Source: https://patents.google.com/patent/JPH1068730A/en
Timestamp: 2019-02-21 13:11:19
Document Index: 758559274

Matched Legal Cases: ['art 3', 'art 4', 'art 5', 'art 5', 'art 6', 'art) 1', 'art 5', 'art 6']

JPH1068730A - Test tool for immunochromatography - Google Patents
Test tool for immunochromatography
JPH1068730A
JPH1068730A JP24408596A JP24408596A JPH1068730A JP H1068730 A JPH1068730 A JP H1068730A JP 24408596 A JP24408596 A JP 24408596A JP 24408596 A JP24408596 A JP 24408596A JP H1068730 A JPH1068730 A JP H1068730A
JP24408596A
Jun Suzuoki
置 純 鈴
1996-08-27 Application filed by Wako Pure Chem Ind Ltd, 和光純薬工業株式会社 filed Critical Wako Pure Chem Ind Ltd
1996-08-27 Priority to JP24408596A priority Critical patent/JPH1068730A/en
1998-03-10 Publication of JPH1068730A publication Critical patent/JPH1068730A/en
PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a test tool for use in immunochromatography, by which a material to be measured in a liquid sample can be measured with accuracy and high sensitivity. SOLUTION: This test tool includes a first part 3 held in such a way that it can be moved by the capillary phenomenon and containing a first antibody specific to a material to be measured which is coupled to either avidin or biotin; a second part 4 labeled by a marker from which a visually detectable signal can be obtained and containing a substance that can form an avidin-biotin complex together with the avidin or biotin coupled to the first antibody; and a third part 5 having a portion which is specific to the material to be measured and in which a second antibody different in recognizable part from the first antibody is fixed. The first and second parts, and the second and third parts, are interconnected so that the capillary phenomenon occurs between them.
【産業上の利用分野】本発明は、液体試料中の測定対象物質量を測定するためのイムノクロマト法用試験用具及びそれに用いた測定方法に関する。 The present invention relates to a measuring method using the test kit and its immunochromatographic method for measuring the analyte content in the liquid sample.
【従来技術及びその問題点】毛管現象を利用するクロマトグラフィーの手法と免疫学的手法とを組み合わせた測定方法、所謂イムノクロマト法（イムノフロー法）は、 BACKGROUND OF THE INVENTION measuring method combining the chromatographic techniques and immunological techniques utilizing capillary phenomenon, so-called immunochromatographic (immunoblot flow method),
簡便で、特別な装置を用いることなく判定を容易に且つ短時間で測定できる方法として、殊に優れた半定量分析法として広く利用されている測定方法である。 Simple, as a method for determining can easily and measured in a short time without using a special device, a measuring method which is widely used as especially excellent semi-quantitative analysis.
【０００３】イムノクロマト法の基本原理は、測定対象物質を含有する液体試料を、マーカーにより標識された抗体を含有させた部位に供して反応させ、生じた測定対象物質とマーカー標識抗体との複合物を毛管現象により、測定対象物質に特異的に結合する抗体が固定化されている第２部分に移動させて、当該第２部分に固定化抗体−測定対象物質−マーカー標識抗体の所謂サンドイッチ型免疫複合体を形成させ、固定化されたマーカーに由来する発色に基づいて測定対象物質量を測定するというものである。 The basic principle of immunochromatography, the liquid sample containing the analyte is reacted subjected to site which contains the antibody labeled with a marker compound with the analyte and a marker-labeled antibody raised by capillary action, the antibody that specifically binds to the analyte is moved to the second moiety that is immobilized, immobilized antibody to the second part - the target substance - marker-labeled antibody so-called sandwich-type immune to form a complex, is that to measure the analyte amount based on color derived from the immobilized marker.
【０００４】例えば特公平7ー13640号公報には、同一平面上に存在し互いに毛管現象が生じるように連結された、a)その中に移動可能なように保持された小胞マーカーにより標識された測定対象物質に特異的な抗体（トレーサー）を含み且つ試料添加部位である第１部分及び、 [0004] JP-Kokoku 7-2 13640, capillarity from each other exist in the same plane are connected to occur, a) is labeled with vesicular marker held so as to be movable therein the first portion and a and sample addition site comprises an antibody specific (tracer) in the measurement target substance,
b)その中に測定対象物質に特異的に結合する抗体が固定化されている第２部分を有するイムノクロマト法用試験用具、及びこれを用いた測定対象物質の測定方法が開示されている。 b) measuring method of the measurement target substance using immunochromatography test equipment, and which antibody specifically binding a second moiety that is immobilized on the target substance are disclosed therein.
【０００５】また、国際公開第WO84/04171号公報には、 [0005] In addition, the International Publication No. WO84 / 04171,
イムノクロマト法用試験用具の一部分に測定対象物質に対する抗体を予め固定化させるために、アビジン−ビオチン反応を利用した方法が開示されている。 To advance immobilized antibodies to the analyte in a portion of the immunochromatography test equipment, avidin - method utilizing biotin reaction is disclosed.
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これらの方法においては、測定対象物質を検出するためのマーカーが標識された抗体は、通常、マーカー粒子（金コロイド、着色ラテックス等）に対して抗体分子が複数個結合した構造となっているため、マーカー標識抗体の抗体として、測定対象物質の認識部位が測定対象物質中に通常１つしかないモノクロ−ナル抗体等を用いた場合には、固定化抗体−測定対象物質−マーカー標識抗体からなる所謂サンドイッチ型免疫複合体中のマーカー粒子は、測定対象物質１個に対して最大１個にしかなり得ないため必ずしも充分な感度が得られない、という問題点があった。 [SUMMARY OF THE INVENTION However, in these methods, the antibody markers for the detection of the target substance is labeled, usually an antibody molecule to a marker particles (colloidal gold, colored latex and the like) There because that is the plurality bound structure, as the antibody marker-labeled antibody, usually one only monochrome recognition site in the target substance in the target substance - in the case of using a monoclonal antibody, etc., immobilized antibody - analyte - marker particles of so-called sandwich-type immune complex consisting of the markers labeled antibody, up to one not always sufficient sensitivity can not be obtained because only not be a problem that the measurement target substance one there was a point.
【０００７】一般に、イムノクロマト法は、短時間（多くの場合10分以内）で測定を完了させる必要のある測定方法であるため、上記の如き問題点を有する方法では測定精度の低下や検出感度の低下を招く場合が多々あった。 [0007] In general, immunochromatography is fast because measuring method needs to complete the measurement in (often within 10 minutes), and a decrease in the detection sensitivity of the measurement accuracy by a method having such problems of the If you lead to a decrease there were many.
【課題を解決するための手段】本発明は、上記した如き状況に鑑み成されたもので、(a)毛管現象により移動可能なように保持された、アビジン又はビオチンの何れかと結合した測定対象物質に特異的な第１抗体を含む第１ Means for Solving the Problems The present invention has been made in view of such conditions described above, measured bound to any one of (a) is held so as to be movable by the capillary phenomenon, avidin or biotin the includes a first antibody specific for the substance 1
部分と、(b)視覚的に検知し得るシグナルが得られるマーカーで標識された、第１抗体に結合したアビジン又はビオチンとアビジン・ビオチン複合体を形成し得るものを含む第２部分と、(c)測定対象物質に特異的で、第１ A portion, a second portion, including those capable of forming a (b) visually signals that may be detected is labeled with a marker to be obtained, avidin or biotin and avidin-biotin complex bound to the first antibody, ( c) specific for the analyte, the first
抗体と認識部位が異なった第２抗体が固定化されている部位を有する第３部分とを具備し、(d)当該第１部分と第２部分及び第２部分と第３部分が、相互間に毛管現象が生じるように連結された、イムノクロマト法用試験用具、の発明である。 The second antibody comprises a third portion having a site being immobilized antibody recognition sites are different, is (d) said first portion and second portion and a second portion and a third portion, between each other capillary action linked as occurs, immunochromatography test tool, an invention.
【０００９】また、本発明は、１）アビジン又はビオチンと結合した測定対象物質に特異的な第１抗体を毛管現象により移動可能なように保持した第１部分に液体試料を供して液相中で反応を開始させ、２）反応生成物を毛管現象により、視覚的に検知し得るシグナルが得られるマーカーで標識された、第１抗体に結合したアビジン又はビオチンとアビジン・ビオチン複合体を形成し得るものを毛管現象により移動可能なように保持した第２部分に運ばせ、３）形成したマーカー結合反応生成物を毛管現象により測定対象物質に特異的で、第１抗体と認識部位が異なった第２抗体が固定化されている部位を有する第３部分に運ばせ、４）該第３部分の第２抗体固定化部位に捕捉された反応生成物中のマーカーに由来する発色の程度に基づいて Further, the present invention provides 1) avidin or biotin first antibody specific for the analyte bound by subjecting the liquid sample to the first portion and held so as to be movable by the capillary phenomenon and a liquid phase in reaction is started and, 2) the reaction product capillarity, visually signaling that may be detected is labeled with a marker obtained by forming avidin or biotin and avidin-biotin complex bound to the first antibody obtain what was conveyed to a second portion which holds so as to be movable by the capillary phenomenon, 3) the formation marker binding reaction products specific to the analyte by capillary action, first antibody recognition site is different It was conveyed to a third portion having a portion in which the second antibody is immobilized, 4) based on the degree of color development derived from the marker of the third second antibody immobilized reaction product trapped at the site of the moiety Te 該液体試料中の測定対象物質量を測定する方法、の発明である。 Method for measuring the analyte content of the liquid sample, which is the invention.
【００１０】即ち、本発明者は、従来のイムノクロマト法用試験用具に於ける問題点、即ち測定対象物質に対するマーカーの結合量が少ないために、測定精度の低下や検出感度の低下を招く、という問題を解決したイムノクロマト法用試験用具を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、測定対象物質と、アビジン（又はビオチン）と結合した測定対象物質に特異的な第１抗体（以下、アビジン（又はビオチン）結合第１抗体と略記する。）とを第１ [0010] Namely, the present inventors have in problems with the conventional immunochromatography test tool point, that due to the small amount of binding of a marker for the analyte, leads to a decrease in reduction and the detection sensitivity of the measurement accuracy, that results problem intensive studies to develop a resolved immunochromatography test equipment, the measurement and the target substance, avidin (or biotin) and the first antibody specific for the analyte bound (hereinafter, avidin (or biotin ) abbreviated as binding first antibody.) and a first
部分の液相中で反応させて、先ず、［アビジン（又はビオチン）結合第１抗体−測定対象物質免疫複合体］（即ち、反応生成物）を液相中で形成させ、次いでこれを、 Is reacted with part of the liquid phase, first, [avidin (or biotin) binding a first antibody - analyte immune complexes (i.e., reaction product) was formed in the liquid phase, then it,
視覚的に検知し得るシグナルが得られるマーカーで標識された、第１抗体に結合したアビジン（又はビオチン） Signal that can be visually detected is labeled with a marker obtained, bound to the first antibody avidin (or biotin)
とアビジン・ビオチン複合体を形成し得るもの（以下、 Those capable of forming avidin-biotin complex (hereinafter,
マーカー標識ビオチン（又はアビジン）と略記する。 Abbreviated as marker-labeled biotin (or avidin). ） )
を含む第２部分に毛管現象で運ばせ、［マーカー標識ビオチン（又はアビジン）−アビジン（又はビオチン）結合第１抗体−測定対象物質免疫複合体］（即ち、マーカー結合反応生成物）を形成させ、更にこれを、第１抗体と認識部位の異なった第２抗体固定化部（判定部）を有する第３部分に毛管現象により運ばせ、サンドイッチ型免疫複合体を判定部に形成させ、結果的に判定部に形成された当該サンドイッチ型免疫複合体中のビオチン（又はアビジン）に標識されたマーカーに由来する発色の程度に基づいて測定対象物質量を測定するように構成したイムノクロマト法用試験用具を用いれば、従来のイムノクロマト法用試験用具に於ける上記した如き問題を解決して、測定対象物質を高感度に精度良く測定し得ることを見出し、本発明 It was carried on capillarity to the second portion comprising, to form the marker-labeled biotin (or avidin) - analyte immunocomplexes - avidin (or biotin) binding a first antibody (i.e., marker-binding reaction product) further which causes carried by capillarity to the third portion having a second antibody immobilization part having different recognition sites and the first antibody (determination unit), is formed to the determination section sandwich type immunocomplex, consequently configuration the immunochromatography test tool to measure a measurement target substance amount on the basis of the degree of coloration derived from the labeled marker biotin (or avidin) of the sandwich immune complex formed in the determination unit to the use of, and solve the conventional problems such as in the above immunochromatography test tool, found that a target substance can be accurately measured with high sensitivity, the present invention 完成するに至った。 It has been completed.
【００１１】尚、サンドイッチ型免疫複合体中のマーカー量を単に増加させたいのであれば、アビジン（又はビオチン）結合抗体とマーカー標識ビオチン（又はアビジン）とを予め反応させておき、これと測定対象物質とを反応させても良いはずであるが、このようにして反応を行わせると、理由は不明であるが最終的に測定対象物質の検出感度が低下する場合が多いので、好ましくない。 [0011] Incidentally, if you want simply to increase the amount of marker of the sandwich-type immune complex, avidin (or biotin) were allowed to react in advance with the bound antibody and a marker-labeled biotin (or avidin), which the measurement object but it should be allowed to react with material, when to perform this manner the reaction, the reason is unknown in many cases the detection sensitivity of the final analyte to become bad.
【００１２】本発明の、相互に毛管現象により連結可能な第１部分及び第２部分並びに第３部分は、通常毛管現象を生じさせることのできる吸水性の膜状物或いはシート状物を使用して形成される。 [0012] of the present invention, a first portion connectable by capillarity each other and the second portion and the third portion, using a film-like material of the water-absorbing or sheet-like material that is capable of causing a normal capillary action It is formed Te. このような膜状物或いはシート状物としては、吸水性を有する膜状物或いはシート状物として通常この分野で用いられるものであれば特に限定されることなく挙げられるが、例えばニトロセルロース膜、セルロースナイトレート膜、グラスフィルター膜、ナイロン膜、修飾ナイロン膜、ポリビニリデンジフルオロライド（ＰＶＤＦ）膜等の膜状物、例えば濾紙、不織布（例えばレーヨン，木綿等のセルロース系繊維、ガラス繊維、例えばナイロン，ポリエステル，ポリプロピレン，ポリウレタン等の合成高分子を素材とする合成繊維等から調製されたもの）等のシート状物等が好ましく挙げられる。 Such film-like material or sheet, there may be mentioned, without being limited usually particularly as long as it is used in this field as a film-like material or sheet having water absorbent, such as nitrocellulose membrane, cellulose nitrate film, a glass filter membrane, a nylon membrane, modified nylon membrane, polyvinylidene difluoro fluoride (PVDF) membrane film-like material such as, for example filter paper, nonwoven (e.g. rayon, cellulose fiber cotton, etc., glass fibers, such as nylon , polyester, polypropylene, sheet material or the like of synthetic polymers that have been prepared from synthetic fibers or the like to a material) such as polyurethanes preferably.
【００１３】本発明の第１部分に保持させるアビジン（又はビオチン）結合第１抗体を調製するために用いられる抗体や第３部分に固定化されている第２抗体として使用される抗体としては、測定対象物質に対する抗体であれば何れにてもよく特に限定されない。 [0013] As antibodies used as the second antibody immobilized on the antibody and the third part which is used to prepare the avidin (or biotin) binding a first antibody to hold the first part of the present invention, is not particularly limited and may be at any if antibodies to the analyte. 即ち、常法、 In other words, a conventional method,
例えば「免疫実験学入門、第２刷、松橋直ら、（株）学会出版センター(1981)」等に記載の方法に準じて、馬、 For example, "immune Experimentology Introduction, Second Printing, repaired Matsuhashi, Ltd. Society of Publication Center (1981)," according to the method described in such as, horse,
牛、羊、兎、山羊、ラット、マウス等の動物に測定対象を免疫して作製されるポリクローナル抗体でも、或はまた常法、即ちケラーとミルスタイン［Nature,vol.256,4 Cattle, sheep, rabbits, goats, rats, either a polyclonal antibody prepared by immunizing a measurement target in an animal such as a mouse, or also a conventional method, i.e., Keller and Milstein [Nature, vol.256,4
95(1975)］により確立された細胞融合法に従い、マウスの腫瘍ラインからの細胞と測定対象物で予め免疫されたマウスの脾細胞とを融合させて得られるハイブリドーマ等が産生するモノクローナル抗体でも何れにてもよく、 95 (1975) in accordance with the cell fusion method established by, both a monoclonal antibody by a hybridoma such as obtained by fusing the mouse splenic cells previously immunized with cells and the measurement object from mouse tumor line is produced may be at,
これらを単独で或はこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。 These, or the like is used alone or in combination as appropriate is arbitrary. 尚、均一の性質を有する抗体の得易さを考慮すると、ポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体の方が好ましい。 In view of the resulting ease of antibodies with uniform properties, towards the monoclonal antibodies are preferred over polyclonal antibodies. また、これら抗体は、要すればペプシン，パパイン等の酵素を用いて消化してＦ(ab') 2 、 These antibodies are then digested with pepsin, the enzyme papain or the like if necessary F (ab ') 2,
Ｆab'、或は Ｆabとして使用してもよいことは言うまでもない。 Fab ', or may of course be used as a Fab.
【００１４】本発明に使用されるアビジン結合第１抗体は、例えば２価性試薬を使用する常法、より具体的には例えばN-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate [0014] Avidin bound first antibody used in the present invention, for example, a conventional method of using bifunctional reagents, and more specifically, for example N-Succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate
(SPDP)をアビジンのアミノ基に結合後、還元することによって得られるチオール基が導入されたアビジンと、抗体のアミノ基にSPDPを導入したものとを反応させる方法、N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide(EMCS)をアビジンのアミノ基に結合後、これとFab'のチオール基とを反応させて結合する方法等、通常この分野で使用される方法であって、アビジンのビオチン結合能と抗体の活性とを失活させない方法であれば何れの方法を利用しても良い。 After combining the (SPDP) to the amino group of avidin, a method of reacting avidin which a thiol group obtained were introduced by reducing, and those obtained by introducing SPDP the amino groups of the antibody, N- (6-Maleimidocaproyloxy) after binding succinimide of (EMCS) to the amino group of avidin, and a method for coupling by reacting a thiol group of this and Fab ', usually a method used in the art, the avidin-biotin binding capacity and antibody as long as the method does not deactivate the active may be used any method.
【００１５】また、本発明に使用されるビオチン結合第１抗体は、例えば市販のビオチン化試薬、より具体的には例えばスクシンイミド基が導入されたビオチン（例えば、ＮＨＳ-ビオチン）やN-ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とビオチンをスペーサーを介して結合したもの等を、抗体のアミノ基に反応させる方法［例えばJ.Bi Further, biotin-conjugated first antibody used in the present invention include commercially available biotinylation reagent, biotin (e.g., NHS-biotin) which more specifically have been introduced, for example, succinimide group and N- hydroxysuccinimide etc. which acid imide and (NHS) biotin was attached via a spacer, a method of reacting the amino group of an antibody [e.g. J.Bi
ol.Chem.,vol.264, 272-279(1989)、新生化学実験講座1 ol.Chem., vol.264, 272-279 (1989), new biochemical Experimental Course 1
2， 分子免疫学III，p103ー104，東京化学同人社等］、 2, molecular immunology III, p103 over 104, Tokyo Kagaku Dojin Co., etc.],
例えば市販の N-[6-(Biotinamide)hexyl]-3'-(2'-pyrid Such as the commercially available N- [6- (Biotinamide) hexyl] -3 '- (2'-pyrid
yldithio)propionamide（ビオチンーＨＰＤＰ）や N-Iod yldithio) propionamide (biotin over HPDP) and N-Iod
oacetyl-N-biotinylhexylenediamineを、抗体のチオール基に反応させる方法 ［例えばAnnals ofthe New York The oacetyl-N-biotinylhexylenediamine, method [e.g. Annals ofthe New York to be reacted with a thiol group of an antibody
Academy of Science,vol.254, 203(1975)等］、ヒドラジノ基が導入されたビオチンを、アルデヒド化された抗体のアルデヒド基に反応させる方法［例えばJ.Biol.Che Academy of Science, vol.254, 203 (1975), etc.], methods of biotin hydrazino group is introduced, reacted aldehyde groups aldehyde antibodies [e.g. J.Biol.Che
m.,vol.172, 71(1948);Biotech.Appl.Biochem.,vol.9, . M, vol.172, 71 (1948);. Biotech.Appl.Biochem, vol.9,
488-496(1987)等］、ビオチンにマレイミド基を導入した誘導体を用いてFab'のSH基と結合させる方法、ヒドラジノ基が導入されたビオチンを抗体の糖鎖と結合させる方法、ヒドラジノ基が導入されたビオチンを水溶性カルボジイミド存在下で抗体のカルボキシル基と結合させる方法等、通常この分野で使用される抗体の活性を失わせない方法であれば何れの方法を利用しても良い。 488-496 (1987), etc.], a method of bonding with SH groups using the derivative obtained by introducing a maleimide group to biotin Fab ', a method of the biotin hydrazino group is introduced combined with sugar chains of the antibody, the hydrazino group the method or the like to be bonded with the carboxyl groups of the antibody introduced biotin in the presence of water-soluble carbodiimide, typically it may be used any method as long as it is a method that does not destroy the activity of the antibody used in this field.
【００１６】本発明の第１部分に保持されるアビジン（又はビオチン）結合第１抗体の抗体に結合させる物質はアビジン又はビオチンの何れかであるが、測定対象物質へのマーカーの結合量をより増加させるためには、アビジンを結合させることが望ましい。 [0016] Although the substance to be bound to the antibodies of avidin held (or biotin) binding a first antibody to a first portion of the present invention is either avidin or biotin, more amount of binding of a marker to the analyte to increase, it is desirable to bind avidin. 尚、その場合には、第２部分にはマーカー標識ビオチンを保持させることはいうまでもない。 Incidentally, in this case, it goes without saying that to hold the marker-labeled biotin to the second portion.
【００１７】本発明の第２部分に保持されるマーカー標識ビオチン（又はアビジン）に於けるマーカーとしては、視覚的に検知し得るシグナルが得られるものであって、これを第１抗体に標識したものが毛管現象により移動可能なものであれば良く特に限定されないが、具体的には例えば金コロイド、鉄コロイド、銀コロイド等の金属コロイド、例えばセレニウムコロイド等の非金属コロイド、例えばポリスチレン，ポリアクリルアミド等の高分子化合物を原料として調製された着色ラテックス、例えばローダミンＢ，カルボキシルフルオレッセン等の蛍光色素や例えばメチルオレンジ，クーマシーブリリアントブルーR250等の色素等を内包する着色リポソーム、例えばローダミンイソチオシアネート、フルオレッセンイソチオシアネート（FIT [0017] As in the marker to the marker-labeled biotin retained (or avidin) to a second portion of the present invention, which signal can be visually detected is obtained, labeled this the first antibody things although not particularly limited as long as it can be moved by capillary action, specifically, for example, gold colloid, iron colloid, metal colloid silver colloid, for example, non-metallic colloidal selenium colloid, such as polystyrene, polyacrylamide colored latex polymer compounds were prepared as raw materials etc., such as rhodamine B, a fluorescent dye and for example, methyl orange, colored liposomes, for example, rhodamine isothiocyanate containing the dye such as Coomassie Brilliant Blue R250, such as carboxyl fluorescein Sen, fluorescein isothiocyanate (FIT C）等の蛍光色素、例えばクーマシーブリリアントブルーR250等の色素等が挙げられるが、取扱易さや感度等の点を考慮すると中でも金コロイドが好ましい。 C) a fluorescent dye such as, for example, Coomassie brilliant blue R250 or the like of a dye and the like, but the handling when consideration of ease and sensitivity, etc. Among them, colloidal gold are preferred.
【００１８】本発明に用いられる金コロイドとしては、 [0018] as a gold colloid used in the present invention,
通常市販のものを用いればよいが、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法［Nature Phys. Usually may be used commercially available ones, but a conventional method, for example, a method of reducing chloroauric acid with sodium citrate [Nature Phys.
Sci.,vol.241,20(1973)等］により調製したものを用いてもよい。 Sci., May be used those prepared by vol.241,20 (1973), etc.]. また、金コロイドの粒径は特に限定されないが、通常５nm〜90nm、好ましくは10nm〜70nmの範囲のものが挙げられる。 Although the particle diameter of the gold colloid is not particularly limited, it is generally 5Nm～90nm, with preference given to the range of 10Nm～70nm.
【００１９】ビオチン（又はアビジン）にこれらのマーカーを標識して本発明に係るマーカー標識ビオチン（又はアビジン）を調製する方法としては、通常この分野で用いられる常法、例えば物理的吸着法［例えばTechniqu [0019] As a method for preparing the biotin (or avidin) to a marker-labeled biotin according to these markers to label to the present invention (or avidin), typically a conventional method used in this field, for example, physical adsorption methods [e.g. Techniqu
es in Immunocytochemistry,volume 1, p108-133, Aca es in Immunocytochemistry, volume 1, p108-133, Aca
denic Press 社やJ.Histochem.Cytochem.,vol.25,1187 denic Press, Inc. and J.Histochem.Cytochem., vol.25,1187
〜1200(1977)、Experientia,vol.31,1147(1975) 等に記載の方法］、化学的結合法［例えば特公平7-107535号公報、J.Immunol.Methods,vol.75,351(1984)、BBA,vo ~1200 (1977), Experientia, vol.31,1147 method according to (1975), etc.], chemical bonding methods [e.g. KOKOKU 7-107535 discloses, J.Immunol.Methods, vol.75,351 (1984), BBA, vo
l.640,66(1981)、BBRC,VOL.89,1114(1979)、J.Immu l.640,66 (1981), BBRC, VOL.89,1114 (1979), J.Immu
nol.Methods,vol.22,165(1984)等に記載の方法］、マーカーを蛋白質を介して標識する方法等は全て挙げられ 、マーカーの種類に応じて適宜選択して目的のマーカー標識ビオチン（又はアビジン）を調製すればよい。 Nol.Methods, the method described in vol.22,165 (1984), etc.], include all methods, such as labeling via the protein marker, Marker labeled biotin (or avidin object selected according to the kind of the marker ) can be prepared.
【００２０】尚、マーカーとして金コロイドを用いたマーカー標識ビオチン（又はアビジン）の調製は、自体公知の方法［例えばTechniques in Immunocytochemistry, [0020] Preparation of a marker-labeled biotin with colloidal gold as a marker (or avidin) is a method known per se [e.g. Techniques in Immunocytochemistry,
volume 1, p108-133, Acadenic Press 社、J.Histoch volume 1, p108-133, Acadenic Press, Inc., J.Histoch
em.Cytochem.,vol.25,1187〜1200(1977)、Experientia, em.Cytochem., vol.25,1187~1200 (1977), Experientia,
vol.31,1147(1975)等に記載の方法］により容易に行うことができるが、マーカーを蛋白質と結合した後、その蛋白質をビオチン標識する方法や、蛋白質をビオチン標識した後、ビオチン標識蛋白質をマーカーと結合させる方法が好ましい。 vol.31,1147 (1975) can be easily performed by Method according to such, after binding with the protein markers, and methods for biotinylated its protein after the protein was biotinylated biotin labeled protein method for binding a marker is preferred.
【００２１】具体的には、例えば以下の如くして容易に得ることができる。 [0021] Specifically, it is possible to obtain for example easily by as follows. 金コロイドをビオチン標識する場合 即ち、市販の金コロイド、或は常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法［Nature Phys.Sc That is, biotin-labeled colloidal gold, commercially available gold colloid or a conventional method, for example, a method of reducing chloroauric acid with sodium citrate, [Nature Phys.Sc
i.,vol.241,20(1973)等］により調製された金コロイドと、免疫反応に関与しない蛋白質、例えばアルブミン、 i., vol.241,20 (1973) and gold colloid prepared by, etc.], a protein not involved in the immune response, such as albumin,
グロブリン、カゼインなどの蛋白質とを、常法［J.Hist Globulin, a protein such as casein, a conventional method [J.Hist
ochem.Cytochem.,vol.25,1187〜1200(1977)、Experient ochem.Cytochem., vol.25,1187~1200 (1977), Experient
ia,vol.31,1147(1975)等］により処理することにより調製した後、例えば市販のビオチン化試薬、より具体的には例えばスクシンイミド基が導入されたビオチン（例えば、ＮＨＳ-ビオチン）やN-ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ） とビオチンをスペーサーを介して結合したもの等を、金コロイドに結合した蛋白質のアミノ基に反応させる方法［例えばJ.Biol.Chem.,vol.264, 272-279 ia, vol.31,1147 (1975) was prepared by treatment with, etc.], such as the commercially available biotinylation reagent, more specifically biotin was introduced succinimide group such as (e.g., NHS-biotin) or N -. hydroxysuccinimide (NHS) and the like that attached via a spacer to biotin, a method of reacting the amino group of protein bound to the colloidal gold [e.g. J.Biol.Chem, vol.264, 272-279
(1989)、新生化学実験講座12， 分子免疫学III，p103ー1 (1989), new biochemical experiments Course 12, molecular immunology III, p103-1
04，東京化学同人社等］、例えば市販の N-[6-(Biotina 04, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd., etc.], such as the commercially available N- [6- (Biotina
mide)hexyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamide（ビオチンーＨＰＤＰ）や N-Iodoacetyl-N-biotinylhexylen mide) hexyl] -3 '- (2'-pyridyldithio) propionamide (Biotin over HPDP) and N-Iodoacetyl-N-biotinylhexylen
ediamineを、金コロイドに結合した蛋白質のチオール基に反応させる方法 ［例えばAnnals of the New York Ac The ediamine, a method of reacting to a thiol group of the protein bound to the colloidal gold [for example Annals of the New York Ac
ademy of Science,vol.254, 203(1975)等］、ヒドラジノ基が導入されたビオチンを、金コロイドが結合し且つアルデヒド化された蛋白質のアルデヒド基に反応させる方法［例えばJ.Biol.Chem.,vol.172, 71(1948);Biotec ademy of Science, vol.254, 203 (1975), etc.], a method of reacting biotin hydrazino group is introduced, the aldehyde group bonded gold colloid and aldehyde are proteins [e.g. J.Biol.Chem. , vol.172, 71 (1948); Biotec
h.Appl.Biochem.,vol.9, 488-496(1987)等］、ヒドラジノ基が導入されたビオチンを金コロイドに結合した蛋白質の糖鎖と結合させる方法、ヒドラジノ基が導入されたビオチンを水溶性カルボジイミド存在下で金コロイドに結合した蛋白質のカルボキシル基と結合させる方法等、 h.Appl.Biochem., vol.9, 488-496 (1987), etc.], a method of attaching biotin hydrazino group is introduced protein sugar chain attached to colloidal gold, biotin hydrazino group is introduced the method is combined with the protein carboxyl groups bound to colloidal gold in the presence of water soluble carbodiimide and the like,
通常この分野で使用される抗体の活性を失わせない方法であれば何れの方法を利用しても良い。 Usually it may be used any method as long as it is a method that does not destroy the activity of the antibody used in this field. より具体的には、金コロイドと、金コロイド１mgに対して通常0.5〜1 Usually 0.5 to 1 with respect More specifically, a gold colloid, a gold colloid 1mg
00μg、好ましくは１〜50μgのアルブミンとを、適当な緩衝液中で５〜30分間室温下に反応させた後、例えばポリエチレングリコール等の分散剤を添加して遠心分離等により目的の金コロイド標識アルブミンを分取し、得られた金コロイド標識アルブミンを、アルブミン１mgに対して通常0.5〜10mg、好ましくは、１〜５mgのＮＨＳ− 00Myug, preferably after reacting the albumin 1～50Myug, in a suitable buffer to room temperature for 5 to 30 minutes, for example, the purpose of the colloidal gold-labeled by adding a dispersant such as polyethylene glycol by centrifugation or the like It was separated albumin, the resulting colloidal gold-labeled albumin, usually 0.5~10mg to albumin 1 mg, preferably, of 1 to 5 mg NHS-
ビオチンと適当な緩衝液中で、４℃１晩反応させることにより容易に得られる。 Biotin and appropriate buffer are readily obtained by reacting 4 ° C. 1 night. 尚、得られた金コロイド標識ビオチンは、例えばポリエチレングリコール等の分散剤を含む溶液中に均一に分散させて保存すればよい。 Incidentally, the colloidal gold-labeled biotin obtained, for example, may be stored dispersed uniformly in a solution containing a dispersant such as polyethylene glycol. また、 Also,
先に免疫反応に関与しない蛋白質、例えばアルブミン、 Protein which is not involved in the earlier in the immune response, such as albumin,
グロブリン、カゼインなどの蛋白質を上記の方法でビオチンと結合させたものを、金コロイドと上記の如き方法で結合させても良い。 Globulin, those proteins such as casein coupled with biotin by the method described above, may be coupled with colloidal gold and above such method. また、マーカー標識アビジンも、 Also, marker-labeled avidin,
常法［J.Histochem.Cytochem.,vol.25,1187〜1200(197 A conventional method [J.Histochem.Cytochem., Vol.25,1187~1200 (197
7)、Experientia,vol.31,1147(1975)等］を利用することにより容易に調製することができる。 7), Experientia, can be easily prepared by utilizing vol.31,1147 (1975), etc.]. より具体的には、金コロイドと、金コロイド１mgに対して通常0.5〜1 Usually 0.5 to 1 with respect More specifically, a gold colloid, a gold colloid 1mg
00μg、好ましくは１〜50μgのアビジンとを、適当な緩衝液中で５〜30分間室温下に反応させた後、例えばポリエチレングリコール等の分散剤を添加して遠心分離等により目的の金コロイド標識アビジンを分取することにより容易に得られる。 00Myug, preferably after reacting the avidin 1～50Myug, in a suitable buffer to room temperature for 5 to 30 minutes, for example, the purpose of the colloidal gold-labeled by adding a dispersant such as polyethylene glycol by centrifugation or the like It is easily obtained by preparative avidin min. 尚、得られた金コロイド標識アビジンは、例えばポリエチレングリコール等の分散剤を含む溶液中に均一に分散させて保存すればよい。 Incidentally, the resulting colloidal gold-labeled avidin may be, for example, stored uniformly dispersed in a solution containing a dispersant such as polyethylene glycol.
【００２２】尚、上記反応に於いて用いられる緩衝液は、金コロイドと測定対象物質に対するビオチン（又はアビジン）との結合反応を阻害しないものであればその種類、濃度、pＨ等は特に限定されない。 [0022] The buffer solution used in the above-mentioned reaction, the type as long as it does not inhibit the binding reaction between biotin (or avidin) for the analyte and gold colloid, concentration, pH, etc. is not particularly limited .
【００２３】上記の如くして調製されたアビジン（又はビオチン）結合第１抗体を本発明の第１部分に毛管現象により移動可能なように保持させる方法、或いは上記の如くして調製されたマーカー標識ビオチン（又はアビジン）を本発明の第２部分に毛管現象により移動可能なように保持させる方法としては、通常この分野で用いられる方法であればよく、特に限定されないが、具体的には例えば上記した如き膜状物又はシート状物を、アビジン（又はビオチン）結合第１抗体或いはマーカー標識ビオチン（又はアビジン）を含有する溶液中に浸漬後、送風乾燥或いは凍結乾燥する方法、上記した如き膜状物又はシート状物に、アビジン（又はビオチン）結合第１抗体或いはマーカー標識ビオチン（又はアビジン）を含有する溶液を塗布、噴 [0023] The above as the be prepared avidin (or biotin) binding method for holding so as to be movable by the capillary phenomenon to the first portion of the first antibody of the invention markers or are prepared as described above, as a method for holding so as to be movable by the capillary phenomenon in the second part of the present invention the labeled biotin (or avidin), typically may be a method used in this field, is not particularly limited, specifically, for example the such film-like material or sheet-like material described above, avidin (or biotin) binding the first after the immersion to the antibody or a solution containing a marker-labeled biotin (or avidin), a method of blowing drying or freeze-drying, such as films described above to Jo compound or sheet, applying a solution containing avidin (or biotin) binding a first antibody or marker-labeled biotin (or avidin), injection 或いは滴下した後、送風乾燥或いは凍結乾燥する方法等が挙げられる。 Or after dropping, and a method of blowing drying or freeze-drying. 尚、アビジン（又はビオチン）結合第１抗体或いはマーカー標識ビオチン（又はアビジン）を含有させる溶液としては、通常この分野で用いられている、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常抗原抗体反応を利用した測定法に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpＨとしては抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定はされないが、通常５〜９の範囲から好ましく選択される。 Incidentally, avidin (or biotin) as a solution to contain bound first antibody or marker-labeled biotin (or avidin), normally used in this field, such as Tris buffer, phosphate buffer, veronal buffer, borate acid buffer, Good's buffer or the like, a buffer used in the normal measurement method utilizing an antigen-antibody reaction include all, but are not particularly limited as long as it does not inhibit the antigen-antibody reaction as its pH, It is preferably selected from the range of usually 5-9. また、このような溶液中には、目的の抗原抗体反応を阻害しないものであれば、例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、界面活性剤、糖類等を適宜含有させて於いても良い。 Further, in such solutions, as long as it does not inhibit the antigen-antibody reaction of interest, such as albumin, globulin, water-soluble gelatin, stabilizer such as polyethylene glycol, surfactants, is suitably contain saccharides it may be at Te. 尚、アビジン（又はビオチン）結合第１抗体或いはマーカー標識ビオチン（又はアビジン）を保持させるために用いられる膜状物やシート状物は、これらが非特異的に吸着されて測定への影響が生じるのを防止するために、予め所謂ブロッキング処理を施しておくことが望ましい。 Incidentally, avidin (or biotin) binding a first antibody or marker-labeled biotin (or avidin) film-like material or sheet-like material which is used to hold the can, it impact on the measurement is non-specifically adsorbed occur to prevent, it is desirable to preliminarily subjected to so-called blocking treatment. このようなブロッキング処理は、通常この分野で行われる方法、 Such blocking treatment is usually method performed in this field,
例えばこれら膜状物やシート状物を例えばアルブミン、 For example these film-like material or sheet-like material such as albumin,
グロブリン、カゼイン、ポリビニルアルコール、界面活性剤等のブロッキング剤（但し、測定への影響のないものを選択して使用する。）を含有する適当な緩衝液（例えばpＨが５〜９ 程度の例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等）中に適当な時間浸漬した後に乾燥する方法等により行えばよい。 Globulin, casein, polyvinyl alcohol, surface active agents such as blocking agents (however, selected and used without effect on the measurement.) Suitable buffer containing (e.g. pH 5 to 9 about the example tris buffer, phosphate buffer, veronal buffer, borate buffer, may be performed by a method such as drying after immersion appropriate time in Good's buffer, etc.).
【００２４】本発明の第１部分に保持させるアビジン（又はビオチン）結合第１抗体の量としては、測定対象物質の種類や、検出限界や検量限界をどの程度に設定するかによって変動し、特に限定されないが、例えば本発明の第１部分の単位面積（cm 2 ）当たりの保持量（蛋白質量として）として通常0.01μg〜10mg、好ましくは0.0 [0024] As the amount of avidin (or biotin) binding a first antibody to hold the first part of the present invention will vary type of the measurement substance, by either set to what extent the detection limit and calibration limits, particularly but it is not limited to, usually 0.01μg~10mg example as the amount retained in the first part per unit area (cm 2) of the present invention (as protein content), preferably 0.0
5μg〜１mg、より好ましくは0.1〜100μgの範囲から適宜選択される。 5Myuji～1mg, more preferably selected from a range of 0.1-100. また、本発明の第２部分に保持させるマーカー標識ビオチン（又はアビジン）の量としては、測定対象物質の種類や、検出限界や検量限界をどの程度に設定するかによって変動し、特に限定されないが、例えば本発明の第２部分の単位面積（cm 2 ）当たりの保持量（蛋白質量として）として通常0.01μg〜10mg、好ましくは0.05μg〜１mg、より好ましくは0.1〜100μgの範囲から適宜選択される。 As the amount of marker-labeled biotin for holding the second portion of the present invention (or avidin), type of the measurement substance, vary depending on whether you set how much the detection limit and calibration limits, but are not limited to usually 0.01μg~10mg as for example the amount holding unit area (cm 2) per second portion of the present invention (as protein mass), preferably 0.05Myuji～1mg, more preferably be selected from a range of 0.1~100μg that.
【００２５】本発明の第１部分に保持させるアビジン結合第１抗体や第２部分に保持させるマーカー標識アビジンを調製するために使用されるアビジンとしては、ビオチンとの結合能力を持ったものであれば特に限定されないが、具体的には例えば卵白由来のアビジン、微生物由来のストレプトアビジン、これらの誘導体［例えば、アビジンの糖鎖を切断して得られるニュートロアビジン（NeutrAvidin。ピアース 社製）等］等が挙げられる。 [0025] As avidin used to prepare a marker-labeled avidin for holding the avidin binding first antibody or the second portion to be held in the first part of the present invention, as long as having the ability to bind to biotin if is not particularly limited, avidin, for example egg white Specifically, streptavidin microbial origin, these derivatives [for example, neutroavidin obtained by cutting the avidin sugar (NeutrAvidin. manufactured by Pierce Co.), etc.] or the like and the like.
また、本発明に用いられるアビジンは市販されているものをそのまま用いることが可能であり、目的の測定を阻害する成分が含まれていなければその品質、精製度等は特に限定されない。 Further, avidin used in the present invention can be used as it is commercially available, its quality, purity, etc. are not particularly limited unless they may contain ingredients that inhibit the measurement of interest.
【００２６】本発明の第３部分（展開膜）への第２抗体の固定化方法としては、通常この分野で用いられる方法であれば特に限定されないが、具体的には例えば当該第３部分として使用する上記した如き材質からなる膜状物やシート状物の一部に第２抗体溶液を塗布、滴下或いは噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法、膜状物やシート状物中の例えばアミノ基、カルボキシル基等の官能基を利用して化学的に第２抗体を結合させる方法等が挙げられる。 [0026] As a third partial method for immobilizing the second antibody to (expanded film) of the present invention is usually not particularly limited as long as the method used in this field, specifically, for example as the third part after the second antibody solution coating, dripping or spraying the part of film-like material or sheet-like material made of a material such as described above to use a method of fixing by drying to physical adsorption, membrane-like material or sheet-like material for example an amino group, methods and the like to couple the utilizing functional groups chemically second antibody such as a carboxyl group. 尚、このようにして得られた第２抗体固定化部を有する膜状物やシート状物は、非特異的な吸着による測定への影響を防止するために所謂ブロッキング処理を施しておくことが望ましい。 The film-like material or sheet-like material having a second antibody immobilization part obtained in this way, be kept subjected to so-called blocking treatment to prevent the influence on the measurement by the non-specific adsorption desirable. このようなブロッキング処理は、通常この分野で行われる方法、例えばこれら膜状物やシート状物を例えばアルブミン、グロブリン、カゼイン、ポリビニルアルコール、界面活性剤等のブロッキング剤（但し、測定への影響のないものを選択して使用する。）を含有する適当な緩衝液（例えばpＨ Such blocking treatment is usually method performed in this field, for example, these film-like material or sheet-like material such as albumin, globulin, casein, polyvinyl alcohol, surface active agents such as blocking agents (provided that the impact on the measurement selected and used without appropriate buffer containing.) (e.g., pH
が５〜９程度の例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等）中に適当な時間浸漬した後に乾燥する方法等により行えばよい。 There 5-9 about such as Tris buffer, phosphate buffer, veronal buffer, borate buffer, may be performed by a method such as drying after immersion appropriate time in Good's buffer, etc.).
【００２７】本発明の第３部分中に固定化させる第２抗体の量としては、測定対象物質の種類や、検出限界や検量限界をどの程度に設定するかによって変動し、特に限定されないが、例えば本発明の第３部分中の第２抗体固定化部の単位面積（cm 2 ）当たりの抗体保持量として通常0.01μg〜１mg、好ましくは0.1μg〜100μg、 より好ましくは0.5μg〜50μgの範囲から適宜選択される。 [0027] As the amount of second antibody that is immobilized during the third part of the present invention, the type and the target substance, vary depending on whether you set how much the detection limit and calibration limits, but are not limited to, for example typically the antibodies retain the amount of the third unit area of the second antibody immobilization part in the partial (cm 2) per the present invention 0.01Myuji～1mg, preferably 0.1Myuji～100myug, more preferably from 0.5μg~50μg It is appropriately selected from.
【００２８】また、サンドイッチ型免疫複合体形成反応を充分に完了させるために、或いは液体試料中の着色物質による測定への影響や測定対象物質と結合していないマーカー標識ビオチン（又はアビジン）による測定への影響を回避するためには、第３部分に於ける第２抗体固定化部は、第２部分との連結端並びに第３部分の他端からある程度離れた位置（例えば第３部分の中程等）に設けておくことが望ましい。 Further, in order to sufficiently complete the sandwich immune complex formation reaction, or measurement by the marker-labeled biotin (or avidin) which is not bound effects and the analyte to the measurement by the coloring material in a liquid sample to avoid affecting the the second antibody immobilization part in the third part, to some extent away from the other end of the connection end and the third portion of the second part (e.g. in the third portion it is desirable to provide a degree, etc.).
【００２９】本発明のイムノクロマト法用試験用具の測定対象物質としては、特に限定されないが、例えば血液、血漿、血清、髄液、尿、糞便等の生体由来の試料やこれらを適宜適当な緩衝液等で希釈或いは懸濁させて得られる液体試料中に含まれる、例えばアルブミン，ヘモグロビン，ミオグロビン，トランスフェリン，プロテインＡ，Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）等のタンパク質、例えば高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ），低比重リポ蛋白質（Ｌ Examples of the analyte immunochromatographic test device of the present invention is not particularly limited, for example, blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, urine, sample and these appropriately suitable buffer biologically derived such as feces contained in a liquid sample obtained by diluting or suspending the like, such as albumin, hemoglobin, myoglobin, transferrin, protein a, C-reactive protein (CRP) protein such as, for example, high density lipoprotein (HDL), low density lipoprotein (L
ＤＬ），超低比重リポ蛋白質等の脂質蛋白質、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ），リボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸、例えばアルカリ性ホスファターゼ，乳酸脱水素酵素，リパーゼ，アミラーゼ等の酵素、例えばＩgＧ，Ｉg DL), very low density lipoprotein, etc. lipoprotein, for example, deoxyribonucleic acid (DNA), and, nucleic acids such as ribonucleic acid (RNA), for example, alkaline phosphatase, lactate dehydrogenase, lipase, enzymes such as amylase, e.g. IgG, Ig
Ｍ，ＩgＡ，ＩgＤ，ＩgＥ等の免疫グロブリン（或はこれらの、例えばＦc部，Ｆab部，Ｆ(ab) 2部等の断片）、 M, IgA, IgD, etc. immunoglobulin IgE (or thereof such Fc portion, Fab portion, F (ab) fragments, etc. 2 parts),
例えばフィブリノーゲン，フィブリン分解産物（ＦＤ For example, fibrinogen, fibrin degradation products (FD
Ｐ），プロトロンビン，トロンビン等の血液凝固関連因子、例えばＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エイズウイルス等のウイルスに対する抗体、例えばＢ型肝炎ウイルス、梅毒トリポネーマ（ＴＰ）、クラミジア、カンジダ等の微生物関連抗原、例えばクラミジア等の微生物に対する抗体、例えばヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈ P), prothrombin, blood coagulation-related factors of thrombin and the like, for example, hepatitis B virus, C type hepatitis virus, antibodies to viruses such as AIDS virus, e.g. hepatitis B virus, syphilis Toriponema (TP), chlamydia, microbes Candida etc. associated antigens, antibodies against microorganisms e.g. Chlamydia, etc., such as human chorionic gonadotropin (h
ＣＧ）等のホルモン等が挙げられる。 CG) hormones such as the like.
【００３０】本発明のイムノクロマト法用試験用具を調製するには、例えば以下の如くして行えばよい。 [0030] To prepare the immunochromatography test tool according to the present invention, for example, it may be performed in as follows. 即ち、 In other words,
先ず、例えば適当な大きさのポリ塩化ビニルシート、ポリエチレンシート、ポリプロピレンシート、ポリスチレンシート等を担体として用い、該担体上に例えば両面テープ等を用いて、上記の如くして作製した第２抗体固定化部（判定部）を有する膜状物又はシート状物を接着して第３部分（即ち展開膜）を形成し、次いでマーカー標識ビオチン（又はアビジン）（例えば金コロイド標識ビオチン（又はアビジン）等）を保持させた膜状物又はシート状物を例えば両面テープ等を用いて該第３部分と相互間に毛管現象が生じるように接着させて第２部分を形成し、更に次にアビジン（又はビオチン）結合第１抗体を保持させた膜状物又はシート状物を例えば両面テープ等を用いて、該第２部分と相互間に毛管現象が生じるように接着させて第 First, for example, appropriate size of the polyvinyl chloride sheet, polyethylene sheet, polypropylene sheet, using a polystyrene sheet or the like as the carrier, using the on the carrier for example double-sided tape or the like, the second antibody fixed manufactured by as described above unit to form a third portion adhered to the film-like material or sheet-like material having a (determination unit) (i.e., expanded film), then the marker-labeled biotin (or avidin) (e.g. colloidal gold-labeled biotin (or avidin) or the like ) using the retained was film-like material or sheet-like material for example double-sided tape or the like a second portion formed adhered so as capillary phenomenon occurs therebetween and the third part, further then avidin (or with biotin) binding a first antibody film-like material was held or sheet, for example, double-sided tape or the like, first and adhered so as capillary phenomenon occurs therebetween and the second part 部分を形成することにより調製し得る。 It may be prepared by forming a portion. 尚、第１部分と第２部分との間で、或いは第２部分と第３部分との間で毛管現象を生じさせ易くするために、第１部分が第２部分の下端に約１〜２mm程度重なるように、また第２部分が第３部分の下端に約１〜２mm程度重なるように接着させるようにしても良い。 In between the first and second portions, or in order to facilitate causing capillarity between the second portion and the third portion, the first portion is approximately the lower end of the second portion 1~2mm to overlap degree, also the second portion may be caused to adhere to overlap about 1~2mm the lower end of the third portion. また、本発明のイムノクロマト法用試験用具に於いては、液体試料の吸収及び第１部分での免疫反応を円滑に行わせるために、第１部分の下端に更に液体試料吸収部を設け、液体試料を先ずこの部分に滴下し、毛管現象を利用して第１部分にこれを運ばせて反応を開始させるようにしても良い。 Furthermore, in the immunochromatography test tool according to the present invention, in order to smoothly immune reaction in the absorption and the first portion of the liquid sample, further provided a liquid sample-absorbing portion at the lower end of the first portion, the liquid samples were added dropwise first in this portion, may be caused to initiate the reaction was carried this first portion by utilizing the capillary phenomenon. 当該液体試料吸収部は、液体試料を吸収し得る膜状物やシート状物（第１部分や第２部分を形成するために用いられる膜状物やシート状物と同じものでよい）を例えば両面テープ等を用いて、第１部分と相互間に毛管現象が生じるように接着させることにより調製し得る。 The liquid sample absorbing section, film-like material or sheet-like material capable of absorbing a liquid sample (or the same as the film-like material or sheet-like material used to form the first portion and the second portion) for example using double-sided tape or the like, may be prepared by adhering to the capillary phenomenon occurs between the first part and the other.
尚、第１部分と液体試料吸収部との間で毛管現象を生じさせ易くするために、液体吸収部分が第１部分の下端に約１〜２mm程度重なるように接着させるようにしても良い。 In order to facilitate causing capillarity between the first portion and the liquid sample absorbing section, the liquid absorbent portion may be caused to adhere to overlap about 1~2mm the lower end of the first portion. 尚、全体の大きさとしては、液体試料吸収部に液体試料を例えば滴下等してから毛管現象により第３部分の末端にまで液体試料が展開されるまでの時間が、通常15 As the overall size, the time the liquid specimen absorption part from a liquid sample, for example, dropped or the like to the liquid sample to the end of the third portion is expanded by the capillary phenomenon, usually 15
分以内、好ましくは10分以内となるように設定される。 Within a minute, it is preferably set to be within 10 minutes.
このようにして得られた本発明のイムノクロマト法用試験用具の好ましい態様の一つを図１に示す。 It illustrates one preferred embodiment of the immunochromatography test tool of the present invention thus obtained in FIG.
【００３１】尚、図１に於いて各数字は夫々以下のものを示す。 [0031] In addition, each of the numbers In FIG. 1 shows the ones of each below. １：担体 ２：液体試料吸収部 ３：第１部分 ４：第２部分 ５：第３部分 ６：判定部（第２抗体固定化部） 1: support 2: Liquid reagent absorption unit 3: first portion 4: second part 5: third part 6: determination unit (second antibody immobilization part)
【００３２】また、本発明の試験用具を用いた測定方法は、例えば以下の如く行えばよい。 [0032] The measuring method using the test kit of the present invention, for example, as follows. 即ち、先ず上記した如くして調製された本発明のイムノクロマト法用試験用具の第１部分に液体試料を例えば滴下したり、第１部分を液体試料中に浸漬する等して（尚、当該試験用具に液体試料吸収部が設けられている場合は、液体試料吸収部に液体試料を滴下したり、液体試料吸収部を液体試料中に浸漬する等し、ここから毛管現象を利用して第１部分に液体試料を供するようにする。）、第１部分に於いて液体試料中の測定対象物質と、アビジン（又はビオチン）結合第１抗体とを反応させて、［アビジン（又はビオチン）結合第１抗体−測定対象物質の免疫複合体］ That is, first or a liquid sample e.g. dropwise to a first portion of the immunochromatography test instrument of the present invention prepared by as described above, the first portion equal immersed in a liquid sample (Note that the test If the liquid sample-absorbing portion is provided on the tool, or dropped liquid sample into the liquid sample-absorbing unit, equal to the immersion liquid sample absorbing portion in the liquid sample, the utilizing capillarity from here 1 so that subjecting the liquid sample to the portion.), and analyte in the liquid sample at the first portion, avidin (or biotin) reacting bound first antibody, [avidin (or biotin) binding the 1 antibodies - immune complexes of the analyte]
（即ち、反応生成物）を液相中で形成させる。 (I.e., reaction product) to be formed in the liquid phase. 次いでこれをマーカー標識ビオチン（又はアビジン）の保持された第２部分に毛管現象で運び、［マーカー標識ビオチン（又はアビジン）−アビジン（又はビオチン）結合第１ Which is then transported by capillary action to the second portion which is held in a marker-labeled biotin (or avidin), Marker-labeled biotin (or avidin) - avidin (or biotin) binding the first
抗体−測定対象物質］（マーカー結合免疫複合体）を液相中で形成させる。 Antibody - an analyte (marker-binding immune complexes) is formed in the liquid phase. 更にこれを第２抗体固定化部（判定部）を有する第３部分（展開膜）に毛管現象により運ばせ、サンドイッチ型免疫複合体を判定部に形成させる。 Further It was carried by the third part capillarity (developing membrane) having a second antibody immobilization part (determination unit), it is formed to the determination section sandwich type immunocomplex.
尚、測定対象物質と結合しなかったマーカー標識ビオチン（又はアビジン）及び［マーカー標識ビオチン（又はアビジン）−アビジン（又はビオチン）結合第１抗体複合体］は、毛管現象により更に下流に運ばれる。 Incidentally, the marker-labeled biotin did not bind analyte (or avidin) and Marker-labeled biotin (or avidin) - avidin (or biotin) binding a first antibody complex] is further conveyed to the downstream by capillary action. 次いで、結果的に判定部に捕捉されたサンドイッチ型免疫複合体中のビオチン（又はアビジン）に標識されたマーカーに由来する発色の程度を目視にて観察し、その結果を予め作製しておいたマーカーに由来する発色の程度と測定対象物質量との関係を表わす色調表に当てはめる等することにより、測定対象物質量を定量的に測定することができる。 Then, to observe the degree of coloration derived from results in biotin sandwich immune complex trapped in the determination unit (or avidin) to labeled markers were visually had been previously prepared and the results by such fitting the shade table representing the relationship between the extent and the analyte amount of color derived from the marker, the measurement substance amount can be measured quantitatively.
【００３３】尚、発色の程度が特定の色調より薄ければ陰性、濃ければ陽性としておけば、本発明の方法により測定対象物質の半定量も可能である。 [0033] Incidentally, if the degree of color development is thin than a specific color negative, if a darker if positive, it is also possible semi-quantitative measurement target substance by the method of the present invention. また、発色の程度の判定は、例えば、プレテスター RM-405、プレテスター RM-505（何れも和光純薬工業（株）製）等の尿試験紙用のテスター、例えばデンシトメーター等を用いて行っても良いことはいうまでもない。 The determination of the degree of color development, for example, using pre-tester RM-405, pre-tester RM-505 (both manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) tester for urine test paper or the like, for example, a densitometer, etc. be carried out may be a matter of course.
【００３４】また、本発明のイムノクロマト法用試験用具は、アビジン−ビオチン反応を利用して、第１抗体が測定対象物質と結合した後に第１抗体とマーカーとを結合させているため、第１抗体と測定対象物質との結合反応を、予めマーカーが結合した第１抗体を用いる場合よりも効率良く行うことができるので、結果として測定対象物質の測定感度が上昇するという効果が得られる。 Further, immunochromatography test tool according to the present invention, avidin - using the biotin reaction, the first antibody is a first antibody and the marker is bound after binding with the analyte, the first the binding reaction between the antibody and the analyte, can be performed more efficiently than the case of using the first antibody pre marker is bound, the effect is obtained that measurement sensitivity of the measurement target material as a result increases. また、本発明の試験用具に於けるマーカー標識ビオチン（又はアビジン）を保持した膜状物（第２部分）中には、マーカー標識ビオチン（又はアビジン）以外に目的の測定に直接関与する試薬は含まれていない。 Further, in the film-like material which holds in marker-labeled biotin (or avidin) to a test kit of the present invention (second part), the reagents directly involved in the measurement object of the non-marker-labeled biotin (or avidin) not included. そのため、本発明のイムノクロマト法用試験用具は、アビジン結合第１抗体を含む膜と第２抗体を固定化した膜とを測定対象に合わせて適宜適当なものと交換するだけで種々の測定対象物質の測定に使用可能なイムノクロマト法用試験用具を製造し得るという、製造上の有利性をも有している。 Therefore, immunochromatography test tool according to the present invention, various analyte by simply replaced with a suitably appropriate together with film immobilized membrane and a second antibody comprising the avidin-bound first antibody to be measured that the can be produced with available immunochromatographic test instrument to measure also has the advantage in manufacturing. 以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail, but the present invention should not be construed as being limited thereto.
実施例１． Example 1. （イムノクロマト法用試験用具の作製） （１）判定部（第２抗体固定化部）を有する展開膜の作製 ニトロフロー膜（ニトロセルロース膜：日本ミリポア社製。５mm×40mm）の下端より20mmの位置に抗Hbs抗原モノクロ−ナル抗体溶液（２mg/ml：50mMリン酸緩衝液、p (Preparation of immunochromatography test tool) (1) determining unit manufactured nitro-flow membrane of developing membrane having a (second antibody immobilization part): the 20mm from the lower end of the (nitrocellulose membrane Nippon Millipore .5mm × 40 mm) located in anti Hbs antigen monochrome - monoclonal antibody solution (2mg / ml: 50mM phosphate buffer, p
Ｈ7.4 。 H7.4. 抗Hbs抗原モノクロ−ナル抗体；和光純薬工業（株）製。 Anti Hbs antigen monochrome - monoclonal antibody; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.. ）をＴＬＣアプリケーター（商品名：リノマート。カマグ社製）を用いて線状に塗布した後に、乾燥させて、判定部（抗Hbs抗原(第２抗体)固定化部）を作製した。 ) And TLC applicator (trade name:. Rinomato After streaked Kamagu Inc.) using a dried, the determination unit (anti Hbs antigen (second antibody) was prepared immobilization part). 得られた判定部を有する膜を、ブロッキング溶液［0.5％Tween20、0.5％カゼイン及び0.15M NaCl含有5 A film having a determination unit obtained, blocking solution [0.5% Tween 20,% casein and 0.15 M NaCl containing 5
0mMリン酸緩衝液、pＨ7.4。 0mM phosphate buffer, pH 7.4. ］に浸漬し、２時間ブロッキング処理を行った後再度乾燥させたものを展開膜とした。 Immersed in, as a developing membrane that is dried again after 2 hours blocking treatment.
【００３６】（２）アビジン結合第１抗体溶液の作製 ストレプトアビジン溶液（1mg/ml 0.1M リン酸緩衝液 p [0036] (2) Preparation of streptavidin solution avidin bound first antibody solution (1 mg / ml 0.1 M phosphate buffer p
H 7.5；和光純薬工業（株）製）2mlを、N-Succinimidyl H 7.5; produced by Wako Pure Chemical Industries) 2 ml, N-succinimidyl
-3-(2-pyridyldithio)propionate(SPDP)のエタノール溶液（1mg/ml；和光純薬工業（株））12μlと混合後、室温で１時間反応させた。 -3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) in ethanol (1 mg / ml; Wako Pure Chemical Industries (Ltd.)) 12 [mu] l and after mixing, was allowed to react at room temperature for 1 hour. その後、Sephadex G-25で脱塩後、２mlに濃縮しSPDPーストレプトアビジンを得た。 Then, after desalting by Sephadex G-25, was obtained SPDP over streptavidin concentrated to 2 ml. また、抗Hbs抗原モノクロ−ナル抗体溶液（ＩgＧ 含量：1 Moreover, anti-Hbs antigen monochrome - monoclonal antibody solution (IgG content: 1
mg /ml 0.1M リン酸緩衝液 pH 7.5）２mlを、SPDPのエタノール溶液12μlと混合後、室温で１時間反応させ、 The mg / ml 0.1 M phosphate buffer pH 7.5) 2 ml, were mixed with an ethanol solution 12μl of SPDP, reacted at room temperature for 1 hour,
その後Sephadex G-25で脱塩、濃縮しSPDPー抗体を得た。 Desalted thereafter Sephadex G-25, and concentrated to obtain SPDP antibody.
SPDPーストレプトアビジン溶液にジチオスレイトールを加え（終濃度 0.1M）、室温で30分還元したのち、Sepha Dithiothreitol was added to SPDP over streptavidin solution (final concentration 0.1 M), After reduction at room temperature for 30 minutes, Sepha
dex G-25で脱塩、濃縮して、チオプロピオニルーストレプトアビジンとし、これをSPDP-抗体を混合後、４℃、1 Desalted dex G-25, concentrated, and thio propionyl Lou streptavidin were mixed SPDP- antibodies this, 4 ° C., 1
8時間反応させた。 It was allowed to react for 8 hours. 反応物をSephadex G-100でゲル濾過し、ストレプトアビジン結合第１抗体を得た。 The reaction was gel filtered on a Sephadex G-100, to give a streptavidin-binding first antibody.
【００３７】（３）金コロイド標識ビオチン溶液の作製 牛血清アルブミン（蛋白濃度：20mg/ml）10μｌと、フレンス（Frens）の方法［Nature Phys.Sci.,vol.241,20 [0037] (3) Preparation bovine serum albumin (protein concentration: 20 mg / ml) of the colloidal gold-labeled biotin solution. 10 [mu] l and a method of Furensu (Frens) [Nature Phys.Sci, vol.241,20
-22(1973)］で調製し0.1MK 2 CO 3でpＨを6.5に調整した金コロイド溶液（金コロイドの平均粒経：15nm。ＯＤ -22 (1973)] pH was adjusted to 6.5 with 0.1MK 2 CO 3 was prepared in the gold colloid solution (colloidal gold The average particle size: 15Nm.OD
520nm ＝1.2）６mlとを混合し１時間反応させた後、反応液に分散剤としてポリエチレングリコール（シグマ社製。商品名：カーボワックス20M）を終濃度で0.05％となるように添加した。 520 nm = 1.2) was reacted 6ml were mixed 1 hour, polyethylene glycol (manufactured by Sigma as a dispersing agent to the reaction solution trade name:. Was added carbowax 20M) so that 0.05% a final concentration. その後、反応液を15000rpm×20分で遠心分離処理し、上清を除き、得られた残渣を50mMリン酸緩衝液（0.05％ポリエチレングリコール含有。pＨ Thereafter, the reaction solution was centrifuged at 15000 rpm × 20 min, the supernatant was removed, the resulting residue 50mM phosphate buffer (0.05% polyethylene glycol-containing .pH
7.4）３mlに懸濁後、再度15000rpm×20分で遠心分離処理した。 Was suspended in 7.4) 3 ml, was centrifuged again at 15000 rpm × 20 min. 得られた残渣を50mMリン酸緩衝液（0.05％ポリエチレングリコール含有。pＨ7.4。）３mlに懸濁したものにＮＨＳ−ビオチン（10mg/ml）40μlを混合後、４℃ The resulting residue 50mM phosphate buffer (polyethylene glycol containing 0.05% .pH7.4.) To those suspended in 3 ml NHS-biotin (10 mg / ml) were mixed 40 [mu] l, 4 ° C.
１晩反応後、反応液を15000rpm×20分で遠心分離処理し、上清を除いて、得られた残渣を50mMリン酸緩衝液（0.05％ポリエチレングリコール含有。pＨ7.4）３mlに懸濁後、再度15000rpm×20分で遠心分離処理した。 After overnight reaction, the reaction solution was centrifuged at 15000 rpm × 20 min, and the supernatant removed, the resulting residue 50mM phosphate buffer (0.05% polyethylene glycol-containing .PH7.4) was suspended in 3ml It was centrifuged again at 15000 rpm × 20 min. 得られた残渣を50mMリン酸緩衝液（0.05％ポリエチレングリコール含有。pＨ7.4。）３mlに懸濁し、金コロイド標識ビオチン溶液とした。 The resulting residue 50mM phosphate buffer (polyethylene glycol containing 0.05% .pH7.4.) Was suspended in 3 ml, and the gold colloid-labeled biotin solution.
【００３８】（４）アビジン結合第１抗体のグラスファイバー膜への保持 （２）で調製したアビジン結合第１抗体溶液に、予めブロッキング溶液［0.5％Tween20（花王（株）商品名）、 [0038] (4) held to avidin bound first antibody of glass fiber membranes to avidin bound first antibody solution prepared in (2), pre-blocking solution [0.5% Tween20 (Kao Corporation trade name),
0.5％カゼイン及び0.15M NaCl含有50mMリン酸緩衝液、p 0.5% casein and 0.15 M NaCl containing 50mM phosphate buffer, p
Ｈ7.4。 H7.4. ］でブロッキング処理したグラスファイバー膜（５mm×６mm。ミリポア社製）を浸漬した後風乾し、アビジン結合第１抗体を保持させたグラスファイバー膜を得た。 ] Blocking treated glass fiber membranes air dried was dipped (5 mm × 6 mm. Millipore), to obtain a glass fiber film was held avidin binding first antibody. （５）金コロイド標識ビオチンのグラスファイバー膜への保持 （３）で調製した金コロイド標識ビオチン溶液に、予めブロッキング溶液［0.5％Tween20（花王（株）商品名）、0.5％カゼイン及び0.15M NaCl含有50mMリン酸緩衝液、pＨ7.4。 (5) to the colloidal gold-labeled biotin solution prepared in the retention of the glass fiber membrane of the colloidal gold-labeled biotin (3), pre-blocking solution [0.5% Tween20 (Kao Corporation trade name), 0.5% casein and 0.15 M NaCl containing 50mM phosphate buffer, pH 7.4. ］でブロッキング処理したグラスファイバー膜（５mm×６mm。ミリポア社製）を浸漬した後風乾し、金コロイド標識ビオチンを保持させたグラスファイバー膜を得た。 ] Blocking treated glass fiber membranes air dried was dipped (5 mm × 6 mm. Millipore), to obtain a glass fiber film was held with colloidal gold-labeled biotin.
【００３９】（５）イムノクロマト法用試験用具の作製 塩化ビニル製シート（５mm×60mm。シンエイ産業（株） [0039] (5) immunochromatography test tool manufacturing polyvinyl chloride sheet (5 mm × 60 mm. Shinei Sangyo Co.
製。 Manufacturing. ）の上端に両面テープを用いて、上記（１）で作製した判定部（第２抗体固定化部）を有する展開膜を接着して第３部分を形成し、次いで（５）で作製した金コロイド標識ビオチンを保持させたグラスファイバー膜を、 ) Using a double-sided tape to the upper end of the gold prepared above (by bonding a developing membrane having a determination unit produced (second antibody immobilization part) 1) forming a third portion, then (5) glass fiber membranes obtained by holding the colloid-labeled biotin,
両面テープを用いて該展開膜の下端に約１〜２mm程度重なるように接着させて第２部分を形成した。 Using double-sided tape to form a second portion is adhered so as to overlap about 1~2mm the lower end of the developing membrane. 更に該グラスファイバー膜の下端に約１〜２mm程度重なるように、 As further overlap about 1~2mm the lower end of the glass fiber membrane,
次いで（４）で作製したアビジン結合第１抗体を保持させたグラスファイバー膜を、両面テープを用いて該展開膜の下端に約１〜２mm程度重なるように接着させて第１ Then glass fiber film was held avidin binding first antibody prepared in (4), first and adhered so as to overlap about 1~2mm the lower end of the developing membrane using double-sided tape 1
部分を形成した。 To form a part. 更に液体試料吸収用膜（ロプロソーブ：日本ポール社製）（５mm×１６mm）を両面テープを用いて接着し液体試料吸収部を形成して、図１に示される如きイムノクロマト法用試験用具を作製した。 Additionally the liquid sample-absorbing layer (Ropurosobu: manufactured by Nihon Pall Ltd.) (5 mm × 16 mm) adhesive to form a liquid sample absorbing section using double-sided tape, to prepare a such immunochromatography test equipment shown in FIG. 1 .
【００４０】（測定操作）上で作製したイムノクロマト法用試験用具の液体試料吸収部に液体試料（Ｈｂｓ抗原 [0040] (Measurement Operation) on the liquid sample into the liquid sample-absorbing portion of the immunochromatography test tool was produced by (Hbs antigen
20ng/ml含有する10mMリン酸緩衝塩類溶液。 20 ng / ml 10 mM phosphate buffered saline containing. pＨ7.4）80 pH7.4) 80
μｌを滴下した。 It was added dropwise a μl. 一方、別のイムノクロマト法用試験用具の液体試料吸収部に、陰性対照として10mMリン酸緩衝塩類溶液（pＨ7.4。）を80μｌを滴下した。 On the other hand, the liquid sample absorbing section of another immunochromatographic test devices, 10 mM phosphate buffered saline as a negative control (pH 7.4.) Was added dropwise 80 [mu] l. 液体試料が毛管現象によりイムノクロマト法用試験用具の先端（展開膜の末端）まで展開した時点（約８分）で、判定部（第２抗体固定化部）の着色を観察したところ、Ｈｂｓ When the liquid sample is developed by capillarity to the tip of the immunochromatography test tool (end of developing membrane) (about 8 minutes), observation of the coloration of the determination section (second antibody immobilization part), Hbs
抗原を含んだ液体試料を滴下した場合には、赤紫色の明瞭なラインが観察され、一方、陰性対照の液体試料を滴下した場合には、判定部（第２抗体固定化部）上に赤紫色のラインは観察されなかった。 When dropped liquid sample containing the antigen is distinct line of red-purple was observed, whereas, in the case of dripped liquid sample of negative control, red on determination section (second antibody immobilization part) purple line was observed. これらの結果から、本発明のイムノクロマト法用試験用具を用いて液体試料中のＨｂｓ抗原を定量又は半定量し得ることが判る。 From these results, the immunochromatography test tool according to the present invention the Hbs antigen in a liquid sample it can be seen that can be quantified or semi-quantified using.
【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、液体試料中の測定対象物質量を測定するためのイムノクロマト法用試験用具及びそれを用いた測定方法を提供するものである。 As described above, according to the present invention, the present invention is to provide a measuring method using test kit and it immunochromatographic method for measuring the analyte content in the liquid sample. 本発明によれば、従来のイムノクロマト法用試験用具に於ける、測定対象物質に結合するマーカー量が少ないために、測定精度の低下や検出感度の低下を招く、という問題点を生じさせることなく、液体試料中の測定対象物質を高感度に精度良く測定し得るという効果を奏する。 According to the present invention, in the conventional immunochromatography test equipment, due to the low amount of marker that binds to the analyte, leads to a decrease in reduction and the detection sensitivity of the measurement accuracy, without causing a problem that an effect that the analyte in a liquid sample can be accurately measured with high sensitivity.
【００４２】また、本発明のイムノクロマト法用試験用具は、アビジン−ビオチン反応を利用して、第１抗体が測定対象物質と結合した後に第１抗体とマーカーとを結合させているため、第１抗体と測定対象物質との結合反応を、予めマーカーが結合した第１抗体を用いる場合よりも効率良く行うことができるので、結果として測定対象物質の測定感度が上昇するという効果が得られる。 Further, immunochromatography test tool according to the present invention, avidin - using the biotin reaction, the first antibody is a first antibody and the marker is bound after binding with the analyte, the first the binding reaction between the antibody and the analyte, can be performed more efficiently than the case of using the first antibody pre marker is bound, the effect is obtained that measurement sensitivity of the measurement target material as a result increases. また、本発明の試験用具に於けるマーカー標識ビオチン（又はアビジン）を保持した膜状物（第２部分）中には、マーカー標識ビオチン（又はアビジン）以外に目的の測定に直接関与する試薬は含まれていない。 Further, in the film-like material which holds in marker-labeled biotin (or avidin) to a test kit of the present invention (second part), the reagents directly involved in the measurement object of the non-marker-labeled biotin (or avidin) not included. そのため、本発明のイムノクロマト法用試験用具は、アビジン結合第１抗体を含む膜と第２抗体を固定化した膜とを目的に合わせて適宜適当なものと交換するだけで種々の測定対象物質の測定に使用可能なイムノクロマト法用試験用具を製造し得るという、製造上の有利性をも有している。 Therefore, immunochromatography test tool according to the present invention, the various analyte by simply replaced with a suitably appropriate together with film immobilized membrane and a second antibody comprising the avidin-bound first antibody on the purpose being able to produce a usable immunochromatography test tool to measure also has the advantage in manufacturing. 従って、本発明は、斯業に貢献するところ大なる発明である。 Accordingly, the present invention is greater consisting invention where contributes to Shigyo.
【図１】本発明のイムノクロマト法用試験用具の好ましい態様の１つを示す。 1 shows one of the preferred embodiments of the immunochromatography test tool according to the present invention.
図１に於いて各数字は夫々以下のものを示す。 Each digit In FIG. 1 shows the ones of each below. １：担体 ２：液体試料吸収部 ３：第１部分 ４：第２部分 ５：第３部分 ６：判定部（第２抗体固定化部） 1: support 2: Liquid reagent absorption unit 3: first portion 4: second part 5: third part 6: determination unit (second antibody immobilization part)
【請求項１】(a)毛管現象により移動可能なように保持された、アビジン又はビオチンの何れかと結合した測定対象物質に特異的な第１抗体を含む第１部分と、 (b)視覚的に検知し得るシグナルが得られるマーカーで標識された、第１抗体に結合したアビジン又はビオチンとアビジン・ビオチン複合体を形成し得るものを含む第２部分と、 (c)測定対象物質に特異的で、第１抗体と認識部位が異なった第２抗体が固定化されている部位を有する第３部分とを具備し、 (d)当該第１部分と第２部分及び第２部分と第３部分が、相互間に毛管現象が生じるように連結された、イムノクロマト法用試験用具。 1. A (a) is held so as to be movable by the capillary phenomenon, a first portion comprising a first antibody specific for the analyte bound to either avidin or biotin, (b) visually a second portion including those signals that can be detected is labeled with a marker obtained, capable of forming a avidin or biotin and avidin-biotin complex bound to the first antibody, specific for the (c) analyte in second antibody first antibody recognition site is different; and a third portion having a site being immobilized, (d) said first and second portions and the second portion and the third portion but it linked to a capillary phenomenon between each other occurs, immunochromatography test equipment.
【請求項２】１）アビジン又はビオチンと結合した測定対象物質に特異的な第１抗体を毛管現象により移動可能なように保持した第１部分に液体試料を供して液相中で反応を開始させ、２）反応生成物を毛管現象により、視覚的に検知し得るシグナルが得られるマーカーで標識された、第１抗体に結合したアビジン又はビオチンとアビジン・ビオチン複合体を形成し得るものを毛管現象により移動可能なように保持した第２部分に運ばせ、３）形成したマーカー結合反応生成物を毛管現象により測定対象物質に特異的で、第１抗体と認識部位が異なった第２ Wherein 1) avidin or initiate the reaction by subjecting the liquid sample liquid phase in a first part which holds so as to be movable by the capillary phenomenon of the first antibody specific for the analyte conjugated with biotin are allowed, 2) by the reaction product capillarity, visually signaling that may be detected is labeled with a marker obtained, bound avidin or biotin and avidin-biotin capillary those complexes capable of forming the first antibody Symptoms were transported to a second portion which holds so as to be movable by, 3) the formation marker binding reaction products specific to the analyte by capillary action, the second to the first antibody recognition site is different
抗体が固定化されている部位を有する第３部分に運ばせ、４）該第３部分の第２抗体固定化部位に捕捉された反応生成物中のマーカーに由来する発色の程度に基づいて、該液体試料中の測定対象物質量を測定する方法。 Antibody was carried in the third portion having a site being immobilized, 4) based on the degree of color development derived from the marker of the third reaction product trapped in the second antibody immobilized site portions, method for measuring the analyte content of the liquid sample.
JP24408596A 1996-08-27 1996-08-27 Test tool for immunochromatography Withdrawn JPH1068730A (en)
JP24408596A JPH1068730A (en) 1996-08-27 1996-08-27 Test tool for immunochromatography
JPH1068730A true JPH1068730A (en) 1998-03-10
ID=17113517
JP24408596A Withdrawn JPH1068730A (en) 1996-08-27 1996-08-27 Test tool for immunochromatography
JP (1) JPH1068730A (en)
WO2009123148A1 (en) 2008-03-31 2009-10-08 旭化成せんい株式会社 Cellulose derivative fine particles, fluid dispersions of the same, solid dispersions thereof, and diagnostic drugs
1996-08-27 JP JP24408596A patent/JPH1068730A/en not_active Withdrawn