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Timestamp: 2018-01-23 17:50:38+00:00
Document Index: 96760263

Matched Legal Cases: ['art.  4', 'art. 3', 'art. 5', 'art. 8', 'art. 3', 'art. 4', 'art. 1']

MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE ALIMENTARI E FORESTALI - DECRETO 13 dicembre 2011 | Geometra.info
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<TESTO COORDINATO DEL DECRETO-LEGGE 29 dicembre 2011, n. 216 – Testo del decreto-legge 29 dicembre 2011, n. 216 (in Gazzetta Ufficiale – serie generale – n. 302 del 29 dicembre 2011), coordinato con la legge di conversione 24 febbraio 2012, n. 14 (in questo stesso Supplemento ordinario alla pag. 25), recante: «Proroga di termini previsti da disposizioni legislative.». (12A02365) – (GU n. 48 del 27-2-2012
MINISTERO DEL LAVORO E DELLE POLITICHE SOCIALI – COMUNICATO – Approvazione della delibera adottata dall’assemblea nazionale dei delegati dell’ente nazionale di previdenza ed assistenza dei veterinari (ENPAV) in data 19 giugno 2010>
MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE ALIMENTARI E FORESTALI – DECRETO 13 dicembre 2011
MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE ALIMENTARI E FORESTALI - DECRETO 13 dicembre 2011 - Linee guida per l'esecuzione di analisi fitosanitarie sui campi di piante madri dei materiali di moltiplicazione vegetativa della vite, ai sensi del decreto 7 luglio 2006, allegato I. (12A02164) - (GU n. 50 del 29-2-2012 )
DECRETO 13 dicembre 2011
Linee guida per l’esecuzione di analisi fitosanitarie  sui  campi  di
piante madri dei materiali di moltiplicazione vegetativa della  vite,
ai sensi del decreto 7 luglio 2006, allegato I. (12A02164)
Titolo I   Criteri generali
della competitivita’ per lo sviluppo rurale
Vista  la  direttiva  68/193/CEE  del   Consiglio   relativa   alla
commercializzazione dei materiali di moltiplicazione vegetativa della
vite e successive modifiche;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 24 dicembre  1969,
n. 1164, recante norme sulla produzione e sul commercio dei materiali
di moltiplicazione vegetativa della vite;
Visto il decreto ministeriale  4  luglio  1970  recante  norme  per
l’applicazione  del  decreto  del  Presidente  della  Repubblica   24
dicembre 1969, n. 1164, relativo alla disciplina della  produzione  e
del commercio dei materiali di moltiplicazione vegetativa della vite;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 29 luglio 1974, n.
543, recante norme regolamentari per l’applicazione del  decreto  del
Presidente della Repubblica 24 dicembre 1969, n. 1164, recante  norme
sulla produzione e sul commercio  dei  materiali  di  moltiplicazione
vegetativa della vite;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 18 maggio 1982, n.
518, relativo all’attuazione delle direttive 71/140/CEE,  74/648/CEE,
74/649/CEE,  77/629/CEE,  78/55/CEE  e   78/692/CEE   relative   alla
produzione  ed  al  commercio  dei   materiali   di   moltiplicazione
Vista la legge 19 dicembre 1984, n.  865,  relativa  all’attuazione
della direttiva 82/331/CEE della Commissione del 6  maggio  1982  che
modifica la direttiva 68/193/CEE del  Consiglio  del  9  aprile  1968
relativa  alla  produzione  ed  al   commercio   dei   materiali   di
moltiplicazione vegetativa della vite;
Visto il decreto ministeriale 2 luglio 1991, n. 290, istitutivo del
regolamento recante l’indicazione supplementare in  etichetta  per  i
materiali di moltiplicazione della vite;
Visto il decreto ministeriale  24  giugno  1997  recante  norme  di
produzione e commercializzazione di materiali di  moltiplicazione  di
categoria standard di varieta’ di viti portinnesto;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 29  ottobre  1997,
n. 432, che emana il regolamento recante modificazioni al decreto del
Presidente della Repubblica 24 dicembre 1969, n. 1164, in materia  di
produzione e di commercio dei materiali di moltiplicazione vegetativa
della vite;
Visto il decreto ministeriale 22 dicembre 1997  che  stabilisce  il
protocollo  tecnico  per  la  micropropagazione  dei   materiali   di
moltiplicazione di varieta’ di portinnesto della vite;
Visto il decreto  ministeriale  30  maggio  2001  che  modifica  il
decreto ministeriale 24 giugno 1997 relativo alle norme di produzione
e commercializzazione di materiali di  moltiplicazione  di  categoria
standard di varieta’ di viti portinnesto;
Vista la direttiva 2002/11/CE del Consiglio del  14  febbraio  2002
che    modifica    la    direttiva    68/193/CEE    relativa     alla
vite e che abroga la direttiva 74/649/CEE;
Visto  il  decreto  ministeriale  8   febbraio   2005   «Norme   di
vite» ed in particolare gli articoli 4 e 5;
Vista la direttiva 2005/43/CE della Commissione del 23 giugno  2005
che modifica gli allegati della direttiva 68/193/CEE del Consiglio;
Visto il decreto ministeriale 7  luglio  2006  recante  recepimento
della direttiva 2005/43/CE della Commissione del 23 giugno  2005  che
modifica  gli  allegati  della  direttiva  68/193/CEE  del  Consiglio
relativa alla commercializzazione dei  materiali  di  moltiplicazione
Ritenuto  di  dover  indicare  linee  guida  per  l’esecuzione  dei
controlli  previsti  dalla  normativa  di   commercializzazione   dei
materiali di moltiplicazione vegetativa della vite;
Sentita l’Unita’ di coordinamento di cui  all’art.  4  del  decreto
ministeriale 8 febbraio 2005, ed acquisito il suo  parere  favorevole
nel corso della riunione del 3 novembre 2011;
1.  Il  presente  decreto  riguarda  le  procedure   di   controllo
virologico previste dal decreto ministeriale 7 luglio 2006,  allegato
I, punto 5 e si applica agli impianti di piante  madri  per  marze  e
portainnesto.
a) «Certificazione»: l’autorizzazione al prelievo di talee o  marze
dagli impianti di piante madri;
b) «Impianto di piante madri»: l’impianto corrispondente ad un rigo
della denuncia di produzione (domanda di controllo  e  certificazione
dei materiali di moltiplicazione vegetativa della vite);
c) «Servizio di controllo»: il Centro di ricerca per la viticoltura
– CRA-VIT di Conegliano per  i  materiali  di  moltiplicazione  delle
categorie «Iniziale» e di «Base», i competenti uffici regionali per i
materiali della categoria «Certificato» e «Standard»;
d) «Campione  pool»:  campione  multiplo  costituito  da  materiali
prelevati  da  non  piu’  di  cinque  piante,  se  non   diversamente
e) «Responsabile del campo»: il titolare o il rappresentante  della
ditta vivaistica che presenta la denuncia di produzione;
f) «Costitutore» o «Proponente»: si intendono, ai fini del presente
decreto, i responsabili dell’identita’ varietale  e  clonale  nonche’
dello  stato  sanitario  dei  materiali  di   moltiplicazione   delle
categorie  «Iniziale»  e  «Base»  delle  varieta’  e  cloni  da  loro
costituiti.
Metodi di campionamento e di analisi
1. Le attivita’ di campionamento e di analisi svolte  ai  fini  dei
controlli ufficiali oggetto del  presente  decreto  sono  conformi  a
quanto di seguito specificato.
2. Le analisi di laboratorio finalizzate ai controlli ufficiali per
la ricerca dei virus indicati all’allegato I del decreto ministeriale
7 luglio 2006, devono seguire  il  protocollo  di  analisi  riportato
all’allegato 1 del presente decreto.
3. Eventuali modifiche o  integrazioni  agli  allegati  tecnici  al
presente decreto sono adottate mediante nota tecnica del responsabile
del Servizio fitosanitario centrale, sentita  l’Unita’  nazionale  di
Sospensione dell’utilizzo degli impianti di piante madri
1. Gli impianti di piante madri per poter essere certificati devono
essere sottoposti a campionamento ed analisi ufficiali  nel  rispetto
dei tempi e  delle  scadenze  previste  all’allegato  I  del  decreto
ministeriale 7 luglio 2006.
2. Qualora un impianto di cui  al  comma  precedente,  giunto  alle
scadenze previste all’allegato I del decreto  ministeriale  7  luglio
2006, non e’ oggetto di utilizzazione, puo’ usufruire di una  proroga
dei termini per una sola annualita’.
3. Il responsabile del campo di piante madri deve comunque inserire
l’impianto nella denuncia annuale e deve  altresi’  segnalare,  prima
del periodo dei controlli, che non sono state effettuate  le  analisi
previste in quanto non intende utilizzare l’impianto medesimo.
4. Per la campagna in questione l’impianto  non  viene  autorizzato
per il prelievo  di  materiale  di  moltiplicazione  e  resta  quindi
«sospeso».
5. L’impianto di piante madri tenuto «sospeso» secondo le procedure
di cui ai commi precedenti, puo’ essere  riammesso  al  controllo  ed
alla certificazione solo a seguito della effettuazione delle  analisi
fitosanitarie previste  e  nel  rispetto  del  biennio  di  controllo
indicato dalle norme sugli organismi nocivi di quarantena di  cui  al
decreto legislativo 19 agosto 2005, n. 214.
Titolo II   Materiali di categoria «Iniziale» e «Base»
Certificati di analisi e documenti accessori
1. Entro il 30 giugno di ogni anno, secondo le  modalita’  indicate
all’allegato 2 al presente decreto,  il  responsabile  del  campo  di
piante madri presenta al servizio di  controllo,  il  certificato  di
analisi, recante la firma del responsabile dell’analisi e la data del
rilascio, integrato  con  le  seguenti  informazioni,  riportate  sul
certificato medesimo o in un documento allegato:
il riferimento al campo di piante madri sottoposto a test;
la data del prelievo;
il nome di chi ha effettuato il prelievo;
il numero di piante sottoposte a prelievo;
il numero di piante per campione, nel caso di campione pool;
il codice del campione;
informazioni che consentano il collegamento tra campione e pianta o
le piante del campione pool da cui e’ stato prelevato;
il laboratorio che ha effettuato l’analisi con test ELISA;
il protocollo di analisi  seguito  con  specifica  degli  antisieri
2. Le disposizioni di cui  al  comma  1  si  applicano  anche  alle
analisi delle piante madri  effettuate  precedentemente  all’adozione
del presente decreto; in tal caso, l’intervallo di cinque o sei anni,
rispettivamente per gli impianti di categoria  «Iniziale»  e  «Base»,
decorrono dalla data di rilascio del  certificato  di  analisi  e  la
comunicazione al servizio di controllo puo’ essere priva dei seguenti
codice del campione;
nome di chi ha effettuato il prelievo;
la data del prelievo, fermo restando  l’obbligo  di  citare  almeno
l’anno e il mese del campionamento.
1.  Tutte  le  piante  del  campo  di  piante  madri  di  categoria
«Iniziale» e «Base», sia per marze, sia per portinnesto devono essere
sottoposte ai test per la verifica dello  stato  virologico,  secondo
quanto indicato all’allegato 2 al presente decreto.
2.  Il  costitutore  del  clone  o   suo   delegato   effettua   il
campionamento  secondo  le  modalita’  indicate  all’allegato  2   al
presente decreto e provvede altresi’ ad effettuare  le  analisi  o  a
farle  effettuare  presso  un  laboratorio  di  propria  fiducia,  in
conformita’ a quanto stabilito all’art. 3 del presente decreto.
3. Il costitutore  puo’  delegare  al  responsabile  del  campo  le
proprie attribuzioni previste dal presente decreto.
4. Nel caso di campi di piante madri realizzati in Italia con cloni
costituiti in altri Paesi dell’Unione europea,  i  campioni  raccolti
possono essere analizzati anche presso un laboratorio operante in  un
altro Paese membro, purche’ il protocollo di analisi, in  particolare
per quanto riguarda  gli  antisieri  utilizzati,  sia  equivalente  a
quello riportato all’allegato 1.
Autorizzazione al prelievo di materiale di moltiplicazione
«Iniziale» e «Base» e verifiche del servizio di controllo
1. Il servizio di controllo, sulla base dei certificati di  analisi
presentati dal costitutore o da suo delegato, autorizza, se del caso,
il prelievo di materiale dagli impianti di piante madri,  secondo  le
procedure indicate all’allegato 2 al presente decreto.
2. Il servizio di controllo effettua annualmente test  di  verifica
mediante l’analisi di almeno cento campionamenti dei campi di  piante
madri  gia’  verificati  dal   costitutore   l’anno   precedente   ed
autorizzati al prelievo di materiale.
3. Detti  test  di  verifica,  costituiti  da  campioni  singoli  o
multipli (campioni «pool») riguardano i virus previsti all’allegato I
del decreto ministeriale 7 luglio 2006.
Prima denuncia di impianti di piante madri
di categoria «Iniziale»
1.  Il  responsabile  del  campo  di  piante  madri  di   categoria
«Iniziale» che inserisce per la prima volta l’impianto nella denuncia
di produzione deve accompagnare tale denuncia di  produzione  con  il
certificato delle analisi, effettuate secondo le modalita’  descritte
dal  presente  decreto,  attestante  l’assenza  dei  virus   previsti
dall’allegato I del decreto ministeriale 7 luglio 2006,  compreso  il
virus della maculatura  infettiva  della  vite  (GFkV  Fleck)  per  i
portinnesti.
2. La certificazione d’analisi include le informazioni  specificate
all’art. 5 del presente decreto.
3.  Il  certificato  di  analisi  deve  riferirsi  ad  un  prelievo
effettuato entro il quarto anno solare precedente a quello in cui  e’
presentata la denuncia di produzione.
Prima denuncia di impianti di piante madri  di  categoria  «Iniziale»
per la produzione di materiale di categoria «Base»
1. Per i cloni di nuova  iscrizione  al  Registro  nazionale  delle
varieta’ di viti e’ consentito realizzare un impianto di piante madri
per la produzione di materiale  di  moltiplicazione  della  categoria
«Base» contestualmente alla prima  denuncia  del  primo  impianto  di
piante madri per la produzione di  materiale  di  moltiplicazione  di
categoria  «Iniziale»,  utilizzando  piante  della  stessa  categoria
«Iniziale».
2. A detti impianti per la produzione  di  materiale  di  categoria
«Base» si applicano le medesime condizioni indicate all’art. 8 per  i
nuovi impianti di piante madri di categoria «Iniziale».
Titolo III   Materiali di moltiplicazione di categoria certificato
Materiali di categoria «certificato»
1. Le piante del campo di piante madri destinate alla produzione di
materiali  di  moltiplicazione  della  categoria  certificato  devono
essere sottoposte periodicamente ad analisi  per  la  verifica  dello
stato  fitosanitario  secondo  quanto  indicato  all’allegato  3   al
2. I servizi di controllo  regionali  dispongono  il  campionamento
ufficiale che deve  essere  realizzato  sotto  loro  responsabilita’,
secondo le modalita’ indicate all’allegato 3 al presente  decreto.  I
servizi medesimi provvedono ad effettuare o fare effettuare per  loro
conto le analisi  presso  un  laboratorio  in  conformita’  a  quanto
stabilito all’art. 3 del presente decreto.
Autorizzazione al prelievo di materiale certificato
1. Il servizio di controllo, sulla base dei risultati delle analisi
effettuate, autorizza, se del caso, il prelievo  di  materiale  dagli
impianti di piante madri, secondo le procedure indicate  all’allegato
3 al presente decreto.
Titolo IV   Rapporti istituzionali
Comunicazioni e coordinamento
1. I servizi di controllo devono presentare annualmente,  entro  il
31 dicembre, all’Unita’ nazionale di coordinamento, di cui all’art. 4
del decreto ministeriale 8 febbraio 2005, presso il  Ministero  delle
politiche   agricole   alimentari   e   forestali,   una    relazione
sull’attivita’ di controllo di cui all’art. 1 che riporta almeno:
il numero e la superficie degli  impianti  giunti  a  scadenza  per
essere sottoposti a test;
quelli effettivamente sottoposti a test ed eventualmente le ragioni
per cui determinati impianti non sono stati controllati;
le  contestazioni  ed  i  risultati  delle  analisi   di   verifica
effettuate dal servizio di controllo ed i provvedimenti presi;
eventuali particolari situazioni o problematiche riscontrate.
2. Qualora, sulla base di tali informazioni o in assenza  di  esse,
emergono  gravi  ritardi  e  carenze  funzionali  del   servizio   di
certificazione, il Ministero delle politiche  agricole  alimentari  e
forestali, su indicazione dell’unita’ di coordinamento, puo’ disporre
adeguata  attivita’  ispettiva  ed  indicare  le   opportune   misure
correttive atte a superare le disfunzioni rilevate.
Il presente decreto sara’ inviato all’organo di  controllo  per  la
registrazione e  sara’  pubblicato  nella  Gazzetta  Ufficiale  della
Repubblica italiana al fine di  assicurarne  una  diffusa  conoscenza
nell’intero territorio nazionale.
Roma, 13 dicembre 2011
Il direttore generale: Blasi
Registrato alla Corte dei conti il 30 gennaio 2012
Ufficio di controllo atti MISE – MIPAAF, registro n. 1, foglio n. 274
METODICA DI CAMPIONAMENTO ED ANALISI
Per la diagnosi  dei  cinque  virus  della  vite  previsti  dalla
certificazione la matrice da utilizzare in tutti i protocolli  e’  il
tessuto floematico ottenuto da materiale legnoso raccolto nel periodo
Un corretto campionamento  e’  un  presupposto  fondamentale  per
l’attendibilita’ del risultato  di  qualsiasi  saggio  diagnostico  e
anche lo stato di degradazione del materiale vegetale costituente  il
campione puo’ influire sul risultato dell’analisi di laboratorio.
Il corretto campionamento prevede quindi:
il prelievo del campione vegetale nel periodo idoneo;
la raccolta di materiale vegetale esente da alterazioni dovute  a
fattori abiotici o a fattori biotici di altra natura;
il corretto mantenimento del campione vegetale sino alla consegna
al laboratorio;
la rapida spedizione al laboratorio di diagnosi.
Norme da osservare per i prelievi in campo:
periodo: tutto il periodo di riposo vegetativo;
matrice: la matrice migliore e’ costituita da tralci  lignificati
dell’anno;
tipologia del campione: raccogliere almeno una  porzione  legnosa
lunga circa 60 cm dalla parte basale di tralci dell’anno. I  campioni
legnosi devono essere integri e  non  devono  presentare  alterazioni
dovute a fattori abiotici o a fattori biotici di altra natura;
mantenimento del campione:  il  materiale  vegetale  deve  essere
asciutto, deve essere posto in buste  di  plastica  da  conservare  a
basse temperature o in  luoghi  freschi  tali  da  evitare  eventuale
rintracciabilita’  del  campione:  ogni  campione   deve   essere
opportunamente siglato sulla busta e sulla pianta;
spedizione del campione: i campioni raccolti devono  arrivare  al
laboratorio  di  diagnosi  entro  72  ore  preferibilmente  in  borse
termiche.
Norme da osservare in laboratorio.
I campioni legnosi possono essere mantenuti a 4 °C non oltre i 60
giorni,  evitandone  la  disidratazione.  Conservazioni  piu’  lunghe
possono inficiare il risultato del saggio diagnostico.
Tutti i campioni vegetali che manifestano imbrunimenti  o  inizio
di muffa o seccumi non devono essere processati.
Saggio sierologico ELISA – Modalita’ generali
L’ELISA   consiste   in   una   reazione    specifica    antigene
(virus)-anticorpo che avviene su un supporto solido,  i  pozzetti  di
una piastra ELISA, e che viene  visualizzata  mediante  una  reazione
colorimetrica.
Strumentazione, materiali e reagenti necessari.
1) agitatore magnetico;
2) bilancia analitica;
3) distillatore;
4) frigorifero e congelatore;
5) incubatore termostatico (37 °C);
6) lavatore di piastre automatico (opzionale);
7) lettore piastre ELISA (fotometro);
8) micro pipette dedicate  e  calibrate  (P10,  P20,  P50,  P200,
P1000, P5000);
9) pipetta multicanale (opzionale);
10)  fresa  per  polverizzazione  del  legno  o   omogeneizzatore
(opzionale);
11) pH metro;
12) bisturi o coltelli.
1) kit sierologico ELISA;
2) reagenti chimici per i tamponi (PBS, PBS-T, tampone carbonato,
tampone di estrazione, tampone coniugato, tampone per substrato);
3) substrato (para-nitro-fenilfosfato – PNP);
4) controllo positivo, sicuramente infetto dai  virus  target  ed
appartenente alla stessa specie vegetale saggiata;
5) controllo negativo, sicuramente esente da infezione dai  virus
target ed appartenente alla stessa specie vegetale saggiata.
1) acqua distillata;
2) fogli di carta per ricoprire i banchi da lavoro;
3) carta da laboratorio;
4) rotoli di carta di alluminio;
5) guanti monouso;
6) pellicola trasparente;
7) mortai e pestelli;
8) piastre polistirene a novantasei pozzetti per  ELISA  ad  alta
capacita’ di legame con gli anticorpi;
9) puntali per micro pipette di  tutti  i  volumi  adeguati  alle
pipette sopra indicate;
10) vetreria varia o materiale plastico monouso;
11) lame da bisturi;
12) azoto liquido (opzionale).
L’efficienza del saggio  riportata  dalla  ditta  produttrice  e’
correlata ai test di qualita’ effettuati nelle condizioni  di  lavoro
espressamente riportate nel foglietto di istruzioni.
Seguire, quindi, attentamente tutte  le  istruzioni  della  ditta
produttrice del kit sierologico utilizzato. In particolare effettuare
scrupolosamente tutte le diluizioni dei reagenti riportate.
Utilizzare  la  diluizione  del  campione   nel   rapporto   1/10
peso/volume. Non modificare i tamponi indicati.
Procedura del saggio
Preparazione dei tamponi.
Il tampone carbonato per la sensibilizzazione delle  piastre,  il
tampone coniugato ed il tampone PBS (che puo’ essere  preparato  alla
concentrazione 10× da utilizzare  come  stock  di  partenza)  possono
essere  preparati  precedentemente  e  mantenuti  in  laboratorio,  a
temperatura ambiente. Controllare accuratamente  il  pH  del  tampone
carbonato perche’ e’ determinante per l’adesione degli anticorpi alla
plastica dei pozzetti.
Il tampone  per  il  substrato  puo’  essere  preparato  prima  e
mantenuto a 4 °C al riparo dalla luce.
Il tampone di estrazione deve essere sempre preparato poco  prima
dell’utilizzo e mantenuto a 4 °C o in ghiaccio.
E’ importante utilizzare i  tamponi  entro  trenta  giorni  dalla
preparazione. E’ possibile arrivare fino a  sei  mesi  se  i  tamponi
vengono aggiunti di sodio azide (0,2 g/L).
Preparazione del saggio ELISA.
Stabilire il numero di piastre ELISA necessario  e  preparare  un
opportuno schema cartaceo per piastra (allegato 1),  in  cui  vengono
riportati tutti i dati dell’esperimento.
Per ogni piastra e’ possibile caricare quarantuno  campioni  piu’
un controllo sano,  uno  infetto  ed  un  bianco  secondo  lo  schema
Come controllo positivo  e  negativo  possono  essere  utilizzati
quelli forniti dai kit commerciali oppure possono  essere  utilizzati
campioni di materiale vegetale, appartenenti alla  stessa  matrice  e
alla stessa specie dei campioni saggiati,  provenienti  da  una  vite
sicuramente infetta dai  virus  oggetto  di  studio  e  da  una  vite
sicuramente esente  da  virus,  rispettivamente.  In  questo  caso  i
controlli  devono  essere  macerati  congiuntamente  ai  campioni  da
saggiare.
Il controllo bianco e’ costituito da  tampone  di  estrazione  da
caricare al posto del campione vegetale.
Ciascun campione deve essere replicato su due pozzetti,  compresi
il controllo sano, quello infetto ed il tampone.
Otto pozzetti di bordo (evidenziati in  grigio  nell’allegato  1)
saranno riempiti con tampone, i valori pero’ non saranno  considerati
nel calcolo del rumore di fondo (vedi il  capitolo  «Valutazione  dei
risultati»).
Pulire accuratamente e disinfettare il piano di lavoro e coprirlo
con fogli di carta, da sostituire ad ogni fase.
Estrazione del virus dal campione da analizzare.
La matrice utilizzata per il  saggio  di  tutti  i  virus  e’  il
tessuto floematico, ottenuta seguendo le fasi di seguito elencate:
fase 1: rimozione dello strato corticale esterno (ritidoma)  fino
a mettere a nudo il tessuto floematico;
fase 2: prelievo del floema mediante raschiamento con  bisturi  o
fase 3: il tessuto  floematico  ottenuto  deve  essere  posto  in
mortaio e polverizzato con azoto liquido e  successivamente  aggiunto
del tampone di estrazione o, in  alternativa,  direttamente  macerato
con pestello in  presenza  di  tampone  di  estrazione  nel  rapporto
peso/volume 1/10;
fase 4: lasciare macerare il  floema  ottenuto  dalla  fase  3  a
contatto con il tampone di estrazione per 2-3 ore a freddo (4 °C o in
ghiaccio).
In  alternativa  e’  possibile  l’utilizzo  di  una   fresa   per
macinare/polverizzare il campione:
fase 1: il  campione  puo’  essere  trattato  in  due  modi:  con
rimozione dello strato corticale esterno (ritidoma)  oppure  trattato
integralmente. In questo caso l’unica accortezza e’ di  aumentare  la
quantita’ di campione a contatto con il tampone di estrazione;
fase 2: prelievo del floema, congiuntamente  agli  altri  tessuti
del tralcio legnoso, mediante macinazione/polverizzazione tramite una
fresa  (tipo  Granex  o  artigianale),  con  raccolta  del  materiale
campionato in contenitori di plastica;
fase 3: aggiungere il tampone di estrazione ai tessuti campionati
in rapporto 1/10; macerare direttamente a freddo (4 °C o in ghiaccio)
per 2-3 ore oppure (opzionale) omogeneizzare meccanicamente prima  di
lasciare a freddo (4 °C o in ghiaccio) per 2-3 ore.
E’ necessario siglare sempre ogni singolo campione.
durante le operazioni  di  preparazione  mantenere  i  mortai  in
ghiaccio o in cella fredda a 4 °C;
mantenere i campioni via via macerati in ghiaccio o a 4 °C.
Seguire l’evoluzione della reazione colorimetrica con  attenzione
nelle prime fasi, prendendo come riferimento il controllo positivo.
I risultati sono attendibili fino a che i controlli negativi, una
volta  sottratto  il  valore  di   fondo   (bianco),   non   superano
l’assorbanza di 0,2 OD.
Quantificare la colorazione tramite lettura visiva (+/-) e in  un
apposito fotometro a 405  nm.  Fare  almeno  tre  letture  a  partire
dall’inizio della colorazione del controllo  positivo  (o  del  primo
campione risultato infetto) e proseguire  fino  a  che  il  controllo
negativo non supera l’assorbanza di 0,2 OD.
Lo sviluppo  del  colore  puo’  essere  bloccato  aggiungendo  50
µl/pozzetto di NaOH 3M.
INTERPRETAZIONE DELLE LETTURE CON FOTOMETRO
Background  o  rumore di fondo (A) = media dei valori dell’assorbanza
dei controlli negativi
Threshold  o  limite  soglia  (B) = A x 2,5  se questo valore risulta
superiore o  uguale a 0,1 OD, in caso contrario il valore soglia sara’
pari a 0,1 OD.
Campione positivo: > = B
Campione negativo: < B
Nel  caso  in cui le due repliche non siano entrambe al di sopra o al
di sotto della soglia B, il campione deve essere considerato dubbio e
va  analizzato   di  nuovo,  utilizzando   lo  stesso  omogenato,  se
conservato  in  frigo,  entro  48 ore dalla sua preparazione, in caso
contrario estratto di nuovo.
ELISA diretta o DAS-ELISA (per i virus ArMV, GFLV, GLRaV-1 e GLRaV-3)
1. Sensibilizzazione della piastra ELISA con gli anticorpi specifici:
diluire gli anticorpi secondo quanto riportato sull'etichetta del
kit in tampone carbonato 1×;
mescolare bene la soluzione ottenuta;
distribuire la soluzione di anticorpi per ciascun pozzetto  nella
quantita'  indicata  dalla  ditta  produttrice  del   kit   specifico
(generalmente 100 o 200 µl);
coprire la piastra con pellicola  trasparente  o  con  l'apposito
coperchio;
incubare  in  camera  umida  alla  temperatura  e  per  il  tempo
richiesti dalla ditta produttrice.
Se ci sono  pozzetti  inutilizzati  non  lasciarli  asciutti,  ma
riempirli col tampone carbonato.
2. Estrazione del virus dai campioni:
seguire quanto sopra indicato nelle procedure del saggio.
3. Lavaggio della piastra:
dopo l'incubazione della piastra con gli anticorpi,  iniziare  il
fare il numero di lavaggi con PBS-T  riportato  sulle  istruzioni
per il tempo indicato;
asciugare la piastra battendola su carta da laboratorio, fino  ad
eliminare bolle o residui di tampone.
4. Distribuzione dei campioni:
caricare i campioni (100 o 200 µl per  pozzetto,  secondo  quanto
riportato  dalla  ditta  produttrice  del  kit)  seguendo  lo  schema
(eliminare gli otto pozzetti esterni), replicando ciascun campione in
due pozzetti. Includere un controllo positivo, un controllo  negativo
(pianta  sana)  e  un  controllo  bianco  (caricare  il  tampone   di
estrazione al posto del campione). Se ci sono  pozzetti  inutilizzati
non lasciarli asciutti, ma riempirli col tampone di estrazione;
riempire con tampone anche i pozzetti di bordo  in  grigio  nello
schema (vedi allegato 1);
Quando si preleva la soluzione macerata  fare  attenzione  a  non
versare nei pozzetti residui vegetali solidi.
5. Lavaggio della piastra:
lavare la piastra con PBS-T fino a  completa  rimozione  di  ogni
residuo di tessuto vegetale;
Questa  fase  di  lavaggio  e'  molto  critica  e  va  fatta  con
6. Distribuzione anticorpo specifico coniugato:
diluire il coniugato alla  diluizione  e  nel  tampone  riportato
dalla ditta produttrice;
caricare 100 o  200  µl  della  soluzione  ottenuta  per  ciascun
pozzetto;
riempirli col tampone coniugato.
7. Preparazione del substrato:
preparare il substrato cinque minuti prima dell'uso;
aggiungere al tampone substrato cinque minuti prima  dell'uso  il
4-Nitrophenyl phosphate disodium salthexahydrate alla  concentrazione
di  1  mg/1  ml.  Si  consiglia  di  utilizzarlo  nella  formulazione
commerciale in tavolette;
mantenere il substrato al buio prima dell'uso.
8. Lavaggio della piastra:
eliminare bolle o residui di
9. Caricamento del substrato:
caricare 100 o 200 µl della soluzione di substrato per  ciascun
pozzetto. Coprire la piastra con un foglio di alluminio ed  incubarla
a temperatura ambiente fino alla comparsa della colorazione.
10. Valutazione dei risultati:
seguire le modalita' sopra indicate  nelle  procedure  generali
del saggio.
ELISA indiretta o DASI-ELISA (per il virus GVA)
diluire gli anticorpi, secondo quanto riportato sull'etichetta in
tampone carbonato 1×;
riempirli col tampone carbonato
caricare i campioni (100 o 200 µl  per  pozzetto  secondo  quanto
previsto dalla ditta produttrice) seguendo lo schema  (eliminare  gli
otto pozzetti esterni), replicando ciascun campione in due  pozzetti.
Includere un controllo positivo, un controllo negativo (pianta  sana)
e un controllo bianco (caricare il tampone di estrazione al posto del
campione);
riempirli col tampone di estrazione.
6. Distribuzione del secondo anticorpo specifico:
diluire il  secondo  anticorpo  alla  diluizione  e  nel  tampone
riportato dalla ditta produttrice;
riempirli col tampone coniugato
7. Lavaggio della piastra:
8. Distribuzione dell'anticorpo coniugato:
9. Preparazione del substrato:
10. Lavaggio della piastra:
11. Caricamento del substrato:
12. Valutazione dei risultati:
ELISA con pre-sensibilizzazione con proteina A per il virus GVA
1. Pre-sensibilizzazione con proteina A:
diluire la proteina A, secondo quanto riportato sull'etichetta in
distribuire la soluzione di proteina A per ciascun pozzetto nella
quantita' indicata dalla ditta produttrice  del  kit  specifico  (200
µl);
Per la migliore ripetibilita'  del  saggio  e'  consigliabile  lo
stoccaggio della proteina A suddivisa in aliquote  minime  (es.:  per
una piastra) o in alternativa utilizzare in un'unica soluzione  tutto
il contenuto della proteina A e sensibilizzare  le  piastre  relative
che potranno essere conservate a  -20  °C.  E'  questo  un  passaggio
fondamentale dal  momento  che  la  proteina  A  va  incontro  ad  un
degradamento se congelata e scongelata piu' volte.
2. Lavaggio della piastra:
dopo l'incubazione della piastra iniziare il lavaggio;
3. Sensibilizzazione della piastra ELISA con anticorpi specifici:
diluire gli anticorpi secondo quanto riportato sull'etichetta  in
4. Estrazione del virus dai campioni:
6. Distribuzione dei campioni:
caricare 200 µl di ogni campione per pozzetto seguendo lo  schema
estrazione al posto del campione);
8. Distribuzione degli anticorpi specifici coniugati:
caricare 200 µl della soluzione ottenuta per ciascun pozzetto;
aggiungere al tampone substrato cinque minuti prima dell'uso il
caricare 200  µl  della  soluzione  di  substrato  per  ciascun
Punti critici dell'ELISA
a) Essendo l'ELISA una reazione antigene-anticorpo che avviene su
un supporto solido  la  scelta  della  piastra  e'  molto  importante
perche'  influisce  sul  legame  degli  anticorpi  e   sull'eventuale
background della reazione. Esistono diversi tipi di piastre ELISA  in
commercio: a fondo piatto o a fondo conico, ad alta,  media  e  bassa
capacita' di legame con gli anticorpi, dovuta a  pre-trattamenti  del
materiale plastico. Si consiglia di cambiare il tipo di piastra o  il
lotto  utilizzato  nel  caso  si  osservino  fenomeni   ripetuti   di
background (giallo diffuso sui controlli negativi) o  reazioni  molto
deboli. Accertarsi, comunque, che la piastra  sia  specifica  per  il
saggio  ELISA  (esistono  in  commercio  molti  tipi  di  piastre   a
novantasei pozzetti dedicate ad altri scopi).
b) Nello schema del test riportare anche il numero di  lotto  del
kit sierologico (puo'  essere  determinante  per  la  uniformita'  di
alcuni risultati).
c) Utilizzare il kit sierologico entro la data di scadenza.
d) Rispettare scrupolosamente le condizioni di  conservazione  di
tutti i reagenti.
e) Controllare con accuratezza  il  pH  dei  tamponi  utilizzati,
perche' e' determinante per la loro efficienza.
f) Controllare almeno una volta al mese la taratura  delle  micro
pipette utilizzate.
g) L'efficienza del test ELISA e' strettamente dipendente da  una
buona macerazione del campione vegetale, effettuare con molta cura le
operazioni di preparazione del campione.
h)  La  reazione  di  legame   antigene-anticorpo   che   avviene
all'interno  dei  pozzetti  della  piastra  ELISA  e'  efficiente   e
specifica solo se ad ogni passaggio vengono eliminati i reagenti  che
non  si  sono  legati.  Le  fasi  di  lavaggio  sono,  quindi,  molto
importanti per la  buona  riuscita  del  test.  Il  lavaggio  manuale
mediante uso di una bottiglia a spruzzo e' il piu' efficiente. Se  si
utilizzano macchinari per il lavaggio automatico delle piastre  ELISA
e' necessario controllare  ogni  settimana  la  perfetta  pulizia  ed
efficienza di ogni  canale  di  lavaggio.  In  particolare,  dopo  il
caricamento dei campioni fare molta attenzione ad eliminare qualunque
residuo  di  materiale  vegetale   (le   piastre   devono   risultare
assolutamente trasparenti).
i) Controllare sempre le etichette dei  reagenti  del  kit  ed  i
fogli di istruzione della ditta produttrice prima  di  effettuare  le
opportune  diluizioni  (possono  variare  in   funzione   del   lotto
utilizzato).
j) Le soluzioni di anticorpo o coniugato devono essere effettuate
secondo le istruzioni, in contenitori di vetro o  di  polietilene  (o
opportuna plastica a bassa capacita' di legame delle  proteine)  poco
prima dell'uso.
k)  Tenere  le  piastre  ELISA  sempre  coperte   con   pellicola
trasparente o l'apposito coperchio durante le incubazioni.
l) Controllare sempre la pulizia e le  condizioni  asettiche  dei
contenitori in cui vengono preparati e mantenuti i tamponi.
m) Utilizzare guanti per la manipolazione delle piastre  ELISA  o
fare molta attenzione a non toccare il fondo delle piastre.
n) I pozzetti delle righe e colonne esterne della piastra possono
essere soggetti al cosiddetto «effetto bordo», dovuto al contatto con
l'aria, che si evidenzia  con  la  colorazione  gialla  dei  pozzetti
indipendentemente dall'avvenuta reazione antigene-anticorpo. Caricare
i campioni sempre su doppio pozzetto in modo da evitare che  entrambi
risultino collocati solo su tali righe e colonne. Se l'effetto  bordo
si ripete costantemente, usare per il saggio solo i pozzetti centrali
ed eliminare i pozzetti di bordo, riempiendoli con tampone.
Tamponi necessari per l'effettuazione del test ELISA
ANALISI FITOSANITARIE DI IMPIANTI DI PIANTE MADRI PER  LA  PRODUZIONE
DI  MATERIALI  DI  MOLTIPLICAZIONE  DELLE  CATEGORIE  «INIZIALE»  E
«BASE».
Anno di primo campionamento
La tabella seguente indica sinteticamente l'anno di effettuazione
del primo campionamento in funzione dell'anno di impianto  del  campo
di piante madri.
In conseguenza della prassi  consolidata  del  controllo  annuale
degli impianti,  relativamente  agli  impianti  di  piante  madri  di
categoria «Base», la prima analisi di laboratorio per la ricerca  dei
virus  previsti  dalla  normativa,  puo'  essere  effettuata   quando
l'impianto  ha  sei  anni  di  eta'  (informazione  rilevabile  dalla
denuncia di produzione).
Ulteriori informazioni per il campionamento, l'analisi
ed i rapporti con il servizio di controllo
DI MATERIALI DI MOLTIPLICAZIONE DI CATEGORIA «CERTIFICATO».
degli impianti, anche a seguito  delle  disposizioni  previste  dalla
normativa  fitosanitaria  sulle  malattie  di  quarantena,  la  prima
analisi di laboratorio  per  la  ricerca  dei  virus  previsti  dalla
normativa, puo' essere effettuata quando l'impianto ha dieci anni  di
eta' (informazione rilevabile dalla denuncia di produzione).
Per semplificare la pianificazione dei prelievi negli impianti di
piante madri si riporta, nella sottostante tabella, un  quadro  delle
scadenze in relazione  all'anno  d'impianto  dei  vigneti  di  piante
madri:
ELENCO DEI LABORATORI  PUBBLICI  AUTORIZZATI  DAL  MINISTERO  PER  LE
FINALITA' DI CUI AL DECRETO MINISTERIALE  2  LUGLIO  1991,  N.  290
(INDICAZIONE SUPPLEMENTARE IN ETICHETTA) E DEI LABORATORI  PUBBLICI
PARTECIPANTI AL PROGETTO ARNADIA.
MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE ALIMENTARI E FORESTALI – DECRETO 13 dicembre 2011 redazione redazione 2015-05-05T23:19:24+00:00