la construcción de pKV-pgsA-sM2. Del mismo modo, el CTA1 fue ligado para la construcción de pKV-pgsA-CTA1-sM2. Los productos ligados fueron transformados en células competentes E. coli JM83, como se describió anteriormente, utilizando un método de electroporación [17]. Los perfiles de los plasmidos recombinantes fueron confirmados por la digestión de restricción de endonucleasa y secuenciación de ADN (Solgent, Seúl, Corea). Después de la confirmación, los plásmidos fueron transformados en L. casei L525 por electroporación y llamados pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei Los genes de L. casei recombinantes que contienen pgsA, pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2 fueron cultivados a 30uC durante 48 horas. Las células fueron recolectadas por centrifugación a 6.0006g durante 10 minutos a 4uC, seguidas por lavado dos veces con solución salina estéril bufferada por fosfato (PBS). Los análisis bacteriales fueron realizados por sonificación y centrifugados a 12.0006g durante 20 minutos a 4uC. Las fracciones de pared celular y citoplasmáticas fueron separadas por centrifugación a 25.0006g a 4uC durante 2 horas. Los pellets (pared celular) fueron resuspendidos en 100 ml de sarcosol al 1% que contenía 1 mM de fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF, Sigma-Aldrich Para la detección inmunitaria de proteínas de fusión, las membranas fueron analizadas con toxina anticolera de conejo (1:2000, Abcam, UK), anticuerpos anti-pgsA (1:1000) y anti-M2 (1:1000). Los anticuerpos anti-pgsA y anti-M2 de conejo utilizados en este experimento fueron generados por la inoculación i.m. de pgsA KLH-conjugado o péptido M2 en conejo, respectivamente, dos veces a las 2 semanas-intervalo. Las membranas fueron reaccionadas con una dilución 1:10,000 de inmunoglobulina G anti-rabbit conjugada con peroxidasa de rábano (IgG HRP). Finalmente, las proteínas diana fueron detectadas mediante el sistema de detección WEST-ZOL plus Western Blot (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do, Corea) y visualizadas mediante la mejora de la quimioluminiscencia (ECL) [17, 26, 28]. Para investigar la expresión de sM2 o CTA1-sM2 en la superficie de L. casei, L. casei recombinante se cultivaron en 30uC durante 48 horas en el caldo MRS. Las bacterias se cosecharon mediante centrifugación a 5.0006g durante 10 minutos a 4uC, se lavaron tres veces con solución salina estéril fosfatada que contenía 0,01% Tween-20 (PBST) y se probó con anticuerpo anti-TC del conejo policlonal durante la noche. Después de otro lavado, las células fueron tratadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) anticuerpos anti-rabbit IgG (Burlingame, CA, EE.UU.) durante 2 horas. Finalmente, 10.000 células fueron analizadas por citometría de flujo (Becton Dickinson, Oxnard, CA, EE.UU.). Para la inmunofluorescencia, las células fueron preparadas bajo la misma condición descrita para la citometría de flujo. El pgsA/L. casei fue utilizado como control negativo y el análisis de inmunofluoresencia fue examinado mediante un microscopio de fluorescencia Carl Zeiss Axioskop 2. En primer lugar, las placas inmunosorbentes de 96 pocillos (Nunc) fueron incubadas con 300 ng/proteínas sM2 bien purificadas o CTA1 a 4uC durante la noche. Las proteínas sM2 y CTA1 recombinantes utilizadas en este estudio fueron purificadas a partir de E. coli. A continuación, los pozos fueron bloqueados con leche descremada al 10% durante 2 horas en RT, lavada cinco veces con PBST, tratada con muestras de suero diluido (1:200) en triplicado para detectar IgG y tejido homogeneizado sin diluir, sobrenadante para detectar IgA local e incubada durante 2 horas a 37uC. Después de lavar tres veces, se añadió IgG HRP (1:1000, sigma) o antimouse IgA a cada pozo e incubada Después de otra ronda de lavado, las placas fueron reaccionadas con la solución de sustrato que contenía tetrametilbencidina y H 2 O 2 y se les permitió preceder la reacción durante 10 minutos. Después de añadir la solución de parada 2N-H 2 SO 4, la densidad óptica (OD) se midió a 450 nm utilizando un autolector ELISA (dispositivos moleculares). El desarrollo y recuento de citoquinas fueron realizados por ELISPOTs, como se describió anteriormente [31, 32]. Brevemente, el día antes del aislamiento de los esplenocitos, las placas ELISPOT 96-well fueron recubiertas con anticuerpos antimouse monoclonal IFN-c e IL-4 de captura (5 mg/ml) en PBS e incubadas a 4uC durante la noche. Las placas fueron lavadas con PBS, y 200 ml/pozo de solución de bloqueo que contenía el medio RPMI 1640 completo y 10% de suero fetal bovino, se añadieron (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) e incubadas durante 2 horas en RT. Los bazozos de los ratones vacunados se aislaron asépticamente y se añadieron a 5610 4 células/pozo en medios que contenían proteína sM2, péptido M2 (SLLLTEVETPTRNGWECKCSD) (1 mg/pozo), solo medio (control negativo), o 5 mg/ml fitohemaglutinina (control positivo, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Después de añadir células y estimuladores, las placas fueron incubadas durante 24 horas a 37uC con 5% de CO 2. Las placas fueron tratadas secuencialmente con anticuerpos IFN-c e IL-4 biotinilados antimouse, peroxidasa de estreptavidinhorse rábano y solución de sustrato. Finalmente, los puntos fueron contados utilizando un analizador InmunoScan Entry (Tecnología Celular, Shaker Heights, EE.UU.). Los pulmones fueron recolectados asépticamente, y los títulos del virus fueron determinados por dosis infecciosas de cultivo tisular 50% (TCID 50 ), como se describió anteriormente [33]. Brevemente, los tejidos pulmonares fueron homogenizados en 500 ml de PBS que contenían antibióticos (penicilina y estreptomicina) y compuestos antimicóticos (Fungizone) (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se centrifugaron muestras pulmonares homogeneizadas mecánicamente Las células MDCK fueron inoculadas con una muestra diluida en serie de 10 veces e incubadas a 37uC en una atmósfera húmeda de 5% de CO 2 durante una hora. Después de la absorción, se extrajo el medio y se incubado durante 72 horas el medio que contenía L-1-tosilamido-2-feniletilclorometilcetona (TPCK) tripsina (Thermo Fisher Scientific, Rockford, EE.UU.) se añadió a las células infectadas y se observaron efectos citopáticos virales diarios, y los títulos fueron determinados por la prueba de HA. El título viral de cada muestra se expresó en dosis de 50% de tejido infectado mediante el método Reed-Muench [34]. Para la histopatología, los tejidos pulmonares fueron recolectados en 5 dpi de ratones con narcosis-anestesia de éter. Los tejidos se fijaron inmediatamente en formalina del 10% que contenía tampón neutro, incrustado en cera de parafina, seccionado a un espesor de 4-6 mm mediante una máquina de microtomo, montada en diapositivas y manchada con tinción de eosina. Los cambios histopatológicos se examinaron mediante microscopía ligera, como se ha descrito anteriormente [29, 30, 35]. Además, las diapositivas se mancharon utilizando un método de inmunoperoxidasa con un anticuerpo (anti-M2, 1:500) dirigido contra la proteína matriz-2 del virus influenza A. Se utilizó un IgG HRP (1:2000, Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) como anticuerpo secundario para la detección de células infectadas por el virus en los tejidos respectivos [57]. Los datos se presentan como media 6 desviaciones estándar (S.D.) y son representativos de al Las diferencias entre los grupos fueron analizadas por análisis de varianza (ANOVA), y los medios fueron comparados por la prueba t de Student. Los valores de P inferiores a 0,05 fueron considerados como significativos. Los resultados del porcentaje de peso corporal inicial también fueron comparados por la prueba t de Student. La comparación de supervivencia se realizó mediante prueba de rango logarítmico utilizando la versión 6 de GraphPad Prism. El vector de expresión pgsA se utilizó para construir plásmidos que contenían el gen sM2 de consenso altamente conservado, con (pgsA-CTA1-sM2) o sin (pgsA-sM2) la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1, Fig. 1A ). Los plásmidos se transformaron en células L. casei. Los niveles de expresión de los anticuerpos policlonales pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2 fueron monitorizados por inmunoblote mediante anticuerpos anti-pgsA, anti-M2 o anti-CT (datos no mostrados). Para determinar la localización celular de las proteínas sM2 y CTA1 expresadas en la superficie de L. casei a través de las proteínas de anclaje de pared celular pgsA, membrana y fracciones citoplásmicas fueron sometidas a análisis de blot occidental. Como era de esperar, tanto las proteínas de fusión pgsA-sM2 como las proteínas pgsA-CTA-CTA-sM2 fueron detectadas por anticuerpos anti-pgsA, anti-M2 o anti-CT policlonales en la membrana, no en fracciones citoplásmicas (fig. 1B, carril 2, 3 y Se realizaron inmunoreacciones con anti-pgsA y bandas que representaban el tamaño de las proteínas fusionadas pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2, mientras que durante las reacciones con anticuerpos anti-M2 o anti-CT, no se detectaron otras bandas (Fig. 1B, carril 3 y 4). Este hallazgo puede haber sido resultado de la degradación que se produce durante el procedimiento de fraccionamiento de membrana. Se utilizó la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) e inmunofluorescencia de las células para verificar la localización de la proteína de fusión pgsA-sM2 y pgsA-CTA-CTA2 en la superficie de L. casei. El análisis citométrico de flujo con anticuerpos anti-M2 y anti-CT reveló un aumento del nivel de intensidad de fluorescencia de pgsA-sM2/L Las células casei o pgsA-CTA1-sM2/L., en comparación con las células casei de control L. casei (Fig. 1C ). La microscopía de inmunofluorescencia también mostró bacterias recombinantes que albergaban pgsA-sM2 o pgsA-CTA1-sM2 que inmunosentaban positiva para sM2 y CTA1, pero esto no se encontró en las células de control. Estos resultados demostraron que L. casei recombinante podía mostrar eficientemente las proteínas de fusión sM2 y CTA1-sM2 en la superficie, utilizando pgsA como proteína ancla de membrana. Para caracterizar la inmunogenicidad de los sM2 de L. casei y los sM2 de CTA1conjugados, los ratones BALB/c fueron inmunizados nasalmente (10 dosis de 9 células/20 ml) o por vía oral (10 dosis de 10 células/100 ml) con pgsA-sM2/L. casei y bacterias pgsA-CTA1-sM2/L. casei recombinantes. Como control negativo, los ratones fueron inmunizados con L. casei albergando el plásmido parental pKV-pgsA (pgsA/L. casei) y PBS. Las muestras séricas fueron recogidas a los 0, 14 y 28 días y analizadas por ELISA, utilizando proteínas sM2 y CTA1 (purificadas a partir de E. coli) como antígeno de recubrimiento. Después de la primera serie de inmunización, se detectaron niveles relativamente bajos de IgG sérico tanto en el grupo inmunizado i.n. como en el grupo inmunizado oral. Sin embargo, se detectaron altos niveles de anticuerpos poco después de la segunda serie de inmunización, y el grupo sM2 conjugado con CTA1 indujo IgG sérico a un nivel significativo, comparado con el grupo sM2 y controles negativos (fig. 2A y B). Aunque se esperaba que la conjugación de CTA1 con sM2 tuviera una función adyuvante solamente, se detectó un nivel significativo de anticuerpos anti-CTA1 tanto en las vacunas nasales como orales (fig. 2A y B derecha). En comparación con el grupo oral, el grupo inmunizado nasalmente mostró niveles más altos de IgG sérico específicos de sM2 y CTA1. Para evaluar las respuestas inmunes Los tejidos pulmonares e intestinales fueron recolectados en el día 28 de la inmunización y examinados utilizando proteína sM2 como antígeno de recubrimiento. En ambas vías de vacunación, pgsA-CTA1-sM2/L. casei indujo niveles significativamente mayores de sM2 mucosal IgA en comparación con los grupos pgsA-sM2/L. casei y control. Sin embargo, como era de esperar, se detectaron niveles más altos de títulos de anticuerpos en el lugar de inoculación que en el sitio remoto. Se observó un patrón similar de respuestas de anticuerpos para ambas vías de inmunización, en las que predominaron los grupos pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 2C y D). Estos datos demostraron que la subunidad de toxina de cólera A1 conjugada sM2 dio lugar a aumentos significativos en los niveles específicos de IgG y IgA mucosal de sM2 comparados con sM2 solo o con controles inmunizados con pgsA/ L. casei o PBS. Inmunización mucosa con L. casei La sM2 y CTA1-sM2 estimulados M2 específicos Respuesta inmune celularPara determinar si la vacunación mucosal con L. casei en superficie displayed sM2 y CTA1 conjugado sM2 podría inducir inmunidad celular, se realizaron IFN-c e IL-4 ELISPOT. Se esplenocitos de ratones vacunados fueron estimulados con 10 mg/ml de proteína sM2 recombinante o péptido M2 y se desarrollaron los ELISPOT citoquinas Los puntos fueron contados para medir las diferencias en las respuestas CTL entre los grupos. Las células de los ratones inmunizados i.n. con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron niveles significativos de IFN-c en respuesta a la estimulación con proteína sM2 y péptido M2 (Fig. 3A). De igual manera, observamos que los grupos administrados i.n. tanto para pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron niveles detectables de esplenocitos IL-4 que secretaban tras la estimulación con proteína sM2 o péptido M2 (Fig. 3B). También se observaron células secretantes IFN-c e IL-4 en ratones inmunizados oralmente con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei (Fig. 3C ) aunque sus niveles fueron inferiores al grupo i.n. y no fueron significativos. El grupo de control inmunizado con pgsA/L. casei mostró un nivel de fondo puntual para ambos grupos intranasal y oral. Estos hallazgos indican que sM2 altamente conservado puede inducir respuestas de células T secretas específicas de IFN-c e IL-4 de M2, mientras que el parto de mucosas a través de L. casei y CTA1 con sM2 realzó la inmunidad mediada por la célula, lo que puede contribuir a ampliar la inmunidad protectora. M2 es conocido como un objetivo potencial para el desarrollo de la vacuna contra la gripe de amplio espectro con variabilidad mínima [36, 37]. Para confirmar la variabilidad de las secuencias de sM2 de los virus desafiados utilizados en este estudio, se comparó el sM2 de subtipos de gripe disponibles en el Centro Nacional de Información Biotecnológica de EE.UU. (NCBI) con nuestra secuencia de consenso sM2 particularmente el entero ecto conservado y alguna porción del dominio citoplásmico (CD), aunque la CD entera fue incluida en el constructo de la vacuna (Tabla 1). Encontramos que los virus utilizados en este estudio contienen 0-8 aminoácidos desfasados entre los aminoácidos de sM2 comparados en este estudio. Para evaluar la eficacia de la vacuna sM2, semana después de la inmunización final, los ratones fueron desafiados i.n. con el 10 MLD 50 de A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2) subtipos Los ratones inmunizados oralmente con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron protección del 40 y 60% respectivamente. Asimismo, los grupos de inmunización conferían 40 y 80% contra la infección letal con el virus H5N2 altamente virulento. En contraste, ninguno de los ratones no inmunizados sobrevivió después de la infección letal (fig. 4A y B, panel derecho). La morbilidad aumentó en los ratones inmunizados por vía oral, mientras que los ratones que recibieron inmunización con pgsA-CTA1-sM2/L. perdieron el 20% de su peso corporal inicial y comenzaron a recuperarse por la infección de 9 días después (dpi) y se recuperaron completamente para el día 13 (fig. 4A y B, panel izquierdo). A continuación se evaluó la eficiencia de protección de la vacuna sM2 candidata frente a A/Puerto Rico/8/34(H1N1), que contiene 8 aminoácidos desfasados en relación con la secuencia de consenso de sM2. Se desafiaron conjuntos de ratones vacunados con 10 MLD 50 del virus H1N1. Como se muestra en la figura 4C y D, los ratones inmunizados por los ratones fueron agrupados como se menciona en materiales y métodos y recibieron administraciones orales o nasales, de acuerdo con el calendario. Las flechas indicaron las rutas de inmunización y los períodos de pgsA/L. casei, pgsA-sM2/L. casei o pgsA-CTA1-sM2/L. células casei. Se recogieron seras en los días 0, 14 y 28; se recolectaron muestras de los pulmones e intestinos en el día 28 después Una semana después de la inmunización final, se extrajeron bazos de 3 ratones en cada grupo, con un conjunto para el análisis de CTL. Dos o 24 semanas después de la última inmunización, todos los ratones fueron desafiados con una dosis letal de subtipos de gripe a través de la ruta intranasal y monitoreados durante 13 días. Los días 3 y 5 post infección, los pulmones fueron extraídos de 3 ratones en cada grupo para determinar el título del virus. doi:10.1371/journal.pone.0094051.g001 CTA1-sM2 Induce inmunidad protectora a virus patógenos de gripe A PLOS ONE www.plosone.org i.n ruta mostró un nivel de protección más alto que los grupos inmunizados por vía oral, y ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron un nivel de protección significativamente más alto que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei (fig. 4C y D, panel derecho). Los ratones inmunizados perdieron hasta el 40% de su peso corporal y murieron por 9 dpi. casei perdió el 20% de su peso corporal inicial por 9 dpi y se recuperó más lentamente que los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 4C y D, panel izquierdo). Otro grupo de ratones vacunados fueron infectados con A/Chicken/ Corea/116/2004(H9N2) para comprobar el rango de capacidad de protección de la vacuna sM2 indujo respuestas inmunitarias. La secuencia sM2 de H9N2 contiene 2 desajustes en relación con la secuencia de consenso sM2. Los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron una pérdida de peso corporal insignificante y una recuperación gradual en comparación con los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei y los ratones no vacunados tanto para la vía oral (fig. 4E Ninguno de los ratones no inmunizados sobrevivió, mientras que el 100% y el 80% de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei a través de la vía intravenosa y oral sobrevivieron, respectivamente. Las tasas de supervivencia de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei fueron del 80% y 60% para la vía intravenosa y oral, respectivamente (fig. 4E y F, panel derecho). También se evaluó la amplitud de protección de la vacuna sM2 contra subtipos de gripe divergentes. Conjunto de ratones inmunizados fueron desafiados con gripe aviar de alta patogenicidad (HPAI) A/ EM/Korea/W149/06(H5N1), que contiene 2 desajustes de aminoácidos en relación con la secuencia de consenso sM2. y las vías orales con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron mayor eficacia de protección, 80% y 60%, respectivamente, en comparación con los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, para los cuales las tasas fueron de 60% y 20%, respectivamente (fig. 4G y H, panel derecho). Respecto a la morbilidad, los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron menor morbilidad que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei (fig. 4G y H, panel izquierdo). Un grupo más de ratones vacunados fueron desafiados con el virus A/Acuático/Corea/W44/2005 (H7N3), que contiene 1 desajuste en relación con la secuencia de consenso sM2, y se observó el peso Como se muestra en la figura 4I y J, los ratones no inmunizados perdieron hasta el 30% de su peso corporal que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 4I y J, panel izquierdo). Los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei a través de la ruta de la i.n mostraron un nivel de protección significativamente más alto contra el virus de la gripe H7N3 que los demás grupos (fig. 4I y J, panel derecho). Tomados en conjunto, los resultados indican que la inmunización con pgsA-CTA1-sM2/L. Las respuestas inmunitarias inducidas por casei que conferían niveles significativos de protección frente a subtipos divergentes de virus de la gripe que contenían aminoácidos desfasados que oscilaban entre 0 y 8 del consenso sM2, independientemente de si era completa o parcial. Se midieron títulos de virus en los pulmones de ratones desafiados para estimar su replicación a 3 y 5 dpi. Los ratones fueron vacunados a través de las vías i.n y oral con subtipos de gripe pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei y desafiados con los subtipos H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 o H7N3. En 3 y 5 dpi, 3 ratones fueron sacrificados al azar de cada grupo, y sus títulos de virus pulmonar fueron medidos utilizando el método casei tenía títulos inferiores a 3 dpi y había reducido significativamente la replicación viral a 5 dpi en comparación con ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei o los grupos control al mismo tiempo (fig. 5A-J). Se observaron títulos virales reducidos en los pulmones en grupos de ratones inmunizados por vía intravenosa en relación con los ratones inmunizados por vía oral, especialmente en el día 3 post infecciones (fig. 5). Estos títulos reducidos pueden deberse a que las vías de vacunación y el desafío son los mismos, y los títulos se correlacionaron con los resultados de supervivencia para infecciones letales con H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 y H7N3. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el consenso de proteína sM2 fusionada con CTA1 proporcionó una mejor protección que sM2, y la vía i.n fue más potente que la vía oral de inmunización con respecto a la protección contra un desafío letal de subtipos de gripe divergentes. Se realizó histopatología e inmunohistoquímica para corroborar los hallazgos del título del virus pulmonar. A los 5 dpi, los pulmones fueron recogidos aleatoriamente de cada grupo de un conjunto, fijos y manchados con eosina antes de ser examinados bajo un microscopio ligero. Como se muestra en la figura 5K, se observaron signos claros de inflamación pulmonar profunda en los pulmones de ratones tratados con PBS o pgsA/L. casei para las vías de administración oral e i.n, mientras que los pulmones de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. Para la inmunohistoquímica, se utilizó el método de la inmunoperoxidasa con un anticuerpo dirigido contra la proteína matriz-2 del virus influenza A para la detección de células infectadas por virus en los tejidos respectivos. El antígeno del virus en las células epiteliales aparece como coloración marrón del núcleo y citoplasma. Como se muestra en la figura 5K, a los 5 días p.i., se detectaron numerosas células infectadas por virus en ratones vacunados con control o pgsA-sM2/L. casei, mientras que se encontró un número muy reducido de células positivas de antígeno en los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, tanto en el grupo vacunado por vía oral como en el grupo vacunado por vía oral (fig. panel derecho 5K). Estos resultados indican que los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei desarrollaron respuestas inmunitarias lo suficientemente fuertes como para inhibir la replicación viral, lo que promueve la supervivencia de los ratones tras una infección letal por influenza A. La vacuna PgsA-CTA1-sM2/L. casei indujo protección cruzada duraderaLa duración de la protección es un criterio importante para una posible vacuna. Así, la longevidad de la inmunidad inducida por sM2 y CTA1 conjugado sM2 fue investigada mediante la detección de IgG sérico e IgA mucosal por ELISA. Se observó un aumento significativo de los niveles de IgG sérico específico de sM2, así como de IgA pulmonar e intestinal 180 días después de la vacunación (fig. 6A y C) en comparación con los grupos PBS y pgs Los ratones fueron desafiados con A/ ave acuática/Corea/W81/2005(H5N2), y los cambios en el peso corporal y la supervivencia fueron monitoreados hasta 13 dpi. Los ratones no vacunados mostraron pérdida de peso corporal del 30% (Fig. 6B y D panel izquierdo) y murieron al día 9 post infección tanto en el grupo oral como en el grupo i.n. En contraste, los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron pérdida de peso corporal insignificante, que fue recuperada por 13 dpi; el 80% sobrevivió en el grupo inmunizado de i.n. (Fig. 6B panel derecho) y el 60% sobrevivió en el grupo inmunizado oral (Fig. 6D panel derecho). Este resultado indica que la vacuna CTA1conjugada sM2 mucosal confirió protección contra una infección letal 6 El sistema inmunológico mucosal es la primera barrera inmunológica contra los patógenos que invaden el cuerpo a través de la superficie mucosal. Así, la inducción de la inmunidad mucosal es necesaria para garantizar la protección contra múltiples subtipos del virus influenza A. Un virus respiratorio, la gripe A es responsable de epidemias estacionales anuales en todo el mundo y, ocasionalmente, pandemias, que son causadas por nuevos subtipos o cepas emergentes derivados del reasociamiento con virus aviares o porcinos. Las vacunas actuales contra la gripe proporcionan únicamente protección específica para las cepas. Por lo tanto, es crucial establecer una vacuna contra la gripe ampliamente cruzada. Los antígenos bien conservados entre la gripe Los virus A se consideran objetivos prometedores para la inducción de la protección cruzada contra estos diferentes subtipos. Sin embargo, el objetivo debe ser el desarrollo de una primera línea de defensa mediante la eliminación efectiva de patógenos en la superficie mucosa. La proteína 2 de la matriz de la gripe (M2) está relativamente bien conservada entre los subtipos de gripe y puede considerarse un antígeno prometedor de la vacuna contra la gripe [30]. Consta de los tres siguientes dominios estructurales: un dominio extracelular de 24-aminoácidos, un dominio transmembrana de 19-aminoácidos y un dominio de cola citoplasmática de 54-aminoácidos [39, 40]. En este estudio se utilizaron los dominios extracelulares y citoplasmáticos, bien conservados entre los virus de la gripe y que desempeñan un papel importante en el ensamblaje viral y la morfogénesis. Aquí se desarrolló el consenso sM2 derivado del análisis de secuencias de subtipos H5N1, H1N1 y H9N2 en la base de datos. Considerando los hallazgos previos de que el dominio extracelular particularmente (aa, 1-13) es altamente conservado entre los subtipos del virus de la gripe y reconocido como epítopo para la inducción de anticuerpos monoclonales, lo que podría proteger la infección por el virus de la gripe [56], se utilizó la secuencia vertebral sM2 del virus H5N1; para la posible homología entre otros subtipos cambiamos en la posición de 14 (E-G) y 18 (R-K) y mantuvimos sin cambios el epítopo conservado (aa, 1-13). Como se muestra en la alineación secuencial, la secuencia sM2 de consenso tiene desajustes de 0-8 entre los subtipos utilizados en este estudio (tabla 1). Además, la incorporación de un adyuvante se considera esencial para impulsar la interacción de la vacuna con el sistema inmunológico mucosa [41]. Varios adyuvantes, como liposomas, nanopartículas y complejos inmunoestimulantes (ISCOMs), han sido estudiados y han sido encontrados para mejorar la respuesta inmune [42], pero su eficacia no fue óptima. A pesar de su potencial como adyuvante mucosa [43], el uso de la toxina del cólera (TC) en las vacunas está limitado por su toxicidad innata, por lo que la toxicidad de la TC tendría que separarse de su adyuvante antes de poder ser utilizada como adyuvante vacunal. Estudios han demostrado que los constructos consistentes en M2e fusionados con la subunidad de toxina del cólera A1 junto con un fuerte agente ADpremilante y un dímero de la D-fragmento de la proteína Staphylococcus aureus Una vacuna provocó protección completa y morbilidad reducida [6, 44]. La CTA1 conserva la función adyuvante de la TC sin sus efectos secundarios tóxicos, como la reactogenicidad en el lugar de su administración y la unión o acumulación en los tejidos nerviosos [45]. Basándose en hallazgos previos, se ha supuesto que el fragmento de consenso sM2, cuando se fusiona con el potente adyuvante mucosal CTA1, puede inducir una amplia inmunidad protectora contra subtipos divergentes del virus de la gripe. En este estudio se utilizó la proteína total CTA1 de 22 kDa (una ribosiltransferasa ADP), que consta de tres subdominios distintos: CTA11 (residuos 1 a 132), CTA12 (residuos 133 a 161) y CTA13 (residuos 162 a 192). Se ha informado que la CTA1 carece de CTB tiene actividades adyuvantes fuertes sin toxicidad alguna. Para el desarrollo de una vacuna universal contra la gripe mucosa con un péptido de sM2 conservado y potente adyuvante CTA1, L. casei recombinante muestra sM2 fusionado con o sin CTA1Los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron alvéolos claros sin infiltración celular inflamatoria, en contraste con los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-sM2/L. casei o ratones de control, los cuales revelaron características de neumonitis grave (panel medio e izquierdo).Se detectó un número reducido de antígenos virales en los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, en contraste con los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-sM2/L. Los microgramas son representativos para cada grupo de tratamiento a una ampliación de 200X. El antígeno del virus en las células epiteliales aparece como coloración marrón del núcleo y citoplasma. En los títulos pulmonares, las barras denotan una media de 6 S.D. El asterisco indica una diferencia significativa entre pgsA-CTA1-sM2/L. casei y otros grupos (*P,0.05). doi:10.1371/journal.pone.0094051.g005 fueron construidos para el parto de mucosas por el vehículo de vacuna viva ampliamente utilizado LAB [38]. El gen pgsA utilizado en este estudio es un ancla para la visualización en la superficie de LAB que se deriva del complejo enzimático pgsBCA de Bacillus subtilis y consiste en dominio transmembrana cerca de su N-terminal con el dominio ubicado en el exterior de la membrana celular. Así, pgsA es capaz de cruzar la pared celular y mostrar la proteína heteróloga fusionada a su C-terminal [17]. Las vacunas desarrolladas se probaron a través de dos rutas principales. Encontramos que la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei fue capaz de inducir un nivel significativamente más alto de sM2 específico IgG sérico ( Fig. 2A y B ) y mucosa IgA (Fig. 2C y D) en comparación con pgsA-sM2/L. casei, y confiriendo protección contra subtipos de gripe divergentes del grupo filogenético 1 (H1, H5, H9) y del grupo 2 (H7) [46] (Fig. 4). Este estudio también reveló que la administración de i.n. fue superior a la vía oral de vacunación, lo que es consistente con otras observaciones [48]. Puede haber dos posibles razones para explicar este fenómeno. Primero, la vía de desafío es la misma que la de la vacunación; la mucosal IgA específica puede prevenir la colonización viral en el tracto respiratorio. Segundo, el volumen de la inocula fue 5 veces menor que el de la inoculación oral, lo que puede haber permitido presentar la forma concentrada del antígeno a las células inmunes. Debido a que se detectaron mayores niveles de IgG sérico e IgA mucosal en ratones inmunizados intranasalmente que en los inmunizados oralmente (fig. 2), una explicación alternativa podría ser que los antígenos se procesan y/o se presentan de manera diferente a las células inmunitarias en los dos compartimentos de la mucosa. Es importante destacar que nuestro estudio demostró por primera vez que la inmunización de la mucosa con la vacuna basada en sM2 con TCA1 presentada en la superficie de LAB induce una amplia protección contra el desafío con subtipos de gripe divergentes. Sin embargo, el mecanismo por el cual Abs contra sM2 mediaba esta amplia protección no se entiende plenamente. Estudios anteriores han demostrado que Abs a la N-terminal de M2e, particularmente posiciones 1-10, inhibió la replicación del virus influenza A [49, 50]. Otros estudios revelaron que la citotoxicidad celular mediada por IgG anti-M2e o fagocitosis puede inducir la eliminación de células infectadas antes de que el virus de la progenie florezca y se propague [54, 55] que está apoyando nuestros hallazgos del título del virus pulmonar y los datos inmunohistoquímicos detectados a 5 dpi en nuestros experimentos de desafío. Por lo tanto, en este estudio, la combinación de esas respuestas y Abs a la secuencia N-terminal de la secuencia sM2 que se conserva entre los virus de desafío (Tabla 1 ) puede proteger los subtipos de gripe divergentes después de la inmunización mucosa con la vacuna recombinante LAB CTA1 basada en M2. Además, la respuesta inmune celular juega un papel importante en el control de la replicación viral. Examinamos las respuestas de citoquina Th1 (IFN-c) y Th2 (IL-4) por Se detectaron niveles significativamente más altos de IFN-c en respuesta a la estimulación con la proteína sM2 y el péptido M2 en ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei en comparación con los niveles en ratones en los grupos de pgsA-sM2/L. casei y control (fig. 3A y C). Asimismo, se observaron niveles sustancialmente más altos de IL-4 en ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei tras la estimulación con la proteína sM2 y el péptido M2 (fig. 3B y D). Estos resultados apoyan aún más los hallazgos de que los anticuerpos y la citotoxicidad mediada por células fueron específicos del antígeno M2 y que sus actividades antivirales fueron inducidas por M2 monomérico, tres copias de M2 fusiona En conjunto, estos resultados indican que la M2 adyuvada con CTA1 fusionada indujo respuestas inmunitarias en ratones, lo que los protegió de subtipos de gripe divergentes. En este sentido, nuestros resultados tienen significancia para el uso de CTA1, que tiene función adyuvante, en candidatos vacunales. Como la protección clínica no es el único parámetro por el cual se evalúa el desempeño de la vacuna, se evaluó la inmunogenicidad de la vacuna LAB recombinante sobre la base de otros parámetros, como la reducción de lesiones patológicas y la eliminación del virus. En este estudio, los títulos bajos del virus de desafío fueron valorados desde los pulmones después de la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, mientras que el virus de desafío podría ser detectado en títulos superiores en ratones simulados y los vacunados con pgsA-sM2/L. casei (Fig La reducción de las lesiones groseras y histopatológicas consistentes con la infección viral son los principales parámetros indicativos de la eficacia de la vacuna antigripal. Aquí, demostramos que la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei limitó notablemente la gravedad del daño al inhibir la replicación viral y la acumulación de células inflamatorias y antígenos virales en los tejidos alveolares pulmonares, en relación con la gravedad en ratones no inmunizados y ratones vacunados con pgsA-sM2/L. casei (Fig. 5K). Nuestro estudio demostró además, por primera vez, que L. casei recombinante que expresaba la inmunidad CTA1-sM2 inducida de larga duración y confería protección contra infecciones letales por gripe, incluso a los 6 meses de la vacunación final (Fig. 6), que es importante para cualquier vacuna exitosa. Se observaron resultados similares en estudios previos, en los que la M2 VLP confería inmunidad a largo plazo y protección cruzada y los anticuerpos en los sitios sueros y mucosas eran de larga vida [53, 54]. En conclusión, nuestros hallazgos revelaron que la inmunización mucosal de ratones con L. casei recombinante que expresaba CTA1conjugado sM2 puede inducir respuestas inmunes sistémicas y locales, así como celulares mediadas, contra subtipos divergentes del virus de la gripe. Así, la L. casei recombinante que expresaba CTA1conjugado consenso sM2 vacuna mucosal puede ser una vacuna prometedora candidata para la preparación para la pandemia de gripe.

¿Por qué las vacunas basadas en M2 han sido ineficaces?

La vacuna contra la gripe recombinante Lactobacillus casei-Displayed CTA1-Conjugated Consensus Matrix Protein-2 (sM2) induce una amplia protección contra los subtipos de gripe divergente en BALB/c Micehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3979752/SHA: efaa556b484fbcd9cc34832ffac53ef3e8334e9c0Autores: Chowdhury, Mohammed Y. E.; Li, Rui; Kim, Jae-Hoon; Park, Min-Eun; Kim, Tae-Hwan; Pathinayake, Prabuddha; Weeratunga, Prasanna; Song, Man Ki; Son, Hwa-Young; Hong, Se casei) o sin (pgsA-sM2/L. casei) subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) en la superficie. La localización superficial de la proteína de fusión fue verificada mediante análisis de fraccionamiento celular, citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia. Inoculaciones orales y nasales de L. casei recombinante en ratones dieron lugar a altos niveles de inmunoglobulina sérica G (IgG) e IgA mucosal. Sin embargo, la conjugación de la subunidad de toxina de cólera A1 indujo respuestas inmunes más potentes de mucosa, humoral y mediadas por células. En una prueba de desafío con 10 MLD(50) de A/EM/Corea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/Ave acuática /Corea/W81/2005(H5N2), A/Ave acuática/Corea/W44/2005(H7N3) y virus A/Chicken/Corea/116/2004(H9N2), los pgsA-CTA1-sM2/L. casei recombinantes proporcionaron una mejor protección contra los desafíos letales que pgsA-sM2/L. casei, pgsA/L. casei y PBS en ratones. Estos resultados indican que la inmunización mucosal con L. casei recombinante que expresa la proteína sM2 conjugada con CTA1 en su superficie es un medio eficaz para obtener respuestas inmunes protectoras contra diversos subtipos de gripe. Texto: La vacunación sigue siendo el medio más económico y eficaz contra las enfermedades respiratorias causadas por virus de la gripe [1]. Con base en los virus que circulan en la población, se han desarrollado cepas de vacunas trivalentes que se utilizan para la protección del virus de la gripe [2]. La estrategia actual más aceptable es la administración intramuscular de vacunas inactivadas producidas por sistemas de fabricación a base de huevos que, si bien son eficaces, se ven obstaculizadas por una capacidad y flexibilidad limitadas [3]. Sin embargo, las cepas vacunales deben adaptarse con frecuencia para adaptarse a los virus circulantes en todo el mundo [4]. Además, se ha observado que los niveles de anticuerpos inducidos por la vacuna in Por lo tanto, las estrategias alternativas para el desarrollo de vacunas ampliamente cruzadas, seguras y eficaces contra las infecciones virales de la gripe son de gran importancia. La proteína matriz 2 (M2) está muy conservada entre las cepas del virus influenza A, lo que indica que M2 es un objetivo atractivo para el desarrollo de una vacuna universal [6]. En estudios anteriores, se han desarrollado y probado varios constructos de la vacuna M2, incluyendo escherichia coli recombinante (E. coli) que expresa la proteína de fusión M2, vectores adenovirales que expresan la proteína M2, codificación de ADN plasmido M2 [7] [8] [9] y péptidos que codifican M2e [11], cada uno de los cuales fue capaz de generar respuestas inmunes protectoras en ratones. Sin embargo, el inconveniente de estas vacunas basadas en M2 es su baja inmunogenicidad; además, la mayoría de ellas requeriría inyecciones intramusculares. Por lo tanto, se han aplicado muchas estrategias centradas en el aumento de la inmunogenicidad de las vacunas basadas en M2, por ejemplo, la fusión de M2 con diferentes moléculas portadoras como la proteína L del virus del papiloma humano [12], la hemocianina de la cojera del ojo clave [10] y la flagellina [13]. Además, se han aplicado vacunas con diferentes adyuvantes y vías de administración para evaluar su protección contra cepas divergentes de virus de la gripe. Los ratones vacunaron mucosally con una M2 o partículas similares al virus (VLP) adyuvadas con toxina de cólera (TC) demostraron una mejor protección que los ratones sometidos a inmunización parenteral [14, 15]. Sin embargo, debido a los efectos adversos de la TC en humanos, los investigadores han intentado identificar subunidades no tóxicas con adyuvancia mediante la eliminación de la subunidad A o E. coli expresando la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) fusionada con el fragmento D de Staphylococcus aureus mostró los efectos adyuvante sin ninguna reactogenicidad de la subunidad A1 en la vacuna mucosa [6]. Aunque la conjugación química o genética de M2 puede no presentar M2 en su forma tetramérica nativa, antígenos de acceso extracelular expresados en las superficies de bacterias son mejor reconocidos por el sistema inmunitario que los que son intracelulares [17]. Por lo tanto, la elección del vehículo de distribución es también una preocupación importante para las posibles vacunas mucosas. Recientemente, se han estudiado bacterias de ácido láctico (LAB) que presentan antígenos del virus de la gripe [3, 18, 19]. Para la inmunización de la mucosa, LAB es un sistema de administración más atractivo que otros vectores de vacunas vivas, como Shigella Se considera seguro y presenta un efecto adyuvante sobre la inmunidad mucosal y sistémica [18, 22, 23]. El anclaje de la proteína diana a las superficies celulares del LAB está destinado principalmente a usarse en vacunas mucosales. La proteína transmembrana pgsA es uno de los complejos de poli-glutamato sintetasa de Bacillus subtilis [17, 24, 25], que es una proteína ancla bien estudiada es capaz de fusionar la proteína diana a su término C y estabilizar el complejo al anclarla en la membrana celular. Dado que el sM2 es un objetivo altamente conservado y prometedor para una vacuna universal y el CTA1 es fuerte adyuvante mucosa, en este estudio se desarrollaron constructos utilizando un gen sM2 de consenso reconstituido a partir del análisis de virus de la gripe H1N1, H5N1 y H9N2 (sin dominio transmembrana) con o sin fusión de CTA1. Para ello se utilizó un nuevo vector de expresión que puede expresar un producto del gen pgsA como matriz de anclaje. Nuestros antígenos objetivo, sM2 y CTA1, se mostraron en la superficie de Lactobacillus casei, y la administración oral o intranasal de respuestas inmunológicas sistémicas y mucosas inducidas por L. casei recombinantes que tienen el potencial de proteger contra los desafíos letales de subtipos de gripe divergentes. Un total de 672 ratones BALB/c hembra (5 semanas de edad) fueron comprados a Samtako (Seúl, Corea) y alojados en jaulas ventiladas. Los ratones fueron manejados con alimentación en pellets y agua del grifo ad libitum, mantenidos en un ambiente específico libre de patógenos y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento después de la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Corporación de Biolíderes, Daejeon, Corea del Sur, número de protocolo: BSL-ABLS-13-002. Las inmunizaciones de animales se realizaron en instalaciones de laboratorio de nivel de bioseguridad (BSL)-2. Los ratones se dividieron en 6 conjuntos experimentales, cada uno de los cuales constaba de 2 subconjuntos: 1 para administración oral y 1 para administración intranasal que contenía 4 grupos cada uno. De 6, 4 conjuntos tenían 14 ratones por grupo Uno de los grupos tenía 17 (3 ratones para histopatología pulmonar e inmunohistoquímica) y el último contenía 11 ratones por grupo (3 ratones para respuesta CTL). Las concentraciones de L. casei recombinante se determinaron por unidades formadoras de colonias (UFC). En cada subconjunto, 2 grupos recibieron 10 UFC de pgsA-sM2/L. casei o pgsA-CTA1-sM2/L. casei, y los otros dos grupos recibieron la misma concentración de pKV-pgsA/L. casei o PBS en 100 ml por vía oral a través de lavado intragástrico en los días 0 a 3, 7 a 9 y 21 a 23. Del mismo modo, 10 9 UFC de células recombinantes se administraron en 20 ml suspensiones en las fosas nasales de ratones ligeramente anestesiados en los días 0 a 3, 7 a 9 y 21. Se recogieron muestras de sangre del plexo retro-orbital en los días 21, 14 y 28; se separaron los sueros por centrifugación durante 5 minutos a 12.0006g y se almacenaron a 220uC hasta el análisis; al día 28, se sacrificaron al azar 3 ratones de cada grupo para recoger la muestra IgA de los pulmones y el intestino y se almacenaron a 270uC hasta el análisis; se recolectaron bazo asépticamente en el día 28 para el análisis de la respuesta CTL al azar de 3 ratones de un grupo; el resto de ratones del mismo grupo se mantuvieron durante 6 meses desde la fecha del último impulso para medir las respuestas inmunes duraderas y la eficacia de protección. Los virus de la gripe aviar A/EM/Korea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2), A/Aquatic bird/Korea/W44/2005(H7N3) y A/ Chicken/Korea/116/2004(H9N2) utilizados en este estudio fueron proporcionados amablemente por el Dr. Young-Ki Choi (College of Medicine and Medical Research Institute, Chungbuk National University, Cheongju, República de Corea). Todos los virus se propagaron en el líquido alantoico de embriones de pollo de 10 días de edad, y el 50% de dosis letales de ratón (MLD 50 ) se determinaron en ratones ingenuos BALB/ c de 8 semanas de Se infectó por vía intranasal a ratones con narcosis-anestesia de ether con 10 veces el MLD 50 de virus de desafío en 20 ml de PBS. Seis ratones en cada grupo fueron sacrificados en 3 y 5 dpi para comprobar el título del virus en los pulmones y otros 5 ratones permanecieron en cada grupo han sido utilizados para la supervivencia. Los ratones fueron monitorizados cada día alternativo en el punto de tiempo fijo para medir la pérdida de peso y supervivencia. Los ratones fueron eutanasiados si moribundos, es decir, pérdida de peso, pelaje escalonado, escalofríos, taquipnea, malestar respiratorio, hipotermia y poco sensibles a estímulos externos, quedando considerados como número de supervivencia. Después del monitoreo final, todos los ratones sobrevivientes fueron humanizados mediante inhalación de CO 2 durante 5 minutos. A los 180 días de la vacunación final, ratones de un conjunto fueron desafiados En este estudio, E. coli JM83 se utilizó para la clonación y L. casei L525 se utilizó para la expresión superficial de la proteína diana. Estas bacterias se cultivaron en los medios LB y MRS, respectivamente. El plásmido pKV-Pald-PgsA, que alberga los genes pgsA de Bacillus subtilis, se utilizó para construir el plásmido de visualización superficial, que fue un regalo amable de la Bioleaders Corporation (Daejeon, Corea del Sur). Se generó un gen que codifica la secuencia de consenso de M2 que abarca los residuos de los dominios extracelular y citoplasmático sin el dominio transmembrana del virus de la gripe. Las secuencias de consenso se crearon a partir de los aminoácidos más comunes en cada posición de la alineación de H1N1, H5N1 y H9N2; luego se sintetizaron y utilizaron como plantillas para la construcción de los plásmidos pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei por clonación, como se describió anteriormente [26, 27]. El gen sM2 fue modificado añadiendo un sitio Kpn I en el terminal 59 y Sal I en el terminal 39 para clonación. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó para amplificar el gen utilizando el par de imprimadores 59-GGGGACCTCTATTAACA-39, y 59-ACGTCGACT-CATTCAAGTTCAATAATG AC-39. Del mismo modo, un sitio BamH I en la terminal 59 y un sitio Kpn I en la terminal 39 fueron añadidos al gen CTA1 utilizando los imprimadores 59-CGGGATCCAAT-GATTATAT-39 y 59-GGGGT ACCGAT-GATCTTGAGC ATT-39. Los genes modificados se ligaron al Vector T Easy (Invitrogen, Seúl, Corea). Los genes fueron luego digeridos con Kpn I-Sal I para sM2 y BamH I-Kpn I para CTA1. El sM2 digerido fue ligado al plásmido vector pKV-pgsA para la construcción de pKV-pgsA-sM2. Del mismo modo, el CTA1 fue ligado para la construcción de pKV-pgsA-CTA1-sM2. Los productos ligados fueron transformados en células competentes E. coli JM83, como se describió anteriormente, utilizando un método de electroporación [17]. Los perfiles de los plasmidos recombinantes fueron confirmados por la digestión de restricción de endonucleasa y secuenciación de ADN (Solgent, Seúl, Corea). Después de la confirmación, los plásmidos fueron transformados en L. casei L525 por electroporación y llamados pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei Los genes de L. casei recombinantes que contienen pgsA, pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2 fueron cultivados a 30uC durante 48 horas. Las células fueron recolectadas por centrifugación a 6.0006g durante 10 minutos a 4uC, seguidas por lavado dos veces con solución salina estéril bufferada por fosfato (PBS). Los análisis bacteriales fueron realizados por sonificación y centrifugados a 12.0006g durante 20 minutos a 4uC. Las fracciones de pared celular y citoplasmáticas fueron separadas por centrifugación a 25.0006g a 4uC durante 2 horas. Los pellets (pared celular) fueron resuspendidos en 100 ml de sarcosol al 1% que contenía 1 mM de fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF, Sigma-Aldrich Para la detección inmunitaria de proteínas de fusión, las membranas fueron analizadas con toxina anticolera de conejo (1:2000, Abcam, UK), anticuerpos anti-pgsA (1:1000) y anti-M2 (1:1000). Los anticuerpos anti-pgsA y anti-M2 de conejo utilizados en este experimento fueron generados por la inoculación i.m. de pgsA KLH-conjugado o péptido M2 en conejo, respectivamente, dos veces a las 2 semanas-intervalo. Las membranas fueron reaccionadas con una dilución 1:10,000 de inmunoglobulina G anti-rabbit conjugada con peroxidasa de rábano (IgG HRP). Finalmente, las proteínas diana fueron detectadas mediante el sistema de detección WEST-ZOL plus Western Blot (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do, Corea) y visualizadas mediante la mejora de la quimioluminiscencia (ECL) [17, 26, 28]. Para investigar la expresión de sM2 o CTA1-sM2 en la superficie de L. casei, L. casei recombinante se cultivaron en 30uC durante 48 horas en el caldo MRS. Las bacterias se cosecharon mediante centrifugación a 5.0006g durante 10 minutos a 4uC, se lavaron tres veces con solución salina estéril fosfatada que contenía 0,01% Tween-20 (PBST) y se probó con anticuerpo anti-TC del conejo policlonal durante la noche. Después de otro lavado, las células fueron tratadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) anticuerpos anti-rabbit IgG (Burlingame, CA, EE.UU.) durante 2 horas. Finalmente, 10.000 células fueron analizadas por citometría de flujo (Becton Dickinson, Oxnard, CA, EE.UU.). Para la inmunofluorescencia, las células fueron preparadas bajo la misma condición descrita para la citometría de flujo. El pgsA/L. casei fue utilizado como control negativo y el análisis de inmunofluoresencia fue examinado mediante un microscopio de fluorescencia Carl Zeiss Axioskop 2. En primer lugar, las placas inmunosorbentes de 96 pocillos (Nunc) fueron incubadas con 300 ng/proteínas sM2 bien purificadas o CTA1 a 4uC durante la noche. Las proteínas sM2 y CTA1 recombinantes utilizadas en este estudio fueron purificadas a partir de E. coli. A continuación, los pozos fueron bloqueados con leche descremada al 10% durante 2 horas en RT, lavada cinco veces con PBST, tratada con muestras de suero diluido (1:200) en triplicado para detectar IgG y tejido homogeneizado sin diluir, sobrenadante para detectar IgA local e incubada durante 2 horas a 37uC. Después de lavar tres veces, se añadió IgG HRP (1:1000, sigma) o antimouse IgA a cada pozo e incubada Después de otra ronda de lavado, las placas fueron reaccionadas con la solución de sustrato que contenía tetrametilbencidina y H 2 O 2 y se les permitió preceder la reacción durante 10 minutos. Después de añadir la solución de parada 2N-H 2 SO 4, la densidad óptica (OD) se midió a 450 nm utilizando un autolector ELISA (dispositivos moleculares). El desarrollo y recuento de citoquinas fueron realizados por ELISPOTs, como se describió anteriormente [31, 32]. Brevemente, el día antes del aislamiento de los esplenocitos, las placas ELISPOT 96-well fueron recubiertas con anticuerpos antimouse monoclonal IFN-c e IL-4 de captura (5 mg/ml) en PBS e incubadas a 4uC durante la noche. Las placas fueron lavadas con PBS, y 200 ml/pozo de solución de bloqueo que contenía el medio RPMI 1640 completo y 10% de suero fetal bovino, se añadieron (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) e incubadas durante 2 horas en RT. Los bazozos de los ratones vacunados se aislaron asépticamente y se añadieron a 5610 4 células/pozo en medios que contenían proteína sM2, péptido M2 (SLLLTEVETPTRNGWECKCSD) (1 mg/pozo), solo medio (control negativo), o 5 mg/ml fitohemaglutinina (control positivo, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Después de añadir células y estimuladores, las placas fueron incubadas durante 24 horas a 37uC con 5% de CO 2. Las placas fueron tratadas secuencialmente con anticuerpos IFN-c e IL-4 biotinilados antimouse, peroxidasa de estreptavidinhorse rábano y solución de sustrato. Finalmente, los puntos fueron contados utilizando un analizador InmunoScan Entry (Tecnología Celular, Shaker Heights, EE.UU.). Los pulmones fueron recolectados asépticamente, y los títulos del virus fueron determinados por dosis infecciosas de cultivo tisular 50% (TCID 50 ), como se describió anteriormente [33]. Brevemente, los tejidos pulmonares fueron homogenizados en 500 ml de PBS que contenían antibióticos (penicilina y estreptomicina) y compuestos antimicóticos (Fungizone) (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se centrifugaron muestras pulmonares homogeneizadas mecánicamente Las células MDCK fueron inoculadas con una muestra diluida en serie de 10 veces e incubadas a 37uC en una atmósfera húmeda de 5% de CO 2 durante una hora. Después de la absorción, se extrajo el medio y se incubado durante 72 horas el medio que contenía L-1-tosilamido-2-feniletilclorometilcetona (TPCK) tripsina (Thermo Fisher Scientific, Rockford, EE.UU.) se añadió a las células infectadas y se observaron efectos citopáticos virales diarios, y los títulos fueron determinados por la prueba de HA. El título viral de cada muestra se expresó en dosis de 50% de tejido infectado mediante el método Reed-Muench [34]. Para la histopatología, los tejidos pulmonares fueron recolectados en 5 dpi de ratones con narcosis-anestesia de éter. Los tejidos se fijaron inmediatamente en formalina del 10% que contenía tampón neutro, incrustado en cera de parafina, seccionado a un espesor de 4-6 mm mediante una máquina de microtomo, montada en diapositivas y manchada con tinción de eosina. Los cambios histopatológicos se examinaron mediante microscopía ligera, como se ha descrito anteriormente [29, 30, 35]. Además, las diapositivas se mancharon utilizando un método de inmunoperoxidasa con un anticuerpo (anti-M2, 1:500) dirigido contra la proteína matriz-2 del virus influenza A. Se utilizó un IgG HRP (1:2000, Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) como anticuerpo secundario para la detección de células infectadas por el virus en los tejidos respectivos [57]. Los datos se presentan como media 6 desviaciones estándar (S.D.) y son representativos de al Las diferencias entre los grupos fueron analizadas por análisis de varianza (ANOVA), y los medios fueron comparados por la prueba t de Student. Los valores de P inferiores a 0,05 fueron considerados como significativos. Los resultados del porcentaje de peso corporal inicial también fueron comparados por la prueba t de Student. La comparación de supervivencia se realizó mediante prueba de rango logarítmico utilizando la versión 6 de GraphPad Prism. El vector de expresión pgsA se utilizó para construir plásmidos que contenían el gen sM2 de consenso altamente conservado, con (pgsA-CTA1-sM2) o sin (pgsA-sM2) la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1, Fig. 1A ). Los plásmidos se transformaron en células L. casei. Los niveles de expresión de los anticuerpos policlonales pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2 fueron monitorizados por inmunoblote mediante anticuerpos anti-pgsA, anti-M2 o anti-CT (datos no mostrados). Para determinar la localización celular de las proteínas sM2 y CTA1 expresadas en la superficie de L. casei a través de las proteínas de anclaje de pared celular pgsA, membrana y fracciones citoplásmicas fueron sometidas a análisis de blot occidental. Como era de esperar, tanto las proteínas de fusión pgsA-sM2 como las proteínas pgsA-CTA-CTA-sM2 fueron detectadas por anticuerpos anti-pgsA, anti-M2 o anti-CT policlonales en la membrana, no en fracciones citoplásmicas (fig. 1B, carril 2, 3 y Se realizaron inmunoreacciones con anti-pgsA y bandas que representaban el tamaño de las proteínas fusionadas pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2, mientras que durante las reacciones con anticuerpos anti-M2 o anti-CT, no se detectaron otras bandas (Fig. 1B, carril 3 y 4). Este hallazgo puede haber sido resultado de la degradación que se produce durante el procedimiento de fraccionamiento de membrana. Se utilizó la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) e inmunofluorescencia de las células para verificar la localización de la proteína de fusión pgsA-sM2 y pgsA-CTA-CTA2 en la superficie de L. casei. El análisis citométrico de flujo con anticuerpos anti-M2 y anti-CT reveló un aumento del nivel de intensidad de fluorescencia de pgsA-sM2/L Las células casei o pgsA-CTA1-sM2/L., en comparación con las células casei de control L. casei (Fig. 1C ). La microscopía de inmunofluorescencia también mostró bacterias recombinantes que albergaban pgsA-sM2 o pgsA-CTA1-sM2 que inmunosentaban positiva para sM2 y CTA1, pero esto no se encontró en las células de control. Estos resultados demostraron que L. casei recombinante podía mostrar eficientemente las proteínas de fusión sM2 y CTA1-sM2 en la superficie, utilizando pgsA como proteína ancla de membrana. Para caracterizar la inmunogenicidad de los sM2 de L. casei y los sM2 de CTA1conjugados, los ratones BALB/c fueron inmunizados nasalmente (10 dosis de 9 células/20 ml) o por vía oral (10 dosis de 10 células/100 ml) con pgsA-sM2/L. casei y bacterias pgsA-CTA1-sM2/L. casei recombinantes. Como control negativo, los ratones fueron inmunizados con L. casei albergando el plásmido parental pKV-pgsA (pgsA/L. casei) y PBS. Las muestras séricas fueron recogidas a los 0, 14 y 28 días y analizadas por ELISA, utilizando proteínas sM2 y CTA1 (purificadas a partir de E. coli) como antígeno de recubrimiento. Después de la primera serie de inmunización, se detectaron niveles comparativamente bajos de IgG sérico tanto en el grupo inmunizado i.n. como en el grupo inmunizado oral. Sin embargo, se detectaron altos niveles de anticuerpos poco después de la segunda serie de inmunización, y el grupo sM2 conjugado con CTA1 indujo IgG sérico a un nivel significativo, comparado con el grupo sM2 y los controles negativos (fig. 2A y B). Aunque se esperaba que la conjugación de CTA1 con sM2 tuviera una función adyuvante solamente, se detectó un nivel significativo de anticuerpos anti-CTA1 tanto en las vacunas nasales como orales (fig. 2A y B derecha). En comparación con el grupo oral, el grupo inmunizado nasalmente mostró niveles más altos de IgG sérico específicos de sM2 y CTA1. Para evaluar las respuestas Los tejidos pulmonares e intestinales fueron recolectados en el día 28 de la inmunización y examinados utilizando proteína sM2 como antígeno de recubrimiento. En ambas vías de vacunación, pgsA-CTA1-sM2/L. casei indujo niveles significativamente mayores de sM2 mucosal IgA en comparación con los grupos pgsA-sM2/L. casei y control. Sin embargo, como era de esperar, se detectaron niveles más altos de títulos de anticuerpos en el lugar de inoculación que en el sitio remoto. Se observó un patrón similar de respuestas de anticuerpos para ambas vías de inmunización, en las que predominaron los grupos pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 2C y D). Estos datos demostraron que la subunidad de toxina de cólera A1 conjugada sM2 dio lugar a aumentos significativos en los niveles específicos de IgG y IgA mucosal de sM2 comparados con la sM2 sola o con controles inmunizados con pgsA/ L. casei o PBS. Inmunización mucosa con L. casei La sM2 y la CTA1-sM2 estimuladas M2 específicas para la respuesta inmune celularPara determinar si la vacunación mucosal con L. casei en superficie displayed sM2 y CTA1 conjugadas sM2 podría inducir inmunidad celular, se realizaron IFN-c e IL-4 ELISPOT. Se esplenocitos de ratones vacunados fueron estimulados con 10 mg/ml de proteína sM2 recombinante o péptido M2 y se desarrollaron los ELISPO Los puntos fueron contados para medir las diferencias en las respuestas CTL entre los grupos. Las células de los ratones inmunizados i.n. con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron niveles significativos de IFN-c en respuesta a la estimulación con proteína sM2 y péptido M2 (Fig. 3A). De igual manera, observamos que los grupos administrados i.n. tanto para pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron niveles detectables de esplenocitos IL-4 que secretaban tras la estimulación con proteína sM2 o péptido M2 (Fig. 3B). También se observaron células secretantes IFN-c e IL-4 en ratones inmunizados oralmente con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei (Fig. 3C ) aunque sus niveles fueron inferiores al grupo i.n. y no fueron significativos. El grupo de control inmunizado con pgsA/L. casei mostró un nivel de fondo puntual para ambos grupos intranasal y oral. Estos hallazgos indican que sM2 altamente conservado puede inducir respuestas de células T secretas específicas de IFN-c e IL-4 de M2, mientras que el parto de mucosas a través de L. casei y CTA1 con sM2 realzó la inmunidad mediada por la célula, lo que puede contribuir a ampliar la inmunidad protectora. M2 es conocido como un objetivo potencial para el desarrollo de la vacuna contra la gripe de amplio espectro con variabilidad mínima [36, 37]. Para confirmar la variabilidad de las secuencias de sM2 de los virus desafiados utilizados en este estudio, se comparó el sM2 de subtipos de gripe disponibles en el Centro Nacional de Información Biotecnológica de EE.UU. (NCBI) con nuestra secuencia de consenso sM2 particularmente el entero ecto conservado y alguna porción del dominio citoplásmico (CD), aunque la CD entera fue incluida en el constructo de la vacuna (Tabla 1). Encontramos que los virus utilizados en este estudio contienen 0-8 aminoácidos desfasados entre los aminoácidos de sM2 comparados en este estudio. Para evaluar la eficacia de la vacuna sM2, semana después de la inmunización final, los ratones fueron desafiados i.n. con el 10 MLD 50 de A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2) subtipos Los ratones inmunizados oralmente con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron protección del 40 y 60% respectivamente. Asimismo, los grupos de inmunización conferían 40 y 80% contra la infección letal con el virus H5N2 altamente virulento. En contraste, ninguno de los ratones no inmunizados sobrevivió después de la infección letal (fig. 4A y B, panel derecho). La morbilidad aumentó en los ratones inmunizados por vía oral, mientras que los ratones que recibieron inmunización con pgsA-CTA1-sM2/L. perdieron el 20% de su peso corporal inicial y comenzaron a recuperarse por la infección de 9 días después (dpi) y se recuperaron completamente para el día 13 (fig. 4A y B, panel izquierdo). A continuación se evaluó la eficiencia de protección de la vacuna sM2 candidata frente a A/Puerto Rico/8/34(H1N1), que contiene 8 aminoácidos desfasados en relación con la secuencia de consenso de sM2. Se desafiaron conjuntos de ratones vacunados con 10 MLD 50 del virus H1N1. Como se muestra en la figura 4C y D, los ratones inmunizados por los ratones fueron agrupados como se menciona en materiales y métodos y recibieron administraciones orales o nasales, de acuerdo con el calendario. Las flechas indicaron las rutas de inmunización y los períodos de pgsA/L. casei, pgsA-sM2/L. casei o pgsA-CTA1-sM2/L. células casei. Se recogieron seras en los días 0, 14 y 28; se recolectaron muestras de los pulmones e intestinos en el día 28 después Una semana después de la inmunización final, se extrajeron bazos de 3 ratones en cada grupo, con un conjunto para el análisis de CTL. Dos o 24 semanas después de la última inmunización, todos los ratones fueron desafiados con una dosis letal de subtipos de gripe a través de la ruta intranasal y monitoreados durante 13 días. Los días 3 y 5 post infección, los pulmones fueron extraídos de 3 ratones en cada grupo para determinar el título del virus. doi:10.1371/journal.pone.0094051.g001 CTA1-sM2 Induce inmunidad protectora a virus patógenos de gripe A PLOS ONE www.plosone.org i.n ruta mostró un nivel de protección más alto que los grupos inmunizados por vía oral, y ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron un nivel de protección significativamente más alto que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei (fig. 4C y D, panel derecho). Los ratones inmunizados perdieron hasta el 40% de su peso corporal y murieron por 9 dpi. casei perdió el 20% de su peso corporal inicial por 9 dpi y se recuperó más lentamente que los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 4C y D, panel izquierdo). Otro grupo de ratones vacunados fueron infectados con A/Chicken/ Corea/116/2004(H9N2) para comprobar el rango de capacidad de protección de la vacuna sM2 indujo respuestas inmunitarias. La secuencia sM2 de H9N2 contiene 2 desajustes en relación con la secuencia de consenso sM2. Los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron una pérdida de peso corporal insignificante y una recuperación gradual en comparación con los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei y los ratones no vacunados tanto para la vía oral (fig. 4E Ninguno de los ratones no inmunizados sobrevivió, mientras que el 100% y el 80% de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei a través de la vía intravenosa y oral sobrevivieron, respectivamente. Las tasas de supervivencia de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei fueron del 80% y 60% para la vía intravenosa y oral, respectivamente (fig. 4E y F, panel derecho). También se evaluó la amplitud de protección de la vacuna sM2 contra subtipos de gripe divergentes. Conjunto de ratones inmunizados fueron desafiados con gripe aviar de alta patogenicidad (HPAI) A/ EM/Korea/W149/06(H5N1), que contiene 2 desajustes de aminoácidos en relación con la secuencia de consenso sM2. y las vías orales con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron mayor eficacia de protección, 80% y 60%, respectivamente, en comparación con los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, para los cuales las tasas fueron de 60% y 20%, respectivamente (fig. 4G y H, panel derecho). Respecto a la morbilidad, los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron menor morbilidad que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei (fig. 4G y H, panel izquierdo). Un grupo más de ratones vacunados fueron desafiados con el virus A/Acuático/Corea/W44/2005 (H7N3), que contiene 1 desajuste en relación con la secuencia de consenso sM2, y se observó el peso Como se muestra en la figura 4I y J, los ratones no inmunizados perdieron hasta el 30% de su peso corporal que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 4I y J, panel izquierdo). Los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei a través de la ruta de la i.n mostraron un nivel de protección significativamente más alto contra el virus de la gripe H7N3 que los demás grupos (fig. 4I y J, panel derecho). Tomados en conjunto, los resultados indican que la inmunización con pgsA-CTA1-sM2/L. Las respuestas inmunitarias inducidas por casei que conferían niveles significativos de protección frente a subtipos divergentes de virus de la gripe que contenían aminoácidos desfasados que oscilaban entre 0 y 8 del consenso sM2, independientemente de si era completa o parcial. Se midieron títulos de virus en los pulmones de ratones desafiados para estimar su replicación a 3 y 5 dpi. Los ratones fueron vacunados a través de las vías i.n y oral con subtipos de gripe pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei y desafiados con los subtipos H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 o H7N3. En 3 y 5 dpi, 3 ratones fueron sacrificados al azar de cada grupo, y sus títulos de virus pulmonar fueron medidos utilizando el método casei tenía títulos inferiores a 3 dpi y había reducido significativamente la replicación viral a 5 dpi en comparación con ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei o los grupos control al mismo tiempo (fig. 5A-J). Se observaron títulos virales reducidos en los pulmones en grupos de ratones inmunizados por vía intravenosa en relación con los ratones inmunizados por vía oral, especialmente en el día 3 post infecciones (fig. 5). Estos títulos reducidos pueden deberse a que las vías de vacunación y el desafío son los mismos, y los títulos se correlacionaron con los resultados de supervivencia para infecciones letales con H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 y H7N3. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el consenso de proteína sM2 fusionada con CTA1 proporcionó una mejor protección que sM2, y la vía i.n fue más potente que la vía oral de inmunización con respecto a la protección contra un desafío letal de subtipos de gripe divergentes. Se realizó histopatología e inmunohistoquímica para corroborar los hallazgos del título del virus pulmonar. A los 5 dpi, los pulmones fueron recogidos aleatoriamente de cada grupo de un conjunto, fijos y manchados con eosina antes de ser examinados bajo un microscopio ligero. Como se muestra en la figura 5K, se observaron signos claros de inflamación pulmonar profunda en los pulmones de ratones tratados con PBS o pgsA/L. casei para las vías de administración oral e i.n, mientras que los pulmones de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. Para la inmunohistoquímica, se utilizó el método de la inmunoperoxidasa con un anticuerpo dirigido contra la proteína matriz-2 del virus influenza A para la detección de células infectadas por virus en los tejidos respectivos. El antígeno del virus en las células epiteliales aparece como coloración marrón del núcleo y citoplasma. Como se muestra en la figura 5K, a los 5 días p.i., se detectaron numerosas células infectadas por virus en ratones vacunados con control o pgsA-sM2/L. casei, mientras que se encontró un número muy reducido de células positivas de antígeno en los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, tanto en el grupo vacunado por vía oral como en el grupo vacunado por vía oral (fig. panel derecho 5K). Estos resultados indican que los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei desarrollaron respuestas inmunitarias lo suficientemente fuertes como para inhibir la replicación viral, lo que promueve la supervivencia de los ratones tras una infección letal por influenza A. La vacuna PgsA-CTA1-sM2/L. casei indujo protección cruzada duraderaLa duración de la protección es un criterio importante para una posible vacuna. Así, la longevidad de la inmunidad inducida por sM2 y CTA1 conjugado sM2 fue investigada mediante la detección de IgG sérico e IgA mucosal por ELISA. Se observó un aumento significativo de los niveles de IgG sérico específico de sM2, así como de IgA pulmonar e intestinal 180 días después de la vacunación (fig. 6A y C) en comparación con los grupos PBS y pgs Los ratones fueron desafiados con A/ ave acuática/Corea/W81/2005(H5N2), y los cambios en el peso corporal y la supervivencia fueron monitoreados hasta 13 dpi. Los ratones no vacunados mostraron pérdida de peso corporal del 30% (Fig. 6B y D panel izquierdo) y murieron al día 9 post infección tanto en el grupo oral como en el grupo i.n. En contraste, los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron pérdida de peso corporal insignificante, que fue recuperada por 13 dpi; el 80% sobrevivió en el grupo inmunizado de i.n. (Fig. 6B panel derecho) y el 60% sobrevivió en el grupo inmunizado oral (Fig. 6D panel derecho). Este resultado indica que la vacuna CTA1conjugada sM2 mucosal confirió protección contra una infección letal 6 El sistema inmunológico mucosal es la primera barrera inmunológica contra los patógenos que invaden el cuerpo a través de la superficie mucosal. Así, la inducción de la inmunidad mucosal es necesaria para garantizar la protección contra múltiples subtipos del virus influenza A. Un virus respiratorio, la gripe A es responsable de epidemias estacionales anuales en todo el mundo y, ocasionalmente, pandemias, que son causadas por nuevos subtipos o cepas emergentes derivados del reasociamiento con virus aviares o porcinos. Las vacunas actuales contra la gripe proporcionan únicamente protección específica para las cepas. Por lo tanto, es crucial establecer una vacuna contra la gripe ampliamente cruzada. Los antígenos bien conservados entre la gripe Los virus A se consideran objetivos prometedores para la inducción de la protección cruzada contra estos diferentes subtipos. Sin embargo, el objetivo debe ser el desarrollo de una primera línea de defensa mediante la eliminación efectiva de patógenos en la superficie mucosa. La proteína 2 de la matriz de la gripe (M2) está relativamente bien conservada entre los subtipos de gripe y puede considerarse un antígeno prometedor de la vacuna contra la gripe [30]. Consta de los tres siguientes dominios estructurales: un dominio extracelular de 24-aminoácidos, un dominio transmembrana de 19-aminoácidos y un dominio de cola citoplasmática de 54-aminoácidos [39, 40]. En este estudio se utilizaron los dominios extracelulares y citoplasmáticos, bien conservados entre los virus de la gripe y que desempeñan un papel importante en el ensamblaje viral y la morfogénesis. Aquí se desarrolló el consenso sM2 derivado del análisis de secuencias de subtipos H5N1, H1N1 y H9N2 en la base de datos. Considerando los hallazgos previos de que el dominio extracelular particularmente (aa, 1-13) es altamente conservado entre los subtipos del virus de la gripe y reconocido como epítopo para la inducción de anticuerpos monoclonales, lo que podría proteger la infección por el virus de la gripe [56], se utilizó la secuencia vertebral sM2 del virus H5N1; para la posible homología entre otros subtipos cambiamos en la posición de 14 (E-G) y 18 (R-K) y mantuvimos sin cambios el epítopo conservado (aa, 1-13). Como se muestra en la alineación secuencial, la secuencia sM2 de consenso tiene desajustes de 0-8 entre los subtipos utilizados en este estudio (tabla 1). Además, la incorporación de un adyuvante se considera esencial para impulsar la interacción de la vacuna con el sistema inmunológico mucosa [41]. Varios adyuvantes, como liposomas, nanopartículas y complejos inmunoestimulantes (ISCOMs), han sido estudiados y han sido encontrados para mejorar la respuesta inmune [42], pero su eficacia no fue óptima. A pesar de su potencial como adyuvante mucosa [43], el uso de la toxina del cólera (TC) en las vacunas está limitado por su toxicidad innata, por lo que la toxicidad de la TC tendría que separarse de su adyuvante antes de poder ser utilizada como adyuvante vacunal. Estudios han demostrado que los constructos consistentes en M2e fusionados con la subunidad de toxina del cólera A1 junto con un fuerte agente ADpremilante y un dímero de la D-fragmento de la proteína Staphylococcus aureus Una vacuna provocó protección completa y morbilidad reducida [6, 44]. La CTA1 conserva la función adyuvante de la TC sin sus efectos secundarios tóxicos, como la reactogenicidad en el lugar de su administración y la unión o acumulación en los tejidos nerviosos [45]. Basándose en hallazgos previos, se ha supuesto que el fragmento de consenso sM2, cuando se fusiona con el potente adyuvante mucosal CTA1, puede inducir una amplia inmunidad protectora contra subtipos divergentes del virus de la gripe. En este estudio se utilizó la proteína total CTA1 de 22 kDa (una ribosiltransferasa ADP), que consta de tres subdominios distintos: CTA11 (residuos 1 a 132), CTA12 (residuos 133 a 161) y CTA13 (residuos 162 a 192). Se ha informado que la CTA1 carece de CTB tiene actividades adyuvantes fuertes sin toxicidad alguna. Para el desarrollo de una vacuna universal contra la gripe mucosa con un péptido de sM2 conservado y potente adyuvante CTA1, L. casei recombinante muestra sM2 fusionado con o sin CTA1Los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron alvéolos claros sin infiltración celular inflamatoria, en contraste con los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-sM2/L. casei o ratones de control, los cuales revelaron características de neumonitis grave (panel medio e izquierdo).Se detectó un número reducido de antígenos virales en los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, en contraste con los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-sM2/L. Los microgramas son representativos para cada grupo de tratamiento a una ampliación de 200X. El antígeno del virus en las células epiteliales aparece como coloración marrón del núcleo y citoplasma. En los títulos pulmonares, las barras denotan una media de 6 S.D. El asterisco indica una diferencia significativa entre pgsA-CTA1-sM2/L. casei y otros grupos (*P,0.05). doi:10.1371/journal.pone.0094051.g005 fueron construidos para el parto de mucosas por el vehículo de vacuna viva ampliamente utilizado LAB [38]. El gen pgsA utilizado en este estudio es un ancla para la visualización en la superficie de LAB que se deriva del complejo enzimático pgsBCA de Bacillus subtilis y consiste en dominio transmembrana cerca de su N-terminal con el dominio ubicado en el exterior de la membrana celular. Así, pgsA es capaz de cruzar la pared celular y mostrar la proteína heteróloga fusionada a su C-terminal [17]. Las vacunas desarrolladas se probaron a través de dos rutas principales. Encontramos que la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei fue capaz de inducir un nivel significativamente más alto de sM2 específico IgG sérico ( Fig. 2A y B ) y mucosa IgA (Fig. 2C y D) en comparación con pgsA-sM2/L. casei, y confiriendo protección contra subtipos de gripe divergentes del grupo filogenético 1 (H1, H5, H9) y del grupo 2 (H7) [46] (Fig. 4). Este estudio también reveló que la administración de i.n. fue superior a la vía oral de vacunación, lo que es consistente con otras observaciones [48]. Puede haber dos posibles razones para explicar este fenómeno. Primero, la vía de desafío es la misma que la de la vacunación; la mucosal IgA específica puede prevenir la colonización viral en el tracto respiratorio. Segundo, el volumen de la inocula fue 5 veces menor que el de la inoculación oral, lo que puede haber permitido presentar la forma concentrada del antígeno a las células inmunes. Debido a que se detectaron mayores niveles de IgG sérico e IgA mucosal en ratones inmunizados intranasalmente que en los inmunizados oralmente (fig. 2), una explicación alternativa podría ser que los antígenos se procesan y/o se presentan de manera diferente a las células inmunitarias en los dos compartimentos de la mucosa. Es importante destacar que nuestro estudio demostró por primera vez que la inmunización de la mucosa con la vacuna basada en sM2 con TCA1 presentada en la superficie de LAB induce una amplia protección contra el desafío con subtipos de gripe divergentes. Sin embargo, el mecanismo por el cual Abs contra sM2 mediaba esta amplia protección no se entiende plenamente. Estudios anteriores han demostrado que Abs a la N-terminal de M2e, particularmente posiciones 1-10, inhibió la replicación del virus influenza A [49, 50]. Otros estudios revelaron que la citotoxicidad celular mediada por IgG anti-M2e o fagocitosis puede inducir la eliminación de células infectadas antes de que el virus de la progenie florezca y se propague [54, 55] que está apoyando nuestros hallazgos del título del virus pulmonar y los datos inmunohistoquímicos detectados a 5 dpi en nuestros experimentos de desafío. Por lo tanto, en este estudio, la combinación de esas respuestas y Abs a la secuencia N-terminal de la secuencia sM2 que se conserva entre los virus de desafío (Tabla 1 ) puede proteger los subtipos de gripe divergentes después de la inmunización mucosa con la vacuna recombinante LAB CTA1 basada en M2. Además, la respuesta inmune celular juega un papel importante en el control de la replicación viral. Examinamos las respuestas de citoquina Th1 (IFN-c) y Th2 (IL-4) por Se detectaron niveles significativamente más altos de IFN-c en respuesta a la estimulación con la proteína sM2 y el péptido M2 en ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei en comparación con los niveles en ratones en los grupos de pgsA-sM2/L. casei y control (fig. 3A y C). Asimismo, se observaron niveles sustancialmente más altos de IL-4 en ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei tras la estimulación con la proteína sM2 y el péptido M2 (fig. 3B y D). Estos resultados apoyan aún más los hallazgos de que los anticuerpos y la citotoxicidad mediada por células fueron específicos del antígeno M2 y que sus actividades antivirales fueron inducidas por M2 monomérico, tres copias de M2 fusiona En conjunto, estos resultados indican que la M2 adyuvada con CTA1 fusionada indujo respuestas inmunitarias en ratones, lo que los protegió de subtipos de gripe divergentes. En este sentido, nuestros resultados tienen significancia para el uso de CTA1, que tiene función adyuvante, en candidatos vacunales. Como la protección clínica no es el único parámetro por el cual se evalúa el desempeño de la vacuna, se evaluó la inmunogenicidad de la vacuna LAB recombinante sobre la base de otros parámetros, como la reducción de lesiones patológicas y la eliminación del virus. En este estudio, los títulos bajos del virus de desafío fueron valorados desde los pulmones después de la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, mientras que el virus de desafío podría ser detectado en títulos superiores en ratones simulados y los vacunados con pgsA-sM2/L. casei (Fig La reducción de las lesiones groseras y histopatológicas consistentes con la infección viral son los principales parámetros indicativos de la eficacia de la vacuna antigripal. Aquí, demostramos que la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei limitó notablemente la gravedad del daño al inhibir la replicación viral y la acumulación de células inflamatorias y antígenos virales en los tejidos alveolares pulmonares, en relación con la gravedad en ratones no inmunizados y ratones vacunados con pgsA-sM2/L. casei (Fig. 5K). Nuestro estudio demostró además, por primera vez, que L. casei recombinante que expresaba la inmunidad CTA1-sM2 inducida de larga duración y confería protección contra infecciones letales por gripe, incluso a los 6 meses de la vacunación final (Fig. 6), que es importante para cualquier vacuna exitosa. Se observaron resultados similares en estudios previos, en los que la M2 VLP confería inmunidad a largo plazo y protección cruzada y los anticuerpos en los sitios sueros y mucosas eran de larga vida [53, 54]. En conclusión, nuestros hallazgos revelaron que la inmunización mucosal de ratones con L. casei recombinante que expresaba CTA1conjugado sM2 puede inducir respuestas inmunes sistémicas y locales, así como celulares mediadas, contra subtipos divergentes del virus de la gripe. Así, la L. casei recombinante que expresaba CTA1conjugado consenso sM2 vacuna mucosal puede ser una vacuna prometedora candidata para la preparación para la pandemia de gripe.

¿Qué pares de imprimación se utilizaron para PCR?

La vacuna contra la gripe recombinante Lactobacillus casei-Displayed CTA1-Conjugated Consensus Matrix Protein-2 (sM2) induce una amplia protección contra los subtipos de gripe divergente en BALB/c Micehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3979752/SHA: efaa556b484fbcd9cc34832ffac53ef3e8334e9c0Autores: Chowdhury, Mohammed Y. E.; Li, Rui; Kim, Jae-Hoon; Park, Min-Eun; Kim, Tae-Hwan; Pathinayake, Prabuddha; Weeratunga, Prasanna; Song, Man Ki; Son, Hwa-Young; Hong, Se casei) o sin (pgsA-sM2/L. casei) subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) en la superficie. La localización superficial de la proteína de fusión fue verificada mediante análisis de fraccionamiento celular, citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia. Inoculaciones orales y nasales de L. casei recombinante en ratones dieron lugar a altos niveles de inmunoglobulina sérica G (IgG) e IgA mucosal. Sin embargo, la conjugación de la subunidad de toxina de cólera A1 indujo respuestas inmunes más potentes de mucosa, humoral y mediadas por células. En una prueba de desafío con 10 MLD(50) de A/EM/Corea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/Ave acuática /Corea/W81/2005(H5N2), A/Ave acuática/Corea/W44/2005(H7N3) y virus A/Chicken/Corea/116/2004(H9N2), los pgsA-CTA1-sM2/L. casei recombinantes proporcionaron una mejor protección contra los desafíos letales que pgsA-sM2/L. casei, pgsA/L. casei y PBS en ratones. Estos resultados indican que la inmunización mucosal con L. casei recombinante que expresa la proteína sM2 conjugada con CTA1 en su superficie es un medio eficaz para obtener respuestas inmunes protectoras contra diversos subtipos de gripe. Texto: La vacunación sigue siendo el medio más económico y eficaz contra las enfermedades respiratorias causadas por virus de la gripe [1]. Con base en los virus que circulan en la población, se han desarrollado cepas de vacunas trivalentes que se utilizan para la protección del virus de la gripe [2]. La estrategia actual más aceptable es la administración intramuscular de vacunas inactivadas producidas por sistemas de fabricación a base de huevos que, si bien son eficaces, se ven obstaculizadas por una capacidad y flexibilidad limitadas [3]. Sin embargo, las cepas vacunales deben adaptarse con frecuencia para adaptarse a los virus circulantes en todo el mundo [4]. Además, se ha observado que los niveles de anticuerpos inducidos por la vacuna in Por lo tanto, las estrategias alternativas para el desarrollo de vacunas ampliamente cruzadas, seguras y eficaces contra las infecciones virales de la gripe son de gran importancia. La proteína matriz 2 (M2) está muy conservada entre las cepas del virus influenza A, lo que indica que M2 es un objetivo atractivo para el desarrollo de una vacuna universal [6]. En estudios anteriores, se han desarrollado y probado varios constructos de la vacuna M2, incluyendo escherichia coli recombinante (E. coli) que expresa la proteína de fusión M2, vectores adenovirales que expresan la proteína M2, codificación de ADN plasmido M2 [7] [8] [9] y péptidos que codifican M2e [11], cada uno de los cuales fue capaz de generar respuestas inmunes protectoras en ratones. Sin embargo, el inconveniente de estas vacunas basadas en M2 es su baja inmunogenicidad; además, la mayoría de ellas requeriría inyecciones intramusculares. Por lo tanto, se han aplicado muchas estrategias centradas en el aumento de la inmunogenicidad de las vacunas basadas en M2, por ejemplo, la fusión de M2 con diferentes moléculas portadoras como la proteína L del virus del papiloma humano [12], la hemocianina de la cojera del ojo clave [10] y la flagellina [13]. Además, se han aplicado vacunas con diferentes adyuvantes y vías de administración para evaluar su protección contra cepas divergentes de virus de la gripe. Los ratones vacunaron mucosally con una M2 o partículas similares al virus (VLP) adyuvadas con toxina de cólera (TC) demostraron una mejor protección que los ratones sometidos a inmunización parenteral [14, 15]. Sin embargo, debido a los efectos adversos de la TC en humanos, los investigadores han intentado identificar subunidades no tóxicas con adyuvancia mediante la eliminación de la subunidad A o E. coli expresando la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) fusionada con el fragmento D de Staphylococcus aureus mostró los efectos adyuvante sin ninguna reactogenicidad de la subunidad A1 en la vacuna mucosa [6]. Aunque la conjugación química o genética de M2 puede no presentar M2 en su forma tetramérica nativa, antígenos de acceso extracelular expresados en las superficies de bacterias son mejor reconocidos por el sistema inmunitario que los que son intracelulares [17]. Por lo tanto, la elección del vehículo de distribución es también una preocupación importante para las posibles vacunas mucosas. Recientemente, se han estudiado bacterias de ácido láctico (LAB) que presentan antígenos del virus de la gripe [3, 18, 19]. Para la inmunización de la mucosa, LAB es un sistema de administración más atractivo que otros vectores de vacunas vivas, como Shigella Se considera seguro y presenta un efecto adyuvante sobre la inmunidad mucosal y sistémica [18, 22, 23]. El anclaje de la proteína diana a las superficies celulares del LAB está destinado principalmente a usarse en vacunas mucosales. La proteína transmembrana pgsA es uno de los complejos de poli-glutamato sintetasa de Bacillus subtilis [17, 24, 25], que es una proteína ancla bien estudiada es capaz de fusionar la proteína diana a su término C y estabilizar el complejo al anclarla en la membrana celular. Dado que el sM2 es un objetivo altamente conservado y prometedor para una vacuna universal y el CTA1 es fuerte adyuvante mucosa, en este estudio se desarrollaron constructos utilizando un gen sM2 de consenso reconstituido a partir del análisis de virus de la gripe H1N1, H5N1 y H9N2 (sin dominio transmembrana) con o sin fusión de CTA1. Para ello se utilizó un nuevo vector de expresión que puede expresar un producto del gen pgsA como matriz de anclaje. Nuestros antígenos objetivo, sM2 y CTA1, se mostraron en la superficie de Lactobacillus casei, y la administración oral o intranasal de respuestas inmunológicas sistémicas y mucosas inducidas por L. casei recombinantes que tienen el potencial de proteger contra los desafíos letales de subtipos de gripe divergentes. Un total de 672 ratones BALB/c hembra (5 semanas de edad) fueron comprados a Samtako (Seúl, Corea) y alojados en jaulas ventiladas. Los ratones fueron manejados con alimentación en pellets y agua del grifo ad libitum, mantenidos en un ambiente específico libre de patógenos y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento después de la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Corporación de Biolíderes, Daejeon, Corea del Sur, número de protocolo: BSL-ABLS-13-002. Las inmunizaciones de animales se realizaron en instalaciones de laboratorio de nivel de bioseguridad (BSL)-2. Los ratones se dividieron en 6 conjuntos experimentales, cada uno de los cuales constaba de 2 subconjuntos: 1 para administración oral y 1 para administración intranasal que contenía 4 grupos cada uno. De 6, 4 conjuntos tenían 14 ratones por grupo Uno de los grupos tenía 17 (3 ratones para histopatología pulmonar e inmunohistoquímica) y el último contenía 11 ratones por grupo (3 ratones para respuesta CTL). Las concentraciones de L. casei recombinante se determinaron por unidades formadoras de colonias (UFC). En cada subconjunto, 2 grupos recibieron 10 UFC de pgsA-sM2/L. casei o pgsA-CTA1-sM2/L. casei, y los otros dos grupos recibieron la misma concentración de pKV-pgsA/L. casei o PBS en 100 ml por vía oral a través de lavado intragástrico en los días 0 a 3, 7 a 9 y 21 a 23. Del mismo modo, 10 9 UFC de células recombinantes se administraron en 20 ml suspensiones en las fosas nasales de ratones ligeramente anestesiados en los días 0 a 3, 7 a 9 y 21. Se recogieron muestras de sangre del plexo retro-orbital en los días 21, 14 y 28; se separaron los sueros por centrifugación durante 5 minutos a 12.0006g y se almacenaron a 220uC hasta el análisis; al día 28, se sacrificaron al azar 3 ratones de cada grupo para recoger la muestra IgA de los pulmones y el intestino y se almacenaron a 270uC hasta el análisis; se recolectaron bazo asépticamente en el día 28 para el análisis de la respuesta CTL al azar de 3 ratones de un grupo; el resto de ratones del mismo grupo se mantuvieron durante 6 meses desde la fecha del último impulso para medir las respuestas inmunes duraderas y la eficacia de protección. Los virus de la gripe aviar A/EM/Korea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2), A/Aquatic bird/Korea/W44/2005(H7N3) y A/ Chicken/Korea/116/2004(H9N2) utilizados en este estudio fueron proporcionados amablemente por el Dr. Young-Ki Choi (College of Medicine and Medical Research Institute, Chungbuk National University, Cheongju, República de Corea). Todos los virus se propagaron en el líquido alantoico de embriones de pollo de 10 días de edad, y el 50% de dosis letales de ratón (MLD 50 ) se determinaron en ratones ingenuos BALB/ c de 8 semanas de Se infectó por vía intranasal a ratones con narcosis-anestesia de ether con 10 veces el MLD 50 de virus de desafío en 20 ml de PBS. Seis ratones en cada grupo fueron sacrificados en 3 y 5 dpi para comprobar el título del virus en los pulmones y otros 5 ratones permanecieron en cada grupo han sido utilizados para la supervivencia. Los ratones fueron monitorizados cada día alternativo en el punto de tiempo fijo para medir la pérdida de peso y supervivencia. Los ratones fueron eutanasiados si moribundos, es decir, pérdida de peso, pelaje escalonado, escalofríos, taquipnea, malestar respiratorio, hipotermia y poco sensibles a estímulos externos, quedando considerados como número de supervivencia. Después del monitoreo final, todos los ratones sobrevivientes fueron humanizados mediante inhalación de CO 2 durante 5 minutos. A los 180 días de la vacunación final, ratones de un conjunto fueron desafiados En este estudio, E. coli JM83 se utilizó para la clonación y L. casei L525 se utilizó para la expresión superficial de la proteína diana. Estas bacterias se cultivaron en los medios LB y MRS, respectivamente. El plásmido pKV-Pald-PgsA, que alberga los genes pgsA de Bacillus subtilis, se utilizó para construir el plásmido de visualización superficial, que fue un regalo amable de la Bioleaders Corporation (Daejeon, Corea del Sur). Se generó un gen que codifica la secuencia de consenso de M2 que abarca los residuos de los dominios extracelular y citoplasmático sin el dominio transmembrana del virus de la gripe. Las secuencias de consenso se crearon a partir de los aminoácidos más comunes en cada posición de la alineación de H1N1, H5N1 y H9N2; luego se sintetizaron y utilizaron como plantillas para la construcción de los plásmidos pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei por clonación, como se describió anteriormente [26, 27]. El gen sM2 fue modificado añadiendo un sitio Kpn I en el terminal 59 y Sal I en el terminal 39 para clonación. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó para amplificar el gen utilizando el par de imprimadores 59-GGGGACCTCTATTAACA-39, y 59-ACGTCGACT-CATTCAAGTTCAATAATG AC-39. Del mismo modo, un sitio BamH I en la terminal 59 y un sitio Kpn I en la terminal 39 fueron añadidos al gen CTA1 utilizando los imprimadores 59-CGGGATCCAAT-GATTATAT-39 y 59-GGGGT ACCGAT-GATCTTGAGC ATT-39. Los genes modificados se ligaron al Vector T Easy (Invitrogen, Seúl, Corea). Los genes fueron luego digeridos con Kpn I-Sal I para sM2 y BamH I-Kpn I para CTA1. El sM2 digerido fue ligado al plásmido vector pKV-pgsA para la construcción de pKV-pgsA-sM2. Del mismo modo, el CTA1 fue ligado para la construcción de pKV-pgsA-CTA1-sM2. Los productos ligados fueron transformados en células competentes E. coli JM83, como se describió anteriormente, utilizando un método de electroporación [17]. Los perfiles de los plasmidos recombinantes fueron confirmados por la digestión de restricción de endonucleasa y secuenciación de ADN (Solgent, Seúl, Corea). Después de la confirmación, los plásmidos fueron transformados en L. casei L525 por electroporación y llamados pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei Los genes de L. casei recombinantes que contienen pgsA, pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2 fueron cultivados a 30uC durante 48 horas. Las células fueron recolectadas por centrifugación a 6.0006g durante 10 minutos a 4uC, seguidas por lavado dos veces con solución salina estéril bufferada por fosfato (PBS). Los análisis bacteriales fueron realizados por sonificación y centrifugados a 12.0006g durante 20 minutos a 4uC. Las fracciones de pared celular y citoplasmáticas fueron separadas por centrifugación a 25.0006g a 4uC durante 2 horas. Los pellets (pared celular) fueron resuspendidos en 100 ml de sarcosol al 1% que contenía 1 mM de fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF, Sigma-Aldrich Para la detección inmunitaria de proteínas de fusión, las membranas fueron analizadas con toxina anticolera de conejo (1:2000, Abcam, UK), anticuerpos anti-pgsA (1:1000) y anti-M2 (1:1000). Los anticuerpos anti-pgsA y anti-M2 de conejo utilizados en este experimento fueron generados por la inoculación i.m. de pgsA KLH-conjugado o péptido M2 en conejo, respectivamente, dos veces a las 2 semanas-intervalo. Las membranas fueron reaccionadas con una dilución 1:10,000 de inmunoglobulina G anti-rabbit conjugada con peroxidasa de rábano (IgG HRP). Finalmente, las proteínas diana fueron detectadas mediante el sistema de detección WEST-ZOL plus Western Blot (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do, Corea) y visualizadas mediante la mejora de la quimioluminiscencia (ECL) [17, 26, 28]. Para investigar la expresión de sM2 o CTA1-sM2 en la superficie de L. casei, L. casei recombinante se cultivaron en 30uC durante 48 horas en el caldo MRS. Las bacterias se cosecharon mediante centrifugación a 5.0006g durante 10 minutos a 4uC, se lavaron tres veces con solución salina estéril fosfatada que contenía 0,01% Tween-20 (PBST) y se probó con anticuerpo anti-TC del conejo policlonal durante la noche. Después de otro lavado, las células fueron tratadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) anticuerpos anti-rabbit IgG (Burlingame, CA, EE.UU.) durante 2 horas. Finalmente, 10.000 células fueron analizadas por citometría de flujo (Becton Dickinson, Oxnard, CA, EE.UU.). Para la inmunofluorescencia, las células fueron preparadas bajo la misma condición descrita para la citometría de flujo. El pgsA/L. casei fue utilizado como control negativo y el análisis de inmunofluoresencia fue examinado mediante un microscopio de fluorescencia Carl Zeiss Axioskop 2. En primer lugar, las placas inmunosorbentes de 96 pocillos (Nunc) fueron incubadas con 300 ng/proteínas sM2 bien purificadas o CTA1 a 4uC durante la noche. Las proteínas sM2 y CTA1 recombinantes utilizadas en este estudio fueron purificadas a partir de E. coli. A continuación, los pozos fueron bloqueados con leche descremada al 10% durante 2 horas en RT, lavada cinco veces con PBST, tratada con muestras de suero diluido (1:200) en triplicado para detectar IgG y tejido homogeneizado sin diluir, sobrenadante para detectar IgA local e incubada durante 2 horas a 37uC. Después de lavar tres veces, se añadió IgG HRP (1:1000, sigma) o antimouse IgA a cada pozo e incubada Después de otra ronda de lavado, las placas fueron reaccionadas con la solución de sustrato que contenía tetrametilbencidina y H 2 O 2 y se les permitió preceder la reacción durante 10 minutos. Después de añadir la solución de parada 2N-H 2 SO 4, la densidad óptica (OD) se midió a 450 nm utilizando un autolector ELISA (dispositivos moleculares). El desarrollo y recuento de citoquinas fueron realizados por ELISPOTs, como se describió anteriormente [31, 32]. Brevemente, el día antes del aislamiento de los esplenocitos, las placas ELISPOT 96-well fueron recubiertas con anticuerpos antimouse monoclonal IFN-c e IL-4 de captura (5 mg/ml) en PBS e incubadas a 4uC durante la noche. Las placas fueron lavadas con PBS, y 200 ml/pozo de solución de bloqueo que contenía el medio RPMI 1640 completo y 10% de suero fetal bovino, se añadieron (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) e incubadas durante 2 horas en RT. Los bazozos de los ratones vacunados se aislaron asépticamente y se añadieron a 5610 4 células/pozo en medios que contenían proteína sM2, péptido M2 (SLLLTEVETPTRNGWECKCSD) (1 mg/pozo), solo medio (control negativo), o 5 mg/ml fitohemaglutinina (control positivo, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Después de añadir células y estimuladores, las placas fueron incubadas durante 24 horas a 37uC con 5% de CO 2. Las placas fueron tratadas secuencialmente con anticuerpos IFN-c e IL-4 biotinilados antimouse, peroxidasa de estreptavidinhorse rábano y solución de sustrato. Finalmente, los puntos fueron contados utilizando un analizador InmunoScan Entry (Tecnología Celular, Shaker Heights, EE.UU.). Los pulmones fueron recolectados asépticamente, y los títulos del virus fueron determinados por dosis infecciosas de cultivo tisular 50% (TCID 50 ), como se describió anteriormente [33]. Brevemente, los tejidos pulmonares fueron homogenizados en 500 ml de PBS que contenían antibióticos (penicilina y estreptomicina) y compuestos antimicóticos (Fungizone) (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se centrifugaron muestras pulmonares homogeneizadas mecánicamente Las células MDCK fueron inoculadas con una muestra diluida en serie de 10 veces e incubadas a 37uC en una atmósfera húmeda de 5% de CO 2 durante una hora. Después de la absorción, se extrajo el medio y se incubado durante 72 horas el medio que contenía L-1-tosilamido-2-feniletilclorometilcetona (TPCK) tripsina (Thermo Fisher Scientific, Rockford, EE.UU.) se añadió a las células infectadas y se observaron efectos citopáticos virales diarios, y los títulos fueron determinados por la prueba de HA. El título viral de cada muestra se expresó en dosis de 50% de tejido infectado mediante el método Reed-Muench [34]. Para la histopatología, los tejidos pulmonares fueron recolectados en 5 dpi de ratones con narcosis-anestesia de éter. Los tejidos se fijaron inmediatamente en formalina del 10% que contenía tampón neutro, incrustado en cera de parafina, seccionado a un espesor de 4-6 mm mediante una máquina de microtomo, montada en diapositivas y manchada con tinción de eosina. Los cambios histopatológicos se examinaron mediante microscopía ligera, como se ha descrito anteriormente [29, 30, 35]. Además, las diapositivas se mancharon utilizando un método de inmunoperoxidasa con un anticuerpo (anti-M2, 1:500) dirigido contra la proteína matriz-2 del virus influenza A. Se utilizó un IgG HRP (1:2000, Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) como anticuerpo secundario para la detección de células infectadas por el virus en los tejidos respectivos [57]. Los datos se presentan como media 6 desviaciones estándar (S.D.) y son representativos de al Las diferencias entre los grupos fueron analizadas por análisis de varianza (ANOVA), y los medios fueron comparados por la prueba t de Student. Los valores de P inferiores a 0,05 fueron considerados como significativos. Los resultados del porcentaje de peso corporal inicial también fueron comparados por la prueba t de Student. La comparación de supervivencia se realizó mediante prueba de rango logarítmico utilizando la versión 6 de GraphPad Prism. El vector de expresión pgsA se utilizó para construir plásmidos que contenían el gen sM2 de consenso altamente conservado, con (pgsA-CTA1-sM2) o sin (pgsA-sM2) la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1, Fig. 1A ). Los plásmidos se transformaron en células L. casei. Los niveles de expresión de los anticuerpos policlonales pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2 fueron monitorizados por inmunoblote mediante anticuerpos anti-pgsA, anti-M2 o anti-CT (datos no mostrados). Para determinar la localización celular de las proteínas sM2 y CTA1 expresadas en la superficie de L. casei a través de las proteínas de anclaje de pared celular pgsA, membrana y fracciones citoplásmicas fueron sometidas a análisis de blot occidental. Como era de esperar, tanto las proteínas de fusión pgsA-sM2 como las proteínas pgsA-CTA-CTA-sM2 fueron detectadas por anticuerpos anti-pgsA, anti-M2 o anti-CT policlonales en la membrana, no en fracciones citoplásmicas (fig. 1B, carril 2, 3 y Se realizaron inmunoreacciones con anti-pgsA y bandas que representaban el tamaño de las proteínas fusionadas pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2, mientras que durante las reacciones con anticuerpos anti-M2 o anti-CT, no se detectaron otras bandas (Fig. 1B, carril 3 y 4). Este hallazgo puede haber sido resultado de la degradación que se produce durante el procedimiento de fraccionamiento de membrana. Se utilizó la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) e inmunofluorescencia de las células para verificar la localización de la proteína de fusión pgsA-sM2 y pgsA-CTA-CTA2 en la superficie de L. casei. El análisis citométrico de flujo con anticuerpos anti-M2 y anti-CT reveló un aumento del nivel de intensidad de fluorescencia de pgsA-sM2/L Las células casei o pgsA-CTA1-sM2/L., en comparación con las células casei de control L. casei (Fig. 1C ). La microscopía de inmunofluorescencia también mostró bacterias recombinantes que albergaban pgsA-sM2 o pgsA-CTA1-sM2 que inmunosentaban positiva para sM2 y CTA1, pero esto no se encontró en las células de control. Estos resultados demostraron que L. casei recombinante podía mostrar eficientemente las proteínas de fusión sM2 y CTA1-sM2 en la superficie, utilizando pgsA como proteína ancla de membrana. Para caracterizar la inmunogenicidad de los sM2 de L. casei y los sM2 de CTA1conjugados, los ratones BALB/c fueron inmunizados nasalmente (10 dosis de 9 células/20 ml) o por vía oral (10 dosis de 10 células/100 ml) con pgsA-sM2/L. casei y bacterias pgsA-CTA1-sM2/L. casei recombinantes. Como control negativo, los ratones fueron inmunizados con L. casei albergando el plásmido parental pKV-pgsA (pgsA/L. casei) y PBS. Las muestras séricas fueron recogidas a los 0, 14 y 28 días y analizadas por ELISA, utilizando proteínas sM2 y CTA1 (purificadas a partir de E. coli) como antígeno de recubrimiento. Después de la primera serie de inmunización, se detectaron niveles comparativamente bajos de IgG sérico tanto en el grupo inmunizado i.n. como en el grupo inmunizado oral. Sin embargo, se detectaron altos niveles de anticuerpos poco después de la segunda serie de inmunización, y el grupo sM2 conjugado con CTA1 indujo IgG sérico a un nivel significativo, comparado con el grupo sM2 y los controles negativos (fig. 2A y B). Aunque se esperaba que la conjugación de CTA1 con sM2 tuviera una función adyuvante solamente, se detectó un nivel significativo de anticuerpos anti-CTA1 tanto en las vacunas nasales como orales (fig. 2A y B derecha). En comparación con el grupo oral, el grupo inmunizado nasalmente mostró niveles más altos de IgG sérico específicos de sM2 y CTA1. Para evaluar las respuestas Los tejidos pulmonares e intestinales fueron recolectados en el día 28 de la inmunización y examinados utilizando proteína sM2 como antígeno de recubrimiento. En ambas vías de vacunación, pgsA-CTA1-sM2/L. casei indujo niveles significativamente mayores de sM2 mucosal IgA en comparación con los grupos pgsA-sM2/L. casei y control. Sin embargo, como era de esperar, se detectaron niveles más altos de títulos de anticuerpos en el lugar de inoculación que en el sitio remoto. Se observó un patrón similar de respuestas de anticuerpos para ambas vías de inmunización, en las que predominaron los grupos pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 2C y D). Estos datos demostraron que la subunidad de toxina de cólera A1 conjugada sM2 dio lugar a aumentos significativos en los niveles específicos de IgG y IgA mucosal de sM2 comparados con la sM2 sola o con controles inmunizados con pgsA/ L. casei o PBS. Inmunización mucosa con L. casei La sM2 y la CTA1-sM2 estimuladas M2 específicas para la respuesta inmune celularPara determinar si la vacunación mucosal con L. casei en superficie displayed sM2 y CTA1 conjugadas sM2 podría inducir inmunidad celular, se realizaron IFN-c e IL-4 ELISPOT. Se esplenocitos de ratones vacunados fueron estimulados con 10 mg/ml de proteína sM2 recombinante o péptido M2 y se desarrollaron los ELISPO Los puntos fueron contados para medir las diferencias en las respuestas CTL entre los grupos. Las células de los ratones inmunizados i.n. con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron niveles significativos de IFN-c en respuesta a la estimulación con proteína sM2 y péptido M2 (Fig. 3A). De igual manera, observamos que los grupos administrados i.n. tanto para pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron niveles detectables de esplenocitos IL-4 que secretaban tras la estimulación con proteína sM2 o péptido M2 (Fig. 3B). También se observaron células secretantes IFN-c e IL-4 en ratones inmunizados oralmente con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei (Fig. 3C ) aunque sus niveles fueron inferiores al grupo i.n. y no fueron significativos. El grupo de control inmunizado con pgsA/L. casei mostró un nivel de fondo puntual para ambos grupos intranasal y oral. Estos hallazgos indican que sM2 altamente conservado puede inducir respuestas de células T secretas específicas de IFN-c e IL-4 de M2, mientras que el parto de mucosas a través de L. casei y CTA1 con sM2 realzó la inmunidad mediada por la célula, lo que puede contribuir a ampliar la inmunidad protectora. M2 es conocido como un objetivo potencial para el desarrollo de la vacuna contra la gripe de amplio espectro con variabilidad mínima [36, 37]. Para confirmar la variabilidad de las secuencias de sM2 de los virus desafiados utilizados en este estudio, se comparó el sM2 de subtipos de gripe disponibles en el Centro Nacional de Información Biotecnológica de EE.UU. (NCBI) con nuestra secuencia de consenso sM2 particularmente el entero ecto conservado y alguna porción del dominio citoplásmico (CD), aunque la CD entera fue incluida en el constructo de la vacuna (Tabla 1). Encontramos que los virus utilizados en este estudio contienen 0-8 aminoácidos desfasados entre los aminoácidos de sM2 comparados en este estudio. Para evaluar la eficacia de la vacuna sM2, semana después de la inmunización final, los ratones fueron desafiados i.n. con el 10 MLD 50 de A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2) subtipos Los ratones inmunizados oralmente con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron protección del 40 y 60% respectivamente. Asimismo, los grupos de inmunización conferían 40 y 80% contra la infección letal con el virus H5N2 altamente virulento. En contraste, ninguno de los ratones no inmunizados sobrevivió después de la infección letal (fig. 4A y B, panel derecho). La morbilidad aumentó en los ratones inmunizados por vía oral, mientras que los ratones que recibieron inmunización con pgsA-CTA1-sM2/L. perdieron el 20% de su peso corporal inicial y comenzaron a recuperarse por la infección de 9 días después (dpi) y se recuperaron completamente para el día 13 (fig. 4A y B, panel izquierdo). A continuación se evaluó la eficiencia de protección de la vacuna sM2 candidata frente a A/Puerto Rico/8/34(H1N1), que contiene 8 aminoácidos desfasados en relación con la secuencia de consenso de sM2. Se desafiaron conjuntos de ratones vacunados con 10 MLD 50 del virus H1N1. Como se muestra en la figura 4C y D, los ratones inmunizados por los ratones fueron agrupados como se menciona en materiales y métodos y recibieron administraciones orales o nasales, de acuerdo con el calendario. Las flechas indicaron las rutas de inmunización y los períodos de pgsA/L. casei, pgsA-sM2/L. casei o pgsA-CTA1-sM2/L. células casei. Se recogieron seras en los días 0, 14 y 28; se recolectaron muestras de los pulmones e intestinos en el día 28 después Una semana después de la inmunización final, se extrajeron bazos de 3 ratones en cada grupo, con un conjunto para el análisis de CTL. Dos o 24 semanas después de la última inmunización, todos los ratones fueron desafiados con una dosis letal de subtipos de gripe a través de la ruta intranasal y monitoreados durante 13 días. Los días 3 y 5 post infección, los pulmones fueron extraídos de 3 ratones en cada grupo para determinar el título del virus. doi:10.1371/journal.pone.0094051.g001 CTA1-sM2 Induce inmunidad protectora a virus patógenos de gripe A PLOS ONE www.plosone.org i.n ruta mostró un nivel de protección más alto que los grupos inmunizados por vía oral, y ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron un nivel de protección significativamente más alto que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei (fig. 4C y D, panel derecho). Los ratones inmunizados perdieron hasta el 40% de su peso corporal y murieron por 9 dpi. casei perdió el 20% de su peso corporal inicial por 9 dpi y se recuperó más lentamente que los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 4C y D, panel izquierdo). Otro grupo de ratones vacunados fueron infectados con A/Chicken/ Corea/116/2004(H9N2) para comprobar el rango de capacidad de protección de la vacuna sM2 indujo respuestas inmunitarias. La secuencia sM2 de H9N2 contiene 2 desajustes en relación con la secuencia de consenso sM2. Los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron una pérdida de peso corporal insignificante y una recuperación gradual en comparación con los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei y los ratones no vacunados tanto para la vía oral (fig. 4E Ninguno de los ratones no inmunizados sobrevivió, mientras que el 100% y el 80% de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei a través de la vía intravenosa y oral sobrevivieron, respectivamente. Las tasas de supervivencia de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei fueron del 80% y 60% para la vía intravenosa y oral, respectivamente (fig. 4E y F, panel derecho). También se evaluó la amplitud de protección de la vacuna sM2 contra subtipos de gripe divergentes. Conjunto de ratones inmunizados fueron desafiados con gripe aviar de alta patogenicidad (HPAI) A/ EM/Korea/W149/06(H5N1), que contiene 2 desajustes de aminoácidos en relación con la secuencia de consenso sM2. y las vías orales con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron mayor eficacia de protección, 80% y 60%, respectivamente, en comparación con los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, para los cuales las tasas fueron de 60% y 20%, respectivamente (fig. 4G y H, panel derecho). Respecto a la morbilidad, los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron menor morbilidad que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei (fig. 4G y H, panel izquierdo). Un grupo más de ratones vacunados fueron desafiados con el virus A/Acuático/Corea/W44/2005 (H7N3), que contiene 1 desajuste en relación con la secuencia de consenso sM2, y se observó el peso Como se muestra en la figura 4I y J, los ratones no inmunizados perdieron hasta el 30% de su peso corporal que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 4I y J, panel izquierdo). Los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei a través de la ruta de la i.n mostraron un nivel de protección significativamente más alto contra el virus de la gripe H7N3 que los demás grupos (fig. 4I y J, panel derecho). Tomados en conjunto, los resultados indican que la inmunización con pgsA-CTA1-sM2/L. Las respuestas inmunitarias inducidas por casei que conferían niveles significativos de protección frente a subtipos divergentes de virus de la gripe que contenían aminoácidos desfasados que oscilaban entre 0 y 8 del consenso sM2, independientemente de si era completa o parcial. Se midieron títulos de virus en los pulmones de ratones desafiados para estimar su replicación a 3 y 5 dpi. Los ratones fueron vacunados a través de las vías i.n y oral con subtipos de gripe pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei y desafiados con los subtipos H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 o H7N3. En 3 y 5 dpi, 3 ratones fueron sacrificados al azar de cada grupo, y sus títulos de virus pulmonar fueron medidos utilizando el método casei tenía títulos inferiores a 3 dpi y había reducido significativamente la replicación viral a 5 dpi en comparación con ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei o los grupos control al mismo tiempo (fig. 5A-J). Se observaron títulos virales reducidos en los pulmones en grupos de ratones inmunizados por vía intravenosa en relación con los ratones inmunizados por vía oral, especialmente en el día 3 post infecciones (fig. 5). Estos títulos reducidos pueden deberse a que las vías de vacunación y el desafío son los mismos, y los títulos se correlacionaron con los resultados de supervivencia para infecciones letales con H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 y H7N3. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el consenso de proteína sM2 fusionada con CTA1 proporcionó una mejor protección que sM2, y la vía i.n fue más potente que la vía oral de inmunización con respecto a la protección contra un desafío letal de subtipos de gripe divergentes. Se realizó histopatología e inmunohistoquímica para corroborar los hallazgos del título del virus pulmonar. A los 5 dpi, los pulmones fueron recogidos aleatoriamente de cada grupo de un conjunto, fijos y manchados con eosina antes de ser examinados bajo un microscopio ligero. Como se muestra en la figura 5K, se observaron signos claros de inflamación pulmonar profunda en los pulmones de ratones tratados con PBS o pgsA/L. casei para las vías de administración oral e i.n, mientras que los pulmones de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. Para la inmunohistoquímica, se utilizó el método de la inmunoperoxidasa con un anticuerpo dirigido contra la proteína matriz-2 del virus influenza A para la detección de células infectadas por virus en los tejidos respectivos. El antígeno del virus en las células epiteliales aparece como coloración marrón del núcleo y citoplasma. Como se muestra en la figura 5K, a los 5 días p.i., se detectaron numerosas células infectadas por virus en ratones vacunados con control o pgsA-sM2/L. casei, mientras que se encontró un número muy reducido de células positivas de antígeno en los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, tanto en el grupo vacunado por vía oral como en el grupo vacunado por vía oral (fig. panel derecho 5K). Estos resultados indican que los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei desarrollaron respuestas inmunitarias lo suficientemente fuertes como para inhibir la replicación viral, lo que promueve la supervivencia de los ratones tras una infección letal por influenza A. La vacuna PgsA-CTA1-sM2/L. casei indujo protección cruzada duraderaLa duración de la protección es un criterio importante para una posible vacuna. Así, la longevidad de la inmunidad inducida por sM2 y CTA1 conjugado sM2 fue investigada mediante la detección de IgG sérico e IgA mucosal por ELISA. Se observó un aumento significativo de los niveles de IgG sérico específico de sM2, así como de IgA pulmonar e intestinal 180 días después de la vacunación (fig. 6A y C) en comparación con los grupos PBS y pgs Los ratones fueron desafiados con A/ ave acuática/Corea/W81/2005(H5N2), y los cambios en el peso corporal y la supervivencia fueron monitoreados hasta 13 dpi. Los ratones no vacunados mostraron pérdida de peso corporal del 30% (Fig. 6B y D panel izquierdo) y murieron al día 9 post infección tanto en el grupo oral como en el grupo i.n. En contraste, los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron pérdida de peso corporal insignificante, que fue recuperada por 13 dpi; el 80% sobrevivió en el grupo inmunizado de i.n. (Fig. 6B panel derecho) y el 60% sobrevivió en el grupo inmunizado oral (Fig. 6D panel derecho). Este resultado indica que la vacuna CTA1conjugada sM2 mucosal confirió protección contra una infección letal 6 El sistema inmunológico mucosal es la primera barrera inmunológica contra los patógenos que invaden el cuerpo a través de la superficie mucosal. Así, la inducción de la inmunidad mucosal es necesaria para garantizar la protección contra múltiples subtipos del virus influenza A. Un virus respiratorio, la gripe A es responsable de epidemias estacionales anuales en todo el mundo y, ocasionalmente, pandemias, que son causadas por nuevos subtipos o cepas emergentes derivados del reasociamiento con virus aviares o porcinos. Las vacunas actuales contra la gripe proporcionan únicamente protección específica para las cepas. Por lo tanto, es crucial establecer una vacuna contra la gripe ampliamente cruzada. Los antígenos bien conservados entre la gripe Los virus A se consideran objetivos prometedores para la inducción de la protección cruzada contra estos diferentes subtipos. Sin embargo, el objetivo debe ser el desarrollo de una primera línea de defensa mediante la eliminación efectiva de patógenos en la superficie mucosa. La proteína 2 de la matriz de la gripe (M2) está relativamente bien conservada entre los subtipos de gripe y puede considerarse un antígeno prometedor de la vacuna contra la gripe [30]. Consta de los tres siguientes dominios estructurales: un dominio extracelular de 24-aminoácidos, un dominio transmembrana de 19-aminoácidos y un dominio de cola citoplasmática de 54-aminoácidos [39, 40]. En este estudio se utilizaron los dominios extracelulares y citoplasmáticos, bien conservados entre los virus de la gripe y que desempeñan un papel importante en el ensamblaje viral y la morfogénesis. Aquí se desarrolló el consenso sM2 derivado del análisis de secuencias de subtipos H5N1, H1N1 y H9N2 en la base de datos. Considerando los hallazgos previos de que el dominio extracelular particularmente (aa, 1-13) es altamente conservado entre los subtipos del virus de la gripe y reconocido como epítopo para la inducción de anticuerpos monoclonales, lo que podría proteger la infección por el virus de la gripe [56], se utilizó la secuencia vertebral sM2 del virus H5N1; para la posible homología entre otros subtipos cambiamos en la posición de 14 (E-G) y 18 (R-K) y mantuvimos sin cambios el epítopo conservado (aa, 1-13). Como se muestra en la alineación secuencial, la secuencia sM2 de consenso tiene desajustes de 0-8 entre los subtipos utilizados en este estudio (tabla 1). Además, la incorporación de un adyuvante se considera esencial para impulsar la interacción de la vacuna con el sistema inmunológico mucosa [41]. Varios adyuvantes, como liposomas, nanopartículas y complejos inmunoestimulantes (ISCOMs), han sido estudiados y han sido encontrados para mejorar la respuesta inmune [42], pero su eficacia no fue óptima. A pesar de su potencial como adyuvante mucosa [43], el uso de la toxina del cólera (TC) en las vacunas está limitado por su toxicidad innata, por lo que la toxicidad de la TC tendría que separarse de su adyuvante antes de poder ser utilizada como adyuvante vacunal. Estudios han demostrado que los constructos consistentes en M2e fusionados con la subunidad de toxina del cólera A1 junto con un fuerte agente ADpremilante y un dímero de la D-fragmento de la proteína Staphylococcus aureus Una vacuna provocó protección completa y morbilidad reducida [6, 44]. La CTA1 mantiene la función adyuvante de la TC sin sus efectos secundarios tóxicos, como la reactogenicidad en el lugar de su administración y la unión o acumulación en los tejidos nerviosos [45]. Basándose en hallazgos previos, se ha supuesto que el fragmento de consenso sM2, cuando se fusiona con el potente adyuvante mucosal CTA1, puede inducir una amplia inmunidad protectora contra subtipos divergentes del virus de la gripe. En este estudio se utilizó la proteína total CTA1 de 22 kDa (una ribosiltransferasa ADP), que consta de tres subdominios distintos: CTA11 (residuos 1 a 132), CTA12 (residuos 133 a 161) y CTA13 (residuos 162 a 192). Se ha informado que la CTA1 carece de CTB tiene actividades adyuvantes fuertes sin toxicidad alguna. Para el desarrollo de una vacuna universal contra la gripe mucosa con un péptido de sM2 conservado y potente adyuvante CTA1, L. casei recombinante muestra sM2 fusionado con o sin CTA1Los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron alvéolos claros sin infiltración celular inflamatoria, en contraste con los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-sM2/L. casei o ratones de control, los cuales revelaron características de neumonitis grave (panel medio e izquierdo).Se detectó un número reducido de antígenos virales en los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, en contraste con los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-sM2/L. Los microgramas son representativos para cada grupo de tratamiento a una ampliación de 200X. El antígeno del virus en las células epiteliales aparece como coloración marrón del núcleo y citoplasma. En los títulos pulmonares, las barras denotan una media de 6 S.D. El asterisco indica una diferencia significativa entre pgsA-CTA1-sM2/L. casei y otros grupos (*P,0.05). doi:10.1371/journal.pone.0094051.g005 fueron construidos para el parto de mucosas por el vehículo de vacuna viva ampliamente utilizado LAB [38]. El gen pgsA utilizado en este estudio es un ancla para la visualización en la superficie de LAB que se deriva del complejo enzimático pgsBCA de Bacillus subtilis y consiste en dominio transmembrana cerca de su N-terminal con el dominio ubicado en el exterior de la membrana celular. Así, pgsA es capaz de cruzar la pared celular y mostrar la proteína heteróloga fusionada a su C-terminal [17]. Las vacunas desarrolladas se probaron a través de dos rutas principales. Encontramos que la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei fue capaz de inducir un nivel significativamente más alto de sM2 específico IgG sérico ( Fig. 2A y B ) y mucosa IgA (Fig. 2C y D) en comparación con pgsA-sM2/L. casei, y confiriendo protección contra subtipos de gripe divergentes del grupo filogenético 1 (H1, H5, H9) y del grupo 2 (H7) [46] (Fig. 4). Este estudio también reveló que la administración de i.n. fue superior a la vía oral de vacunación, lo que es consistente con otras observaciones [48]. Puede haber dos posibles razones para explicar este fenómeno. Primero, la vía de desafío es la misma que la de la vacunación; la mucosal IgA específica puede prevenir la colonización viral en el tracto respiratorio. Segundo, el volumen de la inocula fue 5 veces menor que el de la inoculación oral, lo que puede haber permitido presentar la forma concentrada del antígeno a las células inmunes. Debido a que se detectaron mayores niveles de IgG sérico e IgA mucosal en ratones inmunizados intranasalmente que en los inmunizados oralmente (fig. 2), una explicación alternativa podría ser que los antígenos se procesan y/o se presentan de manera diferente a las células inmunitarias en los dos compartimentos de la mucosa. Es importante destacar que nuestro estudio demostró por primera vez que la inmunización de la mucosa con la vacuna basada en sM2 con TCA1 presentada en la superficie de LAB induce una amplia protección contra el desafío con subtipos de gripe divergentes. Sin embargo, el mecanismo por el cual Abs contra sM2 mediaba esta amplia protección no se entiende plenamente. Estudios anteriores han demostrado que Abs a la N-terminal de M2e, particularmente posiciones 1-10, inhibió la replicación del virus influenza A [49, 50]. Otros estudios revelaron que la citotoxicidad celular mediada por IgG anti-M2e o fagocitosis puede inducir la eliminación de células infectadas antes de que el virus de la progenie florezca y se propague [54, 55] que está apoyando nuestros hallazgos del título del virus pulmonar y los datos inmunohistoquímicos detectados a 5 dpi en nuestros experimentos de desafío. Por lo tanto, en este estudio, la combinación de esas respuestas y Abs a la secuencia N-terminal de la secuencia sM2 que se conserva entre los virus de desafío (Tabla 1 ) puede proteger los subtipos de gripe divergentes después de la inmunización mucosa con la vacuna recombinante LAB CTA1 basada en M2. Además, la respuesta inmune celular juega un papel importante en el control de la replicación viral. Examinamos las respuestas de citoquina Th1 (IFN-c) y Th2 (IL-4) por Se detectaron niveles significativamente más altos de IFN-c en respuesta a la estimulación con la proteína sM2 y el péptido M2 en ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei en comparación con los niveles en ratones en los grupos de pgsA-sM2/L. casei y control (fig. 3A y C). Asimismo, se observaron niveles sustancialmente más altos de IL-4 en ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei tras la estimulación con la proteína sM2 y el péptido M2 (fig. 3B y D). Estos resultados apoyan aún más los hallazgos de que los anticuerpos y la citotoxicidad mediada por células fueron específicos del antígeno M2 y que sus actividades antivirales fueron inducidas por M2 monomérico, tres copias de M2 fusiona En conjunto, estos resultados indican que la M2 adyuvada con CTA1 fusionada indujo respuestas inmunitarias en ratones, lo que los protegió de subtipos de gripe divergentes. En este sentido, nuestros resultados tienen significancia para el uso de CTA1, que tiene función adyuvante, en candidatos vacunales. Como la protección clínica no es el único parámetro por el cual se evalúa el desempeño de la vacuna, se evaluó la inmunogenicidad de la vacuna LAB recombinante sobre la base de otros parámetros, como la reducción de lesiones patológicas y la eliminación del virus. En este estudio, los títulos bajos del virus de desafío fueron valorados desde los pulmones después de la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, mientras que el virus de desafío podría ser detectado en títulos superiores en ratones simulados y los vacunados con pgsA-sM2/L. casei (Fig La reducción de las lesiones groseras y histopatológicas consistentes con la infección viral son los principales parámetros indicativos de la eficacia de la vacuna antigripal. Aquí, demostramos que la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei limitó notablemente la gravedad del daño al inhibir la replicación viral y la acumulación de células inflamatorias y antígenos virales en los tejidos alveolares pulmonares, en relación con la gravedad en ratones no inmunizados y ratones vacunados con pgsA-sM2/L. casei (Fig. 5K). Nuestro estudio demostró además, por primera vez, que L. casei recombinante que expresaba la inmunidad CTA1-sM2 inducida de larga duración y confería protección contra infecciones letales por gripe, incluso a los 6 meses de la vacunación final (Fig. 6), que es importante para cualquier vacuna exitosa. Se observaron resultados similares en estudios previos, en los que la M2 VLP confería inmunidad a largo plazo y protección cruzada y los anticuerpos en los sitios sueros y mucosas eran de larga vida [53, 54]. En conclusión, nuestros hallazgos revelaron que la inmunización mucosal de ratones con L. casei recombinante que expresaba CTA1conjugado sM2 puede inducir respuestas inmunes sistémicas y locales, así como celulares mediadas, contra subtipos divergentes del virus de la gripe. Así, la L. casei recombinante que expresaba CTA1conjugado consenso sM2 vacuna mucosal puede ser una vacuna prometedora candidata para la preparación para la pandemia de gripe.

¿Qué se considera esencial para aumentar la interacción de la vacuna antigripal con el sistema inmunológico de la mucosa?

La vacuna contra la gripe recombinante Lactobacillus casei-Displayed CTA1-Conjugated Consensus Matrix Protein-2 (sM2) induce una amplia protección contra los subtipos de gripe divergente en BALB/c Micehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3979752/SHA: efaa556b484fbcd9cc34832ffac53ef3e8334e9c0Autores: Chowdhury, Mohammed Y. E.; Li, Rui; Kim, Jae-Hoon; Park, Min-Eun; Kim, Tae-Hwan; Pathinayake, Prabuddha; Weeratunga, Prasanna; Song, Man Ki; Son, Hwa-Young; Hong, Se casei) o sin (pgsA-sM2/L. casei) subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) en la superficie. La localización superficial de la proteína de fusión fue verificada mediante análisis de fraccionamiento celular, citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia. Inoculaciones orales y nasales de L. casei recombinante en ratones dieron lugar a altos niveles de inmunoglobulina sérica G (IgG) e IgA mucosal. Sin embargo, la conjugación de la subunidad de toxina de cólera A1 indujo respuestas inmunes más potentes de mucosa, humoral y mediadas por células. En una prueba de desafío con 10 MLD(50) de A/EM/Corea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/Ave acuática /Corea/W81/2005(H5N2), A/Ave acuática/Corea/W44/2005(H7N3) y virus A/Chicken/Corea/116/2004(H9N2), los pgsA-CTA1-sM2/L. casei recombinantes proporcionaron una mejor protección contra los desafíos letales que pgsA-sM2/L. casei, pgsA/L. casei y PBS en ratones. Estos resultados indican que la inmunización mucosal con L. casei recombinante que expresa la proteína sM2 conjugada con CTA1 en su superficie es un medio eficaz para obtener respuestas inmunes protectoras contra diversos subtipos de gripe. Texto: La vacunación sigue siendo el medio más económico y eficaz contra las enfermedades respiratorias causadas por virus de la gripe [1]. Con base en los virus que circulan en la población, se han desarrollado cepas de vacunas trivalentes que se utilizan para la protección del virus de la gripe [2]. La estrategia actual más aceptable es la administración intramuscular de vacunas inactivadas producidas por sistemas de fabricación a base de huevos que, si bien son eficaces, se ven obstaculizadas por una capacidad y flexibilidad limitadas [3]. Sin embargo, las cepas vacunales deben adaptarse con frecuencia para adaptarse a los virus circulantes en todo el mundo [4]. Además, se ha observado que los niveles de anticuerpos inducidos por la vacuna in Por lo tanto, las estrategias alternativas para el desarrollo de vacunas ampliamente cruzadas, seguras y eficaces contra las infecciones virales de la gripe son de gran importancia. La proteína matriz 2 (M2) está muy conservada entre las cepas del virus influenza A, lo que indica que M2 es un objetivo atractivo para el desarrollo de una vacuna universal [6]. En estudios anteriores, se han desarrollado y probado varios constructos de la vacuna M2, incluyendo escherichia coli recombinante (E. coli) que expresa la proteína de fusión M2, vectores adenovirales que expresan la proteína M2, codificación de ADN plasmido M2 [7] [8] [9] y péptidos que codifican M2e [11], cada uno de los cuales fue capaz de generar respuestas inmunes protectoras en ratones. Sin embargo, el inconveniente de estas vacunas basadas en M2 es su baja inmunogenicidad; además, la mayoría de ellas requeriría inyecciones intramusculares. Por lo tanto, se han aplicado muchas estrategias centradas en el aumento de la inmunogenicidad de las vacunas basadas en M2, por ejemplo, la fusión de M2 con diferentes moléculas portadoras como la proteína L del virus del papiloma humano [12], la hemocianina de la cojera del ojo clave [10] y la flagellina [13]. Además, se han aplicado vacunas con diferentes adyuvantes y vías de administración para evaluar su protección contra cepas divergentes de virus de la gripe. Los ratones vacunaron mucosally con una M2 o partículas similares al virus (VLP) adyuvadas con toxina de cólera (TC) demostraron una mejor protección que los ratones sometidos a inmunización parenteral [14, 15]. Sin embargo, debido a los efectos adversos de la TC en humanos, los investigadores han intentado identificar subunidades no tóxicas con adyuvancia mediante la eliminación de la subunidad A o E. coli expresando la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) fusionada con el fragmento D de Staphylococcus aureus mostró los efectos adyuvante sin ninguna reactogenicidad de la subunidad A1 en la vacuna mucosa [6]. Aunque la conjugación química o genética de M2 puede no presentar M2 en su forma tetramérica nativa, antígenos de acceso extracelular expresados en las superficies de bacterias son mejor reconocidos por el sistema inmunitario que los que son intracelulares [17]. Por lo tanto, la elección del vehículo de distribución es también una preocupación importante para las posibles vacunas mucosas. Recientemente, se han estudiado bacterias de ácido láctico (LAB) que presentan antígenos del virus de la gripe [3, 18, 19]. Para la inmunización de la mucosa, LAB es un sistema de administración más atractivo que otros vectores de vacunas vivas, como Shigella Se considera seguro y presenta un efecto adyuvante sobre la inmunidad mucosal y sistémica [18, 22, 23]. El anclaje de la proteína diana a las superficies celulares del LAB está destinado principalmente a usarse en vacunas mucosales. La proteína transmembrana pgsA es uno de los complejos de poli-glutamato sintetasa de Bacillus subtilis [17, 24, 25], que es una proteína ancla bien estudiada es capaz de fusionar la proteína diana a su término C y estabilizar el complejo al anclarla en la membrana celular. Dado que el sM2 es un objetivo altamente conservado y prometedor para una vacuna universal y el CTA1 es fuerte adyuvante mucosa, en este estudio se desarrollaron constructos utilizando un gen sM2 de consenso reconstituido a partir del análisis de virus de la gripe H1N1, H5N1 y H9N2 (sin dominio transmembrana) con o sin fusión de CTA1. Para ello se utilizó un nuevo vector de expresión que puede expresar un producto del gen pgsA como matriz de anclaje. Nuestros antígenos objetivo, sM2 y CTA1, se mostraron en la superficie de Lactobacillus casei, y la administración oral o intranasal de respuestas inmunológicas sistémicas y mucosas inducidas por L. casei recombinantes que tienen el potencial de proteger contra los desafíos letales de subtipos de gripe divergentes. Un total de 672 ratones BALB/c hembra (5 semanas de edad) fueron comprados a Samtako (Seúl, Corea) y alojados en jaulas ventiladas. Los ratones fueron manejados con alimentación en pellets y agua del grifo ad libitum, mantenidos en un ambiente específico libre de patógenos y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento después de la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Corporación de Biolíderes, Daejeon, Corea del Sur, número de protocolo: BSL-ABLS-13-002. Las inmunizaciones de animales se realizaron en instalaciones de laboratorio de nivel de bioseguridad (BSL)-2. Los ratones se dividieron en 6 conjuntos experimentales, cada uno de los cuales constaba de 2 subconjuntos: 1 para administración oral y 1 para administración intranasal que contenía 4 grupos cada uno. De 6, 4 conjuntos tenían 14 ratones por grupo Uno de los grupos tenía 17 (3 ratones para histopatología pulmonar e inmunohistoquímica) y el último contenía 11 ratones por grupo (3 ratones para respuesta CTL). Las concentraciones de L. casei recombinante se determinaron por unidades formadoras de colonias (UFC). En cada subconjunto, 2 grupos recibieron 10 UFC de pgsA-sM2/L. casei o pgsA-CTA1-sM2/L. casei, y los otros dos grupos recibieron la misma concentración de pKV-pgsA/L. casei o PBS en 100 ml por vía oral a través de lavado intragástrico en los días 0 a 3, 7 a 9 y 21 a 23. Del mismo modo, 10 9 UFC de células recombinantes se administraron en 20 ml suspensiones en las fosas nasales de ratones ligeramente anestesiados en los días 0 a 3, 7 a 9 y 21. Se recogieron muestras de sangre del plexo retro-orbital en los días 21, 14 y 28; se separaron los sueros por centrifugación durante 5 minutos a 12.0006g y se almacenaron a 220uC hasta el análisis; al día 28, se sacrificaron al azar 3 ratones de cada grupo para recoger la muestra IgA de los pulmones y el intestino y se almacenaron a 270uC hasta el análisis; se recolectaron bazo asépticamente en el día 28 para el análisis de la respuesta CTL al azar de 3 ratones de un grupo; el resto de ratones del mismo grupo se mantuvieron durante 6 meses desde la fecha del último impulso para medir las respuestas inmunes duraderas y la eficacia de protección. Los virus de la gripe aviar A/EM/Korea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2), A/Aquatic bird/Korea/W44/2005(H7N3) y A/ Chicken/Korea/116/2004(H9N2) utilizados en este estudio fueron proporcionados amablemente por el Dr. Young-Ki Choi (College of Medicine and Medical Research Institute, Chungbuk National University, Cheongju, República de Corea). Todos los virus se propagaron en el líquido alantoico de embriones de pollo de 10 días de edad, y el 50% de dosis letales de ratón (MLD 50 ) se determinaron en ratones ingenuos BALB/ c de 8 semanas de Se infectó por vía intranasal a ratones con narcosis-anestesia de ether con 10 veces el MLD 50 de virus de desafío en 20 ml de PBS. Seis ratones en cada grupo fueron sacrificados en 3 y 5 dpi para comprobar el título del virus en los pulmones y otros 5 ratones permanecieron en cada grupo han sido utilizados para la supervivencia. Los ratones fueron monitorizados cada día alternativo en el punto de tiempo fijo para medir la pérdida de peso y supervivencia. Los ratones fueron eutanasiados si moribundos, es decir, pérdida de peso, pelaje escalonado, escalofríos, taquipnea, malestar respiratorio, hipotermia y poco sensibles a estímulos externos, quedando considerados como número de supervivencia. Después del monitoreo final, todos los ratones sobrevivientes fueron humanizados mediante inhalación de CO 2 durante 5 minutos. A los 180 días de la vacunación final, ratones de un conjunto fueron desafiados En este estudio, E. coli JM83 se utilizó para la clonación y L. casei L525 se utilizó para la expresión superficial de la proteína diana. Estas bacterias se cultivaron en los medios LB y MRS, respectivamente. El plásmido pKV-Pald-PgsA, que alberga los genes pgsA de Bacillus subtilis, se utilizó para construir el plásmido de visualización superficial, que fue un regalo amable de la Bioleaders Corporation (Daejeon, Corea del Sur). Se generó un gen que codifica la secuencia de consenso de M2 que abarca los residuos de los dominios extracelular y citoplasmático sin el dominio transmembrana del virus de la gripe. Las secuencias de consenso se crearon a partir de los aminoácidos más comunes en cada posición de la alineación de H1N1, H5N1 y H9N2; luego se sintetizaron y utilizaron como plantillas para la construcción de los plásmidos pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei por clonación, como se describió anteriormente [26, 27]. El gen sM2 fue modificado añadiendo un sitio Kpn I en el terminal 59 y Sal I en el terminal 39 para clonación. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó para amplificar el gen utilizando el par de imprimadores 59-GGGGACCTCTATTAACA-39, y 59-ACGTCGACT-CATTCAAGTTCAATAATG AC-39. Del mismo modo, un sitio BamH I en la terminal 59 y un sitio Kpn I en la terminal 39 fueron añadidos al gen CTA1 utilizando los imprimadores 59-CGGGATCCAAT-GATTATAT-39 y 59-GGGGT ACCGAT-GATCTTGAGC ATT-39. Los genes modificados se ligaron al Vector T Easy (Invitrogen, Seúl, Corea). Los genes fueron luego digeridos con Kpn I-Sal I para sM2 y BamH I-Kpn I para CTA1. El sM2 digerido fue ligado al plásmido vector pKV-pgsA para la construcción de pKV-pgsA-sM2. Del mismo modo, el CTA1 fue ligado para la construcción de pKV-pgsA-CTA1-sM2. Los productos ligados fueron transformados en células competentes E. coli JM83, como se describió anteriormente, utilizando un método de electroporación [17]. Los perfiles de los plasmidos recombinantes fueron confirmados por la digestión de restricción de endonucleasa y secuenciación de ADN (Solgent, Seúl, Corea). Después de la confirmación, los plásmidos fueron transformados en L. casei L525 por electroporación y llamados pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei Los genes de L. casei recombinantes que contienen pgsA, pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2 fueron cultivados a 30uC durante 48 horas. Las células fueron recolectadas por centrifugación a 6.0006g durante 10 minutos a 4uC, seguidas por lavado dos veces con solución salina estéril bufferada por fosfato (PBS). Los análisis bacteriales fueron realizados por sonificación y centrifugados a 12.0006g durante 20 minutos a 4uC. Las fracciones de pared celular y citoplasmáticas fueron separadas por centrifugación a 25.0006g a 4uC durante 2 horas. Los pellets (pared celular) fueron resuspendidos en 100 ml de sarcosol al 1% que contenía 1 mM de fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF, Sigma-Aldrich Para la detección inmunitaria de proteínas de fusión, las membranas fueron analizadas con toxina anticolera de conejo (1:2000, Abcam, UK), anticuerpos anti-pgsA (1:1000) y anti-M2 (1:1000). Los anticuerpos anti-pgsA y anti-M2 de conejo utilizados en este experimento fueron generados por la inoculación i.m. de pgsA KLH-conjugado o péptido M2 en conejo, respectivamente, dos veces a las 2 semanas-intervalo. Las membranas fueron reaccionadas con una dilución 1:10,000 de inmunoglobulina G anti-rabbit conjugada con peroxidasa de rábano (IgG HRP). Finalmente, las proteínas diana fueron detectadas mediante el sistema de detección WEST-ZOL plus Western Blot (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do, Corea) y visualizadas mediante la mejora de la quimioluminiscencia (ECL) [17, 26, 28]. Para investigar la expresión de sM2 o CTA1-sM2 en la superficie de L. casei, L. casei recombinante se cultivaron en 30uC durante 48 horas en el caldo MRS. Las bacterias se cosecharon mediante centrifugación a 5.0006g durante 10 minutos a 4uC, se lavaron tres veces con solución salina estéril fosfatada que contenía 0,01% Tween-20 (PBST) y se probó con anticuerpo anti-TC del conejo policlonal durante la noche. Después de otro lavado, las células fueron tratadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) anticuerpos anti-rabbit IgG (Burlingame, CA, EE.UU.) durante 2 horas. Finalmente, 10.000 células fueron analizadas por citometría de flujo (Becton Dickinson, Oxnard, CA, EE.UU.). Para la inmunofluorescencia, las células fueron preparadas bajo la misma condición descrita para la citometría de flujo. El pgsA/L. casei fue utilizado como control negativo y el análisis de inmunofluoresencia fue examinado mediante un microscopio de fluorescencia Carl Zeiss Axioskop 2. En primer lugar, las placas inmunosorbentes de 96 pocillos (Nunc) fueron incubadas con 300 ng/proteínas sM2 bien purificadas o CTA1 a 4uC durante la noche. Las proteínas sM2 y CTA1 recombinantes utilizadas en este estudio fueron purificadas a partir de E. coli. A continuación, los pozos fueron bloqueados con leche descremada al 10% durante 2 horas en RT, lavada cinco veces con PBST, tratada con muestras de suero diluido (1:200) en triplicado para detectar IgG y tejido homogeneizado sin diluir, sobrenadante para detectar IgA local e incubada durante 2 horas a 37uC. Después de lavar tres veces, se añadió IgG HRP (1:1000, sigma) o antimouse IgA a cada pozo e incubada Después de otra ronda de lavado, las placas fueron reaccionadas con la solución de sustrato que contenía tetrametilbencidina y H 2 O 2 y se les permitió preceder la reacción durante 10 minutos. Después de añadir la solución de parada 2N-H 2 SO 4, la densidad óptica (OD) se midió a 450 nm utilizando un autolector ELISA (dispositivos moleculares). El desarrollo y recuento de citoquinas fueron realizados por ELISPOTs, como se describió anteriormente [31, 32]. Brevemente, el día antes del aislamiento de los esplenocitos, las placas ELISPOT 96-well fueron recubiertas con anticuerpos antimouse monoclonal IFN-c e IL-4 de captura (5 mg/ml) en PBS e incubadas a 4uC durante la noche. Las placas fueron lavadas con PBS, y 200 ml/pozo de solución de bloqueo que contenía el medio RPMI 1640 completo y 10% de suero fetal bovino, se añadieron (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) e incubadas durante 2 horas en RT. Los bazozos de los ratones vacunados se aislaron asépticamente y se añadieron a 5610 4 células/pozo en medios que contenían proteína sM2, péptido M2 (SLLLTEVETPTRNGWECKCSD) (1 mg/pozo), solo medio (control negativo), o 5 mg/ml fitohemaglutinina (control positivo, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Después de añadir células y estimuladores, las placas fueron incubadas durante 24 horas a 37uC con 5% de CO 2. Las placas fueron tratadas secuencialmente con anticuerpos IFN-c e IL-4 biotinilados antimouse, peroxidasa de estreptavidinhorse rábano y solución de sustrato. Finalmente, los puntos fueron contados utilizando un analizador InmunoScan Entry (Tecnología Celular, Shaker Heights, EE.UU.). Los pulmones fueron recolectados asépticamente, y los títulos del virus fueron determinados por dosis infecciosas de cultivo tisular 50% (TCID 50 ), como se describió anteriormente [33]. Brevemente, los tejidos pulmonares fueron homogenizados en 500 ml de PBS que contenían antibióticos (penicilina y estreptomicina) y compuestos antimicóticos (Fungizone) (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se centrifugaron muestras pulmonares homogeneizadas mecánicamente Las células MDCK fueron inoculadas con una muestra diluida en serie de 10 veces e incubadas a 37uC en una atmósfera húmeda de 5% de CO 2 durante una hora. Después de la absorción, se extrajo el medio y se incubado durante 72 horas el medio que contenía L-1-tosilamido-2-feniletilclorometilcetona (TPCK) tripsina (Thermo Fisher Scientific, Rockford, EE.UU.) se añadió a las células infectadas y se observaron efectos citopáticos virales diarios, y los títulos fueron determinados por la prueba de HA. El título viral de cada muestra se expresó en dosis de 50% de tejido infectado mediante el método Reed-Muench [34]. Para la histopatología, los tejidos pulmonares fueron recolectados en 5 dpi de ratones con narcosis-anestesia de éter. Los tejidos se fijaron inmediatamente en formalina del 10% que contenía tampón neutro, incrustado en cera de parafina, seccionado a un espesor de 4-6 mm mediante una máquina de microtomo, montada en diapositivas y manchada con tinción de eosina. Los cambios histopatológicos se examinaron mediante microscopía ligera, como se ha descrito anteriormente [29, 30, 35]. Además, las diapositivas se mancharon utilizando un método de inmunoperoxidasa con un anticuerpo (anti-M2, 1:500) dirigido contra la proteína matriz-2 del virus influenza A. Se utilizó un IgG HRP (1:2000, Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) como anticuerpo secundario para la detección de células infectadas por el virus en los tejidos respectivos [57]. Los datos se presentan como media 6 desviaciones estándar (S.D.) y son representativos de al Las diferencias entre los grupos fueron analizadas por análisis de varianza (ANOVA), y los medios fueron comparados por la prueba t de Student. Los valores de P inferiores a 0,05 fueron considerados como significativos. Los resultados del porcentaje de peso corporal inicial también fueron comparados por la prueba t de Student. La comparación de supervivencia se realizó mediante prueba de rango logarítmico utilizando la versión 6 de GraphPad Prism. El vector de expresión pgsA se utilizó para construir plásmidos que contenían el gen sM2 de consenso altamente conservado, con (pgsA-CTA1-sM2) o sin (pgsA-sM2) la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1, Fig. 1A ). Los plásmidos se transformaron en células L. casei. Los niveles de expresión de los anticuerpos policlonales pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2 fueron monitorizados por inmunoblote mediante anticuerpos anti-pgsA, anti-M2 o anti-CT (datos no mostrados). Para determinar la localización celular de las proteínas sM2 y CTA1 expresadas en la superficie de L. casei a través de las proteínas de anclaje de pared celular pgsA, membrana y fracciones citoplásmicas fueron sometidas a análisis de blot occidental. Como era de esperar, tanto las proteínas de fusión pgsA-sM2 como las proteínas pgsA-CTA-CTA-sM2 fueron detectadas por anticuerpos anti-pgsA, anti-M2 o anti-CT policlonales en la membrana, no en fracciones citoplásmicas (fig. 1B, carril 2, 3 y Se realizaron inmunoreacciones con anti-pgsA y bandas que representaban el tamaño de las proteínas fusionadas pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2, mientras que durante las reacciones con anticuerpos anti-M2 o anti-CT, no se detectaron otras bandas (Fig. 1B, carril 3 y 4). Este hallazgo puede haber sido resultado de la degradación que se produce durante el procedimiento de fraccionamiento de membrana. Se utilizó la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) e inmunofluorescencia de las células para verificar la localización de la proteína de fusión pgsA-sM2 y pgsA-CTA-CTA2 en la superficie de L. casei. El análisis citométrico de flujo con anticuerpos anti-M2 y anti-CT reveló un aumento del nivel de intensidad de fluorescencia de pgsA-sM2/L Las células casei o pgsA-CTA1-sM2/L., en comparación con las células casei de control L. casei (Fig. 1C ). La microscopía de inmunofluorescencia también mostró bacterias recombinantes que albergaban pgsA-sM2 o pgsA-CTA1-sM2 que inmunosentaban positiva para sM2 y CTA1, pero esto no se encontró en las células de control. Estos resultados demostraron que L. casei recombinante podía mostrar eficientemente las proteínas de fusión sM2 y CTA1-sM2 en la superficie, utilizando pgsA como proteína ancla de membrana. Para caracterizar la inmunogenicidad de los sM2 de L. casei y los sM2 de CTA1conjugados, los ratones BALB/c fueron inmunizados nasalmente (10 dosis de 9 células/20 ml) o por vía oral (10 dosis de 10 células/100 ml) con pgsA-sM2/L. casei y bacterias pgsA-CTA1-sM2/L. casei recombinantes. Como control negativo, los ratones fueron inmunizados con L. casei albergando el plásmido parental pKV-pgsA (pgsA/L. casei) y PBS. Las muestras séricas fueron recogidas a los 0, 14 y 28 días y analizadas por ELISA, utilizando proteínas sM2 y CTA1 (purificadas a partir de E. coli) como antígeno de recubrimiento. Después de la primera serie de inmunización, se detectaron niveles comparativamente bajos de IgG sérico tanto en el grupo inmunizado i.n. como en el grupo inmunizado oral. Sin embargo, se detectaron altos niveles de anticuerpos poco después de la segunda serie de inmunización, y el grupo sM2 conjugado con CTA1 indujo IgG sérico a un nivel significativo, comparado con el grupo sM2 y los controles negativos (fig. 2A y B). Aunque se esperaba que la conjugación de CTA1 con sM2 tuviera una función adyuvante solamente, se detectó un nivel significativo de anticuerpos anti-CTA1 tanto en las vacunas nasales como orales (fig. 2A y B derecha). En comparación con el grupo oral, el grupo inmunizado nasalmente mostró niveles más altos de IgG sérico específicos de sM2 y CTA1. Para evaluar las respuestas Los tejidos pulmonares e intestinales fueron recolectados en el día 28 de la inmunización y examinados utilizando proteína sM2 como antígeno de recubrimiento. En ambas vías de vacunación, pgsA-CTA1-sM2/L. casei indujo niveles significativamente mayores de sM2 mucosal IgA en comparación con los grupos pgsA-sM2/L. casei y control. Sin embargo, como era de esperar, se detectaron niveles más altos de títulos de anticuerpos en el lugar de inoculación que en el sitio remoto. Se observó un patrón similar de respuestas de anticuerpos para ambas vías de inmunización, en las que predominaron los grupos pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 2C y D). Estos datos demostraron que la subunidad de toxina de cólera A1 conjugada sM2 dio lugar a aumentos significativos en los niveles específicos de IgG y IgA mucosal de sM2 comparados con la sM2 sola o con controles inmunizados con pgsA/ L. casei o PBS. Inmunización mucosa con L. casei La sM2 y la CTA1-sM2 estimuladas M2 específicas para la respuesta inmune celularPara determinar si la vacunación mucosal con L. casei en superficie displayed sM2 y CTA1 conjugadas sM2 podría inducir inmunidad celular, se realizaron IFN-c e IL-4 ELISPOT. Se esplenocitos de ratones vacunados fueron estimulados con 10 mg/ml de proteína sM2 recombinante o péptido M2 y se desarrollaron los ELISPO Los puntos fueron contados para medir las diferencias en las respuestas CTL entre los grupos. Las células de los ratones inmunizados i.n. con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron niveles significativos de IFN-c en respuesta a la estimulación con proteína sM2 y péptido M2 (Fig. 3A). De igual manera, observamos que los grupos administrados i.n. tanto para pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron niveles detectables de esplenocitos IL-4 que secretaban tras la estimulación con proteína sM2 o péptido M2 (Fig. 3B). También se observaron células secretantes IFN-c e IL-4 en ratones inmunizados oralmente con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei (Fig. 3C ) aunque sus niveles fueron inferiores al grupo i.n. y no fueron significativos. El grupo de control inmunizado con pgsA/L. casei mostró un nivel de fondo puntual para ambos grupos intranasal y oral. Estos hallazgos indican que sM2 altamente conservado puede inducir respuestas de células T secretas específicas de IFN-c e IL-4 de M2, mientras que el parto de mucosas a través de L. casei y CTA1 con sM2 realzó la inmunidad mediada por la célula, lo que puede contribuir a ampliar la inmunidad protectora. M2 es conocido como un objetivo potencial para el desarrollo de la vacuna contra la gripe de amplio espectro con variabilidad mínima [36, 37]. Para confirmar la variabilidad de las secuencias de sM2 de los virus desafiados utilizados en este estudio, se comparó el sM2 de subtipos de gripe disponibles en el Centro Nacional de Información Biotecnológica de EE.UU. (NCBI) con nuestra secuencia de consenso sM2 particularmente el entero ecto conservado y alguna porción del dominio citoplásmico (CD), aunque la CD entera fue incluida en el constructo de la vacuna (Tabla 1). Encontramos que los virus utilizados en este estudio contienen 0-8 aminoácidos desfasados entre los aminoácidos de sM2 comparados en este estudio. Para evaluar la eficacia de la vacuna sM2, semana después de la inmunización final, los ratones fueron desafiados i.n. con el 10 MLD 50 de A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2) subtipos Los ratones inmunizados oralmente con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron protección del 40 y 60% respectivamente. Asimismo, los grupos de inmunización conferían 40 y 80% contra la infección letal con el virus H5N2 altamente virulento. En contraste, ninguno de los ratones no inmunizados sobrevivió después de la infección letal (fig. 4A y B, panel derecho). La morbilidad aumentó en los ratones inmunizados por vía oral, mientras que los ratones que recibieron inmunización con pgsA-CTA1-sM2/L. perdieron el 20% de su peso corporal inicial y comenzaron a recuperarse por la infección de 9 días después (dpi) y se recuperaron completamente para el día 13 (fig. 4A y B, panel izquierdo). A continuación se evaluó la eficiencia de protección de la vacuna sM2 candidata frente a A/Puerto Rico/8/34(H1N1), que contiene 8 aminoácidos desfasados en relación con la secuencia de consenso de sM2. Se desafiaron conjuntos de ratones vacunados con 10 MLD 50 del virus H1N1. Como se muestra en la figura 4C y D, los ratones inmunizados por los ratones fueron agrupados como se menciona en materiales y métodos y recibieron administraciones orales o nasales, de acuerdo con el calendario. Las flechas indicaron las rutas de inmunización y los períodos de pgsA/L. casei, pgsA-sM2/L. casei o pgsA-CTA1-sM2/L. células casei. Se recogieron seras en los días 0, 14 y 28; se recolectaron muestras de los pulmones e intestinos en el día 28 después Una semana después de la inmunización final, se extrajeron bazos de 3 ratones en cada grupo, con un conjunto para el análisis de CTL. Dos o 24 semanas después de la última inmunización, todos los ratones fueron desafiados con una dosis letal de subtipos de gripe a través de la ruta intranasal y monitoreados durante 13 días. Los días 3 y 5 post infección, los pulmones fueron extraídos de 3 ratones en cada grupo para determinar el título del virus. doi:10.1371/journal.pone.0094051.g001 CTA1-sM2 Induce inmunidad protectora a virus patógenos de gripe A PLOS ONE www.plosone.org i.n ruta mostró un nivel de protección más alto que los grupos inmunizados por vía oral, y ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron un nivel de protección significativamente más alto que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei (fig. 4C y D, panel derecho). Los ratones inmunizados perdieron hasta el 40% de su peso corporal y murieron por 9 dpi. casei perdió el 20% de su peso corporal inicial por 9 dpi y se recuperó más lentamente que los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 4C y D, panel izquierdo). Otro grupo de ratones vacunados fueron infectados con A/Chicken/ Corea/116/2004(H9N2) para comprobar el rango de capacidad de protección de la vacuna sM2 indujo respuestas inmunitarias. La secuencia sM2 de H9N2 contiene 2 desajustes en relación con la secuencia de consenso sM2. Los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron una pérdida de peso corporal insignificante y una recuperación gradual en comparación con los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei y los ratones no vacunados tanto para la vía oral (fig. 4E Ninguno de los ratones no inmunizados sobrevivió, mientras que el 100% y el 80% de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei a través de la vía intravenosa y oral sobrevivieron, respectivamente. Las tasas de supervivencia de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei fueron del 80% y 60% para la vía intravenosa y oral, respectivamente (fig. 4E y F, panel derecho). También se evaluó la amplitud de protección de la vacuna sM2 contra subtipos de gripe divergentes. Conjunto de ratones inmunizados fueron desafiados con gripe aviar de alta patogenicidad (HPAI) A/ EM/Korea/W149/06(H5N1), que contiene 2 desajustes de aminoácidos en relación con la secuencia de consenso sM2. y las vías orales con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron mayor eficacia de protección, 80% y 60%, respectivamente, en comparación con los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, para los cuales las tasas fueron de 60% y 20%, respectivamente (fig. 4G y H, panel derecho). Respecto a la morbilidad, los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron menor morbilidad que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei (fig. 4G y H, panel izquierdo). Un grupo más de ratones vacunados fueron desafiados con el virus A/Acuático/Corea/W44/2005 (H7N3), que contiene 1 desajuste en relación con la secuencia de consenso sM2, y se observó el peso Como se muestra en la figura 4I y J, los ratones no inmunizados perdieron hasta el 30% de su peso corporal que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 4I y J, panel izquierdo). Los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei a través de la ruta de la i.n mostraron un nivel de protección significativamente más alto contra el virus de la gripe H7N3 que los demás grupos (fig. 4I y J, panel derecho). Tomados en conjunto, los resultados indican que la inmunización con pgsA-CTA1-sM2/L. Las respuestas inmunitarias inducidas por casei que conferían niveles significativos de protección frente a subtipos divergentes de virus de la gripe que contenían aminoácidos desfasados que oscilaban entre 0 y 8 del consenso sM2, independientemente de si era completa o parcial. Se midieron títulos de virus en los pulmones de ratones desafiados para estimar su replicación a 3 y 5 dpi. Los ratones fueron vacunados a través de las vías i.n y oral con subtipos de gripe pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei y desafiados con los subtipos H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 o H7N3. En 3 y 5 dpi, 3 ratones fueron sacrificados al azar de cada grupo, y sus títulos de virus pulmonar fueron medidos utilizando el método casei tenía títulos inferiores a 3 dpi y había reducido significativamente la replicación viral a 5 dpi en comparación con ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei o los grupos control al mismo tiempo (fig. 5A-J). Se observaron títulos virales reducidos en los pulmones en grupos de ratones inmunizados por vía intravenosa en relación con los ratones inmunizados por vía oral, especialmente en el día 3 post infecciones (fig. 5). Estos títulos reducidos pueden deberse a que las vías de vacunación y el desafío son los mismos, y los títulos se correlacionaron con los resultados de supervivencia para infecciones letales con H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 y H7N3. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el consenso de proteína sM2 fusionada con CTA1 proporcionó una mejor protección que sM2, y la vía i.n fue más potente que la vía oral de inmunización con respecto a la protección contra un desafío letal de subtipos de gripe divergentes. Se realizó histopatología e inmunohistoquímica para corroborar los hallazgos del título del virus pulmonar. A los 5 dpi, los pulmones fueron recogidos aleatoriamente de cada grupo de un conjunto, fijos y manchados con eosina antes de ser examinados bajo un microscopio ligero. Como se muestra en la figura 5K, se observaron signos claros de inflamación pulmonar profunda en los pulmones de ratones tratados con PBS o pgsA/L. casei para las vías de administración oral e i.n, mientras que los pulmones de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. Para la inmunohistoquímica, se utilizó el método de la inmunoperoxidasa con un anticuerpo dirigido contra la proteína matriz-2 del virus influenza A para la detección de células infectadas por virus en los tejidos respectivos. El antígeno del virus en las células epiteliales aparece como coloración marrón del núcleo y citoplasma. Como se muestra en la figura 5K, a los 5 días p.i., se detectaron numerosas células infectadas por virus en ratones vacunados con control o pgsA-sM2/L. casei, mientras que se encontró un número muy reducido de células positivas de antígeno en los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, tanto en el grupo vacunado por vía oral como en el grupo vacunado por vía oral (fig. panel derecho 5K). Estos resultados indican que los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei desarrollaron respuestas inmunitarias lo suficientemente fuertes como para inhibir la replicación viral, lo que promueve la supervivencia de los ratones tras una infección letal por influenza A. La vacuna PgsA-CTA1-sM2/L. casei indujo protección cruzada duraderaLa duración de la protección es un criterio importante para una posible vacuna. Así, la longevidad de la inmunidad inducida por sM2 y CTA1 conjugado sM2 fue investigada mediante la detección de IgG sérico e IgA mucosal por ELISA. Se observó un aumento significativo de los niveles de IgG sérico específico de sM2, así como de IgA pulmonar e intestinal 180 días después de la vacunación (fig. 6A y C) en comparación con los grupos PBS y pgs Los ratones fueron desafiados con A/ ave acuática/Corea/W81/2005(H5N2), y los cambios en el peso corporal y la supervivencia fueron monitoreados hasta 13 dpi. Los ratones no vacunados mostraron pérdida de peso corporal del 30% (Fig. 6B y D panel izquierdo) y murieron al día 9 post infección tanto en el grupo oral como en el grupo i.n. En contraste, los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron pérdida de peso corporal insignificante, que fue recuperada por 13 dpi; el 80% sobrevivió en el grupo inmunizado de i.n. (Fig. 6B panel derecho) y el 60% sobrevivió en el grupo inmunizado oral (Fig. 6D panel derecho). Este resultado indica que la vacuna CTA1conjugada sM2 mucosal confirió protección contra una infección letal 6 El sistema inmunológico mucosal es la primera barrera inmunológica contra los patógenos que invaden el cuerpo a través de la superficie mucosal. Así, la inducción de la inmunidad mucosal es necesaria para garantizar la protección contra múltiples subtipos del virus influenza A. Un virus respiratorio, la gripe A es responsable de epidemias estacionales anuales en todo el mundo y, ocasionalmente, pandemias, que son causadas por nuevos subtipos o cepas emergentes derivados del reasociamiento con virus aviares o porcinos. Las vacunas actuales contra la gripe proporcionan únicamente protección específica para las cepas. Por lo tanto, es crucial establecer una vacuna contra la gripe ampliamente cruzada. Los antígenos bien conservados entre la gripe Los virus A se consideran objetivos prometedores para la inducción de la protección cruzada contra estos diferentes subtipos. Sin embargo, el objetivo debe ser el desarrollo de una primera línea de defensa mediante la eliminación efectiva de patógenos en la superficie mucosa. La proteína 2 de la matriz de la gripe (M2) está relativamente bien conservada entre los subtipos de gripe y puede considerarse un antígeno prometedor de la vacuna contra la gripe [30]. Consta de los tres siguientes dominios estructurales: un dominio extracelular de 24-aminoácidos, un dominio transmembrana de 19-aminoácidos y un dominio de cola citoplasmática de 54-aminoácidos [39, 40]. En este estudio se utilizaron los dominios extracelulares y citoplasmáticos, bien conservados entre los virus de la gripe y que desempeñan un papel importante en el ensamblaje viral y la morfogénesis. Aquí se desarrolló el consenso sM2 derivado del análisis de secuencias de subtipos H5N1, H1N1 y H9N2 en la base de datos. Considerando los hallazgos previos de que el dominio extracelular particularmente (aa, 1-13) es altamente conservado entre los subtipos del virus de la gripe y reconocido como epítopo para la inducción de anticuerpos monoclonales, lo que podría proteger la infección por el virus de la gripe [56], se utilizó la secuencia vertebral sM2 del virus H5N1; para la posible homología entre otros subtipos cambiamos en la posición de 14 (E-G) y 18 (R-K) y mantuvimos sin cambios el epítopo conservado (aa, 1-13). Como se muestra en la alineación secuencial, la secuencia sM2 de consenso tiene desajustes de 0-8 entre los subtipos utilizados en este estudio (tabla 1). Además, la incorporación de un adyuvante se considera esencial para impulsar la interacción de la vacuna con el sistema inmunológico mucosa [41]. Varios adyuvantes, como liposomas, nanopartículas y complejos inmunoestimulantes (ISCOMs), han sido estudiados y han sido encontrados para mejorar la respuesta inmune [42], pero su eficacia no fue óptima. A pesar de su potencial como adyuvante mucosa [43], el uso de la toxina del cólera (TC) en las vacunas está limitado por su toxicidad innata, por lo que la toxicidad de la TC tendría que separarse de su adyuvante antes de poder ser utilizada como adyuvante vacunal. Estudios han demostrado que los constructos consistentes en M2e fusionados con la subunidad de toxina del cólera A1 junto con un fuerte agente ADpremilante y un dímero de la D-fragmento de la proteína Staphylococcus aureus Una vacuna provocó protección completa y morbilidad reducida [6, 44]. La CTA1 mantiene la función adyuvante de la TC sin sus efectos secundarios tóxicos, como la reactogenicidad en el lugar de su administración y la unión o acumulación en los tejidos nerviosos [45]. Basándose en hallazgos previos, se ha supuesto que el fragmento de consenso sM2, cuando se fusiona con el potente adyuvante mucosal CTA1, puede inducir una amplia inmunidad protectora contra subtipos divergentes del virus de la gripe. En este estudio se utilizó la proteína total CTA1 de 22 kDa (una ribosiltransferasa ADP), que consta de tres subdominios distintos: CTA11 (residuos 1 a 132), CTA12 (residuos 133 a 161) y CTA13 (residuos 162 a 192). Se ha informado que la CTA1 carece de CTB tiene actividades adyuvantes fuertes sin toxicidad alguna. Para el desarrollo de una vacuna universal contra la gripe mucosa con un péptido de sM2 conservado y potente adyuvante CTA1, L. casei recombinante muestra sM2 fusionado con o sin CTA1Los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron alvéolos claros sin infiltración celular inflamatoria, en contraste con los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-sM2/L. casei o ratones de control, los cuales revelaron características de neumonitis grave (panel medio e izquierdo).Se detectó un número reducido de antígenos virales en los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, en contraste con los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-sM2/L. Los microgramas son representativos para cada grupo de tratamiento a una ampliación de 200X. El antígeno del virus en las células epiteliales aparece como coloración marrón del núcleo y citoplasma. En los títulos pulmonares, las barras denotan una media de 6 S.D. El asterisco indica una diferencia significativa entre pgsA-CTA1-sM2/L. casei y otros grupos (*P,0.05). doi:10.1371/journal.pone.0094051.g005 fueron construidos para el parto de mucosas por el vehículo de vacuna viva ampliamente utilizado LAB [38]. El gen pgsA utilizado en este estudio es un ancla para la visualización en la superficie de LAB que se deriva del complejo enzimático pgsBCA de Bacillus subtilis y consiste en dominio transmembrana cerca de su N-terminal con el dominio ubicado en el exterior de la membrana celular. Así, pgsA es capaz de cruzar la pared celular y mostrar la proteína heteróloga fusionada a su C-terminal [17]. Las vacunas desarrolladas se probaron a través de dos rutas principales. Encontramos que la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei fue capaz de inducir un nivel significativamente más alto de sM2 específico IgG sérico ( Fig. 2A y B ) y mucosa IgA (Fig. 2C y D) en comparación con pgsA-sM2/L. casei, y confiriendo protección contra subtipos de gripe divergentes del grupo filogenético 1 (H1, H5, H9) y del grupo 2 (H7) [46] (Fig. 4). Este estudio también reveló que la administración de i.n. fue superior a la vía oral de vacunación, lo que es consistente con otras observaciones [48]. Puede haber dos posibles razones para explicar este fenómeno. Primero, la vía de desafío es la misma que la de la vacunación; la mucosal IgA específica puede prevenir la colonización viral en el tracto respiratorio. Segundo, el volumen de la inocula fue 5 veces menor que el de la inoculación oral, lo que puede haber permitido presentar la forma concentrada del antígeno a las células inmunes. Debido a que se detectaron mayores niveles de IgG sérico e IgA mucosal en ratones inmunizados intranasalmente que en los inmunizados oralmente (fig. 2), una explicación alternativa podría ser que los antígenos se procesan y/o se presentan de manera diferente a las células inmunitarias en los dos compartimentos de la mucosa. Es importante destacar que nuestro estudio demostró por primera vez que la inmunización de la mucosa con la vacuna basada en sM2 con TCA1 presentada en la superficie de LAB induce una amplia protección contra el desafío con subtipos de gripe divergentes. Sin embargo, el mecanismo por el cual Abs contra sM2 mediaba esta amplia protección no se entiende plenamente. Estudios anteriores han demostrado que Abs a la N-terminal de M2e, particularmente posiciones 1-10, inhibió la replicación del virus influenza A [49, 50]. Otros estudios revelaron que la citotoxicidad celular mediada por IgG anti-M2e o fagocitosis puede inducir la eliminación de células infectadas antes de que el virus de la progenie florezca y se propague [54, 55] que está apoyando nuestros hallazgos del título del virus pulmonar y los datos inmunohistoquímicos detectados a 5 dpi en nuestros experimentos de desafío. Por lo tanto, en este estudio, la combinación de esas respuestas y Abs a la secuencia N-terminal de la secuencia sM2 que se conserva entre los virus de desafío (Tabla 1 ) puede proteger los subtipos de gripe divergentes después de la inmunización mucosa con la vacuna recombinante LAB CTA1 basada en M2. Además, la respuesta inmune celular juega un papel importante en el control de la replicación viral. Examinamos las respuestas de citoquina Th1 (IFN-c) y Th2 (IL-4) por Se detectaron niveles significativamente más altos de IFN-c en respuesta a la estimulación con la proteína sM2 y el péptido M2 en ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei en comparación con los niveles en ratones en los grupos de pgsA-sM2/L. casei y control (fig. 3A y C). Asimismo, se observaron niveles sustancialmente más altos de IL-4 en ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei tras la estimulación con la proteína sM2 y el péptido M2 (fig. 3B y D). Estos resultados apoyan aún más los hallazgos de que los anticuerpos y la citotoxicidad mediada por células fueron específicos del antígeno M2 y que sus actividades antivirales fueron inducidas por M2 monomérico, tres copias de M2 fusiona En conjunto, estos resultados indican que la M2 adyuvada con CTA1 fusionada indujo respuestas inmunitarias en ratones, lo que los protegió de subtipos de gripe divergentes. En este sentido, nuestros resultados tienen significancia para el uso de CTA1, que tiene función adyuvante, en candidatos vacunales. Como la protección clínica no es el único parámetro por el cual se evalúa el desempeño de la vacuna, se evaluó la inmunogenicidad de la vacuna LAB recombinante sobre la base de otros parámetros, como la reducción de lesiones patológicas y la eliminación del virus. En este estudio, los títulos bajos del virus de desafío fueron valorados desde los pulmones después de la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, mientras que el virus de desafío podría ser detectado en títulos superiores en ratones simulados y los vacunados con pgsA-sM2/L. casei (Fig La reducción de las lesiones groseras y histopatológicas consistentes con la infección viral son los principales parámetros indicativos de la eficacia de la vacuna antigripal. Aquí, demostramos que la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei limitó notablemente la gravedad del daño al inhibir la replicación viral y la acumulación de células inflamatorias y antígenos virales en los tejidos alveolares pulmonares, en relación con la gravedad en ratones no inmunizados y ratones vacunados con pgsA-sM2/L. casei (Fig. 5K). Nuestro estudio demostró además, por primera vez, que L. casei recombinante que expresaba la inmunidad CTA1-sM2 inducida de larga duración y confería protección contra infecciones letales por gripe, incluso a los 6 meses de la vacunación final (Fig. 6), que es importante para cualquier vacuna exitosa. Se observaron resultados similares en estudios previos, en los que la M2 VLP confería inmunidad a largo plazo y protección cruzada y los anticuerpos en los sitios sueros y mucosas eran de larga vida [53, 54]. En conclusión, nuestros hallazgos revelaron que la inmunización mucosal de ratones con L. casei recombinante que expresaba CTA1conjugado sM2 puede inducir respuestas inmunes sistémicas y locales, así como celulares mediadas, contra subtipos divergentes del virus de la gripe. Así, la L. casei recombinante que expresaba CTA1conjugado consenso sM2 vacuna mucosal puede ser una vacuna prometedora candidata para la preparación para la pandemia de gripe.

Nombre algunos adyuvantes que se han utilizado con una vacuna contra la gripe.

La vacuna contra la gripe recombinante Lactobacillus casei-Displayed CTA1-Conjugated Consensus Matrix Protein-2 (sM2) induce una amplia protección contra los subtipos de gripe divergente en BALB/c Micehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3979752/SHA: efaa556b484fbcd9cc34832ffac53ef3e8334e9c0Autores: Chowdhury, Mohammed Y. E.; Li, Rui; Kim, Jae-Hoon; Park, Min-Eun; Kim, Tae-Hwan; Pathinayake, Prabuddha; Weeratunga, Prasanna; Song, Man Ki; Son, Hwa-Young; Hong, Se casei) o sin (pgsA-sM2/L. casei) subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) en la superficie. La localización superficial de la proteína de fusión fue verificada mediante análisis de fraccionamiento celular, citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia. Inoculaciones orales y nasales de L. casei recombinante en ratones dieron lugar a altos niveles de inmunoglobulina sérica G (IgG) e IgA mucosal. Sin embargo, la conjugación de la subunidad de toxina de cólera A1 indujo respuestas inmunes más potentes de mucosa, humoral y mediadas por células. En una prueba de desafío con 10 MLD(50) de A/EM/Corea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/Ave acuática /Corea/W81/2005(H5N2), A/Ave acuática/Corea/W44/2005(H7N3) y virus A/Chicken/Corea/116/2004(H9N2), los pgsA-CTA1-sM2/L. casei recombinantes proporcionaron una mejor protección contra los desafíos letales que pgsA-sM2/L. casei, pgsA/L. casei y PBS en ratones. Estos resultados indican que la inmunización mucosal con L. casei recombinante que expresa la proteína sM2 conjugada con CTA1 en su superficie es un medio eficaz para obtener respuestas inmunes protectoras contra diversos subtipos de gripe. Texto: La vacunación sigue siendo el medio más económico y eficaz contra las enfermedades respiratorias causadas por virus de la gripe [1]. Con base en los virus que circulan en la población, se han desarrollado cepas de vacunas trivalentes que se utilizan para la protección del virus de la gripe [2]. La estrategia actual más aceptable es la administración intramuscular de vacunas inactivadas producidas por sistemas de fabricación a base de huevos que, si bien son eficaces, se ven obstaculizadas por una capacidad y flexibilidad limitadas [3]. Sin embargo, las cepas vacunales deben adaptarse con frecuencia para adaptarse a los virus circulantes en todo el mundo [4]. Además, se ha observado que los niveles de anticuerpos inducidos por la vacuna in Por lo tanto, las estrategias alternativas para el desarrollo de vacunas ampliamente cruzadas, seguras y eficaces contra las infecciones virales de la gripe son de gran importancia. La proteína matriz 2 (M2) está muy conservada entre las cepas del virus influenza A, lo que indica que M2 es un objetivo atractivo para el desarrollo de una vacuna universal [6]. En estudios anteriores, se han desarrollado y probado varios constructos de la vacuna M2, incluyendo escherichia coli recombinante (E. coli) que expresa la proteína de fusión M2, vectores adenovirales que expresan la proteína M2, codificación de ADN plasmido M2 [7] [8] [9] y péptidos que codifican M2e [11], cada uno de los cuales fue capaz de generar respuestas inmunes protectoras en ratones. Sin embargo, el inconveniente de estas vacunas basadas en M2 es su baja inmunogenicidad; además, la mayoría de ellas requeriría inyecciones intramusculares. Por lo tanto, se han aplicado muchas estrategias centradas en el aumento de la inmunogenicidad de las vacunas basadas en M2, por ejemplo, la fusión de M2 con diferentes moléculas portadoras como la proteína L del virus del papiloma humano [12], la hemocianina de la cojera del ojo clave [10] y la flagellina [13]. Además, se han aplicado vacunas con diferentes adyuvantes y vías de administración para evaluar su protección contra cepas divergentes de virus de la gripe. Los ratones vacunaron mucosally con una M2 o partículas similares al virus (VLP) adyuvadas con toxina de cólera (TC) demostraron una mejor protección que los ratones sometidos a inmunización parenteral [14, 15]. Sin embargo, debido a los efectos adversos de la TC en humanos, los investigadores han intentado identificar subunidades no tóxicas con adyuvancia mediante la eliminación de la subunidad A o E. coli expresando la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1) fusionada con el fragmento D de Staphylococcus aureus mostró los efectos adyuvante sin ninguna reactogenicidad de la subunidad A1 en la vacuna mucosa [6]. Aunque la conjugación química o genética de M2 puede no presentar M2 en su forma tetramérica nativa, antígenos de acceso extracelular expresados en las superficies de bacterias son mejor reconocidos por el sistema inmunitario que los que son intracelulares [17]. Por lo tanto, la elección del vehículo de distribución es también una preocupación importante para las posibles vacunas mucosas. Recientemente, se han estudiado bacterias de ácido láctico (LAB) que presentan antígenos del virus de la gripe [3, 18, 19]. Para la inmunización de la mucosa, LAB es un sistema de administración más atractivo que otros vectores de vacunas vivas, como Shigella Se considera seguro y presenta un efecto adyuvante sobre la inmunidad mucosal y sistémica [18, 22, 23]. El anclaje de la proteína diana a las superficies celulares del LAB está destinado principalmente a usarse en vacunas mucosales. La proteína transmembrana pgsA es uno de los complejos de poli-glutamato sintetasa de Bacillus subtilis [17, 24, 25], que es una proteína ancla bien estudiada es capaz de fusionar la proteína diana a su término C y estabilizar el complejo al anclarla en la membrana celular. Dado que el sM2 es un objetivo altamente conservado y prometedor para una vacuna universal y el CTA1 es fuerte adyuvante mucosa, en este estudio se desarrollaron constructos utilizando un gen sM2 de consenso reconstituido a partir del análisis de virus de la gripe H1N1, H5N1 y H9N2 (sin dominio transmembrana) con o sin fusión de CTA1. Para ello se utilizó un nuevo vector de expresión que puede expresar un producto del gen pgsA como matriz de anclaje. Nuestros antígenos objetivo, sM2 y CTA1, se mostraron en la superficie de Lactobacillus casei, y la administración oral o intranasal de respuestas inmunológicas sistémicas y mucosas inducidas por L. casei recombinantes que tienen el potencial de proteger contra los desafíos letales de subtipos de gripe divergentes. Un total de 672 ratones BALB/c hembra (5 semanas de edad) fueron comprados a Samtako (Seúl, Corea) y alojados en jaulas ventiladas. Los ratones fueron manejados con alimentación en pellets y agua del grifo ad libitum, mantenidos en un ambiente específico libre de patógenos y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento después de la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Corporación de Biolíderes, Daejeon, Corea del Sur, número de protocolo: BSL-ABLS-13-002. Las inmunizaciones de animales se realizaron en instalaciones de laboratorio de nivel de bioseguridad (BSL)-2. Los ratones se dividieron en 6 conjuntos experimentales, cada uno de los cuales constaba de 2 subconjuntos: 1 para administración oral y 1 para administración intranasal que contenía 4 grupos cada uno. De 6, 4 conjuntos tenían 14 ratones por grupo Uno de los grupos tenía 17 (3 ratones para histopatología pulmonar e inmunohistoquímica) y el último contenía 11 ratones por grupo (3 ratones para respuesta CTL). Las concentraciones de L. casei recombinante se determinaron por unidades formadoras de colonias (UFC). En cada subconjunto, 2 grupos recibieron 10 UFC de pgsA-sM2/L. casei o pgsA-CTA1-sM2/L. casei, y los otros dos grupos recibieron la misma concentración de pKV-pgsA/L. casei o PBS en 100 ml por vía oral a través de lavado intragástrico en los días 0 a 3, 7 a 9 y 21 a 23. Del mismo modo, 10 9 UFC de células recombinantes se administraron en 20 ml suspensiones en las fosas nasales de ratones ligeramente anestesiados en los días 0 a 3, 7 a 9 y 21. Se recogieron muestras de sangre del plexo retro-orbital en los días 21, 14 y 28; se separaron los sueros por centrifugación durante 5 minutos a 12.0006g y se almacenaron a 220uC hasta el análisis; al día 28, se sacrificaron al azar 3 ratones de cada grupo para recoger la muestra IgA de los pulmones y el intestino y se almacenaron a 270uC hasta el análisis; se recolectaron bazo asépticamente en el día 28 para el análisis de la respuesta CTL al azar de 3 ratones de un grupo; el resto de ratones del mismo grupo se mantuvieron durante 6 meses desde la fecha del último impulso para medir las respuestas inmunes duraderas y la eficacia de protección. Los virus de la gripe aviar A/EM/Korea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2), A/Aquatic bird/Korea/W44/2005(H7N3) y A/ Chicken/Korea/116/2004(H9N2) utilizados en este estudio fueron proporcionados amablemente por el Dr. Young-Ki Choi (College of Medicine and Medical Research Institute, Chungbuk National University, Cheongju, República de Corea). Todos los virus se propagaron en el líquido alantoico de embriones de pollo de 10 días de edad, y el 50% de dosis letales de ratón (MLD 50 ) se determinaron en ratones ingenuos BALB/ c de 8 semanas de Se infectó por vía intranasal a ratones con narcosis-anestesia de ether con 10 veces el MLD 50 de virus de desafío en 20 ml de PBS. Seis ratones en cada grupo fueron sacrificados en 3 y 5 dpi para comprobar el título del virus en los pulmones y otros 5 ratones permanecieron en cada grupo han sido utilizados para la supervivencia. Los ratones fueron monitorizados cada día alternativo en el punto de tiempo fijo para medir la pérdida de peso y supervivencia. Los ratones fueron eutanasiados si moribundos, es decir, pérdida de peso, pelaje escalonado, escalofríos, taquipnea, malestar respiratorio, hipotermia y poco sensibles a estímulos externos, quedando considerados como número de supervivencia. Después del monitoreo final, todos los ratones sobrevivientes fueron humanizados mediante inhalación de CO 2 durante 5 minutos. A los 180 días de la vacunación final, ratones de un conjunto fueron desafiados En este estudio, E. coli JM83 se utilizó para la clonación y L. casei L525 se utilizó para la expresión superficial de la proteína diana. Estas bacterias se cultivaron en los medios LB y MRS, respectivamente. El plásmido pKV-Pald-PgsA, que alberga los genes pgsA de Bacillus subtilis, se utilizó para construir el plásmido de visualización superficial, que fue un regalo amable de la Bioleaders Corporation (Daejeon, Corea del Sur). Se generó un gen que codifica la secuencia de consenso de M2 que abarca los residuos de los dominios extracelular y citoplasmático sin el dominio transmembrana del virus de la gripe. Las secuencias de consenso se crearon a partir de los aminoácidos más comunes en cada posición de la alineación de H1N1, H5N1 y H9N2; luego se sintetizaron y utilizaron como plantillas para la construcción de los plásmidos pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei por clonación, como se describió anteriormente [26, 27]. El gen sM2 fue modificado añadiendo un sitio Kpn I en el terminal 59 y Sal I en el terminal 39 para clonación. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó para amplificar el gen utilizando el par de imprimadores 59-GGGGACCTCTATTAACA-39, y 59-ACGTCGACT-CATTCAAGTTCAATAATG AC-39. Del mismo modo, un sitio BamH I en la terminal 59 y un sitio Kpn I en la terminal 39 fueron añadidos al gen CTA1 utilizando los imprimadores 59-CGGGATCCAAT-GATTATAT-39 y 59-GGGGT ACCGAT-GATCTTGAGC ATT-39. Los genes modificados se ligaron al Vector T Easy (Invitrogen, Seúl, Corea). Los genes fueron luego digeridos con Kpn I-Sal I para sM2 y BamH I-Kpn I para CTA1. El sM2 digerido fue ligado al plásmido vector pKV-pgsA para la construcción de pKV-pgsA-sM2. Del mismo modo, el CTA1 fue ligado para la construcción de pKV-pgsA-CTA1-sM2. Los productos ligados fueron transformados en células competentes E. coli JM83, como se describió anteriormente, utilizando un método de electroporación [17]. Los perfiles de los plasmidos recombinantes fueron confirmados por la digestión de restricción de endonucleasa y secuenciación de ADN (Solgent, Seúl, Corea). Después de la confirmación, los plásmidos fueron transformados en L. casei L525 por electroporación y llamados pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei Los genes de L. casei recombinantes que contienen pgsA, pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2 fueron cultivados a 30uC durante 48 horas. Las células fueron recolectadas por centrifugación a 6.0006g durante 10 minutos a 4uC, seguidas por lavado dos veces con solución salina estéril bufferada por fosfato (PBS). Los análisis bacteriales fueron realizados por sonificación y centrifugados a 12.0006g durante 20 minutos a 4uC. Las fracciones de pared celular y citoplasmáticas fueron separadas por centrifugación a 25.0006g a 4uC durante 2 horas. Los pellets (pared celular) fueron resuspendidos en 100 ml de sarcosol al 1% que contenía 1 mM de fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF, Sigma-Aldrich Para la detección inmunitaria de proteínas de fusión, las membranas fueron analizadas con toxina anticolera de conejo (1:2000, Abcam, UK), anticuerpos anti-pgsA (1:1000) y anti-M2 (1:1000). Los anticuerpos anti-pgsA y anti-M2 de conejo utilizados en este experimento fueron generados por la inoculación i.m. de pgsA KLH-conjugado o péptido M2 en conejo, respectivamente, dos veces a las 2 semanas-intervalo. Las membranas fueron reaccionadas con una dilución 1:10,000 de inmunoglobulina G anti-rabbit conjugada con peroxidasa de rábano (IgG HRP). Finalmente, las proteínas diana fueron detectadas mediante el sistema de detección WEST-ZOL plus Western Blot (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do, Corea) y visualizadas mediante la mejora de la quimioluminiscencia (ECL) [17, 26, 28]. Para investigar la expresión de sM2 o CTA1-sM2 en la superficie de L. casei, L. casei recombinante se cultivaron en 30uC durante 48 horas en el caldo MRS. Las bacterias se cosecharon mediante centrifugación a 5.0006g durante 10 minutos a 4uC, se lavaron tres veces con solución salina estéril fosfatada que contenía 0,01% Tween-20 (PBST) y se probó con anticuerpo anti-TC del conejo policlonal durante la noche. Después de otro lavado, las células fueron tratadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) anticuerpos anti-rabbit IgG (Burlingame, CA, EE.UU.) durante 2 horas. Finalmente, 10.000 células fueron analizadas por citometría de flujo (Becton Dickinson, Oxnard, CA, EE.UU.). Para la inmunofluorescencia, las células fueron preparadas bajo la misma condición descrita para la citometría de flujo. El pgsA/L. casei fue utilizado como control negativo y el análisis de inmunofluoresencia fue examinado mediante un microscopio de fluorescencia Carl Zeiss Axioskop 2. En primer lugar, las placas inmunosorbentes de 96 pocillos (Nunc) fueron incubadas con 300 ng/proteínas sM2 bien purificadas o CTA1 a 4uC durante la noche. Las proteínas sM2 y CTA1 recombinantes utilizadas en este estudio fueron purificadas a partir de E. coli. A continuación, los pozos fueron bloqueados con leche descremada al 10% durante 2 horas en RT, lavada cinco veces con PBST, tratada con muestras de suero diluido (1:200) en triplicado para detectar IgG y tejido homogeneizado sin diluir, sobrenadante para detectar IgA local e incubada durante 2 horas a 37uC. Después de lavar tres veces, se añadió IgG HRP (1:1000, sigma) o antimouse IgA a cada pozo e incubada Después de otra ronda de lavado, las placas fueron reaccionadas con la solución de sustrato que contenía tetrametilbencidina y H 2 O 2 y se les permitió preceder la reacción durante 10 minutos. Después de añadir la solución de parada 2N-H 2 SO 4, la densidad óptica (OD) se midió a 450 nm utilizando un autolector ELISA (dispositivos moleculares). El desarrollo y recuento de citoquinas fueron realizados por ELISPOTs, como se describió anteriormente [31, 32]. Brevemente, el día antes del aislamiento de los esplenocitos, las placas ELISPOT 96-well fueron recubiertas con anticuerpos antimouse monoclonal IFN-c e IL-4 de captura (5 mg/ml) en PBS e incubadas a 4uC durante la noche. Las placas fueron lavadas con PBS, y 200 ml/pozo de solución de bloqueo que contenía el medio RPMI 1640 completo y 10% de suero fetal bovino, se añadieron (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) e incubadas durante 2 horas en RT. Los bazozos de los ratones vacunados se aislaron asépticamente y se añadieron a 5610 4 células/pozo en medios que contenían proteína sM2, péptido M2 (SLLLTEVETPTRNGWECKCSD) (1 mg/pozo), solo medio (control negativo), o 5 mg/ml fitohemaglutinina (control positivo, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Después de añadir células y estimuladores, las placas fueron incubadas durante 24 horas a 37uC con 5% de CO 2. Las placas fueron tratadas secuencialmente con anticuerpos IFN-c e IL-4 biotinilados antimouse, peroxidasa de estreptavidinhorse rábano y solución de sustrato. Finalmente, los puntos fueron contados utilizando un analizador InmunoScan Entry (Tecnología Celular, Shaker Heights, EE.UU.). Los pulmones fueron recolectados asépticamente, y los títulos del virus fueron determinados por dosis infecciosas de cultivo tisular 50% (TCID 50 ), como se describió anteriormente [33]. Brevemente, los tejidos pulmonares fueron homogenizados en 500 ml de PBS que contenían antibióticos (penicilina y estreptomicina) y compuestos antimicóticos (Fungizone) (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se centrifugaron muestras pulmonares homogeneizadas mecánicamente Las células MDCK fueron inoculadas con una muestra diluida en serie de 10 veces e incubadas a 37uC en una atmósfera húmeda de 5% de CO 2 durante una hora. Después de la absorción, se extrajo el medio y se incubado durante 72 horas el medio que contenía L-1-tosilamido-2-feniletilclorometilcetona (TPCK) tripsina (Thermo Fisher Scientific, Rockford, EE.UU.) se añadió a las células infectadas y se observaron efectos citopáticos virales diarios, y los títulos fueron determinados por la prueba de HA. El título viral de cada muestra se expresó en dosis de 50% de tejido infectado mediante el método Reed-Muench [34]. Para la histopatología, los tejidos pulmonares fueron recolectados en 5 dpi de ratones con narcosis-anestesia de éter. Los tejidos se fijaron inmediatamente en formalina del 10% que contenía tampón neutro, incrustado en cera de parafina, seccionado a un espesor de 4-6 mm mediante una máquina de microtomo, montada en diapositivas y manchada con tinción de eosina. Los cambios histopatológicos se examinaron mediante microscopía ligera, como se ha descrito anteriormente [29, 30, 35]. Además, las diapositivas se mancharon utilizando un método de inmunoperoxidasa con un anticuerpo (anti-M2, 1:500) dirigido contra la proteína matriz-2 del virus influenza A. Se utilizó un IgG HRP (1:2000, Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) como anticuerpo secundario para la detección de células infectadas por el virus en los tejidos respectivos [57]. Los datos se presentan como media 6 desviaciones estándar (S.D.) y son representativos de al Las diferencias entre los grupos fueron analizadas por análisis de varianza (ANOVA), y los medios fueron comparados por la prueba t de Student. Los valores de P inferiores a 0,05 fueron considerados como significativos. Los resultados del porcentaje de peso corporal inicial también fueron comparados por la prueba t de Student. La comparación de supervivencia se realizó mediante prueba de rango logarítmico utilizando la versión 6 de GraphPad Prism. El vector de expresión pgsA se utilizó para construir plásmidos que contenían el gen sM2 de consenso altamente conservado, con (pgsA-CTA1-sM2) o sin (pgsA-sM2) la subunidad de toxina de cólera A1 (CTA1, Fig. 1A ). Los plásmidos se transformaron en células L. casei. Los niveles de expresión de los anticuerpos policlonales pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2 fueron monitorizados por inmunoblote mediante anticuerpos anti-pgsA, anti-M2 o anti-CT (datos no mostrados). Para determinar la localización celular de las proteínas sM2 y CTA1 expresadas en la superficie de L. casei a través de las proteínas de anclaje de pared celular pgsA, membrana y fracciones citoplásmicas fueron sometidas a análisis de blot occidental. Como era de esperar, tanto las proteínas de fusión pgsA-sM2 como las proteínas pgsA-CTA-CTA-sM2 fueron detectadas por anticuerpos anti-pgsA, anti-M2 o anti-CT policlonales en la membrana, no en fracciones citoplásmicas (fig. 1B, carril 2, 3 y Se realizaron inmunoreacciones con anti-pgsA y bandas que representaban el tamaño de las proteínas fusionadas pgsA-sM2 y pgsA-CTA1-sM2, mientras que durante las reacciones con anticuerpos anti-M2 o anti-CT, no se detectaron otras bandas (Fig. 1B, carril 3 y 4). Este hallazgo puede haber sido resultado de la degradación que se produce durante el procedimiento de fraccionamiento de membrana. Se utilizó la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) e inmunofluorescencia de las células para verificar la localización de la proteína de fusión pgsA-sM2 y pgsA-CTA-CTA2 en la superficie de L. casei. El análisis citométrico de flujo con anticuerpos anti-M2 y anti-CT reveló un aumento del nivel de intensidad de fluorescencia de pgsA-sM2/L Las células casei o pgsA-CTA1-sM2/L., en comparación con las células casei de control L. casei (Fig. 1C ). La microscopía de inmunofluorescencia también mostró bacterias recombinantes que albergaban pgsA-sM2 o pgsA-CTA1-sM2 que inmunosentaban positiva para sM2 y CTA1, pero esto no se encontró en las células de control. Estos resultados demostraron que L. casei recombinante podía mostrar eficientemente las proteínas de fusión sM2 y CTA1-sM2 en la superficie, utilizando pgsA como proteína ancla de membrana. Para caracterizar la inmunogenicidad de los sM2 de L. casei y los sM2 de CTA1conjugados, los ratones BALB/c fueron inmunizados nasalmente (10 dosis de 9 células/20 ml) o por vía oral (10 dosis de 10 células/100 ml) con pgsA-sM2/L. casei y bacterias pgsA-CTA1-sM2/L. casei recombinantes. Como control negativo, los ratones fueron inmunizados con L. casei albergando el plásmido parental pKV-pgsA (pgsA/L. casei) y PBS. Las muestras séricas fueron recogidas a los 0, 14 y 28 días y analizadas por ELISA, utilizando proteínas sM2 y CTA1 (purificadas a partir de E. coli) como antígeno de recubrimiento. Después de la primera serie de inmunización, se detectaron niveles comparativamente bajos de IgG sérico tanto en el grupo inmunizado i.n. como en el grupo inmunizado oral. Sin embargo, se detectaron altos niveles de anticuerpos poco después de la segunda serie de inmunización, y el grupo sM2 conjugado con CTA1 indujo IgG sérico a un nivel significativo, comparado con el grupo sM2 y los controles negativos (fig. 2A y B). Aunque se esperaba que la conjugación de CTA1 con sM2 tuviera una función adyuvante solamente, se detectó un nivel significativo de anticuerpos anti-CTA1 tanto en las vacunas nasales como orales (fig. 2A y B derecha). En comparación con el grupo oral, el grupo inmunizado nasalmente mostró niveles más altos de IgG sérico específicos de sM2 y CTA1. Para evaluar las respuestas Los tejidos pulmonares e intestinales fueron recolectados en el día 28 de la inmunización y examinados utilizando proteína sM2 como antígeno de recubrimiento. En ambas vías de vacunación, pgsA-CTA1-sM2/L. casei indujo niveles significativamente mayores de sM2 mucosal IgA en comparación con los grupos pgsA-sM2/L. casei y control. Sin embargo, como era de esperar, se detectaron niveles más altos de títulos de anticuerpos en el lugar de inoculación que en el sitio remoto. Se observó un patrón similar de respuestas de anticuerpos para ambas vías de inmunización, en las que predominaron los grupos pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 2C y D). Estos datos demostraron que la subunidad de toxina de cólera A1 conjugada sM2 dio lugar a aumentos significativos en los niveles específicos de IgG y IgA mucosal de sM2 comparados con la sM2 sola o con controles inmunizados con pgsA/ L. casei o PBS. Inmunización mucosa con L. casei La sM2 y la CTA1-sM2 estimuladas M2 específicas para la respuesta inmune celularPara determinar si la vacunación mucosal con L. casei en superficie displayed sM2 y CTA1 conjugadas sM2 podría inducir inmunidad celular, se realizaron IFN-c e IL-4 ELISPOT. Se esplenocitos de ratones vacunados fueron estimulados con 10 mg/ml de proteína sM2 recombinante o péptido M2 y se desarrollaron los ELISPO Los puntos fueron contados para medir las diferencias en las respuestas CTL entre los grupos. Las células de los ratones inmunizados i.n. con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron niveles significativos de IFN-c en respuesta a la estimulación con proteína sM2 y péptido M2 (Fig. 3A). De igual manera, observamos que los grupos administrados i.n. tanto para pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron niveles detectables de esplenocitos IL-4 que secretaban tras la estimulación con proteína sM2 o péptido M2 (Fig. 3B). También se observaron células secretantes IFN-c e IL-4 en ratones inmunizados oralmente con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei (Fig. 3C ) aunque sus niveles fueron inferiores al grupo i.n. y no fueron significativos. El grupo de control inmunizado con pgsA/L. casei mostró un nivel de fondo puntual para ambos grupos intranasal y oral. Estos hallazgos indican que sM2 altamente conservado puede inducir respuestas de células T secretas específicas de IFN-c e IL-4 de M2, mientras que el parto de mucosas a través de L. casei y CTA1 con sM2 realzó la inmunidad mediada por la célula, lo que puede contribuir a ampliar la inmunidad protectora. M2 es conocido como un objetivo potencial para el desarrollo de la vacuna contra la gripe de amplio espectro con variabilidad mínima [36, 37]. Para confirmar la variabilidad de las secuencias de sM2 de los virus desafiados utilizados en este estudio, se comparó el sM2 de subtipos de gripe disponibles en el Centro Nacional de Información Biotecnológica de EE.UU. (NCBI) con nuestra secuencia de consenso sM2 particularmente el entero ecto conservado y alguna porción del dominio citoplásmico (CD), aunque la CD entera fue incluida en el constructo de la vacuna (Tabla 1). Encontramos que los virus utilizados en este estudio contienen 0-8 aminoácidos desfasados entre los aminoácidos de sM2 comparados en este estudio. Para evaluar la eficacia de la vacuna sM2, semana después de la inmunización final, los ratones fueron desafiados i.n. con el 10 MLD 50 de A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2) subtipos Los ratones inmunizados oralmente con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron protección del 40 y 60% respectivamente. Asimismo, los grupos de inmunización conferían 40 y 80% contra la infección letal con el virus H5N2 altamente virulento. En contraste, ninguno de los ratones no inmunizados sobrevivió después de la infección letal (fig. 4A y B, panel derecho). La morbilidad aumentó en los ratones inmunizados por vía oral, mientras que los ratones que recibieron inmunización con pgsA-CTA1-sM2/L. perdieron el 20% de su peso corporal inicial y comenzaron a recuperarse por la infección de 9 días después (dpi) y se recuperaron completamente para el día 13 (fig. 4A y B, panel izquierdo). A continuación se evaluó la eficiencia de protección de la vacuna sM2 candidata frente a A/Puerto Rico/8/34(H1N1), que contiene 8 aminoácidos desfasados en relación con la secuencia de consenso de sM2. Se desafiaron conjuntos de ratones vacunados con 10 MLD 50 del virus H1N1. Como se muestra en la figura 4C y D, los ratones inmunizados por los ratones fueron agrupados como se menciona en materiales y métodos y recibieron administraciones orales o nasales, de acuerdo con el calendario. Las flechas indicaron las rutas de inmunización y los períodos de pgsA/L. casei, pgsA-sM2/L. casei o pgsA-CTA1-sM2/L. células casei. Se recogieron seras en los días 0, 14 y 28; se recolectaron muestras de los pulmones e intestinos en el día 28 después Una semana después de la inmunización final, se extrajeron bazos de 3 ratones en cada grupo, con un conjunto para el análisis de CTL. Dos o 24 semanas después de la última inmunización, todos los ratones fueron desafiados con una dosis letal de subtipos de gripe a través de la ruta intranasal y monitoreados durante 13 días. Los días 3 y 5 post infección, los pulmones fueron extraídos de 3 ratones en cada grupo para determinar el título del virus. doi:10.1371/journal.pone.0094051.g001 CTA1-sM2 Induce inmunidad protectora a virus patógenos de gripe A PLOS ONE www.plosone.org i.n ruta mostró un nivel de protección más alto que los grupos inmunizados por vía oral, y ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron un nivel de protección significativamente más alto que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei (fig. 4C y D, panel derecho). Los ratones inmunizados perdieron hasta el 40% de su peso corporal y murieron por 9 dpi. casei perdió el 20% de su peso corporal inicial por 9 dpi y se recuperó más lentamente que los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 4C y D, panel izquierdo). Otro grupo de ratones vacunados fueron infectados con A/Chicken/ Corea/116/2004(H9N2) para comprobar el rango de capacidad de protección de la vacuna sM2 indujo respuestas inmunitarias. La secuencia sM2 de H9N2 contiene 2 desajustes en relación con la secuencia de consenso sM2. Los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron una pérdida de peso corporal insignificante y una recuperación gradual en comparación con los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei y los ratones no vacunados tanto para la vía oral (fig. 4E Ninguno de los ratones no inmunizados sobrevivió, mientras que el 100% y el 80% de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei a través de la vía intravenosa y oral sobrevivieron, respectivamente. Las tasas de supervivencia de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei fueron del 80% y 60% para la vía intravenosa y oral, respectivamente (fig. 4E y F, panel derecho). También se evaluó la amplitud de protección de la vacuna sM2 contra subtipos de gripe divergentes. Conjunto de ratones inmunizados fueron desafiados con gripe aviar de alta patogenicidad (HPAI) A/ EM/Korea/W149/06(H5N1), que contiene 2 desajustes de aminoácidos en relación con la secuencia de consenso sM2. y las vías orales con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron mayor eficacia de protección, 80% y 60%, respectivamente, en comparación con los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, para los cuales las tasas fueron de 60% y 20%, respectivamente (fig. 4G y H, panel derecho). Respecto a la morbilidad, los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron menor morbilidad que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei (fig. 4G y H, panel izquierdo). Un grupo más de ratones vacunados fueron desafiados con el virus A/Acuático/Corea/W44/2005 (H7N3), que contiene 1 desajuste en relación con la secuencia de consenso sM2, y se observó el peso Como se muestra en la figura 4I y J, los ratones no inmunizados perdieron hasta el 30% de su peso corporal que los ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei (fig. 4I y J, panel izquierdo). Los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei a través de la ruta de la i.n mostraron un nivel de protección significativamente más alto contra el virus de la gripe H7N3 que los demás grupos (fig. 4I y J, panel derecho). Tomados en conjunto, los resultados indican que la inmunización con pgsA-CTA1-sM2/L. Las respuestas inmunitarias inducidas por casei que conferían niveles significativos de protección frente a subtipos divergentes de virus de la gripe que contenían aminoácidos desfasados que oscilaban entre 0 y 8 del consenso sM2, independientemente de si era completa o parcial. Se midieron títulos de virus en los pulmones de ratones desafiados para estimar su replicación a 3 y 5 dpi. Los ratones fueron vacunados a través de las vías i.n y oral con subtipos de gripe pgsA-sM2/L. casei y pgsA-CTA1-sM2/L. casei y desafiados con los subtipos H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 o H7N3. En 3 y 5 dpi, 3 ratones fueron sacrificados al azar de cada grupo, y sus títulos de virus pulmonar fueron medidos utilizando el método casei tenía títulos inferiores a 3 dpi y había reducido significativamente la replicación viral a 5 dpi en comparación con ratones inmunizados con pgsA-sM2/L. casei o los grupos control al mismo tiempo (fig. 5A-J). Se observaron títulos virales reducidos en los pulmones en grupos de ratones inmunizados por vía intravenosa en relación con los ratones inmunizados por vía oral, especialmente en el día 3 post infecciones (fig. 5). Estos títulos reducidos pueden deberse a que las vías de vacunación y el reto son los mismos, y los títulos se correlacionaron con los resultados de supervivencia para infecciones letales con H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 y H7N3. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el consenso de proteína sM2 fusionada con CTA1 proporcionó una mejor protección que sM2, y la vía i.n fue más potente que la vía oral de inmunización con respecto a la protección contra un desafío letal de subtipos de gripe divergentes. Se realizó histopatología e inmunohistoquímica para corroborar los hallazgos del título del virus pulmonar. A los 5 dpi, los pulmones fueron recogidos aleatoriamente de cada grupo de un conjunto, fijos y manchados con eosina antes de ser examinados bajo un microscopio ligero. Como se muestra en la figura 5K, se observaron signos claros de inflamación pulmonar profunda en los pulmones de ratones tratados con PBS o pgsA/L. casei para las vías de administración oral e i.n, mientras que los pulmones de los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. Para la inmunohistoquímica, se utilizó el método de la inmunoperoxidasa con un anticuerpo dirigido contra la proteína matriz-2 del virus influenza A para la detección de células infectadas por virus en los tejidos respectivos. El antígeno del virus en las células epiteliales aparece como coloración marrón del núcleo y citoplasma. Como se muestra en la figura 5K, a los 5 días p.i., se detectaron numerosas células infectadas por virus en ratones vacunados con control o pgsA-sM2/L. casei, mientras que se encontró un número muy reducido de células positivas de antígeno en los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, tanto en el grupo vacunado por vía oral como en el grupo vacunado por vía oral (fig. panel derecho 5K). Estos resultados indican que los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei desarrollaron respuestas inmunitarias lo suficientemente fuertes como para inhibir la replicación viral, lo que promueve la supervivencia de los ratones tras una infección letal por influenza A. La vacuna PgsA-CTA1-sM2/L. casei indujo protección cruzada duraderaLa duración de la protección es un criterio importante para una posible vacuna. Así, la longevidad de la inmunidad inducida por sM2 y CTA1 conjugado sM2 fue investigada mediante la detección de IgG sérico e IgA mucosal por ELISA. Se observó un aumento significativo de los niveles de IgG sérico específico de sM2, así como de IgA pulmonar e intestinal 180 días después de la vacunación (fig. 6A y C) en comparación con los grupos PBS y pgs Los ratones fueron desafiados con A/ ave acuática/Corea/W81/2005(H5N2), y los cambios en el peso corporal y la supervivencia fueron monitoreados hasta 13 dpi. Los ratones no vacunados mostraron pérdida de peso corporal del 30% (Fig. 6B y D panel izquierdo) y murieron al día 9 post infección tanto en el grupo oral como en el grupo i.n. En contraste, los ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron pérdida de peso corporal insignificante, que fue recuperada por 13 dpi; el 80% sobrevivió en el grupo inmunizado de i.n. (Fig. 6B panel derecho) y el 60% sobrevivió en el grupo inmunizado oral (Fig. 6D panel derecho). Este resultado indica que la vacuna CTA1conjugada sM2 mucosal confirió protección contra una infección letal 6 El sistema inmunológico mucosal es la primera barrera inmunológica contra los patógenos que invaden el cuerpo a través de la superficie mucosal. Así, la inducción de la inmunidad mucosal es necesaria para garantizar la protección contra múltiples subtipos del virus influenza A. Un virus respiratorio, la gripe A es responsable de epidemias estacionales anuales en todo el mundo y, ocasionalmente, pandemias, que son causadas por nuevos subtipos o cepas emergentes derivados del reasociamiento con virus aviares o porcinos. Las vacunas actuales contra la gripe proporcionan únicamente protección específica para las cepas. Por lo tanto, es crucial establecer una vacuna contra la gripe ampliamente cruzada. Los antígenos bien conservados entre la gripe Los virus A se consideran objetivos prometedores para la inducción de la protección cruzada contra estos diferentes subtipos. Sin embargo, el objetivo debe ser el desarrollo de una primera línea de defensa mediante la eliminación efectiva de patógenos en la superficie mucosa. La proteína 2 de la matriz de la gripe (M2) está relativamente bien conservada entre los subtipos de gripe y puede considerarse un antígeno prometedor de la vacuna contra la gripe [30]. Consta de los tres siguientes dominios estructurales: un dominio extracelular de 24-aminoácidos, un dominio transmembrana de 19-aminoácidos y un dominio de cola citoplasmática de 54-aminoácidos [39, 40]. En este estudio se utilizaron los dominios extracelulares y citoplasmáticos, bien conservados entre los virus de la gripe y que desempeñan un papel importante en el ensamblaje viral y la morfogénesis. Aquí se desarrolló el consenso sM2 derivado del análisis de secuencias de subtipos H5N1, H1N1 y H9N2 en la base de datos. Considerando los hallazgos previos de que el dominio extracelular particularmente (aa, 1-13) es altamente conservado entre los subtipos del virus de la gripe y reconocido como epítopo para la inducción de anticuerpos monoclonales, lo que podría proteger la infección por el virus de la gripe [56], se utilizó la secuencia vertebral sM2 del virus H5N1; para la posible homología entre otros subtipos cambiamos en la posición de 14 (E-G) y 18 (R-K) y mantuvimos sin cambios el epítopo conservado (aa, 1-13). Como se muestra en la alineación secuencial, la secuencia sM2 de consenso tiene desajustes de 0-8 entre los subtipos utilizados en este estudio (tabla 1). Además, la incorporación de un adyuvante se considera esencial para impulsar la interacción de la vacuna con el sistema inmunológico mucosa [41]. Varios adyuvantes, como liposomas, nanopartículas y complejos inmunoestimulantes (ISCOMs), han sido estudiados y han sido encontrados para mejorar la respuesta inmune [42], pero su eficacia no fue óptima. A pesar de su potencial como adyuvante mucosa [43], el uso de la toxina del cólera (TC) en las vacunas está limitado por su toxicidad innata, por lo que la toxicidad de la TC tendría que separarse de su adyuvante antes de poder ser utilizada como adyuvante vacunal. Estudios han demostrado que los constructos consistentes en M2e fusionados con la subunidad de toxina del cólera A1 junto con un fuerte agente ADpremilante y un dímero de la D-fragmento de la proteína Staphylococcus aureus Una vacuna provocó protección completa y morbilidad reducida [6, 44]. La CTA1 mantiene la función adyuvante de la TC sin sus efectos secundarios tóxicos, como la reactogenicidad en el lugar de su administración y la unión o acumulación en los tejidos nerviosos [45]. Basándose en hallazgos previos, se ha supuesto que el fragmento de consenso sM2, cuando se fusiona con el potente adyuvante mucosal CTA1, puede inducir una amplia inmunidad protectora contra subtipos divergentes del virus de la gripe. En este estudio se utilizó la proteína total CTA1 de 22 kDa (una ribosiltransferasa ADP), que consta de tres subdominios distintos: CTA11 (residuos 1 a 132), CTA12 (residuos 133 a 161) y CTA13 (residuos 162 a 192). Se ha informado que la CTA1 carece de CTB tiene actividades adyuvantes fuertes sin toxicidad alguna. Para el desarrollo de una vacuna universal contra la gripe mucosa con un péptido de sM2 conservado y potente adyuvante CTA1, L. casei recombinante muestra sM2 fusionado con o sin CTA1Los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei mostraron alvéolos claros sin infiltración celular inflamatoria, en contraste con los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-sM2/L. casei o ratones de control, los cuales revelaron características de neumonitis grave (panel medio e izquierdo).Se detectó un número reducido de antígenos virales en los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, en contraste con los pulmones de los ratones vacunados con pgsA-sM2/L. Los microgramas son representativos para cada grupo de tratamiento a una ampliación de 200X. El antígeno del virus en las células epiteliales aparece como coloración marrón del núcleo y citoplasma. En los títulos pulmonares, las barras denotan una media de 6 S.D. El asterisco indica una diferencia significativa entre pgsA-CTA1-sM2/L. casei y otros grupos (*P,0.05). doi:10.1371/journal.pone.0094051.g005 fueron construidos para el parto de mucosas por el vehículo de vacuna viva ampliamente utilizado LAB [38]. El gen pgsA utilizado en este estudio es un ancla para la visualización en la superficie de LAB que se deriva del complejo enzimático pgsBCA de Bacillus subtilis y consiste en dominio transmembrana cerca de su N-terminal con el dominio ubicado en el exterior de la membrana celular. Así, pgsA es capaz de cruzar la pared celular y mostrar la proteína heteróloga fusionada a su C-terminal [17]. Las vacunas desarrolladas se probaron a través de dos rutas principales. Encontramos que la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei fue capaz de inducir un nivel significativamente más alto de sM2 específico IgG sérico ( Fig. 2A y B ) y mucosa IgA (Fig. 2C y D) en comparación con pgsA-sM2/L. casei, y confiriendo protección contra subtipos de gripe divergentes del grupo filogenético 1 (H1, H5, H9) y del grupo 2 (H7) [46] (Fig. 4). Este estudio también reveló que la administración de i.n. fue superior a la vía oral de vacunación, lo que es consistente con otras observaciones [48]. Puede haber dos posibles razones para explicar este fenómeno. Primero, la vía de desafío es la misma que la de la vacunación; la mucosal IgA específica puede prevenir la colonización viral en el tracto respiratorio. Segundo, el volumen de la inocula fue 5 veces menor que el de la inoculación oral, lo que puede haber permitido presentar la forma concentrada del antígeno a las células inmunes. Debido a que se detectaron mayores niveles de IgG sérico e IgA mucosal en ratones inmunizados intranasalmente que en los inmunizados oralmente (fig. 2), una explicación alternativa podría ser que los antígenos se procesan y/o se presentan de manera diferente a las células inmunitarias en los dos compartimentos de la mucosa. Es importante destacar que nuestro estudio demostró por primera vez que la inmunización de la mucosa con la vacuna basada en sM2 con TCA1 presentada en la superficie de LAB induce una amplia protección contra el desafío con subtipos de gripe divergentes. Sin embargo, el mecanismo por el cual Abs contra sM2 mediaba esta amplia protección no se entiende plenamente. Estudios anteriores han demostrado que Abs a la N-terminal de M2e, particularmente posiciones 1-10, inhibió la replicación del virus influenza A [49, 50]. Otros estudios revelaron que la citotoxicidad celular mediada por IgG anti-M2e o fagocitosis puede inducir la eliminación de células infectadas antes de que el virus de la progenie florezca y se propague [54, 55] que está apoyando nuestros hallazgos del título del virus pulmonar y los datos inmunohistoquímicos detectados a 5 dpi en nuestros experimentos de desafío. Por lo tanto, en este estudio, la combinación de esas respuestas y Abs a la secuencia N-terminal de la secuencia sM2 que se conserva entre los virus de desafío (Tabla 1 ) puede proteger los subtipos de gripe divergentes después de la inmunización mucosa con la vacuna recombinante LAB CTA1 basada en M2. Además, la respuesta inmune celular juega un papel importante en el control de la replicación viral. Examinamos las respuestas de citoquina Th1 (IFN-c) y Th2 (IL-4) por Se detectaron niveles significativamente más altos de IFN-c en respuesta a la estimulación con la proteína sM2 y el péptido M2 en ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei en comparación con los niveles en ratones en los grupos de pgsA-sM2/L. casei y control (fig. 3A y C). Asimismo, se observaron niveles sustancialmente más altos de IL-4 en ratones inmunizados con pgsA-CTA1-sM2/L. casei tras la estimulación con la proteína sM2 y el péptido M2 (fig. 3B y D). Estos resultados apoyan aún más los hallazgos de que los anticuerpos y la citotoxicidad mediada por células fueron específicos del antígeno M2 y que sus actividades antivirales fueron inducidas por M2 monomérico, tres copias de M2 fusiona En conjunto, estos resultados indican que la M2 adyuvada con CTA1 fusionada indujo respuestas inmunitarias en ratones, lo que los protegió de subtipos de gripe divergentes. En este sentido, nuestros resultados tienen significancia para el uso de CTA1, que tiene función adyuvante, en candidatos vacunales. Como la protección clínica no es el único parámetro por el cual se evalúa el desempeño de la vacuna, se evaluó la inmunogenicidad de la vacuna LAB recombinante sobre la base de otros parámetros, como la reducción de lesiones patológicas y la eliminación del virus. En este estudio, los títulos bajos del virus de desafío fueron valorados desde los pulmones después de la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei, mientras que el virus de desafío podría ser detectado en títulos superiores en ratones simulados y los vacunados con pgsA-sM2/L. casei (Fig La reducción de las lesiones groseras y histopatológicas consistentes con la infección viral son los principales parámetros indicativos de la eficacia de la vacuna antigripal. Aquí, demostramos que la vacunación con pgsA-CTA1-sM2/L. casei limitó notablemente la gravedad del daño al inhibir la replicación viral y la acumulación de células inflamatorias y antígenos virales en los tejidos alveolares pulmonares, en relación con la gravedad en ratones no inmunizados y ratones vacunados con pgsA-sM2/L. casei (Fig. 5K). Nuestro estudio demostró además, por primera vez, que L. casei recombinante que expresaba la inmunidad CTA1-sM2 inducida de larga duración y confería protección contra infecciones letales por gripe, incluso a los 6 meses de la vacunación final (Fig. 6), que es importante para cualquier vacuna exitosa. Se observaron resultados similares en estudios previos, en los que la M2 VLP confería inmunidad a largo plazo y protección cruzada y los anticuerpos en los sitios sueros y mucosas eran de larga vida [53, 54]. En conclusión, nuestros hallazgos revelaron que la inmunización mucosal de ratones con L. casei recombinante que expresaba CTA1conjugado sM2 puede inducir respuestas inmunes sistémicas y locales, así como celulares mediadas, contra subtipos divergentes del virus de la gripe. Así, la L. casei recombinante que expresaba CTA1conjugado consenso sM2 vacuna mucosal puede ser una vacuna prometedora candidata para la preparación para la pandemia de gripe.

¿Qué se encontró en los pulmones de los ratones de control en este estudio?

El síndrome respiratorio agudo severo Coronavirus Viroporina 3a Activa el Inflammasome NLRP3https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6361828/SHA: f02d0c1e8b0109648e578662dc250abe349a033cAutores: Chen, I-Yin; Moriyama, Miyu; Chang, Ming-Fu; Ichinohe, TakeshiFecha: 2019-01-29DOI: 10.3389/fmicb.2019.00050Licencia: cc-byAbstract: Familia de receptores tipo nod, dominio de pirina 3 (NLRP3) regula la secreción de citocinas proinflamatorias interleucina 1 beta (IL-1β) e IL-18. Anteriormente se demostró que las proteínas 2B del virus de la gripe M2 o encefalomiocarditis (EMCV) estimulan la secreción de IL-1β después de la activación del flammasoma NLRP3. Sin embargo, el mecanismo por el cual el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) activa el flammasoma NLRP3 permanece desconocido. Aquí, proporcionamos evidencia directa de que la proteína SRAS-CoV 3a activa el flammasoma NLRP3 en macrófagos lipopolisacáridos. SRAS-CoV 3a fue suficiente para causar la activación del flammasoma NLRP3. La actividad del canal iónico de la proteína 3a fue esencial para la secreción de IL-1β mediada por 3a. Mientras que las células no infectadas o infectadas por un lentivirus que expresaban una proteína 3a defectuosa en la actividad de los canales iónicos expresaban NLRP3 de manera uniforme en todo el citoplasma, NLRP3 se redistribuyó al espacio perinuclear en las células infectadas por un lentivirus que expresaba la proteína 3a. Las especies K(+) eflujo y oxígeno reactivo mitocondrial fueron importantes para la activación del flammasoma SRAS-CoV 3a inducida por NLRP3. Estos resultados destacan la importancia de las viroporinas, proteínas virales formadoras de poros transmembranas, en la activación del NLRP3 inflamatorio inducida por virus. Texto: Síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV), miembro del género Betacoronavirus de la familia Coronaviridae, es un virus envuelto con un genoma Los 5 dos tercios del genoma codifican grandes precursores de poliproteínas, marco abierto de lectura (ORF) 1 y ORF1b, que son proteolíticamente cortados para generar 16 proteínas no estructurales (Tan et al., 2005). El 3 un tercio del genoma codifica cuatro proteínas estructurales, pico (S), sobre (E), matriz (M) y nucleocápsido (N), y proteínas no estructurales, junto con un conjunto de proteínas accesorias (3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b y 9b) (Perlman y Dandekar, 2005; Tan et al., 2005). El SARS-CoV es el agente etiológico del SARS (Drosten et al., 2003; Fouchier et al., 2003; Ksiazek et al., 2003; Kuiken et al., 2003; Peiris et al., 2003). Entre noviembre de 2002 y julio de 2003 se denunciaron a la Organización Mundial de la Salud por lo menos 8.098 casos confirmados en laboratorio de infección humana, con una tasa de mortalidad del 9,6%, y se detectaron altos niveles de citocinas proinflamatorias, incluidos el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, la interleucina (IL)-1β e IL-6, en los tejidos de autopsia de pacientes con SARS (He et al., 2006). Aunque la regulación de las citocinas inflamatorias puede estar involucrada en lesiones pulmonares y la patogénesis del SARS-CoV, no se El sistema inmunitario innato utiliza receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) para detectar patrones moleculares asociados con patógenos (Medzhitov, 2001; Kawai y Akira, 2010). El reconocimiento de la infección por virus juega un papel importante en la limitación de la replicación del virus en las primeras etapas de la infección. Familia de receptores tipo nod, dominio de pirina 3 (NLRP3) se activa por una amplia variedad de estímulos, incluyendo la infección por virus (Bauernfeind et al., 2011). Cuatro modelos que describen la activación de la inflamación NLRP3 se han propuesto hasta ahora (Hornung y Latz, 2010; Schroder et al., 2010; Tschopp y Schroder, 2010). En primer lugar, las alteraciones en las concentraciones iónicas intracelulares, incluyendo K + eflujo y Ca 2 + afluencia, juegan un papel importante (Fernandes-Alnemri et al., 2007; Petrilli et al., 2007; Arlehamn et al., 2010; Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Murakami et al., 2012; Muñoz-Planillo et al., 2013). En segundo lugar, la catepsina B y L, que son proteasasas de cisteína lisosómicas específicas, son aunque jugar un papel después de la fagocitosis de cristales de colesterol (Duewell et al., 2010), péptido fibrilar amiloide-beta, cristales de sílice y sales de aluminio. En tercer lugar, la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) o ADN mitocondrial a partir de mitocondrias dañadas (Zhou et al., 2011 Nakahira et al., 2011; Shimada et al., 2012). Finalmente, los productos de escisión de ARN viral o ARN generados por la Rnasa L activan el inflamasoma NLRP3 a través de la helicasa DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). Al activarse, el NLRP3 se recluta a las mitocondrias mediante asociación con la señalización antiviral mitocondrial (MAVS) o mitofusina 2 expresada en la membrana mitocondrial externa Subramaniano et al., 2013); estas moléculas reclutan a continuación la proteína similar a la mota asociada a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasas (ASC) y pro-caspasa-1 para formar el inflamasoma NLRP3. Este evento activa la molécula aguas abajo, caspasa-1, que cataliza el procesamiento proteolítico de pro-IL-1β y pro-IL-18 en sus formas activas y estimula su secreción (Kayagaki et al., 2015; Shi et al., 2015). Es cada vez más evidente que NLRP3 detecta virus ARN al detectar el daño celular o el malestar inducido por las viroporinas (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013; Nieto-Torres et al., 2015), proteínas transmembranas formadoras de poros, codificadas por ciertos virus ARN; estas proteínas alteran la permeabilidad de la membrana a los iones al formar canales de membrana (Tan et al., 2005; Chen e Ichinohe, 2015). Un estudio reciente muestra que la proteína SRAS-CoV E, que comprende sólo 76 aminoácidos, forma canales de Ca 2+-permeables y activa el inflamasoma NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Aunque las proteínas E y 3a del SARS-CoV, que comprenden 274 aminoácidos y contienen tres dominios transmembranas (Zeng et al., 2004; Lu et al., 2006), se cree que actúan como canales Na + /K + y K +, respectivamente (Wilson et al., 2004; Lu et al., 2006; Torres et al., 2007; Parthasarathy et al., 2008; Pervushin et al., 2009; Wang et al., 2011), el papel de la proteína 3a en la activación del inflamasoma NLRP3 permanece desconocido. Aquí, examinamos el papel de la proteína 3a en la activación del inflamasoma NLRP3. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por los Comités de Animales del Instituto de Ciencias Médicas (Universidad de Tokio). Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMMs) fueron preparados como se describió anteriormente (Ichinohe et al., 2009). En resumen, la médula ósea se obtuvo de la tibia y el fémur mediante el lavado con el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM; Nacalai Tesque). Las células de médula ósea fueron cultivadas durante 5 días en DMEM complementadas con un 30% de L929 sobrenadante celular que contiene factor estimulante de colonias de macrófagos, 10% de suero fetal inactivado por calor (FBS) y L-glutamina (2 mM) a 37 • C/5% CO 2. Las células HEK293FT (línea de células renales embrionarias humanas) y las células HeLa (línea de células de carcinoma epitelial humano) se mantuvieron en el DMEM complementadas con un 10% de FBS, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). Las células MDCK (células renales caninas Madin-Darby) y HT-1080 (línea celular de fibrosarcoma humano) se cultivaron en el medio esencial mínimo de Eagle (E-MEM; Nacalai Tesque) complementadas con un 10% de FBS, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). La cepa viral A/PR8 (H1N1) fue cultivada a 35 • C durante 2 días en las cavidades alantóicas de huevos de pollo fértiles de 10 días de edad (Ichinohe et al., 2009). El título viral fue cuantificado en un ensayo de placa estándar utilizando células MDCK (Pang et al., 2013). Plasmids cDNAs codificando las proteínas E y M de la cepa SRAS-CoV Frankfurt 1 (Matsuyama et al., 2005) se obtuvieron mediante transcripción inversa y PCR del ARN total extraído de células Vero infectadas por SRAS-CoV, seguido de amplificación PCR mediante imprimaciones específicas. pcDNA3.1D-3a-V5His fue proporcionado por Ming-Fu Chang (National Taiwan University College of Medicine, Taipei, Taiwán). Para generar los plásmidos pLenti6-E-V5His, pLenti6-3a-V5His, y pLenti-M-V5His, fragmentos de cDNA de E, 3a, y M fueron amplificados de pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His, y pcDNA3.1D-M-V5His usando conjuntos específicos de imprimadores y luego ligados en vectores pLenti6-TOPO (Invitrogen). Para generar plásmidos pCA7-flag-E, pCA7-flag-3a, y pCA7flag-M, pCA7-HA-E, pCA7-HA-3a, y pCA7-HA-M, fragmentos de cDNA de E, 3a, y M fueron amplificados de pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His, y pcDNA3.1D-M-V5His utilizando conjuntos específicos de imprimación, digeridos con EcoR I y no I, y subclonados en los sitios EcoR I-Not I del plásmido pCA7-flag-ASC o pCA7-HA-M2, respectivamente (Ito et al., 2012). Para construir plásmidos que expresan el mutante E V25F, los fragmentos de E mutados fueron amplificados por PCR inversa con plásmidos que contienen E de tipo salvaje y conjuntos de imprimación específicos. Los productos de PCR fueron cortados por Dpn I, ligados en una reacción que contiene ligasa y T4 cinasa y luego transformados en células competentes DH5α (TOYOBO). Para construir plásmidos que expresan el mutante 3a 3a-CS, fragmentos fueron amplificados de plásmidos que contienen salvaje tipo 3a utilizando conjuntos de imprimación específicos 3a y transformados como se describe anteriormente. Las células HEK293FT fueron sembradas en placas de racimo de 24 pocillos y transfectadas con 1 μg de pLenti6-E/3a/M-V5His, pLenti-GFP (proteína fluorescente verde), o pLenti-M2 utilizando polietilenimina (PEI) Max. A las 24 horas de la transfección, las células fueron lisadas con tampón RIPA (50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 0,05% de sulfato de dodecil sódico (SDS), 150 mM NaCl y 1 mM EDTA). Y los lisatos fueron sometidos a electroforesis de gel de poliacrilamida SDS (PAGE), seguida de electroblote en membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas fueron incubadas durante la noche con anticuerpos anti-V5-tag del ratón (R960-25, Invitrogen), anti-influenza A del ratón M2 (14C2, Abcam), anti-GFP del ratón (GF200, Nacalai Tesque) o antitubulina del conejo (DM1A, Santa Cruz), seguidos de anticuerpos anti-mouse IgG (Jackson Immuno Research Laboratories) o anti-rabbit IgG (Invitrogen). Después de lavar 3 veces con tampón de lavado (0,05% Tween-20/PBS), las membranas fueron expuestas usando Chemi-Lumi One Super (Nacalai Tesque), y las señales quimioluminiscentes fueron capturadas por un mini aparato ImageQuant LAS-4000 (GE Healthcare). Para generar lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E, 3a y M, el cDNA de longitud completa codificando cada proteína viral fue clonado en el vector pLenti6.3/V5-TOPO (Invitrogen) usando los siguientes imprimadores: SARS-CoV E hacia adelante, 5 -caccatgttactctctctctctcgga-3, y hacia atrás, 5 -gaccagaagatcaggaactc-3 ; SARS-CoV 3a hacia adelante, 5caccatggttttttatgagagatt-3, y hacia atrás, 5 -caaaggcacgcctagtagtcg-3 ; SARS-CoV M hacia adelante, 5 -caccatggcaagaggctatat-3, y hacia atrás, 5 -cctactagcaaagcaa Las monocapas subconfluentes de células HEK293FT sembradas en un plato recubierto de colágeno (10 cm de diámetro) fueron transfectadas con 3 μg de pLenti6.3/V5-TOPO vector que expresaba cada proteína viral o EGFP junto con ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los sobrenadantes que contenían lentivirus fueron recolectados y filtrados a través de un filtro de 0,45 μm (Millipore) a 72-96 h de post-transfección (Ito et al., 2012). El título lentiviral fue luego cuantificado utilizando células HT-1080 como se describió anteriormente. Los macrófagos derivados de la médula ósea fueron plateados a una densidad de 8 × 10 5 en placa de 24 pozos e infectados con el virus de la gripe A/PR8 o lentivirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 o 0,2 durante 1 h, respectivamente. Luego, los BMM fueron estimulados con 1 μg/ml de LPS y cultivados por 23 h adicionales en medio completo. Los sobrenadantes fueron recolectados a las 24 h post-infección y centrifugados para eliminar desechos celulares. La cantidad de IL-1β en los sobrenadantes fue medida en un ensayo inmunosorbente enzimático (ELISA) usando anticuerpos emparejados (eBioscience) (Ichinohe et al., 2010. Para aclarar la localización celular de las proteínas de tipo salvaje y mutante 3a del SARS-CoV, las células HeLa fueron cultivadas en coverslips y transfectadas con 1 μg de pCA7-flag-3a o pCD7-flag-3a-CS junto con 0,5 μg de ER-mCherry o DsRed-Golgi (Ito et al., 2012). A las 24 h de post-transfección, las células fueron fijas con 4% de paraformaldehído y permeabilizadas con 1% de Triton X-100/PBS. Después de lavar con PBS y bloquear con 4% de BSA/PBS, las células fueron incubadas con un anticuerpo anti-flag de ratón (M2, Sigma) seguido de incubación con Alexa Fluor 488-conjugado IgG (H+L) anti Para observar la distribución celular de NLRP3 en las células E-o 3a-expresantes, las células HeLa fueron cultivadas en labio-cubierto y transfectadas con 1 μg de pCA7-HA-E, pCA7-HA-EV25F, pCA7-HA-3a, pCA7-HA-3a-CS, o vector de control pCA7 junto con 0,5 μg de pCA7-NLRP3. A las 24 h post-transfección, las células fueron fijas y permeabilizadas con 4% de paraformaldehído y 1% de Tritón X-100/PBS. Después del lavado y bloqueo, las células fueron incubadas con anticuerpos anti-HA del conejo (561, MBL) y anti-NLRP3 del ratón (Cryo-2; AdipoGen), seguidos por Alexa Fluor 488-conjugado de cabra anti-rabbit IgG (H+L) y Alexa Fluor 568-conjugado de cabra anti-mouse IgG (H+L) (Tecnologías de la Vida). Las señales fluorescentes fueron observadas por microscopía confocal (A1R +, Nikon). Anteriormente demostramos que la proteína del virus de la gripe M2 (un canal ion selectivo de protones), su mutante H37G (que ha perdido su selectividad de protones y permite el transporte de otros cationes como Na + y K + ), y la proteína EMCV 2B (un canal Ca 2+) estimula la secreción de IL-1β mediada por NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012). Además, la proteína SRAS-CoV E actúa como un canal de iones permeables a Ca 2+ que activa el NLRP3 inflamaso (Nieto- Torres et al., 2015). El hecho de que 3a proteína de SARS-CoV actúa como viroporina nos llevó a examinar si también desencadena la activación de la inflamación. De esta manera, primero generamos plásmidos lentivirus que expresaban proteínas etiquetadas con V5 y confirmamos su expresión en células HEK293FT mediante el análisis de inmunoblot (Figuras 1A-C). Luego transferimos BMM de lipopolisacárido (LPS) con los lentivirus que expresaban las proteínas SRAS-CoV E, 3a, M, virus influenza M2, o EMCV 2B. De acuerdo con informes anteriores (Ichinohe et al., Figura 1D). De igual manera, los lentivirus que expresan las proteínas SRAS-CoV E o 3a estimulaban la liberación de IL-1β de BMMs con LPS (Figura 1D). Además, la secreción de IL-1β de BMMs con LPSprimed coinfectados con lentivirus E-y 3a-expresantes fue significativamente superior a la de las células infectadas con lentivirus SRAS-CoV (Figura 1E). Estos datos indicaron que la expresión de la viroporina 3a de SARS-CoV es suficiente para estimular la secreción de IL-1β por BMMs con LPS-primed. Estudios anteriores demostraron que los aminoácidos N-terminales 40 de la proteína SRAS-CoV E son importantes para la formación de canales de iones, y que las mutaciones N15A y V25F [ubicadas en el dominio transmembrana (a partir de residuos de aminoácidos 7-38]] previenen la conductividad iónica (Wilson et al., 2004; Torres et al., Además, la proteína SRAS-CoV 3a contiene un dominio rico en cisteína (residuos de aminoácidos 127-133) que participa en la formación de un homodímero para generar el canal iónico (Lu et al., 2006; Chan et al., 2009). Así, la mutación del dominio rico en cisteína bloquea la conductividad iónica por la proteína 3a (Chan et al., 2009). Con este fin, sustituimos los aminoácidos Cys-127, Cys-130 y Cys-133 dentro del dominio rico en cisteína de la proteína SRAS-CoV 3a con serina para generar un lentivirus que expresa el mutante de actividad de pérdida del canal iónico, 3a-CS (Chan et al., 2009; Figura 2A). Para comprobar si la actividad de los canales iónicos de la proteína SRAS-CoV 3a es necesaria para estimular la secreción de IL-1β, tradujimos BMMs con lentivirus que expresan las proteínas SRAS-CoV E, V25F, 3a, 3a-CS o M. De acuerdo con un informe anterior (Nieto -Torres et al., 2015), encontramos que el lentivirus mutante V25F no estimuló la liberación de IL-1β de los BMMs (Figura 2B). En particular, la secreción de IL-1β completamente abrogada de 3a-CS (Figura 2B), sugiriendo que la actividad de los canales iónicos de la proteína 3a es necesaria para la secreción de IL-1β inducida por SRAS-CoV 3a. FIGURA 4 Activación inflamasoma NLRP3 por SARS-CoV 3a. Las células HeLa fueron transfectadas con la expresión plasmid codificando NLRP3 y que codificando SARS-CoV 3a, 3a-CS, E o V25F, y con un microscopio confocal. Barras de escala, 10 μm. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes. A continuación, determinamos la localización subcelular de la proteína SARS-CoV 3a utilizando microscopía confocal. Cuando los sobrenadantes libres de SARS-CoV fueron recolectados a 24 h (lentivirus) o 6 h (ATP) post-infección o estimulación, y analizados para IL-1β por ELISA. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes, e indican la media ± DE; * * P < 0,01 y * * P < 0,001. 3a proteína se expresó en las células HeLa, se observaron dos patrones de distribución principales. De acuerdo con informes anteriores (Yu et al., 2004; Yuan et al., 2005), la proteína 3a localizada en el aparato Golgi (Figura 3A ). Además, las proteínas 3a concentradas en estructuras puntuales, que principalmente se localizaron en el retículo endoplasmático (ER) (Figura 3B ). Por el contrario, el mutante 3a-CS se concentró en el aparato Golgi más que en la EA y no formaron estructuras puntuales (Figuras 3A, B). A continuación se examinó la localización intracelular de NLRP3. La activación del flammasoma NLRP3 llevó a una redistribución del citosol al espacio perinuclear, un proceso considerado como distintivo de la activación del NLRP3 (Zhou et al., 2011; Ito et al., 2012; Johnson et al., 2013; Moriyama et al., 2016). Aunque las células que expresan los mutantes de actividad-pérdida de los canales iónicos 3a-CS o V25F expresaron uniformemente el NLRP3 a lo largo del citoplasma, se redistribuyó a la región perinuclear en las células de expresión SRAS-CoV 3a-o E (figura 4). Juntos, estos datos proporcionan evidencia de que la actividad del canal iónico de la proteína SRAS-CoV 3a es esencial para desencadenar el flammasomasoma NLRP3. Tanto K + Efflux como ROS Production están involucrados en la liberación de IL-1β Inducida por la proteína SRAS-CoV 3a Finalmente, investigamos el mecanismo por el cual SRAS-CoV 3a activa la flammasoma NLRP3. Un estudio previo mostró que la proteína 3a de SRAS-CoV actúa como un canal K + (Lu et al., 2006). Además, K + eflux es un activador bien conocido de la flammasoma NLRP3 (Mariathasan et al., 2006; Petrilli et al., 2007). Estas observaciones nos llevaron a examinar si K + eflux es necesario para la secreción de 3a IL-1β mediada. Para ello, los BMM en medio rico en K + fueron infectados con virus influenza A o lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E o 3a. De acuerdo con un resultado previo (Ichinohe et al., 2010), encontramos que la secreción de IL-1β causada por el virus influenza fue completamente bloqueada cuando la concentración extracelular de K + fue aumentada a 130 mM (Figura 5A). El efecto inhibidor del medio rico en K + también fue observado cuando las células fueron estimuladas con lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E o 3a (Figura 5B ). Dado que los ROS mitocondriales son importantes para la activación del inflamasoma NLRP3 (Nakahira et al., 2011; Zhou et al., 2011), a continuación estimulamos los BMM con ATP o lentivirus extracelulares que expresan las proteínas SARS-CoV E o 3a en presencia o ausencia del antioxidante, Mito-TEMPO, un tesoro específico para los ROS Trnka et al., 2009). Como se informó anteriormente (Nakahira et al., 2011; Ito et al., 2012), el tratamiento de los BMM con secreción de IL-1β Mito-TEMPO completamente bloqueada en respuesta a ATP (Figura 6A). De manera similar, la liberación de IL-1β inducida por las proteínas SARS-CoV E y 3a fue significativamente inhibida por Mito-TEMPO (Figura 6B). Estas observaciones indican que la proteína SARS-CoV 3a interrumpe las concentraciones iónicas intracelulares y causa daños mitocondriales, activando así el inflamasoma NLRP3. En resumen, encontramos que la actividad del canal iónico de la proteína SARS-CoV 3a es esencial para la activación del inflamasoma NLRP3. Además, tanto la producción de K + eflujo y ROS mitocondriales son necesarios para la secreción de IL-1β mediada por SARS-CoV 3a. Hasta ahora, se han propuesto varios modelos para explicar la activación de NLRP3 inflamasoma por virus ARN. En primer lugar, el ARN viral o productos de escisión del ARN generados por la RNASa L activan el inflamasoma NLRP3 a través de la helicasa DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). En segundo lugar, las viroporinas codificadas por virus del ARN activan el inflamasoma NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013; Nieto-Torres et al., 2015). En el caso del virus de la gripe, el canal de iones M2 selectivo de protones en la red trans-Golgi ácida activa el flammasome NLRP3 (Ichinohe et al., 2010). Curiosamente, un mutante M2 en el que la histidina fue sustituida por glicina en la posición 37 (H37G), causando pérdida de selectividad de protones, permite el transporte de otros cationes (es decir, Na+ y K+), lo que conduce a una secreción mejorada de IL-1β de BMMs de LPS y células dendríticas cuando se compara con la proteína de tipo salvaje M2. Además, las proteínas 2B del EMCV, el poliovirus, el enterovirus 71 (EV71) y el rinovirus humano (miembro de la familia Picornaviridae) desencadenan la activación NLRP3 inflamasoma al inducir el flujo de Ca 2+ desde los compartimentos ER y Golgi (Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013). Además, el virus de la hepatitis C estimula la producción de IL-1β mediada por NLRP3 inflamado a través de su p7 viroporina (Negash et al., 2013; Farag et al., 2017). En tercer lugar, un estudio reciente ha demostrado que la proteína 3D del EV71 interactúa directamente con el NLRP3 para facilitar el montaje del complejo NLRP3 inflamasoma (Wang et al., 2017). En el caso de SARS-CoV, las formas de viroporina E forman canales de iones permeables Ca 2+ y activan el inflamasoma NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Además, se encontró que otra viroporina 3a induce la activación del inflamasoma NLRP3 (Yue et al., 2018). Aunque la sustitución de alanina en Cys-133, que se requiere para la formación de dimer o tetrameros (Lu et al., 2006), todavía permite la activación del flammasoma NLRP3 interactuando con caspasa-1 (Yue et al., 2018), la actividad de los canales iónicos - pérdida mutante 3a-CS (Cys-to-Ser sustitución en las posiciones Cys-127, Cys-130 y Cys-133) (Chan et al., 2009 ) completamente abrogado IL-1β secreción de BMMs LPS-primed, lo que sugiere que la proteína 3a de SARS-CoV tiene la capacidad de inducir la activación de inflamación NLRP3 por múltiples mecanismos. Estudios anteriores muestran que la proteína 3a del SARS-CoV está localizada en la membrana plasmática (Minakshi y Padhan, 2014) y actúa como un canal K+ (Lu et al., 2006), estimulando así (presumiblemente) el flujo K+ en la membrana plasmática. De hecho, encontramos que la secreción de IL-1β causada por la proteína 3a fue significativamente inhibida cuando la concentración de K+ extracelular aumentó a 130 mM. Aunque no queda claro si otra viroporina 8a de SARS-CoV (Castano-Rodriguez et al., 2018) activa la inflamación del NLRP3, estos datos destacan la importancia de las viroporinas en la activación del NLRP3 inducida por el SARS-CoV. Una mejor comprensión del mecanismo que rige el flammasoma NLRP3 facilitará el desarrollo de intervenciones más eficaces para el tratamiento de enfermedades infecciosas y aumentará nuestra comprensión de la patogénesis viral.

¿Dónde se activa el flammasoma NLRP3 después de una infección por SARS-CoV?

El síndrome respiratorio agudo severo Coronavirus Viroporina 3a Activa el Inflammasome NLRP3https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6361828/SHA: f02d0c1e8b0109648e578662dc250abe349a033cAutores: Chen, I-Yin; Moriyama, Miyu; Chang, Ming-Fu; Ichinohe, TakeshiFecha: 2019-01-29DOI: 10.3389/fmicb.2019.00050Licencia: cc-byAbstract: Familia de receptores tipo nod, dominio de pirina 3 (NLRP3) regula la secreción de citocinas proinflamatorias interleucina 1 beta (IL-1β) e IL-18. Anteriormente se demostró que las proteínas 2B del virus de la gripe M2 o encefalomiocarditis (EMCV) estimulan la secreción de IL-1β después de la activación del flammasoma NLRP3. Sin embargo, el mecanismo por el cual el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) activa el flammasoma NLRP3 permanece desconocido. Aquí, proporcionamos evidencia directa de que la proteína SRAS-CoV 3a activa el flammasoma NLRP3 en macrófagos lipopolisacáridos. SRAS-CoV 3a fue suficiente para causar la activación del flammasoma NLRP3. La actividad del canal iónico de la proteína 3a fue esencial para la secreción de IL-1β mediada por 3a. Mientras que las células no infectadas o infectadas por un lentivirus que expresaban una proteína 3a defectuosa en la actividad de los canales iónicos expresaban NLRP3 de manera uniforme en todo el citoplasma, NLRP3 se redistribuyó al espacio perinuclear en las células infectadas por un lentivirus que expresaba la proteína 3a. Las especies K(+) eflujo y oxígeno reactivo mitocondrial fueron importantes para la activación del flammasoma SRAS-CoV 3a inducida por NLRP3. Estos resultados destacan la importancia de las viroporinas, proteínas virales formadoras de poros transmembranas, en la activación del NLRP3 inflamatorio inducida por virus. Texto: Síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV), miembro del género Betacoronavirus de la familia Coronaviridae, es un virus envuelto con un genoma Los 5 dos tercios del genoma codifican grandes precursores de poliproteínas, marco abierto de lectura (ORF) 1 y ORF1b, que son proteolíticamente cortados para generar 16 proteínas no estructurales (Tan et al., 2005). El 3 un tercio del genoma codifica cuatro proteínas estructurales, pico (S), sobre (E), matriz (M) y nucleocápsido (N), y proteínas no estructurales, junto con un conjunto de proteínas accesorias (3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b y 9b) (Perlman y Dandekar, 2005; Tan et al., 2005). El SARS-CoV es el agente etiológico del SARS (Drosten et al., 2003; Fouchier et al., 2003; Ksiazek et al., 2003; Kuiken et al., 2003; Peiris et al., 2003). Entre noviembre de 2002 y julio de 2003 se denunciaron a la Organización Mundial de la Salud por lo menos 8.098 casos confirmados en laboratorio de infección humana, con una tasa de mortalidad del 9,6%, y se detectaron altos niveles de citocinas proinflamatorias, incluidos el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, la interleucina (IL)-1β e IL-6, en los tejidos de autopsia de pacientes con SARS (He et al., 2006). Aunque la regulación de las citocinas inflamatorias puede estar involucrada en lesiones pulmonares y la patogénesis del SARS-CoV, no se El sistema inmunitario innato utiliza receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) para detectar patrones moleculares asociados con patógenos (Medzhitov, 2001; Kawai y Akira, 2010). El reconocimiento de la infección por virus juega un papel importante en la limitación de la replicación del virus en las primeras etapas de la infección. Familia de receptores tipo nod, dominio de pirina 3 (NLRP3) se activa por una amplia variedad de estímulos, incluyendo la infección por virus (Bauernfeind et al., 2011). Cuatro modelos que describen la activación de la inflamación NLRP3 se han propuesto hasta ahora (Hornung y Latz, 2010; Schroder et al., 2010; Tschopp y Schroder, 2010). En primer lugar, las alteraciones en las concentraciones iónicas intracelulares, incluyendo K + eflujo y Ca 2 + afluencia, juegan un papel importante (Fernandes-Alnemri et al., 2007; Petrilli et al., 2007; Arlehamn et al., 2010; Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Murakami et al., 2012; Muñoz-Planillo et al., 2013). En segundo lugar, la catepsina B y L, que son proteasasas de cisteína lisosómicas específicas, son aunque jugar un papel después de la fagocitosis de cristales de colesterol (Duewell et al., 2010), péptido fibrilar amiloide-beta, cristales de sílice y sales de aluminio. En tercer lugar, la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) o ADN mitocondrial a partir de mitocondrias dañadas (Zhou et al., 2011 Nakahira et al., 2011; Shimada et al., 2012). Finalmente, los productos de escisión de ARN viral o ARN generados por la Rnasa L activan el inflamasoma NLRP3 a través de la helicasa DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). Al activarse, el NLRP3 se recluta a las mitocondrias mediante asociación con la señalización antiviral mitocondrial (MAVS) o mitofusina 2 expresada en la membrana mitocondrial externa Subramaniano et al., 2013); estas moléculas reclutan a continuación la proteína similar a la mota asociada a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasas (ASC) y pro-caspasa-1 para formar el inflamasoma NLRP3. Este evento activa la molécula aguas abajo, caspasa-1, que cataliza el procesamiento proteolítico de pro-IL-1β y pro-IL-18 en sus formas activas y estimula su secreción (Kayagaki et al., 2015; Shi et al., 2015). Es cada vez más evidente que NLRP3 detecta virus ARN al detectar el daño celular o el malestar inducido por las viroporinas (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013; Nieto-Torres et al., 2015), proteínas transmembranas formadoras de poros, codificadas por ciertos virus ARN; estas proteínas alteran la permeabilidad de la membrana a los iones al formar canales de membrana (Tan et al., 2005; Chen e Ichinohe, 2015). Un estudio reciente muestra que la proteína SRAS-CoV E, que comprende sólo 76 aminoácidos, forma canales de Ca 2+-permeables y activa el inflamasoma NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Aunque las proteínas E y 3a del SARS-CoV, que comprenden 274 aminoácidos y contienen tres dominios transmembranas (Zeng et al., 2004; Lu et al., 2006), se cree que actúan como canales Na + /K + y K +, respectivamente (Wilson et al., 2004; Lu et al., 2006; Torres et al., 2007; Parthasarathy et al., 2008; Pervushin et al., 2009; Wang et al., 2011), el papel de la proteína 3a en la activación del inflamasoma NLRP3 permanece desconocido. Aquí, examinamos el papel de la proteína 3a en la activación del inflamasoma NLRP3. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por los Comités de Animales del Instituto de Ciencias Médicas (Universidad de Tokio). Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMMs) fueron preparados como se describió anteriormente (Ichinohe et al., 2009). En resumen, la médula ósea se obtuvo de la tibia y el fémur mediante el lavado con el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM; Nacalai Tesque). Las células de médula ósea fueron cultivadas durante 5 días en DMEM complementadas con un 30% de L929 sobrenadante celular que contiene factor estimulante de colonias de macrófagos, 10% de suero fetal inactivado por calor (FBS) y L-glutamina (2 mM) a 37 • C/5% CO 2. Las células HEK293FT (línea de células renales embrionarias humanas) y las células HeLa (línea de células de carcinoma epitelial humano) se mantuvieron en el DMEM complementadas con un 10% de FBS, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). Las células MDCK (células renales caninas Madin-Darby) y HT-1080 (línea celular de fibrosarcoma humano) se cultivaron en el medio esencial mínimo de Eagle (E-MEM; Nacalai Tesque) complementadas con un 10% de FBS, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). La cepa viral A/PR8 (H1N1) fue cultivada a 35 • C durante 2 días en las cavidades alantóicas de huevos de pollo fértiles de 10 días de edad (Ichinohe et al., 2009). El título viral fue cuantificado en un ensayo de placa estándar utilizando células MDCK (Pang et al., 2013). Plasmids cDNAs codificando las proteínas E y M de la cepa SRAS-CoV Frankfurt 1 (Matsuyama et al., 2005) se obtuvieron mediante transcripción inversa y PCR del ARN total extraído de células Vero infectadas por SRAS-CoV, seguido de amplificación PCR mediante imprimaciones específicas. pcDNA3.1D-3a-V5His fue proporcionado por Ming-Fu Chang (National Taiwan University College of Medicine, Taipei, Taiwán). Para generar los plásmidos pLenti6-E-V5His, pLenti6-3a-V5His, y pLenti-M-V5His, fragmentos de cDNA de E, 3a, y M fueron amplificados de pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His, y pcDNA3.1D-M-V5His usando conjuntos específicos de imprimadores y luego ligados en vectores pLenti6-TOPO (Invitrogen). Para generar plásmidos pCA7-flag-E, pCA7-flag-3a, y pCA7flag-M, pCA7-HA-E, pCA7-HA-3a, y pCA7-HA-M, fragmentos de cDNA de E, 3a, y M fueron amplificados de pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His, y pcDNA3.1D-M-V5His utilizando conjuntos específicos de imprimación, digeridos con EcoR I y no I, y subclonados en los sitios EcoR I-Not I del plásmido pCA7-flag-ASC o pCA7-HA-M2, respectivamente (Ito et al., 2012). Para construir plásmidos que expresan el mutante E V25F, los fragmentos de E mutados fueron amplificados por PCR inversa con plásmidos que contienen E de tipo salvaje y conjuntos de imprimación específicos. Los productos de PCR fueron cortados por Dpn I, ligados en una reacción que contiene ligasa y T4 cinasa y luego transformados en células competentes DH5α (TOYOBO). Para construir plásmidos que expresan el mutante 3a 3a-CS, fragmentos fueron amplificados de plásmidos que contienen salvaje tipo 3a utilizando conjuntos de imprimación específicos 3a y transformados como se describe anteriormente. Las células HEK293FT fueron sembradas en placas de racimo de 24 pocillos y transfectadas con 1 μg de pLenti6-E/3a/M-V5His, pLenti-GFP (proteína fluorescente verde), o pLenti-M2 utilizando polietilenimina (PEI) Max. A las 24 horas de la transfección, las células fueron lisadas con tampón RIPA (50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 0,05% de sulfato de dodecil sódico (SDS), 150 mM NaCl y 1 mM EDTA). Y los lisatos fueron sometidos a electroforesis de gel de poliacrilamida SDS (PAGE), seguida de electroblote en membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas fueron incubadas durante la noche con anticuerpos anti-V5-tag del ratón (R960-25, Invitrogen), anti-influenza A del ratón M2 (14C2, Abcam), anti-GFP del ratón (GF200, Nacalai Tesque) o antitubulina del conejo (DM1A, Santa Cruz), seguidos de anticuerpos anti-mouse IgG (Jackson Immuno Research Laboratories) o anti-rabbit IgG (Invitrogen). Después de lavar 3 veces con tampón de lavado (0,05% Tween-20/PBS), las membranas fueron expuestas usando Chemi-Lumi One Super (Nacalai Tesque), y las señales quimioluminiscentes fueron capturadas por un mini aparato ImageQuant LAS-4000 (GE Healthcare). Para generar lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E, 3a y M, el cDNA de longitud completa codificando cada proteína viral fue clonado en el vector pLenti6.3/V5-TOPO (Invitrogen) usando los siguientes imprimadores: SARS-CoV E hacia adelante, 5 -caccatgttactctctctctctcgga-3, y hacia atrás, 5 -gaccagaagatcaggaactc-3 ; SARS-CoV 3a hacia adelante, 5caccatggttttttatgagagatt-3, y hacia atrás, 5 -caaaggcacgcctagtagtcg-3 ; SARS-CoV M hacia adelante, 5 -caccatggcaagaggctatat-3, y hacia atrás, 5 -cctactagcaaagcaa Las monocapas subconfluentes de células HEK293FT sembradas en un plato recubierto de colágeno (10 cm de diámetro) fueron transfectadas con 3 μg de pLenti6.3/V5-TOPO vector que expresaba cada proteína viral o EGFP junto con ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los sobrenadantes que contenían lentivirus fueron recolectados y filtrados a través de un filtro de 0,45 μm (Millipore) a 72-96 h de post-transfección (Ito et al., 2012). El título lentiviral fue luego cuantificado utilizando células HT-1080 como se describió anteriormente. Los macrófagos derivados de la médula ósea fueron plateados a una densidad de 8 × 10 5 en placa de 24 pozos e infectados con el virus de la gripe A/PR8 o lentivirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 o 0,2 durante 1 h, respectivamente. Luego, los BMM fueron estimulados con 1 μg/ml de LPS y cultivados por 23 h adicionales en medio completo. Los sobrenadantes fueron recolectados a las 24 h post-infección y centrifugados para eliminar desechos celulares. La cantidad de IL-1β en los sobrenadantes fue medida en un ensayo inmunosorbente enzimático (ELISA) usando anticuerpos emparejados (eBioscience) (Ichinohe et al., 2010. Para aclarar la localización celular de las proteínas de tipo salvaje y mutante 3a del SARS-CoV, las células HeLa fueron cultivadas en coverslips y transfectadas con 1 μg de pCA7-flag-3a o pCD7-flag-3a-CS junto con 0,5 μg de ER-mCherry o DsRed-Golgi (Ito et al., 2012). A las 24 h de post-transfección, las células fueron fijas con 4% de paraformaldehído y permeabilizadas con 1% de Triton X-100/PBS. Después de lavar con PBS y bloquear con 4% de BSA/PBS, las células fueron incubadas con un anticuerpo anti-flag de ratón (M2, Sigma) seguido de incubación con Alexa Fluor 488-conjugado IgG (H+L) anti Para observar la distribución celular de NLRP3 en las células E-o 3a-expresantes, las células HeLa fueron cultivadas en labio-cubierto y transfectadas con 1 μg de pCA7-HA-E, pCA7-HA-EV25F, pCA7-HA-3a, pCA7-HA-3a-CS, o vector de control pCA7 junto con 0,5 μg de pCA7-NLRP3. A las 24 h post-transfección, las células fueron fijas y permeabilizadas con 4% de paraformaldehído y 1% de Tritón X-100/PBS. Después del lavado y bloqueo, las células fueron incubadas con anticuerpos anti-HA del conejo (561, MBL) y anti-NLRP3 del ratón (Cryo-2; AdipoGen), seguidos por Alexa Fluor 488-conjugado de cabra anti-rabbit IgG (H+L) y Alexa Fluor 568-conjugado de cabra anti-mouse IgG (H+L) (Tecnologías de la Vida). Las señales fluorescentes fueron observadas por microscopía confocal (A1R +, Nikon). Anteriormente demostramos que la proteína del virus de la gripe M2 (un canal ion selectivo de protones), su mutante H37G (que ha perdido su selectividad de protones y permite el transporte de otros cationes como Na + y K + ), y la proteína EMCV 2B (un canal Ca 2+) estimula la secreción de IL-1β mediada por NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012). Además, la proteína SRAS-CoV E actúa como un canal de iones permeables a Ca 2+ que activa el NLRP3 inflamaso (Nieto- Torres et al., 2015). El hecho de que 3a proteína de SARS-CoV actúa como viroporina nos llevó a examinar si también desencadena la activación de la inflamación. De esta manera, primero generamos plásmidos lentivirus que expresaban proteínas etiquetadas con V5 y confirmamos su expresión en células HEK293FT mediante el análisis de inmunoblot (Figuras 1A-C). Luego transferimos BMM de lipopolisacárido (LPS) con los lentivirus que expresaban las proteínas SRAS-CoV E, 3a, M, virus influenza M2, o EMCV 2B. De acuerdo con informes anteriores (Ichinohe et al., Figura 1D). De igual manera, los lentivirus que expresan las proteínas SRAS-CoV E o 3a estimulaban la liberación de IL-1β de BMMs con LPS (Figura 1D). Además, la secreción de IL-1β de BMMs con LPSprimed coinfectados con lentivirus E-y 3a-expresantes fue significativamente superior a la de las células infectadas con lentivirus SRAS-CoV (Figura 1E). Estos datos indicaron que la expresión de la viroporina 3a de SARS-CoV es suficiente para estimular la secreción de IL-1β por BMMs con LPS-primed. Estudios anteriores demostraron que los aminoácidos N-terminales 40 de la proteína SRAS-CoV E son importantes para la formación de canales de iones, y que las mutaciones N15A y V25F [ubicadas en el dominio transmembrana (a partir de residuos de aminoácidos 7-38]] previenen la conductividad iónica (Wilson et al., 2004; Torres et al., Además, la proteína SRAS-CoV 3a contiene un dominio rico en cisteína (residuos de aminoácidos 127-133) que participa en la formación de un homodímero para generar el canal iónico (Lu et al., 2006; Chan et al., 2009). Así, la mutación del dominio rico en cisteína bloquea la conductividad iónica por la proteína 3a (Chan et al., 2009). Con este fin, sustituimos los aminoácidos Cys-127, Cys-130 y Cys-133 dentro del dominio rico en cisteína de la proteína SRAS-CoV 3a con serina para generar un lentivirus que expresa el mutante de actividad de pérdida del canal iónico, 3a-CS (Chan et al., 2009; Figura 2A). Para comprobar si la actividad de los canales iónicos de la proteína SRAS-CoV 3a es necesaria para estimular la secreción de IL-1β, tradujimos BMMs con lentivirus que expresan las proteínas SRAS-CoV E, V25F, 3a, 3a-CS o M. De acuerdo con un informe anterior (Nieto -Torres et al., 2015), encontramos que el lentivirus mutante V25F no estimuló la liberación de IL-1β de los BMMs (Figura 2B). En particular, la secreción de IL-1β completamente abrogada de 3a-CS (Figura 2B), sugiriendo que la actividad de los canales iónicos de la proteína 3a es necesaria para la secreción de SRAS-CoV 3a-inducida por IL-1β. FIGURA 4 Activación inflamasoma NLRP3 por SARS-CoV 3a. Las células HeLa fueron transfectadas con la expresión plasmid codificando NLRP3 y que codificando SARS-CoV 3a, 3a-CS, E o V25F, y con un microscopio confocal. Barras de escala, 10 μm. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes. A continuación, determinamos la localización subcelular de la proteína SARS-CoV 3a utilizando microscopía confocal. Cuando los sobrenadantes libres de SARS-CoV fueron recolectados a 24 h (lentivirus) o 6 h (ATP) post-infección o estimulación, y analizados para IL-1β por ELISA. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes, e indican la media ± DE; * * P < 0,01 y * * P < 0,001. 3a proteína se expresó en las células HeLa, se observaron dos patrones de distribución principales. De acuerdo con informes anteriores (Yu et al., 2004; Yuan et al., 2005), la proteína 3a localizada en el aparato Golgi (Figura 3A ). Además, las proteínas 3a concentradas en estructuras puntuales, que principalmente se localizaron en el retículo endoplasmático (ER) (Figura 3B ). Por el contrario, el mutante 3a-CS se concentró en el aparato Golgi más que en la EA y no formaron estructuras puntuales (Figuras 3A, B). A continuación se examinó la localización intracelular de NLRP3. La activación del flammasoma NLRP3 llevó a una redistribución del citosol al espacio perinuclear, un proceso considerado como distintivo de la activación del NLRP3 (Zhou et al., 2011; Ito et al., 2012; Johnson et al., 2013; Moriyama et al., 2016). Aunque las células que expresan los mutantes de actividad-pérdida de los canales iónicos 3a-CS o V25F expresaron uniformemente el NLRP3 a lo largo del citoplasma, se redistribuyó a la región perinuclear en las células de expresión SRAS-CoV 3a-o E (figura 4). Juntos, estos datos proporcionan evidencia de que la actividad del canal iónico de la proteína SRAS-CoV 3a es esencial para desencadenar el flammasomasoma NLRP3. Tanto K + Efflux como ROS Production están involucrados en la liberación de IL-1β Inducida por la proteína SRAS-CoV 3a Finalmente, investigamos el mecanismo por el cual SRAS-CoV 3a activa la flammasoma NLRP3. Un estudio previo mostró que la proteína 3a de SRAS-CoV actúa como un canal K + (Lu et al., 2006). Además, K + eflux es un activador bien conocido de la flammasoma NLRP3 (Mariathasan et al., 2006; Petrilli et al., 2007). Estas observaciones nos llevaron a examinar si K + eflux es necesario para la secreción de 3a IL-1β mediada. Para ello, los BMM en medio rico en K + fueron infectados con virus influenza A o lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E o 3a. De acuerdo con un resultado previo (Ichinohe et al., 2010), encontramos que la secreción de IL-1β causada por el virus influenza fue completamente bloqueada cuando la concentración extracelular de K + fue aumentada a 130 mM (Figura 5A). El efecto inhibidor del medio rico en K + también fue observado cuando las células fueron estimuladas con lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E o 3a (Figura 5B ). Dado que los ROS mitocondriales son importantes para la activación del inflamasoma NLRP3 (Nakahira et al., 2011; Zhou et al., 2011), a continuación estimulamos los BMM con ATP o lentivirus extracelulares que expresan las proteínas SARS-CoV E o 3a en presencia o ausencia del antioxidante, Mito-TEMPO, un tesoro específico para los ROS Trnka et al., 2009). Como se informó anteriormente (Nakahira et al., 2011; Ito et al., 2012), el tratamiento de los BMM con secreción de IL-1β Mito-TEMPO completamente bloqueada en respuesta a ATP (Figura 6A). De manera similar, la liberación de IL-1β inducida por las proteínas SARS-CoV E y 3a fue significativamente inhibida por Mito-TEMPO (Figura 6B). Estas observaciones indican que la proteína SARS-CoV 3a interrumpe las concentraciones iónicas intracelulares y causa daños mitocondriales, activando así el inflamasoma NLRP3. En resumen, encontramos que la actividad del canal iónico de la proteína SARS-CoV 3a es esencial para la activación del inflamasoma NLRP3. Además, tanto la producción de K + eflujo y ROS mitocondriales son necesarios para la secreción de IL-1β mediada por SARS-CoV 3a. Hasta ahora, se han propuesto varios modelos para explicar la activación de NLRP3 inflamasoma por virus ARN. En primer lugar, el ARN viral o productos de escisión del ARN generados por la RNASa L activan el inflamasoma NLRP3 a través de la helicasa DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). En segundo lugar, las viroporinas codificadas por virus del ARN activan el inflamasoma NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013; Nieto-Torres et al., 2015). En el caso del virus de la gripe, el canal de iones M2 selectivo de protones en la red trans-Golgi ácida activa el flammasome NLRP3 (Ichinohe et al., 2010). Curiosamente, un mutante M2 en el que la histidina fue sustituida por glicina en la posición 37 (H37G), causando pérdida de selectividad de protones, permite el transporte de otros cationes (es decir, Na+ y K+), lo que conduce a una secreción mejorada de IL-1β de BMMs de LPS y células dendríticas cuando se compara con la proteína de tipo salvaje M2. Además, las proteínas 2B del EMCV, el poliovirus, el enterovirus 71 (EV71) y el rinovirus humano (miembro de la familia Picornaviridae) desencadenan la activación NLRP3 inflamasoma al inducir el flujo de Ca 2+ desde los compartimentos ER y Golgi (Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013). Además, el virus de la hepatitis C estimula la producción de IL-1β mediada por NLRP3 inflamado a través de su p7 viroporina (Negash et al., 2013; Farag et al., 2017). En tercer lugar, un estudio reciente ha demostrado que la proteína 3D del EV71 interactúa directamente con el NLRP3 para facilitar el montaje del complejo NLRP3 inflamasoma (Wang et al., 2017). En el caso de SARS-CoV, las formas de viroporina E forman canales de iones permeables Ca 2+ y activan el inflamasoma NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Además, se encontró que otra viroporina 3a induce la activación del inflamasoma NLRP3 (Yue et al., 2018). Aunque la sustitución de alanina en Cys-133, que se requiere para la formación de dimer o tetrameros (Lu et al., 2006), todavía permite la activación del flammasoma NLRP3 interactuando con caspasa-1 (Yue et al., 2018), la actividad de los canales iónicos - pérdida mutante 3a-CS (Cys-to-Ser sustitución en las posiciones Cys-127, Cys-130 y Cys-133) (Chan et al., 2009 ) completamente abrogado IL-1β secreción de BMMs LPS-primed, lo que sugiere que la proteína 3a de SARS-CoV tiene la capacidad de inducir la activación de inflamación NLRP3 por múltiples mecanismos. Estudios anteriores muestran que la proteína 3a del SARS-CoV está localizada en la membrana plasmática (Minakshi y Padhan, 2014) y actúa como un canal K+ (Lu et al., 2006), estimulando así (presumiblemente) el flujo K+ en la membrana plasmática. De hecho, encontramos que la secreción de IL-1β causada por la proteína 3a fue significativamente inhibida cuando la concentración de K+ extracelular aumentó a 130 mM. Aunque no queda claro si otra viroporina 8a de SARS-CoV (Castano-Rodriguez et al., 2018) activa la inflamación del NLRP3, estos datos destacan la importancia de las viroporinas en la activación del NLRP3 inducida por el SARS-CoV. Una mejor comprensión del mecanismo que rige el flammasoma NLRP3 facilitará el desarrollo de intervenciones más eficaces para el tratamiento de enfermedades infecciosas y aumentará nuestra comprensión de la patogénesis viral.

¿Qué canal iónico es esencial para la secreción de IL-1Beta mediada por 3a?

El síndrome respiratorio agudo severo Coronavirus Viroporina 3a Activa el Inflammasome NLRP3https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6361828/SHA: f02d0c1e8b0109648e578662dc250abe349a033cAutores: Chen, I-Yin; Moriyama, Miyu; Chang, Ming-Fu; Ichinohe, TakeshiFecha: 2019-01-29DOI: 10.3389/fmicb.2019.00050Licencia: cc-byAbstract: Familia de receptores tipo nod, dominio de pirina 3 (NLRP3) regula la secreción de citocinas proinflamatorias interleucina 1 beta (IL-1β) e IL-18. Anteriormente se demostró que las proteínas 2B del virus de la gripe M2 o encefalomiocarditis (EMCV) estimulan la secreción de IL-1β después de la activación del flammasoma NLRP3. Sin embargo, el mecanismo por el cual el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) activa el flammasoma NLRP3 permanece desconocido. Aquí, proporcionamos evidencia directa de que la proteína SRAS-CoV 3a activa el flammasoma NLRP3 en macrófagos lipopolisacáridos. SRAS-CoV 3a fue suficiente para causar la activación del flammasoma NLRP3. La actividad del canal iónico de la proteína 3a fue esencial para la secreción de IL-1β mediada por 3a. Mientras que las células no infectadas o infectadas por un lentivirus que expresaban una proteína 3a defectuosa en la actividad de los canales iónicos expresaban NLRP3 de manera uniforme en todo el citoplasma, NLRP3 se redistribuyó al espacio perinuclear en las células infectadas por un lentivirus que expresaba la proteína 3a. Las especies K(+) eflujo y oxígeno reactivo mitocondrial fueron importantes para la activación del flammasoma SRAS-CoV 3a inducida por NLRP3. Estos resultados destacan la importancia de las viroporinas, proteínas virales formadoras de poros transmembranas, en la activación del NLRP3 inflamatorio inducida por virus. Texto: Síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV), miembro del género Betacoronavirus de la familia Coronaviridae, es un virus envuelto con un genoma Los 5 dos tercios del genoma codifican grandes precursores de poliproteínas, marco abierto de lectura (ORF) 1 y ORF1b, que son proteolíticamente cortados para generar 16 proteínas no estructurales (Tan et al., 2005). El 3 un tercio del genoma codifica cuatro proteínas estructurales, pico (S), sobre (E), matriz (M) y nucleocápsido (N), y proteínas no estructurales, junto con un conjunto de proteínas accesorias (3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b y 9b) (Perlman y Dandekar, 2005; Tan et al., 2005). El SARS-CoV es el agente etiológico del SARS (Drosten et al., 2003; Fouchier et al., 2003; Ksiazek et al., 2003; Kuiken et al., 2003; Peiris et al., 2003). Entre noviembre de 2002 y julio de 2003 se denunciaron a la Organización Mundial de la Salud por lo menos 8.098 casos confirmados en laboratorio de infección humana, con una tasa de mortalidad del 9,6%, y se detectaron altos niveles de citocinas proinflamatorias, incluidos el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, la interleucina (IL)-1β e IL-6, en los tejidos de autopsia de pacientes con SARS (He et al., 2006). Aunque la regulación de las citocinas inflamatorias puede estar involucrada en lesiones pulmonares y la patogénesis del SARS-CoV, no se El sistema inmunitario innato utiliza receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) para detectar patrones moleculares asociados con patógenos (Medzhitov, 2001; Kawai y Akira, 2010). El reconocimiento de la infección por virus juega un papel importante en la limitación de la replicación del virus en las primeras etapas de la infección. Familia de receptores tipo nod, dominio de pirina 3 (NLRP3) se activa por una amplia variedad de estímulos, incluyendo la infección por virus (Bauernfeind et al., 2011). Cuatro modelos que describen la activación de la inflamación NLRP3 se han propuesto hasta ahora (Hornung y Latz, 2010; Schroder et al., 2010; Tschopp y Schroder, 2010). En primer lugar, las alteraciones en las concentraciones iónicas intracelulares, incluyendo K + eflujo y Ca 2 + afluencia, juegan un papel importante (Fernandes-Alnemri et al., 2007; Petrilli et al., 2007; Arlehamn et al., 2010; Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Murakami et al., 2012; Muñoz-Planillo et al., 2013). En segundo lugar, la catepsina B y L, que son proteasasas de cisteína lisosómicas específicas, son aunque jugar un papel después de la fagocitosis de cristales de colesterol (Duewell et al., 2010), péptido fibrilar amiloide-beta, cristales de sílice y sales de aluminio. En tercer lugar, la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) o ADN mitocondrial a partir de mitocondrias dañadas (Zhou et al., 2011 Nakahira et al., 2011; Shimada et al., 2012). Finalmente, los productos de escisión de ARN viral o ARN generados por la Rnasa L activan el inflamasoma NLRP3 a través de la helicasa DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). Al activarse, el NLRP3 se recluta a las mitocondrias mediante asociación con la señalización antiviral mitocondrial (MAVS) o mitofusina 2 expresada en la membrana mitocondrial externa Subramaniano et al., 2013); estas moléculas reclutan a continuación la proteína similar a la mota asociada a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasas (ASC) y pro-caspasa-1 para formar el inflamasoma NLRP3. Este evento activa la molécula aguas abajo, caspasa-1, que cataliza el procesamiento proteolítico de pro-IL-1β y pro-IL-18 en sus formas activas y estimula su secreción (Kayagaki et al., 2015; Shi et al., 2015). Es cada vez más evidente que NLRP3 detecta virus ARN al detectar el daño celular o el malestar inducido por las viroporinas (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013; Nieto-Torres et al., 2015), proteínas transmembranas formadoras de poros, codificadas por ciertos virus ARN; estas proteínas alteran la permeabilidad de la membrana a los iones al formar canales de membrana (Tan et al., 2005; Chen e Ichinohe, 2015). Un estudio reciente muestra que la proteína SRAS-CoV E, que comprende sólo 76 aminoácidos, forma canales de Ca 2+-permeables y activa el inflamasoma NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Aunque las proteínas E y 3a del SARS-CoV, que comprenden 274 aminoácidos y contienen tres dominios transmembranas (Zeng et al., 2004; Lu et al., 2006), se cree que actúan como canales Na + /K + y K +, respectivamente (Wilson et al., 2004; Lu et al., 2006; Torres et al., 2007; Parthasarathy et al., 2008; Pervushin et al., 2009; Wang et al., 2011), el papel de la proteína 3a en la activación del inflamasoma NLRP3 permanece desconocido. Aquí, examinamos el papel de la proteína 3a en la activación del inflamasoma NLRP3. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por los Comités de Animales del Instituto de Ciencias Médicas (Universidad de Tokio). Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMMs) fueron preparados como se describió anteriormente (Ichinohe et al., 2009). En resumen, la médula ósea se obtuvo de la tibia y el fémur mediante el lavado con el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM; Nacalai Tesque). Las células de médula ósea fueron cultivadas durante 5 días en DMEM complementadas con un 30% de L929 sobrenadante celular que contiene factor estimulante de colonias de macrófagos, 10% de suero fetal inactivado por calor (FBS) y L-glutamina (2 mM) a 37 • C/5% CO 2. Las células HEK293FT (línea de células renales embrionarias humanas) y las células HeLa (línea de células de carcinoma epitelial humano) se mantuvieron en el DMEM complementadas con un 10% de FBS, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). Las células MDCK (células renales caninas Madin-Darby) y HT-1080 (línea celular de fibrosarcoma humano) se cultivaron en el medio esencial mínimo de Eagle (E-MEM; Nacalai Tesque) complementadas con un 10% de FBS, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). La cepa viral A/PR8 (H1N1) fue cultivada a 35 • C durante 2 días en las cavidades alantóicas de huevos de pollo fértiles de 10 días de edad (Ichinohe et al., 2009). El título viral fue cuantificado en un ensayo de placa estándar utilizando células MDCK (Pang et al., 2013). Plasmids cDNAs codificando las proteínas E y M de la cepa SRAS-CoV Frankfurt 1 (Matsuyama et al., 2005) se obtuvieron mediante transcripción inversa y PCR del ARN total extraído de células Vero infectadas por SRAS-CoV, seguido de amplificación PCR mediante imprimaciones específicas. pcDNA3.1D-3a-V5His fue proporcionado por Ming-Fu Chang (National Taiwan University College of Medicine, Taipei, Taiwán). Para generar los plásmidos pLenti6-E-V5His, pLenti6-3a-V5His, y pLenti-M-V5His, fragmentos de cDNA de E, 3a, y M fueron amplificados de pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His, y pcDNA3.1D-M-V5His usando conjuntos específicos de imprimadores y luego ligados en vectores pLenti6-TOPO (Invitrogen). Para generar plásmidos pCA7-flag-E, pCA7-flag-3a, y pCA7flag-M, pCA7-HA-E, pCA7-HA-3a, y pCA7-HA-M, fragmentos de cDNA de E, 3a, y M fueron amplificados de pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His, y pcDNA3.1D-M-V5His utilizando conjuntos específicos de imprimación, digeridos con EcoR I y no I, y subclonados en los sitios EcoR I-Not I del plásmido pCA7-flag-ASC o pCA7-HA-M2, respectivamente (Ito et al., 2012). Para construir plásmidos que expresan el mutante E V25F, los fragmentos de E mutados fueron amplificados por PCR inversa con plásmidos que contienen E de tipo salvaje y conjuntos de imprimación específicos. Los productos de PCR fueron cortados por Dpn I, ligados en una reacción que contiene ligasa y T4 cinasa y luego transformados en células competentes DH5α (TOYOBO). Para construir plásmidos que expresan el mutante 3a 3a-CS, fragmentos fueron amplificados de plásmidos que contienen salvaje tipo 3a utilizando conjuntos de imprimación específicos 3a y transformados como se describe anteriormente. Las células HEK293FT fueron sembradas en placas de racimo de 24 pocillos y transfectadas con 1 μg de pLenti6-E/3a/M-V5His, pLenti-GFP (proteína fluorescente verde), o pLenti-M2 utilizando polietilenimina (PEI) Max. A las 24 horas de la transfección, las células fueron lisadas con tampón RIPA (50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 0,05% de sulfato de dodecil sódico (SDS), 150 mM NaCl y 1 mM EDTA). Y los lisatos fueron sometidos a electroforesis de gel de poliacrilamida SDS (PAGE), seguida de electroblote en membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas fueron incubadas durante la noche con anticuerpos anti-V5-tag del ratón (R960-25, Invitrogen), anti-influenza A del ratón M2 (14C2, Abcam), anti-GFP del ratón (GF200, Nacalai Tesque) o antitubulina del conejo (DM1A, Santa Cruz), seguidos de anticuerpos anti-mouse IgG (Jackson Immuno Research Laboratories) o anti-rabbit IgG (Invitrogen). Después de lavar 3 veces con tampón de lavado (0,05% Tween-20/PBS), las membranas fueron expuestas usando Chemi-Lumi One Super (Nacalai Tesque), y las señales quimioluminiscentes fueron capturadas por un mini aparato ImageQuant LAS-4000 (GE Healthcare). Para generar lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E, 3a y M, el cDNA de longitud completa codificando cada proteína viral fue clonado en el vector pLenti6.3/V5-TOPO (Invitrogen) usando los siguientes imprimadores: SARS-CoV E hacia adelante, 5 -caccatgttactctctctctctcgga-3, y hacia atrás, 5 -gaccagaagatcaggaactc-3 ; SARS-CoV 3a hacia adelante, 5caccatggttttttatgagagatt-3, y hacia atrás, 5 -caaaggcacgcctagtagtcg-3 ; SARS-CoV M hacia adelante, 5 -caccatggcaagaggctatat-3, y hacia atrás, 5 -cctactagcaaagcaa Las monocapas subconfluentes de células HEK293FT sembradas en un plato recubierto de colágeno (10 cm de diámetro) fueron transfectadas con 3 μg de pLenti6.3/V5-TOPO vector que expresaba cada proteína viral o EGFP junto con ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los sobrenadantes que contenían lentivirus fueron recolectados y filtrados a través de un filtro de 0,45 μm (Millipore) a 72-96 h de post-transfección (Ito et al., 2012). El título lentiviral fue luego cuantificado utilizando células HT-1080 como se describió anteriormente. Los macrófagos derivados de la médula ósea fueron plateados a una densidad de 8 × 10 5 en placa de 24 pozos e infectados con el virus de la gripe A/PR8 o lentivirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 o 0,2 durante 1 h, respectivamente. Luego, los BMM fueron estimulados con 1 μg/ml de LPS y cultivados por 23 h adicionales en medio completo. Los sobrenadantes fueron recolectados a las 24 h post-infección y centrifugados para eliminar desechos celulares. La cantidad de IL-1β en los sobrenadantes fue medida en un ensayo inmunosorbente enzimático (ELISA) usando anticuerpos emparejados (eBioscience) (Ichinohe et al., 2010. Para aclarar la localización celular de las proteínas de tipo salvaje y mutante 3a del SARS-CoV, las células HeLa fueron cultivadas en coverslips y transfectadas con 1 μg de pCA7-flag-3a o pCD7-flag-3a-CS junto con 0,5 μg de ER-mCherry o DsRed-Golgi (Ito et al., 2012). A las 24 h de post-transfección, las células fueron fijas con 4% de paraformaldehído y permeabilizadas con 1% de Triton X-100/PBS. Después de lavar con PBS y bloquear con 4% de BSA/PBS, las células fueron incubadas con un anticuerpo anti-flag de ratón (M2, Sigma) seguido de incubación con Alexa Fluor 488-conjugado IgG (H+L) anti Para observar la distribución celular de NLRP3 en las células E-o 3a-expresantes, las células HeLa fueron cultivadas en labio-cubierto y transfectadas con 1 μg de pCA7-HA-E, pCA7-HA-EV25F, pCA7-HA-3a, pCA7-HA-3a-CS, o vector de control pCA7 junto con 0,5 μg de pCA7-NLRP3. A las 24 h post-transfección, las células fueron fijas y permeabilizadas con 4% de paraformaldehído y 1% de Tritón X-100/PBS. Después del lavado y bloqueo, las células fueron incubadas con anticuerpos anti-HA del conejo (561, MBL) y anti-NLRP3 del ratón (Cryo-2; AdipoGen), seguidos por Alexa Fluor 488-conjugado de cabra anti-rabbit IgG (H+L) y Alexa Fluor 568-conjugado de cabra anti-mouse IgG (H+L) (Tecnologías de la Vida). Las señales fluorescentes fueron observadas por microscopía confocal (A1R +, Nikon). Anteriormente demostramos que la proteína del virus de la gripe M2 (un canal ion selectivo de protones), su mutante H37G (que ha perdido su selectividad de protones y permite el transporte de otros cationes como Na + y K + ), y la proteína EMCV 2B (un canal Ca 2+) estimula la secreción de IL-1β mediada por NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012). Además, la proteína SRAS-CoV E actúa como un canal de iones permeables a Ca 2+ que activa el NLRP3 inflamaso (Nieto- Torres et al., 2015). El hecho de que 3a proteína de SARS-CoV actúa como viroporina nos llevó a examinar si también desencadena la activación de la inflamación. De esta manera, primero generamos plásmidos lentivirus que expresaban proteínas etiquetadas con V5 y confirmamos su expresión en células HEK293FT mediante el análisis de inmunoblot (Figuras 1A-C). Luego transferimos BMM de lipopolisacárido (LPS) con los lentivirus que expresaban las proteínas SRAS-CoV E, 3a, M, virus influenza M2, o EMCV 2B. De acuerdo con informes anteriores (Ichinohe et al., Figura 1D). De igual manera, los lentivirus que expresan las proteínas SRAS-CoV E o 3a estimulaban la liberación de IL-1β de BMMs con LPS (Figura 1D). Además, la secreción de IL-1β de BMMs con LPSprimed coinfectados con lentivirus E-y 3a-expresantes fue significativamente superior a la de las células infectadas con lentivirus SRAS-CoV (Figura 1E). Estos datos indicaron que la expresión de la viroporina 3a de SARS-CoV es suficiente para estimular la secreción de IL-1β por BMMs con LPS-primed. Estudios anteriores demostraron que los aminoácidos N-terminales 40 de la proteína SRAS-CoV E son importantes para la formación de canales de iones, y que las mutaciones N15A y V25F [ubicadas en el dominio transmembrana (a partir de residuos de aminoácidos 7-38]] previenen la conductividad iónica (Wilson et al., 2004; Torres et al., Además, la proteína SRAS-CoV 3a contiene un dominio rico en cisteína (residuos de aminoácidos 127-133) que participa en la formación de un homodímero para generar el canal iónico (Lu et al., 2006; Chan et al., 2009). Así, la mutación del dominio rico en cisteína bloquea la conductividad iónica por la proteína 3a (Chan et al., 2009). Con este fin, sustituimos los aminoácidos Cys-127, Cys-130 y Cys-133 dentro del dominio rico en cisteína de la proteína SRAS-CoV 3a con serina para generar un lentivirus que expresa el mutante de actividad de pérdida del canal iónico, 3a-CS (Chan et al., 2009; Figura 2A). Para comprobar si la actividad de los canales iónicos de la proteína SRAS-CoV 3a es necesaria para estimular la secreción de IL-1β, tradujimos BMMs con lentivirus que expresan las proteínas SRAS-CoV E, V25F, 3a, 3a-CS o M. De acuerdo con un informe anterior (Nieto -Torres et al., 2015), encontramos que el lentivirus mutante V25F no estimuló la liberación de IL-1β de los BMMs (Figura 2B). En particular, la secreción de IL-1β completamente abrogada de 3a-CS (Figura 2B), sugiriendo que la actividad de los canales iónicos de la proteína 3a es necesaria para la secreción de IL-1β inducida por SRAS-CoV 3a. FIGURA 4 Activación inflamasoma NLRP3 por SARS-CoV 3a. Las células HeLa fueron transfectadas con la expresión plasmid codificando NLRP3 y que codificando SARS-CoV 3a, 3a-CS, E o V25F, y con un microscopio confocal. Barras de escala, 10 μm. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes. A continuación, determinamos la localización subcelular de la proteína SARS-CoV 3a utilizando microscopía confocal. Cuando los sobrenadantes libres de SARS-CoV fueron recolectados a 24 h (lentivirus) o 6 h (ATP) post-infección o estimulación, y analizados para IL-1β por ELISA. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes, e indican la media ± DE; * * P < 0,01 y * * P < 0,001. 3a proteína se expresó en las células HeLa, se observaron dos patrones de distribución principales. De acuerdo con informes anteriores (Yu et al., 2004; Yuan et al., 2005), la proteína 3a localizada en el aparato Golgi (Figura 3A ). Además, las proteínas 3a concentradas en estructuras puntuales, que principalmente se localizaron en el retículo endoplasmático (ER) (Figura 3B ). Por el contrario, el mutante 3a-CS se concentró en el aparato Golgi más que en la EA y no formaron estructuras puntuales (Figuras 3A, B). A continuación se examinó la localización intracelular de NLRP3. La activación del flammasoma NLRP3 llevó a una redistribución del citosol al espacio perinuclear, un proceso considerado como distintivo de la activación del NLRP3 (Zhou et al., 2011; Ito et al., 2012; Johnson et al., 2013; Moriyama et al., 2016). Aunque las células que expresan los mutantes de actividad-pérdida de los canales iónicos 3a-CS o V25F expresaron uniformemente el NLRP3 a lo largo del citoplasma, se redistribuyó a la región perinuclear en las células de expresión SRAS-CoV 3a-o E (figura 4). Juntos, estos datos proporcionan evidencia de que la actividad del canal iónico de la proteína SRAS-CoV 3a es esencial para desencadenar el flammasomasoma NLRP3. Tanto K + Efflux como ROS Production están involucrados en la liberación de IL-1β Inducida por la proteína SRAS-CoV 3a Finalmente, investigamos el mecanismo por el cual SRAS-CoV 3a activa la flammasoma NLRP3. Un estudio previo mostró que la proteína 3a de SRAS-CoV actúa como un canal K + (Lu et al., 2006). Además, K + eflux es un activador bien conocido de la flammasoma NLRP3 (Mariathasan et al., 2006; Petrilli et al., 2007). Estas observaciones nos llevaron a examinar si K + eflux es necesario para la secreción de 3a IL-1β mediada. Para ello, los BMM en medio rico en K + fueron infectados con virus influenza A o lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E o 3a. De acuerdo con un resultado previo (Ichinohe et al., 2010), encontramos que la secreción de IL-1β causada por el virus influenza fue completamente bloqueada cuando la concentración extracelular de K + fue aumentada a 130 mM (Figura 5A). El efecto inhibidor del medio rico en K + también fue observado cuando las células fueron estimuladas con lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E o 3a (Figura 5B ). Dado que los ROS mitocondriales son importantes para la activación del inflamasoma NLRP3 (Nakahira et al., 2011; Zhou et al., 2011), a continuación estimulamos los BMM con ATP o lentivirus extracelulares que expresan las proteínas SARS-CoV E o 3a en presencia o ausencia del antioxidante, Mito-TEMPO, un tesoro específico para los ROS Trnka et al., 2009). Como se informó anteriormente (Nakahira et al., 2011; Ito et al., 2012), el tratamiento de los BMM con secreción de IL-1β Mito-TEMPO completamente bloqueada en respuesta a ATP (Figura 6A). De manera similar, la liberación de IL-1β inducida por las proteínas SARS-CoV E y 3a fue significativamente inhibida por Mito-TEMPO (Figura 6B). Estas observaciones indican que la proteína SARS-CoV 3a interrumpe las concentraciones iónicas intracelulares y causa daños mitocondriales, activando así el inflamasoma NLRP3. En resumen, encontramos que la actividad del canal iónico de la proteína SARS-CoV 3a es esencial para la activación del inflamasoma NLRP3. Además, tanto la producción de K + eflujo y ROS mitocondriales son necesarios para la secreción de IL-1β mediada por SARS-CoV 3a. Hasta ahora, se han propuesto varios modelos para explicar la activación de NLRP3 inflamasoma por virus ARN. En primer lugar, el ARN viral o productos de escisión del ARN generados por la RNASa L activan el inflamasoma NLRP3 a través de la helicasa DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). En segundo lugar, las viroporinas codificadas por virus del ARN activan el inflamasoma NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013; Nieto-Torres et al., 2015). En el caso del virus de la gripe, el canal de iones M2 selectivo de protones en la red trans-Golgi ácida activa el flammasome NLRP3 (Ichinohe et al., 2010). Curiosamente, un mutante M2 en el que la histidina fue sustituida por glicina en la posición 37 (H37G), causando pérdida de selectividad de protones, permite el transporte de otros cationes (es decir, Na+ y K+), lo que conduce a una secreción mejorada de IL-1β de BMMs de LPS y células dendríticas cuando se compara con la proteína de tipo salvaje M2. Además, las proteínas 2B del EMCV, el poliovirus, el enterovirus 71 (EV71) y el rinovirus humano (miembro de la familia Picornaviridae) desencadenan la activación NLRP3 inflamasoma al inducir el flujo de Ca 2+ desde los compartimentos ER y Golgi (Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013). Además, el virus de la hepatitis C estimula la producción de IL-1β mediada por NLRP3 inflamado a través de su p7 viroporina (Negash et al., 2013; Farag et al., 2017). En tercer lugar, un estudio reciente ha demostrado que la proteína 3D del EV71 interactúa directamente con el NLRP3 para facilitar el montaje del complejo NLRP3 inflamasoma (Wang et al., 2017). En el caso de SARS-CoV, las formas de viroporina E forman canales de iones permeables Ca 2+ y activan el inflamasoma NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Además, se encontró que otra viroporina 3a induce la activación del inflamasoma NLRP3 (Yue et al., 2018). Aunque la sustitución de alanina en Cys-133, que se requiere para la formación de dimer o tetrameros (Lu et al., 2006), todavía permite la activación del flammasoma NLRP3 interactuando con caspasa-1 (Yue et al., 2018), la actividad de los canales iónicos - pérdida mutante 3a-CS (Cys-to-Ser sustitución en las posiciones Cys-127, Cys-130 y Cys-133) (Chan et al., 2009 ) completamente abrogado IL-1β secreción de BMMs LPS-primed, lo que sugiere que la proteína 3a de SARS-CoV tiene la capacidad de inducir la activación de inflamación NLRP3 por múltiples mecanismos. Estudios anteriores muestran que la proteína 3a del SARS-CoV está localizada en la membrana plasmática (Minakshi y Padhan, 2014) y actúa como un canal K+ (Lu et al., 2006), estimulando así (presumiblemente) el flujo K+ en la membrana plasmática. De hecho, encontramos que la secreción de IL-1β causada por la proteína 3a fue significativamente inhibida cuando la concentración de K+ extracelular aumentó a 130 mM. Aunque no queda claro si otra viroporina 8a de SARS-CoV (Castano-Rodriguez et al., 2018) activa la inflamación del NLRP3, estos datos destacan la importancia de las viroporinas en la activación del NLRP3 inducida por el SARS-CoV. Una mejor comprensión del mecanismo que rige el flammasoma NLRP3 facilitará el desarrollo de intervenciones más eficaces para el tratamiento de enfermedades infecciosas y aumentará nuestra comprensión de la patogénesis viral.

¿Cuál es el género del coronavirus SARS?

El síndrome respiratorio agudo severo Coronavirus Viroporina 3a Activa el Inflammasome NLRP3https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6361828/SHA: f02d0c1e8b0109648e578662dc250abe349a033cAutores: Chen, I-Yin; Moriyama, Miyu; Chang, Ming-Fu; Ichinohe, TakeshiFecha: 2019-01-29DOI: 10.3389/fmicb.2019.00050Licencia: cc-byAbstract: Familia de receptores tipo nod, dominio de pirina 3 (NLRP3) regula la secreción de citocinas proinflamatorias interleucina 1 beta (IL-1β) e IL-18. Anteriormente se demostró que las proteínas 2B del virus de la gripe M2 o encefalomiocarditis (EMCV) estimulan la secreción de IL-1β después de la activación del flammasoma NLRP3. Sin embargo, el mecanismo por el cual el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) activa el flammasoma NLRP3 permanece desconocido. Aquí, proporcionamos evidencia directa de que la proteína SRAS-CoV 3a activa el flammasoma NLRP3 en macrófagos lipopolisacáridos. SRAS-CoV 3a fue suficiente para causar la activación del flammasoma NLRP3. La actividad del canal iónico de la proteína 3a fue esencial para la secreción de IL-1β mediada por 3a. Mientras que las células no infectadas o infectadas por un lentivirus que expresaban una proteína 3a defectuosa en la actividad de los canales iónicos expresaban NLRP3 de manera uniforme en todo el citoplasma, NLRP3 se redistribuyó al espacio perinuclear en las células infectadas por un lentivirus que expresaba la proteína 3a. Las especies K(+) eflujo y oxígeno reactivo mitocondrial fueron importantes para la activación del flammasoma SRAS-CoV 3a inducida por NLRP3. Estos resultados destacan la importancia de las viroporinas, proteínas virales formadoras de poros transmembranas, en la activación del NLRP3 inflamatorio inducida por virus. Texto: Síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV), miembro del género Betacoronavirus de la familia Coronaviridae, es un virus envuelto con un genoma Los 5 dos tercios del genoma codifican grandes precursores de poliproteínas, marco abierto de lectura (ORF) 1 y ORF1b, que son proteolíticamente cortados para generar 16 proteínas no estructurales (Tan et al., 2005). El 3 un tercio del genoma codifica cuatro proteínas estructurales, pico (S), sobre (E), matriz (M) y nucleocápsido (N), y proteínas no estructurales, junto con un conjunto de proteínas accesorias (3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b y 9b) (Perlman y Dandekar, 2005; Tan et al., 2005). El SARS-CoV es el agente etiológico del SARS (Drosten et al., 2003; Fouchier et al., 2003; Ksiazek et al., 2003; Kuiken et al., 2003; Peiris et al., 2003). Entre noviembre de 2002 y julio de 2003 se denunciaron a la Organización Mundial de la Salud por lo menos 8.098 casos confirmados en laboratorio de infección humana, con una tasa de mortalidad del 9,6%, y se detectaron altos niveles de citocinas proinflamatorias, incluidos el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, la interleucina (IL)-1β e IL-6, en los tejidos de autopsia de pacientes con SARS (He et al., 2006). Aunque la regulación de las citocinas inflamatorias puede estar involucrada en lesiones pulmonares y la patogénesis del SARS-CoV, no se El sistema inmunitario innato utiliza receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) para detectar patrones moleculares asociados con patógenos (Medzhitov, 2001; Kawai y Akira, 2010). El reconocimiento de la infección por virus juega un papel importante en la limitación de la replicación del virus en las primeras etapas de la infección. Familia de receptores tipo nod, dominio de pirina 3 (NLRP3) se activa por una amplia variedad de estímulos, incluyendo la infección por virus (Bauernfeind et al., 2011). Cuatro modelos que describen la activación de la inflamación NLRP3 se han propuesto hasta ahora (Hornung y Latz, 2010; Schroder et al., 2010; Tschopp y Schroder, 2010). En primer lugar, las alteraciones en las concentraciones iónicas intracelulares, incluyendo K + eflujo y Ca 2 + afluencia, juegan un papel importante (Fernandes-Alnemri et al., 2007; Petrilli et al., 2007; Arlehamn et al., 2010; Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Murakami et al., 2012; Muñoz-Planillo et al., 2013). En segundo lugar, la catepsina B y L, que son proteasasas de cisteína lisosómicas específicas, son aunque jugar un papel después de la fagocitosis de cristales de colesterol (Duewell et al., 2010), péptido fibrilar amiloide-beta, cristales de sílice y sales de aluminio. En tercer lugar, la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) o ADN mitocondrial a partir de mitocondrias dañadas (Zhou et al., 2011 Nakahira et al., 2011; Shimada et al., 2012). Finalmente, los productos de escisión de ARN viral o ARN generados por la Rnasa L activan el inflamasoma NLRP3 a través de la helicasa DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). Al activarse, el NLRP3 se recluta a las mitocondrias mediante asociación con la señalización antiviral mitocondrial (MAVS) o mitofusina 2 expresada en la membrana mitocondrial externa Subramaniano et al., 2013); estas moléculas reclutan a continuación la proteína similar a la mota asociada a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasas (ASC) y pro-caspasa-1 para formar el inflamasoma NLRP3. Este evento activa la molécula aguas abajo, caspasa-1, que cataliza el procesamiento proteolítico de pro-IL-1β y pro-IL-18 en sus formas activas y estimula su secreción (Kayagaki et al., 2015; Shi et al., 2015). Es cada vez más evidente que NLRP3 detecta virus ARN al detectar el daño celular o el malestar inducido por las viroporinas (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013; Nieto-Torres et al., 2015), proteínas transmembranas formadoras de poros, codificadas por ciertos virus ARN; estas proteínas alteran la permeabilidad de la membrana a los iones al formar canales de membrana (Tan et al., 2005; Chen e Ichinohe, 2015). Un estudio reciente muestra que la proteína SRAS-CoV E, que comprende sólo 76 aminoácidos, forma canales de Ca 2+-permeables y activa el inflamasoma NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Aunque las proteínas E y 3a del SARS-CoV, que comprenden 274 aminoácidos y contienen tres dominios transmembranas (Zeng et al., 2004; Lu et al., 2006), se cree que actúan como canales Na + /K + y K +, respectivamente (Wilson et al., 2004; Lu et al., 2006; Torres et al., 2007; Parthasarathy et al., 2008; Pervushin et al., 2009; Wang et al., 2011), el papel de la proteína 3a en la activación del inflamasoma NLRP3 permanece desconocido. Aquí, examinamos el papel de la proteína 3a en la activación del inflamasoma NLRP3. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por los Comités de Animales del Instituto de Ciencias Médicas (Universidad de Tokio). Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMMs) fueron preparados como se describió anteriormente (Ichinohe et al., 2009). En resumen, la médula ósea se obtuvo de la tibia y el fémur mediante el lavado con el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM; Nacalai Tesque). Las células de médula ósea fueron cultivadas durante 5 días en DMEM complementadas con un 30% de L929 sobrenadante celular que contiene factor estimulante de colonias de macrófagos, 10% de suero fetal inactivado por calor (FBS) y L-glutamina (2 mM) a 37 • C/5% CO 2. Las células HEK293FT (línea de células renales embrionarias humanas) y las células HeLa (línea de células de carcinoma epitelial humano) se mantuvieron en el DMEM complementadas con un 10% de FBS, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). Las células MDCK (células renales caninas Madin-Darby) y HT-1080 (línea celular de fibrosarcoma humano) se cultivaron en el medio esencial mínimo de Eagle (E-MEM; Nacalai Tesque) complementadas con un 10% de FBS, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). La cepa viral A/PR8 (H1N1) fue cultivada a 35 • C durante 2 días en las cavidades alantóicas de huevos de pollo fértiles de 10 días de edad (Ichinohe et al., 2009). El título viral fue cuantificado en un ensayo de placa estándar utilizando células MDCK (Pang et al., 2013). Plasmids cDNAs codificando las proteínas E y M de la cepa SRAS-CoV Frankfurt 1 (Matsuyama et al., 2005) se obtuvieron mediante transcripción inversa y PCR del ARN total extraído de células Vero infectadas por SRAS-CoV, seguido de amplificación PCR mediante imprimaciones específicas. pcDNA3.1D-3a-V5His fue proporcionado por Ming-Fu Chang (National Taiwan University College of Medicine, Taipei, Taiwán). Para generar los plásmidos pLenti6-E-V5His, pLenti6-3a-V5His, y pLenti-M-V5His, fragmentos de cDNA de E, 3a, y M fueron amplificados de pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His, y pcDNA3.1D-M-V5His usando conjuntos específicos de imprimadores y luego ligados en vectores pLenti6-TOPO (Invitrogen). Para generar plásmidos pCA7-flag-E, pCA7-flag-3a, y pCA7flag-M, pCA7-HA-E, pCA7-HA-3a, y pCA7-HA-M, fragmentos de cDNA de E, 3a, y M fueron amplificados de pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His, y pcDNA3.1D-M-V5His utilizando conjuntos específicos de imprimación, digeridos con EcoR I y no I, y subclonados en los sitios EcoR I-Not I del plásmido pCA7-flag-ASC o pCA7-HA-M2, respectivamente (Ito et al., 2012). Para construir plásmidos que expresan el mutante E V25F, los fragmentos de E mutados fueron amplificados por PCR inversa con plásmidos que contienen E de tipo salvaje y conjuntos de imprimación específicos. Los productos de PCR fueron cortados por Dpn I, ligados en una reacción que contiene ligasa y T4 cinasa y luego transformados en células competentes DH5α (TOYOBO). Para construir plásmidos que expresan el mutante 3a 3a-CS, fragmentos fueron amplificados de plásmidos que contienen salvaje tipo 3a utilizando conjuntos de imprimación específicos 3a y transformados como se describe anteriormente. Las células HEK293FT fueron sembradas en placas de racimo de 24 pocillos y transfectadas con 1 μg de pLenti6-E/3a/M-V5His, pLenti-GFP (proteína fluorescente verde), o pLenti-M2 utilizando polietilenimina (PEI) Max. A las 24 horas de la transfección, las células fueron lisadas con tampón RIPA (50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 0,05% de sulfato de dodecil sódico (SDS), 150 mM NaCl y 1 mM EDTA). Y los lisatos fueron sometidos a electroforesis de gel de poliacrilamida SDS (PAGE), seguida de electroblote en membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas fueron incubadas durante la noche con anticuerpos anti-V5-tag del ratón (R960-25, Invitrogen), anti-influenza A del ratón M2 (14C2, Abcam), anti-GFP del ratón (GF200, Nacalai Tesque) o antitubulina del conejo (DM1A, Santa Cruz), seguidos de anticuerpos anti-mouse IgG (Jackson Immuno Research Laboratories) o anti-rabbit IgG (Invitrogen). Después de lavar 3 veces con tampón de lavado (0,05% Tween-20/PBS), las membranas fueron expuestas usando Chemi-Lumi One Super (Nacalai Tesque), y las señales quimioluminiscentes fueron capturadas por un mini aparato ImageQuant LAS-4000 (GE Healthcare). Para generar lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E, 3a y M, el cDNA de longitud completa codificando cada proteína viral fue clonado en el vector pLenti6.3/V5-TOPO (Invitrogen) usando los siguientes imprimadores: SARS-CoV E hacia adelante, 5 -caccatgttactctctctctctcgga-3, y hacia atrás, 5 -gaccagaagatcaggaactc-3 ; SARS-CoV 3a hacia adelante, 5caccatggttttttatgagagatt-3, y hacia atrás, 5 -caaaggcacgcctagtagtcg-3 ; SARS-CoV M hacia adelante, 5 -caccatggcaagaggctatat-3, y hacia atrás, 5 -cctactagcaaagcaa Las monocapas subconfluentes de células HEK293FT sembradas en un plato recubierto de colágeno (10 cm de diámetro) fueron transfectadas con 3 μg de pLenti6.3/V5-TOPO vector que expresaba cada proteína viral o EGFP junto con ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los sobrenadantes que contenían lentivirus fueron recolectados y filtrados a través de un filtro de 0,45 μm (Millipore) a 72-96 h de post-transfección (Ito et al., 2012). El título lentiviral fue luego cuantificado utilizando células HT-1080 como se describió anteriormente. Los macrófagos derivados de la médula ósea fueron plateados a una densidad de 8 × 10 5 en placa de 24 pozos e infectados con el virus de la gripe A/PR8 o lentivirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 o 0,2 durante 1 h, respectivamente. Luego, los BMM fueron estimulados con 1 μg/ml de LPS y cultivados por 23 h adicionales en medio completo. Los sobrenadantes fueron recolectados a las 24 h post-infección y centrifugados para eliminar desechos celulares. La cantidad de IL-1β en los sobrenadantes fue medida en un ensayo inmunosorbente enzimático (ELISA) usando anticuerpos emparejados (eBioscience) (Ichinohe et al., 2010. Para aclarar la localización celular de las proteínas de tipo salvaje y mutante 3a del SARS-CoV, las células HeLa fueron cultivadas en coverslips y transfectadas con 1 μg de pCA7-flag-3a o pCD7-flag-3a-CS junto con 0,5 μg de ER-mCherry o DsRed-Golgi (Ito et al., 2012). A las 24 h de post-transfección, las células fueron fijas con 4% de paraformaldehído y permeabilizadas con 1% de Triton X-100/PBS. Después de lavar con PBS y bloquear con 4% de BSA/PBS, las células fueron incubadas con un anticuerpo anti-flag de ratón (M2, Sigma) seguido de incubación con Alexa Fluor 488-conjugado IgG (H+L) anti Para observar la distribución celular de NLRP3 en las células E-o 3a-expresantes, las células HeLa fueron cultivadas en labio-cubierto y transfectadas con 1 μg de pCA7-HA-E, pCA7-HA-EV25F, pCA7-HA-3a, pCA7-HA-3a-CS, o vector de control pCA7 junto con 0,5 μg de pCA7-NLRP3. A las 24 h post-transfección, las células fueron fijas y permeabilizadas con 4% de paraformaldehído y 1% de Tritón X-100/PBS. Después del lavado y bloqueo, las células fueron incubadas con anticuerpos anti-HA del conejo (561, MBL) y anti-NLRP3 del ratón (Cryo-2; AdipoGen), seguidos por Alexa Fluor 488-conjugado de cabra anti-rabbit IgG (H+L) y Alexa Fluor 568-conjugado de cabra anti-mouse IgG (H+L) (Tecnologías de la Vida). Las señales fluorescentes fueron observadas por microscopía confocal (A1R +, Nikon). Anteriormente demostramos que la proteína del virus de la gripe M2 (un canal ion selectivo de protones), su mutante H37G (que ha perdido su selectividad de protones y permite el transporte de otros cationes como Na + y K + ), y la proteína EMCV 2B (un canal Ca 2+) estimula la secreción de IL-1β mediada por NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012). Además, la proteína SRAS-CoV E actúa como un canal de iones permeables a Ca 2+ que activa el NLRP3 inflamaso (Nieto- Torres et al., 2015). El hecho de que 3a proteína de SARS-CoV actúa como viroporina nos llevó a examinar si también desencadena la activación de la inflamación. De esta manera, primero generamos plásmidos lentivirus que expresaban proteínas etiquetadas con V5 y confirmamos su expresión en células HEK293FT mediante el análisis de inmunoblot (Figuras 1A-C). Luego transferimos BMM de lipopolisacárido (LPS) con los lentivirus que expresaban las proteínas SRAS-CoV E, 3a, M, virus influenza M2, o EMCV 2B. De acuerdo con informes anteriores (Ichinohe et al., Figura 1D). De igual manera, los lentivirus que expresan las proteínas SRAS-CoV E o 3a estimulaban la liberación de IL-1β de BMMs con LPS (Figura 1D). Además, la secreción de IL-1β de BMMs con LPSprimed coinfectados con lentivirus E-y 3a-expresantes fue significativamente superior a la de las células infectadas con lentivirus SRAS-CoV (Figura 1E). Estos datos indicaron que la expresión de la viroporina 3a de SARS-CoV es suficiente para estimular la secreción de IL-1β por BMMs con LPS-primed. Estudios anteriores demostraron que los aminoácidos N-terminales 40 de la proteína SRAS-CoV E son importantes para la formación de canales de iones, y que las mutaciones N15A y V25F [ubicadas en el dominio transmembrana (a partir de residuos de aminoácidos 7-38]] previenen la conductividad iónica (Wilson et al., 2004; Torres et al., Además, la proteína SRAS-CoV 3a contiene un dominio rico en cisteína (residuos de aminoácidos 127-133) que participa en la formación de un homodímero para generar el canal iónico (Lu et al., 2006; Chan et al., 2009). Así, la mutación del dominio rico en cisteína bloquea la conductividad iónica por la proteína 3a (Chan et al., 2009). Con este fin, sustituimos los aminoácidos Cys-127, Cys-130 y Cys-133 dentro del dominio rico en cisteína de la proteína SRAS-CoV 3a con serina para generar un lentivirus que expresa el mutante de actividad de pérdida del canal iónico, 3a-CS (Chan et al., 2009; Figura 2A). Para comprobar si la actividad de los canales iónicos de la proteína SRAS-CoV 3a es necesaria para estimular la secreción de IL-1β, tradujimos BMMs con lentivirus que expresan las proteínas SRAS-CoV E, V25F, 3a, 3a-CS o M. De acuerdo con un informe anterior (Nieto -Torres et al., 2015), encontramos que el lentivirus mutante V25F no estimuló la liberación de IL-1β de los BMMs (Figura 2B). En particular, la secreción de IL-1β completamente abrogada de 3a-CS (Figura 2B), sugiriendo que la actividad de los canales iónicos de la proteína 3a es necesaria para la secreción de SRAS-CoV 3a-inducida por IL-1β. FIGURA 4 Activación inflamasoma NLRP3 por SARS-CoV 3a. Las células HeLa fueron transfectadas con la expresión plasmid codificando NLRP3 y que codificando SARS-CoV 3a, 3a-CS, E o V25F, y con un microscopio confocal. Barras de escala, 10 μm. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes. A continuación, determinamos la localización subcelular de la proteína SARS-CoV 3a utilizando microscopía confocal. Cuando los sobrenadantes libres de SARS-CoV fueron recolectados a 24 h (lentivirus) o 6 h (ATP) post-infección o estimulación, y analizados para IL-1β por ELISA. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes, e indican la media ± DE; * * P < 0,01 y * * P < 0,001. 3a proteína se expresó en las células HeLa, se observaron dos patrones de distribución principales. De acuerdo con informes anteriores (Yu et al., 2004; Yuan et al., 2005), la proteína 3a localizada en el aparato Golgi (Figura 3A ). Además, las proteínas 3a concentradas en estructuras puntuales, que principalmente se localizaron en el retículo endoplasmático (ER) (Figura 3B ). Por el contrario, el mutante 3a-CS se concentró en el aparato Golgi más que en la EA y no formaron estructuras puntuales (Figuras 3A, B). A continuación se examinó la localización intracelular de NLRP3. La activación del flammasoma NLRP3 llevó a una redistribución del citosol al espacio perinuclear, un proceso considerado como distintivo de la activación del NLRP3 (Zhou et al., 2011; Ito et al., 2012; Johnson et al., 2013; Moriyama et al., 2016). Aunque las células que expresan los mutantes de actividad-pérdida de los canales iónicos 3a-CS o V25F expresaron uniformemente el NLRP3 a lo largo del citoplasma, se redistribuyó a la región perinuclear en las células de expresión SRAS-CoV 3a-o E (figura 4). Juntos, estos datos proporcionan evidencia de que la actividad del canal iónico de la proteína SRAS-CoV 3a es esencial para desencadenar el flammasomasoma NLRP3. Tanto K + Efflux como ROS Production están involucrados en la liberación de IL-1β Inducida por la proteína SRAS-CoV 3a Finalmente, investigamos el mecanismo por el cual SRAS-CoV 3a activa la flammasoma NLRP3. Un estudio previo mostró que la proteína 3a de SRAS-CoV actúa como un canal K + (Lu et al., 2006). Además, K + eflux es un activador bien conocido de la flammasoma NLRP3 (Mariathasan et al., 2006; Petrilli et al., 2007). Estas observaciones nos llevaron a examinar si K + eflux es necesario para la secreción de 3a IL-1β mediada. Para ello, los BMM en medio rico en K + fueron infectados con virus influenza A o lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E o 3a. De acuerdo con un resultado previo (Ichinohe et al., 2010), encontramos que la secreción de IL-1β causada por el virus influenza fue completamente bloqueada cuando la concentración extracelular de K + fue aumentada a 130 mM (Figura 5A). El efecto inhibidor del medio rico en K + también fue observado cuando las células fueron estimuladas con lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E o 3a (Figura 5B ). Dado que los ROS mitocondriales son importantes para la activación del inflamasoma NLRP3 (Nakahira et al., 2011; Zhou et al., 2011), a continuación estimulamos los BMM con ATP o lentivirus extracelulares que expresan las proteínas SARS-CoV E o 3a en presencia o ausencia del antioxidante, Mito-TEMPO, un tesoro específico para los ROS Trnka et al., 2009). Como se informó anteriormente (Nakahira et al., 2011; Ito et al., 2012), el tratamiento de los BMM con secreción de IL-1β Mito-TEMPO completamente bloqueada en respuesta a ATP (Figura 6A). De manera similar, la liberación de IL-1β inducida por las proteínas SARS-CoV E y 3a fue significativamente inhibida por Mito-TEMPO (Figura 6B). Estas observaciones indican que la proteína SARS-CoV 3a interrumpe las concentraciones iónicas intracelulares y causa daños mitocondriales, activando así el inflamasoma NLRP3. En resumen, encontramos que la actividad del canal iónico de la proteína SARS-CoV 3a es esencial para la activación del inflamasoma NLRP3. Además, tanto la producción de K + eflujo y ROS mitocondriales son necesarios para la secreción de IL-1β mediada por SARS-CoV 3a. Hasta ahora, se han propuesto varios modelos para explicar la activación de NLRP3 inflamasoma por virus ARN. En primer lugar, el ARN viral o productos de escisión del ARN generados por la RNASa L activan el inflamasoma NLRP3 a través de la helicasa DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). En segundo lugar, las viroporinas codificadas por virus del ARN activan el inflamasoma NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013; Nieto-Torres et al., 2015). En el caso del virus de la gripe, el canal de iones M2 selectivo de protones en la red trans-Golgi ácida activa el flammasome NLRP3 (Ichinohe et al., 2010). Curiosamente, un mutante M2 en el que la histidina fue sustituida por glicina en la posición 37 (H37G), causando pérdida de selectividad de protones, permite el transporte de otros cationes (es decir, Na+ y K+), lo que conduce a una secreción mejorada de IL-1β de BMMs de LPS y células dendríticas cuando se compara con la proteína de tipo salvaje M2. Además, las proteínas 2B del EMCV, el poliovirus, el enterovirus 71 (EV71) y el rinovirus humano (miembro de la familia Picornaviridae) desencadenan la activación NLRP3 inflamasoma al inducir el flujo de Ca 2+ desde los compartimentos ER y Golgi (Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013). Además, el virus de la hepatitis C estimula la producción de IL-1β mediada por NLRP3 inflamado a través de su p7 viroporina (Negash et al., 2013; Farag et al., 2017). En tercer lugar, un estudio reciente ha demostrado que la proteína 3D del EV71 interactúa directamente con el NLRP3 para facilitar el montaje del complejo NLRP3 inflamasoma (Wang et al., 2017). En el caso de SARS-CoV, las formas de viroporina E forman canales de iones permeables Ca 2+ y activan el inflamasoma NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Además, se encontró que otra viroporina 3a induce la activación del inflamasoma NLRP3 (Yue et al., 2018). Aunque la sustitución de alanina en Cys-133, que se requiere para la formación de dimer o tetrameros (Lu et al., 2006), todavía permite la activación del flammasoma NLRP3 interactuando con caspasa-1 (Yue et al., 2018), la actividad de los canales iónicos - pérdida mutante 3a-CS (Cys-to-Ser sustitución en las posiciones Cys-127, Cys-130 y Cys-133) (Chan et al., 2009 ) completamente abrogado IL-1β secreción de BMMs LPS-primed, lo que sugiere que la proteína 3a de SARS-CoV tiene la capacidad de inducir la activación de inflamación NLRP3 por múltiples mecanismos. Estudios anteriores muestran que la proteína 3a del SARS-CoV está localizada en la membrana plasmática (Minakshi y Padhan, 2014) y actúa como un canal K+ (Lu et al., 2006), estimulando así (presumiblemente) el flujo K+ en la membrana plasmática. De hecho, encontramos que la secreción de IL-1β causada por la proteína 3a fue significativamente inhibida cuando la concentración de K+ extracelular aumentó a 130 mM. Aunque no queda claro si otra viroporina 8a de SARS-CoV (Castano-Rodriguez et al., 2018) activa la inflamación del NLRP3, estos datos destacan la importancia de las viroporinas en la activación del NLRP3 inducida por el SARS-CoV. Una mejor comprensión del mecanismo que rige el flammasoma NLRP3 facilitará el desarrollo de intervenciones más eficaces para el tratamiento de enfermedades infecciosas y aumentará nuestra comprensión de la patogénesis viral.

¿Cuál es la familia del coronavirus SARS?

El síndrome respiratorio agudo severo Coronavirus Viroporina 3a Activa el Inflammasome NLRP3https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6361828/SHA: f02d0c1e8b0109648e578662dc250abe349a033cAutores: Chen, I-Yin; Moriyama, Miyu; Chang, Ming-Fu; Ichinohe, TakeshiFecha: 2019-01-29DOI: 10.3389/fmicb.2019.00050Licencia: cc-byAbstract: Familia de receptores tipo nod, dominio de pirina 3 (NLRP3) regula la secreción de citocinas proinflamatorias interleucina 1 beta (IL-1β) e IL-18. Anteriormente se demostró que las proteínas 2B del virus de la gripe M2 o encefalomiocarditis (EMCV) estimulan la secreción de IL-1β después de la activación del flammasoma NLRP3. Sin embargo, el mecanismo por el cual el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) activa el flammasoma NLRP3 permanece desconocido. Aquí, proporcionamos evidencia directa de que la proteína SRAS-CoV 3a activa el flammasoma NLRP3 en macrófagos lipopolisacáridos. SRAS-CoV 3a fue suficiente para causar la activación del flammasoma NLRP3. La actividad del canal iónico de la proteína 3a fue esencial para la secreción de IL-1β mediada por 3a. Mientras que las células no infectadas o infectadas por un lentivirus que expresaban una proteína 3a defectuosa en la actividad de los canales iónicos expresaban NLRP3 de manera uniforme en todo el citoplasma, NLRP3 se redistribuyó al espacio perinuclear en las células infectadas por un lentivirus que expresaba la proteína 3a. Las especies K(+) eflujo y oxígeno reactivo mitocondrial fueron importantes para la activación del flammasoma SRAS-CoV 3a inducida por NLRP3. Estos resultados destacan la importancia de las viroporinas, proteínas virales formadoras de poros transmembranas, en la activación del NLRP3 inflamatorio inducida por virus. Texto: Síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV), miembro del género Betacoronavirus de la familia Coronaviridae, es un virus envuelto con un genoma Los 5 dos tercios del genoma codifican grandes precursores de poliproteínas, marco abierto de lectura (ORF) 1 y ORF1b, que son proteolíticamente cortados para generar 16 proteínas no estructurales (Tan et al., 2005). El 3 un tercio del genoma codifica cuatro proteínas estructurales, pico (S), sobre (E), matriz (M) y nucleocápsido (N), y proteínas no estructurales, junto con un conjunto de proteínas accesorias (3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b y 9b) (Perlman y Dandekar, 2005; Tan et al., 2005). El SARS-CoV es el agente etiológico del SARS (Drosten et al., 2003; Fouchier et al., 2003; Ksiazek et al., 2003; Kuiken et al., 2003; Peiris et al., 2003). Entre noviembre de 2002 y julio de 2003 se denunciaron a la Organización Mundial de la Salud por lo menos 8.098 casos confirmados en laboratorio de infección humana, con una tasa de mortalidad del 9,6%, y se detectaron altos niveles de citocinas proinflamatorias, incluidos el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, la interleucina (IL)-1β e IL-6, en los tejidos de autopsia de pacientes con SARS (He et al., 2006). Aunque la regulación de las citocinas inflamatorias puede estar involucrada en lesiones pulmonares y la patogénesis del SARS-CoV, no se El sistema inmunitario innato utiliza receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) para detectar patrones moleculares asociados con patógenos (Medzhitov, 2001; Kawai y Akira, 2010). El reconocimiento de la infección por virus juega un papel importante en la limitación de la replicación del virus en las primeras etapas de la infección. Familia de receptores tipo nod, dominio de pirina 3 (NLRP3) se activa por una amplia variedad de estímulos, incluyendo la infección por virus (Bauernfeind et al., 2011). Cuatro modelos que describen la activación de la inflamación NLRP3 se han propuesto hasta ahora (Hornung y Latz, 2010; Schroder et al., 2010; Tschopp y Schroder, 2010). En primer lugar, las alteraciones en las concentraciones iónicas intracelulares, incluyendo K + eflujo y Ca 2 + afluencia, juegan un papel importante (Fernandes-Alnemri et al., 2007; Petrilli et al., 2007; Arlehamn et al., 2010; Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Murakami et al., 2012; Muñoz-Planillo et al., 2013). En segundo lugar, la catepsina B y L, que son proteasasas de cisteína lisosómicas específicas, son aunque jugar un papel después de la fagocitosis de cristales de colesterol (Duewell et al., 2010), péptido fibrilar amiloide-beta, cristales de sílice y sales de aluminio. En tercer lugar, la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) o ADN mitocondrial a partir de mitocondrias dañadas (Zhou et al., 2011 Nakahira et al., 2011; Shimada et al., 2012). Finalmente, los productos de escisión de ARN viral o ARN generados por la Rnasa L activan el inflamasoma NLRP3 a través de la helicasa DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). Al activarse, el NLRP3 se recluta a las mitocondrias mediante asociación con la señalización antiviral mitocondrial (MAVS) o mitofusina 2 expresada en la membrana mitocondrial externa Subramaniano et al., 2013); estas moléculas reclutan a continuación la proteína similar a la mota asociada a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasas (ASC) y pro-caspasa-1 para formar el inflamasoma NLRP3. Este evento activa la molécula aguas abajo, caspasa-1, que cataliza el procesamiento proteolítico de pro-IL-1β y pro-IL-18 en sus formas activas y estimula su secreción (Kayagaki et al., 2015; Shi et al., 2015). Es cada vez más evidente que NLRP3 detecta virus ARN al detectar el daño celular o el malestar inducido por las viroporinas (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013; Nieto-Torres et al., 2015), proteínas transmembranas formadoras de poros, codificadas por ciertos virus ARN; estas proteínas alteran la permeabilidad de la membrana a los iones al formar canales de membrana (Tan et al., 2005; Chen e Ichinohe, 2015). Un estudio reciente muestra que la proteína SRAS-CoV E, que comprende sólo 76 aminoácidos, forma canales de Ca 2+-permeables y activa el inflamasoma NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Aunque las proteínas E y 3a del SARS-CoV, que comprenden 274 aminoácidos y contienen tres dominios transmembranas (Zeng et al., 2004; Lu et al., 2006), se cree que actúan como canales Na + /K + y K +, respectivamente (Wilson et al., 2004; Lu et al., 2006; Torres et al., 2007; Parthasarathy et al., 2008; Pervushin et al., 2009; Wang et al., 2011), el papel de la proteína 3a en la activación del inflamasoma NLRP3 permanece desconocido. Aquí, examinamos el papel de la proteína 3a en la activación del inflamasoma NLRP3. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por los Comités de Animales del Instituto de Ciencias Médicas (Universidad de Tokio). Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMMs) fueron preparados como se describió anteriormente (Ichinohe et al., 2009). En resumen, la médula ósea se obtuvo de la tibia y el fémur mediante el lavado con el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM; Nacalai Tesque). Las células de médula ósea fueron cultivadas durante 5 días en DMEM complementadas con un 30% de L929 sobrenadante celular que contiene factor estimulante de colonias de macrófagos, 10% de suero fetal inactivado por calor (FBS) y L-glutamina (2 mM) a 37 • C/5% CO 2. Las células HEK293FT (línea de células renales embrionarias humanas) y las células HeLa (línea de células de carcinoma epitelial humano) se mantuvieron en el DMEM complementadas con un 10% de FBS, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). Las células MDCK (células renales caninas Madin-Darby) y HT-1080 (línea celular de fibrosarcoma humano) se cultivaron en el medio esencial mínimo de Eagle (E-MEM; Nacalai Tesque) complementadas con un 10% de FBS, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). La cepa viral A/PR8 (H1N1) fue cultivada a 35 • C durante 2 días en las cavidades alantóicas de huevos de pollo fértiles de 10 días de edad (Ichinohe et al., 2009). El título viral fue cuantificado en un ensayo de placa estándar utilizando células MDCK (Pang et al., 2013). Plasmids cDNAs codificando las proteínas E y M de la cepa SRAS-CoV Frankfurt 1 (Matsuyama et al., 2005) se obtuvieron mediante transcripción inversa y PCR del ARN total extraído de células Vero infectadas por SRAS-CoV, seguido de amplificación PCR mediante imprimaciones específicas. pcDNA3.1D-3a-V5His fue proporcionado por Ming-Fu Chang (National Taiwan University College of Medicine, Taipei, Taiwán). Para generar los plásmidos pLenti6-E-V5His, pLenti6-3a-V5His, y pLenti-M-V5His, fragmentos de cDNA de E, 3a, y M fueron amplificados de pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His, y pcDNA3.1D-M-V5His usando conjuntos específicos de imprimadores y luego ligados en vectores pLenti6-TOPO (Invitrogen). Para generar plásmidos pCA7-flag-E, pCA7-flag-3a, y pCA7flag-M, pCA7-HA-E, pCA7-HA-3a, y pCA7-HA-M, fragmentos de cDNA de E, 3a, y M fueron amplificados de pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His, y pcDNA3.1D-M-V5His utilizando conjuntos específicos de imprimación, digeridos con EcoR I y no I, y subclonados en los sitios EcoR I-Not I del plásmido pCA7-flag-ASC o pCA7-HA-M2, respectivamente (Ito et al., 2012). Para construir plásmidos que expresan el mutante E V25F, los fragmentos de E mutados fueron amplificados por PCR inversa con plásmidos que contienen E de tipo salvaje y conjuntos de imprimación específicos. Los productos de PCR fueron cortados por Dpn I, ligados en una reacción que contiene ligasa y T4 cinasa y luego transformados en células competentes DH5α (TOYOBO). Para construir plásmidos que expresan el mutante 3a 3a-CS, fragmentos fueron amplificados de plásmidos que contienen salvaje tipo 3a utilizando conjuntos de imprimación específicos 3a y transformados como se describe anteriormente. Las células HEK293FT fueron sembradas en placas de racimo de 24 pocillos y transfectadas con 1 μg de pLenti6-E/3a/M-V5His, pLenti-GFP (proteína fluorescente verde), o pLenti-M2 utilizando polietilenimina (PEI) Max. A las 24 horas de la transfección, las células fueron lisadas con tampón RIPA (50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 0,05% de sulfato de dodecil sódico (SDS), 150 mM NaCl y 1 mM EDTA). Y los lisatos fueron sometidos a electroforesis de gel de poliacrilamida SDS (PAGE), seguida de electroblote en membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas fueron incubadas durante la noche con anticuerpos anti-V5-tag del ratón (R960-25, Invitrogen), anti-influenza A del ratón M2 (14C2, Abcam), anti-GFP del ratón (GF200, Nacalai Tesque) o antitubulina del conejo (DM1A, Santa Cruz), seguidos de anticuerpos anti-mouse IgG (Jackson Immuno Research Laboratories) o anti-rabbit IgG (Invitrogen). Después de lavar 3 veces con tampón de lavado (0,05% Tween-20/PBS), las membranas fueron expuestas usando Chemi-Lumi One Super (Nacalai Tesque), y las señales quimioluminiscentes fueron capturadas por un mini aparato ImageQuant LAS-4000 (GE Healthcare). Para generar lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E, 3a y M, el cDNA de longitud completa codificando cada proteína viral fue clonado en el vector pLenti6.3/V5-TOPO (Invitrogen) usando los siguientes imprimadores: SARS-CoV E hacia adelante, 5 -caccatgttactctctctctctcgga-3, y hacia atrás, 5 -gaccagaagatcaggaactc-3 ; SARS-CoV 3a hacia adelante, 5caccatggttttttatgagagatt-3, y hacia atrás, 5 -caaaggcacgcctagtagtcg-3 ; SARS-CoV M hacia adelante, 5 -caccatggcaagaggctatat-3, y hacia atrás, 5 -cctactagcaaagcaa Las monocapas subconfluentes de células HEK293FT sembradas en un plato recubierto de colágeno (10 cm de diámetro) fueron transfectadas con 3 μg de pLenti6.3/V5-TOPO vector que expresaba cada proteína viral o EGFP junto con ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los sobrenadantes que contenían lentivirus fueron recolectados y filtrados a través de un filtro de 0,45 μm (Millipore) a 72-96 h de post-transfección (Ito et al., 2012). El título lentiviral fue luego cuantificado utilizando células HT-1080 como se describió anteriormente. Los macrófagos derivados de la médula ósea fueron plateados a una densidad de 8 × 10 5 en placa de 24 pozos e infectados con el virus de la gripe A/PR8 o lentivirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 o 0,2 durante 1 h, respectivamente. Luego, los BMM fueron estimulados con 1 μg/ml de LPS y cultivados por 23 h adicionales en medio completo. Los sobrenadantes fueron recolectados a las 24 h post-infección y centrifugados para eliminar desechos celulares. La cantidad de IL-1β en los sobrenadantes fue medida en un ensayo inmunosorbente enzimático (ELISA) usando anticuerpos emparejados (eBioscience) (Ichinohe et al., 2010. Para aclarar la localización celular de las proteínas de tipo salvaje y mutante 3a del SARS-CoV, las células HeLa fueron cultivadas en coverslips y transfectadas con 1 μg de pCA7-flag-3a o pCD7-flag-3a-CS junto con 0,5 μg de ER-mCherry o DsRed-Golgi (Ito et al., 2012). A las 24 h de post-transfección, las células fueron fijas con 4% de paraformaldehído y permeabilizadas con 1% de Triton X-100/PBS. Después de lavar con PBS y bloquear con 4% de BSA/PBS, las células fueron incubadas con un anticuerpo anti-flag de ratón (M2, Sigma) seguido de incubación con Alexa Fluor 488-conjugado IgG (H+L) anti Para observar la distribución celular de NLRP3 en las células E-o 3a-expresantes, las células HeLa fueron cultivadas en labio-cubierto y transfectadas con 1 μg de pCA7-HA-E, pCA7-HA-EV25F, pCA7-HA-3a, pCA7-HA-3a-CS, o vector de control pCA7 junto con 0,5 μg de pCA7-NLRP3. A las 24 h post-transfección, las células fueron fijas y permeabilizadas con 4% de paraformaldehído y 1% de Tritón X-100/PBS. Después del lavado y bloqueo, las células fueron incubadas con anticuerpos anti-HA del conejo (561, MBL) y anti-NLRP3 del ratón (Cryo-2; AdipoGen), seguidos por Alexa Fluor 488-conjugado de cabra anti-rabbit IgG (H+L) y Alexa Fluor 568-conjugado de cabra anti-mouse IgG (H+L) (Tecnologías de la Vida). Las señales fluorescentes fueron observadas por microscopía confocal (A1R +, Nikon). Anteriormente demostramos que la proteína del virus de la gripe M2 (un canal ion selectivo de protones), su mutante H37G (que ha perdido su selectividad de protones y permite el transporte de otros cationes como Na + y K + ), y la proteína EMCV 2B (un canal Ca 2+) estimula la secreción de IL-1β mediada por NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012). Además, la proteína SRAS-CoV E actúa como un canal de iones permeables a Ca 2+ que activa el NLRP3 inflamaso (Nieto- Torres et al., 2015). El hecho de que 3a proteína de SARS-CoV actúa como viroporina nos llevó a examinar si también desencadena la activación de la inflamación. De esta manera, primero generamos plásmidos lentivirus que expresaban proteínas etiquetadas con V5 y confirmamos su expresión en células HEK293FT mediante el análisis de inmunoblot (Figuras 1A-C). Luego transferimos BMM de lipopolisacárido (LPS) con los lentivirus que expresaban las proteínas SRAS-CoV E, 3a, M, virus influenza M2, o EMCV 2B. De acuerdo con informes anteriores (Ichinohe et al., Figura 1D). De igual manera, los lentivirus que expresan las proteínas SRAS-CoV E o 3a estimulaban la liberación de IL-1β de BMMs con LPS (Figura 1D). Además, la secreción de IL-1β de BMMs con LPSprimed coinfectados con lentivirus E-y 3a-expresantes fue significativamente superior a la de las células infectadas con lentivirus SRAS-CoV (Figura 1E). Estos datos indicaron que la expresión de la viroporina 3a de SARS-CoV es suficiente para estimular la secreción de IL-1β por BMMs con LPS-primed. Estudios anteriores demostraron que los aminoácidos N-terminales 40 de la proteína SRAS-CoV E son importantes para la formación de canales de iones, y que las mutaciones N15A y V25F [ubicadas en el dominio transmembrana (a partir de residuos de aminoácidos 7-38]] previenen la conductividad iónica (Wilson et al., 2004; Torres et al., Además, la proteína SRAS-CoV 3a contiene un dominio rico en cisteína (residuos de aminoácidos 127-133) que participa en la formación de un homodímero para generar el canal iónico (Lu et al., 2006; Chan et al., 2009). Así, la mutación del dominio rico en cisteína bloquea la conductividad iónica por la proteína 3a (Chan et al., 2009). Con este fin, sustituimos los aminoácidos Cys-127, Cys-130 y Cys-133 dentro del dominio rico en cisteína de la proteína SRAS-CoV 3a con serina para generar un lentivirus que expresa el mutante de actividad de pérdida del canal iónico, 3a-CS (Chan et al., 2009; Figura 2A). Para comprobar si la actividad de los canales iónicos de la proteína SRAS-CoV 3a es necesaria para estimular la secreción de IL-1β, tradujimos BMMs con lentivirus que expresan las proteínas SRAS-CoV E, V25F, 3a, 3a-CS o M. De acuerdo con un informe anterior (Nieto -Torres et al., 2015), encontramos que el lentivirus mutante V25F no estimuló la liberación de IL-1β de los BMMs (Figura 2B). En particular, la secreción de IL-1β completamente abrogada de 3a-CS (Figura 2B), sugiriendo que la actividad de los canales iónicos de la proteína 3a es necesaria para la secreción de IL-1β inducida por SRAS-CoV 3a. FIGURA 4 Activación inflamasoma NLRP3 por SARS-CoV 3a. Las células HeLa fueron transfectadas con la expresión plasmid codificando NLRP3 y que codificando SARS-CoV 3a, 3a-CS, E o V25F, y con un microscopio confocal. Barras de escala, 10 μm. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes. A continuación, determinamos la localización subcelular de la proteína SARS-CoV 3a utilizando microscopía confocal. Cuando los sobrenadantes libres de SARS-CoV fueron recolectados a 24 h (lentivirus) o 6 h (ATP) post-infección o estimulación, y analizados para IL-1β por ELISA. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes, e indican la media ± DE; * * P < 0,01 y * * P < 0,001. 3a proteína se expresó en las células HeLa, se observaron dos patrones de distribución principales. De acuerdo con informes anteriores (Yu et al., 2004; Yuan et al., 2005), la proteína 3a localizada en el aparato Golgi (Figura 3A ). Además, las proteínas 3a concentradas en estructuras puntuales, que principalmente se localizaron en el retículo endoplasmático (ER) (Figura 3B ). Por el contrario, el mutante 3a-CS se concentró en el aparato Golgi más que en la EA y no formaron estructuras puntuales (Figuras 3A, B). A continuación se examinó la localización intracelular de NLRP3. La activación del flammasoma NLRP3 llevó a una redistribución del citosol al espacio perinuclear, un proceso considerado como distintivo de la activación del NLRP3 (Zhou et al., 2011; Ito et al., 2012; Johnson et al., 2013; Moriyama et al., 2016). Aunque las células que expresan los mutantes de actividad-pérdida de los canales iónicos 3a-CS o V25F expresaron uniformemente el NLRP3 a lo largo del citoplasma, se redistribuyó a la región perinuclear en las células de expresión SRAS-CoV 3a-o E (figura 4). Juntos, estos datos proporcionan evidencia de que la actividad del canal iónico de la proteína SRAS-CoV 3a es esencial para desencadenar el flammasomasoma NLRP3. Tanto K + Efflux como ROS Production están involucrados en la liberación de IL-1β Inducida por la proteína SRAS-CoV 3a Finalmente, investigamos el mecanismo por el cual SRAS-CoV 3a activa la flammasoma NLRP3. Un estudio previo mostró que la proteína 3a de SRAS-CoV actúa como un canal K + (Lu et al., 2006). Además, K + eflux es un activador bien conocido de la flammasoma NLRP3 (Mariathasan et al., 2006; Petrilli et al., 2007). Estas observaciones nos llevaron a examinar si K + eflux es necesario para la secreción de 3a IL-1β mediada. Para ello, los BMM en medio rico en K + fueron infectados con virus influenza A o lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E o 3a. De acuerdo con un resultado previo (Ichinohe et al., 2010), encontramos que la secreción de IL-1β causada por el virus influenza fue completamente bloqueada cuando la concentración extracelular de K + fue aumentada a 130 mM (Figura 5A). El efecto inhibidor del medio rico en K + también fue observado cuando las células fueron estimuladas con lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E o 3a (Figura 5B ). Dado que los ROS mitocondriales son importantes para la activación del inflamasoma NLRP3 (Nakahira et al., 2011; Zhou et al., 2011), a continuación estimulamos los BMM con ATP o lentivirus extracelulares que expresan las proteínas SARS-CoV E o 3a en presencia o ausencia del antioxidante, Mito-TEMPO, un tesoro específico para los ROS Trnka et al., 2009). Como se informó anteriormente (Nakahira et al., 2011; Ito et al., 2012), el tratamiento de los BMM con secreción de IL-1β Mito-TEMPO completamente bloqueada en respuesta a ATP (Figura 6A). De manera similar, la liberación de IL-1β inducida por las proteínas SARS-CoV E y 3a fue significativamente inhibida por Mito-TEMPO (Figura 6B). Estas observaciones indican que la proteína SARS-CoV 3a interrumpe las concentraciones iónicas intracelulares y causa daños mitocondriales, activando así el inflamasoma NLRP3. En resumen, encontramos que la actividad del canal iónico de la proteína SARS-CoV 3a es esencial para la activación del inflamasoma NLRP3. Además, tanto la producción de K + eflujo y ROS mitocondriales son necesarios para la secreción de IL-1β mediada por SARS-CoV 3a. Hasta ahora, se han propuesto varios modelos para explicar la activación de NLRP3 inflamasoma por virus ARN. En primer lugar, el ARN viral o productos de escisión del ARN generados por la RNASa L activan el inflamasoma NLRP3 a través de la helicasa DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). En segundo lugar, las viroporinas codificadas por virus del ARN activan el inflamasoma NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013; Nieto-Torres et al., 2015). En el caso del virus de la gripe, el canal de iones M2 selectivo de protones en la red trans-Golgi ácida activa el flammasome NLRP3 (Ichinohe et al., 2010). Curiosamente, un mutante M2 en el que la histidina fue sustituida por glicina en la posición 37 (H37G), causando pérdida de selectividad de protones, permite el transporte de otros cationes (es decir, Na+ y K+), lo que conduce a una secreción mejorada de IL-1β de BMMs de LPS y células dendríticas cuando se compara con la proteína de tipo salvaje M2. Además, las proteínas 2B del EMCV, el poliovirus, el enterovirus 71 (EV71) y el rinovirus humano (miembro de la familia Picornaviridae) desencadenan la activación NLRP3 inflamasoma al inducir el flujo de Ca 2+ desde los compartimentos ER y Golgi (Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013). Además, el virus de la hepatitis C estimula la producción de IL-1β mediada por NLRP3 inflamado a través de su p7 viroporina (Negash et al., 2013; Farag et al., 2017). En tercer lugar, un estudio reciente ha demostrado que la proteína 3D del EV71 interactúa directamente con el NLRP3 para facilitar el montaje del complejo NLRP3 inflamasoma (Wang et al., 2017). En el caso de SARS-CoV, las formas de viroporina E forman canales de iones permeables Ca 2+ y activan el inflamasoma NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Además, se encontró que otra viroporina 3a induce la activación del inflamasoma NLRP3 (Yue et al., 2018). Aunque la sustitución de alanina en Cys-133, que se requiere para la formación de dimer o tetrameros (Lu et al., 2006), todavía permite la activación del flammasoma NLRP3 interactuando con caspasa-1 (Yue et al., 2018), la actividad de los canales iónicos - pérdida mutante 3a-CS (Cys-to-Ser sustitución en las posiciones Cys-127, Cys-130 y Cys-133) (Chan et al., 2009 ) completamente abrogado IL-1β secreción de BMMs LPS-primed, lo que sugiere que la proteína 3a de SARS-CoV tiene la capacidad de inducir la activación de inflamación NLRP3 por múltiples mecanismos. Estudios anteriores muestran que la proteína 3a del SARS-CoV está localizada en la membrana plasmática (Minakshi y Padhan, 2014) y actúa como un canal K+ (Lu et al., 2006), estimulando así (presumiblemente) el flujo K+ en la membrana plasmática. De hecho, encontramos que la secreción de IL-1β causada por la proteína 3a fue significativamente inhibida cuando la concentración de K+ extracelular aumentó a 130 mM. Aunque no queda claro si otra viroporina 8a de SARS-CoV (Castano-Rodriguez et al., 2018) activa la inflamación del NLRP3, estos datos destacan la importancia de las viroporinas en la activación del NLRP3 inducida por el SARS-CoV. Una mejor comprensión del mecanismo que rige el flammasoma NLRP3 facilitará el desarrollo de intervenciones más eficaces para el tratamiento de enfermedades infecciosas y aumentará nuestra comprensión de la patogénesis viral.

¿Cuál fue la tasa de mortalidad del brote de coronavirus del SARS entre noviembre de 2002 y julio de 2003?

El síndrome respiratorio agudo severo Coronavirus Viroporina 3a Activa el Inflammasome NLRP3https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6361828/SHA: f02d0c1e8b0109648e578662dc250abe349a033cAutores: Chen, I-Yin; Moriyama, Miyu; Chang, Ming-Fu; Ichinohe, TakeshiFecha: 2019-01-29DOI: 10.3389/fmicb.2019.00050Licencia: cc-byAbstract: Familia de receptores tipo nod, dominio de pirina 3 (NLRP3) regula la secreción de citocinas proinflamatorias interleucina 1 beta (IL-1β) e IL-18. Anteriormente se demostró que las proteínas 2B del virus de la gripe M2 o encefalomiocarditis (EMCV) estimulan la secreción de IL-1β después de la activación del flammasoma NLRP3. Sin embargo, el mecanismo por el cual el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV) activa el flammasoma NLRP3 permanece desconocido. Aquí, proporcionamos evidencia directa de que la proteína SRAS-CoV 3a activa el flammasoma NLRP3 en macrófagos lipopolisacáridos. SRAS-CoV 3a fue suficiente para causar la activación del flammasoma NLRP3. La actividad del canal iónico de la proteína 3a fue esencial para la secreción de IL-1β mediada por 3a. Mientras que las células no infectadas o infectadas por un lentivirus que expresaban una proteína 3a defectuosa en la actividad de los canales iónicos expresaban NLRP3 de manera uniforme en todo el citoplasma, NLRP3 se redistribuyó al espacio perinuclear en las células infectadas por un lentivirus que expresaba la proteína 3a. Las especies K(+) eflujo y oxígeno reactivo mitocondrial fueron importantes para la activación del flammasoma SRAS-CoV 3a inducida por NLRP3. Estos resultados destacan la importancia de las viroporinas, proteínas virales formadoras de poros transmembranas, en la activación del NLRP3 inflamatorio inducida por virus. Texto: Síndrome respiratorio agudo severo coronavirus (SARS-CoV), miembro del género Betacoronavirus de la familia Coronaviridae, es un virus envuelto con un genoma Los 5 dos tercios del genoma codifican grandes precursores de poliproteínas, marco abierto de lectura (ORF) 1 y ORF1b, que son proteolíticamente cortados para generar 16 proteínas no estructurales (Tan et al., 2005). El 3 un tercio del genoma codifica cuatro proteínas estructurales, pico (S), sobre (E), matriz (M) y nucleocápsido (N), y proteínas no estructurales, junto con un conjunto de proteínas accesorias (3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b y 9b) (Perlman y Dandekar, 2005; Tan et al., 2005). El SARS-CoV es el agente etiológico del SARS (Drosten et al., 2003; Fouchier et al., 2003; Ksiazek et al., 2003; Kuiken et al., 2003; Peiris et al., 2003). Entre noviembre de 2002 y julio de 2003 se denunciaron a la Organización Mundial de la Salud por lo menos 8.098 casos confirmados en laboratorio de infección humana, con una tasa de mortalidad del 9,6%, y se detectaron altos niveles de citocinas proinflamatorias, incluidos el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, la interleucina (IL)-1β e IL-6, en los tejidos de autopsia de pacientes con SARS (He et al., 2006). Aunque la regulación de las citocinas inflamatorias puede estar involucrada en lesiones pulmonares y la patogénesis del SARS-CoV, no se El sistema inmunitario innato utiliza receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) para detectar patrones moleculares asociados con patógenos (Medzhitov, 2001; Kawai y Akira, 2010). El reconocimiento de la infección por virus juega un papel importante en la limitación de la replicación del virus en las primeras etapas de la infección. Familia de receptores tipo nod, dominio de pirina 3 (NLRP3) se activa por una amplia variedad de estímulos, incluyendo la infección por virus (Bauernfeind et al., 2011). Cuatro modelos que describen la activación de la inflamación NLRP3 se han propuesto hasta ahora (Hornung y Latz, 2010; Schroder et al., 2010; Tschopp y Schroder, 2010). En primer lugar, las alteraciones en las concentraciones iónicas intracelulares, incluyendo K + eflujo y Ca 2 + afluencia, juegan un papel importante (Fernandes-Alnemri et al., 2007; Petrilli et al., 2007; Arlehamn et al., 2010; Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Murakami et al., 2012; Muñoz-Planillo et al., 2013). En segundo lugar, la catepsina B y L, que son proteasasas de cisteína lisosómicas específicas, son aunque jugar un papel después de la fagocitosis de cristales de colesterol (Duewell et al., 2010), péptido fibrilar amiloide-beta, cristales de sílice y sales de aluminio. En tercer lugar, la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) o ADN mitocondrial a partir de mitocondrias dañadas (Zhou et al., 2011 Nakahira et al., 2011; Shimada et al., 2012). Finalmente, los productos de escisión de ARN viral o ARN generados por la Rnasa L activan el inflamasoma NLRP3 a través de la helicasa DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). Al activarse, el NLRP3 se recluta a las mitocondrias mediante asociación con la señalización antiviral mitocondrial (MAVS) o mitofusina 2 expresada en la membrana mitocondrial externa Subramaniano et al., 2013); estas moléculas reclutan a continuación la proteína similar a la mota asociada a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasas (ASC) y pro-caspasa-1 para formar el inflamasoma NLRP3. Este evento activa la molécula aguas abajo, caspasa-1, que cataliza el procesamiento proteolítico de pro-IL-1β y pro-IL-18 en sus formas activas y estimula su secreción (Kayagaki et al., 2015; Shi et al., 2015). Es cada vez más evidente que NLRP3 detecta virus ARN al detectar el daño celular o el malestar inducido por las viroporinas (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013; Nieto-Torres et al., 2015), proteínas transmembranas formadoras de poros, codificadas por ciertos virus ARN; estas proteínas alteran la permeabilidad de la membrana a los iones al formar canales de membrana (Tan et al., 2005; Chen e Ichinohe, 2015). Un estudio reciente muestra que la proteína SRAS-CoV E, que comprende sólo 76 aminoácidos, forma canales de Ca 2+-permeables y activa el inflamasoma NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Aunque las proteínas E y 3a del SARS-CoV, que comprenden 274 aminoácidos y contienen tres dominios transmembranas (Zeng et al., 2004; Lu et al., 2006), se cree que actúan como canales Na + /K + y K +, respectivamente (Wilson et al., 2004; Lu et al., 2006; Torres et al., 2007; Parthasarathy et al., 2008; Pervushin et al., 2009; Wang et al., 2011), el papel de la proteína 3a en la activación del inflamasoma NLRP3 permanece desconocido. Aquí, examinamos el papel de la proteína 3a en la activación del inflamasoma NLRP3. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por los Comités de Animales del Instituto de Ciencias Médicas (Universidad de Tokio). Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMMs) fueron preparados como se describió anteriormente (Ichinohe et al., 2009). En resumen, la médula ósea se obtuvo de la tibia y el fémur mediante el lavado con el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM; Nacalai Tesque). Las células de médula ósea fueron cultivadas durante 5 días en DMEM complementadas con un 30% de L929 sobrenadante celular que contiene factor estimulante de colonias de macrófagos, 10% de suero fetal inactivado por calor (FBS) y L-glutamina (2 mM) a 37 • C/5% CO 2. Las células HEK293FT (línea de células renales embrionarias humanas) y las células HeLa (línea de células de carcinoma epitelial humano) se mantuvieron en el DMEM complementadas con un 10% de FBS, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). Las células MDCK (células renales caninas Madin-Darby) y HT-1080 (línea celular de fibrosarcoma humano) se cultivaron en el medio esencial mínimo de Eagle (E-MEM; Nacalai Tesque) complementadas con un 10% de FBS, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). La cepa viral A/PR8 (H1N1) fue cultivada a 35 • C durante 2 días en las cavidades alantóicas de huevos de pollo fértiles de 10 días de edad (Ichinohe et al., 2009). El título viral fue cuantificado en un ensayo de placa estándar utilizando células MDCK (Pang et al., 2013). Plasmids cDNAs codificando las proteínas E y M de la cepa SRAS-CoV Frankfurt 1 (Matsuyama et al., 2005) se obtuvieron mediante transcripción inversa y PCR del ARN total extraído de células Vero infectadas por SRAS-CoV, seguido de amplificación PCR mediante imprimaciones específicas. pcDNA3.1D-3a-V5His fue proporcionado por Ming-Fu Chang (National Taiwan University College of Medicine, Taipei, Taiwán). Para generar los plásmidos pLenti6-E-V5His, pLenti6-3a-V5His, y pLenti-M-V5His, fragmentos de cDNA de E, 3a, y M fueron amplificados de pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His, y pcDNA3.1D-M-V5His usando conjuntos específicos de imprimadores y luego ligados en vectores pLenti6-TOPO (Invitrogen). Para generar plásmidos pCA7-flag-E, pCA7-flag-3a, y pCA7flag-M, pCA7-HA-E, pCA7-HA-3a, y pCA7-HA-M, fragmentos de cDNA de E, 3a, y M fueron amplificados de pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His, y pcDNA3.1D-M-V5His utilizando conjuntos específicos de imprimación, digeridos con EcoR I y no I, y subclonados en los sitios EcoR I-Not I del plásmido pCA7-flag-ASC o pCA7-HA-M2, respectivamente (Ito et al., 2012). Para construir plásmidos que expresan el mutante E V25F, los fragmentos de E mutados fueron amplificados por PCR inversa con plásmidos que contienen E de tipo salvaje y conjuntos de imprimación específicos. Los productos de PCR fueron cortados por Dpn I, ligados en una reacción que contiene ligasa y T4 cinasa y luego transformados en células competentes DH5α (TOYOBO). Para construir plásmidos que expresan el mutante 3a 3a-CS, fragmentos fueron amplificados de plásmidos que contienen salvaje tipo 3a utilizando conjuntos de imprimación específicos 3a y transformados como se describe anteriormente. Las células HEK293FT fueron sembradas en placas de racimo de 24 pocillos y transfectadas con 1 μg de pLenti6-E/3a/M-V5His, pLenti-GFP (proteína fluorescente verde), o pLenti-M2 utilizando polietilenimina (PEI) Max. A las 24 horas de la transfección, las células fueron lisadas con tampón RIPA (50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 0,05% de sulfato de dodecil sódico (SDS), 150 mM NaCl y 1 mM EDTA). Y los lisatos fueron sometidos a electroforesis de gel de poliacrilamida SDS (PAGE), seguida de electroblote en membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas fueron incubadas durante la noche con anticuerpos anti-V5-tag del ratón (R960-25, Invitrogen), anti-influenza A del ratón M2 (14C2, Abcam), anti-GFP del ratón (GF200, Nacalai Tesque) o antitubulina del conejo (DM1A, Santa Cruz), seguidos de anticuerpos anti-mouse IgG (Jackson Immuno Research Laboratories) o anti-rabbit IgG (Invitrogen). Después de lavar 3 veces con tampón de lavado (0,05% Tween-20/PBS), las membranas fueron expuestas usando Chemi-Lumi One Super (Nacalai Tesque), y las señales quimioluminiscentes fueron capturadas por un mini aparato ImageQuant LAS-4000 (GE Healthcare). Para generar lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E, 3a y M, el cDNA de longitud completa codificando cada proteína viral fue clonado en el vector pLenti6.3/V5-TOPO (Invitrogen) usando los siguientes imprimadores: SARS-CoV E hacia adelante, 5 -caccatgttactctctctctctcgga-3, y hacia atrás, 5 -gaccagaagatcaggaactc-3 ; SARS-CoV 3a hacia adelante, 5caccatggttttttatgagagatt-3, y hacia atrás, 5 -caaaggcacgcctagtagtcg-3 ; SARS-CoV M hacia adelante, 5 -caccatggcaagaggctatat-3, y hacia atrás, 5 -cctactagcaaagcaa Las monocapas subconfluentes de células HEK293FT sembradas en un plato recubierto de colágeno (10 cm de diámetro) fueron transfectadas con 3 μg de pLenti6.3/V5-TOPO vector que expresaba cada proteína viral o EGFP junto con ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los sobrenadantes que contenían lentivirus fueron recolectados y filtrados a través de un filtro de 0,45 μm (Millipore) a 72-96 h de post-transfección (Ito et al., 2012). El título lentiviral fue luego cuantificado utilizando células HT-1080 como se describió anteriormente. Los macrófagos derivados de la médula ósea fueron plateados a una densidad de 8 × 10 5 en placa de 24 pozos e infectados con el virus de la gripe A/PR8 o lentivirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 o 0,2 durante 1 h, respectivamente. Luego, los BMM fueron estimulados con 1 μg/ml de LPS y cultivados por 23 h adicionales en medio completo. Los sobrenadantes fueron recolectados a las 24 h post-infección y centrifugados para eliminar desechos celulares. La cantidad de IL-1β en los sobrenadantes fue medida en un ensayo inmunosorbente enzimático (ELISA) usando anticuerpos emparejados (eBioscience) (Ichinohe et al., 2010. Para aclarar la localización celular de las proteínas de tipo salvaje y mutante 3a del SARS-CoV, las células HeLa fueron cultivadas en coverslips y transfectadas con 1 μg de pCA7-flag-3a o pCD7-flag-3a-CS junto con 0,5 μg de ER-mCherry o DsRed-Golgi (Ito et al., 2012). A las 24 h de post-transfección, las células fueron fijas con 4% de paraformaldehído y permeabilizadas con 1% de Triton X-100/PBS. Después de lavar con PBS y bloquear con 4% de BSA/PBS, las células fueron incubadas con un anticuerpo anti-flag de ratón (M2, Sigma) seguido de incubación con Alexa Fluor 488-conjugado IgG (H+L) anti Para observar la distribución celular de NLRP3 en las células E-o 3a-expresantes, las células HeLa fueron cultivadas en labio-cubierto y transfectadas con 1 μg de pCA7-HA-E, pCA7-HA-EV25F, pCA7-HA-3a, pCA7-HA-3a-CS, o vector de control pCA7 junto con 0,5 μg de pCA7-NLRP3. A las 24 h post-transfección, las células fueron fijas y permeabilizadas con 4% de paraformaldehído y 1% de Tritón X-100/PBS. Después del lavado y bloqueo, las células fueron incubadas con anticuerpos anti-HA del conejo (561, MBL) y anti-NLRP3 del ratón (Cryo-2; AdipoGen), seguidos por Alexa Fluor 488-conjugado de cabra anti-rabbit IgG (H+L) y Alexa Fluor 568-conjugado de cabra anti-mouse IgG (H+L) (Tecnologías de la Vida). Las señales fluorescentes fueron observadas por microscopía confocal (A1R +, Nikon). Anteriormente demostramos que la proteína del virus de la gripe M2 (un canal ion selectivo de protones), su mutante H37G (que ha perdido su selectividad de protones y permite el transporte de otros cationes como Na + y K + ), y la proteína EMCV 2B (un canal Ca 2+) estimula la secreción de IL-1β mediada por NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012). Además, la proteína SRAS-CoV E actúa como un canal de iones permeables a Ca 2+ que activa el NLRP3 inflamaso (Nieto- Torres et al., 2015). El hecho de que 3a proteína de SARS-CoV actúa como viroporina nos llevó a examinar si también desencadena la activación de la inflamación. De esta manera, primero generamos plásmidos lentivirus que expresaban proteínas etiquetadas con V5 y confirmamos su expresión en células HEK293FT mediante el análisis de inmunoblot (Figuras 1A-C). Luego transferimos BMM de lipopolisacárido (LPS) con los lentivirus que expresaban las proteínas SRAS-CoV E, 3a, M, virus influenza M2, o EMCV 2B. De acuerdo con informes anteriores (Ichinohe et al., Figura 1D). De igual manera, los lentivirus que expresan las proteínas SRAS-CoV E o 3a estimulaban la liberación de IL-1β de BMMs con LPS (Figura 1D). Además, la secreción de IL-1β de BMMs con LPSprimed coinfectados con lentivirus E-y 3a-expresantes fue significativamente superior a la de las células infectadas con lentivirus SRAS-CoV (Figura 1E). Estos datos indicaron que la expresión de la viroporina 3a de SARS-CoV es suficiente para estimular la secreción de IL-1β por BMMs con LPS-primed. Estudios anteriores demostraron que los aminoácidos N-terminales 40 de la proteína SRAS-CoV E son importantes para la formación de canales de iones, y que las mutaciones N15A y V25F [ubicadas en el dominio transmembrana (a partir de residuos de aminoácidos 7-38]] previenen la conductividad iónica (Wilson et al., 2004; Torres et al., Además, la proteína SRAS-CoV 3a contiene un dominio rico en cisteína (residuos de aminoácidos 127-133) que participa en la formación de un homodímero para generar el canal iónico (Lu et al., 2006; Chan et al., 2009). Así, la mutación del dominio rico en cisteína bloquea la conductividad iónica por la proteína 3a (Chan et al., 2009). Con este fin, sustituimos los aminoácidos Cys-127, Cys-130 y Cys-133 dentro del dominio rico en cisteína de la proteína SRAS-CoV 3a con serina para generar un lentivirus que expresa el mutante de actividad de pérdida del canal iónico, 3a-CS (Chan et al., 2009; Figura 2A). Para comprobar si la actividad de los canales iónicos de la proteína SRAS-CoV 3a es necesaria para estimular la secreción de IL-1β, tradujimos BMMs con lentivirus que expresan las proteínas SRAS-CoV E, V25F, 3a, 3a-CS o M. De acuerdo con un informe anterior (Nieto -Torres et al., 2015), encontramos que el lentivirus mutante V25F no estimuló la liberación de IL-1β de los BMMs (Figura 2B). En particular, la secreción de IL-1β completamente abrogada de 3a-CS (Figura 2B), sugiriendo que la actividad de los canales iónicos de la proteína 3a es necesaria para la secreción de IL-1β inducida por SRAS-CoV 3a. FIGURA 4 Activación inflamasoma NLRP3 por SARS-CoV 3a. Las células HeLa fueron transfectadas con la expresión plasmid codificando NLRP3 y que codificando SARS-CoV 3a, 3a-CS, E o V25F, y con un microscopio confocal. Barras de escala, 10 μm. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes. A continuación, determinamos la localización subcelular de la proteína SARS-CoV 3a utilizando microscopía confocal. Cuando los sobrenadantes libres de SARS-CoV fueron recolectados a 24 h (lentivirus) o 6 h (ATP) post-infección o estimulación, y analizados para IL-1β por ELISA. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes, e indican la media ± DE; * * P < 0,01 y * * P < 0,001. 3a proteína se expresó en las células HeLa, se observaron dos patrones de distribución principales. De acuerdo con informes anteriores (Yu et al., 2004; Yuan et al., 2005), la proteína 3a localizada en el aparato Golgi (Figura 3A ). Además, las proteínas 3a concentradas en estructuras puntuales, que principalmente se localizaron en el retículo endoplasmático (ER) (Figura 3B ). Por el contrario, el mutante 3a-CS se concentró en el aparato Golgi más que en la EA y no formaron estructuras puntuales (Figuras 3A, B). A continuación se examinó la localización intracelular de NLRP3. La activación del flammasoma NLRP3 llevó a una redistribución del citosol al espacio perinuclear, un proceso considerado como distintivo de la activación del NLRP3 (Zhou et al., 2011; Ito et al., 2012; Johnson et al., 2013; Moriyama et al., 2016). Aunque las células que expresan los mutantes de actividad-pérdida de los canales iónicos 3a-CS o V25F expresaron uniformemente el NLRP3 a lo largo del citoplasma, se redistribuyó a la región perinuclear en las células de expresión SRAS-CoV 3a-o E (figura 4). Juntos, estos datos proporcionan evidencia de que la actividad del canal iónico de la proteína SRAS-CoV 3a es esencial para desencadenar el flammasomasoma NLRP3. Tanto K + Efflux como ROS Production están involucrados en la liberación de IL-1β Inducida por la proteína SRAS-CoV 3a Finalmente, investigamos el mecanismo por el cual SRAS-CoV 3a activa la flammasoma NLRP3. Un estudio previo mostró que la proteína 3a de SRAS-CoV actúa como un canal K + (Lu et al., 2006). Además, K + eflux es un activador bien conocido de la flammasoma NLRP3 (Mariathasan et al., 2006; Petrilli et al., 2007). Estas observaciones nos llevaron a examinar si K + eflux es necesario para la secreción de 3a IL-1β mediada. Para ello, los BMM en medio rico en K + fueron infectados con virus influenza A o lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E o 3a. De acuerdo con un resultado previo (Ichinohe et al., 2010), encontramos que la secreción de IL-1β causada por el virus influenza fue completamente bloqueada cuando la concentración extracelular de K + fue aumentada a 130 mM (Figura 5A). El efecto inhibidor del medio rico en K + también fue observado cuando las células fueron estimuladas con lentivirus que expresaban las proteínas SARS-CoV E o 3a (Figura 5B ). Dado que los ROS mitocondriales son importantes para la activación del inflamasoma NLRP3 (Nakahira et al., 2011; Zhou et al., 2011), a continuación estimulamos los BMM con ATP o lentivirus extracelulares que expresan las proteínas SARS-CoV E o 3a en presencia o ausencia del antioxidante, Mito-TEMPO, un tesoro específico para los ROS Trnka et al., 2009). Como se informó anteriormente (Nakahira et al., 2011; Ito et al., 2012), el tratamiento de los BMM con secreción de IL-1β Mito-TEMPO completamente bloqueada en respuesta a ATP (Figura 6A). De manera similar, la liberación de IL-1β inducida por las proteínas SARS-CoV E y 3a fue significativamente inhibida por Mito-TEMPO (Figura 6B). Estas observaciones indican que la proteína SARS-CoV 3a interrumpe las concentraciones iónicas intracelulares y causa daños mitocondriales, activando así el inflamasoma NLRP3. En resumen, encontramos que la actividad del canal iónico de la proteína SARS-CoV 3a es esencial para la activación del inflamasoma NLRP3. Además, tanto la producción de K + eflujo y ROS mitocondriales son necesarios para la secreción de IL-1β mediada por SARS-CoV 3a. Hasta ahora, se han propuesto varios modelos para explicar la activación de NLRP3 inflamasoma por virus ARN. En primer lugar, el ARN viral o productos de escisión del ARN generados por la RNASa L activan el inflamasoma NLRP3 a través de la helicasa DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). En segundo lugar, las viroporinas codificadas por virus del ARN activan el inflamasoma NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013; Nieto-Torres et al., 2015). En el caso del virus de la gripe, el canal de iones M2 selectivo de protones en la red trans-Golgi ácida activa el flammasome NLRP3 (Ichinohe et al., 2010). Curiosamente, un mutante M2 en el que la histidina fue sustituida por glicina en la posición 37 (H37G), causando pérdida de selectividad de protones, permite el transporte de otros cationes (es decir, Na+ y K+), lo que conduce a una secreción mejorada de IL-1β de BMMs de LPS y células dendríticas cuando se compara con la proteína de tipo salvaje M2. Además, las proteínas 2B del EMCV, el poliovirus, el enterovirus 71 (EV71) y el rinovirus humano (miembro de la familia Picornaviridae) desencadenan la activación NLRP3 inflamasoma al inducir el flujo de Ca 2+ desde los compartimentos ER y Golgi (Ito et al., 2012; Triantafilou et al., 2013). Además, el virus de la hepatitis C estimula la producción de IL-1β mediada por NLRP3 inflamado a través de su p7 viroporina (Negash et al., 2013; Farag et al., 2017). En tercer lugar, un estudio reciente ha demostrado que la proteína 3D del EV71 interactúa directamente con el NLRP3 para facilitar el montaje del complejo NLRP3 inflamasoma (Wang et al., 2017). En el caso de SARS-CoV, las formas de viroporina E forman canales de iones permeables Ca 2+ y activan el inflamasoma NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Además, se encontró que otra viroporina 3a induce la activación del inflamasoma NLRP3 (Yue et al., 2018). Aunque la sustitución de alanina en Cys-133, que se requiere para la formación de dimer o tetrameros (Lu et al., 2006), todavía permite la activación del flammasoma NLRP3 interactuando con caspasa-1 (Yue et al., 2018), la actividad de los canales iónicos - pérdida mutante 3a-CS (Cys-to-Ser sustitución en las posiciones Cys-127, Cys-130 y Cys-133) (Chan et al., 2009 ) completamente abrogado IL-1β secreción de BMMs LPS-primed, lo que sugiere que la proteína 3a de SARS-CoV tiene la capacidad de inducir la activación de inflamación NLRP3 por múltiples mecanismos. Estudios anteriores muestran que la proteína 3a del SARS-CoV está localizada en la membrana plasmática (Minakshi y Padhan, 2014) y actúa como un canal K+ (Lu et al., 2006), estimulando así (presumiblemente) el flujo K+ en la membrana plasmática. De hecho, encontramos que la secreción de IL-1β causada por la proteína 3a fue significativamente inhibida cuando la concentración de K+ extracelular aumentó a 130 mM. Aunque no queda claro si otra viroporina 8a de SARS-CoV (Castano-Rodriguez et al., 2018) activa la inflamación del NLRP3, estos datos destacan la importancia de las viroporinas en la activación del NLRP3 inducida por el SARS-CoV. Una mejor comprensión del mecanismo que rige el flammasoma NLRP3 facilitará el desarrollo de intervenciones más eficaces para el tratamiento de enfermedades infecciosas y aumentará nuestra comprensión de la patogénesis viral.

¿Cuántos aminoácidos hay en la proteína SARS-CoV E?

Una nueva función antimicobacteriana de la proteína quinasa fosfatasa activada por mitogenos-1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2804704/SHA: f6ed1f1e9999e57793addb1c9c54c61c7861a995Autores: Cheung, Benny KW; Yim, Howard CH; Lee, Norris CM; Lau, Allan SYDate: 2009-12-17DOI: 10.1186/1471-2172-10-64Licencia: cc-byAbstract: ANTERIORDANTE: Mycobacterium tuberculosis (MTB) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Para combatir este patógeno, las células inmunitarias liberan citocinas incluyendo el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), que es fundamental en el desarrollo de granulomas protectores. Nuestros resultados anteriores mostraron que Bacillus Calmette Guerin (BCG), un micobacterio utilizado como modelo para investigar la respuesta inmune contra MTB, estimula la inducción de TNF-α a través de la proteína quinasa activada por mitogenos (MAPK) en los monocitos sanguíneos humanos. Dado que MAPK phosphatasa-1 (MPK-1) es conocido por regular las actividades de MAPK, examinamos si el MPK-1 juega un papel en la activación de la MAPK inducida por BCG y la expresión de citoquinas. RESULTADOS: Los monocitos sanguíneos primarios humanos fueron tratados con BCG y analizados para la expresión de MKP-1. Además, la inducción del MPK-1 fue regulada por p38 MAPK y quinasa 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2). Sorprendentemente, cuando la expresión del MPK-1 fue bloqueada por su siRNA específico, hubo una disminución significativa en los niveles de fosfo-MAPK (p38 MAPK y ERK1/2) y TNF-α inducible por BCG. CONCLUSIONES: Dado que el TNF-α es fundamental en la formación de granuloma, los resultados indicaron una función positiva inesperada del MPK-1 contra la infección micobacterial en contraposición a su actividad habitual de fosfatasa. Texto: La tuberculosis (TB) sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo, especialmente en los países en desarrollo [1]. La enfermedad es causada por Mycobacterium tuberculosis (MTB) y aproximadamente un tercio de la población mundial ha sido infectada En un informe reciente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que hay 9,2 millones de nuevos casos de tuberculosis en todo el mundo en 2006 [1]. En respuesta a la infección por MTB, la inducción de citocinas por células inmunitarias es un importante mecanismo de defensa. Los macrófagos infectados secretan factores de señalización intercelular, citoquinas proinflamatorias, para mediar la respuesta inflamatoria que conduce a la formación de granuloma e inducción de inmunidad mediada por células T [2]. Para entender la patogénesis de la tuberculosis, las vías de señalización inducidas por micobacterias han sido motivo de interés desde hace mucho tiempo. Informes anteriores han demostrado que p38 MAPK y ERK1/2 son necesarios en la inducción de la expresión TNF-α en monocitos humanos infectados con M. tuberculosis H37Rv [4]. Hemos revelado además el papel significativo de los MAPK en los eventos de transducción de señales de activación micobacteriana de monocitos sanguíneos primarios humanos (PBMo) que conducen a expresiones citocinas a través de la interacción con PKR [5]. Sin embargo, los eventos posteriores en cuanto a cómo se regula MAPK y cómo tal regulación afecta a la producción de citocinas en respuesta a micobacterias siguen siendo elucidadas. Puesto que los MAPK se activan por fosforilación, la desfosforilación de los MAPK parece ser un proceso eficiente para inactivar sus actividades. Los ejemplos de estas fosfatasas incluyen fosfatasas de tirosina, fosfatasas de serina/treonina y fosfatasas de doble especificidad (DUSPs). Algunas fosfatasas de DUSPs también se conocen como fosfatasas de MAPK (MPK) [6] [7]. Actualmente, hay al menos 10 PHPs identificados, mientras que el MKP-1 es el miembro más estudiado de la familia. El papel regulador del PKP-1 en la inducción de citoquinas se demuestra mejor por los macrófagos de KKP-1 (KO) en respuesta al lipopolisacárido (LPS), un componente de pared celular de las bacterias Gram-negativas. Los macrófagos de PKP-1 mostraron fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como una mayor producción de TNF-α en respuesta Consistente con estos resultados, otro grupo reveló además que los macrófagos derivados de la médula ósea KO-MPK-1 tratados con LPS muestran una mayor actividad de unión al ADN AP-1 [10]. También mostraron que la expresión del MPK-1 inducida por LPS depende del factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) y del adaptador que contiene el dominio TIR induciendo IFN-β (TRIF) [10], demostrando así el papel del MPKP-1 en la transducción de señales. No sólo el LPS, otros inductores del TLR incluyendo CpG, peptidoglicano, poli CI y Pam 3 Cys pueden regular las expresiones citoquinas incluyendo TNF-α, IL-10 a través de las actividades del MPKP-1 [10, 11]. En estos procesos, el MPKP-1 sirve para mitigar los efectos indeseables del shock séptico y mantener Otro ejemplo de la función MPK-1 es la respuesta inmune a Staphylococcus aureus (S. aureus), una bacteria Gram positiva. Hay niveles más altos de producción de citocinas incluyendo TNF-α, IL-6, y MIP-1α en ratones MKP-1 KO infectados con S. aureus [12]. Además, los ratones tendrían un rápido desarrollo de disfunción multiorgánica, así como una tasa de mortalidad más rápida en caso de desafío con S. aureus matados por calor [12]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que MKP-1 protege al huésped de la sobreactivación del sistema inmunitario en respuesta a bacterias Gram negativo o Gram positivo. En el pasado, se creía que diferentes miembros de la familia MKP/DUSP tienen funciones superpuestas. Sin embargo, la aparición de DUSP2 cambió el concepto hacia abajo [13]. Se En las células DUSP2 KO, produjeron menos mediadores inflamatorios, lo que implica que DUSP2 puede desempeñar un papel en la mediación en lugar de limitar la inflamación. Para los casos, cuando los macrófagos DUSP2 KO fueron tratados con LPS, hubo menos receptores de TNF, IL-6, óxido nítrico, IL-12, en comparación con los de las contrapartes del tipo salvaje [13]. Cuando los mastocitos derivados de la médula ósea DUSP2 KO fueron sensibilizados por primera vez con el receptor de inmunoglobulina E (IgE) (Fc.RI) y luego estimulados con antígeno estable dinitrofenol-calor, produjeron niveles más bajos de ARNmT, menor producción de IL-6, menor fosforilación de ERK1/2, p38 MAPK, y menos actividades transcripcionales por Elk1 y NF Estas inesperadas regulaciones positivas de funciones celulares inmunitarias por DUSP2 se han hipotetizado debido a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. La estimulación de los mastocitos KO y macrófagos mostró incrementos en la fosforilación de JNK. Además, la inhibición de JNK por inhibidores de moléculas pequeñas mostró incrementos en la fosforilación de ERK [13]. Los autores también mostraron que hubo interacciones físicas de DUSP2 con ERK2, DUSP2 con JNK2, así como DUSP2 y p38 MAPK después de la estimulación de las células con antígeno estable de dinitrofenol-calor. Sin embargo, los detalles de las conversaciones cruzadas entre MAPKs y fosfatasas necesitan mayor investigación. Así, la familia MKP juega un papel crítico en la regulación de las respuestas inmunes. La respuesta inmune innata protege al huésped de la infección por MTB por secreción de citocinas incluyendo TNF-α en células inmunitarias. Mientras tanto, MAPK es una de las proteínas críticas en la regulación de la inmunidad y la expresión de citoquinas. Dado que MAPK está regulado por MKP-1 en respuesta a LPS y la activación de MAPK es importante en la expresión de citoquinas inducidas por BCG, hipotetizamos que el MKP-1 juega un papel crítico en la regulación inmune de BCG en monocitos humanos. Examinamos la implicación del MKP-1 en la activación de MAPK inducida por BCG y su consiguiente expresión de citoquinas. Aquí presentamos evidencias de que el MKP-1 juega un papel inesperado en la regulación de la inducción de citoquinas por BCG a través de su control de la fosforilación de MAPK. Se ha reportado que muchos inductores incluyendo factores de crecimiento, LPS, peptidoglicano, y dexametasona pueden estimular la expresión de MKP-1 en macrófagos humanos, microglia, mastocitos o fibroblastos [6]. Para investigar el papel de diferentes inductores de TLR en el proceso de inducción de MKP-1 en monocitos sanguíneos humanos, el nivel de MKP-1 mRNA se midió mediante el método de reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR). PBMo se aisló de células mononucleares primarias de sangre humana y se estimuló con Pam 3 Cys (agonista TLR2), poli IC (agonista TLR3) o LPS (agonista TLR4) durante 1 y 3 horas. Tras la exposición a Pam 3 Cys o LPS, hubo inducciones significativas de los niveles Estos efectos sobre la inducción del MPKP-1 continuaron durante 3 horas después del tratamiento con Pam 3 Cys (Figura 1A ). Por el contrario, el poli CI no indujo el MPKP-1 (Figura 1A ). Los resultados indican que diferentes inductores mostraron una regulación diferencial de la expresión del MPKP-1. LPS ha sido ampliamente utilizado para demostrar el papel del MPKP-1 en la respuesta inmune tanto in vivo como in vitro [9, 12]. Para establecer una base para la interpretación de los resultados experimentales posteriores, se utilizó el LPS como un control positivo para la inducción de la expresión del MPKP-1. Para determinar los niveles del MPKP-1 en respuesta al LPS, la cinética de la transcripción del MPKP-1 fue determinada por el QPCR. Hubo una inducción significativa del MPKP-1 mRNA, que alcanzó su punto máximo tan temprano como 1 hora Estos resultados mostraron que LPS indujo la expresión MCP-1 (Figura 1B). A continuación, para demostrar la inducción de fosfatasas específicas por BCG, se estudió la cinética de la expresión MCP-1 en PBMo utilizando QPCR durante el tratamiento BCG. Similar a los resultados producidos por LPS, con la adición de BCG (MOI = 1 CFU/celda), hubo una inducción significativa de MKP-1 mRNA dentro de 1 hora de tratamiento BCG determinado por la sonda Taqman específica para MCP-1 (Figura 2A ). Los efectos duraron al menos 6 horas (Figura 2A ). Para examinar si los cambios en la producción proteica fueron paralelos a los niveles de mRNA, los niveles proteicos de MKP-1 fueron medidos por Western blotting. En respuesta a B Los niveles proteicos se mantuvieron durante 2 horas y disminuyeron a los niveles basales a las 3 horas (Figura 2B ). Los resultados demostraron que hubo inducción MKP-1 en respuesta a la activación de BCG en monocitos humanos. Se ha demostrado que la inhibición de p38 MAPK bien por inhibidor específico o siRNA redujo la expresión de MKP-1 en macrófagos tratados con LPS o peptidoglicano [14]. Para determinar los mecanismos involucrados en la expresión BCG inducida por MKP-1, PBMo fue pretratado con varios inhibidores incluyendo PD98059 (inhibidor de MAP quinasa [MEK] o ERK1/2), SB203580 (inhibidor de p38 MAPK), SP600125 (inhibidor de JNK), y CAPE (inhibidor de NF- Se utilizó un rango de concentraciones de cada inhibidor para probar sus concentraciones óptimas y efectos sobre la viabilidad celular y las inhibiciones de la cinasa. Posteriormente se añadió BCG y se recogió el ARN total. Los resultados demostraron que, con la inhibición de las actividades de ERK1/2 y p38 MAPK por sus correspondientes inhibidores relativamente específicos, las expresiones MKP-1 se redujeron significativamente (Figura 3 ). Además, utilizando dosis más altas de SB203580, se demostró que la inhibición se incrementa aún más (datos no mostrados). Por el contrario, el pretratamiento de las células con CAPE y SP600125 no afectó a la inducción de MKP-1 por BCG (Figura 3 ). Estos resultados sugieren que la expresión inducida por BCG MKP-1 es dependiente tanto de p38 MAPK como de ERK1/2. A lo largo de los experimentos anteriores, el objetivo principal fue Así, para examinar más a fondo el papel del MPKP-1 en la señalización inducida por BCG, se utilizó la transfección de siRNA en PBMo para derribar la actividad del MPKP-1. Para demostrar que el MPKP-1 siRNA puede efectivamente derribar el gen objetivo, PBMo fue primero transfectado con control o MKP-1 siRNA y luego tratado con BCG durante 3 horas. Los niveles de MKP-1 mRNA fueron medidos por el método RT-PCR. En la Figura 4A, BCG estimuló la expresión MKP-1 (lanes 1 y 2). En MKP-1 siRNA transfectó monocitos, la inducción de MKP-1 por BCG fue significativamente disminuida (lanes 2 y 4). Los resultados mostraron que el siRNA hace abrogar los niveles de MKP-1 mRNA. Para determinar si el siRNA MKP-1 afecta al BCG inducido MKP-1 a niveles proteicos, PBMo fue tratado como arriba y las proteínas MKP-1 fueron medidas por Western blotting. Los resultados mostraron que el BCG podría inducir proteínas MKP-1 como de costumbre para células transfectadas con control siRNA (Figura 4B, carriles 1-3). Sin embargo, los niveles de BCG inducido expresión proteica MKP-1 fueron reducidos en células transfectadas con siRNA MKP-1 (Figura 4B, carriles 4-6). Juntos, los resultados sugieren que el siRNA MKP-1 no sólo redujo el MKP-1 mRNA en el tratamiento BCG sino que también abrogó la proteína MKP-1 inducida por BCG. Como se indica en la literatura [9], los ratones MKP-1 KO mostraron aumento de la producción Sobre la base de los resultados anteriores de siRNA del MPK-1, se utilizó LPS como control para demostrar los efectos de este sistema siRNA del MPK-1. La expresión citoquina inducida por LPS en células transfectadas de siRNA del MPK-1 sugiere que el sistema siRNA es eficaz para derribar la expresión del MPK-1 y que el MPK-1 actúa como regulador negativo en la expresión del TNF-α inducida por LPS. Para investigar el efecto del siRNA del MPK-1 en la expresión de citoquina inducida por BCG, los niveles de TNF-α, IL-6 e IL-10 mRNA se midieron por el método QPCR. PBMo fueron transfectados con control o MKP-1 siRNA. Después de la exposición al BCG con control siRNA, hubo inducciones significativas de TNF-α, IL-6 e IL-10 m A continuación, se examinaron los efectos del siRNA-MCP-1 en la expresión citoquina inducida por BCG. Sorprendentemente, hubo una abrogación significativa de la expresión TNF-α inducida por BCG por MKP-1 siRNA (Figura 4D ). Con la caída del siRNA-MCP-1, el nivel de TNF-α inducido por BCG fue sólo 60% comparado con el de las células de control, mientras que el IL-6 e IL-10 inducidos por BCG fueron sin cambios en las células transfectadas por MKP-1 siRNA. Los resultados revelaron que el MKP-1 juega un papel en la inducción de la expresión TNF-α sobre la estimulación BCG, que puede ser diferente a la de sus funciones convencionales en las que el MKP-1 actúa como regulador negativo en las vías de señalización inducidas por LPS [7]. El estado de fosforilación de los MAPK fue evaluado en control o siRNA del MPK-1 transfectado PBMo. Los resultados de Western blocking demostraron que BCG indujo tanto la fosforilación p38 como la ERK1/2 en 15 minutos (datos no mostrados) y alcanzó su punto máximo en 30 minutos, y luego regresó a los niveles basales en células tratadas con el siRNA del control (Figura 5). Al igual que los resultados de la expresión de citoquinas, la fosforilación de ambos p38 MAPK y ERK1/2 en respuesta a BCG fue disminuida en monocitos transfectados con siRNA del MPK-1 en lugar del esperado aumento de fosforilación (Figura 5). Los resultados sugieren que la reducción del nivel de producción de TNF-α en monocitos estimulados por BCG se debe a la reducción de la fosforilación de MAPK por MKP-1 siRNA. Este informe presentó evidencias de que una nueva función de MKP-1 se descubre en la regulación de citoquinas en respuesta a la infección micobacteriana. BCG induce el MKP-1 como respuesta rápida (Figura 2). El mecanismo de inducción del MKP-1 por BCG depende tanto de ERK1/2 como de p38 MAPK (Figura 3). Utilizando el enfoque de siRNA, las funciones del MKP-1 se pueden examinar en monocitos humanos primarios. Los resultados mostraron que la activación de los MAPK inducidos por BCG, así como la expresión de citoquinas, son aguas abajo del MKP-1 (Figuras 4D y 5). Por lo tanto, el MPK-1 es una molécula de señalización crítica que está involucrada en la expresión de citoquinas inducidas por BCG. Informes anteriores han demostrado que el MPK-1 inducido por LPS o peptidoglicano depende de p38 MAPK [14]. En consecuencia, el MPK-1 inducido por BCG puede ser inhibido por inhibidores de p38 MAPK y ERK1/2. Curiosamente, se ha demostrado que la degradación del MPK-1 se reduce después de la fosforilación ERK1/2 [15]. Se puede hipotetizar que las proteínas inducidas por BCG MKP-1 pueden ser estabilizadas por ERK1/2 y los mecanismos detallados involucrados requieren más exploración. También, ya que la inhibición de la expresión de MKP-1 por ambos inhibidores (para p38 MAPK y ERK1/ 2) no fue completa, se cree que otras Sobre la base de los resultados de la literatura sobre los efectos de LPS (Figura 6 ), la expectativa original para este proyecto es que el MPK-1 actúa como regulador negativo. Los macrófagos peritoneales estimulados por el MPK-1 KO mostraron una fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como un aumento de la producción de TNF-α [9]. Al hacerlo, la fosforilación inducida por el MPK-1 por el LPS podría disminuir por el MPK-1 siRNA previene la producción prolongada de TNF-α como en la sepsis, lo que puede conducir a un daño grave al huésped. Se esperaba que el BCG indujera el MPK-1 y su inducción se correlacionaría con la defosforilación de los MAPKs incluyendo p38 MAPK. Al bloquear el MKP-1 utilizando siRNA, se esperaba que hubiera aumentado la fosforilación p38 MAPK y la producción prolongada de TNF-α en respuesta a BCG. Sin embargo, nuestros resultados mostrados aquí son diametralmente opuestos. Una posibilidad para los resultados inesperados puede deberse a efectos no específicos de transfección o siRNA. Sin embargo, este no fue el caso ya que hubo una expresión prolongada y aumentada de TNF-α después de que los monocitos transfectados por siRNA del MKP-1 fueron tratados con LPS (Figura 4C ). Ahora hay una nueva hipótesis para explicar tales efectos paradójicos de MKP-1 en la regulación del TNF-α en la que la fosfatasa juega un papel en la regulación positiva de la producción de TNF-α en respuesta a BCG como en el caso de DUSP2 [13 Las estructuras de PKP-1 y DUSP2 son similares, con las que ambos contienen un dominio de interacción MAPK y un sitio catalítico de fosfatasa. Por el contrario, otros dominios DUSP pueden tener dominios adicionales, por ejemplo, PEST [6]. Aquí, postulamos que la función de PKP-1 en la señalización inducida por BCG es similar a la del DUSP2/PAC1. En realidad, el descubrimiento de DUSP2 ha creado inicialmente algunas preguntas paradójicas. Como se describe, DUSP2 se comporta de manera diferente a otros miembros de la familia MKP [13]. En los macrófagos DUSP2 KO tratados con LPS, produjeron menos mediadores inflamatorios incluyendo menos TNF, IL-6, óxido nítrico y células productoras de IL-12, en comparación con la de las contrapartes de tipo salvaje [13 De hecho, los resultados de estos estudios publicados sobre estudios DUSP2 son bastante similares a los de nuestros resultados reportados aquí. Es plausible que estas regulaciones positivas inesperadas de funciones de células inmunes por DUSP2 se deban a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. Se demostró que hay interacciones entre las vías JNK y ERK1/2 [16]. Aquí, demostramos que la activación sostenida de los bloques JNK de activación ERK (Figura 6 ). En la situación DUSP2, la estimulación de los mastocitos y macrófagos KO muestra un aumento de la fosforilación de JNK, e inhibición de JNK por su propio inhibidor específico restaura la fosforilación de ERK1/2 [13]. En la situación BCG-MPK-1, hay una fosforilación temprana de p38 MAPK y ERK Por lo tanto, es posible que JNK pueda jugar un papel en la interacción de crosstalk de MAPK. Sin embargo, nuestros datos preliminares sugieren que el nivel de JNK fosforilado no fue aumentado en PBMo MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana Figura 6 MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana. Modelo LPS fue proporcionado de acuerdo con los hallazgos de la literatura (Izquierda). En este escenario, LPS activa MKP-1, que a su vez defosforila y desactiva fosfo-p38 MAPK, resultando en menos inducción TNF-α. Sin embargo, la situación en la activación DHP-HSA de DUSP2 es más complicada (Middle), ya que la actividad fosfatasa causa la inhibición posterior de fosfo-JNK que conduce a la derrepresión de fosfo-p38 MAPK. En consecuencia, los efectos combinados de esta cascada resultan en más expresión TNF-α. El inesperado papel antimicobacterial del MBP-1 (Right) puede explicarse por eventos similares a los efectos DUSP2. En este caso (Right), hubo una inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MBP-1, y el factor desconocido a su vez inhibe la activación MAPKs que conduce a más inducción TNF-α. Los detalles y los objetivos de la cinasa aún no se han identificado. transfectado con MBP-1 siRNNA (datos no mostrados). Así, los detalles de Aquí presentamos un modelo para resumir los resultados e hipotetizar la existencia de un factor o factores intermedios aún no identificados en las vías aguas abajo de los efectos del MPK-1 en la cascada de señalización inducida por el BCG. El inesperado papel antimicobacteriano del MPK-1 (Figura 6 ) puede explicarse por eventos similares a los efectos del DUSP2. En este caso, el BCG induce la expresión del MPK-1 mientras activa también los MAPKs incluyendo p38 MAPK y ERK1/2. Downstream del MPKP-1, hay una inhibición de vías desconocidas o cinasas. El factor desconocido a su vez inhibe la activación del MAPKs, que finalmente conduce a más inducción del TNF-α (Figura 6 ). En resumen, el MPK-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citoquinas sobre la infección micobacteriana. La inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MPK-1, que a su vez inhibe la activación de los MAPK, puede utilizarse para explicar la función novedosa del MPK-1 en la mejora de la actividad de MAPK y la consiguiente expresión TNF-α después del tratamiento con BCG (Figura 6 ). Tomado en conjunto, el papel de los crosstalks de MAPK necesita exploración adicional. (3) TNF-α, 30 ciclos (TM = 56°C), aguas arriba, 5'-GGGCTAGGCGGTGTTC-3', aguas abajo, 5'-AGACGCGGGCGCGGTGATGG-3'. Los productos PCR fueron analizados en un gel de agarosa del 1% con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta. Para comprobar el tamaño de los productos PCR, 1 kb Plus ADN Lad-der Para la realización de QPCR, los niveles de MKP-1 y TNF-α mRNA, así como el gen de referencia GAPDH (como control interno) fueron analizados por los kits de reactivos de prueba de demanda específicos del gen (Aplicated Biosystems, EE.UU.). Todas las muestras se ejecutaron en duplicados o triplicados y sin controles de plantillas en un detector de secuencias de prisma ABI 7700. El método de análisis de QPCR fue el método del número de ciclo comparativo al umbral (C T ) descrito en el boletín del usuario no 2 del sistema de detección de secuencias de prisma ABI 7700. El número de C T de los genes objetivo se normalizó al de GAPDH en cada muestra (ΔC T ). El valor de C T de las células tratadas se comparó con el de las células tratadas sin tratamiento o simulacro ( La expresión génica relativa de los genes objetivo (inducción doble) se calculó como 2 -CT. Las proteínas celulares totales fueron extraídas por células lising en tampón de lisis que contiene 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (pH 8,0), 1% SDS, 0,2 mg/ml PMSF, 1 μg/ml aprotinina, 1 mM de ortovanadato sódico, 2 μg/ml de peptatina, 2 μg/ml de leupeptina y 50 mM de fluoruro sódico durante 5 minutos. El homogenato fue hervido durante 10 minutos y almacenado a -70°C hasta su uso. Las concentraciones de proteína total en extractos celulares fueron determinadas por BCATM Protein Assay Kit (Pierce, IL, EE.UU.). Western blot se realizó como se describe [20]. Cantidades iguales de proteína fueron separadas por 10% SDS-PAGE, electrobloqueadas en membranas nitrocelulosas (Schleicher & Schuell), y seguidas de sondeo con anticuerpos específicos para Actin, MKP-1 (Santa Cruz Biotech., EE.UU.), fosfo-p38 MAPK, fosfo-ERK1/2 (Cell Signaling, EE.UU.). Después de tres lavados, las membranas fueron incubadas con los anticuerpos secundarios correspondientes. Las bandas fueron detectadas utilizando el Sistema Chemiluminiscence mejorado (Amersham Pharmacia Biotech) como instrucciones del fabricante. La transfección de siRNA El siRNA MKP-1 incluyó: i) MLP1-HSS102982, AAACGCUUCGUAUCUCCUUGAGG; ii) MLP1-HSS102983, UUAUGCCCAAGGCAUCCAG-CAUGUC; y iii) MLP1-HSS102984, UGAUG-GAGUCUAUGAAGUCAAugGGC. El derribo del MLP-1 en PBMo se llevó a cabo utilizando solamente MLP1-HSS102983 o un grupo de los tres MKP-1 StealthTM Select RNAi (ratio = 1:1:1, 200 nM, Invitrogen, USA). StealthTM RNAi Negative Control Duplex (200 nM) se utilizó como control de efectos independientes de secuencia para la transfección de siRN La transfección de monocitos se realizó mediante el reactivo de transfección de ADN jetPEITM (Polyplus Transfection, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de transfectar las células durante 24 h, los transfectantes fueron tratados con diferentes inductores como se describe anteriormente. El análisis estadístico fue realizado por la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los valores de p fueron inferiores a 0,05.

¿Qué es crítico para el desarrollo de un granuloma protector en infecciones de tuberculosis?

Una nueva función antimicobacteriana de la proteína quinasa fosfatasa activada por mitogenos-1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2804704/SHA: f6ed1f1e9999e57793addb1c9c54c61c7861a995Autores: Cheung, Benny KW; Yim, Howard CH; Lee, Norris CM; Lau, Allan SYDate: 2009-12-17DOI: 10.1186/1471-2172-10-64Licencia: cc-byAbstract: ANTERIORDANTE: Mycobacterium tuberculosis (MTB) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Para combatir este patógeno, las células inmunitarias liberan citocinas incluyendo el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), que es fundamental en el desarrollo de granulomas protectores. Nuestros resultados anteriores mostraron que Bacillus Calmette Guerin (BCG), un micobacterio utilizado como modelo para investigar la respuesta inmune contra MTB, estimula la inducción de TNF-α a través de la proteína quinasa activada por mitogenos (MAPK) en los monocitos sanguíneos humanos. Dado que MAPK phosphatasa-1 (MPK-1) es conocido por regular las actividades de MAPK, examinamos si el MPK-1 juega un papel en la activación de la MAPK inducida por BCG y la expresión de citoquinas. RESULTADOS: Los monocitos sanguíneos primarios humanos fueron tratados con BCG y analizados para la expresión de MKP-1. Además, la inducción del MPK-1 fue regulada por p38 MAPK y quinasa 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2). Sorprendentemente, cuando la expresión del MPK-1 fue bloqueada por su siRNA específico, hubo una disminución significativa en los niveles de fosfo-MAPK (p38 MAPK y ERK1/2) y TNF-α inducible por BCG. CONCLUSIONES: Dado que el TNF-α es fundamental en la formación de granuloma, los resultados indicaron una función positiva inesperada del MPK-1 contra la infección micobacterial en contraposición a su actividad habitual de fosfatasa. Texto: La tuberculosis (TB) sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo, especialmente en los países en desarrollo [1]. La enfermedad es causada por Mycobacterium tuberculosis (MTB) y aproximadamente un tercio de la población mundial ha sido infectada En un informe reciente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que hay 9,2 millones de nuevos casos de tuberculosis en todo el mundo en 2006 [1]. En respuesta a la infección por MTB, la inducción de citocinas por células inmunitarias es un importante mecanismo de defensa. Los macrófagos infectados secretan factores de señalización intercelular, citoquinas proinflamatorias, para mediar la respuesta inflamatoria que conduce a la formación de granuloma e inducción de inmunidad mediada por células T [2]. Para entender la patogénesis de la tuberculosis, las vías de señalización inducidas por micobacterias han sido motivo de interés desde hace mucho tiempo. Informes anteriores han demostrado que p38 MAPK y ERK1/2 son necesarios en la inducción de la expresión TNF-α en monocitos humanos infectados con M. tuberculosis H37Rv [4]. Hemos revelado además el papel significativo de los MAPK en los eventos de transducción de señales de activación micobacteriana de monocitos sanguíneos primarios humanos (PBMo) que conducen a expresiones citocinas a través de la interacción con PKR [5]. Sin embargo, los eventos posteriores en cuanto a cómo se regula MAPK y cómo tal regulación afecta a la producción de citocinas en respuesta a micobacterias siguen siendo elucidadas. Puesto que los MAPK se activan por fosforilación, la desfosforilación de los MAPK parece ser un proceso eficiente para inactivar sus actividades. Los ejemplos de estas fosfatasas incluyen fosfatasas de tirosina, fosfatasas de serina/treonina y fosfatasas de doble especificidad (DUSPs). Algunas fosfatasas de DUSPs también se conocen como fosfatasas de MAPK (MPK) [6] [7]. Actualmente, hay al menos 10 PHPs identificados, mientras que el MKP-1 es el miembro más estudiado de la familia. El papel regulador del PKP-1 en la inducción de citoquinas se demuestra mejor por los macrófagos de KKP-1 (KO) en respuesta al lipopolisacárido (LPS), un componente de pared celular de las bacterias Gram-negativas. Los macrófagos de PKP-1 mostraron fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como una mayor producción de TNF-α en respuesta Consistente con estos resultados, otro grupo reveló además que los macrófagos derivados de la médula ósea KO-MPK-1 tratados con LPS muestran una mayor actividad de unión al ADN AP-1 [10]. También mostraron que la expresión del MPK-1 inducida por LPS depende del factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) y del adaptador que contiene el dominio TIR induciendo IFN-β (TRIF) [10], demostrando así el papel del MPKP-1 en la transducción de señales. No sólo el LPS, otros inductores del TLR incluyendo CpG, peptidoglicano, poli CI y Pam 3 Cys pueden regular las expresiones citoquinas incluyendo TNF-α, IL-10 a través de las actividades del MPKP-1 [10, 11]. En estos procesos, el MPKP-1 sirve para mitigar los efectos indeseables del shock séptico y mantener Otro ejemplo de la función MPK-1 es la respuesta inmune a Staphylococcus aureus (S. aureus), una bacteria Gram positiva. Hay niveles más altos de producción de citocinas incluyendo TNF-α, IL-6, y MIP-1α en ratones MKP-1 KO infectados con S. aureus [12]. Además, los ratones tendrían un rápido desarrollo de disfunción multiorgánica, así como una tasa de mortalidad más rápida en caso de desafío con S. aureus matados por calor [12]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que MKP-1 protege al huésped de la sobreactivación del sistema inmunitario en respuesta a bacterias Gram negativo o Gram positivo. En el pasado, se creía que diferentes miembros de la familia MKP/DUSP tienen funciones superpuestas. Sin embargo, la aparición de DUSP2 cambió el concepto hacia abajo [13]. Se En las células DUSP2 KO, produjeron menos mediadores inflamatorios, lo que implica que DUSP2 puede desempeñar un papel en la mediación en lugar de limitar la inflamación. Para los casos, cuando los macrófagos DUSP2 KO fueron tratados con LPS, hubo menos receptores de TNF, IL-6, óxido nítrico, IL-12, en comparación con los de las contrapartes del tipo salvaje [13]. Cuando los mastocitos derivados de la médula ósea DUSP2 KO fueron sensibilizados por primera vez con el receptor de inmunoglobulina E (IgE) (Fc.RI) y luego estimulados con antígeno estable dinitrofenol-calor, produjeron niveles más bajos de ARNmT, menor producción de IL-6, menor fosforilación de ERK1/2, p38 MAPK, y menos actividades transcripcionales por Elk1 y NF Estas inesperadas regulaciones positivas de funciones celulares inmunitarias por DUSP2 se han hipotetizado debido a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. La estimulación de los mastocitos KO y macrófagos mostró incrementos en la fosforilación de JNK. Además, la inhibición de JNK por inhibidores de moléculas pequeñas mostró incrementos en la fosforilación de ERK [13]. Los autores también mostraron que hubo interacciones físicas de DUSP2 con ERK2, DUSP2 con JNK2, así como DUSP2 y p38 MAPK después de la estimulación de las células con antígeno estable de dinitrofenol-calor. Sin embargo, los detalles de las conversaciones cruzadas entre MAPKs y fosfatasas necesitan mayor investigación. Así, la familia MKP juega un papel crítico en la regulación de las respuestas inmunes. La respuesta inmune innata protege al huésped de la infección por MTB por secreción de citocinas incluyendo TNF-α en células inmunitarias. Mientras tanto, MAPK es una de las proteínas críticas en la regulación de la inmunidad y la expresión de citoquinas. Dado que MAPK está regulado por MKP-1 en respuesta a LPS y la activación de MAPK es importante en la expresión de citoquinas inducidas por BCG, hipotetizamos que el MKP-1 juega un papel crítico en la regulación inmune de BCG en monocitos humanos. Examinamos la implicación del MKP-1 en la activación de MAPK inducida por BCG y su consiguiente expresión de citoquinas. Aquí presentamos evidencias de que el MKP-1 juega un papel inesperado en la regulación de la inducción de citoquinas por BCG a través de su control de la fosforilación de MAPK. Se ha reportado que muchos inductores incluyendo factores de crecimiento, LPS, peptidoglicano, y dexametasona pueden estimular la expresión de MKP-1 en macrófagos humanos, microglia, mastocitos o fibroblastos [6]. Para investigar el papel de diferentes inductores de TLR en el proceso de inducción de MKP-1 en monocitos sanguíneos humanos, el nivel de MKP-1 mRNA se midió mediante el método de reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR). PBMo se aisló de células mononucleares primarias de sangre humana y se estimuló con Pam 3 Cys (agonista TLR2), poli IC (agonista TLR3) o LPS (agonista TLR4) durante 1 y 3 horas. Tras la exposición a Pam 3 Cys o LPS, hubo inducciones significativas de los niveles Estos efectos sobre la inducción del MPKP-1 continuaron durante 3 horas después del tratamiento con Pam 3 Cys (Figura 1A ). Por el contrario, el poli CI no indujo el MPKP-1 (Figura 1A ). Los resultados indican que diferentes inductores mostraron una regulación diferencial de la expresión del MPKP-1. LPS ha sido ampliamente utilizado para demostrar el papel del MPKP-1 en la respuesta inmune tanto in vivo como in vitro [9, 12]. Para establecer una base para la interpretación de los resultados experimentales posteriores, se utilizó el LPS como un control positivo para la inducción de la expresión del MPKP-1. Para determinar los niveles del MPKP-1 en respuesta al LPS, la cinética de la transcripción del MPKP-1 fue determinada por el QPCR. Hubo una inducción significativa del MPKP-1 mRNA, que alcanzó su punto máximo tan temprano como 1 hora Estos resultados mostraron que LPS indujo la expresión MCP-1 (Figura 1B). A continuación, para demostrar la inducción de fosfatasas específicas por BCG, se estudió la cinética de la expresión MCP-1 en PBMo utilizando QPCR durante el tratamiento BCG. Similar a los resultados producidos por LPS, con la adición de BCG (MOI = 1 CFU/celda), hubo una inducción significativa de MKP-1 mRNA dentro de 1 hora de tratamiento BCG determinado por la sonda Taqman específica para MCP-1 (Figura 2A ). Los efectos duraron al menos 6 horas (Figura 2A ). Para examinar si los cambios en la producción proteica fueron paralelos a los niveles de mRNA, los niveles proteicos de MKP-1 fueron medidos por Western blotting. En respuesta a B Los niveles proteicos se mantuvieron durante 2 horas y disminuyeron a los niveles basales a las 3 horas (Figura 2B ). Los resultados demostraron que hubo inducción MKP-1 en respuesta a la activación de BCG en monocitos humanos. Se ha demostrado que la inhibición de p38 MAPK bien por inhibidor específico o siRNA redujo la expresión de MKP-1 en macrófagos tratados con LPS o peptidoglicano [14]. Para determinar los mecanismos involucrados en la expresión BCG inducida por MKP-1, PBMo fue pretratado con varios inhibidores incluyendo PD98059 (inhibidor de MAP quinasa [MEK] o ERK1/2), SB203580 (inhibidor de p38 MAPK), SP600125 (inhibidor de JNK), y CAPE (inhibidor de NF- Se utilizó un rango de concentraciones de cada inhibidor para probar sus concentraciones óptimas y efectos sobre la viabilidad celular y las inhibiciones de la cinasa. Posteriormente se añadió BCG y se recogió el ARN total. Los resultados demostraron que, con la inhibición de las actividades de ERK1/2 y p38 MAPK por sus correspondientes inhibidores relativamente específicos, las expresiones MKP-1 se redujeron significativamente (Figura 3 ). Además, utilizando dosis más altas de SB203580, se demostró que la inhibición se incrementa aún más (datos no mostrados). Por el contrario, el pretratamiento de las células con CAPE y SP600125 no afectó a la inducción de MKP-1 por BCG (Figura 3 ). Estos resultados sugieren que la expresión inducida por BCG MKP-1 es dependiente tanto de p38 MAPK como de ERK1/2. A lo largo de los experimentos anteriores, el objetivo principal fue Así, para examinar más a fondo el papel del MPKP-1 en la señalización inducida por BCG, se utilizó la transfección de siRNA en PBMo para derribar la actividad del MPKP-1. Para demostrar que el MPKP-1 siRNA puede efectivamente derribar el gen objetivo, PBMo fue primero transfectado con control o MKP-1 siRNA y luego tratado con BCG durante 3 horas. Los niveles de MKP-1 mRNA fueron medidos por el método RT-PCR. En la Figura 4A, BCG estimuló la expresión MKP-1 (lanes 1 y 2). En MKP-1 siRNA transfectó monocitos, la inducción de MKP-1 por BCG fue significativamente disminuida (lanes 2 y 4). Los resultados mostraron que el siRNA hace abrogar los niveles de MKP-1 mRNA. Para determinar si el siRNA MKP-1 afecta al BCG inducido MKP-1 a niveles proteicos, PBMo fue tratado como arriba y las proteínas MKP-1 fueron medidas por Western blotting. Los resultados mostraron que el BCG podría inducir proteínas MKP-1 como de costumbre para células transfectadas con control siRNA (Figura 4B, carriles 1-3). Sin embargo, los niveles de BCG inducido expresión proteica MKP-1 fueron reducidos en células transfectadas con siRNA MKP-1 (Figura 4B, carriles 4-6). Juntos, los resultados sugieren que el siRNA MKP-1 no sólo redujo el MKP-1 mRNA en el tratamiento BCG sino que también abrogó la proteína MKP-1 inducida por BCG. Como se indica en la literatura [9], los ratones MKP-1 KO mostraron aumento de la producción Sobre la base de los resultados anteriores de siRNA del MPK-1, se utilizó LPS como control para demostrar los efectos de este sistema siRNA del MPK-1. La expresión citoquina inducida por LPS en células transfectadas de siRNA del MPK-1 sugiere que el sistema siRNA es eficaz para derribar la expresión del MPK-1 y que el MPK-1 actúa como regulador negativo en la expresión del TNF-α inducida por LPS. Para investigar el efecto del siRNA del MPK-1 en la expresión de citoquina inducida por BCG, los niveles de TNF-α, IL-6 e IL-10 mRNA se midieron por el método QPCR. PBMo fueron transfectados con control o MKP-1 siRNA. Después de la exposición al BCG con control siRNA, hubo inducciones significativas de TNF-α, IL-6 e IL-10 m A continuación, se examinaron los efectos del siRNA-MCP-1 en la expresión citoquina inducida por BCG. Sorprendentemente, hubo una abrogación significativa de la expresión TNF-α inducida por BCG por MKP-1 siRNA (Figura 4D ). Con la caída del siRNA-MCP-1, el nivel de TNF-α inducido por BCG fue sólo 60% comparado con el de las células de control, mientras que el IL-6 e IL-10 inducidos por BCG fueron sin cambios en las células transfectadas por MKP-1 siRNA. Los resultados revelaron que el MKP-1 juega un papel en la inducción de la expresión TNF-α sobre la estimulación BCG, que puede ser diferente a la de sus funciones convencionales en las que el MKP-1 actúa como regulador negativo en las vías de señalización inducidas por LPS [7]. El estado de fosforilación de los MAPK fue evaluado en control o siRNA del MPK-1 transfectado PBMo. Los resultados de Western blocking demostraron que BCG indujo tanto la fosforilación p38 como la ERK1/2 en 15 minutos (datos no mostrados) y alcanzó su punto máximo en 30 minutos, y luego regresó a los niveles basales en células tratadas con el siRNA del control (Figura 5). Al igual que los resultados de la expresión de citoquinas, la fosforilación de ambos p38 MAPK y ERK1/2 en respuesta a BCG fue disminuida en monocitos transfectados con siRNA del MPK-1 en lugar del esperado aumento de fosforilación (Figura 5). Los resultados sugieren que la reducción del nivel de producción de TNF-α en monocitos estimulados por BCG se debe a la reducción de la fosforilación de MAPK por MKP-1 siRNA. Este informe presentó evidencias de que una nueva función de MKP-1 se descubre en la regulación de citoquinas en respuesta a la infección micobacteriana. BCG induce el MKP-1 como respuesta rápida (Figura 2). El mecanismo de inducción del MKP-1 por BCG depende tanto de ERK1/2 como de p38 MAPK (Figura 3). Utilizando el enfoque de siRNA, las funciones del MKP-1 se pueden examinar en monocitos humanos primarios. Los resultados mostraron que la activación de los MAPK inducidos por BCG, así como la expresión de citoquinas, son aguas abajo del MKP-1 (Figuras 4D y 5). Por lo tanto, el MPK-1 es una molécula de señalización crítica que está involucrada en la expresión de citoquinas inducidas por BCG. Informes anteriores han demostrado que el MPK-1 inducido por LPS o peptidoglicano depende de p38 MAPK [14]. En consecuencia, el MPK-1 inducido por BCG puede ser inhibido por inhibidores de p38 MAPK y ERK1/2. Curiosamente, se ha demostrado que la degradación del MPK-1 se reduce después de la fosforilación ERK1/2 [15]. Se puede hipotetizar que las proteínas inducidas por BCG MKP-1 pueden ser estabilizadas por ERK1/2 y los mecanismos detallados involucrados requieren más exploración. También, ya que la inhibición de la expresión de MKP-1 por ambos inhibidores (para p38 MAPK y ERK1/ 2) no fue completa, se cree que otras Sobre la base de los resultados de la literatura sobre los efectos de LPS (Figura 6 ), la expectativa original para este proyecto es que el MPK-1 actúa como regulador negativo. Los macrófagos peritoneales estimulados por el MPK-1 KO mostraron una fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como un aumento de la producción de TNF-α [9]. Al hacerlo, la fosforilación inducida por el MPK-1 por el LPS podría disminuir por el MPK-1 siRNA previene la producción prolongada de TNF-α como en la sepsis, lo que puede conducir a un daño grave al huésped. Se esperaba que el BCG indujera el MPK-1 y su inducción se correlacionaría con la defosforilación de los MAPKs incluyendo p38 MAPK. Al bloquear el MKP-1 utilizando siRNA, se esperaba que hubiera aumentado la fosforilación p38 MAPK y la producción prolongada de TNF-α en respuesta a BCG. Sin embargo, nuestros resultados mostrados aquí son diametralmente opuestos. Una posibilidad para los resultados inesperados puede deberse a efectos no específicos de transfección o siRNA. Sin embargo, este no fue el caso ya que hubo una expresión prolongada y aumentada de TNF-α después de que los monocitos transfectados por siRNA del MKP-1 fueron tratados con LPS (Figura 4C ). Ahora hay una nueva hipótesis para explicar tales efectos paradójicos de MKP-1 en la regulación del TNF-α en la que la fosfatasa juega un papel en la regulación positiva de la producción de TNF-α en respuesta a BCG como en el caso de DUSP2 [13 Las estructuras de PKP-1 y DUSP2 son similares, con las que ambos contienen un dominio de interacción MAPK y un sitio catalítico de fosfatasa. Por el contrario, otros dominios DUSP pueden tener dominios adicionales, por ejemplo, PEST [6]. Aquí, postulamos que la función de PKP-1 en la señalización inducida por BCG es similar a la del DUSP2/PAC1. En realidad, el descubrimiento de DUSP2 ha creado inicialmente algunas preguntas paradójicas. Como se describe, DUSP2 se comporta de manera diferente a otros miembros de la familia MKP [13]. En los macrófagos DUSP2 KO tratados con LPS, produjeron menos mediadores inflamatorios incluyendo menos TNF, IL-6, óxido nítrico y células productoras de IL-12, en comparación con la de las contrapartes de tipo salvaje [13 De hecho, los resultados de estos estudios publicados sobre estudios DUSP2 son bastante similares a los de nuestros resultados reportados aquí. Es plausible que estas regulaciones positivas inesperadas de funciones de células inmunes por DUSP2 se deban a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. Se demostró que hay interacciones entre las vías JNK y ERK1/2 [16]. Aquí, demostramos que la activación sostenida de los bloques JNK de activación ERK (Figura 6 ). En la situación DUSP2, la estimulación de los mastocitos y macrófagos KO muestra un aumento de la fosforilación de JNK, e inhibición de JNK por su propio inhibidor específico restaura la fosforilación de ERK1/2 [13]. En la situación BCG-MPK-1, hay una fosforilación temprana de p38 MAPK y ERK Por lo tanto, es posible que JNK pueda jugar un papel en la interacción de crosstalk de MAPK. Sin embargo, nuestros datos preliminares sugieren que el nivel de JNK fosforilado no fue aumentado en PBMo MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana Figura 6 MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana. Modelo LPS fue proporcionado de acuerdo con los hallazgos de la literatura (Izquierda). En este escenario, LPS activa MKP-1, que a su vez defosforila y desactiva fosfo-p38 MAPK, resultando en menos inducción TNF-α. Sin embargo, la situación en la activación DHP-HSA de DUSP2 es más complicada (Middle), ya que la actividad fosfatasa causa la inhibición posterior de fosfo-JNK que conduce a la derrepresión de fosfo-p38 MAPK. En consecuencia, los efectos combinados de esta cascada resultan en más expresión TNF-α. El inesperado papel antimicobacterial del MBP-1 (Right) puede explicarse por eventos similares a los efectos DUSP2. En este caso (Right), hubo una inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MBP-1, y el factor desconocido a su vez inhibe la activación MAPKs que conduce a más inducción TNF-α. Los detalles y los objetivos de la cinasa aún no se han identificado. transfectado con MBP-1 siRNNA (datos no mostrados). Así, los detalles de Aquí presentamos un modelo para resumir los resultados e hipotetizar la existencia de un factor o factores intermedios aún no identificados en las vías aguas abajo de los efectos del MPK-1 en la cascada de señalización inducida por el BCG. El inesperado papel antimicobacteriano del MPK-1 (Figura 6 ) puede explicarse por eventos similares a los efectos del DUSP2. En este caso, el BCG induce la expresión del MPK-1 mientras activa también los MAPKs incluyendo p38 MAPK y ERK1/2. Downstream del MPKP-1, hay una inhibición de vías desconocidas o cinasas. El factor desconocido a su vez inhibe la activación del MAPKs, que finalmente conduce a más inducción del TNF-α (Figura 6 ). En resumen, el MPK-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citoquinas sobre la infección micobacteriana. La inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MPK-1, que a su vez inhibe la activación de los MAPK, puede utilizarse para explicar la función novedosa del MPK-1 en la mejora de la actividad de MAPK y la consiguiente expresión TNF-α después del tratamiento con BCG (Figura 6 ). Tomado en conjunto, el papel de los crosstalks de MAPK necesita exploración adicional. (3) TNF-α, 30 ciclos (TM = 56°C), aguas arriba, 5'-GGGCTAGGCGGTGTTC-3', aguas abajo, 5'-AGACGCGGGCGCGGTGATGG-3'. Los productos PCR fueron analizados en un gel de agarosa del 1% con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta. Para comprobar el tamaño de los productos PCR, 1 kb Plus ADN Lad-der Para la realización de QPCR, los niveles de MKP-1 y TNF-α mRNA, así como el gen de referencia GAPDH (como control interno) fueron analizados por los kits de reactivos de prueba de demanda específicos del gen (Aplicated Biosystems, EE.UU.). Todas las muestras se ejecutaron en duplicados o triplicados y sin controles de plantillas en un detector de secuencias de prisma ABI 7700. El método de análisis de QPCR fue el método del número de ciclo comparativo al umbral (C T ) descrito en el boletín del usuario no 2 del sistema de detección de secuencias de prisma ABI 7700. El número de C T de los genes objetivo se normalizó al de GAPDH en cada muestra (ΔC T ). El valor de C T de las células tratadas se comparó con el de las células tratadas sin tratamiento o simulacro ( La expresión génica relativa de los genes objetivo (inducción doble) se calculó como 2 -CT. Las proteínas celulares totales fueron extraídas por células lising en tampón de lisis que contiene 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (pH 8,0), 1% SDS, 0,2 mg/ml PMSF, 1 μg/ml aprotinina, 1 mM de ortovanadato sódico, 2 μg/ml de peptatina, 2 μg/ml de leupeptina y 50 mM de fluoruro sódico durante 5 minutos. El homogenato fue hervido durante 10 minutos y almacenado a -70°C hasta su uso. Las concentraciones de proteína total en extractos celulares fueron determinadas por BCATM Protein Assay Kit (Pierce, IL, EE.UU.). Western blot se realizó como se describe [20]. Cantidades iguales de proteína fueron separadas por 10% SDS-PAGE, electrobloqueadas en membranas nitrocelulosas (Schleicher & Schuell), y seguidas de sondeo con anticuerpos específicos para Actin, MKP-1 (Santa Cruz Biotech., EE.UU.), fosfo-p38 MAPK, fosfo-ERK1/2 (Cell Signaling, EE.UU.). Después de tres lavados, las membranas fueron incubadas con los anticuerpos secundarios correspondientes. Las bandas fueron detectadas utilizando el Sistema Chemiluminiscence mejorado (Amersham Pharmacia Biotech) como instrucciones del fabricante. La transfección de siRNA El siRNA MKP-1 incluyó: i) MLP1-HSS102982, AAACGCUUCGUAUCUCCUUGAGG; ii) MLP1-HSS102983, UUAUGCCCAAGGCAUCCAG-CAUGUC; y iii) MLP1-HSS102984, UGAUG-GAGUCUAUGAAGUCAAugGGC. El derribo del MLP-1 en PBMo se llevó a cabo utilizando solamente MLP1-HSS102983 o un grupo de los tres MKP-1 StealthTM Select RNAi (ratio = 1:1:1, 200 nM, Invitrogen, USA). StealthTM RNAi Negative Control Duplex (200 nM) se utilizó como control de efectos independientes de secuencia para la transfección de siRN La transfección de monocitos se realizó mediante el reactivo de transfección de ADN jetPEITM (Polyplus Transfection, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de transfectar las células durante 24 h, los transfectantes fueron tratados con diferentes inductores como se describe anteriormente. El análisis estadístico fue realizado por la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los valores de p fueron inferiores a 0,05.

¿Qué es el factor de necrosis tumoral alfa?

Una nueva función antimicobacteriana de la proteína quinasa fosfatasa activada por mitogenos-1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2804704/SHA: f6ed1f1e9999e57793addb1c9c54c61c7861a995Autores: Cheung, Benny KW; Yim, Howard CH; Lee, Norris CM; Lau, Allan SYDate: 2009-12-17DOI: 10.1186/1471-2172-10-64Licencia: cc-byAbstract: ANTERIORDANTE: Mycobacterium tuberculosis (MTB) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Para combatir este patógeno, las células inmunitarias liberan citocinas incluyendo el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), que es fundamental en el desarrollo de granulomas protectores. Nuestros resultados anteriores mostraron que Bacillus Calmette Guerin (BCG), un micobacterio utilizado como modelo para investigar la respuesta inmune contra MTB, estimula la inducción de TNF-α a través de la proteína quinasa activada por mitogenos (MAPK) en los monocitos sanguíneos humanos. Dado que MAPK phosphatasa-1 (MPK-1) es conocido por regular las actividades de MAPK, examinamos si el MPK-1 juega un papel en la activación de la MAPK inducida por BCG y la expresión de citoquinas. RESULTADOS: Los monocitos sanguíneos primarios humanos fueron tratados con BCG y analizados para la expresión de MKP-1. Además, la inducción del MPK-1 fue regulada por p38 MAPK y quinasa 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2). Sorprendentemente, cuando la expresión del MPK-1 fue bloqueada por su siRNA específico, hubo una disminución significativa en los niveles de fosfo-MAPK (p38 MAPK y ERK1/2) y TNF-α inducible por BCG. CONCLUSIONES: Dado que el TNF-α es fundamental en la formación de granuloma, los resultados indicaron una función positiva inesperada del MPK-1 contra la infección micobacterial en contraposición a su actividad habitual de fosfatasa. Texto: La tuberculosis (TB) sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo, especialmente en los países en desarrollo [1]. La enfermedad es causada por Mycobacterium tuberculosis (MTB) y aproximadamente un tercio de la población mundial ha sido infectada En un informe reciente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que hay 9,2 millones de nuevos casos de tuberculosis en todo el mundo en 2006 [1]. En respuesta a la infección por MTB, la inducción de citocinas por células inmunitarias es un importante mecanismo de defensa. Los macrófagos infectados secretan factores de señalización intercelular, citoquinas proinflamatorias, para mediar la respuesta inflamatoria que conduce a la formación de granuloma e inducción de inmunidad mediada por células T [2]. Para entender la patogénesis de la tuberculosis, las vías de señalización inducidas por micobacterias han sido motivo de interés desde hace mucho tiempo. Informes anteriores han demostrado que p38 MAPK y ERK1/2 son necesarios en la inducción de la expresión TNF-α en monocitos humanos infectados con M. tuberculosis H37Rv [4]. Hemos revelado además el papel significativo de los MAPK en los eventos de transducción de señales de activación micobacteriana de monocitos sanguíneos primarios humanos (PBMo) que conducen a expresiones citocinas a través de la interacción con PKR [5]. Sin embargo, los eventos posteriores en cuanto a cómo se regula MAPK y cómo tal regulación afecta a la producción de citocinas en respuesta a micobacterias siguen siendo elucidadas. Puesto que los MAPK se activan por fosforilación, la desfosforilación de los MAPK parece ser un proceso eficiente para inactivar sus actividades. Los ejemplos de estas fosfatasas incluyen fosfatasas de tirosina, fosfatasas de serina/treonina y fosfatasas de doble especificidad (DUSPs). Algunas fosfatasas de DUSPs también se conocen como fosfatasas de MAPK (MPK) [6] [7]. Actualmente, hay al menos 10 PHPs identificados, mientras que el MKP-1 es el miembro más estudiado de la familia. El papel regulador del PKP-1 en la inducción de citoquinas se demuestra mejor por los macrófagos de KKP-1 (KO) en respuesta al lipopolisacárido (LPS), un componente de pared celular de las bacterias Gram-negativas. Los macrófagos de PKP-1 mostraron fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como una mayor producción de TNF-α en respuesta Consistente con estos resultados, otro grupo reveló además que los macrófagos derivados de la médula ósea KO-MPK-1 tratados con LPS muestran una mayor actividad de unión al ADN AP-1 [10]. También mostraron que la expresión del MPK-1 inducida por LPS depende del factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) y del adaptador que contiene el dominio TIR induciendo IFN-β (TRIF) [10], demostrando así el papel del MPKP-1 en la transducción de señales. No sólo el LPS, otros inductores del TLR incluyendo CpG, peptidoglicano, poli CI y Pam 3 Cys pueden regular las expresiones citoquinas incluyendo TNF-α, IL-10 a través de las actividades del MPKP-1 [10, 11]. En estos procesos, el MPKP-1 sirve para mitigar los efectos indeseables del shock séptico y mantener Otro ejemplo de la función MPK-1 es la respuesta inmune a Staphylococcus aureus (S. aureus), una bacteria Gram positiva. Hay niveles más altos de producción de citocinas incluyendo TNF-α, IL-6, y MIP-1α en ratones MKP-1 KO infectados con S. aureus [12]. Además, los ratones tendrían un rápido desarrollo de disfunción multiorgánica, así como una tasa de mortalidad más rápida en caso de desafío con S. aureus matados por calor [12]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que MKP-1 protege al huésped de la sobreactivación del sistema inmunitario en respuesta a bacterias Gram negativo o Gram positivo. En el pasado, se creía que diferentes miembros de la familia MKP/DUSP tienen funciones superpuestas. Sin embargo, la aparición de DUSP2 cambió el concepto hacia abajo [13]. Se En las células DUSP2 KO, produjeron menos mediadores inflamatorios, lo que implica que DUSP2 puede desempeñar un papel en la mediación en lugar de limitar la inflamación. Para los casos, cuando los macrófagos DUSP2 KO fueron tratados con LPS, hubo menos receptores de TNF, IL-6, óxido nítrico, IL-12, en comparación con los de las contrapartes del tipo salvaje [13]. Cuando los mastocitos derivados de la médula ósea DUSP2 KO fueron sensibilizados por primera vez con el receptor de inmunoglobulina E (IgE) (Fc.RI) y luego estimulados con antígeno estable dinitrofenol-calor, produjeron niveles más bajos de ARNmT, menor producción de IL-6, menor fosforilación de ERK1/2, p38 MAPK, y menos actividades transcripcionales por Elk1 y NF Estas inesperadas regulaciones positivas de funciones celulares inmunitarias por DUSP2 se han hipotetizado debido a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. La estimulación de los mastocitos KO y macrófagos mostró incrementos en la fosforilación de JNK. Además, la inhibición de JNK por inhibidores de moléculas pequeñas mostró incrementos en la fosforilación de ERK [13]. Los autores también mostraron que hubo interacciones físicas de DUSP2 con ERK2, DUSP2 con JNK2, así como DUSP2 y p38 MAPK después de la estimulación de las células con antígeno estable de dinitrofenol-calor. Sin embargo, los detalles de las conversaciones cruzadas entre MAPKs y fosfatasas necesitan mayor investigación. Así, la familia MKP juega un papel crítico en la regulación de las respuestas inmunes. La respuesta inmune innata protege al huésped de la infección por MTB por secreción de citocinas incluyendo TNF-α en células inmunitarias. Mientras tanto, MAPK es una de las proteínas críticas en la regulación de la inmunidad y la expresión de citoquinas. Dado que MAPK está regulado por MKP-1 en respuesta a LPS y la activación de MAPK es importante en la expresión de citoquinas inducidas por BCG, hipotetizamos que el MKP-1 juega un papel crítico en la regulación inmune de BCG en monocitos humanos. Examinamos la implicación del MKP-1 en la activación de MAPK inducida por BCG y su consiguiente expresión de citoquinas. Aquí presentamos evidencias de que el MKP-1 juega un papel inesperado en la regulación de la inducción de citoquinas por BCG a través de su control de la fosforilación de MAPK. Se ha reportado que muchos inductores incluyendo factores de crecimiento, LPS, peptidoglicano, y dexametasona pueden estimular la expresión de MKP-1 en macrófagos humanos, microglia, mastocitos o fibroblastos [6]. Para investigar el papel de diferentes inductores de TLR en el proceso de inducción de MKP-1 en monocitos sanguíneos humanos, el nivel de MKP-1 mRNA se midió mediante el método de reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR). PBMo se aisló de células mononucleares primarias de sangre humana y se estimuló con Pam 3 Cys (agonista TLR2), poli IC (agonista TLR3) o LPS (agonista TLR4) durante 1 y 3 horas. Tras la exposición a Pam 3 Cys o LPS, hubo inducciones significativas de los niveles Estos efectos sobre la inducción del MPKP-1 continuaron durante 3 horas después del tratamiento con Pam 3 Cys (Figura 1A ). Por el contrario, el poli CI no indujo el MPKP-1 (Figura 1A ). Los resultados indican que diferentes inductores mostraron una regulación diferencial de la expresión del MPKP-1. LPS ha sido ampliamente utilizado para demostrar el papel del MPKP-1 en la respuesta inmune tanto in vivo como in vitro [9, 12]. Para establecer una base para la interpretación de los resultados experimentales posteriores, se utilizó el LPS como un control positivo para la inducción de la expresión del MPKP-1. Para determinar los niveles del MPKP-1 en respuesta al LPS, la cinética de la transcripción del MPKP-1 fue determinada por el QPCR. Hubo una inducción significativa del MPKP-1 mRNA, que alcanzó su punto máximo tan temprano como 1 hora Estos resultados mostraron que LPS indujo la expresión MCP-1 (Figura 1B). A continuación, para demostrar la inducción de fosfatasas específicas por BCG, se estudió la cinética de la expresión MCP-1 en PBMo utilizando QPCR durante el tratamiento BCG. Similar a los resultados producidos por LPS, con la adición de BCG (MOI = 1 CFU/celda), hubo una inducción significativa de MKP-1 mRNA dentro de 1 hora de tratamiento BCG determinado por la sonda Taqman específica para MCP-1 (Figura 2A ). Los efectos duraron al menos 6 horas (Figura 2A ). Para examinar si los cambios en la producción proteica fueron paralelos a los niveles de mRNA, los niveles proteicos de MKP-1 fueron medidos por Western blotting. En respuesta a B Los niveles proteicos se mantuvieron durante 2 horas y disminuyeron a los niveles basales a las 3 horas (Figura 2B ). Los resultados demostraron que hubo inducción MKP-1 en respuesta a la activación de BCG en monocitos humanos. Se ha demostrado que la inhibición de p38 MAPK bien por inhibidor específico o siRNA redujo la expresión de MKP-1 en macrófagos tratados con LPS o peptidoglicano [14]. Para determinar los mecanismos involucrados en la expresión BCG inducida por MKP-1, PBMo fue pretratado con varios inhibidores incluyendo PD98059 (inhibidor de MAP quinasa [MEK] o ERK1/2), SB203580 (inhibidor de p38 MAPK), SP600125 (inhibidor de JNK), y CAPE (inhibidor de NF- Se utilizó un rango de concentraciones de cada inhibidor para probar sus concentraciones óptimas y efectos sobre la viabilidad celular y las inhibiciones de la cinasa. Posteriormente se añadió BCG y se recogió el ARN total. Los resultados demostraron que, con la inhibición de las actividades de ERK1/2 y p38 MAPK por sus correspondientes inhibidores relativamente específicos, las expresiones MKP-1 se redujeron significativamente (Figura 3 ). Además, utilizando dosis más altas de SB203580, se demostró que la inhibición se incrementa aún más (datos no mostrados). Por el contrario, el pretratamiento de las células con CAPE y SP600125 no afectó a la inducción de MKP-1 por BCG (Figura 3 ). Estos resultados sugieren que la expresión inducida por BCG MKP-1 es dependiente tanto de p38 MAPK como de ERK1/2. A lo largo de los experimentos anteriores, el objetivo principal fue Así, para examinar más a fondo el papel del MPKP-1 en la señalización inducida por BCG, se utilizó la transfección de siRNA en PBMo para derribar la actividad del MPKP-1. Para demostrar que el MPKP-1 siRNA puede efectivamente derribar el gen objetivo, PBMo fue primero transfectado con control o MKP-1 siRNA y luego tratado con BCG durante 3 horas. Los niveles de MKP-1 mRNA fueron medidos por el método RT-PCR. En la Figura 4A, BCG estimuló la expresión MKP-1 (lanes 1 y 2). En MKP-1 siRNA transfectó monocitos, la inducción de MKP-1 por BCG fue significativamente disminuida (lanes 2 y 4). Los resultados mostraron que el siRNA hace abrogar los niveles de MKP-1 mRNA. Para determinar si el siRNA MKP-1 afecta al BCG inducido MKP-1 a niveles proteicos, PBMo fue tratado como arriba y las proteínas MKP-1 fueron medidas por Western blotting. Los resultados mostraron que el BCG podría inducir proteínas MKP-1 como de costumbre para células transfectadas con control siRNA (Figura 4B, carriles 1-3). Sin embargo, los niveles de BCG inducido expresión proteica MKP-1 fueron reducidos en células transfectadas con siRNA MKP-1 (Figura 4B, carriles 4-6). Juntos, los resultados sugieren que el siRNA MKP-1 no sólo redujo el MKP-1 mRNA en el tratamiento BCG sino que también abrogó la proteína MKP-1 inducida por BCG. Como se indica en la literatura [9], los ratones MKP-1 KO mostraron aumento de la producción Sobre la base de los resultados anteriores de siRNA del MPK-1, se utilizó LPS como control para demostrar los efectos de este sistema siRNA del MPK-1. La expresión citoquina inducida por LPS en células transfectadas de siRNA del MPK-1 sugiere que el sistema siRNA es eficaz para derribar la expresión del MPK-1 y que el MPK-1 actúa como regulador negativo en la expresión del TNF-α inducida por LPS. Para investigar el efecto del siRNA del MPK-1 en la expresión de citoquina inducida por BCG, los niveles de TNF-α, IL-6 e IL-10 mRNA se midieron por el método QPCR. PBMo fueron transfectados con control o MKP-1 siRNA. Después de la exposición al BCG con control siRNA, hubo inducciones significativas de TNF-α, IL-6 e IL-10 m A continuación, se examinaron los efectos del siRNA-MCP-1 en la expresión citoquina inducida por BCG. Sorprendentemente, hubo una abrogación significativa de la expresión TNF-α inducida por BCG por MKP-1 siRNA (Figura 4D ). Con la caída del siRNA-MCP-1, el nivel de TNF-α inducido por BCG fue sólo 60% comparado con el de las células de control, mientras que el IL-6 e IL-10 inducidos por BCG fueron sin cambios en las células transfectadas por MKP-1 siRNA. Los resultados revelaron que el MKP-1 juega un papel en la inducción de la expresión TNF-α sobre la estimulación BCG, que puede ser diferente a la de sus funciones convencionales en las que el MKP-1 actúa como regulador negativo en las vías de señalización inducidas por LPS [7]. El estado de fosforilación de los MAPK fue evaluado en control o siRNA del MPK-1 transfectado PBMo. Los resultados de Western blocking demostraron que BCG indujo tanto la fosforilación p38 como la ERK1/2 en 15 minutos (datos no mostrados) y alcanzó su punto máximo en 30 minutos, y luego regresó a los niveles basales en células tratadas con el siRNA del control (Figura 5). Al igual que los resultados de la expresión de citoquinas, la fosforilación de ambos p38 MAPK y ERK1/2 en respuesta a BCG fue disminuida en monocitos transfectados con siRNA del MPK-1 en lugar del esperado aumento de fosforilación (Figura 5). Los resultados sugieren que la reducción del nivel de producción de TNF-α en monocitos estimulados por BCG se debe a la reducción de la fosforilación de MAPK por MKP-1 siRNA. Este informe presentó evidencias de que una nueva función de MKP-1 se descubre en la regulación de citoquinas en respuesta a la infección micobacteriana. BCG induce el MKP-1 como respuesta rápida (Figura 2). El mecanismo de inducción del MKP-1 por BCG depende tanto de ERK1/2 como de p38 MAPK (Figura 3). Utilizando el enfoque de siRNA, las funciones del MKP-1 se pueden examinar en monocitos humanos primarios. Los resultados mostraron que la activación de los MAPK inducidos por BCG, así como la expresión de citoquinas, son aguas abajo del MKP-1 (Figuras 4D y 5). Por lo tanto, el MPK-1 es una molécula de señalización crítica que está involucrada en la expresión de citoquinas inducidas por BCG. Informes anteriores han demostrado que el MPK-1 inducido por LPS o peptidoglicano depende de p38 MAPK [14]. En consecuencia, el MPK-1 inducido por BCG puede ser inhibido por inhibidores de p38 MAPK y ERK1/2. Curiosamente, se ha demostrado que la degradación del MPK-1 se reduce después de la fosforilación ERK1/2 [15]. Se puede hipotetizar que las proteínas inducidas por BCG MKP-1 pueden ser estabilizadas por ERK1/2 y los mecanismos detallados involucrados requieren más exploración. También, ya que la inhibición de la expresión de MKP-1 por ambos inhibidores (para p38 MAPK y ERK1/ 2) no fue completa, se cree que otras Sobre la base de los resultados de la literatura sobre los efectos de LPS (Figura 6 ), la expectativa original para este proyecto es que el MPK-1 actúa como regulador negativo. Los macrófagos peritoneales estimulados por el MPK-1 KO mostraron una fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como un aumento de la producción de TNF-α [9]. Al hacerlo, la fosforilación inducida por el MPK-1 por el LPS podría disminuir por el MPK-1 siRNA previene la producción prolongada de TNF-α como en la sepsis, lo que puede conducir a un daño grave al huésped. Se esperaba que el BCG indujera el MPK-1 y su inducción se correlacionaría con la defosforilación de los MAPKs incluyendo p38 MAPK. Al bloquear el MKP-1 utilizando siRNA, se esperaba que hubiera aumentado la fosforilación p38 MAPK y la producción prolongada de TNF-α en respuesta a BCG. Sin embargo, nuestros resultados mostrados aquí son diametralmente opuestos. Una posibilidad para los resultados inesperados puede deberse a efectos no específicos de transfección o siRNA. Sin embargo, este no fue el caso ya que hubo una expresión prolongada y aumentada de TNF-α después de que los monocitos transfectados por siRNA del MKP-1 fueron tratados con LPS (Figura 4C ). Ahora hay una nueva hipótesis para explicar tales efectos paradójicos de MKP-1 en la regulación del TNF-α en la que la fosfatasa juega un papel en la regulación positiva de la producción de TNF-α en respuesta a BCG como en el caso de DUSP2 [13 Las estructuras de PKP-1 y DUSP2 son similares, con las que ambos contienen un dominio de interacción MAPK y un sitio catalítico de fosfatasa. Por el contrario, otros dominios DUSP pueden tener dominios adicionales, por ejemplo, PEST [6]. Aquí, postulamos que la función de PKP-1 en la señalización inducida por BCG es similar a la del DUSP2/PAC1. En realidad, el descubrimiento de DUSP2 ha creado inicialmente algunas preguntas paradójicas. Como se describe, DUSP2 se comporta de manera diferente a otros miembros de la familia MKP [13]. En los macrófagos DUSP2 KO tratados con LPS, produjeron menos mediadores inflamatorios incluyendo menos TNF, IL-6, óxido nítrico y células productoras de IL-12, en comparación con la de las contrapartes de tipo salvaje [13 De hecho, los resultados de estos estudios publicados sobre estudios DUSP2 son bastante similares a los de nuestros resultados reportados aquí. Es plausible que estas regulaciones positivas inesperadas de funciones de células inmunes por DUSP2 se deban a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. Se demostró que hay interacciones entre las vías JNK y ERK1/2 [16]. Aquí, demostramos que la activación sostenida de los bloques JNK de activación ERK (Figura 6 ). En la situación DUSP2, la estimulación de los mastocitos y macrófagos KO muestra un aumento de la fosforilación de JNK, e inhibición de JNK por su propio inhibidor específico restaura la fosforilación de ERK1/2 [13]. En la situación BCG-MPK-1, hay una fosforilación temprana de p38 MAPK y ERK Por lo tanto, es posible que JNK pueda jugar un papel en la interacción de crosstalk de MAPK. Sin embargo, nuestros datos preliminares sugieren que el nivel de JNK fosforilado no fue aumentado en PBMo MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana Figura 6 MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana. Modelo LPS fue proporcionado de acuerdo con los hallazgos de la literatura (Izquierda). En este escenario, LPS activa MKP-1, que a su vez defosforila y desactiva fosfo-p38 MAPK, resultando en menos inducción TNF-α. Sin embargo, la situación en la activación DHP-HSA de DUSP2 es más complicada (Middle), ya que la actividad fosfatasa causa la inhibición posterior de fosfo-JNK que conduce a la derrepresión de fosfo-p38 MAPK. En consecuencia, los efectos combinados de esta cascada resultan en más expresión TNF-α. El inesperado papel antimicobacterial del MBP-1 (Right) puede explicarse por eventos similares a los efectos DUSP2. En este caso (Right), hubo una inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MBP-1, y el factor desconocido a su vez inhibe la activación MAPKs que conduce a más inducción TNF-α. Los detalles y los objetivos de la cinasa aún no se han identificado. transfectado con MBP-1 siRNNA (datos no mostrados). Así, los detalles de Aquí presentamos un modelo para resumir los resultados e hipotetizar la existencia de un factor o factores intermedios aún no identificados en las vías aguas abajo de los efectos del MPK-1 en la cascada de señalización inducida por el BCG. El inesperado papel antimicobacteriano del MPK-1 (Figura 6 ) puede explicarse por eventos similares a los efectos del DUSP2. En este caso, el BCG induce la expresión del MPK-1 mientras activa también los MAPKs incluyendo p38 MAPK y ERK1/2. Downstream del MPKP-1, hay una inhibición de vías desconocidas o cinasas. El factor desconocido a su vez inhibe la activación del MAPKs, que finalmente conduce a más inducción del TNF-α (Figura 6 ). En resumen, el MPK-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citoquinas sobre la infección micobacteriana. La inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MPK-1, que a su vez inhibe la activación de los MAPK, puede utilizarse para explicar la función novedosa del MPK-1 en la mejora de la actividad de MAPK y la consiguiente expresión TNF-α después del tratamiento con BCG (Figura 6 ). Tomado en conjunto, el papel de los crosstalks de MAPK necesita exploración adicional. (3) TNF-α, 30 ciclos (TM = 56°C), aguas arriba, 5'-GGGCTAGGCGGTGTTC-3', aguas abajo, 5'-AGACGCGGGCGCGGTGATGG-3'. Los productos PCR fueron analizados en un gel de agarosa del 1% con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta. Para comprobar el tamaño de los productos PCR, 1 kb Plus ADN Lad-der Para la realización de QPCR, los niveles de MKP-1 y TNF-α mRNA, así como el gen de referencia GAPDH (como control interno) fueron analizados por los kits de reactivos de prueba de demanda específicos del gen (Aplicated Biosystems, EE.UU.). Todas las muestras se ejecutaron en duplicados o triplicados y sin controles de plantillas en un detector de secuencias de prisma ABI 7700. El método de análisis de QPCR fue el método del número de ciclo comparativo al umbral (C T ) descrito en el boletín del usuario no 2 del sistema de detección de secuencias de prisma ABI 7700. El número de C T de los genes objetivo se normalizó al de GAPDH en cada muestra (ΔC T ). El valor de C T de las células tratadas se comparó con el de las células tratadas sin tratamiento o simulacro ( La expresión génica relativa de los genes objetivo (inducción doble) se calculó como 2 -CT. Las proteínas celulares totales fueron extraídas por células lising en tampón de lisis que contiene 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (pH 8,0), 1% SDS, 0,2 mg/ml PMSF, 1 μg/ml aprotinina, 1 mM de ortovanadato sódico, 2 μg/ml de peptatina, 2 μg/ml de leupeptina y 50 mM de fluoruro sódico durante 5 minutos. El homogenato fue hervido durante 10 minutos y almacenado a -70°C hasta su uso. Las concentraciones de proteína total en extractos celulares fueron determinadas por BCATM Protein Assay Kit (Pierce, IL, EE.UU.). Western blot se realizó como se describe [20]. Cantidades iguales de proteína fueron separadas por 10% SDS-PAGE, electrobloqueadas en membranas nitrocelulosas (Schleicher & Schuell), y seguidas de sondeo con anticuerpos específicos para Actin, MKP-1 (Santa Cruz Biotech., EE.UU.), fosfo-p38 MAPK, fosfo-ERK1/2 (Cell Signaling, EE.UU.). Después de tres lavados, las membranas fueron incubadas con los anticuerpos secundarios correspondientes. Las bandas fueron detectadas utilizando el Sistema Chemiluminiscence mejorado (Amersham Pharmacia Biotech) como instrucciones del fabricante. La transfección de siRNA El siRNA MKP-1 incluyó: i) MLP1-HSS102982, AAACGCUUCGUAUCUCCUUGAGG; ii) MLP1-HSS102983, UUAUGCCCAAGGCAUCCAG-CAUGUC; y iii) MLP1-HSS102984, UGAUG-GAGUCUAUGAAGUCAAugGGC. El derribo del MLP-1 en PBMo se llevó a cabo utilizando solamente MLP1-HSS102983 o un grupo de los tres MKP-1 StealthTM Select RNAi (ratio = 1:1:1, 200 nM, Invitrogen, USA). StealthTM RNAi Negative Control Duplex (200 nM) se utilizó como control de efectos independientes de secuencia para la transfección de siRN La transfección de monocitos se realizó mediante el reactivo de transfección de ADN jetPEITM (Polyplus Transfection, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de transfectar las células durante 24 h, los transfectantes fueron tratados con diferentes inductores como se describe anteriormente. El análisis estadístico fue realizado por la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los valores de p fueron inferiores a 0,05.

¿Qué causa la tuberculosis?

Una nueva función antimicobacteriana de la proteína quinasa fosfatasa activada por mitogenos-1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2804704/SHA: f6ed1f1e9999e57793addb1c9c54c61c7861a995Autores: Cheung, Benny KW; Yim, Howard CH; Lee, Norris CM; Lau, Allan SYDate: 2009-12-17DOI: 10.1186/1471-2172-10-64Licencia: cc-byAbstract: ANTERIORDANTE: Mycobacterium tuberculosis (MTB) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Para combatir este patógeno, las células inmunitarias liberan citocinas incluyendo el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), que es fundamental en el desarrollo de granulomas protectores. Nuestros resultados anteriores mostraron que Bacillus Calmette Guerin (BCG), un micobacterio utilizado como modelo para investigar la respuesta inmune contra MTB, estimula la inducción de TNF-α a través de la proteína quinasa activada por mitogenos (MAPK) en los monocitos sanguíneos humanos. Dado que MAPK phosphatasa-1 (MPK-1) es conocido por regular las actividades de MAPK, examinamos si el MPK-1 juega un papel en la activación de la MAPK inducida por BCG y la expresión de citoquinas. RESULTADOS: Los monocitos sanguíneos primarios humanos fueron tratados con BCG y analizados para la expresión de MKP-1. Además, la inducción del MPK-1 fue regulada por p38 MAPK y quinasa 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2). Sorprendentemente, cuando la expresión del MPK-1 fue bloqueada por su siRNA específico, hubo una disminución significativa en los niveles de fosfo-MAPK (p38 MAPK y ERK1/2) y TNF-α inducible por BCG. CONCLUSIONES: Dado que el TNF-α es fundamental en la formación de granuloma, los resultados indicaron una función positiva inesperada del MPK-1 contra la infección micobacterial en contraposición a su actividad habitual de fosfatasa. Texto: La tuberculosis (TB) sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo, especialmente en los países en desarrollo [1]. La enfermedad es causada por Mycobacterium tuberculosis (MTB) y aproximadamente un tercio de la población mundial ha sido infectada En un informe reciente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que hay 9,2 millones de nuevos casos de tuberculosis en todo el mundo en 2006 [1]. En respuesta a la infección por MTB, la inducción de citocinas por células inmunitarias es un importante mecanismo de defensa. Los macrófagos infectados secretan factores de señalización intercelular, citoquinas proinflamatorias, para mediar la respuesta inflamatoria que conduce a la formación de granuloma e inducción de inmunidad mediada por células T [2]. Para entender la patogénesis de la tuberculosis, las vías de señalización inducidas por micobacterias han sido motivo de interés desde hace mucho tiempo. Informes anteriores han demostrado que p38 MAPK y ERK1/2 son necesarios en la inducción de la expresión TNF-α en monocitos humanos infectados con M. tuberculosis H37Rv [4]. Hemos revelado además el papel significativo de los MAPK en los eventos de transducción de señales de activación micobacteriana de monocitos sanguíneos primarios humanos (PBMo) que conducen a expresiones citocinas a través de la interacción con PKR [5]. Sin embargo, los eventos posteriores en cuanto a cómo se regula MAPK y cómo tal regulación afecta a la producción de citocinas en respuesta a micobacterias siguen siendo elucidadas. Puesto que los MAPK se activan por fosforilación, la desfosforilación de los MAPK parece ser un proceso eficiente para inactivar sus actividades. Los ejemplos de estas fosfatasas incluyen fosfatasas de tirosina, fosfatasas de serina/treonina y fosfatasas de doble especificidad (DUSPs). Algunas fosfatasas de DUSPs también se conocen como fosfatasas de MAPK (MPK) [6] [7]. Actualmente, hay al menos 10 PHPs identificados, mientras que el MKP-1 es el miembro más estudiado de la familia. El papel regulador del PKP-1 en la inducción de citoquinas se demuestra mejor por los macrófagos de KKP-1 (KO) en respuesta al lipopolisacárido (LPS), un componente de pared celular de las bacterias Gram-negativas. Los macrófagos de PKP-1 mostraron fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como una mayor producción de TNF-α en respuesta Consistente con estos resultados, otro grupo reveló además que los macrófagos derivados de la médula ósea KO-MPK-1 tratados con LPS muestran una mayor actividad de unión al ADN AP-1 [10]. También mostraron que la expresión del MPK-1 inducida por LPS depende del factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) y del adaptador que contiene el dominio TIR induciendo IFN-β (TRIF) [10], demostrando así el papel del MPKP-1 en la transducción de señales. No sólo el LPS, otros inductores del TLR incluyendo CpG, peptidoglicano, poli CI y Pam 3 Cys pueden regular las expresiones citoquinas incluyendo TNF-α, IL-10 a través de las actividades del MPKP-1 [10, 11]. En estos procesos, el MPKP-1 sirve para mitigar los efectos indeseables del shock séptico y mantener Otro ejemplo de la función MPK-1 es la respuesta inmune a Staphylococcus aureus (S. aureus), una bacteria Gram positiva. Hay niveles más altos de producción de citocinas incluyendo TNF-α, IL-6, y MIP-1α en ratones MKP-1 KO infectados con S. aureus [12]. Además, los ratones tendrían un rápido desarrollo de disfunción multiorgánica, así como una tasa de mortalidad más rápida en caso de desafío con S. aureus matados por calor [12]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que MKP-1 protege al huésped de la sobreactivación del sistema inmunitario en respuesta a bacterias Gram negativo o Gram positivo. En el pasado, se creía que diferentes miembros de la familia MKP/DUSP tienen funciones superpuestas. Sin embargo, la aparición de DUSP2 cambió el concepto hacia abajo [13]. Se En las células DUSP2 KO, produjeron menos mediadores inflamatorios, lo que implica que DUSP2 puede desempeñar un papel en la mediación en lugar de limitar la inflamación. Para los casos, cuando los macrófagos DUSP2 KO fueron tratados con LPS, hubo menos receptores de TNF, IL-6, óxido nítrico, IL-12, en comparación con los de las contrapartes del tipo salvaje [13]. Cuando los mastocitos derivados de la médula ósea DUSP2 KO fueron sensibilizados por primera vez con el receptor de inmunoglobulina E (IgE) (Fc.RI) y luego estimulados con antígeno estable dinitrofenol-calor, produjeron niveles más bajos de ARNmT, menor producción de IL-6, menor fosforilación de ERK1/2, p38 MAPK, y menos actividades transcripcionales por Elk1 y NF Estas inesperadas regulaciones positivas de funciones celulares inmunitarias por DUSP2 se han hipotetizado debido a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. La estimulación de los mastocitos KO y macrófagos mostró incrementos en la fosforilación de JNK. Además, la inhibición de JNK por inhibidores de moléculas pequeñas mostró incrementos en la fosforilación de ERK [13]. Los autores también mostraron que hubo interacciones físicas de DUSP2 con ERK2, DUSP2 con JNK2, así como DUSP2 y p38 MAPK después de la estimulación de las células con antígeno estable de dinitrofenol-calor. Sin embargo, los detalles de las conversaciones cruzadas entre MAPKs y fosfatasas necesitan mayor investigación. Así, la familia MKP juega un papel crítico en la regulación de las respuestas inmunes. La respuesta inmune innata protege al huésped de la infección por MTB por secreción de citocinas incluyendo TNF-α en células inmunitarias. Mientras tanto, MAPK es una de las proteínas críticas en la regulación de la inmunidad y la expresión de citoquinas. Dado que MAPK está regulado por MKP-1 en respuesta a LPS y la activación de MAPK es importante en la expresión de citoquinas inducidas por BCG, hipotetizamos que el MKP-1 juega un papel crítico en la regulación inmune de BCG en monocitos humanos. Examinamos la implicación del MKP-1 en la activación de MAPK inducida por BCG y su consiguiente expresión de citoquinas. Aquí presentamos evidencias de que el MKP-1 juega un papel inesperado en la regulación de la inducción de citoquinas por BCG a través de su control de la fosforilación de MAPK. Se ha reportado que muchos inductores incluyendo factores de crecimiento, LPS, peptidoglicano, y dexametasona pueden estimular la expresión de MKP-1 en macrófagos humanos, microglia, mastocitos o fibroblastos [6]. Para investigar el papel de diferentes inductores de TLR en el proceso de inducción de MKP-1 en monocitos sanguíneos humanos, el nivel de MKP-1 mRNA se midió mediante el método de reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR). PBMo se aisló de células mononucleares primarias de sangre humana y se estimuló con Pam 3 Cys (agonista TLR2), poli IC (agonista TLR3) o LPS (agonista TLR4) durante 1 y 3 horas. Tras la exposición a Pam 3 Cys o LPS, hubo inducciones significativas de los niveles Estos efectos sobre la inducción del MPKP-1 continuaron durante 3 horas después del tratamiento con Pam 3 Cys (Figura 1A ). Por el contrario, el poli CI no indujo el MPKP-1 (Figura 1A ). Los resultados indican que diferentes inductores mostraron una regulación diferencial de la expresión del MPKP-1. LPS ha sido ampliamente utilizado para demostrar el papel del MPKP-1 en la respuesta inmune tanto in vivo como in vitro [9, 12]. Para establecer una base para la interpretación de los resultados experimentales posteriores, se utilizó el LPS como un control positivo para la inducción de la expresión del MPKP-1. Para determinar los niveles del MPKP-1 en respuesta al LPS, la cinética de la transcripción del MPKP-1 fue determinada por el QPCR. Hubo una inducción significativa del MPKP-1 mRNA, que alcanzó su punto máximo tan temprano como 1 hora Estos resultados mostraron que LPS indujo la expresión MCP-1 (Figura 1B). A continuación, para demostrar la inducción de fosfatasas específicas por BCG, se estudió la cinética de la expresión MCP-1 en PBMo utilizando QPCR durante el tratamiento BCG. Similar a los resultados producidos por LPS, con la adición de BCG (MOI = 1 CFU/celda), hubo una inducción significativa de MKP-1 mRNA dentro de 1 hora de tratamiento BCG determinado por la sonda Taqman específica para MCP-1 (Figura 2A ). Los efectos duraron al menos 6 horas (Figura 2A ). Para examinar si los cambios en la producción proteica fueron paralelos a los niveles de mRNA, los niveles proteicos de MKP-1 fueron medidos por Western blotting. En respuesta a B Los niveles proteicos se mantuvieron durante 2 horas y disminuyeron a los niveles basales a las 3 horas (Figura 2B ). Los resultados demostraron que hubo inducción MKP-1 en respuesta a la activación de BCG en monocitos humanos. Se ha demostrado que la inhibición de p38 MAPK bien por inhibidor específico o siRNA redujo la expresión de MKP-1 en macrófagos tratados con LPS o peptidoglicano [14]. Para determinar los mecanismos involucrados en la expresión BCG inducida por MKP-1, PBMo fue pretratado con varios inhibidores incluyendo PD98059 (inhibidor de MAP quinasa [MEK] o ERK1/2), SB203580 (inhibidor de p38 MAPK), SP600125 (inhibidor de JNK), y CAPE (inhibidor de NF- Se utilizó un rango de concentraciones de cada inhibidor para probar sus concentraciones óptimas y efectos sobre la viabilidad celular y las inhibiciones de la cinasa. Posteriormente se añadió BCG y se recogió el ARN total. Los resultados demostraron que, con la inhibición de las actividades de ERK1/2 y p38 MAPK por sus correspondientes inhibidores relativamente específicos, las expresiones MKP-1 se redujeron significativamente (Figura 3 ). Además, utilizando dosis más altas de SB203580, se demostró que la inhibición se incrementa aún más (datos no mostrados). Por el contrario, el pretratamiento de las células con CAPE y SP600125 no afectó a la inducción de MKP-1 por BCG (Figura 3 ). Estos resultados sugieren que la expresión inducida por BCG MKP-1 es dependiente tanto de p38 MAPK como de ERK1/2. A lo largo de los experimentos anteriores, el objetivo principal fue Así, para examinar más a fondo el papel del MPKP-1 en la señalización inducida por BCG, se utilizó la transfección de siRNA en PBMo para derribar la actividad del MPKP-1. Para demostrar que el MPKP-1 siRNA puede efectivamente derribar el gen objetivo, PBMo fue primero transfectado con control o MKP-1 siRNA y luego tratado con BCG durante 3 horas. Los niveles de MKP-1 mRNA fueron medidos por el método RT-PCR. En la Figura 4A, BCG estimuló la expresión MKP-1 (lanes 1 y 2). En MKP-1 siRNA transfectó monocitos, la inducción de MKP-1 por BCG fue significativamente disminuida (lanes 2 y 4). Los resultados mostraron que el siRNA hace abrogar los niveles de MKP-1 mRNA. Para determinar si el siRNA MKP-1 afecta al BCG inducido MKP-1 a niveles proteicos, PBMo fue tratado como arriba y las proteínas MKP-1 fueron medidas por Western blotting. Los resultados mostraron que el BCG podría inducir proteínas MKP-1 como de costumbre para células transfectadas con control siRNA (Figura 4B, carriles 1-3). Sin embargo, los niveles de BCG inducido expresión proteica MKP-1 fueron reducidos en células transfectadas con siRNA MKP-1 (Figura 4B, carriles 4-6). Juntos, los resultados sugieren que el siRNA MKP-1 no sólo redujo el MKP-1 mRNA en el tratamiento BCG sino que también abrogó la proteína MKP-1 inducida por BCG. Como se indica en la literatura [9], los ratones MKP-1 KO mostraron aumento de la producción Sobre la base de los resultados anteriores de siRNA del MPK-1, se utilizó LPS como control para demostrar los efectos de este sistema siRNA del MPK-1. La expresión citoquina inducida por LPS en células transfectadas de siRNA del MPK-1 sugiere que el sistema siRNA es eficaz para derribar la expresión del MPK-1 y que el MPK-1 actúa como regulador negativo en la expresión del TNF-α inducida por LPS. Para investigar el efecto del siRNA del MPK-1 en la expresión de citoquina inducida por BCG, los niveles de TNF-α, IL-6 e IL-10 mRNA se midieron por el método QPCR. PBMo fueron transfectados con control o MKP-1 siRNA. Después de la exposición al BCG con control siRNA, hubo inducciones significativas de TNF-α, IL-6 e IL-10 m A continuación, se examinaron los efectos del siRNA-MCP-1 en la expresión citoquina inducida por BCG. Sorprendentemente, hubo una abrogación significativa de la expresión TNF-α inducida por BCG por MKP-1 siRNA (Figura 4D ). Con la caída del siRNA-MCP-1, el nivel de TNF-α inducido por BCG fue sólo 60% comparado con el de las células de control, mientras que el IL-6 e IL-10 inducidos por BCG fueron sin cambios en las células transfectadas por MKP-1 siRNA. Los resultados revelaron que el MKP-1 juega un papel en la inducción de la expresión TNF-α sobre la estimulación BCG, que puede ser diferente a la de sus funciones convencionales en las que el MKP-1 actúa como regulador negativo en las vías de señalización inducidas por LPS [7]. El estado de fosforilación de los MAPK fue evaluado en control o siRNA del MPK-1 transfectado PBMo. Los resultados de Western blocking demostraron que BCG indujo tanto la fosforilación p38 como la ERK1/2 en 15 minutos (datos no mostrados) y alcanzó su punto máximo en 30 minutos, y luego regresó a los niveles basales en células tratadas con el siRNA del control (Figura 5). Al igual que los resultados de la expresión de citoquinas, la fosforilación de ambos p38 MAPK y ERK1/2 en respuesta a BCG fue disminuida en monocitos transfectados con siRNA del MPK-1 en lugar del esperado aumento de fosforilación (Figura 5). Los resultados sugieren que la reducción del nivel de producción de TNF-α en monocitos estimulados por BCG se debe a la reducción de la fosforilación de MAPK por MKP-1 siRNA. Este informe presentó evidencias de que una nueva función de MKP-1 se descubre en la regulación de citoquinas en respuesta a la infección micobacteriana. BCG induce el MKP-1 como respuesta rápida (Figura 2). El mecanismo de inducción del MKP-1 por BCG depende tanto de ERK1/2 como de p38 MAPK (Figura 3). Utilizando el enfoque de siRNA, las funciones del MKP-1 se pueden examinar en monocitos humanos primarios. Los resultados mostraron que la activación de los MAPK inducidos por BCG, así como la expresión de citoquinas, son aguas abajo del MKP-1 (Figuras 4D y 5). Por lo tanto, el MPK-1 es una molécula de señalización crítica que está involucrada en la expresión de citoquinas inducidas por BCG. Informes anteriores han demostrado que el MPK-1 inducido por LPS o peptidoglicano depende de p38 MAPK [14]. En consecuencia, el MPK-1 inducido por BCG puede ser inhibido por inhibidores de p38 MAPK y ERK1/2. Curiosamente, se ha demostrado que la degradación del MPK-1 se reduce después de la fosforilación ERK1/2 [15]. Se puede hipotetizar que las proteínas inducidas por BCG MKP-1 pueden ser estabilizadas por ERK1/2 y los mecanismos detallados involucrados requieren más exploración. También, ya que la inhibición de la expresión de MKP-1 por ambos inhibidores (para p38 MAPK y ERK1/ 2) no fue completa, se cree que otras Sobre la base de los resultados de la literatura sobre los efectos de LPS (Figura 6 ), la expectativa original para este proyecto es que el MPK-1 actúa como regulador negativo. Los macrófagos peritoneales estimulados por el MPK-1 KO mostraron una fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como un aumento de la producción de TNF-α [9]. Al hacerlo, la fosforilación inducida por el MPK-1 por el LPS podría disminuir por el MPK-1 siRNA previene la producción prolongada de TNF-α como en la sepsis, lo que puede conducir a un daño grave al huésped. Se esperaba que el BCG indujera el MPK-1 y su inducción se correlacionaría con la defosforilación de los MAPKs incluyendo p38 MAPK. Al bloquear el MKP-1 utilizando siRNA, se esperaba que hubiera aumentado la fosforilación p38 MAPK y la producción prolongada de TNF-α en respuesta a BCG. Sin embargo, nuestros resultados mostrados aquí son diametralmente opuestos. Una posibilidad para los resultados inesperados puede deberse a efectos no específicos de transfección o siRNA. Sin embargo, este no fue el caso ya que hubo una expresión prolongada y aumentada de TNF-α después de que los monocitos transfectados por siRNA del MKP-1 fueron tratados con LPS (Figura 4C ). Ahora hay una nueva hipótesis para explicar tales efectos paradójicos de MKP-1 en la regulación del TNF-α en la que la fosfatasa juega un papel en la regulación positiva de la producción de TNF-α en respuesta a BCG como en el caso de DUSP2 [13 Las estructuras de PKP-1 y DUSP2 son similares, con las que ambos contienen un dominio de interacción MAPK y un sitio catalítico de fosfatasa. Por el contrario, otros dominios DUSP pueden tener dominios adicionales, por ejemplo, PEST [6]. Aquí, postulamos que la función de PKP-1 en la señalización inducida por BCG es similar a la del DUSP2/PAC1. En realidad, el descubrimiento de DUSP2 ha creado inicialmente algunas preguntas paradójicas. Como se describe, DUSP2 se comporta de manera diferente a otros miembros de la familia MKP [13]. En los macrófagos DUSP2 KO tratados con LPS, produjeron menos mediadores inflamatorios incluyendo menos TNF, IL-6, óxido nítrico y células productoras de IL-12, en comparación con la de las contrapartes de tipo salvaje [13 De hecho, los resultados de estos estudios publicados sobre estudios DUSP2 son bastante similares a los de nuestros resultados reportados aquí. Es plausible que estas regulaciones positivas inesperadas de funciones de células inmunes por DUSP2 se deban a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. Se demostró que hay interacciones entre las vías JNK y ERK1/2 [16]. Aquí, demostramos que la activación sostenida de los bloques JNK de activación ERK (Figura 6 ). En la situación DUSP2, la estimulación de los mastocitos y macrófagos KO muestra un aumento de la fosforilación de JNK, e inhibición de JNK por su propio inhibidor específico restaura la fosforilación de ERK1/2 [13]. En la situación BCG-MPK-1, hay una fosforilación temprana de p38 MAPK y ERK Por lo tanto, es posible que JNK pueda jugar un papel en la interacción de crosstalk de MAPK. Sin embargo, nuestros datos preliminares sugieren que el nivel de JNK fosforilado no fue aumentado en PBMo MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana Figura 6 MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana. Modelo LPS fue proporcionado de acuerdo con los hallazgos de la literatura (Izquierda). En este escenario, LPS activa MKP-1, que a su vez defosforila y desactiva fosfo-p38 MAPK, resultando en menos inducción TNF-α. Sin embargo, la situación en la activación DHP-HSA de DUSP2 es más complicada (Middle), ya que la actividad fosfatasa causa la inhibición posterior de fosfo-JNK que conduce a la derrepresión de fosfo-p38 MAPK. En consecuencia, los efectos combinados de esta cascada resultan en más expresión TNF-α. El inesperado papel antimicobacterial del MBP-1 (Right) puede explicarse por eventos similares a los efectos DUSP2. En este caso (Right), hubo una inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MBP-1, y el factor desconocido a su vez inhibe la activación MAPKs que conduce a más inducción TNF-α. Los detalles y los objetivos de la cinasa aún no se han identificado. transfectado con MBP-1 siRNNA (datos no mostrados). Así, los detalles de Aquí presentamos un modelo para resumir los resultados e hipotetizar la existencia de un factor o factores intermedios aún no identificados en las vías aguas abajo de los efectos del MPK-1 en la cascada de señalización inducida por el BCG. El inesperado papel antimicobacteriano del MPK-1 (Figura 6 ) puede explicarse por eventos similares a los efectos del DUSP2. En este caso, el BCG induce la expresión del MPK-1 mientras activa también los MAPKs incluyendo p38 MAPK y ERK1/2. Downstream del MPKP-1, hay una inhibición de vías desconocidas o cinasas. El factor desconocido a su vez inhibe la activación del MAPKs, que finalmente conduce a más inducción del TNF-α (Figura 6 ). En resumen, el MPK-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citoquinas sobre la infección micobacteriana. La inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MPK-1, que a su vez inhibe la activación de los MAPK, puede utilizarse para explicar la función novedosa del MPK-1 en la mejora de la actividad de MAPK y la consiguiente expresión TNF-α después del tratamiento con BCG (Figura 6 ). Tomado en conjunto, el papel de los crosstalks de MAPK necesita exploración adicional. (3) TNF-α, 30 ciclos (TM = 56°C), aguas arriba, 5'-GGGCTAGGCGGTGTTC-3', aguas abajo, 5'-AGACGCGGGCGCGGTGATGG-3'. Los productos PCR fueron analizados en un gel de agarosa del 1% con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta. Para comprobar el tamaño de los productos PCR, 1 kb Plus ADN Lad-der Para la realización de QPCR, los niveles de MKP-1 y TNF-α mRNA, así como el gen de referencia GAPDH (como control interno) fueron analizados por los kits de reactivos de prueba de demanda específicos del gen (Aplicated Biosystems, EE.UU.). Todas las muestras se ejecutaron en duplicados o triplicados y sin controles de plantillas en un detector de secuencias de prisma ABI 7700. El método de análisis de QPCR fue el método del número de ciclo comparativo al umbral (C T ) descrito en el boletín del usuario no 2 del sistema de detección de secuencias de prisma ABI 7700. El número de C T de los genes objetivo se normalizó al de GAPDH en cada muestra (ΔC T ). El valor de C T de las células tratadas se comparó con el de las células tratadas sin tratamiento o simulacro ( La expresión génica relativa de los genes objetivo (inducción doble) se calculó como 2 -CT. Las proteínas celulares totales fueron extraídas por células lising en tampón de lisis que contiene 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (pH 8,0), 1% SDS, 0,2 mg/ml PMSF, 1 μg/ml aprotinina, 1 mM de ortovanadato sódico, 2 μg/ml de peptatina, 2 μg/ml de leupeptina y 50 mM de fluoruro sódico durante 5 minutos. El homogenato fue hervido durante 10 minutos y almacenado a -70°C hasta su uso. Las concentraciones de proteína total en extractos celulares fueron determinadas por BCATM Protein Assay Kit (Pierce, IL, EE.UU.). Western blot se realizó como se describe [20]. Cantidades iguales de proteína fueron separadas por 10% SDS-PAGE, electrobloqueadas en membranas nitrocelulosas (Schleicher & Schuell), y seguidas de sondeo con anticuerpos específicos para Actin, MKP-1 (Santa Cruz Biotech., EE.UU.), fosfo-p38 MAPK, fosfo-ERK1/2 (Cell Signaling, EE.UU.). Después de tres lavados, las membranas fueron incubadas con los anticuerpos secundarios correspondientes. Las bandas fueron detectadas utilizando el Sistema Chemiluminiscence mejorado (Amersham Pharmacia Biotech) como instrucciones del fabricante. La transfección de siRNA El siRNA MKP-1 incluyó: i) MLP1-HSS102982, AAACGCUUCGUAUCUCCUUGAGG; ii) MLP1-HSS102983, UUAUGCCCAAGGCAUCCAG-CAUGUC; y iii) MLP1-HSS102984, UGAUG-GAGUCUAUGAAGUCAAugGGC. El derribo del MLP-1 en PBMo se llevó a cabo utilizando solamente MLP1-HSS102983 o un grupo de los tres MKP-1 StealthTM Select RNAi (ratio = 1:1:1, 200 nM, Invitrogen, USA). StealthTM RNAi Negative Control Duplex (200 nM) se utilizó como control de efectos independientes de secuencia para la transfección de siRN La transfección de monocitos se realizó mediante el reactivo de transfección de ADN jetPEITM (Polyplus Transfection, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de transfectar las células durante 24 h, los transfectantes fueron tratados con diferentes inductores como se describe anteriormente. El análisis estadístico fue realizado por la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los valores de p fueron inferiores a 0,05.

¿Qué porcentaje del mundo ha sido infectado por tuberculosis?

Una nueva función antimicobacteriana de la proteína quinasa fosfatasa activada por mitogenos-1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2804704/SHA: f6ed1f1e9999e57793addb1c9c54c61c7861a995Autores: Cheung, Benny KW; Yim, Howard CH; Lee, Norris CM; Lau, Allan SYDate: 2009-12-17DOI: 10.1186/1471-2172-10-64Licencia: cc-byAbstract: ANTERIORDANTE: Mycobacterium tuberculosis (MTB) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Para combatir este patógeno, las células inmunitarias liberan citocinas incluyendo el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), que es fundamental en el desarrollo de granulomas protectores. Nuestros resultados anteriores mostraron que Bacillus Calmette Guerin (BCG), un micobacterio utilizado como modelo para investigar la respuesta inmune contra MTB, estimula la inducción de TNF-α a través de la proteína quinasa activada por mitogenos (MAPK) en los monocitos sanguíneos humanos. Dado que MAPK phosphatasa-1 (MPK-1) es conocido por regular las actividades de MAPK, examinamos si el MPK-1 juega un papel en la activación de la MAPK inducida por BCG y la expresión de citoquinas. RESULTADOS: Los monocitos sanguíneos primarios humanos fueron tratados con BCG y analizados para la expresión de MKP-1. Además, la inducción del MPK-1 fue regulada por p38 MAPK y quinasa 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2). Sorprendentemente, cuando la expresión del MPK-1 fue bloqueada por su siRNA específico, hubo una disminución significativa en los niveles de fosfo-MAPK (p38 MAPK y ERK1/2) y TNF-α inducible por BCG. CONCLUSIONES: Dado que el TNF-α es fundamental en la formación de granuloma, los resultados indicaron una función positiva inesperada del MPK-1 contra la infección micobacterial en contraposición a su actividad habitual de fosfatasa. Texto: La tuberculosis (TB) sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo, especialmente en los países en desarrollo [1]. La enfermedad es causada por Mycobacterium tuberculosis (MTB) y aproximadamente un tercio de la población mundial ha sido infectada En un informe reciente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que hay 9,2 millones de nuevos casos de tuberculosis en todo el mundo en 2006 [1]. En respuesta a la infección por MTB, la inducción de citocinas por células inmunitarias es un importante mecanismo de defensa. Los macrófagos infectados secretan factores de señalización intercelular, citoquinas proinflamatorias, para mediar la respuesta inflamatoria que conduce a la formación de granuloma e inducción de inmunidad mediada por células T [2]. Para entender la patogénesis de la tuberculosis, las vías de señalización inducidas por micobacterias han sido motivo de interés desde hace mucho tiempo. Informes anteriores han demostrado que p38 MAPK y ERK1/2 son necesarios en la inducción de la expresión TNF-α en monocitos humanos infectados con M. tuberculosis H37Rv [4]. Hemos revelado además el papel significativo de los MAPK en los eventos de transducción de señales de activación micobacteriana de monocitos sanguíneos primarios humanos (PBMo) que conducen a expresiones citocinas a través de la interacción con PKR [5]. Sin embargo, los eventos posteriores en cuanto a cómo se regula MAPK y cómo tal regulación afecta a la producción de citocinas en respuesta a micobacterias siguen siendo elucidadas. Puesto que los MAPK se activan por fosforilación, la desfosforilación de los MAPK parece ser un proceso eficiente para inactivar sus actividades. Los ejemplos de estas fosfatasas incluyen fosfatasas de tirosina, fosfatasas de serina/treonina y fosfatasas de doble especificidad (DUSPs). Algunas fosfatasas de DUSPs también se conocen como fosfatasas de MAPK (MPK) [6] [7]. Actualmente, hay al menos 10 PHPs identificados, mientras que el MKP-1 es el miembro más estudiado de la familia. El papel regulador del PKP-1 en la inducción de citoquinas se demuestra mejor por los macrófagos de KKP-1 (KO) en respuesta al lipopolisacárido (LPS), un componente de pared celular de las bacterias Gram-negativas. Los macrófagos de PKP-1 mostraron fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como una mayor producción de TNF-α en respuesta Consistente con estos resultados, otro grupo reveló además que los macrófagos derivados de la médula ósea KO-MPK-1 tratados con LPS muestran una mayor actividad de unión al ADN AP-1 [10]. También mostraron que la expresión del MPK-1 inducida por LPS depende del factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) y del adaptador que contiene el dominio TIR induciendo IFN-β (TRIF) [10], demostrando así el papel del MPKP-1 en la transducción de señales. No sólo el LPS, otros inductores del TLR incluyendo CpG, peptidoglicano, poli CI y Pam 3 Cys pueden regular las expresiones citoquinas incluyendo TNF-α, IL-10 a través de las actividades del MPKP-1 [10, 11]. En estos procesos, el MPKP-1 sirve para mitigar los efectos indeseables del shock séptico y mantener Otro ejemplo de la función MPK-1 es la respuesta inmune a Staphylococcus aureus (S. aureus), una bacteria Gram positiva. Hay niveles más altos de producción de citocinas incluyendo TNF-α, IL-6, y MIP-1α en ratones MKP-1 KO infectados con S. aureus [12]. Además, los ratones tendrían un rápido desarrollo de disfunción multiorgánica, así como una tasa de mortalidad más rápida en caso de desafío con S. aureus matados por calor [12]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que MKP-1 protege al huésped de la sobreactivación del sistema inmunitario en respuesta a bacterias Gram negativo o Gram positivo. En el pasado, se creía que diferentes miembros de la familia MKP/DUSP tienen funciones superpuestas. Sin embargo, la aparición de DUSP2 cambió el concepto hacia abajo [13]. Se En las células DUSP2 KO, produjeron menos mediadores inflamatorios, lo que implica que DUSP2 puede desempeñar un papel en la mediación en lugar de limitar la inflamación. Para los casos, cuando los macrófagos DUSP2 KO fueron tratados con LPS, hubo menos receptores de TNF, IL-6, óxido nítrico, IL-12, en comparación con los de las contrapartes del tipo salvaje [13]. Cuando los mastocitos derivados de la médula ósea DUSP2 KO fueron sensibilizados por primera vez con el receptor de inmunoglobulina E (IgE) (Fc.RI) y luego estimulados con antígeno estable dinitrofenol-calor, produjeron niveles más bajos de ARNmT, menor producción de IL-6, menor fosforilación de ERK1/2, p38 MAPK, y menos actividades transcripcionales por Elk1 y NF Estas inesperadas regulaciones positivas de funciones celulares inmunitarias por DUSP2 se han hipotetizado debido a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. La estimulación de los mastocitos KO y macrófagos mostró incrementos en la fosforilación de JNK. Además, la inhibición de JNK por inhibidores de moléculas pequeñas mostró incrementos en la fosforilación de ERK [13]. Los autores también mostraron que hubo interacciones físicas de DUSP2 con ERK2, DUSP2 con JNK2, así como DUSP2 y p38 MAPK después de la estimulación de las células con antígeno estable de dinitrofenol-calor. Sin embargo, los detalles de las conversaciones cruzadas entre MAPKs y fosfatasas necesitan mayor investigación. Así, la familia MKP juega un papel crítico en la regulación de las respuestas inmunes. La respuesta inmune innata protege al huésped de la infección por MTB por secreción de citocinas incluyendo TNF-α en células inmunitarias. Mientras tanto, MAPK es una de las proteínas críticas en la regulación de la inmunidad y la expresión de citoquinas. Dado que MAPK está regulado por MKP-1 en respuesta a LPS y la activación de MAPK es importante en la expresión de citoquinas inducidas por BCG, hipotetizamos que el MKP-1 juega un papel crítico en la regulación inmune de BCG en monocitos humanos. Examinamos la implicación del MKP-1 en la activación de MAPK inducida por BCG y su consiguiente expresión de citoquinas. Aquí presentamos evidencias de que el MKP-1 juega un papel inesperado en la regulación de la inducción de citoquinas por BCG a través de su control de la fosforilación de MAPK. Se ha reportado que muchos inductores incluyendo factores de crecimiento, LPS, peptidoglicano, y dexametasona pueden estimular la expresión de MKP-1 en macrófagos humanos, microglia, mastocitos o fibroblastos [6]. Para investigar el papel de diferentes inductores de TLR en el proceso de inducción de MKP-1 en monocitos sanguíneos humanos, el nivel de MKP-1 mRNA se midió mediante el método de reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR). PBMo se aisló de células mononucleares primarias de sangre humana y se estimuló con Pam 3 Cys (agonista TLR2), poli IC (agonista TLR3) o LPS (agonista TLR4) durante 1 y 3 horas. Tras la exposición a Pam 3 Cys o LPS, hubo inducciones significativas de los niveles Estos efectos sobre la inducción del MPKP-1 continuaron durante 3 horas después del tratamiento con Pam 3 Cys (Figura 1A ). Por el contrario, el poli CI no indujo el MPKP-1 (Figura 1A ). Los resultados indican que diferentes inductores mostraron una regulación diferencial de la expresión del MPKP-1. LPS ha sido ampliamente utilizado para demostrar el papel del MPKP-1 en la respuesta inmune tanto in vivo como in vitro [9, 12]. Para establecer una base para la interpretación de los resultados experimentales posteriores, se utilizó el LPS como un control positivo para la inducción de la expresión del MPKP-1. Para determinar los niveles del MPKP-1 en respuesta al LPS, la cinética de la transcripción del MPKP-1 fue determinada por el QPCR. Hubo una inducción significativa del MPKP-1 mRNA, que alcanzó su punto máximo tan temprano como 1 hora Estos resultados mostraron que LPS indujo la expresión MCP-1 (Figura 1B). A continuación, para demostrar la inducción de fosfatasas específicas por BCG, se estudió la cinética de la expresión MCP-1 en PBMo utilizando QPCR durante el tratamiento BCG. Similar a los resultados producidos por LPS, con la adición de BCG (MOI = 1 CFU/celda), hubo una inducción significativa de MKP-1 mRNA dentro de 1 hora de tratamiento BCG determinado por la sonda Taqman específica para MCP-1 (Figura 2A ). Los efectos duraron al menos 6 horas (Figura 2A ). Para examinar si los cambios en la producción proteica fueron paralelos a los niveles de mRNA, los niveles proteicos de MKP-1 fueron medidos por Western blotting. En respuesta a B Los niveles proteicos se mantuvieron durante 2 horas y disminuyeron a los niveles basales a las 3 horas (Figura 2B ). Los resultados demostraron que hubo inducción MKP-1 en respuesta a la activación de BCG en monocitos humanos. Se ha demostrado que la inhibición de p38 MAPK bien por inhibidor específico o siRNA redujo la expresión de MKP-1 en macrófagos tratados con LPS o peptidoglicano [14]. Para determinar los mecanismos involucrados en la expresión BCG inducida por MKP-1, PBMo fue pretratado con varios inhibidores incluyendo PD98059 (inhibidor de MAP quinasa [MEK] o ERK1/2), SB203580 (inhibidor de p38 MAPK), SP600125 (inhibidor de JNK), y CAPE (inhibidor de NF- Se utilizó un rango de concentraciones de cada inhibidor para probar sus concentraciones óptimas y efectos sobre la viabilidad celular y las inhibiciones de la cinasa. Posteriormente se añadió BCG y se recogió el ARN total. Los resultados demostraron que, con la inhibición de las actividades de ERK1/2 y p38 MAPK por sus correspondientes inhibidores relativamente específicos, las expresiones MKP-1 se redujeron significativamente (Figura 3 ). Además, utilizando dosis más altas de SB203580, se demostró que la inhibición se incrementa aún más (datos no mostrados). Por el contrario, el pretratamiento de las células con CAPE y SP600125 no afectó a la inducción de MKP-1 por BCG (Figura 3 ). Estos resultados sugieren que la expresión inducida por BCG MKP-1 es dependiente tanto de p38 MAPK como de ERK1/2. A lo largo de los experimentos anteriores, el objetivo principal fue Así, para examinar más a fondo el papel del MPKP-1 en la señalización inducida por BCG, se utilizó la transfección de siRNA en PBMo para derribar la actividad del MPKP-1. Para demostrar que el MPKP-1 siRNA puede efectivamente derribar el gen objetivo, PBMo fue primero transfectado con control o MKP-1 siRNA y luego tratado con BCG durante 3 horas. Los niveles de MKP-1 mRNA fueron medidos por el método RT-PCR. En la Figura 4A, BCG estimuló la expresión MKP-1 (lanes 1 y 2). En MKP-1 siRNA transfectó monocitos, la inducción de MKP-1 por BCG fue significativamente disminuida (lanes 2 y 4). Los resultados mostraron que el siRNA hace abrogar los niveles de MKP-1 mRNA. Para determinar si el siRNA MKP-1 afecta al BCG inducido MKP-1 a niveles proteicos, PBMo fue tratado como arriba y las proteínas MKP-1 fueron medidas por Western blotting. Los resultados mostraron que el BCG podría inducir proteínas MKP-1 como de costumbre para células transfectadas con control siRNA (Figura 4B, carriles 1-3). Sin embargo, los niveles de BCG inducido expresión proteica MKP-1 fueron reducidos en células transfectadas con siRNA MKP-1 (Figura 4B, carriles 4-6). Juntos, los resultados sugieren que el siRNA MKP-1 no sólo redujo el MKP-1 mRNA en el tratamiento BCG sino que también abrogó la proteína MKP-1 inducida por BCG. Como se indica en la literatura [9], los ratones MKP-1 KO mostraron aumento de la producción Sobre la base de los resultados anteriores de siRNA del MPK-1, se utilizó LPS como control para demostrar los efectos de este sistema siRNA del MPK-1. La expresión citoquina inducida por LPS en células transfectadas de siRNA del MPK-1 sugiere que el sistema siRNA es eficaz para derribar la expresión del MPK-1 y que el MPK-1 actúa como regulador negativo en la expresión del TNF-α inducida por LPS. Para investigar el efecto del siRNA del MPK-1 en la expresión de citoquina inducida por BCG, los niveles de TNF-α, IL-6 e IL-10 mRNA se midieron por el método QPCR. PBMo fueron transfectados con control o MKP-1 siRNA. Después de la exposición al BCG con control siRNA, hubo inducciones significativas de TNF-α, IL-6 e IL-10 m A continuación, se examinaron los efectos del siRNA-MCP-1 en la expresión citoquina inducida por BCG. Sorprendentemente, hubo una abrogación significativa de la expresión TNF-α inducida por BCG por MKP-1 siRNA (Figura 4D ). Con la caída del siRNA-MCP-1, el nivel de TNF-α inducido por BCG fue sólo 60% comparado con el de las células de control, mientras que el IL-6 e IL-10 inducidos por BCG fueron sin cambios en las células transfectadas por MKP-1 siRNA. Los resultados revelaron que el MKP-1 juega un papel en la inducción de la expresión TNF-α sobre la estimulación BCG, que puede ser diferente a la de sus funciones convencionales en las que el MKP-1 actúa como regulador negativo en las vías de señalización inducidas por LPS [7]. El estado de fosforilación de los MAPK fue evaluado en control o siRNA del MPK-1 transfectado PBMo. Los resultados de Western blocking demostraron que BCG indujo tanto la fosforilación p38 como la ERK1/2 en 15 minutos (datos no mostrados) y alcanzó su punto máximo en 30 minutos, y luego regresó a los niveles basales en células tratadas con el siRNA del control (Figura 5). Al igual que los resultados de la expresión de citoquinas, la fosforilación de ambos p38 MAPK y ERK1/2 en respuesta a BCG fue disminuida en monocitos transfectados con siRNA del MPK-1 en lugar del esperado aumento de fosforilación (Figura 5). Los resultados sugieren que la reducción del nivel de producción de TNF-α en monocitos estimulados por BCG se debe a la reducción de la fosforilación de MAPK por MKP-1 siRNA. Este informe presentó evidencias de que una nueva función de MKP-1 se descubre en la regulación de citoquinas en respuesta a la infección micobacteriana. BCG induce el MKP-1 como respuesta rápida (Figura 2). El mecanismo de inducción del MKP-1 por BCG depende tanto de ERK1/2 como de p38 MAPK (Figura 3). Utilizando el enfoque de siRNA, las funciones del MKP-1 se pueden examinar en monocitos humanos primarios. Los resultados mostraron que la activación de los MAPK inducidos por BCG, así como la expresión de citoquinas, son aguas abajo del MKP-1 (Figuras 4D y 5). Por lo tanto, el MPK-1 es una molécula de señalización crítica que está involucrada en la expresión de citoquinas inducidas por BCG. Informes anteriores han demostrado que el MPK-1 inducido por LPS o peptidoglicano depende de p38 MAPK [14]. En consecuencia, el MPK-1 inducido por BCG puede ser inhibido por inhibidores de p38 MAPK y ERK1/2. Curiosamente, se ha demostrado que la degradación del MPK-1 se reduce después de la fosforilación ERK1/2 [15]. Se puede hipotetizar que las proteínas inducidas por BCG MKP-1 pueden ser estabilizadas por ERK1/2 y los mecanismos detallados involucrados requieren más exploración. También, ya que la inhibición de la expresión de MKP-1 por ambos inhibidores (para p38 MAPK y ERK1/ 2) no fue completa, se cree que otras Sobre la base de los resultados de la literatura sobre los efectos de LPS (Figura 6 ), la expectativa original para este proyecto es que el MPK-1 actúa como regulador negativo. Los macrófagos peritoneales estimulados por el MPK-1 KO mostraron una fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como un aumento de la producción de TNF-α [9]. Al hacerlo, la fosforilación inducida por el MPK-1 por el LPS podría disminuir por el MPK-1 siRNA previene la producción prolongada de TNF-α como en la sepsis, lo que puede conducir a un daño grave al huésped. Se esperaba que el BCG indujera el MPK-1 y su inducción se correlacionaría con la defosforilación de los MAPKs incluyendo p38 MAPK. Al bloquear el MKP-1 utilizando siRNA, se esperaba que hubiera aumentado la fosforilación p38 MAPK y la producción prolongada de TNF-α en respuesta a BCG. Sin embargo, nuestros resultados mostrados aquí son diametralmente opuestos. Una posibilidad para los resultados inesperados puede deberse a efectos no específicos de transfección o siRNA. Sin embargo, este no fue el caso ya que hubo una expresión prolongada y aumentada de TNF-α después de que los monocitos transfectados por siRNA del MKP-1 fueron tratados con LPS (Figura 4C ). Ahora hay una nueva hipótesis para explicar tales efectos paradójicos de MKP-1 en la regulación del TNF-α en la que la fosfatasa juega un papel en la regulación positiva de la producción de TNF-α en respuesta a BCG como en el caso de DUSP2 [13 Las estructuras de PKP-1 y DUSP2 son similares, con las que ambos contienen un dominio de interacción MAPK y un sitio catalítico de fosfatasa. Por el contrario, otros dominios DUSP pueden tener dominios adicionales, por ejemplo, PEST [6]. Aquí, postulamos que la función de PKP-1 en la señalización inducida por BCG es similar a la del DUSP2/PAC1. En realidad, el descubrimiento de DUSP2 ha creado inicialmente algunas preguntas paradójicas. Como se describe, DUSP2 se comporta de manera diferente a otros miembros de la familia MKP [13]. En los macrófagos DUSP2 KO tratados con LPS, produjeron menos mediadores inflamatorios incluyendo menos TNF, IL-6, óxido nítrico y células productoras de IL-12, en comparación con la de las contrapartes de tipo salvaje [13 De hecho, los resultados de estos estudios publicados sobre estudios DUSP2 son bastante similares a los de nuestros resultados reportados aquí. Es plausible que estas regulaciones positivas inesperadas de funciones de células inmunes por DUSP2 se deban a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. Se demostró que hay interacciones entre las vías JNK y ERK1/2 [16]. Aquí, demostramos que la activación sostenida de los bloques JNK de activación ERK (Figura 6 ). En la situación DUSP2, la estimulación de los mastocitos y macrófagos KO muestra un aumento de la fosforilación de JNK, e inhibición de JNK por su propio inhibidor específico restaura la fosforilación de ERK1/2 [13]. En la situación BCG-MPK-1, hay una fosforilación temprana de p38 MAPK y ERK Por lo tanto, es posible que JNK pueda jugar un papel en la interacción de crosstalk de MAPK. Sin embargo, nuestros datos preliminares sugieren que el nivel de JNK fosforilado no fue aumentado en PBMo MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana Figura 6 MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana. Modelo LPS fue proporcionado de acuerdo con los hallazgos de la literatura (Izquierda). En este escenario, LPS activa MKP-1, que a su vez defosforila y desactiva fosfo-p38 MAPK, resultando en menos inducción TNF-α. Sin embargo, la situación en la activación DHP-HSA de DUSP2 es más complicada (Middle), ya que la actividad fosfatasa causa la inhibición posterior de fosfo-JNK que conduce a la derrepresión de fosfo-p38 MAPK. En consecuencia, los efectos combinados de esta cascada resultan en más expresión TNF-α. El inesperado papel antimicobacterial del MBP-1 (Right) puede explicarse por eventos similares a los efectos DUSP2. En este caso (Right), hubo una inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MBP-1, y el factor desconocido a su vez inhibe la activación MAPKs que conduce a más inducción TNF-α. Los detalles y los objetivos de la cinasa aún no se han identificado. transfectado con MBP-1 siRNNA (datos no mostrados). Así, los detalles de Aquí presentamos un modelo para resumir los resultados e hipotetizar la existencia de un factor o factores intermedios aún no identificados en las vías aguas abajo de los efectos del MPK-1 en la cascada de señalización inducida por el BCG. El inesperado papel antimicobacteriano del MPK-1 (Figura 6 ) puede explicarse por eventos similares a los efectos del DUSP2. En este caso, el BCG induce la expresión del MPK-1 mientras activa también los MAPKs incluyendo p38 MAPK y ERK1/2. Downstream del MPKP-1, hay una inhibición de vías desconocidas o cinasas. El factor desconocido a su vez inhibe la activación del MAPKs, que finalmente conduce a más inducción del TNF-α (Figura 6 ). En resumen, el MPK-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citoquinas sobre la infección micobacteriana. La inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MPK-1, que a su vez inhibe la activación de los MAPK, puede utilizarse para explicar la función novedosa del MPK-1 en la mejora de la actividad de MAPK y la consiguiente expresión TNF-α después del tratamiento con BCG (Figura 6 ). Tomado en conjunto, el papel de los crosstalks de MAPK necesita exploración adicional. (3) TNF-α, 30 ciclos (TM = 56°C), aguas arriba, 5'-GGGCTAGGCGGTGTTC-3', aguas abajo, 5'-AGACGCGGGCGCGGTGATGG-3'. Los productos PCR fueron analizados en un gel de agarosa del 1% con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta. Para comprobar el tamaño de los productos PCR, 1 kb Plus ADN Lad-der Para la realización de QPCR, los niveles de MKP-1 y TNF-α mRNA, así como el gen de referencia GAPDH (como control interno) fueron analizados por los kits de reactivos de prueba de demanda específicos del gen (Aplicated Biosystems, EE.UU.). Todas las muestras se ejecutaron en duplicados o triplicados y sin controles de plantillas en un detector de secuencias de prisma ABI 7700. El método de análisis de QPCR fue el método del número de ciclo comparativo al umbral (C T ) descrito en el boletín del usuario no 2 del sistema de detección de secuencias de prisma ABI 7700. El número de C T de los genes objetivo se normalizó al de GAPDH en cada muestra (ΔC T ). El valor de C T de las células tratadas se comparó con el de las células tratadas sin tratamiento o simulacro ( La expresión génica relativa de los genes objetivo (inducción doble) se calculó como 2 -CT. Las proteínas celulares totales fueron extraídas por células lising en tampón de lisis que contiene 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (pH 8,0), 1% SDS, 0,2 mg/ml PMSF, 1 μg/ml aprotinina, 1 mM de ortovanadato sódico, 2 μg/ml de peptatina, 2 μg/ml de leupeptina y 50 mM de fluoruro sódico durante 5 minutos. El homogenato fue hervido durante 10 minutos y almacenado a -70°C hasta su uso. Las concentraciones de proteína total en extractos celulares fueron determinadas por BCATM Protein Assay Kit (Pierce, IL, EE.UU.). Western blot se realizó como se describe [20]. Cantidades iguales de proteína fueron separadas por 10% SDS-PAGE, electrobloqueadas en membranas nitrocelulosas (Schleicher & Schuell), y seguidas de sondeo con anticuerpos específicos para Actin, MKP-1 (Santa Cruz Biotech., EE.UU.), fosfo-p38 MAPK, fosfo-ERK1/2 (Cell Signaling, EE.UU.). Después de tres lavados, las membranas fueron incubadas con los anticuerpos secundarios correspondientes. Las bandas fueron detectadas utilizando el Sistema Chemiluminiscence mejorado (Amersham Pharmacia Biotech) como instrucciones del fabricante. La transfección de siRNA El siRNA MKP-1 incluyó: i) MLP1-HSS102982, AAACGCUUCGUAUCUCCUUGAGG; ii) MLP1-HSS102983, UUAUGCCCAAGGCAUCCAG-CAUGUC; y iii) MLP1-HSS102984, UGAUG-GAGUCUAUGAAGUCAAugGGC. El derribo del MLP-1 en PBMo se llevó a cabo utilizando solamente MLP1-HSS102983 o un grupo de los tres MKP-1 StealthTM Select RNAi (ratio = 1:1:1, 200 nM, Invitrogen, USA). StealthTM RNAi Negative Control Duplex (200 nM) se utilizó como control de efectos independientes de secuencia para la transfección de siRN La transfección de monocitos se realizó mediante el reactivo de transfección de ADN jetPEITM (Polyplus Transfection, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de transfectar las células durante 24 h, los transfectantes fueron tratados con diferentes inductores como se describe anteriormente. El análisis estadístico fue realizado por la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los valores de p fueron inferiores a 0,05.

¿Cuántos nuevos casos de tuberculosis hay cada año en todo el mundo?

Una nueva función antimicobacteriana de la proteína quinasa fosfatasa activada por mitogenos-1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2804704/SHA: f6ed1f1e9999e57793addb1c9c54c61c7861a995Autores: Cheung, Benny KW; Yim, Howard CH; Lee, Norris CM; Lau, Allan SYDate: 2009-12-17DOI: 10.1186/1471-2172-10-64Licencia: cc-byAbstract: ANTERIORDANTE: Mycobacterium tuberculosis (MTB) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Para combatir este patógeno, las células inmunitarias liberan citocinas incluyendo el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), que es fundamental en el desarrollo de granulomas protectores. Nuestros resultados anteriores mostraron que Bacillus Calmette Guerin (BCG), un micobacterio utilizado como modelo para investigar la respuesta inmune contra MTB, estimula la inducción de TNF-α a través de la proteína quinasa activada por mitogenos (MAPK) en los monocitos sanguíneos humanos. Dado que MAPK phosphatasa-1 (MPK-1) es conocido por regular las actividades de MAPK, examinamos si el MPK-1 juega un papel en la activación de la MAPK inducida por BCG y la expresión de citoquinas. RESULTADOS: Los monocitos sanguíneos primarios humanos fueron tratados con BCG y analizados para la expresión de MKP-1. Además, la inducción del MPK-1 fue regulada por p38 MAPK y quinasa 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2). Sorprendentemente, cuando la expresión del MPK-1 fue bloqueada por su siRNA específico, hubo una disminución significativa en los niveles de fosfo-MAPK (p38 MAPK y ERK1/2) y TNF-α inducible por BCG. CONCLUSIONES: Dado que el TNF-α es fundamental en la formación de granuloma, los resultados indicaron una función positiva inesperada del MPK-1 contra la infección micobacterial en contraposición a su actividad habitual de fosfatasa. Texto: La tuberculosis (TB) sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo, especialmente en los países en desarrollo [1]. La enfermedad es causada por Mycobacterium tuberculosis (MTB) y aproximadamente un tercio de la población mundial ha sido infectada En un informe reciente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que hay 9,2 millones de nuevos casos de tuberculosis en todo el mundo en 2006 [1]. En respuesta a la infección por MTB, la inducción de citocinas por células inmunitarias es un importante mecanismo de defensa. Los macrófagos infectados secretan factores de señalización intercelular, citoquinas proinflamatorias, para mediar la respuesta inflamatoria que conduce a la formación de granuloma e inducción de inmunidad mediada por células T [2]. Para entender la patogénesis de la tuberculosis, las vías de señalización inducidas por micobacterias han sido motivo de interés desde hace mucho tiempo. Informes anteriores han demostrado que p38 MAPK y ERK1/2 son necesarios en la inducción de la expresión TNF-α en monocitos humanos infectados con M. tuberculosis H37Rv [4]. Hemos revelado además el papel significativo de los MAPK en los eventos de transducción de señales de activación micobacteriana de monocitos sanguíneos primarios humanos (PBMo) que conducen a expresiones citocinas a través de la interacción con PKR [5]. Sin embargo, los eventos posteriores en cuanto a cómo se regula MAPK y cómo tal regulación afecta a la producción de citocinas en respuesta a micobacterias siguen siendo elucidadas. Puesto que los MAPK se activan por fosforilación, la desfosforilación de los MAPK parece ser un proceso eficiente para inactivar sus actividades. Los ejemplos de estas fosfatasas incluyen fosfatasas de tirosina, fosfatasas de serina/treonina y fosfatasas de doble especificidad (DUSPs). Algunas fosfatasas de DUSPs también se conocen como fosfatasas de MAPK (MPK) [6] [7]. Actualmente, hay al menos 10 PHPs identificados, mientras que el MKP-1 es el miembro más estudiado de la familia. El papel regulador del PKP-1 en la inducción de citoquinas se demuestra mejor por los macrófagos de KKP-1 (KO) en respuesta al lipopolisacárido (LPS), un componente de pared celular de las bacterias Gram-negativas. Los macrófagos de PKP-1 mostraron fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como una mayor producción de TNF-α en respuesta Consistente con estos resultados, otro grupo reveló además que los macrófagos derivados de la médula ósea KO-MPK-1 tratados con LPS muestran una mayor actividad de unión al ADN AP-1 [10]. También mostraron que la expresión del MPK-1 inducida por LPS depende del factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) y del adaptador que contiene el dominio TIR induciendo IFN-β (TRIF) [10], demostrando así el papel del MPKP-1 en la transducción de señales. No sólo el LPS, otros inductores del TLR incluyendo CpG, peptidoglicano, poli CI y Pam 3 Cys pueden regular las expresiones citoquinas incluyendo TNF-α, IL-10 a través de las actividades del MPKP-1 [10, 11]. En estos procesos, el MPKP-1 sirve para mitigar los efectos indeseables del shock séptico y mantener Otro ejemplo de la función MPK-1 es la respuesta inmune a Staphylococcus aureus (S. aureus), una bacteria Gram positiva. Hay niveles más altos de producción de citocinas incluyendo TNF-α, IL-6, y MIP-1α en ratones MKP-1 KO infectados con S. aureus [12]. Además, los ratones tendrían un rápido desarrollo de disfunción multiorgánica, así como una tasa de mortalidad más rápida en caso de desafío con S. aureus matados por calor [12]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que MKP-1 protege al huésped de la sobreactivación del sistema inmunitario en respuesta a bacterias Gram negativo o Gram positivo. En el pasado, se creía que diferentes miembros de la familia MKP/DUSP tienen funciones superpuestas. Sin embargo, la aparición de DUSP2 cambió el concepto hacia abajo [13]. Se En las células DUSP2 KO, produjeron menos mediadores inflamatorios, lo que implica que DUSP2 puede desempeñar un papel en la mediación en lugar de limitar la inflamación. Para los casos, cuando los macrófagos DUSP2 KO fueron tratados con LPS, hubo menos receptores de TNF, IL-6, óxido nítrico, IL-12, en comparación con los de las contrapartes del tipo salvaje [13]. Cuando los mastocitos derivados de la médula ósea DUSP2 KO fueron sensibilizados por primera vez con el receptor de inmunoglobulina E (IgE) (Fc.RI) y luego estimulados con antígeno estable dinitrofenol-calor, produjeron niveles más bajos de ARNmT, menor producción de IL-6, menor fosforilación de ERK1/2, p38 MAPK, y menos actividades transcripcionales por Elk1 y NF Estas inesperadas regulaciones positivas de funciones celulares inmunitarias por DUSP2 se han hipotetizado debido a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. La estimulación de los mastocitos KO y macrófagos mostró incrementos en la fosforilación de JNK. Además, la inhibición de JNK por inhibidores de moléculas pequeñas mostró incrementos en la fosforilación de ERK [13]. Los autores también mostraron que hubo interacciones físicas de DUSP2 con ERK2, DUSP2 con JNK2, así como DUSP2 y p38 MAPK después de la estimulación de las células con antígeno estable de dinitrofenol-calor. Sin embargo, los detalles de las conversaciones cruzadas entre MAPKs y fosfatasas necesitan mayor investigación. Así, la familia MKP juega un papel crítico en la regulación de las respuestas inmunes. La respuesta inmune innata protege al huésped de la infección por MTB por secreción de citocinas incluyendo TNF-α en células inmunitarias. Mientras tanto, MAPK es una de las proteínas críticas en la regulación de la inmunidad y la expresión de citoquinas. Dado que MAPK está regulado por MKP-1 en respuesta a LPS y la activación de MAPK es importante en la expresión de citoquinas inducidas por BCG, hipotetizamos que el MKP-1 juega un papel crítico en la regulación inmune de BCG en monocitos humanos. Examinamos la implicación del MKP-1 en la activación de MAPK inducida por BCG y su consiguiente expresión de citoquinas. Aquí presentamos evidencias de que el MKP-1 juega un papel inesperado en la regulación de la inducción de citoquinas por BCG a través de su control de la fosforilación de MAPK. Se ha reportado que muchos inductores incluyendo factores de crecimiento, LPS, peptidoglicano, y dexametasona pueden estimular la expresión de MKP-1 en macrófagos humanos, microglia, mastocitos o fibroblastos [6]. Para investigar el papel de diferentes inductores de TLR en el proceso de inducción de MKP-1 en monocitos sanguíneos humanos, el nivel de MKP-1 mRNA se midió mediante el método de reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR). PBMo se aisló de células mononucleares primarias de sangre humana y se estimuló con Pam 3 Cys (agonista TLR2), poli IC (agonista TLR3) o LPS (agonista TLR4) durante 1 y 3 horas. Tras la exposición a Pam 3 Cys o LPS, hubo inducciones significativas de los niveles Estos efectos sobre la inducción del MPKP-1 continuaron durante 3 horas después del tratamiento con Pam 3 Cys (Figura 1A ). Por el contrario, el poli CI no indujo el MPKP-1 (Figura 1A ). Los resultados indican que diferentes inductores mostraron una regulación diferencial de la expresión del MPKP-1. LPS ha sido ampliamente utilizado para demostrar el papel del MPKP-1 en la respuesta inmune tanto in vivo como in vitro [9, 12]. Para establecer una base para la interpretación de los resultados experimentales posteriores, se utilizó el LPS como un control positivo para la inducción de la expresión del MPKP-1. Para determinar los niveles del MPKP-1 en respuesta al LPS, la cinética de la transcripción del MPKP-1 fue determinada por el QPCR. Hubo una inducción significativa del MPKP-1 mRNA, que alcanzó su punto máximo tan temprano como 1 hora Estos resultados mostraron que LPS indujo la expresión MCP-1 (Figura 1B). A continuación, para demostrar la inducción de fosfatasas específicas por BCG, se estudió la cinética de la expresión MCP-1 en PBMo utilizando QPCR durante el tratamiento BCG. Similar a los resultados producidos por LPS, con la adición de BCG (MOI = 1 CFU/celda), hubo una inducción significativa de MKP-1 mRNA dentro de 1 hora de tratamiento BCG determinado por la sonda Taqman específica para MCP-1 (Figura 2A ). Los efectos duraron al menos 6 horas (Figura 2A ). Para examinar si los cambios en la producción proteica fueron paralelos a los niveles de mRNA, los niveles proteicos de MKP-1 fueron medidos por Western blotting. En respuesta a B Los niveles proteicos se mantuvieron durante 2 horas y disminuyeron a los niveles basales a las 3 horas (Figura 2B ). Los resultados demostraron que hubo inducción MKP-1 en respuesta a la activación de BCG en monocitos humanos. Se ha demostrado que la inhibición de p38 MAPK bien por inhibidor específico o siRNA redujo la expresión de MKP-1 en macrófagos tratados con LPS o peptidoglicano [14]. Para determinar los mecanismos involucrados en la expresión BCG inducida por MKP-1, PBMo fue pretratado con varios inhibidores incluyendo PD98059 (inhibidor de MAP quinasa [MEK] o ERK1/2), SB203580 (inhibidor de p38 MAPK), SP600125 (inhibidor de JNK), y CAPE (inhibidor de NF- Se utilizó un rango de concentraciones de cada inhibidor para probar sus concentraciones óptimas y efectos sobre la viabilidad celular y las inhibiciones de la cinasa. Posteriormente se añadió BCG y se recogió el ARN total. Los resultados demostraron que, con la inhibición de las actividades de ERK1/2 y p38 MAPK por sus correspondientes inhibidores relativamente específicos, las expresiones MKP-1 se redujeron significativamente (Figura 3 ). Además, utilizando dosis más altas de SB203580, se demostró que la inhibición se incrementa aún más (datos no mostrados). Por el contrario, el pretratamiento de las células con CAPE y SP600125 no afectó a la inducción de MKP-1 por BCG (Figura 3 ). Estos resultados sugieren que la expresión inducida por BCG MKP-1 es dependiente tanto de p38 MAPK como de ERK1/2. A lo largo de los experimentos anteriores, el objetivo principal fue Así, para examinar más a fondo el papel del MPKP-1 en la señalización inducida por BCG, se utilizó la transfección de siRNA en PBMo para derribar la actividad del MPKP-1. Para demostrar que el MPKP-1 siRNA puede efectivamente derribar el gen objetivo, PBMo fue primero transfectado con control o MKP-1 siRNA y luego tratado con BCG durante 3 horas. Los niveles de MKP-1 mRNA fueron medidos por el método RT-PCR. En la Figura 4A, BCG estimuló la expresión MKP-1 (lanes 1 y 2). En MKP-1 siRNA transfectó monocitos, la inducción de MKP-1 por BCG fue significativamente disminuida (lanes 2 y 4). Los resultados mostraron que el siRNA hace abrogar los niveles de MKP-1 mRNA. Para determinar si el siRNA MKP-1 afecta al BCG inducido MKP-1 a niveles proteicos, PBMo fue tratado como arriba y las proteínas MKP-1 fueron medidas por Western blotting. Los resultados mostraron que el BCG podría inducir proteínas MKP-1 como de costumbre para células transfectadas con control siRNA (Figura 4B, carriles 1-3). Sin embargo, los niveles de BCG inducido expresión proteica MKP-1 fueron reducidos en células transfectadas con siRNA MKP-1 (Figura 4B, carriles 4-6). Juntos, los resultados sugieren que el siRNA MKP-1 no sólo redujo el MKP-1 mRNA en el tratamiento BCG sino que también abrogó la proteína MKP-1 inducida por BCG. Como se indica en la literatura [9], los ratones MKP-1 KO mostraron aumento de la producción Sobre la base de los resultados anteriores de siRNA del MPK-1, se utilizó LPS como control para demostrar los efectos de este sistema siRNA del MPK-1. La expresión citoquina inducida por LPS en células transfectadas de siRNA del MPK-1 sugiere que el sistema siRNA es eficaz para derribar la expresión del MPK-1 y que el MPK-1 actúa como regulador negativo en la expresión del TNF-α inducida por LPS. Para investigar el efecto del siRNA del MPK-1 en la expresión de citoquina inducida por BCG, los niveles de TNF-α, IL-6 e IL-10 mRNA se midieron por el método QPCR. PBMo fueron transfectados con control o MKP-1 siRNA. Después de la exposición al BCG con control siRNA, hubo inducciones significativas de TNF-α, IL-6 e IL-10 m A continuación, se examinaron los efectos del siRNA-MCP-1 en la expresión citoquina inducida por BCG. Sorprendentemente, hubo una abrogación significativa de la expresión TNF-α inducida por BCG por MKP-1 siRNA (Figura 4D ). Con la caída del siRNA-MCP-1, el nivel de TNF-α inducido por BCG fue sólo 60% comparado con el de las células de control, mientras que el IL-6 e IL-10 inducidos por BCG fueron sin cambios en las células transfectadas por MKP-1 siRNA. Los resultados revelaron que el MKP-1 juega un papel en la inducción de la expresión TNF-α sobre la estimulación BCG, que puede ser diferente a la de sus funciones convencionales en las que el MKP-1 actúa como regulador negativo en las vías de señalización inducidas por LPS [7]. El estado de fosforilación de los MAPK fue evaluado en control o siRNA del MPK-1 transfectado PBMo. Los resultados de Western blocking demostraron que BCG indujo tanto la fosforilación p38 como la ERK1/2 en 15 minutos (datos no mostrados) y alcanzó su punto máximo en 30 minutos, y luego regresó a los niveles basales en células tratadas con el siRNA del control (Figura 5). Al igual que los resultados de la expresión de citoquinas, la fosforilación de ambos p38 MAPK y ERK1/2 en respuesta a BCG fue disminuida en monocitos transfectados con siRNA del MPK-1 en lugar del esperado aumento de fosforilación (Figura 5). Los resultados sugieren que la reducción del nivel de producción de TNF-α en monocitos estimulados por BCG se debe a la reducción de la fosforilación de MAPK por MKP-1 siRNA. Este informe presentó evidencias de que una nueva función de MKP-1 se descubre en la regulación de citoquinas en respuesta a la infección micobacteriana. BCG induce el MKP-1 como respuesta rápida (Figura 2). El mecanismo de inducción del MKP-1 por BCG depende tanto de ERK1/2 como de p38 MAPK (Figura 3). Utilizando el enfoque de siRNA, las funciones del MKP-1 se pueden examinar en monocitos humanos primarios. Los resultados mostraron que la activación de los MAPK inducidos por BCG, así como la expresión de citoquinas, son aguas abajo del MKP-1 (Figuras 4D y 5). Por lo tanto, el MPK-1 es una molécula de señalización crítica que está involucrada en la expresión de citoquinas inducidas por BCG. Informes anteriores han demostrado que el MPK-1 inducido por LPS o peptidoglicano depende de p38 MAPK [14]. En consecuencia, el MPK-1 inducido por BCG puede ser inhibido por inhibidores de p38 MAPK y ERK1/2. Curiosamente, se ha demostrado que la degradación del MPK-1 se reduce después de la fosforilación ERK1/2 [15]. Se puede hipotetizar que las proteínas inducidas por BCG MKP-1 pueden ser estabilizadas por ERK1/2 y los mecanismos detallados involucrados requieren más exploración. También, ya que la inhibición de la expresión de MKP-1 por ambos inhibidores (para p38 MAPK y ERK1/ 2) no fue completa, se cree que otras Sobre la base de los resultados de la literatura sobre los efectos de LPS (Figura 6 ), la expectativa original para este proyecto es que el MPK-1 actúa como regulador negativo. Los macrófagos peritoneales estimulados por el MPK-1 KO mostraron una fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como un aumento de la producción de TNF-α [9]. Al hacerlo, la fosforilación inducida por el MPK-1 por el LPS podría disminuir por el MPK-1 siRNA previene la producción prolongada de TNF-α como en la sepsis, lo que puede conducir a un daño grave al huésped. Se esperaba que el BCG indujera el MPK-1 y su inducción se correlacionaría con la defosforilación de los MAPKs incluyendo p38 MAPK. Al bloquear el MKP-1 utilizando siRNA, se esperaba que hubiera aumentado la fosforilación p38 MAPK y la producción prolongada de TNF-α en respuesta a BCG. Sin embargo, nuestros resultados mostrados aquí son diametralmente opuestos. Una posibilidad para los resultados inesperados puede deberse a efectos no específicos de transfección o siRNA. Sin embargo, este no fue el caso ya que hubo una expresión prolongada y aumentada de TNF-α después de que los monocitos transfectados por siRNA del MKP-1 fueron tratados con LPS (Figura 4C ). Ahora hay una nueva hipótesis para explicar tales efectos paradójicos de MKP-1 en la regulación del TNF-α en la que la fosfatasa juega un papel en la regulación positiva de la producción de TNF-α en respuesta a BCG como en el caso de DUSP2 [13 Las estructuras de PKP-1 y DUSP2 son similares, con las que ambos contienen un dominio de interacción MAPK y un sitio catalítico de fosfatasa. Por el contrario, otros dominios DUSP pueden tener dominios adicionales, por ejemplo, PEST [6]. Aquí, postulamos que la función de PKP-1 en la señalización inducida por BCG es similar a la del DUSP2/PAC1. En realidad, el descubrimiento de DUSP2 ha creado inicialmente algunas preguntas paradójicas. Como se describe, DUSP2 se comporta de manera diferente a otros miembros de la familia MKP [13]. En los macrófagos DUSP2 KO tratados con LPS, produjeron menos mediadores inflamatorios incluyendo menos TNF, IL-6, óxido nítrico y células productoras de IL-12, en comparación con la de las contrapartes de tipo salvaje [13 De hecho, los resultados de estos estudios publicados sobre estudios DUSP2 son bastante similares a los de nuestros resultados reportados aquí. Es plausible que estas regulaciones positivas inesperadas de funciones de células inmunes por DUSP2 se deban a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. Se demostró que hay interacciones entre las vías JNK y ERK1/2 [16]. Aquí, demostramos que la activación sostenida de los bloques JNK de activación ERK (Figura 6 ). En la situación DUSP2, la estimulación de los mastocitos y macrófagos KO muestra un aumento de la fosforilación de JNK, e inhibición de JNK por su propio inhibidor específico restaura la fosforilación de ERK1/2 [13]. En la situación BCG-MPK-1, hay una fosforilación temprana de p38 MAPK y ERK Por lo tanto, es posible que JNK pueda jugar un papel en la interacción de crosstalk de MAPK. Sin embargo, nuestros datos preliminares sugieren que el nivel de JNK fosforilado no fue aumentado en PBMo MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana Figura 6 MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana. Modelo LPS fue proporcionado de acuerdo con los hallazgos de la literatura (Izquierda). En este escenario, LPS activa MKP-1, que a su vez defosforila y desactiva fosfo-p38 MAPK, resultando en menos inducción TNF-α. Sin embargo, la situación en la activación DHP-HSA de DUSP2 es más complicada (Middle), ya que la actividad fosfatasa causa la inhibición posterior de fosfo-JNK que conduce a la derrepresión de fosfo-p38 MAPK. En consecuencia, los efectos combinados de esta cascada resultan en más expresión TNF-α. El inesperado papel antimicobacterial del MBP-1 (Right) puede explicarse por eventos similares a los efectos DUSP2. En este caso (Right), hubo una inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MBP-1, y el factor desconocido a su vez inhibe la activación MAPKs que conduce a más inducción TNF-α. Los detalles y los objetivos de la cinasa aún no se han identificado. transfectado con MBP-1 siRNNA (datos no mostrados). Así, los detalles de Aquí presentamos un modelo para resumir los resultados e hipotetizar la existencia de un factor o factores intermedios aún no identificados en las vías aguas abajo de los efectos del MPK-1 en la cascada de señalización inducida por el BCG. El inesperado papel antimicobacteriano del MPK-1 (Figura 6 ) puede explicarse por eventos similares a los efectos del DUSP2. En este caso, el BCG induce la expresión del MPK-1 mientras activa también los MAPKs incluyendo p38 MAPK y ERK1/2. Downstream del MPKP-1, hay una inhibición de vías desconocidas o cinasas. El factor desconocido a su vez inhibe la activación del MAPKs, que finalmente conduce a más inducción del TNF-α (Figura 6 ). En resumen, el MPK-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citoquinas sobre la infección micobacteriana. La inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MPK-1, que a su vez inhibe la activación de los MAPK, puede utilizarse para explicar la función novedosa del MPK-1 en la mejora de la actividad de MAPK y la consiguiente expresión TNF-α después del tratamiento con BCG (Figura 6 ). Tomado en conjunto, el papel de los crosstalks de MAPK necesita exploración adicional. (3) TNF-α, 30 ciclos (TM = 56°C), aguas arriba, 5'-GGGCTAGGCGGTGTTC-3', aguas abajo, 5'-AGACGCGGGCGCGGTGATGG-3'. Los productos PCR fueron analizados en un gel de agarosa del 1% con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta. Para comprobar el tamaño de los productos PCR, 1 kb Plus ADN Lad-der Para la realización de QPCR, los niveles de MKP-1 y TNF-α mRNA, así como el gen de referencia GAPDH (como control interno) fueron analizados por los kits de reactivos de prueba de demanda específicos del gen (Aplicated Biosystems, EE.UU.). Todas las muestras se ejecutaron en duplicados o triplicados y sin controles de plantillas en un detector de secuencias de prisma ABI 7700. El método de análisis de QPCR fue el método del número de ciclo comparativo al umbral (C T ) descrito en el boletín del usuario no 2 del sistema de detección de secuencias de prisma ABI 7700. El número de C T de los genes objetivo se normalizó al de GAPDH en cada muestra (ΔC T ). El valor de C T de las células tratadas se comparó con el de las células tratadas sin tratamiento o simulacro ( La expresión génica relativa de los genes objetivo (inducción doble) se calculó como 2 -CT. Las proteínas celulares totales fueron extraídas por células lising en tampón de lisis que contiene 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (pH 8,0), 1% SDS, 0,2 mg/ml PMSF, 1 μg/ml aprotinina, 1 mM de ortovanadato sódico, 2 μg/ml de peptatina, 2 μg/ml de leupeptina y 50 mM de fluoruro sódico durante 5 minutos. El homogenato fue hervido durante 10 minutos y almacenado a -70°C hasta su uso. Las concentraciones de proteína total en extractos celulares fueron determinadas por BCATM Protein Assay Kit (Pierce, IL, EE.UU.). Western blot se realizó como se describe [20]. Cantidades iguales de proteína fueron separadas por 10% SDS-PAGE, electrobloqueadas en membranas nitrocelulosas (Schleicher & Schuell), y seguidas de sondeo con anticuerpos específicos para Actin, MKP-1 (Santa Cruz Biotech., EE.UU.), fosfo-p38 MAPK, fosfo-ERK1/2 (Cell Signaling, EE.UU.). Después de tres lavados, las membranas fueron incubadas con los anticuerpos secundarios correspondientes. Las bandas fueron detectadas utilizando el Sistema Chemiluminiscence mejorado (Amersham Pharmacia Biotech) como instrucciones del fabricante. La transfección de siRNA El siRNA MKP-1 incluyó: i) MLP1-HSS102982, AAACGCUUCGUAUCUCCUUGAGG; ii) MLP1-HSS102983, UUAUGCCCAAGGCAUCCAG-CAUGUC; y iii) MLP1-HSS102984, UGAUG-GAGUCUAUGAAGUCAAugGGC. El derribo del MLP-1 en PBMo se llevó a cabo utilizando solamente MLP1-HSS102983 o un grupo de los tres MKP-1 StealthTM Select RNAi (ratio = 1:1:1, 200 nM, Invitrogen, USA). StealthTM RNAi Negative Control Duplex (200 nM) se utilizó como control de efectos independientes de secuencia para la transfección de siRN La transfección de monocitos se realizó mediante el reactivo de transfección de ADN jetPEITM (Polyplus Transfection, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de transfectar las células durante 24 h, los transfectantes fueron tratados con diferentes inductores como se describe anteriormente. El análisis estadístico fue realizado por la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los valores de p fueron inferiores a 0,05.

¿Cómo se activa MAPK?

Una nueva función antimicobacteriana de la proteína quinasa fosfatasa activada por mitogenos-1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2804704/SHA: f6ed1f1e9999e57793addb1c9c54c61c7861a995Autores: Cheung, Benny KW; Yim, Howard CH; Lee, Norris CM; Lau, Allan SYDate: 2009-12-17DOI: 10.1186/1471-2172-10-64Licencia: cc-byAbstract: ANTERIORDANTE: Mycobacterium tuberculosis (MTB) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Para combatir este patógeno, las células inmunitarias liberan citocinas incluyendo el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), que es fundamental en el desarrollo de granulomas protectores. Nuestros resultados anteriores mostraron que Bacillus Calmette Guerin (BCG), un micobacterio utilizado como modelo para investigar la respuesta inmune contra MTB, estimula la inducción de TNF-α a través de la proteína quinasa activada por mitogenos (MAPK) en los monocitos sanguíneos humanos. Dado que MAPK phosphatasa-1 (MPK-1) es conocido por regular las actividades de MAPK, examinamos si el MPK-1 juega un papel en la activación de la MAPK inducida por BCG y la expresión de citoquinas. RESULTADOS: Los monocitos sanguíneos primarios humanos fueron tratados con BCG y analizados para la expresión de MKP-1. Además, la inducción del MPK-1 fue regulada por p38 MAPK y quinasa 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2). Sorprendentemente, cuando la expresión del MPK-1 fue bloqueada por su siRNA específico, hubo una disminución significativa en los niveles de fosfo-MAPK (p38 MAPK y ERK1/2) y TNF-α inducible por BCG. CONCLUSIONES: Dado que el TNF-α es fundamental en la formación de granuloma, los resultados indicaron una función positiva inesperada del MPK-1 contra la infección micobacterial en contraposición a su actividad habitual de fosfatasa. Texto: La tuberculosis (TB) sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo, especialmente en los países en desarrollo [1]. La enfermedad es causada por Mycobacterium tuberculosis (MTB) y aproximadamente un tercio de la población mundial ha sido infectada En un informe reciente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que hay 9,2 millones de nuevos casos de tuberculosis en todo el mundo en 2006 [1]. En respuesta a la infección por MTB, la inducción de citocinas por células inmunitarias es un importante mecanismo de defensa. Los macrófagos infectados secretan factores de señalización intercelular, citoquinas proinflamatorias, para mediar la respuesta inflamatoria que conduce a la formación de granuloma e inducción de inmunidad mediada por células T [2]. Para entender la patogénesis de la tuberculosis, las vías de señalización inducidas por micobacterias han sido motivo de interés desde hace mucho tiempo. Informes anteriores han demostrado que p38 MAPK y ERK1/2 son necesarios en la inducción de la expresión TNF-α en monocitos humanos infectados con M. tuberculosis H37Rv [4]. Hemos revelado además el papel significativo de los MAPK en los eventos de transducción de señales de activación micobacteriana de monocitos sanguíneos primarios humanos (PBMo) que conducen a expresiones citocinas a través de la interacción con PKR [5]. Sin embargo, los eventos posteriores en cuanto a cómo se regula MAPK y cómo tal regulación afecta a la producción de citocinas en respuesta a micobacterias siguen siendo elucidadas. Puesto que los MAPK se activan por fosforilación, la desfosforilación de los MAPK parece ser un proceso eficiente para inactivar sus actividades. Los ejemplos de estas fosfatasas incluyen fosfatasas de tirosina, fosfatasas de serina/treonina y fosfatasas de doble especificidad (DUSPs). Algunas fosfatasas de DUSPs también se conocen como fosfatasas de MAPK (MPK) [6] [7]. Actualmente, hay al menos 10 PHPs identificados, mientras que el MKP-1 es el miembro más estudiado de la familia. El papel regulador del PKP-1 en la inducción de citoquinas se demuestra mejor por los macrófagos de KKP-1 (KO) en respuesta al lipopolisacárido (LPS), un componente de pared celular de las bacterias Gram-negativas. Los macrófagos de PKP-1 mostraron fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como una mayor producción de TNF-α en respuesta Consistente con estos resultados, otro grupo reveló además que los macrófagos derivados de la médula ósea KO-MPK-1 tratados con LPS muestran una mayor actividad de unión al ADN AP-1 [10]. También mostraron que la expresión del MPK-1 inducida por LPS depende del factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) y del adaptador que contiene el dominio TIR induciendo IFN-β (TRIF) [10], demostrando así el papel del MPKP-1 en la transducción de señales. No sólo el LPS, otros inductores del TLR incluyendo CpG, peptidoglicano, poli CI y Pam 3 Cys pueden regular las expresiones citoquinas incluyendo TNF-α, IL-10 a través de las actividades del MPKP-1 [10, 11]. En estos procesos, el MPKP-1 sirve para mitigar los efectos indeseables del shock séptico y mantener Otro ejemplo de la función MPK-1 es la respuesta inmune a Staphylococcus aureus (S. aureus), una bacteria Gram positiva. Hay niveles más altos de producción de citocinas incluyendo TNF-α, IL-6, y MIP-1α en ratones MKP-1 KO infectados con S. aureus [12]. Además, los ratones tendrían un rápido desarrollo de disfunción multiorgánica, así como una tasa de mortalidad más rápida en caso de desafío con S. aureus matados por calor [12]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que MKP-1 protege al huésped de la sobreactivación del sistema inmunitario en respuesta a bacterias Gram negativo o Gram positivo. En el pasado, se creía que diferentes miembros de la familia MKP/DUSP tienen funciones superpuestas. Sin embargo, la aparición de DUSP2 cambió el concepto hacia abajo [13]. Se En las células DUSP2 KO, produjeron menos mediadores inflamatorios, lo que implica que DUSP2 puede desempeñar un papel en la mediación en lugar de limitar la inflamación. Para los casos, cuando los macrófagos DUSP2 KO fueron tratados con LPS, hubo menos receptores de TNF, IL-6, óxido nítrico, IL-12, en comparación con los de las contrapartes del tipo salvaje [13]. Cuando los mastocitos derivados de la médula ósea DUSP2 KO fueron sensibilizados por primera vez con el receptor de inmunoglobulina E (IgE) (Fc.RI) y luego estimulados con antígeno estable dinitrofenol-calor, produjeron niveles más bajos de ARNmT, menor producción de IL-6, menor fosforilación de ERK1/2, p38 MAPK, y menos actividades transcripcionales por Elk1 y NF Estas inesperadas regulaciones positivas de funciones celulares inmunitarias por DUSP2 se han hipotetizado debido a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. La estimulación de los mastocitos KO y macrófagos mostró incrementos en la fosforilación de JNK. Además, la inhibición de JNK por inhibidores de moléculas pequeñas mostró incrementos en la fosforilación de ERK [13]. Los autores también mostraron que hubo interacciones físicas de DUSP2 con ERK2, DUSP2 con JNK2, así como DUSP2 y p38 MAPK después de la estimulación de las células con antígeno estable de dinitrofenol-calor. Sin embargo, los detalles de las conversaciones cruzadas entre MAPKs y fosfatasas necesitan mayor investigación. Así, la familia MKP juega un papel crítico en la regulación de las respuestas inmunes. La respuesta inmune innata protege al huésped de la infección por MTB por secreción de citocinas incluyendo TNF-α en células inmunitarias. Mientras tanto, MAPK es una de las proteínas críticas en la regulación de la inmunidad y la expresión de citoquinas. Dado que MAPK está regulado por MKP-1 en respuesta a LPS y la activación de MAPK es importante en la expresión de citoquinas inducidas por BCG, hipotetizamos que el MKP-1 juega un papel crítico en la regulación inmune de BCG en monocitos humanos. Examinamos la implicación del MKP-1 en la activación de MAPK inducida por BCG y su consiguiente expresión de citoquinas. Aquí presentamos evidencias de que el MKP-1 juega un papel inesperado en la regulación de la inducción de citoquinas por BCG a través de su control de la fosforilación de MAPK. Se ha reportado que muchos inductores incluyendo factores de crecimiento, LPS, peptidoglicano, y dexametasona pueden estimular la expresión de MKP-1 en macrófagos humanos, microglia, mastocitos o fibroblastos [6]. Para investigar el papel de diferentes inductores de TLR en el proceso de inducción de MKP-1 en monocitos sanguíneos humanos, el nivel de MKP-1 mRNA se midió mediante el método de reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR). PBMo se aisló de células mononucleares primarias de sangre humana y se estimuló con Pam 3 Cys (agonista TLR2), poli IC (agonista TLR3) o LPS (agonista TLR4) durante 1 y 3 horas. Tras la exposición a Pam 3 Cys o LPS, hubo inducciones significativas de los niveles Estos efectos sobre la inducción del MPKP-1 continuaron durante 3 horas después del tratamiento con Pam 3 Cys (Figura 1A ). Por el contrario, el poli CI no indujo el MPKP-1 (Figura 1A ). Los resultados indican que diferentes inductores mostraron una regulación diferencial de la expresión del MPKP-1. LPS ha sido ampliamente utilizado para demostrar el papel del MPKP-1 en la respuesta inmune tanto in vivo como in vitro [9, 12]. Para establecer una base para la interpretación de los resultados experimentales posteriores, se utilizó el LPS como un control positivo para la inducción de la expresión del MPKP-1. Para determinar los niveles del MPKP-1 en respuesta al LPS, la cinética de la transcripción del MPKP-1 fue determinada por el QPCR. Hubo una inducción significativa del MPKP-1 mRNA, que alcanzó su punto máximo tan temprano como 1 hora Estos resultados mostraron que LPS indujo la expresión MCP-1 (Figura 1B). A continuación, para demostrar la inducción de fosfatasas específicas por BCG, se estudió la cinética de la expresión MCP-1 en PBMo utilizando QPCR durante el tratamiento BCG. Similar a los resultados producidos por LPS, con la adición de BCG (MOI = 1 CFU/celda), hubo una inducción significativa de MKP-1 mRNA dentro de 1 hora de tratamiento BCG determinado por la sonda Taqman específica para MCP-1 (Figura 2A ). Los efectos duraron al menos 6 horas (Figura 2A ). Para examinar si los cambios en la producción proteica fueron paralelos a los niveles de mRNA, los niveles proteicos de MKP-1 fueron medidos por Western blotting. En respuesta a B Los niveles proteicos se mantuvieron durante 2 horas y disminuyeron a los niveles basales a las 3 horas (Figura 2B ). Los resultados demostraron que hubo inducción MKP-1 en respuesta a la activación de BCG en monocitos humanos. Se ha demostrado que la inhibición de p38 MAPK bien por inhibidor específico o siRNA redujo la expresión de MKP-1 en macrófagos tratados con LPS o peptidoglicano [14]. Para determinar los mecanismos involucrados en la expresión BCG inducida por MKP-1, PBMo fue pretratado con varios inhibidores incluyendo PD98059 (inhibidor de MAP quinasa [MEK] o ERK1/2), SB203580 (inhibidor de p38 MAPK), SP600125 (inhibidor de JNK), y CAPE (inhibidor de NF- Se utilizó un rango de concentraciones de cada inhibidor para probar sus concentraciones óptimas y efectos sobre la viabilidad celular y las inhibiciones de la cinasa. Posteriormente se añadió BCG y se recogió el ARN total. Los resultados demostraron que, con la inhibición de las actividades de ERK1/2 y p38 MAPK por sus correspondientes inhibidores relativamente específicos, las expresiones MKP-1 se redujeron significativamente (Figura 3 ). Además, utilizando dosis más altas de SB203580, se demostró que la inhibición se incrementa aún más (datos no mostrados). Por el contrario, el pretratamiento de las células con CAPE y SP600125 no afectó a la inducción de MKP-1 por BCG (Figura 3 ). Estos resultados sugieren que la expresión inducida por BCG MKP-1 es dependiente tanto de p38 MAPK como de ERK1/2. A lo largo de los experimentos anteriores, el objetivo principal fue Así, para examinar más a fondo el papel del MPKP-1 en la señalización inducida por BCG, se utilizó la transfección de siRNA en PBMo para derribar la actividad del MPKP-1. Para demostrar que el MPKP-1 siRNA puede efectivamente derribar el gen objetivo, PBMo fue primero transfectado con control o MKP-1 siRNA y luego tratado con BCG durante 3 horas. Los niveles de MKP-1 mRNA fueron medidos por el método RT-PCR. En la Figura 4A, BCG estimuló la expresión MKP-1 (lanes 1 y 2). En MKP-1 siRNA transfectó monocitos, la inducción de MKP-1 por BCG fue significativamente disminuida (lanes 2 y 4). Los resultados mostraron que el siRNA hace abrogar los niveles de MKP-1 mRNA. Para determinar si el siRNA MKP-1 afecta al BCG inducido MKP-1 a niveles proteicos, PBMo fue tratado como arriba y las proteínas MKP-1 fueron medidas por Western blotting. Los resultados mostraron que el BCG podría inducir proteínas MKP-1 como de costumbre para células transfectadas con control siRNA (Figura 4B, carriles 1-3). Sin embargo, los niveles de BCG inducido expresión proteica MKP-1 fueron reducidos en células transfectadas con siRNA MKP-1 (Figura 4B, carriles 4-6). Juntos, los resultados sugieren que el siRNA MKP-1 no sólo redujo el MKP-1 mRNA en el tratamiento BCG sino que también abrogó la proteína MKP-1 inducida por BCG. Como se indica en la literatura [9], los ratones MKP-1 KO mostraron aumento de la producción Sobre la base de los resultados anteriores de siRNA del MPK-1, se utilizó LPS como control para demostrar los efectos de este sistema siRNA del MPK-1. La expresión citoquina inducida por LPS en células transfectadas de siRNA del MPK-1 sugiere que el sistema siRNA es eficaz para derribar la expresión del MPK-1 y que el MPK-1 actúa como regulador negativo en la expresión del TNF-α inducida por LPS. Para investigar el efecto del siRNA del MPK-1 en la expresión de citoquina inducida por BCG, los niveles de TNF-α, IL-6 e IL-10 mRNA se midieron por el método QPCR. PBMo fueron transfectados con control o MKP-1 siRNA. Después de la exposición al BCG con control siRNA, hubo inducciones significativas de TNF-α, IL-6 e IL-10 m A continuación, se examinaron los efectos del siRNA-MCP-1 en la expresión citoquina inducida por BCG. Sorprendentemente, hubo una abrogación significativa de la expresión TNF-α inducida por BCG por MKP-1 siRNA (Figura 4D ). Con la caída del siRNA-MCP-1, el nivel de TNF-α inducido por BCG fue sólo 60% comparado con el de las células de control, mientras que el IL-6 e IL-10 inducidos por BCG fueron sin cambios en las células transfectadas por MKP-1 siRNA. Los resultados revelaron que el MKP-1 juega un papel en la inducción de la expresión TNF-α sobre la estimulación BCG, que puede ser diferente a la de sus funciones convencionales en las que el MKP-1 actúa como regulador negativo en las vías de señalización inducidas por LPS [7]. El estado de fosforilación de los MAPK fue evaluado en control o siRNA del MPK-1 transfectado PBMo. Los resultados de Western blocking demostraron que BCG indujo tanto la fosforilación p38 como la ERK1/2 en 15 minutos (datos no mostrados) y alcanzó su punto máximo en 30 minutos, y luego regresó a los niveles basales en células tratadas con el siRNA del control (Figura 5). Al igual que los resultados de la expresión de citoquinas, la fosforilación de ambos p38 MAPK y ERK1/2 en respuesta a BCG fue disminuida en monocitos transfectados con siRNA del MPK-1 en lugar del esperado aumento de fosforilación (Figura 5). Los resultados sugieren que la reducción del nivel de producción de TNF-α en monocitos estimulados por BCG se debe a la reducción de la fosforilación de MAPK por MKP-1 siRNA. Este informe presentó evidencias de que una nueva función de MKP-1 se descubre en la regulación de citoquinas en respuesta a la infección micobacteriana. BCG induce el MKP-1 como respuesta rápida (Figura 2). El mecanismo de inducción del MKP-1 por BCG depende tanto de ERK1/2 como de p38 MAPK (Figura 3). Utilizando el enfoque de siRNA, las funciones del MKP-1 se pueden examinar en monocitos humanos primarios. Los resultados mostraron que la activación de los MAPK inducidos por BCG, así como la expresión de citoquinas, son aguas abajo del MKP-1 (Figuras 4D y 5). Por lo tanto, el MPK-1 es una molécula de señalización crítica que está involucrada en la expresión de citoquinas inducidas por BCG. Informes anteriores han demostrado que el MPK-1 inducido por LPS o peptidoglicano depende de p38 MAPK [14]. En consecuencia, el MPK-1 inducido por BCG puede ser inhibido por inhibidores de p38 MAPK y ERK1/2. Curiosamente, se ha demostrado que la degradación del MPK-1 se reduce después de la fosforilación ERK1/2 [15]. Se puede hipotetizar que las proteínas inducidas por BCG MKP-1 pueden ser estabilizadas por ERK1/2 y los mecanismos detallados involucrados requieren más exploración. También, ya que la inhibición de la expresión de MKP-1 por ambos inhibidores (para p38 MAPK y ERK1/ 2) no fue completa, se cree que otras Sobre la base de los resultados de la literatura sobre los efectos de LPS (Figura 6 ), la expectativa original para este proyecto es que el MPK-1 actúa como regulador negativo. Los macrófagos peritoneales estimulados por el MPK-1 KO mostraron una fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como un aumento de la producción de TNF-α [9]. Al hacerlo, la fosforilación inducida por el MPK-1 por el LPS podría disminuir por el MPK-1 siRNA previene la producción prolongada de TNF-α como en la sepsis, lo que puede conducir a un daño grave al huésped. Se esperaba que el BCG indujera el MPK-1 y su inducción se correlacionaría con la defosforilación de los MAPKs incluyendo p38 MAPK. Al bloquear el MKP-1 utilizando siRNA, se esperaba que hubiera aumentado la fosforilación p38 MAPK y la producción prolongada de TNF-α en respuesta a BCG. Sin embargo, nuestros resultados mostrados aquí son diametralmente opuestos. Una posibilidad para los resultados inesperados puede deberse a efectos no específicos de transfección o siRNA. Sin embargo, este no fue el caso ya que hubo una expresión prolongada y aumentada de TNF-α después de que los monocitos transfectados por siRNA del MKP-1 fueron tratados con LPS (Figura 4C ). Ahora hay una nueva hipótesis para explicar tales efectos paradójicos de MKP-1 en la regulación del TNF-α en la que la fosfatasa juega un papel en la regulación positiva de la producción de TNF-α en respuesta a BCG como en el caso de DUSP2 [13 Las estructuras de PKP-1 y DUSP2 son similares, con las que ambos contienen un dominio de interacción MAPK y un sitio catalítico de fosfatasa. Por el contrario, otros dominios DUSP pueden tener dominios adicionales, por ejemplo, PEST [6]. Aquí, postulamos que la función de PKP-1 en la señalización inducida por BCG es similar a la del DUSP2/PAC1. En realidad, el descubrimiento de DUSP2 ha creado inicialmente algunas preguntas paradójicas. Como se describe, DUSP2 se comporta de manera diferente a otros miembros de la familia MKP [13]. En los macrófagos DUSP2 KO tratados con LPS, produjeron menos mediadores inflamatorios incluyendo menos TNF, IL-6, óxido nítrico y células productoras de IL-12, en comparación con la de las contrapartes de tipo salvaje [13 De hecho, los resultados de estos estudios publicados sobre estudios DUSP2 son bastante similares a los de nuestros resultados reportados aquí. Es plausible que estas regulaciones positivas inesperadas de funciones de células inmunes por DUSP2 se deban a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. Se demostró que hay interacciones entre las vías JNK y ERK1/2 [16]. Aquí, demostramos que la activación sostenida de los bloques JNK de activación ERK (Figura 6 ). En la situación DUSP2, la estimulación de los mastocitos y macrófagos KO muestra un aumento de la fosforilación de JNK, e inhibición de JNK por su propio inhibidor específico restaura la fosforilación de ERK1/2 [13]. En la situación BCG-MPK-1, hay una fosforilación temprana de p38 MAPK y ERK Por lo tanto, es posible que JNK pueda jugar un papel en la interacción de crosstalk de MAPK. Sin embargo, nuestros datos preliminares sugieren que el nivel de JNK fosforilado no fue aumentado en PBMo MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana Figura 6 MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana. Modelo LPS fue proporcionado de acuerdo con los hallazgos de la literatura (Izquierda). En este escenario, LPS activa MKP-1, que a su vez defosforila y desactiva fosfo-p38 MAPK, resultando en menos inducción TNF-α. Sin embargo, la situación en la activación DHP-HSA de DUSP2 es más complicada (Middle), ya que la actividad fosfatasa causa la inhibición posterior de fosfo-JNK que conduce a la derrepresión de fosfo-p38 MAPK. En consecuencia, los efectos combinados de esta cascada resultan en más expresión TNF-α. El inesperado papel antimicobacterial del MBP-1 (Right) puede explicarse por eventos similares a los efectos DUSP2. En este caso (Right), hubo una inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MBP-1, y el factor desconocido a su vez inhibe la activación MAPKs que conduce a más inducción TNF-α. Los detalles y los objetivos de la cinasa aún no se han identificado. transfectado con MBP-1 siRNNA (datos no mostrados). Así, los detalles de Aquí presentamos un modelo para resumir los resultados e hipotetizar la existencia de un factor o factores intermedios aún no identificados en las vías aguas abajo de los efectos del MPK-1 en la cascada de señalización inducida por el BCG. El inesperado papel antimicobacteriano del MPK-1 (Figura 6 ) puede explicarse por eventos similares a los efectos del DUSP2. En este caso, el BCG induce la expresión del MPK-1 mientras activa también los MAPKs incluyendo p38 MAPK y ERK1/2. Downstream del MPKP-1, hay una inhibición de vías desconocidas o cinasas. El factor desconocido a su vez inhibe la activación del MAPKs, que finalmente conduce a más inducción del TNF-α (Figura 6 ). En resumen, el MPK-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citoquinas sobre la infección micobacteriana. La inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MPK-1, que a su vez inhibe la activación de los MAPK, puede utilizarse para explicar la función novedosa del MPK-1 en la mejora de la actividad de MAPK y la consiguiente expresión TNF-α después del tratamiento con BCG (Figura 6 ). Tomado en conjunto, el papel de los crosstalks de MAPK necesita exploración adicional. (3) TNF-α, 30 ciclos (TM = 56°C), aguas arriba, 5'-GGGCTAGGCGGTGTTC-3', aguas abajo, 5'-AGACGCGGGCGCGGTGATGG-3'. Los productos PCR fueron analizados en un gel de agarosa del 1% con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta. Para comprobar el tamaño de los productos PCR, 1 kb Plus ADN Lad-der Para la realización de QPCR, los niveles de MKP-1 y TNF-α mRNA, así como el gen de referencia GAPDH (como control interno) fueron analizados por los kits de reactivos de prueba de demanda específicos del gen (Aplicated Biosystems, EE.UU.). Todas las muestras se ejecutaron en duplicados o triplicados y sin controles de plantillas en un detector de secuencias de prisma ABI 7700. El método de análisis de QPCR fue el método del número de ciclo comparativo al umbral (C T ) descrito en el boletín del usuario no 2 del sistema de detección de secuencias de prisma ABI 7700. El número de C T de los genes objetivo se normalizó al de GAPDH en cada muestra (ΔC T ). El valor de C T de las células tratadas se comparó con el de las células tratadas sin tratamiento o simulacro ( La expresión génica relativa de los genes objetivo (inducción doble) se calculó como 2 -CT. Las proteínas celulares totales fueron extraídas por células lising en tampón de lisis que contiene 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (pH 8,0), 1% SDS, 0,2 mg/ml PMSF, 1 μg/ml aprotinina, 1 mM de ortovanadato sódico, 2 μg/ml de peptatina, 2 μg/ml de leupeptina y 50 mM de fluoruro sódico durante 5 minutos. El homogenato fue hervido durante 10 minutos y almacenado a -70°C hasta su uso. Las concentraciones de proteína total en extractos celulares fueron determinadas por BCATM Protein Assay Kit (Pierce, IL, EE.UU.). Western blot se realizó como se describe [20]. Cantidades iguales de proteína fueron separadas por 10% SDS-PAGE, electrobloqueadas en membranas nitrocelulosas (Schleicher & Schuell), y seguidas de sondeo con anticuerpos específicos para Actin, MKP-1 (Santa Cruz Biotech., EE.UU.), fosfo-p38 MAPK, fosfo-ERK1/2 (Cell Signaling, EE.UU.). Después de tres lavados, las membranas fueron incubadas con los anticuerpos secundarios correspondientes. Las bandas fueron detectadas utilizando el Sistema Chemiluminiscence mejorado (Amersham Pharmacia Biotech) como instrucciones del fabricante. La transfección de siRNA El siRNA MKP-1 incluyó: i) MLP1-HSS102982, AAACGCUUCGUAUCUCCUUGAGG; ii) MLP1-HSS102983, UUAUGCCCAAGGCAUCCAG-CAUGUC; y iii) MLP1-HSS102984, UGAUG-GAGUCUAUGAAGUCAAugGGC. El derribo del MLP-1 en PBMo se llevó a cabo utilizando solamente MLP1-HSS102983 o un grupo de los tres MKP-1 StealthTM Select RNAi (ratio = 1:1:1, 200 nM, Invitrogen, USA). StealthTM RNAi Negative Control Duplex (200 nM) se utilizó como control de efectos independientes de secuencia para la transfección de siRN La transfección de monocitos se realizó mediante el reactivo de transfección de ADN jetPEITM (Polyplus Transfection, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de transfectar las células durante 24 h, los transfectantes fueron tratados con diferentes inductores como se describe anteriormente. El análisis estadístico fue realizado por la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los valores de p fueron inferiores a 0,05.

¿Cuántas fosfatasas MAPK existen?

Una nueva función antimicobacteriana de la proteína quinasa fosfatasa activada por mitogenos-1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2804704/SHA: f6ed1f1e9999e57793addb1c9c54c61c7861a995Autores: Cheung, Benny KW; Yim, Howard CH; Lee, Norris CM; Lau, Allan SYDate: 2009-12-17DOI: 10.1186/1471-2172-10-64Licencia: cc-byAbstract: ANTERIORDANTE: Mycobacterium tuberculosis (MTB) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Para combatir este patógeno, las células inmunitarias liberan citocinas incluyendo el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), que es fundamental en el desarrollo de granulomas protectores. Nuestros resultados anteriores mostraron que Bacillus Calmette Guerin (BCG), un micobacterio utilizado como modelo para investigar la respuesta inmune contra MTB, estimula la inducción de TNF-α a través de la proteína quinasa activada por mitogenos (MAPK) en los monocitos sanguíneos humanos. Dado que MAPK phosphatasa-1 (MPK-1) es conocido por regular las actividades de MAPK, examinamos si el MPK-1 juega un papel en la activación de la MAPK inducida por BCG y la expresión de citoquinas. RESULTADOS: Los monocitos sanguíneos primarios humanos fueron tratados con BCG y analizados para la expresión de MKP-1. Además, la inducción del MPK-1 fue regulada por p38 MAPK y quinasa 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2). Sorprendentemente, cuando la expresión del MPK-1 fue bloqueada por su siRNA específico, hubo una disminución significativa en los niveles de fosfo-MAPK (p38 MAPK y ERK1/2) y TNF-α inducible por BCG. CONCLUSIONES: Dado que el TNF-α es fundamental en la formación de granuloma, los resultados indicaron una función positiva inesperada del MPK-1 contra la infección micobacterial en contraposición a su actividad habitual de fosfatasa. Texto: La tuberculosis (TB) sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo, especialmente en los países en desarrollo [1]. La enfermedad es causada por Mycobacterium tuberculosis (MTB) y aproximadamente un tercio de la población mundial ha sido infectada En un informe reciente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que hay 9,2 millones de nuevos casos de tuberculosis en todo el mundo en 2006 [1]. En respuesta a la infección por MTB, la inducción de citocinas por células inmunitarias es un importante mecanismo de defensa. Los macrófagos infectados secretan factores de señalización intercelular, citoquinas proinflamatorias, para mediar la respuesta inflamatoria que conduce a la formación de granuloma e inducción de inmunidad mediada por células T [2]. Para entender la patogénesis de la tuberculosis, las vías de señalización inducidas por micobacterias han sido motivo de interés desde hace mucho tiempo. Informes anteriores han demostrado que p38 MAPK y ERK1/2 son necesarios en la inducción de la expresión TNF-α en monocitos humanos infectados con M. tuberculosis H37Rv [4]. Hemos revelado además el papel significativo de los MAPK en los eventos de transducción de señales de activación micobacteriana de monocitos sanguíneos primarios humanos (PBMo) que conducen a expresiones citocinas a través de la interacción con PKR [5]. Sin embargo, los eventos posteriores en cuanto a cómo se regula MAPK y cómo tal regulación afecta a la producción de citocinas en respuesta a micobacterias siguen siendo elucidadas. Puesto que los MAPK se activan por fosforilación, la desfosforilación de los MAPK parece ser un proceso eficiente para inactivar sus actividades. Los ejemplos de estas fosfatasas incluyen fosfatasas de tirosina, fosfatasas de serina/treonina y fosfatasas de doble especificidad (DUSPs). Algunas fosfatasas de DUSPs también se conocen como fosfatasas de MAPK (MPK) [6] [7]. Actualmente, hay al menos 10 PHPs identificados, mientras que el MKP-1 es el miembro más estudiado de la familia. El papel regulador del PKP-1 en la inducción de citoquinas se demuestra mejor por los macrófagos de KKP-1 (KO) en respuesta al lipopolisacárido (LPS), un componente de pared celular de las bacterias Gram-negativas. Los macrófagos de PKP-1 mostraron fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como una mayor producción de TNF-α en respuesta Consistente con estos resultados, otro grupo reveló además que los macrófagos derivados de la médula ósea KO-MPK-1 tratados con LPS muestran una mayor actividad de unión al ADN AP-1 [10]. También mostraron que la expresión del MPK-1 inducida por LPS depende del factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) y del adaptador que contiene el dominio TIR induciendo IFN-β (TRIF) [10], demostrando así el papel del MPKP-1 en la transducción de señales. No sólo el LPS, otros inductores del TLR incluyendo CpG, peptidoglicano, poli CI y Pam 3 Cys pueden regular las expresiones citoquinas incluyendo TNF-α, IL-10 a través de las actividades del MPKP-1 [10, 11]. En estos procesos, el MPKP-1 sirve para mitigar los efectos indeseables del shock séptico y mantener Otro ejemplo de la función MPK-1 es la respuesta inmune a Staphylococcus aureus (S. aureus), una bacteria Gram positiva. Hay niveles más altos de producción de citocinas incluyendo TNF-α, IL-6, y MIP-1α en ratones MKP-1 KO infectados con S. aureus [12]. Además, los ratones tendrían un rápido desarrollo de disfunción multiorgánica, así como una tasa de mortalidad más rápida en caso de desafío con S. aureus matados por calor [12]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que MKP-1 protege al huésped de la sobreactivación del sistema inmunitario en respuesta a bacterias Gram negativo o Gram positivo. En el pasado, se creía que diferentes miembros de la familia MKP/DUSP tienen funciones superpuestas. Sin embargo, la aparición de DUSP2 cambió el concepto hacia abajo [13]. Se En las células DUSP2 KO, produjeron menos mediadores inflamatorios, lo que implica que DUSP2 puede desempeñar un papel en la mediación en lugar de limitar la inflamación. Para los casos, cuando los macrófagos DUSP2 KO fueron tratados con LPS, hubo menos receptores de TNF, IL-6, óxido nítrico, IL-12, en comparación con los de las contrapartes del tipo salvaje [13]. Cuando los mastocitos derivados de la médula ósea DUSP2 KO fueron sensibilizados por primera vez con el receptor de inmunoglobulina E (IgE) (Fc.RI) y luego estimulados con antígeno estable dinitrofenol-calor, produjeron niveles más bajos de ARNmT, menor producción de IL-6, menor fosforilación de ERK1/2, p38 MAPK, y menos actividades transcripcionales por Elk1 y NF Estas inesperadas regulaciones positivas de funciones celulares inmunitarias por DUSP2 se han hipotetizado debido a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. La estimulación de los mastocitos KO y macrófagos mostró incrementos en la fosforilación de JNK. Además, la inhibición de JNK por inhibidores de moléculas pequeñas mostró incrementos en la fosforilación de ERK [13]. Los autores también mostraron que hubo interacciones físicas de DUSP2 con ERK2, DUSP2 con JNK2, así como DUSP2 y p38 MAPK después de la estimulación de las células con antígeno estable de dinitrofenol-calor. Sin embargo, los detalles de las conversaciones cruzadas entre MAPKs y fosfatasas necesitan mayor investigación. Así, la familia MKP juega un papel crítico en la regulación de las respuestas inmunes. La respuesta inmune innata protege al huésped de la infección por MTB por secreción de citocinas incluyendo TNF-α en células inmunitarias. Mientras tanto, MAPK es una de las proteínas críticas en la regulación de la inmunidad y la expresión de citoquinas. Dado que MAPK está regulado por MKP-1 en respuesta a LPS y la activación de MAPK es importante en la expresión de citoquinas inducidas por BCG, hipotetizamos que el MKP-1 juega un papel crítico en la regulación inmune de BCG en monocitos humanos. Examinamos la implicación del MKP-1 en la activación de MAPK inducida por BCG y su consiguiente expresión de citoquinas. Aquí presentamos evidencias de que el MKP-1 juega un papel inesperado en la regulación de la inducción de citoquinas por BCG a través de su control de la fosforilación de MAPK. Se ha reportado que muchos inductores incluyendo factores de crecimiento, LPS, peptidoglicano, y dexametasona pueden estimular la expresión de MKP-1 en macrófagos humanos, microglia, mastocitos o fibroblastos [6]. Para investigar el papel de diferentes inductores de TLR en el proceso de inducción de MKP-1 en monocitos sanguíneos humanos, el nivel de MKP-1 mRNA se midió mediante el método de reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR). PBMo se aisló de células mononucleares primarias de sangre humana y se estimuló con Pam 3 Cys (agonista TLR2), poli IC (agonista TLR3) o LPS (agonista TLR4) durante 1 y 3 horas. Tras la exposición a Pam 3 Cys o LPS, hubo inducciones significativas de los niveles Estos efectos sobre la inducción del MPKP-1 continuaron durante 3 horas después del tratamiento con Pam 3 Cys (Figura 1A ). Por el contrario, el poli CI no indujo el MPKP-1 (Figura 1A ). Los resultados indican que diferentes inductores mostraron una regulación diferencial de la expresión del MPKP-1. LPS ha sido ampliamente utilizado para demostrar el papel del MPKP-1 en la respuesta inmune tanto in vivo como in vitro [9, 12]. Para establecer una base para la interpretación de los resultados experimentales posteriores, se utilizó el LPS como un control positivo para la inducción de la expresión del MPKP-1. Para determinar los niveles del MPKP-1 en respuesta al LPS, la cinética de la transcripción del MPKP-1 fue determinada por el QPCR. Hubo una inducción significativa del MPKP-1 mRNA, que alcanzó su punto máximo tan temprano como 1 hora Estos resultados mostraron que LPS indujo la expresión MCP-1 (Figura 1B). A continuación, para demostrar la inducción de fosfatasas específicas por BCG, se estudió la cinética de la expresión MCP-1 en PBMo utilizando QPCR durante el tratamiento BCG. Similar a los resultados producidos por LPS, con la adición de BCG (MOI = 1 CFU/celda), hubo una inducción significativa de MKP-1 mRNA dentro de 1 hora de tratamiento BCG determinado por la sonda Taqman específica para MCP-1 (Figura 2A ). Los efectos duraron al menos 6 horas (Figura 2A ). Para examinar si los cambios en la producción proteica fueron paralelos a los niveles de mRNA, los niveles proteicos de MKP-1 fueron medidos por Western blotting. En respuesta a B Los niveles proteicos se mantuvieron durante 2 horas y disminuyeron a los niveles basales a las 3 horas (Figura 2B ). Los resultados demostraron que hubo inducción MKP-1 en respuesta a la activación de BCG en monocitos humanos. Se ha demostrado que la inhibición de p38 MAPK bien por inhibidor específico o siRNA redujo la expresión de MKP-1 en macrófagos tratados con LPS o peptidoglicano [14]. Para determinar los mecanismos involucrados en la expresión BCG inducida por MKP-1, PBMo fue pretratado con varios inhibidores incluyendo PD98059 (inhibidor de MAP quinasa [MEK] o ERK1/2), SB203580 (inhibidor de p38 MAPK), SP600125 (inhibidor de JNK), y CAPE (inhibidor de NF- Se utilizó un rango de concentraciones de cada inhibidor para probar sus concentraciones óptimas y efectos sobre la viabilidad celular y las inhibiciones de la cinasa. Posteriormente se añadió BCG y se recogió el ARN total. Los resultados demostraron que, con la inhibición de las actividades de ERK1/2 y p38 MAPK por sus correspondientes inhibidores relativamente específicos, las expresiones MKP-1 se redujeron significativamente (Figura 3 ). Además, utilizando dosis más altas de SB203580, se demostró que la inhibición se incrementa aún más (datos no mostrados). Por el contrario, el pretratamiento de las células con CAPE y SP600125 no afectó a la inducción de MKP-1 por BCG (Figura 3 ). Estos resultados sugieren que la expresión inducida por BCG MKP-1 es dependiente tanto de p38 MAPK como de ERK1/2. A lo largo de los experimentos anteriores, el objetivo principal fue Así, para examinar más a fondo el papel del MPKP-1 en la señalización inducida por BCG, se utilizó la transfección de siRNA en PBMo para derribar la actividad del MPKP-1. Para demostrar que el MPKP-1 siRNA puede efectivamente derribar el gen objetivo, PBMo fue primero transfectado con control o MKP-1 siRNA y luego tratado con BCG durante 3 horas. Los niveles de MKP-1 mRNA fueron medidos por el método RT-PCR. En la Figura 4A, BCG estimuló la expresión MKP-1 (lanes 1 y 2). En MKP-1 siRNA transfectó monocitos, la inducción de MKP-1 por BCG fue significativamente disminuida (lanes 2 y 4). Los resultados mostraron que el siRNA hace abrogar los niveles de MKP-1 mRNA. Para determinar si el siRNA MKP-1 afecta al BCG inducido MKP-1 a niveles proteicos, PBMo fue tratado como arriba y las proteínas MKP-1 fueron medidas por Western blotting. Los resultados mostraron que el BCG podría inducir proteínas MKP-1 como de costumbre para células transfectadas con control siRNA (Figura 4B, carriles 1-3). Sin embargo, los niveles de BCG inducido expresión proteica MKP-1 fueron reducidos en células transfectadas con siRNA MKP-1 (Figura 4B, carriles 4-6). Juntos, los resultados sugieren que el siRNA MKP-1 no sólo redujo el MKP-1 mRNA en el tratamiento BCG sino que también abrogó la proteína MKP-1 inducida por BCG. Como se indica en la literatura [9], los ratones MKP-1 KO mostraron aumento de la producción Sobre la base de los resultados anteriores de siRNA del MPK-1, se utilizó LPS como control para demostrar los efectos de este sistema siRNA del MPK-1. La expresión citoquina inducida por LPS en células transfectadas de siRNA del MPK-1 sugiere que el sistema siRNA es eficaz para derribar la expresión del MPK-1 y que el MPK-1 actúa como regulador negativo en la expresión del TNF-α inducida por LPS. Para investigar el efecto del siRNA del MPK-1 en la expresión de citoquina inducida por BCG, los niveles de TNF-α, IL-6 e IL-10 mRNA se midieron por el método QPCR. PBMo fueron transfectados con control o MKP-1 siRNA. Después de la exposición al BCG con control siRNA, hubo inducciones significativas de TNF-α, IL-6 e IL-10 m A continuación, se examinaron los efectos del siRNA-MCP-1 en la expresión citoquina inducida por BCG. Sorprendentemente, hubo una abrogación significativa de la expresión TNF-α inducida por BCG por MKP-1 siRNA (Figura 4D ). Con la caída del siRNA-MCP-1, el nivel de TNF-α inducido por BCG fue sólo 60% comparado con el de las células de control, mientras que el IL-6 e IL-10 inducidos por BCG fueron sin cambios en las células transfectadas por MKP-1 siRNA. Los resultados revelaron que el MKP-1 juega un papel en la inducción de la expresión TNF-α sobre la estimulación BCG, que puede ser diferente a la de sus funciones convencionales en las que el MKP-1 actúa como regulador negativo en las vías de señalización inducidas por LPS [7]. El estado de fosforilación de los MAPK fue evaluado en control o siRNA del MPK-1 transfectado PBMo. Los resultados de Western blocking demostraron que BCG indujo tanto la fosforilación p38 como la ERK1/2 en 15 minutos (datos no mostrados) y alcanzó su punto máximo en 30 minutos, y luego regresó a los niveles basales en células tratadas con el siRNA del control (Figura 5). Al igual que los resultados de la expresión de citoquinas, la fosforilación de ambos p38 MAPK y ERK1/2 en respuesta a BCG fue disminuida en monocitos transfectados con siRNA del MPK-1 en lugar del esperado aumento de fosforilación (Figura 5). Los resultados sugieren que la reducción del nivel de producción de TNF-α en monocitos estimulados por BCG se debe a la reducción de la fosforilación de MAPK por MKP-1 siRNA. Este informe presentó evidencias de que una nueva función de MKP-1 se descubre en la regulación de citoquinas en respuesta a la infección micobacteriana. BCG induce el MKP-1 como respuesta rápida (Figura 2). El mecanismo de inducción del MKP-1 por BCG depende tanto de ERK1/2 como de p38 MAPK (Figura 3). Utilizando el enfoque de siRNA, las funciones del MKP-1 se pueden examinar en monocitos humanos primarios. Los resultados mostraron que la activación de los MAPK inducidos por BCG, así como la expresión de citoquinas, son aguas abajo del MKP-1 (Figuras 4D y 5). Por lo tanto, el MPK-1 es una molécula de señalización crítica que está involucrada en la expresión de citoquinas inducidas por BCG. Informes anteriores han demostrado que el MPK-1 inducido por LPS o peptidoglicano depende de p38 MAPK [14]. En consecuencia, el MPK-1 inducido por BCG puede ser inhibido por inhibidores de p38 MAPK y ERK1/2. Curiosamente, se ha demostrado que la degradación del MPK-1 se reduce después de la fosforilación ERK1/2 [15]. Se puede hipotetizar que las proteínas inducidas por BCG MKP-1 pueden ser estabilizadas por ERK1/2 y los mecanismos detallados involucrados requieren más exploración. También, ya que la inhibición de la expresión de MKP-1 por ambos inhibidores (para p38 MAPK y ERK1/ 2) no fue completa, se cree que otras Sobre la base de los resultados de la literatura sobre los efectos de LPS (Figura 6 ), la expectativa original para este proyecto es que el MPK-1 actúa como regulador negativo. Los macrófagos peritoneales estimulados por el MPK-1 KO mostraron una fosforilación prolongada de p38 MAPK y JNK, así como un aumento de la producción de TNF-α [9]. Al hacerlo, la fosforilación inducida por el MPK-1 por el LPS podría disminuir por el MPK-1 siRNA previene la producción prolongada de TNF-α como en la sepsis, lo que puede conducir a un daño grave al huésped. Se esperaba que el BCG indujera el MPK-1 y su inducción se correlacionaría con la defosforilación de los MAPKs incluyendo p38 MAPK. Al bloquear el MKP-1 utilizando siRNA, se esperaba que hubiera aumentado la fosforilación p38 MAPK y la producción prolongada de TNF-α en respuesta a BCG. Sin embargo, nuestros resultados mostrados aquí son diametralmente opuestos. Una posibilidad para los resultados inesperados puede deberse a efectos no específicos de transfección o siRNA. Sin embargo, este no fue el caso ya que hubo una expresión prolongada y aumentada de TNF-α después de que los monocitos transfectados por siRNA del MKP-1 fueron tratados con LPS (Figura 4C ). Ahora hay una nueva hipótesis para explicar tales efectos paradójicos de MKP-1 en la regulación del TNF-α en la que la fosfatasa juega un papel en la regulación positiva de la producción de TNF-α en respuesta a BCG como en el caso de DUSP2 [13 Las estructuras de PKP-1 y DUSP2 son similares, con las que ambos contienen un dominio de interacción MAPK y un sitio catalítico de fosfatasa. Por el contrario, otros dominios DUSP pueden tener dominios adicionales, por ejemplo, PEST [6]. Aquí, postulamos que la función de PKP-1 en la señalización inducida por BCG es similar a la del DUSP2/PAC1. En realidad, el descubrimiento de DUSP2 ha creado inicialmente algunas preguntas paradójicas. Como se describe, DUSP2 se comporta de manera diferente a otros miembros de la familia MKP [13]. En los macrófagos DUSP2 KO tratados con LPS, produjeron menos mediadores inflamatorios incluyendo menos TNF, IL-6, óxido nítrico y células productoras de IL-12, en comparación con la de las contrapartes de tipo salvaje [13 De hecho, los resultados de estos estudios publicados sobre estudios DUSP2 son bastante similares a los de nuestros resultados reportados aquí. Es plausible que estas regulaciones positivas inesperadas de funciones de células inmunes por DUSP2 se deban a conversaciones cruzadas entre MAPKs [13]. Se demostró que hay interacciones entre las vías JNK y ERK1/2 [16]. Aquí, demostramos que la activación sostenida de los bloques JNK de activación ERK (Figura 6 ). En la situación DUSP2, la estimulación de los mastocitos y macrófagos KO muestra un aumento de la fosforilación de JNK, e inhibición de JNK por su propio inhibidor específico restaura la fosforilación de ERK1/2 [13]. En la situación BCG-MPK-1, hay una fosforilación temprana de p38 MAPK y ERK Por lo tanto, es posible que JNK pueda jugar un papel en la interacción de crosstalk de MAPK. Sin embargo, nuestros datos preliminares sugieren que el nivel de JNK fosforilado no fue aumentado en PBMo MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana Figura 6 MKP-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citocinas sobre la infección micobacteriana. Modelo LPS fue proporcionado de acuerdo con los hallazgos de la literatura (Izquierda). En este escenario, LPS activa MKP-1, que a su vez defosforila y desactiva fosfo-p38 MAPK, resultando en menos inducción TNF-α. Sin embargo, la situación en la activación DHP-HSA de DUSP2 es más complicada (Middle), ya que la actividad fosfatasa causa la inhibición posterior de fosfo-JNK que conduce a la derrepresión de fosfo-p38 MAPK. En consecuencia, los efectos combinados de esta cascada resultan en más expresión TNF-α. El inesperado papel antimicobacterial del MBP-1 (Right) puede explicarse por eventos similares a los efectos DUSP2. En este caso (Right), hubo una inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MBP-1, y el factor desconocido a su vez inhibe la activación MAPKs que conduce a más inducción TNF-α. Los detalles y los objetivos de la cinasa aún no se han identificado. transfectado con MBP-1 siRNNA (datos no mostrados). Así, los detalles de Aquí presentamos un modelo para resumir los resultados e hipotetizar la existencia de un factor o factores intermedios aún no identificados en las vías aguas abajo de los efectos del MPK-1 en la cascada de señalización inducida por el BCG. El inesperado papel antimicobacteriano del MPK-1 (Figura 6 ) puede explicarse por eventos similares a los efectos del DUSP2. En este caso, el BCG induce la expresión del MPK-1 mientras activa también los MAPKs incluyendo p38 MAPK y ERK1/2. Downstream del MPKP-1, hay una inhibición de vías desconocidas o cinasas. El factor desconocido a su vez inhibe la activación del MAPKs, que finalmente conduce a más inducción del TNF-α (Figura 6 ). En resumen, el MPK-1 juega un papel crítico en la regulación de la expresión de citoquinas sobre la infección micobacteriana. La inhibición de vías desconocidas o cinasas aguas abajo del MPK-1, que a su vez inhibe la activación de los MAPK, puede utilizarse para explicar la función novedosa del MPK-1 en la mejora de la actividad de MAPK y la consiguiente expresión TNF-α después del tratamiento con BCG (Figura 6 ). Tomado en conjunto, el papel de los crosstalks de MAPK necesita exploración adicional. (3) TNF-α, 30 ciclos (TM = 56°C), aguas arriba, 5'-GGGCTAGGCGGTGTTC-3', aguas abajo, 5'-AGACGCGGGCGCGGTGATGG-3'. Los productos PCR fueron analizados en un gel de agarosa del 1% con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta. Para comprobar el tamaño de los productos PCR, 1 kb Plus ADN Lad-der Para la realización de QPCR, los niveles de MKP-1 y TNF-α mRNA, así como el gen de referencia GAPDH (como control interno) fueron analizados por los kits de reactivos de prueba de demanda específicos del gen (Aplicated Biosystems, EE.UU.). Todas las muestras se ejecutaron en duplicados o triplicados y sin controles de plantillas en un detector de secuencias de prisma ABI 7700. El método de análisis de QPCR fue el método del número de ciclo comparativo al umbral (C T ) descrito en el boletín del usuario no 2 del sistema de detección de secuencias de prisma ABI 7700. El número de C T de los genes objetivo se normalizó al de GAPDH en cada muestra (ΔC T ). El valor de C T de las células tratadas se comparó con el de las células tratadas sin tratamiento o simulacro ( La expresión génica relativa de los genes objetivo (inducción doble) se calculó como 2 -CT. Las proteínas celulares totales fueron extraídas por células lising en tampón de lisis que contiene 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (pH 8,0), 1% SDS, 0,2 mg/ml PMSF, 1 μg/ml aprotinina, 1 mM de ortovanadato sódico, 2 μg/ml de peptatina, 2 μg/ml de leupeptina y 50 mM de fluoruro sódico durante 5 minutos. El homogenato fue hervido durante 10 minutos y almacenado a -70°C hasta su uso. Las concentraciones de proteína total en extractos celulares fueron determinadas por BCATM Protein Assay Kit (Pierce, IL, EE.UU.). Western blot se realizó como se describe [20]. Cantidades iguales de proteína fueron separadas por 10% SDS-PAGE, electrobloqueadas en membranas nitrocelulosas (Schleicher & Schuell), y seguidas de sondeo con anticuerpos específicos para Actin, MKP-1 (Santa Cruz Biotech., EE.UU.), fosfo-p38 MAPK, fosfo-ERK1/2 (Cell Signaling, EE.UU.). Después de tres lavados, las membranas fueron incubadas con los anticuerpos secundarios correspondientes. Las bandas fueron detectadas utilizando el Sistema Chemiluminiscence mejorado (Amersham Pharmacia Biotech) como instrucciones del fabricante. La transfección de siRNA El siRNA MKP-1 incluyó: i) MLP1-HSS102982, AAACGCUUCGUAUCUCCUUGAGG; ii) MLP1-HSS102983, UUAUGCCCAAGGCAUCCAG-CAUGUC; y iii) MLP1-HSS102984, UGAUG-GAGUCUAUGAAGUCAAugGGC. El derribo del MLP-1 en PBMo se llevó a cabo utilizando solamente MLP1-HSS102983 o un grupo de los tres MKP-1 StealthTM Select RNAi (ratio = 1:1:1, 200 nM, Invitrogen, USA). StealthTM RNAi Negative Control Duplex (200 nM) se utilizó como control de efectos independientes de secuencia para la transfección de siRN La transfección de monocitos se realizó mediante el reactivo de transfección de ADN jetPEITM (Polyplus Transfection, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de transfectar las células durante 24 h, los transfectantes fueron tratados con diferentes inductores como se describe anteriormente. El análisis estadístico fue realizado por la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los valores de p fueron inferiores a 0,05.

¿Qué proteína está en el camino crítico de la inmunidad y la expresión de citoquinas?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Cómo se administra la IVT?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a la NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo de vida del virus que reduzca las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión genética son impulsados por la proximidad Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo tanto las respuestas séricas como las de anticuerpos mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Si bien estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para promover el NDV como vector humano de la vacuna contra la gripe. El virus parainfluenza tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 sólo se ha descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus que reduce las preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Qué contiene la IVT?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. La LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Qué protege contra las enfermedades clínicas?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a la NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo de vida del virus que reduzca las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión genética son impulsados por la proximidad Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo tanto las respuestas séricas como las de anticuerpos mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Si bien estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para promover el NDV como vector humano de la vacuna contra la gripe. El virus parainfluenza tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 sólo se ha descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus que reduce las preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Cómo se administra la LAIV?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Qué contiene el LAIV?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. La LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Se replica LAIV a temperatura corporal?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Qué permite la invasión del virus de la inmunidad?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a la NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo de vida del virus que reduzca las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión genética son impulsados por la proximidad Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo tanto las respuestas séricas como las de anticuerpos mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Si bien estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para promover el NDV como vector humano de la vacuna contra la gripe. El virus parainfluenza tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 sólo se ha descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus que reduce las preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Cuándo ocurre la selección de cepas de la vacuna en el hemisferio norte?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a la NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo de vida del virus que reduzca las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión genética son impulsados por la proximidad Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo tanto las respuestas séricas como las de anticuerpos mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Si bien estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para promover el NDV como vector humano de la vacuna contra la gripe. El virus parainfluenza tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 sólo se ha descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus que reduce las preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Cuál es la ventaja de los sistemas de ADN recombinante?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Cuántos serotipos de adenovirus hay?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Por qué los vectores de adenovirus son más atractivos?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. La LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Cuál es la ventaja del adenovirus?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Qué es un inconveniente del vector Ad5?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Qué adenovirus animales se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a rdA5-HA?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. La LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Qué puede evitar la respuesta anti-Ad5 y también proporcionar un suministro eficaz de antígenos e inmunogenicidad?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a la NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo de vida del virus que reduzca las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión genética son impulsados por la proximidad Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo tanto las respuestas séricas como las de anticuerpos mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Si bien estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para promover el NDV como vector humano de la vacuna contra la gripe. El virus parainfluenza tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 sólo se ha descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus que reduce las preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Se ha estudiado la AAV como vectores de la gripe?

Virus-Vectored Influenza Virus Vacunashttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bAutores: Tripp, Ralph A.; Tompkins, S. MarkFecha: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055Licencia: cc-byAbstract: A pesar de la disponibilidad de una vacuna inactivada que ha sido autorizada durante más de 50 años, el virus de la gripe sigue causando morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La evolución constante de las cepas de virus de la gripe circulante y la aparición de nuevas cepas disminuye la eficacia de vacunas anuales que se basan en una combinación con cepas de gripe circulante. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con vacunas nuevas y eficaces que confieran protección cruzada para evitar la necesidad de reformular bianualmente las vacunas estacionales contra la gripe. Las vacunas recombinantes con vectores de virus son una alternativa atractiva a las vacunas clásicas inactivadas porque los vectores de virus permiten la expresión nativa de antígenos de la gripe, incluso de virus de la gripe virulenta, mientras se expresan en el contexto del vector que puede mejorar la inmunogenicidad. Además, una vacuna vectorizada a menudo permite la entrega de la vacuna a sitios de inmunidad inductiva como el tracto respiratorio que permite la protección contra la infección por el virus de la gripe. Además, la capacidad de manipular fácilmente vectores de virus para producir nuevas vacunas contra la gripe puede proporcionar el camino más rápido hacia una vacuna universal que proteja contra todos los virus de la gripe. Texto: La gripe estacional es un problema de salud mundial que causa una alta movilidad y una mortalidad sustancial [1] [2] [4]. Además, la infección por gripe a menudo empeora las condiciones médicas preexistentes [5] [6] [7]. Las vacunas contra las cepas de gripe circulantes están disponibles y se actualizan anualmente, pero todavía hay muchos problemas, incluida la baja eficacia en las poblaciones con mayor riesgo de complicaciones por la infección por el virus de la gripe, es decir, los jóvenes y los ancianos [8, 9]. A pesar del aumento de las tasas de vacunación, las hospitalizaciones relacionadas con la gripe están aumentando [8, 10], y se ha desarrollado una resistencia sustancial a los medicamentos antirretrovirales en dos de los cuatro fármacos actualmente aprobados [11, 12]. Los tipos generales de vacunas contra la gripe disponibles en los Estados Unidos son la vacuna contra la gripe inactivada trivalente (TIV), la vacuna contra la gripe cuatrivalente (QIV) y la vacuna contra la gripe atenuada viva (LAIV; en formas trivalente y cuadrivalente).Hay tres tipos de vacunas inactivadas que incluyen vacunas contra el virus entero inactivadas, inactivadas contra el virus dividido y subunidades.En las vacunas contra el virus dividido, el virus se ve interrumpido por un detergente.En las vacunas de subunidad, la HA y la NA se han purificado aún más mediante la eliminación de otros componentes virales.La TIV se administra por vía intramuscular y contiene tres o cuatro virus inactivados, es decir, dos cepas de tipo A (H1 y H3) y una o dos cepas de tipo B. La eficacia de la TIV se mide mediante la inducción de respuestas humor Las respuestas de anticuerpos séricos a la HA se miden mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), y el título de HI específico para cepas se considera la correlación oro-estándar de la inmunidad a la gripe, donde un aumento de cuatro veces en el título post-vacunación, o un título de ≥1:40 de HI se considera protector [4, 14]. La protección contra la enfermedad clínica se confiere principalmente por anticuerpos séricos; sin embargo, los anticuerpos IgA de mucosa también pueden contribuir a la resistencia contra la infección. Las vacunas inactivadas por virus divididos pueden inducir respuestas de anticuerpos específicas de la neuraminidasa (NA) [15] [16] [17], y los anticuerpos anti-NA se han asociado con la protección contra la infección en humanos [18] [19] [20] [22]. La LAIV se administra como aerosol nasal y contiene las mismas tres o cuatro cepas del virus de la gripe que las vacunas inactivadas, pero sobre una columna vertebral atenuada de la vacuna [4]. La LAIV es sensible a la temperatura y se adapta al frío, por lo que no se replican eficazmente a la temperatura corporal central, sino que se replican en la mucosa de la nasofaringe [23]. La inmunización LAIV induce respuestas de anticuerpos séricos, respuestas de anticuerpos mucosas (IgA) y respuestas de células T. Mientras que las respuestas de anticuerpos séricos robustos y anticuerpos de lavado nasal (mucoso) están asociadas con la protección contra infecciones, otras respuestas inmunes, como las respuestas CD8 + linfocitos citotóxicos (CTL) pueden contribuir a la protección y no hay una correlación clara de inmunidad para la LAIV [4, 14, 24]. Las vacunas del virus de la Las porciones inmunodominantes de las moléculas HA y NA experimentan un proceso constante de deriva antigénica, una acumulación natural de mutaciones, permitiendo la evasión del virus de la inmunidad [9, 25]. Así, las cepas circulantes de la gripe A y B se revisan anualmente para determinar si son compatibles antigénicas con las vacunas actuales, la sustitución de cepas vacunales puede ocurrir regularmente, y se recomienda la vacunación anual para asegurar la protección [4, 26, 27]. Para el hemisferio norte, la selección de cepas vacunales se produce en febrero y luego los fabricantes comienzan la producción, tomando al menos seis meses para producir los millones de dosis de vacunas necesarias para la caída [27]. Si la predicción es imperfecta, o si los fabricantes tienen problemas con la producción de vacunas, la eficacia o la disponibilidad de vacunas puede verse comprometida [28]. LAIV no se recomienda para todas las poblaciones; sin embargo, Mientras que LAIV se basa en la compatibilidad antigénica y los antígenos HA y NA se sustituyen en el mismo esquema que la IVT [4, 9], hay alguna sugerencia de que la VIT puede inducir una protección más amplia que la IVT debido a la diversidad de la respuesta inmune consistente en inducir anticuerpos séricos y mucosas neutralizantes del virus, así como respuestas ampliamente reactivas de las células T [9, 23, 29]. Si bien en general tanto la IVT como la IVL se consideran seguras y eficaces, existe una necesidad reconocida de mejorar las vacunas estacionales contra la gripe [26]. Además, una mejor comprensión de la inmunidad a los antígenos del virus de la gripe conservados ha aumentado la posibilidad de una vacuna universal, y estos antígenos universales probablemente requerirán vacunas novedosas para la entrega efectiva [30] [31] [32]. Esto a su vez permite modificar los vectores para atenuar el virus o aumentar la inmunogenicidad, además de añadir y manipular los antígenos del virus de la gripe. Muchos de estos vectores han sido ampliamente estudiados o utilizados como vacunas contra formas salvajes del virus. Finalmente, cada uno de estos vectores de la vacuna es replicativo-defectivo o causa una infección autolimitante, aunque como LAIV, la seguridad en individuos inmunocomprometidos sigue siendo una preocupación [4, 13, [33] [35]. En el cuadro 1 se resumen los beneficios y preocupaciones de cada una de las vacunas con vectores de virus que se discuten aquí. Hay 53 serotipos de adenovirus, muchos de los cuales han sido explorados como vectores de la vacuna. Una vacuna de adenovirus vivo que contiene serotipos 4 y 7 ha estado en uso por los militares durante décadas, sugiriendo que los adenovirus pueden ser seguros para el uso generalizado de la vacuna Sin embargo, los problemas de seguridad han llevado a que la mayoría de las vacunas basadas en adenovirus se centren en vectores defectuosos de replicación. El adenovirus 5 (Ad5) es el serotipo más estudiado, habiendo sido probado para el suministro de genes y agentes anticancerosos, así como para vacunas de enfermedades infecciosas. Los vectores de adenovirus son atractivos como vectores de vacunas porque su genoma es muy estable y hay una variedad de sistemas recombinantes disponibles que pueden acomodar hasta 10 kb de material genético recombinante [37]. El adenovirus es un virus no envuelto que es relativamente estable y puede ser formulado para almacenamiento a largo plazo a 4 °C, o incluso almacenamiento hasta seis meses a temperatura ambiente [33]. Las vacunas con adenovirus pueden ser cultivadas a títulos altos, superando 10 unidades de formación de placa de 1° (PFU) por mL cuando se cultivan en células 293 o PER.C6 [38], y el virus puede ser purificado por métodos simples [39]. Las vacunas con adenovirus también pueden ser entregadas a través de múltiples vías, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intradérmica, administración oral utilizando una cápsula protectora y mediante el parto intranasal. Es importante destacar que estos dos últimos métodos de administración inducen respuestas inmunes mucosales robustas y pueden evitar la inmunidad vectorial preexistente [33]. Incluso los vectores de adenovirus defectivos de replicación son naturalmente inmunoestimuladores y adyuvantes eficaces al antígeno recombinante que se está entregando. El adenovirus ha sido ampliamente estudiado como vector vacunal de enfermedad humana. El primer informe utilizando adenovirus como vector de la vacuna contra la gripe demostró la inmunogenicidad de adenovirus recombinante 5 (rAd5) que expresaba la HA de un virus de la gripe porcina, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). La inmunización intramuscular de ratones con este constructo indujo respuestas robustas de anticuerpos neutralizantes y protegió a los ratones del desafío con un virus heterólogo, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40]. La replicación defectuosa de las vacunas rAd5 que expresaban la influenza HA también se han probado en humanos. Un rAd5-HA que expresaba la HA de A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) se entregó a los seres humanos epicutánea o intranasal y se evaluó por seguridad e inmunogenicidad. La vacuna Si bien los ensayos clínicos con vectores rAd han tenido éxito en general, demostrando seguridad y cierto nivel de eficacia, rAd5 como vector ha sido eclipsado negativamente por dos fracasos de los ensayos clínicos. El primer ensayo fue un examen de terapia génica en el que la administración intravenosa de dosis altas de un vector Ad resultó en la muerte de un varón de 18 años [42, 43]. El segundo fracaso clínico fue el uso de una vacuna contra el VIH con vectores Ad5 que se probó como parte de un estudio de fase, un ensayo clínico de fase 2B. En este estudio, los individuos fueron vacunados con el vector de vacuna Ad5 que expresaba genes HIV-1 gag, pol y nef. La vacuna indujo respuestas de células T específicas del VIH; sin embargo, el estudio se interrumpió después de un análisis provisional sugirió que la vacuna no alcanzó eficacia y los individuos con títulos de anticuerpos Ad5 preexistentes Posteriormente, se confirmó el riesgo asociado a la vacuna rAd5 [47]. Aunque estos dos casos no sugieren que las vacunas ad-vectoras sean inseguras o inefectivas, las notas de los ensayos clínicos indican que la umbra ha afectado el interés por todas las vacunas adenovirus, pero sigue existiendo interés. La inmunización con vectores de adenovirus induce potentes respuestas inmunes celulares y humorales que se inician a través de vías independientes y dependientes de receptores de peaje que inducen respuestas robustas de citoquinas proinflamatorias. Las vacunas ad recombinantes que expresan antígenos HA de pandemia H1N1 (pH1N1), H5 y H7 virus de gripe aviar altamente patógena (HPAIV) y virus de gripe aviar H9 se han probado para la eficacia en varios modelos animales, incluidos pollos, ratones y hurones, y se ha demostrado que son eficaces y proporcionan protección Se han explorado varios vectores rAd5 para el suministro de antígenos no-HA, nucleoproteína de gripe (NP) y proteína de la matriz 2 (M2) [29, [50] [51] [52]. La eficacia de antígenos no-HA ha llevado a su inclusión con vacunas basadas en HA para mejorar la inmunogenicidad y ampliar la amplitud de la inmunidad humoral y celular [53, 54]. Sin embargo, como tanto las respuestas de células CD8 + T como las de anticuerpos neutralizantes son generadas por antígenos vectoriales y vacunales, la memoria inmunológica a estos componentes puede reducir la eficacia y limitar el uso repetido [48]. Un inconveniente de un vector Ad5 es el potencial de inmunidad preexistente, por lo que se han explorado serotipos de adenovirus alternativos como vectores, especialmente serotipos humanos no humanos y poco comunes. Los vectores de adenovirus no humanos incluyen los de primates no humanos (NHP), perros, ovejas, cerdos, vacas, aves y otros [48, 55]. Estos vectores pueden infectar una variedad de tipos de células, pero generalmente son atenuados en los seres humanos evitando preocupaciones de inmunidad preexistente. Porcino, NHP y adenovirus bovinos que expresan antígenos H5 HA también se ha demostrado que inducen inmunidad comparable a las vacunas humanas rAd5-H5 [33, 56]. Recombinantes, replicación-defectiva adenovirus de los serotipos de baja prevalencia también se ha demostrado que son eficaces. Serotipos de baja prevalencia como los tipos de adenovirus 3, 7, 11 y 35 pueden evadir las respuestas inmunes anti-Ad5 manteniendo la administración eficaz de antígenos y la inmunogenicidad [48, 57]. Las estrategias de primer impulso, utilizando la inmunización de ADN o proteína junto con una inmunización de refuerzo de la vacuna contra adenovirus, también han sido exploradas como un medio para evitar la inmunidad preexistente [52]. Los virus asociados a adeno (AAV) fueron explorados por primera vez como vectores de terapia génica. Al igual que los vectores de rAd, los rAAV tienen un amplio tropismo que infecta una variedad de huéspedes, tejidos y tipos de células proliferantes y no proliferantes [58]. Los AAV generalmente no se habían considerado vectores de vacunas porque se consideraban poco inmunogénicos. Un estudio seminal usando AAV-2 para expresar una glucoproteína HSV-2 mostró que este vector vacunador del virus induce respuestas potentes de células CD8 + T y anticuerpos séricos, abriendo así la puerta a otros estudios asociados a la vacuna rAAV [59, 60]. Los virus de tipo salvaje no son patógenos y la replicación es incompetente en humanos y los sistemas de vectores AAV recombinantes son aún más atenuados [61]. Como miembros de la familia de parvovirus, los AAV son pequeños virus no envueltos que son estables y susceptibles de almacenamiento a largo plazo sin una cadena fría. Si bien existe una inmunidad preexistente limitada, la disponibilidad de cepas no humanas como candidatos a la vacuna elimina estas preocupaciones. Las modificaciones al vector han aumentado la inmunogenicidad, así como [60]. Hay estudios limitados que utilizan AAVs como vectores de vacunas para la gripe. Un AAV que expresa un antígeno HA se mostró por primera vez para inducir protección en 2001 [62]. Más tarde, un AAV híbrido derivado de dos aislados de primates no humanos (AAVrh32,33) se utilizó para expresar influenza NP y proteger contra el desafío PR8 en ratones Más recientemente, después de la pandemia del virus H1N1 de la gripe de 2009, se generaron vectores rAAV que expresaban las proteínas HA, NP y matriz 1 (M1) de A/Mexico/4603/2009 (pH1N1), y en los estudios de inmunización y desafío murino, se demostró que las proteínas rAAV-HA y rAAV-NP eran protectoras; sin embargo, los ratones vacunados con rAAV-HA + NP + M1 tenían la protección más robusta. Además, los ratones vacunados con rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 también estaban parcialmente protegidos contra el desafío heterólogo (PR8, H1N1) [63]. En estos estudios, se utilizó el AAV (AAV8 y AAV9) para administrar un anticuerpo transgénico que codificaba un anticuerpo monoclonal antiinfluenza ampliamente cruzado de protección para la expresión in vivo. Se demostró que la administración intramuscular e intranasal de los AAVs protegía contra una serie de desafíos del virus de la gripe en ratones y hurones, incluidos los virus H1N1 y H5N1 [64, 65]. Estos estudios sugieren que los vectores rAAV son vectores prometedores de vacunas e inmunoprofilaxis. Hasta este punto, mientras que aproximadamente 80 ensayos clínicos en fase I, I/II, II o III del rAAV están abiertos, completados o en revisión, estos se han centrado en estudios de transferencia genética y por lo tanto todavía hay datos limitados de seguridad para el uso del rAAV como vacunas [66]. Los alfavirus son virus de ARN de sentido positivo de la familia Togaviridae. Se han desarrollado una variedad de alfavirus como vectores de vacunas, incluyendo el virus Semliki Forest (SFV), el virus Sindbis (SIN), el virus Venezolano de la encefalitis equina (VEE), así como virus quiméricos que incorporan porciones de virus SIN y VEE. La replicación de vacunas defectuosas o replicones no codifican proteínas estructurales virales, ya que estas porciones del genoma se sustituyen por material transgénico. Las proteínas estructurales se proporcionan en los sistemas de producción de cultivos celulares. Una característica importante de los sistemas de replicon es la naturaleza autorreplicante del ARN. A pesar del genoma viral parcial, los ARN son auto-replicantes y pueden expresar transgenes a niveles muy altos [67]. El SIN, el SFV y el VEE han sido probados para determinar su eficacia como vectores de la vacuna contra el virus de la gripe [68] [69] [70] [71]. Se demostró que un sistema de replicación basado en el VEE que codifica la HA desde el PR8 induce una potente respuesta inmune específica de la HA y está protegido contra el desafío en un modelo murino, a pesar de la inmunización repetida con el vector que expresa un antígeno de control, lo que sugiere que la inmunidad preexistente no puede ser un problema para la vacuna de replicación [68]. Un estudio separado desarrolló un sistema de replicación de la VEE que expresa la HA desde el A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) y demostró una eficacia variable después de la vacunación de ovo o la vacunación de pollitos de 1 día [70]. El epítopo NP bien caracterizado se expresó transgénicamente en el sistema SIN y demostró ser inmunogénico en ratones, primiendo una respuesta robusta de células CD8 + T y reduciendo el título del virus de la gripe después del desafío [69]. Más recientemente, se demostró que un sistema de replicación de VEE que expresa la proteína HA de PR8 protege a ratones adultos jóvenes (de 8 semanas de edad) y ancianos (12 meses de edad) de un desafío homólogo letal [72]. Los sistemas de replicación de VEE son particularmente atractivos ya que el VEE se dirige a las células que presentan antígenos en los tejidos linfáticos, estimulando respuestas inmunes rápidas y robustas [73]. Los sistemas de replicación de VEE pueden inducir respuestas inmunitarias mucosas robustas mediante inmunización intranasal o subcutánea [72] [73] [74], y la inmunización subcutánea con partículas de replicación vírica (VRP) que expresan anticuerpos IgG sistémicos específicos de antígenos inducidos por HA y anticuerpos IgA fecal [74]. Los VRP derivados del virus VEE se han desarrollado como vacunas candidatas para el citomegalovirus (CMV). Un ensayo clínico de fase I con el VRP CMV mostró que la vacuna era inmunogénica, induciendo respuestas de anticuerpos neutralizantes de CMV y respuestas potentes de células T. Además, la vacuna fue bien tolerada y considerada segura [75]. Un ensayo clínico independiente evaluó la eficacia de la inmunización repetida con un VRP que expresaba un antígeno tumoral. La vacuna era segura y a pesar de la elevada inmunidad específica de vectores tras la Aunque se necesitan datos clínicos adicionales, estos informes sugieren que los sistemas de replicación de virus alfa o VRPs pueden ser seguros y eficaces, incluso frente a la inmunidad preexistente. Baculovirus se ha utilizado ampliamente para producir proteínas recombinantes. Recientemente, una vacuna de HA recombinante derivada de baculovirus fue aprobada para uso humano y estaba disponible por primera vez para su uso en los Estados Unidos para la temporada de gripe 2013-2014 [4]. Los Baculovirus también se han explorado como vectores de vacunas. Los Baculovirus tienen una serie de ventajas como vectores de vacunas. Los virus han sido ampliamente estudiados para la expresión de proteínas y para el uso de pesticidas y por lo tanto son fácilmente manipulados. Los vectores pueden acomodar grandes inserciones genéticas, mostrar un efecto citopático limitado en células de mamíferos, y se ha demostrado que infectan y expresan genes de interés en un espectro de células de mamíferos [77]. Si bien los promotores de insectos no son eficaces para la expresión génica de los mamíferos, los promotores apropiados pueden ser clonados en los vectores de la vacuna contra baculovirus. Los vectores de Baculovirus han sido probados como vacunas contra la gripe, con la primera vacuna reportada usando el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) expresando la HA de PR8 bajo control del promotor de CAG (AcCAG-HA) [77]. Inmunización intramuscular, intranasal, intradérmica e intraperitoneal o ratones con AcCAG-HA obtuvo respuestas anticuerpos específicos de HA, sin embargo sólo la inmunización intranasal proporcionó protección contra el desafío letal. Curiosamente, la inmunización intranasal con el tipo salvaje AcNPV también resultó en protección contra el desafío PR8. La respuesta inmune innata robusta al baculovirus proporcionó Aunque estos estudios no demostraron una protección específica, hubo respuestas inmunes específicas de antígenos y posibles efectos adyuvantes por la respuesta innata. También se han explorado virus pseudotipo del Baculovirus. Se utilizó la proteína G del virus de la estomatitis vesicular controlada por el promotor del poliedro de insectos y la HA de A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV controlada por un promotor del CMV para generar el BV-G-HA. La inmunización intramuscular de ratones o pollos con BV-G-HA provocó fuertes respuestas de anticuerpos séricos HI y VN, respuestas IFN-γ, y protegida contra el desafío H5N1 [79]. Un estudio separado demostró la eficacia utilizando un vector pseudotipo bivalente del baculovirus [80]. El Baculovirus también se ha utilizado para generar una vacuna antipartícula inactiva La HA de A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) fue incorporada a un vector comercial de baculovirus controlado por el promotor e1 del Virus del Síndrome de White Spot. El virus recombinante resultante fue propagado en células de insectos (Sf9) e inactivado como una vacuna de partículas [81, 82]. La administración intranasal con toxina de cólera B como adyuvante obtuvo títulos robustos de IH y protegido contra el desafío letal [81]. La administración oral de esta vacuna encapsulada indujo títulos robustos de IH sérico y títulos de IgA mucosal en ratones, y protegido contra el desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, también se ha demostrado que las coformulaciones de vectores de baculovirus inactivados son eficaces en ratones [83]. Aunque hay datos crecientes sobre el uso potencial del baculovirus o el baculovirus pseudotipo como vector de la vacuna, no hay datos de eficacia en modelos animales de mamíferos distintos de los ratones. Tampoco hay datos sobre la seguridad en los seres humanos, lo que reduce el entusiasmo por el baculovirus como vector de la vacuna contra la gripe en este momento. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus de ARN de sentido negativo de una sola cadena que causa la enfermedad en las aves de corral. NDV tiene una serie de cualidades atractivas como vector de la vacuna. Como virus aviar, hay poca o ninguna inmunidad preexistente a NDV en humanos y NDV propaga a títulos altos tanto en huevos de pollo como en cultivos celulares. Como paramixovirus, no hay fase de ADN en el ciclo vital del virus que reduce las preocupaciones de los eventos de integración, y los niveles de expresión génica son impulsados por la proximidad a Este gradiente de expresión génica permite la atenuación a través del reordenamiento del genoma, o por la inserción de transgenes dentro del genoma. Finalmente, la patogenicidad de la NDV está determinada en gran medida por las características de la proteína de fusión que permiten la atenuación rápida del vector vacunal [84]. Genética inversa, método que permite rescatar a NDV de los plásmidos que expresan la polimerasa de ARN viral y proteínas nucleocápsidas, fue reportado por primera vez en 1999 [85, 86]. Este proceso ha permitido la manipulación del genoma NDV, así como la incorporación de transgenes y el desarrollo de vectores NDV. La gripe fue la primera enfermedad infecciosa dirigida con un vector NDV recombinante. La proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1) se insertó en la cepa Si bien el virus fue atenuado en comparación con la cepa de la vacuna parental, indujo una fuerte respuesta de anticuerpos séricos y se protegió contra el desafío del virus de la gripe homóloga en un modelo murino de infección [87]. Posteriormente, se probó el rNDV como vector de la vacuna contra el virus HPAIV con una eficacia variable frente a las infecciones por el virus de la gripe H5 y H7 en aves de corral [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94]. Estas vacunas tienen el beneficio añadido de proporcionar potencialmente protección contra el virus de la gripe y la infección por el NDV. También se ha explorado el NDV como vector de la vacuna para seres humanos. La administración intranasal e intratraqueal de las vacunas rNDV-HA o rNDV-NA indujo las respuestas de anticuerpos séricos y mucosas y protegió del desafío HPAIV [95, 96]. NDV tiene datos clínicos limitados; sin embargo, los ensayos clínicos de fase I y fase I/II han demostrado que el vector NDV está bien tolerado, incluso a altas dosis entregadas por vía intravenosa [44, 97]. Aunque estos resultados son prometedores, se necesitan estudios adicionales para avanzar en el NDV como vector de vacuna humana contra la gripe. Parainfluenza virus tipo 5 (PIV5) es un vector vacunal paramixovirus que se explora para el suministro de antígenos de la vacuna contra la gripe y otras enfermedades infecciosas. PIV5 ha sido descrito recientemente como vector vacunal [98]. Al igual que otros virus ARN, PIV5 Por ejemplo, PIV5 tiene un genoma de ARN estable y ninguna fase de ADN en el ciclo de replicación del virus reduciendo preocupaciones de integración o modificación del genoma del huésped. PIV5 puede crecer a títulos muy altos en sustratos de cultivos celulares de vacunas de mamíferos y no es citopática permitiendo un cultivo prolongado y cosecha del virus de la vacuna [98, 99]. Al igual que NDV, PIV5 tiene un gradiente de 3' a 5' de expresión génica e inserción de transgenes en diferentes lugares en el genoma puede invariablemente atenuar el virus y alterar la expresión de transgenes [100]. PIV5 tiene un amplio tropismo, infectando muchos tipos de células, tejidos y especies sin causar enfermedad clínica, aunque PIV5 se ha asociado con la tos de perno en perros [99]. Se utilizó por primera vez un sistema de genética inversa para la PIV5 para insertar el gen HA de A/Udorn/307/72 (H3N2) en el genoma de PIV5 entre el gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y el gen polimerasa grande (L). Al igual que el NDV, la HA se expresó en altos niveles en células infectadas y se repitió de manera similar al virus del tipo salvaje, y lo que es más importante, no fue patógena en ratones inmunodeficientes [98]. Además, se demostró que una única inmunización intranasal en un modelo murino de infección por gripe induce respuestas neutralizantes de anticuerpos y protege contra un virus que expresa la proteína homóloga de HA [98]. Los ratones vacunados intranasalmente con una dosis única de vacuna PIV5-H5 tuvieron respuestas sólidas de anticuerpos séricos y mucosas, y fueron protegidos contra el desafío letal. En particular, aunque las respuestas inmunes celulares parecían contribuir a la protección, los anticuerpos séricos fueron suficientes para la protección frente al desafío [100, 101]. La inmunización intramuscular con PIV5-H5 también demostró ser eficaz para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes y proteger contra el desafío del virus de la gripe letal [101]. La PIV5 que expresa la proteína NP del HPAIV también fue eficaz en el modelo de inmunización y desafío murino, donde una única inmunización intranasal indujo respuestas robustas de células CD8 + T y protegida contra el desafío del virus homólogo (H5N1) y heterosubtípico (H1N1) [102]. Actualmente no hay datos clínicos de seguridad para el uso Sin embargo, la PIV5 viva ha sido un componente de las vacunas veterinarias para la tos de perrera durante > 30 años, y los veterinarios y dueños de perros están expuestos a la PIV5 viva sin enfermedad notificada [99]. Esto combinado con los datos preclínicos de una variedad de modelos animales sugiere que la PIV5 como vector es probable que sea segura en los seres humanos. Como la inmunidad preexistente es una preocupación para todas las vacunas con vectores de virus, debe señalarse que no hay datos sobre los niveles de inmunidad preexistente a la PIV5 en humanos. Sin embargo, un estudio que evalúa la eficacia de una vacuna PIV5-H3 en caninos previamente vacunados contra la PIV5 (tos de perrera) mostró inducción de respuestas de anticuerpos séricos anti-H3 robustas, así como altos niveles de anticuerpos séricos a la vacuna PIV5, lo que sugiere que la inmunidad preexistente al vector PIV5 La terminación del programa de vacunación contra el virus de la viruela ha dado lugar a que una gran población de individuos naïve del virus de la viruela tenga la oportunidad de utilizar los virus de la viruela como vectores sin inmunidad preexistente [103]. En 1982 se propuso por primera vez la utilización de vacunas con vectores del virus de la viruela con dos informes de virus de la vaccinia recombinante que codificaban y expresaban el gen funcional de la timidina cinasa del virus del herpes [104, 105]. En un año, se demostró que un virus de la vaccinia que codificaba la HA de un virus H2N2 expresaba una proteína funcional del virus de la HA (dejada en las subunidades HA1 y HA2) y era inmunogénico en conejos y hamsters [106]. Posteriormente, las diez proteínas primarias de la gripe se han expresado en virus vacunal [107]. El trabajo temprano con vectores intactos del virus de la vaccinia planteó problemas de seguridad, ya que hubo una reactogenicidad sustancial que obstaculizó el desarrollo de la vacuna recombinante [108]. Se desarrollaron dos vectores de vaccinia para abordar estos problemas de seguridad. La cepa modificada del virus de la vaccinia Ankara (MVA) fue atenuada por el paso 530 veces en cultivos de fibroblastos embrionarios de pollitos. El segundo virus de la vaccinia de Nueva York (NYVAC) fue un clon purificado en placa de la cepa de la vacuna de Copenhague atenuada racionalmente por la eliminación de 18 marcos de lectura abiertos [109] [119]. El virus modificado de la vaccinia Ankara (MVA) fue desarrollado antes de la erradicación de la viruela para reducir o prevenir los efectos adversos de otras vacunas de la viruela [109]. Los defectos afectaron a las etapas tardías del ensamblaje del virus en células no aviares, una característica que permite el uso del vector como vector de expresión monorredominal en huéspedes no permisivos. Curiosamente, hace más de dos décadas, se demostró que el MVA recombinante que expresa el HA y el NP del virus de la gripe era eficaz contra el desafío del virus de la gripe letal en un modelo murino [112]. Posteriormente, el MVA que expresa diversos antígenos de estacionalidad, pandemia (A/California/04/2009, pH1N1), equinos (A/Equina/Kentucky/1/81 H3N8), y virus HPAI (VN1203) han demostrado ser eficaces en modelos de desafío murina, hurón, NHP y equinos [113]. Las vacunas MVA son estimulantes muy eficaces de la inmunidad celular y humoral. Por ejemplo, la infección abortiva proporciona la expresión nativa de los antígenos de gripe que permiten respuestas robustas de anticuerpos a antígenos virales de superficie nativa. Al mismo tiempo, los péptidos intracelulares de gripe expresados por el vector de la viruela entran en la vía de procesamiento y presentación del antígeno MHC de clase I que permite la inducción de respuestas antivirales de células CD8 + T. MVA también induce respuestas de células CD4 + T que contribuyen aún más a la magnitud de las funciones efectoras específicas del antígeno [107, [112] [113] [114] [114]. MVA también es un potente activador de respuestas inmunes tempranas innatas que mejoran aún más las respuestas inmunes adaptativas [116]. Con amplios datos preclínicos, las vacunas de VAM recombinantes que expresan antígenos de gripe han sido probadas en ensayos clínicos y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [117] [118]. Estos resultados, combinados con datos de otros estudios clínicos y preclínicos (no influenza), apoyan al VAM como una de las principales vacunas candidatas a los vectores virales. El vector NYVAC es una cepa del virus de la vaccinia altamente atenuada. NYVAC está restringido a la replicación; sin embargo, crece en fibroblastos embrionarios de pollitos y células de Vero que permiten la producción a escala vacunal. En las células no permisivas, las proteínas estructurales tardías críticas no se producen deteniendo la replicación en el estadio del virión inmaduro [120]. El NYVAC es muy atenuado y se considera Tanto el VAM como el NYVAC provocan respuestas humorales robustas, y se pueden administrar mucosas para inducir respuestas de anticuerpos mucosas [121]. Se ha demostrado que la exploración del VAMC como vector de la vacuna contra el virus de la gripe es limitada; sin embargo, se ha demostrado que una vacuna que expresa la HA de A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) induce respuestas de anticuerpos neutralizantes potentes y protege contra el desafío en los cerdos [122]. Si bien hay datos sólidos de seguridad y eficacia para el uso de vacunas de NYVAC o de gripe con VAM, la inmunidad preexistente sigue siendo motivo de preocupación. Aunque la campaña de vacunación contra la viruela ha dado lugar a una población de personas que no han recibido la vacuna contra el virus de la viruela, el inicio de un programa de vacunación contra el VIH, la gripe u otros patógenos de la VAMC para Si bien existe un interés significativo en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela, las estrategias actuales de vacunación contra la gripe se basan en la vacunación regular con vacunas combinadas con cepas circulantes, lo que probablemente limitaría el uso y/o la eficacia de las vacunas contra el virus de la gripe con vectores de viruela para su uso regular y estacional [13]. Es curioso que el NYVAC pueda tener una ventaja para su uso como vector de la vacuna contra la gripe, ya que la inmunización con este vector induce respuestas inmunes específicas de la vacuna más débiles en comparación con otras vacunas contra el virus de la viruela, una característica que puede abordar las preocupaciones relacionadas con la inmunidad preexistente [123]. La vacuna con vectores de virus de la gripe aviar, que expresa el antígeno HA del virus de la gripe aviar, tiene el beneficio añadido de proporcionar protección contra la infección por esta enfermedad. Actualmente, al menos diez vacunas con vectores de virus de la viruela han sido autorizadas para uso veterinario [126]. Estos vectores de virus de la viruela tienen el potencial de ser utilizados como vectores de vacunas en seres humanos, similar al primer uso de la viruela para la vacunación contra la viruela [127]. La disponibilidad de estos vectores de virus de la viruela no humanos con amplios datos de seguridad y eficacia de los animales puede abordar los problemas con la inmunidad preexistente a las cepas de vacunas humanas, aunque la reactividad cruzada descrita originalmente con el virus de la viruela también podría limitar el uso. Tanto los vectores de la vacuna VSV vivos como los defectuosos de replicación han demostrado ser inmunogénicos [128, 129], y como Paramyxoviridae, el genoma de Rabdoviridae tiene un gradiente de expresión génica de 3' a 5' que permite la atención mediante la inserción selectiva del gen vacunal o el reordenamiento del genoma [130]. El VSV tiene otras ventajas, incluyendo el tropismo de tejido amplio y el potencial de inmunización intramuscular o intranasal. Este último método de administración permite la inducción de la inmunidad mucosal y la eliminación de agujas necesarias para la vacunación. Además, hay poca evidencia de la seropositividad del VSV en seres humanos que eliminan preocupaciones de inmunidad preexistente, aunque el uso repetido puede ser una preocupación. Tanto la HA como la NA se expresaron como proteínas funcionales y se incorporaron a las partículas VSV recombinantes [131]. Posteriormente, VSV-HA, expresando la proteína HA de A/WSN/1933 (H1N1), demostró ser inmunogénica y proteger a los ratones del desafío del virus de la gripe letal [129]. Para reducir las preocupaciones de seguridad, se desarrollaron vectores VSV atenuados. Una vacuna candidata tenía una proteína VSV G truncada, mientras que un segundo candidato era deficiente en la expresión de la proteína G y se basó en la proteína G expresada por una línea celular de vacuna ayudante para proporcionar el receptor del virus. Ambos vectores se encontraron atenuados en ratones, pero mantuvieron la inmunogenicidad [128]. Más recientemente, las vacunas VSV replicantes de un solo ciclo han sido probadas para la eficacia frente a H5N1 HPAIV. Se demostró que los vectores VSV que expresan la HA de A/Hong Kong/156/97 (H5N1) son inmunogénicos e inducen respuestas de anticuerpos de reacción cruzada y protegen contra el desafío con el desafío H5N1 heterólogo en los modelos murino y NHP [132] [134]. Los vectores VSV no carecen de preocupaciones potenciales. El VSV puede causar enfermedad en una serie de especies, incluyendo humanos [135]. El virus también es potencialmente neuroinvasivo en algunas especies [136], aunque los estudios del NHP sugieren que esto no es una preocupación en humanos [137]. Además, si bien la incorporación del antígeno de gripe en el virion puede proporcionar algún beneficio en inmunogenicidad, los cambios en el tropismo o la atenuación podrían surgir de la incorporación de diferentes glicoproteínas de gripe. No obstante [134]. En la actualidad, no existen datos de seguridad humana para las vacunas con VSV. Si bien los datos experimentales son prometedores, es necesario realizar un trabajo adicional antes de considerar la vacunación contra la gripe humana. Las vacunas actuales se basan en la compatibilidad del antígeno de HA de la vacuna con cepas circulantes para proporcionar respuestas de anticuerpos neutralizantes específicas por cepas [4, 14, 24]. Hay un interés significativo en desarrollar vacunas universales contra la gripe que no requieran una reformulación anual para proporcionar una inmunidad protectora robusta y duradera. Estas vacunas se basan en la generación de respuestas inmunes específicas a las porciones del virus altamente conservadas que son refractarias a la mutación [30] [31] [32]. Las vacunas tradicionales pueden no ser adecuadas para estas estrategias de vacunación; sin embargo, las vacunas vectorizadas que tienen la capacidad de ser fácilmente modificadas y de expresar transgenes son compatibles para estas aplicaciones. El trabajo temprano con vectores virales recombinantes demostró que la inmunización con vacunas que expresan antígenos de gripe indujo respuestas potentes de células CD8 + T [107, [138] [139] [140] [141]. Estas respuestas, incluso al antígeno HA, podrían ser cruzadas [138]. Varios estudios han demostrado que la inmunización con NP expresada por AAV, rAd5, vectores de virus alfa, MVA u otros sistemas vectores induce respuestas potentes de células CD8 + T y protege contra el desafío del virus de la gripe [52, 63, 69, 102, 139, 142]. Dado que la proteína NP es altamente conservada a través de virus influenza A, las células T específicas de NP pueden proteger contra los desafíos heterólogos e incluso del virus heterosubtípico [30]. La proteína M2 también es altamente conservada y expresada en la superficie de células infectadas Gran parte del trabajo de la vacuna en esta área se ha centrado en partículas víricas o subunidades que expresan el ectodominio M2; sin embargo, estudios que utilizan estrategias de DNA-prime, rAd-boost para vacunar contra toda la proteína M2 han demostrado que el antígeno es inmunogénico y protector [50]. En estos estudios, anticuerpos contra la proteína M2 protegidos contra desafíos homólogos y heterosubtípicos, incluyendo un desafío H5N1 HPAIV. Más recientemente, NP y M2 se han combinado para inducir respuestas ampliamente reactivas de células CD8 + T y anticuerpos, y vacunas rAd5 que expresan estos antígenos han demostrado proteger contra desafíos pH1N1 y H5N1 [29, 51]. Históricamente, el HA no ha sido ampliamente considerado como un antígeno vacunal universal. Sin embargo, la reciente identificación de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus que reaccionan de forma cruzada con muchos subtipos del virus de la gripe [143] ha presentado la oportunidad de diseñar antígenos vacunales a las respuestas de anticuerpos focalizados principales a las regiones altamente conservadas reconocidas por estos anticuerpos monoclonales. La mayoría de estos anticuerpos ampliamente reactivas reconocen regiones en el tallo de la proteína HA [143]. El tallo HA es generalmente menos inmunogénico en comparación con la cabeza globular de la proteína HA, por lo que la mayoría de los enfoques han utilizado proteínas HA sin cabeza como inmunogenes. Las vacunas HA tallo se han diseñado utilizando ADN y partículas similares a virus [144] y MVA [142] ; sin embargo, estos enfoques son susceptibles de expresión en cualquiera de los virus vectores descritos aquí.El objetivo de cualquier vacuna es proteger contra infecciones y enfermedades, al tiempo que induce la inmunidad basada en la población Es evidente que las vacunas contra la gripe actualmente autorizadas no han cumplido plenamente estos objetivos, ni las específicas para inducir una inmunidad sólida a largo plazo. Hay una serie de cuestiones relacionadas con la vacuna que deben abordarse antes de que se optimicen las estrategias de vacunación contra la gripe basadas en la población. Es necesario actualizar el concepto de una vacuna de un solo tamaño que se ajuste a todas las vacunas, dada la reciente capacidad de investigar la interfaz virus-anfitriona mediante enfoques de interferencia del ARN que faciliten la identificación de genes anfitriones que afecten a la replicación del virus, la inmunidad y la enfermedad. También es necesario revisar las estrategias actuales de vacunación contra el virus de la gripe para las poblaciones en riesgo, en particular las de ambos extremos del espectro de edad. Un ejemplo de un régimen mejorado de vacunas podría incluir el uso de una vacuna contra el virus de la gripe vectorizada que exprese las proteínas HA, NA y M y/o NP para los dos subtipo Las vacunas Vectoradas pueden ser construidas para expresar proteínas del virus de la gripe de larga duración, así como generar epitopos conformacionalmente restringidos, características críticas para generar una protección humoral adecuada. La inclusión de antígenos de la gripe interna en una vacuna vectorizada también puede inducir altos niveles de inmunidad celular protectora. Para generar inmunidad sostenida, es una ventaja inducir inmunidad en sitios de inmunidad inductiva a la infección natural, en este caso el tracto respiratorio. Varias vacunas vectorizadas se dirigen al tracto respiratorio. Típicamente, las vacunas vectorizadas generan antígenos durante semanas después de la inmunización, en contraste con la vacunación subunidad. Este aumento de la presencia y el nivel de antígeno de la vacuna contribuye y ayuda a mantener una respuesta inmune de memoria duradera, incluso aumentando la selección de células secretas de anticuerpos de afinidad superior. Por lo tanto, para los antígenos más débiles típicos de la HA, las vacunas vectorizadas tienen la capacidad de superar las limitaciones reales para lograr una protección robusta y duradera. Cumplir los mandatos del desarrollo estacional de la vacuna contra la gripe es difícil, y responder a una cepa pandémica es aún más difícil. Los problemas con la selección de cepas de la vacuna contra la gripe basada en virus que circulan recientemente a menudo reflejan recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un proceso que es engorroso. Las cepas de virus de la gripe A que se utilizan en la fabricación de vacunas no son virus de tipo salvaje, sino más bien reasociantes que son virus híbridos que contienen al menos los segmentos de genes HA y NA de las cepas objetivo y otros segmentos genéticos de la cepa principal, PR8, que tiene propiedades de alto crecimiento en los huevos de gallina fertilizada. Este proceso adicional requiere más tiempo y control de calidad En cambio, las vacunas con vectores virales son relativamente fáciles de manipular y producir, y tienen perfiles de seguridad bien establecidos. Existen varios vectores basados en virus empleados actualmente como sistemas vectores de antígenos, incluyendo poxvirus, adenovirus baculovirus, paramixovirus, rabdovirus, y otros; sin embargo, la mayoría de los ensayos clínicos humanos que evalúan las vacunas contra la gripe con vectores virales utilizan vectores de poxvirus y adenovirus. Si bien cada uno de estos enfoques vectoriales tiene características únicas y se encuentra en diferentes etapas de desarrollo, los éxitos combinados de estos enfoques apoyan el enfoque de la vacuna con vectores virus en su conjunto. Las vacunas con vectores de virus son particularmente prometedoras para la vacunación con antígenos universales o enfocados donde los métodos de vacunación tradicionales no son adecuados para la administración eficaz de estos antígenos. Los enfoques más prometedores actualmente en desarrollo son, sin duda, los dirigidos a los epitopos de la región de tallo de HA conservada.

¿Qué son los alfavirus?