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Timestamp: 2020-04-07 14:43:20
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JP2716503B2 - Chimeric glycoprotein such which contain an immunogenic segment glycoprotein such human respiratory syncytial virus - Google Patents
Chimeric glycoprotein such which contain an immunogenic segment glycoprotein such human respiratory syncytial virus
JP2716503B2
JP2716503B2 JP63509171A JP50917188A JP2716503B2 JP 2716503 B2 JP2716503 B2 JP 2716503B2 JP 63509171 A JP63509171 A JP 63509171A JP 50917188 A JP50917188 A JP 50917188A JP 2716503 B2 JP2716503 B2 JP 2716503B2
JP63509171A
JPH03501723A (en
ウェーセン，マイケル
ジ・アップジョン・カンパニー
1987-12-23 Priority to US13738787A priority Critical
1987-12-23 Priority to US137,387 priority
1988-10-31 Application filed by ジ・アップジョン・カンパニー filed Critical ジ・アップジョン・カンパニー
1991-04-18 Publication of JPH03501723A publication Critical patent/JPH03501723A/ja
1998-02-18 Publication of JP2716503B2 publication Critical patent/JP2716503B2/en
C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA Viruses negative-sense
C12N2760/00011—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA Viruses negative-sense ssRNA Viruses negative-sense
C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ヒト呼吸系シンシチウムウイルス（syncyt BACKGROUND OF THE INVENTION Field of the Invention The present invention is a human respiratory syncytial virus (syncyt
ial virus）、HRSVに対するウイルス特異的免疫応答を調製するのに有用な新規キメラ糖蛋白類をコード付けするDNA組成物に関する。 ial virus), it relates to DNA compositions with encoding useful novel chimeric glycoprotein such in preparing virus specific immune responses against HRSV. 該DNA組成物は該糖蛋白についてコード付けする構造遺伝子ならびに該構造遺伝子を含有する発現および複製プラスミドを包含する。 The DNA compositions include the expression and replication plasmids containing the structural gene and the structural gene with codes for the sugar protein. 前記DNA組成物で形質転換した宿主細胞、該糖蛋白類から造ったワクチン類および該ワクチン類での接種によってヒトを保護する方法もまた本発明の一部である。 Host cells transformed with said DNA composition, a method for protecting a human by inoculation with vaccines and the vaccines made from sugar proteins such is also part of the present invention.
背景 HRSVは1956年に発見され、世界中で見い出されている。 Background HRSV was discovered in 1956, it has been found all over the world. それは、特に幼児および年少の子供で上部気道病および下部気道病を引き起こす。 It is particularly cause upper respiratory tract disease and lower respiratory tract disease in children of infants and young. 急性気道病をもつ入院した年少子供の約30パーセントは呼吸系シンシチウムウイルスに感染している。 About 30 percent of hospitalized young children with acute respiratory tract disease is infected with respiratory syncytial virus. 年長の子供および成人では、該病気はより穏やかである。 In older children and adults, the disease is more gentle. 幼児では、このひどい病気はしばしば入院を必要とする。 In young children, this terrible disease often require hospitalization.
呼吸系シンシチウムウイルスでの感染は気道のすべての部分に及び、通常、発熱、咳き、鼻水、および疲労を伴い、臨床的には気管支炎、細気管支炎、肺炎、クループ、またはウイルス感染と診断される。 The infection with respiratory syncytial virus Oyobi to all parts of the respiratory tract, usually, fever, cough, runny nose, and accompanied by fatigue, clinically diagnosed bronchitis, bronchiolitis, pneumonia, croup, or viral infection that. 年長の子供および成人においては、該ウイルスは、一般に、上部気道における複製に限定される。 In older children and adults the virus is generally limited to replication in the upper respiratory tract. 幼児は、該ウイルスが肺まで拡大すると、ひどくなる。 Infant, when the virus is to expand to the lungs, worse. 肺の損傷は永久的なものになりかねない。 Damage of the lung that could become a permanent thing.
呼吸系シンシチウムウイルスでの初感染は一生のうち早期、通常、４才前に起こる。 Early out of the primary infection of respiratory syncytial virus is a lifetime, usually occurs in the 4-year-old before. 子供では、このウイルスによって引き起こされる病気は毎年少なくとも１回は起こる傾向にあり、かなりはっきりと確認できる数カ月間の集団発生となる。 In children, there is a tendency disease that occurs at least once a year, which is caused by the virus, the outbreak of several months that quite clearly can be confirmed. 流行病は、一般に３〜５カ月間と、 Epidemics, and generally 3 to 5 months,
はっきりと限局性である。 It is clearly localized. 家族を調べると、幼学年の子供は頻繁に該ウイルスを家に持ち帰り、家族の他の者よりも年少の者にひどく感染させる。 If you examine the family, young school year of children is frequently brought back the virus in the house, it is severely infected with younger persons than the family of the other person. 該感染の臨床的結果は最初の経験時が最もひどく、免疫的に経験した年長の者ではより穏やかである。 The most severely during the first experience is the clinical result of the infection, which is more gentle than those of older experienced immunologically.
呼吸系シンシチウムウイルスの二次的影響は不顕性感染からひどい肺炎および死亡までの範囲があり得る。 Secondary effects of respiratory syncytial virus may be in the range of up to severe pneumonia and death from subclinical infection. 気道の炎症はほとんどの徴候の原因である。 Inflammation of the respiratory tract is the cause of most of the symptoms. ほとんどの場合における完全な回復は抗体の生産とともに１ないし３ A complete recovery in most cases to 1 along with the production of antibodies 3
週間内で起こり、該生産は生涯持続させるようである。 Takes place in the week, the production seems to sustain life.
米国においては、１才の幼児の約30パーセントおよび５ In the United States, about 30 percent, and 5 of 1-year-old infant
才の子供の95パーセントが循環呼吸系シンシチウムウイルス抗体を有する。 95% of the talent of the children has a circulation respiratory syncytial virus antibody. 抗体をもつ年長幼児、子供、および成人における再感染は、風邪の形態でかなり穏やかな上部気道病である。 Re-infection in older infants, children, and adults with antibody is a fairly mild upper respiratory tract disease in the cold of the form.
細胞培養におけるウイルスの低収率がHRSVの研究を妨げてきたにもかかわらず、該ウイルスはかなり研究された。 Despite the low yield of the virus in cell culture have prevented the study of HRSV, the virus has been extensively studied. HRSVは10の支配的モノシストロニックメッセンジャーへ転写されるRNAのマイナス一本鎖を含有するパラミクソウイルスである。 HRSV is a paramyxovirus containing 10 dominant monocistronic negative single-stranded RNA transcribed into messenger. 該メッセンジャーは単離され、in The messenger is isolated, in
vitroにて翻訳されている。 It has been translated in vitro. 産物はゲル電気泳動、ペプチド・マッピングおよび免疫沈殿により、ウイルス粒子から単離された構造蛋白と同様であることが特色とされている。 Product gel electrophoresis, by peptide mapping and immunoprecipitation, it is a feature is similar to the isolated structural proteins from viral particles. 該構造蛋白は主要なヌクレオキャプシド蛋白（N;分子量約42000）、ヌクレオキャプシド・リン蛋白（P;分子量約34000）、大きなヌクレオキャプシド蛋白（L;分子量約200000）、エンベロープマトリックス蛋白（M;分子量約26000）、マトリックス糖蛋白（約22000） The structural proteins are the major nucleocapsid protein (N; molecular weight: about 42000), nucleocapsid, phosphoprotein (P; molecular weight: about 34000), a large nucleocapsid protein (L; molecular weight about 200,000), an envelope matrix protein (M; molecular weight of about 26000), matrix glycoprotein (about 22000)
および２種のエンベロープ糖蛋白、融合糖蛋白（F;分子量約68000ないし70000）および第２のメチオニン欠乏糖蛋白（G;分子量約84000ないし90000）を包含する。 And two envelope glycoproteins, the fusion glycoprotein including; (molecular weight from about 84000 no 90000 G) (F molecular weight of about 68000 to 70000) and a second methionine deficient glycoprotein. 加えて、約9500ダルトンのウイルスにコード付けされた蛋白および他の小さな蛋白が感染細胞中に存在することが知られている。 In addition, virus coded by protein and other small proteins of about 9500 daltons is known to be present in infected cells. コリンズら（Collins,et al）、HRSVの10 Collins et al. (Collins, et al), 10 of HRSV
番目のmRNAの同定およびポリペプチド類の10のウイルス遺伝子への帰属（Identification of a tenth mRNA of Th mRNA identification and attribution to 10 viral genes of polypeptides (Identification of a tenth mRNA of
HRSV and assignment of polypeptides to the 10 vira HRSV and assignment of polypeptides to the 10 vira
l genes）、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J.of Vi l genes), Journal of Bairoroji (J.of Vi
rol.）、49:572〜578（1984）およびそこで引用された文献。 rol), 49:. 572~578 (1984) and the references cited therein. さらに、HRSVの分子生物学を記載する研究は： In addition, the studies described the molecular biology of HRSV:
（１）コリンズら（Collins,et al）、Ｆ糖蛋白についての遺伝子配列を開示する「ヒト呼吸系シンシチウムウイルスの融合（Ｆ）糖蛋白をコード付けする遺伝子のヌクレオチド配列（Nucleotide Sequence of the gene en (1) Collins et al. (Collins, et al), nucleotide sequence of the gene with encoding the fusion (F) glycoprotein of "human respiratory syncytial virus to disclose the gene sequence for the F glycoprotein (Nucleotide Sequence of the gene en
coding the fusion（Ｆ） glycoprotein of human resp coding the fusion (F) glycoprotein of human resp
iratory syncytial virus）」、プロシーディングズ・ iratory syncytial virus) ", - Proceedings
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、81:7683〜7687（1984年1 Of the National Academy of Sciences USA, 81 (Proc.Natl.Acad.Sci.): 7683~7687 (1984 year 1
2月）；（２）コリンズら（Collins,et al）、1A蛋白についての遺伝子配列を開示する「ヒト呼吸系シンシチウムウイルスの1A蛋白遺伝子:mRNAのヌクレオチド配列および関連ポリシストロニック転写物（The 1A Protein G Feb); (2) Collins, et al. (Collins, et al), 1A protein gene 1A discloses the gene sequences for the protein "human respiratory syncytial virus: nucleotide sequence and related polycistronic transcript of mRNA (The 1A Protein G
ene of Human Respiratory Syncytial Virus:Nucleotid ene of Human Respiratory Syncytial Virus: Nucleotid
e Sequence of the RNA and a Related Polycistronic e Sequence of the RNA and a Related Polycistronic
Transcript）」、バイロロジー（Virology）、141:283 Transcript) ", Bairoroji (Virology), 141: 283
〜291（1985）；（３）コリンズら（Collins,et al）、 ～291 (1985); (3) Collins, et al. (Collins, et al),
22K蛋白についての遺伝子配列を開示する「ヒト呼吸シンシチウムウイルスのエンベロープ−結合22K蛋白:mRNA Envelope "human respiratory syncytial virus discloses the gene sequence for the 22K protein - bound 22K protein: mRNA
のヌクレオチド配列および関連多重転写物（The Envelo The nucleotide sequence and associated multiple transcripts (The Envelo
pe−Associated 22K Protein of Human Respiratory Sy pe-Associated 22K Protein of Human Respiratory Sy
ncytial Virus:Nucleotide Sequence of the mRNA and ncytial Virus: Nucleotide Sequence of the mRNA and
a Related Polytranscript）」、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J.of Virol.）、54（No.l）:65〜71（1985 a Related Polytranscript) ", Journal of Bairoroji (J.of Virol), 54 (No.l):. 65~71 (1985
年４月）；（４）ウェルツら（Wertz,et al）、Ｇ糖蛋白についての遺伝子配列を開示する「ヒト呼吸系シンシチウムウイルスのＧ蛋白遺伝子のヌクレオチド配列は異常タイプのウイルス膜蛋白を明らかにする（Nucleotide April year); (4) Waelz et al (Wertz, et al), reveal the nucleotide sequence abnormality type viral membrane protein of the G protein gene of the gene sequences disclosed a "human respiratory syncytial virus for G glycoprotein to (Nucleotide
sequence of the G Protein gene of human respirato sequence of the G Protein gene of human respirato
ry syncytial virus reveals an unusual type of vira ry syncytial virus reveals an unusual type of vira
l membrane protein）」、プロシィーデングズ・オブ・ l membrane protein) ", professional Shii dengue's Of
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.N National Academy of Sciences (Proc.N
atl.Acad.Sci.）USA、82:4075〜4079（1985年６月）； . Atl.Acad.Sci) USA, 82: 4075~4079 (6 May 1985);
および（５）∞蛋白についての遺伝子配列を開示する「呼吸系シシチウムウイルスの主要ヌクレオキャプシド蛋白mRNAについての正しい配列（Correct Sequence for And (5) ∞ discloses the gene sequences for the protein "respiratory shea cytidine um correct sequence for the major nucleocapsid protein mRNA of viruses (Correct Sequence for
the Major Nucleocapsid Protein mRNA of Respirator the Major Nucleocapsid Protein mRNA of Respirator
y Syncytial Virus）」、バイロロジー（Virology）、1 y Syncytial Virus) ", Bairoroji (Virology), 1
46:69〜77（1985）を含む。 46: including 69-77 (1985).
HRSVのＦおよびＧ糖蛋白は他のパラミキソウイルスにおける同様の片われを有する。 F and G glycoproteins of HRSV have cracks similar piece in other paramyxovirus. HRSVと同様に、他のパラミキソウイルスは細胞膜の融合に関連するＦ糖蛋白を有する。 As with HRSV, other paramyxoviruses have an F glycoprotein associated with fusion of cell membranes. ピイ・ダブリュー・チョピンおよびエイ・シェイド（PWChoppin and A.Scheid）、レブ・インフェクト・ディズ（Rev.Infect.Dis.）2:40〜60（1980）；メルツら（Merz.et al）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）151:275〜288（198 Pii, W. Chopin and TA Shade (PWChoppin and A.Scheid), rev Infekuto, Didsbury 2 (Rev.Infect.Dis.): 40~60 (1980); Merz et al. (Merz.et al), journal of Experimental Medicine 151 (J.Exp.Med.): 275~288 (198
0）。 0). 活性なパラミキソウイルスＦ蛋白は２個のジスルフィド連結サブユニットF1およびF2よりなり、該サブユニットは細胞プロテアーゼによる特異的内部切断によって不活性前駆体（Ｆ。）から生じる。 Active paramyxovirus F protein consists of two disulfide linked subunits F1 and F2, the sub-unit results from the inactive precursor by specific internal cleavage by cellular proteases (F.). シェイドおよびショピン（Scheid and Choppin）、バイロロジー（Viro Shade and Shopin (Scheid and Choppin), Bairoroji (Viro
l.）80:54〜66（1977）。 . L) 80: 54~66 (1977). ほとんどのパラミキソウイルスについての第２の主要糖蛋白はHN蛋白と呼ばれ、これらのウイルスの血球凝集素およびノイラミニダーゼ活性に関する。 Most of the second major glycoprotein for paramyxovirus is called HN protein, relates hemagglutinin and neuraminidase activities of these viruses. HRSV G蛋白は前記酵素活性を有しないが、Ｇ HRSV G protein does not have the enzyme activity, G
およびNH両糖蛋白はウイルスの付着に関する。 And NH Both glycoprotein relates viral attachment. また、これらの糖蛋白は、アミノ末端に異常な疎水性シグナル／ These glycoproteins are amino-terminal to the aberrant hydrophobic signal /
アンカー領域を有する点で構造的に似ている。 It is structurally similar in that it has an anchor region. ウェルツら（Wertz,et al）、PNAS82:4075〜4079（1985）；エランゴら（Elango,et al）、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）57:481〜489（1986）。 Waelz et al. (Wertz, et al), PNAS82:; (. J.Virol) 4075~4079 (1985) Erango et al. (Elango, et al), Journal of Bairoroji 57: 481-489 (1986).
HRSVと戦う入手可能な効果的ワクチンはない。 There is no available effective vaccines to combat HRSV. HRSVに対する効果的なワクチンを得ようとする多くの試みがなされてきた。 Many in an attempt to achieve an effective vaccine against HRSV have been made. フリーデワルドら（Friedewald,et al）、 Friedewald et al. (Friedewald, et al),
はジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・メディカル・アソーシエーション（Journal of the American Medical The Journal of the American Medical Athol-negotiation (Journal of the American Medical
Association）、204:690〜694（1968年５月20日）、ウシ胚腎臓組織培養での呼吸系シンシチウムウイルスの増殖を記載している。 Association), 204: 690~694 (5 May 20, 1968), describes the growth of the respiratory syncytial virus in bovine embryonic kidney tissue culture. 34℃または28℃で増殖させたウイルスは感染症または菌力が減少しなかった。 34 ° C. or virus grown at 28 ℃ the infection or virulence has not decreased. 26℃で増殖させたHRSVは、成人についての感染性の減少に関係するが、成人における感染の防止に用いることができるとは考えられなかった。 HRSV grown at 26 ° C. is related to the decrease in infectivity for adults, and can be used for prevention of infection in adults was not considered. というのは、該ウィルスは限定された感染性しか有さず、免疫原性に乏しかったからである。 This is because, the virus does not have only a limited infectious, because was poor in immunogenicity.
キムら（Kim,et al）は、ペディアトリックス（Pedia Kimura (Kim, et al), the rooms Trix (Pedia
trics）、48:745〜755（1971年11月）、26℃で増殖させたウイルスから調製した不活化呼吸系シンシチウムウイルスワクチンは６月令ないし13才までの幼児おらび子供で高レベルの血清抗体の発生を刺激したが、感染を防止しなかったことを開示している。 trics), 48: 745~755 (11 May 1971), high levels of serum inactivated respiratory syncytial virus vaccine prepared from virus grown at 26 ° C. in infants Orabi children up to 6 months of age to 13 years old Although stimulated the generation of antibodies, discloses that it did not prevent infection.
マックイントッシュら（McIntosh,et al）は、ペディアトリック・リサーチ（Pediatric Research）、8:689 Mac in Tosh, et al. (McIntosh, et al), the rooms trick Research (Pediatric Research), 8: 689
〜696（1974）、２種の実験的呼吸系シンシチウムウイルス生ワクチン、１つは26℃で増殖させたウイルスから調製したものおよびもう１つは32℃ではよく増殖するが ～696 (1974), two experimental respiratory syncytial virus vaccines, one is one thing and another was prepared from virus grown at 26 ° C. grows well at 32 ° C.
37℃またはそれ以上では全く増殖しない温度感受性突然変異体から調製したものを記載している。 It describes those entirely prepared from a temperature sensitive mutant which does not grow in 37 ° C. or higher. 第１のワクチンはワクチン接種と攻撃との間の間隔が４カ月以上である場合は感染から保護しないので不満足なものであった。 The first vaccine when the distance between the attack and the vaccination is 4 or more months were unsatisfactory because they do not protect against infection. 第２のワクチンは何人かのワクチン接種者でその温度感受性を明らかに喪失した点でこれまた不満足なものであった。 The second vaccine was achieved which also unsatisfactory in that lost clearly the temperature-sensitive in some vaccinees.
クレイグヘッド（Craighead）は、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジーズ（Journal of Infecti Craighead (Craighead), the Journal of Infekushasu Disease (Journal of Infecti
ous Disease）、131:749〜753（1975年６月）、1966年に行われた試験について記載しているが、その実験では数グループの研究者が、組織培養にて増殖させ、ホルムアルデヒド処理し、ミョウバン沈殿させたウイルスが幼児および年少の子供で試験されてい。 ous Disease), 131: 749~753 (6 May 1975), has been described for the test, which was conducted in 1966, researchers in several groups in the experiment, grown in tissue culture, and formaldehyde treatment , the virus that was alum precipitation has not been tested in children of infant and young. 野生型ウイルスに対する引き続いての暴露に際し、ワクチン受容者は気道病のパターンが強調された。 Upon exposure subsequent to wild-type virus, vaccine recipients pattern of airway disease was emphasized. クレイグヘッドはホルムアルデヒド処理ウイルスでの免疫化は該病気を促進したと結論している。 Craig head immunization with formaldehyde treatment virus is concluded that to promote the care the disease.
ライトら（Wright,et al）は、ジャーナル・オブ・ペディアトリックス（Journal of Pediatrics）、88:931 Light et al. (Wright, et al), the Journal of rooms Tricks (Journal of Pediatrics), 88: 931
〜936（1976年６月）、温度感受性の呼吸系シンシチウム弱毒性ワクチンの幼児における評価を記載している。 ～936 (June 1976), describe the evaluation in infants of respiratory syncytial attenuated vaccine of temperature-sensitive.
このワクチンはすべての血清陰性幼児を感染させるのに充分な高レベルで投与した場合、軽い上部気道病を引き起こしたものの、用量を低下させると許容されるレベルの感染性を達成できなかった。 This vaccine when administered in high enough levels to infect all seronegative infants, although caused mild upper respiratory tract disease, could not be achieved infectivity levels acceptable to lower the dose. また、該ウイルスはあるワクチンツでの温度感受性の喪失の証拠があるので遺伝的にも不安定であった。 It was also unstable genetically because the virus there is evidence of loss of temperature sensitivity in some Wakuchintsu. このワクチンでは天然の病気の増強作用の証拠はなく、再感染がワクチン接種者間で起こった。 There was no evidence of potentiation of natural illness with this vaccine, re-infection has occurred among vaccine recipients.
米国特許第4122167号および第4145252号はヒト二倍体肺腺維芽細胞を介して系列的継代によってウイルス粒子を弱毒化する方法を記載しており、米国特許第4517304 U.S. Patent Nos. 4122167 and No. 4145252 are described a method for attenuating virions by serial passaging through human diploid lung adenocarcinoma fibroblasts, U.S. Patent No. 4,517,304
号は培養で増殖させた罹患細胞の細胞膜上で免疫原生的に活性なHRSV蛋白を生産する方法を開示している。 No. discloses a method of producing immunogenic active HRSV proteins on the cell membrane of the affected cells grown in culture. 次いで、これらの細胞を宿主に注射して免疫応答を誘導する。 Then, the injection of these cells into the host induces an immune response.
組換体ワクシニアウイルス発現系はHRSVのＧおよびＦ Recombinant vaccinia virus expression system HRSV G and F
糖蛋白を別々に発現することが知られている。 It is known to express the glycoprotein separately. ボールら（Ball,et al）、組換体ワクシニアウイルスベクターからのヒト呼吸系シンシチウムウイルスの主要Ｇ糖蛋白の発現（Expression of the Major Glycoprotein G of Hu Ball et al. (Ball, et al), recombinant vaccinia expression of the major G glycoprotein of human respiratory syncytial virus from virus vector (Expression of the Major Glycoprotein G of Hu
man Respiratory Syncytial Virus from Recombinant V man Respiratory Syncytial Virus from Recombinant V
accinia Virus Vectors）、PNAS,USA、83:246〜250 accinia Virus Vectors), PNAS, USA, 83: 246~250
（1986）およびオルムステッドら（Olmsted,et al）、 (1986) and Olmsted et al. (Olmsted, et al),
組換体ワクシニアウイルスによる呼吸系シンシチウムウイルスのＦ糖蛋白の発現：宿主の免疫性に対するＦおよびＧ糖蛋白の個々の寄与の比較（Expression of the F Recombinant vaccinia virus by expression of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus: individual comparisons contributions F and G glycoproteins to host immunity (Expression of the F
Glycoprotein of Respiratory Syncytial Virus by a R Glycoprotein of Respiratory Syncytial Virus by a R
ecombinant Vaccinia Virus:Comparison of the Indivi ecombinant Vaccinia Virus: Comparison of the Indivi
dual Contributions of the F and G Glycoiproteins t dual Contributions of the F and G Glycoiproteins t
o HostImmuniy）、PNAS,USA、83:7462〜7466（198 o HostImmuniy), PNAS, USA, 83: 7462~7466 (198
6）。 6). また、これらの２種の糖蛋白は哺乳動物で生きたH In addition, these two types of glycoproteins were living in mammalian H
RSVウイルス攻撃に対して免疫保護を誘導することが証明されている。 To induce immune protection has been demonstrated against RSV virus attack. スコットら（Scott,et al）、組換体ワクシニアウイルスベクターから発現されたヒト呼吸系シンシチウムウイルス糖蛋白Ｇはマウスを生きたウイルス攻撃から保護する（Human Respiratory Syncytial Viru Sukottora (Scott, et al), recombinant vaccinia virus vectors human respiratory syncytial virus glycoprotein G expressed from the protection against live virus challenge Mice (Human Respiratory Syncytial Viru
s Glucoprotein G Expressed from Recombinant Vaccin s Glucoprotein G Expressed from Recombinant Vaccin
ia Virus Vector Protects Mice Against Live−virus ia Virus Vector Protects Mice Against Live-virus
Challenge）、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Journ Challenge), Journal of Bairoroji (Journ
al of Virology）、67:607〜613（1986）；ワルシュら（Walsh,et al）、ウイルス感染からコトンラットを保護するための呼吸系シンシチウムウイルスの糖蛋白サブユニットを用いる免疫化（Immunization with Glycopro al of Virology), 67: 607~613 (1986); Walsh et al. (Walsh, et al), immunization with glycoprotein subunits of respiratory syncytial virus to protect cotton rats from virus infection (Immunization with Glycopro
tein Subunits of Respiratory Syncytial Virus to Pr tein Subunits of Respiratory Syncytial Virus to Pr
otect Cotton Rats Against Viral Infection）、ジャーナル・オブ・インフェクシァス・ディジージズ（Jour otect Cotton Rats Against Viral Infection), Journal of Infekushiasu-Dijijizu (Jour
nal of Infectious Diseases）、1198〜1204（1987）； nal of Infectious Diseases), 1198~1204 (1987);
ウェルツら（Wertz,et al）、組換体ワクシニアウイルスベクターからのヒト呼吸系シンシチウムウイルスの融合蛋白の発現およびワクチン接種マウスの保護（Expres Waelz et (Wertz, et al), recombinant expression of a fusion protein of human respiratory syncytial virus and vaccination protection in mice from vaccinia virus vector (Expres
sion of the Fusion Protein of Human Respiratory Sy sion of the Fusion Protein of Human Respiratory Sy
ncytial Virus from Recombinant Vaccinia Virus Vect ncytial Virus from Recombinant Vaccinia Virus Vect
ors and Protection of Vaccinated Mice）、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Journal of Virology）、293 ors and Protection of Vaccinated Mice), Journal of Bairoroji (Journal of Virology), 293
〜301（1987）；エランゴら（Elango,etal）、RV G糖蛋白を発現する組換体ワクシニアウイルスでコトンラットを免疫化することによって誘導されたヒト呼吸系シンシチウムウイルス（RSV）感染に対する耐性（Resistance To 301 (1987); Erango al (Elango, etal), expressing the RV G glycoprotein recombinant vaccinia human respiratory Shin was induced by immunizing cotton rats with vaccinia virus cytidine um virus (RSV) resistance to infection (Resistance
to Human Respiratory Syncytial Virus（RSV）Infecti to Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infecti
on Induced by Immunization of Cotton Rats with a R on Induced by Immunization of Cotton Rats with a R
ecombinant Vaccinia Virus Expressing the RSV G Gly ecombinant Vaccinia Virus Expressing the RSV G Gly
coprotein）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.S coprotein), Proceedings of National Academy of Sciences (Proc.Natl.Acad.S
ci.）、USA、1906〜1910（1986）。 ci.), USA, 1906~1910 (1986).
発明の要約 本発明は、シグナル配列およびヒト呼吸系シンシチウムウイルス糖蛋白ＦおよびＧ双方からの少なくとも１つの免疫原生断片よりなるポリペプチドを含む。 SUMMARY OF THE INVENTION The present invention comprises at least one polypeptide consisting of immunogenic fragment from the signal sequence and the human respiratory syncytial virus glycoprotein F and G both. この蛋白のワクチンとしての使用、HRSV−関連病を防止する方法および組成法を用いるこの蛋白の製法もまた本発明の一部である。 Use as a vaccine of this protein, which is part of the preparation of this protein is also present invention using the methods and compositions methods to prevent HRSV- related diseases.
詳細な記載 以下に定義する語は本明細書中で用いるものである。 Term defined below detailed description are those used herein.
「細胞培養」なる語句は、細胞をもとの植物または動物の体外で生きた状態で保つ、多細胞の植物または動物いずれか由来の細胞を増殖させる封じ込めをいう。 The phrase "cell culture", keep in a state in which the cells were alive outside the body of the original plant or animal, it refers to the containment of growing a plant or animal either derived cells of multicellular. 「下流」なる語は発現方向により進行した配列をいい；例えば、コーディング領域は開始コドンの下流にある。 The term "downstream" refers to a sequence that has traveled by expression orientation; for example, the coding region is downstream of the start codon. 「微生物」なる語は細菌、放線菌および酵母のごとき単細胞原核生物および真核生物を共にいう。 The term "microorganism" refers to bacteria, such as actinomycetes and yeast unicellular prokaryotic and eukaryotic organisms together. 「オペロン」なる語は遺伝子の発現および調節の完全な単位をいい、構造遺伝子、調節遺伝子および調節遺伝子産物によって認識されるDNA中の制御要素を包含する。 The term "operon" includes refers to complete unit of expression and regulation of genes, structural genes, regulatory elements in DNA recognized by regulator gene and regulatory gene products. 「プラスミド」なる語は自律性で自己複製する染色体外環状DNAをいい、 The term "plasmid" refers to the extrachromosomal circular DNA to self-replicate in autonomy,
発現および非発現両タイプを包含する。 Expression and including non-expressing both types. 組換体微生物または細胞培養について、それらを発現プラスミドの宿主と記載する場合、「発現プラスミド」なる語句は染色体外環状DNAおよび宿主染色体に組み込まれたDNAを共に包含する。 For recombinant microorganism or cell culture, it is referred to as a host of their expression plasmid, "expression plasmid" The phrase was incorporated in extrachromosomal circular DNA and the host chromosomal DNA encompasses both. プラスミドを宿主細胞によって維持する場合、 If maintaining plasmids by host cells,
プラスミドは自律性構造としてか、あるいは宿主ゲノムに組み込まれた一部として、有糸分裂間に細胞において安定に複製される。 Plasmid or as an autonomous structure, or as part integrated into the host genome is stably replicated in cell between mitosis. 「プロモーター」なる語は転写開始用RNAポリメラーゼを結合させることに関与するDNA領域をいう。 The term "promoter" refers to a DNA region involved in binding the transcription start for RNA polymerase. 「DNA配列」なる語はヌクレオチド塩基、アデノシン、チミジン、シトシンおよびグアノシンよりなる一本または二本鎖DNA分子をいう。 The term "DNA sequence" refers to nucleotide base, adenosine, thymidine, a single- or double-stranded DNA molecule consisting of cytosine and guanosine. 「実質的に純粋」なる語は、所望の組換体キメラ糖蛋白以外のパラミキソウイルス蛋白を含有しない蛋白の組成物をいう。 The term "substantially pure" refers to a composition of proteins containing no paramyxovirus protein other than the desired recombinant chimeric glycoprotein. 実質的に純粋な蛋白は低濃度の宿主細胞成分で汚染しているかも知れないが、該蛋白は複製パラミキソウイルスによって産生された構造および非構造ウイルス蛋白汚染を欠く。 A substantially pure protein but might be contaminated with host cell components in the low density, it said protein lacks structural and nonstructural viral proteins pollution produced by replication paramyxovirus.
「適当な宿主」なる語は、組換体プラスミドに適合し、 "Suitable host" refers to, compatible with the recombinant plasmid,
かつ該プラスミドが複製され、そのゲノムに取り込まれ、発現されるのを可能とする細胞培養または微生物をいう。 And the plasmid is replicated, incorporated into its genome, refers to a cell culture or microorganism to allow being expressed. 「上流」なる語は発現と反対方向に進行する配列をいい；例えば、細菌プロモーターは転写ユニットから上流にあり、開始コドンはコーディング配列から上流にある。 The term "upstream" refers to a sequence which proceeds in the opposite direction to the expression; for example, a bacterial promoter is upstream from the transcription unit, the initiation codon from the coding sequence upstream.
本発明は、種々の公知方法によって達成できる一連の分子遺伝操作を含む。 The present invention includes a series of molecular genetic manipulation can be achieved by a variety of known methods. 該操作は蛋白のcDNAを得、該cDNA The manipulation is to obtain cDNA of the protein, the cDNA
をイー・コリ（E.coli）中でクローニングし、および複製し、所望のcDNAを適当な宿主中で発現させることに要約できる。 Was cloned in E. coli (E. coli), and replicate, it can be summarized in expressing in a suitable host the desired cDNA. 以下の記載は、蛋白を発現するに利用できる種々の方法を詳しく述べるものであり、続いて好ましい方法の特別の例を記載する。 The following description, which details the various methods available to express the protein, describes a specific example of a subsequently preferred method. 個々のポリペプチド、糖蛋白FGについての特別の配列および塩基のナンバリング位置はチャート９に示す。 Individual polypeptides, special sequence and base numbering positions for your glycoprotein FG is shown in Chart 9.
一般に、本発明で必要な命名法および一般的な実験室的手法はマニアティスら（Maniatis et al）、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Sprin In general, the nomenclature and general laboratory procedures required in this invention Maniatis et al (Maniatis et al), Molecular Cloning A Laboratory Manual (Molecular Cloning A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Sprin
g Harbor Laboratory）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク、1982（マニアティス（Maniatis））中に見い出すことができる。 g Harbor Laboratory), Cold Spring Harbor can be found in (Cold Spring Harbor), New York, 1982 (Maniatis (Maniatis)).
すべてのイー・コリ（E.coli）株はグルコースを含むルリア・ブロス（LB）、ディフコの抗生物質培地＃２およびグルコースおよび酸加水分解カゼインアミノ酸を補足したM9培地上で増殖させる。 All E. coli (E. coli) strains are grown in Luria Broth (LB), Difco antibiotic media # 2 and glucose and acid hydrolysis supplemented casein degraded amino acids was M9 medium on containing glucose. 耐抗生物質株をマニアティスに記載された薬剤濃度で維持した。 The antibiotic resistant strains were maintained in drug concentrations described in Maniatis. 形質転換は、ロウェカンプおよびフィルテル（Rowekamp and Firte Transformation Rowekanpu and Firuteru (Rowekamp and Firte
l）、ディベロップメンタル・バイオロジー（Dev.Bio l), Development down Tal Biology (Dev.Bio
l.）、79:409〜418（1980）に記載されている方法に従って行った。 l), 79:. was performed according to the method described in 409-418 (1980).
すべての酵素は製造業者の指示に従って使用した。 All enzymes were used according to the manufacturer's instructions. グルンステインおよびワリス（Grunstein and Wallis）、 Gurung stain and Wallis (Grunstein and Wallis),
メソッズ・イン・エンザイモロジー（Metods in Enzymo Methods in Enzymology (Metods in Enzymo
logy）、68:379〜388に記載されているごとくに形質転換体を分析した。 logy), 68: were analyzed transformants as described in 379-388.
ハイブリダイゼーションの後、プローブを取り出し、 After hybridization, remove the probe,
保存し、フィルターを、0.1％SDS、0.2xSSC中、各400ml Save, a filter, 0.1% SDS, in 0.2xSSC, each 400ml
で５回とりかえて計３時間洗浄する。 In washed five times swop with a total of three hours. フィルターを充分に風乾し、セットし、コダック（Kodak）Ｘ−OMAT ARフィルムおよびデュポン・クロネックス・ライトネニング・プラス増感スクリーン（Dupont Cronex Lightnening Fully air-dried the filter, set to, Kodak (Kodak) X-OMAT AR film and DuPont Cronex Light Ne training plus intensifying screen (Dupont Cronex Lightnening
Plus intensifying screens）を用い、−70で16時間オートラジオグラフィーに付す。 Plus intensifying screens) using, -70 in subjected to 16 hours autoradiography.
プラスミドの配列決定についは、精製したプラスミド For sequencing of plasmids, purified plasmid
DNAをマニアティスに記載されているごとくに調製する。 It is prepared as described for DNA in Maniatis. コリンズ及びウェルツ（Collins and Wertz）、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、54:65〜7 Collins and Waelz (Collins and Wertz), Journal of Bairoroji, 54 (J.Virol.): 65~7
1（1985）によって記載されている変法とともにマキサム及びギルバート（Maxam and Gilbert）の化学配列決定法によって、末端標識DNA断片を調製し分析する。 1 by Maxam and chemical sequencing Gilbert (Maxam and Gilbert) with variants described by (1985), end-labeled DNA fragments were prepared analysis.
ヌクレオチドのサイズはキロベース（kb）または塩基対（bp）いずれかで表す。 The size of the nucleotide represents either kilobases (kb) or base pairs (bp). これらはアガロースゲル電気泳動から見積ったものである。 These were estimated from agarose gel electrophoresis.
蛋白を発現させる最初の工程では、cDNAクローンから蛋白についてコード付けするDNA配列を得る。 In the first step of expressing the protein, to obtain the DNA sequence with coding for proteins from a cDNA clone. 次いで、 Then,
この配列を、遺伝子の転写を指示でき、転写体の効果的な翻訳が可能な発現プラスミドにクローニングする。 This sequence can direct transcription of a gene, cloned into efficient translation capable expression plasmid transcript. 蛋白をコード付けするcDNAを得るためのライブラリー法は、一般に、マニアティス、特にコリンズおよびウェルツ（Collins and Wertz）、HRSVのゲノムによってコード付けされる９種のポイＡ化RNAのcDNAクローニングおよび転写マッピング（cDNA Cloning and Transcription Library method for obtaining cDNA which attach encoding proteins, generally, Maniatis, particularly Collins and Waelz (Collins and Wertz), cDNA cloning and transcription of nine POI A of RNA encoded with by the genome of HRSV mapping (cDNA Cloning and Transcription
al Mapping of Nine Polyadenylated RNAs Encoded by al Mapping of Nine Polyadenylated RNAs Encoded by
the Genome of HRSV）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Nat the Genome of HRSV), Proceedings of National Academy of Sciences (Proc.Nat
l.Acad.）USA、80:3208〜3212（1983）、RSV G糖蛋白を発現する組換体ワクシニアウイルスでコトンラットを免疫化することによって誘導されるヒト呼吸系シンシチウムウイルス（RSV）感染に対する耐性（Resistance to H . L.Acad) USA, 80: 3208~3212 (1983), RSV G sugar pairs expressing protein recombinants vaccinia human respiratory system Shin induced by immunizing cotton rats with vaccinia virus cytidine um virus (RSV) resistance to infection ( Resistance to H
uman Respiratory Syncytial Virus（RSV）Infection I uman Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infection I
nduced by Immunizaiton of Cotton Rats with a Recom nduced by Immunizaiton of Cotton Rats with a Recom
binant Vaccinia Virus Expressing the RSV G Glycopr binant Vaccinia Virus Expressing the RSV G Glycopr
otein）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sc otein), Proceedings of National Academy of Sciences (Proc.Natl.Acad.Sc
i.）USA、1906〜1910（1986）およびオルムステッド・ i.) USA, 1906~1910 (1986) and Olmsted -
アール・エイら（Olmsted RAet al）、組換体ワクシニアウイルスによる呼吸系シンシチウムウイルスのＦ糖蛋白の発現:FおよびＧ糖蛋白の宿主免疫化に対する個々の寄与の比較（Expresson of the F Glycoprotein of R R. EIRE (Olmsted RAet al), recombinant vaccinia virus by expression of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus: comparison of the individual contributions to the host immunization of F and G glycoprotein (Expresson of the F Glycoprotein of R
espiratory Syncytial Virus by a Recombinant Vaccin espiratory Syncytial Virus by a Recombinant Vaccin
ia Virus:Comparison of the Individual Contribution ia Virus: Comparison of the Individual Contribution
of the F and G glycoproteins to Host Immunity）、 of the F and G glycoproteins to Host Immunity),
プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・ Proceedings of National Academy
オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、7462 Of Sciences (Proc.Natl.Acad.Sci.) USA, 7462
〜7466（1986）に記載されている。 It is described in ～7466 (1986).
dGTPのホモポリマー・トラクトが切断部位における３′末端に酵素によって付加されたPstI切断のpBR322に 3 'end of pBR322 appended PstI cleaved by the enzyme in homopolymeric tracts cleavage site dGTP
cDNAを挿入することによってクローンを調製する。 Preparing clones by inserting cDNA. dGTP dGTP
のホモポリマー・トラクトは、マニアティスによって記載されている方法に従って、cDNA分子の３′末端に酵素により付加する。 Homopolymer tracts can according to the method described by Maniatis, added enzymatically to the 3 'end of the cDNA molecules. 理想的には、dCTPまたはdGTPの10〜30 Ideally, 10 to 30 of dCTP or dGTP
残基を付加してクローニング効率を最大化する。 To maximize cloning efficiency by adding a residue. 該cDNA The cDNA
およびプラスミドを一緒にアニールし、イー・コリ（E. And plasmid were annealed together, E. coli (E.
coli）に形質転換する。 Transformed into coli). 遺伝子配列の各部に相補的な標識したウイルスcDNAまたはオリゴヌクレオチドのプローブによって全長cDNAを含有するクローンを検出し、続いて制限酵素分析し、DNA配列を決定する。 Detecting a clone containing the full-length cDNA by a probe complementary labeled viral cDNA or oligonucleotides to each part of the gene sequence, followed by restriction enzyme analysis to determine the DNA sequence.
ニードハム−バンデバンターら（Needham−VanDevant Needham - Bandebanta et al. (Needham-VanDevant
er,et al）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl er, et al), Nucleic Acids Research (Nucl
eic Acids Res.）、12:6159〜6168（1984）に記載されているごとく、自動合成器を用い、最初ボーケージおよびカルザース（Beaucage and Caruthers）、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）、22（20）:18 eic Acids Res), 12:. 6159~6168 (as described in 1984), using an automated synthesizer, the first Beaucage and Carruthers (Beaucage and Caruthers), Tetrahedron Letters (Tetrahedron Letters), 22 (20) : 18
59〜1862（1981）によって記載された固相ホスホルアミデイトトリエステル法に従い、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する。 According solid phase phosphoramidite date triester method described by 59-1862 (1981), chemically synthesized oligonucleotides. オリゴヌクレオチドの精製は、ペアソンおよびレグニェ（Person and Regnier）、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（J.Chrom.）、255:137〜1 Purification of oligonucleotides, Pearson and Regunye (Person and Regnier), Journal of Chromatography, 255 (J.Chrom.): 137~1
49（1983）に記載されているごとき天然アクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換HPLCいずれかによる。 49 by either natural acrylamide gel electrophoresis or anion-exchange HPLC such described in (1983).
合成オリゴヌクレオチドの配列は、マキサム及びギルバート（Maxam and Gilbert）、グロスマンおよびモルデイブ（Grossman and Moldave）編、アカデミック・プレス（Academic Press）、ニューヨーク、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods In Enzymology）、65: The sequence of the synthetic oligonucleotides, Maxam and Gilbert (Maxam and Gilbert), Grossman and Morudeibu (Grossman and Moldave), eds., Academic Press (Academic Press), New York, Methods in Enzymology (Methods In Enzymology), 65 :
499〜560（1680）の化学分解法を用いて確認できる。 Chemical decomposition method of 499-560 (1680) can be confirmed using.
原核生物系においてクローン化遺伝子の高レベル発現を達成するには、少なくとも、mRNA転写を指示する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターを含有する発現ベクターを構築することが必須である。 To achieve high level expression of cloned genes in prokaryotic systems, at least, a strong promoter to direct mRNA transcription, be used to construct expression vectors containing a ribosome binding site, for translation initiation and a transcription terminator it is essential. この目的に適した調節領域の例は、ヤノフスキー、ケレイ、およびホルン（Yano Examples of regulatory regions suitable for this purpose are, Yanofu ski, Kerei, and Horn (Yano
fsky,Kelley,and Horn）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）、158:1018〜1024（1984）によって記載されているイー・コリ（E.coli）のプロモーターおよびオペレーター領域ならびにヘルスコビィッツおよびハーゲン（Herskowitz and Hagen）、アン・レブ・ジェネット（Ann.Rev.Genet.）、14:399〜445（180） fsky, Kelley, and Horn), J. Bact (J.Bacteriol), 158:. 1018~1024 promoter and operator region as well as Herusuko of (E. coli, which is described by 1984) (E.coli) Byittsu and Hagen (Herskowitz and Hagen), Anne rev Jeanette, 14 (Ann.Rev.Genet.): 399~445 (180)
によって記載されているファージラムダ（P L ）の左側プロモーターである。 It is a left promoter of phage lambda listed (P L) by.
イー・コリで産生される蛋白は、システイン残基の存在のため、および適当な翻訳後修飾を欠くために、適当には折りたたまれない。 Protein produced in E. coli, due to the presence of a cysteine ​​residue, and due to the lack of appropriate post-translational modifications, suitably not folded. イー・コリからの精製の間に、 During purification from E. coli,
発現された蛋白をまず変性し、次いで復元しなければならない。 The expressed protein is first denatured and then must be restored. これは、イー・コリ産生蛋白を塩酸グアニジンに溶解し、すべてのシステイン残基をβ−メルカプトエタノールで還元することによって達成される。 This is accomplished by dissolving the E. coli producing protein in guanidine hydrochloride, reduced all the cysteine ​​residues with β- mercaptoethanol. 次いで、 Then,
該蛋白をゆっくりとした透析またはゲル濾過いずれかによって復元する。 To restore either by dialysis or gel filtration was slow said protein. 米国特許第4511503号 蛋白の検出はラジオイムノアッセイ。 Detection radioimmunoassay of US Patent No. 4511503 protein. またはウェスタンブロッティング法もしくは免疫沈殿のごとき当該分野で公知の方法によって行う。 Or performed by methods known in the art such as Western blotting or immunoprecipitation. イー・コリからの精製は米国特許第1544503号に記載される方法によって行うことができる。 Purification from E. coli can be carried out by the methods described in U.S. Patent No. 1,544,503.
酵母における異種蛋白の発現はよく知られ、記載されている。 Expression of heterologous proteins in yeast is well known and described. 酵母遺伝学における方法（Methods in Yast Ge Method in yeast genetics (Methods in Yast Ge
netics）、シーマンら（Scherman,et al）、コールド・ netics), Seaman et al. (Scherman, et al), cold
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Ha Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Ha
rbor Laboratory）（1982）は酵母において蛋白を産生するための種々の方法を記載するよく知られた文献である。 rbor Laboratory) (1982) is a well-known literature describing various methods for producing a protein in yeast.
酵母における遺伝子の高レベル発現については、原核生物におけるごとく遺伝子を強力なプロモーター系に接続し、また酵母遺伝子から効果的な転写停止／ポリＡ配列を供することが必須である。 For high level expression of genes in yeast, connected to a strong promoter system the gene as in prokaryotes, also it is essential to provide an effective transcription termination / poly A sequence from yeast genes. 有用なプロモーターの例はGAL1,10、ジョンストンおよびデイビス（Johnston an Examples of useful promoters are GAL1,10, Johnston and Davis (Johnston an,
d Davis）、モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Mol.and Cell.Biol.）、4:1440〜1448（198 d Davis), Molecular and-Seryura Biology (Mol.and Cell.Biol), 4:. 1440~1448 (198
4）、ADH2、ラッセルら（Russell）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、25 4), ADH2, Russell et al. (Russell), Journal of Biological Chemistry (J.Biol.Chem.), 25
8:2674〜2682（1983）、PHO5、EMBOJ、6:675〜680（198 8: 2674~2682 (1983), PHO5, EMBOJ, 6: 675~680 (198
2）、およびMFα１を包含する。 2), and it includes the MFα1. Lue−２、URA−３、Trp Lue-2, URA-3, Trp
−１、またはHis−３のごとき選択マーカーをもつマルチコピープラスミド・プロモーターも望ましい。 -1 or multicopy plasmid promoter with such selection markers His-3, it is also desirable. 該MFα The MFα
１プロモーターが好ましい。 1 promoter is preferred. 該MFα１プロモーターはα The MFα1 promoter is α
接合型の宿主において構成的であるが、ａ接合型をもつジプロイドまたは細胞では働かない。 A constitutive in junction host, but does not work in the diploid or cells with a junction type. しかしながら、それは、SIR座の１つにおいてts突然変異を有する宿主中で温度を上昇させるかまたは低下させることによって調節できる。 However, it can be adjusted by or reduce the temperature is increased in a host having a ts mutation at one of the SIR loci. 35℃におけるかかる突然変異がα型細胞に与える影響はａ接合型についてコーディングする通常サイレントな遺伝子を作動開始させることにある。 Effects of such mutations in 35 ° C. gives the α type cell is to be started operating normally silent gene coding for a junction. 一方、サイレントなａ接合型遺伝子の発現はMFα１プロモーターを作動停止させる。 On the other hand, the expression of the silent a mating type gene stops actuating the MFα1 promoter. 増殖温度を27℃まで低下させると全プロセスが逆行する。 To lower the growth temperature to 27 ° C. The entire process is reversed. すなわち、ａ接合型を作動停止させ、MFα１を作動開始させる。 That is, operation is stopped a junction, to start operating the MF.alpha.1. ヘルスコウィッツおよびオーシマ（Herskowitz and Oshima）、酵母サッカロミセス属の分子生物学（The Molecular Biology of the Y Health co-Witz and Oshima (Herskowitz and Oshima), yeast Saccharomyces of molecular biology (The Molecular Biology of the Y
east Saccharomyces）、ストラセルン、ジョーンズ、およびブローチ（Strathern,Johns,and Broach）編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、181〜209（19 east Saccharomyces), Sutoraserun, Jones, and brooch (Strathern, Johns, and Broach), eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 181-209 (19
82） ポリＡ配列はADH1、MFα１、またはTPIのような、高度に発現されたいずれかの遺伝子の３′−末端配列によって供される。 82) Poly A sequences ADH1, MF.alpha.1, or TPI, such as are provided by the 3'-terminal sequence of any gene that is highly expressed. アルバーおよびカワサキ（Alber and Ka Albar and Kawasaki (Alber and Ka
wasaki）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・ wasaki), Journal of Molecular and -
アプライド・ジェネティクス（J.of Mol.and Appll.Gen Applied Genetics (J.of Mol.and Appll.Gen
et.）、1:419〜434（1982）。 et), 1:. 419~434 (1982).
YEp5、YEp13、YEp24のような多数の酵母発現プラスミドをベクターとして用いることができる。 YEp5, YEp13, a number of yeast expression plasmids like YEp24 can be used as a vector. 注目する遺伝子を前記いずれかのプロモーターに連結し、次いで、種々の酵母宿主における発現用のプラスミドに結ぶことができる。 Wherein the gene of interest linked to any promoter, it can then be tied into a plasmid for expression in various yeast hosts. これらのプラスミドは、ボートステインら（Bo These plasmids, boat stain, et al. (Bo
tstein,et al）、ジーン（Gene）、8:17〜24（1979）； tstein, et al), Gene (Gene), 8: 17~24 (1979);
ブローチら（Broach,et al）、ジーン（Gene）、8:121 Broach et (Broach, et al), Gene (Gene), 8: 121
〜133（1979）の文献に詳細に記載されている。 It is described in detail in the literature to 133 (1979).
酵母細胞を形質転換するには２種の手法を用いる。 Yeast cells can be transformed using two approaches. １ 1
の場合においては、ザイモリアーゼ、リティカーゼまたはグルスラーゼを用いて酵母細胞をプロトプラストに変換し、続いてDNAおよびポリエチレングリコール（PEG） In the case of, zymolyase, it converts the yeast cells to protoplasts using lyticase or Gurusuraze, followed by DNA and polyethylene glycol (PEG)
を添加する。 It is added. 次いで、該PEG処理プロトプラストを選択した条件下、３％アガール培地中で再生する。 Then, under the chosen conditions the PEG treatment protoplasts are regenerated in a 3% agar medium. この方法の詳細は、ベッグズ（Beggs）、ネイチャー（Nature） For more information on this method, Begguzu (Beggs), Nature (Nature)
（London）、275:104〜109（1978）；およびヒンネンら（Hinnen,et al）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Ac (London), 275: 104~109 (1978); and Hinnen et al. (Hinnen, et al), Proceedings of National Academy of Sciences (Proc.Natl.Ac
ad.Sci.）USA、75:1929〜1933（1978）による論文に記載されている。 . Ad.Sci) USA, 75: are described in the article by 1929-1933 (1978). 第２の手法は細胞壁の除去を含まない。 The second approach does not include the removal of the cell wall.
代わりに、細胞を塩化リチウムまたは酢酸リチウムおよびPEGで処理し、選択したプレート上に乗せる。 Alternatively, cells were treated with lithium chloride or lithium acetate and PEG, put the selected plate. イトーら（Ito,et al）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bact.）、153:163〜168（1983）。 Ito et al. (Ito, et al), J. Bact, 153 (J.Bact.): 163~168 (1983).
cDNAは宿主細胞培養を形質転換するのに使用する種々の発現ベクターに結ぶことができる。 cDNA may be tied to a variety of expression vectors that use a host cell culture to transform. 該ベクターは、すべて、形質転換すべき宿主細胞に適合する、蛋白の転写および翻訳を開始するための遺伝子配列を含有する。 The vector are all compatible with the host cell to be transformed, it contains gene sequences to initiate the transcription of protein and translation.
加えて、該ベクターは、好ましは、ジヒドロ葉酸還元酵素またはメタロチオネインのごとき形質転換宿主細胞の選択用表現型特性を供するためのマーカーを含有する。 In addition, the vector preferably contains a marker for providing a selection phenotypic characteristics of transformed host cells such as dihydrofolate reductase or metallothionein. さらに、複製ベクターはレプリコン含有し得る。 Furthermore, replication vectors may contain a replicon.
蛋白の産生に有用な細胞培養の例は昆虫または哺乳動物起源のものである。 Examples of useful cell culture for the production of proteins are of insect or mammalian origin. 哺乳動物細胞懸濁液を用いることもできるが、哺乳動物細胞系はしばしば細胞の単層形態となろう。 It can also be used mammalian cell suspensions, mammalian cell systems will often become monolayer cell morphology. 哺乳動物細胞系の例はVEROおよびHeLa細胞、 Examples of mammalian cell lines VERO and HeLa cells,
チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞糸、WI38、BH Chinese hamster ovary (CHO) cells yarn, WI38, BH
K、COS−７またはMDCK細胞系を包含する。 K, including COS-7 or MDCK cell lines.
前記したごとく、宿主細胞を形質転換するのに用いるベクターは、好ましくは、蛋白遺伝子配列の転写および翻訳を開始するための遺伝子配列を含有する。 As mentioned above, the vector using host cells for transformation preferably contain gene sequences to initiate transcription and translation of the protein gene sequence. これらの配列を発現制御配列という。 That these sequences expression control sequences. 宿主細胞が哺乳動物たまは昆虫起源のものでもある場合、有用な発現制御配列は、 When the host cell is mammalian balls have a be of insect origin, useful expression control sequences,
例えば、SV−40プロモーター、サイエンス（Scienc For example, SV-40 promoter, Science (Scienc
e）、222、254〜527（1983）、CMV IEプロモーター、 e), 222,254~527 (1983), CMV IE promoter,
オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）81:659〜6 Of Sciences 81 (Proc.Natl.Acad.Sci.): 659~6
63（1984）、メタロチオネインプロモーター、ネイチャー（Nature）、296、39〜42（1982）またはバクロウイルスポリヘドリンプロモーター（昆虫細胞）、バイロロジー（Virol.）、131、561〜565（1983）から得られる。 63 (1984), the metallothionein promoter, Nature (Nature), 296,39~42 (1982) or the baculovirus polyhedrin promoter (insect cells), Bairoroji (Virol.), Obtained from 131,561～565 (1983) . 発現制御配列を含有するプラスミドまたは複製もしくは組込みDNA物質は酵素を用いて切断し、要すればまたは望ましくはサイズを調整し、当該分野で公知の方法によって蛋白をコード付けするcDNAと結ぶ。 Plasmid or replication or integrated DNA material containing the expression control sequences is cleaved using the enzyme, if or preferably adjusts the size desired, connects the cDNA to give encoding a protein by methods known in the art.
高等動物宿主細胞を用いる場合の酵母に関しては、公知哺乳動物遺伝子からのポリＡまたは転写停止配列がベクター中に組み込まれる必要がある。 For the yeast in the case of using a higher animal host cells, it is necessary to poly A or transcription termination sequences from known mammalian genes are incorporated into the vector. 停止配列の例にはウシ成長ホルモン遺伝子からのポリＡ配列がある。 Examples of termination sequences are poly A sequence from the bovine growth hormone gene.
加えて、宿主細胞中で複製を制御するための遺伝子配列を、ウシ乳頭腫ウイルスタイプのベクター、サベリア−カンポ（Saveria−Campo）、「ウシ乳頭腫ウイルスDN Additionally, gene sequences to control replication in the host cell, bovine papilloma virus type vectors, Saberia - Campo (Saveria-Campo), "Bovine Papilloma Virus DN
A:真核生物クローニングベクター」、第II巻、実際的アプローチ（Bovine papilomavirus DNA:a eukaryotic cl A: Eukaryotic cloning vectors ", Volume II, A Practical Approach (Bovine papilomavirus DNA: a eukaryotic cl
oning vector A practical approach）」、ディ・エヌ・エイ・クローニグ（DNA Cloning）、グローバー（Glo oning vector A practical approach) ", di-NA-Kuronigu (DNA Cloning), Grover (Glo
ver）編、アイ・アール・エル・プレス（RL Press）、 ver), ed., eye R. El Press (RL Press),
アーリントン、バージニア州、213〜238（1985）に見い出されるごときベクターに組み込むことができる。 Arlington, Virginia, can be incorporated into a vector, such as are found in 213-238 (1985).
チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞中で蛋白を発現するのに有用で好ましい発現ベクターは、各々、イー・コリ（E.coli）およびCHO細胞中でアンピシリン耐性およびジヒドロ葉酸還元酵素をマーカーとして利用する、CHOおよびイー・コリ両細胞中で複製するシャトルベクターpSVCOW7である。 Chinese preferred expression vector useful for expressing proteins in hamster ovary (CHO) cells, respectively, utilizing ampicillin resistance and dihydrofolate reductase as markers in E. coli (E. coli) and CHO cells, it is a shuttle vector pSVCOW7 which replicates in CHO and E. coli both cells. また、プラスミドpSVCOW7はCH In addition, plasmid pSVCOW7 is CH
O細胞中での発現に必要なウシ成長ホルモンからのポリＡ配列を供する。 Expression in O cells provide a poly A sequence from the bovine growth hormone required. プラスミドpSVCOW7を切断し、ウイルスプロモーターおよびcDNAを挿入する。 Plasmid pSVCOW7 is cut, inserting a viral promoter and cDNA.
昆虫細胞中で蛋白を発現するための組織体バクロウイルスを形成するのに有用な好ましい発現ベクターはpAc3 Preferred expression vectors useful for forming a tissue construct baculovirus for expressing proteins in insect cells pAc3
73である。 It is 73. スミスら（Smith,et al）、モレキュラー・ Smith et al (Smith, et al), Molecular
アンド・セリュラー・バイオロジー（Mol.Cel.Biol.） And Seryura Biology (Mol.Cel.Biol.)
3:2156〜2165（1683）。 3: 2156-2165 (1683). 該プラスミドはアンピシリン耐性を利用してイー・コリ細胞中で複製し、遺伝子の発現用バクロウイルスポリヘドリン遺伝子からの真核生物プロモターおよびポリＡシグナルを供する。 The plasmid utilizes the ampicillin resistance replicate in E. coli cells, providing a eukaryotic promoter-and poly A signal from the baculovirus polyhedrin gene for expression of the gene. プラスミドpA Plasmid pA
c373を切断し、cDNAを該プロモーターに隣接して挿入する。 c373 cleaves and inserts the cDNA adjacent to the promoter. この新しいプラスミドをリン酸カルシウム沈殿法によって、バクロウイルス（アウトグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体ウイルス）DN This new plasmid by the calcium phosphate precipitation method, baculovirus (out publicly available, (Autographa californica) nuclear polyhedrosis virus) DN
Aと共に昆虫細胞に共トランスフェクトする。 Co-transfected into insect cells along with A. 同種組換えによってcDNAを含有するpAc373ポリヘドリン遺伝子が残存するウイルスポリヘドリン遺伝子を置き換えた組換体バクロウイルスは、プローブとして32 −Ｐ−標識cDNA Recombinant baculoviruses pAc373 polyhedrin gene containing a cDNA by homologous recombination replaces the viral polyhedrin gene remaining, 32 -P- labeled cDNA as a probe
を用い、ドットブロットハイブリダイゼーション法によって検出する。 Used to be detected by dot blot hybridization method. サマーズおよびスミス（Summers and Sm Summers and Smith (Summers and Sm
ith）、バクロウイルスベクターおよび昆虫細胞培養法のマニュアル（A Manual of Methods for Baclovirus V ith), baculovirus vectors and insect cell culture method of manual (A Manual of Methods for Baclovirus V
ectors and Insect Cell Culture Procedures）、テキサスＡ＆Ｍ大学、カレッジ・ステーション（College St ectors and Insect Cell Culture Procedures), Texas A & M University, College Station (College St
ation）、テキサス州、29〜30（1986）。 ation), Texas, 29-30 (1986). cDNAのポリヘドリン遺伝子への挿入によりこの閉塞形成蛋白の合成が防止されるので、組換体バクロウイルスに感染した昆虫細胞はそれらの閉塞−陰性形態によって分化させることもできる。 Since the synthesis of this occlusion-forming protein by insertion into the polyhedrin gene in the cDNA can be prevented, insect cells infected with recombinant baculoviruses their closed - can also be differentiated by the negative form.
蛋白発現用ウシ乳頭腫ウイルス（BPV）と組み合わせる好ましい発現ベクターはpTFW9である（プラスミドpTF Preferred expression vectors combined with protein expression for bovine papilloma virus (BPV) is a PTFW9 (plasmid pTF
W9はブダペスト条約によって寄託した。 W9 was deposited by the Budapest Treaty. プラスミドpTFW Plasmid pTFW
9をイー・コリ宿主中で維持し、1986年、11月17日に米国、イリノイ州、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ To maintain a 9 in E. coli host, 1986, the United States on November 17, Illinois, Northern Regional Research
センター（Northern Regional Research Center）に寄託し、受託番号NRRL B−18141が付与された）。 Center was deposited in the (Northern Regional Research Center), accession number NRRL B-18141 has been granted). 該プラスミドはアンピシリン耐性を利用してイー・コリ中で複製し、遺伝子の発現用マウス・メタロチオネインプロモーターおよびSV40ポリアデニレーションシグナルを供する。 The plasmid utilizes the ampicillin resistance replicate in E. coli, provides a mouse metallothionein promoter and SV40 polyadenylation signal for expression of genes. プラスミドpTFW9を切断し、cDNAをプロモーターに隣接して挿入する。 Plasmid pTFW9 is cleaved and inserted adjacent the cDNA to a promoter. 次いで、この新しいプラスミドを切断してBPVの挿入を可能とする。 Then, to allow insertion of BPV cut this new plasmid. リン酸カルシウム沈殿法によって組換体を動物細胞にトランスフェクトし、形質転換した細胞のフォーカスを選択する。 Transfected recombinant in animal cells by the calcium phosphate precipitation method, selects a focus of transformed cells.
宿主細胞はコンピテントであるか、または種々の方法によってトランスフェクションのためにコスピテントとする。 Host cells are either competent or a Kosupitento for transfection by various methods. 動物細胞にDNAを導入するいくつかのよく知られた方法がある。 There are several well-known methods of introducing DNA into animal cells. これらは、リン酸カルシウム沈殿法、受容細胞とDNAを含有する細菌プロトプラストとの融合法、DNAを含有するリポソームを用いる受容細胞の処理法、および細胞へDNAを直接入れるマイクロインジェンション法を含む。 These include calcium phosphate precipitation, fusion method with bacterial protoplasts containing the recipient cells and DNA, treatment of the recipient cells with liposomes containing the DNA, and the microinjected Jen Deployment method to put the DNA directly into cells. トランスフェクトした細胞を当該分野でよく知られた方法によって培養する。 The transfected cells are cultured by methods well known in the art. 細胞培養およびウイルス学におけく生物化的方法（Biological Methods Okeku Biochemistry methods in cell culture and virological (Biological Methods
in Cell Culture and Virology）、クチラー、ドーウェン、ハッチンソン・アンド・ロス・インコーポレイテッド（Kuchler,Dowen,hutchinson and Ross,Inc.）、 in Cell Culture and Virology), Kuchira, Dowen, Hutchinson and Ross, Inc. (Kuchler, Dowen, hutchinson and Ross, Inc.),
（1977）。 (1977). よく知られた機械的または酵素的方法によって、前記真核生物発現系の１つで発現された組換体糖蛋白を宿主細胞系の破砕により生じた細胞懸濁液から単離する。 Well by known mechanical or enzymatic methods, for isolating the expressed recombinant glycoprotein from the cell suspension resulting from crushing of the host cell system in one of the eukaryotic expression systems. 細胞から分泌されるように設計した蛋白は細胞を破砕することなく培地から単離される。 Protein was designed to be secreted from the cells are isolated from the media without disruption of the cells. 糖蛋白の精製には、まず、糖蛋白に特異的に結合するレンチル・レクチンカラムに細胞質画分を適用するのが有利である。 The purification of glycoproteins, first, it is advantageous to apply the cytoplasmic fraction to a lentil lectin column that specifically binds to the glycoprotein. 次いで、溶出した糖蛋白を抗体を含有するアフィニティーカラムに適用する。 Then, the eluted glycoprotein is applied to an affinity column containing antibody.
典型的な糖蛋白は３つの領域に分けることができる。 Typical glycoprotein can be divided into three regions.
アミノ末端にはシグナル配列と呼ばれる疎水性領域がある。 The amino terminus is hydrophobic region called the signal sequence. アミノ酸のこの配列は糖蛋白を細胞膜へ輸送する暗号である。 The sequence of amino acids is a cipher for transporting glycoprotein to the cell membrane. 輸送に続き、該シグナル配列は切断によって除去される。 Following transport, the signal sequence is removed by cleavage. 該シグナル配列から下流には成熟糖蛋白の細胞外ドメインがある。 Downstream from the signal sequence is the extracellular domain of the mature glycoprotein. これは抗体に接近できるので、 This is accessible to antibody,
糖蛋白の免疫原性部分である。 It is an immunogenic portion of the glycoprotein. 糖蛋白のカルボキシ末端には、糖蛋白を細胞膜中に保持する疎水性アンカー領域がある。 The carboxy terminus of the glycoprotein is a hydrophobic anchor region for holding the glycoprotein in the cell membrane. それがアミノ末端シグナル配列およびカルボキシ末端アンカー配列をもつ点でHRSV Fは典型的な糖蛋白である。 It is HRSV F is a typical glycoprotein in that it has an amino-terminal signal sequence and carboxy terminal anchor sequence. コリンズら（Collins,et al）、PNAS81:7683〜 Collins et al. (Collins, et al), PNAS81: 7683~
7687（1984）。 7687 (1984). しかしながら、該HRSV G糖蛋白は、そのアミノ末端がシグナルおよびアンカー両領域として働くので正常でない。 However, the HRSV G glycoprotein is not normal because the amino terminus acts as a signal and anchor both regions. ウェルツら（Wertz,et al）、PNAS82: Waelz et al. (Wertz, et al), PNAS82:
4075〜4079（1985）。 4075 to 4079 (1985).
糖蛋白は細胞から周囲培地へ分泌されるように設計できる。 Glycoprotein can be designed to be secreted from the cell into the surrounding medium. これは、アンカー領域の転写前に糖蛋白の早期停止を引き起こすことによって達成される。 This is accomplished by causing the premature stop of glycoproteins before transcription of the anchor region. ラスキーら（Lasky,et al）、バイオテクノロジー（Biotechnolog Lasky, et al. (Lasky, et al), biotechnology (Biotechnolog
y）、2:527〜532（1984）。 y), 2: 527~532 (1984). 早期停止はユニバーサル翻訳ターミネーターオリゴヌクレオチドを遺伝子DNAの適当な部位に挿入することによって達成できる。 Premature stop can be achieved by inserting a universal translational terminator oligonucleotide into an appropriate site of the gene DNA. これらのオリゴヌクレオチドは商業的に入手可能である。 These oligonucleotides are commercially available. また、 Also,
早期停止はリーディングフレームを変化させ、かくして翻訳停止コドンを生じさせることによっても達成できる。 Premature stop changes the reading frame, thus can also be achieved by producing a translation stop codon.
以下に記載するキメラ糖蛋白はHRSV Gの細胞外ドメインに連結したHRSV Fのシグナルおよび細胞外ドメインよりなり、FGという。 Chimeric glycoprotein consists of signals and the extracellular domain of HRSV F linked to the extracellular domain of HRSV G described hereinafter called FG. Ｇ糖蛋白の大部分の細胞外ドメインはDdeI（ヌクレオチド位置302）およびFoKI（ヌクレオチド位置850）制限酵素部位間にわたるコーディング領域内に含まれる。 The extracellular domain of most of the G glycoprotein is contained in DdeI (nucleotide position 302) and Fok I (nucleotide position 850) coding region spanning between the restriction enzyme sites. この配列は糖蛋白のシグナル／アンカー領域についてコード付けしない。 This arrangement does not put the code for signal / anchor region of the glycoprotein. Ｆ糖蛋白の細胞外ドメインの大部分はNsiI（ヌクレオチド位置1479）制限酵素部位に先立つコーディング領域内に含まれる。 Most of the extracellular domain of F glycoprotein is contained within the coding region prior to the NsiI (nucleotide position 1479) restriction enzyme sites. この配列はシグナル領域および大部分の抗原領域についてコード付けするが、糖蛋白のアンカー領域についてはコード付けしない。 This sequence is attached coding for signal region and the majority of the antigenic region, but not with the code for the anchoring region of the glycoprotein.
Ｇ糖蛋白配列をＦ糖蛋白に挿入するには、HRSV gpGを含有するプラスミドＧ−16をDdeIおよびFoKIで消化し、 The G glycoprotein sequences to be inserted into the F glycoprotein is digested plasmid G-16 containing HRSV GPG with DdeI and Fok I,
クレノーポリメラーゼで平滑末端とする。 And blunt-ended with Klenow polymerase. 次いで、550b Then, 550b
p断片をアガロース電気泳動によって単離する。 A p-fragment isolated by agarose gel electrophoresis. HRSV gp HRSV gp
F遺伝子を含有するプラスミドpGPF−４をNsiIで消化した。 Plasmid pGPF-4 containing F gene was digested with NsiI. 末端をT4 DNAポリメラーゼで平滑とし、細菌アリカリ性ホスファターゼで脱リン酸化した。 The ends were blunt with T4 DNA polymerase, dephosphorylated with bacterial alkalis phosphatase. 次いで、Ｇ−16 Next, G-16
からの550bp断片をpGPF−４プラスミドに結び、イー・ The 550bp fragment from the knot to pGPF-4 plasmid, E.
コリHB101に形質転換した。 It was transformed into E. coli HB101. 形質転換から単離したクローンpGPFG−１の１つは、マキサム−ギルバート配列決定法により正しい結合を有することが確認される。 One of the clones PGPFG-1 was isolated from the transformants are Maxam - it is confirmed to have the correct binding by Gilbert sequencing.
真核生物発現ベクター中に正しく位置させる場合、前記FG遺伝子は、細胞表面へ輸送され、そして培地中へ分泌されるキメラ糖蛋白を発現するように設計される。 Case of correctly positioned in the eukaryotic expression vector, the FG gene is transported to the cell surface, and are designed to express a chimeric glycoprotein is secreted into the medium.
前記制限酵素部位はＦおよびＧ糖蛋白の関連領域の大部分の発現を可能とするので選択した。 The restriction enzyme sites were chosen because it allows the expression of most of the relevant regions of the F and G glycoproteins. しかしながら、 However,
糖蛋白の他の部分は、これらの遺伝子の融合についてのコーディング配列ＦおよびＧ内の他の制限酵素部位を選択することによって発現できる。 Other portions of the glycoprotein may be expressed by choosing other restriction enzyme sites within the coding sequence F and G for the fusion of these genes. 例えば、制限酵素Ale For example, restriction enzyme Ale
I、HincIIまたはHinfIを用いてgpG遺伝子の５′末端を切断できる。 I, can be cut at the 5 'end of the gpG gene using the HincII or HinfI. 制限酵素HphI、MboIIまたはXhoIIを用いて Restriction enzyme HphI, using the MboII or XhoII
gpG遺伝子の３′末端を切断できる。 Able to cleave a 3 'end of the gpG gene. 該酵素を、１つの酵素が各群からのものである２種の酵素の組合で用いて免疫原性蛋白断片を得ることができる。 The enzyme can be obtained an immunogenic protein fragments with single enzyme in combination of two enzymes are from each group. gpF遺伝子について、HinfIII、HincII、AvaII、SspIまたはHphI制限酵素をNsiIの代わりに用いることができる。 For gpF gene, it can be used HinfIII, HincII, AvaII, the SspI or HphI restriction enzymes instead of NsiI. リンカーオリゴヌクレオチドを付加して結合領域のリーディングフレームを正しくすることができる。 By adding linker oligonucleotides can be correctly reading frame of the coupling region. ２つの可能なフレームシフトを修正できる２種のオリゴヌクレオチドは商業的に入手可能なSalIリンカー Two oligonucleotides are commercially available SalI linkers that can correct the two possible frame shifts である。 It is. また、糖蛋白にアンカー領域が所望される場合、リンカーオリゴヌクレオチドを第２の結合に付加してgpFアンカーの合成を可能とする。 Also, if the anchoring region in the glycoprotein is desired, to allow synthesis of gpF anchor by addition of a linker oligonucleotide to the second coupling. 種々の配列の挿入または欠失によるFG融合蛋白の発現のために別法を設計することができる。 It is possible to design the alternative for expression of the FG fusion protein by insertion or deletion of various sequences. 蛋白についての主要な評価基準はシグナル配列および２種の糖蛋白の免疫学的に重要な領域の保持である。 Major criterion for the protein is the signal sequence and two holding the immunologically important regions of the glycoprotein.
CHO、BPV、またはバクロウイルス発現ベクターへのFG FG of CHO, BPV, or the baculovirus expression vector,
遺伝子の挿入はすでに述べた通りである。 Insertion of the gene are the same as those already mentioned.
FGキメラ糖蛋白は個々の糖蛋白の発現に利益をもたらす。 FG chimeric glycoprotein benefit expression of individual glycoproteins. FGは単一の蛋白であるから、ＦおよびＧ糖蛋白を分離するのと比較して精製労力および試薬は半分が必要なのにすぎない。 FG is because it is single protein, purification effort and reagents as compared with the separation of F and G glycoprotein only for half required. また、FGキメラ糖蛋白は培地中に分泌され、精製は容易である。 Further, FG chimeric glycoprotein is secreted into the medium, purification is easy. Ｆ糖蛋白はアンカー領域配列の前での切断によって分泌糖蛋白に設計できる。 F glycoprotein may be designed secretory glycoprotein by cleavage in front of the anchor region sequences. しかしながら、HRSV G糖蛋白はそのアミノ末端にシグナル／アンカー領域を含有する。 However, HRSV G glycoprotein contains a signal / anchor region at its amino terminus. 従って、この糖蛋白の切断により分泌形は生じない。 Therefore, there is no secretion form by cleavage of the glycoprotein. 該シグナル／アンカー領域は外来性糖蛋白からのシグナル配列で置き換えることができるが、これにより外来蛋白配列が可能なワクチンに導入されることになろう。 Although the signal / anchor region could be replaced with a signal sequence from a foreign glycoprotein, thereby it would be introduced into possible foreign protein sequences vaccine.
HRSV FおよびＧ糖蛋白は、ワクシニアウイルス発現系を用いて発現され、これらの組換体ウイルスはHRSV感染からコトンラットを保護するのにワクチンとして使用されてきた。 HRSV F and G glycoproteins are expressed using vaccinia virus expression systems, these recombinant viruses have been used as a vaccine to protect cotton rats from HRSV infection. オルムステッドら（Olmsted,et al）、PNAS8 Olmsted et al. (Olmsted, et al), PNAS8
3:7462〜7466（1986）。 3: 7462 to 7466 (1986). Ｆ糖蛋白を発現するワクシニアウイルスはかなり免疫原生であり、Ｇ糖蛋白を発現するワクシニアウイルスよりも良好な保護を与えた。 Vaccinia virus expressing the F glycoprotein is rather immunogenic, it gave a better protection than vaccinia virus expressing the G glycoprotein. オルムステッドら（Olmsted,et al）、前掲。 Olmsted et al. (Olmsted, et al), supra. 両ウイルスでのワクチン接種はＦ単独よりもすぐれた付加効果は有しないようである。 Vaccination with both viruses appears to have no additional effect superior to F alone. オルムステッドら（Olmsted,et al）、 Olmsted et al. (Olmsted, et al),
前掲。 Supra. 対照的に、分泌されたFG糖蛋白はより免疫原生で、Ｆ糖蛋白の分泌形よりも良好な保護を与える。 In contrast, secreted FG glycoprotein is more immunogenic than secreted forms of F glycoprotein provide good protection. また、FG糖蛋白でのコトンラットをワクチン接種することにより、中和比に対して、免疫酵素法によって測定してより高いパーセンテージの中和抗体が得られる。 Also, by vaccinating the cotton rats in FG glycoprotein, to neutralization ratio, a higher percentage of neutralizing antibodies can be obtained by measuring by immunoenzymatic methods.
FGおよび切形Ｆ（Ft）の免疫原生を比較する実験を企画した。 Was designed an experiment to compare the immunogenicity of FG and truncated F (Ft). 組換体糖蛋白はSDS−PAGEゲルでの電気泳動に付した蛋白のコーマシーブルー染色によって、CoA（糖蛋白に結合するレクチン）精製抽出物中に検出できなかったので（恐らくは蛋白の１％以下）、糖蛋白の等量を決定するのに間接法を用いた。 Recombinant glycoprotein by combed sea blue staining of proteins were subjected to electrophoresis on SDS-PAGE gels, CoA so could not be detected in the purified extract (lectin binds to glycoprotein) (perhaps less than 1% of protein ), it was used indirect method to determine the equivalent amount of glycoprotein. SDS−PAGEゲル上での電気泳動に付した35 Ｓ−メチオニン標識蛋白を含有するオートラジオグラフィーのデンシトメーター追跡を用いて試料中のFGおよびFtの相対量を決定した（FGおよびFtは同数のメチオニンを含有する）。 Using autoradiography densitometer tracing containing 35 S- methionine labeled proteins were subjected to electrophoresis on SDS-PAGE gels to determine the relative amounts of FG and Ft in the samples (FG and Ft is equal containing methionine). 次いで、免疫酵素法によってこれらの同一試料を検定し、本発明者らの免疫酵素法において等量のFGはFtの３倍以上反応すると測定された。 Then assayed for these same samples by immunoenzymatic method, equal amounts of FG in immunoenzymatic method of the present invention have been measured to react 3 times more Ft. 次いで、ワクチン接種用に調製した試料中のFGまたはFtの量を免疫酵素法によって測定し、前記比に従って補正した。 Then, the amount of FG or Ft in the samples prepared for vaccination was measured by immunoenzymatic method, and corrected according to the ratio. 実験群はFG、Ft（高用量）、Ft（低用量）、およびgp50（陰性対照）であった。 Experimental groups FG, Ft (high dose), was Ft (low dose), and gp50 (negative control). フロインドアジュバントにてコトンラットを、用量当たり全蛋白500 Cotton rats by Freund's adjuvant, all per dose protein 500
μｇで３回ワクチン接種した。 3 times were vaccinated with μg. FG群における特異的糖蛋白の量は低用量Ft群と等量である。 The amount of specific glycoprotein in the FG group is a low-dose Ft group and equal amounts. 高用量Ft群にはより特異的な糖蛋白を３回摂取させた。 A more specific glycoprotein is ingested three times the high dose Ft group. この実験からのデータの要約を以下に示す。 A summary of the data from this experiment are described below.
前記実験はフロインドアジュバント中のFGの粗製調製物を用いるキメラFG糖蛋白の有効性を証明するものである。 The experiment is intended to demonstrate the efficacy of the chimeric FG glycoprotein using crude preparations of FG in Freund's adjuvant. 高力価の中和抗体を誘導し、コトンラットをRSV攻撃から保護するFGの有効性を証明するために、ヒト用に許容されるアジュバント（ミョウバン）中に処方したFG Induces high titers of neutralizing antibodies, in order to demonstrate the efficacy of FG to protect cotton rats from RSV challenge was formulated in adjuvant (alum) which are acceptable for human FG
のより精製した調製物を用いて実験を行った。 Experiments were performed using purified preparations from the. カチオン交換および単クローン抗体アフィニティーカラムを含む２工程手法を用いてFGを50％の均質度まで精製した。 Was purified FG to 50% degree of homogeneity using a two step procedure comprising cation exchange and monoclonal antibody affinity column. レンチルレクチンクロマトグラフィー、続いての単クローン抗体アフィニティーカラムによってFt糖蛋白を50％均質度まで精製した。 Lentil lectin chromatography, followed by monoclonal antibody affinity column was purified Ft glycoprotein to 50% homogeneity. ミョウバン（2.5mgミョウバン／用量）に吸着したこれらの糖蛋白でコトンラットを２回ワクチン接種した。 Cotton rats were vaccinated twice with these glycoproteins adsorbed in alum (2.5 mg alum / dose). ラットの１の群を陽性対照として生RS Raw RS one of the groups of rats as a positive control
Vで鼻孔内ワクチン接種した。 And intranasal vaccinated with V. ラットの１の群を陰性対照としてミョウバン（alm）アジュバントでワクチン接種した。 The first group of rats was vaccinated with Alum (alm) adjuvant as a negative control. 各群からのラットを血清および中和抗体について試験した。 Rats from each group were tested for serum and neutralizing antibody. ラットをRSVで攻撃し、肺をウイルスについて検定した。 The rats were challenged with RSV, were assayed lungs for the virus.
チャート１〜６におけるプラスミドおよび断片を表すに用いる約束はプラスミドおよびそれらの断片の通常の環状標示と同様である。 Promise to be used in representing the plasmids and fragments in Charts 1-6 are the same as the normal circular markings plasmids and their fragments. 環状図とは異なり、チャート上の単一線図は環状および直線状二本鎖DNAを共に表わし、開始または転写は左から右（５′から３′）に起こる。 Unlike circle diagram, a single diagram on the chart represents both cyclic and linear double-stranded DNA, initiation or transcription occurring from left to right (5 'to 3'). 星印（＊）はプラスミドの環状形態を完成させるためのヌクレオチドの架橋を表す。 Asterisk (*) denotes the cross-linking of nucleotides to complete the circular form of the plasmids. 断片は星印を有しない。 Fragment does not have an asterisk. 何故ならば、それらは二本鎖DNAの直線状片だからである。 Since they are because straight piece of double-stranded DNA. エンドヌクレアーゼ制限部位は直線の上方に示す。 Endonuclease restriction sites are shown above the line. 遺伝子マーカーは直線の下方に示す。 Genetic markers shown below the line. プラスミドまたは断片を表す図表の下方に現れる棒線を用いてDNA上の２地点間の塩基対数を表す。 With bars appearing below the diagrams representing the plasmid or fragments represents a base pair between two points on the DNA. マーカー間の相対的スペースは現実の距離を表すものではなく、示したDNA配列上のそれらの相対的位置を示すだけである。 The relative spacing between markers do not represent real distance, only show their relative positions on the illustrated DNA sequence.
実施例 実施例１ Ｆ糖蛋白遺伝子からのＧ−Ｃテールの除去 Ｆ糖蛋白の最大発現を得るには、cDNAをプラスミドpB To obtain maximum expression of removal F glycoprotein G-C tails from Example Example 1 F glycoprotein gene, cDNA plasmid pB
R322に挿入するのに用いるＧ−ＣヌクレオチドをcDNAの５′末端（元のmRNAに対して）から除去しなければならない。 The G-C nucleotides used to insert the R322 must be removed from the 5 'end of the cDNA (the original mRNA). gpFGcDNAをCHO細胞、pSVCOW7（後記）についての好ましい発現ベクターに都合よく挿入するためには、蛋白コーディング配列より上流にBamHI部位を供する必要がある。 gpFGcDNA CHO cells, in order to insert conveniently in preferred expression vectors for PSVCOW7 (below), it is necessary to provide a BamHI site upstream from the protein coding sequence. これを達成するために、Ｆ糖蛋白のcDNAをpUC1 To achieve this, the cDNA of the F glycoprotein pUC1
2（PLファルマシア・ラブズ（Pharmacia Labs）、ピスカッタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）に挿入する。 2 (PL Pharmacia Labs (Pharmacia Labs), Piscataway (Piscataway), New Jersey) is inserted into. Ｆ糖蛋白についての全配列を含有するcDNAクローンF5−25の合成法は記載されている。 Synthesis of cDNA clones F5-25 containing the entire sequence for F glycoprotein have been described. コリンズら（Collins, et al）、ヒト呼吸系シンシチウムウイルスの融合（Ｆ）糖蛋白をコード付けする遺伝子のヌクレオチド配列（Nucleotide of human respiratory syncytia Collins et al. (Collins, et al), a fusion of the human respiratory syncytial virus (F) Nucleotide sequence of the gene with encodes a glycoprotein (Nucleotide of human respiratory syncytia
l virus）、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J.Viro l virus), Journal of Bairoroji (J.Viro
l.）、81:7683〜7687（1984年12月）。 l), 81:. 7683~7687 (12 May 1984).
A.pGPF2の構築−チャート１ Ｆ糖蛋白のcDNAには両側にPstI部位がある（チャート１）。 Construction of A.PGPF2 - the cDNA of the chart 1 F glycoprotein has PstI sites on both sides (Chart 1). しかしながら、内部Pst部位もある。 However, there are also internal Pst site. そこで、プラスミドpF5−25をPstIで部分的に消化し、断片１（1.9 Therefore, partially digested plasmid pF5-25 with PstI, fragment 1 (1.9
kb）をゲルから単離する。 kb) is isolated from the gel. 断片１を、予めPstIで消化したプラスミドpUC12（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Res.Lads.）、ロックビル（Rockvill The fragment 1, plasmid pUC12 previously digested with PstI (Bethesda Research Laboratories (Bethesda Res.Lads.), Rockville (Rockvill
e）、ミシガン州）に結ぶ。 e), it ties in Michigan). pUC12中のXbaI部位に隣接するgpF遺伝子の５′末端をもつプラスミドを選択し、pGP Plasmid select with the 5 'end of the gpF gene adjacent to the XbaI site in pUC12, pGP
F2（4.6kb）と命名する。 Designated as F2 (4.6kb). この向きを、ほぼ400bpの断片を生じるNsiIおよびHindIIIでの切断によって確認する。 This orientation is verified by cleavage with NsiI and HindIII resulting in a fragment of approximately 400 bp.
B.pGPF3およびpGPF4の構築−チャート２ cDNAの５′末端からＧ−Ｃヌクレオチドを除去するために、pGPF2をXbaIで開き、細菌アルカリ性ホスファターゼで端部を処理して断片３を得る。 B.pGPF3 and construction of PGPF4 - from the 5 'end of the chart 2 cDNA to remove G-C nucleotides, open the pGPF2 with XbaI, to obtain a fragment 3 by processing the ends with bacterial alkaline phosphatase. 次いで、XbaIおよびPstI部位間で小片を切断除去するSalIで断片３を処理し、クレノー酵素で処理して平滑末端とする。 Then treated fragment 3 with SalI which cuts removing pieces between XbaI and PstI sites, and blunt by treatment with Klenow enzyme. クレノー酵素での処理の後、５′ホスフェートが必要で、３′突出末端を残すラムダエキソヌクレアーゼで断片３を消化する。 After treatment with Klenow enzyme, 5 'phosphate is required, 3' digestion fragment 3 lambda exonuclease leaving a protruding end. gpFの上流の端部での５′ホスフェートの除去のため、該エキソヌクレアーゼはgpF配列に向けて下流を消化するであろう。 For 5 'removal of the phosphate in the upstream end of the GPF, the exonuclease will digest downstream toward the GPF sequence. G/Cテール領域を越えてリーダー配列までヌクレオチドを除去させるため該エキソヌクレアーゼに充分な時間を与える。 Beyond G / C tail region provides sufficient time for the exonuclease in order to remove the nucleotide to leader sequence. リーダー配列の最初の15塩基対を含有する合成配列を断片３にハイブリダイズさせ、失った塩基をクレノー酵素で満たし、T4リガーゼで端部を結んでpGPF3（4.6kb）を得、これをイー・コリに形質転換し、その配列を確認する。 The synthetic sequence containing the first 15 base pairs of the leader sequence is hybridized to fragment 3, filled lost base with Klenow enzyme to give a pGPF3 (4.6kb) by connecting the ends with T4 ligase, this E. It was transformed into E. coli, to confirm the sequence.
cDNAの３′末端からＧ−Ｃヌクレオチドを除去するために、pGPF3をHindIIIで開き、Ｇ−Ｃヌクレオチド全体を消化するのに充分な時間エキソヌクレアーゼBal 31で処理する。 To remove the G-C nucleotides from the 3 'end of the cDNA, open the pGPF3 with HindIII, treated with sufficient time exonuclease Bal 31 to digest the entire G-C nucleotides. クレノー酵素で末端を平滑とし、BamHIでの消化によってベクターDNAからcDNAクローンを遊離する。 The ends were blunt with Klenow enzyme to liberate a cDNA clone from the vector DNA by digestion with BamHI. 該cDNA断片をゲルから単離し、予めBamHIおよびHin Isolated the cDNA fragment from the gel, previously BamHI and Hin
cII（HincIIは平滑末端に適合する）で消化したプラスミドpUC12に結んでpGPF4を得る。 cII (HincII is compatible with blunt ends) to obtain the pGPF4 tied into plasmid pUC12 that had been digested with. 該プラスミドをイー・ E. The plasmid
コリに形質転換し、Bal31で充分に消化した適当なクローンを配列決定法によって同定する。 Transformed into E. coli, identified by appropriate clones sequencing methods was sufficiently digested with Bal31. 別法として、Ｇ− Alternatively, G-
Ｃヌクレオチドから上流に唯一の部位を有する制限酵素で消化することによってＧ−Ｃヌクレオチドを除去することもできる。 It is also possible to remove the G-C nucleotides by digestion with restriction enzyme having a unique site from C nucleotides upstream. gpFについては、かかる酵素はHaeIIIである。 For gpF, such an enzyme is HaeIII. HaeIIIはＦ遺伝子の通常の翻訳停止シグナルより上流を切断するので、HaeIIIでの消化の後に、ユニバーサル翻訳停止オリゴヌクレオチド（ニューイングランド・バイオラブズ（New England Biolabs））をF cDNAに結ぶ。 Since HaeIII cleaves upstream from the normal translational stop signals of F gene, after digestion with HaeIII, connecting the universal translation termination oligonucleotide (New England Biolabs (New England Biolabs)) to F cDNA. 次いで、該DNAをBamHIで処理し、pPGF−４を精製させるについて前記したごとくに処理する。 Then the DNA was treated with BamHI, treating the as described above for thereby purifying PPGF-4.
実施例2 HRSVキメラFG糖蛋白遺伝子の構築−チャート３ HRSV G糖蛋白についての全コーディング領域を含有するクローンG2B−13は記載されている（ウェルツら（Wer Example 2 Construction of HRSV Chimeric FG Glycoprotein Gene - Chart 3 clone G2B-13 containing the entire coding region for HRSV G glycoprotein has been described (Waelz et al (Wer
tz,et al）、ヒト呼吸系シンシチウムウイルスＧ蛋白遺伝子のヌクレオチド配列はウイルス膜蛋白の異常タイプを明らかにする（Nucleotide sequence of the G prote tz, et al), nucleotide sequence of the human respiratory syncytial virus G protein gene reveals an abnormal type of viral membrane protein (Nucleotide sequence of the G prote
in gene of human respiratory synsytial virus revea in gene of human respiratory synsytial virus revea
ls an unusual type of viral membrane protein）、PN ls an unusual type of viral membrane protein), PN
AS、82:4075〜4079（198））。 AS, 82: 4075~4079 (198)). Ｇ糖蛋白cDNAを含有するクローンG2B−16をDdeIおよびFoKIで消化し、イー・コリDNAポリメラーゼ（クレノー断片）で平滑末端とする。 Clone G2B-16 containing the G glycoprotein cDNA is digested with DdeI and Fok I, and blunt ended with E. coli DNA polymerase (Klenow fragment). 次いで、該DNAを1.5％アガロースゲルでの電気泳動に付す。 Then, subjecting the DNA to electrophoresis in 1.5% agarose gel. Ｇ遺伝子の関連領域を含有する550bp断片（断片４）をゲルから切り出し、該DNAをアガロースから精製する。 550bp fragment containing the relevant region of the G gene (fragment 4) was excised from the gel and purified the DNA from the agarose.
BG cDNA断片のHRSV F糖蛋白遺伝子への挿入 プラスミドpGPF4（チャート２）をNsiIで消化する。 BG cDNA fragment HRSV F sugar insertion plasmid into protein gene pGPF4 (the chart 2) digested with NsiI. T T
4DNAポリメラーゼで平滑末端とし、次いで、細菌アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化する。 Blunted with 4DNA polymerase I, and then dephosphorylated with bacterial alkaline phosphatase. 次いで、G cDNA Then, G cDNA
の550bp断片をプラスミドpGPF4に結んでキメラFG遺伝子（pGPFG−１）を得る。 Obtaining a chimeric FG gene (pGPFG-1) of 550bp fragment tied to plasmid PGPF4. 該プラスミドをイー・コリHB101 E. coli HB101 and the plasmid
に形質転換する。 Transformed into. クローンを単離し、875bpおよび186bp Clones were isolated, 875bp and 186bp
の結合断片を生じるHinfIでの消化によってＦ遺伝子内のGcDNAの正しい向きについて選択する。 Selected for the correct orientation of GcDNA in F gene by digestion with HinfI to produce a binding fragment. 正しい向きのＧ断片により、HinfI消化に際し、650bpおよび400bpの結合断片が生じるであろう。 The correct orientation of the G fragment, upon HinfI digestion would bind fragments of 650bp and 400bp occurs. 次いで、適当な向きのクローンの結合領域をマキサム−ギルバート配列決定法によって正しいことを確認する。 Then, the binding region of the appropriate orientation of the clone Maxam - to ensure that the correct by Gilbert sequencing.
前記実施例により、Ｇ糖蛋白の免疫原生領域に結合したＦ糖蛋白のシグナルおよび免疫原生領域を含有するキメラ糖蛋白についてコード付けする遺伝子が生じる。 By the examples, genes with coding for chimeric glycoprotein containing the signal and immunogenic region of the F glycoprotein linked to the immunogenic region of the G glycoprotein may occur. 第２の結合（ＧからＦ）はフレームシフトおよび翻訳停止を引き起こすので、糖蛋白中にはアンカー領域は存在しないであろう。 Since the second coupling (F from G) causes a frameshift and translational stop, during glycoprotein would not anchor region exists.
実施例3 HRSVキメラFG糖蛋白のリーディングブレームを調節するためのDNAオリゴヌクレオチドリンカーの使用−チャート４ もし実施例２で示した以外の制限酵素をＦおよびＧ遺伝子を連結させるのに用いるならば、ＦおよびＧ間の第１の結合でフレームシフトが生じ、糖蛋白の初期の翻訳停止となりかねない。 If using restriction enzymes other than those shown in Chart 4 If Example 2 to link the F and G genes, - Example 3 Using DNA oligonucleotide linkers for adjusting the leading blade beam of HRSV chimeric FG glycoprotein frameshift occurs at a first bond between F and G, it could be the initial translational stop glycoprotein. これは、正しいリーディングフレームを保持するオリゴヌクレオチドリンカーを用いることによって克服できる。 This can be overcome by using oligonucleotide linkers which retain the correct reading frame.
A.HRSV G糖蛋白遺伝子の調製 Ｇ糖蛋白cDNAを含有するクローンプラスミドG2B−16 Clone plasmid G2B-16 containing the G glycoprotein cDNA preparation of A.HRSV G glycoprotein gene
をHphIで消化し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端とする。 It was digested with HphI, and blunt-ended with T4 DNA polymerase.
（ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England (New England Biolabs (New England
Biolabs））をDNAの末端に結ぶ。 Connecting Biolabs)) to the end of the DNA. 該DNAをSalIで消化し、1.5％アガロース電気泳動に付す。 The DNA was digested with SalI, subjected to 1.5% agarose electrophoresis. Ｇ遺伝子の関連領域を含有する410bp断片（断片５）をゲルから切り出し、該DNAをアガロースから精製する。 410bp fragment containing the relevant region of the G gene (fragment 5) was excised from the gel and purified the DNA from the agarose.
BG cDNA断片のHRSV F糖蛋白遺伝子への挿入 プラスミドpGPF4をNsiIで消化し、T4 DNAポリメラーゼで末端を平滑とする。 The insertion plasmid pGPF4 to HRSV F glycoprotein gene BG cDNA fragment was digested with NsiI, and blunt-ended with T4 DNA polymerase. 前記で示したSalIリンカーをpG pG a SalI linker shown by the
PF4DNAの末端に結ぶ。 Tie at the end of the PF4DNA. 該DNAをSalIで消化し、１％アガロース電気泳動に付す。 The DNA was digested with SalI, subjected to 1% agarose electrophoresis. 4.4kb断片をゲルから切り出し、該DNAをアガロースから精製する。 The 4.4kb fragment was excised from the gel and purified the DNA from the agarose. 該4.4kbp GPF4 D The 4.4kbp GPF4 D
NA断片および410bp G断片を一緒に結んでpGPFG−２を形成し、イー・コリHB101に形質転換する。 By connecting the NA fragment and 410 bp G fragment together form a pGPFG-2, transformed into E. coli HB101. クローンを単離し、768bpおよび220bpの結合断片を生じるHinfIでの切断によってＦ遺伝子内のG cDNAの正しい向きについて選択する。 Clones are isolated and selected for the correct orientation of the G cDNA within the F gene by digestion with HinfI to produce a binding fragment of 768bp and 220 bp. Ｆ断片の正しくない向きにより、HinfI消化に際して555bpおよび430bpの結合断片を生じるであろう。 The incorrect orientation of the F fragment will result in a binding fragment of 555bp and 430bp upon HinfI digestion. 次いで、このクローンの結合断片をマキサム−ギルバート配列決定法によって正しいことを確認する。 Then, a binding fragment of this clone Maxam - to ensure that the correct by Gilbert sequencing.
前記実施例により、実施例２におけると同様のキメラ By the examples, the same chimeric as in Example 2
FG糖蛋白についてコード付けする遺伝子が生じる。 Gene with encodes the FG glycoprotein occurs. 本実施例で生じるキメラ糖蛋白は実施例２で生じたキメラよりもＧ糖蛋白の免疫原生領域が少ない。 Chimeric glycoprotein generated in this example are less immunogenic regions of the G glycoprotein than the chimeric generated in Example 2. ２の糖蛋白の他の領域を含有するキメラ糖蛋白は「詳細な記載」の節にリストした酵素を用いて実施例２および３に記載したごとくに生成させることができる。 Chimeric sugar containing other regions of the second glycoprotein protein can be produced as described in Example 2 and 3 using the enzymes listed in the section "detailed description".
実施例4 種々の長さのキメラFG糖蛋白についてコード付けする遺伝子を生成するためのDNAオリゴヌクレオチドの使用−チャート５ ＦおよびＧ糖蛋白の種々の領域を含有するキメラFG糖蛋白についてコード付けする遺伝子は制限酵素およびオリゴヌクレオチドの組合せを用いることによって生成できる。 To attach code for chimeric FG glycoprotein containing various regions of the chart 5 F and G glycoproteins - DNA using oligonucleotides to generate genes with coding for chimeric FG glycoprotein of Example 4 different lengths genes can be produced by using a combination of restriction enzymes and oligonucleotides. この手法により、ＦおよびＧ糖蛋白をそれらのアミノ酸骨格のいずれの所望の地点において連結することも可能となり、同様に、宿主免疫系によって認識されるエピトープを含有させるための領域の組み込みまたは除去が可能となる。 This approach, it becomes possible to connect the F and G glycoprotein at a desired point in any of their amino acid backbone Similarly, incorporation or removal of regions for incorporating epitopes recognized by the host immune system It can become. 所望ならば、個々のアミノ酸を変化させることもできる。 If desired, it is also possible to vary the individual amino acids. オリゴヌクレオチドは所望連結地点から都合よい制限酵素部位までのDNA配列に対応させて合成する。 Oligonucleotides synthesized to correspond to DNA sequences of up to convenient restriction enzyme site from the desired connection point. 糖蛋白遺伝子をその制限酵素で消化し、オリゴヌクレオチドを該制限酵素部位で遺伝子に結んで所望の長さのDNA断片を得る。 It was digested glycoprotein gene in that restriction enzyme to obtain a DNA fragment of a desired length by connecting the gene oligonucleotides with said restriction enzyme site. 容易に結べるように末端を制限酵素に適合させてオリゴヌクレオチドを合成する。 Easily ensue adapt terminal restriction enzyme to synthesize oligonucleotides.
A.HRSV F糖蛋白遺伝子の調製 プラスミドpGPF4をNsiIで消化し、オリゴヌクレオチド１（cDNAヌクレオチド1483〜1519）またはオリゴヌクレオチド１および２の混合物いずれかに結ぶ。 Preparation plasmid pGPF4 of A.HRSV F glycoprotein gene was digested with NsiI, connecting either oligonucleotide 1 (cDNA nucleotides 1483 to 1519) or a mixture of oligonucleotides 1 and 2. オリゴヌクレオチド１および２（cDNAオリゴヌクレオチド1483〜 Oligonucleotides 1 and 2 (cDNA oligonucleotide 1483～
1564）はキメラ遺伝子に組み込まれた糖蛋白F DNAを、 1564) is a glycoprotein F DNA incorporated into the chimeric gene,
Ｆ糖蛋白のアンカーコーディング領域のすぐ前のDNA配列まで延長する。 Extend to just before the DNA sequence of the anchor coding region of F glycoprotein. これらの２のオリゴヌクレオチドにおけるDNA配列は、さらに、Ｆ糖蛋白で見い出されるエピトープについてコード付けし得る。 DNA sequences in these 2 oligonucleotides may additionally attach the code for epitopes found in F glycoprotein. 括弧は、末端オリゴヌクレオチドであると仮定した場合に包含されるオリゴヌクレオチド１の３′末端上のヌクレオチドを囲ったものである。 Parentheses are those enclosed end 3 of oligonucleotides 1 encompassed by assuming an oligonucleotide 'terminus on the nucleotide. 示したヌクレオチドはHindIII制限酵素部位についてコード付けする。 Shows nucleotide is attached coding for HindIII restriction enzyme site. もしオリゴヌクレオチド２も包含されるならば、オリゴヌクレオチド１上の示したヌクレオチドは排除されてオリゴヌクレオチド１の３′末端とオリゴヌクレオチド２の５′末端とを結ぶのが可能となる。 If if Oligonucleotide 2 are included, it is possible that the nucleotides indicated on the oligonucleotide 1 are excluded connecting the terminal oligonucleotide 3 nucleotides 1 5 'end of an oligonucleotide 2'. また、オリゴヌクレオチド２の３′末端はHind Further, the 3 'end of the oligonucleotide 2 Hind
III部位を含有する。 Containing III site.
オリゴヌクレオチドを結んだ後、該DNAをHindIII（Ｆ After connecting the oligonucleotide, the DNA of the HindIII (F
遺伝子の３′末端のオリゴヌクレオチドおよびpUC12プラスミドのポリリンカー領域におけるHindIII部位）で消化し、該プラスミドを再度結ぶ。 It was digested with HindIII site) at the oligonucleotide and pUC12 plasmid polylinker region 3 'end of the gene, connecting the plasmid again. 該DNAをイー・コリH Yee said DNA · coli H
B101に形質転換し、Ｆ遺伝子に連結したオリゴヌクレオチドを含有するクローンを単離する（pGPF5）。 Transformed into B101, isolate clones containing the oligonucleotides linked to the F gene (pGPF5). 該クローンにおけるオリゴヌクレオチドの存在は該クローンと The presence of the oligonucleotide in the clones and the clones
32 Ｐ−標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションによって確認できる。 32 P- can be confirmed by labeled oligonucleotide hybridization.
B.糖蛋白G cDNAのＦ糖蛋白遺伝子への挿入 クローンG2B−16をHinfIおよびXhoIIで消化する。 Insert Clone G2B-16 to F glycoprotein genes of B. glycoprotein G cDNA is digested with HinfI and XhoII. ヌクレオチド位置377ないし654からのcDNA領域を表す277b 277b representing the cDNA region from nucleotide position 377 to 654
p断片をゲル精製する。 A p-fragment is gel-purified. 続いて、G cDNAの隣接領域を表すオリゴヌクレオチドをＧ断片の各末端に結ぶ。 Subsequently, connecting the oligonucleotides representing the adjacent regions of the G cDNA into each end of the G fragment. これらのオリゴヌクレオチドにおけるDNA配列は、さらに、Ｇ DNA sequences in these oligonucleotides may additionally, G
糖蛋白で見い出されるエピトープについてコード付けし得る。 It may attach code for epitopes found in glycoproteins. 個々のオリゴヌクレオチドを唯一のエピトープを含有し得る領域を組み込むよう設計した。 It was designed to incorporate regions which may contain unique epitopes individual oligonucleotides. G cDNAの５′ 5 of the G cDNA '
末端に結んだオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド３（cDNAヌクレオチド297〜377）またはオリゴヌクレオチド４（cDNAオリゴヌクレオチド213〜377）に連結したオリゴヌクレオチド３いずれかよりなり得る。 Connecting the terminal oligonucleotide can be more either oligonucleotide 3 linked to oligonucleotide 3 (cDNA nucleotides 297-377) or oligonucleotide 4 (cDNA oligonucleotide 213-377). G cDNAの３末端に結んだオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド５（cDNAヌクレオチド654〜714）、オリゴヌクレオチド５−６（cDNAヌクレオチド654〜774）、オリゴヌクレオチド５−６−７（cDNAヌクレオチド654〜843）、またはオリゴヌクレオチド５−６−７−８（cDNAヌクレオチド654〜912）よりなり得る。 G connecting it oligonucleotide 3 'end of the cDNA oligonucleotides 5 (cDNA nucleotides 654-714), oligonucleotides 5-6 (cDNA nucleotides 654-774), oligonucleotides 5-6-7 (cDNA nucleotides 654-843), or it may consist of oligonucleotides 5-6-7-8 (cDNA nucleotides 654-912). 括弧は、末端オリゴヌクレオチドのみに包含されるヌクレオチドを囲む。 Brackets enclose the nucleotide encompassed only terminal oligonucleotide. 例えば、 For example,
囲んだヌクレオチドはもしオリゴヌクレオチド６が付加されるならばオリゴヌクレオチド５には包含されない。 Enclosed nucleotides are not included in the oligonucleotide 5 if oligonucleotide 6 is added.
これらの囲んだヌクレオチドはHindIII部位についてコード付けし、オリゴヌクレオチド５、６、７、および８ These enclosed nucleotides attach code for a HindIII site, oligonucleotides 5, 6, 7, and 8
の場合は転写停止コドンについてコード付けする。 For it is attached coding for transcription termination codon. 囲んだヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの適合末端間で結ぶのを可能とするためにさらなるオリゴヌクレオチドを付加する場合は包含されない。 Enclosed nucleotides case of adding additional oligonucleotides to allow tie between compatible end of the oligonucleotide is not included. 例えば、オリゴヌクレオチド３の５′末端は、括弧で囲まれたヌクレオチドがオリゴヌクレオチド３に包含されない場合はオリゴヌクレオチド４の３′末端に適合する。 For example, 5 of the oligonucleotide 3 'end, if the nucleotides enclosed by parentheses are not included in oligonucleotide 3 3 oligonucleotide 4' conforms to end.
オリゴヌクレオチドをG cDNA断片に結ぶのに続き、該 Following tie oligonucleotides to G cDNA fragment, the
DNAをHindIIIで消化し、拡大されたG cDNA断片（断片７）をゲル精製する。 DNA was digested with HindIII, enlarged G cDNA fragment (fragment 7) is gel purified. 次いで、新しいG cDNA断片を、予めHindIIIで消化した本実施例のＡ節で調製したＦクローン（pGPF−５）に結ぶ。 Then, a new G cDNA fragment, linking to the F clone prepared in section A of this example previously digested with HindIII (pGPF-5). 該DNAをイー・コリHB01に形質転換し、Ｆ遺伝子内に正しい向きのＧ遺伝子を含有するクローンを単離する（pGPFG−３）。 Transforming the DNA into E. coli HB01, to isolate clones containing the G gene of the correct orientation within the F gene (pGPFG-3). 向きは適当な制限酵素での消化によって決定する。 Orientation determined by digestion with appropriate restriction enzymes. キメラ遺伝子の新しく合成した領域をマキサム−ギルバート配列決定法によって正しいことを確認する。 The newly synthesized regions of the chimeric gene Maxam - to ensure that the correct by Gilbert sequencing. 次いで、該クローンを以下に記載するごとくに種々の発現ベクターに入れる。 Then, placed in various expression vectors as described the cloning below.
C.オリゴヌクレオチド類 C. oligonucleotides 実施例5 アンカー領域を含有するHRSVキメラFG糖蛋白遺伝子の構築 実施例２、３および４はアンカー領域を含まず、したがって発現細胞の培地に分泌されるキメラFG糖蛋白についてコード付けする遺伝子の合成を説明するものである。 Synthesis Gene Construction Examples 2, 3 and 4 of the HRSV chimeric FG glycoprotein gene containing the Example 5 anchoring region does not contain an anchor region, thus to attach coding for chimeric FG glycoprotein that is secreted into the medium of expressing cells it is intended to describe. アンカー領域を含有するキメラFG糖蛋白についてコード付けする遺伝子は合成できる。 Genes with coding for chimeric FG glycoprotein containing an anchor region can be synthesized. アンカー領域はほとんどのウイルス糖蛋白と同様にキメラ糖蛋白の細胞膜中への保持を引き起こす。 Anchor region as well as most viruses glycoprotein cause retention of the chimeric glycoprotein to the cell membrane. アンカー領域は、ＦおよびＧ両糖蛋白からのキメラ分子の免疫原生領域が細胞外流体に突き出るように、糖蛋白のカルボキシ末端上に位置させ得る。 Anchor region, immunogenic regions of the chimeric molecule from F and G both glycoprotein is to project the extracellular fluid can be located on the carboxy terminus of the glycoprotein. 後記する遺伝子は、アミノ末端からカルボキシ末端にかけてHRSV Fの細胞外領域、HRSV Gの細胞外領域、 Gene described below is the extracellular region of HRSV F from the amino terminus to carboxy terminus, the extracellular region of HRSV G,
およびHRSV Fのアンカー領域の順序のそれらの領域からなるキメラー糖蛋白についてコード付けする。 And HRSV F is attached coding for Kimera glycoprotein consisting of areas of the order of the anchor region of.
AG cDNA断片のHRSV F糖蛋白遺伝子への挿入 クローンG2B−16をDdeIおよびFoKIで消化する。 Insert Clone G2B-16 to HRSV F glycoprotein gene AG cDNA fragment is digested with DdeI and Fok I. 次いで、以下のオリゴヌクレオチド： Then, the following oligonucleotides: を該DNAの末端に結ぶ、結ぶのに続き、該DNAをNsiIで消化し、G cDNAの550bp断片（断片８）をゲル精製する。 The tie the ends of the DNA, followed tie, the DNA was digested with NsiI, G cDNA of 550bp fragment (fragment 8) is gel purified.
次いで、該550bp断片をNsiI消化のpGPF4に結ぶ。 Then, connecting the 550bp fragment pGPF4 the NsiI digestion. 該DNA The DNA
をイー・コリHB101に形質転換する。 Be transformed into E. coli HB101. クローンを単離し、実施例２記載したごとくに正しい向きについて選択する。 Clones are isolated and selected for the correct orientation as described in Example 2. 次いで、適当な向きのクローンの結合領域をマキサム−ギルバート配列決定法によって正しいことを確認する。 Then, the binding region of the appropriate orientation of the clone Maxam - to ensure that the correct by Gilbert sequencing. このクローン（pGPFG−４）は以下に記載するごとく種々の発現ベクターに入れることができる。 This clone (pGPFG-4) may be placed in various expression vectors as described below.
実施例6 HRSVキメラGF糖蛋白遺伝子の構築 HRSV F糖蛋白の細胞外領域の一部をＧ糖蛋白のカルボキシ末端に位置させることができる。 It is possible to position the portion of the extracellular region of construct HRSV F glycoprotein of Example 6 HRSV Chimeric GF Glycoprotein Gene the carboxy terminus of the G glycoprotein. このキメラ糖蛋白はアミノ末端からカルボキシ末端にかけてＧのアミノ末端からのシグナル／アンカー領域、Ｇの細胞外領域の大部分、およびＦの細胞外領域の順序のそれらの領域からなる。 This chimeric glycoprotein consisting of the region of the sequence of the extracellular region of most, and F of the signal / anchor region, extracellular region of G from the amino terminus of G toward the carboxy terminus from the amino terminus.
A.HRSV G糖蛋白遺伝子の調製−チャート７ 発現用のクローンG2B−16を調製するには、cDNAクローニングで用いたＧ−Ｃテールを除去し、適合する制限酵素部位をその末端に位置させなければならない。 Preparation of A.HRSV G glycoprotein gene - To prepare clone G2B-16 for chart 7 expression removes the G-C tails used in cDNA cloning, not to position the compatible restriction enzyme sites at their ends shall. クローンG2B−16をNlaIIIおよびFoKIで消化する。 Clone G2B-16 is digested with NlaIII and Fok I. N1aIIIはc N1aIII is c
DNA遺伝子配列の位置18で切断し、FoKIは位置846で切断する。 Cut at a position 18 of the DNA gene sequence, Fok I cleaves at position 846. 次いで、以下のオリゴヌクレオチド： Then, the following oligonucleotides: を該cDNA断片に結ぶ。 The connecting to the cDNA fragment. オリゴヌクレオチド11をNlaIII部位に結び、該cDNA断片の５′末端上にBamHI制限酵素部位を生じる。 Conclusion The oligonucleotides 11 to NlaIII site, produces a BamHI restriction enzyme site on the 5 'end of the cDNA fragment. オリゴヌクレオチドをFoKIに結んでcDNA断片の３′末端にSalI制限酵素部位を生じる。 Causing SalI restriction enzyme site at the 3 'end of the cDNA fragment by connecting the oligonucleotide to the Fok I. 該DNAを1.5 The DNA 1.5
％アガロースゲルにて電気泳動に付す。 Subjected to electrophoresis in% agarose gel. 850bp GcDNA断片（断片９）をゲルから切り出し、該DNAをアガロースから精製する。 850 bp GcDNA excised fragment (fragment 9) from the gel, to purify the DNA from the agarose. 次いで、G cDNAを、予めBamHIおよびSal Then, the G cDNA, previously BamHI and Sal
Iで消化したpUC12に結んだpGPG−１を得る。 Get the pGPG-1 that connects to pUC12 that had been digested with I. 該プラスミドをイー・コリHB101に形質転換し、プラスミドDNAを単離する。 The plasmid was transformed into E. coli HB101, to isolate plasmid DNA.
BF cDNA断片のHRSV G糖蛋白遺伝子への挿入−チャート８ クローンF5−25をXhoIIおよびNsiIで消化する。 Insertion into HRSV G glycoprotein gene BF cDNA fragment - the chart 8 clones F5-25 is digested with XhoII and NsiI. XhoII XhoII
はF cDNA遺伝子配列の位置446を切断し、NsiIは位置148 Cleaves the position 446 of the F cDNA gene sequence, NsiI position 148
3を切断する。 3 to cut. 次いで、以下のオリゴヌクレオチド： Then, the following oligonucleotides: を該DNA断片に結ぶ。 The tie to the DNA fragment. オリゴヌクレオチド13をXhoII部位に結ぶと、該cDNA断片の５′末端にSalI制限酵素部位を生じる。 When connecting the oligonucleotides 13 to XhoII site, resulting in SalI restriction enzyme sites on the 5 'end of the cDNA fragment. オリゴヌクレオチド14をNsiI部位に結ぶと該cD The When connecting the oligonucleotides 14 to NsiI site cD
NA断片の３′末端にSalI制限酵素部位および翻訳停止コドンを生じる。 Causing SalI restriction enzyme sites and a translation stop codon at the 3 'end of the NA fragments. 次いで、該DNAをSalIで消化し、960bp F Then digested the DNA with SalI, 960 bp F
cDNA断片（断片10）をゲル精製する。 cDNA fragment (fragment 10) is gel-purified. 次いで、F cDNA Then, F cDNA
断片を、SalIで消化したpGPG−１に結ぶ。 The fragment, connecting to Pgpg-1 digested with SalI. 該プラスミドをイー・コリHB101に形質転換する。 Transforming the plasmid into E. coli HB101. クローンを単離し、1.8kb断片を生じるBamHIおよびNsiIでの消化によってＧ遺伝子内のF cDNAの正しい向きについて選択する。 Clones are isolated and selected for the correct orientation of the F cDNA within the G gene by digestion with BamHI and NsiI resulting in 1.8kb fragment.
正しい向きにより、850bp断片が生成する。 With the correct orientation, 850bp fragment is generated. 次いで、適当な向きのクローンの結合領域をマキサム−ギルバート配列決定法によって正しいことを確認する。 Then, the binding region of the appropriate orientation of the clone Maxam - to ensure that the correct by Gilbert sequencing. このクローン（PGPGF−１）は以下に記載するごとく種々の発現ベクターに入れることができる。 This clone (PGPGF-1) can be placed in various expression vectors as described below.
実施例7 CHO細胞におけるHRSVのキメラFG糖蛋白の発現 A.pSVCOW7の構築 （アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から入手可能であるか、またはエス・サブラマニら（S.Subramani,et a Example 7 Construction of expression of the chimeric FG glycoprotein HRSV in CHO cells A.PSVCOW7 (are available from the American Type Culture Collection (American Type Culture Collection), or S. Saburamani et al (S.Subramani, et a
l）、「シミアンウイルス40におけるマウス・ジヒドロ葉酸還元酵素相補的デオキシリボ核酸の発現（Expressi l), "mouse dihydrofolate in simian virus 40 reductase complementary deoxyribonucleic acid expression of (Expressi
on of the Mouse Dihydrofolate Reductase Complement on of the Mouse Dihydrofolate Reductase Complement
ary Deoxyribonucleic Acid in Simian Virus 40）」、 ary Deoxyribonucleic Acid in Simian Virus 40) ",
モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Mo Molecular-and-Seryura Biology (Mo
lecular and Cellular Biology）、2:854〜864（1981年９月）の手法に従って調製される）出発プラスミドpSV2 lecular and Cellular Biology), 2: 854~864 (prepared according to the procedure of September 1981)) starting plasmid pSV2
dhfrをBamHIおよびEcoRIで消化して、アンピシリン耐性遺伝子、SV40複製開始点、およびdhfr遺伝子を含有する The dhfr was digested with BamHI and EcoRI, ampicillin resistance genes, SV40 origin of replication, and containing dhfr gene
5.0kb断片を得る。 Get a 5.0kb fragment. pSV2dhfrを切断してゲノミック・ウシ成長ホルモン遺伝子、すなわちBGH gDNAの３′末端を含有する2.1kb断片を得るのに用いたのと同一の制限エンドヌクレアーゼで消化したプラスミドｐλGH2R2からp Genomic bovine growth hormone gene was cut pSV2dhfr, i.e. p from plasmid pλGH2R2 digested with the same restriction endonucleases to that used to obtain 2.1kb fragment containing the 3 'end of the BGH gDNA
SVCOW7の第２の部分を得る。 Obtaining a second portion of SVCOW7. プラスミドｐλGH2R2は、 Plasmid pλGH2R2 is,
イリノイ州、ペオリアのノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリーズ（Northern Regional Research L Illinois, Northern Regional Research Laboratories, Peoria (Northern Regional Research L
aboratories）に寄託された（NRRL B−15154）イー・コリHB101宿主から公に入手可能である。 Deposited with aboratories) (NRRL B-15154) is from E. coli HB101 host publicly available. 該5.0kg断片および該2.1kg断片を結んでpSVCOW7（7.1kb）を得る。 Obtaining pSVCOW7 (7.1kb) by connecting said 5.0kg fragment and the 2.1kg fragments.
B.pGPFG−IE−PAの構築 実施例２〜６で構築した遺伝子はCHO細胞でのキメラ糖蛋白の発現に用いることができる。 Gene constructed in Construction Examples 2-6 of B.pGPFG-IE-PA can be used for expression of the chimeric glycoprotein in CHO cells. プラスミドpGPFG Plasmid pGPFG
−１を以下の実施例で用いる。 -1 used in the following examples. 特に断りのない限り、他のキメラ遺伝子はpGPFG−１について記載したごとくに処理する。 Unless otherwise noted, other chimeric genes are treated as described for pGPFG-1. ２工程にてpGPFG−IE−PAの構築体を得る。 Obtaining a construct of pGPFG-IE-PA by 2 steps.
まず、pGPFG1からのgpFGcDNAをpSVCOW7に挿入してpGPFG First, pGPFG by inserting the gpFGcDNA from pGPFG1 to pSVCOW7
−PAを得、次いで、サイトメガロウイルスの即時型プロモーターを挿入してHRSV−様蛋白の転写を開始させてpG To obtain a -PA, then, to initiate the transcription of the inserted to HRSV- like protein the immediate early promoter of cytomegalovirus and pG
PFG−IEPAを得る。 Get the PFG-IEPA.
工程1.プラスミドpSVCOW7をEcoRIおよびPvuIIで切断し、BGH遺伝子の３′のほとんどのエクソンのPvuII部位から３′末端の下流のEcoRI部位まで伸びるウシ成長ホルモンのポリＡ配列を含有する断片11（600bp）を単離する。 Step 1. Plasmid pSVCOW7 is cut with EcoRI and PvuII, fragments 11 containing the poly A sequence of bovine growth hormone extending 'from the PvuII site of most of exon 3 of the' up downstream of the EcoRI site distal third BGH gene (600 bp ) to isolate. BGHポリＡ配列の詳しい記載については以下の文献を参照されたい：（１）BGHゲノミックDNAの同定およびキャラクタライゼーションが開示されている、1984年６月27日に公開された欧州特許出願0112012号：（２） BGH poly A for detailed description of sequences reference is made to the following documents: (1) identification and characterization of BGH genomic DNA is disclosed in European Patent Application No. 0112012, published June 27, 1984: (2)
ウォイチック・アール・ピイら（Woychick,RPet a Woichikku R. Piira (Woychick, RPet a
l）、「正確なポリＡについてのウシ成長ホルモン遺伝子の３′フランキング領域の要件（Requirement for th l), 3 'flanking region requirements of the bovine growth hormone gene for the "exact poly A (Requirement for th
e 3′ Flanking Region of the Bovine Growth Hormone e 3 'Flanking Region of the Bovine Growth Hormone
Gene for Accurate Polyadenylation）」、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA 81:3944〜3948 Gene for Accurate Polyadenylation) ", Proceedings of National Academy of Sciences (Proc.Natl.Acad.Sci) USA 81:. 3944~3948
（1984年７月）；およびヌクレオチド配列AATAAAはBGH (July 1984); and the nucleotide sequence AATAAA is BGH
遺伝子の３′末端から11ないし30ヌクレオチド上流（５′末端に向けて）の位置におけるポリアデニレーションを特徴付けることを開示する、デイ・アール・ヒッグズら（DRHiggs,et al）、ネイチャー（Nature）、3 Discloses that characterize the polyadenylation at the position of 3 '11 free from the end to 30 nucleotides upstream (5' towards the end) of a gene, Day R. Higgs et al (DRHiggs, et al), Nature (Nature), 3
06:398〜400（1983年12月24日）およびそこで引用された文献。 06: 398-400 (24 December 1983) and the references cited therein.
pSVCOW7の第２試料をEcoRIおよびBamHIで切断して断片12（5.8kb）を得る。 The second sample of pSVCOW7 is cut with EcoRI and BamHI to obtain a fragment 12 (5.8 kb) with. 別法として、断片12はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Labo Alternatively, fragment 12 Bethesda Research Laboratories (Bethesda Research Labo
ratories）から入手可能な親プラスミドpSV2dhfrからの From ratories) from the parent plasmid pSV2dhfr available
EcoRI/BamHI断片から得ることもできる。 Can also be obtained from the EcoRI / BamHI fragment. 断片12はpBR32 Fragment 12 pBR32
2からの複製開始点およびイー・コリでのプラスミドの選択を可能とするイー・コリで発現されるアンピシリン耐性遺伝子を含有する。 Origin of replication from the 2 and ampicillin resistance gene expressed in E. coli to allow selection of the plasmid in E. coli. また、該断片は、哺乳動物細胞での発現を可能とする構築体中にマウス・ジヒドロ葉酸還元酵素cDNAを含有する。 Furthermore, the fragment contains the mouse dihydrofolate reductase cDNA in constructs in that allows expression in mammalian cells. スブラマニら（Subramani,et Suburamani et al. (Subramani, et
al）、モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）1:854〜864（1981）。 al), Molecular and-Seryura Biology (Mol.Cell.Biol) 1:. 854~864 (1981).
プラスミドpGPFG1をHindIIIで切断し（pGPFG−３をHp Plasmid pGPFG1 was cut with HindIII (pGPFG-3 and Hp
aIで消化し）、クレノー酵素で処理し、BamHIで再切断して断片13（2.2kb）を得、これをゲル単離する。 Was digested with aI), treated with Klenow enzyme to obtain a fragment 13 (2.2 kb) was recut with BamHI, which is gel isolated. BamHI BamHI
部位はFGmRNAの５′非翻訳配列についてコード付けする Site is marked code for the 5 'untranslated sequence of FGmRNA
cDNAのすぐ上流にあり、HindIII部位はgpFG cDNAの３′ There is immediately upstream of the cDNA, HindIII site is 3 of gpFG cDNA '
末端近くのPstI部位を数塩基対越えたpUC12ベクター中にある（pGPFG−３のHpaII部位はFG cDNAの３′末端から95bpのところにある）。 It is in pUC12 vector exceeding a few base pairs near the ends PstI site (HpaII site in pGPFG-3 is at a 95bp from the 3 'end of FG cDNA).
断片11、12および13を結んでpGPFG−PA（8.6kb）を得るが、これはイー・コリおよびCHO細胞を行き来できる複製ベクターである。 While obtaining pGPFG-PA (8.6kb) by connecting pieces 11, 12 and 13, which are replication vector capable traverse the E. coli and CHO cells. プラスミドpGPFG−PAをイー・コリに形質転換する。 Transforming the plasmid pGPFG-PA in E. coli.
工程2.工程２においては、ヒト・サイトメガロウイルスからの即時型遺伝子プロモーター（CMV IEプロモーター）を挿入することによってpGPFG−PAを発現プラスミドpGPFG−IE−PAに変換する。 Step 2. In Step 2, converts the pGPFG-PA by inserting the immediate early gene promoter from human cytomegalovirus (CMV IE promoter) in an expression plasmid pGPFG-IE-PA. 該CMV IEプロモーターはCMVゲノムのPstI消化から得られる。 The CMV IE promoter can be obtained from the PstI digestion of the CMV genome. 主要即時型遺伝子（CMV IE）を含有するヒト・サイトメガロウイルス（CMV）ゲノムの領域の制限エンドヌクレアーゼ切断地図はスティンスキーら（Stinski,et al）、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、46:1〜14、1983; Major immediate-type gene (CMV IE) a restriction endonuclease cleavage map of the region of the human cytomegalovirus (CMV) genome containing the Augustin ski et al. (Stinski, et al), Journal of Bairoroji (J.Virol.) , 46: 1～14,1983;
ステンベクグら（Stenberg,et al）、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、49:190〜199、1984;およびトムセンら（Thomsen,et al）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、81−659〜663、1984に詳細に記載されている。 Sutenbekugu et al. (Stenberg, et al), Journal of Bairoroji, 49 (J.Virol.): 190~199,1984; and Thomsen et al. (Thomsen, et al), Proceedings of National Academy of Sciences (Proc.) USA, are described in detail in 81-659～663,1984.
該スティンスキーおよびトムセンの文献は、主要即時型遺伝子についてのプロモーターを含有する2.0キロベースのPstI断片を記載している。 Literature of the Augustin ski and Thomsen describes 2.0 kilobase PstI fragment containing the promoter for the major immediate early gene. この2.0kbPstI断片を単離し、Sau3AIで消化すると、産物のうちに760塩基対断片が得られる。 The 2.0kbPstI fragment isolated and digested with Sau3AI, 760 bp fragment of the product are obtained. この760塩基対断片は、そのサイズ、 The 760 bp fragment, its size,
および断片内のSacI切断部位およびBalI切断部位の存在によって他の産物と区別できる。 And the presence of SacI cleavage site and BalI cleavage site within the fragment can be distinguished from other products. その便利な同定のために、このSau3AI断片の利用は、本明細書中に記載するCM CM because of its convenient identification, utilization of this Sau3AI fragment, as described herein
V IEプロモーターの好ましい使用方法である。 It is the preferred method of use of the V IE promoter.
プラスミドpGPFG−PAをBamHIで切断し、CMV即時型プロモーターを含有するSau3AI断片を適合するBamHI部位に結ぶ。 Plasmid pGPFG-PA is cleaved with BamHI, connecting the Sau3AI fragment containing the CMV immediate early promoter in a compatible BamHI site. プロモーターからの転写によりHRSV−様蛋白についてのmRNAが合成されるような向きであるCMVプロモーター断片を含有するプラスミドはプラスミドのSacIでの切断によって同定できる。 Plasmids containing the CMV promoter fragment mRNA is oriented as synthesis for HRSV- like protein by transcription from the promoter can be identified by cleavage with SacI of plasmid. 得られたプラスミドをpGPF pGPF the resulting plasmid
G−IE−PAと命名するが、これはcDNAの５′末端にCMV It is designated G-IE-PA, which is CMV at the 5 'end of the cDNA
IEプロモーターを、および３′末端にBGHポリＡシグナルを有する。 The IE promoter, and has a BGH poly A signal at the 3 'end. 該プラスミドをCHO細胞へのトランスフェクションまでイー・コリ中で維持する。 Maintained in E. coli the plasmid to transfection into CHO cells.
C.トランスフェクションおよびCHO細胞の培養 グラハムら（Graham,et al）、「マクロ分子の活性哺乳動物細胞への導入（Introduction of Nacromolecules C. Transfection and CHO cells in culture Graham et al. (Graham, et al), "Introduction to macromolecular active mammalian cells (Introduction of Nacromolecules
into Viable Mammalian Cells）」、アラン・アール・ into Viable Mammalian Cells) ", Alan R.
リス・インコーポレイテッド（Alan R.Liss Inc.）、ニューヨーク、1980、３〜25頁に記載されているDNAの細胞へのトランスフェクションについてのリン酸カルシウム法を用い、プラスミドpGPFG−IE−PAをジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）欠損チャイニーズハムスター卵巣（CH Squirrel Inc. (Alan R. Liss Inc.), New York, using the calcium phosphate method for transfection into cells of DNA pp 1980,3～25, dihydrofolate reductase Plasmid pGPFG-IE-PA enzyme (dhfr) deficient Chinese hamster ovary (CH
O）細胞にトランスフェクトする。 O) is transfected into cells. 用いる細胞系は、コロンビア大学のエル・チェイシン（L.Cahsin）から元々入手可能であり、かつプロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl. Cell system is capable originally obtained from Columbia University of El Chasin (L.Cahsin), and Proceedings of National Academy of Sciences (Proc.Natl used.
Acad.Sci.）USA77:4216〜4220（1980）に詳細に記載されている突然変異体DXB−11である。 . Acad.Sci) USA77: a mutant DXB-11 which is described in detail in 4216 to 4220 (1980). トランスフェクションについての前記方法は、トランスフェクトしたプラスミドを取り込む細胞はもはやdhfr欠損ではなく、ダルベッコウの修正イーグル培地＋プロリン中で増殖するという事実に基づくものである。 The method of transfection, the cells incorporating the transfected plasmid is no longer dhfr deficient, it is based on the fact that to grow in modified Eagle's medium plus proline Darubekkou.
キメラ糖蛋白がアンカー領域を含まない場合は、分泌されるキメラFG蛋白を発現するCHO細胞からの上清を低速遠心によて清澄化する。 Chimeric glycoprotein is if without the anchor region is clarified good low speed centrifugation of the supernatant from CHO cells expressing the chimeric FG protein is secreted. 上澄をコンカナバリンＡ（またはレンチルレクチン）カラムに適用する。 Applying the supernatant to a Concanavalin A (or lentil lectin) column. 前記緩衝液におけるα−Ｄ−メチルグリコシドの直線グラジエント（０〜0.5M）で十分に洗浄した後、該糖蛋白を溶出させる。 After extensive washing with a linear gradient of alpha-D-methyl glycoside in the buffer (0-0.5 M), eluting the sugar protein. 溶出した糖蛋白を0.1％トリトン（Triton）Ｘ−100 The eluted glycoproteins 0.1% Triton (Triton) X-100
を含有するPBSに対して透析し、アフィニティーカラムに適用する。 Dialyzed against PBS containing, it applied to the affinity column. 該アフィニティーカラムは、公知技術によってセファロース4Bビーズ（ファルマシア（Pharmaci The affinity column, Sepharose 4B beads (Pharmacia by known techniques (Pharmacia
a）、ピスカッタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）に連結された対HRSVの多クローンまたは単クローン抗体いずれかよりなる。 a), Piscataway (Piscataway), the more one NJ) to linked-to HRSV polyclonal or monoclonal antibody of. カラムを透析緩衝液で洗浄し、HRSV FG糖蛋白を0.1Mグリシン（pH2.5）および0.1 The column was washed with dialysis buffer, 0.1 M glycine (pH 2.5) the HRSV FG glycoprotein and 0.1
％トリトンＸ−100を含有するPBSで溶出させる。 % Containing Triton X-100 and eluted with PBS. 糖蛋白を生理食塩水に対して透析し、SDS−PAGEゲル上の電気泳動によって純度をチェックする。 The glycoprotein is dialyzed against saline and checked for purity by electrophoresis on SDS-PAGE gels.
キメラ糖蛋白がアンカー領域を含有する場合は、該糖蛋白を発現するCHO細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS） If the chimeric glycoprotein contains an anchor region, CHO cells with phosphate buffered saline expressing sugar protein (PBS)
で洗浄し、次いで、0.1％トリトンＸ−100および1.0％ In washed, then 0.1% Triton X-100 and 1.0%
デオキシコール酸ナトリウムを含有するPBS中で溶解する。 Dissolved in PBS containing sodium deoxycholate. 核をペレット化した後、細胞質抽出物をコンカナバリンＡカラムに適用し、分泌糖蛋白について前記したごとくに精製する。 After Nuclei were pelleted, by applying the cytoplasmic extract concanavalin A column and purified as described above for secreted glycoproteins.
実施例8 ウシ乳頭腫ウイルス（BPV）を用いるHRSV GP HRSV GP with EXAMPLE 8 bovine papilloma virus (BPV)
FGの発現 A.イー・コリ中での複製に適した転写不可能発現カセットを含有するクローニングベクターの構築 pTFW8およびpTFW9の構築により、BPVを用いてHRSV蛋白を発現するための便利な出発物質が提供される。 The construction of the cloning vector construction pTFW8 and pTFW9 containing transcription impossible expression cassette suitable for replication in expression A. in E. coli FG, convenient starting material for expressing HRSV proteins using BPV It is provided. 寄託したプラスミドの転写ターミネーターはHRSV蛋白の発現を阻止し、単一工程での切り出しおよび結びによって除去しなければならない。 Transcription terminator of the deposited plasmid blocks the expression of HRSV proteins and must be removed by excision and knot in a single step.
1.PTFW8の構築 プラスミドpdBPV−MMTneo（342−12）は、モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Mol.and Cel 1.PTFW8 of Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12), the Molecular-and-Seryura Biology (Mol.and Cel
l.Biol.）、３巻（11号）:2110〜2115（1983）に記載されており、米国、メリーランド州、ベセスダ、ナショナル・キャンサー・インスティテュート（National Cance . L.Biol), 3 Volume (No. 11): 2110-2115 are described in (1983), the United States, Maryland, Bethesda, the National Cancer Institute (National Cance
r Institute）のピーター・ホーレイ（Peter Howley） Peter Horley of r Institute) (Peter Howley)
から入手できる。 Available from. プラスミドpdBPV−MMTneo（342−12） Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12)
は３つの部分：唯一のBamHI部位で開いた完全なBPV−１ Three parts: only complete open at the BamHI site BPV-1
ゲノム（100％）;pML2（pBR322の「ポイズン−マイナス（poison−minus）」誘導体）；ならびにマウス・メタロチオネインＩ遺伝子プロモーター、Tn5のネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子、およびシミアンウイルス40の初期領域転写プロセッシングシグナルよりなる転写カセットからなる。 Genomic (100%); pML2 (pBR322 for "Poison - minus (poison-minus)" derivatives); and mouse metallothionein I gene promoter, the neomycin phosphotransferase II gene of Tn5, and the simian virus 40 from early region transcriptional processing signals consisting of consisting of the transfer cassette. まず、プラスミドpdBPV−M First, the plasmid pdBPV-M
MTneo（342−12）をBamHIで消化して、単離かつ後の挿入のために保存したBPV配列を除去する。 MTneo the (342-12) was digested with BamHI, to remove the BPV sequences which were stored for insertion after isolation and. T4リガーゼを用いて残存する断片を再度結んでpMMpro.nptII（6.7k Signed a fragment remaining using T4 ligase again pMMpro.nptII (6.7k
b）を得る。 b) obtain. BPVゲノムの除去により、残存するプラスミド中に唯一の制限部位を生じさせることによって後の遺伝子操作が容易となる。 Removal of BPV genome, genetic manipulation after by generating unique restriction sites is readily plasmid remaining. 組換が完了すると、BPVゲノムを置き換える。 When the recombinant is complete, replace the BPV genome.
プラスミドpMMpro.nptIIをBglIIで消化し、唯一の制限部位を含有する合成DNA断片14を挿入し、T4リガーゼを用いて結び、pTFW8（6.7kb）を得る。 Plasmid pMMpro.nptII was digested with BglII, only containing restriction sites to insert the synthetic DNA fragment 14, signed using T4 ligase to obtain pTFW8 (6.7kb). プラスミドpTFW Plasmid pTFW
8は、マウスメタロチオネインＩ遺伝子プロモーターおよびネオマイシン耐性遺伝子間の唯一の制限部位の挿入を除いてpMMpro.nptIIと同一である。 8 is the same as pMMpro.nptII except for insertion of unique restriction sites between the murine metallothionein I gene promoter and the neomycin resistance gene.
2.pTFW9の構築 プラスミドpTWF9はメタロチオネインＩ遺伝子プロモーターおよびネオマイシン耐性遺伝子間に挿入されたファージラムダからの転写ターミネーターT Iを含有する。 Plasmid pTWF9 of 2.pTFW9 contain transcription terminator T I from the inserted lambda between metallothionein I gene promoter and the neomycin resistance gene.
該転写ターミネーターは米国、メリーランド州、ベセスダのナショナル・キャンサー・インスティテュート（Na Transcriptional terminator is the United States, Maryland, the National Cancer Institute of Bethesda (Na
tional Cancer Institute）のドナルド・コート（Donal Donald Court of tional Cancer Institute) (Donal
d Court）氏から入手できる。 d Court) can be obtained from Mr. 該転写ターミネーターは、T Iがグアネロスら（Guarenos et al）、PNAS、79:2 Transcription terminator, T I is Guanerosu et al. (Guarenos et al), PNAS, 79: 2
38〜242（1982）に記載されているsib3突然変異を担持する以外は、ジーン（Gene）、28:343〜350（1984）に記載されているpUS6と同一であるpKG 1800sib3中にて供給される。 38-242 except for carrying sib3 mutations listed in (1982), Gene (Gene), 28: 343~350 supplied at pKG in 1800sib3 is identical to pUS6 listed in (1984) that. ファージラムダの通常の感染過程の間、T Iターミネーターは、P Lからのバクテリオファージλ int遺伝子発現の抑制、およびP Iに由来するint遺伝子転写の停止にて機能する。 During normal infection process of phage lambda, T I terminator, inhibition of bacteriophage lambda int gene expression from P L, and functions at stop of int gene transcription originating from P I. AluIおよびPvuIを用いて該ターミネーターを断片15（1.2kb）としてpKG1800sib3から切り出し、これをゲル単離し、断片のいずれかの末端にXhoIリンカーを位置させる。 Excised from pKG1800sib3 the terminator as a fragment 15 (1.2 kb) using AluI and PvuI, which gel isolated, to position the XhoI linker to one of the ends of the fragments. 該リンカーは米国、マサチューセッツ州、ベバレイ（Beverly）、ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）から入手可能である。 The linker is the United States, Massachusetts, Bebarei (Beverly), is available from New England Biolabs (New England Biolabs). 次いで、XhoI相補末端と結合したターミネーター断片を、予めXhoIで消化したpTWF8に挿入する。 Then, a terminator fragment bound to XhoI cohesive ends, inserted into pTWF8 previously digested with XhoI. プラスミドpTWF9はブダペスト条約に従って寄託した。 Plasmid pTWF9 was deposited in accordance with the Budapest Treaty. プラスミドpTWF9をイー・コリ宿主中で維持するが、これは1 To maintain the plasmid pTWF9 in E. coli host, but this is 1
986年11月17日に米国、イリノイ州、ペオリア、ノーザン・リージョナル・リサーチ・センターに寄託し、NRRL The United States in 986 years November 17, Illinois, Peoria, deposited at the Northern Regional Research Center, NRRL
B−18141の受託番号が付された。 Accession number of B-18141 is attached.
B.pTFW/GPFGの構築 実施例２〜６で構築した遺伝子はBPVを用いるキメラ糖蛋白の発現で用いることができる。 Gene constructed in Construction Examples 2-6 of B.pTFW / GPFG can be used in the expression of the chimeric glycoprotein using BPV. プラスミドpGPFG Plasmid pGPFG
−１を本実施例で用いる。 -1 used in this example. 特に断りのない限り、他のキメラ遺伝子はpGPFG−１について記載したごとくに処理する。 Unless otherwise noted, other chimeric genes are treated as described for pGPFG-1. pTWF/GPFGを構築するには、pTWF1をBamHIおよびH To build a pTWF / GPFG is, the pTWF1 BamHI and H
indIIIで消化する（pGPFG−３はBamHIおよびHpaIIで消化する）。 Digested with indIII (pGPFG-3 is digested with BamHI and HpaII). その末端をクレノー酵素で平滑とし、合成Bg Made blunt the ends with Klenow enzyme, synthesis Bg
lIIリンカー（ニュー・イングランド・バイオラブズ） lII linker (New England Biolabs)
をクローンの末端に結ぶ。 A tie at the end of the clone. 該DNAをBglIIで消化し、断片 Digesting the DNA with BglII, fragment
16（2.2kb）とする。 16 and (2.2kb). 次いで、gpFG遺伝子（2.2kg）を含有する断片16をゲルから単離する。 Then isolated fragment 16 containing the gpFG gene (2.2 kg) from the gel. 精製した断片を、予めBglIIで消化したpTFW6に結んでpTFW/GPFG（10.1kb） The purified fragment, tied to pTFW6 digested beforehand with BglII pTFW / GPFG (10.1kb)
C.pTFE−GPFGの原核生物発現ベクターへの変換 実施例8Aの工程ａにおいてHamHIで切り出した100％完全なBPV−１ゲノムを再挿入することによってプラスミドpTFW/GPFGを原核生物発現ベクターに変換する。 Converting the plasmid pTFW / GPFG into prokaryotic expression vector by reinserting the 100% complete BPV-1 genome excised with HamHI in step a conversion Example 8A into a prokaryotic expression vector C.pTFE-GPFG . プラスミドpTFW/GPFGをBamHIで切断し、BPV−１無傷ゲノム、7.9kb断片を挿入してpTFW/GPFG/BPV＊（18.0kb）を得、これを原核生物細胞による糖蛋白FGの産生が所望されるまでイー・コリ中で複製する。 Plasmid pTFW / GPFG is cut with BamHI, BPV-1 intact genome, insert the 7.9kb fragment obtained pTFW / GPFG / BPV * a (18.0kb) by which the production of glycoprotein FG by prokaryotic cells is desired to replicate in E. coli up to that.
D.マウスC127細胞におけるgpFGの発現 マウスC127細胞へのトランスフェクションに先立ち、 Prior to transfection into expressing murine C127 cells gpFG in D. mouse C127 cells,
pTFW/GPFG/BPV＊をXhoIで消化してT Iターミネーターを切り出し、T4 DNAリガーゼで再び結ぶ。 cut out T I terminator the pTFW / GPFG / BPV * is digested with XhoI, connecting again with T4 DNA ligase. 得られたプラスミドpTFW/GPFG/BPV（16.9kb）は、今や、培地中に分泌されるgpFGの高レベル発現を指令する。 The resulting plasmid pTFW / GPFG / BPV (16.9kb) is now direct high level expression of gpFG which is secreted into the medium. C127細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能であり、10％胎児ウシ血清を含有するダルベッコウの修正最小必須培地で増殖させる。 C127 cells are available from the American Type Culture Collection, are grown in modified minimum essential medium Darubekkou containing 10% fetal calf serum. C127細胞の培地中での C127 cell culture medium in the
gpFG蛋白の濃度は抗−RSV抗体および125 Ｉ−標識蛋白でのウェスタン・ブロット実験で測定する。 Concentration of gpFG protein measured by Western blot experiments with anti -RSV antibody and 125 I- labeled protein.
HRSV gpFGを実施例７に記載したごとくに培地または細胞から精製する。 Purified from culture medium or cell as described the HRSV GpFG in Example 7.
実施例９ バクロウイルスを用いるHRSV GPFGの発現 以下の実施例は昆虫細胞培養での糖蛋白の発現に関する。 The following examples Expression of HRSV GPFG with EXAMPLE 9 baculovirus related to the expression of glycoprotein in insect cell culture. すべての手順は、カレッジ・オブ・アグリカルチャー（College of Agriculture）、テキサス・アグリカルチュラル・エクスペリメンタル・ステイション（Texas All procedures, College of Agriculture (College of Agriculture), Texas Agricultural & Experimental Stay Deployment (Texas
Agricultural Experiment Station）、テキサス・アグリカルチュラル・エクステンション・サービス（Texas Agricultural Experiment Station), Texas Agricultural Extension Service (Texas
Agricultural Extension Service）、テキサス州によつて1986年に発行されたサマーズ・エム・デイおよびスミス・ジイ・イー（Summers,MDand Smith）、バクロウイルスベクター類および昆虫細胞培養法のマニュアル（A Manual for Bacrovirus Vectors and Insect Cell Agricultural Extension Service), issued Summers M. Day and Smith diisopropyl Yee in 1986 Yotsute Texas (Summers, MDand Smith), baculovirus vector acids and insect cell culture method of manual (A Manual for Bacrovirus Vectors and Insect Cell
Culture Procedures）に詳細に記載されている。 It is described in detail in Culture Procedures). 出発プラスミドpAc373（7.1kb）はオートグラファ・カリフォルニカ核多角体ウイルス（AcNPV）についてのポリヘドロンプロモーターからすぐ下流の唯一のBamHI部位を有する一般的なバクロウイルス発現ベクターである。 The starting plasmids pAc373 (7.1 kb) is a general baculovirus expression vector having a unique BamHI site from the polyhedron promoter just downstream of the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). 該ポリヘドロン蛋白はウイルス感染およびin vitroでの複製にとって必須でないマトリックス蛋白である。 The polyhedron protein is a matrix protein is not essential for replication of a viral infection and in vitro. 該プラスミドは、テキサス77843、カレッジ・ステーション（Col The plasmid, Texas 77843, College Station (Col
lege Station）、テキサスＡ＆Ｍ大学、昆虫学講座のマックス・サマーズ（Max Summers）教授から入手でき、 lege Station), available from Texas A & M University, from Max Summers (Max Summers) professor of entomology course,
lecular and Cell.Biology）、３（12）:2156〜2165（1 lecular and Cell.Biology), 3 (12): 2156~2165 (1
983）に詳細に記載されている。 It is described in detail in 983).
A.pAcGPFGの構築 実施例２〜６で構築した遺伝子をバクロウイルスをもいるキメラ糖蛋白の発現に用いることができる。 The genes constructed in Construction Examples 2-6 of A.pAcGPFG can be used to express a chimeric glycoprotein Some baculoviruses. プラスミドpGPFG−１を本実施例で用いる。 Plasmid pGPFG-1 used in this embodiment. 特に断りのない限り、他のキメラ遺伝子をpGPFG−１について記載したごとくに処理する。 Unless otherwise stated, it handles other chimeric genes as described for pGPFG-1. プラスミドpGPFG1をHindIIIで消化し（pGPFG−３はHpaIIで消化する）、クレノー酵素で末端を平滑とする。 Plasmid pGPFG1 was digested with HindIII (pGPFG-3 is digested with HpaII), and blunt ended with Klenow enzyme. 合成BamHIリンカー（ニュー・イングランド・バイオラブズ）を該DNAの末端に結ぶ。 Synthetic BamHI linkers (New England Biolabs) connecting the ends of the DNA. 該DNAをBa The DNA Ba
mHIで消化し、gpFG遺伝子を含有する断片17（2.2kb）をゲルから単離する。 It was digested with BamHI, isolating the fragment 17 (2.2 kb) containing the gpFG gene from the gel. 精製した断片を、予めBamHIで消化したpAc373に結ぶ。 The purified fragment, connecting to pAc373 previously digested with BamHI.
B.エス・フルギペルダ（S.Frugiperda）のトランスフェクションおよび培養 pAcGPFGのgpFG cDNAインサートをエス・フルギペルダにおける共トランスフェクションによって天然AcNPV DN Natural AcNPV DN by transfection and co-transfection of GpFG cDNA insert in S. frugiperda culture pAcGPFG of B. S. frugiperda (S. frugiperda)
Aで組み換える。 Recombine in A. エス・フルギペルダ（SF9;ATCC CRL171 S. frugiperda (SF9; ATCC CRL171
1）をディフコ（Difco）ラクトアルブミン加水分解物および酵母分解物を補足したグレース培地（ジブコ・ラブ（Gibco Lab.）、リボニア（Livonia）、ミシガン州481 1) Difco (Difco) lactalbumin hydrolyzate and Grace's medium supplemented with yeast hydrolyzate (Gibco Love (Gibco Lab.), Livonia (Livonia), Michigan 481
50）、10％胎児ウシ血清で培養する。 50), they are cultured in 10% fetal calf serum. 該細胞を各々１μ The cells each 1μ
g/mlおよび２μg/mlにてAcNPV DNAおよびpAcGPFGで共トランスフェクトする。 At g / ml and 2 [mu] g / ml cotransfected with AcNPV DNA and PAcGPFG. 培地を収集し、低速遠心によって細胞物質を除去することによってウイルス粒子を得る。 The medium was collected, obtaining viral particles by removing the cellular material by low speed centrifugation.
次いで、ウイルス含有培地を用いてエス・フルギペルダを感染させる。 Then, to infect S. frugiperda using virus-containing medium. 天然ウイルスDNAおよび糖蛋白FGについてコード付けするcDNAで組み換えたDNA双方を包含するこれらのウイルス粒子を用いてエス・フルギペルダを引き続いて感染させ、ポリヘドロン蛋白の代わりにHRSV蛋白を発現するいくらかの細胞を得る。 It encompasses native viral DNA and DNA both recombined with cDNA with coding for glycoprotein FG using these viral particles were infected subsequently S. frugiperda, some cells expressing the HRSV protein instead of the polyhedron protein obtain. 組換体ウイルスの精製はエス・フルギペルダ細胞を含有する96−ウェル組織培養プレートにおける一連の制限希釈平板培養（limi A series of limiting dilution plating purification of recombinant viruses in 96-well tissue culture plates containing S. frugiperda cells (limi
ted dilution plating）によって達成される。 Is achieved by ted dilution plating). ニックトランスレーションによって32 −Ｐ−dCTPで標識したpGPF PGPF labeled with 32 -P-dCTP by nick translation
G1をプローブとして用いるドットブロットハイブリダイゼーションによって、組換体ウイルスを含有するウェルを検出する。 By dot blot hybridization using G1 as a probe to detect the wells containing the recombinant virus. 充分に純粋ならば、該組換体ウイルスはその唯一の閉塞−陰性プラーク形態によって検出される。 If sufficiently pure, it said set recombinants viruses whose only closed - is detected by the negative plaque morphology.
組換体バクロウイルス感染細胞で合成されたHRSV蛋白は抗−RSV抗体および125 Ｉ−標識蛋白Ａ（アメルスハム・ Recombinant baculovirus HRSV protein synthesized in virus infected cells Anti -RSV antibody and 125 I- labeled protein A (Amerusuhamu &
コーポレーション（Amersham Corp.）でのウェスタンブロット法によって検出される。 It is detected by Western blotting with Corporation (Amersham Corp.).
該HRSV蛋白を実施例７に記載したごとくに培養培地または細胞から精製する。 Purified from culture medium or cells as described in Example 7 the HRSV protein.
実施例10 天然多角体リーダー配列を含有するpAcGPFG pAcGPFG containing Example 10 natural polyhedrin leader sequence
の構築 実施例８に記載したプラスミドpAc373は多角体リーダーの−８位にBamHIリンカー配列を含有するので、外来性遺伝子の挿入が容易である。 The plasmid pAc373 described in Construction Example 8 contains a BamHI linker sequence -8 position of the polyhedron leader, it is easy to insert foreign genes. しかしながら、多角体リーダー配列のこの破壊は天然多角体リンカーで可能なよりも低レベルの挿入遺伝子の発現に導きかねない。 However, this destruction than is possible with the natural polyhedron linker can lead to low level expression of the inserted gene polyhedrin leader sequence. 以下に記載するのは天然多角体リーダー配列をHRSV FG遺伝子の開始コドンに連結する方法である。 The Described below is a method of connecting the natural polyhedron leader sequence to the initiation codon of the HRSV FG gene. 実施例２〜６で構築した遺伝子をキメラ糖蛋白の発現用の本実施例で用いることができる。 The genes constructed in Examples 2-6 may be used in this embodiment for expression of the chimeric glycoprotein. プラスミドpGPFG−１を本実施例で用いる。 Plasmid pGPFG-1 used in this embodiment. 他のキメラ遺伝子はpGPFG−１について記載したごとくに処理する。 Other chimeric genes are treated as described for pGPFG-1.
A.pAcGPFG−２の調製 プラスミドpAcGPGF（実施例８）をEcoRIおよびPstIで消化する。 A.pAcGPFG-2 Preparation plasmid pAcGPGF (Example 8) is digested with EcoRI and PstI. EcoRIは多角体リーダー配列を−93位で切断するが、PstIはHRSV FGコーディング配列を該FGコーディング配列の＋50、636、および＋1701位で、およびFG EcoRI is cleaves the polyhedron leader sequence at position -93, PstI in Tasu50,636, and Tasu1701-position of the FG coding sequence HRSV FG coding sequence, and FG
遺伝子の３′末端に隣接するpUC12ポリリンカー領域で切断する。 Cleaves pUC12 polylinker region adjacent to the 3 'end of the gene. 該DNAを１％アガロースゲルにて電気泳動に付し、主として該プラスミドpAc373を含有する大きな断片（9.8kb）をゲルから精製する。 Subjected to electrophoresis the DNA on 1% agarose gels, mainly large fragment containing the plasmid pAc373 a (9.8 kb) is purified from the gel.
０位（開始コドンのヌクレオチドＡ）から＋50位（Ps 0 place (the start codon of the nucleotides A) from +50 place (Ps
tI切断部位）のFG遺伝子に連結した−93位（EcoRI切断部位）から−１位の多角体クーダー配列よりなるオリゴヌクレオチドを合成し、組み立てる。 tI cleavage site) -93-position linked to the FG gene (oligonucleotides were synthesized consisting of polyhedrin Cooder sequence of EcoRI cleavage site) -1 position, assemble. この配列の長さのため、該DNAをいくつかのオリゴヌクレオチドとして合成し、次いで、これらを一緒に結ぶ。 Because of the length of this sequence, the DNA was synthesized as several oligonucleotides, then connecting them together. 無傷オリゴヌクレオチドを前記調製の該9.8kb断片に結ぶ。 Connecting the intact oligonucleotide in the 9.8kb fragment of the preparation. 該DNAをイー・ Yee said DNA ·
コリHB01に形質転換する。 Transformed into E. coli HB01. 新しいプラスミド（pAcGPFG The new plasmid (pAcGPFG
−２）を含有するクローンを単離し、新しく合成した領域をマキサム−ギルバート配列決定法によって正しいことを確認する。 -2) clones were isolated containing the newly synthesized regions Maxam - to ensure that the correct by Gilbert sequencing.
B.pAcGPFG−２へのFG遺伝子の挿入 プラスミドpGPFG−１（実施例２）をPstIで部分的に消化する。 Insertion of FG gene into B.PAcGPFG-2 plasmid pGPFG-1 (Example 2) partially digested with PstI. PstIはFGコーディング配列の＋50、＋636、 + 50 PstI is FG coding sequence, + 636,
および＋1701位で、およびFG遺伝子の３′末端に隣接するpUC12ポリリンカー領域で切断する。 And at position Tasu1701, and adjacent to the 3 'end of the FG gene cleaves pUC12 polylinker region. 該DNAを1.2％アガロースゲルにて電気泳動に付す。 Subjected to electrophoresis the DNA with 1.2% agarose gel. ほぼ無傷のFG遺伝子（pUC12ポリリンカーにおけるFG位置＋50ないしPstI部位）に対応する2.2kb断片を該ゲルから精製する。 Substantially (to +50 no FG position in pUC12 polylinker PstI site) intact FG gene purifying 2.2kb fragment corresponding to from the gel. 次いで、該2.2kb断片を、予めPstIで消化したプラスミドpAc Then, plasmid pAc of the 2.2kb fragment, previously digested with PstI
GPFG−２に結ぶ。 Connecting to the GPFG-2. 該DNAをイー・コリHB101に形質転換する。 Transforming the DNA into E. coli HB101. クローンを単離し、2.3kb断片を生じるEcoRIおよび Clones were isolated, EcoRI produces a 2.3kb fragment and
SspIでの消化によってFG遺伝子の正しい向きをチェックする。 To check the correct orientation of the FG gene by digestion with SspI. 前記遺伝子を実施例８に記載したごとくにHRSVキメラFG糖蛋白の発現用のバクロウイルスゲノムに挿入する。 Inserted into the baculovirus genome for expression of HRSV chimeric FG glycoprotein in as described in Example 8 of said gene.
実施例11 ワクチンの調製 免疫原はよく知られた手法によってワクチン投与形態に調製できる。 Preparation immunogen of Example 11 Vaccine can be prepared in a vaccine dose form by well-known techniques. 該ワクチンは、筋肉内、皮下または鼻孔内投与できる。 The vaccine, intramuscularly, may be administered subcutaneously or nostrils. 筋肉内注射のごとき非経口投与については、免疫原を適当な担体と組み合わせることができる。 For parenteral administration, such as intramuscular injection, it can be combined with an immunogen with a suitable carrier.
例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（alum）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、カーボン、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、ムラミルジペプチド、細菌エンドトキシン、リピドＸ、コリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）（プロピオノバクテリウム・アクネス（Propionobacterium acnes））、ボルデテラ・ペルトゥシス（Bordetella pertussis）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リソレクチン、ビタミンＡ、サポニン、リポソーム、レバミソール、DEAE−デキストラン、プロックコポリマーまたは他の合成アジュバントのごとき種々のアジュバントまたは免疫調節剤とともにまたはそれ無しで、水、生理食塩水または緩衝液中にて投与できる。 For example, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum potassium sulfate (alum), beryllium sulfate, silica, kaolin, carbon, water-in-oil emulsions, oil-in-water emulsions, muramyl dipeptide, bacterial endotoxin, lipid X, Corynebacterium parvum (Corynebacterium parvum) (propionohydrazide acnes (Propionobacterium acnes)), Bordetella Perutushisu (Bordetella pertussis), polyribonucleotides, sodium alginate, lanolin, lysolecithin, vitamin A, saponin, liposomes, levamisole, DEAE-dextran , proc copolymers or other with or without it with various adjuvants or immunomodulating agents such as synthetic adjuvant can be administered with water and saline or buffer. かかるアジュバントは種々の源から商業的に入手可能である。 Such adjuvants are commercially available from a variety of sources. 例えばメルク・アジュバント（Merk Adjuvant）65（メルク・アンド・カンパニー・インコーポレイテッド（Merk and Com For example, Merck's adjuvant (Merk Adjuvant) 65 (Merck & Co., Inc. (Merk and Com
any,Inc.）、ラウェイ（Rahway）、ニュージャージー州）。 any, Inc.), lethwei (Rahway), New Jersey).
免疫原およびアジュバントの割合は、両者を有効量で存在させる限り、広い範囲にわたって変更できる。 Proportion of immunogen and adjuvant, as long as be present in effective amounts of both can be changed over a wide range. 例えば、水酸化アルミニウムはワクチン混合物の約0.5％の量（Al 2 O 3ベース）で存在させることができる。 For example, aluminum hydroxide can be present in an amount of about 0.5% of the vaccine mixture (Al 2 O 3 basis). 用量ベース当たりでは、免疫原の濃度は患者体重1kg当たり約 In the dose-based hit, the concentration of the immunogen about per patient body weight 1kg
0.015μｇないし約1.5mgの範囲とできる。 It can range from 0.015μg to about 1.5 mg. 好ましい用量範囲は約1.5μg/kgないし約0.15mg/kg患者体重である。 A preferred dosage range is from about 1.5 [mu] g / kg to about 0.15 mg / kg of patient body weight.
ヒトにおける適当な用量サイズは約0.1〜1ml、好ましくは約0.1mlである。 Suitable dose sizes about 0.1~1ml in humans, preferably about 0.1 ml. 従って、例えば、筋肉内注射についての用量は0.5％水酸化アルミニウムと混合した免疫原を含有する0.1mlよりなる。 Thus, for example, a dose for intramuscular injection consists of 0.1ml containing immunogen in admixture with 0.5% aluminum hydroxide.
ワクチンは妊婦または子供をもつ年令の婦人に投与できて、母児抗体を刺激できる。 The vaccine is can be administered to women of age with a pregnant woman or a child, can stimulate the Hahaji antibody. 該女性には、必要に応じて再度ワクチン接種できる。 To the woman of, again it can be vaccinated if necessary. 幼児には、母児抗体の枯渇の後２ないし３カ月令にてワクチン接種でき、免疫系の成熟の後、必要に応じて、好ましくは６ないし９カ月令にて再度ワクチン接種できる。 The infant, 2 to after depletion of Hahaji antibody can vaccination at 3 months of age, after maturation of the immune system, as required, preferably inoculated again vaccine at 6 to 9 months of age. ワクチン接種しなかった母親から生まれた赤ん坊には２ないし３カ月令にてワクチン接種できる。 The babies born to mothers who did not vaccinated can be vaccinated at 2 to 3 months old. また、該ワクチンは年のいったまたは衰弱した患者のごとき他の罹患集団においても有用である。 In addition, the vaccine may also be useful in other affected populations, such as patients who have to say or weakness of the year.
また、該ワクチンを他の病気のための他のワクチンと組み合わせて多価ワクチンを得ることもできる。 It is also possible to obtain a multivalent vaccine in combination with other vaccines for the vaccine other diseases. また、 Also,
抗生物質のごとき他の薬剤と組み合わせることもできる。 It can also be combined with other agents such as antibiotics.
チャート１ pGPF2の組み立て （ａ）プラスミドpF5−25をPstIで切断し、断片１（1.9 Chart 1 PGPF2 assembly of: (a) plasmid pF5-25 was cut with PstI, fragment 1 (1.9
kb）をゲル単離する。 kb) the gel isolated.
（ｂ）プラスミドpUC12（2.7kb）をPstIで切断して断片２を得、これをゲル単離する。 (B) Plasmid pUC12 a (2.7 kb) was cut with PstI to obtain a fragment 2, which is gel isolated.
（ｃ）断片１および２を結んでpGPF2（4.6kb）を得、これをイー・コルに形質転換する。 By connecting the (c) fragments 1 and 2 give the pGPF2 (4.6kb), transforming it into E. Coll.
AmpR＝アンピシリン耐性 Ｔ＝グアノシン／シトシン・テール Ｆ＝糖蛋白Ｆ チャート２ pGPF3およびpGPF4の構築 （ａ）プラスミドpGPF2をXbaIで切断し、細菌アルカリ性ホスファターゼで処理し、SalIで再切断し、クレノー酵素で処理して断片３を得る。 AmpR = Construction of ampicillin resistance T = Guanosine / cytosine tail F = Glycoprotein F Chart 2 PGPF3 and pGPF4 the (a) Plasmid pGPF2 is digested with XbaI, treated with bacterial alkaline phosphatase, recut with SalI, with Klenow enzyme obtain fragments 3 processing.
（ｂ）ランダムエキソヌクレアーゼを用いて断片３をSa (B) a fragment 3 using random exonuclease Sa
lI部位から下流を消化し、残存する３′テールを、GpF To digest the downstream from lI site, 3 'tail of the remaining, GpF
cDNAの以下の配列： The following sequence of cDNA: を有するリーダー配列の５′部分に相補的な合成オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。 Hybridizes to complementary synthetic oligonucleotides 5 'part of the leader sequence having.
（ｃ）合成オリゴヌクレオチドから下流のcDNA3′の一本鎖部分をクレノー酵素を用いて満たし、T4リガーゼを用いて末端を結んでpGPF3（4.6kb）を得る。 From (c) a synthetic oligonucleotide single stranded portions of the downstream cDNA 3 'filled with Klenow enzyme to obtain pGPF3 (4.6kb) by connecting the ends with T4 ligase.
（ｄ）プラスミドpGPF3をHindIIIで切断し、Bal 31で処理してgpF cDANAの３′末端のＧ−Ｃヌクレオチドテールを消化する。 (D) is a plasmid pGPF3 cut with HindIII, to digest the G-C nucleotides tail at the 3 'end of the GPF CDANA treated with Bal 31. gpF cDNAをBamHIで切断し（1.7kb）、ゲルから単離し、PUC12のBamHI/HincII消化物に再度結んでpGPF4（4.4kb）を得る。 The GPF cDNA was digested with BamHI (1.7 kb), was isolated from the gel, obtaining a pGPF4 (4.4kb) connects again BamHI / HincII digest of pUC12.
AmpR＝アンピシリン耐性 Ｔ＝グアノシン／シトシン・テール Ｆ＝糖蛋白Ｆ チャート３ キメラFG糖蛋白遺伝子の構築 AmpR = construction of ampicillin-resistant T = guanosine / cytosine tail F = glycoprotein F chart 3 chimeric FG glycoprotein gene （ａ）プラスミドG2B−16をDdeIおよびFoKIで消化し、 (A) a plasmid G2B-16 is digested with DdeI and Fok I,
クレノー酵素で末端を平滑とする。 The end and smoothed by Klenow enzyme. 該DNAを1.5％アガロースゲルにて電気泳動に付し、断片４（550bp）をアガロースから精製する。 Subjected to electrophoresis the DNA with 1.5% agarose gel and purified fragment 4 (550 bp) from the agarose.
（ｂ）プラスミドpGPF−４（チャート２）をNsiIで消化する。 (B) Plasmid pGPF-4 (the chart 2) digested with NsiI. T4 DNAポリメラーゼで末端を平滑とし、細菌アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化する。 The ends with T4 DNA polymerase to blunt and dephosphorylated with bacterial alkaline phosphatase. 次いで、断片４を該プラスミドに結んでpGPFG−１（5.0kb）を得る。 Then, obtained pGPFG-1 a (5.0 kb) fragment 4 connects to the plasmid.
AmpR＝アンピシリン耐性 TcR＝テトラサイクリン耐性 Ｔ＝グアノシン／シトシン・テール Ｇ＝Ｇ糖蛋白についてのDNA配列 Ｆ＝Ｆ糖蛋白についてのDNA配列 Term＝翻訳停止シグナル チャート４ FGのリーディングフレームを調製するためのリンカーの使用 AmpR = ampicillin resistance TcR = Tetracycline resistance T = Guanosine / DNA sequence for DNA sequences F = F glycoprotein for cytosine tail G = G glycoprotein Term = linker for preparing reading frame translational stop signal chart 4 FG Use of （ａ）プラスミドG2B−16をHphIで消化し、T4 DNAポリメラーゼで末端を平滑とする。 (A) digesting the plasmid G2B-16 with HphI, and blunt-ended with T4 DNA polymerase. SalIリンカーをcDNAの末端に結ぶ。 Connecting the SalI linkers to the ends of cDNA. 該DNAをSalIで消化し、断片５（410bp）をゲル精製する。 The DNA was digested with SalI, fragments 5 (410 bp) is gel-purified.
（ｂ）プラスミドGPF4（チャート２）をNsiIで消化し、 (B) plasmid GPF4 the (chart 2) was digested with NsiI,
T4 DNAポリメラーゼで末端を平滑とする。 The end and smooth with T4 DNA polymerase. SalIリンカーをcDNAの末端に結ぶ。 Connecting the SalI linkers to the ends of cDNA. 該DNAをSalIで消化し、プラスミド（4.4kb）をゲル単離する。 The DNA was digested with SalI, plasmid (4.4 kb) is gel isolated. 次いで、断片５を該ゲル精製GPF4に結んでpGPFG−２を得る。 Then, obtain pGPFG-2 fragments 5 by connecting to the gel purified GPF4.
AmpR＝アンピシリン耐性 TcR＝テトラサイクリン耐性 Ｔ＝グアニジン／シトシン・テール Ｆ＝Ｆ糖蛋白についてのDNA配列 Ｇ＝Ｇ糖蛋白についてのDNA配列 Ｌ＝SalIリンカー Term＝翻訳停止シグナル チャート５ 種々の長さのFG遺伝子を生じさせるためのオリゴヌクレオチドの使用 （ａ）オリゴヌクレオチドＡはオリゴヌクレオチド１ AmpR = ampicillin resistance TcR = Tetracycline resistance T = Guanidine / Cytosine tail F = DNA sequences for DNA sequence G = G glycoprotein for F glycoprotein L = SalI linker Term = FG translation stop signal chart 5 different lengths use of oligonucleotides to produce a gene (a) oligonucleotide a oligonucleotide 1
（36bp）よりなるか、またはオリゴヌクレオチド１および２を一緒に結ぶ（81bp）。 (36 bp) consisting of, or linking oligonucleotide 1 and 2 together (81 bp). オリゴヌクレオチドＢはオリゴヌクレオチド３（80bp）よりなるか、またはオリゴヌクレオチド３および４を一緒に結ぶ（164bp）。 Oligonucleotide B is connecting or consists of oligonucleotide 3 (80 bp), or oligonucleotides 3 and 4 together (164 bp). オリゴヌクレオチドＣはオリゴヌクレオチド５（60bp）からなるか、またはオリゴヌクレオチド５および６を一緒に結ぶ（120bp）か、あるいはオリゴヌクレオチド５、 Oligonucleotide C is either consisting of an oligonucleotide 5 (60 bp), or connecting the oligonucleotides 5 and 6 together (120 bp) or, alternatively oligonucleotides 5,
６、および７を一緒に結ぶか（189bp）、あるいはオリゴヌクレオチド５、６、７、および８を一緒に結ぶ（25 6, and 7 or tie together (189 bp), or connecting the oligonucleotides 5, 6, 7, and 8 together (25
8bp）。 8bp). オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、およびＣをゲル精製する。 Oligonucleotides A, B, and C is gel-purified.
（ｂ）プラスミドGPF−４をNsiIで消化し、オリゴヌクレオチドＡをNsiI部位に結ぶ。 The (b) plasmid GPF-4 was digested with NsiI, connecting the oligonucleotides A to NsiI site. 該DNAをHindIIIで消化し、該プラスミドを再度結んでpGPF−５を得る。 The DNA was digested with HindIII, to obtain a pGPF-5 connects the plasmid again.
（ｃ）プラスミドG2B−16をHinfIおよびXhoIIで消化し、断片６（277bp）をゲル単離する。 (C) a plasmid G2B-16 is digested with HinfI and XhoII, fragments 6 (277 bp) is gel isolated.
（ｄ）オリゴヌクレオチドＢおよびＣを結んで断片６を得る。 (D) obtaining a fragment 6 by connecting the oligonucleotides B and C. 該DNAをHindIIIで消化し、断片７をゲル精製する（断片７の長さはオリゴヌクレオチドＢおよびＣないに含有されるオリゴヌクレオチドに応じて417bpから700bp The DNA was digested with HindIII, 700 bp fragment 7 length of the gel-purified (fragment 7 from 417bp in accordance with the oligonucleotides contained in the free oligonucleotides B and C
まで変わる）。 Change up).
（ｅ）プラスミドGPF−５をHindIIIで消化し、細菌アルカリ性ホスホファターゼで脱リン酸化する。 (E) a plasmid GPF-5 was digested with HindIII, dephosphorylated with bacterial alkaline Hosuhofataze. 次いで、断片７をpGPF−５のHindIII部位に結んでpGPFG−３を得る。 Then, obtain pGPFG-3 by connecting pieces 7 into the HindIII site of pGPF-5.
AmpR＝アンピシリン耐性 Ｆ＝Ｆ糖蛋白のDNA配列 Ｇ＝Ｇ糖蛋白のDNA配列 Ａ＝オリゴヌクレオチドＡ Ｂ＝オリゴヌクレオチドＢ Ｃ＝オリゴヌクレオチドＣ Term＝翻訳停止シグナル チャート６ アンカー領域を含有するFG遺伝子の構築 AmpR = ampicillin resistance F = F glycoprotein DNA sequence G = G glycoprotein DNA sequence A = Oligonucleotide A B = Oligonucleotide B C = oligonucleotide C Term = the FG gene containing a translational stop signal chart 6 anchoring region construction （ａ）プラスミドG2B−16をDdeIおよびFoKIで消化する。 (A) a plasmid G2B-16 is digested with DdeI and Fok I. オリゴヌクレオチド９および10を該DNAの末端に結ぶ。 Connecting the oligonucleotides 9 and 10 at the ends of the DNA. 該DNAをNsiIで消化し、断片８（550bp）をゲル単離する。 The DNA was digested with NsiI, fragment 8 (550 bp) is gel isolated.
（ｂ）プラスミドGPF−４をNsiIで消化し、断片８を該N (B) Plasmid GPF-4 was digested with NsiI, the fragment 8 the N
siI部位に結んでpGPFG−４を得る。 Get the pGPFG-4 connects to siI site.
AmpR＝アンピシリン耐性 TcR＝テトラサイクリン耐性 Ｔ＝グアノシン／シトシン・テール Ｆ＝Ｆ糖蛋白についてのDNA配列 Ｇ＝Ｇ糖蛋白についてのDNA配列 ９＝オリゴヌクレオチド９ 10＝オリゴヌクレオチド10 Ａ＝Ｆ糖蛋白のアンカー領域についてコード付けするDN AmpR = ampicillin resistance TcR = Tetracycline resistance T = Guanosine / cytosine tail F = F sugars DNA sequence 9 = Oligonucleotide 9 10 = Oligonucleotide 10 A = F glycoprotein for DNA sequence G = G glycoprotein for protein anchor DN to put the code for the region
A配列 Term＝翻訳停止シグナル チャート７ GFキメラ遺伝子の構築用Ｇ遺伝子の調製 Preparation of G genes for the construction of the A array Term = Translation termination signal chart 7 GF chimeric gene （ａ）プラスミドG2B−16をNlaIIIおよびFoKIで消化する。 (A) a plasmid G2B-16 is digested with NlaIII and Fok I. オリゴヌクレオチド11および12を該DNAの末端に結び、断片９（850bp）をゲル単離する。 Conclusion The oligonucleotides 11 and 12 at the ends of the DNA, fragment 9 (850 bp) is gel isolated.
（ｂ）プラスミドpUC12をBamHIおよびSalIで消化し、細菌アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化する。 The (b) Plasmid pUC12 was digested with BamHI and SalI, dephosphorylated with bacterial alkaline phosphatase. 断片９ Fragment 9
を該プラスミドに結んでpGPG−１を得る。 Obtaining Pgpg-1 connects to the plasmid.
AmpR＝アンピシリン耐性 TcR＝テトラサイクリン耐性 Ｔ＝グアノシン／シトシン・テール Ｇ＝Ｇ糖蛋白についてのDNA配列 11＝オリゴヌクレオチド11 12＝オリゴヌクレオチド12 チャート８ G cDNAのpGPG−１への挿入 AmpR = insertion into the ampicillin resistance TcR = Tetracycline resistance T = Guanosine / cytosine tail G = DNA sequence 11 = Oligonucleotide 11 12 = Oligonucleotide 12 Chart 8 Pgpg-1 of G cDNA for G glycoprotein （ａ）プラスミドF5−25をXhoIIおよびNsiIで消化する。 (A) a plasmid F5-25 is digested with XhoII and NsiI. オリゴヌクレオチド13および14を該DNAの末端に結ぶ。 Connecting the oligonucleotides 13 and 14 at the ends of the DNA. 該DNAをSalIで消化し、断片10（960bp）をゲル単離する。 The DNA was digested with SalI, fragments 10 (960 bp) is gel isolated.
（ｂ）PGPF−１をSalIで消化し、細菌アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化する。 (B) the PGPF-1 was digested with SalI, dephosphorylated with bacterial alkaline phosphatase. 次いで、断片10を該プラスミドに結んでpGPGF−１を得る。 Then, obtain pGPGF-1 fragment 10 connects to the plasmid.
AmpR＝アンピシリン耐性 TcR＝テトラサイクリン耐性 Ｔ＝グアノシン／シトシン・テール Ｇ＝Ｇ糖蛋白についてのDNA配列 Ｆ＝Ｆ糖蛋白についてのDNA配列 11＝オリゴヌクレオチド11 12＝オリゴヌクレオチド12 13＝オリゴヌクレオチド13 14＝オリゴヌクレオチド14 Term＝翻訳停止シグナル チャート９ 糖蛋白FG AmpR = ampicillin resistance TcR = Tetracycline resistance T = Guanosine / cytosine tail G = DNA sequence for the DNA sequence F = F glycoprotein for G glycoprotein 11 = Oligonucleotide 11 12 = Oligonucleotide 12 13 = Oligonucleotide 13 14 = oligonucleotide 14 Term = translational stop signals chart 9 glycoprotein FG
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 6識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） ────────────────────────────────────────────────── ─── front page continued (51) Int.Cl. 6 in identification symbol Agency Docket No. FI art display portion // C12P 21/02 C12N 5/00 B (C12P 21/02 C12R 1:91) (C12P 21 / 02 C12R 1:92)
【請求項１】シグナル配列およびヒト呼吸系シンシチウムウイルス糖蛋白ＦおよびＧ双方からの少なくとも１つの免疫原生断片よりなることを特徴とするポリペプチド。 1. A signal sequence and the human respiratory system syncytial least one polypeptide characterized in that it consists of immunogenic fragments from um virus glycoprotein F and G both.
【請求項２】シグナル配列およびヒト呼吸系シンシチウムウイルス糖蛋白ＦおよびＧ双方からの少なくとも１つの免疫原性断片よりなることを特徴とするヒト・ワクチン。 2. A signal sequence and the human respiratory syncytial virus glycoprotein F and human vaccine characterized in that comprises at least one immunogenic fragment from G both.
【請求項３】ヒト呼吸系シンシチウムウイルスからヒトを保護する医薬品を調製するための、シグナル配列およびヒト呼吸系シンシチウムウイルス糖蛋白ＦおよびＧ双方からの少なくとも１つの免疫原性断片よりなるワクチンの使用。 3. A human respiratory syncytial virus for the preparation of a medicament for protecting a human, use of a vaccine which comprises at least one immunogenic fragment from the signal sequence and the human respiratory syncytial virus glycoprotein F and G both .
【請求項４】シグナル配列およびヒト呼吸系シンシチウムウイルス糖蛋白ＦおよびＧ双方からの少なくとも１つの免疫原性断片からなるポリペプチドを発現できるDNA 4. A DNA capable of expressing a polypeptide comprising at least one immunogenic fragment from the signal sequence and the human respiratory syncytial virus glycoprotein F and G both
配列を含有する適当な宿主よりなる発現系。 Expression system consisting of a suitable host containing the sequence.
【請求項５】ヒト呼吸系シンシチウムウイルス糖蛋白Ｆ 5. The human respiratory syncytial virus glycoprotein F
およびＧ双方からの少なくとも１つの免疫原性断片からなることを特徴とするポリペプチド。 And polypeptides characterized by comprising at least one immunogenic fragment from G both.
【請求項６】ヒト呼吸系シンシチウムウイルス糖蛋白Ｆ 6. The human respiratory syncytial virus glycoprotein F
およびＧ双方からの少なくとも１つの免疫原性断片よりなることを特徴とするヒト・ワクチン。 And human vaccine characterized in that comprises at least one immunogenic fragment from G both.
【請求項７】ヒト呼吸系シンシチウムウイルスからヒトを保護する医薬品を調製するための、ヒト呼吸系シンシチウムウイルス糖蛋白ＦおよびＧ双方からの少なくとも１つの免疫原性断片よりなるワクチンの使用。 7. A human respiratory syncytial virus for the preparation of a medicament for protecting a human, use of a vaccine which comprises at least one immunogenic fragment from the human respiratory syncytial virus glycoprotein F and G both.
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