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Timestamp: 2019-10-19 07:20:29
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Vigencia desde 6 de abril de 1994. Esta revisi�n vigente desde 1 de abril de 2007.
ANEXO I. Método de diagnóstico, detección e identificación de la necrosis bacteriana, Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff).
ANEXO II. Conservación de las pruebas analíticas en caso de aparición de un brote sospechoso.
ANEXO III. Elementos que deben tenerse en cuenta para la determinación de la población contaminante.
ANEXO IV. Medidas bajo control oficial.
ANEXO V. Métodos oficialmente autorizados para la eliminación de residuos.
el diagnóstico de la necrosis bacteriana en tubérculos y plantas de patata,
la detección de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus en muestras de tubérculos y plantas de patata,
la identificación de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ( C. m. subsp. sepedonicus ).
Si en la primera prueba de selección (IF o PCR/FISH) se obtiene un resultado positivo, puede sospecharse la contaminación con C. m. subsp. sepedonicus y se debe efectuar una segunda prueba de selección. Si el resultado de la segunda prueba de selección es positivo, la sospecha se confirma (aparición sospechosa) y las pruebas deben proseguir de acuerdo con el método. En el caso de que el resultado de la segunda prueba de selección sea negativo, la muestra no se considerará contaminada con C. m. subsp. sepedonicus .
1.1 Método de detección para el diagnóstico de la necrosis bacteriana en tubérculos y plantas de patata que presentan síntomas de necrosis bacteriana.
Este protocolo de análisis está destinado a los tubérculos y plantas de patata que muestran síntomas típicos o sospechosos de necrosis bacteriana. Incluye una prueba de selección rápida, el aislamiento del patógeno del tejido vascular infectado en un medio de diagnóstico y, en caso de resultado positivo, la identificación del cultivo como C. m. subsp. Sepedonicus .
(1) El punto 2 recoge una descripción de los síntomas.
(2) Se consideran adecuadas las pruebas siguientes:
- la prueba IF (punto 4),
- la prueba PCR (punto 5),
- la prueba FISH (punto 6).
(3) Aunque el aislamiento de patógeno a partir de material vegetal con síntomas típicos mediante dilución de placas es sencillo, el aislamiento puede fallar en estados avanzados de infección, las bacterias saprofitas que crecen en el tejido enfermo pueden enmascarar o inhibir el patógeno en el medio de aislamiento. Se recomienda, por tanto, utilizar medios selectivos y no selectivos, preferiblemente MTNA (punto 8) o la prueba de bioensayo (punto 7).
(4) El punto 8 recoge una descripción de la morfología típica de las colonias.
(5) Si los resultados de la prueba de aislamiento son negativos, pero los síntomas de la enfermedad son los típicos, deberá repetirse el aislamiento.
(6) La identificación fiable de un cultivo puro de C.m. subsp. sepedonicus se consigue utilizando las pruebas que se enumeran en el punto 9.
(7) En el punto 10 se describe la prueba de patogenicidad.
1.2 Método de detección e identificación de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus en muestras de tubérculos de patata asintomáticos.
Este protocolo de análisis se destina a la detección de infecciones latentes en tubérculos de patata asintomáticos mediante al menos dos pruebas de selección basadas en distintos principios biológicos que, de ser positivas, deberán complementarse con el aislamiento del patógeno; en caso de aislamiento de colonias típicas, se procede a continuación a la identificación de un cultivo puro como C. m. subsp. sepedonicus . El hecho de obtener resultados positivos sólo en una de las pruebas no es suficiente para considerar la muestra sospechosa.
(1) El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos, aunque el procedimiento puede adaptarse para muestras con menos tubérculos en el caso de que no se disponga de 200.
(2) Los métodos de extracción y concentración del patógeno se describen en el punto 3.1.
(3) En el caso de que al menos dos de las pruebas basadas en principios biológicos diferentes proporcionen resultados positivos, habrá de procederse al aislamiento y la confirmación. Debe realizarse como mínimo una prueba de selección. Cuando el resultado de esta prueba sea negativo, la muestra se considerará negativa. En el caso de que el resultado de esta prueba sea positivo, será necesario realizar dos o más pruebas de selección basadas en principios biológicos diferentes con el fin de verificar el primer resultado positivo. Sí la segunda prueba o el resto de las pruebas proporcionan resultados negativos, la muestra se considerará negativa y no será necesario llevar a cabo más pruebas.
(4) Prueba de inmunofluorescencia (IF). Para la prueba de selección IF debe utilizarse siempre un anticuerpo policional, los anticuerpos monoclonales adicionales pueden proporcionar una mayor especificidad (véase el punto 4).
(5) Prueba PCR. Deben utilizarse reactivos y protocolos PCR convenientemente validados (véase el punto 6).
(6) Prueba FISH. Deben utilizarse reactivos y protocolos convenientemente validados (véase el punto 5).
(7) Aislamiento selectivo. Con el medio MTNA o el medio NCP-88 y una dilución al 1/100 del precipitado resuspendido, es en muchos casos un método adecuado para el aislamiento directo de C. m. subsp. sepedonicus . Entre 3 y 10dias después de la siembra selectiva pueden obtenerse colonias típicas. Posteriormente se puede purificar e identificar el patógeno. Para poder aprovechar plenamente el potencial de la prueba, es necesario preparar con cuidado las cuñas de la parte basal a fin de evitar que otras bacterias secundarias asociadas al tubérculo de la patata, que compitan con C. m. subsp. sepedonicus en el medio, puedan afectar al desarrollo del patógeno. Si la prueba de la siembra selectiva no resulta efectiva, se deberá proceder al aislamiento a partir de las plantas utilizadas para el bioensayo (véase el punto 8).
(8) La prueba de bioensayo se utiliza para el aislamiento de C. m. subsp. sepedonicus a partir de precipitado de extracto de patatas mediante el enriquecimiento selectivo de la bacteria en berenjenas ( Solanum melongena ). Exige que las condiciones de incubación sean óptimas, según se especifican en este método. Es muy probable que las bacterias inhibidoras de C. m. subsp. sepedonicus en los medios MTNA o NCP-88 no interfieran en esta prueba (véase el punto 7).
(9) En el punto 8 se describe la morfología típica de las colonias.
(10) Los cultivos o bioensayos pueden fallar debido a la competencia de las bacterias saprofitas o a la inhibición provocada por las mismas. En el caso de que se obtengan resultados positivos en las pruebas de selección pero negativos en las de aislamiento, se deberán repetir las pruebas de aislamiento a partir del mismo precipitado o utilizando además tejido vascular de la parte basal de tubérculos cortados de la misma muestra y, si fuese necesario, con otras muestras.
(11) La identificación fiable de cultivos puros supuestamente de C. m. subsp. sepedonicus se consigue utilizando las pruebas que se describen en el punto 9.
(12) En el punto 10 se describe la prueba de patogenicidad.
1.3 Método de detección e identificación de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus en muestras de plantas de patata asintomáticas.
(1) Véase el punto 3.2 para obtener información sobre los tamaños recomendados de la muestra.
(2) Los métodos de extracción y concentración del patógeno se describen en el punto 3.2.
(3) En el caso de que al menos dos de las pruebas basadas en principios biológicos diferentes proporcionen resultados positivos, habrá de procederse al aislamiento y la confirmación. Debe realizarse como mínimo una prueba de selección. Cuando el resultado de la prueba sea negativo, la muestra se considerará negativa. En el caso de que el resultado de esta prueba sea positivo, será necesario realizar dos o más pruebas de selección basadas en principios biológicos diferentes con el fin de verificar el primer resultado positivo. Si la segunda prueba o el resto de las pruebas proporcionan resultados negativos, la muestra se considerará negativa y no será necesario llevar a cabo más pruebas.
(4) En el punto 8 se describe la prueba de aislamiento selectivo y la morfología típica de las colonias.
(5) En el punto 4 se describe la prueba IF.
(6) En el punto 6 se describe la prueba PCR.
(7) En el punto 5 se describe la prueba FISH.
(8) En el punto 7 se describe la prueba de bioensayo.
(9) Los cultivos o bioensayos pueden fallar debido a la competencia de las bacterias saprofitas o a la inhibición provocada por las mismas. En el caso de que se obtengan resultados positivos en las pruebas de selección pero negativos en las de aislamiento, se deberán repetir las pruebas de aislamiento y, si fuese necesario, efectuar pruebas con otras muestras.
(10) La identificación fiable de cultivos puros supuestamente de C. m. subsp. sepedonicus se consigue utilizando las pruebas que se describen en el punto 9.
(11) En el punto 10 se describe la prueba de patogenicidad.
2. EXAMEN VISUAL PARA DETECTAR SÍNTOMAS DE NECROSIS BACTERIANA.
2.1 Plantas de patata.
En las condiciones climáticas europeas, los síntomas se presentan rara vez en el campo y con frecuencia sólo al final de la temporada. Por otra parte, en numerosos casos, otras enfermedades, la senescencia o los daños mecánicos enmascaran los síntomas o se confunden con ellos. Por tanto, puede ser fácil pasar por alto los síntomas en las inspecciones de campo. Los síntomas de marchitamiento son muy distintos de los de la podredumbre parda; el marchitamiento es normalmente un proceso lento y se limita en principio a los bordes de las hojas. El crecimiento de las hojas jóvenes infectadas no suele detenerse, aunque sea más lento en las zonas infectadas. Esto hace que las hojas tengan formas extrañas. Las hojas afectadas por el bloqueo de los tejidos vasculares de la parte baja del tallo desarrollan con frecuencia zonas intenerviales cloróticas amarillas o anaranjadas. Los foliolos, hojas e incluso tallos infectados pueden llegar a morir. Con frecuencia las hojas y tubérculos muestran simplemente un tamaño reducido. En algunos casos las plantas se atrofian. Se pueden consultar fotografías en color de algunos de estos síntomas en el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
2.2 Tubérculos de patata.
Los primeros síntomas consisten en un ligero aspecto vítreo o traslúcido del tejido, sin ablandamiento, en torno al sistema vascular, en especial cerca de la parte basal. La corona vascular de la parte basal puede tener un color ligeramente más oscuro de lo normal. El primer síntoma claramente detectable consiste en que la corona vascular adquiere una coloración amarillenta y al comprimir suavemente el tubérculo emergen de los vasos unos exudados de aspecto lechoso. Dicho exudado contiene millones de bacterias. Se puede producir el oscurecimiento del tejido vascular y los síntomas que presentan los tubérculos en esta fase son similares a los de la podredumbre parda provocada por Ralstonia solanacearum . Al principio, estos síntomas pueden limitarse a una parte de la corona, no necesariamente cerca de la parte basal, y pueden extenderse posteriormente a la totalidad de la corona.
A medida que la infección progresa, se produce destrucción de tejido vascular; la zona cortical externa puede separarse de la zona cortical interna. En las fases avanzadas de la infección, se producen grietas en la superficie del tubérculo, que suelen tener un color pardo rojizo en los bordes. Recientemente se han producido varios casos en Europa en los que la zona cortical central se ha podrido al mismo tiempo que la corona vascular provocando una invasión secundaria con oquedades y necrosis interna. Los síntomas pueden verse enmascarados por una invasión secundaria fúngica o bacteriana que puede hacer difícil, o incluso imposible, diferenciar los síntomas de necrosis bacteriana avanzada de otras necrosis de los tubérculos. Pueden presentarse síntomas atípicos. Se pueden consultar fotografías en color de algunos de estos síntomas en el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
3.1 Tubérculos de patata.
El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos por ensayo. Para realizar un muestreo más intensivo es preciso llevar a cabo más pruebas con muestras de este tamaño. El hecho de disponer de un número mayor de tubérculos en la muestra puede provocar la inhibición o dificultar la interpretación de los resultados. No obstante, el procedimiento puede adaptarse convenientemente a muestras formadas por un número menor de tubérculos en el caso de que no se disponga de 200.
La validación de todos los métodos de detección descritos más adelante se basa en los ensayos realizados con muestras de 200 tubérculos.
El extracto de patata descrito a continuación puede emplearse también para la detección de la bacteria de la podredumbre parda de la patata, Ralstonia solanacearum.
bien añadir la solución de tampón de extracción (apéndice 3) en cantidad suficiente para que cubra las cuñas (aproximadamente 40 ml) y agitar en un agitador rotatorio (50-100 rpm) durante 4 horas a una temperatura inferior a 24 °C o durante 16 a 24 horas si están refrigeradas;
o bien homogeneizar las cuñas con solución de tampón de extracción (apéndice 3) en cantidad suficiente (aproximadamente 40 ml), ya sea mediante una trituradora (por ejemplo, Waring o Ultra Thurax) o machacándolas en una bolsa de maceración desechable sellada (por ejemplo, bolsas resistentes Stomacher o Bioreba de polietileno de 150 mm x 250 mm, esterilizadas por radiación) utilizando un mazo de caucho o un aparato triturador adecuado (por ejemplo, Homex).
3.1.4 Decantar el sobrenadante. Si presenta un aspecto excesivamente turbio, clarificarlo centrifugándolo a baja velocidad (a 180 g como máximo, durante 10 minutos, a una temperatura entre 4 y 10 °C) o mediante filtración al vacío (40-100 µm), lavando el filtro con solución adicional (10 ml) de tampón de extracción (apéndice 3).
3.1.6 Resuspender el precipitado en un 1,5 ml de tampón de precipitado (apéndice 3). Utilizar 500 µl para la prueba de C. m. subsp. sepedonicus , 500 µl para Ralstonia solanacearum y 500 µl a efectos de referencia. Añadir glicerol estéril en una concentración final de 10-25 % (v/v) a los 500 µl de la alícuota de referencia y a la alícuota restante de cada prueba, homogeneizar por agitación y guardar a una temperatura entre -16 y -24 °C (semanas) o entre -68 y -86 ° C (meses). Mantener las alícuotas de la prueba a una temperatura comprendida entre 4 y 10 °C durante los ensayos.
3.2 Plantas de patata
bien añadir la solución de tampón de extracción (apéndice 3) en cantidad suficiente para que cubra las secciones (aproximadamente 40 ml) y agitar en un agitador rotatorio (50-100 rpm) durante 4 horas a una temperatura inferior a 24 °C o durante 16 a 24 horas si están refrigeradas;
o bien procesar inmediatamente triturando las secciones en una bolsa de maceración resistente (p. ej. Stomacher o Bioreba) con una cantidad adecuada de tampón de extracción (apéndice 3) utilizando para ello un mazo de caucho o un aparato triturador adecuado (p. ej. Homex). Si esto no es posible, almacenar las secciones de tallo refrigeradas durante 72 horas como máximo o a temperatura ambiente durante 24 horas como máximo.
3.2.5 Dividir el extracto puro o concentrado de la muestra en dos partes iguales. Mantener una de las partes a 4-10 °C durante los ensayos y almacenar la parte restante, tras haber añadido glicerol estéril al 10-25 % (v/v), a una temperatura comprendida entre -16 y -24 °C (semanas) o entre -68 y -86 °C (meses) en el caso de que sea necesario realizar nuevas pruebas.
4. PRUEBA IF.
Conviene utilizar anticuerpos frente a la cepa de referencia de C. m. subsp. sepedonicus . Se recomienda determinar el título para cada nuevo lote de anticuerpos. El título se define como la dilución superior en la que se produce la reacción óptima cuando se realiza la prueba con una suspensión que contiene entre 105 y 106 células por ml de la cepa homóloga de C. m. subsp. sepedonicus y se utiliza una dilución apropiada del conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC), según las recomendaciones del fabricante.
(véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
La prueba debería realizarse con extractos de muestras que se acaben de preparar. Si fuese necesario, puede efectuarse también con extractos almacenados a una temperatura comprendida entre -68 y -86 °C en glicerol. El glicerol puede separarse de la muestra mediante la adición de 1 ml de tampón de precipitado (apéndice 4), la recentrifugación durante 15 minutos a 7.000 g y la resuspensión en el mismo volumen de tampón de precipitado. Normalmente esto no es necesario, especialmente si las muestras se fijan al portaobjetos flameándolas (véase el punto 2.2).
Preparar otros portaobjetos con controles positivos de la cepa homóloga o de cualquier otra cepa de referencia de C. m. subsp. sepedonicus , suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el apéndice 2 y, opcionalmente, en tampón.
De ser posible, deberán utilizarse tejidos infectados de forma natural (conservados mediante liofilización o congelación a temperaturas comprendidas entre -16 y -24 °C) como control similar, en el mismo portaobjetos.
Para precipitados con una cantidad relativamente pequeña de sedimento de almidón:
Verter con una pipeta un volumen determinado (15 µl es suficiente para pocillos de 6 mm de diámetro; aumentar el volumen si el diámetro es mayor) de una dilución al 1/100 del precipitado de patata resuspendido en el primer pocillo. Posteriormente, verter un volumen similar de precipitado sin diluir (1/1) en los demás pocillos de la fila. La otra fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 1.
Para otros precipitados:
Preparar diluciones decimales (1/10 y 1/100) del precipitado resuspendido en el tampón de precipitado. Verter con una pipeta un volumen determinado (15 µl es suficiente para pocillos de 6 mm de diámetro; aumentar el volumen si el diámetro es mayor) del precipitado resuspendido y de cada dilución en una de las filas de pocillos. La otra fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 2.
si el portaobjetos se ha preparado según el inciso i del punto 4.1:
si el portaobjetos se ha preparado según el inciso ii del punto 4.1:
Figura 1. Preparación del portaobjetos de acuerdo con el punto 4.1, inciso i, y el punto 4.3, inciso i.
Figura 2. Preparación del portaobjetos de acuerdo con el punto 4.1, inciso ii, y el punto 4.3, inciso ii.
4.3.7 Verter con una pipeta de 5 a 10 µl de tampón fosfato glicerol de 0,1 M (véase el apéndice 3) o una solución comercial similar que proteja la fluorescencia (anti-fading) en cada pocillo y tapar.
4.4 Lectura de la prueba IF:
4.4.3 Existen varios problemas inherentes a la especificidad de la prueba de inmunofluorescencia. En los precipitados de cuñas basales y secciones de tallo de patata pueden aparecer poblaciones de base de células fluorescentes de morfología atípica y bacterias saprofitas con reacción cruzada cuyo tamaño y morfología sean similares a los de C. m. subsp sepedonicus .
si se encuentran células fluorescentes brillantes con morfología característica, calcular el número medio de células típicas por campo microscópico y el número de células típicas por ml de precipitado resuspendido (apéndice 4).
La prueba IF es positiva para las muestras que presenten al menos 5 x 103 células típicas por ml de precipitado resuspendido. La muestra se considera potencialmente contaminada y es necesario realizar nuevas pruebas,
la prueba IF es negativa para las muestras que presenten menos de 5 x 103 células por ml de precipitado resuspendido y la muestra se considera negativa. No es necesario realizar nuevas pruebas.
5. PRUEBA FISH.
El procedimiento siguiente debería llevarse a cabo, a ser posible, con extracto de muestra que se acabe de preparar, pero también puede realizarse con extracto de muestra que se haya almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre -16 y -24 °C o entre -68 y -86 °C.
Como controles negativos, deben utilizarse alícuotas de extracto de muestra que previamente haya arrojado resultados negativos para C. m. subsp. sepedonicus .
Como controles positivos, deben prepararse suspensiones que contengan de 105 a 106 células por ml de C. m. subsp. sepedonicu (por ejemplo, la cepa NCPPB 4053, o PD 406) en tampón fosfato de concentración 0,01 M de un cultivo de 3 a 5 días (para la preparación véase el apéndice 2). Preparar en otro portaobjetos controles positivos de la cepa homóloga o de cualquier otra cepa de referencia de C. m. subsp. sepedonicus , suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el apéndice 2.
5.1 Fijación del extracto de patata.
El protocolo siguiente se basa en Wullings et al. , (1998):
5.1.2 Verter 100 µl de cada extracto de muestra en un tubo eppendorf y centrifugar durante 8 minutos a 7 000 g.
5.1.3 Quitar el sobrenadante y disolver el precipitado en 500 µl de solución fijadora preparada con menos de 24 horas de antelación. Agitar e incubar de un día para otro a 4 °C.
El etanol al 96 % constituye una solución fijadora alternativa. Para utilizarlo, disolver el precipitado a partir del paso 5.1.2. en 50 µl de tampón fosfato de concentración 0,01 M y 50 µl de etanol al 96 %. Agitar la mezcla e incubar a 4 °C durante 30 a 60 minutos.
5.1.4 Centrifugar durante 8 minutos a 7 000 g, quitar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 75 µl de tampón fosfato de concentración 0,01 M (véase el apéndice 3).
5.1.5 Colocar 16 µl de las suspensiones fijadas en un portaobjetos múltiple limpio, tal como muestra la figura 3. Aplicar 2 muestras diferentes por portaobjetos sin diluir y utilizar 10 µl para realizar una dilución al 1:100 (en tampón fosfato de concentración 0,01 M). La solución de la muestra restante (49 µl) puede almacenarse a -20 °C tras la adición de 1 volumen de etanol al 96 %. En el caso de que sea necesario repetir la prueba FISH, separar el etanol mediante centrifugación y añadir un volumen equivalente de tampón fosfato de concentración 0,01 M (mezclar mediante agitación).
Figura 3. Distribución del portaobjetos para la prueba FISH.
5.2 Prehibridación e hibridación.
5.2.1 Preparar una solución de lisozima que contenga 10 mg de lisozima (Sigma L-6876) en 10 ml de tampón (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Esta solución puede almacenarse pero sólo debe congelarse y descongelarse una vez. Cubrir todas las muestras bien con aproximadamente 50 µl de solución de lisozima e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Sumergir los portaobjetos en agua desmineralizada una única vez y secar con papel de filtro.
Alternativamente, en lugar de lisozima, añadir 50 µl de 40-400 µg ml-1 de proteinasa K en tampón (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) en cada pocillo e incubar a 37 °C durante 30 minutos.
5.2.4 Preparar la solución de hibridación (apéndice 7) con 45 µl por portaobjeto, y preincubar durante 5 minutos a 55 °C.
5.2.5 Colocar los portaobjetos en una placa caliente a 45 °C y aplicar 10 µl de solución de hibridación en cada uno de los 4 pocillos del (o de los) portaobjetos.
5.2.11 Sumergir las preparaciones brevemente en agua ultrapura y colocarlas en papel de filtro. Eliminar el exceso de humedad cubriendo la superficie con cuidado con papel de filtro. Verter de 5 a 10 µl de solución de montaje protectora de la fluorescencia (p. ej. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA o equivalente) en cada pocillo y aplicar un cubreobjetos grande (24 x 60 mm) sobre la totalidad de los portaobjetos.
5.3 Lectura de la prueba FISH:
5.3.1 Los portaobjetos deben examinarse inmediatamente utilizando un microscopio epifluorescente a 630 o 1.000 aumentos con aceite de inmersión. Con un filtro adecuado para isotiocianato de fluoresceína (FITC) las células eubacterianas (incluidas la mayoría de las células gramnegativas) de la muestra aparecen teñidas de verde fluorescente. Utilizando un filtro para tetrametilrodamina5-isotiocianato, las células de C. m. subsp. sepedonicus marcadas con Cy3 aparecen teñidas de rojo fluorescente. Comparar la morfología de las células con la de los controles positivos. Las células deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente teñidas.
5.3.2 Comprobar si hay células fluorescentes brillantes con la morfología característia de C. m. subsp. sepedonicus en los pocillos de los portaobjetos (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). La intensidad de la fluorescencia debe ser mejor que la de la cepa de control positivo o equivalente a la misma. Deberán descartarse las células que presenten una tinción incompleta o cuya fluorescencia sea escasa.
5.3.4 Existen varios problemas inherentes a la especificidad de la prueba FISH. En los precipitados de cuñas basales y secciones de tallo de patata pueden aparecer poblaciones de base de células fluorescentes de morfología atípica y bacterias saprofitas con reacción cruzada cuyo tamaño y morfología sean similares a los de C. m. subsp. sepedonicus , aunque con mucha menor frecuencia que en la prueba IF.
se obtendrán resultados válidos en la prueba FISH siempre que en todos los controles positivos y en ninguno de los controles negativos se observen células teñidas de verde fluorescente brillante, cuyo tamaño y morfología sean los típicos de las de C. m. subsp. sepedonicus , cuando se utilice el filtro FITC, y células teñidas de rojo fluorescente brillante cuando se utilice el filtro de rodamina. Si se encuentran células fluorescentes brillantes con morfología característica, calcular el número medio de células típicas por campo microscópico y el número de células típicas por ml de precipitado resuspendido (apéndice 4). Las muestras que presenten al menos 5 x 103 células típicas por ml de precipitado resuspendido se considerarán potencialmente contaminadas y será preciso realizar nuevas pruebas. Las muestras que presenten menos de 5 x 103 células típicas por ml de precipitado resuspendido se considerarán negativas,
los resultados de la prueba FISH serán negativos cuando, utilizando el filtro de rodamina, no se observen células teñidas de rojo fluorescente brillante con un tamaño y morfología típicos de C. m. subsp. sepedonicus , siempre que se observen células teñidas de rojo fluorescente brillante típicas en las preparaciones de control positivo cuando se utilice el filtro de rodamina.
6. PRUEBA PCR.
extracto de la muestra que previamente haya proporcionado resultados negativos para C. m. subsp. sepedonicus ,
controles de tampón utilizados para extraer la bacteria y el ADN de la muestra,
mezcla para la reacción PCR.
alícuotas de los precipitados resuspendidos a los que se haya añadido C. m. subsp. sepedonicus (para la preparación, véase el apéndice 2),
una suspensión de 106 células por ml de C. m. subsp. sepedonicus en agua de un aislado virulento (por ejemplo, NCPPB 2140 o NCPPB 4053),
siempre que sea posible, utilizar también ADN extraído de las muestras de control positivas en la prueba PCR.
6.1 Métodos de purificación del ADN.
6.1.a. Método de Pastrik (2000):
Verter con una pipeta 220 µl de tampón de lisis (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) en un tubo eppendorf de 1,5 ml.
Añadir 100 µl de extracto de muestra y colocar en un calentador o al baño maría a 95 °C durante 10 minutos.
Colocar el tubo en hielo durante 5 minutos.
Añadir 80 µl de solución madre de lisozima (50 mg de lisozima por ml en 10 mM Tris HCl, pH 8,0) e incubar a 37 °C durante 30 minutos.
Añadir 220 µl de solución A Easy DNA® (Invitrogen), mezclar adecuadamente por agitación e incubar a 65 °C durante 30 minutos.
Añadir 100 µl de solución B Easy DNA® (Invitrogen) y agitar vigorosamente hasta que el precipitado se mueva libremente en el tubo y la muestra sea uniformemente viscosa.
Añadir 500 µl de cloroformo y agitar hasta que disminuya la viscosidad y la mezcla sea homogénea.
Centrifugar a 15.000 g durante 20 minutos a 4 °C para separar las fases y formar la interfase.
Transferir la fase superior a un tubo eppendorf sin utilizar.
Añadir 1 ml de etanol al 100 % (-20 °C), agitar brevemente e incubar en hielo durante 10 minutos.
Centrifugar a 15.000 g durante 20 minutos a 4° C y retirar el etanol del precipitado.
Añadir 500 µl de etanol al 80 % (-20 °C) y mezclar invirtiendo el tubo.
Centrifugar a 15.000 g durante 10 minutos a 4° C, guardar el precipitado y retirar el etanol.
Dejar que el precipitado se seque al aire o en un Speed Vac de ADN.
Resuspender el precipitado en 100 µl de agua ultrapura estéril y dejar a temperatura ambiente durante un mínimo de 20 minutos.
Almacenar a -20 °C hasta que se necesite para PCR.
Decantar todo precipitado blanco mediante centrifugación, y utilizar 5 µl del sobrenadante que contenga ADN para la prueba PCR.
6.1.b Otros métodos.
6.2 PCR.
6.2.2 Preparar la mezcla de reacción PCR adecuada en un entorno libre de contaminación de acuerdo con el protocolo publicado (apéndice 6). El protocolo PCR validado es una reacción multiplex que también incorpora un protocolo PCR interno.
6.2.3 Añadir 5 µl de extracto de ADN por 25 µl de reacción PCR en tubos PCR estériles.
6.3 Análisis del producto de la PCR.
6.3.1 Confirmar los amplicones PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Correr al menos 12 µl de mezcla de reacción de ADN amplificada de cada muestra mezclada con 3 µl de tampón de carga (apéndice 6) en un gel de agarosa al 2,0 % (p/v) en tampón tris-acetato-EDTA (TAE) (apéndice 6) a 5-8 V por cm. Utilizar un marcador de ADN adecuado, por ejemplo, 100 bp ladder.
6.3.3 En el caso de los productos PCR amplificados del tamaño esperado (apéndice 6), visualizar el gel teñido mediante transiluminación UV de onda corta (por ejemplo, =302 nm) y anotar los resultados.
Interpretación de los resultados de la prueba PCR.
La prueba PCR es negativa si el amplicón PCR específico de la C. m. subsp. sepedonicus del tamaño esperado no se detecta en la muestra en cuestión pero sí en todas las muestras de los controles positivos (en el caso de PCR multiplex con cebadores de control interno específicos de la planta, se debe amplificar con la muestra en cuestión un segundo producto PCR del tamaño esperado).
Nota: Se puede sospechar la inhibición de la PCR si el amplicón esperado se obtiene de la muestra de ontrol positiva que contiene C. m. subsp. sepedonicus en agua pero se obtienen resultados negativos de los controles positivos con C. m. subsp. sepedonicus en extracto de patata. En protocolos PCR multiplex con controles PCR internos, la inhibición de la reacción aparece indicada cuando no se obtiene ninguno de los dos amplicones.
7. PRUEBA DE BIOENSAYO.
La máxima sensibilidad de detección se alcanzará cuando se utilicen extractos de muestras que se acaben de preparar y cuando las condiciones de cultivo sean las óptimas. No obstante, este método puede aplicarse también con éxito a extractos que se hayan almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre 68 y 86 °C.
Algunas variedades de berenjena constituyen un medio de enriquecimiento selectivo excelente para la proliferación de C. m. subsp. sepedonicus , incluso en ausencia de síntomas, y facilitan también una prueba confirmatoria de huésped excelente.
7.3.1 Sosteniendo la planta entre dos dedos aplíquese con una pipeta una gota (de unos 5-10 µl) del precipitado en suspensión en el tallo situado entre los cotiledones y la primera hoja.
7.4 Inoculación con jeringa.
El marchitamiento puede estar inducido también por poblaciones de otras bacterias u hongos presentes en el precipitado de tejido tuberoso. Entre estos se incluyen Ralstonia solanacearum , Erwinia carotovora subsp. carotovora y E. carotovora subsp. atroseptica , Erwinia chrysanthemi , Phoma exigua var. foveata , así como grandes poblaciones de bacterias saprofitas. En particular, Erwinia chrysanthemi puede provocar síntomas y marchitamiento en las hojas muy parecidos a los de C. m. subsp sepedonicus . La única diferencia en el caso de las infecciones causadas por Erwinia chrysanthemi es el ennegrecimiento de los tallos. Dichos marchitamientos se pueden distinguir de los causados por C. m. subsp. sepedonicus , porque se marchitan rápidamente hojas o plantas enteras. También puede prepararse una tinción de Gram, esta prueba diferenciará a C. m. subsp. sepedonicus de Erwinia ssp.
Interpretación de los resultados de la prueba del bioensayo.
Los resultados de la prueba del bioensayo serán positivos cuando las plantas sometidas a la prueba estén infectadas por C. m. subsp. sepedonicus .
8. AISLAMIENTO DE C. m. subsp. sepedonicus .
Nota: El diagnóstico sólo estará completo cuando se haya aislado e identificado (véase el punto 9) C. m. subsp. sepedonicus , y posteriormente confirmado mediante una prueba de patogenicidad (punto 10). Aunque C. m. subsp sepedonicus es un organismo delicado, puede aislarse a partir de tejido sintomático.
8.1 Siembra en medio selectivo.
8.1.1 A partir de una alícuota de 100 µl de una muestra de precipitado de patata resuspendido o de savia de berenjena, realizar diluciones decimales en tampón de precipitado (apéndice 3).
8.1.2 El aislamiento a partir de precipitado de patata sin diluir no suele funcionar debido a la lentitud de crecimiento de C. m. subsp sepedonicus y a la competencia de saprofitas. Dado que en los tejidos infectados suele haber poblaciones elevadas de la bacteria, las saprofitas se diluyen normalmente, mientras que el patógeno persiste. Se recomienda, por tanto, recurrir a la técnica de la extensión en placa y extender, con ayuda de un asa de extensión ( palos de hockey ), 100 µl de cada una de las muestras, en diluciones de 1/100 hasta 1/10 000, en medio MTNA o NCP-88 (apéndice 5) (si se utilizan placas de Petri de 90 mm de diámetro, se deberá ajustar el volumen para tamaños alternativos de placa).
Nota: Otra estrategia alternativa consiste en extender la alícuota inicial de 100 µl de precipitado de patata en una primera placa de agar con ayuda de un aplicador y posteriormente extender, en estrías, todos los residuos que queden en el aplicador en una segunda placa de agar. Repetir por último con una tercera placa, logrando así, mediante el aplicador, el efecto de dilución en las placas.
8.2 Purificación de las colonias sospechosas.
C. m. subsp. sepedonicus crece lentamente y suele provocar unas colonias punteadas, de color crema, de forma abovedada, en el plazo de diez días. &391;Fotos de colonias típicas de C. m. subsp. sepedonicus (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)].
8.2.2 Volver a sembrar en estrías para obtener cultivos puros.
Identificar cultivos puros de posibles aislados de C. m. subsp. Sepedonicus , utilizando al menos dos de las pruebas siguientes basadas en principios biológicos diferentes.
9.1 Pruebas de identificación nutricional y enzimática.
Determinar las propiedades fenotípicas siguientes que estén universalmente presentes o ausentes en la C. m. subsp. sepedonicus , de acuerdo con los métodos de Lelliott y Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001), Anónimo (1987).
En todas las pruebas deberá incluirse un control conocido de C. m. subsp. sepedonicus . Las pruebas fisiológicas y nutricionales deberán realizarse utilizando inoculaciones de subcultivos en agar nutritivo. Las comparaciones morfológicas deberán realizarse a partir de cultivos de agar de dextrosa nutritivos.
Pruebas Resultado esperado
Prueba de la oxidación/fermentac. (O/F) Inerte o ligeramente oxidante
Actividad oxidasa -
Actividad ureasa -
Tolerancia de NaCl al 7 % -
Actividad catalasa +
Utilización de citrato -
Producción de ácido de glicerol -
Producción de ácido de lactosa - o débil
Producción de ácido de ramnosa -
Producción de ácido de salicina -
Tinción de Gram (apéndice 9) +
9.2 Prueba IF.
Preparar una suspensión de aproximadamente 106 células por ml en tampón IF (apéndice 3).
Preparar una serie de diluciones a 1/2 de un antisuero adecuado.
Aplicar el procedimiento IF (punto 4).
La prueba IF será positiva si el título IF del cultivo es equivalente al del control positivo.
9.3 Prueba PCR.
Preparar una suspensión de aproximadamente 106 células por ml en agua ultrapura.
Calentar 100 µl de la suspensión celular en tubos cerrados en un calentador o al baño maría a 100 °C durante 4 minutos. Si fuese necesario, la adición de NaOH recién preparado a una concentración final de 0,05 M puede ayudar a la lisis celular. Las muestras pueden almacenarse entonces a una temperatura de -16 a -24 °C hasta que sea necesario.
Aplicar los procedimientos PCR adecuados para amplificar los amplicones específicos de C. m. subsp. sepedonicus (por ejemplo, Pastrik, 2000; véase el apéndice 4; Li y de Boer, 1995; Mills et al. , 1997; Pastrik y Rainey, 1999; Schaad et al., 1999).
Se logrará la identificación positiva de C. m. subsp. sepedonicus si los amplicones de PCR son del mismo tamaño y presentan polimorfismos del fragmento de restricción con la misma longitud que los de la cepa de control positivo.
9.4 Prueba FISH.
Aplicar el procedimiento FISH (punto 5).
La prueba FISH será positiva si se obtienen las mismas reacciones del cultivo y el control positivo.
9.5 Perfiles de ácidos grasos (Fatty acid profiling o FAP) a) Mantener el cultivo en agar de tripticasa de soja (Oxoid) durante 72 horas a 21 °C (+/-1°).
Aplicar un procedimiento FAP adecuado (Janse, 1991; Stead, 1992).
La prueba FAP será positiva si el perfil del supuesto cultivo es idéntico al del control positivo. Los ácidos grasos cuya presencia es característica son 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 y 17:0. El Anteiso es altamente indicativo de C. m. subsp sepedonicus . Otros géneros tales como Curtobacterium , Arthrobacter y Micrococcus cuentan también con algunos de estos ácidos. No obstante, el 15:1 Anteiso A es un ácido raro en estas bacterias que, sin embargo, está presente en todas las spp. Clavibacter en una proporción que oscila entre el 1 y el 5 %. En C. m. subsp sepedonicus el valor se sitúa normalmente en torno al 5 %.
9.6 BOX-PCR.
Aplicar la prueba con arreglo al procedimiento (Smith et al. , 2001).
10 PRUEBA DE CONFIRMACIÓN DE PATOGENCIDAD.
10.1 Preparar un inóculo de aproximadamente 106 células por ml de cultivos de 3 días del aislado que se vaya a someter a prueba y de una cepa de control positivo adecuada de C. m. subsp. sepedonicus .
Transcurrido este plazo, las plantas que no muestren síntoma alguno (véase el punto 7.8.) deberán incubarse durante un máximo de 3 semanas a temperaturas que favorezcan su crecimiento pero que no superen los 25 °C (apéndice 8). Si después de 3 semanas no se presentan los síntomas, no podrá confirmarse que el cultivo es una forma patógena de C. m. subsp. sepedonicus .
10.4 Aislar de las plantas sintomáticas separando una sección de tallo que esté 2 cm por encima de la sección de inoculación. Dilacerar y suspender en un pequeño volumen de agua destilada estéril o en tampón fosfato 50 mM (apéndice 3). Aislar de la suspensión mediante dilución, extendiendo o aplicando en estrías en MTNA e YPGA (apéndice 5), incubar entre 3 y 5 días a una temperatura de 21 a 23 °C y examinar la formación de colonias típicas de C. m. subsp. sepedonicus .
Laboratorios dedicados a la optimización y la validación de los protocolos.
Laboratorio (1) Ciudad País
Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Viena y Linz Austria
Departement Gewasbescherming Merelbeke Bélgica
Plantedirektoratet Lyngby Dinamarca
Central Science Laboratory York Inglaterra
Scottish Agricultural Science Agency Edimburgo Escocia
Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité Bactériologie Angers Francia
Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre Le Rheu Francia
Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Alemania
Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Alemania
State Laboratory Irlanda Dublín
Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Países Bajos
Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre Aas Noruega
Direcção-Geral de Protecção das Culturas Lisboa Portugal
Nacionalni institut za biologijo Liubliana Eslovenia
Centro de Diagnóstico de Aldearrubia Salamanca España
(1) Científicos de contacto: véase el sitio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
Preparación de controles positivos y negativos para las pruebas de selección básicas PCR/IF y FISH.
Preparar un cultivo de 72 horas de una cepa virulenta de C. m. subsp. sepedonicus [NCPPB 4053 o PD 406] en medio base MTNA y suspender en tampón fosfato 10 mM para obtener una concentración de aproximadamente 1 a 2 x 108 cfu por ml. Esto se obtiene normalmente mediante una suspensión ligeramente turbia equivalente a una densidad óptica de 0,20 a 600 nm.
Separar las cuñas basales de 200 tubérculos de una variedad de piel blanca conocida por estar exenta de C. m. subsp. sepedonicus .
Preparar 10 microviales estériles de 1,5 ml con 900 µl del precipitado resuspendido.
Transferir 100 µl de la suspensión de C. m. subsp. sepedonicus al primer microvial. Homogeneizar por agitación.
Preparar alícuotas de 100 µl en microviales estériles de 1,5 ml para obtener de este modo 9 réplicas de cada muestra de control. Almacenar a una temperatura de -16 a -24 °C hasta su uso.
Tampones para los métodos de prueba.
1. Tampones para el procedimiento de extracción.
1.1 Tampón de extracción (tampón fosfato 50 mM, pH 7,0).
Finalidad Cantidad (por l)
Copos de Lubrol Defloculante (*) 0,5 g
Compuesto DC silicona antiespumante Antiespumante (*) 1,0 ml
Pirofosfato tetrasódico Antioxidante 1,0 g
Polivinilpirrolidona -40 000 (PVP-40) Unir los inhibidores PCR 50 g
(*) Para su utilización en el método de extracción por homogeneización.
1.2 Tampón de extracción (tampón fosfato 10 mM, pH 7,2).
2. Tampones para la prueba IF.
2.1 Tampón IF [tampón fosfato salino (PBS) 10 mM, pH 7,2].
2.2 Tampón IF-Tween.
2.3 Solución de glicerol con tampón fosfato, pH 7,6.
En el mercado se pueden encontrar soluciones de montaje que protegen la fluorescencia, como p. ej., Vectashield® (Vector Laboratories) o Citifluor® (Leica).
Determinación del nivel de contaminación en las pruebas IF y FISH.
C = c x S/s
S = superficie del pocillo del portaobjetos múltiple y
s = i2/4G2K2
N = C x 1.000/y x F
y = volumen de precipitado resuspendido en cada pocillo y
F = factor de dilución del precipitado resuspendido.
Medios para el aislamiento y cultivo de C. m. subsp. sepedonicus .
a. Medios de cultivo generales:
Agar nutritivo de Difco Bacto con un 1 % de D(+) glucosa (monohidrato). Esterilizar en autoclave a 115 °C durante 20 minutos.
D(+) glucosa (monohidrato) 10,0 g
D(+) glucosa (monohidrato) 2,5 g
Medios de cultivo selectivo validados:
Reactivos y protocolo PCR validados.
1. Protocolo PCR multiplex con control PCR interno (Pastrik, 2000).
1.1 Cebadores oligonucleótidos.
Cebador directo PSA-1 5'ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3'
Cebador reverso PSA -R 5'tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3'
Cebador directo NS-7-F 5'gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3'
Cebador reverso NS-8-R 5'tcc gca ggt tca cct acg ga -3'
Reactivo Cantidad para la reacción Concentración final
Agua ultrapura estéril 15,725 µl
10x tampón PCR (1) (15 mM MgCl2) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (fracción V) (10 %) 0,25 µl 0,1 %
Mezcla d-nTP (20 mM) 0,125 µl 0,1 mM
Cebador PSA-1 (10µM) 0,5 µl 0,2 µM
Cebador PSA-R (10µM) 0,5 µl 0,2 µM
Cebador NS-7-F (10µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM
Cebador NS-8-R (10µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM
Polimerasa Taq (5U/µl) (1) 0,2 µl 1,0 U
Volumen de muestra 5,0 µl
Volumen total: 25,0 µl
(1) Los métodos se validaron utilizando polimerasa Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq o Gold) y Gibco BRL.
(2) La concentración de los cebadores NS-7 F y NS-8-R se optimizó para la extracción de cuñas basales de patata utilizando el método de homogeneización y purificación del ADN de acuerdo con Pastrik (2000) (véanse los puntos 6.1.a y 6.2). Será necesario proceder a la reoptimización de las concentraciones de reactivos si se utiliza el método de extracción por agitación u otros métodos de aislamiento del ADN.
1.3 Condiciones de reacción PCR.
3 minutos a 95 °C (desnaturalización de ADN)
1 minuto a 95 °C (desnaturalización de ADN)
1 minuto a 64 °C (anillamiento de los cebadores)
1 minuto a 72 °C (extensión de la copia)
30 segundos a 95 °C (desnaturalización de ADN)
30 segundos a 62 °C (anillamiento de los cebadores)
5 minutos a 72 °C (extensión final)
mantener a 4 °C
Nota: Este programa se ha optimizado para utilizarlo con un termociclador MJ Research PTC 200. Puede ser preciso modificar la duración de los ciclos ii, iii, iv, v, vi y vii para su utilización con otros modelos.
1.4 Análisis de la enzima de restricción del amplicón.
2.1 Azul de bromofenol (solución estándar al 10 %)
2.2 Tampón de carga
Azul de bromofenol (2.1.) 300 µl
Reactivos validados para la prueba FISH.
1. Oligosondas.
5'ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3'
5'gct gcc tcc cgt agg agt-3'
2. Solución fijadora.
ADVERTENCIA: LA SOLUCIÓN FIJADORA CONTIENE PARAFORMALDEHÍDO QUE ES TÓXICO. UTILIZAR GUANTES Y NO INHALAR. SE RECOMIENDA TRABAJAR EN UNA CAMPANA EXTRACTORA DE GASES.
Calentar 9 ml de agua de grado molecular (p. ej. agua ultrapura) a 60 °C aproximadamente y añadir 0,4 g de paraformaldehído. El paraformaldehído se disuelve cuando se añaden 5 gotas de NaOH 1N y se remueve con un agitador magnético.
Ajustar el pH a 7,0 mediante la adición de 1 ml de tampón fosfato de concentración 0,1 M (pH 7,0) y 5 gotas de HCl 1N. Verificar el pH con bandas indicadoras y ajustar si fuese necesario con HCl o NaOH.
ADVERTENCIA: NO UTILIZAR UN MEDIDOR DE PH EN SOLUCIONES QUE CONTENGAN PARAFORMALDEHÍDO.
Filtrar la solución con un filtro de membrana de 0,22 µm y mantener libre de polvo a 4 °C hasta nueva utilización.
Nota: Solución fijadora alternativa: etanol al 96 %.
3. 3X Hybmix.
4. Solución de hibridación.
sonda EUB 338 5 ng/&mciro;l
sonda CMSCY301 5 ng/&mciro;l
Preparar las cantidades de solución de hibridación de acuerdo con los cálculos de la tabla 1. Para cada portaobjetos (que contenga 2 muestras distintas por duplicado) se precisan 90 µl de solución de hibridación.
2 portaobjetos 8 portaobjetos
Agua ultrapura estéril 50,1 200,4
3x hybmix 30,0 120,0
1 % SDS 0,9 3,6
Sonda EUB 338 (100 ng/µl) 4,5 18,0
Sonda CMSCY301 (100 ng/µl) 4,5 18,0
Volumen total (µl) 90,0 360,0
NB. Almacenar todas las soluciones que contengan oligosondas fotosensibles en la oscuridad a 20 °C. Proteger de la luz directa ya sea del sol o eléctrica durante su utilización.
5. Tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0.
Black Beauty ,
Long Tom ,
(1) También pueden utilizarse otras soluciones y kits de tinción disponibles en el mercado.
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Conservación de las pruebas analíticas en caso de aparición de un brote sospechoso.
todos los tubérculos y, siempre que sea posible, las plantas de los que se hayan obtenido muestras,
cualquier extracto sobrante y cualquier material adicional que se haya preparado para la prueba o pruebas de selección (por ejemplo, las placas de inmunofluorescencia), y
toda la documentación pertinente, hasta completar la aplicación de los métodos arriba mencionados.
del material especificado en el punto 1,
de una muestra de las berenjenas infectadas inoculadas con extracto de tubérculo o de planta, y
del cultivo aislado del organismo,
hasta un mes después, como mínimo, en virtud del procedimiento establecido en el artículo 5, apartado 2.
Elementos que deben tenerse en cuenta para la determinación de la población contaminante.
1. Los elementos que deben tenerse en cuenta para la determinación de la extensión de la probable contaminación con arreglo al artículo 5, apartado 1, letra b, incluirán:
los tubérculos o plantas cultivados en un lugar de producción declarado contaminado en virtud del artículo 5, apartado 1, letra a;
el lugar o lugares de producción relacionados en alguna medida con la producción de los tubérculos o plantas declarados contaminados en virtud del artículo 5, apartado 1, letra a, incluido el material y las instalaciones de producción compartidos directamente o a través de un contratista común;
los tubérculos o plantas producidos en el lugar o los lugares de producción contemplados en el guión anterior, o presentes en tal(es) lugar(es) de producción durante el período en el que los tubérculos o plantas declarados contaminados según el artículo 5, apartado 1, letra a, se encontraban en el lugar de producción citado en el primer guión;
los locales que manipulen patatas procedentes de los lugares de producción mencionados en los guiones anteriores;
cualquier maquinaria, vehículo, buque, almacén o unidades de estos y cualesquiera otros objetos, incluido el material de embalaje, que puedan haber estado en contacto con los tubérculos o plantas declarados contaminados en virtud del artículo 5, apartado 1, letra a;
todos los tubérculos o plantas almacenados o que hayan estado en contacto con cualquiera de las estructuras u objetos enumerados en el guión anterior antes de la limpieza y desinfección de los mismos;
como resultado de las pruebas contempladas en el artículo 6, aquellos tubérculos o plantas que tengan una relación clonal fraterna o paternal con los tubérculos o plantas declarados contaminados en virtud del artículo 5, apartado 1, letra a, y con respecto a los cuales parezca probable la contaminación a través de un vínculo clonal, aunque las pruebas de detección del organismo hayan arrojado resultados negativos; pueden llevarse a cabo pruebas de variedades para verificar la identidad de los tubérculos o plantas contaminados y clonalmente relacionados, y
el lugar o lugares de producción de los tubérculos o plantas a los que se hace referencia en el guión anterior.
2. Los elementos que deben tenerse en cuenta para la determinación de la posible propagación con arreglo al artículo 5, apartado 1, letra c, incluirán:
la proximidad de otros lugares de producción en los que se cultiven patatas u otras plantas huéspedes, y
la producción en común y el uso común de existencias de patatas de siembra.
se efectuará de manera inmediata una vez que la presencia haya sido confirmada por las pruebas de laboratorio con arreglo a los métodos expuestos en el anexo I, y deberá recoger, como mínimo:
el nombre de la variedad del lote de patatas,
el tipo (de consumo, de siembra, etc.) y, en su caso, la categoría de patata de siembra,
cuando exista el riesgo de contaminación de patatas procedentes de otra u otras Comunidades Autónomas, la Comunidad Autónoma en que se haya confirmado el brote notificará inmediatamente a las Comunidades Autónomas interesadas la información necesaria para, en su caso, declarar la contaminación, determinar la extensión de la probable contaminación y delimitar una zona de conformidad con las letras a, b, y c del apartado 1 del artículo 5, incluyendo:
el nombre y la dirección del proveedor y del destinatario,
la fecha de entrega del lote de patatas,
el tamaño del lote de patatas entregado,
una copia del pasaporte fitosanitario o al menos el número de dicho pasaporte, en su caso, o el número de registro del cultivador o del comerciante, en su caso, y una copia del aviso de entrega.
cuando exista el riesgo de contaminación de patatas destinadas a otro u otros Estados Miembros, la Comunidad Autónoma en que se haya confirmado el brote notificará inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación y este a su vez, a través del cauce correspondiente a los Estados Miembros interesados, la información necesaria para, en su caso, declarar la contaminación y delimitar una zona de conformidad con las letras a, b, y c del apartado 1 del artículo 5, incluyendo:
cuando exista el riesgo de contaminación de patatas procedentes de otro u otros Estados Miembros a raíz de la correspondiente notificación o notificaciones de los mismos, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación comunicará la información recibida a las Comunidades Autónomas interesadas para, en su caso, declarar la contaminación, determinar la extensión de la probable contaminación y delimitar una zona de acuerdo con las letras a, b, y c del apartado 1 del artículo 5.
Una vez que todas las investigaciones hayan concluido, las Comunidades Autónomas facilitarán, para cada caso:
la fecha en la que se confirmó la contaminación,
una breve descripción de la investigación llevada a cabo para identificar la fuente y la posible propagación de la contaminación, incluido el alcance del muestreo efectuado,
información sobre la fuente o fuentes de contaminación determinadas o presuntas,
detalles relativos a la extensión de la contaminación declarada, incluido el número de lugares de producción y el número de lotes, con la indicación de la variedad y, en el caso de la patatas de siembra, la categoría,
detalles relativos a la delimitación de la zona, incluido el número de lugares de producción no declarados contaminados pero incluidos en la zona,
cualesquiera otros datos que requiera el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación o, en su caso, la Comisión relativos al brote o brotes confirmados.
Medidas bajo control oficial.
1. Las medidas bajo control oficial contempladas en el artículo 7, letra a, serán las siguientes:
la utilización como piensos tras un tratamiento térmico adecuado que garantice que no hay riesgo alguno de supervivencia del organismo,
la eliminación en un vertedero autorizado oficialmente a tal fin donde no se haya podido determinar riesgo alguno de escape del patógeno al medio ambiente, por ejemplo, mediante la filtración a tierras de cultivo,
la incineración,
la transformación industrial mediante entrega directa e inmediata a una planta de transformación dotada de instalaciones de eliminación de residuos autorizadas oficialmente, con respecto a las cuales se haya excluido cualquier riesgo identificable de propagación del organismo, y de un sistema de limpieza y desinfección de los vehículos de transporte, al menos,
otras medidas, siempre que se haya descartado el posible riesgo de propagación del organismo, las cuales deberán notificarse al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación y este a su vez, a través del cauce correspondiente, a la Comisión y a los demás Estados miembros acompañadas de su justificación.
2. La utilización o la eliminación apropiadas de los tubérculos o plantas declaradas probablemente contaminadas de conformidad con el artículo 5, apartado 1, letra b, a las que se hace referencia en el artículo 7, letra b, deberán efectuarse bajo el control de los organismos oficiales responsables interesados, así como con la oportuna comunicación entre estos organismos para garantizar en todo momento dicho control, y con la aprobación del organismo oficial responsable de la Comunidad Autónoma donde vayan a envasarse o transformarse las patatas, en lo que se refiere a los vertederos citados en los guiones primero y segundo, y consistirán en lo siguiente:
la utilización como patatas de consumo destinadas al consumo, envasadas para su distribución y venta sin cambio de envase, en un lugar dotado de instalaciones de eliminación de residuos adecuadas; las patatas destinadas a la siembra sólo pueden manipularse en el mismo lugar si esto se realiza separadamente o tras la limpieza y desinfección, o
su uso como patatas de consumo para la transformación industrial y destinadas a la entrega directa e inmediata a una planta de transformación dotada de instalaciones adecuadas de eliminación de residuos y de un sistema de limpieza y desinfección de, al menos, los vehículos de transporte, o
algún otro tipo de uso o eliminación, siempre que se excluya todo riesgo identificable de propagación del organismo, y previa aprobación de los citados organismos oficiales responsables.
3. Los métodos apropiados de limpieza y desinfección de todos los objetos contemplados en el artículo 7, letra c, serán aquellos para los que se haya excluido cualquier riesgo identificable de propagación del organismo, y se aplicarán bajo el control de los organismos oficiales responsables de las Comunidades Autónomas.
4. La serie de medidas que deben adoptar las Comunidades Autónomas en la zona delimitada de conformidad con el artículo 5, apartado 1, letra c, a la que se hace referencia en el artículo 7, letra d, incluirá las medidas siguientes:
4.1 En los lugares de producción que se declaren contaminados en virtud del artículo 5, apartado 1, letra a:
en los campos que se declaren contaminados según el artículo 5, apartado 1, letra a, o bien,
al menos durante los tres años de cultivo siguientes al de declaración de la contaminación:
se adoptarán medidas para eliminar las plantas de patata espontáneas y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo, y
no se plantarán tubérculos, plantas ni semillas de patata propiamente dichas, ni ninguna otra planta que pueda contener naturalmente el organismo, ni ningún cultivo que presente un riesgo cierto de propagación del organismo,
en la primera temporada de cultivo de patatas siguiente al período indicado en el guión anterior y, siempre que en las inspecciones oficiales se haya comprobado que, durante al menos los dos años de vegetación inmediatamente anteriores a la plantación, el campo estuvo libre de plantas de patata espontáneas y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo, sólo se permitirá la producción de patatas de consumo y los tubérculos recolectados se someterán a prueba conforme al procedimiento detallado en el anexo I,
en la temporada de cultivo de patatas siguiente a la mencionada en el guión anterior y tras un ciclo de rotación adecuado, cuya duración mínima será de dos años cuando vayan a cultivarse patatas de siembra, se podrán plantar patatas de siembra o de consumo y se realizará una encuesta oficial tal como se dispone el artículo 2, apartado 1, o bien,
durante los cuatro años de cultivo siguientes al de declaración de la contaminación:
se adoptarán medidas para eliminar las plantas de patata espontáneas y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo,
se dejará y mantendrá el campo, o bien en barbecho completo, o bien en pasto permanente con siega o pastoreo intenso o frecuente,
en la primera temporada de cultivo de patatas siguiente al período indicado en el guión anterior y, siempre que en las inspecciones oficiales se haya comprobado que, durante al menos los dos años de vegetación inmediatamente anteriores a la plantación, el campo estuvo libre de plantas de patata espontáneas y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo, se permitirá la producción de patatas de siembra o consumo y los tubérculos recolectados se someterán a prueba conforme al procedimiento detallado en el anexo I;
en el resto de los campos del lugar de producción contaminado, y a condición de que los organismos oficiales competentes tengan la certeza de que se ha eliminado el riesgo de plantas de patata espontáneas y de cualquier otra planta que pueda contener naturalmente el organismo:
durante el año de cultivo siguiente al de declaración de contaminación o bien no se plantarán tubérculos, plantas ni semillas propiamente dichas de patata, ni cualquier otra planta que pueda contener naturalmente el organismo, o se podrán plantar patatas de siembra certificadas, pero sólo para la producción de patatas de consumo, y
durante el segundo año de cultivo siguiente al de declaración de contaminación sólo se podrán plantar patatas de siembra certificadas o patatas de siembra que hayan sido sometidas a pruebas oficiales para determinar la ausencia de necrosis bacteriana y cultivadas bajo control oficial en lugares de producción distintos a los mencionados en el punto 4.1, ya sea para la producción de siembra o de consumo,
durante el tercer año de cultivo siguiente al de declaración de contaminación, al menos, sólo se podrán plantar patatas de siembra certificadas o patatas de siembra cultivadas bajo control oficial a partir de patatas de siembra certificadas, ya sea para la producción de siembra o de consumo,
en cada uno de los años de cultivo mencionados en los guiones anteriores, se tomarán medidas para eliminar las plantas de patata espontáneas y cualquier otra planta que pueda contener naturalmente el organismo en caso de advertirse su presencia, y se realizarán pruebas oficiales de las patatas recolectadas conforme al procedimiento detallado en el anexo I en todos los campos de patatas;
inmediatamente después de la declaración de contaminación en virtud del artículo 5, apartado 1, letra a, y tras el primer año de cultivo siguiente, todas las máquinas e instalaciones de almacenamiento que se encuentren en el lugar de producción e intervengan en la producción de patatas serán limpiadas y desinfectadas como resulte adecuado con los métodos apropiados, según lo dispuesto en el punto 3;
en el caso de las unidades de producción de cultivos protegidos en las que sea posible una sustitución total de los medios de cultivo,
no se plantarán tubérculos, plantas ni semillas propiamente dichas hasta que la unidad de producción no haya sido sometida a medidas bajo control oficial destinadas a eliminar el organismo y a retirar todo el material vegetal que pueda ser huésped del mismo, incluida, como mínimo, la sustitución total del medio de cultivo y la limpieza y desinfección de la unidad de producción y de todos los equipos, y los organismos oficiales responsables no hayan concedido la subsiguiente autorización para la producción de patata, y
la producción de patata procederá de patatas de siembra certificadas o de minitubérculos o micro-plantas derivadas de fuentes probadas.
inmediatamente después de la declaración de contaminación, velarán por que toda la maquinaria e instalaciones de almacenamiento de la explotación que hayan intervenido en la producción de patatas se limpien y desinfecten como resulte adecuado y con los métodos apropiados, según lo dispuesto en el punto 3,
inmediatamente y durante al menos tres temporadas de cultivo después de la declaración de contaminación:
controlarán a través de sus organismos oficiales responsables las explotaciones que cultiven, almacenen o manipulen tubérculos de patata, además de las explotaciones que contraten máquinas para este cultivo,
requerirán que, para todos los cultivos de patata dentro de la zona delimitada, se planten exclusivamente semillas certificadas o semillas cultivadas bajo control oficial, y se efectúe un análisis después de recolectar los cultivos de patatas de siembra en lugares de producción declarados probablemente contaminados según el artículo 5, apartado 1, letra b,
exigirán que se manipulen por separado las existencias de patatas de siembra y de patatas de consumo recolectadas en todas las explotaciones de la zona, o que se establezca un sistema de limpieza y desinfección entre el manejo de las existencias de patatas de siembra y el de las de consumo.
llevarán a cabo una encuesta oficial según lo dispuesto en el artículo 2, apartado 1;
establecerán un programa, según corresponda, para la sustitución de todas las existencias de patatas de siembra por un período de tiempo conveniente.
Métodos oficialmente autorizados para la eliminación de residuos.
Los residuos de patata (incluidas las patatas descartadas y las mondaduras) y cualquier otro residuo sólido asociado a las patatas (incluida la tierra, las piedras y otros restos) se eliminarán de una de las siguientes maneras:
en un vertedero autorizado oficialmente a tal fin donde no se haya podido determinar riesgo alguno de escape del organismo al medio ambiente, por ejemplo, mediante la filtración a tierras de cultivo; los residuos se trasladarán directamente al vertedero en unas condiciones de confinamiento que impidan todo riesgo de pérdida de los mismos,
se incinerarán, o
se someterán a otras medidas, siempre que se descarte el posible riesgo de propagación del organismo; dichas medidas deben notificarse inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación y este a su vez, a través del cauce correspondiente, a la Comisión y a los demás Estados miembros.
Los residuos líquidos que contengan elementos sólidos en suspensión se filtrarán o se someterán a procesos de sedimentación para la separación de dichos elementos; estos se eliminarán de la forma dispuesta en el inciso i.
se calentarán a un mínimo de 60 °C en todo su volumen durante 30 minutos por lo menos antes de la eliminación, o
se eliminarán por otro sistema que, aprobado oficialmente y aplicado bajo control oficial, descarte todo riesgo identificable de contacto de los residuos con tierras de cultivo. Las características de tal sistema serán notificadas al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación y este a su vez, a través del cauce correspondiente, a los demás Estados miembros y a la Comisión.
Las opciones descritas en el presente anexo se aplican asimismo a los residuos asociados a la manipulación, la eliminación y el tratamiento de lotes contaminados.
Anexos I, II, III, IV y V:
Redacción según Orden APA/718/2007, de 15 de marzo, por la que se modifican los anexos de la Orden de 22 de marzo de 1994, relativa a la lucha contra la necrosis bacteriana de la patata, en aplicación de la Directiva 93/85/CEE del Consejo de las Comunidades Europeas.