Source: http://docplayer.pl/2743415-Spis-metod-wzgledna-temperatura-samozapalenia-substancji-preparatow-chemicznych.html
Timestamp: 2017-09-21 01:45:05+00:00
Document Index: 50503124

Matched Legal Cases: ['art 2', 'ART 1', 'ART 1', 'ART 1', 'ART 1', 'ART 5', 'ART 5', 'ART 5', 'ART 5']

SPIS METOD. Względna temperatura samozapalenia substancji/preparatów chemicznych - PDF
SPIS METOD. Względna temperatura samozapalenia substancji/preparatów chemicznych
Download "SPIS METOD. Względna temperatura samozapalenia substancji/preparatów chemicznych"
1 Załącznik nr 1 SPIS METOD Część A. Metody przeprowadzania badań właściwości fizykochemicznych A.1. Temperatura topnienia/krzepnięcia A.2. Temperatura wrzenia A.3. Gęstość względna A.4. Prężność par A.5. Napięcie powierzchniowe A.6. Rozpuszczalność w wodzie A.8. Współczynnik podziału A.9. Temperatura zapłonu A.10. Palność (substancje i preparaty chemiczne stałe) A.11. Palność (gazy) A.12. Palność (w kontakcie z wodą) A.13. Właściwości piroforyczne ciał stałych i cieczy A.14. Właściwości wybuchowe A.15. Temperatura samozapłonu (ciecze i gazy) A.16. Względna temperatura samozapalenia substancji/preparatów chemicznych stałych A.17. Właściwości utleniające (substancje/preparaty chemiczne stałe) A.18. Liczbowo średnia masa cząsteczkowa i rozkład masy cząsteczkowej polimerów A.19. Zawartość polimerów o małej masie cząsteczkowej A.20. Rozpuszczanie/ekstrakcja polimerów w wodzie A.21. Właściwości utleniające (ciecze) Część B. Metody oznaczania toksyczności i innych skutków zdrowotnych B.1.BIS. Toksyczność ostra (podanie drogą pokarmową) Metoda Ustalonej Dawki B.1.TRIS. Toksyczność ostra (podanie drogą pokarmową) Metoda Klas Toksyczności Ostrej B.2. Toksyczność ostra (inhalacyjna) B.3. Toksyczność ostra (narażenie przez skórę) B.4. Toksyczność ostra: Działanie drażniące/żrące na skórę B.5. Toksyczność ostra : Działanie drażniące/żrące na oczy B.6. Toksyczność ostra (uczulenie skóry) B.7. Toksyczność dawki powtarzanej (28 dni, droga pokarmowa) B.8. Toksyczność dawki powtarzanej (28 dni, droga inhalacyjna) B.9. Toksyczność dawki powtarzanej (28 dni, po podaniu na skórę) B.10. Mutagenność (test aberracji chromosomowych in vitro na komórkach ssaków) B.11. Mutagenność (test aberracji chromosomowych w komórkach szpiku kostnego ssaków) B.12. Mutagenność (test mikrojądrowy na erytrocytach ssaków in vivo) 1/124
2 B.13/14. Mutagenność (test rewersji mutacji na bakteriach) B.15. Mutagenność (test mutacji genowych na komórkach Saccharomyces cerevisiae) B.16. Mutagenność (test rekombinacji mitotycznych na komórkach Saccharomyces cerevisiae) B.17. Mutagenność (test mutacji genowych na komórkach ssaków) B.18. Uszkodzenie i naprawa DNA Nieplanowa synteza DNA Badanie na komórkach ssaków in vitro B.19. Test wymiany chromatyd siostrzanych in vitro B.20. Recesywne mutacje letalne związane z płcią u Drosophila melanogaster B.21. Transformacja komórek ssaków in vitro B.22. Dominujące mutacje letalne u gryzoni B.23. Aberracje chromosomowe spermatogoniów ssaków B.24. Test plamkowy u myszy B.25. Test dziedzicznych translokacji u myszy B.26. Toksyczność podchroniczna (90-dniowe powtarzane narażenie gryzoni drogą pokarmową) B.27. Toksyczność podchroniczna (90-dniowe powtarzane narażenie drogą pokarmową zwierząt z gatunków innych niż gryzonie) B.28. Toksyczność podprzewlekła - narażenie przez skórę (90-dniowe powtarzane narażenie na skórę u gryzoni) B.29. Toksyczność podprzewlekła - narażenie inhalacyjne (90-dniowe powtarzane narażenie inhalacyjne u gryzoni) B.30. Toksyczność przewlekła B.31. Badanie toksyczności w rozwoju prenatalnym B.32. Działanie rakotwórcze B.33. Toksyczność przewlekła/działanie rakotwórcze B.34. Działanie toksyczne na rozrodczość w warunkach testu jednopokoleniowego B.35. Działanie toksyczne na rozrodczość w warunkach testu dwupokoleniowego B.36. Toksykokinetyka B.37. Opóźniona neurotoksyczność związków fosforoorganicznych po narażeniu ostrym B.38. Opóźniona neurotoksyczność związków fosforoorganicznych po dawce powtarzanej 28-dniowej B.39. Nieplanowana synteza DNA na komórkach wątroby ssaków B.40. Działanie żrące na skórę B.41. Fototoksyczność in vitro test wychwytu czerwieni obojętnej 3T3 B.42. Uczulanie skóry: próba na miejscowym węźle chłonnym B.43. Badanie neurotoksyczności na gryzoniach Część C. Metody przeprowadzenia badań ekotoksyczności C.1. C.2. C.3. C.4. C.4.I. C.4.II. C.4.III. C.4.IV. C.4.V. C.4.VI. C.4.VII. Toksyczność ostra (dla ryb) Toksyczność ostra (dla rozwielitek - Daphnia sp.) Hamowanie wzrostu glonów Podatność na biodegradację Uwagi ogólne Zanikanie RWO (Metoda C.4-A) Zmodyfikowane badanie przesiewowe wg OECD (Metoda C.4-B) Wydzielanie CO 2 (Metoda C.4-C) Metoda respirometrii manometrycznej (Metoda C.4-D) Metoda naczynia zamkniętego (Metoda C.4-E) Metoda M.I.T.I. (Metoda C.4-F) 2/124
3 C.5. C.6. C.7. C.8. C.9. C.10. C.11. C.12. C.13. C.14. C.15. C.16. C.17. C.18. C.19. C.20. C.21. C.22. C.23. C.24. Degradacja biochemiczne zapotrzebowanie na tlen Degradacja - chemiczne zapotrzebowanie na tlen Degradacja - abiotyczny rozkład przez hydrolizę w zależności od ph Toksyczność dla dżdżownic. Badanie w sztucznej glebie Biodegradacja. Test Zahn-Wellensa Biodegradacja. Badania symulacyjne osadu czynnego Biodegradacja. Badania stopnia hamowania oddychania osadu czynnego Biodegradacja. Zmodyfikowany test SCAS Biokoncentracja. Badanie przepływowe na rybach Badanie wzrostu narybku Krótkoterminowa toksyczność na embrionach ryb i stadiach narabku Badanie toksyczności ostrej drogą pokarmową na pszczołach miodnych Badanie toksyczności ostrej kontaktowej na pszczołach miodnych Adsorpcja/desorpcja metodą wyznaczania stanu równowagi Wyznaczanie współczynnika adsorpcji (K OC ) na glebie i osadzie ściekowym za pomocą chromatografii cieczowej (HPLC) Rozmnażanie rozwielitki (- Daphnia magna sp.) Mikroorganizmy glebowe: Badanie przemian azotu Mikroorganizmy glebowe: Badanie przemian węgla Przemiany tlenowe i beztlenowe w glebie Przemiany tlenowe i beztlenowe w osadach wodnych 3/124
4 Załącznik nr 2 A.21. WŁAŚCIWOŚCI UTLENIAJĄCE (CIECZE) 1. METODA 1.1. Wstęp Niniejsza metoda badania jest przewidziana do pomiaru zdolności substancji ciekłej do zwiększenia szybkości spalania lub intensywności spalania substancji palnych, lub do tworzenia mieszanin z substancjami palnymi, które ulegają samozapaleniu, jeżeli takie dwa składniki zostaną dokładnie zmieszane. Opiera się ona na metodzie ONZ przewidzianej dla cieczy utleniających 1) i jest z nią równoważna. Jednakże, metoda ta jako A.21 przewidziana jest przede wszystkim do spełnienia wymagań Dyrektywy 67/548; wymagane jest porównanie tylko z jedną substancją referencyjną. Badanie i porównanie z dodatkową substancją referencyjną może być konieczne, jeżeli wyniki badania przewidywane są do zastosowania do innych celów 1. Niniejsze badanie nie musi być przeprowadzane, jeżeli analiza wzoru strukturalnego nie stwarza racjonalnych wątpliwości, że substancja reaguje egzotermicznie z materiałem palnym. Zaleca się, przed przeprowadzeniem tego badania, posiadanie wstępnej informacji o potencjalnych właściwościach wybuchowych substancji. Niniejsza metoda nie ma zastosowania do substancji stałych, gazów, materiałów wybuchowych, substancji wysoce łatwopalnych lub nadtlenków organicznych. Niniejsze badanie nie musi być przeprowadzane, jeżeli dostępne są wyniki badania substancji według metody ONZ dla cieczy utleniających 1) Definicje i jednostki Średni czas narastania ciśnienia jest średnią z zmierzonych okresów narastania ciśnienia dla mieszanin podatnych w warunkach oznaczenia do powodowania wzrostu ciśnienia z 690 kpa do 2070 kpa powyżej ciśnienia atmosferycznego Substancje kontrolne Jako substancję 2 kontrolną stosuje się 65% (w/w) roztwór wodny kwasu azotowego (czystość analityczna). Alternatywnie, jeżeli badający przewiduje, że wyniki takiego badania mogą być użyte do innych celów 1, to może uznać za zasadne przeprowadzenie badania z dodatkową substancją referencyjną Zasada metody badawczej Badaną ciecz miesza się w stosunku 1:1 (masowo), z włóknami celulozy i umieszcza się w naczyniu ciśnieniowym. Jeżeli podczas mieszania lub napełniania naczynia nastąpi samozapalenie, to dalsze prowadzenie badania nie jest konieczne. Jeżeli samozapalenie nie nastąpiło, to powinno być przeprowadzone pełne badanie. Mieszaninę ogrzewa się w naczyniu ciśnieniowym i oznacza się średnia czas narastania ciśnienia od 690 kpa do 2070 kpa powyżej ciśnienia atmosferycznego. Uzyskany czas porównuje się ze średnim czasem narastania ciśnienia dla mieszaniny 1:1 substancji referencyjnej(ych) i celulozy Kryteria jakości W serii pięciu prób dla jednej substancji nie powinno być wyników różniących się o więcej niż 30% od średniej arytmetycznej. Wyniki różniące się o więcej niż 30% od średniej arytmetycznej powinny być odrzucone, a procedury mieszania i napełniania powinny zostać skorygowane, a badanie powtórzone Opis metody badawczej Przygotowanie Substancja palna Jako materiał palny stosuje się wysuszone, włókna celulozy o długości włókna pomiędzy 50 i 250 µm oraz przeciętnej średnicy 25 µm 4. Powinny być one wysuszone do stałej wagi w warstwie nie grubszej niż 25 mm w 105 C przez 4 godz. i przechowywane w eksykatorze, ze środkiem suszącym, aż do ochłodzenia i osiągnięcia 1 Np., w ramach przepisów transportowych ONZ. 2 Przed badaniem kwas powinien być zmiareczkowany w celu potwierdzenia stężenia. 3 Według odsyłacza 1 stosowane są np.: 50% (w/w) kwas nadchlorowy i 40% (w/w) chloran sodu. 4 Np. Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, katalog nr /124
5 stanu wymaganego do stosowania. Zawartość wody w wysuszonej celulozie powinna być niższa niż 0,5% w przeliczeniu na suchą masę 5. Jeżeli to konieczne, czas suszenia powinien być przedłużony, aż do osiągnięcia tej wartości 6. Ta sama partia celulozy powinna być stosowana podczas całego badania Aparatura Naczynie ciśnieniowe Wymagane jest naczynie ciśnieniowe. Aparat składa się z cylindrycznego stalowego naczynia ciśnieniowego o długości 89 mm i średnicy zewnętrznej 60 mm (patrz Rysunek A.21.1). Na przeciwnych stronach znajdują się dwie płaszczyzny (zmniejszające przekrój naczynia do 50 mm) w celu ułatwienia trzymania podczas zakładania głowiczki zapalającej i odpowietrznika. Naczynie, które ma wywiercony otwór o średnicy 20 mm, z jednego końca nagwintowany do głębokości 19 mm gwintem 1" zgodnie z normą British Standard Pipe (BSP) lub jego odpowiednikiem metrycznym. Odprowadzenie ciśnienia, w postaci bocznego ramienia, jest wkręcane w zakrzywioną powierzchnię naczynia ciśnieniowego 35 mm od jedngego końca i pod kątem 90 do powierzchni uchwytowych. Na końcu ramienia bocznego wywiercone jest gniazdo na głębokość 12 mm i nagwintowane gwintem 1/2", zgodnie z BSP lub jego odpowiednikiem metrycznym. Jeżeli jest to konieczne, uszczelnienie wewnętrzne zawiera uszczelkę gazoszczelną. Ramię boczne wchodzi 55 mm w głąb korpusu naczynia ciśnieniowego i ma otwór 6 mm. Koniec ramienia bocznego jest nagwintowany w celu unieruchomienia czujnika ciśnienia. Do pomiaru ciśnienia może być użyte dowolne urządzenie pod warunkiem, że nie jest wrażliwe na gorące gazy lub produkty rozkładu i jest odpowiednie do odczytu szybkości narastania ciśnienia w przedziale kpa, w okresie nie dłuższym niż 5 ms. Najdalszy od ramienia bocznego koniec naczynia ciśnieniowego jest zamykany głowiczką zapalającą, wyposażoną w dwie elektrody, jedna odizolowana od korpusu, a druga uziemiająca jest z nim połączona. Drugi koniec naczynia ciśnieniowego jest zamykany aluminiową membraną rozrywającą o grubości 0,2 mm (ciśnienie rozrywające wynosi ok kpa) zamocowaną w gnieździe za pomocą korka z otworem 20 mm. Jeżeli to konieczne, pod głowiczką zapalającą stosuje się obojętne uszczelnienie w celu zapewnienia hermetyczności. Urządzenie podtrzymujące (Rysunek A.21.2) umożliwia właściwą pozycję zestawu podczas badania. Zwykle składa się ono z płytki z miękkiej stali o wymiarach 235 mm 184 mm 6 mm z przymocowanym do niej wspornikiem o długości 185 mm i wyprofilowanym kwadratowo zagłębieniem na naczynie ciśnieniowe o wymiarach 70 mm 70 mm 4 mm. Ściany boczne wyprofilowanego kwadratowo wspornika są nacięte na dwóch przeciwległych stronach na jednym końcu jego długości tak, że konstrukcja ma dwie płaskie boczne nogi wznoszące się na wysokość 86 mm ponad nienaruszony przekrój wspornika. Drugie końce tych płaskich ścian są obcięte pod kątem 60 do poziomu i przyspawane do płytki podstawy. Po jednej stronie górnej części podstawy przekroju wspornika wykonana jest szczelina o wymiarach 22 mm szerokości i 46 mm głębokości tak, że gdy zestaw naczynia ciśnieniowego jest opuszczany w głąb wspornika, najpierw podparty jest we wsporniku zacisk zapalający, a boczne ramię umieszczone jest w tej szczelinie. Podkładka stalowa o długości 30 mm i grubości 6 mm jest dospawana do dolnej wewnętrznej części przedniej wspornika, która działa jako przekładka dystansowa. Dwie śruby 7 mm z płaskim łbem (lub motylkowe) wkręcone w ścianę przeciwległą służą do mocowania naczynia ciśnieniowego w miejscu. Dwie 12 mm szerokości taśmy stalowe o grubości 6 mm, przyspawane do części bocznych, stykają się z podstawą wspornika podpierając naczynie ciśnieniowe od dołu Układ zapalania Układ zapalania zawiera drut Ni/Cr o długości 25 cm, średnicy 0,6 mm i oporności 3,85 ohm/m. Drut zwija się, za pomocą pręta o średnicy 5 mm w spiralę i przymocowuje się do elektrod głowiczki zapalającej. Spirala powinna mieć jedną z form pokazanych na Rysunku A Odległość pomiędzy dnem naczynia a dolną częścią spirali powinna wynosić 20 mm. Jeżeli elektrody nie są nastawialne, to końce drutu zapalającego pomiędzy spiralą dnem naczynia powinny być odizolowane za pomocą ceramicznej gilzy. Drut rozgrzewa się wskutek przepływu prądu stałego o natężeniu, co najmniej 10 A Wykonanie badania 7 Urządzenie, zestawione razem z czujnikiem ciśnienia i układem grzewczym, ale bez membrany rozrywającej umieszczonej na miejscu, jest podtrzymywane od dołu przez głowiczkę zapalającą. Badaną ciecz w ilości 2,5 g 5 Potwierdzone za pomocą miareczkowania metodą np. Karl-Fisher a. 6 Alternatywnie, wskazana zawartość wody może być również osiągana np. przez ogrzewanie w 105 C pod obniżonym ciśnieniem przez 24 h. 7 Mieszaniny utleniacza z celulozą powinny być traktowane jako potencjalnie wybuchowe i wszelkie czynności powinny być wykonywane ostrożnie. 5/124
6 miesza się z 2,5 g wysuszonej celulozy w szklanej zlewce stosując bagietkę szklaną 8. Ze względów bezpieczeństwa, mieszanie powinno być przeprowadzone spoza osłony pomiędzy wykonawcą a mieszaniną. Jeżeli mieszanina zapali się podczas mieszania lub napełniania, dalsze wykonywanie badania nie jest konieczne. Mieszaninę dodaje się, w małych porcjach przez zawór, do naczynia ciśnieniowego w sposób gwarantujący, że mieszanina została ułożona wokół spirali zapalającej i jest z nią w dobrym kontakcie. Ważne jest, aby spirala nie została zniekształcona podczas operacji ładowania, co może mieć wpływ na błędne wyniki 9. Membranę rozrywającą umieszcza się na miejscu i zabezpiecza się ją wkręcając korek w celu uszczelnienia. Załadowane naczynie przenosi się do urządzenia podtrzymującego, z membraną rozrywającą możliwie najwyżej, a urządzenie należy umieścić w komorze ognioodpornej wyposażonej w wyciąg odprowadzający dymy gdyż powinna być ona umieszczona w odpowiednim pancerzu, zabezpieczającym przed dymem i ogniem. Końcówki zasilania powinny zostać podłączone do zewnętrznych końcówek głowiczki zapalającej i powinien zostać włączony prąd 10 A. Czas pomiędzy początkiem mieszania i włączeniem zasilania nie powinien przekraczać 10 minut. Sygnał wytwarzany przez czujnik ciśnienia rejestruje się przez odpowiedni układ, który umożliwia ocenę i rejestrowanie stałego zapisu czasu narastania ciśnienia (np. przekaźnik połączony jest z rejestratorem). Mieszaninę ogrzewa się, aż do pęknięcia membrany rozrywającej lub przez co najmniej 60 s. Jeżeli membrana rozrywająca nie pękła, to mieszaninę należy pozostawić do ochłodzenia przed ostrożnym rozebraniem urządzenia, stosując zabezpieczenia przed działaniem nadciśnienia, które może w nim występować. Wykonuje się pięć prób z substancją badaną i substancją(ami) odniesienia. Zapisuje się czas narastania ciśnienia od 690 kpa do 2070 kpa powyżej cisnienia tmosferycznego. Potem oblicza się średni czas narastania ciśnienia. W pewnych przypadkach, substancje mogą powodować wzrost ciśnienia (zbyt wysoki lub zbyt niski), spowodowany przez reakcje chemiczne niebędące charakterystycznymi dla właściwości utleniających substancji. W takich przypadkach, może być konieczne powtórzenie badania z substancją obojętną, np. diatomitem (ziemią okrzemkową), zastępującym celulozę w celu wyjaśnienia rodzaju reakcji. 2. DANE Czas narastania ciśnienia zarówno dla substancji badanej i substancji referencyjnej(ych). Czas narastania ciśnienia z badań z substancją obojętną, o ile zostały przeprowadzone OPRACOWANIE WYNIKÓW Oblicza się średni czas narastania ciśnienia dla substancji badanej i substancji referencyjnej(ych). Oblicza się średni czas narastania ciśnienia z badań z substancją obojętną, (o ile zostały przeprowadzone). Niektóre przykłady wyników podano w Tabeli A.21.1 Tabela A.21.1 Przykłady wyników d) Substancja c) Dichromian amonu, nasycony roztwór wodny Azotan wapnia, nasycony roztwór wodny 6700 Azotan żelazowy, nasycony roztwór wodny 4133 Nadchloran litu, nasycony roztwór wodny 1686 Nadchloran magnezu, nasycony roztwór wodny 777 Azotan niklawy, nasycony roztwór wodny 6250 Kwas azotowy, 65% 4767 a) Kwas nadchlorowy, 50% 121 a) Kwas nadchlorowy, 55% 59 Azotan potasu, 30% roztwór wodny Azotan srebra, nasycony roztwór wodny - b) Chloran sodu, 40% roztwór wodny 2555 a) Azotan sodu, 45% roztwór wodny 4133 Substancja obojętna Woda:celuloza - b) a) Średnia wartość z porównawczych prób międzylaboratoryjnych b) Maksymalnego ciśnienia 2070 kpa nie uzyskano c) Roztwory nasycone powinny być przygotowywane w 20 C Średni czas narastania ciśnienia dla substancji badanej zmieszanej w stosunku 1:1 z celulozą (ms) 8 W praktyce, może to być uzyskiwane poprzez przygotowanie mieszaniny 1:1 mieszaniny cieczy badanej i celulozy w ilości większej niż potrzebna do próby i do przeniesienia 5 ± 0,1g do naczynia ciśnieniowego. Do każdej próby mieszanina powinna być świeżo przygotowana. 9 W szczególności, nie należy dopuścić do kontaktu pomiędzy sąsiadującymi zwojami spirali. 6/124
7 d) Patrz pozycja odniesienia 1) dotycząca klasyfikacji według algorytmu ONZ dla transportu 3. SPRAWOZDANIE 3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ Sprawozdanie z badań musi zawierać następujące informacje: - identyfikację, skład, czystość badanej substancji itp.; - stężenie substancji badanej; - zastosowaną procedurę suszenia celulozy; - zawartość wody w wysuszonej celulozie - wyniki pomiarów; - wyniki badań z substancją obojętną, jeżeli były wykonywane; - obliczone średnie czasy narastania ciśnienia; - odstępstwa od niniejszej metody i ich przyczyny; - wszystkie informacje dodatkowe lub uwagi dotyczące interpretacji wyników INTERPRETACJA WYNIKÓW 10 Wyniki badań ocenia się na podstawie: - obserwacji, czy mieszanina substancji badanej i celulozy zapala się samorzutnie; oraz - porównania średniego czasu przyjętego dla narastania ciśnienia od 690 kpa do 2070 kpa z substancją(ami) referencyjną(ymi). Substancję ciekłą uważa się za utleniającą, jeżeli: - mieszanina 1:1 (masowo), substancji i celulozy zapala się samorzutnie; lub - mieszanina 1:1 (masowo), substancji i celulozy wykazuje średni czas narastania ciśnienia mniejszy lub równy średniemu czasowi narastania ciśnienia dla mieszaniny 1:1 masowo, 65% (w/w) wodnego roztworu kwasu azotowego i celulozy. W celu uniknięcia fałszywie pozytywnych zafałszowania wyników, jeżeli to konieczne, wyniki uzyskane podczas badania substancji z materiałem obojętnym powinny być również uwzględnione przy interpretacji wyników. 4. PIŚMIENNICTWO 1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids. 10 Patrz odnośnik 1); w celu interpretacji wyników na podstawie zaleceń ONZ dla transportu stosowanych dla różnych substancji referencyjnych 7/124
8 Rysunek A.21.1 Naczynie ciśnieniowe A Korpus naczynia ciśnieniowego B Korek blokujący membranę rozrywającą C Głowiczka zapalająca D Miękka podkładka ołowiana E Membrana rozrywająca F Ramię boczne G Głowica czujnika ciśnienia H Podkładka I Elektroda zaizolowana J Elektroda uziemiona K Izolacja L Króciec stalowy M Wyżłobienie na odkształcenie podkładki 8/124
9 Rysunek A.21.2 Urządzenie podtrzymujące Rysunek A.21.3 Układ zapalający A Spirala zapalająca B Izolacja C Elektrody D Głowiczka zapalająca Uwaga: mogą być stosowane oba te ustawienia. 9/124
10 Załącznik nr 3 B.1. BIS. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA (PODANIE DROGĄ POKARMOWĄ) METODA USTALONEJ DAWKI 1. METODA Niniejsza metoda jest równoważna metodzie opisanej w Wytycznej OECD Nr 420 (2001) Wstęp W tradycyjnych metodach szacowania toksyczności ostrej zgon zwierząt jest poszukiwanym wskaźnikiem siły działania toksycznego. W 1984 Brytyjskie Towarzystwo Toksykologiczne zaproponowało nowe podejście do badań toksyczności ostrej opierające się na kolejnym podawaniu dawek o ustalonej wielkości 1). Podejście to umożliwia uniknięcia traktowania zgonu zwierząt jako kryterium oceny, gdyż polega na obserwacji wyraźnych cech działania toksycznego ujawnijących się po kolejnym podaniu dawki o ustalonej wielkości. Po brytyjskich 2) i międzynarodowych 3) badaniach walidacyjnych in vivo procedura została przyjęta w 1992 roku jako metoda badawcza. Następnie w kolejnych badaniach 4), 5), 6) oszacowano wiarygodność Metody Ustalonej Dawki przy zastosowaniu statystycznych modeli matematycznych. Badania in vivo i modelowania wykazały, że procedura jest powtarzalna, umożliwia zmniejszenie liczby stosowanych zwierząt niż w metodach tradycyjnych oraz można uszeregować substancje w sposób zbliżony do innych nietradycyjnych metod badania toksyczności ostrej. Wytyczne, co do wyboru najbardziej właściwej metody badawczej do oceny toksyczności ostrej podane są w Wytycznych do Badań Toksyczności Ostrej po Podaniu Drogą Pokarmową 7). Dokument ten zawiera także dodatkowe informacje, dotyczące przeprowadzenia badań i ich interpretacji Metodą B.1. bis. Zasadą metody jest, aby w badaniu głównym stosowane były tylko średnio toksyczne dawki; unikać należy podawania dawek, które prawdopodobnie będą powodować zgon zwierząt. Nie należy podawać również substancji w dawkach, co do których jest pewność, że powodują znaczny ból i cierpienie z powodu ich ostrego działania drażniącego lub żrącego. Zwierzęta w agonii lub w widoczny sposób cierpiące, bądź też wykazujące oznaki silnego i trwałego bólu, powinny być humanitarnie uśmiercone, a w interpretacji wyników powinny zostać traktowane tak samo, jak zwierzęta, które padły podczas badania. Kryteria podjęcia decyzji o uśmierceniu zwierząt w agonii lub cierpiących oraz wytyczne, co do rozpoznawania przewidywanej lub nieuchronnej śmierci są przedmiotem osobnych Wytycznych 8). Stosując tę metodę można uzyskać informacje na temat niebezpiecznych właściwościach substancji oraz uszeregować je i sklasyfikować zgodnie z zasadami Światowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) dotyczącymi klasyfikacji substancji chemicznych ze względu na toksyczność ostrą 9). Przed przystąpieniem do badania, wykonujący je powinien wziąć pod uwagę wszystkie dostępne informacje na temat badanej substancji. Do takich informacji zalicza się tożsamość i budowę chemiczną substancji, jej właściwości fizykochemiczne, wyniki innych badań toksykologicznych in vitro lub in vivo, dane toksykologiczne dla substancji o podobnej budowie chemicznej oraz przewidywane zastosowanie(a) tej substancji. Takie informacje są konieczne w celu przekonania wszystkich zainteresowanych, że badanie jest odpowiednie dla ochrony zdrowia ludzkiego i odpowiednie do właściwego wyboru dawki początkowej Definicje Toksyczność ostra po podaniu drogą pokarmową: oznacza wszystkie szkodliwe efekty, które występują po podaniu substancji drogą pokarmową w pojedynczej dawce lub w wielu dawkach, podanych w czasie 24 godzin. Zgon opóźniony: oznacza, że zwierzę nie ginie lub nie znajduje się w stanie agonii w czasie 48 godzin od podania badanej substancji, ale pada później, w czasie 14 dniowego okresu obserwacji. Dawka: jest ilością substancji badanej podanej zwierzęciu. Dawkę wyraża się jako masę substancji badanej przypadającą na jednostkę masy ciała zwierzęcia (np.: mg/kg). Toksyczność widoczna: jest ogólnym terminem opisującym wyraźne oznaki zatrucia występujące po podaniu substancji badanej (zobacz pozycja 3) piśmiennictwa) takie, że w następnej najwyższej ustalonej dawce mogą wystąpić trwałe objawy ostrego bólu i cierpienia, stan agonii (kryteria podano w Humane Endpoints Guidance Document 8)) lub prawdopodobny jest zgon większości zwierząt. GHS: Światowy System Zharmonizowany Klasyfikacji Substancji Chemicznych i Mieszanin. Wspólne przedsięwzięcie OECD (zdrowie i środowisko), Komitetu Ekspertów ONZ ds. Transportu Towarów Niebezpiecznych (właściwości fizykochemiczne), ILO (informacja o zagrożeniach) i koordynowane przez Międzyorganizacyjny Program Zarządzania Chemikaliami (IOMC). Nieuchronny zgon: gdy spodziewany jest stan agonii lub zgon po przedłużeniu czasu obserwacji. Do objawów mogących wskazywać na taki stan u gryzoni zalicza się konwulsje, położenie boczne, pozycję leżącą i drgawki (bardziej szczegółowy opis można znaleźć w Human Endpoints Guidance Document 8) ). 10/124
11 LD 50 (dawka śmiertelna medialna): jest statystycznie obliczoną pojedynczą dawką substancji, która spowoduje śmierć 50% zwierząt po podaniu drogą pokarmową. Wartość LD 50 jest wyrażana w postaci masy substancji badanej przypadająca na jednostkę masy badanego zwierzęcia (mg/kg). Dawka graniczna: odnosi się do górnego ograniczenia dawki w badaniu (2000 lub 5000 mg/kg). Prognozowany zgon: obecność cech klinicznych świadczących o zgonie w przewidywalnym okresie w przyszłości przed upływem zakończenia doświadczenia, np. niezdolność do picia wody lub spożywania paszy (bardziej szczegółowy opis można znaleźć w Humane Endpoints Guidance Document 8)) Zasada badania Grupy zwierząt jednej płci narażane są według procedury etapowej przy zastosowaniu ustalonych dawek 5, 50, 300 i 2000 mg/kg (wyjątkowo może być brana pod uwagę dodatkowa dawka 5000 mg/kg, zobacz punkt ). Poziom dawki początkowej jest wybierany na podstawie badania wstępnego i jest to dawka, która powinna powodować wystąpienie pewnych objawów toksyczności jednak bez wystąpienia jej ostrych efektów lub śmiertelności. Objawy kliniczne i warunki powiązane z wystąpieniem bólu, cierpienia i nieuchronnego zgonu są szczegółowo opisane w oddzielnych Wytycznych OECD 8). Następne grupy zwierząt mogą być narażane na badaną substancję podawaną w wyższych lub niższych ustalonych dawkach, w zależności od występowania lub nie występowania objawów toksyczności lub śmiertelności. Procedura ta jest kontynuowana, aż do podania substancji w dawce powodującej widoczne objawy toksyczności lub do momentu, gdy stwierdzi się nie więcej niż jeden przypadek zgonu lub, gdy w najwyższej dawce nie notuje się żadnych efektów, bądź też zgony występuje w dawce najniższej Opis metody badawczej Wybór gatunku zwierząt Preferowanym gatunkiem gryzoni jest szczur, chociaż mogą być również stosowane inne gatunki gryzoni. W badaniach zazwyczaj używa się samic 7). Jest to uzasadnione opisanymi w literaturze wynikami konwencjonalnych badań służących do określenia wartości LD 50, które wykazują, że zazwyczaj istnieje niewielka różnica we wrażliwości pomiędzy samcami, a samicami gryzoni; a w tych przypadkach, w których obserwowane są różnice, samice są na ogół nieco bardziej wrażliwe 10). Jeżeli wiedza o toksykologicznych lub toksykokinetycznych właściwościach strukturalnie podobnych substancji wskazuje na większe prawdopodobieństwo, że samce mogą być bardziej wrażliwe, wówczas do badań powinny być użyte szczury tej płci. Gdy badanie prowadzi się na samcach należy podać wyraźne tego uzasadnienie. Stosowane powinny być młode, dojrzałe, zdrowe osobniki powszechnie używanych ras laboratoryjnych. Samice powinny być dziewicze i nieciężarne. Każde zwierzę na początku doświadczenia powinno być w wieku 8 do 12 tygodni, a jego masa powinna zawierać się w przedziale ±20% średniej masy uprzednio narażanych zwierząt Warunki przetrzymywania i karmienia Temperatura w pomieszczeniach doświadczalnych powinna wynosić 22 C (±3 C). Wilgotność względna powinna wynosić 50-60% przy dopuszczalnych odchyleniach między 30% a 70% jedynie podczas czyszczenia pomieszczeń. Należy stosować sztuczne oświetlenie: 12 godzin światła i 12 godzin ciemności. Do karmienia może być stosowana typowa pasza laboratoryjna, należy zapewnić nieograniczony dostęp do wody. Zwierzęta mogą być pogrupowane w klatkach wg otrzymywanej dawki, ale liczba zwierząt przypadających na klatkę nie może zakłócać dokładnych obserwacji każdego zwierzęcia Przygotowanie zwierząt Zwierzęta są wybierane losowo, znakowane dla umożliwienia identyfikacji każdego osobnika i w celu aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych przetrzymywane w klatkach przynajmniej 5 dni przed rozpoczęciem podawania substancji Przygotowanie określonych dawek substancji i ich podawanie Zasadniczo substancje badane, niezależnie od dawki, powinny być podawane w stałej objętości poprzez zróżnicowanie stężenia podawanego preparatu. Gdy bada się produkt końcowy w postaci ciekłej lub mieszaninę, wówczas zastosowanie nierozcieńczonej substancji badanej, tj. w stałym stężeniu, może być bardziej odpowiednie i wymagane przez niektóre urzędy dla następującej w dalszej kolejności oceny ryzyka tej substancji. W każdym z tych przypadków nie należy przekraczać maksymalnej objętości podawanej dawki. Maksymalna objętość cieczy, która może być podana jednorazowo zależy od rozmiarów zwierzęcia. U gryzoni objętość ta nie powinna przekraczać 1 ml/100 g masy ciała, jednakże w przypadku roztworów wodnych można wziąć pod uwagę objętość 2 ml/100 g masy ciała. O ile jest to tylko możliwe, to w przypadku różnych postaci (formulacji) podawanego preparatu zaleca się w pierwszej kolejności użycie wodnych roztworów/zawiesin/emulsji, a w następnej kolejno- 11/124
12 ści wskazane są roztwory/zawiesiny/emulsje w oleju (np.: oleju kukurydzianym), a w ostateczności roztwory w innych rozpuszczalnikach. Powinny być znane własności toksykologiczne nośników innych niż woda. Podawane roztwory muszą być przygotowane na krótko przed ich podaniem chyba, że stabilność preparatu w okresie dłuższym od okresu, w jakim przeprowadzono badanie jest znana i akceptowalna Sposób postępowania Podawanie substancji Badana substancja jest podawana jednorazowo w pojedynczej dawce za pomocą sondy dożołądkowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. W przypadku, gdy jednorazowe podanie całej dawki jest niemożliwe może być ona podana w porcjach, przy czym czas podania całej dawki nie może przekroczyć 24 godzin. Zwierzęta powinny być głodzone przed podaniem badanej substancji (np. w przypadku szczurów pozostawia się wodę, ale paszy nie podaje się w nocy; w przypadku myszy pozostawia się wodę, a paszy nie podaje się w okresię 3 4 godzin przed doświadczeniem). Po okresie głodzenia należy zważyć zwierzęta i podać im badaną substancję. Po podaniu substancji, w przypadku szczurów, paszę podaje się po upływie 3 4 godzin, a w przypadku myszy po upływie 1 2 godzin. Jeżeli substancje podaje się w porcjach w ciągu pewnego okresu, wówczas w zależności od długości trwania tego okresu może okazać się konieczne dostarczenie zwierzętom wody i paszy Badanie wstępne Celem badania wstępnego jest ustalenie właściwej dawki początkowej stosowanej w badaniu głównym. Badana substancja jest podawana pojedynczym zwierzętom w sposób sekwencyjny według schematów zamieszczonych w Schemacie 1. Badanie wstępne kończy się, gdy można podjąć decyzję, co do wyboru dawki początkowej stosowanej w badaniu głównym lub, gdy w najniższej ustalonej dawce obserwuje się zgon badanych zwierząt. Dawka początkowa do badania wstępnego jest wybierana z ustalonych poziomów 5, 50, 300 i 2000 mg/kg jako dawka mająca spowodować toksyczność widocznąjeśli można to przewidzieć na podstawie wyników badań in vivo i in vitro tej samej substancji lub substancji podobnej strukturalnie. W przypadku braku takich indormacji dawką początkową będzie 300 mg/kg. Pomiędzy narażaniem kolejnych zwierząt powinien być zachowany odstęp wynoszący przynajmniej 24 godziny. Wszystkie zwierzęta powinny być obserwowane przez przynajmniej 14 dni. W wyjątkowych sytuacjach, usprawiedliwionych tylko szczególnymi wymaganiami prawnymi, można rozważać zastosowanie dodatkowej, wyższej dawki 5000 mg/kg (Kryteria Klasyfikacji). W celu zapobieżenia nadmiernym cierpieniom zwierząt nie jest zalecane badanie w zakresach Kategorii 5 wg GHS (dawki 2000 do 5000 mg/kg) i powinno być ono brane pod uwagę tylko wtedy, gdy istnieje duże prawdopodobieństwo, że wyniki takiego badania będą miały istotne znaczenie dla ochrony zdrowia ludzi i zwierząt. W przypadkach, gdy badane zwierzę narażone w badaniu wstępnym na substancję w najniższej ustalonej dawce (5 mg/kg) padnie, wskazaną procedurą jest zakończenie badań i przypisanie substancji do Kategorii 1 wg GHS (jak przedstawiono w Schemacie 1). Jeżeli wymagane jest dalsze potwierdzenie tej klasyfikacji, można przeprowadzić dodatkową procedurę narażając drugie zwierzę w dawce 5 mg/kg. Jeżeli i to zwierzę padnie, wówczas potwierdza się zaklasyfikowanie substancji do Kategorii 1 wg GHS i natychmiast kończy badanie. Jeżeli drugie zwierzę przeżyje, wówczas narażane są maksymalnie trzy dodatkowe zwierzęta w dawce 5 mg/kg. Ze względu na wysokie ryzyko śmiertelności, w celu zapobieżenia zbędnym cierpieniom, zwierzęta powinny być narażane jedno po drugim. Odstęp czasowy pomiędzy podawaniem substancji w kolejnych dawkach powinien być wystarczający do ustalenia, czy poprzednie zwierzę może przeżyć. Jeżeli padnie drugie zwierzę natychmiast wstrzymuje się podawanie substancji w kolejnych dawkach, a badanie się kończy. Wystąpienie przypadku drugiego zgonu (bez względu na liczbę zwierząt pozostałych przy życiu w momencie zakończenia badania) powoduje zaklasyfikowanie substancji do wyniku A (2 lub więcej zgonów), przestrzegana jest zasada klasyfikacji wg Schematu 2 w ustalonej dawce 5 mg/kg (Kategoria 1 - jeżeli wystąpiły 2 lub więcej przypadków zgonów lub Kategoria 2 - jeżeli nie wystąpił więcej niż 1 przypadek zgonu). Ponadto Schemat 3 przedstawia wytyczne, co do klasyfikacji według systemu UE obowiązującego do czasu wdrożenia systemu GHS Badanie właściwe Liczba zwierząt i poziomy dawek Działania, które należy podjąć po badaniu wstępnym podane są w Schemacie 2. Konieczne będzie dokonanie wyboru jednej z trzech możliwości: zaprzestanie badań i przypisanie substancji do odpowiedniej klasy zagrożenia, badanie w wyższej ustalonej dawce lub badanie w niższej ustalonej dawce. Jednakże w celu oszczędzenia cierpień zwierzętom dawka powodująca zgony w badaniu wstępnym nie będzie powtarzana w badaniu głównym (zobacz Schemat 2). Doświadczenie wykazuje, że najbardziej prawdopodobnym wynikiem badania substancji w dawce początkowej będzie możliwość sklasyfikowania jej i dalsze eksperymenty nie będą konieczne. 12/124
13 Dla każdej badanej dawki należy użyć pięć zwierząt jednej płci. Wśród tych pięciu zwierząt powinno znajdować się jedno zwierzę, któremu podawana była substancja w odpowiednio ustalonej dawce w trakcie badania wstępnego, oraz cztery dodatkowe zwierzęta (z wyjątkiem sytuacji, gdy dawka stosowana w badaniu głównym nie była stosowana w badaniu wstępnym). Odstęp czasowy pomiędzy podawaniem substancji w kolejnych dawkach jest określony przez pojawienie się, czas trwania i nasilenie objawów toksyczności. Badanie zwierząt poprzez narażanie na substancję w kolejnej dawce powinno być wstrzymane do czasu uzyskania pewności, co do przeżycia uprzednio narażonych zwierząt. Zalecany jest okres przerwy trwający 3 do 4 dni pomiędzy podawaniem substancji w kolejnych dawkach, aby umożliwić zaobserwowanie objawów opóźnionej toksyczności. Odstęp czasowy powinien być właściwie dostosowany np.: w przypadku niedających się wyjaśnić reakcji. Gdy pod uwagę bierze się zastosowanie najwyższej ustalonej dawki 5000 mg/kg, to powinna być stosowana procedura podana w Kryteriach Klasyfikacji (zobacz także punkt ) Badanie dawki granicznej Badanie dawek granicznych wykonywane jest w sytuacjach, gdy osoba przeprowadzająca eksperyment posiada informacje, że badany materiał jest prawdopodobnie nietoksyczny tj., gdy przejawia on objawy toksyczności w dawkach powyżej górnych, wymaganych przez prawo poziomów. Informacje o toksyczności badanego materiału mogą pochodzić z badań podobnych związków lub podobnych zarówno pod względem tożsamości składników jak i składu procentowego produktów. W przypadku braku informacji o toksyczności bądź też przypuszczeń, że badany materiał jest toksyczny, należy przeprowadzić badanie główne. Stosując typową procedurę do badania wstępnego z zastosowaniem dawki początkowej 2000 mg/kg (lub wyjątkowo 5000 mg/kg) i następnie badanie z wykorzystaniem czterech zwierząt narażanych na substancję w dawce na tym samym poziomie, spełnia się wymagania badania dawki granicznej zgodne z tym opisem Obserwacje Obserwacje należy prowadzić dla każdego pojedynczego zwierzęcia, przynajmniej raz podczas pierwszych 30 minut po podaniu badanej substancji i okresowo podczas pierwszych 24 godzin, ze zwróceniem szczególnej uwagi podczas pierwszych 4 godzin. Obserwację zwierząt należy przeprowadzić codziennie przez 14 dni, z wyjątkiem przypadków, gdy muszą być one usuwane z badania i humanitarnie uśmiercane lub gdy są martwe. Okres obserwacji nie powinien być jednak ustalony sztywno. Powinien być określony przez reakcje toksyczne, czas ich rozpoczęcia i długość okresu powrotu do stanu normalnego i dlatego, gdy uzna się to za konieczne, może być odpowiednio wydłużony. Okresy pojawiania się i znikania objawów toksyczności są ważne, szczególnie w przypadku istnienia tendencji do wystąpienia opóźnienia objawów toksyczności 11). Wszystkie obserwacje należy systematycznie zapisywać, prowadząc dla każdego zwierzęcia osobne zapisy. Dodatkowe obserwacje będą konieczne, gdy zwierzęta nadal przejawiają objawy toksyczności. Należy obserwować zmiany na skórze i futrze, oczach i błonach śluzowych, a także w układzie oddechowym, układzie krążenia, ośrodkowym i autonomicznym układzie nerwowym oraz w aktywności somatomotorycznej i zachowaniu. Uwagę należy zwrócić na pojawienie się drgawek, konwulsji, ślinotoku, biegunki, letargu, snu i śpiączki. Pod uwagę należy brać zasady i kryteria podane w Human Endpoints Guidance Document 8). Zwierzęta w agonii i wykazujące objawy silnego cierpienia lub bólu powinny być humanitarnie uśmiercone. Dla zwierząt uśmiercanych lub martwych należy możliwie dokładnie zanotować czas padnięcia Masa ciała Masy ciała poszczególnych osobników powinny być określone na krótko przed rozpoczęciem podawania substancji badanej i następnie powinny być określone przynajmniej raz w tygodniu. Zmiany masy ciała powinny być obliczone i zapisywane. Pod koniec badania zwierzęta, które przeżyły należy ponownie zważyć i następnie humanitarnie je uśmiercić Badania patologiczne Wszystkie zwierzęta powinny być poddane badaniom makroskopowym podczas sekcji (także te, które padną podczas badania lub są uśmiercane z powodów humanitarnych). Należy zanotować wszystkie zmiany patologiczne, które wystąpiły u każdego zwierzęcia. Należy wziąć pod uwagę badania mikroskopowe narządów wykazujących zmiany patologiczne u zwierząt przeżywających 24 lub więcej godzin od początku podawania badanej substancji, ponieważ mogą dostarczyć użytecznych informacji. 2. WYNIKI Należy dostarczyć dane pochodzące od każdego zwierzęcia indywidualnie. Dodatkowo wszystkie dane powinny być zebrane w formie tabeli przedstawiającej dla każdej grupy badanej: liczbę użytych zwierząt, liczbę zwierząt przejawiających objawy toksyczności, liczbę zwierząt martwych i uśmierconych podczas badania, czas zgonu poszczególnych zwierząt, opis i czas wystąpieniaefektów toksyczności i odwracalności reakcji oraz wyniki sekcji. 13/124
14 3. SPRAWOZDANIE Sprawozdanie powinno zawierać następujące informacje: Badana substancja: - stan skupienia, czystość, gdy ma to znaczenie, także właściwości fizykochemiczne (w tym izomeryzacja); - dane identyfikacyjne, w tym numer CAS. Nośnik (jeśli jego użycie było konieczne): - uzasadnienie wyboru nośnika, jeśli nie była nim woda. Badane zwierzęta: - gatunek/rasa; - stan mikrobiologiczny zwierząt, jeśli jest znany; - liczba, wiek i płeć zwierząt (w tym także uzasadnienie zastosowania samców zamiast samic); - źródło pochodzenia, warunki przetrzymywania, pożywienie, itp. Warunki doświadczenia: - szczegółowe dane dotyczące postaci (formulacji) substancji badanej, w tym stan skupienia podanego materiału; - szczegółowe dane dotyczące sposobu podawania substancji badanej, w tym podawane objętości i czas podawania; - szczegółowe dane dotyczące pożywienia i jakości wody, w tym typ i źródło pożywienia, źródło wody; - podstawy wyboru dawki początkowej. Wyniki: - ujęte w tabeli dane dla każdego zwierzęcia i poziomu dawki (tj. zwierzęta wykazujące objawy toksyczności łącznie ze śmiertelnością, nasilenie i czas trwania efektów); - ujęte w tabeli dane dotyczące masy ciała i jej zmian; - masa ciała poszczególnych zwierząt w dniu podawania badanej substancji i następnie w odstępach tygodniowych oraz w dniu padnięcia bądź uśmiercenia; - data i czas padnięcia; - czas pojawienia się objawów toksyczności i informacje, czy były one odwracalne dla każdego zwierzęcia; - jeśli są dostępne, wyniki sekcji i wyniki badań histopatologicznych każdego zwierzęcia. Dyskusja i interpretacja wyników. Wnioski. 4. PIŚMIENNICTWO 1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, ) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, ) Van den Heuvel M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of the fixed - dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol., 28, ) Whithead and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed - dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, ) Stallard and Whitehead, A.(1995). Reducing the numbers in the fixed - dose procedure. Human Exptl. Toxicol., 14, ) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2000). Statistical evaluation of modifications to the fixed - dose procedure (manuscript in preparation). 7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N ) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,endocuments no-24-no- 0,FF.html]. 14/124
15 10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L.,Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, ) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA. 15/124
16 SCHEMAT 1: SCHEMAT BADANIA WSTĘPNEGO dawka początkowa: 5 mg/kg START 1 zwierzę 5 mg/kg 1 zwierzę 50 mg/kg 1 zwierzę 300 mg/kg 1 zwierzę 2000 mg/kg Klasyfikuj GHS Kategoria 1* A B C A B C A B C A B C Początek bad. gł Dawka (mg/kg): dawka początkowa: 50 mg/kg START 1 zwierzę 5 mg/kg 1 zwierzę 50 mg/kg 1 zwierzę 300 mg/kg 1 zwierzę 2000 mg/kg A B C A B C A B C A B C Klasyfikuj GHS Początek bad. gł Dawka (mg/kg): A B C Wynik zgon toksyczność widoczna brak widocznej toksyczności i zgonu * dla wyniku A w 5 mg/kg istnieje procedura uzupełniająca dla potwierdzenia klasyfikacji GHS: zobacz punkt /124
17 SCHEMAT 1: SCHEMAT BADANIA WSTĘPNEGO dawka początkowa: 300 mg/kg START 1 zwierzę 5 mg/kg 1 zwierzę 50 mg/kg 1 zwierzę 300 mg/kg 1 zwierzę 2000 mg/kg A B C A B C A B C A B C Klasyfikuj GHS Kategoria 1* Początek bad. gł Dawka (mg/kg): dawka początkowa: 2000 mg/kg START 1 zwierzę 5 mg/kg 1 zwierzę 50 mg/kg 1 zwierzę 300 mg/kg 1 zwierzę 2000 mg/kg A B C A B C A B C A B C Klasyfikuj GHS Kategoria 1* Początek bad. gł Dawka (mg/kg): A Wynik zgon * dla wyniku A w 5 mg/kg istnieje procedura uzupełniająca dla potwierdzenia klasyfikacji GHS: zobacz punkt B C toksyczność widoczna brak widocznej toksyczności i zgonu 17/124
18 SCHEMAT 2: SCHEMAT BADANIA GŁÓWNEGO Dawka początkowa: 5 mg/kg START 5 zwierząt 5 mg/kg 5 zwierząt 50 mg/kg * 5 zwierząt 300 mg/kg 5 zwierząt 2000 mg/kg A B C A B C A B C A B C Klasyfikuj kateg. GHS /Nieklasyfik. Dawka początkowa: 50 mg/kg START 5 zwierząt 5 mg/kg 5 zwierząt 50 mg/kg 5 zwierząt 300 mg/kg * 5 zwierząt 2000 mg/kg A B C A B C A B C A B C Klasyfikuj kateg. GHS /Nieklasyfik. Wynik A > 2 zgony Wielkość grupy 5 zwierząt w każdej grupie badania głównego zawiera każde zwierzę badane w tej dawce w badaniu wstępnym B C > 1 z toksycznością widoczną / lub 1 zgon Brak widocznej toksyczności i zgonu *Przekroczenie dobrostanu zwierząt Jeżeli ta dawka spowodowała śmierć w badaniu wstępnym, to dalsze zwierzęta nie będą badane. Przejdź do A 18/124
19 SCHEMAT 2: SCHEMAT BADANIA GŁÓWNEGO DAWKA POCZĄTKOWA: 300 mg/kg START 5 zwierząt 5 mg/kg 5 zwierząt 50 mg/kg 5 zwierząt 300 mg/kg 5 zwierząt 2000 mg/kg* A B C A B C A B C A B C Klasyfikuj kateg. GHS /Nieklasyfik. Dawka początkowa: 2000 mg/kg START 5 zwierząt 5 mg/kg 5 zwierząt 50 mg/kg 5 zwierząt 300 mg/kg 5 zwierząt 2000 mg/kg A B C A B C A B C A B C Klasyfikuj kateg. GHS /Nieklasyfik. Wynik A > 2 zgony Wielkość grupy 5 zwierząt w każdej grupie badania głównego zawiera każde zwierzę badane w tej dawce w badaniu wstępnym B C > 1 z widoczną toksycznością i/lub 1 zgon Brak widocznej toksyczności i zgonu *Przekroczenie dobrostanu zwierząt Jeżeli ta dawka spowodowała śmierć w badaniu wstępnym, to dalsze zwierzęta nie będą badane. Przejdź do A 19/124
20 KRYTERIA KLASYFIKACJI KRYTERIA KLASYFIKACJI SUBSTANCJI BADANYCH ZE SPODZIEWANYMI WARTOŚCIAMI LD 50 PRZEKRACZAJĄCYMI 2000 mg/kg BEZ POTRZEBY BADANIA Kryteria zagrożenia Kategorii 5 są przeznaczone dla identyfikacji substancji o stosunkowo niskiej toksyczności ostrej, które w pewnych okolicznościach mogą one stanowić zagrożenie dla wrażliwej populacji. Przewiduje się, że substancje te mają dożołądkowe lub skórne LD 50 w zakresie 2000 do 5000 mg/kg lub równoważne dawki poprzez inne drogi narażenia. Substancje badane mogą być zaklasyfikowane do klasy zagrożenia według klasyfikacji zdefiniowanej przez: 2000 mg/kg <LD 50 < 5000 mg/kg (Kategoria 5 w GHS) w następujących przypadkach: a) jeżeli skierowane do tej kategorii przez schemat badawczy (Schemat 2) w oparciu o występowanie umieralności, b) jeżeli istnieją już wiarygodne dowody, które wykazują że LD 50 będzie w zakresie Kategorii 5; lub inne badania na zwierzętach lub efekty toksyczne u ludzi wskazują ostre działanie na zdrowie ludzkie, c) przez ekstrapolację, oszacowanie lub pomiar danych jeżeli przypisanie do bardziej niebezpiecznej klasy nie jest gwarantowane i - dostępne są wiarygodne informacje wskazujące na znaczące efekty toksyczne u ludzi; lub - nie obserwuje się śmiertelności podczas badania aż do wartości klasy 4 po podaniu drogą pokarmową; lub - gdy opinia ekspertów potwierdza znaczące objawy kliniczne toksyczności, podczas badania aż do wartości Klasy 4, za wyjątkiem biegunki, nastroszenia sierści lub nietypowego wyglądu zewnętrznego; lub - gdy opinia ekspertów potwierdza wiarygodne informacje wskazujące potencjał znaczących efektów ostrych w innych badaniach na zwierzętach. BADANIE W DAWKACH POWYŻEJ 2000 mg/kg W wyjątkowych sytuacjach, uzasadnionych tylko przez szczególne wymogi prawne, pod uwagę brane może być zastosowanie najwyższej ustalonej dawki 5000 mg/kg. Dla dobra zwierząt badanie dawki 5000 mg/kg nie jest zalecane i powinno być stosowane tylko wtedy, gdy istnieje duże prawdopodobieństwo, że wyniki takich badań będą miały bezpośrednie znaczenie dla ochrony zdrowia ludzi i zwierząt 9). Badanie wstępne Zasady rządzące procedurą krokową podane w Schemacie 1 są rozszerzone do poziomu dawki 5000 mg/kg. Stąd jeśli w badaniu wstępnym stosuje się dawkę początkową 5000 mg/l to wynik A (zgon) będzie wymagał drugiego zwierzęcia do badań w dawce 2000 mg/l, wyniki B i C (toksyczność oczywista lub brak toksyczności) pozwoli na wybór dawki 5000 mg/kg do badania głównego. Podobnie, jeśli stosuje się inną dawkę początkową niż 5000 mg/l to wtedy badanie podąży do 5000 mg/kg w przypadku wyników B lub C w 2000 mg/kg; wynik A będzie dyktował dawkę 2000 mg/kg do badania głównego a wyniki B i C dawkę 5000 mg/kg jako początkową do badania głównego. Badania główne Zasady rządzące procedurą krokową podane w Schemacie 2 są rozszerzone do poziomu dawki 5000 mg/kg. Stąd jeśli w badaniu wstępnym stosuje się dawkę początkową 5000 mg/l to wynik A ( 2 zgony) będzie wymagał drugiej grupy do badań w dawce 2000 mg/l; wynik B (toksyczność oczywista i / lub 1 zgon) lub C (brak toksyczności) spowoduje brak klasyfikacji substancji według GHS. Podobnie, jeśli stosuje się dawkę początkową inną niż 5000 mg/kg to badanie podąży do 5000 mg/kg w przypadku wyniku C w 2000 mg/kg; następnie wynik A 5000 mg/kg spowoduje przypisanie substancji do Kategorii 5 GHS, a wyniki B lub C spowodują brak klasyfikacji substancji. 20/124
Jak przygotowywać podsumowania toksykologiczne w IUCLID i jak ustalać wartość DNEL Poradnik praktyczny część 14
Jak przygotowywać podsumowania toksykologiczne w IUCLID i jak ustalać wartość DNEL Poradnik praktyczny część 14 Annankatu 18, P.O. Box 400, FI-00121 Helsinki, Finlandia Tel. +358 9 686180 Fax +358 9 68618210