id
stringlengths
2
9
sections
sequence
sec_text
sequence
extractive_keyphrases
sequence
abstractive_keyphrases
sequence
sec_bio_tags
sequence
18980258
[ "visual sleep staging is still the most widely used procedure to analyze sleep. it allows one", "sleep stages", "subjects and procedures", "eeg parameter = (frequency time portion) sum of all time portions", "statistical analysis", "results", "discussion", "heterogeneity of sleep stages", "spatial representation of sleep trajectory", "sleep as a continuum versus sleep staging", "title", "abstract" ]
[ [ "TO", "SUBDIVIDE", "SLEEP", "RECORDINGS", "INTO", "discrete", "states", "or", "stages,", "defined", "by", "coherent", "and", "recurrent", "patterns", "of", "one", "1", "or", "more", "2", "electrophysiologic", "signals.", "Based", "on", "this", "method,", "human", "sleep", "has", "been", "defined", "as", "an", "alternating", "sequence", "of", "4", "stages", "of", "non-rapid", "eye", "movement", "sleep", "(NREM", "stages", "1", "to", "4),", "and", "rapid", "eye", "movement", "(REM)", "sleep.", "3", "Although", "there", "is", "unanimous", "acceptance", "of", "the", "existence", "of", "2", "different", "states", "of", "sleep,", "REM", "and", "NREM", "sleep,", "different", "conceptions", "of", "the", "structure", "of", "NREM", "sleep", "have", "been", "proposed.", "Based", "on", "quantitative", "electroencephalographic", "analysis", "during", "sleep,", "NREM", "sleep", "can", "be", "represented", "as", "a", "continuum", "instead", "of", "a", "staged", "process.", "4,", "5", "A", "continuous", "representation", "of", "NREM", "sleep", "allows", "one", "to", "model", "the", "sleep", "process", "by", "quantitative", "variables,", "such", "as", "the", "mean", "electroencephalographic", "(EEG)", "frequency", "or", "the", "power", "of", "different", "EEG", "frequency", "bands.", "6,", "7,", "8", "In", "contrast", "with", "this,", "the", "strongest", "point", "for", "sleep", "staging", "is", "that", "it", "allows", "the", "integration", "of", "a", "variety", "of", "electrophysiologic", "information", "from", "different", "recording", "channels", "into", "a", "reasonably", "small", "number", "of", "well-defined", "stages..", "Sleep", "staging", "is", "confronted", "with", "2", "major", "difficulties:", "first,", "how", "to", "exactly", "delineate", "neighboring", "stages,", "and", "second,", "how", "to", "handle", "intrastate", "variability?", "Both", "points", "have", "an", "influence", "on", "the", "reliability", "of", "sleep", "studies.", "9", "Although", "rules", "for", "the", "definition", "of", "sleep", "states", "and", "stages", "have", "been", "developed,", "2", "the", "question", "of", "intrastate", "heterogeneity", "has", "been", "widely", "ignored.", "Exceptions", "consist", "of", "a", "few", "scattered", "proposals", "to", "subdivide", "the", "sleep-onset", "process", "into", "fine-graded", "steps,", "10", "to", "study", "differences", "between", "stage", "2", "sleep", "early", "and", "late", "in", "night-time", "sleep,", "11", "or", "to", "subdivide", "NREM", "and", "REM", "sleep", "into", "tonic", "and", "phasic", "segments.", "12", "Another", "approach", "to", "subdivide", "the", "NREM", "sleep", "process", "into", "meaningful", "subunits", "has", "been", "proposed", "by", "Terzano", "and", "coworkers.", "13,", "14", "These", "authors", "developed", "the", "concept", "of", "a", "cyclic", "alternating", "pattern", "(CAP),", "corresponding", "to", "different", "functional", "states", "of", "arousal-control", "mechanisms", "during", "NREM", "sleep.", "15", "In", "a", "recent", "study,", "Brandenberger", "et", "al", "16", "called", "into", "question", "the", "homogeneity", "of", "stage", "2", "sleep.", "These", "authors", "presented", "data", "that", "suggest", "that", "2", "types", "of", "stage", "2", "sleep", "can", "be", "differentiated,", "a", "quiet", "one,", "preceding", "slow-wave", "sleep,", "and", "an", "active", "one,", "preceding", "REM", "sleep..", "Sleep", "staging", "is", "a", "rule-based", "procedure,", "which", "uses", "expert", "knowledge", "to", "define", "which", "combination", "of", "electrophysiologic", "patterns", "defines", "a", "sleep", "stage.", "2", "As", "an", "alternative,", "a", "statistical", "analysis", "could", "explore", "which", "pattern", "configurations,", "extracted", "from", "EEG,", "electromyogram", "(EMG),", "electrooculogram,", "or", "any", "other", "physiologic", "signal,", "are", "either", "typical,", "ie,", "occur", "more", "frequently,", "or", "atypical,", "i.e.,", "occur", "less", "frequently,", "relative", "to", "one's", "expectation.", "The", "configural", "frequency", "analysis", "(CFA)", "17", "is", "a", "nonparametric", "taxonomic", "statistical", "analysis", "that", "allows", "one", "to", "identify", "overrepresentations", "(types)", "or", "underrepresentations", "(antitypes)", "in", "the", "frequency", "distribution", "of", "multiple", "variable", "classifications.", "This", "procedure", "examines", "the", "statistical", "significance", "of", "patterns", "of", "cell", "frequencies", "in", "cross-tabulated", "data", "and", "defines", "types", "or", "antitypes,", "depending", "on", "whether", "observed", "cell", "frequencies", "are", "greater", "or", "smaller", "than", "expected", "by", "the", "marginal", "distribution..", "The", "objective", "of", "the", "present", "study", "was", "to", "investigate", "the", "structure", "of", "sleep", "by", "means", "of", "the", "CFA.", "We", "applied", "the", "CFA", "to", "3", "continuously", "measured", "variables", "during", "sleep:", "(a)", "an", "EEG", "parameter", "(EEG-P),", "representing", "the", "distribution", "of", "EEG", "wave", "lengths," ], [ "Study", "Objectives:", "To", "study", "the", "structure", "of", "human", "sleep", "at", "the", "level", "of", "sleep", "stages.", "We", "applied", "taxonomic", "statistics", "to", "detect", "significant", "configurations", "(types)", "of", "different", "physiologic", "variables", "and", "their", "relationship", "to", "sleep", "stages.", "Design", "and", "Statistics:", "Polygraphic", "sleep", "recordings", "from", "32", "subjects", "(normal", "sleepers", "as", "well", "as", "patients", "with", "insomnia,", "sleep", "apnea,", "or", "narcolepsy;", "n", "=", "8", "per", "group)", "were", "visually", "scored", "and", "submitted", "to", "a", "configural", "frequency", "analysis.", "The", "configural", "frequency", "analysis", "was", "computed", "with", "3", "continuous", "input", "variables:", "an", "electroencephalogram", "parameter,", "which", "represents", "the", "point", "of", "gravity", "of", "the", "EEG", "frequency", "distribution;", "the", "alpha", "slow-wave", "index,", "and", "the", "Rest", "Index,", "based", "on", "the", "presence", "or", "absence", "of", "phasic", "electromyographic", "activity.", "These", "variables", "were", "dichotomized", "for", "further", "analysis.", "The", "combination", "of", "2", "levels", "(", "+", "or", "-)", "and", "3", "variables", "resulted", "in", "2", "3", "patterns", "(", "+++", "to", "---", "similar", "to", "other", "continuous", "EEG", "parameters", "4,", "18", ";", "(b)", "the", "alpha", "slow-wave", "index", "(ASI)", "19", ";", "and", "(c)", "the", "rest", "index", "(RI),", "based", "on", "the", "amount", "of", "phasic", "or", "transient", "EMG", "activity.", "20", "We", "selected", "these", "parameters", "because", "they", "are", "continuous,", "independent", "from", "staging", "rules,", "and", "belong", "to", "the", "standard", "of", "our", "sleep-analysis", "system.", "The", "EEG", "parameter", "describes", "the", "time", "course", "of", "EEG", "activity", "during", "sleep,", "which", "varies", "between", "low-amplitude", "fast", "waves", "in", "wakefulness", "and", "high-amplitude", "slow", "waves", "during", "deep", "NREM", "sleep.", "The", "ASI,", "which", "is", "based", "on", "the", "proportion", "of", "alpha", "to", "slowwave", "EEG", "activity,", "recognizes", "fairly", "long", "arousals", "and", "intervening", "wakefulness.", "19", "Finally,", "the", "RI", "is", "a", "measure", "of", "motor", "rest", "or", "unrest,", "based", "on", "the", "presence", "or", "absence", "of", "transient", "EMG", "activity.", "20,", "21", "Each", "of", "the", "3", "continuous", "variables", "EEG-P", "(E),", "ASI", "(A),", "and", "RI", "(R)", "was", "dichotomized,", "and", "the", "resulting", "cross-tabulation", "was", "tested", "for", "significant", "patterns", "of", "configurations.", "Significant", "configurations", "or", "types", "were", "matched", "with", "conventional", "sleep", "stages.", "This", "comparison", "allows", "us", "to", "(1)", "estimate", "the", "complexity", "(homogeneity", "vs", "heterogeneity)", "of", "sleep", "stages", "and", "(2)", "determine", "the", "degree", "of", "potential", "overlap", "between", "stages.", "If", "more", "than", "1", "significant", "configuration", "emerges", "from", "the", "same", "sleep", "stage,", "this", "stage", "seems", "to", "be", "heterogeneous.", "On", "the", "other", "hand,", "if", "a", "given", "configuration", "occurs", "in", "more", "than", "1", "stage,", "this", "indicates", "overlap", "between", "stages." ], [ "The", "analysis", "was", "based", "on", "32", "all-night", "sleep", "recordings", "from", "18", "women", "and", "14", "men.", "The", "mean", "age", "was", "50.1", "SD", "9.3", "years", "(range:", "35-70", "years).", "The", "total", "sample", "consisted", "of", "4", "groups", "of", "8", "subjects", "each,", "namely", "control", "subjects", "without", "reported", "sleep", "disturbances", "(4", "women,", "4", "men;", "mean", "age:", "56.5", "years;", "range:", "36-70", "years)", "and", "3", "groups", "of", "patients", "with", "the", "following", "International", "Classification", "of", "Sleep", "Disorders-defined", "sleep", "disorders:", "psychophysiological", "insomnia", "(5", "women,", "3", "men;", "mean", "age:", "48.4", "years;", "range:", "35-63", "years);", "obstructive", "sleep", "apnea", "syndrome", "(OSA:", "4", "women,", "4", "men;", "mean", "age:", "56.1", "years;", "range:", "40-68", "years);", "and", "narcolepsy", "(5", "women,", "3", "men;", "mean", "age:", "52.1", "years;", "range:", "35-62", "years)..", "Polygraphic", "sleep", "recordings", "were", "performed", "for", "7.5", "to", "8", "hours", "between", "10:00", "PM", "and", "6:30", "AM", "under", "standardized", "recording", "conditions", "in", "a", "clinical", "sleep", "lab.", "The", "following", "variables", "were", "continuously", "recorded:", "EEG", "(F1-A1,", "C3-A2,", "C4-A1,", "O2-A2),", "horizontal", "electrooculogram,", "chin", "EMG,", "heart", "rate,", "respiration", "(nasal/mouth", "flow,", "respiratory", "effort", "of", "abdomen", "and", "chest),", "oxygen", "saturation", "and", "EMG", "from", "right", "and", "left", "m.", "tibialis.", "For", "the", "present", "analysis,", "we", "used", "1", "EEG", "channel", "(C3-A2)", "and", "1", "EMG", "channel", "(chin", "EMG)..", "Digital", "sleep", "data", "were", "stored", "for", "later", "analysis,", "and", "sleep", "stages", "were", "visually", "analyzed", "in", "30-second", "segments", "(\"epochs\")", "according", "to", "Rechtschaffen", "and", "Kales", "2", "criteria.", "In", "addition,", "3", "continuous", "parameters", "were", "computed", "from", "the", "recordings,", "A,", "a", "measure", "of", "the", "ratio", "of", "EEG", "alpha", "and", "slow-wave", "activity", "19", ";", "E,", "representing", "the", "point", "of", "gravity", "of", "the", "EEG", "frequency", "distribution", "(similar", "to", "Haustein)", "4", ";", "and", "R,", "a", "measure", "that", "is", "based", "on", "the", "momentary", "amount", "of", "phasic", "EMG", "activity.", "20", "The", "variable", "A", "is", "defined", "as", "the", "ratio", "between", "alpha", "activity", "and", "the", "sum", "of", "activity", "in", "the", "delta", "and", "theta", "frequency", "ranges.", "This", "ratio", "is", "expressed", "as", "follows:.", "During", "a", "transition", "from", "wakefulness", "to", "sleep,", "the", "contribution", "of", "alpha", "decreases", "while", "that", "of", "the", "slow-wave", "frequency", "ranges", "increases..", "E", "is", "a", "continuous", "variable", "that", "is", "defined", "for", "each", "30-second", "epoch", "from", "the", "EEG", "frequency", "distribution.", "The", "amount", "of", "EEG", "activity", "in", "each", "frequency", "band", "is", "defined", "by", "an", "algorithm", "that", "combines", "zero", "crossing", "for", "low", "frequencies", "(<", "4", "Hz)", "and", "peak-topeak", "detection", "for", "higher", "frequencies", "(>", "4", "Hz).", "The", "time", "portion", "per", "30-second", "epoch", "was", "computed", "for", "each", "wavelength.", "E", "is", "defined", "by", "the", "following", "formula:" ], [ "The", "values", "for", "parameter", "E", "are", "highest", "in", "waking", "and", "lowest", "in", "slow-wave", "sleep..", "R", "was", "computed", "from", "the", "m.", "mentalis", "EMG.", "An", "EMG", "increase", "above", "a", "predefined", "threshold", "was", "scored", "as", "transient", "EMG", "activity.", "For", "each", "30-second", "epoch,", "it", "was", "determined", "whether", "or", "not", "there", "was", "transient", "EMG", "activity.", "Based", "on", "this", "information,", "R", "was", "computed", "as", "a", "continuous", "variable", "between", "0", "and", "1.", "As", "long", "as", "there", "is", "no", "transient", "EMG", "activity,", "the", "parameter", "value", "decreases", "by", "a", "certain", "constant", "amount", "per", "time", "unit,", "whereas", "it", "increases", "by", "a", "certain", "amount", "when", "transient", "EMG", "activity", "occurs.", "As", "a", "result,", "R", "reaches", "its", "lowest", "level", "during", "long", "time", "spans", "without", "transient", "EMG", "activity,", "and", "it", "reaches", "the", "upper", "level", "when", "a", "series", "of", "EMG", "transients", "occurs.", "The", "amount", "for", "a", "decrease", "was", "fixed", "at", "one", "third", "of", "that", "for", "an", "increase,", "to", "adjust", "for", "the", "different", "dynamics", "of", "EMG", "changes", "during", "descending", "(W", "→", "slow-wave", "sleep)", "and", "ascending", "(slow-wave", "sleep", "→", "W", "or", "S1)", "parts", "of", "the", "sleep", "cycle.", "The", "time", "course", "of", "R", "values", "can", "be", "graphically", "displayed", "as", "a", "time-dependent", "variable", "(see", "Figure", "1", ").", "The", "computation", "of", "the", "3", "parameters", "was", "performed", "by", "a", "commercial", "sleep", "analysis", "software", "package", "(Leonardo;", "MKE,", "Willroth,", "Germany).", "Figure", "1", "represents", "a", "visually", "scored", "hypnogram", "in", "addition", "to", "the", "3", "continuous", "measures", "A,", "E", "and", "R." ], [ "For", "each", "continuous", "variable", "(A,", "E,", "R),", "1", "value", "was", "computed", "for", "each", "30-second", "epoch.", "Later,", "the", "continuous", "variables", "were", "transformed", "into", "binary", "variables", "by", "separating", "the", "total", "distribution", "of", "epoch-by-epoch", "values", "at", "the", "individual", "median.", "For", "a", "given", "variable", "and", "epoch,", "a", "plus", "(+)", "was", "assigned", "if", "the", "actual", "parameter", "value", "was", "above", "the", "median,", "and", "a", "minus", "(-)", "if", "the", "actual", "value", "was", "below", "the", "median", "for", "a", "given", "subject.", "The", "combination", "of", "the", "3", "binary", "variables", "(A,", "E,", "R)", "results", "in", "2", "3", "=", "8", "different", "patterns", "(", ",", "...,", "---).", "The", "first", "sign", "relates", "to", "A,", "the", "second", "to", "E,", "and", "the", "third", "to", "R..", "In", "the", "next", "step,", "a", "sleep", "stage", "and", "an", "(A,", "E,", "R)", "pattern", "were", "assigned", "to", "each", "epoch", "of", "the", "sleep", "recording.", "Finally,", "the", "frequency", "of", "occurrence", "of", "the", "8", "patterns", "was", "tabulated", "for", "each", "sleep", "stage", "and", "analyzed", "by", "CFA.", "17,", "22", "The", "CFA", "is", "a", "test", "procedure", "for", "the", "analysis", "of", "multidimensional", "contingency", "tables.", "It", "computes", "the", "probability", "of", "whether", "a", "given", "pattern", "could", "be", "expected", "to", "occur", "by", "chance,", "according", "to", "the", "margin", "frequency", "distributions", "of", "the", "binary", "variables", "A,", "E,", "and", "R", "pattern,", "or", "whether", "it", "is", "significant,", "i.e.,", "overrepresented,", "for", "a", "given", "sleep", "stage.", "If", "more", "than", "1", "pattern", "becomes", "significant", "for", "a", "given", "sleep", "stage,", "this", "suggests", "that", "the", "stage", "contains", "different", "identifiable", "substages.", "The", "CFA", "allows", "one", "to", "define", "types,", "by", "a", "statistical", "probability", "above", "the", "chosen", "level", "of", "significance,", "as", "well", "as", "antitypes,", "which", "occur", "less", "frequently", "than", "expected", "by", "chance.", "In", "the", "present", "case,", "the", "prediction", "CFA", "was", "performed", "with", "the", "configurations", "A,", "E,", "R", "as", "predictors", "and", "with", "visually", "scored", "sleep", "stages", "as", "criteria.", "23,", "24", "For", "CFA", "statistical", "testing,", "we", "used", "the", "Fisher", "exact", "test", "for", "4-fold", "tables.", "23", "The", "level", "of", "significance", "α", "was", "set", "at", ".05,", "and", "the", "Holm", "method", "25", "was", "applied", "to", "adjust", "α", "for", "multiple", "testing." ], [ "The", "analysis", "was", "based", "on", "32", "polysomnographic", "recordings", "with", "a", "total", "of", "28,086", "epochs.", "The", "distribution", "of", "sleep", "stages", "was", "8.8%", "(n", "=", "2484", "epochs)", "for", "Stage", "1,", "46.9%", "(n", "=", "13,182)", "for", "Stage", "2,", "7.5%", "(n", "=", "2113)", "for", "Stage", "3,", "2.1%", "(n", "=", "587)", "for", "Stage", "4,", "and", "16.5%", "(n", "=", "4,625)", "for", "REM", "sleep.", "The", "remaining", "epochs", "were", "scored", "as", "awake", "(17.7%,", "n", "=", "4972", "epochs),", "movement", "time", "(0.3%,", "n", "=", "79),", "or", "undefined", "(0.2%,", "n", "=", "44", "epochs).", "There", "was", "no", "definition", "of", "types", "for", "movement", "time", "and", "undefined.", "Table", "1", "shows", "the", "absolute", "and", "Table", "2", "the", "relative", "frequencies", "of", "the", "8", "combinations", "of", "binary", "values", "for", "A,", "E,", "and", "R", "per", "sleep", "stage", "for", "all", "32", "sleep", "recordings.", "The", "margin", "frequencies", "show", "that", "the", "patterns", "(n", "=", "6410,", "22.8%)", "and", "---(n", "=", "5501,", "19.6%)", "were", "the", "most", "frequent,", "whereas", "the", "pattern", "(n", "=", "1893,", "6.7%)", "was", "least", "frequent..", "Those", "patterns", "identified", "by", "the", "CFA", "as", "significant", "for", "the", "total", "sample", "of", "32", "recordings", "are", "marked", "in", "Table", "2", "..", "The", "significant", "patterns", "or", "types", "for", "the", "4", "groups", "of", "subjects", "are", "summarized", "in", "Table", "3", ".", "As", "can", "be", "seen,", "the", "majority", "of", "significant", "pattern-to-stage", "relationships", "applies", "to", "all", "4", "groups", "of", "subjects.", "An", "identical", "pattern-to-stage", "relationship", "was", "found", "for", "all", "4", "groups", "in", "11", "cases,", "for", "3", "groups", "in", "2", "cases,", "for", "2", "groups", "in", "5", "cases,", "and", "for", "1", "group", "in", "2", "cases.", "Given", "the", "limited", "sample", "size", "of", "only", "8", "sleep", "recordings", "per", "group,", "this", "suggests", "a", "rather", "stable", "pattern-to-stage", "relationship,", "largely", "independent", "of", "the", "specific", "pathology", "of", "the", "diagnostic", "groups..", "Stage", "wake", "was", "characterized", "by", "a", "single", "pattern", "(", ")", "with", "high", "values", "for", "A,", "E,", "and", "R", "in", "all", "4", "groups.", "One", "additional", "pattern", "(", ")", "with", "a", "low", "R", "value", "became", "significant", "for", "patients", "with", "insomnia", "and", "narcolepsy,", "and", "1", "(", ")", "with", "low", "A", "for", "patients", "with", "OSA..", "Stage", "1", "sleep", "exhibited", "2", "significant", "patterns", "for", "all", "groups,", "1", "with", "high", "values", "in", "all", "3", "variables", "(", ")", "and", "1", "with", "a", "low", "value", "for", "A", "but", "high", "values", "for", "E", "and", "R", "(.", ").", "This", "suggests", "2", "types", "of", "Stage", "1", "sleep,", "1", "with", "more", "alpha", "activity", "(", ")", "and", "1", "with", "less", "alpha", "(.", ").", "An", "additional", "Stage", "1", "pattern", "with", "a", "low", "value", "for", "R", "(", ")", "became", "significant", "only", "for", "control", "subjects", "and", "patients", "with", "insomnia..", "Stage", "2", "sleep", "turned", "out", "to", "be", "heterogeneous,", "with", "4", "significant", "patterns", "in", "all", "4", "groups.", "All", "4", "patterns", "had", "a", "low", "value", "for", "E", "in", "common.", "Two", "patterns", "had", "a", "high", "value", "for", "A", "(", "and", ")", "and", "2", "had", "a", "low", "value", "(", "and", "---),", "whereas", "the", "value", "for", "R", "was", "twice", "positive", "and", "twice", "negative.", "Interestingly,", "none", "of", "the", "Stage", "2", "patterns", "overlapped", "with", "Stage", "1", "patterns", "in", "any", "of", "the", "4", "groups", "of", "subjects..", "The", "main", "pattern", "for", "Stage", "3", "sleep,", "valid", "for", "all", "4", "groups,", "was", "---.", "One", "additional", "pattern", "(", ")", "became", "significant", "for", "3", "groups", "(insomnia,", "OSA,", "narcolepsy),", "and", "1", "other", "(", ")", "for", "2", "groups", "(OSA,", "narcolepsy).", "All", "3", "patterns", "were", "characterized", "by", "a", "low", "value", "for", "E,", "and", "2", "of", "them", "by", "an", "additionally", "low", "value", "for", "A", "or", "R,", "respectively..", "Stage", "4", "sleep", "displayed", "the", "same", "pattern", "configuration", "as", "Stage", "3.", "Again,", "the", "pattern", "---was", "typical", "for", "all", "4", "groups,", "whereas", "the", "remaining", "2", "patterns", "were", "significant", "for", "either", "2", "groups", "(", ":", "OSA", "and", "narcolepsy)", "or", "only", "1", "group", "(", ":", "insomnia)..", "REM", "sleep", "was", "characterized", "by", "4", "significant", "patterns.", "All", "4", "had", "a", "high", "value", "for", "the", "EEG", "parameter", "E.", "Two", "of", "these", "were", "also", "high", "for", "A,", "whereas", "R", "was", "either", "high", "or", "low", "(", "and", ").", "The", "remaining", "2", "patterns", "were", "low", "for", "A", "but", "differed", "for", "the", "R", "value", "(", "and", ").", "The", "latter", "2", "patterns", "were", "significant", "for", "all", "4", "groups", "whereas", "the", "other", "2", "patterns", "were", "significant", "for", "3", "groups", "each", "(", "for", "controls,", "OSA,", "and", "narcolepsy;", "for", "controls,", "insomnia,", "and", "OSA).", "Representative", "examples", "for", "each", "type", "are", "shown", "in", "Figure", "2", "..", "Overall,", "76.8%", "of", "all", "epochs", "fitted", "into", "significant", "patterns.", "The", "value", "was", "highest", "for", "Stage", "3", "(86.2%)", "and", "lowest", "for", "Stage", "1", "(68.3%)", "sleep.", "The", "4", "subject", "groups", "differed", "only", "slightly", "in", "the", "total", "number", "of", "epochs", "fitting", "into", "significant", "AER", "patterns.", "The", "percentage", "was", "highest", "for", "OSA", "(80.3%)", "and", "lowest", "for", "patients", "with", "narcolepsy", "(74.5%)..", "Beside", "types,", "the", "CFA", "also", "allows", "one", "to", "define", "antitypes.", "Antitypes", "are", "those", "patterns", "that", "occur", "significantly", "less", "frequently", "than", "would", "be", "expected", "according", "to", "the", "margin", "frequencies.", "In", "the", "present", "analysis,", "a", "pattern", "was", "accepted", "as", "an", "antitype", "only", "if", "its", "probability", "was", "less", "than", "0.05", "and", "if", "this", "was", "the", "case", "in", "all", "4", "groups.", "Using", "this", "criterion,", "20", "patterns", "could", "be", "defined", "as", "antitypes", "(see", "Table", "4", "Table", "3", ")", "and", "of", "20", "antitypes", "(see", "Table", "4", ").", "The", "remaining", "8", "fields", "are", "neutral,", "ie,", "they", "may", "either", "hold", "this", "status", "in", "future", "studies", "with", "larger", "samples", "or", "they", "may", "shift", "in", "the", "direction", "of", "types", "or", "antitypes.", "The", "percentage", "of", "epochs", "in", "fields", "with", "antitypes", "was", "quite", "low", "across", "all", "4", "groups", "of", "subjects,", "namely", "1.6%", "for", "wake,", "5.1%", "for", "Stage", "1,", "18.0%", "for", "Stage", "2,", "1.2%", "for", "Stage", "3,", "0%", "for", "Stage", "4", "and", "10.5%", "for", "REM", "sleep." ], [ "The", "present", "results", "call", "attention", "to", "the", "structural", "complexity", "of", "sleep", "stages.", "The", "statistical", "analysis", "revealed", "that", "visually", "scored", "sleep", "stages", "are", "not", "homogeneous", "units", "but,", "rather,", "agglomerations", "of", "different", "significant", "patterns,", "called", "types,", "that", "in", "the", "present", "study", "were", "based", "on", "a", "set", "of", "3", "physiologic", "variables", "representing", "aspects", "of", "the", "momentary", "EEG", "and", "EMG", "activity.", "The", "decomposition", "of", "sleep", "stages", "into", "types", "by", "the", "prediction", "CFA", "resulted", "in", "fairly", "comparable", "solutions", "for", "the", "various", "diagnostic", "groups.", "This", "is", "in", "agreement", "with", "the", "experience", "gained", "from", "clinical", "sleep", "research,", "which", "shows", "that", "sleep", "recordings", "from", "different", "diagnostic", "groups", "can", "be", "analyzed", "with", "the", "same", "scoring", "system." ], [ "Sleep", "stages", "contained", "more", "than", "1", "type,", "indicating", "a", "physiological", "heterogeneity", "of", "sleep", "stages.", "The", "least-complex", "stages", "were", "wakefulness", "and", "Stage", "4;", "the", "most", "complex", "were", "Stage", "2", "and", "REM", "sleep.", "Each", "of", "the", "latter", "2", "sleep", "stages", "was", "composed", "of", "4", "different", "types,", "which", "did", "not", "significantly", "overlap", "between", "these", "2", "stages..", "Wakefulness", "was", "characterized", "in", "all", "4", "groups", "by", "type", "AER/", ",", "with", "high", "values", "for", "all", "3", "parameters.", "The", "additional", "occurrence", "of", "patients", "with", "insomnia", "and", "narcolepsy", "on", "the", "neighboring", "type", ",", "and", "of", "patients", "with", "OSA", "on", "type", "AER/", ",", "needs", "replication", "with", "larger", "samples", "before", "they", "can", "be", "taken", "for", "granted..", "Whereas", "Stage", "1", "sleep", "and", "stage", "wake", "had", "type", "AER/", "in", "common,", "Stage", "1", "sleep", "displayed", "AER/", "as", "a", "second", "type", "in", "all", "4", "groups.", "This", "shows", "that", "a", "reduction", "of", "alpha", "and", "a", "shift", "to", "EEG", "slow-wave", "activity,", "resulting", "in", "a", "low", "value", "for", "parameter", "A,", "is", "typical", "of", "a", "significant", "proportion", "of", "stage", "1", "epochs.", "The", "additional", "pattern", "AER/", ",", "characterized", "by", "low", "phasic", "EMG", "activity,", "again", "was", "significant", "only", "for", "patients", "with", "insomnia", "and", "control", "subjects.", "This", "may", "indicate", "fewer", "stage", "1", "movement", "arousals", "near", "the", "onset", "of", "sleep", "for", "the", "control", "and", "insomnia", "groups", "compared", "with", "patients", "in", "the", "OSA", "and", "narcolepsy", "groups.", "26", "The", "present", "results", "underline", "the", "position", "of", "Stage", "1", "as", "a", "transitional", "stage", "that", "shares", "the", "same", "AER", "types", "with", "stage", "wake", "but", "with", "different", "proportions", "of", "these", "types", "(see", "Table", "2", ")..", "As", "opposed", "to", "the", "noticeable", "overlap", "of", "types", "in", "stages", "wake", "and", "1,", "Stage", "2", "was", "characterized", "by", "4", "new", "types.", "All", "Stage", "2", "types", "had", "a", "low", "value", "for", "parameter", "E", "in", "common,", "indicating", "a", "definite", "shift", "to", "lower", "EEG", "frequencies.", "The", "other", "2", "parameters,", "A", "and", "R,", "were", "either", "high", "or", "low.", "The", "presence", "of", "4", "AER", "types", "in", "all", "diagnostic", "groups", "suggests", "that", "Stage", "2,", "which", "occupies", "about", "50%", "of", "total", "sleep", "time,", "is", "a", "broadly", "defined", "heterogeneous", "sleep", "state.", "27", "In", "an", "early", "study,", "Sträle", "(see", "Lairy", "11", ")", "differentiated", "between", "3", "Stage", "2", "EEG", "patterns", "with", "the", "following", "characteristics:", "(1)", "epochs", "with", "fewer", "than", "4", "sleep", "spindles,", "as", "well", "as", "moderate", "delta", "activity;", "(2)", "epochs", "with", "fairly", "low-voltage", "mixed-frequency", "EEG", "with", "4", "to", "8", "spindles;", "and", "(3)", "Stage", "2", "epochs", "with", "a", "maximum", "amount", "of", "slow", "activity.", "Sträle", "observed", "a", "specific", "chronologic", "distribution", "of", "the", "different", "types", "with", "a", "preference", "for", "the", "second", "type", "of", "Stage", "2", "later", "in", "the", "night.", "A", "specific", "chronologic", "distribution", "with", "increasing", "sleep-spindle", "activity", "during", "sleep,", "and", "a", "reciprocal", "relationship", "with", "EEG", "slow-wave", "activity,", "was", "later", "evaluated", "more", "systematically", "by", "others", "using", "digital", "data-analysis", "techniques.", "28", "Comparing", "the", "present", "types", "of", "Stage", "2", "with", "those", "defined", "by", "Sträle,", "his", "type", "c", "may", "correspond", "with", "the", "types", "AER/", "and", "---,", "which", "differ", "only", "in", "phasic", "EMG", "activity.", "In", "future", "studies,", "it", "would", "be", "of", "interest", "to", "analyze", "the", "relationship", "of", "the", "present", "types", "of", "Stage", "2", "sleep", "with", "autonomic", "and", "hormone", "data,", "since", "Brandenberger", "et", "al,", "16", "who", "analyzed", "such", "data,", "presented", "evidence", "for", "a", "quiet", "type", "of", "Stage", "2,", "preceding", "slow-wave", "sleep,", "and", "an", "active", "type", "that", "precedes", "REM", "sleep..", "Molinari", "and", "Foulkes'", "12", "distinction", "between", "tonic", "and", "phasic", "NREM", "sleep", "corresponds", "with", "the", "4", "types", "in", "sleep", "Stage", "2", "of", "the", "present", "analysis,", "2", "of", "them", "with", "phasic", "EMG", "activity", "(AER/", "and", ")", "and", "2", "without", "(AER/", "and", "---).", "Thus,", "Stage", "2", "seems", "to", "be", "a", "composite", "state", "with", "consistently", "low-frequency", "background", "EEG", "(low", "parameter", "values", "for", "E)", "activity,", "but", "fluctuations", "of", "the", "alpha", "to", "slow-wave", "ratio", "(parameter", "A", "either", "or", "-),", "and", "of", "tonic", "versus", "phasic", "EMG", "activity", "(parameter", "R", "either", "or", "-).", "29", "The", "type", "AER/", "---continued", "into", "deep", "NREM", "sleep", "and", "was", "the", "core", "type", "for", "all", "4", "groups", "in", "sleep", "Stages", "3", "and", "4.", "As", "opposed", "to", "the", "group", "of", "healthy", "controls,", "all", "3", "patient", "groups", "had", "an", "additional", "significant", "pattern", "(AER/", ")", "in", "Stage", "3,", "which", "persisted", "in", "patients", "with", "OSA", "and", "narcolepsy", "even", "in", "stage", "4.", "This", "finding,", "which", "awaits", "confirmation,", "suggests", "that", "patients", "with", "sleep", "disorders", "(as", "opposed", "to", "healthy", "persons)", "have", "a", "significant", "subset", "of", "epochs", "in", "Stages", "3", "and", "4,", "with", "a", "high", "EEG", "alpha", "to", "slow-wave", "ratio", "(parameter", "A", ").", "An", "analysis", "of", "the", "chronologic", "sequence", "of", "appearance", "of", "types", "is", "also", "needed", "to", "evaluate", "whether", "the", "AER", "types", "and", "in", "deep", "NREM", "sleep", "(see", "Table", "3", ")", "represent", "transitional", "patterns", "that", "may", "be", "located", "preferentially", "near", "the", "onset", "or", "the", "end", "of", "slow-wave", "sleep..", "REM", "sleep", "turned", "out", "to", "be", "a", "complex", "state", "with", "4", "types.", "In", "contrast", "with", "the", "AER", "types", "of", "NREM", "sleep,", "all", "AER", "types", "of", "REM", "sleep", "had", "a", "high", "value", "for", "parameter", "E", "in", "common,", "indicating", "a", "high-frequency", "EEG.", "Whereas", "the", "two", "types", "with", "low", "Taxonomical", ".", "Configural", "frequency", "analysis", "was", "used", "to", "defined", "types", "of", "activity-A", "refers", "to", "alpha", "slow-wave", "index", ";", "E,", "electroencephalogram", "parameter;", "R,", "Rest", "Index;", "S1,", "R", "represent", "tonic", "REM", "sleep,", "the", "2", "types", "with", "high", "R", "represent", "phasic", "REM", "sleep.", "12", "Two", "of", "the", "4", "types", "in", "REM", "sleep", "occurred", "in", "all", "patient", "groups,", "indicating", "prototypes", "of", "REM-sleep", "patterning", "(AER/", "and", ").", "Type", "AER/", "was", "significant", "for", "3", "groups", "(controls,", "insomnia", "and", "OSA),", "sparing", "the", "group", "of", "patients", "with", "narcolepsy.", "A", "closer", "inspection", "of", "frequency", "distributions", "of", "the", "different", "types", "in", "REM", "sleep", "showed", "that,", "in", "contrast", "with", "the", "other", "3", "groups,", "in", "patients", "with", "narcolepsy,", "type", "was", "clearly", "more", "frequent", "than", "type", ",", "suggesting", "a", "higher", "rate", "of", "phasic", "EMG", "activity", "in", "REM", "sleep", "of", "narcoleptic", "patients.", "This", "is", "in", "agreement", "with", "results", "by", "Geisler", "et", "al,", "30", "who", "found", "higher", "rates", "of", "phasic", "EMG", "activity", "in", "narcoleptic", "patients", "than", "in", "healthy", "controls..", "In", "summary,", "the", "present", "results", "suggest", "that", "sleep", "stages", "are", "not", "homogeneous", "units", "but", "represent", "an", "aggregation", "of", "different", "substates", "or", "types.", "Additionally,", "the", "analysis", "showed", "that", "the", "basic", "structure", "of", "sleep,", "defined", "by", "types,", "is", "similar", "for", "normal", "sleepers", "and", "for", "patients", "with", "different", "sleep", "pathologies.", "This", "is", "in", "line", "with", "the", "clinical", "experience", "that", "sleep", "stages,", "as", "defined", "for", "normal", "adult", "sleepers,", "31", "are", "also", "used", "routinely", "for", "the", "analysis", "of", "patients", "with", "sleep", "disturbances.", "Future", "studies", "will", "show", "whether", "the", "observed", "differences", "between", "diagnostic", "groups", "are", "actually", "valid", "or", "whether", "they", "merely", "resulted", "from", "limited", "sample", "sizes", "in", "the", "4", "groups." ], [ "The", "types", "from", "Table", "3", "can", "also", "be", "depicted", "as", "8", "compartments", "of", "a", "cube,", "with", "the", "axes", "A,", "E,", "and", "R,", "bisected", "(", "/-)", "on", "each", "side", "(see", "Figure", "3)", ".", "In", "this", "figure", "The", "3-dimensional", "representation", "of", "types", "shows", "apparent", "similarities", "to", "Hobson's", "3-dimensional", "AIM", "model,", "32", "with", "the", "3", "dimensions", "of", "low", "versus", "high", "activation", "(A),", "internal", "versus", "external", "orientation", "(I),", "and", "aminergic", "versus", "cholinergic", "modulation", "(M).", "If", "the", "2", "models", "were", "placed", "to", "coincide,", "the", "present", "variables", "of", "A,", "E,", "and", "R", "would", "correspond", "with", "the", "dimensions", "of", "internal/external", "(I),", "low/high", "activation", "(A),", "and", "aminergic/cholinergic", "modulation", "(M),", "respectively.", "The", "assumed", "compatibility", "suggests", "that", "both", "models", "represent", "basic", "dimensions", "of", "sleep", "organization.", "This", "being", "the", "case,", "one", "would", "expect", "a", "comparable", "outcome", "should", "the", "present", "input", "variables", "be", "replaced", "by", "other", "physiologic", "measures", "such", "as", "autonomic", "variables..", "A", "special", "feature", "of", "the", "CFA", "is", "that", "it", "defines", "not", "only", "types,", "but", "antitypes", "as", "well.", "The", "interpretation", "of", "antitypes", "warrants", "some", "caution,", "since", "the", "independence", "of", "types", "and", "antitypes", "has", "been", "questioned.", "33", "However,", "Netter", "24", "has", "emphasized", "that", "types", "and", "antitypes", "can", "be", "interpreted", "independently", "if", "the", "data", "are", "embedded", "not", "in", "2", "×", "2", "but", "in", "larger", "r", "×", "c", "tables.", "The", "distribution", "of", "antitypes", "was", "quite", "obvious", "in", "the", "present", "analysis.", "Stage", "wake", "contained", "3", "antitypes", "(AER/", ",", ",", "and", "---).", "Two", "of", "them", "were", "also", "significant", "for", "Stage", "1.", "All", "3", "antitypes", "had", "a", "low", "value", "for", "E,", "i.e.,", "low", "EEG", "frequency,", "which", "is", "quite", "untypical", "of", "these", "stages.", "In", "contrast,", "Stages", "2,", "3,", "and", "4", "showed", "4", "antitypes,", "all", "with", "a", "high", "value", "for", "E.", "Finally,", "all", "4", "antitypes", "observed", "in", "REM", "sleep", "(AER/", ",", ",", "and", "---)", "were", "characterized", "by", "a", "low", "value", "for", "E,", "again", "indicating", "a", "low-frequency", "EEG,", "which", "is", "untypical", "of", "REM", "sleep.", "In", "summary,", "the", "observed", "antitypes", "represent", "those", "patterns", "of", "physiologic", "input", "variables", "that", "are", "very", "unlikely", "to", "occur", "in", "these", "states." ], [ "The", "present", "analysis", "began", "with", "3", "continuous", "physiologic", "variables", "(A,", "E,", "and", "R),", "which", "were", "then", "split", "into", "dichotomous", "entities", "for", "further", "statistical", "analysis", "by", "the", "CFA", "technique.", "This", "back", "projection", "of", "continuous", "variables", "into", "discrete", "states", "or", "stages", "touches", "upon", "a", "crucial", "question", "of", "sleep", "research,", "namely,", "how", "best", "to", "describe", "the", "sleep", "process", "as", "such.", "In", "the", "era", "of", "analog", "signal", "recording,", "sleep", "staging", "was", "the", "single", "most", "reasonable", "and", "economic", "procedure", "for", "analyzing", "sleep", "data.", "1,", "2", "With", "the", "introduction", "of", "digital", "data", "recording", "and", "storage,", "alternative", "solutions", "became", "available.", "Today", "a", "wealth", "of", "algorithms", "is", "available,", "allowing", "any", "kind", "of", "signal", "analysis", "(from", "microscopic", "to", "macroscopic)", "of", "sleep", "data.", "Sleep", "staging", "was", "driven", "by", "the", "concept", "that", "sleep", "can", "be", "subdivided", "into", "different", "states", "(REM", "and", "NREM)", "and", "stages", "within", "NREM", "sleep,", "implying", "specific", "regulatory", "mechanisms.", "31", "Many", "recent", "computerized", "procedures", "for", "sleep", "analysis", "represent", "hybrid", "systems,", "first", "separating", "the", "sleep", "process", "into", "NREM", "and", "REM", "sleep", "states,", "then", "analyzing", "NREM", "sleep", "as", "a", "Continuum.", "18", "The", "results", "of", "the", "present", "statistical", "analysis", "shed", "light", "on", "the", "following", "3", "aspects", "of", "sleep", "structure:", "(1)", "Sleep", "stages", "are", "constituted", "by", "discrete", "substates", "(types);", "(2)", "The", "substates", "or", "types", "overlap", "between", "Stages", "wake,", "1,", "and", "REM", "and", "between", "NREM", "Stages", "2,", "3,", "and", "4,", "without", "significant", "overlap", "between", "these", "2", "clusters", "of", "states;", "(3)", "although", "normal", "sleepers", "and", "sleep", "disorder", "patients", "displayed", "basically", "the", "same", "structure", "of", "substates,", "there", "appeared", "some", "specific", "group", "differences,", "which", "still", "need", "confirmation..", "The", "present", "analysis", "has", "various", "limitations", "and", "thus", "can", "only", "constitute", "a", "first", "step", "in", "the", "direction", "of", "a", "taxonomic", "classification", "of", "sleep.", "First,", "the", "3", "input", "variables", "of", "A,", "E,", "and", "R", "were", "selected", "from", "a", "pragmatic", "point", "of", "view,", "since", "the", "continuous", "variables", "were", "computed", "on", "a", "routine", "basis", "in", "our", "lab", "and,", "thus,", "were", "available", "for", "all", "subjects.", "Additionally,", "because", "A", "and", "E", "are", "both", "EEGderived", "parameters,", "the", "information", "content", "of", "these", "2", "variables", "may", "overlap", "to", "a", "certain", "extent.", "Other", "continuous", "variables", "might", "be", "used", "in", "future", "studies.", "Second,", "dichotomization", "of", "the", "input", "variables", "at", "the", "individual", "median", "admittedly", "coarsens", "their", "distribution.", "Due", "to", "this", "methodologic", "restriction,", "variability", "within", "each", "variable", "is", "largely", "reduced.", "This", "may", "have", "contributed", "to", "the", "substantial", "overlap", "of", "patterns", "in", "sleep", "stages", "2,", "3,", "and", "4.", "Trisecting", "the", "input", "variables", "as", "an", "alternative", "procedure,", "which", "would", "allow", "a", "finer", "grading", "of", "the", "input", "variables,", "has", "the", "disadvantage", "of", "resulting", "in", "27", "different", "patterns", "for", "only", "3", "variables.", "In", "this", "case,", "a", "very", "large", "number", "of", "sleep", "recordings", "would", "be", "needed", "for", "statistical", "testing..", "The", "taxonomic", "analysis", "of", "multiple", "physiologic", "processes", "in", "sleep", "uncovered", "stable", "pattern", "configurations", "beyond", "the", "level", "of", "sleep", "stages.", "Thus,", "the", "CFA", "represents", "an", "analytic", "procedure", "that", "allows", "one", "to", "study", "the", "internal", "structure", "of", "sleep", "stages", "and", "transitions", "between", "stages." ], [ "A", "taxonomic", "analysis", "of", "sleep", "stages." ], [ "Study", "Objectives:", "To", "study", "the", "structure", "of", "human", "sleep", "at", "the", "level", "of", "sleep", "stages.", "We", "applied", "taxonomic", "statistics", "to", "detect", "significant", "configurations", "(types)", "of", "different", "physiologic", "variables", "and", "their", "relationship", "to", "sleep", "stages.", "Design", "and", "Statistics:", "Polygraphic", "sleep", "recordings", "from", "32", "subjects", "(normal", "sleepers", "as", "well", "as", "patients", "with", "insomnia,", "sleep", "apnea,", "or", "narcolepsy;", "n", "=", "8", "per", "group)", "were", "visually", "scored", "and", "submitted", "to", "a", "configural", "frequency", "analysis.", "The", "configural", "frequency", "analysis", "was", "computed", "with", "3", "continuous", "input", "variables:", "an", "electroencephalogram", "parameter,", "which", "represents", "the", "point", "of", "gravity", "of", "the", "EEG", "frequency", "distribution;", "the", "alpha", "slow-wave", "index,", "and", "the", "Rest", "Index,", "based", "on", "the", "presence", "or", "absence", "of", "phasic", "electromyographic", "activity.", "These", "variables", "were", "dichotomized", "for", "further", "analysis.", "The", "combination", "of", "2", "levels", "(+", "or", "-)", "and", "3", "variables", "resulted", "in", "2", "3", "patterns", "(+++", "to", "-", "-", "-).", "The", "configural", "frequency", "analysis", "is", "a", "nonparametric", "X", "2", "-type", "multivariate", "statistic", "that", "identifies", "significant", "patterns", "or", "types.", "Results:", "Each", "sleep", "stage", "contained", "3", "or", "4", "types.", "For", "non-rapid", "eye", "movement", "sleep", "stages", "2,", "3,", "and", "4,", "types", "overlapped,", "whereas", "there", "was", "no", "overlap", "of", "types", "between", "stages", "1", "and", "2.", "Types", "of", "rapid", "eye", "movement", "sleep", "did", "not", "overlap", "with", "those", "from", "stages", "2,", "3,", "and", "4", "but", "did", "overlap", "with", "wake", "and", "stage", "1", "types.", "The", "majority", "of", "observed", "types", "were", "significant", "in", "all", "4", "groups", "of", "subjects.", "Conclusions:", "Sleep", "stages", "appear", "to", "be", "less", "homogenous", "than", "rule-based", "sleep", "scoring", "would", "suggest.", "Types", "were", "either", "restricted", "to", "one", "stage", "or", "overlapped", "with", "neighboring", "stages." ] ]
[ "classification" ]
[ "sleep wake cycle", "electrodiagnosis", "electrophysiology", "electroencephalography" ]
[ [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ] ]
18980511
[ "introduction", "materials", "preparation of supported lipid membranes", "measurement of mol% cholesterol", "afm imaging of lipid membranes", "high-resolution sims analysis", "determination of lipid composition within lipid phases", "results", "cholesterol-free phase-separated supported lipid membranes", "n-dlpc/d 70 -dspc domains (see later)", "phase-separated supported lipid membranes with 3-15 mol% cholesterol", "supported lipid membranes containing 19 mol% cholesterol and greater", "significance and implications", "conclusion", "title", "abstract" ]
[ [ "Lateral", "variations", "in", "component", "distribution", "within", "the", "plasma", "membrane", "are", "required", "to", "coordinate", "membrane-mediated", "cellular", "functions", "[1]", "[2]", "[3]", ".", "The", "nonrandom", "distributions", "of", "certain", "proteins", "within", "the", "plasma", "membrane", "are", "well-established", "[4]", "[5]", "[6]", "[7]", "[8]", "[9]", ".", "Lipids", "and", "cholesterol", "are", "also", "believed", "to", "be", "spatially", "organized", "in", "biological", "membranes,", "but", "whether", "their", "organization", "is", "driven", "by", "lipid-lipid", "or", "lipid-protein", "interactions", "is", "not", "clear", "[1]", "[2]", "[3]", ".", "In", "one", "model", "of", "plasma", "membrane", "organization,", "differential", "affinities", "between", "cholesterol", "and", "other", "membrane", "components", "are", "hypothesized", "to", "drive", "the", "formation", "of", "liquid-ordered,", "cholesterol-and", "sphingolipid-enriched", "nanoscale", "domains", "(diameters", "b300", "nm)", "that", "are", "referred", "to", "as", "lipid", "rafts", "[1,", "3,", "10,", "11]", ".", "Thus,", "characterizing", "the", "effects", "of", "cholesteroldependent", "interactions", "on", "component", "distribution", "within", "the", "plasma", "membrane", "is", "the", "goal", "of", "much", "research..", "Insight", "into", "how", "lipid-cholesterol", "and", "lipid-lipid", "interactions", "might", "influence", "lipid", "organization", "within", "biological", "membranes", "has", "been", "acquired", "by", "studying", "model", "lipid", "membranes", "[12]", ".", "In", "the", "absence", "of", "cholesterol,", "membranes", "composed", "of", "a", "low", "and", "high", "melting", "temperature", "lipid", "component", "homogeneously", "mix", "when", "heated", "above", "the", "melting", "transition", "temperature", "(T", "m", ")", "of", "both", "lipid", "species,", "but", "separate", "into", "disordered", "fluid-phase", "and", "ordered", "gel-phase", "domains", "when", "cooled", "below", "the", "T", "m", "of", "the", "high-melting", "temperature", "lipid", "species", "[13,", "14]", ".", "The", "addition", "of", "cholesterol", "to", "the", "membrane", "affects", "the", "lipid", "miscibility", "and", "domain", "microstructure", "observed", "at", "room", "temperature", "in", "a", "manner", "that", "depends", "on", "the", "degree", "of", "saturation", "in", "the", "low-melting", "temperature", "lipid", "[15]", "[16]", "[17]", "[18]", ".", "At", "low", "cholesterol", "concentrations,", "membranes", "composed", "of", "a", "di-unsaturated", "low", "T", "m", "lipid,", "such", "as", "1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine", "(DOPC),", "and", "a", "high", "T", "m", "lipid", "species", "exhibit", "macroscopic", "fluid-and", "gel-phase", "domains", "[14,", "15]", ".", "At", "higher", "cholesterol", "concentrations", "(mole", "fraction", "N~0.16),", "the", "gel-phase", "is", "replaced", "by", "macroscopic", "liquidordered", "domains", "that", "coexist", "with", "the", "disordered", "fluid-phase", "[14,", "[17]", "[18]", "[19]", "[20]", "[21]", ".", "Above", "a", "threshold", "cholesterol", "concentration", "(mole", "fraction", "Ñ", "0.4),", "phase", "separation", "ceases", "and", "homogeneous", "lipid", "mixing", "occurs", "[14,", "[17]", "[18]", "[19]", "[20]", "[21]", ".", "In", "contrast,", "macroscopic", "liquid-ordered", "domains", "are", "usually", "not", "detected", "in", "cholesterol-containing", "ternary", "membranes", "in", "which", "the", "lipid", "species", "with", "the", "low", "T", "m", "is", "saturated,", "such", "as", "1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine", "(DLPC)", "[14,", "15,", "17,", "18,", "[22]", "[23]", "[24]", "[25]", ".", "The", "gel-phase", "domains", "that", "coexist", "with", "the", "disordered", "fluid-phase", "undergo", "a", "reduction", "in", "size", "without", "the", "formation", "of", "macroscopic,", "liquid-ordered", "domains", "as", "the", "cholesterol", "concentration", "increases", "[15,", "22,", "23]", ".", "For", "example,", "Fig.", "1", "shows", "the", "ternary", "phase", "diagram", "determined", "by", "Zhao", "et", "al.", "for", "giant", "unilamellar", "vesicles", "composed", "of", "DLPC/1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine", "(DSPC)/cholesterol", "at", "room", "temperature", "[22]", ".", "At", "a", "threshold", "cholesterol", "concentration", "(0.15-0.2", "mole", "fraction),", "phase", "separation", "could", "not", "be", "visualized", "in", "giant", "unilamellar", "vesicles", "(GUVs)", "using", "conventional", "fluorescence", "microscopy,", "but", "fluorescence", "resonance", "energy", "transfer", "(FRET)", "measurements", "indicate", "that", "the", "membrane", "is", "not", "homogeneously", "mixed", "[18,", "22]", ".", "This", "FRET", "behavior", "is", "postulated", "to", "be", "due", "to", "the", "presence", "of", "nanoscopic", "liquid-ordered", "domains", "in", "the", "membrane,", "even", "though", "tiny", "gel-phase", "domains", "and", "distinct", "lipid", "clusters", "transiently", "produced", "by", "non-ideal", "mixing", "may", "also", "be", "consistent", "with", "these", "results", "[18,", "20,", "22,", "25,", "26]", "..", "Although", "saturated,", "low", "T", "m", "lipids", "are", "rarely", "found", "in", "cellular", "membranes,", "identification", "of", "how", "this", "change", "in", "lipid", "structure", "alters", "membrane", "phase", "behavior", "provides", "a", "better", "understanding", "of", "the", "physiological", "significance", "of", "fatty", "acid", "chain", "unsaturation", "in", "biological", "membranes.", "Moreover,", "demonstration", "of", "the", "existence", "of", "nanoscopic", "liquid-ordered", "domains", "in", "model", "lipid", "membranes", "would", "indicate", "that", "lipid-lipid", "and", "lipid-cholesterol", "interactions", "are", "sufficient", "to", "produce", "liquid-ordered", "domains", "with", "dimensions", "similar", "to", "those", "that", "may", "exist", "in", "biological", "membranes.", "Despite", "the", "significance", "of", "such", "a", "finding,", "whether", "the", "nanoscale", "heterogeneity", "detected", "in", "membranes", "composed", "of", "DLPC,", "DSPC,", "and", "a", "threshold", "cholesterol", "concentration", "is", "due", "to", "the", "presence", "of", "liquid-ordered", "domains,", "gelphase", "domains,", "or", "non-ideally", "mixed", "transient", "lipid", "assemblages", "has", "not", "been", "definitively", "established..", "A", "key", "difference", "between", "phase-separated", "domains", "and", "nonideally", "mixed", "transient", "lipid", "clusters", "is", "that", "the", "composition", "and", "microstructure", "would", "be", "constant", "between", "nanoscopic", "phaseseparated", "domains", "of", "the", "same", "phase,", "as", "opposed", "to", "varying", "from", "one", "structure", "to", "another", "in", "non-ideally", "mixed", "lipid", "assemblages", "[18]", ".", "Liquid-ordered", "and", "gel-phase", "domains", "can", "be", "discriminated", "by", "their", "microstructures,", "as", "the", "edges", "of", "liquid-ordered", "domains", "are", "smooth", "and", "rounded,", "whereas", "the", "perimeters", "of", "gel-phase", "domains", "are", "angular", "and", "jagged", "[18,", "22,", "23,", "27]", ".", "The", "membrane", "thickness", "may", "also", "differ", "between", "gel-phase", "and", "liquid-ordered", "domains", "[28]", ".", "Therefore,", "information", "on", "the", "composition", "and", "microstructure", "of", "individual", "domains", "is", "required", "to", "identify", "whether", "the", "lipid", "structures", "detected", "at", "the", "threshold", "cholesterol", "concentration", "are", "non-ideally", "mixed", "lipid", "assemblages", "or", "phase-separated", "domains", "in", "the", "gel-or", "liquid-ordered", "phase.", "The", "microstructure,", "and", "therefore", "phase,", "of", "submicron-sized", "lipid", "assemblages", "within", "supported", "lipid", "bilayers", "can", "be", "characterized", "with", "atomic", "force", "microscopy", "(AFM)", "even", "when", "the", "domain", "sizes", "are", "below", "the", "lateral", "resolution", "of", "conventional", "fluorescence", "microscopy", "[15,", "16,", "23,", "25,", "29,", "30]", "..", "Assessing", "the", "lipid", "composition", "of", "individual", "lipid", "domains", "is", "more", "challenging", "because", "few", "analytical", "techniques", "yield", "spatially", "resolved", "and", "chemically", "specific", "information.", "Secondary", "ion", "mass", "spectrometry", "(SIMS)", "is", "one", "of", "the", "few", "approaches", "that", "enables", "imaging", "specific", "lipid", "species", "within", "supported", "lipid", "membranes", "with", "both", "chemical", "and", "spatial", "specificity", "[30]", "[31]", "[32]", "[33]", "[34]", "[35]", "[36]", "[37]", "[38]", "[39]", "[40]", ".", "Time-of-flight", "SIMS", "(TOF-SIMS)", "is", "a", "molecular", "imaging", "approach", "that", "has", "the", "advantage", "of", "not", "requiring", "labels", "for", "lipid", "identification,", "but", "the", "lateral", "resolution", "and", "sensitivity", "is", "seldom", "sufficient", "to", "characterize", "submicron-sized", "lipid", "domains", "[41]", ".", "Recently,", "a", "combination", "of", "high-resolution", "SIMS", "performed", "with", "a", "Cameca", "NanoSIMS", "50", "and", "lipid-specific", "isotope", "labeling", "has", "permitted", "the", "distributions", "of", "two", "isotopically", "labeled", "lipid", "species", "in", "phase-separated", "supported", "lipid", "membranes", "to", "be", "imaged", "with", "100-nm-lateral", "resolution", "and", "quantified", "[31]", ",", "rendering", "this", "a", "promising", "approach", "to", "analyze", "the", "lipid", "composition", "within", "nanoscopic", "lipid", "domains", "(diameters", "b300", "nm).", "The", "Cameca", "NanoSIMS", "50", "is", "a", "magnetic", "sector", "mass", "spectrometer", "that", "can", "image", "differences", "in", "elemental", "and", "isotopic", "composition", "[42]", ".", "To", "identify", "and", "image", "different", "lipids", "using", "a", "NanoSIMS,", "each", "lipid", "species", "must", "contain", "a", "distinct", "stable", "isotope", "so", "that", "the", "secondary", "ions", "generated", "during", "analysis", "can", "be", "linked", "to", "the", "parent", "lipid", "species", "[42]", "..", "Here", "we", "use", "AFM", "and", "NanoSIMS", "to", "characterize", "the", "effects", "of", "cholesterol", "addition", "on", "the", "microstructure", "and", "composition", "of", "lipid", "domains", "in", "ternary", "membranes", "composed", "of", "the", "saturated,", "low", "T", "m", "lipid", "15", "N-1,2-dilauryl-sn-glycero-3-phosphocholine", "(", "15", "N-DLPC),", "and", "the", "high", "T", "m", "lipid", "1,2-distearoyl-D", "70", "-sn-glycero-3-phosphocholine", "(D", "70", "-DSPC).", "We", "investigated", "the", "cholesterol", "concentrations", "between", "0", "and", "19", "mol%.", "Over", "this", "range", "of", "cholesterol", "concentrations,", "GUVs", "composed", "of", "DLPC/DSPC", "exhibit", "macroscopic", "phase-separated", "domains", "and", "nanoscale", "heterogeneous", "mixing", "that", "is", "postulated", "to", "signify", "the", "presence", "of", "tiny", "liquid-ordered", "domains", "[18,", "22]", ".", "Supported", "lipid", "membranes", "are", "the", "subject", "of", "these", "studies", "to", "permit", "analyses", "with", "NanoSIMS", "and", "AFM.", "Although", "discrepancies", "in", "the", "phase", "behavior", "of", "supported", "membranes", "and", "GUVs", "have", "been", "reported", "[25]", ",", "we", "avoided", "the", "non-equilibrium", "effects", "potentially", "induced", "by", "the", "solid", "support", "by", "using", "slow-cooled", "vesicle", "fusion", "to", "prepare", "the", "supported", "membranes,", "as", "demonstrated", "by", "Longo", "and", "coworkers", "[23]", ".", "Analysis", "of", "the", "same", "regions", "of", "the", "membrane", "with", "both", "AFM", "and", "NanoSIMS", "enabled", "correlation", "of", "domain", "microstructure", "with", "lipid", "composition,", "and", "allowed", "us", "to", "assess", "whether", "the", "nanoscopic", "lipid", "assemblages", "that", "occur", "near", "the", "threshold", "cholesterol", "concentration", "are", "non-ideally", "mixed", "clusters,", "or", "phase-separated", "lipid", "domains", "in", "either", "a", "gel", "or", "liquid-ordered", "state.", "As", "shown", "later,", "the", "AFM", "and", "NanoSIMS", "data", "indicate", "that", "the", "nanoscopic", "lipid", "assemblies", "within", "the", "19", "mol%", "cholesterol", "membrane", "are", "gel-phase", "domains." ], [ "The", "chrome-patterned,", "oxidized", "silicon", "substrates", "(10-nm-thick", "oxide", "layer)", "were", "prepared", "as", "previously", "described", "[31]", "using", "silicon", "wafers", "that", "were", "a", "generous", "gift", "from", "Prof.", "Steven", "G.", "Boxer", "was", "synthesized", "as", "reported", "[31]", ".", "To", "minimize", "possible", "oxidation,", "cholesterol", "was", "freshly", "synthesized", "from", "i-cholesteryl", "methyl", "ether", "(Sigma)", "as", "reported", "[43]", ".", "The", "cholesterol", "and", "phospholipid", "concentrations", "in", "the", "vesicle", "solutions", "were", "measured", "with", "the", "Amplex", "®", "Red", "Cholesterol", "Assay", "Kit", "and", "the", "Amplex", "®", "Red", "Phospholiase", "D", "Assay", "Kit,", "respectively,", "from", "Molecular", "Probes", "(Eugene,", "OR).", "Millipore", "(18", "mΩ)", "water", "was", "used", "in", "all", "experiments." ], [ "Small", "unilamellar", "vesicles", "were", "created", "from", "an", "equal", "molar", "ratio", "of", "15", "A", "small", "amount", "(1", "mol%)", "of", "the", "fluorescent", "lipid,", "NBD-PC,", "was", "added", "to", "the", "mixture", "to", "allow", "the", "evaluation", "of", "membrane", "integrity", "and", "the", "presence", "of", "phase", "separation", "using", "fluorescence", "microscopy.", "These", "components", "were", "dissolved", "in", "chloroform,", "dried", "under", "nitrogen,", "and", "placed", "under", "a", "vacuum", "to", "remove", "residual", "chloroform.", "The", "lipid", "film", "was", "resuspended", "in", "65°C", "water", "to", "a", "final", "lipid", "concentration", "of", "0.5", "mg/mL.", "The", "lipid", "solution", "was", "heated", "in", "a", "65°C", "water", "bath", "for", "15", "min,", "vortexed,", "transferred", "to", "a", "plastic", "tube,", "and", "sonicated", "using", "a", "tip", "sonicator", "(Branson", "Tip", "Sonifier", "Model", "250,", "Branson", "Ultrasonics,", "Danbury", "CT)", "for", "30", "s", "intervals", "until", "it", "became", "transparent.", "The", "vesicle", "solution", "was", "reheated", "to", "65°C", "in", "a", "water", "bath,", "and", "2.5", "mL", "of", "65°C", "vesicle", "solution", "was", "added", "to", "a", "60-mmdiameter", "×", "15-mm-tall", "polystyrene", "culture", "dish", "containing", "multiple", "chrome-patterned,", "oxidized", "silicon", "substrates", "submerged", "in", "2.5", "mL", "of", "65°C", "water.", "The", "culture", "dish", "was", "covered,", "incubated", "at", "room", "temperature", "for", "40", "min", "to", "allow", "for", "bilayer", "formation,", "and", "then", "was", "transferred", "into", "a", "65°C", "water", "bath.", "The", "substrates", "were", "gently", "shaken", "under", "water", "to", "dislodge", "vesicles", "adhered", "to", "the", "bilayer's", "surface,", "and", "were", "transferred", "to", "a", "fresh", "65°C", "water", "bath.", "The", "water", "bath", "containing", "the", "substrates", "was", "placed", "in", "a", "programmable", "oven", "(ECHOterm™", "IN35", "Programmable", "Chilling/Heating", "Incubator,", "Torrey", "Pines", "Scientific,", "San", "Diego,", "CA),", "maintained", "at", "70°C", "for", "1", "h,", "and", "then", "was", "slowly", "cooled", "to", "room", "temperature", "at", "a", "rate", "of", "5°C/h", "to", "induce", "phase", "separation.", "To", "prepare", "the", "lipid", "membranes", "for", "SIMS", "analysis,", "the", "samples", "were", "flash-frozen", "in", "liquid", "ethane", "and", "freeze-dried", "as", "previously", "described", "[31]", "[32]", "[33]", ".", "To", "evaluate", "sample", "quality,", "fluorescence", "imaging", "was", "performed", "on", "a", "Leica", "DM6000", "B", "upright", "fluorescence", "microscope", "equipped", "with", "a", "fluorescence", "filter", "cube", "(GFP,", "Leica)", "that", "matches", "the", "excitation", "and", "emission", "spectra", "for", "NBD-PC." ], [ "The", "moles", "of", "cholesterol", "and", "phosphatidylcholine", "(PC)", "in", "each", "vesicle", "solution", "were", "measured", "using", "the", "Amplex", "®", "Red", "Cholesterol", "Assay", "Kit", "and", "the", "Amplex", "®", "Red", "Phospholiase", "D", "Assay", "Kit,", "respectively.", "The", "assays", "were", "performed", "in", "96-well", "plates", "purchased", "from", "Costar", "®", "(Corning,", "NY),", "and", "the", "fluorescence", "intensity", "was", "read", "using", "a", "Synergy", "HT", "Multi-Mode", "Microplate", "Reader", "Model", "SIAFRT", "(Biotek", "®", "Instruments,", "Inc.,", "Winooski,", "VT).", "Cholesterol", "and", "PC", "standards", "were", "used", "to", "create", "the", "calibration", "curves.", "Eight", "replicates", "were", "performed", "on", "each", "vesicle", "and", "standard", "solution.", "The", "μmole", "of", "cholesterol", "and", "PC", "measured", "in", "each", "small", "unilamellar", "vesicle", "solution", "was", "used", "to", "calculate", "the", "mol%", "of", "cholesterol.", "The", "mol%", "cholesterol", "in", "the", "supported", "lipid", "membranes", "is", "assumed", "to", "be", "the", "same", "as", "the", "cholesterol", "content", "in", "the", "vesicle", "solution", "used", "for", "bilayer", "formation." ], [ "AFM", "analysis", "was", "performed", "in", "ambient", "air", "and", "temperature", "using", "an", "Asylum", "MFP-3D™", "Stand", "Alone", "AFM.", "AFM", "images", "were", "acquired", "of", "the", "phase-separated", "membranes", "within", "specific", "grid", "boxes,", "which", "were", "relocated", "and", "analyzed", "with", "the", "NanoSIMS.", "Measurements", "were", "taken", "with", "standard", "tapping", "300", "kHz", "AFM", "probes", "(Tap300Al-G,", "Budget", "Sensors,", "Bulgaria)", "in", "AC", "(tapping)", "mode", "operated", "in", "the", "repulsive", "tip-sample", "interaction", "regime", "to", "preserve", "tip", "lifetime.", "Images", "were", "flattened", "to", "the", "first", "order.", "The", "line", "scans", "were", "averaged", "over", "three", "pixels", "perpendicular", "to", "the", "line-section", "path", "to", "minimize", "random", "variations", "in", "height", "due", "to", "noise.", "The", "line", "scans", "made", "on", "the", "19", "mol%", "cholesterol", "membrane", "were", "not", "averaged", "because", "the", "domains", "were", "often", "smaller", "than", "the", "3-pixel", "averaging", "width.", "For", "each", "cholesterol", "concentration", "investigated,", "the", "height", "difference", "between", "the", "gel-and", "fluid-phase", "regions", "was", "measured", "at", "ten", "different", "domain", "interfaces." ], [ "SIMS", "was", "performed", "on", "a", "Cameca", "NanoSIMS", "50", "instrument", "(Cameca,", "France)", "at", "Lawrence", "Livermore", "National", "Laboratory", "(Livermore,", "CA).", "Measurements", "were", "made", "with", "a~0.8", "pA,", "16", "keV", "Cs", "+", "primary", "ion", "beam", "focused", "onto", "a~100", "nm-diameter", "spot", "with", "an", "analysis", "area", "of", "25", "μm", "×", "25", "μm.", "A", "beam", "diameter", "of", "102", "nm", "was", "determined", "using", "the", "reported", "knife-edge", "method", "[31]", ".", "Measurements", "consisted", "of", "six", "replicate", "scans", "of", "512", "×", "512", "pixels", "with", "a", "dwell", "time", "of", "0.3", "ms/pixel,", "and", "corresponded", "to", "a", "primary", "ion", "dose", "of", "3.8", "×", "10", "14", "ions/cm", "2", ".", "The", "analysis", "conditions", "used", "in", "this", "work", "were", "chosen", "to", "provide", "sufficient", "ion", "counts", "to", "characterize", "the", "samples", "while", "minimizing", "analysis", "time.", "Based", "on", "our", "analysis", "conditions,", "a", "total", "sputter", "time", "of", "472", "s,", "and", "the", "sputtering", "rate", "of", "2.5", "nm", "μm", "2", "/pA", "s", "determined", "on", "other", "biological", "samples", "[45]", ",", "we", "estimate", "that", "the", "sputtering", "depth", "was~1.5", "nm", "for", "these", "measurements.", "Based", "on", "the", "thickness", "of", "the", "bilayer,", "the", "analysis", "time", "could", "have", "been~3", "times", "longer,", "though", "the", "secondary", "ion", "intensities", "obtained", "in", "each", "additional", "replicate", "scan", "would", "be", "lower", "than", "the", "previous", "scan.", "The", "pixel", "size", "in", "the", "NanoSIMS", "ion", "images", "was", "49", "nm×", "49", "nm,", "which", "is", "smaller", "than", "the", "beam", "diameter.", "The", "secondary", "ion", "signals", ",", "and", "the", "secondary", "electron", "signal", "were", "collected", "simultaneously", "using", "multi-collection", "mode.", "A", "mass", "resolving", "power", "of~7500", "was", "used", "to", "separate", "isobaric", "interferences", "from", "the", "isotopes", "of", "interest,", "e.g.,", ")", "were", "smoothed", "over", "3", "×", "3", "pixels", "(147", "nm×", "147", "nm).", "Then", "the", "lipid-specific", "ion", "signal", "was", "normalized", "by", "dividing", "the", "intensity", "for", "each", "ion", "by", "the", "12", "C", "−", "intensity", "measured", "at", "the", "same", "pixel", "in", "order", "to", "minimize", "random,", "concentration-independent", "changes", "in", "the", "signal", "intensity.", "Regions", "of", "interest", "(ROIs)", "on", "the", "calibration", "set", "of", "homogeneous", "lipid", "membranes", "were", "defined", "on", "areas", "of", "the", "substrate", "that", "were", "covered", "by", "the", "membrane,", "and", "excluded", "areas", "where", "the", "chrome", "grid", "or", "obvious", "defects", "were", "visible", "in", "the", "secondary", "electron", "image", "that", "was", "collected", "in", "parallel", "to", "the", "secondary", "ion", "images.", "ROIs", "on", "the", "phaseseparated", "membranes", "that", "consisted", "of", "only", "gel-phase", "or", "fluid-phase", "regions", "were", "defined", "based", "on", "the", "correlated", "AFM", "images." ], [ "A", "calibration", "curve", "correlating", "the", "normalized", "N-DLPC", "in", "the", "membrane", "was", "made", "as", "previously", "reported", "[31,", "32]", ".", "Briefly,", "NanoSIMS", "analysis", "was", "performed", "on", "homogeneous", "lipid", "bilayers", "that", "systematically", "varied", "in", "mol%", "15", "N-DLPC", "to", "unlabeled", "DLPC.", "These", "samples", "were", "used", "instead", "of", "15", "N-DLPC/cholesterol", "membranes", "in", "order", "to", "obtain", "a", "calibration", "curve", "that", "was", "accurate", "at", "both", "high", "and", "low", "15", "N-DLPC", "concentrations.", "The", "same", "analytical", "conditions", "were", "used", "for", "the", "calibration", "and", "phaseseparated", "samples.", "We", "assessed", "the", "validity", "of", "these", "calibration", "samples", "by", "calculating", "the", "relative", "sensitivity", "factors", "(RSF)", "[36]", "N-DLPC", "in", "the", "gel-phase", "and", "standard", "deviation", "were", "calculated.", "Because", "NBD-PC", "is", "excluded", "from", "the", "gel-phase", "[31,", "46]", ",", "the", "average", "amount", "of", "D", "70", "-DSPC", "in", "the", "gelphase", "regions", "of", "the", "cholesterol-free", "membrane", "was", "determined", "by", "subtracting", "the", "mol%", "15", "N-DLPC", "measured", "at", "membrane", "locations", "identified", "as", "gel-phase", "by", "AFM", "from", "100", "mol%." ], [ "The", "cooling", "rate", "employed", "for", "bilayer", "formation", "determines", "whether", "the", "phase", "separation", "approaches", "equilibrium.", "All", "of", "the", "samples", "we", "studied", "were", "cooled", "to", "room", "temperature", "at", "the", "same", "rate", "to", "ensure", "that", "any", "variations", "in", "domain", "morphology", "were", "not", "due", "to", "differences", "in", "their", "thermal", "history.", "For", "compatibility", "with", "NanoSIMS", "analysis,", "the", "room", "temperature", "15", "N-DLPC/D", "70", "-DSPC/", "cholesterol", "supported", "lipid", "membranes", "were", "flash-frozen", "and", "freeze-dried", "to", "remove", "the", "water", "without", "perturbing", "lipid", "organization", "[31]", ".", "Previous", "studies", "demonstrated", "that", "flash-freezing", "and", "freeze-drying", "do", "not", "induce", "further", "phase", "separation", "or", "other", "changes", "in", "membrane", "organization", "[31]", ",", "and", "the", "preserved", "membrane", "structure", "reflects", "that", "present", "at", "room", "temperature", "prior", "to", "membrane", "preservation.", "The", "lipids", "in", "the", "membrane", "do", "not", "exhibit", "lateral", "mobility", "after", "freeze-drying,", "and", "the", "membrane", "organization", "does", "not", "change", "in", "the", "time", "between", "AFM", "imaging", "and", "NanoSIMS", "analysis", "(2-6", "weeks).", "Note", "that", "the", "use", "of", "isotopically", "labeled", "lipids", "is", "not", "expected", "to", "alter", "membrane", "phase", "behavior", "because", "D", "70", "-DSPC", "has", "nearly", "the", "same", "T", "m", "as", "natural", "abundance", "DSPC", "(50.5°C", "and", "55.0°C,", "respectively,", "[44]", "),", "and", "the", "single", "nitrogen-15", "isotope", "in", "15", "N-DLPC", "should", "not", "affect", "its", "T", "m", "." ], [ "To", "correlate", "domain", "structure", "with", "lipid", "composition,", "we", "imaged", "the", "same", "locations", "within", "the", "phase-separated", "supported", "lipid", "membrane", "using", "both", "AFM", "and", "NanoSIMS.", "Similar", "to", "previous", "AFM", "studies", "of", "phase-separated", "supported", "lipid", "membranes", "[29]", "[30]", "[31]", "46", ",47],", "we", "observed", "circular", "gel-phase", "domains", "with", "a", "bimodal", "size", "distribution", "in", "the", "cholesterol-free", "membrane", "(Fig.", "3", "and", "supplemental", "images).", "Small", "gel-phase", "domains", "with", "diameters", "below", "200", "nm", "were", "primarily", "located", "near", "the", "perimeters", "of", "the", "large", "gelphase", "structures", "that", "were", "several", "microns", "in", "diameter", "(", "Fig.", "3a", "and", "b)", ".", "Nanoscopic", "fluid-phase", "subdomains", "were", "also", "trapped", "inside", "of", "the", "micron-sized", "gel-phase", "domains.", "We", "measured", "a", "height", "difference", "of", "1.3", "nm", "at", "the", "interface", "between", "the", "gel-and", "fluid-phase", "domains", "(Fig.", "3b,", "inset", ").", "This", "height", "difference", "is", "smaller", "than", "that", "previously", "reported", "between", "gel-and", "fluid-phase", "domains", "(1.8", "nm)", "and", "is", "closer", "to", "the", "height", "difference", "between", "an", "asymmetric", "domain,", "with", "one", "gel-phase", "and", "one", "fluid-phase", "leaflet,", "and", "a", "symmetric", "fluidphase", "domain", "[31,", "46]", ".", "However,", "NanoSIMS", "analysis", "of", "these", "domains", "(", "Fig.", "3c", "and", "d)", "indicated", "they", "contain", "too", "little", "15", "N-DLPC", "to", "be", "asymmetric", "15" ], [ ".", "The", "smaller", "height", "difference", "we", "measured", "between", "the", "gel-and", "fluid-phases", "is", "likely", "due", "to", "our", "use", "of", "a", "repulsive", "tip-sample", "interaction", "for", "AFM", "imaging", "[48]", ".", "AFM", "imaging", "of", "similar", "samples", "performed", "with", "a", "repulsive", "tip-sample", "interaction", "yielded", "a", "height", "difference", "of", "1.3", "nm", "at", "the", "gel/fluid", "interface,", "but", "with", "a", "tip-sample", "interaction", "that", "fluctuated", "between", "repulsive", "and", "attractive,", "we", "measured", "a", "height", "difference", "of", "1.6", "nm", "at", "the", "same", "location", "(not", "shown),", "which", "is", "close", "to", "the", "1.8", "nm", "height", "difference", "that", "was", "previously", "reported", "[31,", "46]", ".", "NanoSIMS", "analysis", "was", "performed", "at", "the", "same", "membrane", "locations", "that", "were", "imaged", "with", "AFM.", "The", "normalized", "12", "N-DLPC,", "respectively.", "The", "absence", "of", "lipid-specific", "ions", "at", "the", "some", "pixels", "is", "due", "to", "the", "low", "intensity", "of", "the", "minor", "isotopes,", "as", "the", "AFM", "image", "of", "the", "freeze-dried", "membrane", "does", "not", "show", "damage", "at", "these", "sites", "(", "Fig.", "3a", "and", "b)", ".", "Similar", "to", "previous", "reports,", "the", "area", "occupied", "by", "D", "70", "-DSPC", "within", "the", "membrane", "appeared", "to", "be", "slightly", "lower", "than", "that", "expected", "based", "on", "the", "mol%", "D", "70", "-DSPC", "in", "the", "vesicles", "used", "for", "membrane", "preparation", "[31]", ".", "This", "difference", "in", "the", "D", "70", "-DSPC", "content", "within", "the", "supported", "membranes", "and", "the", "vesicles", "used", "for", "membrane", "formation", "is", "likely", "due", "to", "the", "selective", "adsorption", "of", "these", "different", "lipid", "species", "onto", "the", "substrate,", "or", "from", "a", "lipid", "exchange", "process", "[23,", "49]", "..", "Using", "the", "NanoSIMS", "calibration", "curves", "described", "earlier,", "we", "determined", "that", "the", "15", "N-DLPC", "concentration", "was~97", "mol%", "in", "the", "fluid-phase", "domains,", "and~6", "mol%", "in", "the", "gel-phase", "domains.", "Because", "NBD-PC", "is", "excluded", "from", "the", "gel-phase", "[31,", "46]", ",", "the", "D", "70", "-DSPC", "concentration", "in", "the", "gel-phase", "regions", "of", "the", "cholesterol-free", "membrane", "is~94", "mol%.", "These", "results", "are", "consistent", "with", "previous", "NanoSIMS", "studies", "of", "DLPC/DSPC", "membranes,", "and", "with", "phase", "diagram", "predictions", "that", "the", "gel-phase", "contains", "≤10", "mol%", "DLPC", "and", "the", "fluidphase", "contains", "≤10", "mol%", "DSPC", "[31,", "50]", ".", "The", "one", "exception", "was", "at", "the", "edges", "of", "the", "large", "gel-phase", "domains,", "where", "the", "data", "occasionally", "suggest", "the", "fractions", "of", "D", "70", "-DSPC", "and", "15", "N-DLPC", "within", "the", "same", "pixel", "(yellow", "areas,", "Fig.", "3c", "and", "d)", "were", "more", "nearly", "equal.", "This", "might", "suggest", "that", "the", "amount", "of", "lipid", "mixing", "at", "the", "edges", "of", "the", "domains", "was", "greater", "than", "that", "predicted", "by", "phase-diagrams.", "However,", "the", "AFM", "images", "acquired", "at", "these", "sites", "show", "that", "the", "edges", "of", "the", "gelphase", "domains", "are", "not", "smooth,", "but", "instead", "consist", "of", "many", "small", "crevices", "and", "peninsulas.", "Thus,", "the", "detection", "of", "elevated", "amounts", "of", "D", "70", "-DSPC", "and", "15", "N-DLPC", "at", "the", "same", "pixel", "occurred", "because", "these", "structures", "were", "not", "resolved", "in", "these", "NanoSIMS", "images,", "which", "were", "acquired", "with", "a", "beam", "diameter", "of~100", "nm", "and", "were", "smoothed", "to", "the", "equivalent", "of~150-nm-lateral", "resolution." ], [ "The", "addition", "of", "cholesterol", "to", "the", "membrane", "induced", "an", "elongation", "of", "the", "macroscopic", "gel-phase", "domains.", "At", "3", "mol%", "cholesterol,", "the", "macroscopic", "D", "70", "-DSPC-enriched", "gel-phase", "domains", "were", "oblong", "and", "had", "jagged", "borders", "(", "Fig.", "4a", "and", "d,", "and", "supplemental", "images)", ".", "A", "network", "of", "gel-phase", "domains", "was", "observed", "at", "7", "mol%", "cholesterol", "(", "Fig.", "4b", "and", "e,", "and", "supplemental", "images)", ".", "Similar", "to", "the", "cholesterol-free", "membrane,", "fluid-phase", "subdomains", "were", "entrapped", "within", "the", "macroscopic", "gel-phase", "structures,", "and", "gel-phase", "microdomains", "were", "dispersed", "throughout", "the", "fluid-phase", "in", "the", "3", "and", "7", "mol%", "cholesterol", "membranes.", "A", "networked", "gel-phase", "structure", "that", "contained", "entrapped", "fluid-phase", "subdomains", "was", "also", "observed", "in", "the", "15", "mol%", "cholesterol", "membrane,", "but", "the", "edges", "of", "the", "gel-phase", "structures", "were", "smoother", "than", "those", "observed", "in", "the", "other", "membranes", "(", "Fig.", "4c", "and", "f,", "and", "supplemental", "images)", ".", "The", "area", "occupied", "by", "the", "D", "70", "-DSPC-rich", "domains", "in", "the", "membranes", "that", "contained", "7", "and", "15", "mol%", "cholesterol", "was", "higher", "than", "that", "expected", "based", "on", "the", "compositions", "of", "the", "vesicles", "used", "for", "membrane", "formation.", "This", "difference", "in", "surface", "coverage", "was", "consistent", "across", "the", "membrane", "(see", "supplemental", "images).", "We", "attribute", "these", "results", "to", "the", "phenomena", "occurring", "during", "bilayer", "formation,", "such", "as", "the", "selective", "adsorption", "of", "the", "lipid", "species", "onto", "the", "substrate", "or", "lipid", "exchange,", "as", "opposed", "to", "selective", "incorporation", "of", "cholesterol", "into", "the", "ordered", "domains,", "because", "cholesterol", "is", "expected", "to", "evenly", "distribute", "between", "the", "two", "lipid", "phases", "[14]", ".", "Moreover,", "the", "increase", "in", "D", "70", "-DSPC", "domain", "surface", "coverage", "seems", "larger", "than", "the", "fraction", "of", "cholesterol", "in", "the", "membrane.", "The", "height", "difference", "between", "the", "gel-and", "fluid-phase", "regions", "of", "the", "3,", "7,", "and", "15", "mol%", "cholesterol", "membranes", "did", "not", "change", "from", "that", "measured", "in", "the", "cholesterol-free", "membrane", "(~1.3", "nm)", ".", "Similarly,", "the", "15", "N-DLPC", "concentration", "within", "the", "D", "70", "-DSPC-enriched", "domains", "remained", "constant", "at~6", "mol%,", "indicating", "that", "the", "solubility", "of", "15", "N-DLPC", "within", "the", "D", "70", "-DSPC-rich", "domains", "did", "not", "change", "over", "this", "range", "of", "cholesterol", "concentrations.", "We", "did", "not", "attempt", "to", "quantify", "the", "mol%", "of", "15", "N-DLPC", "in", "the", "fluid-phase", "due", "to", "the", "high", "likelihood", "that", "the", "numerous", "nanoscopic", "gel-phase", "domains", "detected", "within", "the", "fluid-phase", "by", "AFM", "would", "inadvertently", "be", "included", "in", "the", "measurement." ], [ "Our", "AFM", "and", "NanoSIMS", "images", "of", "the", "19", "mol%", "cholesterol", "membrane", "clearly", "show", "heterogeneity", "in", "membrane", "composition", "N-DLPC,", "respectively,", "were", "acquired", "at", "the", "same", "site", "as", "the", "AFM", "image", "(a).", "The", "absence", "of", "lipid-specific", "ions", "at", "the", "regions", "that", "appear", "dark", "is", "due", "to", "the", "low", "intensity", "of", "the", "minor", "isotopes.", "(d)", "Detail", "of", "the", "region", "outlined", "in", "(a),", "which", "corresponds", "to", "the", "AFM", "image", "in", "(b).", "The", "NanoSIMS", "images", "were", "acquired", "with~100-nm-lateral", "resolution", "and", "smoothed", "over", "a", "lateral", "resolution", "of~150", "nm..", "and", "structure", "(Fig.", "5)", ".", "Individual", "and", "micron-sized", "aggregates", "of", "nanoscopic", "ordered", "domains", "enriched", "with", "D", "70", "-DSPC", "are", "visible", "in", "the", "membrane.", "The", "height", "difference", "measured", "with", "AFM", "between", "the", "gel-and", "fluid-phases", "in", "the", "19", "mol%", "cholesterol", "membrane", "did", "not", "vary", "with", "domain", "size", "(~1.2", "nm),", "and", "was", "similar", "to", "those", "measured", "in", "membranes", "with", "lower", "cholesterol", "levels", "(~1.3", "nm).", "The", "15", "N-DLPC", "concentration", "within", "the", "submicron-size", "domains", "that", "were", "resolved", "in", "the", "NanoSIMS", "images", "was~7", "mol%,", "within", "one", "standard", "deviation", "of", "the", "value", "measured", "on", "the", "0-15", "mol%", "cholesterol", "membranes.", "Thus,", "a", "significant", "increase", "in", "lipid", "intermixing", "did", "not", "occur", "in", "these", "domains.", "However,", "elevated", "amounts", "of", "D", "70", "-DSPC", "and", "15", "N-DLPC", "were", "detected", "at", "the", "same", "pixel", "more", "frequently", "in", "the", "19", "mol%", "cholesterol", "membrane", "than", "in", "the", "other", "membranes", "(yellow", "areas,", "Fig.", "5d-f", ").", "Comparison", "to", "the", "AFM", "images", "acquired", "at", "these", "locations", "revealed", "the", "presence", "of", "nanoscopic", "lipid", "structures", "that", "were", "smaller", "than", "the", "resolution", "of", "the", "NanoSIMS", "images", "(Fig.", "5a-c)", ".", "Therefore,", "the", "detection", "of", "significant", "amounts", "of", "D", "70", "-DSPC", "and", "15", "N-DLPC", "at", "the", "same", "pixel", "in", "the", "19", "mol%", "cholesterol", "membrane", "signifies", "the", "presence", "of", "a", "phase-separated", "domain", "that", "is", "smaller", "than", "the", "lateral", "resolution", "of", "the", "NanoSIMS", "image.", "The", "lack", "of", "an", "observable", "change", "in", "the", "height", "of", "the", "nanoscopic", "lipid", "structures", "or", "lipid", "intermixing", "denotes", "the", "presence", "of", "phase-separated", "domains,", "and", "not", "non-ideally", "mixed", "lipid", "clusters,", "in", "the", "19", "mol%", "cholesterol", "membrane.", "Because", "AFM", "imaging", "also", "shows", "that", "both", "the", "micron-sized", "and", "nanoscopic", "lipid", "domains", "have", "irregular", "borders,", "we", "conclude", "that", "the", "domains", "enriched", "with", "D", "70", "-DSPC", "remained", "in", "the", "gel-phase", "at", "19", "mol%", "cholesterol.", "We", "also", "attempted", "to", "characterize", "supported", "lipid", "membranes", "that", "contained", "N19", "mol%", "cholesterol", "(27", "and", "35", "mol%", "cholesterol).", "These", "membranes", "exhibited", "numerous", "small", "height", "changes", "(b1", "nm)", "and", "taller", "features", "indicative", "of", "debris", "by", "AFM,", "whereas", "patches", "of", "15", "N-DLPC", "and", "very", "little", "D", "70", "-DSPC", "was", "detected", "on", "the", "substrate", "using", "the", "NanoSIMS", "(not", "shown).", "These", "features", "are", "not", "characteristic", "of", "those", "we", "have", "observed", "in", "poorly", "preserved", "membranes,", "nor", "do", "they", "resemble", "the", "dehydration-induced", "defects", "characterized", "by", "others", "[51]", ".", "These", "results", "suggest", "that", "high-quality", "supported", "lipid", "membranes", "did", "not", "form", "under", "the", "same", "conditions", "as", "those", "used", "to", "create", "the", "membranes", "with", "lower", "mol%", "cholesterol.", "found", "that", "the", "addition", "of", "up", "to", "19", "mol%", "cholesterol", "induced", "significant", "changes", "in", "domain", "morphology,", "but", "produced", "no", "observable", "change", "in", "the", "miscibility", "of", "15", "N-DLPC", "within", "the", "gel-phase.", "Unlike", "previous", "results", "in", "which", "the", "phase", "behavior", "of", "analogous", "supported", "membranes", "differed", "from", "that", "of", "GUVs", "[25]", ",", "our", "results", "are", "in", "agreement", "with", "those", "reported", "for", "DLPC/DSPC/cholesterol", "GUVs", "and", "mica-supported", "membranes", "[22,", "47]", ".", "This", "good", "agreement", "indicates", "that", "the", "slow-cooled", "vesicle", "fusion", "process", "we", "employed", "for", "membrane", "formation", "likely", "allowed", "the", "membrane", "to", "approach", "equilibrium,", "and", "neither", "the", "silicon", "substrate", "nor", "the", "isotope", "labels", "appeared", "to", "alter", "membrane", "phase", "behavior..", "According", "to", "the", "DLPC/DSPC/cholesterol", "phase", "diagram", "(Fig.", "1)", ",", "the", "miscibility", "point", "for", "a", "1:1", "molar", "ratio", "of", "DLPC/DSPC", "is~19", "mol%", "cholesterol,", "and", "non-ideal", "mixing", "postulated", "to", "be", "caused", "by", "nanoscopic", "liquid-ordered", "domains", "has", "been", "previously", "detected", "with", "FRET", "at", "slightly", "higher", "cholesterol", "concentrations", "(between", "20", "and", "25", "mol%)", "[18,", "22]", ".", "Yet", "gel-phase", "domains", "were", "present", "in", "our", "supported", "lipid", "membranes", "composed", "of", "DLPC/DSPC", "(1:1", "molar", "ratio)", "and", "19", "mol%", "cholesterol.", "A", "higher", "amount", "of", "D", "70", "-DSPC", "than", "15", "N-DLPC", "in", "the", "membrane,", "which", "could", "have", "occurred", "due", "to", "small", "gravimetric", "and", "volumetric", "errors", "in", "measuring", "the", "lipids,", "would", "shift", "the", "miscibility", "point", "to", "a", "higher", "cholesterol", "concentration", "(~20", "mol%)", "than", "we", "studied", "[22]", ".", "However,", "we", "expect", "that", "nanoscopic", "gel-phase", "domains", "would", "also", "be", "present", "in", "our", "membranes", "at", "20-21", "mol%", "cholesterol", "because", "we", "detected", "a", "small", "number", "of", "micron-sized,", "gelphase", "domains", "at", "19", "mol%", "cholesterol", "(", "Fig.", "5a", "and", "b,", "lower", "left)", ",", "and", "the", "gel-phase", "domains", "in", "supported", "lipid", "membranes", "undergo", "a", "reduction", "in", "size", "due", "to", "domain", "pinning", "before", "complete", "miscibility", "is", "reached", "[15,", "47]", ".", "This", "expectation", "is", "supported", "by", "a", "recent", "report", "by", "Gosku", "and", "Longo", "[47]", ".", "The", "speckling", "in", "Gosku", "and", "Longo's", "fluorescence", "microscopy", "images", "of", "mica-supported", "DLPC/DSPC/", "cholesterol", "(40/40/20", "mol:mol:mol)", "membranes", "[47]", "suggests", "the", "presence", "of", "tiny", "phase-separated", "domains", "that", "could", "be", "detected", "by", "AFM,", "but", "were", "too", "small", "to", "be", "clearly", "visualized", "with", "fluorescence", "microscopy.", "We", "hypothesize", "that", "the", "small", "inconsistency", "in", "the", "location", "of", "the", "boundary", "for", "phase", "separation", "between", "our", "results", "and", "the", "published", "DLPC/DSPC/cholesterol", "phase", "diagram", "is", "due", "to", "the", "difference", "in", "techniques", "used", "to", "detect", "phase", "separation,", "as", "the", "AFM", "and", "NanoSIMS", "techniques", "we", "used", "are", "better", "suited", "to", "unambiguously", "detect", "submicron-sized", "domains", "than", "the", "conventional", "fluorescence", "microscopy", "[17,", "22,", "25,", "47]", ".", "The", "fusion", "of", "DLPC/DSPC", "(1:1", "mol", "ratio)", "vesicles", "that", "contained", "27", "and", "35", "mol%", "cholesterol", "to", "the", "silicon", "substrates", "under", "conditions", "identical", "to", "those", "employed", "for", "the", "other", "cholesterol", "concentrations", "did", "not", "produce", "continuous,", "defect-free", "membranes.", "Increasing", "the", "cholesterol", "concentration", "within", "vesicles", "composed", "of", "phase-separating", "lipids", "is", "reported", "to", "hinder", "vesicle", "rupture,", "causing", "an", "increase", "in", "the", "critical", "number", "of", "vesicles", "that", "must", "adsorb", "to", "the", "silicon", "substrate", "in", "order", "to", "initiate", "vesicle", "fusion", "[52]", ".", "Because", "others", "have", "used", "vesicle", "fusion", "to", "form", "DLPC/DSPC", "(1/1", "mole", "ratio)", "membranes", "that", "contained", "30", "mol%", "cholesterol", "on", "mica", "substrates", "[47]", ",", "we", "hypothesize", "that", "the", "vesicle", "concentration", "or", "incubation", "time", "we", "employed", "for", "vesicle", "fusion", "was", "insufficient", "for", "the", "formation", "of", "defect-free", "membranes", "that", "contained", "27", "or", "35", "mol%", "cholesterol." ], [ "Our", "data", "indicate", "that", "interactions", "between", "saturated", "lipids,", "such", "as", "DLPC", "and", "DSPC,", "and", "cholesterol", "are", "insufficient", "to", "drive", "the", "formation", "of", "liquid-ordered", "domains", "that", "are", "similar", "to", "those", "expected", "to", "exist", "within", "biological", "membranes.", "Our", "results,", "and", "those", "reported", "by", "others,", "suggest", "that", "molecular", "interactions", "between", "the", "fluid-phase", "lipid", "and", "cholesterol", "affect", "the", "structure", "of", "the", "ordered", "lipid", "domains", "that", "form", "in", "the", "membranes", "[15,", "23]", ".", "Although", "the", "DLPC/DSPC/cholesterol", "membranes", "we", "studied", "are", "not", "compositionally", "or", "biophysically", "representative", "of", "biological", "membranes,", "our", "findings", "do", "provide", "insight", "into", "the", "physiological", "significance", "of", "fatty", "acid", "chain", "saturation", "in", "biological", "membranes.", "Specifically,", "our", "results", "support", "the", "hypothesis", "that", "the", "presence", "of", "unsaturation", "in", "the", "fatty", "acid", "chains", "of", "the", "low-melting", "lipids", "found", "in", "biological", "membranes", "is", "required", "for", "the", "formation", "of", "a", "liquid-ordered", "phase.", "Furthermore,", "we", "propose", "that", "the", "absence", "of", "saturated,", "low", "T", "m", "lipids", "in", "cellular", "membranes", "is", "functionally", "significant,", "as", "their", "presence", "may", "hinder", "the", "formation", "of", "liquid-ordered", "membrane", "domains..", "This", "work", "also", "establishes", "a", "direct", "approach", "to", "acquire", "correlated", "information", "on", "the", "microstructure", "and", "composition", "of", "individual", "lipid", "domains.", "This", "approach", "could", "be", "extended", "to", "quantifying", "the", "amounts", "of", "DSPC", "and", "cholesterol", "in", "the", "lipid", "domains", "detected", "in", "these", "membranes", "by", "also", "incorporating", "a", "different", "distinct", "stable", "isotope", "into", "the", "cholesterol,", "and", "creating", "separate", "calibration", "curves", "for", "DSPC", "and", "cholesterol", "using", "sets", "of", "standard", "lipid", "membrane", "samples.", "Such", "studies", "would", "permit", "identifying", "whether", "the", "cholesterol", "concentration", "is", "equal", "in", "both", "lipid", "phases,", "as", "indicated", "by", "original", "experiments", "[14]", ",", "or", "if", "the", "cholesterol", "concentration", "is", "higher", "in", "the", "ordered", "domains,", "as", "found", "for", "other", "lipid", "mixtures", "[18]", ".", "Our", "approach", "could", "also", "be", "used", "to", "construct", "more", "detailed", "phasediagrams", "that", "include", "tie", "lines", "for", "DLPC/DSPC/cholesterol", "or", "other", "more", "physiologically", "relevant", "lipid", "mixtures.", "Such", "studies", "may", "clarify", "uncertainties", "in", "membrane", "phase", "behavior,", "and", "provide", "a", "better", "understanding", "of", "how", "cholesterol-dependent", "interactions", "contribute", "to", "cell", "membrane", "organization." ], [ "By", "analyzing", "the", "same", "locations", "in", "supported", "lipid", "membranes", "with", "AFM", "and", "high-resolution", "SIMS,", "we", "were", "able", "to", "acquire", "correlated", "information", "on", "the", "microstructure", "and", "composition", "of", "the", "individual", "lipid", "domains", "found", "in", "the", "membranes", "at", "room", "temperature.", "We", "showed", "that", "the", "nanoscopic", "D", "70", "-DSPC", "domains", "present", "in", "the", "19", "mol%", "cholesterol", "membrane", "were", "in", "the", "gel-phase.", "The", "15", "N-DLPC", "concentration", "in", "the", "D", "70", "-DSPC", "domains", "was", "relatively", "constant", "(6-7", "mol%)", "for", "cholesterol", "concentrations", "between", "0", "and", "19", "mol%,", "indicating", "that", "cholesterol", "did", "not", "induce", "a", "significant", "increase", "in", "lipid", "intermixing", "in", "these", "domains.", "Our", "results", "support", "the", "finding", "of", "Zhao", "et", "al.", "[22]", "that", "nanoscopic", "phase-separated", "domains", "are", "present", "in", "the", "membrane", "at~19", "mol%", "cholesterol,", "but", "we", "found", "no", "evidence", "for", "the", "presence", "of", "liquid-ordered", "domains.", "We", "conclude", "that", "the", "interactions", "between", "cholesterol", "and", "saturated", "lipids,", "such", "as", "DLPC", "and", "DSPC,", "are", "not", "sufficient", "to", "create", "liquid-ordered", "domains.", "Consequently,", "the", "absence", "of", "saturated,", "low-melting", "lipids", "in", "biological", "membranes", "may", "be", "required", "for", "the", "formation", "of", "the", "liquidordered", "domains", "that", "are", "expected", "to", "exist", "in", "cellular", "membranes." ], [ "Correlated", "AFM", "and", "NanoSIMS", "imaging", "to", "probe", "cholesterol-induced", "changes", "in", "phase", "behavior", "and", "non-ideal", "mixing", "in", "ternary", "lipid", "membranes." ], [ "Cholesterol", "is", "believed", "to", "be", "an", "important", "component", "in", "compositionally", "distinct", "lipid", "domains", "in", "the", "cellular", "plasma", "membrane,", "which", "are", "referred", "to", "as", "lipid", "rafts.", "Insight", "into", "how", "cholesterol", "influences", "the", "interactions", "that", "contribute", "to", "plasma", "membrane", "organization", "can", "be", "acquired", "from", "model", "lipid", "membranes.", "Here", "we", "characterize", "the", "lipid", "mixing", "and", "phase", "behavior", "exhibited", "by", "15", "N-dilaurolyphosphatidycholine", "(", "15", "N-DLPC)/", "deuterated", "distearoylphosphatiylcholine", "(D", "70", "-DSPC)", "membranes", "with", "various", "amounts", "of", "cholesterol", "(0,", "3,", "7,", "15", "or", "19", "mol%)", "at", "room", "temperature.", "The", "microstructures", "and", "compositions", "of", "individual", "membrane", "domains", "were", "determined", "by", "imaging", "the", "same", "membrane", "locations", "with", "both", "atomic", "force", "microscopy", "(AFM)", "and", "high-resolution", "secondary", "ion", "mass", "spectrometry", "(SIMS)", "performed", "with", "a", "Cameca", "NanoSIMS", "50.", "As", "the", "cholesterol", "composition", "increased", "from", "0", "to", "19", "mol%,", "the", "circular", "ordered", "domains", "became", "more", "elongated,", "and", "the", "amount", "of", "15", "N-DLPC", "in", "the", "gel-phase", "domains", "remained", "constant", "at", "6-7", "mol%.", "Individual", "and", "micronsized", "clusters", "of", "nanoscopic", "domains", "enriched", "in", "D", "70", "-DSPC", "were", "abundant", "in", "the", "19", "mol%", "cholesterol", "membrane.", "AFM", "imaging", "showed", "that", "these", "lipid", "domains", "had", "irregular", "borders,", "indicating", "that", "they", "were", "gel-phase", "domains,", "and", "not", "non-ideally", "mixed", "lipid", "clusters", "or", "nanoscopic", "liquid-ordered", "domains." ] ]
[ "phase separation", "room temperature", "atomic force microscopy", "secondary ion mass spectrometry", "microstructures" ]
[ "high resolution", "lipid raft" ]
[ [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ] ]
18982235
[ "", "title", "abstract" ]
[ [ "The", "temperature", "equation", "diagnostic", "terms", "in", "°C/second", "along", "the", "glider", "track", "from", "ESPreSSO", "ROMS", "model.", "(A)", "Temperature", "rate", "of", "change,", "(B)", "Vertical", "diffusion", "term,", "(C)", "Total", "advection.", "The", "total", "advection", "is", "separated", "into", "along--shelf", "advection", "(D,", "u*dT/dx);", "cross--shelf", "advection", "(E,", "v*dT/dy);", "and", "vertical", "advection", "(F,", "w*dT/dz).", "The", "black", "contour", "in", "all", "plots", "indicates", "the", "bottom", "of", "the", "surface", "mixed", "layer", "and", "magenta", "contour", "indicates", "the", "bottom", "of", "the", "thermocline.", "Landfall", "time", "was", "on", "August", "28", "th", "2011", "at", "9:35", "GMT.", "Supplementary", "Fig.", "7", "Same", "as", "Fig.", "4", "but", "for", "maximum", "sustained", "10m", "wind", "speeds", "(m/s).", "Supplementary", "Fig.", "8", "Central", "pressure", "sensitivity", "table.", "Sensitivity", "(hPa)", "is", "calculated", "by", "taking", "the", "cumulative", "hourly", "sum", "of", "the", "differences", "from", "00", "to", "13", "UTC", "on", "28", "August.", "Options", "column", "is", "described", "in", "Supplementary", "Fig.", "10", "Time--series", "plots", "of", "air", "temperature", "(red),", "water", "temperature", "(blue),", "pressure", "(black),", "and", "wind", "speed", "(green).", "The", "first", "vertical", "black", "line", "indicates", "the", "maximum", "water", "temperature", "before", "wind", "speed", "increased", "above", "5", "m", "s", "--1", ",", "the", "second", "represents", "the", "minimum", "temperature", "ahead--of", "or", "at", "the", "minimum", "pressure,", "and", "the", "third", "vertical", "black", "line", "is", "the", "minimum", "temperature", "before", "wind", "speeds", "drop", "below", "5", "m", "s", "--1", ".", "Values", "from", "these", "plots", "are", "used", "to", "determine", "ahead--of--eye--center", "(AOEC)", "and", "in--storm", "cooling", "from", "NDBC", "buoys", "used", "to", "create", "Table", "1", "for", "Hurricanes", "Arthur", "(2014),", "Irene,", "Barry,", "and", "Hermine.", "Supplementary", "Fig.", "11", "Time--series", "plots", "of", "air", "temperature", "(red),", "water", "temperature", "(blue),", "pressure", "(black),", "and", "wind", "speed", "(green).", "The", "first", "vertical", "black", "line", "indicates", "the", "maximum", "water", "temperature", "before", "wind", "speed", "increased", "above", "5", "m", "s", "--1", ",", "the", "second", "represents", "the", "minimum", "temperature", "ahead--of", "or", "at", "the", "minimum", "pressure,", "and", "the", "third", "vertical", "black", "line", "is", "the", "minimum", "temperature", "before", "wind", "speeds", "drop", "below", "5", "m", "s", "--1", ".", "Values", "from", "these", "plots", "are", "used", "to", "determine", "ahead--of--eye--center", "(AOEC)", "and", "in--storm", "cooling", "from", "NDBC", "buoys", "used", "to", "create", "Table", "1", "for", "Hurricanes", "Allison,", "Bonnie,", "Danny,", "and", "Arthur", "(1996).", "Supplementary", "Fig.", "12", "Time--series", "plots", "of", "air", "temperature", "(red),", "water", "temperature", "(blue),", "pressure", "(black),", "and", "wind", "speed", "(green).", "The", "first", "vertical", "black", "line", "indicates", "the", "maximum", "water", "temperature", "before", "wind", "speed", "increased", "above", "5", "m", "s", "--1", ",", "the", "second", "represents", "the", "minimum", "temperature", "ahead--of", "or", "at", "the", "minimum", "pressure,", "and", "the", "third", "vertical", "black", "line", "is", "the", "minimum", "temperature", "before", "wind", "speeds", "drop", "below", "5", "m", "s", "--1", ".", "Values", "from", "these", "plots", "are", "used", "to", "determine", "ahead--of--eye--center", "(AOEC)", "and", "in--storm", "cooling", "from", "NDBC", "buoys", "used", "to", "create", "Table", "1", "for", "Hurricanes", "Emily,", "Bob,", "and", "Charley." ], [ "Stratified", "coastal", "ocean", "interactions", "with", "tropical", "cyclones" ], [ "Accurate", "forecasts", "of", "hurricane", "intensity", "remain", "problematic.", "Here,", "using", "an", "ocean", "observing", "network", "to", "inform", "ocean", "and", "atmospheric", "model", "simulations,", "the", "authors", "show", "that", "consideration", "of", "ahead-of-eye", "cooling", "improves", "intensity", "forecasts." ] ]
[]
[ "oceanography", "atmospheric science", "earth sciences" ]
[ [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ] ]
18983838
[ "introduction", "charged thin shell wormholes", "stability", "case", "conclusion", "title", "abstract" ]
[ [ "Lorentzian", "wormholes", "were", "originally", "found", "as", "solutions", "of", "the", "Einstein", "field", "equations", "with", "nontrivial", "topology.", "In", "their", "more", "simple", "examples", "they", "present", "two", "mouths", "in", "asymptotically", "flat", "spacetimes", "connected", "by", "a", "throat", "[1]", ".", "More", "general", "and", "purely", "geometric", "definitions", "allow", "to", "remove", "the", "requirement", "for", "asymptotically", "flat", "regions", "and", "the", "introduction", "of", "trivial", "topologies", "in", "wormhole", "spacetimes,", "both", "static", "[2]", "and", "dynamic", "[3]", ".", "All", "these", "wormholes,", "nonetheless,", "must", "be", "threaded", "by", "matter", "that", "violates", "the", "null", "energy", "condition", "if", "they", "are", "going", "to", "be", "traversable", "by", "material", "systems", "[1,", "2,", "3]", "..", "The", "requirements", "for", "exotic", "matter", "that", "violates", "the", "energy", "conditions", "can", "be", "reduced", "introducing", "scalar", "fields", "or", "electric", "charges.", "Very", "recently", "Kim", "and", "Lee", "[4]", "have", "presented", "exact", "solutions", "for", "a", "static", "charged", "wormhole.", "These", "spacetimes", "are", "free", "of", "horizons,", "so", "the", "charge,", "although", "having", "effects", "on", "the", "stability,", "does", "not", "seriously", "affect", "the", "spacetime", "itself..", "Despite", "nothing", "is", "known", "about", "the", "equation", "of", "state", "of", "exotic", "matter,", "a", "stability", "analysis", "is", "possible", "through", "linearized", "perturbations", "around", "static", "solutions", "of", "the", "Einstein", "field", "equations.", "This", "imposes", "contraints", "onto", "the", "state", "equation", "and", "the", "stability", "domain", "of", "the", "solutions.", "This", "approach", "has", "been", "implemented", "by", "Poisson", "and", "Visser", "for", "spherically", "symmetric", "thin-shell", "wormholes", "[5,", "6]", ".", "For", "surgical", "techniques", "to", "construct", "thin-shell", "wormholes,", "the", "reader", "is", "referred", "to", "the", "papers", "by", "Visser", "[7,", "8]", "..", "In", "this", "paper", "we", "extend", "the", "stability", "analysis", "to", "the", "case", "of", "charged", "wormholes", "with", "the", "aim", "to", "establish", "whether", "the", "presence", "of", "charge", "effectively", "can", "increase", "the", "stability", "domain", "of", "this", "type", "of", "spacetimes." ], [ "We", "use", "geometrized", "units", "(c=G=1).", "The", "Reissner-Nordström", "metric", "is", "the", "unique", "spherically", "symmetric", "solution", "of", "the", "vacuum", "Einstein-Maxwell", "coupled", "equations.", "In", "Schwarzschild", "coordinates", "X", "α", "=", "(t,", "r,", "θ,", "ϕ)", "it", "takes", "the", "form.", "where", "M", "is", "the", "mass", "and", "Q", "is", "the", "sum", "of", "electric", "and", "magnetic", "charges,", "measured", "by", "distant", "observers.", "If", "|Q|", "≤", "M", ",", "it", "represents", "a", "black", "hole", "with", "an", "event", "horizon", "with", "radius.", "If", "|Q|", ">", "M", "it", "is", "a", "naked", "singularity..", "From", "the", "Reissner-Nordström", "geometry", "we", "can", "take", "two", "copies", "of", "the", "region", "with", "r", "≥", "a:.", "where", "a", ">", "r", "h", "if", "|Q|", "≤", "M", "and", "a", ">", "0", "if", "|Q|", ">", "M,", "and", "glue", "them", "together", "at", "the", "hypersurface.", "to", "make", "a", "charged", "spherically", "symmetric", "thin", "shell", "wormhole", "M", "=", "M", "+", "∪", "M", "−", ".", "This", "construction", "creates", "a", "geodesically", "complete", "manifold", "M", "with", "two", "asymptotically", "plane", "regions", "connected", "by", "a", "throat.", "To", "study", "this", "traversable", "wormhole", "we", "use", "the", "standard", "Darmois-Israel", "formalism", "[9]", ".", "For", "a", "modern", "treatment", "of", "this", "formalism", "see", "for", "example", "[10]", "..", "The", "wormhole", "throat", "is", "placed", "at", "Σ.", "This", "shell", "is", "a", "synchronous", "timelike", "hypersurface.", "We", "can", "adopt", "coordinates", "ξ", "i", "=", "(τ,", "θ,", "ϕ)", "in", "Σ,", "with", "τ", "the", "proper", "time", "on", "the", "shell.", "In", "order", "to", "analyze", "the", "stability", "under", "spherically", "symmetric", "perturbations,", "we", "let", "the", "radius", "of", "the", "throat", "be", "a", "function", "of", "the", "proper", "time,", "a", "=", "a(τ", ").", "Then.", "The", "second", "fundamental", "forms", "associated", "with", "the", "two", "sides", "of", "the", "shell", "are:.", "where", "n", "±", "γ", "are", "the", "unit", "normals", "(n", "γ", "n", "γ", "=", "−1", ")", "to", "Σ", "in", "M:.", "In", "the", "orthonormal", "basis", "{eτ", ",", "eθ,", "eφ}", "(eτ", "=", "e", "τ", ",", "eθ", "=", "r", "−1", "e", "θ", ",", "eφ", "=", "(r", "sin", "θ)", "−1", "e", "ϕ", ",", "gî", "=", "ηî)", "we", "have", "that.", "and.", "where", "the", "dot", "means", "d/dτ", "..", "The", "Einstein", "equations", "on", "the", "shell", "reduce", "to", "the", "Lanczos", "equations:.", "where.", "is", "the", "surface", "stressenergy", "tensor,", "with", "σ", "the", "surface", "energy", "density", "and", "ϑ", "1,2", "the", "surface", "tensions.", "Then", "replacing", "Eqs.", "(8)", "and", "(9)", "in", "Eq.", "(10)", "we", "obtain.", "where", "p", "=", "−ϑ", "1", "=", "−ϑ", "2", "is", "the", "surface", "pressure.", "The", "surface", "energy", "density", "is", "negative,", "indicating", "the", "presence", "of", "exotic", "matter", "in", "the", "throat..", "The", "dynamical", "evolution", "of", "the", "wormhole", "throat", "is", "governed", "by", "the", "Einstein", "equations", "plus", "the", "equation", "of", "state", "p", "=", "p(σ)", "that", "relates", "p", "and", "σ.", "From", "the", "Eqs.", "(11)", "and", "(12)", "above,", "it", "is", "easy", "to", "verify", "the", "energy", "conservation", "equation:.", "where", "A", "=", "4πa", "2", "is", "the", "area", "of", "the", "wormhole", "throat.", "The", "first", "term", "of", "Eq.", "(13)", "represents", "the", "internal", "energy", "change", "of", "the", "throat", "and", "the", "second", "the", "work", "done", "by", "the", "internal", "forces", "of", "the", "throat..", "As", "in", "the", "case", "of", "uncharged", "wormholes", "[6]", ",", "the", "conservation", "equation", "can", "be", "written", "in", "the", "forṁ.", "which", "can", "be", "integrated", "to", "give.", "This", "can", "be", "formally", "inverted", "to", "obtain", "σ", "=", "σ(a).", "Thus,", "replacing", "σ(a)", "in", "Eq.", "(11)", "and", "regrouping", "terms,", "the", "dynamics", "of", "the", "wormhole", "throat", "is", "completely", "determined", "by", "a", "single", "equation:" ], [ "Eq.", "(16)", "can", "be", "rewritten", "in", "the", "form:ȧ.", "with.", "Let", "us", "consider", "now", "a", "static", "solution", "with", "radius", "a", "0", "and", "the", "corresponding", "values", "of", "energy", "density", "σ", "0", "and", "pressure", "p", "0", ":.", "A", "Taylor", "expansion", "to", "second", "order", "of", "the", "potential", "V", "(a)", "around", "the", "static", "solution", "yields:", ".", "Since", "σ", "′", "=σ/ȧ,", "using", "the", "Eq.", "(14),", "we", "have", "that.", "The", "second", "derivative", "of", "the", "potential", "is.", "Since", "σ", "′", "+", "2p", "′", "=", "σ", "′", "(1", "+", "2p", "′", "/σ", "′", "),", "defining", "the", "parameter", "β", "2", "(σ)", "≡", "dp/dσ", "=", "p", "′", "/σ", "′", ",", "we", "have", "that.", "Replacing", "in", "a", "=", "a", "0", ",", "we", "have", "that", "V", "(a", "0", ")", "=", "V", "′", "(a", "0", ")", "=", "0,", "so.", "with.", "where.", "The", "wormhole", "is", "stable", "if", "and", "only", "if", "V", "′′", "(a", "0", ")", ">", "0.", "The", "curves", "where", "V", "′′", "(a", "0", ")", "=", "0", "correspond", "to.", "and.", "For", "the", "analysis", "of", "the", "stability", "regions", "it", "is", "convenient", "to", "consider", "five", "cases", "accordingly", "to", "the", "value", "of", "charge:.", "There", "are", "two", "regions", "of", "stability," ], [ "|Q|", "M", "=", "1.", "There", "are", "two", "regions", "of", "stability,.", ".", "There", "are", "two", "regions", "of", "stability,", "i).", ".", "There", "are", "two", "regions", "of", "stability,.", ".", "There", "is", "one", "region", "of", "stability,.", "The", "regions", "of", "stability", "for", "different", "values", "of", "charge", "are", "shown", "in", "Figs.", "1", "and", "2", ".", "For", "ordinary", "matter,", "β", "0", "represents", "the", "velocity", "of", "sound,", "so", "it", "should", "satisfy", "0", "<", "β", "2", "0", "≤", "1.", "If", "the", "matter", "is", "exotic,", "as", "it", "happens", "to", "be", "in", "the", "throat,", "β", "0", "is", "not", "necesarily", "the", "velocity", "of", "sound", "and", "it", "is", "not", "clear", "which", "values", "it", "can", "take", "(see", "discussion", "in", "[6]", ")." ], [ "We", "have", "applied", "a", "linearization", "stability", "analysis", "to", "thin-shell", "wormholes", "endowed", "with", "charge", "and", "we", "have", "found", "that", "the", "presence", "of", "large", "charges", "(|Q|/M", "≈", "1),", "significantly", "increases", "the", "possibility", "of", "obtaining", "stable", "wormhole", "spacetimes,", "imposing", "less", "severe", "restrictions", "on", "the", "equation", "of", "state", "of", "the", "exotic", "matter", "that", "must", "be", "present", "in", "the", "wormhole", "throat." ], [ "Linearized", "stability", "of", "charged", "thin-shell", "wormholes" ], [ "The", "linearized", "stability", "of", "charged", "thin", "shell", "wormholes", "under", "spherically", "symmetric", "perturbations", "is", "analized.", "It", "is", "shown", "that", "the", "presence", "of", "a", "large", "value", "of", "charge", "provides", "stabilization", "to", "the", "system,", "in", "the", "sense", "that", "the", "constraints", "onto", "the", "equation", "of", "state", "are", "less", "severe", "than", "for", "non-charged", "wormholes.PACS", "number(s):", "04" ] ]
[ "exotic matter", "equation of state", "lorentzian wormholes" ]
[ "einstein-maxwell spacetimes", "linear stability" ]
[ [ "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O" ], [ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ] ]
18985550
["background","identifying existing guidelines search strategy","selection criteria","quality apprai(...TRUNCATED)
[["Populations","in","crisis","settings","such","as","those","resulting","from","natural","disasters(...TRUNCATED)
[ "health care", "disasters" ]
["occupational safety","epidemiology","environmental health","systematic review","injury prevention"(...TRUNCATED)
[["O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","B","O","O","O","O","O","O","O","O","O","B","O","O","O","O(...TRUNCATED)
2870460
["introduction","wind dynamics","ejecta dynamics and line emission","continuum emission","detected?"(...TRUNCATED)
[["Studies","of","nearby","clusters","have","revealed","a","population","of","intergalactic","stars.(...TRUNCATED)
[ "galaxy clusters", "interstellar medium" ]
[]
[["O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O(...TRUNCATED)
2870734
["introduction","the generation of a q set or 'item sampling'","3","the participant group","statisti(...TRUNCATED)
[["This","paper","has","a","marked","practical","aspect.","We","wish","to","encourage","and","facili(...TRUNCATED)
["qualitative research","william stephenson","eigenvalues","q methodology","factor rotation","factor(...TRUNCATED)
[ "factor inter- pretation" ]
[["O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","B","I","O","O","O","O","B","I","O(...TRUNCATED)
2870808
["introduction","remark 2.3","remark 2.4","a priori estimates","estimate on","estimate on ||u","proo(...TRUNCATED)
[["The","scope","of","this","work","is","the","discretization","by","the","cell-centered","finite","(...TRUNCATED)
["noncoercive elliptic equation","weak solution","numerical experiment","convection-diffusion equati(...TRUNCATED)
[ "weak regularity assumption", "space dimension" ]
[["O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","B","I","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O(...TRUNCATED)
2871302
["","participants and task","fmri acquisition and analysis","variance components analysis","fmri act(...TRUNCATED)
[["MULTISITE","STUDIES","may","remediate","some","of","the","limitations","in","current","functional(...TRUNCATED)
["fmri","variance components analysis","region of interest","multisite studies","motor task","total (...TRUNCATED)
[ "reproducibility of re- sults" ]
[["B","I","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","B","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O(...TRUNCATED)
2873973
[ "background", "case presentation", "conclusion", "consent", "title", "abstract" ]
[["Peritoneal","lymphomatosis","is","an","extremely","rare","presentation","of","lymphoma.","It","re(...TRUNCATED)
["tuberculous peritonitis","tumor lysis syndrome","continuous renal replacement therapy","bone marro(...TRUNCATED)
[]
[["O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","B","I","O","O","O","O","O","O","O","O(...TRUNCATED)
YAML Metadata Warning: empty or missing yaml metadata in repo card (https://huggingface.co/docs/hub/datasets-cards)

A dataset for benchmarking keyphrase extraction and generation techniques from long document English scientific papers. For more details about the dataset please refer the original paper - .

Data source -

Dataset Summary

Dataset Structure

Data Fields

  • id: unique identifier of the document.
  • sections: list of all the sections present in the document.
  • sec_text: list of white space separated list of words present in each section.
  • sec_bio_tags: list of BIO tags of white space separated list of words present in each section.
  • extractive_keyphrases: List of all the present keyphrases.
  • abstractive_keyphrase: List of all the absent keyphrases.

Data Splits

Split #datapoints
Train-Small 20,000
Train-Medium 50,000
Train-Large 1,296,613
Test 10,000
Validation 10,000

Usage

Small Dataset

from datasets import load_dataset

# get small dataset
dataset = load_dataset("midas/ldkp10k", "small")

def order_sections(sample):
  """
  corrects the order in which different sections appear in the document.
  resulting order is: title, abstract, other sections in the body
  """
  
  sections = []
  sec_text = []
  sec_bio_tags = []

  if "title" in sample["sections"]:
    title_idx = sample["sections"].index("title")
    sections.append(sample["sections"].pop(title_idx))
    sec_text.append(sample["sec_text"].pop(title_idx))
    sec_bio_tags.append(sample["sec_bio_tags"].pop(title_idx))

  if "abstract" in sample["sections"]:
    abstract_idx = sample["sections"].index("abstract")
    sections.append(sample["sections"].pop(abstract_idx))
    sec_text.append(sample["sec_text"].pop(abstract_idx))
    sec_bio_tags.append(sample["sec_bio_tags"].pop(abstract_idx))

  sections += sample["sections"]
  sec_text += sample["sec_text"]
  sec_bio_tags += sample["sec_bio_tags"]

  return sections, sec_text, sec_bio_tags


# sample from the train split
print("Sample from train data split")
train_sample = dataset["train"][0]

sections, sec_text, sec_bio_tags = order_sections(train_sample)
print("Fields in the sample: ", [key for key in train_sample.keys()])
print("Section names: ", sections)
print("Tokenized Document: ", sec_text)
print("Document BIO Tags: ", sec_bio_tags)
print("Extractive/present Keyphrases: ", train_sample["extractive_keyphrases"])
print("Abstractive/absent Keyphrases: ", train_sample["abstractive_keyphrases"])
print("\n-----------\n")

# sample from the validation split
print("Sample from validation data split")
validation_sample = dataset["validation"][0]

sections, sec_text, sec_bio_tags = order_sections(validation_sample)
print("Fields in the sample: ", [key for key in validation_sample.keys()])
print("Section names: ", sections)
print("Tokenized Document: ", sec_text)
print("Document BIO Tags: ", sec_bio_tags)
print("Extractive/present Keyphrases: ", validation_sample["extractive_keyphrases"])
print("Abstractive/absent Keyphrases: ", validation_sample["abstractive_keyphrases"])
print("\n-----------\n")

# sample from the test split
print("Sample from test data split")
test_sample = dataset["test"][0]

sections, sec_text, sec_bio_tags = order_sections(test_sample)
print("Fields in the sample: ", [key for key in test_sample.keys()])
print("Section names: ", sections)
print("Tokenized Document: ", sec_text)
print("Document BIO Tags: ", sec_bio_tags)
print("Extractive/present Keyphrases: ", test_sample["extractive_keyphrases"])
print("Abstractive/absent Keyphrases: ", test_sample["abstractive_keyphrases"])
print("\n-----------\n")

Output


Medium Dataset

from datasets import load_dataset

# get medium dataset
dataset = load_dataset("midas/ldkp10k", "medium")

Large Dataset

from datasets import load_dataset

# get large dataset
dataset = load_dataset("midas/ldkp10k", "large")

Citation Information

Please cite the works below if you use this dataset in your work.

@article{mahata2022ldkp,
  title={LDKP: A Dataset for Identifying Keyphrases from Long Scientific Documents},
  author={Mahata, Debanjan and Agarwal, Naveen and Gautam, Dibya and Kumar, Amardeep and Parekh, Swapnil and Singla, Yaman Kumar and Acharya, Anish and Shah, Rajiv Ratn},
  journal={arXiv preprint arXiv:2203.15349},
  year={2022}
}
@article{lo2019s2orc,
  title={S2ORC: The semantic scholar open research corpus},
  author={Lo, Kyle and Wang, Lucy Lu and Neumann, Mark and Kinney, Rodney and Weld, Dan S},
  journal={arXiv preprint arXiv:1911.02782},
  year={2019}
}
@inproceedings{ccano2019keyphrase,
  title={Keyphrase generation: A multi-aspect survey},
  author={{\c{C}}ano, Erion and Bojar, Ond{\v{r}}ej},
  booktitle={2019 25th Conference of Open Innovations Association (FRUCT)},
  pages={85--94},
  year={2019},
  organization={IEEE}
}
@article{meng2017deep,
  title={Deep keyphrase generation},
  author={Meng, Rui and Zhao, Sanqiang and Han, Shuguang and He, Daqing and Brusilovsky, Peter and Chi, Yu},
  journal={arXiv preprint arXiv:1704.06879},
  year={2017}
}

Contributions

Thanks to @debanjanbhucs, @dibyaaaaax, @UmaGunturi and @ad6398 for adding this dataset

Downloads last month
28
Edit dataset card