Source: http://www.hplc.cz/Validace/program_validace.htm
Timestamp: 2017-11-24 20:08:11+00:00
Document Index: 45307814

Matched Legal Cases: ['čl.2', 'čl. 3', 'čl.3', 'čl.3', 'čl. 3', 'čl.3']

Validace v HPLC
Validační program pro statistické zpracování analytických dat
Druhy validací
Směrodatná odchylka sx
Podmínky stanovení směrodatné odchylky a opakovatelnosti
Správnost metody
Výtěžek metody - recovery
Test pomocí standardu regresní rovnicí
Porovnání s referenčním materiálem
Volba kalibračního modelu
Citlivost metody. Vliv matrice vzorku
Statistické testování
Test shody středních hodnot
Grubbsův test
Deanův a Dixonův test
Cochranův test
Validace instrumentální
Revalidace systému
1. Druhy validací
Validace metody v rámci jedné laboratoře se nazývá interní (vnitřní) validace a podle účelu může tato být validace průzkumová, plná atd. Interní validace, jejímž cílem je na omezeném počtu vzorků stanovit, zda zvolená analytická metoda je vhodnou metodou pro plnou validaci, se nazývá průzkumová validace. Zaměřuje se na vyhodnocení delikátních validačních parametrů jako je selektivita a robustnost, a na stanovení opakovatelnosti na omezeném počtu vzorků. Po prokázání vhodnosti průzkumové validace následuje plná validace, jejímž cílem je demonstrovat vhodnost metody k zamýšlenému použití vyhodnocením všech požadovaných validačních parametrů. Při zavedení publikované validované analytické metody (resp. validované metody v jiné laboratoři) se používá tzv. validace při převodu metody a obvykle zahrnuje stanovení správnosti a přesnosti. K ověření platnosti dříve plně zvalidované metody se používá kontrola způsobilosti metody a zahrnuje pouze kontrolu kalibrační přímky (linearita a citlivost). Existují-li již dříve naměřená data, která byla naměřena za stejných podmínek, může se použít tzv. retrospektivní validace, která umožní vyhodnotit jeden z nejdůležitějších validačních parametrů - opakovatelnosti.
Externí (vnější) validace zahrnuje interní validaci společně s validací metody srovnáním výsledků metody z více laboratoří (mezilaboratorní porovnávací zkoušky) a zahrnuje výpočet reprodukovatelnosti metody.
Pracovní postup (po výběru dané analytické metody) je chápán jako úplný analytický předpis, který slouží k reprodukování celé analytické metody. Proto musí obsaho­vat všechny nezbytné instrukce, musí být dostatečně přesný, podrobný a úplný. Pracovní postup musí být dostatečně optimalizován a takto používán se statistickou kontrolou měření.
Pracovní postup musí obsahovat následující údaje:
stručná charakteristika postupu - oblasti použití metody, princip postupu, chemické re­akce a interakce stanovované složky, analyt a matrice, rozmezí ob­sahů stanovované složky, princip měření a jednotky
roztoky, činidla a pomocné chemikálie - chemická čistota použi­tých chemikálií, jejich úprava a čištění, příprava rozpouštědel, činidel a pomocných chemikálií, stabilita a koncentrace
standardní operační procedura - mechanická úprava vzorku, chemická úprava vzorku, kalibrace, měření, výpočty a hodnocení.
V případě zavedených chyb nebo uvádění nepřesných a neúplných informací v pracovním postupu, dochází k používání subjektivních postupů operátora, což způsobuje zvyšování variability získaných experimentálních dat.
3. Validační parametry
3.1 Přesnost metody
Přesnost metody[1] je definována jako údaj o míře těsnosti shody mezi vzájemně nezávislými[2] výsledky zkoušek za předem specifikovaných podmínek. Přesnost závisí pouze na rozdělení náhodných chyb a nemá vztah k pravé hodnotě. Míra přesnosti se vyjadřuje (počítá) jako směrodatná odchylka výsledků zkoušek. Přesnost za podmínek opakovatelnosti se vyjadřuje jako opakovatelnost.
Není-li směrodatná odchylka závislá na obsahu (X), uvádí se její absolutní hodnota v těch jednotkách jako samotný výsledek, je-li směrodatná odchylka závislá na obsahu, uvádí se relativní hodnota v % nebo jako desetinný zlomek. Je-li směrodatná odchylka konstantní v ce­lém oboru měřených hodnot, pak se také počítá relativní směrodatná odchylka vztažená na nejvyšší hodnotu souboru xmax.
3.1.1 Směrodatná odchylka sx
Rozptýlení jednotlivých hodnot xi okolo průměru x je charakterizováno hodnotou směrodatné odchylky
kde n je počet stupňů volnosti (zde n = n-1). Odhad hodnoty sx se může počítat pomocí rozpětí R, které je definováno jako rozdíl mezi nejmenší a největší hodnotou kvalitativního znaku. Pro výpočet sx analyzuje m vzorků podobného složení, přičemž každý vzorek se analyzuje nA-krát, přičemž obsahy stanovo­vané složky v těchto vzorcích mají být rozloženy v celém rozsahu xmin až xmax. Pro směrodatnou odchylku, je-li nezávislá na obsahu, platí
kde xji je i-té stanovení j-tého vzorku, xj je průměr stanovení.
Provádí-li se dvě paralelní stanovení na m vzorcích, je směrodatná odchylka vyjádřena:
kde Rj= ½xj1-xj2 ½ je rozpětí, tj. rozdíl obou paralelních stanove­ní, provedených na j-tém vzorku. Pro odhad sx pomocí rozpětí R však musí být k dispozici tolik hodnot, aby n=1/2nA³10. Je-li směrodatná odchylka silně závislá na obsahu, počítá se pro minimálně pět zvolených úrovňových hladin (X) podle vztahu (1) nebo (2) a vyjadřuje se jako relativní směrodatná odchylka sr = sx/X pro danou úrovňovou hladinu.
Protože je směrodatná odchylka náhodná veličina, nemůže být pokládána za obecně platnou charakteristiku dané analytické metody a musí být specifikována:
pro přesně specifikovaný pracovní postup bez sebemenších odchylek, v hodnotě sx musí být zahrnuty všechny zdroje variability, tedy i ty, které plynou z pracovního postupu (rozklad vzorku, rozpouštění, extrakce, ředění, konečné instrumentální měření), v případě jakékoli změny v pracovním postupu se musí hodnota směrodatné odchylky revalidovat
musí být určena z dostatečně velkého počtu vzorků téhož materiálu, směrodatná odchylka platí pro danou koncentrační hladinu a materiál
nesmíse určovat z jedné ověřovací série, ale z dlouhodobého měření.
3.1.2 Opakovatelnost
V případě dvou paralelních stanovení se přesnost výsledků určuje pomocí tzv. dovolené diference paralelních stanovení, tj. maximální rozpětí, které charakterizuje přesnost výsledků a dovoluje toto rozpětí vysvětlit přítomností náhodných chyb.
Pro určení dovolené diference se vychází z vypočtené směrodatné odchylky čl.2.1.1 (1, 2) a dovolená diference n paralelních stanovení je pak vyjádřena pro zvolenou hladinu významnosti P:
Rmax = q.sx
kde sx je směrodatná odchylka, q je tabelovaná hodnota Studentizovaného rozpětí (viz tabulka.I)[3]
Pro vypočtenou dovolenou diferenci paralelních stanovení platí ustanovení posledního odstavce čl. 3.1.1.
Opakovatelnost metody je definována jako těsnost shody mezi navzájem nezávislými výsledky zkoušek získanými za podmínek opakovatelnosti (podmínky, kdy navzájem nezávislé výsledky zkoušek se získají opakovaným použitím téže zkušební metody na identickém materiálu, v téže laboratoři, týmž pracovníkem za použití týchž přístrojů a zařízení, během krátkého časového rozmezí (viz definice shodnosti). Ukazatel opakovatelnosti r[4] je pak definován rovnicí (3), přičemž pro platí q = 2,8.
Tab.I Kritické hodnoty Studentizovaného rozpětí q
Poznámka: P - hladina významnosti
3.1.3 Podmínky stanovení směrodatné odchylky a opakovatelnosti
Pro určení směrodatné odchylky se zvolí nejméně pěti úrovňových hladinách (X) tak, aby počet vzorků m byl nejméně 20, při počtu paralelních stanovení nA=2. Do validačního protokolu se uvádí všechny změřené veličiny a vypočtená směrodatná odchylka. Jestliže se předpokládá funkční závislost mezi Rmax a úrovňovou hladinou (X), vyšetří se, zda Rmax závisí na X a určí se tato závislost (hodnota Rmax (resp. sx má snahu nabývat větších hodnot s rostoucí koncentrační úrovni (X)).V případě, že se nehomogenita materiá­lu stává nedílnou součástí rozptýlení výsledků, bude možno očekávat funkční závislost pouze v případě, že i tato heterogenita je funkcí X. Pro zjednodušení se uvažují pouze dva druhy závislosti - lineární, který je vyjádřený rovnicí Rmax = a + bX nebo exponenciální závislost, vyjádřená rovnicí log Rmax = c + d.log X. Pro koeficienty a = 0 a d = 1 jsou rovnice ekvivalentní a dává se přednost rovnici lineární. V případě b = 0 (pro většinu výsledků je b £ 0,1) je Rmax (resp. sx) konstantní v celém rozsahu hodnot X.[5] Není-li směrodatná od­chylka závislá na obsahu, počítá se relativní směrodatná odchylka vzhledem k největší hodnotě souboru xmax. Dovolená diference se vypočítá z naměřených dat podle (3) pro zvolenou hladinu významnosti, která je uvedena.
3.2 Správnost metody
Přesnost metody je definována jako těsnost shody získané hodnoty s jeho hodnotou skutečnou přijatou referenční hodnotou. Jedná se tedy o statisticky významnou rozdílnost mezi získanou a skutečnou hodnotou. Hodnocením správnosti metody je tedy určit přítomnost či nepřítomnost náhodné soustavné složky chyby otestováním velikosti rozdílu nebo soustav­nosti znaménka mezi hodnotou "dáno" a "nalezeno", a to buď porovnáním se standardem, porovnáním analýz ověřované a osvědčené (zavedené) metody, srovnáním s referenčním materiálem, výsledky z referenční laboratoře.
3.2.1 Výtěžnost metody - recovery
Recovery neboli výtěžnost udává poměr množství (koncentrační) analytu získaného danou analytickou metodou (nII) k přijaté referenční hodnotě (nI):
Hodnota recovery se může vyjadřovat jako desetinný zlomek nebo v pro­centech (Re/%/=Re.100).
Tímto testem se testuje rozdíl získaného průměru , určeného z m paralelních stanovení od přijatelné referenční hodnoty X a to analýzou srovnávacího vzorku se známým obsahem stanovované složky (analytu). Množství a složení matrice musí odpovídat reálným vzorkům pro danou metodu. Pak platí
Jestliže t ³ t(P=0,95;f=m-1), pak rozdíl je statisticky význam­ný a je prokázána soustavná chyba, je-li t £ t(P=0,95;f=m-1), pak se liší průměr pouze o náhodnou chybu. Kritické hodnoty Studentova rozdělení t jsou uvedeny v příloze I.
Při určení recovery a následného testu platí následující akceptační kriteria:
počet paralelních opakování k určení směrodatné odchylky sx pro danou koncentrační hladinu musí být minimálně sedm a relativní směrodatná odchylka sx musí být 3 % pro každou koncentrační hladinu. Průměrná výtěžnost Re se musí pohybovat mezi 95 % a 105 % pro každou koncentrační hladinu.
srovnávací vzorky musí pokrývat celý koncentrační obsah analytu a koncentrační hladina odpovídá většinou 50 % až 200 % nominální koncentrace analytu ve vzorku; obvykle se volí minimálně tři koncentrační hladiny.
V případě, že srovnávací vzorek není dostupný, pak se použije referenční hodnota certifikovaného referenčního materiálu nebo se použije referenční hodnota získaná jinou nezávislou metodou resp. metodami nebo se použije positivních vzorků s přídavkem analytu (standardní přídavek). Vnesení přídavku by se mělo provést v takovém kroku analytického postupu, aby byl posti­žen celý pracovní postup. Odezva analytu se stanovuje nejméně v sedmi positivních vzorcích ze kterých se počítá průměr analytu. Vzorky se standardním přídavkem se opakují nejméně sedmkrát na nejméně třech koncentračních hladinách. Při výpočtech se opět postupuje podle rovnice (4,5) a platí stejná akceptační kriteria uvedená výše.
3.2.2 Test regresní rovnicí
Pomocí tohoto testu se zjišťuje, zda je výše (čl.3.2.1) prokázaná soustavná chyba konstantní, nebo proporcionální, tj. závislá na obsahu analytu. Pro několik standardních vzorků s referenční hodnotou xi se určí velikost hodnot yi a jejich závislost se vyjádří formou lineární regrese mezi m nalezenými hodnotami yi a referenčními hodnotami xi
Pokud budou obě metody (resp. nalezená a referenční hodnota) poskytovat stejné výsledky, bude závislost yi na xi lineární s nulovým úsekem a ­= 0 a jednotkovou směrnicí b = 1. Je-li hodnota a nenulová, jedná se o chybu konstantní, je-li hodnota b odlišná od 1, jedná se o soustavnou chybu. Pro lineární regresní rovnici se počítá odhad směrodatné odchylky koeficientu a - sa a odhad směrodatné odchylky regresního koeficientu b - sb. Výpočet koeficientů a, b a směrodatné odchylky saa sb je uveden v čl.3.1 (11, 12, 14, 15).
Významnost se testuje pro
Jestliže ta ³ t(P=0,95;f=m-2), pak rozdíl je statisticky význam­ný a je prokázána konstantní soustavná chyba, je-li ta<t(P = 0,95;f=m-2), pak se liší průměr pouze o náhodnou chybu. Je-li pro­kázána konstantní soustavná chyba, většinou se dá dobře odstranit (odpovídá např. hodnotě slepého pokusu). Jestliže tb³ t(P=0,95;f=m-2), pak rozdíl je statisticky význam­ný a je prokázána proporcionální soustavná chyba, je-li tb < t(P=0,95;f=m-2), pak se liší průměr pouze o náhodnou chybu.
3.2.3 Porovnání s referenčním materiálem
Podmínkou pro použití tohoto srovnání k určení přesnosti metody je dostupnost referenčního materiálu s deklarovanou koncentrací (xref) a deklarovanou shodností danou směrodatnou odchylkou (sref)
Při tomto postupu vyhodnocení musí být dodržena následující kritetia:
opakovaně se analyzuje referenční materiál v počtu opakování 6 až 10
vypočte se směrodatná odchylka (s) a průměrná hodnota ( )
vypočtené hodnoty se porovnají deklarovanými hodnotami, přičemž pro statistické vyhodnocení se používá interval spolehlivosti. Pokud platí nerovnost: xref – 2 sref < < xref + 2 sref, je správnost metody pro danou matrici a koncentrační úroveň prokázána. K validaci správnosti metody je třeba použít tolik referenčních materiálů, aby se pokryl celý koncentrační rozsah a všechny matrice, na které se metoda používá.
3.3 Volba kalibračního modelu
3.3.1 Linearita
Linearita je chápána jako přímková závislost mezi dvěma náhodnými proměnnými, tj. odezvou instrumentace (analytickým signálem) a koncentrací analytu. Těsnost vzájemné závislosti dvou náhodných proměnných charakterizuje korelační koeficient (r). Při lineární závislosti nabývá hodnoty +1 a čím více se blíží jedné, tím je závislost obou proměnných těsnější.
Pro počet m vzorků známého obsahu analytu xi se určí odpovídající intenzita signálu yi, pak pro každou z m naměřených hodnot se vypočítá odchylka od průměru Yi=yi- a Xi=xi- , kde je průměr hodnoty yi, je průměr hodnoty xi. Pro lineární závislost se pak může korelační koeficient odhadnout takto:
Hodnota korelačního koeficientu nesmí klesnout po hodnotu 0,98.
Pro lineární kalibraci se řeší dva problémy:
a) volba vhodného kalibračního modelu a výpočet odhadu jeho parametrů
b) odhad směrodatné odchylky.
Kalibrační model ve tvaru přímky E[y]=box (a) /procházející počátkem/ nebo E[y]= a + bx (b).
Lineární závislost dvou náhodných proměnných je matematicky vyjádřena obecným vztahem:
kde parametr a je úsek (posunutí), parametr b /bo/ je směrnice kalib­rační přímky (regresní koeficient). Při výpočtu hodnot koeficientů a, b se vychází z platnosti modelu regresní závislosti, který předpokládá konstantní rozptyl pro všechny hodnoty závisle proměnné - použití metody nejmenších čtverců.
Pro regresní koeficient b platí:
a pro koeficient a platí:
Směrodatná odchylka, která charakterizuje rozptýlení kolem regresní přímky, se vypočítá podle vztahu:
kde jsou predikované hodnoty yi, tj. hodnoty vypočtené z reg­resní rovnice. Výraz (yi- ) se nazývá absolutní reziduum, směro­datná odchylka sy,x se nazývá také směrodatná odchylka reziduí.
Odhad směrodatné odchylky koeficientu a - sa se vypočítá podle vztahu :
kde je průměrná hodnota nezávisle proměnné x.
Směrodatná odchylka regresního koeficientu b - sb se vypočítá podle vzorce:
Testování, jehož smyslem je porovnání odhadů a,b se skutečnými hodnotami parametrů a, b, lze provést za použití Studentova t-testu (7) při testování pro a = 0 a vypočtená hodnota t se porovnává s tabelovanou kritickou hodnotou Studentova rozdělení. Jestliže ta ³ t(P=0,95;f=m-2), pak rozdíl je statisticky význam­ný. Obdobně se může testovat i regresní koeficient b /8/ proti očekávané hodnotě b = 1 a porovnáním s kritickou hodnotou. V případě, že se otestováním zjistí, že rozdíl koeficientu a od nuly je statisticky nevýznamný, může se pak předpokládat závislost typu (10a). Pro regresní koeficient bo pak platí
a pro směrodatnou odchylku , která charakterizuje rozptýlení kolem regresní přímky pro předpoklad a = 0 , platí:
kde hodnoty jsou predikované hodnoty yi, tj. hodnoty vypočtené z reg­resní rovnice (10a). Odhad směrodatné odchylky je vždy větší než odhad směrodatné odchylky sy,x.Pomocí F-testu je třeba rozhodnout, zda je toto zhoršení přesnosti signifikantní nebo ne. Hodnota F se počítá jako
kde sy,x je směrodatná odchylka (13). Vypočtená hodnotu F se porovná s kritickou hodnotou Fisher-Snedecerova rozdělení F pro n1 = 1, n2 = m-2 a pro zvolenou hladinu významnosti (příloha II). Je-li hodnota F podle vztahu (18) menší než kritická hodnota, lze oba způsoby vystižení závislosti (10a, 10b) pokládat za rovnocenné, přičemž vyjádření podle vztahu (10a) je jednodušší.
Konstanty kalibrační funkce y = a + bx sestrojené z m bodů, se mohou měnit s časem a je nutná kontrola celého systému. Počet re­kalibračních standardů o známém obsahu analytu xi odpovídá počtu konstant kalibrační závislosti. Při rekalibraci se vypočítá nová hodnota regresního koeficientu b´ a otestuje se rozdíl obou hodnot pomocí Studentova t-testu:
resp. vypočte se hodnota koeficientu a´ a otestuje opět rozdíl obou hodnot pomocí Studentova t-testu:
Pokud je t £ t(P=0,95;f=m-1), nejsou dokazatelné žádné odchylky od původně určené hodnoty regresního koeficientu b. Je-li rozdíl statisticky významný, je třeba kalibraci opakovat. Obdobné závěry platí pro koeficient a.
Při určení linearity a následných testů platí následující akceptační kriteria:
počet kalibračních vzorků je minimálně 5 (obsahy analytu x jsou v oblasti xmin až xmax) a pro každou koncentrační hladinu se stanoví nejméně dvakrát (tzn. minimálně získáme 10 údajů). Provede se regresní analýza všech dat a ne pouze jejich průměrných hodnot (korelační koeficient r (9), koeficienty a, b (11, 12, 16) a testování koeficientů a, b (6, 7, 13, 14, 15, 17, 18))
směrnice kalibrační křivky (b) se ověřuje před každou analýzou (nejméně ze dvou bodů) a testuje se podle (19). V případě, že rozdíl mezi hodnotami regresních koeficientů je statisticky významný, provede se rekalibrace
jednobodová kalibrace se může použít v případě, úsek na ose y je zanedbatelný a platí podmínky rovnice (7,18).
3.3.2 Citlivost metody. Vliv matrice vzorku
Citlivost metody je definována jako rozdíl v koncentraci analytu, který odpovídá nejmenšímu rozdílu, jenž může být ještě detekován při odezvě instrumentace metody. Matematicky je citlivost metody vyjádřena jako první derivace kalibrační funkce y = f(x):
a pro lineární závislost se jedná o směrnici kalibrační přímky vy­jádřená regresním koeficientem b (11, 16).
Vliv matrice vzorku na hodnotu směrnice a úseku regresní křivky se prokazuje srovnávacím roztokem kalibračních roztoků s matricí za stejných akceptačních podmínek (3.1) a vypočtou se hodnoty koeficientů a´,b´ a provede se statistické testování (19a,b). Jestliže jsou koeficienty a,b v rámci chyby shodné, pak přítomnost odchylky kalibrace vlivem matrice nebyla prokázána. V případě, že se prokáže vliv matrice, je třeba používat ke kalibraci kalibračních roztoků v příslušné matrici.
V případě, že matrice vzorku není dostupná, použije se metoda standardního přídavku pro pět koncentračních hladin (v minimálně dvou opakování) k positivnímu vzorku pro stanovení shodnosti směrnic regresních křivek (porovnání úseku-koeficientu a´ u této metody není možné). Vypočte se směrnice kalibrační křivky b´ a provede se statistické testování (19a). Jestliže jsou směrnice v rámci chyby shodné, pak přítomnost odchylky kalibrace vlivem matrice nebyla prokázána. V případě, že se prokáže vliv matrice, je třeba používat místo vyhodnocení kalibrační křivkou používat metodu standardního přídavku k potlačení vlivu matrice na odchylku kalibrace.
3.3.3 Mez detekce metody
Mez detekce odpovídá koncentraci, pro kterou je analytický signál statisticky významně odlišný od šumu. Mez detekce yD odpovídá hodnotě koncentrace, pro kterou je dolní mez (1-a) %ního intervalu spolehlivosti predikce signálu z kalibračního modelu rovna yC, tj. kritické úrovni (představuje horní mez 100(1-a)%ního intervalu spolehlivosti predikce signálu z kalibračního modelu pro koncent­raci rovnou nule, tj. slepý pokus). Pro kritickou úroveň platí:
kde m je počet hodnot kalibrační křivky, je průměrná hodnota závisle proměnné yi, je průměrná hodnota nezávisle proměnné xi, t je kvantil Studentova rozdělení pro f = m-2 (P=0,95), sy,x je směrodatná odchylka absolutních reziduí (yi- ) (13,17), b je regresní koeficient kalibrační přímky.
Pro lineární kalibrační model lze psát pro mez detekce yD:
Odpovídající koncentrace xD se pak vypočte podle vztahu:
Mez detekce udává skutečnou úroveň signálu, která ještě umožňu­je detekci koncentrace.
U separačních metod se používá k výpočtu meze detekce velikost hodnoty signálu slepého pokusu. Podmínkou je, že jsou k dispozici chromatogram slepého pokusu a směrnice kalibrační přímky v kombinaci s následujícím postupem: z chromatogramu slepého pokusu se určí maximální kolísání základní linie (hmax) v oblasti dané 20-ti násobkem pološířky píku stanovovaného analytu. Pro odezvu meze detekce platí: yD = 3hmax a pro koncentraci na mezi detekce:
Je nutné uvést, že směrnice kalibrační přímky b1 musí být ze koncentrační závislosti y = b1x, kde y je výška chromatografického píku a ne plocha jak je obvyklé.
U metod, u nichž je k dispozici slepý pokus (optické metody - spektrofotometrie, AAS), se opakovanou analýzou slepého pokusu (v počtu 6 až 10 opakování) určí průměrná hodnota slepého pokusu a směrodatná odchylka . Pro odezvu meze detekce platí a koncentraci meze detekce platí:
kde b1 je směrnice kalibrační přímky.
3.3.4 Mez stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti yS je nejmenší hodnota signálu, pro kterou je relativní směrodatná odchylka predikce z kalibračního modelu dostatečně malá a obyčejně se pokládá hodnotě 0,1. Pro yS platí:
Odpovídající koncentrace je pak rovna:
Při výpočtu meze detekce a meze stanovitelnosti platí stejná akceptační kriteria uvedena v čl. 3.1. Obecně je však mez stanovitelnosti rovna hodnotě y1, tj. prvnímu kalibračnímu bodu kalibračního modelu a její odpovídající hodnotě x1. V případě, že hodnota signálu yS<y1, bude odpovídající hodnota xS zatížena chybou , protože kalibrační funkce je platná pouze v oblasti naměřených hodnot. V tomto případě je účelné provést rekalibraci pro níž platí y1£yS.
U separačních metod se používá k výpočtu meze stanovitelnosti velikost hodnoty signálu slepého pokusu. Podmínkou je, že jsou k dispozici chromatogram slepého pokusu a směrnice kalibrační přímky v kombinaci s následujícím postupem: z chromatogramu slepého pokusu se určí maximální kolísání základní linie (hmax) v oblasti dané 20-ti násobkem pološířky píku stanovovaného analytu. Pro odezvu meze stanovitelnosti platí yS = 10hmax a pro mez stanovitelnosti:
U metod, u nichž je k dispozici slepý pokus (optické metody - spektrofotometrie, AAS), se opakovanou analýzou slepého pokusu (v počtu 6 až 10 opakování) určí průměrná hodnota slepého pokusu a směrodatná odchylka . Pro odezvu meze stanovitelnosti platí a koncentraci meze detekce platí:
3.4 Selektivita
Selektivita analytické metody je definována jako schopnost přesného a správného určení analytu i v přítomnosti interferujících látek (matrice). Selektivní metoda je tedy taková metoda, která za určitých podmínek umožňuje přesné a správné stanovení obsahu složky ve vymezené směsi jiných složek. Selektivita analytické metody je testována porovnáním výsledků vzorků standardů s výsledky vzorků s matricí. Interference matrice se projevuje tím, že analytický signál neodpovídá stanovovanému analytu, ale tento signál je superponován signálem rušivé složky (čistota signálu). Prokazování selektivity metody je do jisté míry závislé na použité instrumen­tální technice a proto je nutné pro každý použitý systém vypracovat individuální program prokazování selektivity metody.
V případě, že je dostupná matrice vzorku, k zjištění selektivity metody se analyzují srovnávací vzorky matrice, srovnávací vzorky metody (vzorek bez přítomnosti matrice a analytu - rozpouštědla) v minimálním počtu tří těchto vzorků a kalibrační standard o nejnižší koncentraci. Stanoví se velikost a rozptyl signálů pozadí a významnost těchto signálů vzhledem k výsledku kalibračního standardu (statistické testování F-testem shody rozptylů a t-testem shody středních hodnot). V případě prokazatelné statistické významnosti velikosti pozadí signálu:
- pocházejícího ze srovnávacího vzorku metody, se musí odstranit zdroj interference (kontaminace rozpouštědla, laboratorního nádobí, přístrojů)
- pocházejícího ze srovnávacího vzorku matrice, je nutné optimalizovat extrakci vzorku, předseparaci (čištění vzorku), chromatografickou separaci.
Odezva interferujících látek musí být menší než 1 % odezvy nejnižší koncentrační hladiny analytu ve vzorku.
V případě, že matrice vzorku není dostupná provedou se stejné operace jako v předešlém případě mimo analýz srovnávacích vzorků matrice; místo analýz srovnávacích vzorků matrice se použijí positivní vzorky s analytem a sledují se kvalitativní data signálu, zda je signál tvořen pouze sledovaným analytem (UV spektra, IR spektra pro standardní substanci a vzorek). V případě, že detekční metoda neumožní sbírat kvalitativní data, použije se k prokázání čistoty signálu jiná technika nebo se používají certifikované materiály s přijatou referenční hodnotou a selektivita metody se takto prokazuje nepřímo.
3.5 Robustnost metody
Robustnost metody je definována jako míra vlivu kolísání úrovně jednotlivých parametrů na výsledek analytického stanovení. Další definice a postupy ověření robustnosti jdou uvedeny zde.
3.5.1 Postup
Statistická optimalizace má význam hlavně v instrumentální analýze, musí být však pečlivě naplánována i provedena (ideální případ je on-line propojení s PC). Dále si ukážeme postup ověření robustnosti dle Placketta a Burmana. Při každé optimalizaci musí být předem definována účelová funkce y (např. směrodatná odchylka), která nabývá za optimálních podmínek určitého extrému a lze ji kvantitativně vyčíslit. Dále musí být určeny faktory x, které významně ovlivňují hodnotu y. Jako faktory mohou být použity jenom vzájemně nezávislé proměnné.
Statistická optimalizace se zpravidla provádí v několika po sobě jdoucích krocích:
zvolí se účelová veličina (účelová funkce), která nabývá za optimálních podmínek svého maxima nebo minima. Tato veličina je vy­jádřena kvantitativně (číselně), označuje se y.
uváží se jednotlivé faktory, které mohou mít vliv na konečný výsledek, popř. na hodnotu účelové funkce y, a to i takové, jejichž vliv lze jenom předpokládat. Jednotlivé faktory se označí x.
z velkého počtu faktorů se určí ty, které výrazně ovlivňují účelovou funkci.
pro významně se uplatňující faktory xi se určí extrém (minimum nebo maximum) účelové veličiny y. Ty hodnoty xi, za nichž y nabývá optima (minima nebo maxima) představují optimální podmínky analytické metody.
Významnost jednotlivých faktorů se může určit pomocí zkrácené multifaktorové analýzy. Jedná se o dvoustupňové (l=2) neúplné plány pokusů umožňující určit x m pokusů (m musí být dělitelné l2=4) významnost nebo nevýznamnost faktorů n=m-1.
V Placketově-Burmanově plánu se každé z proměnných přiřadí dvě hodnoty, vyšší (+) a nižší (-). Celý plán (tabulka II) je uspořádán tak, že v každém řádku je m/2 proměnných větší hodnotu (+) a ostatní proměnné, tj. (m/2-1) proměnných, hodnotu nižší (-). V pos­ledním řádku mají všechny proměnné hodnotu (-). Po sestavení prv­ního řádku plánu vznikají další řádky cyklickou záměnou znamének (+) a (-).
Prakticky se postupuje tak, že se zvolí 4 parametry, u nichž se dá předpokládat vliv na výsledek (jedná se o parametry xA-xD). Zvolí se minimální a maximální hodnota každého z uvedených para­metrů. Při volbě stupňů faktorů je třeba si uvědomit, že 2 stupně představují linearizaci závislosti y na daném faktoru. To je spl­něno tehdy, není-li rozdíl mezi jednotlivými stupni (+) a (-) pří­liš velký, avšak příliš malý rozdíl může naopak způsobit, že se zjistí vliv nevýznamný i tehdy, když vliv ve skutečnosti na y existuje. Pokud není možné odhadnout rozdíl mezi (+) a (-), do­poručuje se provést celý postup dvakrát, pokaždé s jinými rozdíly mezi (+) a (-).
Tab. II Placketův-Burmanův plán pro 7 proměnných při 8 pokusech
Účelová veličina
Působení Wi
Význam jednotlivých symbolů je následující
xi(i=A- G)
parametry analýzy, jejichž vliv na výsledek se zjišťuje
yj(j=1-8)
výsledek analýzy při daná kombinaci hodnot xA až xD
vyšší nebo nižší hodnota parametru xA až xG
Wi(i=1-8)
působení příslušného parametru xA až xG na výsledek y
Sloupce pro xEaž xG se neobsadí žádnou skutečnou veličinou a použijí se pro výpočet vlivu zdánlivě proměnné WS. Pro kombinaci hodnot parametrů podle výše uvedeného schématu se provede 8 analýz identického vzorku za identických podmínek s rozdílem změn hodnot xA až xD. Takto zjištěné yj se zapíše do příslušného sloupce (viz schéma). Hledaný vliv jednotlivých proměnných (faktorů) se zjistí ze vztahu:
Vypočtené hodnoty Wi jsou pouze odhady a lze je porovnávat pouze za použití statistických metod. Vlivem náhodných chyb kolísá proměnná WS okolo nuly a umožňuje vypočítat rozptyl při m pokusech a n skutečných faktorech jako:
a pro směrodatnou odchylku sw:
Vliv faktoru se pokládá za významný tehdy, když
ke s je směrodatná odchylka, t (P,f) je kritická hodnota Studen­tova rozdělení pro zvolenou hladinu významnosti P.
Placket-Burmanův plán s m=8 pokusy poskytuje malý počet stupňů volnosti (f=3) pro testování, což způsobuje malou citlivost průkazu významnosti. Proto se vychází z většího plánu, kdy je vetší po­čet nezávisle proměnných WS, což umožňuje jistější zjištění významnosti.
Pro takové větší plány se volí pak první řádek:
m = 12 + + - + + + - - - + -
m = 16 + + + + - + - + + - - + - - -
m = 24 - - - - + - + - + + + - + + - - - + + + + + -
Ostatní řádky se určí cyklickými záměnami, poslední má všechny hodnoty (-).
3.6 Statistické testování
Statistické testování se uplatňuje při objektivním porovnávání výsledků analýz na dvou souborech experimentálně získaných dat (např. určení významnosti způsobu přípravy vzorků, vliv teploty, času, koncentrace použitých při konkrétním pracovním postupu).
3.6.1 Test shody rozptylů
Jsou dány dva soubory dat pro jejichž směrodatné odchylky platí s12 ¹ s22. Klasický F-test umožňuje ověření hypotézy H0 : s12 = s22 proti alternativní hypotéze HA: s12 ¹ s22. Testovací kriterium má tvar:
a platí-li, že s12> s22, má F -test počet stupňů volnosti f1 = (n1-1) a f2 = (n2-1) (v opačném případě se pořadí stupňů volnosti zamění). Tento test je citlivý na předpoklad normality obou výběrů. Platí-li, že F ³ F(P;f1,f2), je hypotéza H0 o shodě rozptylů zamítnuta.
3.6.2 Test shody středních hodnot
Jsou dány dva soubory dat o průměrech x1 a x2 a platí x1 ¹ x2 Studentův t-test umožňuje testování hypotézy H0: mx1= mx2 proti alternativní HA: mx1¹ mx2 při splnění předpokladů o výběrech:
1) sx12 = sx22 má testovací kriterium tvar:
kde s2 je rozptyl
Tato testovaná statistika má Studentovo rozdělení s f = n1 + n2 - 2 stupni volnosti. Platí-li, že t1 ³ t(P;f), je rozdíl obou průměrů za statisticky významný a hypotéza H0 je zamítnuta.
2) sx12 ¹ sx22 má testovací kriterium tvar
Tato testovaná statistika má Studentovo rozdělení s f stupni volnosti
Platí-li, že t2³ t(P;f), je hypotéza H0 o shodě středních hodnot zamítnuta. Určitým problémem je neznalost obou hodnot sx12 a sx22. V případě, že platí n1 = n2> 8, lze použít testovací kriterium t1 i když sx12 ¹ sx22. V případě, že n1 ¹ n2, lze použít testovacího kriteria, když je poměr výběrových rozptylů blízký jedné.
3.6.3 Odlehlé hodnoty
Pro použití v analytické praxi k vyloučení odlehlých výsledků [6] je nejvhodnější Grubbsův test T za použití míry rozptýlení, která je podobná směrodatné odchylce (populační směrodatná odchylka), nebo Deanův a Dixonův test Q za použití rozpětí R nebo Studentovým t-testem.
3.6.3.1 Grubbsův test
Při tomto testu se výsledky seřadí podle velikosti tak, že x1<x2... <xn a vypočte se kritérium:
podle toho, zda se testuje na odlehlost výsledek největší (xn) nebo nejmenší (x1). Hodnota Sn odpovídá populační směrodatné odchylce
Hodnota Tn nebo T1 se porovnává s kritickou hodnotou Grubbsova rozdělení Ta (příloha III). Je-li T1 nebo Tn³ Ta, je výsledek odlehlý. V opačném případě, tj. je-li T1 nebo Tn <Ta, je splněna nulová hypotéza a testovaný výsledek se nevylučuje.
Nevýhodou tohoto testování je, že se pro účely testování musí počítat s populační směrodatnou odchylkou (36). Může se však postupovat i tak, že se dosazuje do kritéria
kde sx je výběrová směrodatná odchylka (1). Vypočtené hodnoty Ts,n resp. Ts,1 vypočtené podle (37) se porovnávají s kritickou hodnotou Ts,a, která se vypočte
Je-li Ts,1 nebo , je výsledek odlehlý a musí se z testovaného souboru dat vyloučit.
3.6.3.2 Deanův a Dixonův test
Výsledky se seřadí podle velikosti a vypočte se
a poté se porovnává výsledek s kritickou hodnotou Qa, která je tabelovaná v tabulce III pro dané n a a. Je-li Qn nebo Q1 ³ Qa, je testovaný výsledek odlehlý a vylučuje se. Deanovo a Dixonovo kritérium nelze použít k vylučování ze tří výsledků, jsou-li dva z nich stejné, protože podle tohoto kritéria vychází každý výsledek, který se liší od zbývajících dvou výsledků, jako odlehlý, i když ve skutečnosti patří do téhož základního souboru.
Tab. III. Kritické hodnoty Qa pro vylučování odlehlých výsledků
Vylučování odlehlých výsledků je možno použít při počtu paralelních stanovení n³3. Při větším počtu výsledků, je-li odlehlým výsledkem současně nejnižší i nejvyšší, může testování podle Grubbse i Deana a Dixona selhat, protože symetrie obou odlehlých výsledků okolo průměru způsobí zároveň i zvětšení hodnoty Sn nebo R ve jmenovateli vztahu (35, 39).
3.6.3.3 Studentův t-test
Výhodou tohoto testování oproti Grubbsovu testu a testu podle Deana a Dixona je, že při testování odlehlých výsledků neovlivní výpočet hodnoty t velikost směrodatné odchylky sx nezahrnuje testované krajní hodnoty souboru dat. Podle rovnice (31) se vypočítá
kde X je výsledek, který se testuje na odlehlost, celkový průměr (bez testovaného výsledku X) sx - směrodatná odchylka (1), která nezahrnuje testovaný výsledek X a n je počet výsledků z nichž je počítán celkový průměr . Je-li t>t(P;f = n-1), jsou výsledky odlehlé.
3.6.3.4 Cochranův test
Cochranův test se používá v pokusech s jednoduchými úrovněmi, neboť se jedná o test homogenity rozptylů. Cochranův test prověřuje pouze největší hodnotu ze souboru směrodatných odchylek nebo rozpětí - jednostranný test. Nehomogenita rozptylů se však může projevit i tím, že některá ze směrodatných odchylek nebo rozpětí může být výrazně nižší proti ostatním. Toto může být výrazně ovlivněno také stupněm zaokrouhlením výsledků. Vylučovat ale výsledky, jejichž směrodatná odchylka resp. rozdíl vykazují lepší vzájemnou shodu se nezdá být logické.
Pro daný soubor p odhadů směrodatných odchylek si, kdy každý z odhadů byl stanoven na základě n opakovaných výsledků zkoušek, je charakteristika Cochranova testu C dána vztahem:
V případě opakování kdy n=2 lze použít místo směrodatných odchylek si použít rozpětí wi a Cochranova charakteristika má tvar:
V obou výrazech (41, 42) představuje smax a wmax vždy největší hodnotu ze souboru všech hodnot. Kritické hodnoty Cochranovy statistiky jsou uvedeny v příloze IV pro hladinu významnosti P = 0,95 a P = 0,99. Prakticky se postupuje tak, že je-li největší odhad směrodatné odchylky nebo rozpětí označena jako odlehlá, vyloučí se a Cochranův test se použije na zbylé hodnoty. Tento postup se může dále opakovat; přílišné zamítání hypotézy nesvědčí o základním předpokladu normality výběru.
3.7 Validace instrumentální
Validace jednotlivých komponent systému (hardware) je zjednodu­šena v případě, že použitá technika je certifikována podle norem řady ISO (International Organization for Standardization) 9000 - 9004. V tomto případě je testování celého systému zaručena výrobcem. V opačném případě je testování specifickou záležitostí jednotlivých komponent systému a pro ně musí být zpracován individuální validační program instrumentace.
4. Revalidace systému
Podmínky revalidace systému nejsou obecně definovatelné, protože každá změna v celém analytickém systému vede zákonitě k jeho revalidaci. Každá změna musí být však posouzena individuálně, zda má prokazatelný vliv na konečný výsledek. V kladném případě je nutné provést revalidaci, avšak tato revalidace nemusí být komplexní, ale pouze jako dílčí krok validačního programu (např. kalibrace, citlivost) s tím, že musí být zpětně určena směrodatná odchylka (resp. Rmax) a zda tato změna nemá vliv na velikost Rmax resp. sx (viz čl.3.1.1). Některé podmínky, které definují nutnost revalidace jsou dány již ve validačním programu.
5. Validační protokol
Validační protokol se odvolává na validační program, respektive konkrétní validační program. Do validačního protokolu se zazname­návají všechna měření, výpočty i pomocné výpočty. Výsledky a závě­ry jsou zřetelně definované. Do validačního protokolu se uvádí da­tum jednotlivých zkoušek, jméno zodpovědného pracovníka a jména dalších pracovníků, kteří se podíleli na validačním programu.
Literární odkazy mohou být součástí jednotlivých článků vali­dačního programu nebo se může uvést literární odkaz jako samostat­ná příloha validačního programu.
Eckschalger K., Horsák I., Kodejš Z.: Vyhodnocování analytických výsledků a metod, SNTL,Praha 1980.
Doerffel K., Eckschalger K.: Optimální postup chemické analýzy, SNTL, Praha 1985.
Meloun M., Militký J.: Statistické zpracování experimentálních dat na osobním počítači, FINISH, Pardubice 1992.
Hubek L.: Good Laboratory Practice, Hewlett-Packard Company, 1993.
ČSN 01 0251 Stanovení opakovatelnosti a reprodukovatelnosti normalizované zkušební metody pomocí mezilaboratorních zkoušek. ÚNM Praha, 1988.
Mocák J., Eckschlager K.:Chem.Listy,81(1),1-24 (1987).
ČSN ISO 3534-1 Statistika-slovník a značky Část 1: Pravděpodobnost a obecné statistické termíny. ČNI, 1994.
Nejistota výsledků v analytické praxi, Sborník referátů a závěry diskuse, BIJO T.C. a.s. 1998 Praha.
Interlaboratory Analytical method Validation - Short Course Manual, AOAC International, 1996.
Validace analytických metod,Vítězslav Centner, EffiChem (http://www.effichem.cz)
[1] Dříve byl používán pojem přesnost metody, anglický ekvivalent - precision
[2] Nezávislé výsledky jsou výsledky získané takovým způsobem, že nejsou ovlivněny žádným předchozím výsledkem na tomtéž nebo podobném zkoušeném vzorku
[3] Studentizované rozpětí (q) - rozpětí R vyjádřené ve směrodatné odchylce jednotlivých pozorování jako jednotce q = R/sx.
[4] Ukazatel opakovatelnosti r- hodnota, pod níž bude s pravděpodobností 95 % ležet absolutní hodnota rozdílu dvou výsledků zkoušek provedených za podmínek opakovatelnosti.
[5] Dříve byl používán pojem správnost metody, anglický ekvivalent - accuracy [7]. Platí správnost = přesnost + shodnost (truens = accuracy + precision)
[6] Odlehlé hodnoty: pozorování ve výběru natolik se svými hodnotami lišící od ostatních, že vzbuzují domněnku, že pocházejí z jíného základního souboru nebo že jsou důsledkem chyby měření [cit.7].