Source: http://www.gentechnik.uni-hd.de/text.htm
Timestamp: 2017-06-26 23:58:46
Document Index: 242652530

Matched Legal Cases: ['§\n4', '§\n7', '§ 1', '§ 5', '§ 6', '§ 7', '§\n5', '§ 5', '§ 7', '§ 5', '§ 5', '§ 6', '§\n5', '§ 7', '§ 7', '§ 3', '§ 7', '§ 7', '§ 7', '§\n5', '§ 5', '§ 1', '§ 7', '§ 5', '§ 1', '§\n7', '§ 5', '§ 1', '§ 7', '§ 7', '§ 5', '§\n5', '§ 5', '§ 6', '§ 6', '§ 5', '§ 1', '§ 5', '§ 5', '§ 5', '§ 6', '§ 7', '§ 5', '§\n6', '§ 5', '§ 5', '§ 5', '§ 3', '§ 5', '§ 5', '§ 5', '§ 5', '§\n5', '§ 5', '§ 5', '§ 7', '§ 9', '§ 3', '§ 1', '§ 5', '§ 1', '§ 5', '§ 5', '§ 1', '§ 5', '§ 1', '§ 5']

für die Biologische Sicherheit der
Dieser Leitfaden für die Sicherheitseinstufung gentechnischer
Arbeiten wurde von mir in seiner ursprünglichen Fassung in Band 1
der Materialien und Basisdaten für gentechnisches Arbeiten und für
die Errichtung und den Betrieb gentechnischer Anlagen bei der DECHEMA e.V.
veröffentlicht. Das Vorhaben wurde mit Mitteln des Bundesministers
für Forschung und Technologie unter dem Förderkennzeichen 0319468A
1. Vorbemerkungen zur Sicherheitseinstufung
2. Vorgehen bei der Sicherheitseinstufung einer
gentechnischen Arbeit
3. Gentechnische Arbeiten mit Mikroorganismen und Zellkulturen im Produktionsbereich
4. Gentechnische Arbeiten mit Mikroorganismen und Zellkulturen im Laborbereich4.1 Sicherheitsstufe 1
4.2 Sicherheitsstufe 2
4.3 Sicherheitsstufe 3
4.4 Sicherheitsstufe 4
5. Gentechnische Arbeiten mit Tieren und
5.1 Sicherheitsstufe 1
5.2 Sicherheitsstufe 2
5.3 Sicherheitsstufe 3
5.4 Sicherheitsstufe 4
Alle gentechnischen Arbeiten bedürfen grundsätzlich einer Sicherheitseinstufung
zur Festlegung des vorhandenen Gefährdungspotenzials. Die Sicherheitseinstufung
ist in jedem Fall durchzuführen, d.h. es handelt sich eigentlich
immer um eine Einzelfallentscheidung. Die Grundlagen der Sicherheitseinstufung
und nähere Angaben zu ihrer Durchführung werden in den §§
4 - 7 GenTSV ausgeführt.
Für die Zuordnung gentechnischer Arbeiten in eine der in §
7 des Gentechnikgesetzes (GenTG) genannten Sicherheitsstufen ist eine Gesamtbewertung
der für die Sicherheit bedeutsamen Eigenschaften
der verwendeten Spender- und Empfängerorganismen und, soweit verwendet,
der Vektoren sowie
der erzeugten gentechnisch veränderten Organismen
und der von ihnen ausgehenden Gefährdung für die in § 1
Nr. 1 GenTG genannten Rechtsgüter unter Berücksichtigung der
Risikobewertung der Organismen nach § 5 GenTSV und der vorgesehenen
biologischen Sicherheitsmaßnahmen nach § 6 GenTSV nötig.
Das Zusammenwirken der genannten Eigenschaften und nicht die reine Addition
der einzelnen Risikopotenziale ergibt für die gentechnischen Arbeit
die geforderte Gesamtbewertung. Auf der Basis dieser Bewertung erfolgt
die Klassifikation der Arbeit in eine der im GentechnikGesetz beschriebenen
Der Sicherheitsstufe 1 sind gentechnische
Arbeiten zuzuordnen, bei denen nach dem Stand der Wissenschaft nicht von
einem Risiko für die menschliche Gesundheit und die Umwelt auszugehen
Der Sicherheitsstufe 2 sind gentechnische
Arbeiten zuzuordnen, bei denen nach dem Stand der Wissenschaft von einem
geringen Risiko für die menschliche Gesundheit oder die Umwelt auszugehen
Der Sicherheitsstufe 3 sind gentechnische
mäßigen Risiko für die menschliche Gesundheit oder die
Der Sicherheitsstufe 4 sind gentechnische
hohen Risiko oder dem begründeten Verdacht eines solchen Risikos für
die menschliche Gesundheit oder die Umwelt auszugehen ist.
Die Einstufung der gentechnischen Arbeiten im Produktionsbereich dürfte
an der Universität nur von untergeordneter Bedeutung sein, sie soll
jedoch aus Gründen der Vollständigkeit ebenfalls kurz angesprochen
Um die Sicherheitseinstufung einer gentechnischen Arbeit vornehmen zu können,
sollte man das beabsichtigte Projekt in seine Einzelschritte zerlegen und
die gehandhabten Organismen gesondert betrachten. Bei der Zuordnung der
Spender- bzw. Empfängerorganismen zu Risikogruppen ist es sinnvoll,
zunächst zu prüfen, ob die Organismen in die vom Bundesministerium
für Gesundheit nach Anhörung der Zentralen Kommission für
die Biologische Sicherheit im Bundesgesundheitsblatt veröffentlichte
Liste "Risikobewertete
Spender- und Empfängerorganismen für gentechnische Arbeiten"
aufgenommen sind. Im positiven Fall kann die Eingruppierung ohne weitere
Angaben übernomen werden, da es sich bei den Organismenlisten um vorweggenommene
Gutachten handelt [siehe hierzu auch 1; GenTSV § 7, Rdnrn. 47-57].
Auch die Organismenlisten der BG-Chemie [2,3,4,5,7] können herangezogen
werden, sie sind jedoch nicht rechtsverbindlich. Im negativen Fall muss
eine Risikobewertung der Spender- und Empfängerorganismen gem. §
5 Abs. 1 Satz 1 bzw. Abs. 2 Satz 1 GenTSV durchgeführt werden.
Für die entstehenden gentechnisch veränderten Organismen können
solche Listen selbstverständlich nicht präfabriziert werden.
In diesem Fall ist die Bestimmung des Gefährdungspotenzials und die
Zuordnung zu den Risikogruppen gem. § 5 Abs. 1 Satz 2 bzw. Abs. 2
Satz 2 GenTSV durch die Bewertung der allgemeinen Kriterien nach Anhang I GenTSV heranzuziehen. Aus allen Einzelüberlegungen
kann man unter Einbeziehung der einzelnen Abschnitte des § 7 GenTSV
die Sicherheitsstufe der Arbeit ermitteln. Für die Vorgehensweise
kann das folgende Schema herangezogen werden:
Genaue Beschreibung des Projektes mit Zielstellung und einzelnen Klonierungsschritten.
Aufstellung sämtlicher Spenderorganismen und Bestimmung der Risikogruppen nach § 5 Abs. 1 Satz 1 i.V.m. Anhang I Nr. 1 GenTSV Soll das gesamte Genom oder nur ein subgenomischer oder subgenischer Teil
Welche Nukleinsäure soll übertragen werden und wofür kodiert
Falls es sich um Organismen der Risikogruppe 2-4 handelt: was ist über
das Pathogenitätsprinzip und die daran beteiligten Gene bekannt [wird
die Pathogenität nur durch ein einzelnes Gen oder Genprodukt (z.B.
Toxin) oder durch das Zusammenspiel mehrerer Gene verursacht]?
Wird die Nukleinsäure unmittelbar aus dem Spender entnommen oder liegt
sie bereits in einem Ausgangsorganismus vor? Gibt es für diesen Ausgangsorganismus
bereits eine Stellungnahme der ZKBS. Wenn ja, welcher Risikogruppe ist
er zugeordnet?
Aufstellung sämtlicher Empfängerorganismen mit Bestimmung der Risikogruppen nach § 5 Abs. 1 Satz 1 i.V.m. Anhang I Nr. 1 GenTSV
Aufstellung sämtlicher Vektoren mit Beschreibung und Karte. Zuordnung
der Vektoren zu den Empfängern, da beide immer als ein System zu betrachten
sind. Welche Vektor-Empfänger-Systeme entsprechen einer biologischen
Sicherheitsmaßnahme nach § 6 Abs. 1, 4 und 5 i.V.m. Anhang II
Teil A GenTSV?
Aufstellung sämtlicher entstehender gentechnisch veränderter
Organismen und Bestimmung der Risikogruppen nach §
5 Abs. 1 Satz 2 i.V.m. Anhang I Nr. 2
Eigenschaften besitzen die gentechnisch veränderten Organismen? Ist
ein Pathogenitätsprinzip übertragen worden? Kann die übertragene
Nukleinsäure exprimiert werden, könnte sie nach verbringen in
eine menschliche Zelle exprimiert werden?
Ermittlung der Sicherheitsstufe der gentechnischen Arbeiten. Produktionsbereich:
nach § 7 Abs. 2, 4 und 5 GenTSV Laborbereich: nach § 7 Abs.
3, 4 und 5 GenTSV
Die allgemeinen Kriterien für die Sicherheitsbewertung von gentechnischen
Arbeiten sind in Anhang I GenTSV aufgeführt. In einer Art Fragenkatalog zu Spender-, Empfänger-, gentechnisch verändertem Organismus und Vektor werden die möglichen Auswirkungen der Arbeit auf die menschliche Gesundheit und die Umwelt hinterfragt. Im Folgenden sollen die Bewertungskriterien (kursiv) am Beispiel der TNF-Produktion unter Einsatz gentechnisch veränderter E.coli
K12 erläutert werden, wobei die Fragen 1 a-x nur für den Empfänger-,
nicht aber für den Spenderorganismus (Mensch) beantwortet werden:
1. Informationen über den (die) Spender- oder Empfängerorganismus(en)
bzw. Ausgangsorganismus(en)
a) Name und Bezeichnung: Escherichia coli K12 W3110
b) Grad der Verwandtschaft: E. coli K12 Derivat, durch Mutation
erhalten, Genotyp: F- Lambda-, IN(rrnD-rrnE)1, Stammbaum:
Bacteriological Reviews 1972, 525-557.
c) Herkunft des (der) Organismus(en): American Type Culture Collection
d) Information über reproduktive Zyklen (sexuell/asexuell) des
Ausgangsorganismus oder gegebenenfalls des Empfängerorganismus:
e) Angaben über frühere gentechnische Veränderungen: E.coli
K12 W3110 wurde durch klassische Mutationsverfahren (UV-Licht) erhalten,
es wurden keine gentechnischen Veränderungen vorgenommen.
f) Stabilität des Empfängerorganismus in Bezug auf die einschlägigen
genetischen Merkmale: Der unter 1b beschriebene Genotyp wird stabil
g) Pathogenität des Organismus für abwehrgesunde Menschen und Tiere: J.Hacker. M.Orth, H.Tschäpe: "Das Problem der Pathogenität
von Escherichia coli und seine Bedeutung für die rekombinante DNA-
h) kleinste infektiöse Dosis: -
i) Toxizität für die Umwelt sowie Toxizität und Allergenität für Menschen: -
j) Widerstandsfähigkeit des Organismus: Überleben des Organismus bzw. Erhaltung der Vermehruungs- und Infektionsfähigkeit von Mikroorganismen unter relevanten Bedingungen: -
k) Kolonisierungskapazität: -
l) Wirtsbereich: -
m) Art der Übertragung, z.B. durch: -
n) Möglichkeit der Übertragung von Krankheitserregern durch den Organismus: -
o) Verfügbarkeit von Therapeutika und/oder Impfstoffen und/oder anderen wirksamen Methoden zur Verhütung und Behandlung: -
u) bedeutende Beteiligung an Umweltprozessen (wie Stickstoffixierung
oder pH-Regelung): -
v) Vorliegen von geeigneten Bedingungen zur Besiedelung der sonstigen Umwelt durch den Organismus: -
w) Wechselwirkung zu anderen und Auswirkungen auf andere Organismen
in der Umwelt (einschließlich voraussichtlich konkurrierender oder
symbiotischer Eigenschaften): -
x) Fähigkeit, Überlebensstrukturen zu bilden (wie Samen, Sporen
oder Sklerotien) und deren Ausbreitungsmöglichkeiten. : -
2. Informationen über den gentechnisch veränderten Organismus
2.1 Beschreibung der gentechnischen Veränderung a) Beschreibung der Veränderung einschließlich des Verfahrens
zur Einführung des Vektors/Inserts in den Empfängerorganismus
oder des Verfahrens, das zur Erzielung der betreffenden gentechnischen
Veränderung angewandt wird: In den Empfängerorganismus E.coli
K12 W3110 wurde mittels Transformation (CaCl2-Technik) ein Plasmid eingebracht,
das die genetische Information für die Expression von humanem Tumor
Nekrose Faktor und für eine Tetrazyklin-Resistenz besitzt. Das Plasmid
repliziert extrachromosomal in E.coli K12 W3110 mit einer Kopienzahl
von bis zu 100 Kopien/Zelle.
b) Herkunft des genetischen Materials, ggf. Identität des Spenderorganismus/der Spenderorganismen und der Merkmale: -
c) vorangegangene gentechnische Veränderungen des Inserts: -
d) Funktion der betreffenden gentechnischen Veränderung und/oder
der neuen Nukleinsäure: Der kodierende Teil des humanen TNF-Gens
wurde mit bakteriellen Expressionssignalen verknüpft und erlaubt so
die Proteinsynthese des reifen humanen TNF (157 Aminosäuren) in E.coli
K12 W3110. Die Tetrazyklin-Resistenz dient als Selektionsmarker für
Plasmid enthaltende E.coli K12 W3110.
e) Art und Herkunft des Vektors: Als Vektor wurde ein Derivat von
pBR322 verwendet (Gene 2, 95-113, 1977), dessen Ampicillin-Resistenz deletiert
wurde. In diesen Vektor wurde das humane TNF-Gen, verknüpft mit einem
Bakteriophagen T4- Promotor und ribosomaler Bindungsstelle und einem trpA-
Transkriptionsterminator, eingebaut. Das Plasmid ist 3269 Basenpaare lang,
seine DNS-Primärstruktur ist bekannt.
f) Struktur und Menge eines Vektors und/oder einer Nukleinsäure
des Spenderorganismus, die noch in der Endstruktur des veränderten
Organismus verblieben ist: Der gentechnisch veränderte Organismus
enthält bis zu 100 Kopien des humanen TNF-Gens als Plasmid (extrachromosomal).
Als Spenderorganismus diente die menschliche Monozyten-Zellinie U937 (Int.J.Cancer
17, 565- 577, 1976). Der Empfängerorganismus enthält ausschließlich
die für TNF kodierende DNS aus der menschlichen Zellinie; andere kodierende
oder nicht kodierende DNS aus menschlichen Zellen ist nicht vorhanden.
g) Stabilität des Organismus in bezug auf die gentechnisch veränderten
Merkmale: Die genetische Information für humanen TNF ist mit der
Information für die Tetrazyklin-Resistenz physisch verknüpft.
Deshalb wird durch Züchtung des Produktionsorganismus in Tetrazyklin
enthaltendem Nährmedium die genetische Information für beide
Merkmale beibehalten und stabil weitervererbt.
h) Häufigkeit der Mobilisierung des eingeführten Vektors und/oder
Fähigkeit zur Übertragung genetischer Information: Der verwendete
Vektor wurde in seiner Mobilisierbarkeit stark eingeschränkt durch
Deletion der Genorte mob und tra. Er besitzt lediglich die nic/bom Region.
Die Häufigkeit der Mobilisierung eines pBR322 ist Literatur bekannt
und beträgt 10-12.
i) Höhe der Expression des gentechnisch eingeführten
Materials; Messverfahren und Empfindlichkeitsgrad: Der zur Produktion
verwendete E.coli K12 W3110/pT4TNFST8rop produziert humanen TNF
konstitutiv, d.h. während der gesamten Wachstumsdauer, und biologisch
aktiv. Nachweisverfahren für den exprimierten TNF sind:
SDS-Gelelektrophorese der rekombinanten E.coli K12 W3110 (Empfindlichkeit:
100ng TNF).
MonoS-FPLC der aufgeschlossenen E.coli (Empfindlichkeit: 10 µg
Zytotoxität des gereinigten TNF auf Maus-Fibroblasten-Zellen; siehe
2h (Empfindlichkeit: 100pg).
j) Ort des eingefügten genetischen Materials (Möglichkeit einer Aktivierung/Deaktivierung von Wirtsgenen durch die Einfügung): -
k) Aktivität des zur Expression gebrachten Proteins: Der humane
TNF wird von E.coli K12 W3110 in biologisch aktiver Form synthetisiert;
die spezifische Aktivität beträgt 8 x 106 units/mg bezogen auf
den L929-Test (PNAS USA, 72, 3666-3670, 1975).
2.2. Gesundheitliche Erwägungen a) toxische oder allergene Auswirkungen der nicht lebensfähigen
Organismen und/oder ihrer Stoffwechselprodukte: TNF ist oral nicht
toxisch. Es wirkt nicht sensibilisierend auf die Haut des Meerschweinchens.
Es zeigt keine primäre Hautreizung (Kaninchen, OECD.Test,404). Auch
nach Inhalation ist TNF kein hochwirksames Toxin entsprechend der Definition
nach § 3 Nr.5 GenTSV
b) Produktrisiken: -
c) Vergleich der Pathogenität des gentechnisch veränderten Organismus mit der des Spender-
oder Empfängerorganismus oder ggf. Ausgangsorganismus: Durch den Besitz des TNF-Gens kann ein E.coli nicht
pathogen werden.
d) Kolonisierungskapazität: Keine Kolonisierungskapazität
des Darms für den gesunden Erwachsenen durch E.coli K12.
e) bei Pathogenität des Organismus für Menschen, die abwehrgesund
sind: Keine bekannte Pathogenität.
2.3. Umwelterwägungen a) Faktoren, die das Überleben, die Vermehrung und die Verbreitung
der gentechnisch veränderten Organismen in der Umwelt beeinflussen:
Für E.coli K12 wurde die rasche Titer-Reduktion in der belebten Umwelt
gezeigt. Die Überlebensfähigkeit im Darm von Säugetieren
dürfte bei gleichzeitiger Tetrazyklin-Therapie zwar kurzfristig gefördert
werden, eine dauerhafte Kolonisierung ist aber nicht zu erwarten.
b) verfügbare Techniken zur Erfassung, Identifizierung und Überwachung
der gentechnisch veränderten Organismen: Ein Nachweis ist vorhanden.
c) verfügbare Techniken zur Erfassung der Übertragung des
gentechnisch eingeführten Materials auf andere Organismen: Die
notwendige Gensonde ist vorhanden.
d) bekannte und vorhergesagte Habitate des gentechnisch veränderten
Organismus: Keine spezifisch anderen Habitate als die des E.coli K12
e) Beschreibung der Ökosysteme, auf die der Organismus zufällig
verbreitet werden könnte: Gartenerde, Flusswasser, Klärschlamm,
Abfall, Kacheln, Glasoberflächen.
f) erwarteter Mechanismus und Ergebnis der Wechselwirkung zwischen dem
gentechnisch veränderten Organismus und den Organismen oder Mikroorganismen,
die im Fall einer Freisetzung in die Umwelt belastet werden könnten:
Aufgrund des verwendeten Plasmids werden spezifische Wechselwirkungen nicht
g) bekannte oder vorhergesagte Auswirkungen auf Pflanzen und Tiere,
wie Krankheiten hervorrufende Eigenschaften, Infektion, Toxigenität,
Virulenz, Überträger der Krankheiten hervorrufenden Eigenschaften,
Allergenität, veränderte Muster der Antibiotikaresistenz, veränderter Tropismus, Kolonisierung: Negative Auswirkungen auf Pflanzen
und Tiere können nicht vorhergesagt werden und sind nicht bekannt.
Kein Unterschied zum Empfängerorganismus.
h) bekannte oder vorhergesagte Beteiligung an biogeochemischen Prozessen:
Vom Empfängerorganismus liegen keine bekannten negativen Auswirkungen
vor. Vom TNF ist ein solcher Beitrag nicht zu erwarten.
i) Verfügbarkeit von Methoden zur Dekontamination des Gebietes
im Falle eines Austretens von Organismen in die Umwelt: Desinfektionsmethoden
sind vorhanden. Im Umweltbereich ist eine Desinfektion wegen der beschriebenen
raschen Titerreduktion nach dem Stand der Wissenschaft nicht erforderlich.
Der Produktionsbereich ist dadurch gekennzeichnet, dass in ihm gentechnisch veränderte Organismen vermehrt oder mit ihrer Hilfe Substanzen gewonnen werden, wobei der Umgang mit diesen Organismen in weitgehend geschlossenen Apparaturen stattfindet. Die Sicherheitseinstufung dieser Arbeiten
hat nach § 7 Abs. 2 GenTSV zu erfolgen.
In der vom Bundesministerium für Gesundheit veröffentlichten
Liste risikobewerteter Spender- und Empfängerorganismen für gentechnische Arbeiten werden z.Z. noch die Spender- und Empfängerorganismen für gentechnische Arbeiten zu gewerblichen Zwecken aufgeführt. Diese Auflistung kann für Arbeiten im Produktionsbereich herangezogen werden. Die Organismen werden hierbei in vier Risikogruppen eingeteilt. Die Einstufung
der Mikroorganismen in die Risikogruppen 2-4 ist dabei vollkommen übereinstimmend
mit denen für Arbeiten im Laborbereich (z.Z. noch "gentechnische Arbeiten zu Forschungszwecken" genannt). Bei der Risikogruppe 1 sind die
Anforderungen für die Einstufung im Produktionsbereich jedoch höher
(siehe unten). So erklärt sich die Tatsache, dass viele Organismen,
die im Laborbereich in die Risikogruppe 1 eingestuft werden, im Produktionsbereich der Risikogruppe 2 zuzuordnen sind. Es sind alle Kriterien des § 7 Abs. 2 Nr. 1 zu berücksichtigen, da es sich nicht um
eine vorläufige, wie bei den Arbeiten im Laborbereich, sondern
um eine endgültige Bewertung handelt.
Gentechnische Arbeiten mit Mikroorganismen und Zellkulturen im Produktionsbereich sind gemäß § 7 Abs. 2 Nr. 1 GenTSV der Sicherheitsstufe
1 zuzuordnen, wenn sie die folgenden Voraussetzungen erfüllen:
a) Die Empfängerorganismen sind
aa) Organismen der Risikogruppe 1 nach §
5 Abs. 1 Satz 1 mit experimentell erwiesener oder langer sicherer Verwendung
oder mit eingebauten biologischen Sicherheitsmaßnahmen, die ohne
Beeinträchtigung der Verwendungsfähigkeit die Überlebens-
und Replikationsfähigkeit in der Umwelt begrenzen,
bb) eukaryote Zellen, die nicht spontan zu
Organismen regenerieren
und geben keine Organismen der Risikogruppen
2 - 4 ab,
b) Vektoren und aus dem Spenderorganismus überführte
sowie synthetische Nukleinsäuren
aa) sind gut beschrieben und frei von Nukleinsäuresequenzen
mit bekanntem Gefährdungspotenzial,
bb) sind in der Größe soweit wie
möglich auf die genetischen Sequenzen begrenzt, die zur Erreichnung
des beabsichtigten Zwecks notwendig sind,
cc) erhöhen die Stabilität des Organismus
in der Umwelt nicht, soweit dies nicht für die beabsichtigte Funktion
dd) sind wenig mobilisierbar,
ee) übertragen keine Resistenzgene auf
andere Mikroorganismen, die diese nicht von Natur aus aufnehmen, wenn eine
solche Aufnahme die Anwendung von Heilmitteln zur Kontrolle von Infektionskrankheiten
des Menschen oder von Nutztieren in Frage stellen könnte,
c) der gentechnisch veränderte Organismus
aa) ist unter den gewählten Verwendungsbedingungen
(z.B. im Reaktor oder Fermenter) genauso sicher wie der Empfängerorganismus,
aber mit begrenzter Überlebens- oder Replikationsfähigkeit und
ohne nachteilige Folgewirkungen für die Umwelt,
bb) überschreitet nicht das Gefährdungspotenzial
von Organismen der Risikogruppe 1 und
cc) gibt keine gentechnisch veränderten
Organismen höherer Risikogruppen ab; nach dem Stand der Wissenschaft
ist nicht zu erwarten, dass der gentechnisch veränderte Organismus
Krankheiten bei Menschen, Tieren oder Pflanzen hervorruft;
Die Voraussetzungen für die Einstufung gentechnischer Arbeiten
im Produktionsbereich in die Sicherheitsstufe 1 werden sowohl von
den Organismen, die in der vom Bundesministerium für Gesundheit veröffentlichten
Liste in die Risikogruppe1 eingestuft wurden, als auch von den als biologische Sicherheitsmaßnahme anerkannten Organismen erfüllt.
Gentechnische Arbeiten mit Mikroorganismen und Zellkulturen im Produktionsbereich sind der Sicherheitsstufe 2 zuzuordnen, wenn der gentechnisch veränderte
Organismus nach § 5 Abs. 1 Satz 2 i.V. mit Anhang I Nr. 2 bis 4 GenTSV für die Rechtsgüter nach § 1 Nr. 1 GenTG insgesamt
ein geringes Risiko darstellt.
Die Anforderungen an die Empfängerorganismen, an die zu übertragenden
Nukleinsäuren sowie an die Vektoren für gentechnische Arbeiten
zu gewerblichen Zwecken unterscheiden sich in der Sicherheitsstufe 2 nicht
von denen an die Organismen und Vektoren für Arbeiten zu Forschungszwecken.
Dies wird in § 7 Abs. 2 Nr. 2 Satz 2 ausdrücklich festgelegt
und spiegelt sich auch in der Übereinstimmung in den vom Bundesministerium
für Gesundheit veröffentlichten Listen wieder. Dort wird lediglich
in der Sicherheitsstufe 1 eine eigene gewerbliche Liste aufgeführt,
in den Sicherheitsstufen 2 bis 4 gibt es gemeinsame Listen für Gewerbe
und Forschung. Die Sicherheitseinstufung der gentechnischen Arbeiten im Produktionsbereich erfolgt entsprechend den Arbeiten im Laborbereich,
wobei jedoch nicht nur eine vorläufige Bewertung erforderlich ist.
Zu den gewerblichen Arbeiten der Sicherheitsstufe 2 kommen jedoch noch
solche Arbeiten hinzu, die im Laborbereich in die Sicherheitsstufe
1 eingestuft werden, die aber die strengeren Anforderungen an die Sicherheitsstufe
1 im gewerblichen Bereich nicht erfüllen.
Gentechnische Arbeiten mit Mikroorganismen und Zellkulturen im Produktionsbereich sind der Sicherheitsstufe 3 zuzuordnen, wenn der gentechnisch veränderte
Organismus nach § 5 Abs. 1 Satz 2 i.V. mit Anhang I Nr. 2 bis 4 GenTSV für die Rechtsgüter nach § 1 Nr. 1 GenTG insgesamt ein mäßiges Risiko darstellt. Auch in der
Sicherheitsstufe 3 erfolgt die Zuordnung zu der Sicherheitsstufe gem. §
7 Abs. 2 Nr. 2 Satz 2 entsprechend den gentechnischen Arbeiten zu Forschungszwecken, wobei jedoch nicht nur eine vorläufige Bewertung erforderlich ist..
Gentechnische Arbeiten mit Mikroorganismen und Zellkulturen zu gewerblichen
Zwecken sind der Sicherheitsstufe 4 zuzuordnen, wenn der gentechnisch veränderte
Organismus nach § 5 Abs. 1 Satz 2 i.V. mit Anhang I Nr. 2 bis 4 GenTSV für die Rechtsgüter nach § 1 Nr. 1 GenTG insgesamt ein hohes Risiko darstellt. Auch hier wäre eine
Sicherheitseinstufung entsprechend den gentechnischen Arbeiten zu Forschungszwecken
möglich. Es wird jedoch in der amtlichen Begründung zur Gentechnik-Sicherheitsverordnung i.d.F. vom 24.10.1990 darauf hingewiesen, dass nach derzeitigem Kenntnisstand
davon ausgegangen werden kann, dass eine gewerbliche Produktion in
der Sicherheitsstufe 4 nicht in Betracht kommt. Insofern wären alle
Überlegungen zur Sicherheitseinstufung solcher Arbeiten rein hypothetischer
4. Gentechnische Arbeiten mit Mikroorganismen und Zellkulturen im Laborbereich
Im Folgenden werden die Grundsätze der Einstufung gentechnischer
Arbeiten in die 4 Sicherheitsstufen dargelegt. Zunächst werden die
im § 7 Abs. 3 genannten formalen Kriterien für die Einstufung
gentechnischer Arbeiten in die einzelnen Sicherheitsstufen (Wortlaut
der GenTSV kursiv) aufgeführt und anschließend, wo
erforderlich, für jeden einzelnen Buchstaben erläutert. Die angegebenen
Beispiele stammen aus Gutachten der Zentralen Kommission für die Biologische
Sicherheit (ZKBS). Weitere Beispiele können dem Merkblatt B008 der
BG-Chemie [6] entnommen werden.
4.1 Sicherheitsstufe 1
Nach § 7 Abs. 3 Nr. 1 GenTSV sind gentechnische Arbeiten mit Mikroorganismen
und Zellkulturen im Laborbereich der Sicherheitsstufe 1 zuzuordnen,
5 Abs. 1 Satz 1,
bb) Stämme von Organismenarten der Risikogruppen
2 bis 4, die experimentell erwiesen oder auf Grund langer Erfahrung genauso
sicher wie Organismen der Risikogruppe 1 sind und daher entsprechend verwendet
cc) eukaryote Zellen, die nicht spontan zu
Organismen regenerieren,
und geben keine Organismen der Risikogruppen 2
bis 4 ab, b) Vektoren und aus dem Spenderorganismus überführte
sowie synthetische Nukleinsäuren sind soweit charakterisiert, dass
der gentechnisch veränderte Organismus nach einer vorläufigen
Risikobewertung nach § 5 Abs. 1 Satz 2 das Gefährdungspotenzial
von Organismen der Risikogruppe 1 nicht überschreitet und keine gentechnisch
veränderten Organismen höherer Risikogruppen abgibt,
ist bei Verwendung im Reaktor oder Fermenter genauso sicher wie der Empfängerorganismus,
ohne nachteilige Folgewirkung für die Umwelt;
- aa) Organismen der Risikogruppe 1 nach §
5 Abs. 1 Satz 1, und geben keine Organismen der Risikogruppen 2 bis 4 ab
Das Gefährdungspotenzial des gentechnisch veränderten Organismus
wird im wesentlichen von den Eigenschaften des Empfängerorganismus
und des Spenderorganismus bzw. der übertragenen Nukleinsäure
bestimmt. Eine besondere Bedeutung kommt dabei dem Empfängerorganismus
zu, da dessen Risikopotenzial gem. § 5 Abs. 4 GenTSV normalerweise
vollständig in die Abschätzung des Gefährdungspotenzials
und damit in die Einstufung in eine Risikogruppe einfließt (Ausnahmen
können z.B. die sogenannten "Sternchen-organismen" sein). Der einfachste
Fall einer Arbeit der Sicherheitsstufe 1 stellt sich somit wie folgt dar:
Empfänger und Spender gehören der Risikogruppe 1 an, der Vektor
erfüllt die Bedingungen des § 6 Abs. 5 GenTSV, der gentechnisch
veränderte Organismus übersteigt nicht das Gefährdungspotenzial
von Organismen der Risikogruppe 1 und gibt keine gentechnisch veränderten
Organismen höherer Risikogruppen ab.
Beispiel: Thema:
Für Ausbildungszwecke soll eine vorhandene, klonierte Bacillus subtilis
DNA-Sequenz fragmentiert und in E. coli K12 kloniert werden.
Bacillus subtilis (DSM10) ein 40 kb-DNA-Fragment,
kloniert in dem cosmid pcos RW 2, liegt vor
E. coli K12 (HB101)
pBC (pBluescript-Derivat) .
E. coli K12 einschließlich
des Vektors pBC mit subgenomischen DNA-Fragmenten aus B. subtilis Begründung: subgenomische DNA-Fragmente von B. subtilis
ohne pathogenes Potenzial sollen in E. coli K12 kloniert werden.
Das Vektor-Empfänger-System entspricht einer biologischen Sicherheitsmaßnahme
gemäß Anhang II, Teil A GenTSV
Einstufung der Arbeit
Begründung: Spender und Empfänger
sind Organismen der Risikogruppe 1. Der Empfänger ist gemeinsam mit
dem verwendeten Vektor als biologische Sicherheitsmaßnahme anerkannt.
Es liegen die Voraussetzungen gemäß § 6 Abs. 4 und 5 GenTSV
vor. Die gentechnisch veränderten Organismen überschreiten nach
einer vorläufigen Sicherheitsbewertung gemäß § 5 Abs.
2 Satz 2 GenTSV nicht das Gefährdungspotenzial von Organismen der
Risikogruppe 1.
- bb) Stämme von Organismenarten der
Risikogruppe 2 bis 4, die experimentell erwiesen oder aufgrund langer Erfahrung
genau so sicher wie Organismen der Risikogruppe 1 sind und daher entsprechend
verwendet werden können, und keine Organismen der Risikogruppen
2 bis 4 abgeben
Eine große Zahl von Organismen sind in entsprechenden Auflistungen
(z.B. Organismenliste
"Risikobewertete Spender- und Empfängerorganismen für gentechnische
Arbeiten" des Bundesministeriums für Gesundheit oder Merkblätter
"Sichere Biotechnologie" der BG Chemie [2,3,4,5,7]) in Risikogruppen klassifiziert.
Innerhalb der in diesen Listen aufgeführten Arten kann es jedoch Stämme
unterschiedlichen Risikopotenzials geben. Dieses ist abhängig von
den Virulenzfaktoren und den unweltrelevanten Eigenschaften. So sind z.B.
spezifische bakterielle Pathogenitätsfaktoren Adhäsine, Invasine,
Toxine (Endotoxine, Enterotoxine), Oberflächenstrukturen (wie z.B.
O-Antigene oder Kapseln), ein Aufnahmesystem für Eisen und Serum-Resistenzeigenschaften.
Zumeist sind mehrere dieser Faktoren für die Pathogenität eines
Stammes notwendig. Am für die Gentechnik klassischen Modellorganismus,
den fakultativ pathogenen E. coli-Bakterien wurde dies am besten
untersucht [8]. Aufgrund dieser genauen Kenntnis sind in der Liste "Risikobewertete
einige E. coli Stämme (enteroinvasive, enteropathogene, enterohämorrhagische,
enterotoxische und uropathogene) in die Risikogruppe 2, einige jedoch
auch in die Risikogruppe 1 eingestuft. Hier muss vor der Verwendung
geprüft werden, ob der Stamm, der benutzt werden soll, Pathogenitätsfaktoren
trägt oder nicht (siehe auch Stellungnahme der ZKBS zur
des "E. coli TOPP TM-Protein-Expressionssystems"
und "zur Einstufung von Escherichia coli C als Spender- und Empfängerorganismus bei gentechnischen Arbeiten zu Forschungszwecken" ). Auch von anderen, ansonsten pathogenen Arten können einzelne Stämme
der Risikogruppe 1 zugeordnet werden, ohne dass diese in den Listen
explizit erwähnt werden. Selbst bei Stämmen von obligat pathogenen
Organismen kann dies der Fall sein. Als Beispiel sei der auxotrophe LT2-Stamm
von Salmonella typhimurium mit der galE - Mutation genannt,
wie er für den Ames-Test verwendet wird. Hier gibt es mittlerweile
auch gentechnisch weiterentwickelte Isolate (z.B. TA 98, TA 100, TA 102),
die darüber hinaus ein mutiertes Histidin/Biotin-operon tragen und
eine beschädigte Membran besitzen. In der Stellungnahme der ZKBS zur
von S. typhimurium LT2-Stämmen vom Januar 1996 werden S.
typhimurium LT2-Stämme grundsätzlich der Risikogruppe
2 zugeordnet, alle Stämme mit stabilen Mutationen in den Genen
aroA-, galE-, cya und crp jedoch der Risikogruppe
1. In weiteren Stellungnahmen der ZKBS zur Einstufung von zwei S.
typhimurium-Impfstämmen
für Hühner (Impfstoffe Zoosaloral H bzw.TAD Salmonella vac T)
als Empfängerorganismen und zur Einstufung der S.
Stämme MvP101 und MvP103 (HH104) mit Mutationen in den Genen sseD
bzw. sseC wurden weitere Abstufungen in die Risikogruppe 1 vorgenommen.
In Stellungnahmen der ZKBS
zur Einstufung von Listeria monocytogenes-Stämmen vom November 1999 wurden die Stämme von L. monocytogenes mit Deletionen in den Genen prfA, hly, actA oder actA und plcB in die Risikogruppe 1 eingestuft und
zur Einstufung des Streptococcus pneumoniae Stammes R6 wurde dieser als Empfängerorganismus (nicht jedoch als Spender) in die Risikogruppe 1 herabgestuft.Bei Einsatz eines solchen apathogenen Stammes einer pathogenen Art als
Empfängerorganismus kann die Arbeit, falls sich an den anderen Parametern
nichts ändert, in die Sicherheitsstufe 1 klassifiziert werden.
- cc) eukaryote Zellen, die nicht spontan
zu Organismen regenerieren, und keine Organismen der Risikogruppen 2 bis
Die hier getroffene Aussage wurde in Anhang I Teil B Satz 11-14 der Gentechnik-Sicherheitsverordnung
i.d.F. vom 24.10.1990 noch näher ausgeführt. Höhere Tiere
und Pflanzen als Spender- und Empfängerorganismen werden in die Risikogruppe
1 eingestuft, wenn keine schädlichen Auswirkungen auf die Rechtsgüter
nach § 1 Nr. 1 GenTG zu erwarten sind. Zellen und Zelllinien als Spender-
und Empfängerorganismen werden in Risikogruppe 1 eingestuft, wenn
sie keine Organismen einer höheren Risikogruppe abgeben. Enthalten
sie Organismen höherer Risikogruppen, werden sie in die Risikogruppe
dieser Organismen eingestuft. Sind die Tiere und Pflanzen bzw. Zellen und
Zelllinien gentechnisch verändert, werden sie der der gentechnischen
Veränderung entsprechenden Risikogruppe zugeordnet.
Beim Einsatz von permanenten Zelllinien als Spender- oder Empfängerorganismus
ist die Einstufung der gentechnischen Arbeit aufgrund des vorangehenden
Abschnittes relativ einfach. Die etablierten Zelllinien (z.B. CHO, Hela,
Balb-3T3 oder SF9) sind zumeist in die Risikogruppe 1 eingestuft. Ist die
Zelllinie jedoch in der Lage infektiöse Viruspartikel, z.B. des zur
Immortalisierung herangezogenen Virus zu produzieren (NC-37 kann Epstein-Barr-Virus
freisetzen und ist in Risikogruppe 2 einzustufen) oder enthält die Zelllinie auf Grund ihrer Herkunft mehrere Kopien des vollständigen Genoms eines pathogenen Virus (z.B. die Zelllinie CaSki,
siehe hierzu Stellungnahme der ZKBS), muss sie entsprechend
des Gefährdungspotenzials dieses Virus eingestuft werden. Nähere
Informationen zur Einstufung etablierter Zelllinien sind im Merkblatt B004
der BG-Chemie zu finden [2; Kapitel 2.5 und 2.6].
Bei der Verwendung primärer Zellen aus Körperflüssigkeiten
oder Körpergeweben vielzelliger Organismen ist die Risikobewertung
schwieriger. Gerade beim Einsatz gentechnischer Methoden in der Humanmedizin
ist die Verwendung von menschlichem Material unumgänglich. Es wird
dabei selbstverständlich auch und gerade Biopsiematerial von Patienten
zur direkten Extraktion der cDNA herangezogen oder es werden körpereigene
Zellen von Patienten transfiziert. Bei diesem Ausgangsmaterial ist die
Frage nach einer Kontamination durch Organismen einer höheren Risikogruppe
besonders evident, zumal davon auszugehen ist, dass höhere Tiere
(einschließlich Mensch) regelmäßig mit Mikroorganismen
und Viren infiziert sind. Aufgrund der Bedeutung dieser Problematik hat
die Zentrale Kommission für die Biologische Sicherheit sich in einer
grundsätzlichen Stellungnahme zur
von primären Zellen aus Vertebraten geäußert und dabei
die Voraussetzung für eine Einstufung primärer humaner Zellen
und Zellkulturen in die Risikogruppe 1 festgelegt. Bei humanen Zellen aus
klinisch unauffälligen Patienten oder Spendern ist der Nachweis der
Seronegativität des Spenders für HIV, HBV und HCV ausreichend.
Es kann jedoch auch ein anderes Verfahren zum Nachweis der Virusfreiheit
herangezogen werden. Bei begründetem Verdacht auf das Vorhandensein
eines bestimmten Virus, ist das primäre Gewebe zusätzlich auf
Abwesenheit dieses Virus zu prüfen. Im Falle einer bekannten, klinisch
apparenten viralen Infektion des Patienten oder Spenders mit der Möglichkeit
einer Abgabe viraler Erreger, muss das Material entsprechend der Risikogruppe
des Virus zugeordnet werden. Sind weder Patient noch entnommene Zellen
auf die Abwesenheit der oben genannten Viren geprüft, ist das Material
unter Einhaltung von Maßnahmen der Sicherheitsstufe 2 zu verwenden.
Entsprechende Einstufungen werden in der Stellungnahme auch für nichthumane
Primatenzellen und Vertebratenzellen außer Primaten vorgenommen.
Werden Zellen und Zelllinien als Empfängerorganismen eingesetzt,
so fließt ihre Risikogruppe ganz in die Risikobewertung der gentechnischen
Arbeit ein. Sollen solche Zellen, insbesondere primäre humane Zellen
als Spender von cDNA in den Experimenten genutzt werden, muss die
Risikobewertung der gentechnischen Arbeit nicht identisch mit der Risikogruppe
des Spenders sein.
Dies soll am folgenden Beispiel erläutert werden, bei dem aufgrund
der angewandten Methodik ein Risiko auszuschließen ist:
Beispiel: Thema: Charakterisierung
des T-Zellrezeptors in HCV-infizierten Patienten
Menschliches Material mit HCV-Infektion (T-Lymphozyten
aus Blut mit HCV kontaminiert) Risikogruppe 3
E. coli K12 Risikogruppe 1
PCR 1000 (pBR 322-Derivat)
E. coli K12 mit T-Zellrezeptorsequenzen
Begründung für die Eingruppierung des GVO und die Sicherheitseinstufung
der gentechnischen Arbeit: Mit Hilfe spezifischer PCR-Primer werden
aus genomischer DNA rearrangierte T-Zellrezeptorsegmente isoliert und sequenziert.
Der Spenderorganismus ist zwar der Risikogruppe 3 zugeordnet, bei der benutzten
Methodik (genomische DNA, spezifische Primer) kann aber ausgeschlossen
werden, dass das HCV-Virus (RNA-Virus ohne reverse Transkriptase und
somit ohne DNA-Zwischenstufen) in infektiöser Form aus dem gentechnisch
veränderten Organismus entsteht.
Dieses Beispiel, bei dem die angewandte Methode eine Einstufung in die
Sicherheitsstufe 1 erlaubt, obwohl der Spenderorganismus in die Risikogruppe
3 eingestuft war, führt zum nächsten Spiegelstrich über:
zu: b) Vektoren und aus dem Spenderorganismus
überführte sowie synthetische Nukleinsäuren sind soweit
charakterisiert, dass der gentechnisch veränderte Organismus
nach einer vorläufigen Risikobewertung nach § 5 Abs. 1 Satz
2 das Gefährdungspotenzial von Organismen der Risikogruppe 1 nicht
überschreitet und keine gentechnisch veränderten Organismen höherer
Risikogruppen abgibt
Sind die Spenderorganismen in die Risikogruppen 2 - 4 eingestuft und
soll nicht das komplette Genom übertragen werden (z.B. in eine Genbank),
so kann die gentechnische Arbeit in die Sicherheitsstufe 1 eingestuft werden,
unter der Voraussetzung, dass keine Pathogenitätsfaktoren übertragen
werden. Hierbei ist klar, dass es sich um nicht pathogene Teile eines
Genoms handelt. Werden lediglich Punktmutationen durchgeführt, zum
Beispiel um das humanpathogene oder das toxische Potenzial auszuschalten,
so ist dieses nicht ausreichend um die Voraussetzung nach Nr. 1b zu erfüllen.
Beispiel: Thema: Untersuchungen
zur Stabilität und zum Abbau von mRNA der Antibiotika- Resistenz-Plasmide
von Staphylococcus aureus in Bacillus subtilis
Risikogruppe 2 Ausgangsorganismus
E. coli K12, der die Plasmide pUB
112 mit dem Gen für Chloramphenicol acetyltransferase (CAT) und pUB
110 mit dem Gen für Kanamycin-Resistenz aus Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis BD 168
pRB 273
a) Chloramphenicol acetyltransferase tragendes
B. subtilis b) Kanamycin-Resistenz tragendes B. subtilis
Risikogruppe 1 Risikogruppe 1
Begründung: Die übertragenen
subgenomischen Nukleinsäurefragmente sind charakterisiert und ohne
Gefährdungspotenzial. Die Risikobewertung kann somit nach § 5 Abs 3 Satz 2 GenTSV durchgeführt werden. Zusätzlich entspricht
das Vektor-Empfänger-System einer biologischen Sicherheitsmaßnahme
Hinweis: Soll von dem genannten Spenderorganismus S. aureus
hingegen eine Genbank mit unbekannten subgenomischen DNA-Fragmenten erstellt
werden, wäre diese gentechnische Arbeit in die Sicherheitsstufe
2 einzustufen. In diesem Fall muss das Gefährdungspotenzial
des Spenders nach § 5 Abs. 3 Satz 1 GenTSV vollständig in die
Risikobewertung einfließen.
Die Frage der Sicherheitseinstufung subgenomischer Fragmente von Viren, die sich in der Zielzelle replizieren können, wurde zunächst kontrovers gesehen. Solche „Replikons“ wurden bei einigen Viren in die Risikogruppe 1, bei anderen (z.B. HCV) jedoch in die Risikogruppe 2 eingestuft. In einer Empfehlung zur Einstufung flaviviraler Replikons (z.B. HCV, West-Nil Virus, Denguevirus) wurde von der ZKBS im Dezember 2003 eine Vereinheitlichung der Einstufung vorgenommen. Die Arbeiten mit subgenomischen flaviviralen Replikons (mit Ausnahme eines subgenomischen DENV-Replikons mit den Strukturgenen prM und/oder E, die vermutlich verantwortlich für die Kreuzreaktion der DENV-spezifischen Antikörper sind, welches der
Risikogruppe 2 zugeordnet wird) in Zelllinien werden der Sicherheitsstufe 1 zugeordnet. Voraussetzung ist, dass nicht die komplette virale genetische Information auf eukaryote Zellen übertragen wird und die Bildung und Abgabe viraler Partikel ausgeschlossen werden kann. Nach allen bisherigen Erkenntnissen geht von diesen viralen subgenomischen Replikons keine Pathogenität aus.
Ist das Pathogenitätsprinzip des Spenders sehr komplex und kann
nicht übertragen werden, da die pathogene Wirkung vom gesamten Organismus
ausgeht, wie dies z.B. bei eukaryoten Parasiten der Fall ist, können
gentechnische Arbeiten ebenfalls in die Sicherheitsstufe 1 klassifiziert
Beispiel: Thema: Herstellung einer
Genbank von Onchocerca volvulus in E. coli zur molekularbiologischen
Charakterisierung von Antigenen
Onchocerca volvulus (Filaroidea)
Risikogruppe 2 Empfänger
Lambdavektor
E. coli K12 mit genomischen Fragmenten genomischer
DNA von O. volvulus
der gentechnischen Arbeit: Es werden nicht charakterisierte Nukleinsäureabschnitte
eines Spenders der Risikogruppe 2 in den Empfängerorganismus überführt.
Die pathogene Wirkung des Protozoen O. volvulus geht jedoch vom
gesamten adulten Organismus aus, und beruht auf Mechanismen, die höchstwahrscheinlich
nicht auf Bakterien übertragbar sind. Darüber hinaus entspricht
das Vektor-Empfänger-System einer biologischen Sicherheitsmaßnahme.
Hinweis: O. volvulus ist in der
"risikobewerteter Spender- und Empfängerorganismen für gentechnische
Arbeiten" nur bei Arbeiten mit Überträger/Zwischenwirt in die
Risikogruppe 2 eingestuft. Die oben getätigte Aussage gilt jedoch
auch für Parasiten, die in jedem Fall in die Risikogruppe 2 eingestuft
werden, wie z.B. Plasmodium falciparum.
Eine Gruppe von Genen, bei deren Übertragung die Sicherheitseinstufung
der gentechnischen Arbeit zuweilen Schwierigkeiten bereitet, sind die Onkogene.
Unter dem Eindruck von Veröffentlichungen, die von einer karzinogenen
Wirkung dieser DNA auf der Haut im Tiermodell berichten, entstand eine
Stellungnahme der ZKBS zu
beim Umgang mit Nukleinsäuren mit onkogenem Potenzial. In dieser
ist neben den Maßnahmen zum Personenschutz und den arbeitsmedizinischen
Vorsorgemaßnahmen auch eine Liste der entsprechenden Nukleinsäuren
enthalten, es wird jedoch nicht auf die Sicherheitseinstufung eingegangen.
Im Februar 1996 ergänzte die ZKBS diese Empfehlung um eine Risikobewertung
des Umgangs mit gentechnisch veränderten Bakterien, Hefen oder Säugerzellen,
in die solche Nukleinsäuren oder andere Nukleinsäuren eingeführt
wurden, deren Expression zu einer Deregulation der Transkriptionsaktivität
einer Säugerzelle führen (Bewertung
von GVO, in die Nukleinsäuren eingeführt wurden, welche für
Proteine mit genregulatorischer Funktion kodieren). Generell kann man sagen, dass alle Arbeiten mit Nukleinsäureabschnitten von Säugerzellen oder deren Viren, die in eine Biologische Sicherheitsmaßnahme gemäß Anhang II GenTSV oder in primäre Zellen der Risikogruppe 1 eingeführt werden, in der Sicherheitsstufe 1 durchgeführt werden können, selbst wenn diese für Proteine mit genregulatorischer Funktion kodieren. Es müssen jedoch die
Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Nukleinsäuren mit onkogenem Potenzial eingehalten werden. Beispiel: Thema: Erstellen einer Genbank aus einer humanen Zervix-Karzinomzellinie
und Klonierung des Gens E6 des humanen Papillomvirus
Humane Zervixkarzinomzellinie (Hela),
enthält Fragmente des HPV 18 Genoms ins Wirtsgenom integriert
pBR322-Derivat mit CMV-Promotor
a) E. coli K12 mit
nicht charakterisierten Nukleinsäurefragmenten der Hela-Zellinie (shot-gun-Klonierung) b) E. coli K12 mit charakterisiertem E6 Gen in Verbindung mit
einem eukaryoten Promotor
1 Risikogruppe 1
Einstufung der Arbeiten
a) Spender und Empfänger
sind Organismen der Risikogruppe 1. Das Vektor-Empfänger-System entspricht
einer biologischen Sicherheitsmaßnahme. Bei der shot-gun-Klonierung
ist es unwahrscheinlich exprimierbare HPV Gene zu erhalten. Wenn überhaupt
liegen diese in geringer Kopienzahl vor. Eine Gefährdung der Beschäftigten
kann weitgehend ausgeschlossen wer Sicherheitsstufe
b) Das übertragene Nukleinsäurefragment
enthält das Gefährdungspotenzial von HPV. Das Gen ist nachweislich
tumorinduzierend und steht unter der Kontrolle eines eukaryoten Promotors.
Die Zielzellen der pathogenen Wirkung (Schleimhaut der Beschäftigten)
können durch Aerosole erreicht werden. Das Vektor-Empfänger-System
entspricht einer biologischen Sicherheitsmaßnahme. Die Wahrscheinlichkeit
eines DNA-Transfers von GVO auf Körperzellen oder der Aufnahme freier
DNA aus lysierten GVO durch Körperzellen ist unter in vivo Bedingungen
Diese Einstufung gilt nicht für virale Vektorsysteme der Sicherheitsstufe 1.
Alle Adeno-assoziierten Viren (auch die Serotypen 2, 3 und 5) mit Zellzyklus-regulierenden Genen werden in die Risikogruppe 2 eingestuft und es müssen besondere Sicherheitsmaßnahmen zum Personenschutz eingehalten werden (siehe hierzu die Allgemeine Stellungnahme der ZKBS
„Empfehlung der ZKBS zu adenoviralen und AAV-abgeleiteten replikationsdefekten Vektoren mit zellzyklus-regulierenden Genen“)
Beim Sindbis-Virus- und dem Semliki Forest-Virus-Expressionssystem hält die ZKBS bei der Expression von Proteinen mit transformierendem Potenzial eine Einzelfallbewertung für erforderlich.
und der gentechnischen Arbeit wird im wesentlichen von den Eigenschaften
des Empfängerorganismus und der übertragenen Nukleinsäure
bestimmt. Lediglich beim Einsatz von Vektoren mit eigenständiger Infektiosität
(z.B. virale Vektoren) liegt ein Gefährdungspotenzial durch den Vektor
vor. Es war und ist wissenschaftlich nicht begründet, bei Vorliegen
eines Spenders, Empfängers und gentechnisch veränderten Organismus
der Risikogruppe 1 die Arbeit z.B. nur aufgrund der Mobilisierbarkeit eines Plasmids in eine höhere Sicherheitsstufe einzustufen, zumal die Begriffe
begrenzte Wirtsspezifität, geringe Cotransfer-Rate und geringe Mobilisierbarkeit
des § 6 Abs. 5 GenTSV nicht genau definiert sind. Aus diesem Grund
hatte die ZKBS auch im Falle der Bewertung von Vektoren eine grundsätzliche
Stellungnahme abgegeben (Stellungnahme
der ZKBS zur Bewertung von Vektoren bei gentechnischen Arbeiten mit Mikroorganismen
zu Forschungszwecken). In ihr wurde klar ausgedrückt, dass
der Vektor im Kontext mit dem Empfänger als Vektor-Empfänger-System
zu berücksichtigen ist. Dabei konnte der Organismus durchaus Plasmide
enthalten, die mobilisierbar sind und/oder einen weiten Wirtsbereich für
ihre Replikationsfähigkeit haben, ohne dass dies eine Erhöhung
des Gefährdungspotenzials bedeuten musste. Hier seien insbesondere
die shuttle-Vektoren aus der Zellkultur erwähnt, die sowohl Replikon
und Selektionsmarker für E. coli als auch eukaryote Transkriptionssignale
und zuweilen ein eukaryotes Replikon tragen.
Virale Vektoren, die in der Sicherheitsstufe 1 gehandhabt werden können:
Die retroviralen Vektoren sind die am häufigsten genutzte virale Vektorgruppe. Sie sind von besonderem Interesse beim Einsatz in der somatischen Gentherapie und deshalb, insbesondere unter dem Gesichtspunkt der sicheren Anwendung, bestens untersucht und ständig weiterentwickelt. Die ZKBS hat bereits im Juni 1996 eine allgemeine Stellungnahme
zum Gentransfer mit Hilfe retroviraler Vektoren verfasst.
Für die Sicherheitseinstufung der Arbeiten mit retroviralen Vektoren muss man zwischen drei Systemen unterscheiden:
Verpackungszelllinien, bei denen aufgrund von Rekombinationsereignissen
murine ecotrope (replikationskompetente oder replikationsdefekte) Retroviren
amphotrope replikationskompetente Retroviren, d.h. Viren, die in der Lage
sind, sich in infizierten Zellen zu replizieren und weitere Zellen zu infizieren,
Verpackungszelllinien, bei denen amphotrope replikationsdefekte Retroviren,
d.h. Viren, die das rekombinante Genom bei einer einmaligen Infektion in
die Wirtszelle einbringen, sich aber nicht replizieren können, entstehen.
Gerade bei den retroviralen Vektoren mit den entsprechenden Plasmiden (z.B.
LXSN oder pMV-7), Verpackungszelllinien und Empfängerzellen wird besonders
deutlich, dass das Vektor-Empfänger-System als Einheit zu betrachten
ist. Das Plasmid entspricht zusammen mit E. coli einer biologischen Sicherheitsmaßnahme,
nicht jedoch mit der Verpackungszelllinie. Die Verpackungszelllinie kann
jedoch mit einem anderen Plasmid (ohne retrovirale LTRs) eine biologische
Sicherheitsmaßnahme darstellen.
Unter den folgenden Voraussetzungen können Arbeiten mit retroviralen
Vektoren in die Sicherheitsstufe 1 klassifiziert werden:
Es wird eine Verpackungszelllinie auf der Basis des MMLV (Moloney Murine
Leukemia Virus) verwendet, die das Insert in ecotrope replikationskompetente
oder replikationsdefekte Retroviren verpackt. Die Arbeiten mit diesen Retroviren
und mit von ihnen infizierten Zellen der Risikogruppe 1, sofern diese keine
Retroviren mit erweitertem Wirtsbereich abgeben, sind der Sicherheitsstufe
1 zuzuordnen.
Arbeiten mit Zellen der Risikogruppe 1, die mit rekombinanten replikationsdefekten
amphotropen Retroviren infiziert wurden, sind der Sicherheitsstufe 1 zuzuordnen,
sofern die Zellen den Replikationsdefekt nicht komplementieren und keine
Hüllproteine zur Verpackung der Vektor-RNA zur Verfügung stellen
(Ausnahme: ecotrope Verpackungszellinien).
Der Umgang mit amphotropen (replikationskompetenten und replikationsdefekten)
Retroviren einschließlich der Infektion von Zellen der Risikogruppe
1 ist der Sicherheitsstufe 2 zuzuordnen.
Beispiel: Thema: Etablierung von
permanenten, neuronalen Zelllinien der Ratte und Immortalisierung menschlicher
Stromazellen mit Hilfe retroviraler Vektoren, die die RNA von t-neu
bzw. das SV40 T-Antigen übertragen
a) Ratte (neuraler Tumor) für t-neu Gen b) Affenvirus SV40 für SV40 T-Antigen
Risikogruppe 1 Risikogruppe 2
Ausgangsorganismen
E. coli K12 einschließlich des Vektors
LXSN (pBR-Derivat mit 5´- und 3´-LTR des MMLV und dem Neomycinresistenzgen)
mit dem Gen für t-neu bzw. für SV40-T-Antigen Begründung: Der Empfänger ist ein Organismus der Risikogruppe
1. Die Spender sind Organismen der Risikogruppe 1 bzw. 2. Es werden subgenomische
Nukleinsäureabschnitte in den Empfängerorganismus eingeführt,
die einen Teil des Gefährdungspotenzials der Spenderorganismen beinhalten.
Da das Vektor-Empfänger-System einer biologischen Sicherheitsmaßnahme
gem. Anhang II A GenTSV entspricht, erfolgt eine Herabstufung. Empfängerorganismen
Empfängerorganismen
a) Verpackungszellinie psi2 b) Verpackungszellinie GP+AM12 c) primäre Rattenzellen d) primäre menschliche Stromazellen, die nachweislich frei von
HIV, HBV und HCV sind Risikogruppe 1 Risikogruppe 1 Risikogruppe 1 Risikogruppe 1
a) Verpackungszelllinie psi2 einschließlich des Vektors LXSN mit
dem Gen für t-neu b) ecotrope rekombinante Retroviren abgegeben von GVO a Begründung: Die Verpackungszelllinie psi 2 ist eine Mauszelllinie
mit ins Genom integrierter, defekter proviraler Moloney Murine Leukemia
Virus (MMLV)-DNA, der die Signalsequenz zur Verpackung der viralen RNA
fehlt. In diese Verpackungszelllinie werden rekombinante, retrovirale Plasmide
(5´- und 3´-LTR des MMLV) eingeführt, welche das Neomycin-Resistenzgen
und das t-neu Gen enthalten. Die retroviralen Plasmide enthalten
neben den 5´- und 3´-LTRs von MMLV Verpackungssignal-Sequenzen,
die ermöglichen, dass Transkripte der eingeführten Plasmide
in MMLV-Partikel verpackt und von der Zelle als infektiöse, aber replikationsdefekte
Viruspartikel abgegeben werden. Die so erzeugten Retroviren sind ecotrop,
d.h. sie können nur Nagerzellen infizieren. Die Verpackungszelllinie
gibt auch in geringen Mengen ecotrope Wildtyp-MMLV ab, die vermutlich durch
Rekombinationsereignisse entstehen. Die verpackte Nukleinsäure enthält
ein Onkogen für Nagetiere. Sie liegt in Form von RNA vor und können
erst nach Umschreiben in DNA durch reverse Transkriptase ins Wirtsgenom
integrieren. Eine solche Übertragung auf den Menschen durch Infektion
oder Aerosol ist jedoch nicht zu erwarten.
Risikogruppe 1 Risikogruppe 1 .
c) Verpackungszelllinie GP+AM12 einschließlich des Vektors LXSN
mit dem Gen des SV40-T-Antigen
d) amphotrope replikationsdefekte Retroviren abgegeben von GVO c
Begründung: Die Verpackungszelllinie GP+AM12 ist eine Mauszelllinie
mit ins Genom integrierten voneinander getrennten proviralen Genomabschnitten
des MMLV mit den gag/pol Genen bzw. dem env-Gen. Die Signalsequenz zur
Verpackung von viraler RNA und die 3´-LTRs fehlen. In diese Verpackungszelllinie
werden rekombinante retrovirale Plasmide (5´- und 3´- LTRs
von MMLV) eingeführt, welche das Neomycin-Resistenzgen und das Gen
des SV40-T-Antigens enthalten. Es entstehen infektiöse, aber replikationsdefekte
amphotrope Retroviren. Diese können menschliche Zellen infizieren.
Risikogruppe 2 Risikogruppe 2
e) primäre Nagerzellen einschließlich des rekombinanten
retroviralen Vektors aus dem Überstand der psi2-Verpackungszelle
Begründung: Der Empfängerorganismus ist ein Organismus
der Risikogruppe 1. Die Rattenzellen werden mit ecotropen Retroviren der
Risikogruppe 1 infiziert.
f) primäre menschliche Stromazellen einschließlich des rekombinanten
retroviralen Vektors aus dem Überstand der GP+AM12-Verpackungs-Zellinie
Begründung: Die getesten menschlichen Stromazellen sind Organismen
der Risikogruppe 1. Sie werden mit replikationsdefekten amphotropen Retroviren
der Risikogruppe 2 infiziert. Nach Integration als Provirus in das Genom
der Empfängerzellen können keine Retroviren mehr abgegeben werden,
da die Zellen den Replikationsdefekt nicht komplementieren. Risikogruppe 1
GVO a) und b) GVO c) und d) GVO e) und f) Sicherheitsstufe 1 Sicherheitsstufe 2 Sicherheitsstufe 1
Nach einer Stellungnahme der ZKBS vom März 1994
Risikobewertung von C-Typ Retroviren der Hühner wird nunmehr auch
ein Teil dieser Retroviren, nämlich die Geflügel-Leukose-Sarkom-Viren
(GLSV), akute Leukämie/Sarkom Viren der Subgruppen A und B in
die Risikogruppe 1 eingestuft. Arbeiten mit diesen Viren als Vektor
können somit, unter Berücksichtigung des Informationsgehalts
des Inserts, in die Sicherheitsstufe 1 eingestuft werden.
Weitere gentechnische Arbeiten mit einem viralen Vektorsystem, die in
die Sicherheitsstufe 1 eingestuft werden können, sind solche
mit Baculovirus und der Insektenzellinie SF9. Bei diesem System
vermehren sich die rekombinanten Viren in der Wirtszelle, wobei diese abstirbt.
In ein Rekombinationsplasmid mit allen zur Vermehrung in E. coli
notwendigen Funktionen wird ein Fremdgen vor einen viralen Promotor inseriert.
Die flankierenden Sequenzen sind homolog zu viralen Sequenzen. Wird dieses
Plasmid in Baculovirus infizierte SF9 Zellen transfiziert, kommt es (über
homologe Sequenzen) zur Rekombination des Plasmids mit dem viralen Genom.
Da die Arbeitseinstufung in einem solchen Fall von der Risikogruppe des
benutzten Virus abhängt, kann, unter Berücksichtigung des Informationsgehalts
des Inserts, beim Umgang mit Baculoviren (Risikogruppe 1) in die Sicherheitsstufe
1 klassifiziert werden.
Arbeiten mit dem Semliki-Forest-Virus- und dem Sindbis-Virus-Expressionssystem
werden ebenfalls z.T. in die Sicherheitsstufe 1 eingestuft, wenn
die rekombinanten Expressionsvektoren bzw. die rekombinanten Viruspartikel Nukleinsäuresequenzen ohne eigenes pathogenes Potenzial (z.B. Prionproteine oder Proteine mit transformierendem Potenzial) tragen und
die Empfängerorganismen der Risikogruppe 1 zuzuordnen sind (siehe
Stellungnahme Gentechnische
Arbeiten mit dem Sindbis-Virus- und dem Semliki-Forest Virus-Expressionssystem
der ZKBS vom Oktober 2004). Es sind dies im Einzelnen die Übertragung rekombinanter SFV- bzw. Sindbis-Virus-Expressionsvektoren oder Helferplasmide
in E. coli, die Übertragung der Transkripte rekombinanter SFV-
bzw. Sindbis-Virus-Expressionsvektoren in eeukaryote Zellen der Risikogruppe 1 sowie die Erzeugung und Verwendung SFV- bzw. SIN- abgeleiteter Vektorpartikel bei Verwendung des Helferplasmids pSFV-Helper2 oder vergleichbarer Helferplasmide, die an der proteolytischen Spaltstelle von p62 dreifach mutiert sind (Ausnahme: beim Insert handelt es sich um ein virales Hüllprotein).
Bei Verwendung der Helferplasmide pSFV-Helper1 bzw. DH-BB kann in den kotransfizierten
Zellen eine Rekombination zwischen der RNA des Expressionsvektors und der
RNA des Helferplasmids mit Bildung und folgender Amplifikation replikationskompetenter,
infektiöser Viruspartikel nicht ausgeschlossen werden. Diese Arbeiten
werden der Sicherheitsstufe 2 zugeordnet.
Gleiches gilt für die Verwendung SFV- bzw. SIN abgeleiteter Vektorpartikel bei Verwendung des Helferplasmids pSFV-Helper2 nach deren Aktivierung durch α-Chymotrypsin.In ihrer Stellungnahme zum Umgang mit rekombinanten Vacciniaviren vom Mai 1997 hat die ZKBS
das modifizierte Vaccinia-Virus Ankara MVA, das multiple Deletionen
von insgesamt 31 kb aufweist und sich nicht auf menschlichen Zellen vermehrt,
in die Risikogruppe 1 eingestuft. Gentechnische Arbeiten mit rekombinanten
Vaccinia-Virus MVA, das heterologe Gene enthält, die nicht das Wirtsspektrum
verändern und nicht das Gefährdungspotenzial des Vaccinia-Virus
Ankara MVA erhöhen, wurden in die Sicherheitsstufe 1 eingestuft. In einer neuerlichen Stellungnahme speziell zum Vacciniavirus MVA wurde diese Einstufung noch weiter präzisiert (Stellungnahme der ZKBS zur Risikobewertung des rekombinanten Vacciniavirus MVA).Im November 2001 veröffentlichte die ZKBS eine geänderte Stellungnahme zum Gentransfer mit Hilfe von Adenovirus Typ 5 (siehe
mit Hilfe von Adenovirus Typ 5). In dieser Stellungnahme werden die rekombinanten, replikationsdefekten Ad5-abgeleiteten Vektoren, bei denen sämtliche adenoviralen Gene deletiert sind (sogenannte "Gutless"-Vektoren oder "High Capacity"-Vektoren), und die subgenomische Nukleinsäureabschnitte ohne Gefährdungspotenzial enthalten, der Riskogruppe 1 zugeordnet, wenn sie auf Helferzelllinien erzeugt wurden, bei denen nicht von einer homologen Rekombination zwischen integrierten Helfergenen und Helfervirus auszugehen ist, wenn die Verpackung der Helfervirus-DNA minimiert ist und wenn durch Dichtegradientenzentrifugation der Ad5-abgeleitete Vektor von kontaminierendem Helfervirus abgetrennt ist. Achtung: Alle anderen Adenoviren Typ 5, auch replikationsdefekte, werden der Risikogruppe 2 zugeordnet.In ihrer Stellungnahme vom Oktober 2001
zur Risikobewertung humaner Adeno-assoziierter Viren hat die ZKBS die Serotypen 2, 3 und 5 der Adeno-assoziierten Viren in die Risikogruppe 1 eingestuft, während die Serotypen 1, 4 und 6 in die Risikogruppe 2 eingestuft wurden. Bei den heute verwendeten chimären AAV ist die Sicherheitseinstufung abhängig von den eingesetzten Elementen. Wird lediglich in den Verpackungskonstrukten cap von einem AAV der Risikogruppe 2 eingesetzt, sind die entstehenden AAV immer noch in die Risikogruppe 1 einzustufen.
Zusammenfassung der wichtigsten Vektor-Empfänger-Systeme in der Sicherheitsstufe
E. coli: K12 und Derivate, B und Derivate sowie die Einzelstämme
MRC1, chi-1776, ATCC 9637, NCIB 8743, CCM 2843, C, ABLE C und ABLE K mit
ihren Plasmiden (z.B. pBR322) oder Bakteriophagen (z.B. Lambda gt 10 und
Bacillus subtilis mit seinen Plasmiden (z.B. pUB und pPL)
Pseudomonas putida (z.B. Stamm mt-2 KT 2440 mit den Vektoren pKT262,
pKT263 und pKT264)
Agrobacterium tumefaciens mit binärem Plasmid für die
Transfektion von Pflanzenzellen (siehe Stellungnahme der ZKBS
zur Einstufung von
Agrobacterium tumefaciens)
Saccharomyces cerevisiae (haploid und diploid) mit den Vektortypen
YIp, YRp, YEp und YAC
etablierte Zellinien, die keine Organismen höherer Risikogruppen abgeben
humanes Primärmaterial, das nachweislich frei von HBV, HCV und HIV
ist oder von Spendern stammt, die für die genannten Viren seronegativ
primäres Material aus sonstigen Vertebraten, wenn keine Krankheitssymptome
vorliegen (Ausnahme Primaten, deren primäre Zellen in die Risikogruppe
2 einzuordnen sind)
Zellen dicotyler Pflanzen
ecotrope Verpackungszelllinien (z.B. psi2, PE501, PsiCRE, GP+E86, Bosc23
oder omegaE) in Verbindung mit retroviralen Vektoren (z.B. LXSN oder pMV7)
Verpackungszelllinien ohne retrovirale Vektoren
Baculovirus mit Insektenzellen
Geflügel-Leukose-Sarkom-Viren (GLSV), akute Leukämie/Sarkom Viren
der Subgruppen A und B
Semliki-Forest-Virus- und Sindbis-Virus-Expressionssystem bei Verwendung des Helferplasmids pSFV-Helper2 vor der Aktivierung mit α-Chymotrypsin
Vaccinia-Virus Ankara MVA (wenn das Insert das Wirtsspektrum nicht verändert)
Adenovirus Typ 5 (sogenannte "Gutless"-Vektoren oder "High Capacity"-Vektoren) unter definierten Voraussetzungen
Adeno assoziierte Viren der Serotypen 2, 3 und 5 (wenn das Insert keine zellzyklus-regulierenden Eigenschaften besitzt)
Nach § 7 Abs. 3 Nr. 2 GenTSV sind gentechnische Arbeiten mit Mikroorganismen
und Zellkulturen im Laborbereich der Sicherheitsstufe 2 zuzuordnen,
a) die Empfängerorganismen sind Organismen
der Risikogruppe 2 und geben keine Organismen der Risikogruppen 3 oder
b) Vektoren und aus dem Spenderorganismus
2 das Gefährdungspotenzial von Organismen der Risikogruppe 2 nicht
Risikogruppen abgibt;
zu: a) die Empfängerorganismen sind Organismen
Ist der Empfängerorganismus ein Organismus der Risikogruppe 2 und
gibt keine Organismen der Risikogruppen 3 oder 4 ab, so ist die gentechnische
Arbeit in die Sicherheitsstufe 2 einzustufen, da das Gefährdungspotenzial
des Empfängerorganismus gem. § 5 Abs. 4 GenTSV vollständig
in die Risikobewertung der gentechnisch veränderten Organismen und
somit in die Sicherheitseinstufung der gentechnischen Arbeit einfließt
(Ausnahme siehe unter D).
Aus dem Nebensatz ergibt sich, dass bei der Gesamtbewertung der
Sicherheitseinstufung der gentechnischen Arbeit die Einstufung des gentechnisch
veränderten Organismus in die Risikogruppe 2 von ausschlaggebender
Bedeutung ist. Die Einstufung in die Risikogruppe 2 ist unter den folgenden
Voraussetzungen vorzunehmen:
A) Der Spenderorganismus
ist ein Organismus der Risikogruppe 2 und gibt keine Organismen der Risikogruppen
3 oder 4 ab, und der Empfängerorganismus ist der Risikogruppe 1 zuzuordnen,
- aus dem Spenderorganismus wird ein Genomabschnitt
übertragen, der nicht charakterisiert ist
Beispiel: Thema: Erstellen einer
Genbank von Listeria monocytogenes
Listerisa monocytogenes
E. coli K12 mit dem Vektor pLSV1 pLSV1 ist ein "shuttle"-Vektor für Gram-negative und Gram-positive
Bakterien. Der Vektor ist ein pUC18-Derivat mit einem temperatursensitiven
ori des Plasmids pE194 aus Staphylococcus aureus und dem Erythromycin-Resistenzgen
des Plasmids pIP501 aus Streptococcus agalactiae
E. coli K12 einschließlich des obengenannten
Vektors mit subgenomischen DNA-Fragmenten aus L. monocytogenes Begründung: Es werden nicht charakterisierte DNA-Sequenzen
aus einem Organismus der Risikogruppe 2 in E. coli K12 eingeführt.
Eine Expression der Gene in E. coli K12 ist nicht auszuschließen. Der verwendete Vektor ist ausreichend charakterisiert und ohne pathogenes Potenzial
Begründung: Der Spenderorganismus
ist ein Organismus der Risikogruppe 2, der Empfängerorganismus ist
ein Organismus der Risikogruppe 1. Die in E. coli eingeführten
DNA-Sequenzen sind nicht charakterisiert, dürften aber vermutlich
nicht stark exprimiert werden. Der verwendete Vektor kann in Gram-negativen
und Gram-positiven Bakterien replizieren
- es werden Nukleinsäureabschnitte übertragen,
die das Gefährdungspotenzial des Spenderorganismus bestimmen. Hierbei
ist durchaus von Bedeutung ob es sich um einen dominierenden Virulenzfaktor
handelt, oder um virulenzassoziierte Gene. Beispiel: Thema: Regulation und
Expression virulenz-assoziierter Gene aus Listerien
Listeria monocytogenes bzw. ivanovii Risikogruppe 2
Ausgangsorganismus
E. coli K12 mit einzelnen Virulenz-assoziierten
Genen aus den o.g. Listerien a) Ausgangsorganismen die Listeriolysingene aus L. monocytogenes
und L.ivanovii tragen, da diese die dominierenden Virulenzfaktoren
darstellen, (Listeriolysin-negative Mutanten sind avirulent)
b) Alle anderen Ausgangsorganismen, die jeweils ein
anderes virulenz-assoziiertes Gen enthalten (Gen für das Regulator-protein
prfA, das Invasionsprotein p60, eine Phospholipase {plcA oder plcB}, eine
Metalloprotease {mpl}, eine Katalase, eine Superoxid-Dismutase und ein
vermutlich Aktin-polymerisierendes Enzym {actA})
E. coli K12 und Derivate mit den Vektoren pBR322
und pUC18
a) E. coli K12 und Derivate einschließlich der genannten
Vektoren mit dem Listeriolysin-Gen aus L. monocytogenes oder L.
Begründung: Es werden charakterisierte DNA-Sequenzen mit pathogenem
Potenzial aus Organismen der Risikogruppe 2 in E. coli K12 eingeführt.
Die Vektor-Empfänger-Systeme entsprechen biologischen Sicherheitsmaßnahmen
gemäß Anhang II A GenTSV.
Risikogruppe 2 .
b) E. coli K12 und Derivate einschließlich der genannten
Vektoren mit einem einzelnen Gen aus einem Ausgangsorganismus der Gruppe
Begründung: Es werden charakterisierte DNA-Sequenzen aus einem
Organismus der Risikogruppe 2, die für sich keine Pathogenität
vermitteln können, in E. coli K12 eingeführt. Die Vektor-Empfänger-Systeme
entsprechen einer biologischen Sicherheitsmaßnahme gemäß
Anhang II A GenTSV
a) Begründung: Die Spenderorganismen
sind Organismen der Risikogruppe 2, die Empfängerorganismen sind Organismen
der Risikogruppe 1. Die in die Empfängerorganismen eingeführten
DNA-Sequenzen sind zwar charakterisiert, stellen jedoch den Hauptvirulenzfaktor
der Spenderorganismen dar. Die Empfänger sind gemeinsam mit den verwendeten
Vektoren als biologische Sicherheitsmaßnahme gemäß §
6 Abs. 4 und 5 GenTS Sicherheitsstufe 2 .
b) Begründung: Die Spenderorganismen
der Risikogruppe 1. Die Empfänger sind gemeinsam mit den verwendeten
6 Abs. 4 und 5 GenTSV anerkannt. Die gentechnisch veränderten Organismen
überschreiten nach einer vorläufigen Sicherheitsbewertung nach
§ 5 Abs. 2 GenTSV nicht das Gefährdungspotenzial von Organismen
der Risikogruppe 1.
Hinweis: Sollen mehrere Gene des Virulenzgenclusters
von L. monocytogenes oder L. ivanovii in Kombination bzw.
Fusion eingeführt werden, lautet das Ergebnis der vorläufigen
Sicherheitsbewertung Sicherheitsstufe 2.
- das gesamte Genom des Spenderorganismus wird
Diese generelle Forderung, wie sie in § 5 Abs. 3 Satz 1 GenTSV
aufgestellt wird, erscheint überzogen und steht im Widerspruch zu
dem Nebensatz von Absatz b). Sie ist sicherlich richtig in allen Fällen,
bei denen die pathogene Wirkung des Spenders übertragbar ist. Es gibt
m.E. jedoch auch Fälle der Übertragung des gesamten Genoms, bei
denen der entstehende GVO kein Gefährdungspotenzial darstellt und
deshalb als Ergebnis seiner vorläufigen Sicherheitsbewertung die Risikogruppe
1 resultieren kann. Ein Beispiel hierfür ist die bereits zuvor angesprochene
Übertragung von DNA aus eukaryotischen Parasiten auf Bakterien. Selbst
bei Arbeiten mit dem gesamten Genom ist die Übertragung der Pathogenitätsmechanismen
auf die Bakterien sehr unwahrscheinlich. Dies zeigt, dass die Forderung
nach einer vorläufigen Sicherheitseinstufung in jedem Einzelfall sinnvoll
und berechtigt ist. Das Ergebnis der Einzelfallbetrachtung kann dabei,
wie oben gezeigt, durchaus von einer generellen Forderung abweichen. In
einem solchen Fall, darf m.E. der Wissenschaftler nicht im Rahmen seiner
wissenschaftlichen Verantwortlichkeit die Herabstufung vornehmen. Dies
kann nur in Absprache mit der Genehmigungsbehörde bzw. nach Befragung
der ZKBS geschehen.
B) Aus Absatz b) geht jedoch auch
hervor, dass Arbeiten in die Sicherheitsstufe 2 klassifiziert werden
können, bei denen als Spender Organismen einer höheren Risikogruppe
als 2 benutzt werden. Voraussetzung ist dabei, dass der aus dieser
Arbeit hervorgehende gentechnisch veränderte Organismus nicht das
Gefährdungspotenzial der Risikogruppe 2 überschreitet und keine
gentechnisch veränderten Organismen einer höheren Risikogruppe
abgibt. In diesen Fällen kann eine Herabstufung gem. § 5 Abs.
3 Satz 2 GenTSV vorgenommen werden. Dies trifft insbesondere zu, wenn Teilsequenzen
eines Virusgenoms auf Organismen der Risikogruppe 1 übertragen werden,
die keine biologische Sicherheitsmaßnahme gem. Anhang II A GenTSV
darstellen. Aber auch die Sicherheitsbeurteilung der so genannten "3-Stern-organismen"
kann zu einer Einstufung in die Sicherheitsstufe 2 führen (siehe hierzu
C) Absatz b) ermöglicht gleichzeitig
auch eine Aussage zu den verwendeten Vektoren. Vorgaben an die Vektoren
ergeben sich bei der Einstufung von gentechnischen Arbeiten in die Sicherheitsstufe
2 lediglich aus dem Nebensatz. Zu den bei der Einstufung in die Sicherheitsstufe
1 aufgetauchten Fragen der Mobilisierbarkeit bzw. zum Transfersystem gibt
es keine Einschränkungen, auch bei Vorliegen der mob- und tra-Funktion
ist die Einhaltung der Voraussetzungen gewährleistet. Eine indirekte
Vorgabe ist jedoch durchaus vorhanden, da der gentechnisch veränderte
Organismus das Gefährdungspotenzial von Organismen der Risikogruppe
2 nicht überschreiten darf. Es ist somit klar, dass auch die
Vektoren frei sein müssen von Nukleinsäuresequenzen, die das
Gefährdungspotenzial über die Risikogruppe 2 hinaus erhöhen.
Neben den bereits erwähnten Retroviren und retroviralen Vektoren
mit ihren Verpackungszelllinien (Ausnahme ecotrope Zelllinien, siehe Sicherheitsstufe
1) gewinnen zunehmend die lentiviralen Vektor-Systeme für die Transformation eukaryoter Zellen an Bedeutung. Hierbei werden ebenfalls in einer Verpackungszelllinie mit Hilfe von HIV- oder FIV-basierten Transfer-Vektoren und nach Kotransfektion mit den Verpackungsvektoren rekombinante, replikationsdefekte Lentiviren hergestellt. Zur Vermeidung der Entstehung replikationskompetenter Viren werden die Struktur und Verpackungssequenzen auf drei Plasmide verteilt. Die gentechnischen Arbeiten mit subgenomischen Nukleinsäureabschnitten der Lentiviren (Rekombinationsplasmide) werden in die Sicherheitsstufe 1 eingestuft. Die kotransfizierte Verpackungszelllinie und die entstehenden replikationsdefekten Lentiviren werden in die Risikogruppe 2 eingestuft. Dies gilt auch, wenn die Lentiviren mit retroviralen Hüllglykoproteinen anderer Viren der Risikogruppe 2 pseudotypisiert wurden. Mit den viralen Vektoren infizierte Zellen können in die Risikogruppe 1 herabgestuft werden, wenn nachgewiesen ist, dass der Mediumüberstand frei von Viruspartikeln ist und keine Lentiviren abgegeben werden.Daneben sind drei weitere Vektor-Systeme für die Transformation eukaryoter Zellen unter der Sicherheitsstufe 2 zu nennen, das Semliki-Forest-Virus
bzw. Sindbis-Virus Expressionssystem, das Vaccinia-Virus System und adenovirale
Vektoren. Das Prinzip der Klonierung in Semliki-Forest-, Sindbis- und Vaccinia-Viren
ist identisch mit dem bei Baculovirus. Es wird ein Rekombinationsplasmid
mit dem Fremdgen vor einem viralen Promotor und zu viralen Sequenzen homologen
flankierenden Sequenzen benutzt. Nach Transfektion des Plasmids in eine
Virus infizierte Zelllinie kommt es während der viralen Replikation
über die homologen Sequenzen zu einer Rekombination des Plasmids mit
dem viralen Genom. Das rekombinante Virus wird freigesetzt. Da die Verwendung
von Semliki-Forest-, Sindbis- und Vaccinia-Virus weit verbreitet ist, hat
auch hierzu die ZKBS grundlegende Stellungnahmen abgegeben (Semliki
Forest Virus- und Sindbis Virus-Expressionssystem,
Vacciniaviren).
Auf die bei diesen Systemen mittlerweile vorliegenden Expressions- und
Helferplasmide, die zu einer Einstufung der gentechnischen Arbeiten in
die Sicherheitsstufe 1 führen, sei nochmals hingewiesen.
Beispiel: Thema: Expression von
Graninen in konstitutiv und reguliert sekretierenden Zelllinien
E. coli K12 einschließlich des Vektors pSC11
mit DNA-Sequenzen der humanen Gene für Chromogranin A (hCgA) und B
(hCgB)
a) humane Zelllinie HuTK- infiziert mit Vaccinia-Virus (Stamm WR) mit dem Vektor pSC11: pBR322
ori, P7,5- und P11-Promotor sowie Sequenzen des Thymidin-Kinase-Gens des
Vaccinia-Virus, beta-Galactosidase-Gen und Ampicillin-Resistenzgen aus
b) Rattenzellinie PC12
Der Vektor enthält Sequenzen des Thymidin-Kinase-Gens
(TK- Gen) des Vaccinia-Virus, wodurch es zu einer homologen Rekombination
mit dem TK-Gen des Vaccinia-Virus kommt. Eine Bewertung des rekombinanten
Vaccinia-Virus erfolgt anhand der gentechnisch veränderten Organismen.
a) humane Zellinie HuTK- infiziert mit Vaccinia-Virus des
o.g. Vektors mit cDNA-Sequenzen humaner Granin-Gene
Begründung: Die humanen Zellen sind mit Vaccinia-Virus infiziert
und daher der Risikogruppe 2 zuzuordnen. Sie geben nach Rekombination des
Virus mit dem transfizierten Vektor gentechnisch veränderte Organismen
der Risikogruppe 2 ab. Die Zellen sterben etwa zwei Wochen nach der Infektion
ab. Maßgeblich für die Sicherheitsbewertung sind daher rekombinante
Vaccinia-Viren.
Riskogruppe 2 .
b) Vaccinia-Virus einschließlich integrierter cDNA-Sequenzen
humaner Granin-Gene und dem beta-Galaktosidase- Gen aus E. coli Begründung: Gemäß § 3 Nr 3 Satz 1 GenTG entsprechen
die rekombinanten Vaccinia-Viren gentechnisch veränderten Organismen.
Das Vaccinia-Virus ist ein Organismus der Risikogruppe 2. Die eingeführten
Gene sind ohne pathogenes Potenzial. Es ist kein höheres Risikopotenzial
des gentechnisch veränderten Organismus als das des Wildtyp-Virus
c) PC12-Zellinie infiziert mit den unter b) genannten rekombinanten
Begründung: Die Zellen sind mit den unter b) in die Risikogruppe
2 eingestuften rekombinanten Vaccinia-Viren infiziert und geben diese als
infektiöse Viruspartikel wieder ab. Die Zellen sterben etwa zwei Wochen
nach der Infektion ab.
a) und c) Begründung: Der Spender ist
ein Organismus der Risikogruppe 1. Die Empfängerzellen (Risikogruppe
1) sind mit Viren der Risikogruppe 2 infi-lziert und setzen diese nach Vermehrung
frei. Die Zellen sterben nach der Infektion ab. Die gentechnisch veränderten
Organismen überschreiten nach einer vorläufigen Sicherheitsbewertung
nach § 5 Abs. 2 Satz 2 GenTSV nicht das Gefährdungspotenzial
von Organismen der Risikogruppe 2 und geben keine GVOs höherer Risikogruppen
ab. Sicherheitsstufe 2 .
b) Begründung: Der Spender ist ein Organismus
der Risikogruppe 1. Der Empfänger ist ein Virus der Risikogruppe 2.
Die gentechnisch veränderten Organismen überschreiten nach einer
vorläufigen Sicherheitsbewertung nach § 5 Abs. 2 Satz 2 GenTSV
nicht das Gefährdungspotenzial von Organismen der Risikogruppe 2.
Umgang mit rekombinanten Vacciniaviren ist eine grundsätzliche
Stellungnahme der ZKBS erstellt worden.
Zur Übertragung heterologer Gene und in der somatischen Gentherapie werden häufig adenovirale Vektoren verwendet. Die zu übertragenden
Gene werden in einem Rekombinationsplasmid von Ad5-DNA-Sequenzen flankiert,
mit deren Hilfe das Gen über homologe Rekombination in ein deletiertes
Ad5-Genom eingeführt wird. Die Übertragung findet in der komplementierenden
humanen Zelllinie 293 (siehe hierzu
mit Hilfe von Adenovirus Typ 5) statt. Diese ist permissiv für
die Replikation von Adenoviren und enthält die E1- und E4-Gene von
Ad5 im Genom integriert. Durch die konstitutive Expression der E1-Gene
ist diese Zelllinie in der Lage, Ad5-Mutanten mit Deletionen in der essentiellen
E1-Region zu komplementieren. Das Rekombinationsplasmid mit dem zu übertragenden
Gen wird auf 293-Zellen - entweder nachdem diese mit Ad5-E1-Deletionsmutanten
infiziert wurden oder als Ko-Transfektion gemeinsam mit der DNA von Ad5-E1-Deletionsmutanten
- transfiziert. Die Übertragung des heterologen Gens in das deletierte
Ad5-Genom in der den Replikationsdefekt komplementierenden Zelle führt
zur Freisetzung rekombinanter replikationsdefekter Ad5-Deletionsmutanten.
Werden Zellen die den Replikationsdefekt in der E1-Region nicht komplementieren
können, mit den rekombinanten repliktionsdefekten Ad5-Deletionsmutanten
infiziert, erfolgt keine Produktion infektiöser Virionen. Die gentechnischen
Arbeiten mit subgenomischen Nukleinsäureabschnitten von Ad5 (Rekombinationsplasmide)
werden gemäß der allgemeinen Stellungnahme der ZKBS zu Adenovirus
Typ 5 der Sicherheitsstufe 1 zugeordnet, wenn der Empfängerorganismus
die fehlenden Ad5-Sequenzen nicht komplementieren kann. Die Herstellung
rekombinanter, replikationsdefekter Adenoviren in einer komplementierenden
Zelle (z.B. 293-Zellinie) sowie die Arbeiten mit den entstandenen Viren
sind in die Sicherheitsstufe 2 einzustufen. Infizierte Zellen der
Risikogruppe 1 und Tiere sind, soweit sie den Replikationsdefekt nicht
komplementieren können, wieder in die Sicherheitsstufe 1 einzustufen. Beispiel: Thema: Rekombinante Adenoviren für
die Therapie maligner Tumoren Rekombinante Adenoviren (Serotyp 5) werden für die antitumorale
Therapie verwendet. In Deletionsmutanten des Ad5, die die E1 und die E3
Region des Wildtyp-virus nicht mehr tragen, werden therapeutische Gene
einkloniert und mit Hilfe der replikationsdefekten rekombinanten Adenoviren
in Tumorzellen eingeschleußt. Ausgangskonstrukte für die Arbeiten
sind die Plasmide pTG4656 und pTG9530. Transferriert werden: a) Markergene wie das Green fluorescence protein (GFP) oder das LacZ-Gen. b) Suizidgene, beispielsweise das bakterielle Cytosindesaminasegen
oder HSV-tk. c) Genfragmente tumorspezifischer Gene. Mit den rekombinanten Adenoviren werden zum einen direkte in vivo Transferexperimente
in Ratten und Mäusen durchgeführt. Zum anderen werden parallel
auch in vitro antigenpräsentierende Zellen (APCs) infiziert.
A) Mensch B) Qualle Aequoria victoria C) Nager D) E. coli E) HPV F) HSV Risikogruppe
1 Risikogruppe 1 Risikogruppe 1 Risikogruppe 2 Risikogruppe 2 Risikogruppe 2
Ausgangsorgamisen
a) E. coli K12 mit in pUC-Derivaten
klonierten, charakterisierten Fragmenten tumorassoziierter Gene (z.B. Fusionstranskripte,
Frameshiftmutanten, E6 und E7) Risikogruppe
b) E. coli K12 mit in pUC-Derivaten klonierten
Markergenen (GFP, lacZ)
c) E. coli K12 mit in pUC-Derivaten klonierten
Suizidgenen (z.B. Cytosindesaminasegen aus E. coli, tk-Gen aus HSV) Risikogruppe
a) E. coli K12 mit den Vektoren pTG4656 und pTG9530 b) 293 Zelllinie c) antigenpräsentierende Zellen, human nicht getestet auf HIV,
HCV und HBV d) antigenpräsentierende Zellen der Ratte bzw. Maus e) Ratte, Maus Risikogruppe
1 Risikogruppe 1 Risikogruppe 2 Risikogruppe 1 Risikogruppe 1
a) E. coli K12 einschließlich o.g. Vektoren mit den unter
den Ausgangsorganismen aufgeführten Genen bzw. Genfragmenten
Begründung: Die klonierte Spender-DNA besitzt kein Gefährdungspotenzial,
da sie entweder für unbedenkliche Proteine kodiert oder nur in Fragmenten
vorliegt. Die Plasmide besitzen kein eigenes Gefährdunspotenzial,
da nur Adenoteilsequenzen vorliegen. Die GVO geben keine Organismen der
Risikogruppe 2 oder höher ab.
b) 293 Zellen einschließlich der durch homologe Rekombination
entstandenen pTG-Plasmide mit den unter den Ausgangsorganismen aufgeführten
Genen bzw. Genfragmenten
Begründung: Die 293 Zellen komplementieren den Replikationsdefekt
der Vektoren. Es werden replikationsdefekte, aber infektiöse Adenoviren
gebildet. Die GVO sind gemäß III Nr. 3.3 der allgemeinen Stellungnahme
der ZKBS zum Gentransfer mit Hilfe von Adenovirus Typ 5 in die Risikogruppe
2 einzustufen.
c) replikationsdefekte Adenoviren mit den unter den Ausgangsorganismen
aufgeführten Genen bzw. Genfragmenten
Begründung: Die GVO sind gemäß III Nr. 3.7 der allgemeinen
Stellungnahme der ZKBS zum Gentransfer mit Hilfe von Adenovirus Typ 5 in
die Risikogruppe 2 einzustufen.
d) primäre humane Zellen, infiziert mit den unter 3c)
genannten Viren
e) Nagerzellen, infiziert mit den unter 3c) genannten Viren
Begründung: Die GVO sind gemäß III Nr. 3.9 der allgemeinen
die Risikogruppe 1 einzustufen.
2 Risikogruppe 1
f) Maus bzw. Ratte, infiziert mit den unter 3c) genannten Viren
Begründung: Die GVO sind gemäß III Nr. 3.10 der
allgemeinen Stellungnahme der ZKBS zum Gentransfer mit Hilfe von Adenovirus
Typ 5 in die Risikogruppe 1 einzustufen. Risikogruppe
a) zu 4a) Begründung: Der Empfängerorganismus ist ein Organismus
der Risikogruppe 1 nach § 5 Abs. 2 Satz 1 und gibt keine Organismen
der Risikogruppen 2-4 ab. Vektor-Empfänger-Systeme entsprechen biologischen
Sicherheitsmaßnahmen. Vektoren und aus den Spenderorganismen überführte
Nukleinsäuren sind soweit charakterisiert, dass die gentechnisch
veränderten Organismen nach einer vorläufigen Sicherheitsbewertung
nach § 5 Abs. 2 Satz 2 das Gefährdungspotenzial von Organismen
der Risikogruppe 1 nicht überschreiten und keine gentechnisch veränderten
Organismen höherer Risikogruppen abgeben.
b) zu 4b)
bis Risikogruppe 2 und gibt keine Organismen der Risikogruppen 3 oder 4
ab. Vektoren und aus den Spenderorganismen überführte Nukleinsäuren
sind soweit charakterisiert, dass die gentechnisch veränderten
Organismen nach einer vorläufigen Sicherheitsbewertung nach §
5 Abs. 2 Satz 2 das Gefährdungspotenzial von Organismen der Risikogruppe
2 nicht überschreiten und keine gentechnisch veränderten Organismen
höherer Risikogruppen abgeben.
c) zu 4c)
d) zu 4d)
bis Risikogruppe 2. Vektoren und aus den Spenderorganismen überführte
der Risikogruppe 2 nicht überschreiten und keine gentechnisch veränderten
e) zu 4e) und f)
Begründung: Die Empfängerorganismen sind Organismen der
Risikogruppe 1 nach § 5 Abs. 2 Satz 1 und geben keine Organismen der
Risikogruppen 2-4 ab. Vektoren und aus den Spenderorganismen überführte
Die zuvor genannten Sicherheitseinstufungen von Adenoviren gilt für die Übertragung von Nukleinsäuren ohne Gefährdungspotenzial.
In einer Einzelstellungnahme hatte die ZKBS Anfang 2004 Arbeiten mit Adenoviren mit einem Onkogen (aktiviertes ras) in die Sicherheitsstufe 3 eingestuft, da über den Luftweg Zellen infiziert werden und entarten können. In einer weiteren, späteren Stellungnahme wurde diese Einstufung in die Sicherheitsstufe 2, verbunden mit der Auflage der Benutzung einer Sicherheitswerkbank Klasse 3, mit folgender Begründung korrigiert: Bei den genannten Arbeiten seien insbesondere die mit den Viren umgehenden Mitarbeiter gefährdet, die Sicherheitsmaßnahmen der Sicherheitsstufe 3 bieten jedoch gegenüber denen der Sicherheitsstufe 2 lediglich einen verbesserten Schutz der Umwelt, nicht jedoch der Mitarbeiter. Zum verbesserten Mitarbeiterschutz könne lediglich die Werkbank Klasse 3 beitragen, ein besonderer Schutz der Umwelt sei nicht notwendig.
Im Dezember 2004 hat die ZKBS in der Allgemeinen Stellungnahme „Empfehlung der ZKBS zu adenoviralen und AAV-abgeleiteten replikationsdefekten Vektoren mit zellzyklus-regulierenden Genen“ abschließend Adenoviren und AAV mit zellzyklus-regulierenden Genen in die Sicherheitsstufe 2 eingestuft, für den Umgang mit solchen Adenoviren jedoch
besondere Maßnahmen zum Personenschutz festgelegt. Der Begriff der zellzyklus-regulierenden Gene wurde dabei allerdings sehr weit gefasst. Er umfasst Gene von Tumorviren die für das onkogene Potenzial des Virus verantwortlich sind, Gene die maßgeblich an der Entstehung humaner Tumore beteiligt sind, Gene die in vitro Säugerzellen transformieren und Gene die im Tierversuch Tumore erzeugen. Somit fallen unter diesen Begriff neben den „Onkogenen“ auch mutierte Suppressorgene und siRNAs.
D) Einen Sonderfall bei der Sicherheitseinstufung
stellen die sogenannten "Sternchenorganismen" dar. Bei der Novellierung
der Gentechnik-Sicherheitsverordnung wurden die zuvor in einem Anhang aufgeführten
Organismenlisten mit deren Zuordnung zu Risikogruppen aus der Rechtsverordnung
entfernt. Stattdessen veröffentlicht gem. § 5 Abs. 6 GenTSV das
Bundesministerium für Gesundheit in regelmäßigen Abständen
eine Liste "Risikobewerteter Spender- und Empfängerorganismen für
gentechnische Arbeiten". Bei der Einstufung in diesen Listen ist das Ministerium
an die Arbeitnehmerschutzrichtlinie 93/88 EWG vom 12.10.1993 gebunden.
Aus diesem Grunde sind in der im Bundesgesundheitsblatt veröffentlichten
Liste einige Organismen mit Sternchen versehen. Hierbei handelt es sich
um nicht über die Luft übertragene Organismen der Risikogruppe 3, bei deren
Handhabung die Sicherheitsmaßnahmen der Sicherheitsstufe 3 nicht
vollständig eingehalten werden müssen. Ein Teil dieser Organismen
(z.B. Hepatitis B Virus) war bisher in die Risikogruppe 2 eingestuft. Da
die Änderung in der Einstufung auf juristischen, nicht aber auf neuen
sicherheitsrelevanten Aspekten beruht, hat die ZKBS in einer
zu gentechnischen Arbeiten mit dem Hepatitis B Virus (HBV) des Menschen
gentechnisch veränderte HBV, gentechnisch veränderte Zellen oder
Zelllinien, die HBV abgeben, und GVO, die bei der Übertragung vollständiger
Genome von HBV in E. coli K12, Saccharomyces cerevisiae oder etablierte
Zelllinien der Risikogruppe 1 entstehen, in die Risikogruppe 2 und die Arbeiten
in die Sicherheitsstufe 2 eingestuft.
Beispiel: Thema: Klonierung von
Humanes Hepatitis B Virus
Risikogruppe 3*
pBR322-Derivat
E. coli K12 mit dem gesamten Genom von HBV
Begründung: Gemäß Arbeitnehmerschutzrichtlinie 93/88
EWG vom 12.10.93 zur Änderung der Richtlinie 90/679/EWG ist das humane
Hepatitis B Virus (HBV) der Risikogruppe 3* zugeordnet. Diese Risikobewertung
des HBV ist in der Organismenliste "Risikobewertete Spender- und Empfängerorganismen
für gentechnische Arbeiten", die nicht mehr Bestandteil der novellierten
Fassung der GenTSV ist und im Bundesgesundheitsblatt publiziert wird, enthalten.
Neue sicherheitsrelevante Aspekte, die der ZKBS bisher nicht bekannt waren,
lagen dieser Einstufung nicht zugrunde. Die GenTSV sieht für die Risikobewertung
von GVO die Risikogruppen 1, 2, 3 und 4, nicht jedoch die Risikogruppe
3* vor.
Seit Inkrafttreten des GenTG hat die ZKBS die o.g. gentechnischen Arbeiten
in die Sicherheitsstufe 2 eingestuft und die Einhaltung von Sicherheitsmaßnahmen
der Stufe 2 gemäß GenTSV festgelegt, da HBV nicht über
den Luftweg übertragen wird und ein wirksamer Impfstoff gegen die
HBV-Infektion verfügbar ist. Für die genannten gentechnischen
Arbeiten sind Sicherheitsmaßnahmen der Sicherheitsstufe 2 ausreichend.
Demzufolge werden auch die o.g. GVO gemäß GenTSV der Risikogruppe
2 zugeordnet und die gentechnischen Arbeiten in die Sicherheitsstufe 2
Die Stellungnahme der ZKBS zu HBV kann selbstverständlich auch nicht auf andere "3**-Organismen" übertragen werden, es muss in jedem Fall Rücksprache mit der ZKBS gehalten werden bzw. eine neuerliche Stellungnahme eingeholt werden. Dies zeigt sich in zwei weiteren bereits im Oktober 1995 erschienenen Stellungnahmen der ZKBS zu "3**-Organismen". In der Stellungnahme "zu gentechnischen Arbeiten mit Immundefizienzviren des Menschen (HIV-1 und HIV-2)" werden gentechnisch veränderte HIV in die Risikogruppe 3, in der Stellungnahme "zu gentechnischen Arbeiten mit Immundefizienzviren des Affen (SIV)" die gentechnisch veränderten SIV jedoch in die Risikogruppe 2 eingestuft.
Neben den genannten Viren sind in die Gruppe der 3**-Organismen einige Parasiten eingestuft. Auch hier hat die ZKBS in der Stellungnahme „zur Einstufung der Parasiten Leishmania brasiliensis, Leishmania donovani,
Plasmodium falciparum und Trypanosoma brucei rhodesiense als Empfängerorganismen bei gentechnischen Arbeiten“ klargestellt, dass die Arbeiten in der Sicherheitsstufe 2 durchgeführt werden können, wenn nicht vorgesehen ist, mit Überträgern zu arbeiten.
Nach § 7 Abs. 3 Nr. 3 GenTSV sind gentechnische Arbeiten mit Mikroorganismen
und Zellkulturen zim Laborbereich der Sicherheitsstufe 3 zuzuordnen,
bis Risikogruppe 3 und geben keine Organismen der Risikogruppe 4 ab,
2 das Gefährdungspotenzial von Organismen der Risikogruppe 3 nicht
überschreitet und keine gentechnisch veränderten Organismen der
Risikogruppe 4 abgibt; Ebenfalls der Sicherheitsstufe 3 zuzuordnen sind
gentechnische Arbeiten, die darauf gerichtet sind, hochwirksame Toxine
herzustellen, wobei biologische Sicherheitsmaßnahmen zur Anwendung
kommen. Die Zentrale Kommission für die biologische Sicherheit kann
unter Berücksichtigung der Wirkungsweise des hochwirksamen Toxins
Empfehlungen aussprechen, welche biologischen Sicherheitsmaßnahmen
hierfür im Einzelfall geeignet sind;
zu a) die Empfängerorganismen sind Organismen
der Risikogruppe 3 und geben keine Organismen der Risikogruppe 4 ab,
Gentechnische Arbeiten sind in der Regel (Ausnahme können "Sternchenorganismen"
wie z.B. HBV sein) in die Sicherheitsstufe 3 einzustufen, wenn der Empfängerorganismus
ein Organismus der Risikogruppe 3 ist und keine Organismen der Risikogruppe
4 abgibt.
zu b) Vektoren und aus dem Spenderorganismus
Risikogruppe 4 abgibt;
Wenn der Spenderorganismus ein Organismus der Risikogruppe 3 ist, sind
die Arbeiten in den folgenden Fällen in die Sicherheitsstufe 3 einzustufen
(in Analogie zur Einstufung bei der Sicherheitsstufe 2):
wenn das gesamte Genom des Spenders übertragen werden soll
wenn der zu übertragende Genomabschnitt nicht charakterisiert ist
wenn Nukleinsäureabschnitte, die das Gefährdungspotenzial bestimmen,
Die drei genannten Voraussetzungen gelten unabhängig davon, ob der
Empfängerorganismus in die Risikogruppe 1, 2 oder 3 eingestuft ist.
Gentechnische Arbeiten mit Mikroorganismen und Zellkulturen im Laborbereich
sind der Sicherheitsstufe 4 zuzuordnen, wenn sie mit einem hohen Risiko
oder dem begründeten Verdacht eines solchen Risikos für die menschliche
Gesundheit oder die Umwelt verbunden sind. Hierfür kommen insbesondere
Arbeiten mit Viren der Risikogruppe 4 oder defekten Viren dieser Risikogruppe
in Gegenwart von Helferviren in Betracht. Die Zentrale Kommission für
die Biologische Sicherheit gibt unter Berücksichtigung der in den
§§ 9 bis 13 und in ihren Anhängen für diese Sicherheitsstufe
aufgeführten Beispiele Empfehlungen ab, welche Sicherheitsmaßnahmen
im Einzelfall für eine gentechnische Arbeit dieser Stufe erforderlich
Wie auch in der amtlichen Begründung zur Gentechnik-Sicherheitsverordnung
(Fassung vom 24.10.1990) aufgeführt, haben der Zentralen Kommission
für die Biologische Sicherheit bisher keine Anträge auf Arbeiten
dieser Sicherheitsstufe vorgelegen. Es fehlen daher bis jetzt die notwendigen
Anhaltspunkte, um solche Arbeiten allgemein zu beschreiben und einzuordnen.
Ein solches Verfahren ist daher in jedem Einzelfall mit der zuständigen
Behörde und der Zentralen Kommission für die Biologische Sicherheit
abzusprechen. Dies gilt nicht nur für die Einstufung der Arbeit, sondern
auch für die einzuhaltenden Sicherheitsmaßnahmen, die auf die
speziellen Eigenschaften des betreffenden Virus abzustellen sind.
Die im folgenden dargestellten Sicherheitseinstufungen beziehen sich auf
Verfahren der Veränderung genetischen Materials gem. der Begriffsdefinition
des § 3 GenTG. Viele Verfahren zur direkten Einbringung genetischen
Materials in Tiere wie z.B. intramuskuläre Injektion rekombinanter
DNA fallen jedoch nicht unter diese Definition (siehe hierzu auch
der ZKBS zum Einbringen rekombinanter DNA in Tiere ).
Ebenfalls nicht eingegangen wird auf Infektionsversuche an Tieren mit
gentechnisch veränderten Mikroorganismen. Bei solchen Versuchen ist
die Einstufung der gentechnischen Arbeit primär abhängig von
der Risikogruppe der benutzten Mikroorganismen. So geht die ZKBS in einer
zur Infektion von Tieren mit gentechnisch veränderten Organismen der
Risikogruppe 2) davon aus, dass bei Arbeiten der Sicherheitsstufe
2 in den meisten Fällen für den Infektionsversuch sogar eine
neuerliche Stellungnahme durch die ZKBS entbehrlich ist, da die Einstufung
der Mikroorganismen einfach übernommen werden kann. Diese Einstufung
wurde jedoch bereits im letzten Kapitel ausführlich besprochen.
Die Arbeiten sind der Sicherheitsstufe 1 zuzuordnen, wenn sie die folgenden
a) Die Empfängerorganismen sind Tiere
oder Pflanzen, von denen keine schädlichen Auswirkungen auf die Rechtsgüter
nach § 1 Nr. 1 Gentechnikgesetz zu erwarten sind,
b) virale Vektoren sollen nicht horizontal
c) Vektoren und aus dem Spenderorganismus überführte
der gentechnisch veränderte Organismus bei gentechnischen Arbeiten
nach einer vorläufigen Risikobewertung nach
§ 5 Abs. 1 Satz 2 das
Gefährdungspotenzial von Organismen der Risikogruppe 1 nicht überschreitet
und keine gentechnisch veränderten Organismen höherer Risikogruppen
Höhere Tiere und Pflanzen sind gemäß Anhang I Teil B der
GenTSV in der Fassung vom 24.10.1990 in die Risikogruppe 1 eingestuft.
Dies bedeutet, dass für die Sicherheitseinstufung der gentechnischen
Arbeit in erster Linie das Gefährdungspotenzial der zu übertragenden
Nukleinsäure und des eventuell benutzten Vektors heranzuziehen ist.
Handelt es sich bei der zu übertragenden Information ebenfalls um
Gene von höheren Tieren (hierzu zählt auch der Mensch) oder Pflanzen,
so kann die Arbeit, falls keine Vektoren eingesetzt werden in die Sicherheitsstufe
1 klassifiziert werden. Dies trifft bei den zumeist durch Mikroinjektion
hergestellten transgenen Tieren zu.
Beispiel: Thema: Untersuchung des Proteolipid
Protein (PLP)-Transgens in der Mausmutante Jimpy
Maus, Stamm C57BL/6-J (eine genomische
Bank liegt in E. coli K12 vor) Risikogruppe
a) E. coli K12 mit dem Vektor SuperCos
1 b) Maus Stamm CB6 bzw. Kreuzungen aus CB6 und Jimpy
a) E. coli K12 einschließlich des
Vektors SuperCos 1 mit dem PLP-Gen der Maus Begründung: Ein charakterisierter Nukleinsäureabschnitt
des Genoms der Maus ohne patho-genes Potenzial wird mittels eines Vektors
in E. coli K12 amplifiziert.
b) Maus einschließlich des PLP-Gens
der Maus Begründung: Der mit Hilfe des unter a) beschriebenen gentechnisch
veränderten Organismus amplifizierte Nukleinsäureabschnitt des
Genoms der Maus wird ohne Vektor mittels Mikroinjektion in Zygoten der
Maus eingeführt. Risikogruppe
Begründung für die Sicherheitseinstufung
der gentechnischen Arbeiten: Spender- und Empfängerorganismen
sind Organismen der Risikogruppe 1, von Ihnen sind keine schädlichen
Auswirkungen auf die Rechtsgüter nach § 1 Nr. 1 GenTG zu erwarten.
Der gentechnisch veränderte Organismus gibt keine gentechnisch veränderten
Organismen der Risikogruppen 2-4 ab. Der gentechnisch veränderte Organismus
überschreitet nach einer vorläufigen Sicherheitsbewertung nach
§ 5 Abs. 2 Satz 2 GenTSV nicht das Gefährdungspotenzial von Organismen
Werden zur Herstellung der transgenen Tiere Vektoren benutzt, so liegt
der wesentliche Unterschied zwischen den Sicherheitsstufen 1 und 2 darin,
ob der zur Einführung des Gens benutzte Vektor auf das Tier beschränkt
bleibt (Sicherheitsstufe 1) oder horizontal übertragbar ist (Sicherheitsstufe
2). Entscheidend für die Einstufung in die Sicherheitsstufe 1 ist
also, ob das in die Keimbahn eingeführte Merkmal nur vertikal (auf
die Nachkommen) weitergegeben werden kann und damit kontrollierbar bleibt.
Auch die Herstellung transgener Pflanzen unter Verwendung von Spender-
und Empfängerorganismen der Risikogruppe 1 wird in die Sicherheitsstufe
1 klassifiziert, wenn keine horizontal übertragbare Vektoren eingesetzt
werden. Voraussetzung ist weiterhin, dass auch alle Empfängerorganismen
von notwendigen Zwischenschritten in die Risikogruppe 1 gehören. Dies
ist z.B. beim Einsatz von Agrobacterium tumifaciens und binären
"disarmed" Ti-Plasmiden, dem am häufigsten benutzten System zur Übertragung
von Genen auf Pflanzen, der Fall (siehe
der ZKBS zur Einstufung von Agrobacterium tumefaciens). Aus
der T-Region des binären (repliziert in E. coli und A. tumifaciens)
Ti-Plasmids wurden die tumorinduzierenden Gene deletiert. An der Klonierungsstelle
liegt ein in Pflanzen wirksamer Promotor (z.B. von CaMV). Das Plasmid ist
mobilisierbar, kodiert aber nicht für eine eigene Transferfunktion.
Beispiel: Thema: von Saccharose-Phosphat Synthase
(SPS) in Tabak
Spinacia oleracea (Spinat); Expressionsbibliothek
in Phage lambda Zap.II
E. coli K12 Agrobacterium tumifaciens Nicotiana tabacum (Tabak) Risikogruppe
1 Risikogruppe 1 Risikogruppe 1
Ti-Plasmid pGV 2260 mit einer pflanzlichen
Expressionskassette aus 35S-CaMV-Promotor, Struktur-Gen (SPS) und OCS-Terminator
aus A. tumifaciens. Das Plasmid wird in einen ersten Empfänger
(E. coli K12 mit Helferplasmid für die Mobilisierung nach A.
tumifaciens) eingeführt. In Anwesenheit von A. tumifaciens
wird das binäre Plasmid dorthin übertragen. Da A. tumifaciens
das natürliche Ti-Plasmid mit den Virulenz-Genen enthält, kann
die rekombinante T-Region nach Infektion Pflanzenzellen transformieren. .
a) E. coli K12 mit SPS-Gen b) A. tumifaciens mit SPS-Gen c) Nicotiana tabacum (pflanzliches Gewebe und daraus regenerierte
Pflanzen, die frei sind von A. tumifaciens, mit ins Genom integriertem
SPS-Gen) Risikogruppe
Begründung: Sowohl der Spender-
als auch alle Empfängerorganismen (auch die der Zwischen-klonierungsschritte)
sind Organismen der Risikogruppe 1. Das im ersten Arbeitsschritt benutzte
Helferplasmid ermöglicht lediglich den Transfer des Ti-Plasmidvektors
aus E. coli in A. tumifaciens. Das natürliche Ti-Plasmid ermöglicht
die Übertragung des SPS-Gens auf das pflanzliche Genom. Ein weiterer
horizontaler Gentransfer wird durch das Fehlen von A. tumifaciens in den
regenerierten Pflanzen vermieden. Die gentechnisch veränderten Organismen
§ 5 Abs. 2 Satz 2 nicht das Gefährdungspotenzial von Organismen
der Risikogruppe 1 und geben keine gentechnisch veränderten Organismen
höherer Risikogruppen ab
Die Arbeiten sind der Sicherheitsstufe 2 zuzuordnen, wenn sie die folgenden
oder Pflanzen, von denen höchstens ein geringes Risiko für die
Rechtsgüter nach § 1 Nr. 1 Gentechnikgesetz zu erwarten ist,
bei gentechnischen Arbeiten nach einer vorläufigen
Risikobewertung nach § 5 Abs. 1 Satz 2 das Gefährdungspotenzial von Organismen der Risikogruppe
2 nicht überschreitet und keine gentechnisch veränderten Organismen
höherer Risikogruppen abgibt;
Die Einstufung von gentechnischen Arbeiten mit Tieren und Pflanzen in die
Sicherheitsstufe 2 ist fast immer unter dem Gesichtspunkt der Abgabe von
Organismen der Risikogruppe 2 zu sehen. Hierbei sind zwei Gruppen von Experimenten
Infektionsversuche an Tieren oder Pflanzen mit gentechnisch veränderten
Organismen. Als Beispiel seien Infektionen von Mäusen mit den zuvor
erwähnten Listeria monocytogenes oder mit Vaccinia-Viren genannt.
Da die infizierten Tiere humanpathogene gentechnisch veränderte Bakterien
bzw. Viren abgeben können, müssen die Arbeiten in die Sicherheitsstufe
2 klassifiziert werden. Gleiches gilt für die Infektion von Pflanzen
mit gentechnisch veränderten pflanzenpathogenen Erregern. Zur Einstufung
von Mikroorganismen, die Pflanzenkrankheiten erzeugen können, sei
auf die Merkblätter "Sichere Biotechnologie" der BG-Chemie [2,3,4,5,7]
der ZKBS zu Kriterien der Bewertung und der Einstufung von Pflanzenviren,
phytopathogenen Pilzen und phytopathogenen Bakterien verwiesen.
Erzeugung von Tieren, die transgen für vollständige Virusgenome
sind. In diesen Fällen sind die transgenen Tiere in die Risikogruppe
der Spenderviren einzuordnen. Die gentechnische Arbeit ist in die entsprechende
Sicherheitsstufe einzustufen. Somit sind gentechnische Arbeiten, bei denen
vollständige Genome von Viren der Risikogruppe 2 auf Tiere übertragen
werden, in die Sicherheitsstufe 2 zu klassifizieren, da alle Gene des Virus
exprimiert und somit Viruspartikel der Risikogruppe 2 abgegeben werden
Die Arbeiten sind der Sicherheitsstufe 3 zuzuordnen, wenn sie die folgenden
oder Pflanzen, von denen höchstens ein mäßiges Risiko für
die Rechtsgüter nach § 1 Nr. 1 Gentechnikgesetz zu erwarten ist,
Risikobewertung nach § 5 Abs. 1 Satz 2 das Gefährdungspotenzial von Organismen der
Risikogruppe 3 nicht überschreitet und keine gentechnisch veränderten
Organismen der Risikogruppe 4 abgibt;
Die Arbeiten sind der Sicherheitsstufe 4 zuzuordnen, wenn für gentechnische
Arbeiten im Laborbereich die Voraussetzungen des Absatzes 3 Nr. 4
oder für gentechnische Arbeiten im Produktionsbereich die Voraussetzungen
des Absatzes 2 Nr. 2 Buchstabe c erfüllt sind.
[1] Eberbach,W.;Lange,P. (1993) Gentechnikrecht C.F.Müller Juristischer
Merkblätter "Sichere Biotechnologie" der BG-Chemie,
Jedermann Verlag, Heidelberg
[2] B004: Eingruppierung von Viren
[3] B005: Eingruppierung von Parasiten
[4] B006: Eingruppierung von Bakterien
[5] B007: Eingruppierung von Pilzen
[6] B008: Einstufung gentechnischer Arbeiten
[7] B009: Eingruppierung von Zellkulturen
[8] Hacker,J.; Ott,M.; Tschäpe,H. (1991) Das Problem der Pathogenität
von Escherichia coli und seine Bedeutung für die rekombinante DNA-Technologie
BIOforum 14, 150-157