Source: http://docplayer.pl/1202884-Oligonukleotydy-jako-potencjalne-czynniki-terapeutyczne-skierowane-przeciw-wirusowi-zapalenia-w1troby-typu-c.html
Timestamp: 2017-05-30 07:21:08
Legal References Found: art. 5
 art. 31
 art. 1
 art. 2
 ART. 151
 art. 107
 art. 49
 art. 49
 Art. 176

Document Content:
Oligonukleotydy jako potencjalne czynniki terapeutyczne skierowane przeciw wirusowi zapalenia w¹troby typu C - PDF
Oligonukleotydy jako potencjalne czynniki terapeutyczne skierowane przeciw wirusowi zapalenia w¹troby typu C
Download "Oligonukleotydy jako potencjalne czynniki terapeutyczne skierowane przeciw wirusowi zapalenia w¹troby typu C"
Dominika Antonina Wróbel
1 PRACE PRZEGL DOWE Oligonukleotydy jako potencjalne czynniki terapeutyczne skierowane przeciw wirusowi zapalenia w¹troby typu C Agata Œwi¹tkowska, Jerzy Ciesio³ka Pracownia Biochemii RNA, Instytut Chemii Bioorganicznej, Polska Akademia Nauk, Poznañ Oligonucleotides as potential therapeutic tools against hepatitis C virus Summary Hepatitis C virus belongs to the group of particularly dangerous and most extensively studied RNA viruses. Since no vaccine for HCV is known and post-exposure treatment of infected patients has not been yet optimal, novel therapeutic strategies are being developed very intensively. Oligonucleotide-based molecular tools such as antisense oligonucleotides, ribozymes, DNAzymes, aptamers and interfering RNAs are proving as effective modulators of gene expression and potential therapeutics. Several examples of oligonucleotide-based molecular tools directed towards HCV viral RNA are discussed in this review. Key words: Hepatitis C virus, oligonucleotide-based therapy, antisense oligonucleotide, ribozyme, aptamer, DNAzyme, RNAi. Adres do korespondencji Jerzy Ciesio³ka, Pracownia Biochemii RNA, Instytut Chemii Bioorganicznej, Polska Akademia Nauk, ul. Noskowskiego 12/14, Poznañ. 1 (88) Wprowadzenie Ogólnoœwiatowe zagro enie jakie niesie za sob¹ coraz wiêksze rozprzestrzenianie siê wirusa zapalenia w¹troby typu C (HCV) jest bodÿcem do coraz bardziej intensywnych poszukiwañ nowych terapeutyków, szczególnie w obliczu braku szczepionki, która chroni³aby przed zaka eniem. Obecnie stosowane formy leczenia oparte na interferonie i rybawirynie przynosz¹ zadowalaj¹ce rezultaty jedynie w 40-60% przypadków infekcji wirusowej.2 Agata Œwi¹tkowska, Jerzy Ciesio³ka Znalezienie uniwersalnego leku utrudnia du a zmiennoœæ genetyczna wirusa HCV i jego mo liwoœci adaptacyjne. W poszukiwaniu terapeutyków nowej generacji skierowanych przeciw wirusowi HCV w ostatnich latach uwagê zwrócono na narzêdzia molekularne oparte na kwasach nukleinowych, takie jak: oligomery typu antysens, rybozymy i DNAzymy, a tak e interferencyjne RNA. Atakuj¹ one wirusowy genom RNA wi¹ ¹c siê do niego bezpoœrednio w miejscu przewidzianym regu³ami parowania zasad Watsona-Cricka. Strategie antywirusowe tego typu charakteryzuje wiele zalet. Po pierwsze, konstruowanie potencjalnych terapeutyków o wysokiej specyficznoœci oparte jest na znajomoœci sekwencji nukleotydowej danego wirusa i nie wymaga wczeœniejszego poznania funkcji atakowanych genów. Po drugie, inhibicja syntezy nawet jednego wa nego bia³ka wirusowego mo e zaburzaæ cykl yciowy wirusa. Ponadto, narzêdzia molekularne mo - na zaplanowaæ tak, aby atakuj¹c geny wirusowe nie zaburza³y genów komórki gospodarza, minimalizuj¹c b¹dÿ eliminuj¹c w ten sposób efekty uboczne terapii. 2. Oligonukleotydy typu antysens Antysensowe oligonukleotydy DNA po raz pierwszy zosta³y zastosowane w systemie komórkowym w 1978 r. przez Zamecnika i Stephensona (1). Przy³¹czaj¹ siê one do docelowej cz¹steczki RNA na zasadzie parowania zasad wg modelu Watsona-Cricka, dzia³aj¹c na dwóch zasadniczych drogach. Po pierwsze, powsta³y heterodupleks DNA-RNA rozpoznawany jest przez RNazê H, która hydrolizuje cz¹steczkê RNA w obrêbie heterodupleksu. Po drugie, zak³ada siê, e przy³¹czony oligonukleotyd stanowi zawadê steryczn¹ dla rybosomu, utrudniaj¹c jego przy³¹czenie lub przesuwanie siê wzd³u mrna, co w konsekwencji obni a wydajnoœæ translacji (2,3). Efektywnoœæ dzia³ania oligonukleotydów antysensowych zale y od wielu czynników, przy czym jednym z najistotniejszych jest ich stabilnoœæ in vivo. Oligonukleotydy s¹ nietrwa³e w warunkach komórkowych ze wzglêdu na podatnoœæ do hydrolizy pod wp³ywem nukleaz. Zwiêkszenie trwa³oœci oligonukleotydów in vivo, uzyskane poprzez zastosowanie niehydrolizowalnych analogów nukleotydowych, znacznie przyspieszy³o prace nad wykorzystaniem oligonukleotydów jako potencjalnych terapeutyków (4). Oligonukleotydy antysensowe sta³y siê szans¹ na opracowanie nowej formy terapii w leczeniu zaka enia wirusem HCV. Co roku ukazuje siê kilkadziesi¹t publikacji opisuj¹cych ró ne podejœcia eksperymentalne wykorzystania tej strategii w walce z wirusem. Najczêœciej atakowanymi fragmentami genomu wirusa HCV s¹ jego regiony niekoduj¹ce, dotyczy to zarówno nici o polarnoœci dodatniej, jak i nici replikacyjnej (5-10). Szczególnie atrakcyjnym miejscem ataku jest region zlokalizowany na koñcu 5 nici genomowej, w obrêbie którego znajduje siê element IRES odpowiedzialny za inicjacjê translacji wirusowej poliproteiny w procesie niezale nym od 5 -terminalnej struktury kapu (rys. 1). Równie w czêœci koduj¹cej genomu wirusa 14 PRACE PRZEGL DOWE3 Oligonukleotydy jako potencjalne czynniki terapeutyczne skierowane przeciw wirusowi Rys. 1. Struktura drugorzêdowa 5 UTR wirusa HCV z zaznaczonymi wybranymi oligomerami typu antysens, które powodowa³y inhibicjê translacji zale nej od elementu IRES. Opracowano na podstawie (90). BIOTECHNOLOGIA 1 (88)4 Agata Œwi¹tkowska, Jerzy Ciesio³ka HCV próbuje siê znaleÿæ miejsca zdolne do wi¹zania oligomerów antysensowych np. w obrêbie regionu koduj¹cego zachowawcze bia³ko nukleokapsydu lub proteazê NS3 (4,11-13). Efektywnoœæ dzia³ania oligonukleotydów antysensowych skierowanych przeciwko wirusowi HCV jest ró na i mieœci siê w przedziale od 30 do ponad 90%. S¹dzi siê, e tak szeroki zakres efektywnoœci u ytych oligonukleotydów wynika przede wszystkim ze zró nicowania dostêpnoœci do hybrydyzacji atakowanych regionów RNA. Wiêkszoœæ projektowanych oligonukleotydów skierowanych jest przeciwko regionom niekoduj¹cym, poniewa pe³ni¹ one podstawow¹ rolê w cyklu yciowym wirusa oraz cechuj¹ siê wysok¹ zachowawczoœci¹. Regiony te charakteryzuj¹ siê jednak silnie uporz¹dkowan¹ struktur¹, co stanowi du e utrudnienie w znalezieniu miejsc umo liwiaj¹cych zwi¹zanie oligomeru. Czêsto rozbie ne wyniki badañ dotycz¹cych zastosowania oligonukleotydów antysensowych wynikaj¹ tak e z u ycia ró nych modeli, w jakich przeprowadzane s¹ testy. Wiele wczeœniejszych prac prowadzonych by³o w warunkach in vitro (14,15). Wraz z pojawieniem siê replikonów i linii komórkowych, które umo liwiaj¹ namna anie siê wirusa HCV, pojawia siê coraz wiêcej doniesieñ o badaniach w kulturach komórkowych i na modelach zwierzêcych (6,9). Przyk³adem oligonukleotydu antysensowego skierowanego przeciwko wirusowi HCV jest oligomer ISIS14803, zaproponowany przez firmê ISIS Pharmaceuticals (Carlsbad, USA), który zawiera atomy siarki w miejscu niewi¹ ¹cych atomów tlenu wi¹zañ internukleotydowych (16,17). Jest on komplementarny do fragmentu domeny IV (nt ) elementu IRES wirusa HCV (rys. 1). W badaniach przedklinicznych w uk³adach komórkowych oraz na modelu mysim wykazano, e oligonukleotyd ten bardzo efektywnie blokuje translacjê i replikacjê wirusa. W I fazie prób klinicznych zaobserwowano, e po czterech tygodniach od podania oligomeru ISIS14803, u trzech z dwudziestu oœmiu pacjentów z chroniczn¹ infekcj¹ wirusem HCV nast¹pi³o 10-krotne obni enie poziomu wirusowego RNA we krwi (17). Obecnoœæ oligomeru by³a dobrze tolerowana przez organizmy pacjentów, aczkolwiek zaobserwowano 10-krotny wzrost poziomu aminotransferazy alaniny (ALT), który po kilku tygodniach wróci³ do normy. Wiêkszoœæ pacjentów zainfekowana by³a wirusem o genotypie 1, najbardziej opornym na leczenie interferonem. Jednak- e dalsze badania nad oligomerem ISIS14803 wstrzymano z uwagi na ma³¹ skutecznoœæ terapii i obawy zwi¹zane z mo liwymi efektami ubocznymi (18). Inny oligonukleotyd antysensowy skierowany przeciwko wirusowi HCV to AVI-4065 (19). Zawiera³ on ugrupowania fosforoamido-morfolinowe (PMO, ang. Phosphoramidate-Morpholino), a testowany by³ przez firmê AVI BioPharma (Portland, USA). W badaniach przeprowadzonych in vitro oraz na modelach zwierzêcych sugerowano, e AVI-4065 posiada zdolnoœæ hamowania ekspresji wszystkich 5 genotypów wirusa HCV. Oligonukleotyd zakwalifikowany zosta³ do etapu II fazy badañ klinicznych, które zakoñczone zosta³y w 2008 r., lecz jak dot¹d ich wyniki nie zosta³y upublicznione (www.clinicaltrials.gov). 16 PRACE PRZEGL DOWE5 Oligonukleotydy jako potencjalne czynniki terapeutyczne skierowane przeciw wirusowi 3. Rybozymy i DNAzymy Dla celów terapii przeciwwirusowej najwiêksze znaczenie maj¹ warianty rybozymów wystêpuj¹cych w naturze, które poprzez ukierunkowane przeciêcie docelowej cz¹steczki RNA obni aj¹ ekspresjê genów wirusowych bia³ek lub hamuj¹ replikacjê wirusa. Efektywnoœæ dzia³ania rybozymów zale y od wielu czynników. Przy ich planowaniu przede wszystkim brana jest pod uwagê dostêpnoœæ cz¹steczki atakowanej do hybrydyzacji komplementarnych sekwencji oligonukleotydowych. Wa ne jest tak e, aby region rozpoznawany przez rybozym cechowa³ siê du ¹ zachowawczoœci¹ sekwencji (20-22). Kolejny wa ny czynnik to sposób dostarczenia rybozymu do komórki oraz jego kolokalizacja z docelow¹ cz¹steczk¹ RNA. Rybozym mo e byæ dostarczony w formie odpowiednio zaprojektowanego wektora ekspresyjnego, który wewn¹trzkomórkowo ulega transkrypcji lub mo e byæ wprowadzony bezpoœrednio do komórki w postaci RNA. Bezpoœrednie wprowadzenie rybozymu do komórki wymaga pokonania bariery, jak¹ stanowi¹ b³ony biologiczne. Najczêœciej jako noœniki (ang. delivery vehicle) wykorzystywane s¹ kationowe lipidy i liposomy, które z kwasami nukleinowymi tworz¹ kompleksy i dziêki nim na drodze endocytozy dochodzi do wprowadzenia rybozymu do komórki. Aby u³atwiæ uwolnienie rybozymu z endosomu, do noœnika do³¹czane s¹ zwi¹zki promuj¹ce zmiany w b³onie pêcherzyka endosomalnego np. cholesterol (23). Rybozymy chronione s¹ przed dzia³aniem egzoi endorybonukleaz komórkowych poprzez wprowadzenie do RNA ró nego typu modyfikacji chemicznych, podobnie jak w przypadku oligomerów antysensowych, np. podstawienie atomu siarki w miejsce atomu tlenu w wi¹zaniu fosfodiestrowym, obecnoœæ grupy 2 -fluoro, 2 -amino, 2 -O-metylo w reszcie rybozy, wprowadzenie tymidyny tworz¹cej wi¹zanie 3-3 na koñcu 3 cz¹steczki rybozymu (20,22). Zwiêkszenie stabilnoœci rybozymu w obecnoœci nukleaz umo liwia wyd³u enie czasu jego dzia³ania i w konsekwencji pozwala na zmniejszenie jego iloœci wprowadzanej do komórki. Wa ne, aby przy projektowaniu rybozymu by³a zachowana sekwencja wystêpuj¹ca preferencyjnie w obrêbie miejsca ciêcia np. dla rybozymu typu hammerhead to 5 -NUH-3 gdzie H oznacza ka dy nukleotyd z wyj¹tkiem G, natomiast dla rybozymu typu hairpin optymalna sekwencja to 5 -GUC-3. Wiêkszoœæ rybozymów skierowanych przeciwko wirusowi HCV planowanych jest na atakowanie jego regionów niekoduj¹cych (tab. 1). Najczêœciej wykorzystywane s¹ do tego celu rybozymy typu hammerhead. Pomimo ich du ej efektywnoœci w testach prowadzonych w warunkach in vivo, aden z nich nie zosta³ wykorzystany jako lek w terapii przeciwko wirusowi HCV. Na etapie II fazy badañ klinicznych pozosta³ heptazym, rybozym typu hammerhead, zaproponowany przez firmê Ribozyme Pharmaceuticals. Wykorzystanie heptazymu jako monoterapii spowodowa³o znacz¹ce obni enie iloœci RNA wirusa HCV we krwi u 10% pacjentów, jednak e z powodu braku danych dotycz¹cych toksycznoœci rybozymu (12-miesiêczna seria eksperymentów na jednym modelu zwierzêcym) nie zosta³ on zakwalifikowany do kolejnej fazy badañ klinicznych (http://www.sirna.com). W badaniach przeprowadzonych na BIOTECHNOLOGIA 1 (88)6 Agata Œwi¹tkowska, Jerzy Ciesio³ka modelu mysim wykazano natomiast, e aby osi¹gn¹æ terapeutyczne stê enie rybozymu, wymagane do efektywnej inhibicji translacji zale nej od elementu IRES wirusa HCV w uk³adzie komórkowym, trzeba by³o wprowadziæ do w¹troby jego wielokrotny nadmiar (24). Wysokie stê enie rybozymu zwiêksza prawdopodobieñstwo, e bêdzie on niespecyficznie oddzia³ywa³ z bia³kami i innymi elementami komórkowymi, powoduj¹c zaburzenia w jej prawid³owym funkcjonowaniu. Wybrane przyk³ady atakowania wirusa HCV za pomoc¹ rybozymów Tabela 1 Rybozym Atakowany fragment genomu wirusa HCV Œrodowisko reakcji Efektywnoœæ Literatura hammerhead 5 UTR komórki Huh % inhibicja translacji 5 UTR/LUC (74) hammerhead 5 UTR IRES minus komórki CHO, hepatocyty znacz¹ca eliminacja wirusa (75) w zainfekowanych komórkach hammerhead 5 UTR komórki HeLa i Hep3B 40-80% inhibicja translacji 5 UTR/LUC >90% inhibicja replikacji HCV-poliowirus PV chimery (76) hammerhead 5 UTR in vitro 90% inhibicja translacji 5 UTR/LUC (77) hammerhead 5 UTR komórki HeLa >98% inhibicja replikacji HCV-poliowirus PV chimery w obecnoœci IFN- 2a, IFN- 2b i IFN konsensus (78) hammerhead 5 UTR komórki HepG2 i CCL13 >70% inhibicja translacji 5 UTR/RLuc (79) hairpin 5 UTR bia³ko p³aszcza komórki HepG2 >70% inhibicja translacji >90% inhibicja translacji zastosowanie wektora retrowirusowego (80) hairpin 5 UTR 3 UTR (region X) 3 UTR nici replikacyjnej (region X(-)) komórki Huh % inhibicja translacji w uk³adzie bicistronowym prl-5 UTR-FL-3 UTR (brak znacz¹cego efektu dla rybozymu anty-5 UTR) >35% inhibicja replikacji 25-50% obni enie ekspresji NS5B delta 5 UTR in vitro 21-28% przeciêcia RNA IRES (82) w obecnoœci formamidu delta 5 UTR in vitro efektywne ciêcie RNA IRES (27) trans-splicing 5 UTR komórki Huh-7 >70% redukcja iloœci komórek spowodowana wyst¹pieniem efektu cytotoksycznego (29) Podczas projektowania rybozymów wprowadzane s¹ równie zmiany w globalnej architekturze ich cz¹steczek. Technika selekcji in vitro pozwala na otrzymanie tzw. rybozymów allosterycznych. Posiadaj¹ one dodatkowe domeny strukturalne, które, oddzia³uj¹c z odpowiednim efektorem np. niskocz¹steczkowym zwi¹zkiem (81) 18 PRACE PRZEGL DOWE7 Oligonukleotydy jako potencjalne czynniki terapeutyczne skierowane przeciw wirusowi Rys. 2. Schematyczne przedstawienie rybozymu SOFA (27) w formie nieaktywnej oraz w formie katalitycznie aktywnej. chemicznym lub bia³kiem, umo liwiaj¹ w sposób kontrolowany prze³¹czanie rybozymu z formy nieaktywnej w aktywn¹ (25,26). Ciekawym przyk³adem takiej regulacji jest rybozym HDV typu SOFA (ang. Specific On/Off Adaptor), posiadaj¹cy dodatkowe elementy: sekwencjê blokuj¹c¹ oraz biosensor, dziêki którym rybozym jest aktywny jedynie w obecnoœci efektora, którym jest docelowa cz¹steczka RNA (rys. 2) (27,28). Przy braku efektora, sekwencja blokuj¹ca oddzia³uje z regionem rozpoznawania substratu tworz¹c odcinek dwuniciowy, co powoduje, e rybozym przyjmuje formê nieaktywn¹. Biosensorem jest 15-nukleotydowy fragment sekwencji rybozymu komplementarny do sekwencji cz¹steczki docelowej. Obecnoœæ docelowego RNA powoduje rearan acjê struktury rybozymu, który przechodzi w formê aktywn¹, zdoln¹ do przeciêcia cz¹steczki docelowej (rys. 2). Rybozym-SOFA wykazuje wiêksz¹ efektywnoœæ w porównaniu z niezmodyfikowan¹ wersj¹ rybozymu HDV. Element IRES wirusa HCV przecinany by³ w warunkach in vitro przez rybozym typu dzikiego z bardzo ma³¹ wydajnoœci¹, natomiast intensywnoœæ ciêcia wzros³a wielokrotnie przy zastosowaniu rybozymu-sofa (27,28). Odmienne rozwi¹zania w terapii przeciwwirusowej oferuj¹ rybozymy zdolne do katalizowania reakcji splicingu in trans (ang. trans-splicing ribozymes). S¹ one wykorzystywane w warunkach in vivo do naprawiania zmutowanych nukleotydów w cz¹steczkach mrna. W badaniach skierowanych przeciwko wirusowi HCV zaproponowano tego typu rybozym, który przy³¹cza³ fragment RNA koduj¹cy bia³ko DTA (ang. Diphtheria Toxin A), wykazuj¹ce aktywnoœæ cytotoksyczn¹ (29). Fragment ten znajdowa³ siê pod kontrol¹ elementu IRES wirusa HCV, co umo liwia³o translacjê bia³ka DTA (rys. 3). Wprowadzenie rybozymu do komórek, które transfekowane by³y BIOTECHNOLOGIA 1 (88)8 Agata Œwi¹tkowska, Jerzy Ciesio³ka Rys. 3. Schemat przedstawiaj¹cy powstanie nowego transkryptu IRES-DTA za pomoc¹ rybozymu zdolnego do katalizowania reakcji splicingu in trans (29). DTA toksyczne bia³ko (ang. Diphtheria Toxin A). równoczeœnie konstruktem zawieraj¹cym element IRES, powodowa³o aktywacjê szlaku programowanej œmierci komórki. Rybozym cechowa³ siê przy tym du ¹ specyficznoœci¹, a obecnoœæ toksycznego bia³ka powodowa³a ponad 70% redukcjê iloœci ywych komórek, co œwiadczy³o o jego bardzo du ej efektywnoœci (29). Wprowadzenie toksycznego bia³ka do komórek w¹troby pacjenta nie wydaje siê jednak dobrym rozwi¹zaniem, poniewa niesie za sob¹ niebezpieczeñstwo uszkodzenia organu. Natomiast ciekawa jest idea wprowadzania za pomoc¹ rybozymów dzia³aj¹cych w ten sposób innych bia³ek np. zaanga owanych w odpowiedÿ immunologiczn¹. Technologia oparta na wykorzystaniu rybozymu RNazy P z przy³¹czon¹ sekwencj¹ EGS (ang. External Guide Sequence), komplementarn¹ do cz¹steczki docelowej, by³a z powodzeniem wykorzystana w badaniach nad inhibicj¹ wirusa cytomegalii (HCMV) (30), wirusa zespo³u nabytego braku odpornoœci (HIV) (31), czy te wirusa herpes simplex (HSV) (30). Natomiast w przypadku wirusa HCV zaobserwowano, e w warunkach in vitro ludzka RNaza P w sposób specyficzny rozpoznaje i przecina genom wirusa w obrêbie elementu IRES, w pobli u kodonu AUG (32). Równie RNaza P z cyjanobakterii Synechocystis hydrolizuje IRES w zbli onym regionie (33). Co ciekawe, rozpoznanie to nie wymaga sekwencji EGS, co œwiadczy o obecnoœci w obrêbie elementu IRES struktury podobnej do trna (ang. trna-like). Ponadto, w przypadku 20 PRACE PRZEGL DOWE9 Oligonukleotydy jako potencjalne czynniki terapeutyczne skierowane przeciw wirusowi bakteryjnej RNazy P, aktywnoœæ katalityczn¹ wykazuje komponent RNA bez udzia³u czêœci bia³kowej enzymu. Ta obserwacja mo e staæ siê podstaw¹ do zaprojektowania rybozymu, który móg³by inaktywowaæ wirusa HCV w komórkach. Dodatkowo zaobserwowano, e pojedyncze mutacje, które pojawiaj¹ siê w regionie rozpoznawanym przez bakteryjn¹ RNazê P, nie wp³ywaj¹ na efektywnoœæ ciêcia, co oznacza, e zaprojektowany na jej podstawie rybozym stanowi³ uniwersalne narzêdzie w inaktywacji wirusa HCV (33). Przyk³adem katalitycznych kwasów nukleinowych s¹ tak e deoksyrybozymy (DNAzymy) otrzymane drog¹ selekcji in vitro (22,34). Ich zwiêkszona stabilnoœæ w œrodowisku komórkowym w porównaniu do rybozymów, wysoka efektywnoœæ oraz szybka i tania synteza sprawi³y, e DNAzymy budz¹ du e zainteresowanie badaczy. Do tej pory ukaza³o siê tylko kilka publikacji przedstawiaj¹cych próbê wykorzystania DNAzymów w ukierunkowanej hydrolizie RNA wirusa HCV (35-37). DNAzym Dz858-4-OMe, zawieraj¹cy dodatkowo grupy 2 -O-metylo w obrêbie ramion wi¹ ¹cych substrat, powodowa³ w komórkach w¹trobowych 63% redukcjê iloœci RNA wirusa HCV i obni enie poziomu bia³ka p³aszcza o 87% (36). Uda³o siê otrzymaæ DNAzymy, które efektywnie blokowa³y translacjê zale n¹ od elementu IRES HCV w uk³adzie in vitro, jak równie w systemie komórkowym (37). Podjêto tak e próby zaprojektowania DNAzymów przeciwko 3 -terminalnemu regionowi X. Jednak e, spoœród siedmiu zbadanych tylko jeden wykazywa³ aktywnoœæ katalityczn¹ prowadz¹c do obni enia o oko³o 20% poziomu RNA w warunkach in vitro. Zwiêkszanie iloœci DNAzymu nawet do 2000-krotnego nadmiaru nie wp³ynê³o na efektywnoœæ ciêcia cz¹steczki docelowej (35). 4. Aptamery oraz inne niskocz¹steczkowe RNA Aptamery s¹ to cz¹steczki RNA uzyskane na drodze selekcji in vitro (metoda SELEX, ang. Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) o œciœle okreœlonych, po ¹danych w³aœciwoœciach np. wysokim powinowactwie do zwi¹zków niskocz¹steczkowych lub bia³ek (38). Metodê tê zastosowano tak e do poszukiwania aptamerów, które by³yby zdolne asocjowaæ do bia³ek lub fragmentów genomu wirusa HCV i w ten sposób zaburzaæ ich funkcje biologiczne. Dotychczas uda³o siê otrzymaæ aptamery, które efektywnie blokuj¹ aktywnoœæ polimerazy i proteazy wirusa. Z puli cz¹steczek RNA, które zawiera³y 35-nukleotydow¹ sekwencjê typu random wyselekcjonowano aptamer wykazuj¹cy du e powinowactwo (K d =1,5 nm) do bia³ka NS5B wirusa HCV w warunkach in vitro (39). Otrzymany 45-nukleotydowy aptamer by³ bardzo selektywny, poniewa nie oddzia³ywa³ z polimeraz¹ RNA wirusa polio ani z bia³kiem NS5B wirusa GBV-B, bardzo blisko spokrewnionego z wirusem HCV. Wykazano, e aptamer uniemo liwia³ tworzenie siê kompleksu bia³ka NS5B z matryc¹/ starterem poli(ra)/oligo(ru), a du y nadmiar matrycy/startera nie interferowa³ w oddzia³ywanie aptameru z bia³kiem. Oznacza to, e aptamer dzia³a³ na zasadzie inhibicji niekompetycyjnej, przy³¹czaj¹c siê w miejscu odleg³ym od miejsca przy³¹czania BIOTECHNOLOGIA 1 (88)10 Agata Œwi¹tkowska, Jerzy Ciesio³ka matrycy. W badaniach tych pokazano, e aptamer, oddzia³uj¹c z bia³kiem, mo e powodowaæ zamro enie struktury bia³ka w konformacji zamkniêtej, co uniemo liwia odpowiednie umiejscowienie matrycy w miejscu aktywnym (39). Przyk³adem innego aptameru specyficznie oddzia³uj¹cego z polimeraz¹ wirusa HCV jest aptamer RNA, który zosta³ wyselekcjonowany z biblioteki kombinatorycznej zawieraj¹cej 40-nukleotydowy region random (40). Aptamer ten by³ zdolny, przy szeœciokrotnym nadmiarze, wyprzeæ z kompleksu z polimeraz¹ wirusa HCV fragment RNA odpowiadaj¹cy regionowi 3 UTR lub regionowi X. Oznacza to, e wykazuje on wiêksze powinowactwo do bia³ka NS5B ni fragmenty RNA odpowiadaj¹ce matrycy oraz, e przy³¹cza siê prawdopodobnie w tym samym miejscu. Sugerowano, e wysoka efektywnoœæ aptameru mo e wynikaæ z jego strukturalnego podobieñstwa do regionu X wirusa HCV. Na podstawie mapowania kompleksu aptameru z polimeraz¹ za pomoc¹ trawienia RNazami wykazano jednak, e miejsca przy³¹czenia polimerazy w obrêbie aptameru s¹ inne ni w regionie X (40). Na drodze selekcji in vitro uda³o siê tak e otrzymaæ, z biblioteki kombinatorycznej cz¹steczek RNA o 30-nukleotydowym regionie random, trzy aptamery, które przy piêciokrotnym nadmiarze molowym obni a³y o 90% aktywnoœæ proteazy NS3 wirusa HCV (41). W obecnoœci kofaktora proteazy bia³ka NS4A, jej aktywnoœæ by³a redukowana do 30%. W badaniach mechanizmu inhibicji wykazano, e aptamery przy³¹cza³y siê do proteazy w miejscu odleg³ym od jej miejsca aktywnego. W celu sprawdzenia aktywnoœci w uk³adzie komórkowym jednego z wyselekcjonowanych aptamerów, aptameru G9-II, zaprojektowano specjalny wektor, w którym przy³¹czono go do rybozymu HDV (rys. 4) (42). Dodatkowo, wprowadzono sekwencjê CTE (ang. Constitutive Transport Element) u³atwiaj¹c¹ transport RNA z j¹dra do cytoplazmy. Taki uk³ad w wektorze ekspresyjnym wystêpowa³ w kilku kopiach, w celu zwiêkszenia iloœci aptameru w komórce, natomiast obecnoœæ rybozymu gwarantowa³a jego precyzyjne wyciêcie z d³ugiego transkryptu. Konstrukt HDV-G9-II wykazywa³ wiêksz¹ efektywnoœæ (50% obni enie aktywnoœci proteazy) ni aptamer G9-II, który by³ wprowadzany do komórek HeLa w pojedynczej kopii (42). Otrzymano równie aptamer RNA oddzia³uj¹cy specyficznie z domen¹ o aktywnoœci helikazy bia³ka NS3 wirusa HCV (43). Wykazywa³ on podobieñstwo strukturalne do regionu zmiennego w obrêbie 3 UTR, który mo e pe³niæ funkcjê regulatora aktywnoœci helikazy. Uzyskanie aptamerów specyficznie oddzia³uj¹cych z domen¹ o aktywnoœci proteazy oraz helikazy umo liwi³o zaprojektowane cz¹steczek RNA zdolnych do blokowania jednoczeœnie obydwu funkcji bia³ka NS3 w warunkach in vitro, oraz w warunkach komórkowych (44-46). Metodê selekcji in vitro wykorzystano tak e do znalezienia aptamerów oddzia- ³uj¹cych z regionem niekoduj¹cym 5 genomu wirusa HCV (47-49). Otrzymano dwa aptamery, które silnie wi¹za³y siê do pêtli apikalnej domeny II elementu IRES (K d = = 11 nm) oraz aptamer oddzia³uj¹cy z pêtl¹ apikaln¹ domeny IIId (47,50). W warunkach in vitro dwa pierwsze aptamery powodowa³y inhibicjê translacji zale nej od elementu IRES wirusa HCV o oko³o 30%, natomiast aptamer trzeci a o 90%. W tym 22 PRACE PRZEGL DOWE11 Oligonukleotydy jako potencjalne czynniki terapeutyczne skierowane przeciw wirusowi Rys. 4. Schemat otrzymania konstruktu rybozym HDV-aptamer G9-II przez Nishikawê i wsp. (42). Strza³k¹ zaznaczone miejsce autokatalitycznego przecinania siê rybozymu HDV. przypadku jego przy³¹czenie do domeny IIId zaburzy³o prawdopodobnie oddzia- ³ywanie z podjednostk¹ 40S rybosomu. Przyk³adem innych, efektywnie dzia³aj¹cych aptamerów, s¹ chimeryczne cz¹steczki RNA, otrzymane w dwuetapowym procesie selekcji in vitro, zawieraj¹ce domenê katalityczn¹ (rybozym typu hammerhead) oraz domenê specyficznie oddzia³uj¹c¹ z okreœlonym regionem IRES (domena IV) wirusa HCV (51,52). Otrzymane cz¹steczki RNA obni a³y translacjê zale n¹ od elementu IRES nawet o 95%. Dodatkowo, w komórkach Huh-7, nios¹cych replikon wirusa HCV typu 1b, zaobserwowano obni enie poziomu wirusowego RNA o 50%, 24 godziny po transfekcji (52). Na podstawie porównania aktywnoœci chimerycznych cz¹steczek RNA z aktywnoœci¹ odpowiedniego aptameru bez domeny katalitycznej wykazano jednak, e efekt inhibicji w du ej mierze jest wynikiem specyficznego oddzia³ywania aptameru z elementem IRES wirusa HCV (51). Przyk³adem strategii antywirusowej opartej na wykorzystaniu oligonukleotydów jest równie zastosowanie cz¹steczek RNA, które przyjmuj¹ strukturê podobn¹ do naturalnie wystêpuj¹cych w obrêbie genomu wirusa elementów strukturalnych ang. decoy strategy. Takie cz¹steczki RNA oddzia³uj¹c z bia³kami, które s¹ istotne dla replikacji lub translacji wirusa dzia³aj¹ na zasadzie inhibitorów kompetycyjnych i powoduj¹ obni enie efektywnoœci tych procesów. Wykazano w uk³adzie komórkowym, e cz¹steczka RNA odpowiadaj¹ca domenie III elementu IRES wirusa HCV (rys. 1) powodowa³a 80% inhibicjê translacji zale nej od IRES, natomiast nie wywiera³a negatywnego wp³ywu na proces translacji mrna zale ny od kapu (53). W dalszych badaniach wykazano, e cz¹steczki RNA odpowiadaj¹ce subdomenom IIIe i IIIf BIOTECHNOLOGIA 1 (88)12 Agata Œwi¹tkowska, Jerzy Ciesio³ka s¹ odpowiedzialne za obni enie poziomu translacji zale nej od IRES. Inhibicja translacji jest wynikiem ich oddzia³ywania z bia³kiem rybosomalnym S5 bêd¹cym komponentem podjednostki 40S. To oddzia³ywanie prawdopodobnie uniemo liwia przy- ³¹czenie podjednostki 40S do elementu IRES wirusa HCV i tym samym uformowanie funkcjonalnego kompleksu inicjuj¹cego translacjê (53). W obrêbie regionu koduj¹cego bia³ko NS5B genomowy RNA wirusa HCV przyjmuje strukturê drugorzêdow¹ z trzema motywami typu spinki: 5BSL3.1, 5BSL3.2, 5BSL3.3, które s¹ niezbêdne dla prawid³owego przebiegu procesu replikacji wirusa (CRE, ang. Cis-Acting Replication Element). Zaobserwowano, e cz¹steczki RNA typu decoy odpowiadaj¹ce spince 5BSL3.1 i 5BSL3.2 efektywnie blokowa³y replikacjê wirusa, powoduj¹c ponad 35-krotne obni enie poziomu RNA w komórce (54). Co ciekawe, cz¹steczki RNA bêd¹ce analogami spinek, które pochodzi³y z wirusa o genotypie 2a efektywnie hamowa³y replikacjê wirusa o ewolucyjnie odleg³ym genotypie 1b. Jest to obserwacja bardzo istotna, gdy zastosowanie tego typu podejœcia nie by³oby ograniczone do jednego genotypu wirusa. W przypadku innych narzêdzi oligonukleotydowych, brak po ¹danej uniwersalnoœci ich dzia³ania stanowi czêsto znaczny problem w ich wykorzystaniu. Zastosowanie strategii decoy wi¹ e siê z poznaniem dok³adnego mechanizmu dzia³ania stosowanych cz¹steczek RNA. W przypadku analogów spinek 5BSL3.1 i 5BSL3.2, jak siê wydaje, mog¹ one oddzia³ywaæ z bia³kami komórkowymi zaanga owanymi w tworzenie kompleksu replikacyjnego i przez to zmniejszaæ szansê przy³¹czenia siê do niego nici RNA wirusa. Rodzi siê pytanie czy wprowadzenie cz¹steczek RNA, które wykazuj¹ powinowactwo do bia³ek komórkowych nie zaburzy prawid³owego funkcjonowania komórki. Obecnoœæ RNA 5BSL3.1 i 5BSL3.2 w komórkach Huh nie spowodowa³a widocznych efektów ubocznych; konieczne s¹ jednak dalsze szczegó³owe badania w celu pe³nego zrozumienia funkcjonowania zastosowanych inhibitorów RNA. Poszukiwano tak e naturalnie wystêpuj¹cych RNA, które by³yby zdolne do zaburzania prawid³owego funkcjonowania wirusa HCV. Przyk³adem takiej cz¹steczki jest IRNA, RNA o d³ugoœci 60 nukleotydów, która wystêpuje u dro d y Saccharomyces cerevisiae. Wczeœniej zaobserwowano, e IRNA blokuje IRES-zale n¹ translacjê wirusa polio, natomiast nie wykazuje negatywnego wp³ywu na przebieg translacji zale - nej od kapu. Inhibicja jest prawdopodobnie wynikiem oddzia³ywania IRNA z bia³kami komórkowymi np. bia³kiem La (55). Wykazano, e zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo IRNA hamuje tak e IRES-zale n¹ translacjê wirusa HCV (55,56). Inhibicja translacji w komórkach wynosi³a od 50 do 90%. Na podstawie badañ strukturalnych IRNA wykazano, e cz¹steczka ta przyjmuje strukturê typu spinki do w³osów, a jej podobieñstwo do niektórych elementów strukturalnych IRES wirusa HCV mo e mieæ istotne znaczenie w mechanizmie jej dzia³ania. 24 PRACE PRZEGL DOWE13 Oligonukleotydy jako potencjalne czynniki terapeutyczne skierowane przeciw wirusowi 5. Interferencyjne RNA: sirna oraz shrna Wirus HCV nale y do grupy najbardziej intensywnie badanych patogenów pod k¹tem mo liwoœci wykorzystania technologii interferencji RNA do hamowania ekspresji jego genów (57). W obrêbie genomu wirusa poszukuje siê miejsc podatnych na dzia³anie interferencyjnych RNA (sirna i shrna), przy czym region niekoduj¹cy 5, ze wzglêdu na wysok¹ zachowawczoœæ, jak siê wydaje, jest szczególnie atrakcyjnym celem ataku (tab. 2). Wykazano, e sirna komplementarne do domeny IV, Zestawienie przyk³adów atakowania wirusa HCV za pomoc¹ sirna/shrna Tabela 2 Atakowany fragment genomu wirusa HCV Sposób wprowadzenia sirna/shrna Œrodowisko reakcji/ Rodzaj replikonu wirusowego Efektywnoœæ dzia³ania Literatura sirna komórki Huh 7 replikon subgenomowy Rep-Feo (1b) 77-94% inhibicja ekspresji replikonu (genu Fluc) (48) wektor sirna wektor shrna znaczna inhibicja ekspresji replikonu (genu Fluc) sirna komórki Huh 7 replikon subgenomowy 80-90% obni enie aktywnoœci genu FLuc (83) wektor shrna komórki Huh 7 I 389 /NS3-3 /LucUbiNeo-Et (1a/1b) znaczna inhibicja ekspresji replikonu (genu Fluc) (58) 5 UTR wektor sirna komórki Huh 7 replikon monocistronowy I 389/ hyg-ubi/ NS3-3 /5.1 wektor shrna komórki 293FT model mysi 60% redukcja poziomu RNA wirusa (Northern blot) 60-70% redukcja poziomu bia³ka NS5b (Western blot) obni enie poziomu genu FLuc du a efektywnoœæ (61) (60) wektor shrna komórki Huh 7 replikon monocistronowy I 389/ hyg-ubi/ NS3-3 /5.1 (1b) >80% inhibicja replikacji (70) wektor shrna shrna komórki Huh 7 replikon subgenomowy inhibicja replikacji wirusa (RT-PCR) (67) wektor sirna komórki Huh 7 I 389/ hyg-ubi/ NS3-3 /5.1 sirna komórki En5-3, 2-3c replikon subgenomowy Ntat2Aneo (1a) NNoe (1b) 75% redukcja RNA wirusa (Northern blot) redukcja RNA wirusa (RT-PCR) (59) (84) BIOTECHNOLOGIA 1 (88) Pokazać jeszcze
TERAPIA GENOWA dr Marta Żebrowska Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki, Zakładu Biochemii Farmaceutycznej, Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Źródło zdjęcia: httpblog.ebdna.plindex.phpjednoznajwiekszychzagrozenludzkosciwciazniepokonane Bardziej szczegółowo II. WNIOSKI I UZASADNIENIA: 1. Proponujemy wprowadzić w Rekomendacji nr 6 także rozwiązania dotyczące sytuacji, w których:
Warszawa, dnia 25 stycznia 2013 r. Szanowny Pan Wojciech Kwaśniak Zastępca Przewodniczącego Komisji Nadzoru Finansowego Pl. Powstańców Warszawy 1 00-950 Warszawa Wasz znak: DRB/DRB_I/078/247/11/12/MM W Bardziej szczegółowo HAŚKO I SOLIŃSKA SPÓŁKA PARTNERSKA ADWOKATÓW ul. Nowa 2a lok. 15, 50-082 Wrocław tel. (71) 330 55 55 fax (71) 345 51 11 e-mail: kancelaria@mhbs.
Stan prac w zakresie wdrożenia systemów operacyjnych: NCTS2, AIS/INTRASTAT, AES, AIS/ICS i AIS/IMPORT Departament Ceł, Ministerstwo Finansów Usługa e-tranzyt System NCTS 2 Aktualny stan wdrożenia Ogólnopolskie Bardziej szczegółowo Tematy prac licencjackich w Zakładzie Fizjologii Zwierząt
Tematy prac licencjackich w Zakładzie Fizjologii Zwierząt Zegar biologiczny Ekspresja genów i białek zegara Rytmy komórkowe Rytmy fizjologiczne Rytmy behawioralne Lokalizacja neuroprzekźników w układzie Bardziej szczegółowo 2.Prawo zachowania masy
2.Prawo zachowania masy Zdefiniujmy najpierw pewne podstawowe pojęcia: Układ - obszar przestrzeni o określonych granicach Ośrodek ciągły - obszar przestrzeni którego rozmiary charakterystyczne są wystarczająco Bardziej szczegółowo Zobacz to na własne oczy. Przyszłość już tu jest dzięki rozwiązaniu Cisco TelePresence.
Informacje dla kadry zarządzającej Zobacz to na własne oczy. Przyszłość już tu jest dzięki rozwiązaniu Cisco TelePresence. 2010 Cisco i/lub firmy powiązane. Wszelkie prawa zastrzeżone. Ten dokument zawiera Bardziej szczegółowo Nagroda Nobla z fizjologii i medycyny w 2004 r.
Nagroda Nobla z fizjologii i medycyny w 2004 r. Receptory zapachu i organizacja systemu węchowego Takao Ishikawa, M.Sc. Zakład Biologii Molekularnej Instytut Biochemii Uniwersytetu Warszawskiego 10 mln Bardziej szczegółowo SCENARIUSZ ZAJĘĆ SZKOLNEGO KOŁA NAUKOWEGO Z PRZEDMIOTU CHEMIA PROWADZONEGO W RAMACH PROJEKTU AKADEMIA UCZNIOWSKA
SCENARIUSZ ZAJĘĆ SZKOLNEGO KOŁA NAUKOWEGO Z PRZEDMIOTU CHEMIA PROWADZONEGO W RAMACH PROJEKTU AKADEMIA UCZNIOWSKA Temat lekcji Jak dowieść, że woda ma wzór H 2 O? Na podstawie pracy uczniów pod opieką Tomasza Bardziej szczegółowo 8 osób na 10 cierpi na choroby przyzębia!
8 osób na 10 cierpi na choroby przyzębia! Wiemy jak Państwu pomóc Jesteśmy po to, aby Państwu doradzić! Czym jest zapalenie przyzębia (periodontitis)? Przyzębie to zespół tkanek otaczających ząb i utrzymujących Bardziej szczegółowo 3.2 Warunki meteorologiczne
TEST dla stanowisk robotniczych sprawdzający wiedzę z zakresu bhp 1. Informacja o pracownikach wyznaczonych do udzielania pierwszej pomocy oraz o pracownikach wyznaczonych do wykonywania działań w zakresie Bardziej szczegółowo Wykład 14 Biosynteza białek
BIOCHEMIA Kierunek: Technologia Żywności i Żywienie Człowieka semestr III Wykład 14 Biosynteza białek WYDZIAŁ NAUK O ŻYWNOŚCI I RYBACTWA CENTRUM BIOIMMOBILIZACJI I INNOWACYJNYCH MATERIAŁÓW OPAKOWANIOWYCH Bardziej szczegółowo FORUM ZWIĄZKÓW ZAWODOWYCH
L.Dz.FZZ/VI/912/04/01/13 Bydgoszcz, 4 stycznia 2013 r. Szanowny Pan WŁADYSŁAW KOSINIAK - KAMYSZ MINISTER PRACY I POLITYKI SPOŁECZNEJ Uwagi Forum Związków Zawodowych do projektu ustawy z dnia 14 grudnia Bardziej szczegółowo Czy przedsiêbiorstwo, którym zarz¹dzasz, intensywnie siê rozwija, ma wiele oddzia³ów lub kolejne lokalizacje w planach?
Czy przedsiêbiorstwo, którym zarz¹dzasz, intensywnie siê rozwija, ma wiele oddzia³ów lub kolejne lokalizacje w planach? Czy masz niedosyt informacji niezbêdnych do tego, by mieæ pe³en komfort w podejmowaniu Bardziej szczegółowo Seminarium 1: 08. 10. 2015
Seminarium 1: 08. 10. 2015 Białka organizmu ok. 15 000 g białka osocza ok. 600 g (4%) Codzienna degradacja ok. 25 g białek osocza w lizosomach, niezależnie od wieku cząsteczki, ale zależnie od poprawności Bardziej szczegółowo ZASADY WYPEŁNIANIA ANKIETY 2. ZATRUDNIENIE NA CZĘŚĆ ETATU LUB PRZEZ CZĘŚĆ OKRESU OCENY
Promocja i identyfikacja wizualna projektów współfinansowanych ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego Białystok, 19 grudzień 2012 r. Seminarium współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach Bardziej szczegółowo Opracowała: Karolina Król-Komarnicka, kierownik działu kadr i płac w państwowej instytucji
OPUBLIKOWANO: 1 SIERPNIA 2013 ZAKTUALIZOWANO: 12 KWIETNIA 2016 Urlop rodzicielski aktualizacja Opracowała: Karolina Król-Komarnicka, kierownik działu kadr i płac w państwowej instytucji Ustawa z dnia 26 Bardziej szczegółowo Techniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu
Techniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu Jak ju wspomniano, kinesiotaping mo e byç stosowany jako osobna metoda terapeutyczna, jak równie mo e stanowiç uzupe nienie innych metod fizjoterapeutycznych. Bardziej szczegółowo Steelmate - System wspomagaj¹cy parkowanie z oœmioma czujnikami
Steelmate - System wspomagaj¹cy parkowanie z oœmioma czujnikami Cechy: Kolorowy i intuicyjny wyœwietlacz LCD Czujnik wysokiej jakoœci Inteligentne rozpoznawanie przeszkód Przedni i tylni system wykrywania Bardziej szczegółowo Marek Kudła. Rybozymy. RNA nośnik informacji i narzędzie katalizy enzymatycznej
Marek Kudła Rybozymy RNA nośnik informacji i narzędzie katalizy enzymatycznej Właściwości RNA umożliwiają ce kataliz ę enzymatyczną Możliwo ść tworzenia skomplikowanej struktury II i III rzędowej przez Bardziej szczegółowo PRZEPISY KLASYFIKACJI I BUDOWY STATKÓW MORSKICH
PRZEPISY KLASYFIKACJI I BUDOWY STATKÓW MORSKICH ZMIANY NR 2/2010 do CZĘŚCI VIII INSTALACJE ELEKTRYCZNE I SYSTEMY STEROWANIA 2007 GDAŃSK Zmiany Nr 2/2010 do Części VIII Instalacje elektryczne i systemy Bardziej szczegółowo Efektywna strategia sprzedaży
Dz.U.98.21.94 1998.09.01 zm. Dz.U.98.113.717 art. 5 1999.01.01 zm. Dz.U.98.106.668 art. 31 2000.01.01 zm. Dz.U.99.99.1152 art. 1 2000.04.06 zm. Dz.U.00.19.239 art. 2 2001.01.01 zm. Dz.U.00.43.489 art. Bardziej szczegółowo Komunikat 16 z dnia 2015-05-07 dotyczący aktualnej sytuacji agrotechnicznej
Komunikat 16 z dnia 2015-05-07 dotyczący aktualnej sytuacji agrotechnicznej www.sad24.com Wszystkie poniższe informacje zostały przygotowane na podstawie obserwacji laboratoryjnych oraz lustracji wybranych Bardziej szczegółowo Lista standardów w układzie modułowym
Załącznik nr 1. Lista standardów w układzie modułowym Lista standardów w układzie modułowym Standardy są pogrupowane w sześć tematycznych modułów: 1. Identyfikacja i Analiza Potrzeb Szkoleniowych (IATN). Bardziej szczegółowo Rekompensowanie pracy w godzinach nadliczbowych
Rekompensowanie pracy w godzinach nadliczbowych PRACA W GODZINACH NADLICZBOWYCH ART. 151 1 K.P. Praca wykonywana ponad obowiązujące pracownika normy czasu pracy, a także praca wykonywana ponad przedłużony Bardziej szczegółowo Wsparcie wykorzystania OZE w ramach RPO WL 2014-2020
Wsparcie wykorzystania OZE w ramach RPO WL 2014-2020 Zarys finansowania RPO WL 2014-2020 Na realizację Regionalnego Programu Operacyjnego Województwa Lubelskiego na lata 2014-2020 przeznaczono łączną kwotę Bardziej szczegółowo Nowy program terapeutyczny w RZS i MIZS na czym polega zmiana.
Nowy program terapeutyczny w RZS i MIZS na czym polega zmiana. Brygida Kwiatkowska Narodowy Instytut Geriatrii, Reumatologii i Rehabilitacji im. prof. dr hab. med. Eleonory Reicher Programy lekowe dla Bardziej szczegółowo warsztató OMNM ar n medk oafał ptaszewskii mgr goanna tieczorekjmowiertowskai mgr Agnieszka jarkiewicz
warsztató OMNM ar n medk oafał ptaszewskii mgr goanna tieczorekjmowiertowskai mgr Agnieszka jarkiewicz } Pacjent w badaniu klinicznym a NFZ } Kalkulacja kosztów } Współpraca z zespołem badawczym jak tworzyć Bardziej szczegółowo Metody wyceny zasobów, źródła informacji o kosztach jednostkowych
I. Postanowienia ogólne 1.Cel PROCEDURA OCENY RYZYKA ZAWODOWEGO w Urzędzie Gminy Mściwojów Przeprowadzenie oceny ryzyka zawodowego ma na celu: Załącznik A Zarządzenia oceny ryzyka zawodowego monitorowanie Bardziej szczegółowo Zarządzanie projektami. wykład 1 dr inż. Agata Klaus-Rosińska
Zarządzanie projektami wykład 1 dr inż. Agata Klaus-Rosińska 1 DEFINICJA PROJEKTU Zbiór działań podejmowanych dla zrealizowania określonego celu i uzyskania konkretnego, wymiernego rezultatu produkt projektu Bardziej szczegółowo Egzamin gimnazjalny. Biologia. Także w wersji online TRENING PRZED EGZAMINEM. Sprawdź, czy zdasz!
Egzamin gimnazjalny 3 Biologia TRENING PRZED EGZAMINEM Także w wersji online Sprawdź, czy zdasz! Spis treści Zestaw 1: Związki chemiczne budujące organizmy oraz pozyskiwanie i wykorzystywanie energii 5 Bardziej szczegółowo Harmonogramowanie projektów Zarządzanie czasem
Temat: Czy świetlówki energooszczędne są oszczędne i sprzyjają ochronie środowiska? Karta pracy III.. Imię i nazwisko klasa Celem nauki jest stawianie hipotez, a następnie ich weryfikacja, która w efekcie Bardziej szczegółowo TRENING ZDROWOTNY jest to rodzaj aktywności fizycznej podjętej z motywów zdrowotnych, mającej na celu podniesienie poziomu wydolności i sprawności
TRENING ZDROWOTNY jest to rodzaj aktywności fizycznej podjętej z motywów zdrowotnych, mającej na celu podniesienie poziomu wydolności i sprawności psychofizycznej oraz usprawnienie procesów życiowych własnego Bardziej szczegółowo HiTiN Sp. z o. o. Przekaźnik kontroli temperatury RTT 4/2 DTR. 40 432 Katowice, ul. Szopienicka 62 C tel/fax.: + 48 (32) 353 41 31. www.hitin.
HiTiN Sp. z o. o. 40 432 Katowice, ul. Szopienicka 62 C tel/fax.: + 48 (32) 353 41 31 www.hitin.pl Przekaźnik kontroli temperatury RTT 4/2 DTR Katowice, 1999 r. 1 1. Wstęp. Przekaźnik elektroniczny RTT-4/2 Bardziej szczegółowo Proces wprowadzania nowo zatrudnionych pracowników
Proces wprowadzania nowo zatrudnionych pracowników poradnik dla bezpoêredniego prze o onego wprowadzanego pracownika WZMOCNIENIE ZDOLNOÂCI ADMINISTRACYJNYCH PROJEKT BLIèNIACZY PHARE PL03/IB/OT/06 Proces Bardziej szczegółowo Procedura weryfikacji badania czasu przebiegu 1 paczek pocztowych
Procedura weryfikacji badania czasu przebiegu 1 paczek pocztowych Warszawa 2012 (nowelizacja 2014) 1 zmiana nazwy zgodnie z terminologią zawartą w ustawie Prawo pocztowe Jednostka zlecająca: Urząd Komunikacji Bardziej szczegółowo INSTRUKCJA SERWISOWA. Wprowadzenie nowego filtra paliwa PN 874060 w silnikach ROTAX typ 912 is oraz 912 is Sport OPCJONALNY
Wprowadzenie nowego filtra paliwa PN 874060 w silnikach ROTAX typ 912 is oraz 912 is Sport ATA System: Układ paliwowy OPCJONALNY 1) Zastosowanie Aby osiągnąć zadowalające efekty, procedury zawarte w niniejszym Bardziej szczegółowo CONSTRUCTOR. Kompaktowy magazyn z u yciem rega³ów wjezdnych. Deepstor P90 DRIVE -IN
CONSTRUCTOR Kompaktowy magazyn z u yciem rega³ów wjezdnych Deepstor P90 CONSTRUCTOR Magazyn w miejsce korytarzy Rega³y wjezdne P90 daj¹ mo liwoœæ zwiêkszenia powierzchni magazynowania nawet o 90% w porównaniu Bardziej szczegółowo Badanie funkcji genu
Badanie funkcji genu Funkcję genu można zbadać różnymi sposobami Przypadkowa analizy funkcji genu MUTACJA FENOTYP GEN Strategia ukierunkowanej analizy funkcji genu GEN 1. wprowadzenie mutacji w genie 2. Bardziej szczegółowo GEO-SYSTEM Sp. z o.o. GEO-RCiWN Rejestr Cen i Wartości Nieruchomości Podręcznik dla uŝytkowników modułu wyszukiwania danych Warszawa 2007
GEO-SYSTEM Sp. z o.o. 02-732 Warszawa, ul. Podbipięty 34 m. 7, tel./fax 847-35-80, 853-31-15 http:\\www.geo-system.com.pl e-mail:geo-system@geo-system.com.pl GEO-RCiWN Rejestr Cen i Wartości Nieruchomości Bardziej szczegółowo PILNE Informacje dotyczące bezpieczeństwa Aparat ultrasonograficzny AFFINITI 70 firmy Philips
Strona 1 z 5 Szanowni Państwo! W aparatach ultrasonograficznych AFFINITI 70 firmy Philips wykryto usterkę, która może stanowić potencjalne zagrożenie dla pacjentów lub użytkowników. Niniejsze informacje Bardziej szczegółowo Elektryczne ogrzewanie podłogowe fakty i mity
Elektryczne ogrzewanie podłogowe fakty i mity Ogrzewanie podłogowe staje się coraz bardziej docenianym systemem podnoszącym komfort użytkowników mieszkań, apartamentów i domów jednorodzinnych. Niestety Bardziej szczegółowo PRAWA ZACHOWANIA. Podstawowe terminy. Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc
PRAWA ZACHOWANIA Podstawowe terminy Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc a) si wewn trznych - si dzia aj cych na dane cia o ze strony innych Bardziej szczegółowo Karty przypuszczeń IDEA
Karty przypuszczeń IDEA CO? Karty przypuszczeń IDEA są narzędziem zaprojektowanym aby użyc go w kilku kontekstach: w nauczaniu przedsiębiorczości w ramach studiów wyższych w mentoringu i nauczaniu potencjalnych Bardziej szczegółowo REGULAMIN WSPARCIA FINANSOWEGO CZŁONKÓW. OIPiP BĘDĄCYCH PRZEDSTAWICIELAMI USTAWOWYMI DZIECKA NIEPEŁNOSPRAWNEGO LUB PRZEWLEKLE CHOREGO
Załącznik nr 1 do Uchwały Okręgowej Rady Pielęgniarek i Położnych w Opolu Nr 786/VI/2014 z dnia 29.09.2014 r. REGULAMIN WSPARCIA FINANSOWEGO CZŁONKÓW OIPiP BĘDĄCYCH PRZEDSTAWICIELAMI USTAWOWYMI DZIECKA Bardziej szczegółowo Satysfakcja pracowników 2006
Satysfakcja pracowników 2006 Raport z badania ilościowego Listopad 2006r. www.iibr.pl 1 Spis treści Cel i sposób realizacji badania...... 3 Podsumowanie wyników... 4 Wyniki badania... 7 1. Ogólny poziom Bardziej szczegółowo INSTRUKCJA OBSŁUGI URZĄDZENIA: 0101872HC8201
INSTRUKCJA OBSŁUGI URZĄDZENIA: PZ-41SLB-E PL 0101872HC8201 2 Dziękujemy za zakup urządzeń Lossnay. Aby uŝytkowanie systemu Lossnay było prawidłowe i bezpieczne, przed pierwszym uŝyciem przeczytaj niniejszą Bardziej szczegółowo Rozdział 1 Postanowienia ogólne
Załącznik do zarządzenia Rektora nr 59 z dnia 20 lipca 2015 r. REGULAMIN PRZYZNAWANIA ZWIĘKSZENIA STYPENDIUM DOKTORANCKIEGO Z DOTACJI PROJAKOŚCIOWEJ ORAZ ZASADY PRZYZNAWANIA STYPENDIUM DOKTORANCKIEGO W Bardziej szczegółowo Strategia rozwoju kariery zawodowej - Twój scenariusz (program nagrania).
Strategia rozwoju kariery zawodowej - Twój scenariusz (program nagrania). W momencie gdy jesteś studentem lub świeżym absolwentem to znajdujesz się w dobrym momencie, aby rozpocząć planowanie swojej ścieżki Bardziej szczegółowo Lekcja 173, 174. Temat: Silniki indukcyjne i pierścieniowe.
Lekcja 173, 174 Temat: Silniki indukcyjne i pierścieniowe. Silnik elektryczny asynchroniczny jest maszyną elektryczną zmieniającą energię elektryczną w energię mechaniczną, w której wirnik obraca się z Bardziej szczegółowo Regulamin Konkursu wiedzy o podatkach. Podatkowy zawrót głowy
Regulamin Konkursu wiedzy o podatkach Podatkowy zawrót głowy 1 Postanowienia ogólne 1. Konkurs przeprowadzony zostanie pod nazwą Podatkowy zawrót głowy (dalej: Konkurs). 2. Współorganizatorami Konkursu Bardziej szczegółowo Jacek Mrzyg³ód, Tomasz Rostkowski* Rozwi¹zania systemowe zarz¹dzania kapita³em ludzkim (zkl) w bran y energetycznej
Komunikaty 99 Jacek Mrzyg³ód, Tomasz Rostkowski* Rozwi¹zania systemowe zarz¹dzania kapita³em ludzkim (zkl) w bran y energetycznej Artyku³ przedstawi skrócony raport z wyników badania popularnoœci rozwi¹zañ Bardziej szczegółowo Podstawy projektowania leków wykład 4
Podstawy projektowania leków wykład 4 Łukasz Berlicki Cel molekularny Cel molekularny (TARGET) makrocząsteczka w Ŝywym organizmie, która oddziałuje z lekiem i wynikiem tej interakcji jest poŝądany efekt Bardziej szczegółowo DE-WZP.261.11.2015.JJ.3 Warszawa, 2015-06-15
RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej d2)opis OCHRONNY WZORU UŻYTKOWEGO (21) Numer zgłoszenia: 112772 (22) Data zgłoszenia: 29.11.2001 EGZEMPLARZ ARCHIWALNY (19) PL (n)62894 (13) Bardziej szczegółowo Urząd Miasta Bielsko-Biała - um.bielsko.pl Wygenerowano: 2016-06-30/02:29:36. Wpływ promieni słonecznych na zdrowie człowieka
Wpływ promieni słonecznych na zdrowie człowieka Światło słoneczne jest niezbędne do trwania życia na Ziemi. Dostarcza energii do fotosyntezy roślinom co pomaga w wytwarzaniu tlenu niezbędnego do życia. Bardziej szczegółowo Ćwiczenie: "Ruch harmoniczny i fale"
Ćwiczenie: "Ruch harmoniczny i fale" Opracowane w ramach projektu: "Wirtualne Laboratoria Fizyczne nowoczesną metodą nauczania realizowanego przez Warszawską Wyższą Szkołę Informatyki. Zakres ćwiczenia: Bardziej szczegółowo Postanowienia ogólne. Usługodawcy oraz prawa do Witryn internetowych lub Aplikacji internetowych
Wyciąg z Uchwały Rady Badania nr 455 z 21 listopada 2012 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Uchwała o poszerzeniu możliwości Bardziej szczegółowo Lepsze samopoczucie to lepsze oceny. Jaka jest korzyść dla dziecka?
Lepsze samopoczucie to lepsze oceny Jaka jest korzyść dla dziecka? Gdy dziecko przebywa w szkole, warunki nauki znacząco wpływają na jego samopoczucie i skuteczność przyswajania wiedzy. Uczenie się może Bardziej szczegółowo Ochrona pracujących kobiet
Ochrona pracujących kobiet Szczególna ochrona pracy kobiet wynika z ich właściwości psychofizycznych oraz konieczności ochrony ich funkcji prokreacyjnych i macierzyńskich. Ochrona ta przejawia się m.in. Bardziej szczegółowo Strategia rozwoju sieci dróg rowerowych w Łodzi w latach 2015-2020+
Strategia rozwoju sieci dróg rowerowych w Łodzi w latach 2015-2020+ Projekt: wersja β do konsultacji społecznych Opracowanie: Zarząd Dróg i Transportu w Łodzi Ul. Piotrkowska 175 90-447 Łódź Spis treści Bardziej szczegółowo Krótkoterminowe planowanie finansowe na przykładzie przedsiębiorstw z branży 42
Krótkoterminowe planowanie finansowe na przykładzie przedsiębiorstw z branży 42 Anna Salata 0 1. Zaproponowanie strategii zarządzania środkami pieniężnymi. Celem zarządzania środkami pieniężnymi jest wyznaczenie Bardziej szczegółowo Audyt SEO. Elementy oraz proces przygotowania audytu. strona
Audyt SEO Elementy oraz proces przygotowania audytu 1 Spis treści Kim jesteśmy? 3 Czym jest audyt SEO 4 Główne elementy audytu 5 Kwestie techniczne 6 Słowa kluczowe 7 Optymalizacja kodu strony 8 Optymalizacja Bardziej szczegółowo Ethernet VPN tp. Twój œwiat. Ca³y œwiat.
Ethernet VPN tp 19330 Twój œwiat. Ca³y œwiat. Efektywna komunikacja biznesowa pozwala na bardzo szybkie i bezpieczne po³¹czenie poszczególnych oddzia³ów firmy przez wirtualn¹ sieæ prywatn¹ (VPN) oraz zapewnia Bardziej szczegółowo WYMAGANIA EDUKACYJNE Z PRZEDMIOTÓW ZAWODOWYCH ODBYWAJĄCYCH SIĘ W SZKOLNYM LABORATORIUM CHEMICZNYM
WYMAGANIA EDUKACYJNE Z PRZEDMIOTÓW ZAWODOWYCH ODBYWAJĄCYCH SIĘ W SZKOLNYM LABORATORIUM CHEMICZNYM PSO jest uzupełnieniem Wewnątrzszkolnego Systemu Oceniania obowiązującego w GCE. Precyzuje zagadnienia Bardziej szczegółowo Edycja geometrii w Solid Edge ST
Edycja geometrii w Solid Edge ST Artykuł pt.: " Czym jest Technologia Synchroniczna a czym nie jest?" zwracał kilkukrotnie uwagę na fakt, że nie należy mylić pojęć modelowania bezpośredniego i edycji bezpośredniej. Bardziej szczegółowo Zintegrowane Systemy Zarządzania Biblioteką SOWA1 i SOWA2 SKONTRUM
Zintegrowane Systemy Zarządzania Biblioteką SOWA1 i SOWA2 SKONTRUM PROGRAM INWENTARYZACJI Poznań 2011 Spis treści 1. WSTĘP...4 2. SPIS INWENTARZA (EWIDENCJA)...5 3. STAŁE UBYTKI...7 4. INTERPRETACJA ZAŁĄCZNIKÓW Bardziej szczegółowo Techniczne nauki М.М.Zheplinska, A.S.Bessarab Narodowy uniwersytet spożywczych technologii, Кijow STOSOWANIE PARY WODNEJ SKRAPLANIA KAWITACJI
Techniczne nauki М.М.Zheplinska, A.S.Bessarab Narodowy uniwersytet spożywczych technologii, Кijow STOSOWANIE PARY WODNEJ SKRAPLANIA KAWITACJI SKLAROWANEGO SOKU JABŁKOWEGO Skutecznym sposobem leczenia soku Bardziej szczegółowo Warunki Oferty PrOmOcyjnej usługi z ulgą
Warunki Oferty PrOmOcyjnej usługi z ulgą 1. 1. Opis Oferty 1.1. Oferta Usługi z ulgą (dalej Oferta ), dostępna będzie w okresie od 16.12.2015 r. do odwołania, jednak nie dłużej niż do dnia 31.03.2016 r. Bardziej szczegółowo Temat: Funkcje. Własności ogólne. A n n a R a j f u r a, M a t e m a t y k a s e m e s t r 1, W S Z i M w S o c h a c z e w i e 1
Ustawienie wózka w pojeździe komunikacji miejskiej - badania Przodem do kierunku jazdy? Bokiem? Tyłem? Jak ustawić wózek, aby w razie awaryjnego hamowania dziecko było jak najbardziej bezpieczne? Na te Bardziej szczegółowo Odpowiedzi na pytania zadane do zapytania ofertowego nr EFS/2012/05/01
Odpowiedzi na pytania zadane do zapytania ofertowego nr EFS/2012/05/01 1 Pytanie nr 1: Czy oferta powinna zawierać informację o ewentualnych podwykonawcach usług czy też obowiązek uzyskania od Państwa Bardziej szczegółowo POWIATOWY URZĄD PRACY
POWIATOWY URZĄD PRACY ul. Piłsudskiego 33, 33-200 Dąbrowa Tarnowska tel. (0-14 ) 642-31-78 Fax. (0-14) 642-24-78, e-mail: krda@praca.gov.pl Załącznik Nr 3 do Uchwały Nr 5/2015 Powiatowej Rady Rynku Pracy Bardziej szczegółowo Informacje uzyskiwane dzięki spektrometrii mas
Slajd 1 Spektrometria mas i sektroskopia w podczerwieni Slajd 2 Informacje uzyskiwane dzięki spektrometrii mas Masa cząsteczkowa Wzór związku Niektóre informacje dotyczące wzoru strukturalnego związku Bardziej szczegółowo Młodzieńcze spondyloartropatie/zapalenie stawów z towarzyszącym zapaleniem przyczepów ścięgnistych (mspa-era)
www.printo.it/pediatric-rheumatology/pl/intro Młodzieńcze spondyloartropatie/zapalenie stawów z towarzyszącym zapaleniem przyczepów ścięgnistych (mspa-era) Wersja 2016 1. CZYM SĄ MŁODZIEŃCZE SPONDYLOARTROPATIE/MŁODZIEŃCZE Bardziej szczegółowo zywania Problemów Alkoholowych
Państwowa Agencja Rozwiązywania zywania Problemów Alkoholowych Konferencja Koszty przemocy wobec kobiet w Polsce 2013 Warszawa, 27 maja 2013 r. www.parpa.pl 1 Podstawy prawne Ustawa o wychowaniu w trzeźwości Bardziej szczegółowo PROCEDURY POSTĘPOWANIA W SYTUACJACH TRUDNYCH WYCHOWAWCZO Zespół Szkół im. Henryka Sienkiewicza w Końskowoli
PROCEDURY POSTĘPOWANIA W SYTUACJACH TRUDNYCH WYCHOWAWCZO Zespół Szkół im. Henryka Sienkiewicza w Końskowoli POZIOMY PRACY WYCHOWAWCZEJ I. PRACA WYCHOWAWCZA WYCHOWAWCY KLASY 1. Zapoznanie rodziców z obowiązującymi Bardziej szczegółowo Ostatnia cena sprzeda y klienta 1.0 dodatek do Symfonia Faktura dla 1 firmy
Podr cznik u ytkownika Ostatnia cena sprzeda y klienta 1.0 dodatek do Symfonia Faktura dla 1 firmy Masz pytanie? zadzwo 693 936 046 lub napisz handel@symfoniadodatki.pl SPIS TRE CI 1. Instalacja dodatku Bardziej szczegółowo EGZEMPLARZ ARCHIWALNY WZORU UŻYTKOWEGO (12,OPIS OCHRONNY. (19) PL di)62974 B62D 57/02 (2006.01) Dudek Piotr, Włocławek, PL
EGZEMPLARZ ARCHIWALNY RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12,OPIS OCHRONNY WZORU UŻYTKOWEGO (21) Numer zgłoszenia: 114126 (22) Data zgłoszenia: 11.06.2003 (19) PL di)62974 Bardziej szczegółowo TABELA ZGODNOŚCI. W aktualnym stanie prawnym pracodawca, który przez okres 36 miesięcy zatrudni osoby. l. Pornoc na rekompensatę dodatkowych
-...~.. TABELA ZGODNOŚCI Rozporządzenie Komisji (UE) nr 651/2014 z dnia 17 czerwca 2014 r. uznające niektóre rodzaje pomocy za zgodne z rynkiem wewnętrznym w zastosowaniu art. 107 i 108 Traktatu (Dz. Urz. Bardziej szczegółowo Sugerowany profil testów
ZWIERZĘTA FUTERKOWE Alergologia Molekularna Rozwiąż niejasne przypadki alergii na zwierzęta futerkowe Użyj komponentów alergenowych w celu wyjaśnienia problemu wielopozytywności wyników testów na ekstrakty Bardziej szczegółowo PROGRAMU PARTNERSKIEGO BERG SYSTEM
Regulamin PROGRAMU PARTNERSKIEGO BERG SYSTEM 1. Organizatorem Programu Partnerskiego BERG SYSTEM" jest KONEKT Sp. z o.o. z siedzibą w: 15-532 Białystok, ul. Wiewiórcza 111; NIP 966 210 20 23; REGON 363632084; Bardziej szczegółowo Stanowisko Rzecznika Finansowego i Prezesa Urzędu Ochrony Konkurencji i Konsumentów w sprawie interpretacji art. 49 ustawy o kredycie konsumenckim
Prezes Urzędu Ochrony Konkurencji i Konsumentów Warszawa, 16 maja 2016 r. Stanowisko Rzecznika Finansowego i Prezesa Urzędu Ochrony Konkurencji i Konsumentów w sprawie interpretacji art. 49 ustawy o kredycie Bardziej szczegółowo Szkoła Podstawowa nr 1 w Sanoku. Raport z ewaluacji wewnętrznej
Szkoła Podstawowa nr 1 w Sanoku Raport z ewaluacji wewnętrznej Rok szkolny 2014/2015 Cel ewaluacji: 1. Analizowanie informacji o efektach działalności szkoły w wybranym obszarze. 2. Sformułowanie wniosków Bardziej szczegółowo Zmiany te polegają na:
Z dniem 1 stycznia 2013 r. wejdzie w życie ustawa z dnia 11 maja 2012 r. o zmianie ustawy o emeryturach i rentach z Funduszu Ubezpieczeń Społecznych oraz niektórych innych ustaw (Dz. U. z 6 czerwca 2012 Bardziej szczegółowo Producent P.P.F. HASCO-LEK S.A nie prowadził badań klinicznych mających na celu określenie skuteczności produktów leczniczych z ambroksolem.
VI.2 Podsumowanie danych o bezpieczeństwie stosowania produktów leczniczych z ambroksolem VI.2.1 Omówienie rozpowszechnienia choroby Wskazania do stosowania: Ostre i przewlekłe choroby płuc i oskrzeli Bardziej szczegółowo Przygotowały: Magdalena Golińska Ewa Karaś
Przygotowały: Magdalena Golińska Ewa Karaś Druk: Drukarnia VIVA Copyright by Infornext.pl ISBN: 978-83-61722-03-8 Wydane przez Infornext Sp. z o.o. ul. Okopowa 58/72 01 042 Warszawa www.wieszjak.pl Od Bardziej szczegółowo Praca badawcza. Zasady metodologiczne ankietowego badania mobilności komunikacyjnej ludności
Praca badawcza Zasady metodologiczne ankietowego badania mobilności komunikacyjnej ludności Projekt współfinansowany ze środków Unii Europejskiej w ramach Programu Operacyjnego Pomoc Techniczna 2007-2013 Bardziej szczegółowo ZAGADNIENIA PODATKOWE W BRANŻY ENERGETYCZNEJ - VAT
ZAGADNIENIA PODATKOWE W BRANŻY ENERGETYCZNEJ - VAT Szanowni Państwo! Prowadzenie działalności w branży energetycznej wiąże się ze specyficznymi problemami podatkowymi, występującymi w tym sektorze gospodarki. Bardziej szczegółowo DZIAŁ ÓSMY. Uprawnienia pracowników związane z rodzicielstwem
DZIAŁ ÓSMY Uprawnienia pracowników związane z rodzicielstwem Art. 176. Nie wolno zatrudniać kobiet przy pracach szczególnie uciążliwych lub szkodliwych dla zdrowia. Rada Ministrów określi, w drodze rozporządzenia, Bardziej szczegółowo Olej rzepakowy, jako paliwo do silników z zapłonem samoczynnym
Coraz częściej jako paliwo stosuje się biokomponenty powstałe z roślin oleistych. Nie mniej jednak właściwości fizykochemiczne oleju napędowego i oleju powstałego z roślin znacząco różnią się miedzy sobą. Bardziej szczegółowo Szkolenia nie muszą być nudne! Kolejne szkolenie już w lutym wszystkie osoby zachęcamy do wzięcia w nich udziału!
Szkolenia nie muszą być nudne! W Spółce Inwest-Park odbyło się kolejne szkolenie w ramach projektu Akcelerator Przedsiębiorczości działania wspierające rozwój przedsiębiorczości poza obszarami metropolitarnymi Bardziej szczegółowo OŚWIETLENIE PRZESZKLONEJ KLATKI SCHODOWEJ
OŚWIETLENIE PRZESZKLONEJ KLATKI SCHODOWEJ Przykład aplikacji: rys. 1 rys. 2 rys. 3 rys. 4 W tym przypadku do sterowania oświetleniem wykorzystano przekaźniki fi rmy Finder: wyłącznik zmierzchowy 11.01.8.230.0000 Bardziej szczegółowo PROGRAM NR 2(4)/T/2014 WSPIERANIE AKTYWNOŚCI MIĘDZYNARODOWEJ
PROGRAM NR 2(4)/T/2014 WSPIERANIE AKTYWNOŚCI MIĘDZYNARODOWEJ IMiT 2014 1 1. CELE PROGRAMU Program ma na celu podnoszenie kwalifikacji zawodowych artystów tańca oraz doskonalenie kadry pedagogicznej i badawczo-naukowej Bardziej szczegółowo Od redakcji. Symbolem oznaczono zadania wykraczające poza zakres materiału omówionego w podręczniku Fizyka z plusem cz. 2.
Od redakcji Niniejszy zbiór zadań powstał z myślą o tych wszystkich, dla których rozwiązanie zadania z fizyki nie polega wyłącznie na mechanicznym przekształceniu wzorów i podstawieniu do nich danych. Bardziej szczegółowo 2017 © DocPlayer.pl Polityka prywatności | Warunki świadczenia usług | Zwrotny adres